CN114410626A - 一种新型的消化道肿瘤特异性lgr5核心启动子及其筛选构建方法 - Google Patents

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CN114410626A CN202111508792.XA CN202111508792A CN114410626A CN 114410626 A CN114410626 A CN 114410626A CN 202111508792 A CN202111508792 A CN 202111508792A CN 114410626 A CN114410626 A CN 114410626A
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Abstract

本发明公开的是一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子及其筛选构建方法，启动子为p312/‑1786、p312/‑1188、p312/‑888、p312/‑688、p312/‑388、p312/‑188中任一种，用PCR方法，以DNA基因组为模板，使用LGR5启动子特异性引物，得到PCR产物为LGR5启动子全长序列p312/‑1786，用Nhe I和Hind III双酶切，并且与pGL3‑Basic质粒连接，得到pGL3‑p312/‑1786质粒；以pGL3‑p312/‑1786为模板，用携带Nhe I和Hind III酶切位点的不同的引物，经PCR获得含有不同LGR5启动子片段长度的质粒，并与pGL3‑Basic质粒连接，分别得到对应的质粒，具有高效的消化道肿瘤特异性，易于掌握、提高了腺病毒载体的靶向性和安全性。

Description

一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子及其筛选构建 方法
技术领域
本发明涉及一种核心启动子及其筛选构建方法，更具体一点说，涉及一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子及其筛选构建方法，属于生物技术和基因治疗领域。
背景技术
对于大多数种类的癌症，目前仍然采用的是传统疗法如外科手术、放疗、化疗等，而面对很多中晚期恶性肿瘤，传统疗法显得束手无策，主要表现在治愈率低、复发率及死亡率高、预后较差。基因治疗是通过将外源正常基因导入靶细胞以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，人们对肿瘤的基因治疗寄寓极高的热情，64.2％的基因治疗临床试验均用于肿瘤治疗。到目前为止，肿瘤的基因治疗研究已取得了重要进展；对于恶性肿瘤，基因治疗可利用肿瘤细胞与正常细胞间分子水平的差异，显著拓宽肿瘤的“治疗窗”，能高效地、选择性地杀伤肿瘤细胞或阻止肿瘤细胞生长以及防止肿瘤的转移。
2001年，中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的刘新垣院士突破性的提出了癌症的靶向基因-病毒治疗(Cancer Targeting Gene-Viro Therapy)概念，综合了基因治疗和病毒治疗两者的优势，表现出良好的协同作用，大量的体内、外研究实验表明靶向基因-病毒治疗的效果要明显优于单独的基因治疗或者病毒治疗的效果。其主要是以溶瘤腺病毒为载体，将目的基因插入到病毒基因组中，随着病毒在肿瘤细胞中的不断增殖，抗癌基因也随之发生数百倍乃至千倍的复制，从而大量表达抗癌基因，克服了基因治疗中，基因转染效率低和基因拷贝数低的问题，也解决了病毒治疗中杀伤力弱的问题，成为今后癌症基因治疗、病毒治疗的新趋势。
腺病毒载体具有许多独特的优点：腺病毒相对稳定；安全性较好，在人类的肿瘤细胞中尚未发现有腺病毒的整合，未发现其与人类肿瘤的发生有直接关系；腺病毒基因组较大(36kb)，插入大片段外源性基因的潜力大；腺病毒的感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞；细胞及动物实验表明，腺病毒载体容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活性蛋白；腺病毒基因组较易操作。
利用肿瘤特异性启动子控制病毒所携带的治疗基因是构建肿瘤靶向性腺病毒的方法之一，其能使治疗基因只能在肿瘤细胞内表达，而在正常细胞中不表达，从而大大降低了肿瘤基因治疗的副反应而增强了其靶向性和疗效。富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat containing G protein coupled receptor 5,LGR5)是G蛋白偶联受体超家族视紫红质亚家族的成员。研究发现， LGR5在肿瘤的发生发展及肿瘤细胞的信号传导过程中具有重要作用。近年研究表明，LGR5消化道肿瘤关系密切，包括肝癌、结肠癌和胰腺癌等，同时也与消化道肿瘤干细胞的干性维持密切相关，是消化道肿瘤的标志物，其异常表达能够促进消化道肿瘤的发生发展，近年来针对该靶点的治疗研究不断增加，针对LGR5的新型治疗方法对消化道肿瘤患者的个性化治疗具有潜在的应用价值。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor，GM-CSF)是一种具有广谱效应的多肽生长因子，它通过结合特定的高亲和力受体起作用，在调节白细胞和造血功能中有重要作用，可以维持造血前体细胞和成熟血细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核/巨噬细胞)的存活；能够促进造血前体细胞(包括粒细胞、单核细胞和巨核细胞等前体细胞)增殖分化， GM-CSF能增强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能，还能增强巨噬细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，对粒细胞和巨噬细胞有直接的趋化作用。 GM-CSF作为目前已知功能最强大的免疫调节分子，在增强机体抗肿瘤免疫功能方面显示了良好的应用前景，并被广泛应用于肿瘤的免疫治疗。GM-CSF可通过以下机制参与免疫调节：(1)提高肿瘤细胞MHC分子的表达；(2)诱导树突状细胞的成熟、分化并增强抗肿瘤体液免疫；(3)上调共刺激分子CD86表达，逆转T淋巴细胞免疫耐受；(4)促进效应性T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞) 在肿瘤部位浸润，杀伤肿瘤细胞。以病毒为载体携带GM-CSF基因用于癌症治疗，已经有多个进入临床试验，例如JX-594、OncoVEX、CGTG-102等，并且显现出非凡的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供具有高效的消化道肿瘤特异性等技术特点的一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子
本发明的另一个目的在于提供具有易于掌握、提高了腺病毒载体的靶向性和安全性一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子的筛选构建方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子，启动子为 p312/-1786、p312/-1188、p312/-888、p312/-688、p312/-388、p312/-188中任一种；所述p312/-1786序列为SEQ ID NO：1所示(2098bp)，所述p312/-1188序列为SEQ ID NO：2所示(1500bp)；所述p312/-888序列为SEQ ID NO：3所示 (1200bp)；所述p312/-688序列为SEQ ID NO：4所示(1000bp)；所述p312/-388 序列为SEQ ID NO：5所示(700bp)；所述p312/-188序列为SEQ IDNO：6 所示(500bp)。
优选的，该筛选构建包括如下步骤：
步骤1)用PCR方法，以人肝癌细胞HepG2的总DNA基因组为模板，使用LGR5启动子特异性引物，得到PCR产物为LGR5启动子全长序列p312/-1786，用Nhe I和Hind III双酶切，并且与同样用Nhe I和Hind III双酶切的pGL3-Basic 质粒连接，得到pGL3-p312/-1786质粒；
步骤2)以pGL3-p312/-1786为模板，用携带Nhe I和Hind III酶切位点的不同的引物，经PCR获得含有不同LGR5启动子片段长度的质粒，并与Nhe I 和Hind III双酶切的pGL3-Basic质粒连接，得到pGL3-p312/-1188质粒、 pGL3-p312/-888质粒、pGL3-p312/-688质粒、pGL3-p312/-388质粒和 pGL3-p312/-188质粒。
优选的，所述LGR5启动子特异性引物为p312 Hind III和p-1786Nhe I；
其中，上游引物p312 Hind III：CCC AAGCTT ggtgcccgaagtaggg；
下游引物p-1786Nhe I：CTA GCTAGC caaataccatattttcccacatataagtg。
所述pGL3-p312/-1188质粒对应引物为p312 Hind III和p-1188Nhe I；
所述pGL3-p312/-888质粒对应引物为p312(Hind III)和p-888(Nhe I)；
所述pGL3-p312/-688质粒对应引物为p312(Hind III)和p-688(Nhe I)；
所述pGL3-p312/-388质粒对应引物为p312(Hind III)和p-388(Nhe I)；
所述pGL3-p312/-188质粒对应引物为p312(Hind III)和p-188(Nhe I)；
上游引物p312(Hind III)CCC AAGCTT ggtgcccgaagtaggg；
下游引物p-1188Nhe I：CTAGCTAGCgcacatacactgcacagag；
下游引物p-888 Nhe I：CTAGCTAGCtttcctgcagattcactataggac；
下游引物p-688 Nhe I：CTAGCTAGCaagtgacttctagggtattctaaacc；
下游引物p-388 Nhe I：CTAGCTAGCatcacttcaagtatctcatccattatttg；
下游引物p-188 Nhe I：CTAGCTAGCggcggaggctcagtg。
其中，下划线代表酶切位点。
优选的，PCR体系均为：
Figure RE-GDA0003562105930000051
优选的，所述PCR条件均为：94℃×45s，58℃×30s，72℃×1.5min。
有益效果：本发明提供了上述新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子的核心序列，得到具有较高启动活性的转录序列片段，通过筛选的该启动子的核心序列得到具有较高消化道肿瘤启动活性的序列。
附图说明
图1为LGR5 mRNA在不同消化道肿瘤细胞和正常细胞系中的相对表达水平图。
图2为LGR5启动子不同长度的片段在肝癌HepG2中的转录效率图之一。
图3为LGR5启动子不同长度的片段在肝癌HepG2中的转录效率之二。
图4为LGR5核心启动子系列在不同消化道肿瘤细胞和正常细胞系中的转录效率图。
图5为体外实验对肝正常细胞L02的存活率影响实验图。
图4说明：Basic是一个Promego公司的商业化质粒，就是不携带启动子的阴性对照；CMV是人巨细胞病毒启动子，是目前公认的启动真核基因表达的具有很的启动活性的启动子，一般用作阳性参照。设置不同长度的启动子片断对比的目的是为了说明在此构建的LGR5启动子序列p312/-188具有较高的消化道肿瘤特异性。
具体实施方式
以下结合说明书附图，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1图1为LGR5 mRNA在不同消化道肿瘤细胞和正常细胞系中的相对表达水平。
根据LGR5基因序列(NM_003667)设计相关Q-PCR引物：
LGR5基因引物：
Sense：GTCCTTGCCTGTGCTGCTGC；
Anti-sense：CTGAGGTTGGAAGGCAGCT
GAPDH基因引物：
Sense：ATTCCACGGCACAGTCAAGG
Anti-sense：ACATACTCAGCACCAGCATCG
用TRIZOL方法提取处于对数生长期的正常细胞Beas-2B、肝癌细胞HepG2、 SMMC-7721、Huh7、结肠癌细胞HCT116、胃癌细胞BCG823和胰腺癌细胞 SW1990的总RNA，逆转录成cDNA作为模板，根据LGR5基因的引物，以 GAPDH为内参通过Q-PCR得到LGR5基因的相对表达情况。
具体如下：
Q-PCR反应体系和反应条件为：
Figure RE-GDA0003562105930000061
Figure RE-GDA0003562105930000071
将上样好的八连管放入ABI 7500荧光定量PCR仪，设置Q-PCR程序，循环条件为：
Figure RE-GDA0003562105930000072
仪器在60s退火延伸时，收集数据。
所得到的LGR5基因的相对表达情况为：如图1所示LGR5在正常细胞内表达量较低，在消化道肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、Huh7、结肠癌细胞HCT116、胃癌细胞BCG823和胰腺癌细胞SW1990)中表达量要高于肺正常细胞；根据该相对表达情况，得出LGR5基因在消化道肿瘤中的特异性要高于正常细胞的结论。
综上所述，将LGR5启动子替换腺病毒的野生型启动子，在消化道肿瘤中具有相对较高的安全性和较好的杀伤性。
实施例2新型消化道肿瘤特异LGR5启动子在肿瘤细胞内的活性评估报告基因质粒phRL-TK购自Promega公司，TK启动子控制下表达海肾荧光素酶；萤火虫荧光素酶报告基因分析用质粒pGL3-Basic(不含启动子及增强子)、 pGL3-Control(含CMV启动子)购自Promega公司。
1)相关质粒构建
先设计如下引物：
所述pGL3-p312/-1786质粒对应引物为p312(Hind III)和p-1786(Nhe I)；
所述pGL3-p312/-1188质粒对应引物为p312(Hind III)和p-1188(Nhe I) 所述pGL3-p312/-888质粒对应引物为p312(Hind III)和p-888(Nhe I)；
所述pGL3-p312/-688质粒对应引物为p312(Hind III)和p-688(Nhe I)；
所述pGL3-p312/-388质粒对应引物为p312(Hind III)和p-388(Nhe I)；
所述pGL3-p312/-188质粒对应引物为p312(Hind III)和p-188(Nhe I)；
上游引物p312:(Hind III)CCC AAGCTT ggtgcccgaagtaggg
下游引物p-1786:(Nhe I)CTA GCTAGC caaataccatattttcccacatataagtg
下游引物p-1188:(Nhe I)CTAGCTAGCgcacatacactgcacagag
下游引物p-888:(Nhe I)CTAGCTAGCtttcctgcagattcactataggac
下游引物p-688:(Nhe I)CTAGCTAGCaagtgacttctagggtattctaaacc
下游引物p-388:(Nhe I)CTAGCTAGCatcacttcaagtatctcatccattatttg
下游引物p-188:(Nhe I)CTAGCTAGCggcggaggctcagtg
说明：下划线代表酶切位点。
说明：下划线代表酶切位点。
利用上述LGR5启动子两端特异性引物p312:(Hind III)和p-1786:(Nhe I)，以人肝癌细胞HepG2的总DNA基因组为模板，通过PCR方法扩增出LGR5 启动子，PCR体系为：
Figure RE-GDA0003562105930000081
Figure RE-GDA0003562105930000091
PCR条件为：94℃×45s，58℃×30s，72℃×1.5min。所得序列具体如 p312/-1786片段的碱基序列所示；用限制性内切酶Nhe I和Hind III双酶切PCR 产物和pGL3-Basic载体，然后进行连接，构建得到含有p312/-1786片段的质粒 ---pGL3-p312/-1786质粒；
以pGL3-p312/-1786质粒为模板，用携带Nhe I和Hind III酶切位点的不同的引物经PCR(PCR反应体系和反应条件同上)获得含有不同LGR5片段长度的质粒，与Nhe I和HindIII双酶切的pGL3-Basic质粒连接得到pGL3-p312/-1188 (即p312/-1188)、pGL3-p312/-888(即p312/-888)、pGL3-p312/-688(即 p312/-688)、pGL3-p312/-388(即p312/-388)和pGL3-p312/-188(即p312/-188) 质粒。
p312/-1786序列为SEQ ID NO：1
caaataccatattttcccacatataagtgggagctaagctatgaatatgcataagcatacagagtgttaaaacggattt tggagatcccaaaaagggagggtaggagaagggtgtgggattaaaaactacatattgggtacaacatacactacttgggt gatgagtgcactaaaatctcaaaattcaccgctgtataattcatccatataaccaaaacccacttgtacccccaaaagccatt gaaattttttttaaaatgtttaaaaaaaggaagaaagacacaaggtaggcattctttaaatgtggaaagaatggctaagggaa gcaagaataatgtgagaataagcacagagtagcagtgaatgtggtatacatagggaaaagtgaaggaaaagggtgtcca gagacgcgggctctctgtactgattgtgcggaaaccggagttaactcacaattttcagtggcactagcactgtcaagtgcttt gtttgttgtttgttttttcacccaagaaaggaagatgttcagactacagattgtggtcaagaaattatatattttaggtgaacaaa cagcgaggtttggacatgaaggaaggcacatacactgcacagagaaacagctcttcccaactctaaaatttagacgtttatt tgggaaattttgttgggcagtctaaatgcaggaagattaaaaaggacttggaaaatcaacagggtatcctgccttcatgatg ctgtgaggcattgtgccccagagtgaaaactgcatttttgtgagttggtgtggcaggcttggaataccacctctttcagcagctcactcaggtctggcgagggctatttgtacctcaacgagggcttctctccaagaaagccctgaatccttttcctcctttttcctg cagattcactataggacactttttgaagcaagagcatgcattttccccctggcgctctgcagcggttctcagagcccagtgtc actcacataggtgggactgctctcagttcagagagcgctgggacacttaagatgaaaagtccctggaagttagcaaacag ccatctgtcactctggcatcgatttactaaaagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcga cttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagag ctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccgggga cgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttc aagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccg aagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggc gcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtg caagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagcca gggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtgg ggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgcca cggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc
p312/-1188序列为SEQ ID NO：2
gcacatacactgcacagagaaacagctcttcccaactctaaaatttagacgtttatttgggaaattttgttgggcagtct aaatgcaggaagattaaaaaggacttggaaaatcaacagggtatcctgccttcatgatgctgtgaggcattgtgccccaga gtgaaaactgcatttttgtgagttggtgtggcaggcttggaataccacctctttcagcagctcactcaggtctggcgagggct atttgtacctcaacgagggcttctctccaagaaagccctgaatccttttcctcctttttcctgcagattcactataggacacttttt gaagcaagagcatgcattttccccctggcgctctgcagcggttctcagagcccagtgtcactcacataggtgggactgctc tcagttcagagagcgctgggacacttaagatgaaaagtccctggaagttagcaaacagccatctgtcactctggcatcgatt tactaaaagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagatag gaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgag ccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataac gtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagc gggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactctta gatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatc ttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagccc aggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggc tgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccaca ccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcg tggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctgg cgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgc tgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc
p312/-888序列为SEQ ID NO：3
tttcctgcagattcactataggacactttttgaagcaagagcatgcattttccccctggcgctctgcagcggttctcag agcccagtgtcactcacataggtgggactgctctcagttcagagagcgctgggacacttaagatgaaaagtccctggaag ttagcaaacagccatctgtcactctggcatcgatttactaaaagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatg agtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgat tagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcatt cgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctg tttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgttt aggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcc cctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtacc gcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggg gccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcc cacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcc cggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc
p312/-688序列为SEQ ID NO：4
aagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagatag gaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgag ccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataac gtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagc gggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactctta gatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatc ttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagccc aggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggc tgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccaca ccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcg tggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctgg cgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgc tgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc
p312/-388序列为SEQ ID NO：5
atcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgt ttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtc ccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtacc gcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggg gccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaa aacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgcc gctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcc cacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcc cggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc
p312/-188序列为SEQ ID NO：6
gcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagccca ggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggct gcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacac cgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgt ggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggc gctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgct gctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc
2)LGR5启动子在消化道肿瘤细胞内的活性评估
将处于对数生长期的消化道肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、 Huh7、结肠癌细胞HCT116、胃癌细胞BCG823和胰腺癌细胞SW1990)按1×104个/孔接种于96孔培养板中(培养条件为：10％小牛血清的DMEM培养基 (DMEM购自Hyclone公司)，于37℃、5％CO 2恒温培养箱中培养)，分别进行如下操作：
待细胞贴壁后，用Thermo公司的R#0531转染试剂将p312/-1786含萤火虫荧光素酶报告基因质粒0.2μg，内参海肾荧光素酶报告基因phRL-TK 1×10-3μg 共转染细胞。培养48h后(培养条件为：10％小牛血清的DMEM培养基(DMEM 购自Hyclone公司)，于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，去除培养基，用PBS洗两次，加入20μL PLB被动裂解液(Promega公司)，室温裂解15min，把裂解液(即裂解后所得的液态物)转移到检测试管中，检测萤火虫荧光素酶活性，加入65μL的LARⅡ(Promega公司)反应(室温，2sec)，用化学发光仪读取10sec发光光子数(RLU)，然后检测海肾荧光素酶活性，加入Stop&Glo 试剂(Promega公司)65μL反应(室温，2sec)，用化学发光仪读取10sec发光光子数(RLU)。计算萤火虫荧光素酶RLU/海肾荧光素酶RLU(按照试剂说明书操作)，即得相对荧光素酶活性。
如图2-3所示，在肝癌细胞HepG2中不同截短长度LGR5启动子相比CMV 启动子的启动效率。
将处于对数生长期的肝癌细胞HepG2按1×104个/孔接种于96孔培养板中，细胞贴壁后，用Thermo公司的R#0531转染试剂将本发明构建得到 pGL3-p312/-1786、pGL3-p312/-1188、pGL3-p312/-888、pGL3-p312/-688、 pGL3-p312/-388和pGL3-p312/-188含萤火虫荧光素酶报告基因质粒0.2μg，内参海肾荧光素酶报告基因phRL-TK 1×10-3μg共转染细胞。48h后，去除培养基，用PBS洗两次，加入20μLPLB被动裂解液(Promega公司)，室温裂解15min，把裂解液转移到检测试管中，分别检测萤火虫荧光素酶RLU和海肾荧光素酶 RLU，然后计算萤火虫荧光素酶RLU/海肾荧光素酶RLU即得相对荧光素酶活性。
如图2-3所示，在所有质粒中pGL3-p312/-188质粒在肝癌细胞HepG2中具有较高的启动活性，并且序列较短，因此，检测该启动子在上述消化道肿瘤细胞和正常细胞Beas-2B中的转录活性。操作方法如上。
如图4-5所示，相比正常细胞Beas-2B，pGL3-p312/-188在所检测的消化道肿瘤细胞中均具有较高的转录活性。
由此可知，本发明提供了上述新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子的核心序列，得到具有较高启动活性的转录序列片段，通过筛选的该启动子的核心序列得到具有较高消化道肿瘤启动活性的序列。
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
发明名称: 一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子及其筛选构建方法
第一申请人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司
第二申请人：浙江理工大学
p312/-1786：2098 bp(Nhe ⅠandHindⅢ)载体：pGL3-Basic
p312/-1786 F PCR:5’- CTAGCTAGCcaaataccatattttcccacatataagtg-3’
lgr5 R PCR: 5’-CCCAAGCTTggtgcccgaagtaggg-3’
SEQ ID NO：1:
caaataccatattttcccacatataagtgggagctaagctatgaatatgcataagcatacagagtgttaaaacggattttggagatcccaaaaagggagggtaggagaagggtgtgggattaaaaactacatattgggtacaacatacactacttgggtgatgagtgcactaaaatctcaaaattcaccgctgtataattcatccatataaccaaaacccacttgtacccccaaaagccattgaaattttttttaaaatgtttaaaaaaaggaagaaagacacaaggtaggcattctttaaatgtggaaagaatggctaagggaagcaagaataatgtgagaataagcacagagtagcagtgaatgtggtatacatagggaaaagtgaaggaaaagggtgtccagagacgcgggctctctgtactgattgtgcggaaaccggagttaactcacaattttcagtggcactagcactgtcaagtgctttgtttgttgtttgttttttcacccaagaaaggaagatgttcagactacagattgtggtcaagaaattatatattttaggtgaacaaacagcgaggtttggacatgaaggaaggcacatacactgcacagagaaacagctcttcccaactctaaaatttagacgtttatttgggaaattttgttgggcagtctaaatgcaggaagattaaaaaggacttggaaaatcaacagggtatcctgccttcatgatgctgtgaggcattgtgccccagagtgaaaactgcatttttgtgagttggtgtggcaggcttggaataccacctctttcagcagctcactcaggtctggcgagggctatttgtacctcaacgagggcttctctccaagaaagccctgaatccttttcctcctttttcctgcagattcactataggacactttttgaagcaagagcatgcattttccccctggcgctctgcagcggttctcagagcccagtgtcactcacataggtgggactgctctcagttcagagagcgctgggacacttaagatgaaaagtccctggaagttagcaaacagccatctgtcactctggcatcgatttactaaaagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc
p312/-1188：1500 bp(Nhe ⅠandHindⅢ)载体：pGL3-Basic
p312/-1188 F PCR: 5’-CTAGCTAGgcacatacactgcacagag-3’
lgr5 R PCR: 5’-CCCAAGCTTggtgcccgaagtaggg-3’
SEQ ID NO：2
gcacatacactgcacagagaaacagctcttcccaactctaaaatttagacgtttatttgggaaattttgttgggcagtctaaatgcaggaagattaaaaaggacttggaaaatcaacagggtatcctgccttcatgatgctgtgaggcattgtgccccagagtgaaaactgcatttttgtgagttggtgtggcaggcttggaataccacctctttcagcagctcactcaggtctggcgagggctatttgtacctcaacgagggcttctctccaagaaagccctgaatccttttcctcctttttcctgcagattcactataggacactttttgaagcaagagcatgcattttccccctggcgctctgcagcggttctcagagcccagtgtcactcacataggtgggactgctctcagttcagagagcgctgggacacttaagatgaaaagtccctggaagttagcaaacagccatctgtcactctggcatcgatttactaaaagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc
p312/-888：1200 bp(Nhe ⅠandHindⅢ)载体：pGL3-Basic
p312/-888 F PCR:5’- CTAGCTAGtttcctgcagattcactataggac-3’
lgr5 R PCR: 5’-CCCAAGCTTggtgcccgaagtaggg-3’
SEQ ID NO：3
tttcctgcagattcactataggacactttttgaagcaagagcatgcattttccccctggcgctctgcagcggttctcagagcccagtgtcactcacataggtgggactgctctcagttcagagagcgctgggacacttaagatgaaaagtccctggaagttagcaaacagccatctgtcactctggcatcgatttactaaaagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc
p312/-688：1000 bp(Nhe ⅠandHindⅢ)载体：pGL3-Basic
p312/-688 F PCR:5’-CTAGCTAGaagtgacttctagggtattctaaacc-3’
lgr5 R PCR: 5’-CCCAAGCTTggtgcccgaagtaggg-3’
SEQ ID NO：4
aagtgacttctagggtattctaaaccacttttaaaaaacaaatgagtcacttcgacttcctcaccccgcaagagataggaaggcagcagtggagtgctcgctcaggagctgtatttgtttagcgattagcctagagctttgattttagggcaaaagcgagccagacagtgcggcagacgtaaggatcaaaaaggccacctatcattcgccggggacgcctgcctccttaccctgataacgtaactatttctctgcataggattttagtttttgtgtttttgttttgttttattctgtttaatcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc
p312/-388：700 bp(Nhe ⅠandHindⅢ)载体：pGL3-Basic
p312/-388 F PCR: 5’-CTAGCTAGatcacttcaagtatctcatccattatttg-3’
lgr5 R PCR: 5’-CCCAAGCTTggtgcccgaagtaggg-3’
SEQ ID NO：5
atcacttcaagtatctcatccattatttgaagcgggctcggaggaaacgtgccgcatcctccagtccttgtgcgtctgtttaggtctctccgaagcaggtccctctcgactcttagatctgggtctccagcacgcatgaaggggtaagggtgggggggtcccctattccggcgcgcggcgttgagcactgaatcttccaggcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc
p312/-188：500 bp (Nhe ⅠandHindⅢ)载体：pGL3-Basic
p312/-188 F PCR: 5’-CTAGCTAGggcggaggctcagtg-3’
lgr5 R PCR: 5’-CCCAAGCTTggtgcccgaagtaggg-3’
SEQ ID NO：6
gcggaggctcagtgggagcgccgagaactcgccagtaccgcgcgctgcctgctgcctgctgcctcccagcccaggacttgggaaaggagggaggggacaagtggagggaaagtggggccgggcggggggtgcctgggaagccaggctgcgctgacgtcactgggcgcgcaattcgggctggagcgctttaaaaaacgagcgtgcaagcagagatgctgctccacaccgctcaggccgcgagcagcagcaaggcgcaccgccactgtcgccgctgcagccagggctgctccgaaggccggcgtggcggcaaccggcacctctgtccccgccgcgcttctcctcgccgcccacgccgtggggtcaggaacgcggcgtctggcgctgcagacgcccgctgagttgcagaagcccacggagcggcgcccggcgcgccacggcccgtagcagtccggtgctgctctccgcccgcgtccggctcgtggccccctacttcgggcacc

Claims (7)

1.一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子，其特征在于：启动子为p312/-1786、p312/-1188、p312/-888、p312/-688、p312/-388、p312/-188中任一种。
2.根据权要求1所述的一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子，其特征在于：所述p312/-1786序列为SEQ ID NO：1所示，所述p312/-1188序列为SEQ ID NO：2所示；所述p312/-888序列为SEQ ID NO：3所示；所述p312/-688序列为SEQ ID NO：4所示；所述p312/-388序列为SEQ ID NO：5所示；所述p312/-188序列为SEQ ID NO：6所示。
3.一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子的筛选构建方法，其特征在于该筛选构建包括如下步骤：
步骤1)用PCR方法，以人肝癌细胞HepG2的总DNA基因组为模板，使用LGR5启动子特异性引物，得到PCR产物为LGR5启动子全长序列p312/-1786，用Nhe I和Hind III双酶切，并且与同样用Nhe I和Hind III双酶切的pGL3-Basic质粒连接，得到pGL3-p312/-1786质粒；
步骤2)以pGL3-p312/-1786为模板，用携带Nhe I和Hind III酶切位点的不同的引物，经PCR获得含有不同LGR5启动子片段长度的质粒，并与Nhe I和Hind III双酶切的pGL3-Basic质粒连接，得到pGL3-p312/-1188质粒、pGL3-p312/-888质粒、pGL3-p312/-688质粒、pGL3-p312/-388质粒和pGL3-p312/-188质粒。
4.根据权利要求3所述的一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子的筛选构建方法，其特征在于：
所述LGR5启动子特异性引物为p312 Hind III和p-1786 Nhe I；
其中，上游引物p312 Hind III：CCC AAGCTT ggtgcccgaagtaggg；
下游引物p-1786Nhe I：CTA GCTAGC caaataccatattttcccacatataagtg。
5.根据权利要求3所述的一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子的筛选构建方法，其特征在于：
所述pGL3-p312/-1188质粒对应引物为p312 Hind III和p-1188 Nhe I；
所述pGL3-p312/-888质粒对应引物为p312 Hind III和p-888 Nhe I；
所述pGL3-p312/-688质粒对应引物为p312 Hind III和p-688 Nhe I；
所述pGL3-p312/-388质粒对应引物为p312 Hind III和p-388 Nhe I；
所述pGL3-p312/-188质粒对应引物为p312 Hind III和p-188 Nhe I；
上游引物p312 Hind III：CCC AAGCTT ggtgcccgaagtaggg；
下游引物p-1188 Nhe I：CTAGCTAGCgcacatacactgcacagag；
下游引物p-888 Nhe I：CTAGCTAGCtttcctgcagattcactataggac；
下游引物p-688 Nhe I：CTAGCTAGCaagtgacttctagggtattctaaacc；
下游引物p-388 Nhe I：CTAGCTAGCatcacttcaagtatctcatccattatttg；
下游引物p-188 Nhe I：CTAGCTAGCggcggaggctcagtg。
6.根据权利要求3或4或5所述的一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子的筛选构建方法，其特征在于：PCR体系均为：
Figure FDA0003404459160000021
7.根据权利要求3或4或5所述的一种新型的消化道肿瘤特异性LGR5核心启动子的筛选构建方法，其特征在于：所述PCR条件均为：94℃×45s，58℃×30s，72℃×1.5min。
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宋竹雯: "LGR5在肝癌细胞，肝癌组织中的表达及临床意义", <中国优秀硕士学位论文期刊库》, pages 5 *

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