JP2003521941A - ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 自己調節的な発現ベクターであって、逆テトラサイクリントランスアクチベーターをコードする核酸配列を含み、該核酸配列がドキシサイクリンの存在下において、プロモーターを含むtetオペロンに結合することによって、感興のタンパク質の発現を誘導する発現ベクターを提供する。前記ベクターは、遺伝子治療において、再発性の症状を示す慢性症状の治療に対する適用が見出される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、ベクター、および遺伝子治療において特別な適用もされる医薬にお
けるベクターの使用に関する。

【０００２】 真核生物細胞において機能する、転写的に制御された系を開発することは、遺
伝子治療において遺伝子発現を制御するために重要なことである。遺伝子発現を
制御するためのテトラサイクリン系は、もともと2種類のベクター「オフ」の系
として開発された。この系は、tetR、およびVP16で構成されるキメラ・テトラサ
イクリン・トランスアクチベーター（tTA）が、一つのベクターから恒常的に発
現されて、第二のベクター内のプロモーターを含むテトラサイクリン・オペロン
（tetO）に結合して、遺伝子発現を誘導する(Gossen & Bujard, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 89 5547-5551 (1992))。

【０００３】 テトラサイクリンを添加すると、テトラサイクリンは、tTAに結合してコンホ
メーション変化を誘導し、tetOにテトラサイクリンが結合するのを妨害すること
により、遺伝子発現のスイッチを切る。2種のベクターをHeLa細胞に安定してト
ランスフェクションすると、前記「オフ」系は、1000倍を超えて制御された発現
を示す。いくつかの研究において、遺伝子治療セッティングへの適用を容易にす
るオリジナルのテトラサイクリン「オフ」の系の調節が、これまでにいくつかの
研究で報告されている。

【０００４】 1つのバリエーションには、2種のベクターの成分を、自己が含まれた単一のベ
クター内に合併させることを含み、これにより、単一の細胞に2種のベクターを
導入する必要が回避される。このような併用は、レトロウイルスおよびプラスミ
ドベクターのいずれにおいても報告されている(Paulus et al, J. Virol. 70 62
-67 (1996); Lindermann et al, Mol. Med. 3 466-476 (1997))。別の改変では
、tetOプロモーターの制御下にtTAを発現させた。この自己調節的なフォーマッ
トでは、前記tTAが、それ自体の発現を制御しており、テトラサイクリンの非存
在下では、前記tTAが、tetOプロモーターと相互作用することができ、したがっ
て、ポジティブフィードバックループによって自身の発現をアップレギュレート
することができる。系にテトラサイクリンを添加した場合、前記tTAは、もはや
プロモーターと相互作用することができないので、tTAの発現は、ダウンレギュ
レートされる。自己調節的なtTA発現の利点は、テトラサイクリンの存在下にお
けるtTAの発現が低いことである。これは、恒常的に発現されたtTAによる毒作用
、およびテトラサイクリンが除去されたときに、誘導性遺伝子が高レベルで発現
することを減少するはずである。

【０００５】 tTAの自己調節的な発現は、初めは2種のベクター系として用いられ(Shockett
et al., Proc Natl Acad Sci USA 92: 6522-6526 (1995))、後に、自己含有ベク
ターに組み込まれた(A-Mohammadi & Hawkins Gene Therapy 5: 76-84 (1998); H
ofmann et al., Proc Natl Acad Sci ; 93: 5185-5190 (1996))。前記「オフ」
系では、tTAの自己調節により、抗生物質の非存在下においてtTAが、高レベルで
発現された。しかし、tTAは、細胞内レベルで高い「鎮圧」効果を有すると推論
されている(Gossen & Bujard, Proc Natl Acad Sci US. 4 ; 89: 55475551 (199
2))。自己調節的なベクターによる高レベルのtTAの継続的な発現が、増殖、およ
び細胞周を含む細胞機能に有害であることを示す研究によって、実際に、この見
解が指示された(Gallia & Khalili, Oncogene ; 16: 1879-1884 (1998))。対照
的に、テトラサイクリンの存在下で維持した細胞は、通常の増殖特性を示した。

【０００６】 tTAの毒作用は、通常VP16成分の潜在的な「鎮圧」効果に起因するが、tetR成
分もこれらの効果に寄与しているかもしれない。トマト植物においてtetRの発現
を検討した研究では、高レベルのTnlOが、閾値レベル以上のtetRをコードするこ
とを示し、葉クロロフィル含有量、葉サイズ、および根乾燥重量の減少を含む毒
作用を示した(Corlett et al., Plant, Cell and Environment ; 19: 447-454 (
1996))。面白いことに、砂にテトラサイクリンを補うと、植物における有害な作
用がかなり減少された。

【０００７】 自己含有ベクター内のtTAの自己調節的な発現には、tTA依存的発現ユニットの
スイッチを切るためにテトラサイクリン（Tc）またはテトラサイクリン誘導体を
必要とする。Tc、および多くのTc誘導体は、遺伝子発現を停止するために必要な
低濃度では、真核細胞に対して毒性はないとしても、たとえば、トランスジェニ
ック動物を交配する際に、および遺伝子治療の際に、これらが持続して存在する
ことは望ましくない。さらに、エフェクターの除去が必要とされる場合は、遺伝
子発現の誘導がより遅くなるであろう。これは、遺伝子発現のオン／オフ動作の
速度が、役割を担う局面（たとえば、発生過程において）では不利な機能である
。

【０００８】 後に、Gossen、および同僚は、2-ベクターのテトラサイクリン「on」の系を開
発した。tTAの変異により、ドキシサイクリンの存在下において遺伝子発現を誘
導する逆テトラサイクリン・トランスアクチベーター（rtTA）が生じた(Gossen
et al, Science 268 1766-1769 (1995))。

【０００９】 本発明の発明者は、遺伝子発現のオン／オフ動作について驚くほど迅速な速度
を示すことがわかっている系を開発した。遺伝子発現の迅速なオン／オフの切り
替えは、逆-テトラサイクリン発現ユニットを利用した自己調節的な発現ベクタ
ーを使用して達成できることが分かっている。

【００１０】 本発明の第一の側面によれば、第一の核酸構築物および第二の核酸構築物を含
む自己調節的発現ベクターであって、前記第一および第二の核酸構築物が、プロ
モーター配列およびtet-オペレーター配列（tetP）を含み；ここで、前記第一の
核酸構築物は、感興のタンパク質をコードする第一の核酸配列を含み、かつ前記
第二の核酸配列は、逆テトラサイクリントランスアクチベーター（rtTA）をコー
ドする第二の核酸配列を含み；並びにここで、第一および第二の核酸配列のそれ
ぞれが、終止配列とともに提供される発現ベクターが提供される。

【００１１】 本出願において、前記「自己調節的な発現ベクター」の用語は、核酸配列、た
とえば遺伝子をコードする任意の核酸ベクターであって、該核酸配列が発現され
ると、前記発現産物のレベルが増加または減少され、ポジティブフィードバック
またはネガティブフィードバックのいずれかを通じて、前記核酸配列の発現をさ
らにアップレギュレート、またはダウンレギュレートする核酸配列を意味する。

【００１２】 本明細書において使用されるものとして、前記「発現ベクター」の用語は、必
要に応じて、本発明の第一の側面どおりの「自己調節的な発現ベクター」を意味
する。

【００１３】 前記「ベクター」の用語は、一般にRNA、DNAまたはcDNAである任意の核酸ベク
ターをいう。

【００１４】 前記「発現ベクター」の用語は、その中に、染色体に、エピソームに、および
ウイルスに由来するベクターを含み、たとえば、細菌性プラスミドから、バクテ
リオファージから、トランスポゾンから、酵母エピソームから、挿入配列から、
酵母染色体のエレメントから、かん状ウイルス、SV40などのパポバ・ウイルス、
ワクシニアウィルス、アデノウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、仮性狂犬病ウイ
ルス、およびレトロウイルスなどのウイルスに由来するウイルス由来ベクター、
並びにプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝的エレメント（コスミド、およ
びファージミドなど）から由来するものなどの、これらの組み合わせに由来する
ベクターを含む。

【００１５】 好ましくは、前記発現ベクターは、細菌性プラスミド、たとえば細菌性プラス
ミドpGTRTLまたはpGTRTCである。pGTRTLおよびpGTRTC構築物を図1に示す。ある
いは、前記発現ベクターは、レトロウイルスベクター、たとえばM1-LUC-CMVまた
はM2-LUC CMVであってもよい。MI-LUC-CMVおよびM2-LUC CMV構築物を図1に示す
。

【００１６】 本発明のある態様において、前記ベクターは、特異的発現を提供してもよい。
このような特異的発現は、誘導性の発現、または特定のタイプの細胞にのみ、ま
たは誘導性かつ細胞特異的の両方の発現であってもよい。誘導性ベクターの中で
好ましいのは、容易に操作できる環境的因子（例えば温度、および栄養素添加剤
）によって発現を誘導できるベクターである。誘導性ベクターの中で特に好まし
いのは、化学物質（たとえば抗生物質などの化学添加剤）のレベルを変化させる
ことによって発現を誘導できるベクターである。本発明に使用するために適した
種々のベクターには、原核生物および真核生物宿主において使用するための、恒
常性および誘導性の発現ベクターを含み、これらは、当業者に既知であり、日常
的に使用されている。

【００１７】 組換え発現ベクターには、たとえば、複製起源、好ましくは構造配列を転写さ
せるための高発現遺伝子に由来するプロモーター、およびベクターに暴露した後
にベクターを含む細胞を単離できるようにするための選択可能なマーカーを含ん
でいるだろう。

【００１８】 哺乳類発現ベクターには、複製起源、適切なプロモーターおよびエンハンサー
、並びに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化領域、スプライス・
ドナー、およびアクセプター部位、転写終止配列も、並びに発現に必要な5'側方
の非翻訳配列を含んでいてもよい。好ましくは、本発明による哺乳類発現ベクタ
ーは、エンハンサー領域を欠いているものである。

【００１９】 前記プロモーター配列は、任意の最適な既知プロモーターであってもよく、た
とえば、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、CMV前初期プロモータ
ー、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、ま
たはRous肉腫ウイルス（RSV）などのレトロウイルスLTRのプロモーター、マウス
・メタロチオネイン-Iプロモーターなどの、メタロチオネインプロモーターであ
ってもよい。前記プロモーターは、プロモーター活性に必要な最小限の配列、た
とえば、CMVプロモーター（mCMV）の最小限の配列を含んでいてもよい。好まし
くは、前記プロモーターは、エンハンサーエレメントを欠いた、低い基礎レベル
で機能することができる哺乳類プロモーターである。

【００２０】 好ましくは、前記プロモーターは、第一および／または第二の核酸配列に隣接
されている。実際に、前記プロモーターは、tetオペレーター配列と第一または
第二の核酸配列の間に存在する。

【００２１】 本発明の第一の側面の発現ベクターにおけるtetオペレーター配列は、前記プ
ロモーター配列の上流に位置する七つのtetオペレーターを含んでいてもよい。
本願明細書において記載されるプロモーターの変異体（たとえば同族体またはオ
ルソログ）は、本発明の一部と考えられる。好ましくは、前記tetオペレーター
は、適切に機能するようにtetオペレーター配列に連結される。

【００２２】 若干の局面において、前記tetオペレーター配列は、転写因子が結合する部位
（この部位は、発現系における基礎活性レベルに影響を及ぼす）を欠いているこ
とが望ましい。このような局面において、前記tetオペレーターは、転写因子のG
ATA配列に結合する核酸配列を欠いていてもよい。さらに、GATA結合部位を欠い
ているtetオペレーターは、tetリプレッサー（tetR）のための適切な認識配列を
保持していてもよい。これに関して、前記転写因子は、内因性転写因子であって
もよい。

【００２３】 好ましくは、本発明の第一の側面における発現ベクターのバックボーンは、そ
れ自体のプロモーター、およびエンハンサーエレメントを欠いたベクター（たと
えばプラスミドベクターpGL2）に由来する。エンハンサーは、DNAの折りたたみ
を介して数千塩基離れたプロモーター領域に結合することが可能である(Rippe e
t al TIBS 1995; 20: 500-506 (1995))。自己含有ベクター内のプロモーターの
エンハンサーエレメント間の相互作用の場合、rtTAは、tetPがtetOエレメントに
結合することを妨害するか、または隣接するプロモーター（たとえば、CMVプロ
モーター）によりrtTAが発現するのを、何らかの方法で減少させるであろう。

【００２４】 また、前記発現ベクターは、抗生物質抵抗性などの選択可能なマーカーを含ん
でいてもよい。これは、ベクターを増やすことを可能にする。

【００２５】 本出願において、プロモーター配列、およびtet−オペレーター配列とは、「t
etP」を指す。

【００２６】 前記tetP配列は、前記第一および／または第二の核酸構築物の核酸配列に隣接
していてもよい。前記tetP配列は、前記第一および／または第二の核酸構築物の
核酸配列に、適切に実施可能に連結されていることが好ましい。実際に、前記te
tP配列は、前記第一および／または第二の核酸構築物の核酸配列の発現を制御す
る。この局面では、エフェクターの存在下において、rtTAがtetオペレーター領
域に結合して、前記第一および／または第二の核酸配列の発現を誘導する。

【００２７】 本発明の第一の側面の発現ベクターにおける第一の核酸配列は、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）転写ユニットなどのプロモーター
領域を欠いたレポーター転写ユニットであってもよい。周知のように、CAT遺伝
子の上流側の制限部位に、プロモーターを含有する断片を発現ベクターに導入す
ることにより、CAT活性の産生が生じる。これは標準的なCATアッセイによって検
出することができる。リポーター遺伝子の適用は、これらの遺伝子の表現型に関
連があり、これら遺伝子を形質転換した生物内でアッセイすることができ、かつ
たとえば、遺伝子発現を誘導および／または抑制の解析をするために使用するこ
とができる。遺伝子制御の研究に使用するためのレポーター遺伝子には、その他
の既知のレポーター遺伝子を含み、これには以下のレポーター遺伝子を含む；生
体発光アッセイによってアッセイすることができるルシフェラーゼをコードする
lux遺伝子、組織化学的なテストによってアッセイすることができるp-グルクロ
ニダーゼをコードするuidA遺伝子、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラー
ゼをコードするaphIV遺伝子（これは、形質転換された生物のハイグロマイシン
耐性をテストすることによってアッセイできる）、ジヒドロ葉酸レダクターゼを
コードするdhfr遺伝子（これは、形質転換された生物のメトトレキセート耐性を
テストすることによってアッセイできる）、ネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼをコードするネオ遺伝子（これは、形質転換された生物のカナマイシン抵抗
性をテストすることによってアッセイできる）、およびβガラクトシダーゼをコ
ードするlacZ遺伝子（これは、組織化学的なテストによってアッセイすることが
できる）。lux遺伝子を除き、これらのリポーター遺伝子はどれも、大腸菌から
得ることができる。前記lux遺伝子の供与源は、発光細菌Vibrio harveyiiおよび
V. fscheri、ホタルPhotinus pyralis、並びに海生生物Renilla reniformisを含
む。あるいは、第一の核酸配列は、感興のタンパク質をコードしてもよい。前記
感興のタンパク質は、治療的なタンパク質であってもよく、これらには、成長因
子、分化因子、ペプチドホルモン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP
）、もしくはアルカリホスファターゼ（ALP）などの酵素、プロテインキナーゼ
、構造タンパク質、サイトカイン、抗原（たとえばＨＬＡ抗原）、補体系のタン
パク質成分、または任意の生物学上活性タンパク質（たとえば受容体、イムノグ
ロブリン、もしくは「レポーター」タンパク質）、またはその生物学的に活性な
いずれの断片も含むが、これに限定されない。好ましくは、前記第一の核酸配列
は、治療的なタンパク質である可溶性補体受容体Iをコードする。

【００２８】 本発明の第一の核酸配列をコードするDNAは、一本鎖、または二本鎖であって
もよい。一本鎖DNAは、コーディング鎖もしくはセンス鎖であってもよく、また
は非コーディング鎖またはアンチセンス鎖であってもよい。治療的な使用におい
ては、前記第一の遺伝子は、治療する患者において発現することができるような
形態である。

【００２９】 本発明の第一の側面における終止配列は、ポリアデニル化シグナルをコードす
るアデニル化されたヌクレオチドの配列であってもよい。典型的には、前記ポリ
アデニル化シグナルは、治療すべき被験者において認識可能である。たとえばヒ
トの治療においては、SV40ウイルスなどのウイルス由来の対応する配列などがあ
る。その他の終止シグナルは、当業者に周知のものであり、これらを使用しても
よい。好ましくは、前記ポリアデニル化シグナルは、前記発現ベクターの第一の
遺伝子と第二の遺伝子の間に位置するRNA転写の双配向性のターミネーターであ
る。前記終止シグナルは、simian40ウイルス（SV40）のポリアデニル化シグナル
（たとえばSV40後期ポリ(A)）であってもよい。あるいは、前記終止配列は、ウ
シ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル（これは、CMVプロモーターと併用し
た場合に発現が最大となる）であってもよい(Yew et al. Human Gene Therapy ; 8: 575-584 (1997))。

【００３０】 加えて、前記発現ベクターは、さらなるポリアデニル化配列（たとえばSV40初
期ポリ(A)）を含んでいてもよい。このような、さらなるポリ(A)は、第一の遺伝
子の上流に位置して、潜在的な転写を減少するであろう。このような転写がベク
ター内で開始されることによって、ベクターによる基礎遺伝子発現が最小となる
はずである。

【００３１】 前記発現ベクターの第二の核酸配列は、逆テトラサイクリントランスアクチベ
ーター（rtTA）をコードし、かつVP16部分に融合された変異Tetリプレッサーで
ある逆Tetリプレッサー（rTetR）から成っていてもよい(Gossen et al, Science
268 1766 1769 (1995))。逆トランスアクチベーター（rtTA）が、DNA特異的に
結合するためには、エフェクター分子（これは、テトラサイクリンまたは特定の
テトラサイクリン誘導体である）を必要とする。前記エフェクターは、クロルテ
トラサイクリン、オキシテトラサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンま
たはドキシサイクリンであってもよい。好ましくは、前記エフェクターは、ドキ
シサイクリン（Dox）である。典型的には、細胞内でrtTAを活性化して、自己調
節的な発現ベクター内のtetオペレーター・エレメントに結合するために必要なD
oxの濃度は、l0ng/mlより高く、好ましくはl0ng/ml〜1μg/mlの間、たとえば50n
g/mlから900ng/ml間、100ng/ml〜800ng/mlの間、200ng/ml〜700ng/mlの間、300n
g/ml〜600ng/mlの間、または400ng/ml〜500ng/mlの間である。

【００３２】 一般に、前記エフェクター分子は、rtTAが、tetオペレーター配列に結合する
かどうかを決定する。適切なエフェクターの非存在下では、rtTAが、tetオペレ
ーター配列に結合しないので、第一および／または第二の核酸配列の転写活性化
を妨害する。対照的に、適切なエフェクターが存在する場合には、tetオペレー
ター配列が、rtTAに結合して、プロモーター配列から第一および／または第二の
核酸配列の転写が生じるであろう。

【００３３】 本発明の第一の側面における発現ベクターは、第一のtetPがセンス配向性であ
り、かつ第二のtetPがアンチセンス配向性であるように配置されることが好まし
い。前記二種の制御可能なプロモーターと正反対のプロモーターは、エフェクタ
ーを除去した後、自己調節を介してrtTAレベルを減少するので、容易にそれ自体
をダウンレギュレーションするであろう。

【００３４】 本発明の第一の側面における自己調節的な発現ベクターは、好ましくは、エフ
ェクターの非存在下では、rtTAの基礎レベルを低くさせ、エフェクターの存在下
では、ポジティブフィードバックを介してrtTAレベルの増加を引き起こすこし、
これにより前記第一の核酸配列を自己調節的に発現する。

【００３５】 この系においては、Doxなどのエフェクターの非存在下において、低レベルの
発現を生じることが好ましい。一般に、エフェクターの存在下において、迅速に
遺伝子発現が、「スイッチオン」され、エフェクターを除去した後には、迅速に
遺伝子発現が、「スイッチオフ」される。

【００３６】 本発明の第一の側面における一つの態様は、第一の遺伝子配列に実施可能に連
結された第一の誘導可能なプロモーター配列、第二の遺伝子配列に実施可能に連
結された第二の誘導可能なプロモーター配列、前記第一および第二の遺伝子配列
に操作可能に連結された終止配列を有するDNA分子であって、センス配向性の第
一のプロモーター配列、アンチセンス配向性の第二のプロモーター配列が、該プ
ロモーター配列が誘導可能に転写されたときに、該遺伝子配列の同時転写を提供
するDNA分子を提供する。

【００３７】 本発明の第二の側面において、本発明の第一の側面における自己調節的な発現
ベクターを含む発現系を提供する。前記発現系には、一以上の宿主細胞を含んで
いてもよい。

【００３８】 前記自己調節的な発現ベクターのための適切な宿主細胞の代表例には、連鎖球
菌（streptococci）、ブドウ球菌（staphylococci）、大腸菌（E. coli）、スト
レプトミセス（streptomyces）、および枯草菌（Bacillus subtilis）などの細
菌細胞；酵母細胞、たとえばサッカロミセスセレビシエ（Saccharomyce cerevis
iae）、およびアスペルギルス（Aspergillus）細胞などの真菌細胞；ショウジョ
ウバエS2、およびSpodoptera Sf9細胞などの昆虫細胞;CHO、COS、C127、3T3、BH
K、293、およびBowes黒皮腫細胞、およびその他の適切なヒト細胞などの動物細
胞;および植物細胞を含む。

【００３９】 好ましくは、前記発現系の宿主細胞は、低いtetP基礎活性が観察される哺乳類
細胞である。前記tetP基礎活性は、使用する哺乳類の細胞タイプに依存しており
、いくつかの細胞株において、高い遺伝子基礎発現が観察されたことが以前に示
されている(Freundlieb et al., J Gene Med ; 1: 4-12 (1999))。

【００４０】 宿主細胞内に発現ベクターを導入するには、リン酸カルシウムトランスフェク
ション、DEAE−デキストランを介したトランスフェクション、マイクロインジェ
クション、カチオン性脂質を介したトランスフェクション、エレクトロポレーシ
ョン、トランスダクション、スクレープ・ローディング、その他の方法による感
染によって行えばよい。このような方法は、Sambrook et al., Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, C
old Spring Harbor, N. Y. (1989)などの多くの標準的な実験マニュアルに記載
されている。

【００４１】 成熟したタンパク質は、CHO細胞などの哺乳動物細胞、酵母、細菌またはその
他の細胞を、適切なプロモーターの制御下に含む宿主細胞に発現することができ
る。このようなタンパク質を産生するために、本発明の発現ベクターに由来する
RNA'sを使用した無細胞翻訳系を使用することができる。原核、および真核宿主
に使用するための適切なクローニングベクター、および発現ベクターは、Sambro
ok et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)に記載されてい
る。

【００４２】 第三の側面において、本発明は、ヒトを含む哺乳類などの患者を治療する方法
であって、本発明の第一の側面の自己調節的な発現ベクター、または本発明の第
二の側面の発現系を、被験者に投与することを含む方法を提供する。

【００４３】 本明細書において使用されるものとして、前記「治療」の用語には、ヒト、ま
たは非ヒト動物に有益となるいずれの療法も含む。前記治療は、既存の症状もし
くは疾患に関するものでもよく、または予防的（防止的な治療）であってもよい
。前記治療は、遺伝性、または後天性の病気の治療であってもよい。前記治療は
、急性または慢性の症状の治療であってもよい。好ましくは、前記治療は、再発
性症状を伴う慢性症状の治療である。本発明の第一の核酸配列は、嚢胞性線維症
、癌、血友病、X病関連SCID、ハンチントン舞踏病、アジソン病またはグレーブ
ス病を含む遺伝的疾患の治療に使用するためのタンパク質をコードしていてもよ
いが、これに限定されない。また、遺伝的障害の定義に該当するその他疾患も、
本発明によって意図され、これら疾患には、リウマチ様関節炎、真性糖尿病もし
くは尿崩症、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー型痴呆、
パーキンソン病、クローン病、またはいずれの炎症性疾患を含むが、これに限定
されない。

【００４４】 本発明の、第一の側面による自己調節的な発現ベクターまたは第二の側面によ
る発現系は、遺伝子治療を介して、本発明の方法において治療的に使用されても
よい。

【００４５】 治療に使用するために、本発明の第一および第二の核酸配列は、一般に、発現
のために第一のtetP配列に操作可能に連結されるように、標準的な技術を使用し
てベクターに挿入してもよい。核酸配列をin situで発現させるためのプロモー
ターは、望ましくは治療される被検者において認識されるべきである。

【００４６】 第一の側面の自己調節的な発現ベクター、または第二の側面の発現系を投与す
ることは、物理的方法によって標的部位に直接おこなってもよい。このような例
には、「裸の」の核酸ベクターを適切な媒体、たとえばリン酸緩衝食塩水などの
薬学的に許容可能な賦形剤の水溶液として局所的に投与すること、または当業者
に既知の方法によって粒子衝撃などの物理的方法によってベクターを投与するこ
とを含む。

【００４７】 核酸を直接レシピエントに投与するためのその他の物理的方法には、超音波、
電気刺激、エレクトロポレーション、およびマイクロシーディング（microseedi
ng）を含む。さらなる投与方法には、経口投与、または吸入法を介した投与を含
む。

【００４８】 特に好ましいものは、遺伝物質を患者の細胞にin situでデリバリーするため
の系であるマイクロシーディング法である。この方法は、米国特許番号5,697,90
1に記載されている。

【００４９】 また、本発明の発現ベクターは、デリバリーベクターによって投与されてもよ
い。これらには、ウイルスデリバリーベクター（アデノウイルスまたは当業者に
既知のレトロウイルスデリバリーベクター）を含む。

【００５０】 その他、非ウイルス性のデリバリーベクターには、脂質デリバリーベクターを
含み、これには、当業者に既知のリポソームデリバリー媒体を含む。

【００５１】 また、前記投与は、形質転換された宿主細胞を介して行ってもよい。このよう
な細胞には、被検者から回収した細胞を含み、当業者に既知の遺伝子導入方法に
よって核酸を該細胞に移入させた後、培養液中で形質転換細胞を増殖させて、被
検者に移植する。

【００５２】 本明細書において使用されるものとして、前記「遺伝子治療」の用語は、体細
胞の組換え遺伝子工学によって、病気を引き起こす遺伝子を直すこと（体細胞遺
伝子療法）をいう。さらに、遺伝子治療は、ex vivo、およびin vivoにおける技
術に分けることができる。Ex vivo遺伝子治療とは、患者から体細胞を除去して
、該除去した細胞をベクターで処理して、その後、前記患者に処理細胞を戻す治
療をいう。In vivo遺伝子治療とは、組換え遺伝子ベクターを、たとえば経静脈
、または筋肉内注射によって直接投与する治療をいう。

【００５３】 本発明の遺伝子治療法は、ex vivoで行われることが好ましい。

【００５４】 遺伝子治療において、本発明の発現ベクターは、治療すべき被験者において発
現されるように投与されることが好ましい。したがって、ヒト遺伝子治療におい
ては、前記プロモーターが、ヒトCMV由来のプロモーターなど、ヒト遺伝子に由
来するか、またはヒトにおいて典型的に発現されている遺伝子に由来するヒト・
プロモーターであることが好ましい。

【００５５】 本発明は、遺伝子治療のために、ヒトおよび非ヒト哺乳類の体細胞を操作する
方法を提供する。

【００５６】 したがって、本発明は、治療的なタンパク質をヒトに供給するための方法であ
って、哺乳動物細胞をヒトに導入することを含み、前記ヒト細胞は、本発明の第
一の側面にしたがって治療的なタンパク質をコードする自己調節的な発現ベクタ
ーを該ヒト細胞に挿入するために、in vitroで処理されており、前記ヒト細胞は
、該ヒトにおいてin vivoで治療上有効な量の治療的タンパク質を発現する方法
を提供する。

【００５７】 また、Ex vivo体細胞遺伝子治療法の個々の工程は、それぞれ本発明によって
カバーされる。たとえば、患者から除去した細胞を、本発明の発現ベクターまた
は発現系により処置する工程である。本明細書において使用されるものとして、
「処置された細胞」の用語は、組換えベクターで形質転換された細胞をカバーす
る。

【００５８】 また、遺伝的疾患を治療するための薬剤を製造する際にトランスフェクション
された細胞を使用することも意図される。

【００５９】 本発明の第四の側面では、本発明の第一の側面による発現ベクター、および遺
伝子治療において同時に、別々に、または連続して使用するための併用製剤とし
て第二のDNA分子を含む発現ベクターを含む製品を提供する。好ましくは、第二
のＤＮＡ分子は、本願明細書において記載された感興のタンパク質をコードする
核酸配列を含む核酸ベクターである。前記核酸配列は、プロモータ-tetオペレー
ター配列（tetP）、および終止配列に連結されていてもよい。前記プロモーター
は、いずれの適切なプロモーター（たとえばヒト−サイトメガロウイルス（CMV
）プロモーター）であってもよい。好ましくは、前記プロモーターには、プロモ
ーター活性に必要な最小限の配列（たとえばmCMV）を含む。

【００６０】 前記核酸配列は、「レポーター」タンパク質であるタンパク質をコードしてい
てもよい。これには、第二のＤＮＡ分子を、本発明の第一の側面による機能的な
自己調節的発現ベクターの正確なマーカーとして使用することができる。あるい
は、前記核酸配列は、本願明細書において記載された治療的なタンパク質である
タンパク質をコードしてもよい。

【００６１】 典型的には、前記第二のＤＮＡ分子は、細菌性プラスミドであり、該DNA分子
の誘導は、本発明の第一の側面による自己調節的な発現ベクターからのrtTAの発
現に依存するか、または第一のＤＮＡ分子の終止コドン、および第二のＤＮＡ分
子の開始コドンの後に位置しているであろう内部リボソーム導入部位（IRES）を
使用して、共発現される。

【００６２】 治療的なタンパク質をコードする2種の核酸配列のいずれの発現をも同時に制
御することは、第四の側面（前記第二のＤＮＡ分子が、治療的なタンパク質をコ
ードしている）の製品の投与によって達成されるであろう。このような2種の核
酸配列の同時制御された発現は、多くの治療的局面において幅広く応用される可
能性を有するが、前記遺伝子産物が、付加的または相乗的な効果を有するといっ
た利益が、最適な利益であろう。

【００６３】 本発明の第二、および次の側面の好ましい特徴は、第一の側面のmutadis muta
ndisに関するものである。

【００６４】 本発明の第一の、第二の、および第三の側面の好ましい特徴は、すべて本発明
の第四の、および次の側面であるmutadis mutandisに適用する。

【００６５】 再発性症状を有する慢性症状を治療するために遺伝子治療を適用するには、発
現系が必要である。特に、治療的タンパク質の発現を、再発の生じた期間に制限
して、治療的タンパク質が長期間発現することによって起こりうる副作用を防止
するために、調節系が必要である。

【００６６】 本発明の自己調節的な発現ベクターは、治療的タンパク質をコードする核酸の
発現をかなりの程度制御するという調節性の特性を示し、細胞を治療的なタンパ
ク質に長期間暴露されないことを保証する。

【００６７】 したがって、本発明の第五の側面は、医薬に使用するための、好ましくは遺伝
子治療のための、本発明の第一の側面による自己調節的な発現ベクター、または
第二の側面による発現系を提供する。

【００６８】 本発明の第六の側面は、遺伝的疾患の治療するための薬剤の製造における、本
発明の第一の側面による自己調節的な発現ベクター、または第二の側面による発
現系の使用を提供する。

【００６９】 また、本発明は、本発明の第一の側面による自己調節的な発現ベクター、また
は第二の側面による発現系を含む組成物に関する。したがって、本発明の発現ベ
クター、または発現系は、薬学的に許容可能な担体または担体類と組み合わせて
使用してもよい。

【００７０】 このような担体には、塩類溶液、緩衝食塩水、デキストロース、リポソーム、
水、グリセリン、エタノール、およびその組み合わせを含んでいてもよいが、こ
れに限定されない。

【００７１】 本発明の自己調節的な発現ベクターもしくは発現系は、単独で、または治療的
な化合物などその他の化合物とともに使用してもよい。

【００７２】 前記医薬組成物は、患者の病気を治療するために有効な、効果的で、便利ない
ずれの方法（たとえばその中には、経口、局所的、静脈内、筋肉内、鼻腔内、ま
たは皮内の経路によって投与することを含む）で投与されてもよい。治療におい
て、または予防として、前記活性な薬剤を、注射可能な組成物として、たとえば
、滅菌水溶性分散液（好ましくは等張性）として個体に投与してもよい。

【００７３】 哺乳類、特にヒトに対して投与するには、前記活性な薬剤の一日の用量は、O.
Olmg/kg体重以上、典型的にはlmg/kgあたりであろうと予想される。いずれにし
ても、個々の年齢、重量、および応答を含む因子に依存して、個々に最も適切な
実際の用量を医師が決定する。上記用量は、平均的な症例における一例である。
もちろん、これより高いか、または低い容量が適正であってもよく、このような
場合も本発明の範囲内である。

【００７４】 また、本発明は、本発明の第一の側面による自己調節的な発現ベクター、また
は第二の側面による発現系、および投与媒体（経口投与のためのタブレット、肺
投与のための吸入器、および静脈内投与のための注射可能な水溶液を含むがこれ
に限定されない）を含むキットを提供する。

【００７５】

【実施例】

本発明は、ここで以下の非限定的な実施例に関して記載する; 実施例1−ベクターの調整およびクローニング 細胞 温度感受性のT抗原で不死化した初代胚性線維芽細胞であるDBA tst線維芽細胞
（DTF）は、以前に記載した通りに、10%のFCS、ペニシリン（100U/ml）、ストレ
プトマイシン（100μg/ml）、および2mmグルタミンを補ったDMEM中で培養さした
(Triantaphyllopoulos et al, Gene There32 5 253-263 (1998))。レトロウイル
スのゲノム細胞株GP+E86は、同じものを補ったDMEM中で維持した。

【００７６】 クローニングストラテジー プラスミドpUHG17-1、pUHDlO-3、およびpUHC13-3は、Gossen、およびBujard(U
niversitat Heidelberg, Germany)によって寛大に提供された。

【００７７】 レトロウイルス構築物は、以前に記載したmini MFG murine Moloneyレトロウ
イルスベクター(Neve et al, Cytokine 8 365-370 (1996))を基にした。サイト
メガロウイルスの前／初期プロモータ-rtTAカセット（CMV-rtTA）は、Xho 1-平
滑-BamH1断片として、pUHG17-1から切除して、Bst X1-平滑-Bam H1で切断したmi
ni MFGにクローン化して、ベクターMFGCMVrtTAを生じた。

【００７８】 最小CMVプロモーターの上流に位置するテトラサイクリンオペロン（tetP）の7
回繰り返しを、Xho 1-Eco R1で消化することによってpUHDlO-3から除去して、平
滑化し、pBluescript II KS (Stratagene Inc. La Jolla, CA, USA) にサブクロ
ーン化した。

【００７９】 tetPカセットを下流のマルチクローニングサイト（MCS）とともに、Xho 1-Xba
1制限切断によってpBStetから除去して、平滑化し、Bgl IIリンカーで結して、
Bgl IIで切断して、Bam Hlで切断したMFGCMVrtTAにクローン化した。MGTT-1、お
よびMGTT-2の2つのベクターが得られた。これらベクター内のtetPは、それぞれ
センス、およびアンチ・センス方向でrtTAの下流に位置している。

【００８０】 ルシフェラーゼは、pGL2ベーシック(Promega Corp., Madison, USA)からMGTT-
1、およびMGTT-2にクローン化した。BamHI、およびBgl IIで切断することによっ
て、下流のSV40非翻訳領域、およびポリ(A)と一緒にルシフェラーゼをpGL2ベー
シックから切除して、およびBamH1で線状にしたレトロウイルスベクターにクロ
ーン化して、M1-LUC-CMV、およびM2-LUC CMVと呼ばれるベクター（図1）を作製
した。

【００８１】 自己含有誘導性プラスミド、および中間体サブクローンは、すべてpGL2ベーシ
ックをバックボーンとして構築した。mCMV内の制限部位Bbs Iは、全長CMV I/E、
およびtetPプロモーターに共通であり、自己調節的なrtTAユニットを構築する際
に利用した。

【００８２】 プラスミドpUHC13-3を、Xho 1、およびBBS Iで切断して、放出された断片を、
Xho I-BBS Iで切断したpUHG17-1内のrtTAの上流に挿入して、プラスミドpRTを作
製した。前記CMV-rtTA、およびtetP-rtTAカセットは、それぞれpUHG17-1、およ
びpRTからXho I−BamHIで切断することによって除去して、3'-5'向きでpGL2ベー
シックのSal-1-BamHl部位に挿入し、pGR、およびpGTRと名付けたベクターが得ら
れた。その後、前記プラスミドpUHC13-3において、Xho IでtetPの5'およびCla I
でルシフェラーゼの3'末端を切断した。このカセットをXho I-Cla Iで切断したp
GR、およびpGTRの両方にクローン化することによって、全身のルシフェラーゼ遺
伝子を再構成した。得られた構築物をそれぞれpGRTL、およびpGTRTL（図1）と呼
ぶ。

【００８３】 前記誘導性ルシフェラーゼ・プラスミドpGTLは、pUHC13-3と同等であるが、pG
L2をバックボーンとする。このpGTLは、pGL2ベーシックをXho I-Cla Iで切断し
、同じ酵素で切断されたpUHC 13-3由来のtetP-ルシフェラーゼカセットをライゲ
ーションすることによって構築した。

【００８４】 pGL2ベーシックバックボーンのMCSの上流にtetPを有するプラスミドpGTは、pU
HC 10-3と同等であり、Bst XI-平滑-Xho Iによって、pBStetからtetP-MCSカセッ
トを除去して、これを、Xho I-EcoRVで切断することによって除去したtetPルシ
フェラーゼカセットを有するpGTLに挿入することによってクローン化した。

【００８５】 また、増強緑蛍光性タンパク質（EGFP）を発現する誘導性ベクターpGTEGFPは
、EcoRI-Not Iで切断することによって、pEGFP-1（Clontech, Palo Alto, Calif
ornia, USA)からEGFP遺伝子を除去することによって作製し、同じ酵素で切断し
たpGTに挿入した（図1）。

【００８６】 前記レトロウイルスベクターMFG-CR1（これはsCRIの切断型を発現する）は、s
CRl遺伝子を得るために使用した。Nco 1-平滑化-Not Iで切断することによって
、このベクターから前記sCRl遺伝子を除去して、EcoRV−NotIで切断したpGTベク
ターにクローン化して、誘導性ベクターpGTC1を形成した。sCRlを発現する自己
調節的ベクターは、pGTCIからtetP-sCRIカセット（Nhe I-Bsp MIで切断した）を
移すこと必要とし、および同じ酵素で切断したpGTRTLにクローン化して、自己調
節的ベクターpGTRTC（図1）を生じた。

【００８７】 DNAの製法 ラージスケールにおけるDNAの製法は、標準的な塩化セシウム法によって行っ
た(Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory Press, USA, second edition: (1989))。精製したDNAを殺菌
蒸留水中に再び懸濁して、DNA濃度を260nmの吸光度を計測することによって決定
した。

【００８８】 実施例2-細胞トランスフェクション研究 方法 一過性トランスフェクション 自己含有ベクターの誘導特性を比較するために、一過性トランスフェクション
を使用した。6穴プレートに0.25-0.5x10⁶細胞/ウェルでDTFをまいた。次の日、
プラスミド発現の正確な比較を確実に行うために等モルのDNAを使用して、プラ
スミドで細胞をトランスフェクションした。DNAは、細胞に添加する20分前にリ
ン酸カルシウムを添加して、30分間室温においてインキュベートして、沈殿させ
、次いで4mlの培地を添加して、37℃/10%CO₂において一晩インキュベートした。
その翌日、浸透圧衝撃を行った。簡潔には、培地をプレートから除去して、500
μlの10%のグリセリン無血清培地をプレートに穏やかに添加し、細胞とともに4
分間、プレートを穏やかにティルティングしてインキュベートした。次いで、細
胞を3mlの血清フリー培地で二回洗浄して、次に細胞を、Dox（1μg/ml）を含む
か、または含まない3mlの培地で一晩培養した。24〜72時間後において、細胞ラ
イセートまたは上澄みのいずれかにおけるタンパク質発現を測定するときに、実
験を終了した。

【００８９】 恒常性トランスフェクション トランスフェクションのための細胞を9cmのプレートに5x10⁶細胞/プレートで
まいた。次の日、誘導性レトロウイルスベクター（20μg）および選択構築物pSC
2Neo(Southern et al, J. Mol. Appl. Genet. 1 327-341 (1982)) （1μg）、ま
たは誘導性プラスミドベクター（20μg）および選択構築物pTK−Hyg(Clontech,
Palo Alto, California, USA)（1μg）のいずれかで細胞をトランスフェクトし
た。

【００９０】 実施例1に記載したとおり、誘導性プラスミドベクターは、20μgの単一の自己
調節的ベクター（すなわちpGTRTL）単離体で、または10μgの自己調節的および
誘導性ベクター（すなわちpGTRTC、およびpGTEGFP）と組み合わせてのいずれか
で、トランスフェクションした。上述の通りにDNAを沈殿して、10%グリセリンで
細胞を処理した。次の日、細胞を1から5個に分けて、通常の培地で24時間培養し
た後、選択抗生物質G418(1mg/ml) (Life Technologies Inc, Paisley, Scotland
)またはハイグロマイシンB(200ug/ml) (Calbiochem Novabiochem Corp, La Joll
a, CA, USA)をそれぞれ補った通常培地で培養することによって選択を開始した
。選択培地を週に二回変えて、3週後に単一クローンが見えた。

【００９１】 PBSでプレートを洗浄して、オートクレーブされたトリプシン／EDTAに浸した3
MMペーパーの円盤を、目に見えるクローン上におくことによってクローンを単離
した。プレートをインキュベーターに戻して4時間後、前記ペーパーを1mlハイグ
ロマイシン選択培地を含む12ウェルプレートのそれぞれのウェルに移した。Dox
で誘導可能なsCR1の発現を調べる前に、クローンを約70％コンフルエントまで培
養するか、またはルシフェラーゼ発現を調べるために三つに分けた。安定コロニ
ーの遺伝子調節速度は、細胞を6ウェルまたは12ウェルプレートに1×10⁵-2.5x10 ⁵ 細胞／ウェルでまくことによって行い、遺伝子発現を6時間から72時間までの時
点で評価した。

【００９２】 DTF-GTRTLクローン10によるルシフェラーゼ発現の「オン」および「オフ」速
度を評価した。プレーティングの前に、培地中にDox（1μg/ml）を含むか、また
は含まない培地中で細胞を72時間培養した。次いで、同じ培地中に細胞を6ウェ
ルプレートに2.5×10⁵／ウェルでまき直した。次の日、誘導および非誘導細胞の
3ウェルを、反対の培地に72時間入れ換えた。二日後、誘導および非誘導細胞の3
ウェルを、反対の培地にそれぞれ48時間および24時間入れ換えた。ルシフェラー
ゼの発現を以下の通りに測定した。

【００９３】 pGTRTCで恒常的にトランスフェクションされたDTFによるsCRl誘導を評価した
。ハイグロマイシン培地において選択することによって単離したクローンを、6
ウェルプレートに2.5×10⁵細胞/ウェルでまいた。次の日、3ウェルの細胞をDox
（1μg/ml）を含む培地で誘導し、かつ非誘導細胞を通常の培地（3ml）中で維持
した。48時間後の培地中のsCR1レベルを、ELISAによって測定した（以下を参照
）。

【００９４】 CTRTCクローン10によるsCR1発現の「オン」および「オフ」速度を評価した。
この実験を12ウェルプレートにおいて、誘導細胞および非誘導細胞を1×10⁵細胞
/ウェルで行ったことを除いて、上述したとおりのルシフェラーゼ「オン」/「オ
フ」の発現速度と同様の方法で、前記実験を行った。さらに、sCR1は、細胞から
分泌されるので、sCR1を測定するために24時間間隔で培地を除去して、Dox（1μ
g/ml）を含む、または含まない等量の新鮮な培地を再び加えた。

【００９５】 DTF-GTRTC+GTEクローン21におけるsCR1およびEGFPの誘導を評価した。1mlの通
常培地中に、1×10⁵細胞/ウェルの細胞を12ウェルプレートにまいた。次の日、3
ウェルの細胞をDox（1μg/ml）を含む培地で72時間誘導し、かつ48時間および24
時間の誘導をするために、後の二日間では、これを3ウェルにおいて繰り返した
。培地中のsCR1レベルをELISAによって測定した（以下を参照）。

【００９６】 ルシフェラーゼアッセイ 細胞ライセートにおけるルシフェラーゼ活性は、200μlの溶解バッファー(25
mM Tris-リン酸(pH 7.8)、2 mM ジチオスレイトール(DTT)、2 mM 1,2 ジアミノ
シクロヘキサン-N, N, N',-N'-四酢酸、10% グリセロール、1% トライトン X-10
0)で6ウェルまたは12ウェルプレートの細胞を、室温において溶解することによ
って測定した。不溶性物質を遠心（13000rpm、1分）でペレットにして、20μlの
上清を100μlのルシフェリン試薬 (20 mM Tris、1.07 mM (MgCO₃)、4Mg (OH)₂5H ₂ 0、MgS0₄、O.1mM EDTA、33.3mM DTT、270μM 補酵素A、470μM ルシフェリン、
530μM ATP) と混合して、10秒間に産生された光をルミノメーター(Luminoskan,
Labsystems, Helsinki, Finland,またはa MLX Microtiter (g) Plate Luminome
ter, Dynex Technologies Inc., Chantilly, Virginia, USAのどちらか)で測定
した。

【００９７】 Bradfordタンパク質アッセイ(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Califo
rnia USA)を使用して細胞ライセート中の総タンパク質濃度を測定することによ
って、ルシフェラーゼの値を標準化し、ルシフェラーゼ活性の値を、μgタンパ
ク質あたりの比光ユニット（RLU）として表した。

【００９８】 ウエスタンブロッティングおよびELISAによるsCR1の測定 ウエスタンブロッティング：クローンを70％コンフルエントに達するまで培養
し、次いで選択培地を除去して、1mlの無血清選択培地に置換した。細胞を24時
間培養し、次いで上清を回収して、1μg/mlのDoxを含む1.0mlの無血清培地に置
換した。再び、24時間インキュベーションを続け、ウエスタンブロッティングで
sCR1を測定するために10倍に濃縮した。SDSを最終濃度0.5％で上清に添加して、
メタノール（10ml）を添加する前に5分間煮沸して、-20℃においてタンパク質を
一晩沈殿させた。次の日に、前記沈殿を遠心（3000rpm/15分）でペレットとした
。上清を捨てて、前記ペレットを室温に10分間おいて乾燥した。該ペレットを再
び50μl PBSおよび50μl 2×SDSローディングバッファー(Laemmli, Nature 227
680-685 (1970))に懸濁し、次いで10分間煮沸した。

【００９９】 濃縮したsCR1サンプル（30μl）をSDS-PAGEで泳動して(Laemmli, Nature 227
680-685 (1970)) 、ニトロセルロースに転写した(Schleicher and Schuell, Das
sel, Germany)。ブロットを、室温において2時間、5％脱脂粉乳TBS(20 mM Tris-
HCI, 200 mM NaCI, 0.1% Tween 20, pH 7.5)でブロッキングした後、ブロッキン
グ溶液で1：1000に稀釈したmAb YZ1(Prof. D. Fearon, Cambridge Universityか
ら譲り受けた)と1時間インキュベートすることによってsCR1を検出した。次いで
、ブロットを高塩濃度のTBS（500mm NaCI）と3×30分洗浄して、次に1：2000に
稀釈したビオチン化抗マウスIgG(Amersham International plc, Buckingham, UK
)とインキュベートした。再びブロットを、0.01% Tween 20を補ったPBSで3×15
分洗浄した。最後に、ブロットをECL試薬(Amersham International plc)と1分間
インキュベートし、次いでサランラップでラップしてphotographic HyperfiImTM
-MP (Amersham)に暴露して可視化し、sCR1を検出した。

【０１００】 sCR1の半定量的な計測は、イメージング・デンシトメーター（モデルGS-670（
Bio-Rad））を使用して、濃度測定による計測によって行った。

【０１０１】 ELISA：通常の培地中のsCRlを直接ELISAで計測することは、我々（H. D）のう
ちの1人によって開発され、本研究を通して、標準的手法とした。PBSで1：2000
に稀釈した抗CRl mAb J3.D3(Serotec Ltd, Kidlington, Oxford, UK)によってEL
ISAプレートを4度で一晩コーティングした。次の日、1％ウシ血清アルブミン(Si
gma)のPBS溶液でプレートを2時間ブロックした。

【０１０２】 次いで、完全長sCR1(Prof. D. Fearon, Cambridge Universityから譲り受けた
)(5μg/ml〜160 pg/mlの範囲)、および標準サンプルを洗浄したプレートにロー
ドして、3時間インキュベートした。再びプレートを洗浄して、PBSで1：2000に
稀釈したポリクローナルウサギ抗血清(Dr. R. Smith, AdProtec plc, Royston,
Hertfordshire, UKから譲り受けた)を1時間することによりsCRlを検出した。

【０１０３】 第二層の検出は、抗ウサギIg、およびPBSで1：2000に稀釈したホースラディッ
シュペルオキシダーゼに結合されたロバ由来F（ab）₂で行い、1時間インキュベ
ートした。TMBmicrowell substrate system (Kirkegaard and Perry Laboratori
es Inc., Gaithersburg, MD, USA)を使用してシグナルを検出し、1Mリン酸を添
加して反応を停止させた。EL 312e microplate biokinetics reader(Bio-Tek In
struments, Inc. CA, USA)を使用して450nmにおける吸光度測定を行った。

【０１０４】 細胞蛍光によるEGFP発現の定量化 蛍光性細胞は、UV顕微鏡（Fluovert、Leitz、Germany)を使用して視覚化した
。細胞の半定量的な評価においては、クローンを0から3のスコアで判定した（0
、蛍光なし;1、背景であるか蛍光が低い;2、培地が蛍光;および3、蛍光が高い）
。FACScan II(Beckton Dickinson, Mount View, CA)を使用したフローサイトメ
トリーによって、2%パラホルムアルデヒドを含むPBSで固定された細胞における
蛍光を正確に定量し、蛍光データを、Cell Questソフトウェアを使用して分析し
た。

【０１０５】 pGTRTC、およびpGTEを同時にトランスフェクトして、ハイグロマイシンを補っ
た培地で選択したDTFクローンからのEGFPおよびsCR1の半定量的発現を評価した
。12ウェルプレートの一つのウェル内の1mlの無血清培地にクローンをまいた。2
4時間後、非誘導細胞の蛍光を上述したとおりに評価した。sCR1測定のために培
地を回収して、1mlのDox（1μg/ml）を含む無血清培地を再び加えた。Doxを添加
して24時間後、再び培地を回収して評価した。

【０１０６】 統計学的方法 2つのサンプルデータの不等分散について、Microsoft Excel 98のソフトウェ
アを使用して、記述統計学、相関変換、およびｔ検定を行った。

【０１０７】 結果 レトロウイルスベクターおよびプラスミドベクターの誘導特性の比較 予備的なトランスフェクション研究により、DTFがテトラサイクリン誘導性発
現の研究に適した細胞株であることを確認した。一過性トランスフェクションに
よってDTFからDox制御されたルシフェラーゼを発現するためには、1:10および1:
1の間の比で、pUHC 13-3およびpUHG 17-1を同時トランスフェクションすること
が最適だった。

【０１０８】 レトロウイスル構築物（M1 LUC CMV、およびM2 LUC CMV）およびプラスミド構
築物（pGRTL、およびpGTRTL）によるルシフェラーゼ誘導の比較は、DTFを一過性
にトランスフェクションすることによって行った。Doxで48時間誘導した後の遺
伝子誘導の程度は、それぞれ23、21、12、および34倍であった（図2）。ルシフ
ェラーゼ発現の誘導レベルに関して、これらのベクターに付けられたランクの順
位は、pGTRTL >M2 LUC CMV>MI LUC CMV=pGRTLである。ルシフェラーゼ発現のレ
ベルを定量分析するために、これらのベクターは、それぞれ同量のベクターでDT
Fを一過性にトランスフェクションすることによって、構築物pGCMV内の恒常性CM
Vプロモーターと比較した。Doxで誘導してから24時間後、pGTRTLによるルシフェ
ラーゼ発現は、CMV IEの25%と同等だったが、一方pGRTLによる発現は、1%未満で
あった（表1）。

【０１０９】 pGTLおよびpGCMVによる発現とGTRTLによる発現の、基礎ルシフェラーゼ発現、
および誘導性ルシフェラーゼ発現の比較 DTFにおけるtetPの基礎活性を、pGTL、およびpGL2ベーシックで一過性にトラ
ンスフェクションした後のルシフェラーゼ発現を比較することによって評価した
。ルシフェラーゼ発現は、プロモーターのないベクターであるpGL2ベーシックと
比較して、プラスミドpGTLを含むtetPからは1000-倍過剰に、有意に増加した（p
<0.0005）（図3a）。また、pGTRTLによるルシフェラーゼ発現の基礎レベルをpGT
Lと比較した。両プラスミドは、pGTRTLのtetPrtTAカセット含有物を除いて、同
じである。

【０１１０】 図3aの結果は、Doxの非存在下で、pGTRTLによるルシフェラーゼ発現が119.9RL
Uであり、pGTLの55.23とくらべて高かったことを示しており、pGTRTLのtetPrtTA
カセット含有物によるプロモーター活性が、わずかではあるが、有意に（p<0.05
）増加していることを示している。

【０１１１】 pGCMVによる恒常性の発現と、pGTRTLによるDox誘導性の48時間にわたる比較で
は、ルシフェラーゼ発現が、CMVによる発現の割合として、6、24、および48時間
の間隔で、4%、38%、および81%まで増加することを示している（図3b）。pGTRT
によるルシフェラーゼの基礎発現は、48時間の時間経過の全体にわたって、恒常
性CMVプロモーターの2-3%の範囲にあった。

【０１１２】 安定トランスフェクション pGTRTLをエンハンサーのない選択ベクターpTKHygと20：1の比で同時トランス
フェクションすることによって、DTFに恒常的にトランスフェクションした。

【０１１３】 ハイグロマイシンＢによって選択した後、pGTRTLについて28のクローンが得られ
、このうちの20クローンは、Doxによる24時間の誘導に応答して誘導性のルシフ
ェラーゼ発現を示した。残りの8クローンによるルシフェラーゼの発現は、低く
、非誘導細胞による発現は検出限界以下であった。これらの選択クローンによる
ルシフェラーゼの誘導を、図4aに示す。ルシフェラーゼ発現の誘導およびレベル
の程度は、いずれもクローン間で大きく変化した。

【０１１４】 pGTRTLについて得られた12個の安定なクローンにおいて、これらのうち一つの
みがDox誘導に応答性であり、再び観察されるルシフェラーゼ発現のレベルが低
かった（図示せず）。レトロウイルス構築物M1 LUC CMV、およびM2 LUC CMVは、
選択プラスミドpSV2Neoと同時トランスフェクションすることによって、GP+E86
パッケージング細胞に安定的にトランスフェクションした。MI LUC CMVについて
、安定クローンは得られず、M2 LUC CMVにおいて最も安定したクローンでは、Do
xによって調節されるルシフェラーゼ発現が、25倍程度を示した（図示せず）。

【０１１５】 安定クローンによるルシフェラーゼ制御の速度 クローン21において、最も高いルシフェラーゼ制御度が観察された。これはDo
x誘導から72時間後、62-倍の増加を示した（図4b）。

【０１１６】 DTF-GTRTLクローン10を代表的なクローンとして使用して、最大限に誘導され
た細胞（96時間Doxで誘導）をDoxフリー培地に、および非誘導細胞をDox含有培
地にスイッチしてから24、48、および72時間後の時点におけるルシフェラーゼ発
現の「オン」／「オフ」の速度を調査した。Doxの添加または除去の後、ルシフ
ェラーゼ発現が、それぞれ迅速に制御されることが示された。Doxを除去した後
、発現は迅速にスイッチ「オフ」され、48時間後にベースラインの8％に達した
のに対し、誘導細胞では48時間後にプラトーに始動した。

【０１１７】 GTRTCによる安定トランスフェクタント sCRlを発現する安定DTFクローンは、pTKHyg（1μg）およびpGTRTC（20μg）で
トランスフェクションしてハイグロマイシンＢを含む培地で選択した後に得られ
た。Dox誘導性のsCR1の発現について、31個のクローンをテストして、このうち3
0クローンが、誘導から24時間後に誘導性sCR1の発現を示すことがウエスタンブ
ロットで検出された（図示せず）。これら選択クローンは、Dox48時間により誘
導され、およびsCR1の発現は、ELISAによって測定した（図5a）。sCR1の誘導は
、これらのクローンのうち4つにおいて有意であった。安定pGTRTCクローンにつ
いての誘導度レベル、および発現レベルを観測し、クローン2が、74倍で、最も
高い誘導度を示し、クローン4が、最も高い発現誘導レベルであった。

【０１１８】 安定DTF GTRTCクローンによるsCR1発現の「オン」／「オフ」調節 DTF GTRTCクローン1におけるsCR1発現の「オン」および「オフ」の速度を、72
時間の時間経過にわたって24時間間隔で調べた。sCR1発現の「オン」-「オフ」
速度を調べる前に、非誘導細胞をDoxフリー培地で維持し、Dox（1μg/ml）を含
む培地中で誘導細胞を96時間培養した。sCR1発現の誘導は、非誘導細胞をDoxで
誘導してから24時間におけるsCR1発現レベルとして評価した。sCR1発現のスイッ
チ「オフ」は、Doxフリー培地で細胞にスイッチを誘導した後、24時間におけるs
CR1の発現レベルとして測定した。

【０１１９】 Doxで誘導することにより、24時間、および48時間におけるsCRlのレベルは、
非誘導細胞とくらべて増加し、48時間後の発現は、持続的に誘導された細胞と同
等であった。24、48、および72時間後におけるsCRl誘導の程度は、それぞれ10倍
、42倍、および54.5倍であった（図5b）。最大限に誘導された細胞をDoxフリー
の培地において培養すると、sCRl発現が迅速に減少し、24、48、および72時間後
では、持続して誘導した細胞より有意に低かった。sCR1発現の完全なスイッチ「
オフ」は、48時間後に観察された。sCR1発現の減少は、誘導を持続して24、48、
および72時間後の細胞と比較して、それぞれ4.5倍、35倍、74倍の減少を示した
（図5b）。細胞数が増加するため、実験期間にわたって、すべての群においてsC
R1発現のバックグラウンドが増加した。

【０１２０】 単一細胞におけるsCR1およびEGFPの二重制御 pGTRTC (10μg)、pGTE (10μg)、およびpTKHyg (1μg)で同時にトランスフェ
クションして、ハイグロマイシンB耐性で選択した後に得られたDTFクローンにお
いて、sCR1およびEGFPの発現制御を調べた。DoxによるEGFP誘導は、自己調節的
プラスミドpGTRTCからのrtTAの発現に依存しているので、このトランスフェクシ
ョンに誘導性GTE構築物を使用すれば、pGTRTCを含むクローンのマーカーとして
働くはずである。8個のクローンでは、Dox48時間によって誘導された。誘導後、
5つのクローンでは、EGFPを発現することが蛍光顕微鏡によって観察され、1-3の
スコアで判定した（図6a）。

【０１２１】 同じクローンにおいて、sCR1の発現が、ウエスタンブロットによって検出され
、発現パターンが、EGFPのものと適合した（図6b）。これらの結果は、誘導性EG
FPプラスミドが、機能的な自己調節的ベクターの正確なマーカーとして使用でき
ることを証明する。EGFP、およびsCRIの共発現を、クローン21においてより詳細
に検討した。

【０１２２】 Doxで誘導してから24、48、および72時間後におけるクローン21によるEGFP、
およびsCRIの発現をモニターした。sCR1の発現をELISAによって測定し、実験期
間にわたって有意な増加を示し、72時間後において最大の51倍の誘導をさせた（
図７a）。同じ細胞において、EGFPの発現をフローサイトメトリーによって測定
し、発現速度は同等であり、72時間後において最大の16倍の誘導することも示さ
れた（図７b）。これらの細胞におけるsCRl、およびEGFPの発現の類似は、72時
間の時間経過にわたって、r＝0.837の良好な相関を示す。

【０１２３】 結論 一過性アッセイにおいて、これらのベクターからの制御されたリポーター遺伝
子ルシフェラーゼの発現の比較により、ルシフェラーゼ発現の制御、および誘導
レベルの程度が、エンハンサーのない自己調節的な自己含有プラスミドpGTRTL（
ルシフェラーゼ、およびrtTAがどちらも、tetPプロモーターから発現される）と
比較して、自己含有レトロウイルスベクターMI LUC CMV、M2 LUC CMV、およびCM
V IEプロモーターによって駆動されるrtTAを含むプラスミドpGRTIより著しく低
いことを示した。この相違は、CMV IEが、tetPプロモーターの調節能力に何らか
の障害を生じさせることを示している。構造がかなりにているにも関わらず、誘
導から24時間後に誘導されるルシフェラーゼの発現は、7.69%、および0.87%であ
り、CMV IEプロモーターによる発現と比較してかなり相違していた。

【０１２４】 pGTLによるルシフェラーゼの発現は、生得的なtetPのプロモーター活性の測定
を提供する。前記tetPは、プラスミドpGL2ベーシックと比較して、有意なプロモ
ーター活性を示した。tetPの基礎活性は、使用される細胞タイプに依存し、いく
つかの細胞株において、遺伝子の基礎発現が高いことを以前に示した(Freundlie
b et al., J Gene Med ; 1: 4 12 (1999))。両プラスミドは、pGL2ベーシックを
バックボーンにして構築されているので、プラスミドpGTLは、tetP-rtTAカセッ
トを除いて、pGTRTLと同一である。pGTRTLによる基礎ルシフェラーゼ発現のわず
かな増加によって、非誘導状態におけるプロモーター活性にさらなる増加が生じ
る。

【０１２５】 pGTRTLの誘導性プロモーター活性の力価は、大部分の真核細胞の恒常性プロモ
ーターとして最も知られている恒常性CMV IEプロモーターに近いことが示された
(Foecking & Gene ; 45: 101-105 (1986))。

【０１２６】 pGTRTLによって制御されるルシフェラーゼ発現の程度は、一過性にトランスフ
ェクションした細胞では、およそ30倍であった。安定的に取り込まれたpGTRTLは
、ルシフェラーゼ発現の制御が、最も高発現のクローンにおいて60倍過剰であっ
た。

【０１２７】 構築物GTRTCによる恒常性トランスフェクタントによる制御されたsCRIの発現
は、最大70倍を超える制御を示した。恒常性トランスフェクタントにおいて観察
された、前記制御の改善は、おそらく相互作用部位に隣接するDNA配列との有利
な相互作用を介して生じており、これが、基礎発現を減少し、遺伝子発現の良好
な誘導を可能にする。

【０１２８】 これらのクローンにおける誘導速度は、恒常的に組み込まれた2種のプラスミ
ド「オン」の系で報告されたのよりもわずかに長く、HeLa細胞では、24時間未満
に最大発現に達する(Gossen et al. Science ; 268: 1766-1769 (1995))。我々
のプラスミドにおいて観察されたゆっくりとした誘導は、おそらくrtTAが自己調
節的に発現することによって、最適な発現レベルにおいて遅延を生じることによ
ると説明される。

【０１２９】 「オン」の系におけるrtTAの自己調節的な発現は、Doxの非存在下において、r
tTA発現の基礎レベルを低下させ、かつDox誘導によって、ポジティブフィードバ
ックを介してrtTAレベルの増加を引き起こす。このシナリオでは、遺伝子発現が
Doxで誘導されたときに、高レベルのrtTAのみが産生される。したがって、この
タイプの構築物を使用して、短時間で遺伝子を誘導することが必要な遺伝子治療
に応用することにより、細胞を高レベルのrtTAに、短期間だけ暴露することが確
実となるであろう。さらに、本研究において観察された迅速なスイッチ「オフ」
速度は、Dox除去した後、細胞が高レベルのrtTAに長時間暴露されていないこと
を示す。

【０１３０】 自己調節的プラスミドpGTRTC、および誘導性プラスミドpGTEでDTFを同時トラ
ンスフェクトした場合、GTRTCプラスミドを有するクローンにおいて、Dox誘導性
EGFRの発現が検出された。sCR1発現の制御は、GTRTC単独でトランスフェクトさ
れたクローンにおいて観察されたものと同等であった。調査した一つのクローン
では、EGFPおよびsCR1の発現は、72時間の期間にわたって関連することが示され
た。これらの知見は、EGFP発現プロフィールに基づいてクローンを選択すること
により、現実に、感興の遺伝子（GOI）の発現を最適に制御するクローンの選別
を短縮することができることを示している。EGFPの発現をモニタリングすること
は、GOIの発現を効率的にモニターするための迅速な方法を適用できない場合に
有利である。

【０１３１】 実施例3−tetP研究 遺伝子制御の程度は、種々の細胞間でかなり異なっており、ある細胞では制御
が限定されていることが示されている (Howe et al., J. Biol. Chem. ; 270: 1
4168-14174 (1995))。tetP自体は、DTF（マウス胎生期線維芽細胞）において高
い基礎プロモータ活性を示すことが明らかとなっている(Gould et al. Gene The
rapy ; 7: 2061-2070 (2000))。また、ヒト細胞株を含む種々の細胞タイプにお
いてもtetPの基礎活性が高いことが、他のグループによって報告されている。

【０１３２】 基礎活性レベルに寄与するであろう内因性転写因子結合部位の存在下で、tetP
のDNA配列を検討した。tetRコンセンサス配列TCCCTATCAGTGATAGAGA内に位置する
GATA結合モチーフWGATAR（ここで、Wが、AまたはTである、およびRが、AまたはG
である）が存在することを、確認した。6つのGATA転写因子が確認され、そのう
ちのいくつかは、胚組織分化に関与している(Maeda et al., J. Exp. Biol. 20
(199): 513-520 (1996))。成体組織において、GATA1〜3は、主に造血細胞に関連
し、GATA4〜6は、心臓器官、小腸、卵巣、胃、および肝臓分化を含むいくつかの
組織において発現している(Maeda et al., J. Exp. Biol. 20 (199): 513-520 (
1996))。

【０１３３】 tetPとGATA4〜6の相互作用を、GATA因子をコードする発現プラスミド、および
tetPを含むレポータープラスミドpGTLを同時トランスフェクションすることによ
って評価した。さらに、GATA因子およびrtTAの両方の存在下におけるtetPの機能
を評価して、添加剤による転写因子間の阻害作用を測定した。

【０１３４】 方法 DNAおよび細胞 真核生物発現ベクターmGATA-4pcDNA3、mGATA5pcDNA3、およびマウスGATA 4、G
ATA 5、およびGATA 6をそれぞれコードするmG6*PLINKは、Prof. Roger Patient,
Nottingham Universityによって提供された。また、マウス・インターフェロン
βを発現するレトロウイルスのベクターApHRO(Triantaphyllopoulos et al., Ge
ne Therapy ; 5: 253-263 (1998)) 、およびコントロールベクターpcDNA3(Invit
rogen, Leek, The Netherlands)、およびpcEGFPベクター（このベクターによりC
MVプロモーターからEGFPが発現される）を本研究に使用した。

【０１３５】 COS7およびDTF細胞を、10%のFCS、グルタミン（2mM）、およびペニシリン（10
0U/ml）、およびストレプトマイシン（100g/ml）を補ったDMEMで培養した。

【０１３６】 形質転換体 12ウェルプレートに2.5x10⁵でまいたCOS7細胞に、実施例2に記載したリン酸カ
ルシウム沈殿法によって、一過性トランスフェクションを行った。pGTL（5μg/
ウェル）は、GATA発現ベクターとともに、1：1の割合で同時トランスフェクショ
ンした（それぞれの例において、DNAの総量を、空のpcDNA3プラスミドで15μgの
pGTLプラスミドと同等モルに合わせた）。また、GTL（5μg）、pUHG17．1（rtTA
をコード）およびGATA発現ベクターを1：1：1の割合で、三種のトランスフェク
ションを行った。

【０１３７】 結果 tetP応答性レポータープラスミドpGTLと各GATA発現ベクターの同時トランスフ
ェクションを、1：1の割合でトランスフェクションした場合、GATA5による転写
活性の程度は、ルシフェラーゼ発現の5倍増加に相当することが示された。GATA4
および6は、ルシフェラーゼ発現を誘導しなかった。図8に示したとおり、Dox存
在下では、rtTAによってルシフェラーゼ発現が、62倍に誘導された。

【０１３８】 Dox存在下において、GTL、pUHG17．1、およびGATA発現ベクターによる三種の
トランスフェクションすることにより、GATA因子からのルシフェラーゼ発現が阻
害されることが示された。図9に示したとおり、Dox存在下においてrtTAによって
誘導されるpGTLからのルシフェラーゼ発現（6.79RLU/μgタンパク質（これは、1
00%を表す））と比較して、ルシフェラーゼ発現は、GATA 4、GATA 5またはGATA
6の添加により、0.26、0.47、および4.38RLU/μgタンパク質に減少した。これら
は、GATA 4、GATA 5、またはGATA 6に対して、それぞれ98%、95%、および36%に
相当するルシフェラーゼ発現の阻害を示した。

【０１３９】 結論 これらの観測は、内因性GATA因子とtetPの相互作用がかなり重要であることを
示している。GATA4およびGATA5において観測されたTet制御系の有意な阻害が、
該系によってなされる遺伝子制御の程度に、明らかな障害を生じさせるのに対し
、GATA5によって示される転写的活性は、tetPの基礎活性の増加の原因となり得
る。さらなる研究によって、Tetにより制御される遺伝子発現において、tetOにG
ATA因子が直接結合することが確認され、他のGATA因子（1〜3）の影響、並びにG
ATA転写的な、GATA（FOG）1および2の同僚補助因子との相互作用(Fox et al., E
MBO J. ; 18: 2812-2822 (1999))が測定されるであろう。おもしろいことに、Te
t制御系があまり機能しない細胞の多くは、肺組織（HEK293、NIH3T3、DTF）、お
よび卵巣などのその他のGATAリッチな組織（CHO細胞）、および造血肝細胞（Jur
kats）由来である。実際に、胚性繊維芽細胞株NIH3T3は、GATA6のmRNAの発現を
示していた (Morrisey et al., Dev. Biol. ; 177 : 309-322 (1996))。

【０１４０】 増強tetPの構造は、GATA結合部位を欠いているが、tetRのための適切な認識配
列を保持しており、この構造は、幅広い範囲の細胞、および組織においてTet制
御された遺伝子の発現を改善することになりそうである。tetOに結合するtetRに
ついての以前の研究では、tetO内のGATA配列を、TATAまたはGATCに変えると、逆
に細菌内における遺伝子抑制には影響を及ぼさないことが示されている。さらに
これらの置換、またはその他の置換が、哺乳類細胞におけるGATA因子の結合を妨
害しているかもしれない。

【０１４１】 さらに、tetPを修飾して、tetOリピートの間に位置するインターフェロン応答
性エレメント（IREs）を削除すると、Tet制御された遺伝子発現を改善しそうで
ある。tetOリピートの間に位置するIREsは、インターフェロン刺激に応答性であ
り、これは、前記「オフ」系(Rang & Will Nuc. Acid Res. ; 28: 1120-1125 (2
000))、および「オン」系（図10を参照）において示されており、並びに該IREs
は、tetPの基礎活性の増加に応答性である。自己調節的プラスミドpGTRTLと関連
して、ApHROにより発現されるIFNβが、基礎ルシフェラーゼ発現を4倍に増加す
る。このIFNβによる誘導は、Doxで誘導した状態で機能的なままであり、IFNβ
の非存在下における39倍と比較して、88倍の誘導の程度が観察される。

【０１４２】 実施例4−ポリアデニル化シグナルの研究 前の実験において記載した自己調節的ベクターは、SV40に由来する双配向性ポ
リアデニル化シグナル（PolyA）を囲んで構築されている。SV40に由来するポリ
アデニル化配列は、後期配向において最も効果があり、逆配向または初期配向で
使用した同じものと比較して、およそ5倍高いmRNAレベルが産生される(Carswell
& Alwine, Mol. Cell. Biol. 9: 4248-4258 (1989))。前の実施例に記載した自
己調節的ベクターでは、前記後期PolyAが、rtTA遺伝子に対して機能するが、一
方の感興の遺伝子（GOI）は、前記初期PolyAによって終結される。好ましくは、
前記rtTAの発現レベルを最適にして、誘導された状態におけるプラスミドの制御
を最大にするべきである。

【０１４３】 rtTA遺伝子のためのSV40 Poly Aを、初期配列に逆転することによる遺伝子制
御の程度が及ぼす効果を記載する。

【０１４４】 方法 クローニング 図11で示したとおり、Luc+の末端部分、および後期PolyAは、PpuM I-BamH Iで
切断することによってPGl3ベーシックから単離した。同様に、図11で示したとお
り、PpuM IでpGTRTLを切断し、BamH Iで部分切断することにより、Luc遺伝子、3
'UTRおよび初期PolyA部分の除去を可能とした。図11で示したとおり、PGl3由来
のインサートをライゲーションして、pGTRTLベクターからpGTRTL*構築物を形成
した。

【０１４５】 トランスフェクション ヒト・ニューロブラストーマNb100の細胞を、6ウェルプレートに2.5の×10⁶細
胞/ウェルでまいて、実施例2に記載のリン酸カルシウム沈殿法を使用して、pGTR
TLまたはpGTRTL*を5μg/ウェルでトランスフェクトした。細胞をDox（1μg/ml）
の存在下または非存在下において72時間培養し、次いで溶解して、ルシフェラー
ゼ活性を評価した。

【０１４６】 結果 図12に示したとおり、非誘導pGTRTL*によるルシフェラーゼ発現は、pGTRTLに
よる基礎発現より7倍の増加を示した。Doxで72時間誘導することにより、pGTRTL
*によるルシフェラーゼの発現が、6倍に誘導された。この6倍の誘導レベルは、D
ox誘導されたpGTRTLによるレベルよりも有意に高い。

【０１４７】 考察 pGTRTL*による基礎ルシフェラーゼ発現が、pGTRTLと比較して増加することは
、後者のプラスミドにおける初期PolyAの使用に対して、この遺伝子における後
期PolyAの使用に起因することを示している。しかし、その他の因子が、この基
礎ルシフェラーゼ発現の増加に寄与しているであろう。第一に、pGTRTL内のルシ
フェラーゼの下流に位置するSV40スモールT抗原から3'UTRを除去すると、3’UTR
の潜在的な阻害効果が除去されることによって、遺伝子発現を増加する効果を有
し(Evans & Scarpulla, Gene ; 84: 135-142 (1989))、および／または3'UTRに
よって異常なスプライスングが引き起こされる(Huang & Gorman, Mol. Cell Bio
l. ; 10: 1805-1810 (1990))。

【０１４８】 二番目に、pGTRTL*内のルシフェラーゼ遺伝子は、pGL2ベーシックに由来する
ルシフェラーゼ遺伝子の5’部分とpGL3ベーシックに由来するルシフェラーゼ+遺
伝子の3’部分の融合体である。ルシフェラーゼ+遺伝子の3’末端は、修飾され
ており、該タンパク質を該細胞の細胞質にターゲットする (Sherf & Wood, Prom
eg Notes ; 49: 14 (1994))。ルシフェラーゼが細胞質にターゲットされると、N
IH3T3細胞におけるルシフェラーゼ活性が、4〜5倍の増加を生じ(Sherf & Wood,
Promeg Notes ; 49: 14 (1994))、これが、観察された発現の増加に寄与してい
るのであろう。

【０１４９】 pGTRTL*内のrtTA発現の低下により、全体のDox誘導の程度が、pGTRTLと比較し
て（6対16）減少される。これは、pGTRTLにおけるSV40PolyAの配向が、NB100お
よび他の細胞（COS7およびNIH3T3における予備的データ）における遺伝子制御に
最適であることを示している。しかし、双配向性にするために第二のPolyAを併
用して使用することが好ましいが、ウシ成長ホルモンPolyAなどの後期SV40より
も効率的なPolyAシグナルをrtTA遺伝子に対して使用することによって、制御が
増強されるであろう(Yew et al., Human Gene Therapy ; 8: 0575-584 (1997))
。

【０１５０】 ここで、本発明は、添付した図面に関して記載する;

【図面の簡単な説明】

【図１】 本実験で使用したプラスミドベクター（A）およびレトロウイルスベクター（B
）のブロック線図。 tetP：最小CMVプロモーターを働かせるテトラサイクリンオペレーターの7回繰り
返し；EGFP：増強緑蛍光性タンパク質;CMV IE：CMV前−初期エンハンサー/プロ
モーター;rtTA：逆テトラサイクリントランスアクチベーター;LTR：末端反復配
列;sCRl：切断型可溶性補体レセプター１;SV40初期/後期ポリ(A)シグナル（黒三
角）;β-グロビン ポリ(A)シグナル（白三角）;SV40下流の非翻訳領域（灰色四
角）。括弧内の数は、各ベクターの塩基対の長さを表す。

【図２】 自己含有レトロウイルスベクター、およびプラスミドベクターに由来するルシ
フェラーゼの発現の比較。DTFを6cmのプレートに5x10⁵細胞でまいて、30μgのpG
TRTLと同モル量のDNAで一過性にトランスフェクションした。Dox（1μg/ml）で
ルシフェラーゼの発現を48時間誘導して、計測値をタンパク質含量で調整した。
それぞれの値は、複数のトランスフェクションの平均である。

【図３】 (A)Doxの非存在下におけるPGL2ベーシック、pGTL、およびpGTRTLによるルシフ
ェラーゼの発現を、DTF（6穴プレートに5x10⁵細胞/ウェル）を10μgのpGL2ベー
シック、および同モル量のpGTL、およびpGTRTLで一過性にトランスフェクション
して24時間後に評価した。それぞれの値は、三回のトランスフェクションから、
タンパク質含量で調整したルシフェラーゼ計測値の平均であり、鉛直のバーは、
SEMを表す。 （B）Dox（1μg/ml）の存在下におけるpGTRTLのルシフェラーゼ発現を、DTF（
6穴プレートに2.5x10⁵細胞/ウェル）を一過性トランスフェクションして6、24、
および48時間後に評価して、同時点において恒常性に発現されているpGCMV（5ug
）からのルシフェラーゼと比較した。ルシフェラーゼ活性は、pGCMV値の割合と
して示した。

【図４】 （A）24時間のDox（1μg/ml）による、選択クローンからのルシフェラーゼ発
現の誘導。バーの上の数は、誘導の倍数を示す。 （B）DTF-GTRTLクローン20からのルシフェラーゼ発現。細胞を2.5xl0⁵/ウェルで
まいて、Dox（1μg/ml）で72時間誘導した。値は、三回繰り返したものから、タ
ンパク質含量で調整したルシフェラーゼ計測の平均である。鉛直のバーは、SEM
を表し、*は非誘導と誘導間の値のp<0.005の有意性を示す。 （C）DTF-GTRTLクローン10のルシフェラーゼ発現の「オン」「オフ」速度。実験
を通して、24、48、および72時間の時点におけるスイッチ「オン」（白円）と「
オフ」（黒円）後のルシフェラーゼ発現を、非誘導細胞0%〜恒常的に誘導される
細胞100%の間で、割合の変化として決定した。

【図５】 (A)pGTRTCで恒常性にトランスフェクションしたDTF由来のsCR1の誘導。それぞ
れの点は、三回の値の平均であり、鉛直のバーはSEM（非誘導と誘導間の値の有
意差としてのp値、*p<0.05、**p<0.01、および***p<0.005として示される）を表
す。カラム上の数は、DOXの存在下における誘導の大きさを示す。記号〜は、非
誘導でのsCR1レベルが、ELISAの検出限界の下にあったために誘導された倍数が
測定できなかったことを示す。 （B）CTRTCクローン1によるsCRl発現の「オン」「オフ」速度。SCR1値を、三回
繰り返した平均としてロングスケールで示し、および鉛直のバーは、SEMを示す
。誘導されていない細胞とスイッチ「オン」の細胞間、およびスイッチ「オフ」
の細胞と恒常的に誘導される細胞間の有意差のp<005、p<0.01、およびp<0.005は
、*、**、および***によってそれぞれ示される。

【図６】 A：EGFP発現は、蛍光顕微鏡検査法によって検出し、および実施例において概
説した判定基準に従って、0〜3までのスコアをつけた。 B：SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動泳動によって決定し、およびウエスタ
ンブロット（挿入したイメージを参照）で検出したsCRl発現を、濃度計の値から
解析することによって定量した。カラム上の数は、濃度計計測を基礎としたDox
の存在下におけるsCRl誘導の大きさを示した。

【図７】 DTF-GTRTC+GTEクローン21におけるsCR1およびEGFPの誘導。 (A)sCR1レベル。（B）蛍光値。個体群における中央値として測定した。 それぞれのDox誘導値は、三回の値の平均として示し、垂直線はSEMを表し、*、*
*、および***は、それぞれ非誘導値の平均と比較した有意値p<0.05、p<0.01、お
よびp<0.005を表す。

【図８】 pGTLを単独で、もしくはpUHG 17.1と組み合わせて、またはGATA 4、GATA 5、
およびGATA 6を1:1の比でトランスフェクションしたCOS7細胞からのルシフェラ
ーゼ発現。pUHG 17.1でトランスフェクションした細胞をDox（lμg/ml）の非存
在下または存在下で培養した。トランスフェクションから24時間後にルシフェラ
ーゼレベルを測定した。値は、三回の平均のものであり、鉛直のバーは、SEMを
表す。*は、pGTL処理との差の有意差p<0.05を示し、一方^は、GTLとGTL + GATA
5群の間のp値0.053を表す。

【図９】 pGTL単独で、もしくはpUHG 17.1と組み合わせて、またはGATA 4、GATA 5、お
よびGATA 6を1:1の比でトランスフェクションしたCOS7細胞からのルシフェラー
ゼ発現。pUHG 17.1でトランスフェクションした細胞をDox（lμg/ml）の非存在
下または存在下で培養し、GATA因子でトランスフェクションしたすべてにおいて
Doxで誘導した。トランスフェクションから24時間後にルシフェラーゼレベルを
測定した。値は、三回の平均のものであり、鉛直のバーは、SEMを表す。*および
**は、DoxトランスフェクションされたpGTLおよびpUHG 17.1との差の有意差p<0.
05およびp<0.01をそれぞれ表す。

【図１０】 GTRTL（5μg）、およびpcEGFP（不活性プラスミド）で、またはApHRO（mIFNを
コードしているレトロウイルスのプラスミド）でトランスフェクションしたDTF
細胞からのルシフェラーゼ発現。トランスフェクションした細胞をDoxの非存在
下または存在下で48時間培養した。値は、三回の平均のものであり、鉛直のバー
は、SEMを表す。誘導した倍数の値をカラムの上に示し、pGTRTL + pcEGFP-Doxサ
ンプルと比較することによって算出した。*は、pGTRTL + pcEGFP-Doxとの差の有
意差（p<0.005）を示し、＄は、pGTRTL + pcEGFP-Doxとの差の有意差（p<0.05）
を示す。

【図１１】 概略図は、実験したプラスミド内のSV40ポリＡシグナルの位置、および向きを
示す図。記号矢印は、初期（E）および後期（L）SV40ポリＡシグナルの向きを示
す。tetP−テトラサイクリン応答性プロモーター；rtTA−逆テトラサイクリント
ランスアクチベーター；Luc／Luc+−ルシフェラーゼ遺伝子；3'UTR−3'非翻訳領
域。

【図１２】 pGTRTL、およびpGTRTL*でトランスフェクションして、Dox（lμg/ml）の非存
在下または存在下で培養したNB100細胞からのルシフェラーゼ発現。値は、三回
の平均のものであり、鉛直のバーは、SEMを表す。バーの上の数は、誘導された
倍数を示し、一方、非誘導レベル以上のDoxによる誘導の有意差を*（p<0.005）
および**（p<0.001）で示した。pGTRTLの有意に高いルシフェラーゼ値を＄（p<0
.01）および＄＄（p<0.0005）で示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ ４Ｃ０８７ 38/22 48/00 39/395 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 48/00 5/00 Ｂ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 グールド、デビッド・ジェームス イギリス国、イーシー１エム・６ビーキュ ー、ロンドン、チャーターハウス・スクエ ア（番地なし）、クイーン・メリー・アン ド・ウエストフィールド・カレッジ、セン ト・バーソロミューズ・アンド・ザ・ロイ ヤル・ロンドン・スクール・オブ・メディ シン・アンド・デンチストリー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 CA05 DA02 EA02 FA02 FA10 GA11 HA17 4B065 AA90X AA99Y AB01 BA02 CA44 4C084 AA02 AA13 BA44 NA14 ZB211 ZB212 4C085 AA13 AA14 EE01 4C086 AA02 EA16 MA02 MA05 NA14 ZB21 4C087 AA02 BB65 BC30 BC83 NA14 ZB21

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第一の核酸構築物および第二の核酸構築物を含む自己調節的
   発現ベクターであって、前記第一および第二の核酸構築物が、プロモーター配列
   およびtet-オペレーター配列（tetP）を含み；ここで、前記第一の核酸構築物は
   、感興のタンパク質をコードする第一の核酸配列を含み、かつ前記第二の核酸配
   列は、逆テトラサイクリントランスアクチベーター（rtTA）をコードする第二の
   核酸配列を含み；並びにここで、前記第一および第二の核酸配列のそれぞれが、
   終止配列とともに提供される発現ベクター。
2. 【請求項２】 核酸ベクターである請求項1に記載の自己調節的な発現ベク
   ター。
3. 【請求項３】 前記核酸ベクターが、細菌性プラスミドである請求項2に記
   載の自己調節的な発現ベクター。
4. 【請求項４】 前記細菌性プラスミドが、pGTRTLである請求項3に記載の自
   己調節的な発現ベクター。
5. 【請求項５】 前記核酸ベクターが、レトロウイルスである請求項2に記載
   の自己調節的な発現ベクター。
6. 【請求項６】 前記プロモーターが、プロモーター活性のための最小限の配
   列を含む前記請求項1〜5のいずれか一項に記載の自己調節的な発現ベクター。
7. 【請求項７】 前記プロモーターが、mCMVプロモーターである請求項6に記
   載の自己調節的な発現ベクター。
8. 【請求項８】 前記プロモーターが、哺乳動物プロモーターである前記請求
   項1〜7のいずれか一項に記載の自己調節的な発現ベクター。
9. 【請求項９】 請求項1〜9のいずれか一項に記載の自己調節的な発現ベクタ
   ーであって、前記第一の核酸配列が、治療的なタンパク質をコード化する発現ベ
   クター。
10. 【請求項１０】 請求項9に記載の自己調節的な発現ベクターであって、前
    記治療的なタンパク質が、一以上のサイトカイン、成長因子、分化因子、受容体
    または抗体である発現ベクター。
11. 【請求項１１】 請求項10に記載の自己調節的な発現ベクターであって、前
    記治療的なタンパク質が、可溶性補体レセプター１である発現ベクター。
12. 【請求項１２】 請求項1〜11のいずれか一項に記載の自己調節的な発現ベ
    クターであって、前記終止配列が、双配向性の終止コドンである発現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項12に記載の自己調節的な発現ベクターであって、前
    記終止コドンが、前記第一および第二の核酸配列の間に位置する。
14. 【請求項１４】 請求項1〜13のいずれか一項に記載の自己調節的な発現ベ
    クターであって、前記第一のtetPが、センス配向性であり、前記第二のtetPが、
    アンチセンス配向性である発現ベクター。
15. 【請求項１５】 請求項1〜14のいずれか一項に記載の自己調節的な発現ベ
    クターを含む発現系。
16. 【請求項１６】 一以上の細胞を含む請求項15に記載の発現系。
17. 【請求項１７】 一以上の哺乳動物細胞を含む請求項16に記載の発現系。
18. 【請求項１８】 請求項1〜14のいずれか一項に記載の自己調節的な発現ベ
    クター、または請求項15〜17のいずれか一項に記載の発現系をレシピエントに投
    与することを含む治療方法。
19. 【請求項１９】 請求項18に記載の方法であって、前記治療が、再発性の症
    状を有する慢性症状の治療である方法。
20. 【請求項２０】 請求項18または請求項19に記載の方法であって、前記治療
    が、遺伝子治療である方法。
21. 【請求項２１】 請求項1〜14のいずれか一項に記載の自己調節的な発現ベ
    クター、および遺伝子治療において同時に、別々に、または順番に使用するため
    に併用される製剤として、第二のＤＮＡ分子を含むさらなる発現ベクターを含有
    する製品。
22. 【請求項２２】 請求項21に記載の製品であって、前記第二のＤＮＡ分子が
    、核酸ベクターである製品。
23. 【請求項２３】 請求項21または請求項22に記載の産物であって、前記第二
    のＤＮＡ分子が、感興のタンパク質をコード化する核酸配列を含む製品。
24. 【請求項２４】 医薬に使用するための、請求項1〜14のいずれか一項に記
    載の自己調節的な発現ベクター、または請求項15〜17のいずれか一項に記載の発
    現系。
25. 【請求項２５】 遺伝子疾患を治療するための医薬の製造における、請求項
    1〜14のいずれか一項に記載の自己調節的な発現ベクター、または請求項15〜17
    のいずれか一項に記載の発現系の使用。
26. 【請求項２６】 薬学的に許容可能な担体、および請求項1〜14のいずれか
    一項に記載の自己調節的な発現ベクター、請求項15〜17のいずれか一項に記載の
    発現系、または請求項21〜23のいずれか一項に記載の製品を含む医薬製剤。
27. 【請求項２７】 請求項1〜14のいずれか一項に記載の自己調節的な発現ベ
    クター、請求項15〜17のいずれか一項に記載の発現系、または請求項21〜23のい
    ずれか一項に記載の製品、および投与賦形剤を含むキットの一部品。