伝子の 現 御が可能な発現ベクタ 術分野
本 、 外来 伝子の 現の 御が可能であり、 が 伝子を内因 性 伝子の 度の量で発現さ ることができる発現ベクタ 、 びそれを用 て作製したトランスジ ック 胞及び 物に関する。
来 トラ スジ ック 物の 製にお ては、 の 精卵を採取し、 この 精卵に外来 伝子を イ ジ クショ 法により注入することにより 伝子を受精卵の 色体に導入し、 外来 伝子を導入した受精卵を代理 母 物の 管に移植して出産さ る 法が用 られて る。 この 法にお ては、 外来 伝子が動物の 色体にラ ダムに 入されるため、 外来 伝子を 動物の 色体の 定の 位に 入するこ ができな 。 このため、 外来 伝子は 色体上の元来の 伝子の 現に影響を及ぼすよ 位置に 入される場合が多 、 また外来 伝子が 入された 色体上 位置により、 入 れた外来 伝子の が異なるなどの 題点があ た。 て、 色体上の元来の 伝子 の 現に影響を及 さずに、 伝子の 望の をもたらすトラ ス ジ ック 物を得るに 、 多数のトランスジ ック 物の 統を作製し、 そ の中 ら、目的とする性質を有する トランスジ ックを選択する必要があ た。 このため、 目的とするトラ スジ ジク を樹立するためには、 多 の 備と、 多 の と多 の 間を必要とし、 の 伝子を導入した広 範なトラ スジ ック 物を えるこ が不可能であ た。
方、受精卵に外来 伝子を導入する トラ スジ ック 物の 製方法では、 入した外来 伝子が 生の 期 ら発現 れるため、 伝子の 入 が生体の 生及び 持に必須の 伝子に変異を加えるよ なものである場合、 個
体が 死となり、 トラ スジ ック 物が得られな 場合がある。 また、 生 体の ・ 持の 階で多種多様な機能を有する遺伝子が存在し、 外来 伝子の 入により とする目的の 能を直接 析することができな 場合が ある。
また 従来のトラ スジ ック 、 外来 伝子 こで 伝子 は、 一般的には 野生 物が本来 て な 遺伝子である 、 又は野生 物が本来 て る野生 伝子に変異を導入した 伝子などである) を過 剰 現さ ることを意図して作製されたものが一般的であ た。 このよ トラ ンスジ ック 物にお ては、 野生 伝子の 同じ量の変 伝子を 発現さ て、 それらを競合 ることはできな た。
このよ 問題点を解決するため、 薬剤 な ガンド セプタ 白質の 造変化を伴 伝子 ステム 、 ホ な ガ ド セプタ 白質の 造変化を伴 白質の 構を利用することに よ て、 ディ ョナ ・ ラ スジ ック ( 的な条件の 節により、 入した外来 伝子の 現を調節することができる) の 成が試みられて る。 し しながら、 例えば 前者のトラ スジ ック 物を作製するためには、 テトラサイク 系 剤を ガ ドとする セプタ に転写 子を融合さ た 性化 子を発現する外来 伝子、 セプタ に転写 子を融合さ た 制化 子を発現する外来 伝子、 び上記 セプタ ための を転写 域に含み目的遺伝子を発現さ る外来 伝子の3 類の 伝子を 物に導入したトラ スジ ック 物を作製する必要があり、 その際に、 転写 性化 子と転写 子との 現の ラ スとして、 転写 性化 子に比 て 転写 子の 現を高 する必要がある。
このためには 上記それぞれの 伝子を導入した3 類のトラ スジ ック 物を作製し、 次にこれらを交配して3 類の 伝子を含む ランスジ ック 物を取得する必要がある。 し しながら、 このためには多大の 間と 力を必要とするのみならず、 目的とする トラ スジ ック 物が得られる
極めて低 、 実用性に乏し 。
また、 従来の 記したよ なテトラサイク ステムを利用したトラ スジ ク 物にお ては、 外来 伝子を過剰 現させた場合の 果し 察する ことができず、 野生 伝子の 同じ量の外 伝子を発現さ て、 それ らを競合 た結果を観察することはできな た。 さらた、 上記のテトラサイ ク ステムを利用したトラ スジ ック 物にお ては、 薬剤 (ドキ サ イクリ など) の 無によ て外来 伝子の 現をオ 又は にすることは可 能であ たが、 薬剤の 度に依存した様式で外来 伝子の を変化さ るこ とはできな た。 明の
て、 明の 一の 、 目的の 伝子を時期特異 に発現するこ とができる トラ スジ ック 物を提供することである。 明の 二の 、 外来 伝子 現が にな た際にその を制御することができるト ランスジ ック 物を提供することである。 明の 三の 、 野生 伝子 度の で外来 伝子を発現させることができる トラ ス ジ ック 物を提供するこ である。 明の 四の 、 目的の 伝 子が動物のゲノムの 定の 位に導入されており、 その 現が元来の 伝子の 現に影響を及ぼさな よ トラ スジ ック 物、 およびそのよ トラ スジ ック 物を よ 作製して、 多様な目的遺伝子を導入したトラ スジ ク 物の えを こ ができる 段を提供することである。
らは、 上記 題を解決するために 討した結果、 テトラサイク 系 剤を ガ ド する セプタ に転写 子を融合さ た 性化 子を発現する外来 伝子、 セプタ に転写 子を融合さ た 制化 子を発現する外来 伝子、 び上記 セプタ のための 列を転写 域 に含み目的遺伝子を発現さ る外来 伝子をイ ス タ により相互に分離し た状態で 個の クタ に組み込み、 この クタ を動物のゲノムに導入し、
の際に、 テトラサイク 系 剤を ガ ドとする セプタ に転写 子を 融合さ た 性化 子を発現する外来 伝子のプ タ 、 セプタ に転写 子を融合さ た 制化 子を発現する外来 伝子のプ モ タ を適当に選択することにより、 上記 一 ら第三の 的を解決できるこ を見 出した。 より具体的には、 明にお ては、 テトラ リ 系 剤を ガ ドとする セプタ に転写 子を融合さ た 性化 子を発現する外来 伝子のプ タ 中に含まれる ン サ 同じ ンサ を、 セプ タ に転写 子を融合さ た 制化 子を発現する外来 伝子のプ タ 中に含めるこ によ て、 上記 的を解決して る。
さらに、 例え 、 上記の クタ にお て、 目的の 伝子の 現のための 列の P 列を 入しておき、 その クタ を、 例え 作為 に動物のゲノムに導入して の ラ スジ ツク 物を作製し、その中から、 元来の 伝子の 現に影響を与えな 部位に前記 クタ が 入されて る トラ スジ ック 物を選択し、 この 物のゲノム中に 入されて る前記 1 P部位に、 P 列に連結した任意の 的遺伝子を 状の Aを導入する ことにより、 上記 四の 的を解決できることを見出した。
はこれらの 見に基 て完成したものである。
、 明によれ 、 以下の 明が提供される。
( ) ( ) 一のプ タ と、 テトラサイク 系 剤を ガ ドとす る セプタ に正の転 子を連結して成る 性化 子 を含む
ット ) 二のプ モ タ と、 テトラサイク 系 剤を ガ ドとす る セプタ に負の転 子を連結して成る 子とを含む 、 ( ) セプタ のための 列を含む 域を伴 三のプ タ を含む、 目的遺伝子を発現させるための ッ を含 み、 上記 ( ) ) ( ) の ットが相互にイ ス タ により 離されて る、 発現ベクタ 。
( ) 記の 一のプ モ タ 、 第二のプ タ 三のプ タ
が相互に異なるプ モ タ である、 ( ) に記載の クタ 。
(3) 一のプ タ が組織 プ タ であ 、 前記 二の プ タ が組織 プ タ である、 ( ) 又は (2) に記載の ベクタ 。
(4) 一のプ タ 前記 二のプ タ がそれぞれ 一の サ を含んで る、 ( ) から (3) の れ に記載の ベクタ 。 (5) 一のプ タ がC V サ とC プ タ と を含んでなるプ タ であり、 前記 二のプ タ がC V サ アクチンプ タ とを含んでなるプ タ である、 ( ) ら (4) の れ に記載の クタ 。
(6) の 子が、 P 6 スウィ ス 性化 ) である、 ( ) ら (5) の れかに記載の クタ 。
(7) の 子が、 n s AB (K ppe assoc a ed box) である、 ( ) ら (6) の れ に記載の クタ 。
(8) イ ス タ が、 ワ ト p グ リ インス タ である、 ( ) ら (7) の れかに記載の クタ 。
(9) 三 プ タ の 流に OxP が 入されて る、 ( ら (8) の れ に記載の ベクタ 。
( 0) トラ スジ ック トラ スジ ック 物を作製するため の、 ( ) から (9) の れかに記載の クタ 。
( ) ( ) ら ( 0) の れかに記載の クタ を有する トラ ス ジ ック 。
( 2) ( ) ら ( 0) の れかに記載の クタ がゲノムに 入さ れて る、 目的遺伝子を導入したトランスジ ック ヒ ト 物を作製する ためのトラ スジ ック ヒ ト 。
( 3) ウスである、 ( 2) に記載の ヒ ト 。
( 4) ( 2) 又は ( 3) に記載の 物の 胞に、 oxP 列に連結さ
れた目的遺伝子を含む を投与して、 前記 三のプ タ の 流に 設けられて る oxP 列に前記 的遺伝子を ぎこみ 胞 ら動物を 再生することを特徴 する、 目的遺伝子を導入したトラ スジ ック ヒ ト 物の 製方法。
( 5) ( 4) に記載の 法により作製される、 トラ スジ ック ヒ ト はその 。 面の 単な説明
は、 Te Sys e ep Tg の 製の 要を示す。
2は、 Te Sys e ep Tg D ( )の 製の ( ) を示す。
3は、 Te Sys e ep Tg D ( )の 製の ( ) を示す。
4は、 Te Sys em 。 P Tg )の 製の 要を示す。
5は、 タ ゲット ( oxP ) を含有したテ ラサイクリ ス テム 全長 ( 本化) プラス クタ の 製の 要を示す。
6は、 Te Sys e e T の 要を示す。
7は、 Te Sys e ep Tg ) の 要を示す。
8は、 Te Sys e ep T D ) の 要を示す。
9は、 Te Sys e ev T D ( の 要を示す。
0は、 Te Sys e oxP Tg D の 要を示す。
は Te acyc ne Sys e (Te On o Sys e ) ansgeneの 要を示す。 2は、 フ ラ ゼ ガラク ト の 果を示す。
3は、 Te acy。 ne Sys e (Te On o Sys e )の 伝子 御の 式 を示す。
4は、 C e ステムの 要を示す。 明を実施するための 良の
下、 本 明の 施の 態に て説明する。
( ) 明の クタ
明の クタ は、 ( ) 一のプ タ と、 テトラサイク 系 剤をリガ ド する セプタ に正の転 子を連結して成る 性化 子とを含む ット ( ) 二 プ モ タ と、 トラサイク 系 剤を ガ ドとする セプタ に負の転 子を連結して成る
子とを含む ット ( ) セプタ のための 列を含 む 域を伴 三のプ タ を含む、 目的遺伝子を発現さ るため の ットを含 、 上記 ( ) ( ) の ットが 相互にイ ス タ によ 離されて ることを特徴とする クタ である。
記の 一のプ タ 、 第二のプ タ 三のプ タ は相 互に異なるプ タ であることが好まし 、 前記 一のプ モ タ は組織 プ タ であり、 前記 二のプ モ タ が組織 プ タ であることが好まし 。プ タ の 体例としては、例えば、ウイ ス( 、 サイ トメガ ウィ ス (C V) 、 血病ウィ ス、 Cウィ ス ウィ など) 伝子プ タ 、 各種 ( 、 ヒ ト、 ウサギ、 イヌ、 ネ 、 モ ット、 ムスタ 、 ラット、 ウスなど) および ( 、 ワ トリなど) 来のプ モ タ などが挙げられる。
明にお て好まし は、 前記 一のプ タ 前記 二のプ モ タ はそれぞれ 一の ン サ を含んで る。 このよ に第一のプ タ 第二のプ タ にお て同一 サ を用 ることにより、 転写 子の 合を起こさ るこ ができ、 これによ 目的遺伝子の 現の 御が容易に なる。 一のプ タ の 体例としては、 C V サ とC V プ タ とを含んでなるプ タ が挙げられ、 前記 二のプ タ の 体例としてはC V サ アクチ プ タ とを含んでなるプ タ が挙げられる。
明では、 テトラサイク 系 剤を ガ ドとする セプタ に正の転 子を連結して成る 性化 子と、 テトラサイク 系 剤をリガ ド とする セプタ に負の転 子を連結して成る 子を使用する。 正の転 子の 体例 しては、 P 6 ( スウィ ス 性化 ) (Be ge SL e 990Jun2 (7) 99 208 F edma D Na e 1988 ep 2 35(6189) 52 4 T ezenbe g J e es Dev 988 J n (6) 8 29・) などが挙げられる。
負の転 子 しては、 Z ィ ガ チ を有するタン ク質の ち負の転 性を有するタ ク質を使用することができ、例えば、 n sK B (K p e assoc a edbox) などが挙げられる (Da eS n J o ed 2004 ay (5) 37 42 Sh o L e Sc 2004 a 9 74(18) 2213 25 Rev e Sek a a M N c e c c ds Res 2004Ja 2 2) 90 7 P 2004 o D B och B o hys c a 2004Ja 20 676 2) 203 9 Loo anC a m enome 2004Jan 5( 5 40 o de ance es 2003 Dec 5 63(24) 968 76 Ho anK J o Endoc no 2003 De (3) 83 96 Tan J o he 2004Feb20 279 8) 6576 87 Ep b2003Dec02 Se 0 N c e c c ds es 2003 c 5 31 20) 83 7 U a enomeB o 2003 4(10) 23 E b 2003 ep 23 u J o Ce B o 2003 0c 23(20) 7305 4 K m S N c e c c ds es 2003 c
1 31(19) 513 25 e JL H a 2003 ug (2) 21 8 acke Deve op en 2003 g 30(16) 795 805 S n UB 8 L e 2003 a (3 27 Ka a a H B oche J 2003 373(P 3) 47 57 Lako sk B Deve opmen 2003 ay 30(10) 7 28 a adaK B oche J 2003J 1 373(P ) 67 78 T ne J JB o Chem 2003
1 278 15) 2786 95 Ep b2003Jan29 onza ez La unoD Ped a Pa ho o ed 2002 Nov Dec 2 (6) 3 40 ed gno L FEBS Le 2003Jan 16 534(1 3) 3 00 Loo anC o B o Evo 2002 Dec 9(12) 18 30
Pa kH B ood 2003Feb 101 3) 894 902 E b2002 e 9 J aoK 、 o Ce B o 2002 Nov 21) 633 44 Lee TH JB o he 2002 Nov 22 7 (47 4826 37 E b 2002 Sep 7 JB o Che 2002 ug 23 7 34) 0901 3 E b 2002 ay 3 hangJ o Ce B o 2001 u 15) 5041 9 Lo e z P B o Chem 200 p 8 4) 37 44 och S o e B o 200 Ju 21 13) 4110 8 Co sT o Ce B o 200 Jun 2 ( 1 3609 5 ano K eno cs 2000 5(1 75 80 eczo ekE JB o Che 2000 p 28 275(17 2879 88 Tekk essa s N Gene 999Nov 5 40 3 22 S oneD T e Sc 999Dec 2 (P 23) 4437 48 H ang JB o he 999Ma 9 274 12) 7640 8 De g enom cs 998 c 53(1) 97 103 E se B JB o Che 997 c 3 7 (44) 27908 2 K S P oc Na cad c U 996 Dec 24 26) 5299 304 oos a P N c e c c ds Res 996 Dec
5 (24) 4859 67 zga P oc Na cad Sc U 994 ay 10 9 ( 0) 4514 8 a go nJF p oc Na cad Sc U 994 ay 10 9 ( 0 4509 3 Saue F Na e 993J 29 364(6436) 54 7 明で言 テトラサイク ン系 剤としては、 毒性が低 薬剤を使用するこ とが好まし 、 例え 、 ドキ サイク などが挙げられる。
明で用 るイ ス タ の 体例 しては ウス、 ムスタ 、 モット、 ラット、 ウサギ等の 歯類、 又は ワト 、 イヌ、 ネ 、 ヤギ、 ヒツ ジ、 ウ 、 タ、 サ 、 ヒ ト等の動 来の グ ブ イ ス タ を挙 げることができ、 特に好まし は、 ワ ト グ ブ ンインス タ ア クセッ ョ U78775 hung J・H・ 、 e 74 3) 505 514 993)) などが挙 げられる。
明の ベクタ にお て、 第三のプ モ タ の 流には、 O X 列を 入することができる。 、 C e ンビナ ゼによ て認識さ れる A である。 ここで e ビナ ゼは、 O 列に まれた
列を欠 さ る み換え 素である。 明の クタ 中に O xP 列を 入することによ 、 上記 三のプ モ タ の 流に 発現さ る き 所望の 伝子を導入することが可能になる。C e x ステムの 要を図 4に示す。 えば、 明の クタ を有 る トラ スジ ック ( ウスなど) の 宮 精巣に 。 ビ 、 o X 目的外来 伝子を連結さ た環状 を投与することによ て、 明 の クタ の 三 プ タ の 流に、 発現さ る き目的外来 伝子を導入することができる。
記した の 素を ドする はPCR法などを含む 業者に公 の 伝子ク グ 術により取得することができ、 片を適当な クタ 中に順番に 入することにより、 明の ベクタ を構築すること ができる。 明の ベクタ の 、 PCR、 制限 素処理、 ライゲ ョ 等を含む 常の 伝子組み換え技術により ことができる。
(2 明の ラ スジ ク
明のトラ スジ ック 、 上記 ( ) に記載した 明の ク タ を細胞に導入することによ て作製することができる。
、 大腸菌などの 、 又は動物 、 植物 、 酵母 など 胞の れでもよ が、 好まし は動物 である。 明で用 る ことができる動物 胞の 、 特に限定されず、 ウス ムスタ 、 モ ット、 ラッ 、 等の 歯類 来の 、 又は ワ リ、 イヌ、 ネ 、 ヤ ギ、 ヒツジ、 ウシ、ブタ、サ 、 ヒ ト等に由来する細胞を使用するこ ができる。
としては、 例え 、 、 上皮 、 、 その他 の神 来の 、 、 、 、 造血 、 免 疫細胞、 各種の えば、 肝臓、 肺、 心臓 胃、 臓、 および 膚など) の 、 筋肉細胞 ( 、 平滑 および 来の 胞を含む) 、 外分泌また は内分泌 、 、 ならびに その他の分化 能性または多分化 細胞を使用するこ ができ、 また樹立されて る各種の ( えば、 0
3 3 、 293 、 OS 、 COS 7 、 e a 、 イ ムスタ (C O) ) を使用することができる。
明の クタ の 胞 の 、 当業者に公 の 常の 伝子 によ 行 ことができる。 伝子 の 体例 しては、 例え 、 ク ト ポ ョ 、 ウム 、 ポフ ク ョ ( ク ト 薬を使用する方法 含む) 等を挙げることができる。
記 よ にして作製した 明のトラ スジ ック 胞にお ては、 テト ラサイク 系 剤が存在する場合には目的遺伝子 現が誘導され、 テトラサ イク 系 剤が存在しな 場合には目的遺伝子の 現が になる。
(3) 明の スジ ック ヒ ト
明によれ 、 上記 ( ) に記載した発現 クタ がゲノムに 入されて る、 目的遺伝子を導入したトラ ス ック ヒ ト 物を作製するための トラ ック ヒ ト 物が提供される。
ラ スジ ック 物を作製するための 当業者に公 である。 えば、 Hogan,e a , an・p a ・ng he seE b yo ・ ・ ・ Labo a。 y a a o dSp ng Ha bo Labo a o 986などを参照することができる。 来の クタ を 物 胞に導入する 最初は ウスにお て開発された ( o don e a PN S 77 7380 84 ( 980) o donand dd e Sc ence 2 4 1244 46 ( 981) Pa e andB ns e Ce 4 343 45 ( 985) B ns e e a ・ PN 82 4438 42 (1985) など) 。 明にお ても、 これらの 法 に準じて、 上記 ( ) に記載した発現 クタ がゲノムに 入されて る トラ スジ ック ヒ ト 物を作製することができる。 トラ スジ ック ヒ ト 、 目的遺伝子を導入したトランスジ ック ヒ 物を 作製するために有用である。
明の クタ がゲノムに 入されて る トラ スジ ック ヒ ト 物 例え 、 上記の クタ を受精卵などに導入するこ によ り作製することができる。
明の クタ がゲノムに 入されて る トラ スジ ク ヒ ト 、 例え 、 ヒ ト 物 精卵に上記の クタ を導入し、 精卵を偽妊娠 ヒ ト 物に移植し、 ヒ ト 物 ら発現 クタ が導入された ヒ ト 物を分娩さ ることにより作製することができ る。
ヒ ト 物としては、例え 、 ウス ムスタ 、 モッ 、 ラット、 ウサギ等の 歯類の 、 ワ トリ、 イヌ、 ネ 、 ヤギ、 ヒツジ、 ウ 、 ブタ、 サ 等を使用するこ ができるが、 作製、 育成及び 用の さなど 点 ら 見て ウス、 ムスタ 、 ット、 ラット、 ウサギ等の 歯類が好まし 、 そのなかでも が最も好まし 。
明で用 る トラ スジ ック ヒ 、 生殖 ある は とが、 ヒ ト 物またはこの 物の 生の ( まし は、 単細胞または受精卵細胞の 階で 一般に8 以前) にお て 外来性の 明の クタ を導入することによ て作出される。
精卵細胞 階における発現 クタ の 、 対象 物の およ び 胞のす てに存在するよ に 持されるよ に 。 伝子 入後の 動物の 胞にお て、 発現 クタ が存在することは、 作出動物の 代がす てその および 胞のす てに発現ベクタ が存在するこ を意味す る。 伝子を受け継 だこの種の動物の はその および 胞のす てのゲノム上に発現 クタ を有する。
明のトランスジ ック 、 交配により遺伝子を安定に保持すること を確認して、 伝子 物として通常の 境で 育することがで きる。 伝子 (g 、 明の クタ ) を相同 色体の 方に持 ザイ 物を取得し、 この 雄の 物を交配することによ す ての 伝子を過剰に有するよ に することができる。 クタ に ドされるタ ク質の発 位を同 するためには クタ の 現を 個体、 器、 組織、 細胞の ベ で観察することができる。 また、 発現 ク
ドされる タ ク質の抗体を用 た 定法によりその 現の 度を測定することも可能である。
下、 トラ スジ ック ヒ ト 物がトラ スジ ック の 合 を例に挙げて具体的に説明する。 明の クタ を クス 精卵の 前 イク イ ジ ク ョン 、 得られた 細胞を た後、 偽妊娠 ウスの 卵管に移植し、 その 物を飼育し、 まれた ウス ら前記 クタ を有する ウスを選択することにより トラ スジ ック ウス を作製することができる。 ウスの 精卵としては、例え 、 29 S C57B 6 A B c C3 SJ W 等に由来する ウス 配によ 得られるものなら任意のも を使用できる。
また、 注入する発現 クタ の数は受精卵 たり 0 3000 子が 適当である。 そしてまた、 発現 クタ を有する ウスの 、 ウスの よ Aを抽出し、 入した発現 クタ をプ ブとするドット イ ダイゼ ョ 、 特異 プライ を用 たPCR により ことが できる。
さらに 明にお ては、 上記した 明のトランスジ ック ヒ ト の ( えば、 、 細胞など) に、 oxP 列に連結された目 的遺伝子を含む を投与して、 前記 三のプ タ の 流に設けら れて る oxP に前記 的遺伝子を ぎこみ、 胞から動物を再生す ることによ て、 目的遺伝子を導入したトランスジ ック ヒ ト 物を作 製することができる。 法によ て作製される トラ スジ ック ヒ ト はその 部も本 明の 囲内である。
記した 明のトランスジ ック ヒ ト 物の 部としては、 ヒ ト 物の 細胞 器官、 組織および臓器のほ 、 頭部、 指、 手、 足 腹 部、 尾などが挙げられ、 これらも全て本 明の 囲内に属する。
下の により 明をさらに 体的に説明するが、 実施 によ て限定されるものではな 。
伝子 の クタ の
( )P 法を用 たサイ メガ ウィ スプ タ (Ph P o o e )のDN 片の ・
P 法を用 、 Ph P。。 e の 端に新規制限 サイ トを 入する れを en。・ 1とする) 。 P で使用した 、 Ph P om 。 を含有するp。 N 3 プラス クタ である。 P で使用したプライ は、 5 p e o c eo de g ac aa a age a C g Cca g Ca acg g (g 6) 3 e gon c eo de gggC cga Cacg gaagC gg a e Cga a C ag Cgg g c C c ga ggc gg a e ( 7) である。 c N 3プラス クタ をH d 素処理および 理し、H d サイ を排除した れを ec。・ とする) 。
。。 o ・ をKpn ho 素処理し、 同様に処理した。n。 入して、 ec o ・ 2を作製した。
(2) アデ グナ (po y ) の
B㎡ H nd 素処理した 40 P。 y を、 同様に処理したプラス クタ ec。・ 2 入して、 ec o ・ 3を作製した。
(3) テ ラサイク 性化 ( Te P 6) の
pUH プラス one。。h) をBa Eco 素処理し、 Te P 6を取得し、 同様の 素処理したプラス クタ ec o ・ 3 入して、 。。 o ・ 4を作製した。
(4) P 法を用 たS 40 Po y のDN 片の ・
P 法を用 、S 40Po y の 端に新規制限 サイトを 入した れを、 ene・ 2とする) 。 P で使用した 、 S 40 P。 y を含有するp。DN 3又はpT E プラス クタ である。 P で用 たプライ は、 5 p e go nuc eo de gg gga e aga Ca ga aag 8) 3 p e go
nuc eo de g g ac ggg Ccc a a c gg Cga g ga ac e
9) である。 。DN 3プラス クタ をBa H n 素処理し 同様に 処理した。n。・ 2を 入して、 ec o ・ 5を作製した。
(5) テトラサイク ン クタ
Homo Sap ens z c e P o e 0 Kox gene 523 2 の ドメイ ( B をP 法により増幅・ 離した (これをGene・ 3 とする) 。 P で使用 した 、HeLa より 出合成したcDNAである。P で用 たプライ は 5 p me o n c eo de ggg aa c aag C g ge c ( ) 3 e go c eo de gg gga c aaac ga ga ga c aaa g ag C ) である。
ene・ 3をB H nd 素処理し、 同様に処理したテトラサイク
セプタ ( e ) を含有したpB uesc p 入し、 Te K Bを作 製した れを 。 ・ 6とする)。プラス クタ ec o ・ 6をB Eco 素処理し、同様に処理したPh P。 を含有した B 。。 入し、 Ph P。・ Te K Bを作製した れを 。 。 7 とする) 。 プラス クタ ec o ・ 7を ho Ba H 素処理し、 同様に処理したプラス クタ ec o ・ 5 入して、 。。。・ 8を作製した。
(6) テトラサイク (Ph P o Te R P 6 PhC o・ Te K B Kox の
プラス クタ ec o ・ 4 8をそれぞれ ho a 素処理し、 テトラサイク ン 性化 プラス クタ e。。 4 、 テトラサイク 伝子を連結して、 ec o g
・ を作製し た。
(7) 性酸素 伝子 入した (mev ) cy 伝子の 製 れを。n。・ 4とする)
ce R ve ( 系統の ウス ) CDN を 型に、 P 法により ト ク ムb サブ ッ cy ) のク グした。 P で用 たプライ
は 5 P e go c eo de g gaa cg c cac a g g g c g a a Ca g age ( 2) 3 p e go c eo de g g aag C c aga aaa a Cag ggc gg Cag C c (g 3) である 5に より得られた、チトク ムb サブ ットの N 片をpB ues SK p as d Vec o の S u C on g S e Eco ba 入 した。大 D の ピテ トセ を作製し、そこ プラス クタ の 入を行 目的遺伝子のP 片の (サブク グ)を行 た。
性酸素 伝子 入した ev oy 伝子の 、 プライ として、 5 P me gon c eo de g gaa c c c Cca gg Cac g Cc aa gcc ( 4) 3 P me o uc e de gg aag c 。 aga aaa ca ca ggc ggc cag ccc (
5) を使用し、 上記 同様にして、 P および 入を行 、 。" c 伝 子の3 域の ク グを行 た。
作製した野生 cy 伝子 サ ク グ プラス クタ 、 Ea b 素を用 て、 m。" cy 伝子の3 域を 入して、 m 。y 伝子 長を作製した。
(8) テトラサイク ン系 伝子 ステム (T E) を用 た目的遺伝子 ( ev cy 伝子) プラス クタ の
E o b" 素処理した T Eプラス クタ ( one ech) m。"1 cy 伝子 ene・ 4を 入して、 ec o 0を作製した。
pc N 3プラス クタ をN Eco 素処理し、 サイ トメガ ウィ スプ モ ( P o o eめ を排除した cDN 3 P o・プラス クタ を作製 ( じるE。。 サイ トも 壊する) した れを、 。。 o 1とす る) 。
ec o 0を o ba 素処理し、 Te acyc ・ne ece 。 es ons・ve e e en T E) ev 。y 伝子を取得した。 これを、 同様にして ho ba 素処理した ec o 入して、 ec o 2を作製した。
9) プ タ 、 転写 域内に存在する ス メントの 果を外部よ り絶縁するため きをする遺伝子 (be a g ob n ns a o Se e ce nsu a o ) の ( ト o
P R法による nsu a o DN 片の 離した (これを e e・ 5とする) 。 P で使用した ワ c N ライブラ である。 で使用したプライ 、 5 p ・ e ・go n c eo ・de ・ g a a c ggg aca gcc ccc ccc caa ag ( 6) 3 P me go c eo de gggga a C cac ac c g C g ( 7) である。
増幅したDN 。n。・ 5をEco 素処理し、 同様にE。。 素処理したpB uesc p SK プラス クタ 入して、 。。 o 3を作製 した。 プラス クタ ec o 3をEco 素処理し取得した nsu a o を P 素処理したプラス クタ ec o 2 入し て、 ec o 4を作製した。
) Te acyc ne ece o Respo s ve e e en T E) を利用したテトラサ イクリン 伝子 ステム 長の
テトラザイクリ ( 性化 子、 抑制 ) プラス クタ ec o ・ g、 およびテトラサイク 系 伝子 ステム (TRE) を用 た目的遺伝子 ( ev cy 伝子) プラス クタ をそれぞ れ s B 素処理し、 連結して、 。。 o 5を作製した。
( ) プ モ タ 、 転写 域内に存在する ス メントの 果を外部 よ 絶縁 するための きをする遺伝子 ( nsu a oめ の ( ト 2) ns a o B esc SK プラス クタ ec o 3をEco 素処理し取得した ns a o を、 Ssp 素処理したプラス クタ ec o 5 入して、 e。 ・ 16を作製した。
( 2) プ タ 、 転写 域内に存在する ス メ トの 果を外部 よ 絶縁 するための きをする遺伝子 ( s a o ) の ( ト 3 nsu a o B esc p プラス クタ 。。 o 3をE。。
素処理し取得した ns a o を P 素処理したプラス クタ ec o 6 入して、 。 。・ 17を作製した。
( 3) プ タ 、 転写 域内に存在する ス メ トの 果を外部 より絶縁するための きをする遺伝子 ( nsu a o ) の ( ト4)
nsu a o pB esc p K プラス クタ e o 3をEco 素処理し取得した ns a o を、 Eco 素処理したプラ クタ ec o 7 入して、 テ ラサイクリ ステム 全長 ( 本化) プラス クタ ec o 8を作製した。 この ec o 8が、 電子 性酸 素 mev 製のため 伝子である。
( 4) ポ タ 白質 ( 白質 s FP) 伝子の
P 法によりn s FP DN 片を増幅 離した れをGene・ 6とする) 。 P R で使用した 、 FPを含有するpE FP プラス クタ である。 P で使 用したプライ は、 5 e go c eo de ggg c agaaa a aa C gcggc Cgc a g Ccc aa aagaag Cgc aag g g gag gac g c a g g g a aag gc a ( 8 3 P e onuc eo de ac g C C gg a e C g aca g C C a g ( 9) である。 増幅・ 離した s FP 伝子 e。・ 6を b 素処理し、 同様に制限 素処 理したテトラサイク ステム 全長 ) プラス クタ ec o 8 入して、 。。 o 9を作製した。
( 5) ポ タ 白質 u。 e ase) 伝子の
PC 法によりLuc e aseDN 片を増幅 離した れを、 ene・ 7とする) 。 P で使用した 、 L c e a eを含有したp H 0ある は C 871プラス クタ である。 PC で使用したプライ は、 5 p me gon c eo de ggg gga c a gaa ac g c aaa aac 20) 3 P e o n c eo de ggg gg ac gg Ccc a Caa g a C e gc ( 2 ) である。 増幅・ 離したL c e ase 伝子 e e 7を a B
素処理し、 同様に制限 素処理したテトラサイクリン ステム 全長 )
プラス クタ ec o 9 入して ec o 20を作製した。
( 6) 類のプ タ より二種類の N を発現することを可能にする遺 伝子配列 ( E ) の 入する
E 有の B uesc K プラス クタ をH nd No 素処 理し、 E を取得した。 これを、 同様にしてH nd No 素処理したテ トラサイク システム 全長 ( ) プラス クタ ec o 20 入して、 ec o 2 作製した。 ec o 2 、 テトラサイク ステムが nsu a o の 果によ 目的遺伝子の 現が厳密に行えることを証明するた めの 伝子 ( e acyc ne Sys em T ansgene ns a o ) Te sy 。m ep Tg ) 造を図6に示す。 基配 を配列 に示す) であ る。Te Sys e Rep Tg )の 製の 要を図 示す。また、Te acyc eSys em T ansge e s a o ) Te Sys em Re Tg ) を 7に示す。 基配列を配列 2に示す) なるプラス クタ は、 (9) ) ( 3) の 程を除 たものである。
( 7) テトラサイク 性化 T。 P 6) 現がPh プ タ によ て制御されるプラス クタ の
P 法を用 て、 be a g ob 伝子イ ト ン 2、 キソ 3 (be a g ob Sp ce D) 伝子を増幅・ 離した れを ene 8とする) 。 P で使用した 、 ウスcDN ライブラ である。 P で使用したプライ は、 5 P e go c eo de g g aga g ge aac Ca g Ca g g 22) 3 P me gon c eo de gg aa cgaa 9。。 aaa a g a g aga Cag Cac ( 23) である。 増幅・ 離した be a g ob nS ce D 伝子 ene・ 8をE。o ba 素処理し、またE o Nh 素処理したテトラサイクリ 性化 プラス クタ ec o ・ 4 入して、 。。 o 22を作製した。
( 8) テトラサイク (Te K B) の 現がPh ンサ アクチ プ タ によ て制御 れるプラス クタ の
PC法を用 たbe a ac nプ タ (be a ac nP o・) 伝子を増幅、 単離した れを。ne g
・ とする) 。 PC で使用した 、 ウス。DN ライ ラ である。 P で使用したプライ は、 5 p e gonuc eo de ggggga c acg a ga g gag c C aCg ( 24) 3 P e go nu eo de g ggaa c agagee gee g Cac g aga ag ( 5) である。 増幅・ 離したb。、 ac p。・ 伝子 。n。 9を aB b 素処理し、同様に制限 素処理した。DN 3プラス クタ 入して、 。。 o 23を作製した。
e han。。にbe a ac nP o 連結した( enha ce be a ob nP o )。 、 pcDN 3プラス クタ ec o 23、 およびbe a g ob n 伝子イ ト ン2、 キソ 3 (be a g ob nS ce D) 伝子 ene・ 8をEco ba 素処理し、 ec o 23 be a g。b nS ce Dを 入して、 ec。 24を作製した。
テ ラサイク ン プラス クタ ec o 8を N Kp 素処理し 。。 o ・ 8内に存在するpcDN 3プラス クタ の p o 排除した (これを ec o 25 する) enhance be a g ob nP o be a g ob n S ce Dを連結した ( enhance be a ob P o be a g ob Sp ce D) PcDN 3プラス クタ ec o 24をEco S e 素処理し、 同様に制限 素処理した上記 ec o 25 enh n。。 b。 a g ob nP o be a g ob Sp ce を 入した れを ec。 26とす る) 。
( 9) テトラサイク ン系 剤による遺伝子 御を厳密に行 テトラ サイク システム 全長 ( 本化) プラス クタ の
テトラサイク 性化 ( Te P 6)の 現がPh プ タ によ て制御されるプラス クタ ec o 22、 およびテトラサイク ン (Te K AB) の 現がPh enhance ac nプ 20
によ て制御されるプラス クタ ec o 26を pa o 素 処理し。。。 22 。。 o 26を連結して、 ec o 27を作製した。
プラス クタ ec o 27のPm サイ 、平滑 (Eco 素処理された) の ns a o を 入して、 ec o 28を作製した。 プラ ス クタ ec o 28をNhe N 素処理し 様にして制限 素 処理されたテトラサイク ステム 全長 ) プラス クタ ec。・ 21 入して、 。。。・ 29を作製した。 。 。・ 29は、 2 階での
子の ( enha ce の 子の 合競合およびT E のテトラサイク リ 子の 合競合) によりテトラサイク 系 伝子 現 を厳密に制御することを可能 した 明の 伝子 (Te a。y。 ne Sy 。m T ansgene Te Sys em RepTg ))である mを 8に示す Te Sys e e Tg )の 製の 要を図 および 3に示す。 Te Sys em Re Tg D )の 基配列を配列 3に示す。
また、 ev ウス 製には、 このTe acyc e Sys e T ans ene mev cy 伝子を導入したもの (Te Sy 。 。 Tg D ) 造を図9に示す。 基配 を配 4に示す を使用できる。 Te Sys em ev Tg D )の 製の 要を図4に示す。 2 伝子 の クタ の
( ) go 。。。 de 成法を用 た、 № p 2 DN 片の 成 下記に部分 を示す o P 列の0 o n c eo deを合成した。
5 go nuc eo de gga aa C Cg a a g a ac a a a Cga ac a ( 26)
3 0 go nuc eo de ga Cc ac g Cg a a a g a ac a a Cga ag a 。。9。 ( 27)
5 go nuc eo de a aa C Cg a a g a ac a a a gca a g g a g ( 28)
3 go c eo de ga cc ace a e a a a g a ac a a c a a a ccg c ( 29)
5 gon c eo de gga aa c cg a a ga ac a a cga acg g a g ( 5? 30)
3 go c eo de ga cc ace g c a a aag a cc a a cga ag a ccg c ( 3 )
5 go nuc eo de gga aa c cg a a gga ac a a gca a g g a ? 32)
?
3 go uc eo de ga cc ace a ge a a aa a cc a a cga a a ccg c ( 33
5 go c eo de gga aa c cg a a a ac a a a cga ag a g
3 go c eo de ga cca aa c cg a a a a ac a a cga ag a ccg c ( 35
5 go c eo de gg ace g cg a a a ac a a a gca ag a ( 3e
3 gon c eo de ga cca aa c cg a aa g a ac a a cga acg g a ccg c (g 37)
5 gon c eo de ga a a c a a a ac a a a cga a a g
3 on c eo de a cca aa c cg a a a g a ac a a c a a a a ccg c ( 39)
5 gon c eo de g a a a cg a a gga ac a a cga ag a g ( 40
3 gon c eo de ga cca aa c cg a a aag a cc a a cga a a a ccg c ( 4
5 3 go 。。。 deそれぞれの み合わ をPo 。。。 de K n e PNK) 2 DN とし、 № P DNA 片を合成した れを ene・ とする) 。
(2) oxP 2 DN 赤色 白質 (D 。d) 伝子の 上 作製した oxP 2 N 片を B 素処理した p s ed N プラス クタ 入して、 。。 o ・ を作製した。
(3) テトラサイク リ 系 伝子 ステム (T E) を用 た目的遺伝子 ( oxP Ds ed) プラス クタ の
oxP 2 DN D 。d が連結されたプラス クタ Ve。。 S"。 No 素処理し、 同様に制限 素処理したpB 。s。 p SK プラス クタ 入して。。。・ 2を作製した。 プラス クタ ec o ・ 2をS"。 ba 素処理し、 同様に制限 素処理したpT Eプラス クタ 入して 。。。・ 3を作製した。
(4) タ ゲット ( oxP ) を含有したテトラサイク ステム 全長 ( ) プラス クタ の
上記、 pT E oxP Ds edプラス クタ ec o ・ 3を ba ho 素処理し、同様に制限 素処理したp。DN 3プラス クタ 入して ec o 4を作製した。 記、 プラス クタ ec o ・ 4を pa Eco 素処 理し、 同様に制限 素処理したテトラサイクリ ステム 全長 ( 本化) プラ ス クタ ec o 29 入して、 ec o ・ 5を作製した。 ec o ・ 5が、 明の 的である e oxP ステム テ ラサイク 系 伝子 システムを併用するための 伝子 (Te acyc ne Sys e oxP Se e ce T ansgene) である。
タ ゲット ( oxP ) を含有したテトラサイクリ ステム 全 長 ( ) プラス クタ の 製の 要を図 5に示す。 製したT。 sys e ox D( )の 造を図 0に示し、その 基配列を配列 5に示す。
3 伝子 入と発現アッ
N H3T3 6 We プ トに ( 05~ce s we ) 養した。 12 間 の 、 無血清 地 換を行 、 遺伝子 入を行 た。 伝子
フ ク ン (L po ec a e s egen ) ( nv ogen n。・) を用 て行 た。 DN 以下の りである。
( ) ( )
c va o Te P 6 ec o 5) 500 g We
ep esso (Te K B Vec o 7) 500n We
pT E L c e ase 500 g e
p B ga 50ng e
(2) (E7)
Te Sys e e Tg 1500 g e
B ga 50ng We
(3) ( 6)
Te Sys em ep Tg ) ec o 2 ) 20 ng We
p B ga 50n e
(4) 8)
Te Sys em e Tg ) ec o 29) 20 g e
p B ga 0ng e
伝子 入後、 5 養し、 10 FBS 地を加え、 地中の (FBS) 度が5 になるよ にした。 伝子 入 ら 24 した後、 5 FB 地 換し、 さらに48 養した。 この テトラサイク 系 剤である サイク ン (D。。yC n) 地には、 Doxcyc nを最終 地とな るよ に添加した。
記の 遺伝子 入を行 た6 e P a eに 00~ 50は の ys s Bu e ( 下記に示す) を加え、 30 、 細胞 出液を回収し、 ラ ゼ 0 ク ト を下記の 行 た。
ラ ゼ では、 細胞 出液20m c o を用 、 00 の L c e ase assay B e ( 下記に示す) を加え、 ラ ゼによる 発光 度を B 2200 L escence PSN TT nc・) で測定した。 ク ト では、 細胞 液50が を用 、 0 a assay Bu e ( 下記に示す)を加え による ク トシ 性を420n 長で pec a ax 250 o ec a Dev ces)により 定した。 伝子 率の 正として、 j ク ト 性を測定しており、 シフ ラ ゼ 性の 値を ク 性の 値で割 た値が 実際の 伝子 物量 となる。 果を図 2に示 。 明の 伝子 の クタ を用 た場合、 ドキ サイク の 無により目的遺伝子の 現を制御できることが分 る。 また 明による遺伝子 御の 式を図 3に示す。 Lys s Base So
25 M T s P0 pH 7 ) 2 5
50 yce o 30
CHAPS 2 g
Lec h n L a phos hach g cho ne) g
94 7 Lys s B e
Lys s Base So n 9 47m
0 E T PH 7 ) 400
g 80
DT
0 P P SF 404
0m
L c e ase assay Bu e
200㎜ T c ne Na H PH 7 8) m
g So n 107 M 4 gC0 g( H) 5H0 a d 267㎜ 0 0 4
0 5 EDT 2/4
DTT 333
2・7㎜ oA m
4・7㎜ Luc
20 TP 265
0m
Be a a bas son
Be a a assay B e
Be a a basO so n 6
2 e ca oe hano 9 8 z
NP 98
6 上の利用 能性
明による発現 クタ にお ては、 ( ) 一のプ タ と、 テトラ サイク 系 剤を ガ ドとする セプタ に正の転 子を連結して成 る 性化 子とを含む ット ( ) 二のプ タ と、テトラ
サイク 系 剤を ガ ド する セプタ に負の転 子を連結して成 る 子 を含む ット ( ) セプタ のための を含む 域を伴 第三のプ タ を含む、 目的遺伝子を発 現さ るため ッ が一 の クタ に組み込まれて るので、 この クタ を使用することによ 、 上記3 類の クタ を含むトラ スジ ック 物を極めて効率的に作製することができる。
また、 上記3 類の のために相互に異なるプ モ タ が使用され それらの イ ス タ によ 相互に分離されて るので、 合 た発現 サ の 力が相互に絶縁され 転写 性化 子 転写 子の を相互に独立に 易に制御することができる。 更に、 転写 性化 子 の 現のためのプ タ に比 て転写 子の 現のために強力なプ タ を使用することにより、 転写 性化 子に比 て転写 子を多 発現 さ て、 ガ ドであるテトラサイク 系 物による目的外来 伝子の 現 を、 本来の 伝子の ベ にお て 易に制御するこ ができ る。 また、 明の まし 態様によれ 、 前記 一のプ タ 前記 二 のプ タ には、 それぞれ 一の サ を含めることができる。 また、 明にお ては、 上記した発現 クタ にお て、 目的の 伝子 を発現さ るための 域の 流に O P g列を挿入しておき ( 的 伝子自体は 入されて な ) 、 この クタ を動物のゲノム上にラ ダ ムに導入するこ ができる。 これにより、 動物のゲノムの の 位に外来 伝 子系が 入された の ランスジ ック 物がえられ、 それらのトラ スジ ック 物には、 元来の 伝子の 現が悪影響を受けるものや、 入した外来 伝子の 御が容易でな ものも含まれるが、 元来の 伝子の 現が影響を 受けず、 入した外来 伝子の 現の の 御を厳密に行 と同時 にその を容易に ト することができる トラ スジ ック 物を 得ることができる。
そして、 このよ トランスジ ック 物を一見得ることができれば、 目的
とする外来 伝子を O P に連結した環状の 伝子構成 を別途 意し、 この 的外来 伝子を、 目的遺伝子の 現のための 域の 流に、 P 列の み換えを介して 入することができる。 この 合、 記のトラ スジ ック 物にお ては、 外来 伝子が、 元来の 伝子の 現が影響を受けな 位 置に導入されており、し も 1 Pの み換えによる目的外来 伝子の 、 例えば、個体の 宮、 精巣 ベ にお て 易に行 ことができるので、 元来の 伝子の 現に影響することな 、 入した目的外来 伝子の 現を 容易に制御することができ、 か 広範な種類の 的外来 伝子の ずれかを導入 したトランスジ ック 物の えを容易に行 ことができる。 記の 、 明にお ては、 C eリ ビナ ゼを用 て目的外来 伝子を含む
Aを個体に導入した場合、 目的外来 伝子は 明の クタ の 目的遺伝子の 現のための 域の 流に、 O P の み換えを介して 入されるので、 元来の 色体上の遺伝子には影響を及ぼすことがな と 点を有して る。 また、 このよ に目的外来 伝子を導入した動物 体に、 C eリ ンビナ ゼのみを導入すると、 入した目的外来 伝子を除去することも 可能である。 そして、 このよ に目的外来 伝子を除去した動物 体には再度、 別の目的外来 伝子を上記 同様に導入することが可能であり、 遺伝子 入を繰 り返し ことができると 点を有して る。 さらに、 明にお ては、 イク イ ジ ク ョ を行 ことな 目的の 伝子を導入したトラ ス ジ ック 物を作製することができると 点がある。
記の 、 C e O P ステムを用 た環状 A 入の 点として は以下のものが挙げられる。
( ) 色体上 の Aの 、 の 率に比 は る に低 こと ら、 無作為な 色体上 の 入を防ぐ 果が期待 れる。 これ により、 oxP 列を有する環状 の 、 無作為な 色体上 の 入を防 ぎ、 色体上の所定の ( oxP ) の 入が期待できる。
(2) Te S s e oxPTg Dトラ スジ ック ウス の 的遺伝子の 、
テトラサイクリン系 剤の 与によりその 伝子 を抑制するこ が可能と なる。 。 P 列 入が可能なことで、 無作為 入による新たな遺伝子 欠損を招 険性を回避 、 さらに導入した遺伝子の テトラサイク 系 剤に依存 、 目的に応じた発現 を制御することが可能である。