JP7053697B2 - 癌特異的トランス-スプライシングリボザイム及びその用途 - Google Patents
癌特異的トランス-スプライシングリボザイム及びその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7053697B2 JP7053697B2 JP2020028556A JP2020028556A JP7053697B2 JP 7053697 B2 JP7053697 B2 JP 7053697B2 JP 2020028556 A JP2020028556 A JP 2020028556A JP 2020028556 A JP2020028556 A JP 2020028556A JP 7053697 B2 JP7053697 B2 JP 7053697B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cancer
- gene
- mir
- ribozyme
- ecrt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/124—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes based on group I or II introns
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
- C12N2330/51—Specially adapted vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
- C12N2840/445—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor for trans-splicing, e.g. polypyrimidine tract, branch point splicing
Description
本発明の一様態は、(i)サイトメガロウイルスプローモーター;及び(ii)癌特異的遺伝子配列を標的にするトランス-スプライシングリボザイム、前記リボザイムの3'エクソンに連結された目的遺伝子を含む、リボザイム-目的遺伝子発現カセットを含み、前記発現カセットは、リボザイム-目的遺伝子発現カセットの5'末端にスプライシング供与体/スプライシング受容体配列(SD/SA sequence)が連結され、3'末端にWPREが連結されたもので、(iii)前記WPREの3'末端にマイクロRNA-122を認識する核酸配列が追加に連結されたことを特徴とする組換えベクターである。
本発明の他の様態は、本発明による組換えベクターを含む遺伝子伝達システムである。
本発明の他の様態は、本発明による組換えベクターから発現されたリボザイムである。
本発明の他の様態は、本発明による組換えベクター、前記組換えベクターを含む遺伝子伝達システム又はリボザイムを有効成分で含む癌の予防又は治療用薬学的組成物である。
miR-122標的部位であるmiR-122Tを有するとともに高い発現率を示すhTERT標的トランス-スプライシングリボザイムを製作するために、既存のトランス-スプライシングリボザイムを変形した組換えベクターを考案した。
Hep3B細胞を35mm培養皿に2×105個分注した後、37℃、5%のCO2インキュベーターで培養した。Tet-repressor(TetR)miR-122発現ベクター1μgとOpti-MEM 100μlを1.5mlチューブに入れて混ぜ、Lipofectamin2000 5μlと無血清培地100μlを他の1.5mlチューブに入れて混合した後、5分間常温に放置した。その後、上記二つのチューブの内容物を混合し、リボソーム(liposome)形態の複合体をなすように20分間常温で保管した。20分後、チューブを10秒間遠心分離した後にそれぞれの細胞上に振りかけて形質注入(transfection)し、4時間後に新しい培地に交替した。37℃、5%のCO2インキュベーターで24時間の間培養した後、1X PBSで細胞を洗浄し、トリプシン(trypsin)を処理して細胞を離した後、100mm培養皿に移して培養した。2日~3日に一回ずつ抗生剤であるブラストサイジン(blasticidin)を5μg/mlの濃度で含む培地に交替した。細胞クローンを選別してそれぞれを育てた後、RT-PCRでTetRの発現を確認した。
1-1.miR-122発現によるECRT-122Tの抗癌効能の比較
実施例1で製作したECRT-122Tの抗癌効能がmiR-122発現有無によって変わるかを確認した。
実施例1で製作したECRT-122Tの抗癌効果を構成が異なる他のベクターと比較した。
進行性肝癌に対して、1次治療剤で用いられているソラフェニブに感受性のある肝癌でECRT-122Tの抗癌効能を確認した。
肝癌動物モデルでECRT-122Tによる抗癌効能及び肝毒性を確認した。
miR-122の発現量によるリボザイムの作用を分析するために、miR-122発現量とリボザイム発現量の相関関係を分析した。
miR-122の発現量とリボザイムの相互作用をより詳しく分析するため, miR-122の発現量によるリボザイムの作用を分析した。
肝癌患者の正常肝組織と肝癌組織でmiR-122の発現をリアルタイムPCRで分析した。
6-1.細胞実験(in vitro)
miR-122を実質的に発現しない組織の癌細胞株でECRT-122Tの抗癌効能を確認した。
6週齢の雄Balb/c-nunuマウスに膠芽腫細胞であるLN229細胞株1x107個(100μl)又はU87MG細胞株5x106個(100μl)を皮下に注入して腫瘍形成を誘導した。腫瘍が一定サイズに成長すると、ECRT-122Tを発現するアデノウイルスを1.0x109VP(100μl)用量で2日に一回ずつ総3回注入した。GCVは、一番目のウイルス注入24時間後から50mg/kg用量を一日に2回ずつ10日間投与(総20回)した。
7-1.静脈注入
正常ICRマウスにECRT-122Tを発現するアデノウイルスを2.5x1010VP用量で静脈注射で注入し、8日、11日及び15日後に各主要臓器を分離してDNAを抽出した。抽出したDNAを主型にして、リボザイム検出用プライマーセットでPCRを行って主要組織でECRT-122Tの分布を確認した。
ラット(rat)にECRT-122Tを発現するアデノウイルスを2.5x1011VP用量で肝動脈注射(hepatic artery injection)で注入し、前記7-1と同一の方法で主要組織でECRT-122Tの分布を確認した。
8-1.GCV未処理
正常ICRマウスにECRT-122Tアデノウイルスを1回注入し、注入後15日、29日にAST及びALTレベルを測定した。
正常ICRマウスにECRT-122Tアデノウイルスを注入し、GCVを1日2回ずつ10日間投与した後、AST及びALTレベルを測定した。
1-1.抗癌効能の比較
マウス国際標準モデルにHep3B細胞を3x106個注入して肝癌形成を誘導し、CRT-122T又はECRT-122Tベクターを含むアデノウイルスを投与して抗癌効能を比較した。前記CRT-122Tは、ECRT-122TでSV40イントロンスプライシング供与体/受容体(SD/SA)配列、WPREが除去された形態である。
マウス異種移植皮下モデル(mouse xenograft subcutaneous model)にSNU398細胞を注入して腫瘍形成を誘導し、腫瘍が一定サイズ以上に成長すると、CRT-122T又はECRT-122Tベクターを含むアデノウイルスを1x109VP用量で2日に一回ずつ、総2回癌組織内に注入(intratumoral injection、I.T.injection)した。 アデノウイルスを注入した後、マウスを飼育しながら3日間隔で腫瘍サイズ、体重を測定し、22日後にマウスを犠牲させて最終腫瘍サイズ、肝重量、AST(aspartate transaminase)及びALT(alanine transaminase)レベルを測定した。
アデノウイルスの注入用量による毒性を確認するために、正常ICRマウスにECRT又はECRT-122Tアデノウイルスを注入し、注入後2日、7日及び14日にAST及びALTレベルを測定した。
Claims (17)
- (i)サイトメガロウイルス(cytomegalovirus、CMV)プローモーター;及び
(ii)癌特異的遺伝子配列を標的にするトランス-スプライシングリボザイム、前記リボザイムの3'エクソンに連結された目的遺伝子を含む、リボザイム-目的遺伝子発現カセットを含み、
前記発現カセットは、リボザイム-目的遺伝子発現カセットの5'末端にスプライシング供与体/スプライシング受容体配列(splicing donor/splicing acceptor sequence、SD/SA sequence)が連結され、3'末端にWPRE(Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element)が連結されたもので、
(iii)前記WPREの3'末端にマイクロRNA-122(microRNA-122、miR-122)を認識する核酸配列が追加に連結され、
前記癌特異的遺伝子配列は、TERT(Telomerase reverse transcriptase)mRNAであることを特徴とする、組換えベクター。 - 前記TERT mRNA配列は、配列番号2の核酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項1に記載の組換えベクター。
- 前記トランス-スプライシングリボザイムは、配列番号3の核酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項1に記載の組換えベクター。
- 前記目的遺伝子は、癌治療用遺伝子又はレポーター遺伝子であることを特徴とする、請求項1に記載の組換えベクター。
- 前記癌治療用遺伝子は、薬剤感受性遺伝子、細胞死滅遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞毒性遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、サイトカイン遺伝子及び抗新生血管生成遺伝子からなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項4に記載の組換えベクター。
- 前記薬剤感受性遺伝子は、HSVtk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)遺伝子であることを特徴とする、請求項5に記載の組換えベクター。
- 前記HSVtk遺伝子は、配列番号4の核酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項6に記載の組換えベクター。
- 前記レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ(luciferase)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、変形された緑色蛍光タンパク質(modified green fluorescent protein;mGFP)、増強された緑色蛍光タンパク質(enhanced green fluorescent protein;EGFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、変形された赤色蛍光タンパク質(mRFP)、増強された赤色蛍光タンパク質(ERFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、増強された青色蛍光タンパク質(EBFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、増強された黄色蛍光タンパク質(EYFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)又は増強されたシアン蛍光タンパク質(ECFP)であることを特徴とする、請求項4に記載の組換えベクター。
- 前記マイクロRNA-122を認識する核酸配列は、配列番号5の核酸配列を1コピー以上含むものであることを特徴とする、請求項1に記載の組換えベクター。
- 請求項1に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする、遺伝子伝達システム。
- 請求項1に記載の組換えベクター又は請求項10に記載の遺伝子伝達システムを有効成分で含むことを特徴とする、癌の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記癌は、肝癌、膠芽腫、胆管癌、肺癌、膵臓癌、黒色腫、骨癌、乳房癌、大腸癌、胃癌、前立腺癌、白血病、子宮癌、卵巣癌、リンパ腫又は脳癌であることを特徴とする、請求項11に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記癌は、癌組織で発現されるmiR-122のコピー数が前記薬学的組成物により癌組織で発現されるリボザイムのコピー数の100倍未満であることを特徴とする、請求項11に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記癌は、癌組織でmiR-122が実質的に発現されないものであることを特徴とする、請求項13に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記肝癌は、B型肝炎ウイルス(Hepatitis B virus)、肝癌組織でmiR-122の発現が低下されるC型肝炎ウイルス、アルコール、慢性肝炎、肝硬変症、非アルコール性脂肪肝、及びアフラトキシンからなる群より選択されるいずれか一つ以上を原因とするものであることを特徴とする、請求項12に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記薬学的組成物は、静脈内、動脈内、癌組織内及び皮下からなる群より選択される経路で投与されるものであることを特徴とする、請求項11~請求項15のうちいずれか一項に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記薬学的組成物は、注射剤形態で投与されるものであることを特徴とする、請求項11~請求項15のうちいずれか一項に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2019-0021191 | 2019-02-22 | ||
KR20190021191 | 2019-02-22 | ||
KR1020200021014A KR102252423B1 (ko) | 2019-02-22 | 2020-02-20 | 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 |
KR10-2020-0021014 | 2020-02-20 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020146033A JP2020146033A (ja) | 2020-09-17 |
JP7053697B2 true JP7053697B2 (ja) | 2022-04-12 |
Family
ID=70285382
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020028556A Active JP7053697B2 (ja) | 2019-02-22 | 2020-02-21 | 癌特異的トランス-スプライシングリボザイム及びその用途 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11078487B2 (ja) |
JP (1) | JP7053697B2 (ja) |
CN (1) | CN111607610A (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109609505A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-04-12 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种体内筛选的剪切rna的锤头状核酶 |
JP2022543446A (ja) * | 2020-02-28 | 2022-10-12 | アールズィーノミクス・インコーポレイテッド | Apoe4 rna特異的トランススプライシングリボザイム及びその用途 |
CN117347621B (zh) * | 2023-08-25 | 2024-03-12 | 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 | 一种用蛋白模拟抗原-纳米抗体检测黄曲霉毒素b1的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017532032A (ja) | 2014-09-29 | 2017-11-02 | インダストリー−アカデミック コーペレーション ファウンデーション,タングク ユニバーシティー | 癌特異的トランススプライシングリボザイム及びその用途 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101478869B1 (ko) * | 2011-05-26 | 2015-01-06 | 단국대학교 산학협력단 | 마이크로rna를 이용한 조절을 통한 암 특이적 유전자 치료제 |
WO2016052851A1 (ko) | 2014-09-29 | 2016-04-07 | 단국대학교 산학협력단 | 암 특이적 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 이의 용도 |
CN110225977B (zh) * | 2016-11-29 | 2023-05-05 | 阿迪雷尔有限公司 | 基因治疗载体系统和药物前体基因 |
-
2020
- 2020-02-21 JP JP2020028556A patent/JP7053697B2/ja active Active
- 2020-02-21 US US16/797,663 patent/US11078487B2/en active Active
- 2020-02-21 CN CN202010107272.7A patent/CN111607610A/zh active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017532032A (ja) | 2014-09-29 | 2017-11-02 | インダストリー−アカデミック コーペレーション ファウンデーション,タングク ユニバーシティー | 癌特異的トランススプライシングリボザイム及びその用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Hepatology, 2018; 68, Suppl 1, AASLD Abstract (Poster) 882A, Abstract Number: 1550 |
Kim., J., et al., Scientific Reports, 2015; 5, 12315, |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111607610A (zh) | 2020-09-01 |
JP2020146033A (ja) | 2020-09-17 |
US20200270612A1 (en) | 2020-08-27 |
US11078487B2 (en) | 2021-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7048920B2 (en) | Recombinant oncolytic adenovirus for human melanoma | |
JP7053697B2 (ja) | 癌特異的トランス-スプライシングリボザイム及びその用途 | |
US10280420B2 (en) | Cancer specific-splicing ribozyme and use thereof | |
US20080213220A1 (en) | Cancer-targeted viral vectors | |
JP2002507382A (ja) | 組織特異的複製および遺伝子発現のためのベクター | |
US20090156796A1 (en) | Metastatic colon cancer specific promoter and uses thereof | |
EP3733213A1 (en) | Tumor-targeting trans-splicing ribozyme and use thereof | |
KR101478869B1 (ko) | 마이크로rna를 이용한 조절을 통한 암 특이적 유전자 치료제 | |
US7482156B2 (en) | Hepatocellular carcinoma specific promoter and uses thereof | |
CN116670172A (zh) | 表达免疫检查点抑制剂的癌症特异性反式剪接核酶及其用途 | |
KR102471898B1 (ko) | 면역관문 억제제를 발현하는 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 | |
US20230390320A1 (en) | Cancer-specific trans-splicing ribozyme expressing immune checkpoint inhibitor, and use thereor | |
KR20230030063A (ko) | 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임과 키나아제 억제제를 포함하는 암 치료적 병용물 | |
JP2004512380A (ja) | 核酸移送のための糖類と組み合わせたデキストリンポリマーを含む製剤 | |
KR100749859B1 (ko) | VEGF―A 특이적 siRNA를 발현하는 개선된 종양살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스 | |
WO2012121071A1 (ja) | VA-RNAsが発現しないアデノウイルスベクター | |
CN115651932A (zh) | 一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法及其应用 | |
US20020165190A1 (en) | Expression vector coding p972 gene for cancer therapy and adenovirus producing the same | |
WO2015118056A1 (en) | Conditionally replicating adenovirus and use thereof in the treatment of cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200804 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200804 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20210519 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210531 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210830 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220131 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220217 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220307 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220331 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7053697 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |