JP2009519016A - 環状ヌクレオチド決定のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は一般に細胞解析ツールに関し、およびより特に試料中の環状ヌクレオチド濃度を検出または決定するための方法に関する。
二次メッセンジャーである、アデノシン3', 5'環状一リン酸(cAMP)およびグアノシン3', 5'環状一リン酸(cGMP)は、細胞増殖、分化、アポトーシス、および細胞死を含む多様な細胞機能の重要な細胞内メディエーターである。cAMPの産生は、アデノシン三リン酸(ATP)をcAMPおよび無機ピロリン酸(PPi)に変換する、アデニリルシクラーゼファミリーの酵素によって制御される。アデニリルシクラーゼは、膜結合Gタンパク質共役型受容体(GPCR)α-サブユニットとの直接的な相互作用によって活性化または抑制される。Gαsと呼ばれる、促進性GPCRのα-サブユニットが活性化された場合、アデニリルシクラーゼはATPをcAMPおよびPPiに変換する。逆に、Gαiと呼ばれる、抑制性GPCRのα-サブユニットが活性化された場合、アデニリルシクラーゼに対する抑制的効果が発揮され、ならびにATPのcAMPおよびPPiへの変換は実現しない。Gタンパク質共役型受容体は、神経伝達、心拍出力、および痛みの調整などの多種多様な生物学的過程において顕著な役割を果たす。新しい医学的に有用な化合物を開発する際のそれらの重要性は十分に理解され;そのようなものとして、それらは創薬研究において大いに標的にされている。
本発明は一般に細胞解析ツールに関し、およびより特に試料中の環状ヌクレオチド濃度を検出または決定するための方法に関する。
本明細書において使用される場合、「試料」という用語は、その最も幅広い意味で使用される。ある意味において、生物学的試料および環境試料だけでなく、任意の供給源から得られる標本または培養物も含むことが意味される。生物学的試料は(ヒトを含む)動物から得られてもよく、ならびに体液、固形物、組織、および体内ガスを包含する。生物学的試料には、血液産物、細胞ライセート、および細胞ライセートの構成要素が含まれる。環境試料には、表面物質、土壌、水、結晶、および工業試料などの環境材料が含まれる。試料は、環状ヌクレオチド濃度を調整する物質を含んでもよく、または含まなくてもよい。しかしながら、そのような例は、本発明に適用できる試料の種類を限定するものとして解されるべきではない。
一つの態様において、本発明の方法は、環状ヌクレオチドによる活性化によるタンパク質キナーゼの活性の変化をモニターすることによって、細胞タンパク質の調整をモニターすることを提供する。環状ヌクレオチドの細胞レベルは、シクラーゼと環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの活性の間のバランスを反映する(図1)。環状AMPは四量体PKAの調節サブユニットに結合する。環状GMPはcGMP依存性タンパク質キナーゼ、またはPKGの調節サブユニットに結合する。本発明は、特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は本発明を実施するために必要ではない。とはいえ、cAMPがII型PKAの調節サブユニットに結合するだけでなく、cGMPもII型PKAの調節サブユニットに結合するということが見出された。したがって、ひとたびcAMPまたはcGMPがPKAの調節サブユニットに結合すると、PKA活性触媒サブユニットは、ATPから基質リン酸化部位へのリン酸の転移によってセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ基質をリン酸化することができる。そのように、PKA活性は、試料中に存在するcAMPまたはcGMPの量の指標としての役割を果たす。
以下の実施例は、本発明のある種の好ましい態様および局面を示しおよびさらに例証するために提供され、ならびにその範囲を限定するものと解されるべきではない。
そうでないように述べられない限り、哺乳動物細胞HEK D293(ヒト胎児腎臓)を全ての細胞培養関連実験について以下のやり方で培養した。ポリ-D-リジンをコーティングした96ウェルの白い、透明な底の組織培養プレート(BD BioCoat(商標)Poly-D-Lysine Multiwell(商標)プレート)の中に5〜10,000細胞/ウェルの密度で細胞を播種した。細胞培地は、10%胎仔ウシ血清(FBS)、1Uペニシリン、および1mg/mlストレプトマイシンを補充したダルベッコの改変イーグルス培地(DMEM)からなった。ドーパミン受容体D1を安定に発現する細胞株については、選択および維持目的のために500μg/mlのネオマイシンを培養培地に添加した。それらがトランスフェクション、誘導、またはその他の細胞操作が行なわれる時点で60〜75%コンフルエントになるまで、細胞を37℃/5% CO2でおよそ24時間増殖させた。
この実験は、本発明を用いて試料中のcAMP濃度を決定することができるということ、および試料のcAMP濃度を決定する際に多様な検出技術と共に本発明を用いることができるということを示すために実行された。
ポリ-D-リジンをコーティングした、白い、透明な底の96ウェルプレート中で反応を行なったが、添加される試薬の量を比例的に減少させることによって、反応を384ウェルプレート中で行なうこともできる。添加物容量をそれ相当にスケールダウンすることによって、1536ウェルプレートなどの、より高い密度のプレートを場合によっては用いることもできる。
実験は、本発明が、哺乳動物細胞における、Gαs共役型受容体である、GPCRドーパミン受容体D1(DRD1)に対するアゴニストおよびアンタゴニストの効果を決定することができることを示すために実行された。
実験は、PKAが環状ヌクレオチドおよびコグネート環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの存在下でcAMPおよびcGMP濃度の変化をモニターすることができることを示すために実行された。実験はまた、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの活性化剤または抑制剤の存在下でPDE活性の変化をモニターするために実行された。
25μlの全容量で50mM Tris HCl pH 7.5、10mM MgCl2、0.5mM EGTA、0.1mg/ml BSA、および5μM cGMPを含む溶液中で50U濃度から始めたホスホジエステラーゼPDE Vの連続希釈を創出した。酵素反応を室温で60分間進行させ、その後12.5μlの停止緩衝剤を添加した。100ng/ウェル ホロ酵素-R-IIαタンパク質キナーゼA、40μM ケンプチド、40mM Tris HCl pH 7.5、および30mM MgCl2を含む25μlのPKA/基質試薬を反応ウェルに添加し、その後室温で20分のインキュベーションを行なった。等容量(50μl)のKinase-Glo(商標)試薬を添加し、反応物をさらに10分インキュベートし、発光を測定し、ならびに出力をRLU(n=2)として記録しおよびGraphPad Prism(登録商標)ソフトウェア第4.0版を用いてホスホジエステラーゼPDE V濃度に対してプロットした。図7Aで見ることができるように、ホスホジエステラーゼPDE V濃度が増加する時に試料の相対発光は増加する。図7Aは、本アッセイがcAMP加水分解に特異的なホスホジエステラーゼだけでなく、cGMPの加水分解に特異的なホスホジエステラーゼもモニターすることができることを示す。
ホスホジエステラーゼPDE V選択的抑制剤ザプリナスト(Sigma)の滴定を行なった。ザプリナスト(20μM)の2倍連続希釈をIBMXおよびATPを含まないが、10μM cGMPを補充した停止緩衝剤中で作製した。あらゆる12.5μlの酵素溶液が15U(IBMXおよびATPなしの停止緩衝剤)の酵素を含むようにPDE Vを含む酵素溶液も作製した。各希釈のアリコート(12.5μl)を反応ウェルに添加し、および反応を開始させるために等量のホスホジエステラーゼPDEV酵素溶液を添加した。プレートを室温で30分間インキュベートし、その後反応を停止させるために1.5mM IBMXおよび4μM ATPを補充した12.5μlの停止緩衝剤を添加した。100ng/ウェル ホロ酵素-R-IIαタンパク質キナーゼA、40μM ケンプチド、40mM Tris HCl pH 7.5、20mM MgCl2、および0.1mg/ml BSAを含む等容量のPKA/基質試薬を反応ウェルに添加し、プレートをさらに20分間インキュベートし、ならびに50μlのKinase-Glo(商標)試薬を添加した。Kinase-Glo(商標)試薬の添加10分後に発光を測定し、ならびに出力をRLU(n=2)として記録しおよびGraphPad Prism(登録商標)ソフトウェア第4.0版を用いてザプリナスト濃度に対してプロットした。図7Bで示されるように、ホスホジエステラーゼPDE V抑制剤ザプリナストの量が増加する時に相対光単位は減少する。図7Bは、発光とザプリナスト濃度の間の相関を示し、それによってcGMP特異的ホスホジエステラーゼPDE Vの潜在的抑制剤を決定する際の本アッセイの有用性が示されている。図7Bは、文献(Turko 1998)で見出されるザプリナストについてのIC50と比較した本実験で算出されるザプリナストについてのIC50をさらに示し、コグネートcGMPホスホジエステラーゼの活性の変化をモニターするための本アッセイの有用性を再び示している。したがって、本発明は、抑制剤の存在下および非存在下でcAMP濃度およびそのコグネートホスホジエステラーゼの活性を測定するだけでなく、抑制剤の存在下および非存在下でcGMP濃度およびそのコグネートホスホジエステラーゼの活性をモニターする際にも有用性を見出す。
生物学的試料中のcGMP濃度を決定するために、試料を初めに5分間95℃まで熱し、その後PDE IVなどのcAMP選択的ホスホジエステラーゼを添加し、および室温で30分間のさらなるインキュベーションを行なわなければならなかった。その後、PKA基質試薬のアリコートを試料に添加しおよび室温で20分間インキュベートし、その後Kinase-Glo(商標)試薬(Promega Corporation, Madison WI)を添加することができた。Kinase-Glo(商標)試薬の添加10分後、発光を測定し、ならびに出力を記録し(RLU)および異なる試料容量に対してプロットした。その後、GraphPad Prism(登録商標)ソフトウェア第4.0版などのグラフ描写プログラムを用い、および試料発光出力をcGMP標準曲線の発光出力と比較することによって、試料中のcGMP量を決定することができた。
この実験は、低張溶解法または窒素空洞化溶解法を用いて形質膜調製物を調製するための例示的方法を提供する。
ポリ-D-リジンをコーティングした、白い、透明な底の96ウェルプレート中で反応を行なったが、添加される試薬の量を比例的に減少させることによって、反応を384ウェルプレート中で行なうこともできる。添加物容量をそれ相当にスケールダウンすることによって、1536ウェルプレートなどの、より高い密度のプレートを場合によっては用いることもできる。
実験は、本発明が、形質膜調製物におけるGPCRドーパミン受容体D1(DRD1)上のアデニリルシクラーゼ活性に対するアゴニストの影響を決定することができることを示すために実行された。
実験は、本発明が、Gαiタンパク質共役型受容体である、GPCRドーパミン受容体D2(DRD2)に対するアゴニストおよびアンタゴニストの効果を決定することができることを示すために実行された。
Claims (75)
- 試料中の環状ヌクレオチドの量を決定するための方法であって、以下の工程を含む方法:
a)環状ヌクレオチドを含み得る試料を提供する工程、
b)該環状ヌクレオチドによって活性化され得る不活性酵素を該試料に添加する工程、
c)活性化された酵素の活性を検出しかつ検出可能なシグナルを生成させることができる検出系を添加する工程、ならびに
d)該シグナルに基づいて該試料中に存在する環状ヌクレオチドの量を決定する工程。 - 試料がライセートを含む、請求項1記載の方法。
- ライセートが真核細胞に由来する、請求項2記載の方法。
- 試料が形質膜を含む、請求項1記載の方法。
- 環状ヌクレオチドがcAMPまたはcGMPである、請求項1記載の方法。
- 不活性酵素がcAMP依存性タンパク質キナーゼまたはcGMP依存性タンパク質キナーゼである、請求項1記載の方法。
- 検出系がcAMP依存性タンパク質キナーゼまたはcGMP依存性タンパク質キナーゼによってリン酸化されることができる基質を含む、請求項1記載の方法。
- 基質がSEQ ID NO: 1を含む、請求項7記載の方法。
- 検出系がATPを利用して発光シグナルを生成させることができる酵素をさらに含む、請求項7記載の方法。
- 酵素がルシフェラーゼである、請求項9記載の方法。
- 基質が放射性標識ビオチン化基質を含む、請求項7記載の方法。
- 基質がSEQ ID NO: 1をさらに含む、請求項11記載の方法。
- 検出系がストレプトアビジン結合表面をさらに含む、請求項11記載の方法。
- 基質が蛍光標識基質を含む、請求項7記載の方法。
- 基質がSEQ ID NO: 1をさらに含む、請求項14記載の方法。
- 蛍光標識がローダミン部分である、請求項14記載の方法。
- ホスホジエステラーゼの1つまたは複数の抑制剤の添加をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 試料中の環状ヌクレオチド量に影響を及ぼすことができるアゴニストまたはアンタゴニストの添加をさらに含む、請求項1記載の方法。
- アゴニストまたはアンタゴニストがアデニリルシクラーゼ活性を調整する、請求項18記載の方法。
- アゴニストまたはアンタゴニストがGタンパク質共役型受容体活性を調整する、請求項18記載の方法。
- アゴニストまたはアンタゴニストがホスホジエステラーゼ活性を調整する、請求項18記載の方法。
- 試料中のアデニリルシクラーゼ活性を決定するための方法であって、以下の工程を含む方法:
a)アデニリルシクラーゼを含み得る試料を提供する工程、
b)cAMPによって活性化され得る不活性酵素を該試料に添加する工程、
c)活性化された酵素の活性を検出しかつ検出可能なシグナルを生成させることができる検出系を添加する工程、ならびに
d)該シグナルに基づいて該試料中に存在するアデニリルシクラーゼ活性を決定する工程。 - 試料がライセートを含む、請求項22記載の方法。
- ライセートが真核細胞に由来する、請求項23記載の方法。
- 試料が形質膜を含む、請求項22記載の方法。
- 不活性酵素がcAMP依存性タンパク質キナーゼである、請求項22記載の方法。
- 検出系がcAMP依存性タンパク質キナーゼによってリン酸化されることができる基質を含む、請求項22記載の方法。
- 基質がSEQ ID NO: 1を含む、請求項27記載の方法。
- 検出系がATPを利用して発光シグナルを生成させることができる酵素をさらに含む、請求項27記載の方法。
- 酵素がルシフェラーゼである、請求項29記載の方法。
- 基質が放射性標識ビオチン化基質を含む、請求項27記載の方法。
- 基質がSEQ ID NO: 1をさらに含む、請求項31記載の方法。
- 検出系がストレプトアビジン結合表面をさらに含む、請求項31記載の方法。
- 基質が蛍光標識基質を含む、請求項27記載の方法。
- 基質がSEQ ID NO: 1をさらに含む、請求項34記載の方法。
- 蛍光標識がローダミン部分である、請求項34記載の方法。
- ホスホジエステラーゼの1つまたは複数の抑制剤の添加をさらに含む、請求項22記載の方法。
- アデニリルシクラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストの添加をさらに含む、請求項22記載の方法。
- 試料中のホスホジエステラーゼ活性を決定するための方法であって、以下の工程を含む方法:
a)ホスホジエステラーゼを含み得る試料を提供する工程、
b)cAMPによって活性化され得る不活性酵素を該試料に添加する工程、
c)活性化された酵素の活性を検出しかつ検出可能なシグナルを生成させることができる検出系を添加する工程、ならびに
d)該シグナルに基づいて該試料中に存在するホスホジエステラーゼ活性を決定する工程。 - ホスホジエステラーゼが環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼである、請求項39記載の方法。
- 環状ヌクレオチドがcAMPまたはcGMPである、請求項40記載の方法。
- 試料がライセートを含む、請求項39記載の方法。
- ライセートが真核細胞に由来する、請求項39記載の方法。
- 試料が形質膜を含む、請求項39記載の方法。
- 不活性酵素がcAMP依存性タンパク質キナーゼまたはcGMP依存性タンパク質キナーゼである、請求項39記載の方法。
- 検出系がcAMP依存性タンパク質キナーゼまたはcGMP依存性タンパク質キナーゼによってリン酸化されることができる基質を含む、請求項39記載の方法。
- 基質がSEQ ID NO: 1を含む、請求項46記載の方法。
- 検出系がATPを利用して発光シグナルを生成させることができる酵素をさらに含む、請求項46記載の方法。
- 酵素がルシフェラーゼである、請求項48記載の方法。
- 基質が放射性標識ビオチン化基質を含む、請求項46記載の方法。
- 基質がSEQ ID NO: 1をさらに含む、請求項50記載の方法。
- 検出系がストレプトアビジン結合表面をさらに含む、請求項46記載の方法。
- 基質が蛍光標識基質を含む、請求項46記載の方法。
- 基質がSEQ ID NO: 1をさらに含む、請求項53記載の方法。
- 蛍光標識がローダミン部分である、請求項53記載の方法。
- ホスホジエステラーゼの1つまたは複数の抑制剤の添加をさらに含む、請求項39記載の方法。
- 試料中のGタンパク質共役型受容体活性を決定するための方法であって、以下の工程を含む方法:
a)Gタンパク質共役型受容体を含み得る試料を提供する工程、
b)cAMPによって活性化され得る不活性酵素を該試料に添加する工程、
c)活性化された酵素の活性を検出しかつ検出可能なシグナルを生成させることができる検出系を添加する工程、ならびに
d)該シグナルに基づいて該試料中に存在するGタンパク質共役型受容体活性を決定する工程。 - 試料がライセートを含む、請求項57記載の方法。
- ライセートが真核細胞に由来する、請求項58記載の方法。
- 試料が形質膜を含む、請求項57記載の方法。
- 不活性酵素がcAMP依存性タンパク質キナーゼである、請求項57記載の方法。
- 検出系がcAMP依存性タンパク質キナーゼによってリン酸化されることができる基質を含む、請求項57記載の方法。
- 基質がSEQ ID NO: 1を含む、請求項62記載の方法。
- 検出系がATPを利用して発光シグナルを生成させることができる酵素をさらに含む、請求項62記載の方法。
- 酵素がルシフェラーゼである、請求項64記載の方法。
- 基質が放射性標識ビオチン化基質を含む、請求項62記載の方法。
- 基質がSEQ ID NO: 1をさらに含む、請求項66記載の方法。
- 検出系がストレプトアビジン結合表面をさらに含む、請求項66記載の方法。
- 基質が蛍光標識基質を含む、請求項62記載の方法。
- 基質がSEQ ID NO: 1をさらに含む、請求項69記載の方法。
- 蛍光標識がローダミン部分である、請求項69記載の方法。
- ホスホジエステラーゼの1つまたは複数の抑制剤の添加をさらに含む、請求項57記載の方法。
- Gタンパク質共役型受容体活性のアゴニストまたはアンタゴニストの添加をさらに含む、請求項57記載の方法。
- 試料中の環状ヌクレオチドの濃度を決定するためのキットであって、以下を含むキット:
a)環状ヌクレオチド、
b)タンパク質キナーゼ、
c)タンパク質キナーゼ基質、
d)ATP、および
e)試料中の環状ヌクレオチドの濃度を決定するためのキットを用いるための取扱説明書。 - 試料中の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性を決定するためのキットであって、以下を含むキット:
a)cAMPおよびcGMPのための基質、
b)タンパク質キナーゼ、
c)タンパク質キナーゼ基質、
d)ATP、および
e)試料中の環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの濃度を決定するためのキットを用いるための取扱説明書。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6261761B1 (en) * | 1997-03-24 | 2001-07-17 | Cold Spring Harbor Laboratory | NF1 protein and its role in activation of adenylyl cyclase by PACAP38-like neuropeptides |
JP2002533088A (ja) * | 1998-12-23 | 2002-10-08 | ユニヴェルシテ ルイ パスツール ド ストラスブール | 非病原性トランスフェクションベクター |
JP2003521941A (ja) * | 2000-02-11 | 2003-07-22 | クイーンメリー アンド ウエストフィールド カレッジ | ベクター |
WO2003106703A2 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | Pierce Biotechnology, Inc. | Homogenous assay for enzymatic activity |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4234681A (en) * | 1978-07-21 | 1980-11-18 | The Regents Of The University Of California | Immobolized light emitting systems |
US5986061A (en) * | 1988-10-28 | 1999-11-16 | Pbl Biomedical Laboratories | Phosphorylated fusion proteins |
US6080540A (en) * | 1990-04-20 | 2000-06-27 | Cold Spring Harbor Laboratory | Cloning of mammalian genes in microbial organisms and methods for pharmacological screening |
AU8066591A (en) | 1990-05-14 | 1991-12-10 | Duke University | Cloned genes encoding the d1 dopamine receptor |
US5618665A (en) * | 1993-01-22 | 1997-04-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Enzymatic fluorometric assay for adenylate cyclase |
WO1995030012A1 (en) * | 1994-04-26 | 1995-11-09 | Cadus Pharmaceutical Corporation | Functional expression of mammalian adenylyl cyclase in yeast |
US5795756A (en) * | 1995-12-11 | 1998-08-18 | Johnson; Roger A. | Method and compounds for the inhibition of adenylyl cyclase |
US5759787A (en) * | 1996-08-26 | 1998-06-02 | Tularik Inc. | Kinase assay |
JP3059435B1 (ja) * | 1999-03-18 | 2000-07-04 | 扶桑薬品工業株式会社 | cAMPおよびアデニル酸シクラ―ゼの酵素的蛍光定量アッセイ |
US6573059B1 (en) * | 1999-06-04 | 2003-06-03 | Rmf Dictagene S.A. | Use of the regulatory subunit of the camp dependent protein kinase (PKA) from dictyostelium for camp measurements |
US6576059B2 (en) * | 1999-11-22 | 2003-06-10 | Harris & Bruno Company, Inc. | Chambered doctor blade system for water-based and UV-based coatings |
US6632621B1 (en) * | 1999-11-24 | 2003-10-14 | Pharmacia & Upjohn Company | G protein-coupled receptor-like receptors and modulators thereof |
US6893827B1 (en) * | 2000-02-07 | 2005-05-17 | Applera Corporation | Receptor function assay for G-protein coupled receptors and orphan receptors by reporter enzyme mutant complementation |
ATE487797T1 (de) * | 2002-09-06 | 2010-11-15 | Promega Corp | Verfahren zum nachweis von transferase- enzymaktivität |
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---|---|---|---|---|
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JP2002533088A (ja) * | 1998-12-23 | 2002-10-08 | ユニヴェルシテ ルイ パスツール ド ストラスブール | 非病原性トランスフェクションベクター |
JP2003521941A (ja) * | 2000-02-11 | 2003-07-22 | クイーンメリー アンド ウエストフィールド カレッジ | ベクター |
WO2003106703A2 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | Pierce Biotechnology, Inc. | Homogenous assay for enzymatic activity |
Non-Patent Citations (9)
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---|
JPN6012013762; Anal. Biochem. Vol.102, 1980, p.332-339 * |
JPN6012013763; PNAS Vol.67, No.1, 1970, p.305-312 * |
JPN6012013763; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1970), 67, [1], p.305-312 * |
JPN6012013764; Trends Pharm. Sci. Vol.10, 1989, p.442-447 * |
JPN6012013764; Trends Pharmcol. Sci., (1989), 10, [11], p.442-447 * |
JPN6012013765; Curr. Opin. Biotechnol. Vol.16, 2005, p.655-665 * |
JPN6012013765; Curr. Opin. Biotechnol., (2005), 16, [6], p.655-665 * |
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