CN115651932A - 一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法及其应用，先得到LGR5核心启动子，双酶切后替换掉pXC2上E1A的野生型启动子，得到pXC2‑LGR5；再双酶切得到LGR5‑E1A片断后与pSD55相连，得到pSD55‑LGR5；需携带基因时，先获取目的基因，连接到pCA13载体上得到pCA13‑gene，酶切得到基因表达框，连接到pSD55‑LGR5载体上，得到pSD55‑LGR5‑gene质粒；再线性化转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy‑1大肠杆菌BJ5183中重组，产生携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；酶切线性化后，转染到细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒LGR5‑D55‑gene，涉及载体在消化道肿瘤药物中的应用，能够提高消化道肿瘤基因治疗的靶向性，更安全，能有效地抑制肿瘤生长，为治疗癌症提供了新方向。

Description

一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种构建方法及其应用，更具体一点说，涉及一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法及其应用，属于生物技术和基因治疗领域。

背景技术

对于大多数种类的癌症，目前仍然采用的是传统疗法如外科手术、放疗、化疗等，而面对很多中晚期恶性肿瘤，传统疗法显得束手无策，主要表现在治愈率低、复发率及死亡率高、预后较差。基因治疗是通过将外源正常基因导入靶细胞以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，人们对肿瘤的基因治疗寄寓极高的热情，64.2％的基因治疗临床试验均用于肿瘤治疗。到目前为止，肿瘤的基因治疗研究已取得了重要进展；对于恶性肿瘤，基因治疗可利用肿瘤细胞与正常细胞间分子水平的差异，显著拓宽肿瘤的“治疗窗”，能高效地、选择性地杀伤肿瘤细胞或阻止肿瘤细胞生长以及防止肿瘤的转移。

2001年，中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的刘新垣院士突破性的提出了癌症的靶向基因-病毒治疗(Cancer Targeting Gene-Viro Therapy)概念，综合了基因治疗和病毒治疗两者的优势，表现出良好的协同作用，大量的体内、外研究实验表明靶向基因-病毒治疗的效果要明显优于单独的基因治疗或者病毒治疗的效果。其主要是以溶瘤腺病毒为载体，将目的基因插入到病毒基因组中，随着病毒在肿瘤细胞中的不断增殖，抗癌基因也随之发生数百倍乃至千倍的复制，从而大量表达抗癌基因，克服了基因治疗中，基因转染效率低和基因拷贝数低的问题，也解决了病毒治疗中杀伤力弱的问题，成为今后癌症基因治疗、病毒治疗的新趋势。

腺病毒载体具有许多独特的优点：腺病毒相对稳定；安全性较好，在人类的肿瘤细胞中尚未发现有腺病毒的整合，未发现其与人类肿瘤的发生有直接关系；腺病毒基因组较大(36kb)，插入大片段外源性基因的潜力大；腺病毒的感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞；细胞及动物实验表明，腺病毒载体容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白；腺病毒基因组较易操作。

利用肿瘤特异性启动子控制病毒所携带的治疗基因是构建肿瘤靶向性腺病毒的方法之一，其能使治疗基因只能在肿瘤细胞内表达，而在正常细胞中不表达，从而大大降低了肿瘤基因治疗的副反应而增强了其靶向性和疗效。富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat containing G protein coupled receptor 5,LGR5)是G蛋白偶联受体超家族视紫红质亚家族的成员。研究发现，LGR5在肿瘤的发生发展及肿瘤细胞的信号传导过程中具有重要作用。近年研究表明，LGR5消化道肿瘤关系密切，包括肝癌、结肠癌和胰腺癌等，同时也与消化道肿瘤干细胞的干性维持密切相关，是消化道肿瘤的标志物，其异常表达能够促进消化道肿瘤的发生发展，近年来针对该靶点的治疗研究不断增加，针对LGR5的新型治疗方法对消化道肿瘤患者的个性化治疗具有潜在的应用价值。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor，GM-CSF)是一种具有广谱效应的多肽生长因子，它通过结合特定的高亲和力受体起作用，在调节白细胞和造血功能中有重要作用，可以维持造血前体细胞和成熟血细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核/巨噬细胞)的存活；能够促进造血前体细胞(包括粒细胞、单核细胞和巨核细胞等前体细胞)增殖分化，GM-CSF能增强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能，还能增强巨噬细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，对粒细胞和巨噬细胞有直接的趋化作用。GM-CSF作为目前已知功能最强大的免疫调节分子，在增强机体抗肿瘤免疫功能方面显示了良好的应用前景，并被广泛应用于肿瘤的免疫治疗。GM-CSF可通过以下机制参与免疫调节：(1)提高肿瘤细胞MHC分子的表达；(2)诱导树突状细胞的成熟、分化并增强抗肿瘤体液免疫；(3)上调共刺激分子CD86表达，逆转T淋巴细胞免疫耐受；(4)促进效应性T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)在肿瘤部位浸润，杀伤肿瘤细胞。以病毒为载体携带GM-CSF基因用于癌症治疗，已经有多个进入临床试验，例如JX-594、OncoVEX、CGTG-102等，并且显现出非凡的治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于提供具有方法易于掌握，提高了腺病毒载体的靶向性和安全性等技术特点的一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法。

本发明的另一个目的在于提供一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的应用。重组溶瘤腺病毒LGR5-D55-gene，可以制备用于治疗消化道肿瘤的新型基因-病毒药物。可作为消化道肿瘤生物治疗的选择之一，为消化道肿瘤患者带来福音。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法，该构建方法包括如下步骤：

1)利用PCR方法得到LGR5核心启动子(如p312/-188质粒)，用Xho I和SnaB I双酶切后，替换掉pXC2上E1A的野生型启动子，得到pXC2-LGR5；

2)用Xho I和Xba I双酶切pXC2-LGR5得到LGR5-E1A片断，并与同样用Xho I和XbaI双酶切的pSD55相连，得到pSD55-LGR5；当需要携带基因时，通过PCR获得目的基因，连接到经HindⅢ和BamH I双酶切的pCA13载体上得到pCA13-gene，然后用BglⅡ单酶切得到完整的基因表达框，再连接到同样经BglⅡ酶切的pSD55-LGR5载体上，得到pSD55-LGR5-gene质粒；

3)将pSD55-LGR5-gene质粒用PmeI线性化后，转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由LGR5核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；

4)将重组鉴定正确的质粒用Pac I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒LGR5-D55-gene。

利用PCR方法得到LGR5核心启动子中，所述的启动子为p312/-1786、p312/-1188、p312/-888、p312/-688、p312/-388、p312/-188中任一种；所述p312/-1786序列为SEQ IDNO：1所示(2098bp)，所述p312/-1188序列为SEQ ID NO：2所示(1500bp)；所述p312/-888序列为SEQ ID NO：3所示(1200bp)；所述p312/-688序列为SEQ ID NO：4所示(1000bp)；所述p312/-388序列为SEQ ID NO：5所示(700bp)；所述p312/-188序列为SEQ ID NO：6所示(500bp)。

优选的，步骤4中)以LGR5核心启动子和目的基因引物、野毒上游引物：CGCGGGAAAACTGAATAAGA、野毒下游引物：ACCGCCAACATTACAGAGTC进行PCR反应；

对PCR产物进行检测，若PCR产物含LGR5核心启动子和/或目的基因，不含E1B55野生型腺病毒DNA，病毒包装成功，重复步骤4)一次，得到重组正确的目的溶瘤腺病毒LGR5-D55-gene。

优选的，PCR反应体系为：

该PCR条件：94℃×1min，55℃×1min，72℃×1min。

一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的载体，所述载体为LGR5-D55-gene。具体是：将消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子和缺失腺病毒E1B55 kDa区域两种肿瘤靶向优势结合在起来，共同调控腺病毒，从而提供一种更安全的肿瘤双靶向腺病毒载体。该载体具有双重肿瘤靶向性，能作为一种更好的基因－病毒治疗载体平台。

一种所述的载体在消化道肿瘤药物中的应用。

有益效果：筛选并克隆LGR5启动子的核心序列，将其用于控制腺病毒E1A基因转录，从而提高消化道肿瘤基因治疗的靶向性，并且删除了腺病毒的E1B55区，缺失E1B55的腺病毒不能够与正常细胞内p53蛋白结合，而在p53缺失或者突变的肿瘤细胞中能够大量复制，从而达到双靶向性；将消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子和缺失腺病毒E1B55 kDa区域两种肿瘤靶向优势结合在起来，共同调控腺病毒，从而提供一种更安全的肿瘤双靶向腺病毒载体。构建的双靶向溶瘤腺病毒LGR5-D55-gene经实验证明，能选择性的杀死消化道肿瘤细胞，而不影响正常细胞；这种新型双靶向溶瘤腺病毒治疗，能有效地抑制肿瘤生长，为治疗癌症提供了一个优良的新型技术平台。

附图说明

图1为LGR5 mRNA在不同消化道肿瘤细胞和正常细胞系中的相对表达水平图。

图2为LGR5启动子不同长度的片段在肝癌HepG2中的转录效率图之一。

图3为LGR5启动子不同长度的片段在肝癌HepG2中的转录效率之二。

图4为LGR5核心启动子系列在不同消化道肿瘤细胞和正常细胞系中的转录效率图。

图5为体外实验对肝正常细胞L02的存活率影响实验图。

图6为体外实验对肝癌细胞HepG2的特异性杀伤效应图。

图7为体外实验对肝癌细胞SMMC-7721的特异性杀伤效应图。

图8为体外实验对肝癌细胞Huh7的特异性杀伤效应图。

图9为体外实验对结肠癌细胞HCT116的特异性杀伤效应图。

图10为体外实验对胃癌细胞BGC823的特异性杀伤效应图。

图11为体外实验对胰腺癌细胞SW1990的特异性杀伤效应图。

图12为肿瘤双靶向性腺病毒ZD55、LGR5-D55在裸鼠体内治疗结肠癌细胞移植瘤的结果示意图。

图4说明：Basic是一个Promego公司的商业化质粒，就是不携带启动子的阴性对照；CMV是人巨细胞病毒启动子，是目前公认的启动真核基因表达的具有很的启动活性的启动子，一般用作阳性参照。设置不同长度的启动子片断对比的目的是为了说明在此构建的LGR5启动子序列p312/-188具有较高的消化道肿瘤特异性。

具体实施方式

以下结合说明书附图，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。

实施例1图1为LGR5 mRNA在不同消化道肿瘤细胞和正常细胞系中的相对表达水平。

根据LGR5基因序列(NM_003667)设计相关Q-PCR引物：

LGR5基因引物：

Sense：GTCCTTGCCTGTGCTGCTGC；

Anti-sense：CTGAGGTTGGAAGGCAGCT

GAPDH基因引物：

Sense：ATTCCACGGCACAGTCAAGG

Anti-sense：ACATACTCAGCACCAGCATCG

用TRIZOL方法提取处于对数生长期的正常细胞Beas-2B、肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、Huh7、结肠癌细胞HCT116、胃癌细胞BCG823和胰腺癌细胞SW1990的总RNA，逆转录成cDNA作为模板，根据LGR5基因的引物，以GAPDH为内参通过Q-PCR得到LGR5基因的相对表达情况。

具体如下：

Q-PCR反应体系和反应条件为：

将上样好的八连管放入ABI 7500荧光定量PCR仪，设置Q-PCR程序，循环条件为：

仪器在60s退火延伸时，收集数据。

所得到的LGR5基因的相对表达情况为：如图1所示LGR5在正常细胞内表达量较低，在消化道肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、Huh7、结肠癌细胞HCT116、胃癌细胞BCG823和胰腺癌细胞SW1990)中表达量要高于肺正常细胞；根据该相对表达情况，得出LGR5基因在消化道肿瘤中的特异性要高于正常细胞的结论。

综上所述，将LGR5启动子替换腺病毒的野生型启动子，在消化道肿瘤中具有相对较高的安全性和较好的杀伤性。

实施例2新型消化道肿瘤特异LGR5启动子在肿瘤细胞内的活性评估报告基因质粒phRL-TK购自Promega公司，TK启动子控制下表达海肾荧光素酶；萤火虫荧光素酶报告基因分析用质粒pGL3-Basic(不含启动子及增强子)、pGL3-Control(含CMV启动子)购自Promega公司。

1)相关质粒构建

先设计如下引物：

所述pGL3-p312/-1786质粒对应引物为p312(Hind III)和p-1786(Nhe I)；

所述pGL3-p312/-1188质粒对应引物为p312(Hind III)和p-1188(Nhe I)

所述pGL3-p312/-888质粒对应引物为p312(Hind III)和p-888(Nhe I)；

所述pGL3-p312/-688质粒对应引物为p312(Hind III)和p-688(Nhe I)；

所述pGL3-p312/-388质粒对应引物为p312(Hind III)和p-388(Nhe I)；

所述pGL3-p312/-188质粒对应引物为p312(Hind III)和p-188(Nhe I)；

上游引物p312:(Hind III)CCC AAGCTT ggtgcccgaagtaggg

下游引物p-1786:(Nhe I)CTA GCTAGC caaataccatattttcccacatataagtg

下游引物p-1188:(Nhe I)CTAGCTAGCgcacatacactgcacagag

下游引物p-888:(Nhe I)CTAGCTAGCtttcctgcagattcactataggac

下游引物p-688:(Nhe I)CTAGCTAGCaagtgacttctagggtattctaaacc

下游引物p-388:(Nhe I)CTAGCTAGCatcacttcaagtatctcatccattatttg

下游引物p-188:(Nhe I)CTAGCTAGCggcggaggctcagtg

说明：下划线代表酶切位点。

利用上述LGR5启动子两端特异性引物p312:(Hind III)和p-1786:(Nhe I)，以人肝癌细胞HepG2的总DNA基因组为模板，通过PCR方法扩增出LGR5启动子，PCR体系为：

PCR条件为：94℃×45s，58℃×30s，72℃×1.5min。所得序列具体如p312/-1786片段的碱基序列所示；用限制性内切酶Nhe I和Hind III双酶切PCR产物和pGL3-Basic载体，然后进行连接，构建得到含有p312/-1786片段的质粒---pGL3-p312/-1786质粒；

以pGL3-p312/-1786质粒为模板，用携带Nhe I和Hind III酶切位点的不同的引物经PCR(PCR反应体系和反应条件同上)获得含有不同LGR5片段长度的质粒，与Nhe I和HindIII双酶切的pGL3-Basic质粒连接得到pGL3-p312/-1188(即p312/-1188)、pGL3-p312/-888(即p312/-888)、pGL3-p312/-688(即p312/-688)、pGL3-p312/-388(即p312/-388)和pGL3-p312/-188(即p312/-188)质粒。

p312/-1786序列为SEQ ID NO：1

caaataccatattttcccacatataagtgggagctaagctatgaatatgcataagcatacagagtgttaaaacggattttggagatcccaaaaagggagggtaggagaagggtgtgggattaaaaactacatattgggtacaacatacactacttgggtgatgagtgcactaaaatctcaaaattcaccgctgtataattcatccatataaccaaaacccacttgtacccccaaaagccattgaaattttttttaaaatgtttaaaaaaaggaagaaagacacaaggtaggcattctttaaatgtggaaagaatggctaagggaagcaagaataatgtgagaataagcacagagtagcagtgaatgtggtatacatagggaaaagtgaaggaaaagggtgtccagagacgcgggctctctgtactgattgtgcggaaaccggagttaactcacaattttcagtggcactagcactgtcaagtgctttgtttgttgtttgttttttcacccaagaaaggaagatgttcagactacagattgtggtcaagaaattatatattttaggtgaacaaacagcgaggtttggacatgaaggaaggcacatacactgcacagagaaacagctcttcccaactctaaaatttagacgtttatttgggaaattttgttgggcagtctaaatgcaggaagattaaaaaggacttggaaaatcaacagggtatcctgccttcatgatgctgtgaggcattgtgccccagagtgaaaactgcatttttgtgagttggtgtggcaggcttggaataccacctctttcagcagctcactcaggtctggcgagggctatttgtacctcaacgagggcttctctccaagaaagccctgaatccttttcctcctttttcctgcagattcactataggacactttttgaagcaagagcatgcattttccccctggcgctctgcagcggttctcagagcccagtgtcactcacataggtgggactgctctcagttcagagagcgctgggacacttaagatgaaaagtccctggaagttagcaaacagccatctgtcactctggcatcgatttactaaaagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

p312/-1188序列为SEQ ID NO：2

gcacatacactgcacagagaaacagctcttcccaactctaaaatttagacgtttatttgggaaattttgttgggcagtctaaatgcaggaagattaaaaaggacttggaaaatcaacagggtatcctgccttcatgatgctgtgaggcattgtgccccagagtgaaaactgcatttttgtgagttggtgtggcaggcttggaataccacctctttcagcagctcactcaggtctggcgagggctatttgtacctcaacgagggcttctctccaagaaagccctgaatccttttcctcctttttcctgcagattcactataggacactttttgaagcaagagcatgcattttccccctggcgctctgcagcggttctcagagcccagtgtcactcacataggtgggactgctctcagttcagagagcgctgggacacttaagatgaaaagtccctggaagttagcaaacagccatctgtcactctggcatcgatttactaaaagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

p312/-888序列为SEQ ID NO：3

tttcctgcagattcactataggacactttttgaagcaagagcatgcattttccccctggcgctctgcagcggttctcagagcccagtgtcactcacataggtgggactgctctcagttcagagagcgctgggacacttaagatgaaaagtccctggaagttagcaaacagccatctgtcactctggcatcgatttactaaaagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

p312/-688序列为SEQ ID NO：4

aagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

p312/-388序列为SEQ ID NO：5

atcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

p312/-188序列为SEQ ID NO：6

gcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

2)LGR5启动子在消化道肿瘤细胞内的活性评估

将处于对数生长期的消化道肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、Huh7、结肠癌细胞HCT116、胃癌细胞BCG823和胰腺癌细胞SW1990)按1×10⁴个/孔接种于96孔培养板中(培养条件为：10％小牛血清的DMEM培养基(DMEM购自Hyclone公司)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养)，分别进行如下操作：

待细胞贴壁后，用Thermo公司的R^#0531转染试剂将p312/-1786含萤火虫荧光素酶报告基因质粒0.2μg，内参海肾荧光素酶报告基因phRL-TK 1×10^-3μg共转染细胞。培养48h后(培养条件为：10％小牛血清的DMEM培养基(DMEM购自Hyclone公司)，于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养，去除培养基，用PBS洗两次，加入20μL PLB被动裂解液(Promega公司)，室温裂解15min，把裂解液(即裂解后所得的液态物)转移到检测试管中，检测萤火虫荧光素酶活性，加入65μL的LARⅡ(Promega公司)反应(室温，2sec)，用化学发光仪读取10sec发光光子数(RLU)，然后检测海肾荧光素酶活性，加入Stop&Glo试剂(Promega公司)65μL反应(室温，2sec)，用化学发光仪读取10sec发光光子数(RLU)。计算萤火虫荧光素酶RLU/海肾荧光素酶RLU(按照试剂说明书操作)，即得相对荧光素酶活性。

如图2-3所示，在肝癌细胞HepG2中不同截短长度LGR5启动子相比CMV启动子的启动效率。

将处于对数生长期的肝癌细胞HepG2按1×10⁴个/孔接种于96孔培养板中，细胞贴壁后，用Thermo公司的R^#0531转染试剂将本发明构建得到pGL3-p312/-1786、pGL3-p312/-1188、pGL3-p312/-888、pGL3-p312/-688、pGL3-p312/-388和pGL3-p312/-188含萤火虫荧光素酶报告基因质粒0.2μg，内参海肾荧光素酶报告基因phRL-TK 1×10^-3μg共转染细胞。48h后，去除培养基，用PBS洗两次，加入20μLPLB被动裂解液(Promega公司)，室温裂解15min，把裂解液转移到检测试管中，分别检测萤火虫荧光素酶RLU和海肾荧光素酶RLU，然后计算萤火虫荧光素酶RLU/海肾荧光素酶RLU即得相对荧光素酶活性。

如图2-3所示，在所有质粒中pGL3-p312/-188质粒在肝癌细胞HepG2中具有较高的启动活性，并且序列较短，因此，检测该启动子在上述消化道肿瘤细胞和正常细胞Beas-2B中的转录活性。操作方法如上。

如图4所示，相比正常细胞Beas-2B，pGL3-p312/-188在所检测的消化道肿瘤细胞中均具有较高的转录活性。

实施例3双靶向消化道肿瘤溶瘤腺病毒的构建

1)相关质粒的构建(下划线为所列酶切位点序列)

p312:(SnaB I)TAGTACGTAggtgcccgaagtaggg

p-188:(Xho I)CGCTCGAGggcggaggctcagtg

GM-CSF(sense)：(Hind III)CCAAGCTTATGTGGCTGCAGAGCCTGCT

GM-CSF(Anti-sense)：(BamH I)ATGGATCCTCACTCCTGGACTGGCTC

mGM-CSF(sense)：(Hind III)CCCAAGCTTATGTGGCTGCAGAATTTAC

mGM-CSF(Anti-sense)：(BamH I)CGGGATCCTCATTTTTGGCCTGGTT

EGFP(sense)：(BamHI)ATGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG

EGFP(antisense)：(HindIII)CCTAAGCTTTTATCTAGATCCGGTGGATC

以健康人外周血提取的基因组总RNA为模板，通过RT-PCR扩增出cDNA，用GM-CSF上下游引物PCR得到GM-CSF基因，PCR反应体系为：

PCR条件为94℃×45s，55℃×30s，72℃×30s。

以小鼠外周血提取的基因组总RNA为模板，通过RT-PCR扩增出cDNA，用mGM-CSF上下游引物PCR得到mGM-CSF基因，PCR反应体系为：

PCR条件为94℃×45s，56℃×30s，72℃×30s。

以质粒pEGFP-C1为模板，通过PCR方法进行扩增，PCR反应体系和所用引物具体如下；PCR条件：94℃×45s，55℃×30s，72℃×1min。扩增的产物即为EGFP基因；

所用引物：EGFP(sense)：(BamH I)

ATGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG，

EGFP(antisense)：(Hind III)

CCTAAGCTTTTATCTAGATCCGGTGGATC；

反应体系：

将以上基因用BamH I和Hind III双酶切，克隆到同样双酶切的pCA13上，得到pCA13-GM-CSF、pCA13-mGM-CSF、pCA13-EGFP质粒。

说明：pCA13属于常规载体，购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299-+72)及SV40 poly A加尾信号。

用p312(SnaBI)和p-188(XhoI)引物以构建好的p312/p-1786质粒为模板，通过PCR方法进行扩增，PCR体系为：

PCR条件：94℃×45s，55℃×30s，72℃×45s。得到产物用SnaB I和Xho I双酶切，克隆到pXC2(常规载体，事先用SnaB I和Xho I双酶切)上，得到携带LGR5核心启动子的pXC2-LGR5质粒。

说明：以p312/p-1786质粒为模板，上述扩增所得为p312/p-188。

用Xho I和Xba I双酶切pXC2-LGR5得到LGR5-E1A片断，与同样用Xho I和Xba I双酶切的pSD55相连，得到pSD55-LGR5。如需携带基因，要通过PCR获得目的基因，连接到用HindⅢ和BamH I双酶切的pCA13上得到pCA13-gene，然后用BglⅡ酶切得到完整的基因表达框，连接到同样BglⅡ酶切的pSD55-LGR5上，得到pSD55-LGR5-gene质粒。

说明：pSD55属于pShuttle质粒添加Ad5 E1区(删除了E1B55区)构建而成的，pShuttle质粒为常规载体。

将pSD55-LGR5-gene质粒用PmeI线性化后转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由LGR5核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体。

说明：发表于2007年Nature Protocols上的《A protocol for rapid generationof recombinant adenoviruses using the AdEasy system》已经详细叙述了上述含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183。

2)双靶向消化道肿瘤溶瘤腺病毒的构建

将重组构建好的LGR5核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒用Pac I线性化，去磷酸酸化后，转染到人胚肾细胞293A中包装病毒。以捷瑞公司Blood Kit抽提所得的病毒DNA(即上文中所告知的通过重组所构建的在293A细胞中扩增包装的病毒)作为模板，同时以野生型病毒DNA作为对照，以上述LGR5核心启动子和目的基因引物、野毒上游引物：CGCGGGAAAACTGAATAAGA野毒下游引物：ACCGCCAACATTACAGAGTC进行PCR反应。

PCR反应体系为：

PCR条件：94℃×1min，55℃×1min，72℃×1min。对PCR产物进行检测，如PCR产物含LGR5核心启动子和/或目的基因，不含E1B55野生型腺病毒DNA，病毒包装成功。重复此过程一次，得到重组正确的腺病毒(即，肝癌双靶向溶瘤腺病毒，目的溶瘤腺病毒LGR5-D55-gene)。重复此过程一次的目的是：防止假阳性的现象，确保正确。

肝癌双靶向溶瘤腺病毒在293A细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心纯化病毒。具体操作方法见Microbix Biosystem Inc.的操作说明。

实施例4双靶向溶瘤腺病毒LGR5-D55在体外对正常细胞和消化道肿瘤细胞的杀伤能力检测

细胞经病毒处理后的存活率由MTT法检测。步骤如下：将人正常肝细胞L02和消化道肿瘤细胞(肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721和Huh7、结肠癌细胞HCT116、胃癌细胞BCG823、胰腺癌细胞SW1990)以5000个每孔的量铺入96孔板，贴壁后分别加入0.5MOI(每个细胞感染子数,Multiple of infection/Cell)、1MOI、2MOI、5MOI和10MOI的病毒(消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒)，病毒处理48小时后进行细胞存活率的检测。加入20μl的5mg/mL的MTT溶液，37℃继续培养4h后，去除孔内培养液，然后每孔加入150μl二甲基亚砜，摇床缓慢振荡15min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上测定OD490值。细胞存活率＝(病毒感染孔吸光值-调零孔吸光值)/(对照孔吸光值-调零孔吸光值)×100％。上述细胞培养均为37℃，5％CO₂恒温培养；培养基为10％小牛血清的DMEM培养基(DMEM购自Hyclone)。

结果如图5-11所示，消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒LGR5-D55对肿瘤细胞有一定的杀伤作用，而对正常细胞毒性很小，具有肿瘤靶向性。

图5-11中，“ZD55”和“LGR5-D55”均为腺病毒。ZD55是带有内源性E1A启动子且删除E1B55区的腺病毒；LGR5-D55是构建的用LGR5启动子替换了ZD55内源性E1A启动子的腺病毒。

实施例5双靶向溶瘤腺病毒LGR5-D55在裸鼠体内治疗肿瘤移植瘤：

将4-5周龄的雌性裸鼠皮下接种结直肠癌细胞HCT116，每只裸鼠为5×10⁶细胞，1-2周后当肿瘤达到100～150mm³进行动物分组。治疗组为两组分别给予2×10⁹pfu/mice的ZD55、LGR5-D55进行治疗，对照组是磷酸缓冲液(PBS)，采用瘤内注射治疗。试验结果如图12所示，消化道肿瘤双靶向性溶瘤腺病毒LGR5-D55能够抑制移植结直肠癌的生长，延长荷瘤裸鼠生命周期。

本发明筛选得到具有消化道肿瘤特异性、高效性的启动子LGR5核心启动子，采用选择性复制溶瘤腺病毒策略进行消化道肿瘤基因治疗，为了解决消化道肿瘤基基因治疗中的靶向性、特异性问题，构建了LGR5核心启动子调控的删除E1B55和E3区的肝癌靶向性溶瘤腺病毒LGR5-D55-gene，并进行初步体外消化道肿瘤特异杀伤研究，取得了预期的对消化道肿瘤细胞的特异杀伤效果。利用本发明的重组溶瘤腺病毒，可以制备用于治疗消化道肿瘤的新型基因-病毒药物。本发明的重组溶瘤腺病毒可作为消化道肿瘤生物治疗的选择之一，为消化道肿瘤患者带来福音。

最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

发明名称: 一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法及其应用

第一申请人：浙江理工大学

第二申请人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司

p312/-1786：2098 bp(Nhe ⅠandHindⅢ)载体：pGL3-Basic

p312/-1786 F PCR:5’- CTAGCTAGCcaaataccatattttcccacatataagtg-3’

lgr5 R PCR: 5’-CCCAAGCTTggtgcccgaagtaggg-3’

SEQ ID NO：1:

caaataccatattttcccacatataagtgggagctaagctatgaatatgcataagcatacagagtgttaaaacggattttggagatcccaaaaagggagggtaggagaagggtgtgggattaaaaactacatattgggtacaacatacactacttgggtgatgagtgcactaaaatctcaaaattcaccgctgtataattcatccatataaccaaaacccacttgtacccccaaaagccattgaaattttttttaaaatgtttaaaaaaaggaagaaagacacaaggtaggcattctttaaatgtggaaagaatggctaagggaagcaagaataatgtgagaataagcacagagtagcagtgaatgtggtatacatagggaaaagtgaaggaaaagggtgtccagagacgcgggctctctgtactgattgtgcggaaaccggagttaactcacaattttcagtggcactagcactgtcaagtgctttgtttgttgtttgttttttcacccaagaaaggaagatgttcagactacagattgtggtcaagaaattatatattttaggtgaacaaacagcgaggtttggacatgaaggaaggcacatacactgcacagagaaacagctcttcccaactctaaaatttagacgtttatttgggaaattttgttgggcagtctaaatgcaggaagattaaaaaggacttggaaaatcaacagggtatcctgccttcatgatgctgtgaggcattgtgccccagagtgaaaactgcatttttgtgagttggtgtggcaggcttggaataccacctctttcagcagctcactcaggtctggcgagggctatttgtacctcaacgagggcttctctccaagaaagccctgaatccttttcctcctttttcctgcagattcactataggacactttttgaagcaagagcatgcattttccccctggcgctctgcagcggttctcagagcccagtgtcactcacataggtgggactgctctcagttcagagagcgctgggacacttaagatgaaaagtccctggaagttagcaaacagccatctgtcactctggcatcgatttactaaaagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

p312/-1188：1500 bp(Nhe ⅠandHindⅢ)载体：pGL3-Basic

p312/-1188 F PCR: 5’-CTAGCTAGgcacatacactgcacagag-3’

lgr5 R PCR: 5’-CCCAAGCTTggtgcccgaagtaggg-3’

SEQ ID NO：2

gcacatacactgcacagagaaacagctcttcccaactctaaaatttagacgtttatttgggaaattttgttgggcagtctaaatgcaggaagattaaaaaggacttggaaaatcaacagggtatcctgccttcatgatgctgtgaggcattgtgccccagagtgaaaactgcatttttgtgagttggtgtggcaggcttggaataccacctctttcagcagctcactcaggtctggcgagggctatttgtacctcaacgagggcttctctccaagaaagccctgaatccttttcctcctttttcctgcagattcactataggacactttttgaagcaagagcatgcattttccccctggcgctctgcagcggttctcagagcccagtgtcactcacataggtgggactgctctcagttcagagagcgctgggacacttaagatgaaaagtccctggaagttagcaaacagccatctgtcactctggcatcgatttactaaaagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

p312/-888：1200 bp(Nhe ⅠandHindⅢ)载体：pGL3-Basic

p312/-888 F PCR:5’- CTAGCTAGtttcctgcagattcactataggac-3’

lgr5 R PCR: 5’-CCCAAGCTTggtgcccgaagtaggg-3’

SEQ ID NO：3

tttcctgcagattcactataggacactttttgaagcaagagcatgcattttccccctggcgctctgcagcggttctcagagcccagtgtcactcacataggtgggactgctctcagttcagagagcgctgggacacttaagatgaaaagtccctggaagttagcaaacagccatctgtcactctggcatcgatttactaaaagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

p312/-688：1000 bp(Nhe ⅠandHindⅢ)载体：pGL3-Basic

p312/-688 F PCR:5’-CTAGCTAGaagtgacttctagggtattctaaacc-3’

lgr5 R PCR: 5’-CCCAAGCTTggtgcccgaagtaggg-3’

SEQ ID NO：4

aagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

p312/-388：700 bp(Nhe ⅠandHindⅢ)载体：pGL3-Basic

p312/-388 F PCR: 5’-CTAGCTAGatcacttcaagtatctcatccattatttg-3’

lgr5 R PCR: 5’-CCCAAGCTTggtgcccgaagtaggg-3’

SEQ ID NO：5

atcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

p312/-188：500 bp (Nhe ⅠandHindⅢ)载体：pGL3-Basic

p312/-188 F PCR: 5’-CTAGCTAGggcggaggctcagtg-3’

lgr5 R PCR: 5’-CCCAAGCTTggtgcccgaagtaggg-3’

SEQ ID NO：6

gcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

Claims (8)

1.一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于该构建方法包括如下步骤：

1)利用PCR方法得到LGR5核心启动子，用Xho I和SnaB I双酶切后，替换掉pXC2上E1A的野生型启动子，得到pXC2-LGR5；

2)用Xho I和Xba I双酶切pXC2-LGR5得到LGR5-E1A片断，并与同样用Xho I和Xba I双酶切的pSD55相连，得到pSD55-LGR5；当需要携带基因时，通过PCR获得目的基因，连接到经HindⅢ和BamH I双酶切的pCA13载体上得到pCA13-gene，然后用BglⅡ单酶切得到完整的基因表达框，再连接到同样经BglⅡ酶切的pSD55-LGR5载体上，得到pSD55-LGR5-gene质粒；

3)将pSD55-LGR5-gene质粒用PmeI线性化后，转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生E1A区由LGR5核心启动子控制的以及缺失E1B55和E3区携带目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；

4)将重组鉴定正确的质粒用Pac I酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒LGR5-D55-gene。

2.根据权利要求1所述的一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：步骤4中)以LGR5核心启动子和目的基因引物、野毒上游引物：CGCGGGAAAACTGAATAAGA、野毒下游引物：ACCGCCAACATTACAGAGTC进行PCR反应；

对PCR产物进行检测，若PCR产物含LGR5核心启动子和/或目的基因，不含E1B55野生型腺病毒DNA，病毒包装成功，重复步骤4)一次，得到重组正确的目的溶瘤腺病毒LGR5-D55-gene。

3.根据权利要求2所述的一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：PCR反应体系为：

该PCR条件：94℃×1min，55℃×1min，72℃×1min。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：启动子为p312/-1786、p312/-1188、p312/-888、p312/-688、p312/-388、p312/-188中任一种。

5.根据权利要求4所述的一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：所述p312/-1786序列为SEQ ID NO：1所示，所述p312/-1188序列为SEQ ID NO：2所示；所述p312/-888序列为SEQ ID NO：3所示；所述p312/-688序列为SEQ ID NO：4所示；所述p312/-388序列为SEQ ID NO：5所示；所述p312/-188序列为SEQ ID NO：6所示。

6.根据权利要求5所述的一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：所述p312/-1786质粒含有2098bp，所述p312/-1188质粒含有1500bp；所述p312/-888质粒含有1200bp；所述p312/-688质粒含有1000bp；所述p312/-388质粒含有700bp；所述p312/-188质粒含有500bp。

7.一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的载体，其特征在于：所述载体为LGR5-D55-gene。

8.一种如权利要求7所述的载体在消化道肿瘤药物中的应用。

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