CN113474002A - 逃避免疫检测和自身免疫的细胞、胰岛和类器官、其生产方法及其用途 - Google Patents

逃避免疫检测和自身免疫的细胞、胰岛和类器官、其生产方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明的特征在于细胞、胰岛样细胞、胰岛和类器官(例如人胰岛样的类器官或HILO)，以及可用于快速和可靠地产生细胞和类器官(例如体内可持续的胰岛和类器官)的细胞培养物和方法，可逃避免疫检测、排斥和自身免疫。本发明的特征还在于使用细胞、胰岛样细胞、胰岛和类器官(例如HILO)来治疗胰腺疾病(例如2型糖尿病和胰腺癌)的方法，所述细胞、胰岛样细胞、胰岛和类器官旨在调节免疫细胞的活性，否则免疫细胞对其做出反抗。

Description

逃避免疫检测和自身免疫的细胞、胰岛和类器官、其生产方法 及其用途
本申请主张2019年1月22日提交的美国临时申请号62/795,284，和2018年10月12日提交的美国临时申请号62/745,086的优先权和利益，其整体内容通过引用并入本文。
联邦支持研究下的发明权利声明
本申请是在政府的支持下，由美国国立卫生研究院资助研究号DK057978、DK090962、HL088093、HL105278和ES010337，以及由美国国立卫生研究院和国家癌症研究所资助研究号P30 014195完成的。政府拥有本申请的某些权利。
背景技术
为了治疗胰岛素依赖性糖尿病，例如1型糖尿病和晚期2型糖尿病，人胰岛的短缺限制了可从所述疗法中受益的患者数量。尽管在人类诱导的多能干细胞(hiPSC)体外分化为β样细胞的领域取得了进展，但以这种方式生成的β样细胞通常在葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)和线粒体代谢功能方面表现出损伤，以及给药后接受者免疫系统的检测和破坏。因此，需要进一步完善成熟过程，以完全捕获胰岛的生理以及功能性和持久性类器官的产生。
本领域需要的是产生在移植物中存活下来以治疗疾病的功能人体器官的方法，以及用于药物筛选和疾病建模的新平台，以为器官衰竭患者提供新的治疗策略和疗法。
发明内容
提供了用于产生免疫保护的细胞、胰岛、类器官或胰岛样类器官的组合物和方法，包括但不限于人胰岛类器官或胰类器官，特别是人胰岛样类器官(本文中缩写为“HILO”)，其在向受试者施用或移植或植入受试者后，在免疫系统中存活并逃避了免疫系统的检测(自身免疫)。在一个实施方案中，所述细胞、胰岛、类器官、胰岛样类器官(以及其中的细胞)表达干扰素γ(IFNγ)-受体。在一个实施方案中，所述细胞、胰岛、类器官或胰岛样类器官(和其中的细胞)是人的。
在一个方面，提供了一种增加移植的供体细胞的存活或减少细胞死亡的方法，其中所述方法包括在给定的时间段(例如至少24小时的时间段)内通过多次间歇性暴露使供体细胞与干扰素γ(IFNγ)接触，从而增加了移植的供体细胞的存活。在一个实施方案中，移植的供体细胞是类器官细胞、胰岛细胞、胰岛样类器官细胞或β类胰岛细胞。在一个实施方案中，移植的供体细胞与接受移植的受试者是同基因的。在一个实施方案中，移植的供体细胞对于接受移植的受试者是自体的。在一个实施方案中，移植的供体细胞对于接受移植的受试者是同种或异种的。在一个实施方案中，移植的供体细胞是干扰素γ(IFNγ)受体表达细胞。在一个实施方案中，移植的供体细胞是人细胞。
在另一方面，提供了一种产生免疫保护细胞、胰岛或类器官的方法，所述细胞、胰岛或类器官可以在免疫系统细胞例如T细胞或B细胞的检测下幸存，其中所述方法包括使表达干扰素γ(IFNγ)的受体细胞、胰岛或类器官或其细胞在给定时间段(例如至少24小时)内多次间歇暴露于IFNγ，从而诱导细胞、胰岛或类器官的免疫检查点蛋白的表达，使所述细胞、胰岛或类器官得以幸免于免疫检测或自身免疫。
一方面，人胰岛样类器官(HILO)和包含HILO的细胞，即β样细胞，在暴露于IFNγ后表达或被诱导表达一种或多种参与调节免疫应答或自身免疫的分子，例如免疫检查点蛋白，以克服被引入(例如移植或植入)受试者体内的“非自身”细胞或HILO的免疫排斥或自身免疫。在一个实施方案中，免疫检查点蛋白是PD-L1。在一个实施方案中，被引入、移植或植入HILO的受试者患有糖尿病。在一个实施方案中，将HILO引入、移植或植入其中的受试者患有1型、2型糖尿病或晚期2型糖尿病。在一个实施方案中，被引入、移植或植入HILO的受试者患有1型糖尿病。在一个实施方案中，将HILO引入、移植或植入其中的受试者是人类受试者或患者。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白在引入的、移植的或植入的细胞或HILO中重组表达。术语“移植物”和“植入物”在本文中可互换使用，是指通过医学领域中实践的程序引入或转移到受试者体内以实现或提供其功能的细胞、胰岛或类器官(以及其中的细胞)，尤其是治疗疾病，病症或病理的治疗功能。
一方面，提供了一种产生胰岛类器官的方法，其中将诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的β样细胞培养在含有结冷胶的3维基质中，从而产生胰岛类器官。其中类器官细胞表达一种或多种检查点蛋白。还提供了一种细胞培养物，其包括在包含结冷胶的三维基质中表达一种或多种免疫检查点蛋白的iPSC衍生的β样细胞。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。
在一方面，提供了一种细胞培养物，其在包含结冷胶的三维基质中包括人iPSC衍生的β样细胞、人脂肪衍生的干细胞(hADSC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，其中培养物中的细胞表达一种或多种免疫检查点蛋白。
在本文描述的任何方面的各个实施方案中，细胞培养物包括脂肪来源的干细胞和/或内皮细胞。
在一个方面，提供了含有表达一种或多种免疫检查点蛋白的iPSC衍生的β样细胞的胰岛样类器官，其中所述类器官是血管化的并且表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)，并且其中类器官和类器官表达一种或多种免疫检查点蛋白。在一个实施方案中，胰岛样类器官是人胰岛样类器官。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。
在一个方面，一种胰岛类器官，其包含iPSC衍生的β样细胞、iPSC衍生的α细胞、iPSC衍生的δ细胞、iPSC衍生的导管细胞，脂肪来源的干细胞(hADSC)和内皮细胞。其中iPSC细胞表达一种或多种免疫检查点蛋白、类器官被血管化并显示葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)、KCl刺激的胰岛素分泌、GLP-1刺激的胰岛素分泌、生长抑素分泌和胰高血糖素分泌。
在相关方面，提供了移植或植入了本文所述任何方面的类器官的非人类生物。
在一个方面，提供了一种治疗受试者的胰腺疾病的方法，其中将胰岛类器官或HILO引入或移植或植入所述受试者中，其中所述胰岛类器官或HILO包含源自iPSC的β样细胞，表达一种或多种免疫检查点蛋白以逃避免疫检测；其中胰岛类器官或HILO被血管化并表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。在一个实施方案中，所述受试者是人类，并且胰岛类器官或HILO是从人类组织或细胞产生的。
在一个方面，提供了一种治疗受试者的1型糖尿病的方法，其中将胰岛类器官或HILO引入，移植或植入受试者中，其中胰岛类器官或HILO包含iPSC-衍生的β样细胞，表达一种或多种免疫检查点蛋白来逃避免疫检测；其中胰岛类器官或HILO被血管化并表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。在一个实施方案中，胰岛类器官或HILO表达检查点蛋白以逃避免疫检测。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。在一个实施方案中，所述受试者是人类，并且胰岛类器官或HILO是从人类组织或细胞产生的。
一方面，提供了一种胰岛类器官或HILO，其中通过在包含结冷胶的3维基质中培养诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的β样细胞来产生胰岛类器官或HILO。在一个实施方案中，胰岛类器官或HILO表达一种或多种免疫检查点蛋白以逃避免疫检测。在一个实施方案中，所述受试者是人类，并且胰岛类器官或HILO是从人类组织或细胞产生的。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。
另一方面，提供了通过在包含结冷胶的3维基质中培养诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的β样细胞和iPSC衍生的外分泌成分细胞而产生的胰腺类器官或HILO。在一个实施方案中，胰岛类器官或HILO表达一种或多种免疫检查点蛋白以逃避免疫检测。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。在一个实施方案中，所述受试者是人类，并且胰岛类器官或HILO是从人类组织或细胞产生的。
另一方面，提供了通过在诸如含有结冷胶的3维基质的培养基中培养诱导多能干细胞(iPSC)衍生的β样细胞和iPSC衍生外分泌成分细胞而产生的胰腺类器官或HILO，以及在胰腺类器官(β细胞)或HILO的细胞中刺激检查点蛋白的表达和产生的试剂，不希望受到理论的束缚，PD-L1是通过转录记忆机制在β细胞或HILO中产生的。在一个实施方案中，培养基或基质包含干扰素γ(IFNγ)。在一个实施方案中，胰岛类器官或HILO表达一种或多种免疫检查点蛋白以逃避免疫检测。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。在一个实施方案中，所述受试者是人类，并且胰岛类器官或HILO是从人类组织或细胞产生的。
在另一方面，本发明提供了通过在包含结冷胶的3维基质中培养诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的肝细胞而产生的肝脏类器官；其中iPSC来源的肝细胞表达一种或多种免疫检查点蛋白，从而使肝脏类器官逃避免疫检测。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。
在另一方面，本发明提供了通过在包含结冷胶的3维基质中培养诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的心肌细胞而产生的心脏类器官，其中iPSC衍生的心肌细胞表达一种或多种免疫检查点蛋白，从而使心脏类器官逃避免疫检测。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。
在另一方面，本发明提供了通过在包含结冷胶的3维基质中培养诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的肠细胞而产生的肠类器官，其中所述iPSC衍生的肠细胞表达一种或多种免疫检查点蛋白，从而使肠类器官逃避了免疫检测。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。
在本文描述的任何方面的各个实施方案中，所述方法涉及与脂肪来源的干细胞和/或内皮细胞一起培养表达一种或多种免疫检查点蛋白的iPSC来源的β样细胞。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。在本文描述的任何方面的各个实施方案中，所述方法涉及将表达一种或多种免疫检查点蛋白的iPSC衍生的β样细胞与iPSC衍生的α样细胞、iPSC衍生的δ样细胞和/或iPSC衍生的导管样细胞一起培养。
在本文所描述的任何方面的各个实施方案中，胰岛类器官都含有iPSC来源的α样细胞、iPSC来源的δ样细胞和/或iPSC来源的导管样细胞。在本文描述的任何方面的各种实施方案中，胰岛类器官包括脂质来源的干细胞和/或内皮细胞。在本文描述的任何方面的各个实施方案中，胰岛类器官显示出KCl刺激的胰岛素分泌、GLP-1刺激的胰岛素分泌、生长抑素分泌、c肽表达和/或胰高血糖素分泌。在本文所描述的任何方面的各个实施方案中，胰岛类器官都表达一种或多种β细胞转录因子Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6和Foxa2。在某些实施方案中，胰岛类器官包含含有表达一种或多种免疫检查点蛋白的iPSC衍生的β样细胞、iPSC衍生的α细胞、iPSC衍生的δ细胞、iPSC衍生的导管细胞、脂肪来源的干细胞(hADSC)和内皮细胞，其中类器官被血管化并显示葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)、KCl刺激的胰岛素分泌、GLP-1刺激的胰岛素分泌、生长抑素分泌和胰高血糖素分泌。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。在本文所描述的任何方面的各种实施方案中，胰岛类器官被iPSC衍生的外分泌组分包围。在各种实施方案中，源自iPSC的外分泌组分表达标记物PDX1、Nkx6-1和Ptf1中的一种或多种。
在本文描述的任何方面的各种实施方案中，肝类器官表达一种或多种标志物AFP、ALB和Cyp3a7。在本文描述的任何方面的各种实施方案中，肝类器官显示出胰岛素信号传导，棕榈酸对胰岛素的抗性和脂质蓄积。
在本文描述的任何方面的各个实施方案中，心脏类器官表示表达标记物hMlc2a、hNkx2-5、αMHC和KCNQ1中的一个或多个。在本文描述的任何方面的各种实施方案中，心脏类器官表现出心脏跳动。
在本文描述的任何方面的各种实施方案中，肠类器官表达一种或多种标记CDX2、Muc2和Lgr5。在本文所描述的任何方面的各种实施方案中，肠类器官显示出响应于R-spondin的出芽。
在本文描述的任何方面的各个实施方案中，iPSC来源的β样细胞、iPSC来源的α样细胞、iPSC来源的δ样细胞和/或iPSC来源的导管样细胞是人。在本文描述的任何方面的各个实施方案中，iPSC来源的β样细胞、iPSC来源的外分泌成分细胞、iPSC来源的肝细胞、iPSC来源的心肌细胞或iPSC来源的肠细胞是人。在各种实施方案中，脂肪来源的干细胞是人脂肪来源的干细胞(hADSC)。在本文描述的任何方面的各个实施方案中，内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在各种实施方案中，类器官是由人细胞产生的。
在本文描述的任何方面的各种实施方案中，胰岛类器官、胰类器官、肝类器官、心脏类器官或肠类器官包含脂肪来源的干细胞和/或内皮细胞。在本文描述的任何方面的各种实施方案中，胰岛类器官、胰类器官、肝类器官、心脏类器官或肠类器官被血管化。
在另一方面，本发明提供了一种产生HILO的胰岛类器官的方法，所述方法包括在包含Wnt4或Wnt5a蛋白物质的培养基中培养表达一种或多种免疫检查点蛋白的诱导多能干细胞(iPSC)衍生的β样细胞。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。在一个实施方案中，将诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的β样细胞培养在3维矩阵中。在前述方面的一个实施方案中，Wnt4或Wnt5a蛋白是重组人Wnt4或Wnt5a蛋白。在一个特定的实施方案中，培养基包含重组人Wnt4蛋白。在另一个特定的实施方案中，培养基包含重组人Wnt5a蛋白。在一个特定的实施方案中，Wnt4或Wnt5诱导的人胰岛类器官或HILO是成熟的胰岛或成熟的HILO。
在另一方面，本发明提供了一种细胞培养物，其包含人iPSC衍生的β样细胞，其表达一种或多种免疫检查点蛋白，以及Wnt4或Wnt5a蛋白。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。在一个实施方案中，人iPSC衍生的β样细胞在包含结冷胶的三维基质中。在一个实施方案中，Wnt4或Wnt5a蛋白是重组人Wnt4或Wnt5a蛋白。在一个特定的实施方案中，培养基包含重组人Wnt4蛋白。在另一个特定的实施方案中，培养基包含重组人Wnt5a蛋白。在一个特定的实施方案中，Wnt4或Wnt5诱导的人胰岛类器官或HILO是成熟的胰岛或成熟的HILO。
在另一方面，本发明提供了一种胰岛类器官，其包含在包含Wnt4或Wnt5a蛋白的培养基中培养的表达一种或多种免疫检查点蛋白的iPSC衍生的β样细胞，其中所述类器官是血管化的并且表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌物(GSIS)。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。在一个实施方案中，类器官进一步表现出KCl刺激的胰岛素分泌或葡萄糖刺激的胰岛素分泌。在一个实施方案中，胰岛类器官表达Fltp和Esrrg基因。在一个实施方案中，Wnt4或Wnt5a蛋白是重组人Wnt4或Wnt5a蛋白。在一个特定的实施方案中，培养基包含重组人Wnt4蛋白。在另一个特定的实施方案中，培养基包含重组人Wnt5a蛋白。在一个特定的实施方案中，Wnt4或Wnt5诱导的人胰岛类器官或HILO是成熟的胰岛或成熟的HILO。
在另一方面，本发明提供了移植或植入了上述方面所定义的类器官的非人类生物。
在另一方面，本发明提供了增强脂肪来源的干细胞(ADSC)的自组织以产生诱导的多能干细胞(iPSC)的类器官的方法，所述方法避免免疫监视和排斥，所述方法包括在包含Wnt5a蛋白的3维(3-D)培养基中培养ADSC。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。在所述方法的一个实施方案中，将ADSC在包含结冷胶的3-D培养基质中培养。在一个实施方案中，将ADSC在3-D培养基基质中培养，所述培养基包含Wnt5蛋白和iPSC衍生细胞，所述iPSC衍生细胞选自iPSC来源的β样细胞、iPSC来源的外分泌成分细胞、iPSC来源的肝细胞的iPSC来源的细胞、iPSC来源的心肌细胞或iPSC来源的肠细胞，来表达一种或多种免疫检查点抑制剂蛋白。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。在所述方法的一个实施方案中，iPSC衍生的类器官选自胰岛类器官、胰腺类器官、肝脏类器官、心脏类器官或肠类器官。在所述方法的一个实施方案中，诱导多能干细胞(iPSC)来源的类器官是人诱导多能干细胞(hiPSC)来源的类器官。在所述方法的一个实施方案中，Wnt5a蛋白是重组人Wnt5a蛋白。在所述方法的一个实施方案中，胰岛类器官、胰腺类器官、肝脏类器官、心脏类器官或肠类器官衍生自选自iPSC衍生的β样细胞的iPSC衍生细胞、iPSC衍生的外分泌成分细胞分别是iPSC衍生的肝细胞、iPSC衍生的心肌细胞或iPSC衍生的肠细胞。在任何上述的一个实施方案中，iPSC来源的细胞是人。
在另一方面，本发明提供了增强脂肪来源的干细胞(ADSC)的自组织以产生逃避免疫排斥或自身免疫的胰岛或胰腺类器官的方法，所述方法包括在包含Wnt5a蛋白的培养基中培养表达一种或多种免疫检查点蛋白的ADSC。在一个实施方案中，一种或多种免疫检查点蛋白是PD-L1。在一个实施方案中，将ADSC在包含结冷胶的3维基质中培养。在另一个实施方案中，Wnt5a蛋白是重组人Wnt5a蛋白。
在另一方面，本发明提供了通过上述方法和实施方案中的任何一种产生的胰岛类器官、胰类器官、肝脏类器官、心脏类器官或肠类器官。
在前述实施方案中任一项的各个方面中，将免疫检查点蛋白或一个或多个与关联配体结合的免疫检查点蛋白或免疫检查点蛋白的片段或部分重组表达或分子引入细胞中。所述类器官表达一种或多种检查点蛋白的类器官(例如，构成HILO的β样细胞)与结合到自身免疫的免疫细胞(例如T细胞)上的同源配体结合的膜表面蛋白，或与异物或“非自身”细胞起反应，从而抑制或阻断T细胞应答(同种异体免疫应答或自身免疫应答)，从而逃避接受者免疫系统的监视和排斥。
在实施方案中，类器官的细胞(例如构成HILO的β样细胞)表达与免疫细胞表面的同源配体结合的一种或多种检查点蛋白或分子，从而抑制针对所述细胞和类器官的同种异体免疫活性或自身免疫性。在一个特定的实施方案中，类器官的细胞(例如，β样细胞)和类器官(例如，HILO)表达免疫检查点蛋白PD-L1、程序化细胞死亡配体1，其与PD-1，程序化细胞死亡蛋白1，结合，所述程序化细胞死亡蛋白1在例如T细胞上表达。PD-L2，程序化细胞死亡配体2，也与PD-1结合，但具有不同的Kd。在其他实施方案中，对类器官的细胞(例如，β样细胞)和类器官(例如，HILO)进行分子工程改造，以表达与免疫细胞表面表达的检查点蛋白结合的分子，例如T细胞(例如，效应T细胞)，其中在免疫细胞表面表达的检查点蛋白是CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞蛋白4，也称为CD152)；LAG-3，淋巴细胞激活基因3蛋白；KIR，杀伤细胞免疫球蛋白样受体；IDO1，吲哚胺2,3-双加氧酶1；4-1BB，肿瘤坏死因子受体超家族成员9，(也称为CD137)；GITR，“糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因；TIM-3，“T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域；”OX40，肿瘤坏死因子受体超家族成员4，(也称为CD134)；A2AR，腺苷A2A受体；B7-H3(也称为CD276)；B7-H4(也称为VTCN1)；B7-1/B7-2；BTLA(也称为CD272)；VISTA，“T细胞激活的V结构域Ig抑制剂；”或上述任何一项的组合。
在任何前述实施方案的一个方面，免疫检查点蛋白包含检查点蛋白的全部或部分，例如细胞外结构域(在本文中也称为“检查点分子”)。在一个特定的实施方案中，免疫检查点蛋白是PD-L1或其结合部分。在一个实施方案中，检查点蛋白是PD-L1蛋白的细胞外结构域。
另一方面提供了由其产生的人诱导的多能干细胞(hiPSC)、人β-细胞或人胰岛样类器官(HILO)，其经分子工程改造以表达一种或多种结合至免疫细胞，例如T细胞，上的同源配体的免疫检查点蛋白。在一个实施方案中，由hiPSC、人β-细胞或人胰岛样类器官(HILO)表达的一种或多种免疫检查点蛋白与免疫细胞表达的同源配体结合，其中，該免疫细胞表达的同源配体选自程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA-4)；淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)；吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)；肿瘤坏死因子受体超家族成员9(4-1BB)；糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)；T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域(TIM-3)；肿瘤坏死因子受体超家族成员4(OX40)；腺苷A2A受体(A2AR)；B7-H3；B7-H4；B7-1/B7-2；BTLA；T细胞激活的V域Ig抑制剂(VISTA)；或上述任何一项的组合。在一个特定的实施方案中，hiPSC、人β-细胞或HILO表达与PD-1结合的免疫检查点蛋白、程序化细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)。
在另一方面，提供了一种在移植、植入或转移后产生存活并具有减少的细胞死亡的细胞、胰岛、类器官的方法，其中所述方法包括：(a)在预定时间点使表达干扰素(IFNγ)的干扰素(IFNγ)受体的细胞、胰岛或类器官与干扰素(IFNγ)接触至少0.5小时或至少1小时；(b)在约或等于72小时的时间内至少重复两次(a)；其中在与IFNγ接触的时间之间在不存在IFNγ的情况下维持细胞，胰岛或类器官；并且其中步骤(a)和(b)诱导PD-L1在细胞、胰岛或类器官中的持续表达。在所述方法的一个实施方案中，于步骤(a)中将细胞、胰岛、类器官或细胞与IFNγ接触的时间选自：约或等于至少0.5小时、至少1小时、至少2小时或超过2小时。在所述方法的另一个实施方案中，于步骤(a)中使细胞、胰岛或类器官与IFNγ接触一段时间，所述时间选自约或等于0.5小时、或约或等于1小时、或约或等于2小时。或大约等于或等于的12小时。在所述方法的另一个实施方案中，步骤(a)被重复至少三遍，每次至少约0.5小时、或每次至少约1小时、或每次至少约2小时，于步骤(b)的大约或等于72小时的时间内。在所述方法的另一个实施方案中，在步骤(a)和步骤(b)之间洗涤细胞、胰岛或类器官以除去IFNγ的存在。在所述方法的另一个实施方案中，以1-25ng/ml的量使用IFNγ。在所述方法的另一个实施方案中，以10ng/ml的量使用IFNγ。在所述方法的另一个实施方案中，在步骤(b)之后，细胞、胰岛或类器官中的PD-L1表达保持大于约或等于约7天。在一个实施方案中，PD-L1的持续表达包括约或等于3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更长的细胞中PD-L1的表达。
在另一方面，提供了一种在移植、植入或转移后产生存活并具有减少的细胞死亡的胰岛或类器官及其细胞的方法，其中所述方法包括：(a)接触表达β-干扰素的干扰素(IFNγ)受体。胰岛或类器官及其细胞，在给定时间段(例如，大约或等于24小时的时间段)内的第一个时间点与约为1ng/ml至25ng/ml的量的干扰素γ(IFNγ)接触大于1小时；(b)在后续的时间段，例如步骤(a)之后的48小时的时间段，的两个或多个额外时间点，使胰岛或类器官及其细胞与大约1ng/ml至25ng/ml的量的IFNγ接触0.5-1小时或更长时间；其中将所述胰岛或类器官洗涤并在与IFNγ接触之间的不存在IFNγ的培养基中静置；并且其中步骤(a)和(b)诱导PD-L1在所述胰岛或类器官中的持续表达。在所述方法的一个实施方案中，在步骤(a)和步骤(b)中，将胰岛或类器官与10ng/ml的IFNγ接触至少2小时。在所述方法的另一个实施方案中，在72小时的时间段中的3个时间点，将胰岛或类器官与IFNγ接触至少约2小时。
在任何上述方法的实施方式中，细胞、胰岛或类器官是人细胞、胰岛或类器官。在上述方法的另一个实施方案中，类器官是HILO或人HILO。在上述方法的另一个实施方案中，所述胰岛是人尸体胰岛，其被免疫系统保护免于破坏或清除。
在另一方面，提供了一种产生逃避免疫检测或自身免疫的人类细胞、胰岛或人胰岛样类器官(HILO)的方法，其中所述方法包括(a)使人类细胞、胰岛或HILO与干扰素γ(IFNγ)接触。)在预定时间点超过一小时；在给定的时间段内，例如72小时内，至少重复两次步骤(a)；其中在与IFNγ接触的时间之间，在不存在IFNγ的情况下维持人细胞、胰岛或HILO。其中步骤(a)和(b)诱导人胰岛或HILO中PD-L1的持续表达。在所述方法的一个实施方案中，在步骤(a)中，将人细胞、胰岛或HILO与IFNγ接触2小时或更长时间。在所述方法的另一个实施方案中，在步骤(a)中使人细胞、胰岛或HILO与IFNγ接触2小时或12小时。在所述方法的另一个实施例中，在给定的时间段内，即72小时的时间段内，每次至少重复2小时，重复步骤(a)3次。在所述方法的另一个实施方案中，在步骤(a)和步骤(b)之间洗涤人类细胞、胰岛或HILO以去除IFNγ。在所述方法的另一个实施方案中，以1-25ng/ml的量使用IFNγ。在所述方法的另一个实施方案中，以10ng/ml的量使用IFNγ。在所述方法的另一个实施方案中，在步骤(b)之后，胰岛或HILO中的PD-L1表达被维持或维持超过7天。
在另一方面，提供了一种产生逃避免疫检测或自身免疫的人类细胞、胰岛或人胰岛样类器官(HILO)的方法，其中所述方法包括(a)使人类细胞、胰岛或HILO与干扰素γ(IFNγ)接触。在给定时间段，例如24小时时间段内的第一时间点，以约1ng/ml至25ng/ml的量进行大于1小时的处理；(b)在下一个给定时间段的至少两个其他时间点，使人类细胞、胰岛或HILO与IFNγ的量约1ng/ml至25ng/ml接触1小时以上，例如在步骤(a)之后的48小时内；其中，将人细胞、胰岛或HILO洗涤并在与IFNγ接触之间不存在IFNγ的情况下放置在培养基中。其中步骤(a)和(b)诱导人胰岛或HILO中PD-L1的持续表达。在所述方法的一个实施方案中，在步骤(a)和步骤(b)中，使人胰岛或HILO与量为10ng/ml的干扰素γ(IFNγ)接触至少2小时。在所述方法的另一个实施方案中，在给定的时间段(例如72小时的时间段)内，以3个不同的间隔(时间点)使人胰岛或HILO与干扰素γ(IFNγ)接触至少2小时。在前述方面的方法的一个实施方案中，人胰岛或HILO是成熟的人胰岛或HILO。在一个实施方案中，PD-L1的持续表达包括约或等于3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天。或更长的细胞中PD-L1的表达。在所述方法的实施方案中，细胞包括心脏细胞、结肠细胞、肾细胞、膀胱细胞、肝细胞、食道细胞、胃肠道细胞、胃细胞、肺细胞、卵巢细胞、宫颈细胞、子宫细胞、睾丸细胞、胰腺细胞、胰腺β细胞、视网膜细胞、角膜细胞、脑细胞、肌肉细胞、造血细胞、免疫细胞(B细胞、T细胞)、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、骨骼骨髓细胞、单核细胞、神经元、神经元细胞、源自人皮肤细胞的产胰岛素的胰腺β细胞、脐带血(UCB)细胞、脂肪来源的间充质基质(干)细胞、心脏干细胞、结肠干细胞、肾干细胞、肝(肝细胞)干细胞、胃肠干细胞、胃干细胞、肺干细胞、胰腺干细胞、胰腺β干细胞、肌肉干细胞、造血干细胞、免疫细胞(T细胞或B细胞)干细胞、骨髓干细胞s、CD133+干细胞、CD34+造血干细胞、CD34+造血干细胞、间充质干细胞、脐带间充质干细胞、视网膜干细胞、神经元干细胞、外胚层来源的神经元细胞、永生化的多巴胺能神经元前体细胞以及由或含有的类器官产生的类器官说细胞。在所述方法的一个实施方案中，类器官包括心脏类器官、肠/胃肠类器官、结肠类器官、肝类器官、肾脏类器官、膀胱类器官、卵巢类器官、宫颈类器官、神经类器官或肺类器官。
在上述任何方面的方法的实施方式中，使表达干扰素γ(IFNγ)的细胞、胰岛或类器官与IFNγ在培养基或生理上可接受的溶液中或在三维基质中接触。在一个实施方案中，如本文所述，使表达干扰素γ(IFNγ)的细胞、胰岛或类器官与IFNγ在三维(3D)基质例如结冷胶中接触。
在另一方面，提供了一种产生逃避免疫检测或自身免疫的胰岛样类器官的方法，其中所述方法包括在包含Wnt4或Wnt5a蛋白的三维基质中培养内分泌祖细胞一段足以产生多细胞类胰岛样类器官，其中，所述多细胞胰岛样类器官包含两种或更多种细胞类型，所述细胞类型选自β细胞、α细胞、δ细胞、ε细胞和导管样细胞；其中，胰岛样类器官响应葡萄糖而分泌胰岛素。在给定的时间段内，例如至少24小时的时间段内，使所述胰岛样类器官多次间歇地暴露于干扰素γ(IFNγ)；从而诱导胰岛样类器官持续表达免疫检查点蛋白，并使胰岛样类器官逃避免疫检测或自身免疫。在所述方法的一个实施方案中，在至少两天的时间段内，将胰岛样类器官暴露于IFNγ至少两次。在所述方法的另一个实施方案中，胰岛样类器官在三天的时间内暴露于IFNγ至少三次。在所述方法的另一个实施方案中，在两天的时间段内，将胰岛样类器官暴露于IFNγ至少一小时至少两次。在所述方法的另一个实施方案中，在三天的时间段内，将胰岛样类器官暴露于IFNγ至少一小时至少三次。在所述方法的另一个实施方案中，在两天的时间段中，将胰岛样类器官暴露于IFNγ至少两个小时两次。在所述方法的另一个实施方案中，在三天的时间段内，将胰岛样类器官暴露于IFNγ至少两个小时两次，持续两次。在所述方法的实施方案中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或更长时间的时间段内，将胰岛样类器官间歇性地暴露于IFNγ。
在另一方面，提供了一种产生逃避免疫检测或自身免疫的胰岛样类器官的方法，其中所述方法包括在包含Wnt4或Wnt5a蛋白的三维基质中培养重组表达免疫检查点蛋白的内分泌祖细胞一段足以产生多细胞胰岛样类器官的时间，所述多细胞胰岛样类器官包括选自β细胞、α细胞、δ细胞、ε细胞和导管样细胞的两种或更多种细胞类型；其中，胰岛样类器官响应葡萄糖而分泌胰岛素，并且其中胰岛样类器官逃避免疫检测和自身免疫。在一个实施方案中，免疫检查点蛋白的重组表达是由含有编码免疫检查点蛋白的多核苷酸的载体转导胰岛样类器官细胞产生的。
在前述方面的方法的实施方案中，三维基质包含人Wnt4蛋白、重组人Wnt4蛋白、人Wnt5蛋白或重组人Wnt5a蛋白。在一个特定的实施方案中，三维基质包含重组人Wnt4蛋白。
在前述产生逃避免疫检测或自身免疫的胰岛样类器官的方法的实施方式中，三维基质包括结冷胶。在一个实施方案中，三维基质包含重组人Wnt4蛋白。在前述方法的实施方案中，免疫检查点蛋白与选自程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA-4)；淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)；吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)；肿瘤坏死因子受体超家族成员9(4-1BB)；糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)；T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域(TIM-3)；肿瘤坏死因子受体超家族成员4(OX40)；腺苷A2A受体(A2AR)；B7-H3；B7-H4；B7-1/B7-2；BTLA；T细胞激活的V域Ig抑制剂(VISTA)；或上述任何一项的组合的免疫细胞表达的同源配体结合。在一个特定的实施方案中，免疫检查点蛋白是程序化死亡配体-1(PD-L1)。
在前述方面的方法的一个实施方案中，内分泌祖细胞选自诱导的多能干细胞(iPSC)、胚胎多能干细胞(ePSC)和/或胰腺祖细胞。
在前述方面的方法的实施方式中，内分泌祖细胞表达神经元素3(neurogenin 3)、Neurod1、Nkx2.2和Pax4生物标记中的至少一种。
在前述方面的方法的实施方式中，胰岛样类器官是人胰岛样类器官(HILO)。在一个特定的实施方案中，胰岛样类器官是血管化的。在一个特定的实施方案中，胰岛样类器官还包含脂肪来源的干细胞和/或内皮细胞。在一个实施方案中，脂肪干细胞是人脂肪干细胞(hADSC)和/或内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
在前述方面的方法的一个实施方案中，胰岛样类器官进一步表现出KCl刺激的胰岛素分泌、GLP-1刺激的胰岛素分泌、生长抑素分泌、胰高血糖素分泌中的至少一种。
在前述方面的方法的一个实施方案中，胰岛样类器官表达表达选自NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB和SYT4的β细胞谱系标记，并且ARXα细胞谱系标记。
在前述方面的方法的实施方案中，胰岛样类器官显示出雌激素相关受体γ(ERRγ)的表达增加。
在前述方面的方法的另一个实施方案中，胰岛样类器官表现出增加的氧化代谢，其特征在于增加的耗氧率(OCR)和降低的细胞酸化率(ECAR)。
在前述方面的方法的一个实施方案中，胰岛样类器官是胰岛类器官、胰类器官、肝类器官、心脏类器官或肠类器官。在方法的特定实施方案中，胰岛样类器官是人胰岛类器官。
在另一方面，提供了一种产生逃避免疫检测或自身免疫的类人胰岛样类器官(HILO)的方法，其中所述方法包括(a)在培养基或包含Wnt4或Wnt5a蛋白质的三维基质中培养内分泌祖细胞一段足以产生多细胞人胰岛样类器官的时间。所述多细胞人胰岛样类器官包括两种或更多种选自β细胞、α细胞、δ细胞、ε细胞和导管样细胞的细胞类型；其中，人胰岛样类器官样器官响应葡萄糖而分泌胰岛素。(b)在至少48-72小时的整个时间段内，使步骤(a)的HILO与干扰素γ(IFNγ)接触两次或三次，每次超过一小时。其中人胰岛或HILOs在与IFNγ接触的时间之间不存在IFNγ的情况下得以维持；其中步骤(a)和(b)诱导HILO中免疫检查点蛋白程序化死亡配体1(PD-L1)的持续表达。在所述方法的一个实施方案中，在步骤(b)中，使HILO与IFNγ接触2小时。在所述方法的另一个实施方案中，使HILO与IFNγ接触两次，每次至少两个小时，持续至少48小时。在所述方法的另一个实施方案中，在至少72小时内，使HILO与IFNγ接触3次，每次2小时。在所述方法的另一个实施方案中，内分泌祖细胞选自诱导多能干细胞(iPSC)，胚胎多能干细胞(ePSC)和/或胰腺祖细胞。在所述方法的另一个实施方案中，内分泌祖细胞表达神经元素3、neurod1、Nkx2.2和Pax4生物标记中的至少一种。在所述方法的另一个实施方案中，HILO被血管化并且表现出增加的氧化代谢，其特征在于增加的耗氧率(OCR)和降低的细胞酸化率(ECAR)。
在前述方面的方法的一个实施方案中，以1-25ng/ml的量使用IFNγ。在前述方面的方法的一个实施方案中，以10ng/ml的量使用IFNγ。在前述方面的方法的一个实施方案中，胰岛样类器官或HILO中的PD-L1表达维持超过7天。
一方面，通过上述方面中描述的方法产生具有持续表达免疫检查点蛋白的人胰岛样类器官或胰岛类器官。在一个实施方案中，人胰岛样类器官或胰岛类器官表现出免疫检查点蛋白PD-L1的持续表达。
在另一个方面，提供了人胰岛样类器官(HILO)，其衍生自在包含Wnt4或Wnt5蛋白的培养基或三维基质中培养的内分泌祖细胞，并包含包含至少两个β细胞的多谱系细胞，其中HILO被血管化的α细胞，δ细胞，ε细胞和导管样细胞，表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)，并且表现出免疫检查点蛋白的持续表达。在一个实施方案中，人胰岛样类器官(HILO)是胰岛样类器官或胰类器官。在一个实施方案中，人胰岛样类器官(HILO)进一步表现出KCl刺激的胰岛素分泌或葡萄糖刺激的胰岛素分泌。在另一个实施方案中，用于培养人胰岛样类器官(HILO)的三维基质包括结冷胶。在另一个实施方案中，用于培养人胰岛样类器官(HILO)的三维基质包含重组人Wnt4蛋白。在一个实施方案中，人胰岛样类器官(HILO)源自内分泌祖细胞，其选自诱导的多能干细胞(iPSC)、胚胎多能干细胞(ePSC)和/或胰腺祖细胞。在一个实施方案中，内分泌祖细胞表达神经元素3、neurod1、Nkx2.2和Pax4生物标记中的至少一种。在一个实施方案中，人胰岛样类器官(HILO)表达FLTP和ESRRγ基因。在一个实施方案中，人胰岛样类器官(HILO)进一步包含脂肪来源的干细胞和/或内皮细胞。在一个特定的实施方案中，脂肪干细胞是人脂肪干细胞(hADSC)和/或内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在另一个实施方案中，人胰岛样类器官(HILO)进一步表现出KCl刺激的胰岛素分泌、GLP-1刺激的胰岛素分泌、生长抑素分泌或胰高血糖素分泌。在另一个实施方案中，人胰岛样类器官(HILO)表达选自以下的β细胞谱系标记：NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB和SYT4以及ARXα细胞谱系标记。在另一个实施方案中，人胰岛样类器官(HILO)是表达选自Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6和Foxa2的β细胞转录因子的胰腺HILO。在实施方案中，人胰岛样类器官(HILO)表现出免疫检查点蛋白的持续表达，所述免疫检查点蛋白与选自程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA-4)；淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)；吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)；肿瘤坏死因子受体超家族成员9(4-1BB)；糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)；T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域(TIM-3)；肿瘤坏死因子受体超家族成员4(OX40)；腺苷A2A受体(A2AR)；B7-H3；B7-H4；B7-1/B7-2；BTLA；T细胞激活的V域Ig抑制剂(VISTA)；或上述任何一项的组合的免疫细胞表达的同源配体结合。在一个实施方案中，权利要求40-54中任一项的人胰岛样类器官(HILO)，其中所述免疫检查点蛋白是程序化死亡配体-1(PD-L1)。
在另一方面，提供了一种非人类生物，其移植或植入了如上文所述的前述方面中所述的人胰岛样类器官、胰岛类器官或HILO。在一个实施方案中，非人类生物是哺乳动物。在一个实施方案中，非人类生物是小鼠。
在另一方面，提供了一种治疗受试者的胰腺疾病的方法，其中所述方法包括将胰岛样类器官或胰岛类器官移植或植入所述受试者，其中所述胰岛样类器官或胰岛类器官包含内分泌祖细胞衍生的多谱系细胞，包括β、α、δ、ε细胞，导管样细胞或其组合，具有血管化作用，表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)并表现出免疫的持续表达检查点蛋白可逃避免疫检测或自身免疫。
在另一方面，提供了一种治疗受试者的1型糖尿病的方法，其中所述方法包括将胰岛样类器官或胰岛类器官移植或植入所述受试者，其中所述胰岛样类器官或胰岛类器官包含内分泌祖细胞衍生的多谱系细胞，包括β、α、δ、ε细胞、导管样细胞或其组合已血管化，表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)并表现出免疫检查点的持续表达蛋白质可逃避免疫检测或自身免疫。
在上述方面中描述的方法的实施方案中，胰岛样类器官或胰岛类器官进一步表现出KCl刺激的胰岛素分泌、GLP-1刺激的胰岛素分泌、生长抑素分泌或胰高血糖素分泌。在上述方面中描述的方法的实施方案中，胰岛样类器官或胰岛类器官表达表达选自NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB和SYT4以及ARXα细胞谱系标记的β细胞谱系标记物。在上述方面描述的方法的一个实施方案中，内分泌祖细胞选自诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎多能干细胞(ePSC)和/或胰腺祖细胞。在一个实施方案中，内分泌祖细胞表达神经元素3、neurod1、Nkx2.2和Pax4生物标记中的至少一种。在上述方面中描述的方法的一个实施方案中，胰岛样类器官或胰岛类器官表达选自Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6和Foxa2的β细胞转录因子。在上述方面所述的治疗方法的一个实施方案中，所述免疫检查点蛋白与选自程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)的免疫细胞表达的同源配体结合；所述同源配体选自免疫细胞表达蛋白1(PD-1)。细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA-4)；淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)；吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)；肿瘤坏死因子受体超家族成员9(4-1BB)；糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)；T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域(TIM-3)；肿瘤坏死因子受体超家族成员4(OX40)；腺苷A2A受体(A2AR)；B7-H3；B7-H4；B7-1/B7-2；BTLA；T细胞激活的V域Ig抑制剂(VISTA)；或上述任何一项的组合。在一个特定的实施方案中，免疫检查点蛋白是程序化死亡配体-1(PD-L1)。在上述方面中描述的治疗方法的一个实施方案中，通过上述方面中描述的方法产生胰岛样类器官或胰岛类器官。在上述方面所述的治疗方法的实施方案中，所述胰岛样类器官或胰岛类器官是上述方面所述的类器官。在上述方面中描述的治疗方法的一个实施方案中，将免疫抑制剂施用于受试者。在上述方面中描述的治疗方法的一个实施方案中，所述受试者是人类。在上述方面中描述的治疗方法的一个实施方案中，胰腺疾病是1型糖尿病或2型糖尿病。
在另一方面，提供了一种细胞移植的方法，其中所述方法包括向有此需要的受试者施用免疫保护的细胞，如上述方面所述的人胰岛样类器官或胰岛类器官。在一个实施方案中，免疫保护的细胞、人胰岛样类器官或胰岛类器官对于接受移植的受试者是同基因的、自体的、同种异基因的或异种的。
在另一方面，提供了一种试剂盒，其包含免疫保护的细胞，如上述方面所述的人胰岛样类器官或胰岛类器官，或包含所述免疫保护细胞、人胰岛样类器官或胰岛类器官的药学上可接受的组合物。在一个实施方案中，试剂盒包含同种、自体、同种或异种的免疫保护细胞、人胰岛样类器官或胰岛类器官。
根据实施例的详细描述和权利要求，其他特征和优点将显而易见。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为相关领域的技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等，《微生物学和分子生物学词典》(1994年第2版)；剑桥科学技术词典(Walker ed.，1988)；遗传学词汇表，第5版，R.Rieger等(eds.)，Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham，《哈珀·柯林斯生物学词典》(1991年)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有以下赋予它们的含义。
“AFP多肽”或“甲胎蛋白”是指与NCBI登录号NP_001125.1提供的序列具有至少85％的氨基酸序列同一性并且具有AFP多肽的生物学活性的蛋白质或其片段。AFP多肽的示例性生物学活性包括与铜、镍、脂肪酸和胆红素的结合。NCBI登录号NP_001125.1提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000201
“AFP多核苷酸”是指编码AFP多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_001134.2。处提供了示例性的AFP多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_001134.2提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000202
Figure BDA0003112862220000211
“ALB多肽”或“白蛋白”是指与NCBI登录号NP_000468.1提供的序列具有至少85％氨基酸序列同一性并且具有ALB多肽的生物学活性的蛋白质或其片段。ALB多肽的示例性生物学活性包括与脂肪酸、钙离子、钠离子、钾离子、激素和胆红素的结合。稳定细胞外液量；以及血浆锌的运输。NCBI登录号NP_000468.1提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000212
“ALB多核苷酸”是指编码ALB多肽或其片段的多核苷酸。示例性的AFP多核苷酸序列在NCBI Ref：NM_000477.5处提供。NCBI Ref：NM_000477.5提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000213
Figure BDA0003112862220000221
“试剂”是指任何小分子化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
“改善”是指减少、抑制、减弱、减少、阻止或稳定疾病的发展或进程。
“改变”是指增加或减少。增加是任何积极的变化，例如至少约5％、10％或20％；至少约25％、50％、75％，甚至100％、200％、300％或更多。减少是负变化，例如减少至少约5％、10％或20％。至少减少约25％、50％、75％；甚至增加100％、200％、300％或更多。
在本公开中，“包括(comprises)”，“包含(comprising)”，“包含(containing)”和“具有(having)”等可以具有美国专利法赋予它们的含义，并且可以表示“包括(includes)”，“包含(including)”等。“基本上由……组成(consisting essentially of)”或“基本上由……组成(consists essentially)”同样具有美国专利法中赋予的含义，并且所述术语是开放式的，只要所列举的基本或新颖特征不因所列举的以上特征的存在而被改变，则允许存在比所列举的更多的特征，而是排除现有技术的实施例。
“CDX2多肽”是指与NCBI登录号NP_001256.3提供的序列具有至少85％的氨基酸序列同一性并且具有转录因子活性的蛋白质或其片段。NCBI登录号NP_001256.3提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000231
“CDX2多核苷酸”是指编码CDX2多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_001265.4处提供了示例性的CDX2多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_001265.4提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000232
Figure BDA0003112862220000241
“CYP3A7多肽”或“细胞色素P450”是指与NCBI登录号NP_000756.3提供的序列具有至少85％氨基酸序列同一性并且具有单加氧酶活性的蛋白质或其片段。NCBI登录号NP_000756.3提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000242
“CYP3A7多核苷酸”是指编码CYP3A7多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_000765.4处提供了示例性的AFP多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_000765.4提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000243
Figure BDA0003112862220000251
“自体的”是指从相同的个体，受试者或患者获得或衍生的生物材料，例如自体的细胞、组织、胰岛、类器官或胰岛样类器官。举例来说，自体移植(例如供体细胞、组织、器官、胰岛、类器官或胰岛样类器官)涉及一个个体，受试者或患者作为供体和受体。“同基因的”是指在遗传上相似或相同(并且属于相同物种)的细胞、组织、器官、胰岛、类器官、胰岛样类器官或生物体(或其他生物材料)，因此具有免疫兼容性。同种供体生物材料通常紧密相关，以至于移植不会在受体中引起免疫反应。“同种异体”是指遗传上与受体不同的生物材料，例如供体同种异体细胞、组织、器官、胰岛、类器官或胰岛样类器官。同种异体生物材料通常从相同物种的个体获得或衍生。另外，同种异体生物材料可以来自无关的供体或来自与受体的MHC或HLA组织兼容性抗原类型匹配的供体。“异种的”是指衍生自或获得自不同物种的个体的生物材料(例如，细胞、组织、器官、胰岛、类器官或胰岛样类器官)。举例来说，自体的、同基因的、同种异体的或异种的细胞、组织、器官、胰岛、类器官或胰岛样类器官可以用于移植或植入，特别是通过涉及IFNγ治疗的方法(例如MPS)产生的那些。如本文所述的IFNγ处理以产生长期的、免疫逃避的、移植的或植入的生物材料。在一个实施方案中，这样的生物材料是从活体供体(个体、受试者或生物)获得或产生的。在一个实施方案中，这样的生物材料是从无生命的供体例如尸体人胰岛或供体匹配的尸体人胰岛获得或产生的。
如本文所用，术语“载体”是指生理学上可接受的稀释剂、赋形剂、缓冲液或媒介物、组合物(例如，生理学上可接受的或药物组合物)例如与之一起包含细胞、胰岛、胰岛样类器官、或类器官可被施用于受试者或可被存储在其中。药学和药学上可接受的载体包括无菌液体，例如培养基、盐水、缓冲液等。在实施方案中，生理上可接受的载体用于药物组合物中，所述药物组合物被施用于或移植到受试者中，所述受试者包括但不限于人类受试者或患者。在一些实施方案中，水或盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液可以用作载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体(和药物组合物)是本领域技术人员已知和使用的，并在A.R.Gennaro，Lippincott Williams&Wilkins，2000年及其更高版本的《雷明顿：药学的科学和实践》(第20版)中描述。
“片段”是指多肽或核酸分子的一部分。所述部分包含参考核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以包含10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。
如本文所用，术语“免疫应答”是指受试者对一种或多种抗原(例如，免疫原性蛋白或肽)和/或抗原表位的免疫系统应答或反应，被免疫系统识别为外来，同种异体的或异源的。免疫反应包括两种细胞介导的免疫反应(即，由效应T细胞介导的反应，例如抗原特异性或非特异性T细胞，例如CD8+T细胞、Th1细胞、Th2细胞和Th17细胞)以及体液免疫反应(即以B细胞激活和抗原特异性抗体产生为特征的反应)。术语“免疫应答”既包括对抗原或免疫原的先天免疫应答，也包括由于获得性免疫而引起的记忆应答，可以涉及B细胞或T细胞，或两者。
“免疫检查点蛋白”或“免疫检查点分子”，或简称为“检查点蛋白或分子”，是指可以诱导或阻碍T细胞激活或细胞或免疫系统途径中特定过程的蛋白或分子。例如，以防止错误或异常或病理活动或状况。在免疫应答中，抗原呈递细胞(APC)与T细胞之间的关键相互作用受到“三个信号模型”的严格调控：(1)显示由结合在主要组织兼容性复合物(MHC)上的抗原组成的表面复合物)I类或II类蛋白质(MHC I或II)分子与T细胞(CD8+或CD4+)上的T细胞受体(TCR)结合；(2)通过免疫检查点蛋白和(3)细胞因子共同刺激。免疫检查点蛋白包括可以刺激或抑制T细胞激活的共刺激蛋白和抑制蛋白。仅接收信号1而没有共刺激信号2的稚T细胞变得无能或死于细胞凋亡。共刺激配体/受体对的参与在免疫突触的中心触发受体和蛋白质复合物的积累，然后放大并增强TCR信号传导的持续时间(Wulfing，C.和Davis，MM，1998，Science，282：2266-2269)。然后，细胞因子环境信号3诱导稚CD4+T细胞分化为各种T细胞亚群，例如T辅助(Th)1细胞、Th2细胞、Th17细胞和调节性T细胞(Tregs)，激活后产生并释放出一组独特的细胞因子。(Foks，A.C.和Kuiper，J.，2017，Br.J.Pharmacol,，174：3940-3955)。
免疫系统提供多种刺激性和抑制性免疫检查点蛋白(信号2)，并且每种途径对单个免疫细胞的命运都有其独特的影响。通过刺激性免疫检查点蛋白发出的信号可以促进细胞存活，细胞周期进程以及向效应细胞和记忆细胞的分化，而抑制性免疫检查点蛋白发出的信号可以通过诱导Tregs直接或间接终止这些过程。可以按顺式提供共刺激，即信号1和2由同一APC提供，也可以反式提供，即信号2由与信号1不同的“旁观者”APC提供(Roska,A.K.和Lipsky,P.E.,1985,J.Immunol.,135:2953-2961；Liu,Y.和Janeway,C.A.,Jr.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3845-3849；Ding,L.和Shevach,E.M.,1994,Eur.J.Immunol.,24:859-866)。
检查点蛋白是免疫系统的调节剂，经常与配体(同源配体)结合或相互作用，这可能会引起特定的作用，例如细胞刺激、无反应性或凋亡。在一个实施方案中，免疫检查点蛋白是结合免疫细胞表面例如T细胞表面受体上的同源配体(例如受体配体)的蛋白。在一个具体的实施方案中，免疫检查点蛋白是PD-L1或其结合部分，其中PD-L1的同源配体是在T细胞表面表达的PD-1。在一个实施方案中，检查点蛋白是检查点蛋白的细胞外结构域。
术语“同源配体”是指免疫检查点蛋白与之特异性相互作用或与之特异性结合的特异性结合伴侣、结合成员或配体。例如，受体蛋白结合或与其相互作用的特异性配体是所述受体蛋白的“同源配体”。类似地，受体蛋白是特定配体分子或蛋白的同源配体。
“组成型表达”是指与仅根据需要转录的兼性基因相比连续转录的基因的表达。组成型表达的基因以持续的方式转录、控制范围仅限于与细胞、组织或生物的代谢状态直接相关的控制范围。可以例如通过转录后或翻译后修饰来修饰组成型表达基因的表达水平。在一个实施方案中，所述基因是编码PD-L1多肽的PD-L1。
“检测”是指识别要检测的分析物的存在、不存在或数量。
“可检测标记”是指一种组合物，当其与感兴趣的分子连接时，使其能够通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法进行检测。例如，有用的标记包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，通常用于ELISA中)、生物素、洋地黄毒苷或半抗原。
“差异化”是指沿袭承诺的发展过程。可以通过测量一种或多种细胞特异性标志物相对于它们在相应的未分化对照细胞中的表达的增加来测定分化。“谱系”是指细胞发育的途径，其中前体细胞或“祖细胞”经历进行性生理变化以变成具有特征功能的特定细胞类型。在一些实施方案中，细胞类型是β细胞。在一些实施方案中，细胞类型是α细胞、δ细胞或导管细胞。在一些其他实施方案中，细胞类型是肝细胞。在其他实施方案中，细胞类型是心肌细胞。在一些实施方案中，细胞类型是肠细胞。分化是分阶段进行的，因此细胞逐渐变得更加特殊，直到它们达到完全成熟为止，这也称为“终末分化”。“终末分化的细胞”是已经承诺了特定谱系并且已经达到分化的终末期的细胞(即，已经完全成熟的细胞)。在一些实施方案中，诱导的多能干细胞(iPSC)分化为β样细胞、α样细胞、δ样细胞或导管样细胞。在一些其他实施方案中，诱导的多能干细胞(iPSC)分化为肝细胞、心肌细胞或肠细胞。
“去分化细胞”是其中分化过程至少在某种程度上已经逆转的细胞。去分化可以例如通过鉴定一种或多种细胞特异性标志物的表达相对于它们在相应对照细胞中的表达的减少来测定。或者，可通过测量通常在胚胎干细胞，多能或多能细胞类型中表达或在发育早期阶段表达的一种或多种标志物的增加来分析去分化。在一些实施方案中，去分化细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。在某些实施方案中，去分化细胞是人诱导的多能干细胞(iPSC)。
“疾病”是指不利地影响、损害或干扰细胞、组织、器官或身体的一部分的正常功能的任何状况或病症，例如自身免疫性或自身免疫性疾病。疾病的例子包括1型糖尿病、2型糖尿病和胰腺癌。自身免疫性疾病是指人体产生免疫细胞(例如，效应T细胞或NK细胞)和/或由B细胞产生的抗体，这些抗体会对其自身的组织或器官(或组织或器官移植物或植入物)进行免疫反应(攻击))，导致组织或器官(或组织或器官移植物或植入物)的退化，并在某些情况下导致其破坏。
“有效量”是指相对于未经治疗的受试者，缓解受试者的疾病症状所需的治疗剂或类器官的量。用于实施本发明以治疗疾病的治疗剂的有效量取决于给药方式、年龄、体重和受试者的总体健康状况而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。所述量称为“有效”量。在一些实施方案中，治疗类器官是胰岛类器官。在一些其他实施方案中，有效量的胰岛类器官被给予患有1型或2型糖尿病的受试者。
“ESRRG多肽”是指与NCBI登录号NP_001230448.1提供的序列具有至少85％的氨基酸序列同一性并且具有核激素受体活性的蛋白质或其片段。NCBI登录号NP_001230448.1提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000291
“ESRRG多核苷酸”是指编码ESSRG多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_001243519.1。处提供了示例性的ESRRG多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_001243519.1提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000292
Figure BDA0003112862220000301
Figure BDA0003112862220000311
如本文所用，“内分泌”是指试剂(例如，激素)向血流中的分泌。“外分泌”是指试剂通过导管分泌到上皮表面中。
“片段”是指多肽或核酸分子的一部分。所述部分包含参考核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以包含10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。
“FOXA2多肽”是指与NCBI登录号NP_068556.2提供的序列具有至少85％的氨基酸序列同一性并且具有转录因子活性的蛋白质或其片段。NCBI登录号NP_068556.2提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000321
“FOXA2多核苷酸”是指编码FOXA2多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_021784.4处提供了示例性的FOXA2多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_021784.4提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000322
Figure BDA0003112862220000331
“GATA6多肽”是指与NCBI登录号NP_005248.2提供的序列具有至少85％的氨基酸序列同一性并且具有转录因子活性的蛋白质或其片段。NCBI登录号NP_005248.2提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000332
“GATA6多核苷酸”是指编码GATA6多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_005257.5处提供了示例性的KCNK3多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_005257.5提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000333
Figure BDA0003112862220000341
“吉兰糖胶”是指具有带有重复单元的直链的多糖，所述重复单元具有以下任何一种分子结构：
结冷胶-高酰基形式
Figure BDA0003112862220000351
结冷胶-低酰基形式
Figure BDA0003112862220000352
在前述结构中，“Ac”是指乙酸酯基，“Gly”是指甘油酸酯基，”M+”是单价阳离子。在一些实施方案中，结冷胶是结冷胶。
“杂交”是指互补核碱基之间的氢键，其可以是Watson-Crick，Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核碱基。
“免疫抑制剂”或“免疫抑制剂”是指抑制或预防对象中移植或植入的器官，胰岛或类器官的免疫反应，例如排斥反应的试剂。免疫抑制剂的实例包括但不限于巴利西单抗、抗胸腺细胞球蛋白、阿来珠单抗、泼尼松、硫唑嘌呤、霉酚酸酯、环孢素、西罗莫司、甲氨蝶呤、干扰素和他克莫司。
“诱导的多能干细胞”或“iPSC”是指通过细胞中一种或多种转录因子的外源表达获得多能性的分化的体细胞。“iPSC来源的细胞”是源自诱导的多能干细胞的细胞。“iPSC衍生的β样细胞”、“iPSC衍生的α样细胞”、“iPSC衍生的δ样细胞”或“iPSC衍生的导管样细胞”是衍生自诱导多能干的细胞。细胞，并分别具有β细胞、α细胞、δ细胞或导管细胞的特征。
“表达干扰素(IFNγ)受体的细胞”(例如供体细胞)、胰岛、类器官(及其中的细胞)是指在其表面表达一定量的IFNγ受体的细胞、胰岛、类器官(及其中的细胞)根据本文所述的方法，其水平或水平足以在接触或暴露于IFNγ(例如MPSIFNγ)后对IFNγ产生响应，并进而表达或上调编码检查点蛋白的基因或例如检查点蛋白的表达PD-L1(PD-L1标记蛋白)。在一个实施方案中，PD-L1蛋白在细胞表面表达(细胞膜表达)。在一个实施方案中，检查点蛋白例如PD-L1的表达或上调是持续的，例如大于或等于1、2、3、4、5、6或7天或更长时间。在一个实施方案中，检查点蛋白例如PD-L1的表达或上调是持续的，例如大于或等于7天或更长时间(例如，超过1、2、3、4、5、6周或更长时间)。可以通过本领域技术人员常规已知或用于检测或确定蛋白质或多核苷酸水平的任何测定法来检测或确定PD-L1的表达或细胞中或细胞上PD-L1的表达水平，例如但不限于酶促、荧光、化学发光或电化学发光免疫测定、流式细胞术、光谱法(质谱)；PCR或RNA或DNA检测方法。
如本文所用，间歇暴露是指细胞、胰岛、类器官(胰岛样类器官，例如人胰岛样类器官，以及其中的细胞)的重复暴露，例如短时间重复暴露，尤其是干扰素-γ(IFNγ)的重复暴露。受体表达的细胞、胰岛、类器官(胰岛样类器官及其中的细胞)对IFNγ产生多个脉冲，例如短重复脉冲，称为多脉冲刺激(MPS)，如本文所述，在所描述的方案中所使用的术语“抗原”用于产生存活并具有降低的细胞死亡的免疫保护的细胞，胰岛或类器官，例如，在移植，植入或转移后逃避免疫检测。IFNγ暴露的每个重复脉冲的持续时间通常是短时间段，例如几分钟或几小时，而不是延长的时间段。举例来说，暴露于IFNγ的时间可以为0.5小时、1小时、2小时或3小时等，在给定或整个时间段(例如，小时(例如，2、4、6、12、24、36、48、72、144或更多小时，或其间隔)，天数(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，13、14或更多天)或几周(1、2、3、4、5、6、7、8或更多周)，如此所述。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯净的”是指从其天然状态下通常与其伴随的组分不同程度地释放出来的材料。“隔离”表示与原始来源或周围环境的隔离程度。“纯化”表示分离度高于分离度。“纯化的”或“生物纯净的”蛋白质充分不含其他物质，以使任何杂质均不会实质性影响所述蛋白质的生物学特性或引起其他不利后果。也就是说，如果本发明的核酸或肽在通过重组DNA技术生产时基本不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者在化学合成时基本不含化学前体或其他化学品，则将其纯化。纯度和均质性通常使用分析化学技术确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一个条带。对于可以进行修饰的蛋白质，例如磷酸化或糖基化，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，可以将其分别纯化。
“分离的多核苷酸”是指不含基因的核酸(例如DNA)，所述基因在衍生本发明核酸分子的生物的天然存在的基因组中位于所述基因的侧翼。因此，所述术语包括，例如，掺入载体中的重组DNA；等等。进入自主复制的质粒或病毒；或进入原核生物或真核生物的基因组DNA；或以独立于其他序列的独立分子(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)形式存在。另外，所述术语包括从DNA分子转录的RNA分子，以及作为编码附加多肽序列的杂合基因的一部分的重组DNA。
“分离的多肽”是指已经与天然伴随的组分分离的本发明的多肽。通常，当多肽按重量计至少60％不含与之天然结合的蛋白质和天然存在的有机分子时，将其分离。所述制剂可以是按重量计至少75％、至少90％和至少99％的本发明的多肽。本发明的分离的多肽可以例如通过从天然来源提取，通过表达编码这种多肽的重组核酸而获得或通过化学合成蛋白质。纯度可以通过任何适当的方法来测量，例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过HPLC分析。
“KCNK3多肽”是指与NCBI登录号提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。NP_002237.1并具有钾通道活性。NCBI登录号NP_002237.1提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000371
“KCNK3多核苷酸”是指编码KCNK3多肽或其片段的多核苷酸。示例性的KCNK3多核苷酸序列在NCBI Ref：NM_002246.2处提供。NCBI Ref：NM_002246.2提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000381
Figure BDA0003112862220000391
“KCNQ1多肽”是指与NCBI登录号提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。NP_000209.2(异构体1)或NP_861463.1(异构体2)并具有钾通道活性。NCBI登录号NP_000209.2提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000392
“KCNQ1多核苷酸”是指编码KCNQ1多肽或其片段的多核苷酸。示例性的KCNQ1多核苷酸序列在NCBI Ref：NM_000218.2处提供。下面复制了NCBI Ref：NM_000218.2中提供的序列：
Figure BDA0003112862220000401
Figure BDA0003112862220000411
“LGR5多肽”是指与NCBI登录号提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。NP_003658.1(异构体1)，NP_001264155.1(异构体2)或NP_001264156.1(异构体3)并且具有跨膜信号传导受体活性或G蛋白偶联受体活性。NCBI登录号NP_003658.1提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000412
“LGR5多核苷酸”是指编码LGR5多肽或其片段的多核苷酸。示例性的LGR5多核苷酸序列在NCBI Ref：NM_003667.3。NCBI Ref：NM_003667.3提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000413
Figure BDA0003112862220000421
Figure BDA0003112862220000431
“LDHA多肽”或“乳酸脱氢酶A多肽”是指与氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。在NCBI登录号NP_005557.1(异构体1)，NP_001128711.1(异构体2)，NP_001158886.1(异构体3)，NP_001158887.1(异构体4)或NP_001158888.1(异构体5)中提供的序列并具有脱氢酶活性。NCBI登录号NP_005557.1提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000432
“LDHA多核苷酸”或“乳酸脱氢酶A多核苷酸”是指编码LDHA多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_005566.3。处提供了示例性的LDHA多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_005566.3提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000433
Figure BDA0003112862220000441
“MAFA多肽”是指与NCBI登录号提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。NP_963883.2并具有转录因子活性。NCBI登录号NP_963883.2提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000442
“MAFA多核苷酸”是指编码MAFA多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_201589.3处提供了示例性的MAFA多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_201589.3提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000451
如本文所用，“标志物”是指与疾病或病症相关或与特定细胞类型相关的表达水平或活性改变的任何蛋白质或多核苷酸。在一些实施方案中，β细胞的标记是Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6或Foxa2。在一些实施方案中，肝细胞的标记是AFP、ALB或Cyp3a7。在一些其他实施方案中，心肌细胞的标记是hMlc2a、hNkx2-5、αMHC或KCNQ1。在其他实施方案中，小肠细胞的标志物是CDX2、Muc2或Lgr5。
“αMHC多肽”或“肌球蛋白重链(MHC)α多肽”是指具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基的蛋白质或其片段。氨基酸序列与NCBI登录号NP_002462.2提供的序列具有同一性，并具有肌动蛋白结合活性。NCBI登录号NP_002462.2提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000461
“αMHC多核苷酸”是指编码αMHC多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_002471.3。处提供了示例性的αMHC多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_002471.3提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000471
Figure BDA0003112862220000481
Figure BDA0003112862220000491
“MLC2A多肽”或“人MLSC2A(hMLC2A)多肽”是指具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列的蛋白质或其片段。与NCBI登录号NP_067046.1提供的序列具有相同性，并具有钙结合活性。NCBI登录号NP_067046.1提供的氨基酸序列如下所示：
1 MASRKAGTRG KVAATKQAQR GSSNVFSMFE QAQIQEFKEA FSCIDQNRDG IICKADLRET
61 YSQLGKVSVP EEELDAMLQE GKGPINFTVF LTLFGEKLNG TDPEEAILSA FRMFDPSGKG
121 VVNKDEFKQL LLTQADKFSP AEVEQMFALT PMDLAGNIDY KSLCYIITHG DEKEE
“MLC2A多核苷酸”是指编码MLC2A多肽或其片段的多核苷酸。示例性的MLC2A多核苷酸序列在NCBI Ref：NM_021223.2。处提供。NCBI Ref：NM_021223.2提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000492
“MUC2多肽”是指与NCBI登录号提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。NP_002448.3，具有并具有MUC2多肽的生物学活性。MUC2多肽的示例性生物学活性包括聚合成凝胶并包被肠和其他含有粘膜的器官的上皮。NCBI登录号NP_002448.3提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000493
Figure BDA0003112862220000501
Figure BDA0003112862220000511
“MUC2多核苷酸”是指编码MUC2多肽或其片段的多核苷酸。示例性的MUC2多核苷酸序列在NCBI Ref：NM_002457.3处提供。NCBI Ref：NM_002457.3提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000512
Figure BDA0003112862220000521
Figure BDA0003112862220000531
Figure BDA0003112862220000541
Figure BDA0003112862220000551
Figure BDA0003112862220000561
Figure BDA0003112862220000571
“NKX2-5多肽”或“人NKX2-5(hNKX2-5)多肽”是指具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少80％的蛋白质或其片段。与在NCBI登录号NP_004378.1(同工型1)，NP_001159647.1(同工型2)或NP_001159648.1(同工型3)提供的序列具有至少99％的氨基酸序列同一性，并且具有转录因子活性。NCBI登录号NP_004378.1提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000572
“NKX2-5多核苷酸”是指编码NKX2-5多肽或其片段的多核苷酸。示例性的NKX2-5多核苷酸序列在NCBI Ref：NM_004387.3。处提供。NCBI Ref：NM_004387.3提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000573
Figure BDA0003112862220000581
“NEUROD1多肽”是指与NCBI登录号提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。NP_002491.2并具有转录因子活性。NCBI登录号NP_002491.2提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000582
“NEUROD1多核苷酸”是指编码NEUROD1多肽或其片段的多核苷酸。示例性的NEUROD1多核苷酸序列在NCBI Ref：NM_002500.4处提供。NCBI Ref：NM_002500.4上提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000583
Figure BDA0003112862220000591
Figure BDA0003112862220000601
“NKX6-1多肽”是指与NCBI提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段登录号NP_006159.2，具有转录因子活性。NCBI登录号NP_006159.2提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000602
“NKX6-1多核苷酸”是指编码NKX6-1多肽或其片段的多核苷酸。示例性的NKX6-1多核苷酸序列在NCBI Ref：NM_006168.2。处提供。NCBI Ref：NM_006168.2提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000603
“NDUFA4多肽”是指与NCBI登录号提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。NP_002480.1并且具有NADH脱氢酶活性和氧化还原酶活性。NCBI登录号NP_002480.1提供的氨基酸序列如下所示：
1MAAELAMGAE LPSSPLAIEY VNDFDLMKFE VKKEPPEAER FCHRLPPGSL SSTPLSTPCS
Figure BDA0003112862220000611
“NDUFA4多核苷酸”是指编码NDUFA4多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_002489.3。处提供了示例性的NDUFA4多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_002489.3提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000612
如本文所用，“获得”与“获得代理”中的包括合成、购买、采购、推导或以其他方式获得代理。
“器官”是指执行生物学功能的细胞的集合。在一个实施方案中，器官包括但不限于膀胱、脑、神经组织、神经胶质组织、食道、输卵管、心脏、胰腺、肠、胆囊、肾脏、肝脏、肺、卵巢、前列腺、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫、乳房、骨骼肌、皮肤、骨骼和软骨。可以使用技术人员已知的标准方法来测定器官的生物学功能。
“类器官”是指模仿器官结构和功能的体外产生的身体。”有机器官”和“微型器官”在本文可互换使用。“胰岛样类器官”、“胰岛类器官”、“胰岛”或“胰腺类器官”是模仿胰岛的结构和功能的体外产生的细胞簇。胰岛的示例性功能包括但不限于葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)、氯化钾(KCl)刺激的胰岛素分泌、GLP-1刺激的胰岛素分泌、生长抑素分泌或胰高血糖素分泌。“胰岛类器官”、“胰岛样类器官”、“胰类器官”和“小胰岛”在本文中可互换使用。在一个实施方案中，“胰腺类器官”是模拟胰腺的结构和功能的体外产生的体。胰腺的示例性功能包括但不限于调节葡萄糖代谢和血糖浓度的激素(例如葡萄糖和胰高血糖素)的内分泌分泌，以及有助于分解碳水化合物、蛋白质和脂质的消化酶的外分泌。”胰腺类器官”和“小胰腺”在本文中也可互换使用。在一个实施方案中，类器官是本文所述的人胰岛样类器官(“HILO”)。在一个实施方案中，从诱导的多能干细胞(iPSC)产生HILO。在一个实施方案中，HILO是功能成熟的并且包含内分泌样细胞类型，其在移植后例如在糖尿病小鼠模型(NOD-SCID小鼠)中有效地重建葡萄糖稳态。在一个实施方案中，HILO是WNT4处理的HILO(wHILO)。在一个实施方案中，在HILO中过表达检查点蛋白PD-L1使得HILO能够逃避免疫反应或被T细胞监视，从而它们能够在具有免疫能力的糖尿病小鼠(NOD-SCID小鼠)中维持葡萄糖稳态。较长的时间段，例如至少50天。在一个实施方案中，在给定时间段例如至少24小时内多次间断性离体暴露于干扰素γ(IFNγ)后，HILO中内源PD-L1表达的诱导限制了T细胞激活和移植物排斥。在实施方案中，细胞或HILO及其中的细胞多次间歇暴露于IFNγ涵盖细胞或HILO及其中的细胞(例如，低水平)暴露(例如，在培养中，例如液体培养或3D基质培养中)。在给定的时间段内，多次(例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次)IFNγ的暴露，其间没有IFNγ暴露。在一个实施方案中，经历了多次间歇暴露于IFNγ以便表达如本文所述的PD-L1多肽的HILO可以在本文中称为免疫逃避HILO、wHILO或wHILOie。
“PD-L1多肽”(也称为CD274)是指与氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。所述序列在UniProt登录号Q9NZQ7-1中提供并且具有转录因子活性。氨基酸序列在NCBI登录号NP_006184.2中提供，如下所示：
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET
“PD-L1多核苷酸”是指编码PD-L1多肽或其片段的多核苷酸。示例性的PD-L1多核苷酸序列在NCBI登录号：CCDS59118.1中提供。NCBI登录号CCDS59118.1提供的序列如下：
核苷酸序列(531nt)：
atgaggatatttgctgtctttatattcatgacctactggcatttgctgaacgccccatacaacaaaatcaaccaaagaattttggttgtggatccagtcacctctgaacatgaactgacatgtcaggctgagggctaccccaaggccgaagtcatctggacaagcagtgaccatcaagtcctgagtggtaagaccaccaccaccaattccaagagagaggagaagcttttcaatgtgaccagcacactgagaatcaacacaacaactaatgagattttctactgcacttttaggagattagatcctgaggaaaaccatacagctgaattggtcatcccagaactacctctggcacatcctccaaatgaaaggactcacttggtaattctgggagccatcttattatgccttggtgtagcactgacattcatcttccgtttaagaaaagggagaatgatggatgtgaaaaaatgtggcatccaagatacaaactcaaagaagcaaagtgatacacatttggaggagacgtaa
“PAX4多肽”是指与NCBI登录号提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。NP_006184.2并具有转录因子活性。氨基酸序列在NCBI登录号NP_006184.2中提供，如下所示：
Figure BDA0003112862220000631
“PAX4多核苷酸”是指编码PAX4多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_006193.2处提供了示例性的PAX4多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_006193.2提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000641
“PAX6多肽”是指与NCBI登录号提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。NP_001297090.1并具有转录因子活性。NCBI登录号NP_001297090.1提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000642
Figure BDA0003112862220000651
“PAX6多核苷酸”是指编码PAX6多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_001310161.1处提供了示例性的PAX6多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_001310161.1提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000652
Figure BDA0003112862220000661
Figure BDA0003112862220000671
“PDX1多肽”是指与NCBI登录号提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。NP_000200.1并具有转录因子活性。NCBI登录号NP_000200.1提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000672
“PDX1多核苷酸”是指编码PDX1多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_000209.3处提供了示例性的PDX1多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_000209.3提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000673
Figure BDA0003112862220000681
“PTF1多肽”是指与NCBI登录号提供的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段。NP_835455.1并具有转录因子活性。NCBI登录号NP_835455.1提供的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000682
Figure BDA0003112862220000691
“PTF1多核苷酸”是指编码PTF1多肽或其片段的多核苷酸。在NCBI Ref：NM_178161.2处提供了示例性的PTF1多核苷酸序列。NCBI Ref：NM_178161.2提供的序列如下：
Figure BDA0003112862220000692
“Wnt3a多核苷酸”是指编码Wnt3a多肽或其片段的多核苷酸。示例性的人Wnt3a多核苷酸序列在NCBI GenBank登录号AB060284.1中提供。NCBI GenBank登录号AB060284.1提供的多核苷酸序列复制如下：
Figure BDA0003112862220000693
Figure BDA0003112862220000701
“Wnt3a多肽”是指Wnt3a多肽或其片段，或与所述Wnt3a多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的多肽。人Wnt3a多肽序列。示例性的人Wnt3a多肽序列在NCBI GenBank上提供：AAI03924.1。GenBank提供的序列：AAI03924.1如下：
Figure BDA0003112862220000702
“Wnt4多核苷酸”是指编码Wnt4多肽或其片段的多核苷酸。示例性的人Wnt4多核苷酸序列在NCBI GenBank登录号AY009398.1中提供。登记号NCBI Ref NG_008974.1是参考标准Wnt4a多核苷酸序列。NCBI GenBank登录号AY009398.1提供的多核苷酸序列如下：
Figure BDA0003112862220000703
Figure BDA0003112862220000711
“Wnt4多肽”是指Wnt4多肽或其片段，或与所述Wnt4多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的多肽。人Wnt4多肽序列。示例性的人Wnt4多肽序列在NCBI GenBank登录号：AAG38658.1。中提供。GenBank登录号：AAG38658.1提供的序列复制如下：
Figure BDA0003112862220000712
“Wnt5a多核苷酸”是指编码Wnt5a多肽或其片段的多核苷酸。在参考标准序列NCBIRef：GenBank NM_003392处提供了编码人Wnt5a的示例性多核苷酸序列。具有6194个核苷酸的Wnt5a基因组序列的核苷酸658-1800编码人Wnt5a多肽。在NCBI Ref：GenBank NM_003392的658-1800位碱基处提供的人Wnt5a编码序列的多核苷酸序列复制如下：
Figure BDA0003112862220000713
Figure BDA0003112862220000721
“Wnt5a多肽”是指Wnt5a多肽或其片段，或与所述Wnt5a多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的多肽。人Wnt5a多肽序列。在UniProtKB标识符：P41221-1处提供了示例性的人Wnt5a(同工型1)多肽序列。UniProtKB标识符P41221-1提供的序列如下所示：
Figure BDA0003112862220000722
“免疫检查点蛋白或分子”或“免疫检查点”是指跨膜蛋白分子的特定亚型，其提供免疫应答的微调。在正常组织中，免疫检查点是抑制信号，并通过预防自身免疫在免疫细胞功能中发挥重要作用。在患有肿瘤或癌症的受试者中，肿瘤或癌细胞上的免疫检查点蛋白的上调允许肿瘤和癌症逃避免疫监视并逃避抗肿瘤免疫。成为临床免疫治疗重点的免疫检查点蛋白的非限制性例子是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)和程序化细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)。CTLA-4，也称为CD152，对于激活CD4+T细胞和免疫反应的启动阶段至关重要。PD-1，也称为CD279，以前称为B7.1，是激活的T细胞、B细胞和骨髓细胞表达的关键免疫检查点受体，并介导免疫抑制。PD-L1，也称为CD274，以前称为B7-H1，是一种免疫调节蛋白，在某些疾病状态(包括癌症和自身免疫性疾病)中，在抑制免疫系统中起着重要作用。PD-L1是与PD-1结合以调节免疫细胞的激活或抑制的同源配体。在正常情况下，免疫系统会与与外源或内源性因子(例如微生物或细胞)相关的外来抗原发生反应，从而触发抗原特异性细胞毒性CD8+T细胞和/或CD4+辅助T细胞的增殖。PD-L1与PD-1的结合传递了抑制信号，所述信号减少了淋巴结中抗原特异性T细胞的增殖，同时减少了调节性T细胞(抗炎性、抑制性T细胞)的凋亡。
反映PD-L1和PD-1之间的结合亲和力的Kd(解离常数)为770nM。PD-L1对共刺激分子CD80(B7-1)也有明显的亲和力，但对CD86(B7-2)没有亲和力。CD80的PD-L1的亲和力为1.4μM，所述值介于PD-L1对CD28和CTLA-4的亲和力之间(分别为4.0μM和400nM)。相关分子PD-L2对CD80或CD86没有亲和力，但共享PD-1作为受体(Kd较强，为140nM)。PD-1在激活的CD4 T细胞上调，并可以与表达PD-L1的单核细胞结合，从而诱导IL-10的产生。(E.A.Said等，2010，Nature Medicine，16(4)：452-459)。PD-L1及其在T细胞上的受体PD-1的相互作用产生了抑制T细胞受体(TCR)介导的IL-2产生激活和T细胞增殖的信号。PD-1/PD-L1相互作用与自身免疫有关。举例来说，NOD小鼠是一种自身免疫性动物模型，表现出对I型糖尿病和其他自身免疫性疾病自发发展的易感性，并已显示由于PD-1或PD-L1的阻断而导致糖尿病的发作(但不是PD-L2)，(MJ Ansari等，2003,J.Exp.Med.,198(1):63-69)。
“免疫监视”或“免疫监视”是指免疫系统的细胞进行的监视过程，以检测和破坏在身体的组织和器官中被识别为非自身、其他或同种异体的细胞。例如，这样的非自身细胞可以被病毒感染、突变、赘生性转化，或者可以表达未被免疫系统的细胞识别为自身或自体分子的细胞表面分子。
“祖细胞”是指能够产生(例如，通过分化或分裂)内皮细胞的多能干细胞的细胞。当在合适的体外或体内条件下，例如本文所述的那些条件下生长时，能够产生内皮细胞的祖细胞可以表达这种能力。
“后代”是指源自本发明的多能干细胞的细胞。后代包括但不限于祖细胞，分化的细胞和终末分化的细胞。
“源自”是指“获自”或获得后代细胞的过程。
“减少”是指至少10％、25％、50％、75％或100％的负变化。
“参考”或“对照”是指标准条件。例如，用作参考的未经处理或健康(未患病)的细胞、组织或器官。
“参考序列”是用作序列比较基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部。例如，全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度通常为至少约16个氨基酸、至少约20个氨基酸或至少约25个氨基酸。参考多肽序列的长度可以是约35个氨基酸、约50个氨基酸或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度通常将为至少约50个核苷酸、至少约60个核苷酸或至少约75个核苷酸。参考核酸序列的长度可以是约100个核苷酸、约300个核苷酸或在其附近或之间的任何整数。
“体细胞”是指从受试者的组织获得的细胞。这些受试者处于出生后的发育阶段(例如，成人、婴儿、儿童)。相反，“胚胎细胞”或“胚胎干细胞”源自处于发育的产前阶段的胚胎。
“特异性结合”是指识别和结合本发明的多肽，但基本上不识别和结合样品，例如天然包括本发明多肽的生物样品中的其他分子的化合物或抗体。
可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明多肽或其片段的任何核酸分子。这样的核酸分子不需要与内源核酸序列100％相同，但是通常将显示出实质同一性。与内源序列具有“基本同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明多肽或其片段的任何核酸分子。这样的核酸分子不需要与内源核酸序列100％相同，但是通常将显示出实质同一性。与内源序列具有“基本同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”是指在各种严格条件下在互补多核苷酸序列(例如，本文描述的基因)或其部分之间形成双链分子的对。(参见，例如，Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)MethodsEnzymol.152:507)。
例如，严格的盐浓度通常将小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠、小于约500mMNaCl和50mM柠檬酸三钠、或小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。在没有有机溶剂例如甲酰胺的情况下可以得到低严格度的杂交，而在至少约35％的甲酰胺或至少约50％的甲酰胺的存在下可以得到高的严格度杂交。严格的温度条件通常包括至少约30℃、至少约37℃和至少约42℃的温度。各种其他参数，例如杂交时间、去污剂的浓度、例如十二烷基硫酸钠(SDS)，以及包含或排除载体DNA，是本领域技术人员众所周知的。通过根据需要组合这些各种条件来实现各种严格程度。在一实施方案中，杂交将在30℃在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中发生。在另一个实施方案中，杂交将在37℃下在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精子DNA(ssDNA)中进行。在另一个实施方案中，杂交将在42℃在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中发生。在这些条件下有用的变化对于本领域技术人员将是显而易见的。
对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤的严格性也会有所不同。洗涤严格条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上所述，可以通过降低盐浓度或通过提高温度来提高洗涤严格性。例如，洗涤步骤的严格盐浓度将小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠、或小于约15mMNaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常将包括至少约25℃、至少约42℃和至少约68℃的温度。在一个实施方案中，洗涤步骤将在25℃下以30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS进行。在另一个实施方案中，洗涤步骤将在42℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在又一个实施方案中，洗涤步骤将在68℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。这些条件的其他变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员众所周知的，并且描述于例如Benton和Davis(Science196：180，1977)；和Science 196：180。Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci。，USA72：3961，1975)；Ausubel等。(《分子生物学最新研究方案》，威利科学出版社，纽约，2001年)；Berger和Kimmel(分子克隆技术指南，1987年，纽约学术出版社)；和Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》，纽约冷泉港实验室出版社。
“基本上相同”是指与参考氨基酸序列(例如，本文所述的任何氨基酸序列)或核酸序列(例如，以下任何一项)具有至少50％同一性的多肽或核酸分子。(本文所述的核酸序列)。这样的序列在氨基酸水平或核酸上与用于比较的序列至少60％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。
序列同一性通常使用序列分析软件进行测量(例如，遗传计算机组的序列分析软件包，,威斯康星大学生物技术中心,1710University Avenue,Madison,Wis.53705,BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)。这样的软件通过将同源性程度分配给各种取代、缺失和/或其他修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e-3和e-100之间的概率得分表示密切相关的序列。
如本文所用，术语“自我更新”是指干细胞分裂以产生一个(不对称分裂)或两个(对称分裂)子代细胞的过程，其子代细胞的发育潜能与母细胞的潜能没有区别。自我更新涉及增殖和维持未分化状态。
术语“干细胞”是指具有自我更新和分化成多种细胞谱系的能力的多能干细胞或多能干细胞。
“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，例如非人类灵长类动物、牛、马、犬、绵羊、啮齿动物或猫。在一个特定的实施方案中，受试者是人类受试者，例如人类患者。
本文提供的范围应理解为所述范围内所有值的简写形式，包括第一个值和最后一个值。通过非限制性实例，范围1至50应理解为包括任何数量，数量的组合或选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50的子范围。
“组织”是指具有相似形态和功能的细胞的集合。
如本文所用，术语“治疗”是指减轻或改善与之相关的病症和/或症状。应当理解，尽管没有排除，但是治疗疾病或病症并不需要完全消除与之相关的疾病、病症或症状。
“血管化”是指具有血管。在一些实施方案中，胰岛类器官或胰类器官是血管化的。
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或”应理解为包括性的。除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“一个”、“一个”和“所述”应理解为单数或复数。
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差之内。大约可以理解为以下范围的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内规定值。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语“大约”修饰。
在本文对变量的任何定义中列举化学基团的列举包括将所述变量定义为所列基团的任何单个基团或组合。本文中对变量或方面的实施例的叙述包括所述实施例作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分组合。
本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供和描述的任何其他组合物和方法中的一个或多个组合。
附图说明
图1A-1G提供与基于聚合物的培养物中的细胞串扰增强hiPSC衍生的β样细胞的功能性有关的图像、示意图和图。如图1A(上图)显示来自人iPSC(hiPSC)、原代人胰腺上皮细胞(hPanc上皮)、人脂肪来源干细胞(hADSC)、人胰成纤维细胞(hPanc成纤维细胞)、人的转录组的主成分分析结果脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人胰腺微血管内皮细胞(hPanc内皮细胞)。如图1A(底部)显示人类脂肪干细胞(hADSC)在Matrigel中的培养过程(在hADSC培养基中以1：1稀释，在300μl中有200万个细胞)，显示出内在的自我组织(比例尺为1mm)。如图1B示出了多细胞胰岛样球体(MCS)和胰岛样球体(IS)的产生的示意图。将hiPSC衍生的内分泌祖细胞(EP)与hADSC和内皮细胞(EC，HUVEC)在基于结冷胶的3D培养系统中共同培养(左)。EPs是能分化为内分泌细胞的多能细胞，包括α、β、δ、ε胰腺多肽和G细胞，如神经元素3、neurod1、Nkx2.2和Pax4生物标志物的表达所定义(Rezania，A.等，2014，自然生物技术，32：1121-1133)。在基质胶环境中产生的MCS显示通过绿色荧光蛋白(GFP)表达检测到的ECs(mCherry表达)和胰岛素表达的并入(右)(比例尺100μm)。如图1C示出了在3D结冷胶系统中培养的多细胞胰岛样球体(MCS)，其显示胰岛素表达(GFP，上图)。MCS的电子显微镜图像显示胰岛素颗粒(右下)和hADSC中的脂滴(右下)。如图1D展示了胰岛样球体(IS；在没有hADSC和EC的情况下产生的hiPSC衍生的β样细胞)，MCS或人类胰岛(hilsets)中分选的胰岛素表达细胞(GFP+)中的基因表达图。如图1E展示了一个图表，所述图表展示了人类c肽分泌对来自IS，MCS和组蛋白的3mM(G3)或20mM(G20)葡萄糖的反应。如图1F展示了一张图，显示了经深部处理或MCS(500)或人类胰岛移植后，STZ诱导的糖尿病NOD-SCID小鼠体内的随机进食血糖水平。如图1G展示了从移植后4周开始的小鼠进食、禁食和再喂养周期中血清人c肽水平的图表。误差棒代表±SEM。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图2A-2F提供了热图、示意图和图，其证明了人类胰岛的内分泌和支持细胞中非经典Wnt的表达。如图2A显示了在Matrigel中hADSC培养期间表达变化的热图。右侧显示了一个显着受影响的基因本体类别，即Wnt5a和下游信号传导(5.1e-03)。如图2B呈现的图显示了在hADSC自我组织过程中WNT的时间表达的tSNE聚类，如图2A所示。如图2C显示了图表和热图，其显示了人胰岛中WNT的相对表达(n＝5)。如图2D显示人胰岛单细胞转录组的t-SNE聚类(n＝3245)。带注释的细胞类型基于已知的标记基因表达进行分配。图2E和2F分别显示了人胰岛中WNT2B、WNT4、WNT5A、WNT7A、WNT7B和WNT9A表达的单细胞图和小提琴图。误差棒代表±SEM。
图3A-3K提供了与人类胰岛(类器官(HILO))的产生以及WNT4对HILO功能成熟的诱导有关的示意图、图像、热图和图。如图3A示出了人类胰岛样类器官(HILO)产生的示意图。如图3B示出了3D培养物中的HILO的代表性图像(左)和胰岛素表达(人胰岛素启动子驱动的GFP(右，比例尺100μm))图3C示出了分别显示β和α细胞中的胰岛素和胰高血糖素颗粒的电子显微镜图像。WNT4处理的HILO(“wHILOs”)和人类胰岛，比例尺，1μm。图3D-1给出了关键胰岛基因在hiPSC，用PBS(P)或WNT4(W)处理的HILO中相对表达的热图3D-2显示了在人类胰岛中的ISL1、SYT4、PDX1、GCK、NEUROD1、NKX2-2、INSULIN、NKX6-1、MAFA、MAFB和UCN3的相对表达的图。通过qPCR测定的wHILO和人类胰岛(每种样品类型n＝8)图3E是通过用WNT4处理(第26天至第33天为100ng/ml)在HILO中上调和下调的基因的基因本体图3F显示了用增加浓度的WNT4(0、10、25、50、200ng/ml)处理的HILO中ERRγ、NDUFA7和COX7A2的相对表达。5天。如图。3G显示了在3D培养的hiPSC、带有HILO的PBS和经过WNT4处理的HILO(wHILO)和人类胰岛(Z-Score)中氧化磷酸化基因相对表达的热图。如图3H是显示在第0天以hiPSC球体、倒置三角形、以PBS处理的HILO(直角三角形)、以WNT4处理的HILO(正方形)和人胰岛(圆圈)测量的耗氧率(OCR)的图。如图3I显示了显示来自在有和没有WNT4处理下产生的来自HILO的3mM(G3)或20mM(G20)葡萄糖或20mM KCl(K20)的体外人c-肽分泌的图。如图3J提供了动画片示意图，其描绘了可商购的hiPSC来源的样细胞的培养条件(左)和培养细胞的光学显微镜图像(右)。如图3K提供了条形图，其显示了响应于来自图2中描述的培养物的3mM(G3)和20mM(G20)葡萄糖的体外c-肽分泌。7D-2。
图4A-4M提供了绘图、图表、显微镜图像、流式细胞术结果和示意图，其与在免疫能力小鼠中表达PD-L1的wHILOs扩展功能和葡萄糖控制以及在C57BL6J小鼠中的wHILO移植物的免疫概况研究有关。如图4A显示了来自WNT4处理的HILO(wHILO，n＝4840)的单细胞转录组的tSNE聚类。如图4B是显示HILO和人胰岛中的相对细胞类型群体的图。如图4C显示有或没有PD-L1表达的wHILOs移植后随机喂养的血糖水平的图(分别在诱导的糖尿病C57BL6J小鼠的肾脏/肾脏胶囊中(分别为n＝11和9只小鼠)。图的顶部图表示wHILO(-)；图的中间图代表wHILOs(PD-L1表达)；图的底部图代表小肠。图4D显示了从肾脏中回收的胰岛素表达和小鼠免疫(CD45+)细胞的流式细胞分析带有和不带有PD-L1表达的wHILOs移植后第27天的囊状移植物，含有表达PD-L1的HILOs的移植物，其可能与T细胞(例如CD45+细胞)上的PD-1结合，从而抑制T细胞的激活和杀伤活性，与含有不表达PD-L1的HILO的移植物相比，显示出较少的浸润CD45+T细胞图4E显示了在wH移植后STZ诱导的糖尿病小鼠中血糖水平分析的量化如图4D所示，具有或不具有PD-L1表达的ILO。(误差线代表±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。如图4F提供了流式细胞术分析的胰岛素表达和小鼠免疫(CD45+)细胞的肾小球移植后27天wHILOs移植有或没有PD-L1表达后回收。CD45+细胞进一步分为B细胞(CD19+)，T细胞(CD3+)和NK细胞(NK1.1+)。如图4G示出了针对图3所描述的分析的量化的点图。4F(n＝6和6)。如图4H显示了移植后27天在肾移植物中的wHILO(PD-L1)细胞的图像(胰岛素启动子驱动的GFP表达)。比例尺，100μm误差线代表±SEM。*p＜0.05。如图4I显示了示意图，其显示了具有和不具有PD-L1过表达的wHILOs(每只小鼠500HILO)的移植到多剂量低剂量链脲佐菌素(MLD-STZ，50mg/kg/天，持续5天)中诱导的糖尿病人Hu-PBMC-NSG小鼠。如图4J显示了在人PBMC移植后3周，来自Hu-PBMC-NSG小鼠(n＝15只小鼠)的PBMC中的人T细胞(CD45+/CD3+群体中的CD4+和CD8+细胞)的流式细胞术分析。如图4K显示了在移植具有或不具有PD-L1表达的wHILO之后(n＝6和6只小鼠)，在MLD-STZ诱导的糖尿病Hu-PBMC-NSG小鼠中随机喂入的血糖水平的图。如图4L显示了如图4K中描述的小鼠中血清人c-肽水平的图。图4M提出了流式细胞术分析流式细胞术分析的胰岛素表达和人类CD45+免疫细胞，从wHILOs移植后第27天有或没有PD-L1表达的肾脏包膜移植物中回收。如图4N呈现点图，其量化了图4M中所示的分析结果。(误差棒代表±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图5A-5K提供了证明表观遗传记忆诱导免疫耐受的图和示意图。如图5A显示了显示在IFNγ处理(10ng/ml，12小时)后基于胰岛素表达(分别为GFP+和GFP-)通过流式细胞术分类的胰岛(wHILOs)细胞中PD-L1表达的图。GFP+细胞包括β样细胞。GFP细胞包含α、δ和ε细胞。如图5B提供了显示单次IFNγ处理(10ng/ml，2小时)后wHILO中的时间PD-L1表达的图。如图5C是说明wHILO的IFNγ(10ng/ml)脉冲处理的示意图。(MPS治疗)。如图5D呈现的图显示了在最后一次治疗后7天，由所示的IFNγ治疗周期诱导的PD-L1表达。如图5E显示了在指示的IFNγ(10ng/ml)处理后1天和7天的PD-L1蛋白水平的图。PD-L1过表达wHILOs(PDL1O0OE)和单次暴露于IFNγ12小时用作阳性对照。如图5F提供了点图，其显示了响应3mM(G3)或20mM(G20)葡萄糖从IFNγ处理的wHILO中分泌人c-肽。如图5G是说明IFNγ治疗与IL-1β治疗激发(10ng/ml，持续24小时)组合以诱导β细胞去分化的示意图。如图5H显示了显示在wHILO的所示IFNγ和IL-1β处理(10ng/ml，24小时)后INS和UCN3表达的图。如图5I示出了将wHILOs体内移植到诱导的糖尿病动物中的实验方案的示意图。高剂量链脲佐菌素(HD-STZ，180mg/kg)诱导的糖尿病C57BL6J小鼠接受了已经或未经历图5C所示的IFNγ治疗方案的wHILO的移植，(n＝6和6，500wHILO/小鼠)。如图5J显示了显示肾脏胶囊移植wHILOs和IFNγ脉冲刺激的wHILO(“免疫逃避wHILOs”或”wHILOie”)后第17天的受体小鼠(STZ治疗(180mg/kg)糖尿病C57BL6J小鼠)中血糖水平的图。如图5K提供了显示在按图5I所述处理的小鼠中血清人c-肽水平的图。误差棒代表±SEM。*p＜0.05，**p＜0.01。
图6A-6F提供了与本文所述的多细胞球体(MCS)有关的图像、图形和结果。如图6A显示了多细胞球体的3D结冷胶悬浮液(MCS，顶部)，单个MCS的光学显微镜图像(左下)和组蛋白(右下)。如图6B显示了MCS中胰岛素启动子驱动的GPF表达和内皮细胞(EC，以mCherry表达标记)的图像。如图6C呈现的图像显示了在基质胶系统中与内皮生长培养基一起培养的MCS中血管样结构的逐渐发展。如图6D是单细胞RNA-seq分析的示意图。如图6E呈现了来自图2D的人胰岛细胞簇中的前10个签名基因的表达的热图。如图6F显示了显示人胰岛中特征性激素和细胞类型特异性基因的t-SNE_2单细胞表达的图。相对表达量表：低(0.5，最低强度)到高(5，最高强度)。
图7A-7F提供了与成熟的HILO的表征有关的示意图、图形、图像和数据。如图7A描绘了用于人胰岛素启动子驱动的GFP在hiPSC中表达的基于CRISPR-Cas9的敲入的图。如图7B展示了具有胰岛素-GFP和UCN3-RFP表达的wHILO的微分干涉对比(DIC)图像(比例尺，100μm)。如图7C显示了在第0天hiPSC椭球体(空心正方形)、HILOs(载体/PBS处理的实心三角形)、wHILOs(Wnt4处理的实心圆圈)和人胰岛(空心圆)中测得的海马细胞外酸化率(ECAR)分析。依次处理20mM葡萄糖(Glu)、寡霉素(Olig)、Fccp、抗霉素+罗滕酮(Ant+Rot)。如图7D-1的曲线图显示了响应于HILOs逐渐暴露于3mM葡萄糖、20mM葡萄糖、20mM葡萄糖+100mMGLP-1、3mM葡萄糖而引起的从WNT4处理的HILOs分泌人c肽的动力学、和3mM葡萄糖+20mMKCl随时间的推移。如图7D-2显示了一个条形图，显示了用和未用XAV939处理以促进β-catenin降解的wHILO中葡萄糖刺激的人c肽分泌(XAV939，1μM，持续3天)。如图7E提供了数据，其说明了染色质区域中的基序富集，并且在WNT4处理时具有增强的可及性。如图7F描绘了从用PBS或WNT4处理7天的HILO中分选的胰岛素表达细胞中ERRγ靶基因(由ATAC-Seq确定)的染色质可及性(倍数＞1.5)。
图8A-8H提供图像、图表、示意图和图，其显示与WNT4介导的胰岛素-GFP表达和WNT4驱动的代谢成熟有关的结果。如图8A显示了由MitoTracker(红色)染色表示的PBS和WNT4处理的HILOs中线粒体含量的代表性图像(比例尺，100μm)。如图8B显示了用重组人WNT4(rhWNT4)、WNT5A(rhWNT5A)或来自对照或过表达WNT5A的成纤维细胞(n＝3)的条件培养基(CM)处理的HILO中胰岛素表达(GFP)和线粒体含量的流式细胞术定量图。误差棒代表±SEM。*p＜0.05。如图8C显示了由HILO中的WNT4处理(从第26天至第33天的100ng/mlWNT4)诱导的转录变化的基因本体。如图8D展示了一张图，显示了在移植(TP)500个wHILO或小肠或在第3天进行假手术后，STZ诱导的糖尿病NOD-SCID小鼠的血糖水平(n＝7，wHILOs；n＝6，小肠；n＝3，Sham)。误差棒代表±SEM。*p＜0.05。如图8E提供了Venn图，其显示了WNT4诱导的GFP+细胞中的染色质可及性增加和HILO基因表达的增加之间的重叠(上图)，以及在交集基因集中富集的基因本体途径。如图8F示出了富集在图8E所示的交叉基因集合中的基序。图8G和8H证明了实验结果，其中来自WT和β细胞特异性ERRγKO小鼠的产后胰岛(P11-14天)在有或没有rhWNT4(100ng/ml)的条件下培养>5天。如图8G显示了通过qPCR测量的相对基因表达。图8H显示了响应于3mM和20mM葡萄糖的胰岛素分泌。*p＜0.05，***p＜0.001。对于图。在8G和8H中，将来自WT和β细胞特异性ERRγKO小鼠的产后胰岛(P11-14天)在有或没有rhWNT4(100ng/ml)的条件下培养>5天。
图9A-9M提供显微镜(共聚焦)图像、曲线图、热图和图表，展示了wHILO的免疫荧光特性、HILO的流式细胞术分析以及wHILO的单细胞分析。图9AB、9C和9D显示了对C肽染色的wHILO的共聚焦图像。如图9A显示了在wHILO中胰高血糖素、生长抑素和胰多肽(PP)的代表性免疫荧光染色结果。如图9B显示了对C肽染色的wHILO的共聚焦图像。如图9C呈现了对wHILO的共聚焦图像，其对富含β细胞的标志物NKX2-2、NKX6-1、MAFA、MAFB、PDX1染色。图像代表三个独立的实验。如图9D展示了wHILO的共聚焦图像，其中内分泌标记物嗜铬粒蛋白A(CHGA)、突触素(红色，中间图像)和胰岛素GFP可视化了(绿色，左侧图像)。右(合并)面板显示Hoechst核染色。比例尺，100μm。图像代表三个独立的实验。如图9E显示了在有和没有WNT4处理的HILO中共染色β细胞和内分泌标记物的代表性流式细胞术结果。如图9F以图形方式描绘了图9中呈现的结果的量化。9E(n＝6和6)。如图9G显示了来自WNT4处理的HILO(wHILO，n＝4840)的单细胞转录组的tSNE聚类。图9H和9I显示了在wHILO中INS、CHGA、SOX9、HES1的小提琴图(9H)和单细胞表达(9I)。如图9J显示富含β细胞(INS、PDX1、NKX6-1、NKX2-2、NEUROD1、NPTX2、ITGA1、PCSK1、MAFA、MAFB、UCN3、CHGA)、富含α细胞(GCG、ARX)和δ细胞的表达富集基因(SST、RBP4)覆盖在tSNE簇上。如图。9K展示了每个细胞簇中前10个差异表达基因的热图。如图。9L根据细胞类型显示tSNE簇(Panc P＝胰腺祖细胞，Rep＝复制，UK＝未知)。如图9M展示了组合的HILO和wHILO单细胞数据集的tSNE聚类(右图)以及聚类分析定义的细胞类型。
图10A-10C提供了显示scRNA-seq的质量分析的图。如图10A示出了说明在HILO、wHILO和人胰岛中检测到的基因和UMI的数量的相关性的图。如图10B展示了组合的wHILO(蓝色点，n＝4840)和人类胰岛(红色点，n＝3245)单细胞转录组(左图)的tSNE聚类，以及聚类分析定义的细胞类型(左)。如图10C显示了在tSNE可视化中针对wHILO和组蛋白的合并的单细胞数据集的内分泌特异性基因(INS、NKX2-2、GCG、SST、PPY)、导管标记物(KRT19)和星状细胞标记物(ACTA2)的表达。
图11A-11D提供了与基于板的scRNA-seq分析有关的示意图、图表和图。如图11A是基于板的scRNA-seq的方案。通过FACS将来自wHILO的解离的单细胞分选到96孔组织培养板(微孔板)中。图11B和11C：显示每个细胞的平均基因计数(图11B)和鉴定具有高质量基因检测的45个单细胞的箱形图(图11C)。如图11D说明了单细胞RNA-seq在wHILO中揭示了表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素细胞的单一激素。
图12A-12F提供了与PD-L1基因和β细胞和HILO中的蛋白质表达有关的图和图像。如图12A(左)显示了PD-L1在人胰岛细胞中的tSNE内源表达(勾勒出β细胞)，和(右)显示了PD-L1+和PD-L1-β细胞之间的顶部差异表达基因的热图。如图12B给出了wHILOs中慢病毒驱动的PD-L1表达与胰岛素启动子驱动的GFP表达重叠的免疫组织化学结果(比例尺，100μm)。如图12C呈现条形图，其显示了通过qPCR测量的在有和没有慢病毒PD-L1过表达的情况下在wHILO中的人PD-L1表达(左)和人胰岛素表达(右)。如图12D(上)提供了在诱导的糖尿病C57BL6J小鼠中进行的体内实验研究的示意图。高剂量链脲佐菌素(HD-STZ，180mg/kg)诱导的糖尿病C57BL6J小鼠接受了有或没有PD-L1过表达(n＝500)或小鼠胰岛的wHILOs移植；如图12D(底部)显示了将过表达PD-L1的wHILOs移植到STZ诱导的糖尿病小鼠的肾囊中后的结果。如图12E显示了显示在指示的IFNγ刺激后12小时在wHILO中PD-L1表达的柱状图。误差棒代表±SEM。***p＜0.001。如图12F显示了条形图，显示了在INFγ(ng/ml)刺激后12小时在人胰岛中PD-L1基因表达。误差棒代表±SEM。***p＜0.001。
如图13提供了用于生成成熟的、免疫逃避的wHILO(wHILOies)的策略的示意图。
图14A-14D呈现了与研究IFNγ诱导的wHILOs变化的研究有关的维恩图、热图、基因本体图和浏览器轨迹。如图14A显示了在急性(wHILOs)IFNγ治疗(10ng/ml时12h)和多脉冲刺激(MPS)(10ng/ml时2h，持续3天)的差异调节基因的Venn图。在所述图中，最左边的圆圈代表”MPSIFNγ处理”，最右边的圆圈代表“急性IFNγ处理”。如图14B显示了急性和MPSIFNγ刺激后差异表达基因的热图。强调了MPS可持续的PD-L1基因表达。如图14C显示了在MPS-IFNγ(上图)和急性IFNγ(下图)处理后选择性调节的基因的基因本体。如图14D显示了浏览器轨迹的面板，其指示在MPS方法中最后一次IFNγ处理后7天，或在wHILO中急性IFNγ刺激后12小时，选定基因的染色质可及性。
图15A-15C提供了与研究相关的示意图、图形和流式细胞图，这些研究通过增强的内源性PD-L1表达证明了wHILO的免疫逃避性。如图15A显示了涉及Hu-PBMC-NSG小鼠的多低剂量链脲佐菌素治疗(MLD-STZ，50mg/kg/天，持续5天)的治疗方案的示意图，以产生具有免疫能力的糖尿病动物模型。MPS诱导的PD-L1表达的wHILOs(n＝500)被移植到肾囊下。如图15B显示了在已经接受或未接受MPS的wHILOs移植后，STZ诱导的糖尿病人Hu-PBMC-NSG小鼠中随机喂养的血糖水平的图(分别为n＝6只小鼠)。来自图4K和图4G复制的wHILO(-)数据。因为这些实验是并行进行的。如图15C显示了在有或没有MPS的wHILOs移植后27天从肾囊移植物中回收的表达胰岛素和人免疫(CD45+)细胞的流式细胞术分析。误差棒代表±SEM。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
具体实施方式
本文的特征是用于产生和利用源自干细胞的人胰岛和人胰岛样类器官的方法和系统，其为疾病和病理学例如胰腺疾病和胰岛素依赖性糖尿病(一种疾病)的治疗提供了有希望的策略。由内源性产生胰岛素的β细胞的损失引起的。有利地，所描述的方法和系统可以产生生物产物，例如细胞、人胰岛样类器官及其细胞，作为可以减轻供体匹配的尸体人类胰岛短缺的治疗剂，其目前被用于治疗患者。
如本文所述，功能性人胰岛样类器官(HILO)是从人多能干细胞，例如诱导的多能干细胞(iPSC)产生的。在一个实施方案中，采用允许非经典WNT4信号传导的培养系统来产生HILO。不希望受到理论的束缚，诸如iPSC、人胰岛和HILO细胞之类的细胞中的WNT4信号驱动了成熟葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)所必需的代谢成熟。如本文所述，干细胞衍生的胰岛和HILO通过增强的葡萄糖反应性氧化能力实现功能性成熟，并表现出强大的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)，所述能力由WNT4-ERR(雌激素相关受体)代谢途径调节。功能成熟的HILO包含内分泌样细胞类型，其在移植后可在糖尿病性NOD-SCID小鼠中快速重建葡萄糖稳态(例如，实施例4和5)。在一个实施方案中，并且如本文所述，HILO及其细胞避免了在免疫能力条件下免疫细胞的排斥。
在一方面，对功能性HILO以及人尸体胰岛的单细胞RNA(scRNA)测序分析揭示了HILO来源的细胞，包括一小群具有免疫逃避性的β细胞，在转录上的异质性。如本文一个方面所述，为了模拟免疫逃避β细胞的转录程序，对HILO进行分子工程改造以表达检查点蛋白，例如PD-L1。当评估表达PD-L1的HILO时，发现PD-L1的表达克服了HILO的自身免疫排斥，后者已被移植到具有免疫功能的1型糖尿病小鼠中。因此，以可扩展的方式，可以避免免疫检测，自身免疫激活以及移植或植入排斥反应的功能性β细胞和HILO的产生为糖尿病特别是1型糖尿病和晚期类型的糖尿病提供了有利和有益的治疗和疗法。2糖尿病。在一个实施方案中，对β细胞、人HILO和人胰岛进行分子工程改造(例如转导或转染)以表达检查点蛋白，例如PD-L1。在一个实施方案中，如本文所述，诱导β细胞、人HILO和人胰岛表达PD-L1蛋白。
保护胰岛、类器官和其中的细胞免于免疫监视以及杀死和清除免疫细胞的方法
一方面，提供了用于产生胰岛和类器官的方法，特别是体外或离体方法，包括其中存活，降低了细胞死亡和/或可以更好地存活的胰岛和类器官，包括其中的细胞(例如供体细胞、胰岛和类器官细胞)。规避免疫系统细胞进行的免疫检测，尤其是在移植，植入或转移到受试者(如受体个体)后。在一个实施方案中，移植、植入或转移涉及同种异体细胞、胰岛和/或类器官，它们存活并随后在免疫细胞(例如T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞等)之后被杀伤和检测减少。本文所述方法的实践。
在一个方面，检查点蛋白编码基因和/或其编码产物，特别是PD-L1和/或PD-L1蛋白，在给定时间段(例如至少24小时)内多次暴露于干扰素γ(IFNγ)后，表达IFNγ的胰岛、类器官(例如HILO)或细胞(例如HILO的β细胞)中或通过HILO可例如在具有免疫能力的糖尿病小鼠中维持葡萄糖稳态，例如长时间(至少50天)，以及通过激活的T细胞和/或移植排斥反应逃避免疫反应。在一个实施方案中，胰岛、类器官或细胞是人胰岛、类器官或细胞。在实施方案中，这样的胰岛、类器官或细胞表达IFNγ受体和/或对用IFNγ治疗有反应。在一个实施方案中，胰岛、类器官或细胞天然表达IFNγ受体。在一个实施方案中，可以例如通过但不限于本领域已知和实践的重组、病毒或分子生物学技术将IFNγ受体引入胰岛，类器官或细胞中。在一个实施方案中，在表达IFNγ受体的胰岛、类器官和细胞中的PD-L1基因和/或蛋白质表达(或上调表达)构成可检测的标志，其指示了胰岛、类器官和细胞对IFNγ暴露的应答。胰岛、类器官和细胞暴露于IFNγ后，PD-L1表达或PD-L1表达上调作为IFNγ反应性的标志物，可以通过本领域常规使用和已知的多核苷酸和/或蛋白质检测方法进行测定，且旨不限于此。
在实施方案中，所述方法包括以低量或低剂量，例如0.5-100ng/ml、1-50ng/ml、1-25ng/ml、1-20ng/ml、1-10ng/ml、10ng/ml或20ng/ml的干扰素γ(IFNγ)刺激细胞。在一个实施方案中，这是通过使胰岛、类器官和/或细胞(例如HILO)经受IFNγ离散时间段(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，或15小时或更长时间)来实现的，尤其是大约2个小时或12个小时，例如，多次，例如在给定的时间段内达到2次、3次、4次、5次、6次或更多。在一些实施例中，在至少24小时的时间段(约1天)、48小时的时间段、72小时的时间段或4、5、6、7、8、9或10天的过程中执行多次曝光或脉冲。在一些实施方案中，将细胞暴露于IFNγ总计0.5-3小时、0.5-4小时、0.5-5小时、0.5-6小时、0.5-7小时或0.5-10小时。在IFNγ暴露或脉冲之间，在暴露于IFNγ的时间段之间不存在IFNγ的情况下，允许细胞在培养基或3D基质中“休息”。在一些实施方案中，允许细胞在不存在IFNγ的情况下至少在暴露于IFNγ之间“休息”约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在其他实施方案中，允许细胞在不存在IFNγ的情况下“休息”约1、2、3、4或5天。在一个实施方案中，IFNγ治疗引起胰岛、类器官和/或细胞(例如HILO)中PD-L1表达的组成性(延长)上调和表达(和维持)。所述程序涉及细胞、胰岛、类器官(例如HILO或胰岛)以及其中的细胞对IFNγ的多次脉冲刺激(MPS)，也称为间歇暴露。在MPS之后，细胞、胰岛和/或类器官的PD-L1的表达会持续很长时间，特别是如果胰岛、类器官和/或细胞(例如HILO)经历至少3次脉冲或间断暴露于IFNγ(例如10ng/ml)的干扰素每脉冲2小时的时间约为或等于2小时。例如，通过所述方案，在对胰岛、类器官和/或细胞例如HILOs进行MPS程序后，发现PD-L1在胰岛、类器官和/或细胞(例如HILO)持续表达至少7天。在一个实施方案中，通过所述方法产生的胰岛、类器官(例如，HILO)或细胞在移植、植入或转移后在受体受试者中存活至少约或等于50天。
不希望或不受理论的束缚，MPSIFNγ暴露程序导致胰岛、类器官和/或细胞(例如HILO和其中的细胞(例如β)表达PD-L1(或PD-L1表达上调)细胞))，其中涉及转录记忆的机制。所描述的包括暴露于细胞、胰岛和/或类器官的MPSIFNγ的程序可以刺激或产生细胞内信号传导级联，其中细胞、胰岛和/或类器官的去分化被抑制或阻断。方法中细胞、胰岛或类器官暴露于其中的短脉冲IFNγ(MPSIFNγ)可能最终涉及染色质结构的改变，从而保护细胞、胰岛或类器官免受去分化并提供MPSIFNγ暴露的细胞、胰岛或类器官，它们具有生存能力(例如，通过减少免疫系统细胞的细胞死亡)以及对炎性细胞因子和趋化因子(例如白介素-1B(IL-1B))的免疫力如下文所述，以便为细胞、胰岛或类器官提供抗炎作用。由所述方法产生的与暴露于MPSIFNγ的细胞、胰岛或类器官相关的炎症的缺乏或减少，可增强它们的存活潜力，并减少移植、植入或转移至受试者后被免疫细胞杀死的可能性。所描述的方法因此产生供体细胞、胰岛和类器官，其具有改善的存活率并在移植、植入或转移至受试者后保留其功能，并在其用作治疗剂时提供许多有益的优点。
在一个特定的实施方案中，提供了一种方法，用于产生人的胰岛、类器官(例如，HILO)和存活的、具有减少的细胞死亡并且可以更好地逃避免疫检测或自身免疫的各种原代或分化的细胞(具有不同谱系)。所述方法涉及(a)在预定的时间点使人胰岛、类器官(如HILO)或细胞与干扰素γ(IFNγ)接触一小时以上；在给定时间段内，例如大约或等于72小时的时间段内，重复步骤(a)至少约两次；其中人胰岛、类器官(如HILO)或细胞在与IFNγ接触的时间之间不存在IFNγ的情况下得以维持；其中步骤(a)和(b)诱导人胰岛、类器官(例如HILO)或细胞中PD-L1的持续表达。在所述方法的一个实施方案中，将人胰岛、类器官(例如，HILO)或细胞与IFNγ接触约等于或等于至少1小时、或至少2小时或超过2小时的时间。步骤(a)在所述方法的特定实施方案中，在步骤(a)中，将人胰岛，类器官(例如HILO)或细胞与IFNγ接触约或等于2小时或约或等于12小时的时间。在所述方法的另一特定实施例中，步骤(a)在给定时间段(例如，大约或等于72小时的时间段)内每次至少重复约3小时或至少2小时重复3次。在所述方法的另一个实施方案中，在步骤(a)和步骤(b)之间洗涤人胰岛，类器官(例如HILO)或细胞以除去IFNγ的存在。在所述方法的另一个实施方案中，以1-25ng/ml的量使用IFNγ。在所述方法的另一个实施方案中，以10ng/ml的量使用IFNγ。在所述方法的另一个实施方案中，在步骤(b)之后，人胰岛、类器官(例如，HILO)或细胞中的PD-L1表达维持约大于或等于7天。在一个实施方案中，所述方法产生人尸体胰岛(例如，同基因或同种异体的胰岛)，其被免疫系统保护免于破坏或清除。
在另一个特定方面，提供了一种产生各种细胞、胰岛或类器官(例如HILO)的方法，包括存活、减少细胞死亡和/或逃避免疫检测或自身免疫的人类细胞、胰岛或类器官。所述方法涉及(a)第一次使细胞、人胰岛或类器官(如HILO)与干扰素γ(IFNγ)的接触量约为1ng/ml至25ng/ml，持续1小时以上给定时间段内的时间点，例如大约或等于24小时的时间段；(b)使细胞、人胰岛或HILO与IFNγ的量约1ng/ml至25ng/ml接触，在200℃以上约等于或大于0.5小时，或等于或大于1个小时。在步骤(a)之后的随后时间段内，例如48小时时间段内，至少两个另外的时间点；其中将所述胰岛或类器官(例如HILO)洗涤并在与IFNγ接触之间的不存在IFNγ的情况下置于培养基中；其中步骤(a)和(b)诱导PD-L1在胰岛或类器官(例如HILO)中的持续表达。在所述方法的特定实施方案中，在步骤(a)和步骤(b)中，使细胞、胰岛或类器官(例如，HILO)与10ng/ml的IFNγ接触至少2小时。在所述方法的另一个特定实施方案中，在72小时的时间段中的3个时间点(不同的时间点)，使细胞、胰岛或类器官(例如，HILO)与IFNγ接触至少约或等于2小时。
上述表达IFNγ受体的胰岛，类器官和细胞的免疫逃避方法的实践为此类胰岛、类器官和细胞，特别是用于移植、植入或从中转移的人细胞、胰岛和类器官提供了优势。一个人因疾病、病症和病理的治疗和治疗而受到另一人的对待。所描述的方法的实践提供了胰岛、类器官和被移植、植入或转移到受体受试者(例如，过继受体、移植受体等)中的胰岛、类器官和细胞的免疫保护和增强的存活，从而使移植、植入的或转移的胰岛、类器官或细胞得以维持，并在受体中起作用数天或数周，或更长时间，例如，约2天或更长时间，直到1、2、3、4或更长时间，或者更长。
本文所述的方法和系统适用于多种细胞和细胞类型，或供体细胞用于移植，特别是衍生自不同谱系的胰岛和类器官的IFNγ受体表达细胞，例如用于移植、植入、给药或转移到受试者体内后的免疫保护。通常，作为非限制性实例，可以使用干细胞、原代细胞、各种谱系和类型的分化细胞或衍生自不同来源的细胞的一种类型的细胞。在实施方案中，可以根据上述方法使用表达IFNγ受体和/或对IFNγ治疗有反应的此类合适细胞。可以通过测定表达IFNγ受体的细胞、胰岛或类器官(和其中的细胞)检测PD-L1或PD-L1蛋白的可检测表达来确定或鉴定对所述方法中对IFNγ处理的响应性。
作为具体而非限制性的例子，本文所述的方法，其涉及通过IFNγMPS诱导持续的PD-L1表达，可能适用于或适用于多种细胞和细胞类型，或供体细胞进行移植，包括但不限于，心脏细胞、结肠细胞、肾细胞、膀胱细胞、肝细胞、胃肠道细胞、胃细胞、肺细胞、卵巢细胞、宫颈细胞、子宫细胞、睾丸细胞、胰腺细胞、胰腺β细胞、肌肉细胞、造血细胞、免疫细胞(B细胞、T细胞)、视网膜细胞、角膜细胞、脑细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、骨髓细胞(例如单核细胞神经细胞)、神经元细胞、源自人皮肤细胞的产生胰岛素的胰β细胞(例如，如Li，K.等人，2014，Cell Stem Cell，14(2)：228-236所报道)；脐带血(UCB)细胞、脂肪来源的间充质基质(stem)细胞、心脏干细胞、结肠干细胞、肾干细胞、肝干细胞、胃肠干细胞、胃干细胞、肺干细胞、胰腺干细胞、胰腺β干细胞、肌肉干细胞、造血干细胞、免疫细胞(T细胞或B细胞)干细胞、骨髓干细胞、CD133+干细胞、CD34+造血细胞、CD34+干细胞、间充质干细胞、脐带间充质干细胞、视网膜干细胞、神经元干细胞等、以及由此类细胞产生或包含此类细胞的胰岛和类器官。举例来说，以下类型的类器官适于在所述方法中使用：肠类器官、肝类器官、神经类器官、肺类器官，例如可以使用本领域描述的方法制备的或可商购的，例如干细胞TM技术，Cambridge，MA。
其他合适的细胞是衍生自胚胎干细胞的细胞，其产生各种分化的细胞类型，例如，外胚层衍生的细胞，例如神经元细胞、多巴胺能神经元细胞(例如永生化的可从abm获得的多巴胺能神经元前体细胞(LUHMES)，Vancouver,British Columbia)；角膜来源的细胞(例如，正常人角膜上皮细胞，可从LifeLine Cell Technology，Oceanside，CA商购)；内胚层来源的细胞，例如肝细胞(例如，人肝细胞野生型，可从英国剑桥的DefiniGEN获得)；以及中胚层衍生的细胞，例如肌肉细胞、骨髓细胞、肾细胞和骨骼肌细胞(例如人骨骼肌细胞(skMDC)，可从宾夕法尼亚州匹兹堡的Cook MyoSite商购)。可以在所描述的方法中使用的β细胞(例如，具有胰腺β细胞特性/功能)或胰岛的非限制性实例可以在例如WO 2016/100898、WO 2016/100909、WO 2016/100921、WO 2016/100925、WO 2016/100930、WO 2014/145625。
因此，本文特征和描述的方法、系统和组合物可用于并适用于产生细胞、组织和类器官，所述细胞、组织和类器官在施用后例如通过移植、植入、注射等显示出持久的活力和功能活性，根据检查点蛋白(例如PD-L1)在细胞、组织和类器官中的持续表达，以及它们对免疫系统的逃避免疫保护和免疫系统细胞破坏的保护作用，例如：如发生在移植物抗宿主反应中。
在一个特定方面，本文特征和所述的方法、系统和组合物可用于产生可在移植或植入后逃避免疫检测的体外可扩展、功能性、血管化的类器官，特别是人胰腺或胰岛类器官(HILO)。在一个实施方案中，在包含结冷胶的三维基质中，将表达免疫检查点蛋白的iPSC衍生的β样细胞与人脂肪衍生的干细胞(hADSC)和人脐静脉内皮细胞(Huvec)一起培养还提供了产生的功能性胰腺和胰岛类器官。
根据所述方法产生的HILO被血管化并表现出功能特性，例如葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。尽管最近的研究报道了从人多能干细胞(PSC)产生葡萄糖反应性、胰岛素生成、β样细胞的可能性，但从反应中分泌胰岛素、胰高血糖素和生长抑素的PSC生成功能性血管化胰岛类器官的可能性本文中有利地提供了对营养素的抗性，并且能够在相当长的一段时间内避免免疫系统的免疫检测和移植或移植或植入排斥。
如本文所述，人脂肪来源的干细胞(hADSC)、HUVEC和人iPSC来源的β样细胞的自组织功能允许体外产生具有所述能力的葡萄糖反应性胰岛素分泌胰岛样类器官。形成功能性脉管系统。另外，通过使用基于结冷胶的3D培养系统，成功地实现了胰岛样类器官生产的规模化。使用高斯荧光素酶报告基因来测量胰岛素分泌，表征了hiPSC衍生的胰岛样类器官中的功能异质性。不受理论的束缚，本文的结果表明表达检查点蛋白的人胰岛样类器官(HILO)可以为糖尿病提供有益的治疗方法，并为器官衰竭提供新的治疗方法，并为药物筛选提供平台，基因组编辑以及糖尿病的器官发生和发病机理建模。
免疫检查点蛋白
维持免疫稳态对宿主存活至关重要。对病原体或突变的、修饰的或过表达的自身抗原的明显或不受控制的免疫反应可引起炎性组织损伤和自身免疫性疾病。为了防止这种情况，免疫应答的广度和强度由共刺激信号和抑制信号之间的平衡来调节。这些信号统称为免疫检查点，对于维持自我耐受力和保护受试者免受组织损伤是必不可少的。
激活的T细胞是免疫效应功能的主要介质，因此它们表达多种共抑制受体，例如淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)。这些免疫检查点分子已被证明可调节T细胞对“自身”蛋白质以及慢性感染和肿瘤抗原的反应。值得注意的是，这些检查点蛋白利用的途径是独特且非冗余的，因此反映了免疫检查点在调节免疫稳态中的重要作用。
如上文所述，“免疫检查点蛋白”或“免疫检查点分子”，或简称为“检查点蛋白或分子”是调节免疫系统并经常与配体(同源配体)结合或相互作用的蛋白或分子。引起给定的作用，例如细胞刺激、无能或凋亡。在一个实施方案中，免疫检查点蛋白是结合免疫细胞例如T细胞表面受体的膜表面上的同源配体(例如受体配体)的蛋白。在一个具体的实施方案中，免疫检查点蛋白是PD-L1或其结合部分，其中PD-L1的同源配体是PD-1，例如，如在T细胞表面上表达的。在一个实施方案中，检查点蛋白是所述蛋白的细胞外结构域。
一方面，检查点蛋白与其同源配体结合，所述同源配体也可以是免疫细胞如T细胞上的检查点蛋白受体，并阻断或中断表达同源配体或受体的细胞的信号传导、活性或功能。或者，免疫检查点抑制剂包括与检查点蛋白保持结合的抗体和抗体片段，可以与细胞(例如免疫细胞(例如效应T细胞))上的检查点蛋白结合，并阻断或中断信号传导、活性或功能的细胞。检查点蛋白抑制剂与在细胞上表达的检查点蛋白的结合可导致表达检查点蛋白的细胞的正常活性失活。在实施方案中，检查点蛋白抑制剂是与检查点蛋白(同源配体)结合的抗体，例如单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体等或其片段。
可以在细胞、iPSC、β-细胞等中表达的免疫检查点蛋白或其同源配体结合部分的非限制性例子，或如本文所述的类器官，例如HILO和其他类器官，包括PD-1、程序化细胞死亡蛋白1、PD-L1、程序化细胞死亡配体1，其为PD-1的同源结合配体；PD-L2，程序化细胞死亡配体2，也结合PD-1；CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞蛋白4，也称为CD152)；LAG-3，淋巴细胞激活基因3蛋白；KIR，杀伤细胞免疫球蛋白样受体；IDO1，吲哚胺2,3-双加氧酶1；4-1BB，肿瘤坏死因子受体超家族成员9(也称为CD137)；4-1BBL(绑定到4-1BB)；GITR，“糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因；TIM-3，”T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域；”OX40，肿瘤坏死因子受体超家族成员4，(也称为CD134)；OX40L(与OX40结合)，CD40，CD40L，A2AR，腺苷A2A受体；B7-H3(也称为CD276)；B7-H4(也称为VTCN1)；B7-1/B7-2；BTLA(也称为CD272)；VISTA，”T细胞激活的V域Ig抑制剂；”等等。
在实施方案中，免疫检查点蛋白分子是但不限于PD-L1或PD-L1的细胞外结构域，其结合由T细胞表达的PD-1。在一个实施方案中，利用编码免疫检查点蛋白的多核苷酸来分子工程改造细胞以表达检查点蛋白或一种或多种检查点蛋白，例如通过用含有编码检查点蛋白的多核苷酸的病毒或细菌载体感染细胞来进行。在一些实施方案中，细胞(例如，β细胞或HILO细胞)表达一种以上的免疫检查点蛋白或其配体结合部分。在一些实施方案中，对细胞进行分子工程改造以包含一种或一种以上的免疫检查点蛋白或其配体结合部分，其由细胞表达。在一个实施方案中，用病毒载体感染细胞，所述病毒载体例如慢病毒载体或腺相关病毒载体，或不止一种病毒载体，其包含编码一种或多种免疫的一种或多种多核苷酸。检查点蛋白或其配体结合部分，使用本领域熟知的方法和方法。在一个实施方案中，使用质粒载体或多于一个的质粒载体转化或转染细胞，所述质粒载体使用一种或多种多核苷酸，其使用一种或多种多核苷酸来编码一种或多种免疫检查点蛋白或其配体结合部分。本领域众所周知的程序和方法。
PD-1是一种程序化死亡1(PD-1)蛋白，是一种关键的免疫检查点蛋白(受体蛋白)，它由激活的T细胞、B细胞、抗原呈递细胞(APC)和自然杀伤细胞(NK细胞)并介导免疫抑制。PD-1主要在外周细胞中起作用，在外周组织中，T细胞可能会遇到其他细胞表达的免疫抑制性PD-1配体PD-L1(B7-H1)和PD-L2，例如分子工程化表达PD-L1的细胞，以及例如肿瘤细胞、基质细胞或两者。不受理论的限制，并且通过特定的非限制性实例，由移植、植入或植入的β细胞表达的PD-L1、类器官(包括本文所述的HILO细胞)细胞与表达的PD-1结合。通过效应T细胞，从而有效抑制针对β细胞、类器官或HILO细胞的T细胞反应，并介导正常T细胞反应，从而抑制或阻断自身免疫，并使针对β细胞的免疫反应失活，类器官细胞或HILO。在一个实施方案中，β细胞、类器官细胞或HILO在移植物、植入物或移植物的局部区域中原位表达免疫检查点蛋白。因此，细胞和HILO逃避自身免疫的能力在移植物、植入物或移植物的局部区域内和周围发生，并且导致在受治疗者体内免疫细胞活性的全身性或更广泛的调节的风险降低。
胰腺
在一些方面，提供了本文中的胰类器官或胰岛类器官，也称为人胰岛样类器官或HILO。胰腺是位于腹部的器官，具有内分泌和外分泌功能。胰腺具有内分泌作用的部分是称为“胰岛”(也称为朗格罕岛的胰岛)的细胞团。胰腺内分泌分泌物包括调节葡萄糖代谢和血糖浓度的激素。胰岛中存在四种主要的细胞类型：分泌胰高血糖素(一种增加血糖浓度的激素)的α细胞；分泌胰岛素(一种降低血糖浓度的激素)的β细胞；分泌生长抑素(调节α和β细胞的激素)的δ细胞和分泌胰腺多肽的γ细胞。
胰腺中具有外分泌作用的部分称为外分泌成分。外分泌的胰腺分泌物含有进入小肠的消化酶，有助于分解碳水化合物、蛋白质和脂质。外分泌成分的导管呈簇状排列，称为胰腺腺泡。胰腺外分泌物分泌到腺泡腔中。分泌物积聚并排入胰管和十二指肠。
如本文所述，胰岛类器官、胰腺类器官和HILO分别模拟胰岛和胰腺的结构。在一些实施方案中，胰岛类器官或胰类器官包含以下细胞中的任何一个或多个：iPSC衍生的β-样细胞、iPSC衍生的α-样细胞、iPSC衍生的δ样细胞和iPSC来源的导管样细胞。在一些实施方案中，胰腺类器官包含iPSC衍生的外分泌组分。在一些实施方案中，iPSC是人iPSC(hiPSC)。人胚胎干细胞和人诱导的多能干细胞是可商购的(例如，从提供iPS(IMR-90)-1、iPS(IMR-90)-4和iPS(Foreskin)-1的WiCell)。人诱导的多能干细胞也可以使用本领域已知的方法从多种体细胞类型产生(Yu，J.，K.Hu，等人(2009)。“人诱导的多能干细胞不含载体和转基因。序列》，Science,324(5928):797-801)。
如本文所述的胰岛类器官、胰类器官和HILO也表现出胰岛和胰腺的功能。在某些实施方案中，胰岛类器官或胰类器官表现出以下一种或多种功能：葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)、KCl刺激的胰岛素分泌、GLP-1刺激的胰岛素分泌、生长抑素分泌和胰高血糖素分泌。在一些实施方案中，胰岛或胰腺类器官表达任何一种或多种转录因子Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6和Foxa2。在一些实施方案中，HILO表达检查点蛋白或其功能部分，其功能是允许HILO逃避免疫系统的免疫检测和破坏。在一些实施方案中，HILO表达一种以上类型的检查点蛋白或分子或其功能部分。
胰腺和胰岛类器官的产生
在其他方面，描述了产生胰腺或胰岛类器官的方法。最近的研究表明，虽然可能产生葡萄糖反应性，产生胰岛素的β样细胞，但努力产生能够响应营养物而分泌胰岛素、胰高血糖素和生长抑素的胰岛，并努力获得干细胞的血管化没有成功。本文描述的结果表明，使用人脂肪衍生干细胞(hADSC)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人iPSC衍生β-样细胞的自组织功能，可以产生葡萄糖反应性胰岛素分泌胰岛样类器官在体外成功产生了具有功能性血管生成的(HILOs)。此外，使用基于结冷胶的3D培养系统成功地扩大了胰岛样类器官的产生方法。还使用高斯荧光素酶报道基因检测胰岛素分泌，研究了hiPSC衍生的人类胰岛样类器官中的功能异质性。
人体功能器官的产生为药物筛选、疾病建模以及抑制或预防终点器官衰竭提供了新的治疗策略。从人胚胎干细胞(hESC)和人诱导的多能干细胞(hiPSC)到产生胰岛素的β样细胞的高效逐步分化方法已得到证明。例如，D’Amour等。和Kroon E.等人。报道了hESCs有效分化为胰岛素产生细胞，所述细胞在体内成熟4至5个月后能够响应葡萄糖而分泌胰岛素(D'Amour等人,2006,Nature Biotechnology,24,1392-1401；Kroon等人,2008,NatureBiotechnology,26,443-452)。最近，Rezania等人和Pagliuca等人报道了诱导分化成熟的人β样细胞的体外分化方法，所述细胞表达末端β细胞标志物MAFA和Nkx6-1，并表现出部分功能性(例如胰岛素分泌)(Rezania等人,2014,Nature Biotechnology,32(11):1121-33；Pagliuca等人,2014,Cell,159,428-439)。但是，与尸体人胰岛不同，那些β样细胞需要体内功能成熟数月，并且缺乏其他胰岛胰岛细胞类型所提供的功能，例如α细胞的血糖控制(胰高血糖素分泌)和δ细胞(生长抑素的分泌)。此外，β样细胞缺乏人胰岛天然具有的间充质和血管化内皮细胞。hPSCs衍生的β样细胞与人类胰岛之间的这些关键差异可能会损害基于hPSCs的疗法治疗胰岛素依赖型糖尿病(例如1型或2型晚期糖尿病)的能力。
以前，已经确定了在新生婴儿到成人的β细胞成熟过程中发生了代谢转变，其中孤儿核受体雌激素相关受体γ(ERRγ)调节了功能齐全的β细胞所需的氧化代谢的增加。与所述结果一致，表达人胰岛素、MAFA和Nkx6-1的人iPSC衍生的β样细胞可以通过ERRγ的过表达来代谢成熟，从而增加其氧化代谢，从而增强其葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)功能。这些结果表明，除了要表达PDX1、MAFA、Nkx6-1和胰岛素等谱系决定因子外，还需要进一步成熟β细胞代谢的细胞信号来产生功能齐全的β细胞。(图13)。
在早期胰腺器官发生过程中，新指定的胰腺细胞起源于前肠内胚层，并形成了胰腺芽，这是一个很快被血管化的浓缩组织块。在肝脏器官发生中也观察到类似的进展。这种大规模的形态发生变化取决于血液灌注之前内胚层上皮，间充质和内皮祖细胞之间信号的精妙协调。Takebe等人通过使用在体内迅速血管化和功能成熟的内皮和间充质细胞培养肝内胚层细胞，成功地产生了肝器官芽(Takebe等，2013,Nature,499:481-484)。
先前的工作没有揭示在体外产生其他类器官组织的可能性，例如成熟、功能性和血管化的胰腺类器官。此外，以前的工作表明缺乏可扩展性，因为类有机物是使用
Figure BDA0003112862220000971
矩阵生成的，对于放大生产而言效率不高。
本文所述的研究表明，成功地大规模生产了人类胰岛样类器官(HILO)，它们可以分泌胰岛素并被血管化(如在人类胰岛中所见)，并且表达一种或多种免疫检查点蛋白，从而使HILO能够通过监视免疫细胞(例如T细胞)逃避自身免疫或免疫检测。本文证明了(1)人脂肪来源的间充质干细胞(hADSC)具有自组织能力(图1A和1B)；(2)晚期胰腺祖细胞与HUVEC和hADSC共培养时，能够形成与胰岛样细胞相似的效率的胰岛样簇(器官芽)。(图1A-1C，图1E和图3A-3C)；(3)人胰岛样类器官的谱系决定因子以及包括ERRγ在内的代谢调控基因的表达均得到改善。(4)胰岛胰岛素分泌试验表明，人胰岛样类器官含有能够响应葡萄糖而分泌胰岛素的功能性细胞(例如，实施例8)。(5)人胰岛样类器官(HILO)显示出血管化(图6C)；(6)如本文所述的衍生自hiPSC的人胰岛样类器官在盘中重新捕获了人胰岛器官发生和1型和2型糖尿病的发病机制；(7)如本文所述衍生自hiPSC的人胰岛样类器官提供了用于人胰岛移植以治疗1型和2型糖尿病的新的可替代资源；(8)将人胰岛样类器官移植到受者动物的STZ诱导的1型糖尿病的NODSCID小鼠模型中，改善了1型糖尿病(图1F和1G)；(9)Wnt4和Wnt5a增加了HILO中线粒体富集的β细胞的数量(图8A-8D)，因此表明Wnt4和Wnt5a(分别来自胰腺内分泌细胞和支持细胞)均增强了线粒体的代谢功能促进β细胞成熟和可持续的GSIS功能。
本文还描述了一些研究，其中评估了某些Wnt(在本文中也称为”WNT”)蛋白在发育中的人胰岛样类器官中的作用，如在人胰岛中所见，所述胰岛样类器官能够分泌胰岛素并且具有血管化作用。WNT基因家族由结构相关的基因组成，这些基因编码分泌的信号蛋白，这些信号蛋白与肿瘤发生和几种发育过程有关，包括调节细胞命运和胚胎发生过程中的模式。Wnt蛋白包含一个主要的信号分子家族，可以协调和影响各种细胞生物学和发育过程。Wnt蛋白经过复杂的翻译后修饰，涉及几种高度专业化的加工酶。从细胞释放后，Wnt蛋白与细胞外环境中的许多分子相互作用，例如聚糖，蛋白结合伴侣(例如WIF，Sfrp)和细胞表面受体。(Willert，K.等人，2012，Cold Spring Harbor,Perspectives in Biology,2012)。根据本文所述的研究，Wnt5a是诱导hADSCs自组织的主要Wnt蛋白。(2)Wnt5a和Wnt4一起激活ERRγ-线粒体代谢途径；(3)在没有其他细胞类型(例如hADSC和HUVEC)的情况下，Wnt4足以诱导hiPSC衍生的胰岛样类器官的体外功能成熟。
生成逃避免疫检测的成熟HILO
在体内，β细胞通过长期的产后成熟过程而变得功能成熟。迄今为止，通过在体外复制所述过程，人类诱导的多能干细胞(hiPSC)尚未成功转化为功能齐全的β细胞。此外，即使源自hiPSC的β细胞与患者免疫匹配，在将β细胞移植到患者(尤其是通常患有1型糖尿病的患者)后，仍可能需要终生免疫抑制以防止移植排斥高反应性免疫系统。因此，通过表达一种或多种检查点分子而抵抗免疫排斥的通用PSC的产生是高度有益的，因为这将消除对昂贵的个性化疗法的需求。
自组织的三维(3D)组织体系结构是器官形成和器官特异性细胞类型的终末分化所必需的。如本文所述，产生了包含人胰岛组织的3D结构化类器官。功能性β细胞的产生需要发育中的胰岛内的细胞多样性，以及可能影响胰岛与hiPSC的功能分化的细胞相互作用。
如本文所述，提供了一种用于从hiPSC可规模地产生人胰岛样类器官(HILO)的方法。所述方法利用分化途径，所述途径导致增强的功能成熟，并使所得的HILO具有免疫逃避功能。有利地，所描述的方法不需要使用诸如磁性旋转器或气液表面的仪器，从而导致简化且高度可重复的过程。所述系统的可扩展性允许成熟HILO的大规模生产和小规模生产。组织成熟对于概括胰岛功能的各个方面至关重要。由于hiPSC衍生的胰腺祖细胞或β样细胞在几个月内体内胰岛素分泌达到生理水平，从而达到功能成熟，因此体外分化的β样细胞具有成为完全功能的成熟β样细胞的潜力。
如本文所述，用于从hiPSC产生胰岛样类器官的可扩展过程包括用于细胞功能成熟和细胞异质性的有效信号。在一方面，提供了功能性的，基于聚合物的3维(3D)培养系统和非规范性Wnt(例如，Wnt4)信号传导的激活，以产生包含关键胰腺的3D结构化人胰岛样类器官(HILO)。胰岛细胞类型，包括β细胞(胰岛素)、α细胞(胰高血糖素)、δ细胞(生长抑素)、γ细胞(PPY)和ε细胞(ghrelin(GHRL))。
如本文所述，用于产生成熟的人胰岛样类器官(HILO)的可扩展的3D系统涉及刺激非经典的Wnt途径以实现线粒体OxPhos功能和功能性胰岛素分泌，从而提供了用于治疗疾病的医学上有用的治疗性生物材料，例如作为糖尿病。如本文所述，干细胞来源的，成熟的胰岛或HILO可以表达免疫检查点分子；其可以表达免疫原性。因此，它们能够避免同种异体的免疫排斥反应，从而为胰岛素依赖型糖尿病提供根本的治疗方法，而无需使用免疫抑制剂。这样的HILO可以用作通用的(同种异体的)胰岛，而不是患者特异性的或自体的胰岛，从而导致治疗性生物材料的可用性更高并且降低了胰岛素依赖性糖尿病的治疗成本。
如本文所述，评估IFNγ途径使针对移植或植入的wHILO的宿主免疫反应最小化的能力。在将wHILOs短时间暴露于IFNγ刺激之后，发现IFNγ在wHILOs中快速且有力地诱导PD-L1表达(图12E和12F)。值得注意的是，IFNγ诱导PD-L1表达达到与胰岛素表达细胞和非胰岛素表达细胞(分别为GFP+和GFP-细胞)相似的水平(图5A和5B)。HILOs反复暴露于IFNγ(IFNγ刺激)在wHILOs中引起相似的作用，特别是在HILOs中持续诱导PD-L1。在一方面，反复短时间暴露于IFNγ(多脉冲刺激，MPS)导致持续的PD-L1表达和PD-L1蛋白水平的同时增加(图5C，5D和5E)。在实施方案中，人胰岛或HILO，例如成熟胰岛或HILO，暴露于IFNγ至少0.5-5小时、至少1-5小时、至少1-3小时、至少1-2.5小时、或至少1-2小时。在特定的实施方案中，在洗涤之前，将人胰岛或HILO(例如，成熟胰岛或HILO)暴露于IFNγ大于1小时、大于2小时、1小时、2小时或3小时(与之接触)。胰岛或HILO，让它们在无IFNγ的培养基中休息。在实施方案中，人胰岛或HILO每次暴露于IFNγ被称为“脉冲”。在实施方案中，将人胰岛或HILO暴露，接触或脉冲IFNγ至少一次、至少两次、至少三次、至少四次、至少五次等，或在一天或几天(例如，在72小时或更长的时间)内进行1、2、3、4或5次实验，其中允许细胞恢复(例如，在培养基或基质中，干扰素脉冲之间的干扰素(IFNγ)持续约24小时。在一个特定的实施方案中，在每个脉冲周期中，人类胰岛或HILO在3天内(72小时)用IFNγ脉冲3次，持续2小时，以在胰岛或HILO中达到PD-L1表达的组成水平。遵循这种IFNγMPS方案后，在MPS后7天，IFNγ刺激的人胰岛或HILOs表现出高水平的PD-L1蛋白表达。在实施方案中，将人胰岛或HILO以1-100ng/ml、1-50ng/ml、1-25ng/ml、1-20ng/ml、1-10ng/ml、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30ng/ml。在一个具体的实施方案中，对于每个暴露或脉冲周期，IFNγ的量为10ng/ml或20ng/ml。在一个特定的实施方案中，在2天的时间内，将人胰岛或HILO(包括成熟的人胰岛或HILO)暴露于2脉冲IFNγ中，使其与之接触或脉冲2小时。在一个特定的实施方案中，在3天(第3天)的时间内，将人胰岛或HILO(包括成熟的人胰岛或HILO)暴露于，接触或用3脉冲IFNγ脉冲接触2小时，每脉冲2小时。
WHILOs通过IFNγ暴露于MPS不会损害GSIS功能(图5F)。此外，如通过β细胞同一性标记INS和UCN3的表达所揭示的，IFNγ处理的wHILOs被保护免于IL-1β诱导的β细胞去分化(图5H)。
正常情况下，子宫内人胰腺的发育需要280天以上，并且直到出生后几年才能达到完整的功能成熟。因此，全面了解人类胰岛的发育和成熟所涉及的复杂途径是在体外产生功能性胰岛的必要步骤。β细胞功能成熟的关键方面是线粒体代谢途径的激活，这在产后成熟中自然发生，并且是功能性β细胞营养感知胰岛素分泌功能所必需的。对于HILO，可以通过Wnt4驱动的线粒体代谢调节来实现可持续的线粒体激活。
一方面，如本文所述，增强移植的β细胞逃避免疫检测的能力提供了MHC匹配的替代或辅助策略(A.Morizane等人，2017，Nature communications，8：385)，以降低自身免疫风险。移植胰岛细胞、胰岛、类器官和HILOS的排斥反应。基于干细胞、胰岛和类器官的糖尿病治疗方法除了功能成熟外，还必须保护移植细胞、胰岛和类器官免受自身免疫排斥。当将PD-L1阴性的成熟HILOs移植到具有糖尿病免疫能力的C57BL/6J小鼠中时，异种移植物被排斥，无法产生可检测量的人c肽。相反，表达PD-L1的成熟HILO(如本文所述通过分子工程或诱导类器官细胞中PD-L1的表达诱导)在移植入免疫能力动物后成功存活超过50天。(图4D-4E和图12A-12C)。而且，获得免疫耐受性不需要Tregs的存在。因此，一方面，可以通过在用于产生成熟HILO的基于凝胶的系统中共培养Treg来获得额外的免疫保护。在抗原呈递过程中，细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)与B7分子之间的相互作用以及程序化死亡1(PD-1)蛋白及其配体PD-L1以非冗余方式负调节免疫反应。如本文所述，PD-L1阴性对照HILO在T细胞和B细胞感受态C57BL6J小鼠中被拒绝，但在T细胞和B细胞缺陷的NOD-SCID小鼠中不被拒绝(例如，实施例8)，表明对PD的同种异体排斥-L1阴性对照成熟的HILOs主要通过体内的T细胞和B细胞反应。
通过体细胞重编程产生iPSC提供了患者特异性细胞(例如自体细胞)的来源，所述患者特异性细胞可以分化成任何谱系。此外，从iPSC生成胰岛素生产细胞为自体移植提供了宝贵的工具，这将大大降低自身免疫排斥的风险。尽管已证明与MHC匹配的移植物的同种异体移植可有效降低免疫反应，并且很有用，但所述技术可能无法完全逃避免疫系统和免疫监视，即使在免疫力较低的部位(例如大脑)也是如此。因此，MHC匹配和诱导免疫耐受的组合可以提供进一步的方法来控制针对移植的干细胞、胰岛和类器官的免疫应答。在某些情况下，此类程序可能会消除对免疫抑制药物的需求。
由于在移植患者特异性的，源自干细胞的胰岛或使用基于干细胞的胰岛细胞置换的方法时，异基因hiPSC与免疫抑制或致耐受性治疗(对于同时控制同种反应性和自身反应性)为1型糖尿病患者提供了有利的治疗方法。此外，共刺激封锁程序涉及一种或多种检查点抑制剂分子以及检查点蛋白的表达，以逃避免疫监视，例如表达CTLA4Ig和PD-L1的人类干细胞、β细胞、胰岛细胞或类器官细胞可以提供临床相关的材料，以成功地进行糖尿病患者的移植/植入。通过PD-L1表达保护HILO以促进移植物/移植物/植入物的存活，同种异体移植物HILO可以在没有免疫抑制药物的情况下减少免疫细胞的浸润。但是，应所述理解，如果医学上需要或期望的话，可以使用一种或多种免疫抑制剂。
治疗方法
胰岛移植是用于治疗胰岛素缺乏型糖尿病(例如1型和2型晚期糖尿病)的疗法。因此，一方面，提供了治疗诸如1型或2型糖尿病之类的胰腺疾病的方法，其中所述方法包括给予胰腺或胰岛类器官，特别是如上所述的表达检查点蛋白的HILO。通过移植(或植入)的受试者(例如，哺乳动物受试者，例如人或人类患者)。在一个实施方案中，所述方法治疗患有，易患或具有胰腺疾病(例如1型糖尿病)，病症或其症状的受试者。所述方法包括在治疗疾病，病症或症状的条件下将胰腺或胰岛类器官(HILO)移植到足以治疗所述疾病、病症或其症状的哺乳动物中的步骤。
如本文所用，术语“治疗”是指减轻、减少、改善、消除或减缓疾病、病症和/或与其相关的症状。应当理解，尽管没有排除，但是治疗疾病、病症、病状或症状并不需要完全消除与其相关的病症、病状或症状。
如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”等指的是降低有患或易患或患有疾病或病症的受试者的患疾病或病症的可能性。
治疗方法(包括预防性治疗)通常包括向受试者(例如动物、哺乳动物、人类)施用(特别是移植或植入)有效量的胰岛或胰岛类器官(例如HILO)有需要的人，包括哺乳动物，特别是人。特别地，将胰岛或胰岛类器官(例如HILO)分子工程化以表达一种或多种检查点蛋白。在一个实施方案中，检查点蛋白是PD-L1。在一个实施方案中，根据本文所述的方法，使细胞、胰岛或类器官经受多次间歇暴露于干扰素γ(IFNγ)(多次脉冲刺激或MPS)。MPS方法可产生细胞、胰岛或类器官，其中在向对象移植或施用后的很长一段时间内，检查点蛋白(例如PD-L1)的表达得以持续，从而使移植或施用的细胞、胰岛或类器官能够同时避免自身免疫或免疫检测。在一个实施方案中，胰岛或胰岛类器官(例如HILO)的给药可以通过任何合适的方式进行，其导致一定量的类器官与其他成分结合，可有效改善、减少、消除、减轻、或稳定胰腺疾病，例如1型或2型糖尿病。
在某些方面，可以进一步给受试者施用免疫抑制剂。可以在向类器官施用(例如，移植或植入)对象之前、期间或之后向对象施用免疫抑制剂。免疫抑制剂可以是在移植时抑制或防止移植的类器官的排斥(例如，急性排斥)的试剂，或在移植后维持免疫抑制的试剂。免疫抑制剂包括但不限于巴利西单抗、抗胸腺细胞球蛋白、阿来珠单抗、泼尼松、硫唑嘌呤、霉酚酸酯、环孢菌素、西罗莫司和他克莫司。
在一些实施方案中，至少约100,000、至少约200,000、至少约300,000、至少约400,000、至少约500,000、至少约600,000、至少约700,000、至少约800,000、至少约900,000或至少至少约一百万个胰岛类器官(HILO)被移植或植入到受试者体内。在一些实施方案中，在移植或植入本发明的类器官之前，除去受试者的胰岛。在一些其他实施方案中，胰岛类器官(HILO)通过注射入受试者的上腹部而被移植或植入受试者中。在一些实施方案中，将胰岛类器官(HILO)注射到肝脏中。可以使用导管将胰岛类器官注射到对象中。在一些其他实施方案中，通过手术例如移植手术将胰腺类器官或胰岛类器官(HILO)施用给受试者。在另一个实施方案中，将胰岛类器官(HILO)移植到网膜上。对于网膜移植，可以使用分层技术，其中将胰岛类器官(或其细胞)与自体血浆结合，并在腹腔镜下分层到网膜上。接下来将包含重组凝血酶(1000U/ml)的溶液(20ml)铺在胰岛类器官上，然后再铺一层自体血浆以产生可生物降解的生物支架，所述支架可以在患者体内存活并至少运行一年(参见例如Baidal,D.等人，2017，N.Engl.J.Med.，376：19)。在另一个实施方案中，可以将减轻受体免疫应答的水凝胶生物材料用于胰岛类器官移植。(参见例如，Vegas,A.等人，2016，NatureBiotechnology，34：345-352)。
尽管优选将类器官，胰腺类器官或胰岛类器官(例如，HILO)改造为表达一种或多种本文所述的检查点蛋白，但是通过包囊可以进一步减轻受试者对移植类器官(例如，HILO)的免疫反应。在移植至受试者之前，水凝胶中的类器官，胰腺类器官或胰岛类器官(HILO)。此类移植方法在Vegas等人，2016，《Nature Medicine》中有进一步描述。doi：10.1038/nm.4030；Vegas等人，2016，Nature Biotechnology，doi：10.1038/nbt.3462。在一些实施方案中，水凝胶包含藻酸盐或藻酸盐衍生物(例如，三唑-硫代吗啉二氧化物)。还已经鉴定了基本上减少藻酸盐水凝胶的炎症或纤维化作用的藻酸盐水凝胶的各种修饰(Vegas等人，2016，Nature Biotechnology，doi：10.1038/nbt.3462)。因此，在一些其他实施方案中，水凝胶包含化学修饰，所述化学修饰降低了移植的类器官在受试者中的炎性作用。
筛选分析
如本文所述的胰岛类器官和胰类器官(HILO)可用于在体外或体内模拟胰腺疾病。这样的胰腺疾病模型可以识别可用于治疗胰腺疾病的药物。因此，在一些方面，本发明提供了鉴定可以治疗胰腺疾病，特别是胰腺疾病的调节剂的方法，即调节剂或候选化合物或试剂(例如蛋白质、肽、拟肽、类肽、多核苷酸、小分子或其他药物)可以治疗胰腺疾病，尤其是2型糖尿病和/或胰腺癌的药物。。在一个实施方案中，如本文所述，化合物或试剂调节胰腺类器官或胰岛类器官(HILO)的活性。
可以单独地或使用本领域已知的组合文库方法中的多种方法中的任何一种来获得测试化合物或试剂，所述方法包括但不限于生物学文库；类肽库(具有肽功能但具有新颖的非肽主链的分子的库，其对酶促降解具有抗性并保持生物活性；参见例如Zuckermann,R.N.et al.,1994,J.Med.Chem.,37:2678-85；空间可寻址的平行固相或溶液相文库；需要解卷积的合成文库方法；“单珠一化合物”文库方法；以及使用亲和色谱法选择的合成文库方法。这些方法仅限于肽库，而其他四种方法适用于化合物的肽库、非肽低聚物或小分子库(Lam,1997,Anticancer Drug Des.,12:145)。
合成分子文库的方法的实例可以在本领域中找到，例如在：DeWitt等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:6909；Erb等人，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:11422；Zuckermann等人，1994,J.Med.Chem.,37:2678；Cho等人，1993,Science,261:1303；Cho等人，1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,33:2059；Carell等，1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,33:2061；和Gallop等人，1994,J.Med.Chem.,37:1233。
化合物库可存在于溶液中(例如，Houghten,1992,Biotechniques,13:412-421)、或存在于珠子(Lam,1991,Nature,354:82-84)、芯片(Fodor,1993,Nature,364:555-556)中、细菌(Ladner,U.S.Patent No.5,223,409)、孢子(Ladner U.S.Patent No.5,223,409)、质粒(Cull等人，1992,Proc Natl Acad Sci USA,89:1865-1869)或以上噬菌体(Scott和Smith，1990,Science,249:386-390；Devlin，1990,Science,249:404-406；Cwirla等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378-6382；Felici,1991,J.Mol.Biol.,222:301-310；和Ladner,Ibid.,supra)。
可用作测试试剂的化合物(即潜在的抑制剂、拮抗剂、激动剂)可以从商业来源获得，或者可以使用本领域普通技术人员已知的标准合成技术和方法由容易获得的起始原料合成。可用于合成通过本文所述方法鉴定的化合物的合成化学转化和保护基方法(保护和脱保护)是本领域已知的，包括例如R.Larock，1989，Comprehensive OrganicTransformations，VCH出版商；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，《有机合成中的保护基》，第二版，John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser和M.Fieser，《Fieser和Fieser的有机合成试剂》，John Wiley and Sons(1994)；和L.Paquette编辑，《有机合成试剂百科全书》，John Wileyand Sons(1995)，及其后续版本中所述的那些。
这些方法涵盖的化合物中取代基和变量的组合仅是那些导致形成稳定化合物的组合。如本文所用，术语“稳定的”是指具有足以允许制造的稳定性并且将化合物的完整性维持足够长的时间以用于本文详述的目的(例如，对受试者的运输、储存、化验、活性、治疗性给药)。
本文所述的化合物可包含一个或多个不对称中心，因此以外消旋物和外消旋混合物、单一对映异构体、单个非对映异构体和非对映异构混合物的形式存在。这些化合物的所有此类异构形式均明确包括在所述方法中。本文所述的化合物也可以多种互变异构形式表示，所有这些均包括在本文中。所述化合物也可以顺-或反-或E-或Z-双键异构形式存在。明确包括这些化合物的所有这些异构形式。
测试剂、分子和化合物也可以是肽(例如，生长因子、细胞因子、受体配体)或编码此类肽的多核苷酸等。
筛选方法鉴定了如本文所述增加或降低胰腺类器官和胰岛类器官(例如HILO)的生物学活性的试剂。在一些实施方案中，在胰岛类器官(例如，HILO)或胰腺类器官中诱导或模拟了胰腺疾病，例如糖尿病(例如2型糖尿病)或胰腺癌。可以通过使类器官与游离脂肪酸(FFA)、葡萄糖和细胞因子(尤其是高水平的葡萄糖和/或葡萄糖)接触来诱导胰腺类器官或胰岛类器官(例如HILO)中的2型糖尿病FFA含量高)。在一个实施方案中，将胰腺类器官或胰岛类器官(例如HILO)与胰腺癌细胞、星状细胞和免疫细胞共培养以在体外产生人胰腺癌微环境。
在一些实施方案中，使类器官与候选试剂、分子或化合物接触，并测定候选试剂、分子或化合物对生物学活性、功能或事件的作用。在一些实施方案中，候选试剂、分子或化合物是食品和药物管理局(FDA)批准的药物。例如，在筛选方法中测定的胰腺类器官或胰岛类器官(例如HILO)的生物活性包括胰岛素分泌(例如葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS))、β细胞凋亡、LDHA活性、K(ATP)通道活性、线粒体功能、NDUFA4、ESRRG、KCNK3或MAFA多肽或编码多核苷酸的水平或活性、细胞死亡、细胞生长和转移。在一些实施方案中，所述试剂、分子或化合物增加GSIS。
在其他实施方案中，将胰岛细胞、胰类器官或胰岛类器官(例如HILO)移植或植入宿主中以在体内模拟胰腺疾病，例如2型糖尿病或胰腺癌。移植或植入器官或类器官的方法是本领域已知的。宿主可以是任何非人类哺乳动物，例如大鼠或小鼠。
除了在细胞、胰岛、类器官、胰岛细胞、胰类器官或胰岛类器官(例如HILO)中表达检查点蛋白以逃避自身免疫和免疫检测外，受体对移植生物材料的免疫反应，例如如果需要，可以通过将类器官(例如，HILO)包封在水凝胶中，然后将包封的类器官(例如，HILO)移植到动物体内来进一步减少类器官(例如，HILO)中的类器官(例如，HILO)。这样的移植方法在Vegas等人，2016，Nature Medicine，doi：10.1038/nm.4030中进行了描述；和Vegas等人，2016，Nature Biotechnology，doi：10.1038/nbt.3462。在一些实施方案中，水凝胶包含藻酸盐或藻酸盐衍生物(例如，三唑-硫代吗啉二氧化物)。还已经鉴定了藻酸盐水凝胶的各种修饰，其基本上减少了藻酸盐水凝胶的炎症或纤维化作用(Vegas等人，2016，NatureBiotechnology，同上)。在其他实施方案中，水凝胶包含降低宿主中移植的类器官的炎性作用的化学修饰。
在一些实施方案中，将胰腺类器官或胰岛类器官(例如HILO)和肝类器官共移植或植入动物中。肝脏是胰腺癌转移的主要靶器官。在小鼠中、小胰和小肝中的体内内皮细胞相互连接，形成胰腺-肝血管系统网络，以进行胰腺癌转移。因此，与胰腺类器官或胰岛类器官(例如，HILO)和肝类器官共移植的动物可用于研究人类胰腺癌向人类肝脏的转移。在一些实施方案中，根据本文所述的方法，将共移植的类动物体经受IFNγ的多次间歇暴露(MPS方法)。
在一些实施方案中，向本文所述的移植有类器官(例如，HILO)的动物施用环境胁迫(例如，高脂肪/高葡萄糖饮食或施用胰腺癌细胞)以诱导或模拟动物的胰腺疾病。在一些其他实施方案中，所述动物被移植有胰岛、胰腺类器官或胰岛类器官(例如HILO)和/或已诱导出疾病(例如2型糖尿病或胰腺癌)的肝脏类器官。
在一些实施方案中，将候选试剂、分子或化合物施用于动物。在某些实施方案中，候选试剂、分子或化合物是食品和药物管理局(FDA)批准的药物。在一些实施方案中，测定了候选试剂、分子或化合物对动物表型的作用(例如与胰腺相关的生物学活性或功能，或与疾病例如胰腺疾病相关的活性)。示例性的但非限制性的生物学活性包括胰岛素分泌(例如，葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS))、β细胞凋亡、乳酸脱氢酶(LDHA)活性、K(ATP)通道活性、线粒体功能、水平或水平中的一种或多种。NDUFA4(细胞色素C氧化酶亚基NDUFA4)、ESRRG或MAFA(肌腱膜纤维肉瘤癌基因家族蛋白A)多肽或编码多核苷酸的活性、细胞死亡、细胞生长和转移。在一些实施方案中，候选试剂、分子或化合物增加GSIS。
在本文的任何一个实施方案中，相对于参考或对照测量候选试剂、分子或化合物的作用(即调节胰腺活性或功能的能力)。参考可以是例如未处理的胰腺类器官或胰岛类器官。在一些实施方案中，参照物是移植有如本文所述的类器官(例如，HILO)的宿主，其中不对所述宿主施用候选试剂、分子或化合物。
还可以通过鉴定所需标志物(例如，MAFA作为β细胞命运标志物)的表达增加来检测可用于本文所述方法的试剂、分子或化合物。表达水平可以通过多种方式测量，包括但不限于测量由遗传标记编码的mRNA；以及测量由遗传标记编码的蛋白质的量；或测量由遗传标记编码的蛋白质的活性。
可以通过原位和体外形式确定对应于标志物的mRNA的水平。分离的mRNA可以用于杂交或扩增测定中，包括但不限于Southern或Northern分析、聚合酶链反应(PCR)分析和探针阵列。在一种形式中，mRNA(或cDNA)被固定在表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到膜如硝酸纤维素上。在另一种形式中，将探针固定在表面上，并使mRNA(或cDNA)与探针接触，例如，在下面描述的二维基因芯片阵列中。技术人员可以适应已知的mRNA检测方法，以用于检测由本文所述的标志物编码的mRNA的水平。
样品中mRNA的水平可以通过核酸扩增，例如通过rtPCR(C.Mullis，1987，美国专利号4,683,202)、连接酶链反应(Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：189-193)、自我维持的序列复制(Guatelli等，1990，美国国家科学院院刊，87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Nat.Acad.Sci.USA，86：1173-1177)、Q-Beta复制酶(Lizardi等，1988，Bio/Technology，6：1197)、滚环复制(Lizardi等，美国专利No.5,854,033)或任何其他核酸扩增方法来评估，然后使用本领域已知技术检测扩增的分子。如本文所用，扩增引物被定义为可以与基因的5'或3'区域(分别为正和负链，反之亦然)退火的一对核酸分子。通常，扩增引物的长度为约10至30个核苷酸，并且侧翼为长度为约50至200个核苷酸的区域。在合适的条件下和使用合适的试剂，此类引物允许扩增包含侧翼为引物的核苷酸序列的核酸分子(多核苷酸)。
试剂盒
还提供了试剂盒，其包含免疫保护细胞，如本文所述的人胰岛样类器官或胰岛类器官、或包含免疫保护细胞、人胰岛样类器官或胰岛类器官和药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物(治疗组合物)、稀释剂或赋形剂，用于给予或移植至有此需要的受试者。如本领域技术人员将理解的那样，这种试剂盒包括装有治疗组合物的无菌容器；以及装有消毒剂的无菌容器。这样的容器可以是盒子、安瓿瓶、瓶子、小瓶、管、袋、小袋或本领域已知的其他合适的容器形式。容器可以由塑料、玻璃或适合于容纳生物药物的其他材料制成。在一些实施方案中，试剂盒可以包括多个容器，其容纳免疫保护细胞、人胰岛样类器官或胰岛类器官，其组合物、稀释剂、媒介物或赋形剂，以及必要时的使用说明。所述说明书通常将包括关于免疫保护细胞、人胰岛样类器官或胰岛类器官或其组合物用于治疗疾病如胰腺疾病或糖尿病的用途的信息。在其他实施方案中，说明书包括以下至少一项：治疗剂的描述(免疫保护的细胞、人胰岛样类器官或胰岛类器官)。治疗疾病或移植的剂量方案和给药；预防措施；警告；适应症；反指示；过量信息；不良反应；动物药理学临床研究；和/或参考。这些说明可以直接打印在容器上(如果有的话)，或者作为粘贴在容器上的标签，或者作为单独的纸页、小册子、卡片或与容器一起提供的文件夹。
实施例的优点和适用性
遗传和环境因素共同构成了β细胞自身免疫破坏的基础，而外源胰岛素提供了血糖控制，与1型糖尿病相关的长期并发症仍是一个持续关注的问题。因此，产生适合移植的β细胞的能力有可能显着改善患者的生活。虽然尸体胰岛细胞移植提供了一种治疗模式，但基于干细胞的替代方法在大规模产生GSIS感受态β细胞并保护移植的细胞免受自身免疫和同种异体排斥作用方面仍面临众多挑战。对于后者，通常认为需要独立的移植装置、免疫抑制疗法或两者兼有。
本文所述的方法和系统提供了有用的协议，例如系统地驱动多能干细胞(例如，hiPSCs)、干细胞或胚胎干(ES)细胞分化为胰岛素阳性、葡萄糖敏感的β的3D培养条件类胰岛细胞，并导致代谢成熟、免疫逃避的人类胰岛样类器官(wHILOie)的生成，所述类器官能够响应葡萄糖激发而分泌胰岛素。此外，这些功能成熟的HILOs移植到糖尿病，具有免疫能力的小鼠体内后，可迅速恢复葡萄糖稳态。所描述方案的特征进一步促进了发明人的发现，即氧化线粒体代谢对于出生后β细胞成熟至关重要，而转录因子ERRγ对于所述代谢程序而言是必要和充分的。将WNT4鉴定为用于诱导ERRγ表达和增强线粒体氧化磷酸化的有效成熟因子，从而允许在完全化学确定的培养基中产生wHILO(图3F和3H)。
如本领域技术人员将理解的那样，基于干细胞的疗法的挑战除了包括细胞的代谢和功能成熟之外，还包括移植细胞的自身免疫排斥。然而，本文产生和提供的方法，系统和生物产物提供了针对此类挑战的有利解决方案。举例来说，发现wHILO在NOD-SCID中保持功能而不在C57BL6J小鼠中保持功能，这表明T细胞和B细胞参与异种移植排斥(图3K和图7C)。在抗原呈递过程中，细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)与B7分子以及程序化细胞死亡蛋白1(PD1)受体及其配体PD-L1之间的相互作用会在非冗余状态下负面调节免疫反应方式。如本文中所描述和举例说明的，过表达PD-L1的HILO，例如wHILO，被保护免受异种移植(图4C)和同种异体(图4K)排斥。如本文进一步描述和举例说明的那样，开发了一些方法和系统，其中在一段时间内多次重复暴露于有限的IFNγ浓度(IFNγMPS处理方法)可导致持续的内源性PD-L1表达，而不会损害细胞的GSIS活性(例如β细胞)、HILO和其中的细胞。值得注意的是，在没有移植设备的情况下，所得的免疫逃逸HILO在具有免疫能力的小鼠以及人源化的糖尿病小鼠中均保持了葡萄糖稳态。
通过体细胞重编程产生的iPSC提供了患者特异性同系或自体细胞的来源，这些细胞有可能分化为任何谱系。因此，从iPSC产生胰岛素产生细胞用于自体移植可能会大大降低自身免疫排斥的风险。但是，实际上，生成满足制造标准、质量保证和法规遵从性的临床级自体移植涉及昂贵且耗时的过程。尽管已证明与MHC匹配的移植物的同种异体移植可有效降低免疫反应，但所述技术通常不会导致免疫系统的完全逃避，即使在免疫力较低的部位(如大脑)也是如此。此外，自身反应性T细胞可能破坏了移植的产生胰岛素的细胞。因此，本方法及其产生的细胞和产物(例如，免疫逃避的HILO和细胞)提供了有益且持久的疗法，所述疗法在移植或给予需要的受试者后的相当长的时间段内保持功能(例如，GSIS)和完整性。在实施方案中，MHC匹配和/或免疫耐受的诱导可以进一步用于控制免疫反应，最理想的是不使用免疫抑制药物。
本文的一个实施方案中提供和描述的是用于产生人胰岛样类器官(HILO)的有利方法和培养系统(例如3D培养系统)。所述方法和系统结合了非规范的WNT信号传导，以促进HILO和其中的细胞的代谢成熟和葡萄糖敏感性胰岛素分泌，并限制了IFNγ的暴露，即用IFNγ的多脉冲刺激，以驱动内源性PD-L1的持续表达。在HILO和其中的细胞中。能够在相当长的一段时间(超过50天或更长时间)内避免进行免疫检测的功能性免疫逃逸HILO(例如wHILOie)的能力代表了一项重大进步，为当前尸体胰岛的使用或装置-依赖技术提供了可行的替代方案。
除非另有说明，否则本文描述的方法和方案的实施采用分子生物学的常规技术(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学，这些技术在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有充分的解释，例如在“分子克隆：实验室手册”，第二版(Sambrook，1989)以及后续版本中；”寡核苷酸合成”(Gait，1984)；”动物细胞培养”(Freshney，1987年)；”酶学方法”，“实验免疫学手册”(Weir，1996年)；”哺乳动物细胞的基因转移载体”(Miller和Calos，1987年)；”分子生物学的当前方案”(Ausubel，1987年)；”PCR：聚合酶链反应”(Mullis，1994年)；”当前的免疫学方案”(Coligan，1991年)。这些技术适用于本文所述的多核苷酸和多肽的产生，并且因此可以被认为并用于实施和实施本发明。
在以下实施例中讨论了用于特定实施方案的特别有用的技术，这些实施例旨在为本领域的普通技术人员提供有关如何制作和使用产品、测定、程序、筛选和治疗方法的完整公开和描述。如所描述的，而不意图限制本文的描述和公开。
实施例
实施例1：胰和胰岛类器官的产生和表征
尽管动物疾病模型可以深入了解疾病的发病机理，但使用动物模型从筛查中鉴定出的药物通常无法在人类患者中采用。功能性人类类器官的产生为药物筛选和疾病建模提供了一种新的治疗策略。本文描述了一种在盘中产生3D人胰腺微型器官或类器官(例如HILO)的技术。使用所述技术，可以在体外对诸如人类2型糖尿病的疾病进行建模，以找到针对遗传，患者或环境特定疾病(诸如人类2型糖尿病)的有效药物。
开发基于结冷胶的3D培养系统以进行β样细胞分化
已知3维(3D)培养系统有助于促进细胞的自组织和整合。因此，包含细胞外基质成分(例如胶原蛋白和纤连蛋白)的
Figure BDA0003112862220001121
基质通常用作3D培养系统的基础。但是，基于
Figure BDA0003112862220001122
基质的3D培养系统由于成本高且难以扩展，因此不适用于大规模人类类器官的生产。下文描述了用于β样细胞分化的基于结冷胶的3D培养系统和方法，其成本有效并且易于扩展。在一个实施方案中，使用完全化学定义的逐步分化方案，在基于结冷胶的3D培养系统中，人多能细胞(hPSC)以高效和可再现性分化为产生胰岛素的胰岛样球形细胞簇。单个解离的多能干细胞(PSC)在含有STEMCELLTMTeSRTM培养基的吉兰糖胶中在5天内成功地形成了球体。在含有定义的小分子刺激的含结冷胶的Custom TeSRTM分化后的十五(15)到21天，观察到胰岛素阳性的GFP簇。通过RNA-seq进行的全局转录组分析显示，hiPSC逐步分化为表达β细胞谱系特异性标记基因(包括Pdx1、Nkx6-1、GATA6和MAFB)的胰岛素阳性细胞。通过多能性标志物Nanog的逐渐丧失，β细胞特异性标志物Nkx6-1的诱导以及渐进性的进一步证实了hiPSC以及人类ESC系HuES8和H1ES向胰岛样细胞簇的分化。通过qPCR确定内分泌激素胰岛素，生长抑素和胰高血糖素的诱导。这些结果表明，基于结冷胶的3D培养系统适用于从hPSC生成大规模的胰岛样类器官。
在体外产生可扩展的人类胰岛样类器官
源自人类胚胎干细胞(hESC)或人类诱导的多能干细胞(hiPSC)的β样细胞功能有限，缺乏人类胰岛的形态和功能特征。先前的研究表明，hiPSC衍生的肝细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人骨髓间充质干细胞(hMSC)共同培养会在基质胶中产生自组织的3D肝芽球(Takebe等人，2013年，Nature，499：481-484)。这项研究发现，与分离的肝细胞的分化相比，肝脏“类器官”具有优良的谱系决定因子表达，并且这些类器官在体内迅速血管化并功能成熟。
研究发现，使用2D分化方案生成的hiPSC衍生的胰腺祖细胞(hiPSC-PP)(Yoshihara等人，2016，Cell Metab.23，622-634)不会在
Figure BDA0003112862220001131
基质中自组织。(参见，例如，WO 2017/205511)。相反，HUVEC细胞迅速形成了类似血管的结构，而人类脂肪细胞衍生的干细胞(hADSC)在
Figure BDA0003112862220001132
基质中自组织。在
Figure BDA0003112862220001133
基质中，分散的hADSC细胞可在4小时内投射出过程，在12小时内形成布状包裹物，并在24至48小时内呈球状形成。此外，确定了用于自组织的最小细胞密度(即，在约2cm2的孔中300μl
Figure BDA0003112862220001134
基质中约有10,000-20,000个细胞。RNA-seq分析鉴定了hADSC 3D自组织过程中的动态转录变化，这表明在3D培养条件下自组织能力是稚hADSC的固有特征，这些结果表明间充质hADSC是产生自组织类器官的资源。
为了探索胰腺器官发生，在基质胶基质中将hiPSC-PP(1x106细胞)细胞与HUVEC(7x105细胞)和hADSCs(1-2x105细胞)共培养(图1A和1B)。播种后48小时，这种共培养产生了肉眼可见的3D细胞簇。此外，基于GFP报告子的表达的胰岛素表达在接种后5天被检测到，并且在人胰岛样类器官中随着时间的推移而增加。另外，如荧光标记的(mCherry)HUVEC所示，基于HUVEC的内皮细胞整合在类器官内部。
Figure BDA0003112862220001135
基质在类器官生产中的局限性包括高成本，类器官回收困难，结垢限制以及批次间差异。
使用基于结冷胶的3D培养物产生形态相同的人胰岛样类器官的方法在下文和WO2017/205511中描述。将人诱导的多能干细胞衍生的胰腺祖细胞(hiPSC-PPs)(1x108细胞)与基质细胞群(例如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(2-7x106细胞)和人脂肪来源的干细胞(hADSCs))一起培养(2-7x106)在50ml基于吉兰糖胶的3D培养基中。在接种到基于结冷胶的3D培养基中后的5天内，HiPSC-PP与HUVEC和hADSC迅速形成了岛状球体。诸如小器官的人类胰岛在播种后5天内表达了人胰岛素GFP报告基因，并逐渐增强了GFP强度。根据此方法共同培养hiPSC-PP、hADSC和HUVEC，可产生具有高可重复性的人胰岛样类器官，其形态与人胰岛相似。另外，所产生的人胰岛样类器官在β样细胞中含有胰岛素颗粒。基因表达分析显示，在胰岛素表达细胞群(富含GFP的(GFP+)与未使用hADSC和HUVEC共培养物制备的胰岛样类器官中的)相比。葡萄糖刺激的人c肽分泌测定显示，通过此方法生成的胰岛样类器官可以响应高(20mM)葡萄糖而分泌人c肽。
进行了体外功能性血管化测试。将在结冷胶中产生的胰岛样小器官转移到基质中，并在内皮生长培养基(EGM)中进行培养。绿色荧光指示胰岛素基因的表达。在EGM刺激后24小时至48小时内，观察到HUVEC细胞的生长，表明通过所述方法产生的人胰岛样类器官具有形成血管结构的能力。
使用胰岛素原-NanoLuc高斯荧光素酶测定系统建立单胰岛胰岛素分泌测定
先前已经发表了一种报告基因构建体，其中将高斯荧光素酶置于胰岛素原的c肽部分内，可以准确地测量胰岛素分泌而不会影响β细胞功能(Burns等人，2015，细胞代谢，21，126-137)。使用慢病毒系统，产生稳定表达所述高斯荧光素酶的INS-1细胞。稳定表达Proinsulin-NanoLuc的INS-1细胞的萤光素酶分泌随着高葡萄糖(20mM)，高葡萄糖与Exendin-4(G20mM+Ex4)和去极化剂氯化钾的增加而增加，证实了此报告系统的实用性。接下来，评估了所述报告基因在短暂感染前胰岛素-NanoLuc报告基因的小鼠或人类胰岛中测量胰岛素分泌的有用性。在短暂感染的小鼠和人类胰岛中均检测到响应20mM高葡萄糖的萤光素酶分泌。重要的是，测定灵敏度足以使胰岛素分泌达到单个胰岛水平即可。这些结果表明，基于胰岛素原-NanoLuc荧光素酶报告基因的胰岛素分泌测定不仅适用于大鼠β细胞系INS-1细胞，而且适用于原代小鼠和人原代β细胞。(参见，例如，WO2017/205511)。
整合了双重谱系和功能报告基因的hiPSC和hESC细胞的建立
生成了稳定表达β细胞谱系报道子的人iPSC和hESC(人类胰岛素报道子)和β细胞功能的人胰岛素原(NanoLuc报道蛋白)，分别是hiPSChINS-GFP/Sec-Luc和hESChINS-GFP/Sec-Luc。首先，通过将pGreenZeo慢病毒报告基因(SR10028PA-1，System Bioscience)的人胰岛素启动子序列插入pGreenFire Lenti-Reporter质粒(TR019PA-1，SystemBioscience)(命名为hINS-GFP-EF1a-Neo)，生成人胰岛素GFP报告基因的新霉素抗性构建体。将hINS-GFP-EF1a-新慢病毒通过旋转感染(800g，1小时，37℃)感染，然后再换成新鲜的STEMCELLTMTeSR TM培养基，感染到hiPSC和hESC中。第一次感染后三(3)天，将细胞用STEMCELLTMTeSRTM培养基中的100μg/ml G418处理7天。随后将稳定表达hINS-GFP-EF1a-Neo的选定hiPSC和hESC细胞通过旋转感染(800g，1小时，37℃)用Proinsulin-NanoLuc(Addgene，Plasmid#62057)慢病毒感染到新鲜的STEMCELLTMTeSRTM培养基。第二次感染后三(3)天，将细胞用STEMCELLTMTeSRTM培养基中的5μg/ml弹性蛋白酶和100μg/ml G418处理7天。随后，将细胞维持在STEMCELLTMTeSR TM培养基中。所产生的并入有双重报告基因的稳定细胞系保持了自我更新和多能性能力，以及分化为产生胰岛素的β样细胞的能力(参见，例如，WO 2017/205511)。
尽管在单个类器官中发现功能可变，但合并的人类胰岛样类器官培养物仍显示出一致的胰岛素分泌
最近的研究报道了从hESC和hiPSC产生胰岛素的β样细胞的生成，所述细胞能够响应葡萄糖的分泌而分泌胰岛素(Pagliuca等人，2014，Cell，159，428-439；Rezania等人，2014，Nature Biotechnology，32(11)：1121-33；Russ等人，2015，EMBO Journal，34：1759-1772)。然而，尚未证实能够响应包括葡萄糖、氨基酸、脂肪酸和肠降血糖素(例如GLP-1)在内的营养信号而适当分泌胰岛素的功能齐全的人胰岛样簇。迄今为止，努力集中于从hPSC独立地产生胰岛素的β样细胞，产生胰高血糖素的α样细胞和生长激素抑制素的δ样细胞。但是，这些方法缺乏对调节重要的支持细胞，例如间充质细胞、脂肪细胞和脉管系统细胞。由于胰岛的3D结构自然增强了它们的功能，因此这些缺失的细胞成分可能会损害胰岛样细胞簇的功能。另外，胰岛的器官发生涉及β细胞的克隆扩增，表明这些细胞在胰岛样类器官中可能具有多种功能。为了验证这一想法，进行了单一类器官胰岛素原分泌测定。通过本文所述的方法产生的人胰岛样类器官与人胰岛在形态上相同。但是，与人胰岛相比，单个人胰岛样类器官的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)能力存在显着差异，这是通过胰岛素原荧光素酶分泌测定法测得的。在汇集的类器官(用于测定的10至100个类器官)中证明了一致的GSIS功能。此外，当与GLP-1共同刺激时，合并的人类胰岛样类器官显示出增强的GSIS以及强大的KCl刺激的胰岛素分泌。
在延长的培养时间(133天)后，本文产生的体外培养的iPSC衍生的人胰岛样类器官保留了它们对葡萄糖，GLP1和KCl的反应能力。
实施例2：移植的功能性胰岛类器官拯救了1型糖尿病小鼠
如以下实施例中进一步描述的，观察到在hiPSC衍生的人胰岛样类器官中表达了特定的功能性胰岛标记物，例如MAFA、UCN3和线粒体氧化基因，例如ERRγ(Esrrg)、Ndufa1、Ndufa 12、Cox7a2和Atp5b。值得注意的是，这些胰岛样类器官在人类胰岛发育以及糖尿病的发病机理中都重新捕获。这些功能性的胰岛样类器官的移植可以挽救1型糖尿病小鼠，使其具有长生存期、快速血管生成和降低的免疫排斥反应。
实施例3：来自iPSC的胰岛类器官的代谢成熟中的Wnt蛋白
在用PBS、WNT3a(500ng/ml)、重组人(rh)WNT4(100ng/ml)或rhWNT5a(400ng/ml)处理后，发现Fltp和Esrrg基因在iPSC衍生的胰岛类器官中表达(第21天，无需与hADSCs或HUVECs共培养)。响应增加的rhWNT4(0、10、25、50、100、200ng/ml)和rhWNT5a(0、25、50、100、200、400ng/ml)。此外，在hiPSC衍生的胰岛类器官中诱导了参与氧化磷酸化的线粒体基因(Cox7a2、Ndufa1、Ndufa7)、乳酸脱氢酶(Ldha)和Fltp(Wnt/平面细胞极性(PCP)效应子和报告基因)。在缺少支持性hADSC或HUVEC的情况下，应响应增加剂量的rhWNT4(0、10、25、50、100、200ng/ml)和rhWNT5a(0、25、50、100、200、400ng/ml)。用PBS或WNT4(100ng/ml)处理8天后，hiPSC衍生的胰岛类器官中的线粒体(Mitotracker；线粒体红色)和胰岛素(Insulin-GFP)水平增加。用PBS或WNT4(100ng/ml)处理8天后，产生了人iPSC衍生的胰岛类器官(第27天)。与PBS和PBS相比，用rhWNT4(100ng/ml)、rhWNT5a(400ng/ml)或WNT5a分泌成纤维细胞条件培养基(50％)处理8天后，在来自hiPSC的胰岛类器官(第27天)中发现了胰岛素产生。对照成纤维细胞条件培养基(50％)。用rhWnt4(100ng/ml)处理12天的人iPSC(hiPSC)衍生的胰岛类器官，根据对低葡萄糖(3mM，”G3mM”，高葡萄糖(20mM，”G20mM”)或高KCl水平(20mM，”KCL20mM”)，(例如，参见WO 2017/205511)。
实施例4：使用基于功能性聚合物的3D培养系统从诱导性多能干细胞(iPSC)生成功能性人胰岛样类器官(HILO)
干细胞衍生的人胰岛有望作为胰岛素依赖型糖尿病的治疗方法。所述实施例描述了从诱导的多能干细胞(iPSC)产生人胰岛样类器官(HILO)的过程，并表明非经典WNT途径的激活驱动了葡萄糖刺激的胰岛素强烈分泌所必需的代谢成熟步骤。这些具有多种内分泌细胞类型的功能成熟的HILO在移植到糖尿病NOD-SCID小鼠中后可维持葡萄糖稳态。此外，PD-L1的过表达产生了免疫逃避的，受免疫学保护的HILO，可在具有免疫功能的1型糖尿病小鼠中维持葡萄糖稳态至少50天。以可扩展的方式产生避免免疫检测的功能性胰岛样类器官的能力为糖尿病提供了有益而有益的新疗法。
胰岛移植可为1型和2型晚期糖尿病患者提供出色的长期血糖控制。然而，尸体胰岛的可用性和质量目前受到限制。尽管诱导多能干细胞(iPSC)向产生胰岛素的β样细胞的分化代表了所述领域的进步，但是本文提供的用于产生适用于人类疗法和治疗的功能性β样细胞的方法提供了生物学功能性细胞和HILO产品适用于治疗和移植。
如上所述，ERRβ驱动的产后代谢成熟步骤对于β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)是必需的。另外，ERRPS在iPSC衍生的β样细胞中的过表达对于体外和体内功能是足够的。为了产生适合移植的功能细胞，开发了复制细胞结构以及胰岛细胞类型复杂性的培养条件。因此，作为胰腺成纤维细胞和上皮细胞的转录相似模型，人类脂肪来源的干细胞(hADSCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分别用于形成器官样和血管结构的细胞内在能力。当在3维(3D)Matrigel培养物中生长时(图1A)。在人类诱导的多能干细胞(hiPSC)衍生的内分泌祖细胞(EPs)分化过程中并入hADSCs和HUVECs的3维多糖基凝胶(gellan胶)导致形成了大小可与之相比的多细胞球体(MCSs)人类胰岛。(图1B；图6A-6F)。从由胰岛素启动子驱动的GFP的表达和胰岛素颗粒的存在可以看出，这些MCS含有胰岛素产生细胞。hADSCs的掺入通过液滴状结构中含有脂质的细胞的存在得以证实。(图1E)。与在没有hADSCs和HUVECS(IS)的情况下分化的内分泌祖细胞(EPs)相比，在MCSs中ERR 1的表达和线粒体基因NDUFA1和COX7A2的表达增加，与功能性代谢成熟一致(图1D)。与它们的功能成熟一致，MCS显示出响应于葡萄糖激发(通过c-肽分泌测量)而改善的胰岛素分泌(图1E)。另外，当用内皮生长培养基刺激时，MCS形成了血管样结构，这提示了扩展体内功能的可能性(图6C)。实际上，在STZ诱导的糖尿病NOD-SCID小鼠(糖尿病小鼠模型)中，移植到肾囊中的MCS能够维持葡萄糖稳态约40天，显示出与人胰岛移植相似的功效(图1F)。此外，移植的MCS仍保持葡萄糖反应性，如c-肽水平所指示的，在进食、禁食和反射状态下适当调节胰岛素的分泌(图1G)。(小鼠胰岛素水平<0.2ng/ml，未显示)。
获得的结果支持3D多细胞相互作用在器官发生中的作用，如先前对肝脏类器官的研究所示。评估了在hADSC单细胞类型3D培养的最初48小时期间诱导的转录变化，以了解驱动细胞内在自组装能力的分子信号(图2A)。基因本体分析鉴定了富含改变的转录本的代谢和细胞因子信号传导途径以及WNT信号传导(图2A)。与此相一致，在hADSC自组装期间WNT的时间表达揭示了WNT5a表达的瞬时的约2倍的增加，这与在三维(3D)培养物中观察到的初始细胞-细胞相互作用相吻合(图2B)。
实施例5：非经典的Wnt途径调节基因表达以使HILO的氧化磷酸化和成熟
非规范的WNT途径是非增殖性成熟β细胞的标志物，并且在小鼠胰岛的出生后功能成熟期间WNT4的表达得以增强。与这些发现一致，在使用人胰岛的实验研究中，发现WNT4在人胰岛中高度表达(图2C)。此外，人胰岛的单细胞测序鉴定出WNT4在β和α细胞中的广泛表达，以及限制性更强的WNT5A表达主要在星状细胞中表达(图2D、2E、2F；图6D-6F)。为了证明非规范的WNT信号传导足以使iPSC衍生的β细胞或β样细胞功能成熟，使用CRISPR-Cas9基因组编辑将GFP编码序列插入到hiPSC中胰岛素启动子的下游(图7A)，以生成内源性胰岛素启动子活性的报告基因，并使内源性胰岛素启动子活性可视化。这些工程化的hiPSC随后在完全化学定义的3D培养系统中进行了区分，所述系统将WNT4纳入了最终的内分泌祖细胞(EP)成熟步骤(图3A)。所述优化的3D分化方案导致表达胰岛素的人胰岛样类器官(HILO)的形成(图3A和3B)。另外，从β细胞分泌以调节δ细胞生长抑素分泌的Urocortin-3的表达与胰岛素在HILO中共定位(图2B)。通过电子显微镜对HILO的分析显示出与人胰岛的结构相似性，最显着的是，HILO中存在胰岛素和胰高血糖素颗粒(图3C)。
比较的转录分析证实了WNT4处理的HILO(wHILOs)中关键胰岛细胞标志物的诱导水平可与人类胰岛中观察到的水平相当，包括β细胞特异性基因(NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK)和α细胞特异性基因基因(ARX)(图3D-1和3D-2)。重要的是，加入WNT4不会影响β细胞谱系规范标记(包括INS、NKX6-1、UCN3、MAFB和SYT4)的表达，因此表明所述非经典WNT信号不会影响细胞命运的确定。相反，WNT4在HILO中剂量依赖性地增加了ERRγ(由ESRRG编码)以及线粒体呼吸链NDUFA7和COX7A2的成分的表达(图3F)。与这些诱导一致，在WNT4存在下产生的HILO显示出增加的氧化代谢，如通过耗氧率(OCR)的增加和细胞外酸化率(ECAR)的减少所测量的，复制了健康人胰岛的代谢特征(图3H和图7C)。WNT4处理的HILOs显示出改善的体外GSIS。β-连环蛋白抑制剂XAV939未阻断的作用(图3I；图7D-1和7D-2)。同样，在含有WNT4的3D分化培养基中培养可商购的hiPSC来源的like样细胞可促进伪胰岛的形成和GSIS功能。(图3J和图3K)。重要的是，wHILOs(即，在含有WNT4的培养基或分化培养基中培养的HILOs)在移植到STZ诱导的NOD-SCID糖尿病小鼠中后恢复了血糖控制，并且维持葡萄糖稳态超过6周(图8D)。综合起来，这些结果表明，非经典的WNT信号传导足以模仿健壮的GSIS所需的HILO的代谢成熟，其方式类似于人类胰岛的出生后成熟。因此，在含有WNT(例如WNT4)的培养基中培养干细胞(例如hiPSC、PSC或胚胎干(ES)细胞)会产生功能成熟且呈胰岛状且表达更多的胰岛和胰岛样类器官(wHILO)。成熟的β细胞标记物并产生胰岛素。
为了了解驱动HILOs成熟的分子转化，评估了WNT4处理HILOs诱导的转录变化。通过WNT4处理(100ng/ml，第26-33天)，分别增加和减少了1581和1354基因的表达。基因本体分析确定了富含所述图3E基因组的代谢途径，最显着的是氧化磷酸化。如通过图8C的DAVID的GOTERM_BP分析所确定的，与核糖体相关的基因包括线粒体翻译和延伸基因簇。与对细胞代谢的影响一致，WNT4处理使HILO中的OxPhos基因的表达全面增加至类似于在人类胰岛中所见的水平，并增加了线粒体数目(图3G和图8A)。
为了检查对β样细胞群体的特异性作用，基于有和没有用WNT4或WNT5a处理的HILO的GFP表达来分类表达胰岛素的细胞。胰岛素表达细胞的比例不受WNT处理的影响，这与HILO成熟期间不变的β细胞谱系标志物表达一致(图8B)。然而，WNT4和WNT5a处理增加了胰岛素表达细胞的线粒体含量，支持了β细胞的代谢成熟的概念(图8B)。为了确定所述成熟步骤的遗传效应，通过ATAC-Seq将WNT4诱导的染色质可及性变化定位在分选的GFP+细胞中。WNT4处理可观察到染色质可及性的广泛变化，与转录变化的程度相符。染色质可及性增加的区域与通过WNT4处理诱导的HILO基因重叠，鉴定出123个基因(图8E)。基因本体论确定了富含所述基因集的代谢途径，包括氧化磷酸化。此外，在染色质可及性增加与基因表达增加相对应的基因中进行了基序分析，从而确定了细胞成熟因子，包括Foxa2和ERRs。(图8F)。与此相一致，在包括ERR I靶基因NDUFA4、NDUFA7和ATP5E的氧化磷酸化基因上观察到WNT4诱导的染色质可及性增加(图7F)。WNT4(100ng/ml，持续5天)进一步证实了ERRγ信号传导的重要作用，它诱导了线粒体代谢基因的表达，并改善了来自野生型但未从ERRγβ细胞特异性敲除(KO)小鼠分离出的新生儿胰岛的GSIS功能。(图8G和图8H)。不希望受到理论的束缚，这些结果加在一起支持了这样的概念，即非经典的WNT4信号传导主要通过诱导ERRγ来增强线粒体功能，从而驱动β样细胞的代谢成熟。
实施例6：成熟的HILO的细胞复杂度
免疫组织化学和流式细胞仪分析显示，约50-60％的wHILO细胞共表达胰岛素和γ细胞标志物，以及低水平的其他内分泌细胞(胰高血糖素+、生长抑素+、胰腺多肽+(PP+))(图9A-9F)。与转录比较一致，HILO的细胞组成未通过WNT4处理改变(图9F)。为了全面表征代谢成熟的HILOs的细胞复杂性并深入了解体外成熟程序，将HILOs(PBS处理，n＝4078)和wHILOs(WNT4处理，n＝4840)的单细胞转录组进行了比较。人胰岛的数量(n＝3245)(表1)。每次分析中的细胞转录组均通过使用t分布随机邻居嵌入(t-SNE)通过降维减少阅读次数的主成分分析进行聚类。wHILOs的聚类揭示了富含β细胞标记物以及Sox9+HES1+胰腺祖细胞簇的种群(图9G-9J)。签名基因表达分析进一步区分了非复制和复制的导管内分泌双能细胞(+/-TOP2A)、激素阳性内分泌富集的细胞(GCG+，SST+)、导管样细胞(KRT19+)和少量功能未知的细胞(英国)。(图9K和图9L)。HILO和wHILO数据集的共同聚类提供了另外的证据，表明存在多种内分泌样细胞类型(基于每个簇中的高表达基因)，这些细胞类型基本上与WNT4处理无关(图9M)。为了证实多种内分泌样细胞类型的存在，对组合的wHILO和人胰岛单细胞数据集进行了综合分析(图10A-10C)。尽管差异是明显的，但是发现wHILO细胞与包括β、α、δ和γ细胞的胰岛内分泌细胞成簇，表明转录相似性(图10B)。值得注意的是，基于与胰岛细胞类型共簇化的功能分类显示了wHILO中的α-和β-样细胞占优势(图10B)。
表1
Figure BDA0003112862220001211
Figure BDA0003112862220001221
实施例7：PD-L1为HILO提供免疫保护
移植的胰岛的临床实用性受到同种异体和自身免疫反应的限制。考虑到检查点分子抑制免疫反应的能力，研究了人类胰岛中免疫检查点蛋白的内源性表达。健康胰岛中的一小部分β细胞显示出独特的基因表达特征，其中包括PD-L1表达(图12A)，PD-L1表达是β细胞中免疫耐受的决定因素。为了产生表现出外源PD-L1表达的wHILO，从而在移植时保护它们，使用慢病毒系统产生了表达PD-L1的hiPSC克隆，随后分化成代谢成熟的wHILO，如图3A所示。HILO中的PD-L1过表达不影响胰岛素表达(图12B和12C)。将表达PD-L1的wHILO和不表达PD-L1的wHILOs移植到具有免疫能力的糖尿病小鼠(经STZ处理的C57BL6J小鼠)的肾囊中(图12D)。具有和不具有PD-L1过表达的wHILO能够在移植后的几天内以相似的功效恢复血糖控制(图4C)。然而，通过血糖水平的增加监测，缺乏PD-L1表达的wHILOs的功能在数周内逐渐丧失。相反，在不存在免疫抑制药物的情况下，PD-L1+wHILOs能够维持葡萄糖稳态>50天(图4C)。
为了证实PD-L1的免疫抑制作用，在移植后27天从受体小鼠中回收了移植的wHILO，并通过流式细胞术比较了细胞组成。在已经接受了表达PD-L1的wHILO的移植物中，包括T和NKT细胞在内的CD45+免疫细胞的浸入明显减少了(图4D-4G)。此外，在接受了缺乏PD-L1表达的wHILO的移植物中发现的胰岛素表达细胞数量可忽略不计，这与移植后27天观察到的血糖水平大大失调有关(图4D、图4F和图4H)。
wHILO(PD-L1)作为异种移植物的持久性导致在包含重组人T细胞库的模型中对其功能进行了评估。在证实人T细胞的存在后，通过多次低剂量STZ治疗(50mg/kg/天，持续5天，MLD-STZ)使HuPBMS-NSG-SGM3小鼠成为糖尿病，随后将其与wHILO一起移植(图4I和图4J)。与缺乏PD-L1表达的那些相比，移植的wHILO(PD-L1)提供了持续的血糖控制，其中人c-肽水平与血糖控制的程度相关(图4K和图4L)。外科手术摘除移植肾后，高血糖症的迅速发展表明，移植物衍生的胰岛素是主要的作用因子(图4K)。随后对回收的移植物的分析表明wHILO中胰岛素表达细胞的数量显着减少，而人淋巴细胞相应增加(图4E和图4M)。
实施例8：表观遗传记忆驱动免疫耐受的wHILO
在多种癌症中，IFN-γ诱导PD-L1表达。然而，发现长时间暴露于包括IFNγ在内的细胞因子会诱导β细胞死亡和/或去分化。在所述实施例中，进行实验以评估IFNγ途径是否能够使针对移植的wHILO的宿主免疫反应最小化。在将wHILOs暴露于IFNγ刺激之后，发现IFNγ在wHILOs中快速且有力地诱导PD-L1表达(图12E和12F)。特别地，在IFNγ处理后12小时观察到PD-L1表达增加约20倍。(图12F)。值得注意地，在表达胰岛素的和未表达胰岛素的细胞(分别为GFP+和GFP-细胞)中，IFNγ诱导wHILO中的PD-L1表达达到相似的水平(图5A)。随后在wHILOs中进行的剂量递增研究确定了在2个小时的10ng/mlIFNγ暴露后最大的PD-L1诱导。(图12E)。然而，诱导是短暂的，在暴露于IFNγ后的几天PD-L1表达迅速降低(图5B)。由于对炎症刺激(例如脂多糖)的耐受性已与表观遗传学变化相关联，因此进行了实验以研究连续IFNγ刺激是否在wHILOs中引起长期或持续作用，特别是在HILO中持续诱导PD-L1。实际上，发现重复短时间暴露于IFNγ(间歇暴露)(多脉冲刺激，”MPS”)导致持续的PD-L1表达和PD-L1蛋白水平的同时增加(图5C、5D和5E)。重要的是，wHILOs暴露于MPSIFNγ不会损害GSIS功能(图5F)。此外，如通过β细胞同一性标记INS和UCN3的表达所揭示的，MPSIFNγ处理的wHILO受到保护，免于IL-1β诱导的β细胞去分化(图5G和图5H)。
研究中使用了ATAC-Seq，以了解IFNγ驱动的wHILO改变的机理。如ATAC-Seq所测，急性(暴露12h)和MPS处理诱导的全基因组转录变化与染色质可及性的改变有关。通过包括PD-L1的IFNγ处理诱导了大部分重叠的基因集，而通常约有一半的下调基因受到影响(图14A和图14B)。共同上调的基因组的基因本体论确定了IFNγ途径(未显示)。相反，仅在MPS上调的基因集中发现反映细胞炎症状态的途径，包括IL-1β产生的负调控和炎症途径，而在MPS下调的基因集中选择性地发现NFkB信号和凋亡的正向调控。(图14C)。染色质可及性的叠加变化显示，在MPSIFNγ处理后，包括PD-L1、IRF9、JUNB和JUND在内的基因位点持续增加，与基因转录水平的持续增加相一致。相反，虽然在急性治疗后在包括IRF1和STAT1的已知IFNγ应答基因上观察到增加的可及性，但是这些增加并未持续(图14D)。
为了确认IFNγ处理产生了免疫逃逸的wHILOs(wHILOie)，评估了wHILOie提供免疫小鼠中长期葡萄糖调节的能力。将wHILOie移植到STZ诱导的糖尿病C56BL6J小鼠中在数天内降低了小鼠的血糖水平，并维持降低的水平超过40天(图5I、图5J)。相比之下，移植的稚wHILOs(无IFNγ暴露)的功效逐渐降低，这与在受体小鼠的血清中观察到的人c-肽水平降低相一致(图5K)。移植到人源化糖尿病小鼠中发现了相似的结果。值得注意的是，通过wHILO(经MPS处理)的移植获得的降低的葡萄糖水平在外科手术去除受体肾脏时丧失了(图15A和15B)。为了支持IFNγ诱导的PD-L1在移植的wHILO中的免疫抑制作用，在回收的移植物中观察到淋巴细胞浸润减少，以及激活T辅助细胞(CD4+CD3+)的相对数量减少。此外，在wHILO(经MPS处理的)移植物中，胰岛素表达细胞的数量显着增加(图15C)。
不受理论的束缚，本文描述的结果表明，先前的IFNγ刺激，即，细胞如wHILOs暴露于MPSIFNγ方案，诱导了表观遗传记忆，其导致细胞因子耐受和持续的从头PD-L1。wHILOs中的表达。这样的IFNγ刺激的wHILO(wHILOie)提供了作为缓解疾病的疗法的用途，所述疾病例如胰腺疾病或胰岛素依赖性糖尿病，例如1型或2型糖尿病。
基于上述实验的发现表明，wHILO在NOD-SCID中保持功能，但在C57BL6J小鼠中不起作用，这暗示T细胞和B细胞具有同种异体排斥作用。在抗原呈递过程中，细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)与B7分子以及程序化细胞死亡蛋白1(PD1)及其配体PD-L1之间的相互作用以非冗余方式负调节免疫反应。。实验结果表明，表达PD-L1的wHILO，例如通过本文所述的诱导或过表达，被保护免受同种异体排斥。此外，如上所述，提供了一种方案，其中反复暴露于有限的IFNγ浓度导致持续的内源性PD-L1表达，而不损害葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)活性。值得注意且出乎意料的是，本文所述的所得免疫逃避HILO能够在没有移植装置的情况下在具有免疫能力的1型糖尿病小鼠中维持葡萄糖稳态约50天。根据本文所述方法，因IFNγ暴露而产生的免疫逃避细胞(例如HILO)不仅展现出代谢和功能成熟，而且还克服了移植细胞的自身免疫排斥，这为解决其他人普遍存在的问题提供了解决方案基于干细胞的疗法。
实施例9：上述示例中使用的方法
维护鼠标线
在环境温度为23℃的情况下，在12小时的明暗循环中将动物饲养在无特定病原体的动物设施中。随意提供水和食物。动物实验使用了年龄和背景匹配的雄性C57BL6J(股票编号000664)、NOD-SCID小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ，股票编号005557)、β细胞特异性ERRγ基因敲除小鼠(Yoshihara，E.等，2016，细胞代谢23，622-634，doi：10.1016/j.cmet.2016.03.005)、hu-PBMC-SGM3小鼠(称为“人源化小鼠”)。给雌性NSGTM小鼠注射NSG-SGM3(杰克逊013062)品系中的人外周血单个核细胞(PBMC)。所有涉及动物的程序均按照Salk生物研究所IACUC和动物资源部批准的方案进行。
人胰岛素报道基因和过表达PD-L1的人iPSC系的生成
为了标记β细胞的规格，如E.Yoshihara等人所述，用HUVEC衍生的人诱导的多能干细胞(hiPSC)用人胰岛素GFP报告基因感染。(2016,Cell metabolism,23:622-634)。为了可视化内源性胰岛素启动子活性，使用CRISPR/Cas9基因组编辑将GFP敲入胰岛素启动子中(表1和2)。
表2
Figure BDA0003112862220001261
物种*：hu：人类；mo：鼠标
表3
Figure BDA0003112862220001271
通过用编码嘌呤霉素选择的编码人CD274(PD-L1)的慢病毒(abm，LV113090)感染hiPSC来生成表达PD-L1的hiPSC(表4)。通过融合克隆(Clonetech)，使用ApaI/NotI限制性酶切位点将人UCN3近端启动子序列(-1298/+103)引入无启动子的pLV-Cherry-Picker1主链(Clontech，632574)。用于从基因组DNA扩增启动子序列的PCR引物序列是5'-GTCCATGCTGATCCATCCTT-3'(正向)和5'-TGCTTCTCCGGTGTGTGTGCC-3'(反向)。在hiPSC中产生了Yoshihara等，同上的人UCN3载体和人胰岛素GFP(hINS-GFP-EF1α-Neo)的双报告基因系。
表4
质粒信息
Figure BDA0003112862220001281
病毒制备
使用本文所述的方法(例如，实施例10方法)以及本领域技术人员已知和实践的方法，在HEK293T细胞系中使用第二代或第三代慢病毒系统产生慢病毒。
3D结冷胶(3DKG)培养基
将低酰基吉兰糖胶(Kelcogel F GG-LA)(Modernist pantry)的水溶液(0.3％w/v)高压灭菌，然后在mTeSR1或Custom TeSR培养基(StemCell Technologies，终浓度0.015％)中稀释，然后将其稀释。添加甲基纤维素(R&D系统，终浓度为0.3％)和青霉素/链霉素。
更具体地，例如，将Kelcogel F低酰基GG GG-LA(现代主义食品储藏室)悬浮在0.3％(w/v)的纯水中，并通过在90℃下搅拌或通过微波溶解。将所述水溶液在高压釜中在121℃下灭菌20分钟。将所述溶液以0.015％的最终浓度加入到TeSR或Custam TeSR中。添加甲基纤维素(MC)储备溶液至终浓度0.3％(R&D系统)(例如0.3％的Kelcogel储备液；Kelcogel F低酰基GG GG-LA 300mg+MilliQ水100ml：3DKG Stem TeSR基础培养基；StemTeSR 95ml+0.3％的Kelcogel 5毫升+MC储备溶液300μl，添加3％终浓度的青霉素/链霉素用于3DKG茎TeSR。
人多细胞球体(MCSs)
如Yoshihara，E.等人的出版物中所述，从人iPSC制备胰腺内分泌(PE)细胞。(2016,Cell Metabolism,23(4):622-634)。简而言之，将从Salk Stem Cell CoreFacility获得的HUVEC衍生的hiPSC在加有5％CO2的恒温箱中，于37℃的完全Stem TeSR培养基中，在基质胶(BD)包被的培养皿上保存。在胰腺分化之前，通过Spinfection(800g，1小时)将hiPSC感染人胰岛素报告慢病毒(pGreenZero慢报告人胰岛素，SystemBiosciences)，然后将细胞培养基更改为100ng/ml人激活素(R&D Systems)、3μMCHIR99021(Selleckchem)在分化培养基(800ml DMEM/F12、13.28g BSA、10ml Glutamax、560mg NaHCO3、330mg硫胺素、100mg还原型谷胱甘肽、3300mg维生素C、14μg硒、10ml NEAA、2ml痕量元素B、1ml微量痕量元素C、7μlβ-ME、2ml DLC、2ml GABA、2ml LiCl、129.7μgPA、2mg胰岛素，补足1000ml)放置2天，然后将细胞在100ng/ml人激活素中保存在分化培养基中用于再过2天(第1阶段，胰腺内胚层)。随后，将所述培养基替换为含有1μM dorsomorphin(Calbiochem)、2μM视黄酸(Sigma)、10μM SB431542和1％B27补充剂的分化培养基，持续7天(第2阶段)。然后，将培养基替换为含有10μM毛喉素(Sigma)、10μM地塞米松(Stemgent)、10μMTGFβRI激酶抑制剂II/Alk5抑制剂II(Calbiochem或Enzo)、10μM烟酰胺(Sigma)、1μM 3,3',5-Triiodo-L-甲状腺素钠盐(T3)和1％的B27补充剂持续4-5天(第15天至第19天，开发了胰腺内分泌祖细胞)。然后每隔一天(阶段2和阶段3)更换培养基。
将HUVEC原代细胞和人脂肪干细胞(hADSC)(Invitrogen或PromoCell)与EBM培养基(Lonza，cc-3121)或MesenProRS培养基(GIBCO，12747-010或前脂肪细胞生长培养基试剂盒，C-27417)分别在37℃的潮湿5％CO2培养箱中。对于共培养实验，使用Accutase处理源自人iPSC的胰腺内分泌祖细胞，而使用TrypLE(GIBCO，12604-013)处理HUVEC和hADSC。将细胞收集到50ml管中。将hiPSC-EP(1x106细胞)、HUVEC(7x106细胞)和hADSC(1-2x105细胞)与300μl基质胶在24孔板的单孔中共培养。
为了生成MCS，将hiPSC-EP(第15天至第21天，1x106个细胞)、HUVEC(7x106个细胞)和hADSC(1-2x105个细胞)在3D Kelco Gel Custom TeSR与10μM毛喉素(Sigma)、10μM地塞米松(Stemgent)、10μMTGFβRI激酶抑制剂II/Alk5抑制剂II(Calbiochem或Enzo)、10μM烟酰胺(Sigma)、1μM 3,3',5-三碘代-L-甲状腺素钠盐(T3)和1％的B27补充剂R428(2μM)、硫酸锌(10μM)和N-Cys(1mM)中共培养。每隔一天更换一次培养基，并在几天之内形成胰岛样簇。(图6A-6F)。
人胰岛样类器官(HILO)培养
hiPSCs在基质胶包被的平板中培养。使用Accutase制备单细胞悬液，在PBS中洗涤，并通过离心(1000-1300rpm，5分钟)收集。在ROCK抑制剂(10μM Y-27632，StemCell)存在下，将细胞用3D Kelco Gel Stem TeSRTM基础培养基重悬5至7天，直到球体直径达到50-100μm。然后，将培养基替换为含0.3％甲基纤维素的0.015％Kelco凝胶，并在分化培养基(S1)中补充100ng/ml人激活素A(R&D Systems)、3μM CHIR99021(Axon或Selleckchem)，持续1天，然后100ng/ml在分化培养基(S1)中将每毫升人类激活素再培养2天(第1阶段，定形内胚层)。随后，将培养基替换为含50ng/ml FGF7的分化培养基(S2)(R&D Systems)2天，含50ng/ml FGF7的分化培养基(S3)、0.25μM SANT-1(Sigma)、1μM维甲酸(Sigma)、100nMLDN193189、10μM Alk5抑制剂II和200nMβ-淀粉样前体蛋白调节剂TPB 3天，然后加入50ng/ml FGF7、0.25μM SANT-1(Sigma)、1μM维甲酸(Sigma)、100nM LDN193189、10μM Alk5抑制剂II和100nM的β-淀粉样前体蛋白调节剂TPB持续2天。随后，用0.25μM SANT-1、50nM视黄酸、100nM LDN193189、10μM Alk5抑制剂II、1μM T3的分化培养基(S4)替换3天。随后，用100nMLDN193189、100nMγ-分泌酶抑制剂XX(GSiXX，Millipore)、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3替换为分化培养基(S5)，持续7天。随后，将培养基替换为分化培养基(S5)，再加入7至20天，分化培养基(S5)含10μMTrolox(Calbiochem)、2μMR428(Selleckchem)、1mM N-乙酰基半胱氨酸、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3。通过qPCR或报告子活性确认胰岛素表达后(通常在20-30天)，将培养基更换为分化培养基(S5)，其中含10μMTrolox(Calbiochem)、2μMR428(Selleckchem)、1mM N-乙酰基半胱氨酸、10μMAlk5抑制剂II、添加或不添加层粘连蛋白(LM-511/521和LM-411/421)的1μM T3和100ng/ml rhWnt4(R&D Systems)进行5-10天。
WNT5A条件培养基
在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM(完全培养基)中培养产生WNT5A的成纤维细胞(ATCC CRL-2814)和对照成纤维细胞(ATCC CRL-2648)。达到汇合后，将细胞用PBS洗涤，然后在完全培养基中孵育1周。随后收集条件培养基，通过0.2μm无菌过滤器过滤，并在-80℃下以50毫升等分试样冷冻。条件培养基以1：1的比例与differentiative Mediim(S5含10μMTrolox、2μMR428、1mM N-乙酰半胱氨酸、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3)混合，然后用于治疗HILO 5-10天。
人胰岛和wHILOs中的PD-L1诱导
PD-L1表达是通过重组人IFNγ(R&D Systems，285-IF，以1-50ng/ml最终浓度处理2-12小时)诱导的。为了进行急性治疗，在分化培养基(含10μMTrolox、2μMR428、1mM N-乙酰半胱氨酸、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3和100ng/ml rhWnt4(重组人Wnt4)的分化培养基中)的wHILOs用10ng/mlIFNγ处理2小时。然后将细胞用PBS洗涤两次，然后在分化培养基(含10μMTrolox、2μMR428、1mM N-乙酰半胱氨酸、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3和100ng/ml rhWnt4的S5)中培养(单脉冲刺激)。每次IFNγ暴露(MPS)之间，在分化培养基(含10μMTrolox、2μMR428、1mM N-乙酰半胱氨酸、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3和100ng/ml rhWnt4的分化培养基中)重复洗涤3次和静置24小时的IFNγ暴露。刺激)以生成wHILOie。在最终的IFNγ脉冲之后，将细胞在组织培养箱中培养一周，然后进行RNA-seq分析(图14A-14C)、ATAC-seq分析(图14D)并移植到STZ诱导的糖尿病C57BL6J小鼠中(图5J)或人源化小鼠(图15B)。
胰岛的分离
如先前由E.Yoshihara等人，2010，Nature communications，1：127所述，对小鼠胰岛进行分离，并稍加修改。简要地，通过胆总管注射0.5mg/ml的胶原酶P(RocheREF11213873001，在HBSS缓冲液中稀释，GIBCO，14170-112)，解剖灌注的胰腺并在37℃下孵育21分钟。消化的外分泌细胞和完整的胰岛通过在Histopaque-1077(Sigma，H8889)上以900xg离心15分钟进行分离，然后手动选择完整的胰岛。人类胰岛由综合胰岛分布计划根据批准的协议提供。
胰岛素/c-肽分泌测定
使用E.Yoshihara等人，2016，Cell新陈代谢，23：622-634报告的分批孵育方法监测从完整胰岛释放的胰岛素。简而言之，将过夜培养的分离的胰岛(补充有10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)抗生素-抗真菌药(Gibco)的RPMI-1640培养基)在37℃下预培养。在含有129.4mM NaCl、3.7mM KCl、2.7mM CaCl2、1.3mM KH2PO4、1.3mM MgSO4、24.8mM NaHCO3(用5％CO2、95％O2，pH 7.4平衡)的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液(KRBB)中进行30分钟，10mMHEPES和0.2％(v/v)BSA(fraction V，Sigma)(KRBH)含3mM葡萄糖)。将胰岛在含有3mM或20mM葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氢盐HEPES(KRBH)缓冲液(500μl/10个胰岛)中孵育30分钟，以确定胰岛素分泌水平。30分钟后，通过离心沉淀胰岛，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，大鼠/小鼠胰岛素ELISA KIT(Millipore)和人胰岛素ELISA KIT或超敏人c肽ELISA测定培养基中分泌的胰岛素水平分别用于小鼠和人类胰岛的试剂盒(Millipore)。对于源自人iPSC的细胞，将细胞(在24孔培养板中为1x106细胞/孔)在3mM葡萄糖KRBH缓冲液(500μl/孔)中进行预培养。然后将细胞在含有3mM或20mM葡萄糖的KRBB(200μl/孔)中孵育30分钟，以确定c肽的分泌水平作为胰岛素分泌水平的指标。30分钟后，通过离心沉淀细胞，并使用人c-肽ELISA KIT(Millipore)测定上清液中的c-肽水平。(例如，图7D-1和7D-2)。
耗氧量和细胞外酸化率
使用XF24海马(Seahorse Biosciences)在24孔板中记录耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)(例如胰岛)。(图7C)。简而言之，将70个大小匹配的人胰岛、hiPSC球体或HILO在补充有1mM丙酮酸钠(基础培养基)的3mM葡萄糖XF DMEM培养基(pH 7.4)中预培养1小时，然后转移到XF24胰岛培养板中在基本媒介中。在葡萄糖的增量添加过程中记录了OCR(以与3mM葡萄糖相比的变化百分比表示)，直至最终浓度为20mM葡萄糖。随后，按照线粒体试剂盒(Seahorse Biosciences)中的说明添加线粒体应激试剂(寡霉素、Fccp、鱼藤酮和抗霉素A)。
Islet和HILO移植研究
免疫缺陷的NOD-SCID、C57BL6J和Hu-PBMC-SGM3小鼠购自Jackson实验室，并保存在Salk研究所SPF设施的高压灭菌笼中。通过单次高剂量(180mg/kg)注射或5次多次低剂量(MLD，50mg/kg)链脲佐菌素(STZ；i.p.，Sigma S0130-500MG)注射使小鼠患上糖尿病。注射STZ后1周，将血糖水平高于300mg/dl的小鼠用作移植受者。将人类和小鼠的胰岛(每只动物的胰岛为200-500个胰岛或500-1,000IEQ，每只动物的胰岛为500-1,000胰岛或人类胰岛的1,000-2,000IEQ)或HILO(500个簇)重悬于200μl RPMI-1640培养基中，上样放入实验室管(SiLastic，508-004)中，并离心(400xg 1-2分钟)以在管的中心生成细胞簇。将细胞团移植(约30-50μl)在8至16周龄的注射STZ的糖尿病小鼠的肾胶囊下进行。将氯胺酮(80mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)用作手术麻醉剂，并将小鼠置于37℃的加热垫上以恢复。通过使用可商购的血糖/酮监测器(Nova Max Plus)监测血糖水平。进行了肾切除术(Nx)以进行移植物去除实验，以确认在移植的wHILOs中进行葡萄糖调节的功效。使用4-0丝线(LOOK，SP116)将带移植肾的肾结扎在肾门处，然后切除。处理去除的移植物以进行免疫分析。
ATAC-seq
如JD Buenrostro等人2015年在Current Protocols in Molecular Biology,109:21-29中所述，从第27天到第34天，对使用PBS或100ng/ml rhWnt4处理的HILO，使用荧光激活细胞分选(FACS)分离的5x 104个GFP阳性(GFP+)细胞进行ATAC-seq。Bowtie将读数对齐到hg19，HOMER使用默认设置调用峰。基本上按照指示使用HOMER鉴定来自2个生物学重复物的差异峰和基序分析(参见，例如，S.Heinz等人，2010,J.Mol.Cell,38:576-589)。免费提供HOMER的详细方法，例如，在http：//http：//homer.salk.edu/homer/。简而言之，所述程序针对目标序列和背景序列进行搜索，以富集已知基序，并返回富集了1.5倍变化阈值和小于0.05的p值的基序。WHOME4处理后，具有增强的染色质可及性的基因的启动子区域被定义为转录起始位点上游1kb(kB)，使用HOMER模体分析来查询其丰富的8-16bp的模体。
大量RNA-Seq文库生成
使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)从用RNAlater(Invitrogen)处理的细胞沉淀中分离总RNA，并在室温下用DNaseI(Qiagen)处理30分钟。根据制造商的规程，使用TruSeqRNA样品制备试剂盒v2(Illumina)从100-500ng总RNA中制备测序文库。简而言之，将mRNA纯化、片段化并用于第一链和第二链cDNA合成，然后进行3'末端的腺苷酸化。将样品连接至独特的衔接子并PCR扩增。然后使用2100BioAnalyzer(安捷伦)验证库，将其标准化并合并以进行测序。
高通量测序和分析
对于每种实验条件，从3个生物学重复样品制备的RNA-Seq文库在Illumina HiSeq2500上使用条形码复用和100bp读取长度进行测序。图像分析和碱基检出是使用IlluminaHiSeq实时分析软件自动生成的。每个样品的中值读数为29.9M。使用RNA-Seq比对仪STAR将短读序列映射到UCSC hg19参考序列(A.Dobin等人，2013,Bioinformatics,29:15-21)。来自hg19的已知剪接点被提供给aligner，也允许从头发现接合点。使用Cuffdiff 2(C.Trapnell等人，2013,NatureBiotechnology,31:46-53)进行差异基因表达分析，统计测试和注释。将转录物表达计算为外显子模型每千碱基(fpkm)作图片段的每千碱基片段中基因水平的相对丰度，并采用转录物丰度偏差的校正方法(A.Roberts等人，2011，Bioinformatics,27:2325-2329)。还使用UCSC Genome Browser目测了目标基因的RNA-Seq结果。热图是由R-Script使用heatmap.2(gplot)软件或具有Javatree视图软件的Cluster生成的。热图的比例由Z分数确定(图2A、图3D和图3G)。
基于液滴的单细胞RNA序列
来自hiPSC的内分泌祖细胞(第15天)、HILO和WNT4处理的HILO(100ng/ml rhWNT4，共5天)的三个生物学重复(每个重复200个簇)以及人类胰岛(IIDP供体ID 1874)是使用TrypLE解离成单细胞悬液。使用GemCode凝胶珠、芯片和文库试剂盒(10X Genomics)，按照制造商的规程，通过Chromium单细胞平台处理单细胞。简而言之，将8800个单细胞分类到PBS中的0.4％BSA中，以有针对性地恢复5000个细胞。将细胞转移到Chromium仪器的Emulsion乳液中的Gel Beads(Chromium Single Cell 3”v2)中，在其中进行细胞裂解和RNA条形码反转录，然后进行扩增、剪切、5'衔接子和样品索引连接。在Illumina HiSeq4000仪器上对文库进行测序。
scRNA-seq数据分析
使用Cell Ranger软件(10x Genomics，ver2.0.2)进行初始数据处理，包括解复用，与GRCh38转录组对齐和唯一分子标识符(UMI)折叠。根据Cell Ranger管道的结果生成了单个单元格样本信息的概述。使用了R studio(https：www.rstudio.com)、Cell RangerR Kit、Seurat、monocle和其他自定义R脚本。为了鉴定细胞类型，使用了单核细胞的簇细胞功能。(图4B)。使用Seurat R软件包在两个主成分分析的迭代回合中对细胞进行聚类。
在通过总表达对数字基因表达矩阵进行归一化之前，先删除具有少于200个独特基因计数的细胞(FilterCells函数)，然后将其乘以比例因子(默认设置为10,000)并进行对数转换(NormalizeData函数)。然后，通过对所有基因的平均表达量和每个基因的分散度进行分箱来鉴定一组可变基因，将这些基因放入分箱中，然后计算每个分箱内分散的z分数(FindValiableGenes函数)。使用RunPCA的默认设置执行线性尺寸缩减，并使用Jackstraw方法(JackStraw函数，未显示)评估主成分的统计上有意义的基因表达信号。在第二轮聚类中最多使用了12个主要成分。t分布随机邻居嵌入(t-SNE)映射用于可视化scRNA-seq结果。
对聚集的细胞群体进行分类，并鉴定出前10个差异表达的基因(FindAllMarkers功能)。通过检查典型标记基因的表达来验证聚集细胞群内的细胞类型，包括胰岛素(β细胞)、胰高血糖素(α细胞)、生长抑素(δ细胞)、胰多肽(γ细胞)、生长素释放肽(ε细胞)、Prss1(胶状细胞)、Krt19(导管细胞)和Acta2(星状细胞)。(图2D、2E、图4A和图6D-6F)。
将来自WNT4处理的HILO(4,840个细胞)和人类胰岛(7,248个细胞)的scRNA-seq数据合并到1个Seurat对象中，并如上所述鉴定了高度可变的基因。参照人类胰岛细胞中差异表达的基因，鉴定出集群种群内的细胞类型。比较在WNT4处理的HILO和人类胰岛中鉴定出的β细胞群体，以鉴定差异表达的基因。(图10A-10C；图11A-11D)。
生物信息学分析软件和程序
以下软件或程序用于基因组数据分析：R studio(https://www.rstudio.com/)；Cell Ranger R Kit(https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/rkit)；Seurat(https://satijalab.org/seurat/)；Monocle(http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/)；DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)；GOplot(https://wencke.github.io)；UCSC基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu)；和Homer(http://homer.ucsd.edu/homer/)。
免疫组织化学(IHC)
使用胰岛素抗体(抗胰岛素抗体，1/100，Abcam ab7842)对胰腺和人胰岛或胰岛和人胰岛或iβeta细胞(4％PFA固定的细胞)的冷冻或石蜡包埋的切片进行免疫组织化学(IHC)、c肽(抗c肽抗体，1/100，Abcam ab30477)、胰高血糖素(抗胰高血糖素抗体，1/100，Abcam ab10988)、生长抑素(抗生长抑素抗体，1/100，Abcam ab103790)、胰多肽(抗胰多肽抗体，1/100，Abcam，ab113694)、NKX2-2(抗NKX2-2抗体，1/100，DSHB，74.5A5)、NKX6-1(抗NKX6-1抗体)、1/100，DSHB，F55A12)、MAFA(抗MAFA抗体，1/100，Abcam，ab26405)、MAFB(抗MAFB抗体，1/100，Abcam，ab26405)、PDX-1(抗PDX-1抗体，1/100，R&D，AF2419)、CHGA(抗CHGA抗体，1/100，Abcam，ab15160)、突触素(抗突触素抗体，1/100，Biogenex，MU363-UC)和PD-L1(抗PD-L1抗体，1/100，Abcam，ab20592)，(表5)。将二抗与Alexa 568、647(LifeTechnologies)偶联，并通过共聚焦显微镜(ZEISS)或荧光显微镜观察IHC染色。Hoechst33342(Thermo Scientific，62249，1μg/ml最终浓度)用于核染色。
表5
Figure BDA0003112862220001371
物种*：H＝人类；M＝鼠标；R＝鼠；C＝鸡肉；Mon＝猴子
流式细胞仪
将指示阶段的簇在37℃下用带有20ug/ml DNase的TrypLE(GIBCO)解离12分钟，然后在室温下用4％PFA固定10分钟。然后将簇用0.2％Triton X渗透10分钟，用10％山羊血清封闭30分钟，并用抗体、c肽(1/100，abcam，ab30477)、PDX-1(1)染色各种细胞内标记物/100，BD，562161)、NKX6-1(1/100，BD，563338)、嗜铬粒蛋白A(1/100，BD，564583)、MAFA(1/100，abcam，ab264583)、MAFB(1/100，abcam，ab66506)、胰高血糖素(1/100，abcam，ab82270)、生长抑素(1/100，abcam，108456)，用于在BD Biosciences LSRII仪器上进行分析。数据通过FlowJo软件进行分析。c肽、胰高血糖素和生长抑素的二抗与Alexa 647(LifeTechnologies)偶联。
电子显微镜(EM)分析
将人胰岛和悬液中的HILOs在2％低熔点琼脂糖中沉淀，然后在含有2mM氯化钙(pH7.4)的0.15M椰油酸酯缓冲液中，在含有2％多聚甲醛的2.5％戊二醛中固定4小时，持续一小时。除去过量的琼脂糖，并在缓冲液中洗涤沉淀物，然后二次固定在缓冲液中的1％四氧化/0.3％亚铁氰化钾中。用水洗涤后，将沉淀用2％乙酸铀酰整体染色，然后在乙醇(35％、50％、70％、90％、100％、100％)中分级脱水。然后使用Pelco BioWave微波处理装置(TedPella，Redding，CA)将样品迅速渗入Spurr树脂中，并嵌入Pelco金字塔尖端模具(TedPella，Redding，CA)中，并在60℃固化过夜。在Leica UC7超薄切片机(Leica，Vienna)上切割70nm超薄切片，并在120V的Libra120(Zeiss，Oberkochen，德国)上进行检查。
移植的HILO的免疫分析
移植后的第26天收获已移植的HILO，并使用TrypLE将其解离为单细胞。通过Fc阻断(抗小鼠CD16/CD32(Fc Shield)(70-0161-U500)染色)阻断小鼠Fc受体胞外区域中发现的常见表位后，针对细胞表面标志物CD19的抗体(1：100稀释)(PerCP/Cy5.5抗小鼠CD19，BioLegend，115533)、Nk1.1(抗小鼠Nk1.1 PE，eBioscience，12-5941-81)、CD45(明亮的violet 510抗小鼠CD45、BioLegend、103138)，将CD3(灿烂的violet 650抗小鼠CD3，BioLegend，100229)、Cd11b(抗人/小鼠APC菁，TONBO，25-0112U100)用于基于FACS的免疫分析。对于细胞分选，使用BD Influx(100微米喷嘴尖端和1x PBS鞘液，鞘管压力设置为18.5PSI)，样品和收集冷却器设置为4摄氏度。选择单个细胞进行FACS或使用正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)门控进行分析，然后对FSC和SSC进行脉冲宽度判别。
所述方案在供体细胞、胰岛、类器官(及其中的细胞)的移植、植入或转移后，测定淋巴细胞(T细胞，B细胞)向器官或组织例如肾或肾囊中的浸润。与产生胰岛素的PD-L1-wHILOs相比，移植产生胰岛素的PD-L1+wHILOs渗透到组织(如肾脏)的CD45+T细胞数量减少表明，表达PD-L1的HILOs(及其中的细胞)受到保护，不会被识别对于T细胞而言，T细胞是异源的，并且在移植后(例如，移植后27天)来自T细胞的杀伤(图4D和4E)。
在移植、植入或转移到受体受试者后检测免疫保护的细胞、胰岛或类器官(及其中的细胞)
通过感染慢病毒介导的TYF-CMV-eGFP(绿色荧光蛋白)标记来自人体组织的原代人细胞，胰岛和/或类器官，(Mao，Y.等，2015，International Journal of MedicalSciences，12(5)，407-15.doi：10.7150/ijms.11270)，这已显示产生持续的高GFP表达。然后将表达GFP的细胞/胰岛/类生物体暴露于2-3次IFNγ处理(例如，如上所述的MPSIFNγ暴露)，并随后通过qPCR确认PDL-1表达的诱导。暴露于IFNγ的细胞、胰岛和/或类器官被移植到具有免疫能力的小鼠的肾囊中，而稚细胞/胰岛//有机体(即无IFNγ暴露)被移植到同侧肾囊中作为对照。移植后2-3周将小鼠处死，并通过荧光激活细胞分选(FACS)分析对肾脏驻留的GFP阳性细胞进行定量。基于从各个小鼠确定的每个肾脏中GFP+细胞的数量，定量确定在IFNγ暴露后存活的细胞/胰岛/类生物体的增加。
定量RT-PCR分析
使用TRIzol试剂(Invitrogen)和RNeasy KIT(Qiagen)提取总RNA。用SuperScriptIII第一链合成系统试剂盒(Invitrogen)或PrimeScript RT试剂盒(TAKARA)进行逆转录。使用SYBR Green(Bio-Rad)进行实时定量RT-PCR(qPCR)。表2列出了引物信息。
体外血管化
将人多细胞球体(MCS)嵌入到24孔组织培养板中的300l带有EBM培养基(Ronza，cc-3121)的Matrigel中。在接下来的24-72小时内观察到血管化。
统计方法
结果表示为平均值±SEM。使用学生t检验进行统计比较。统计上的显着差异表示为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
实施例10：人胰岛样类器官
根据本文描述的方法的功能性人体器官的产生为药物筛选和疾病建模提供了新的策略。具体而言，功能类器官可以用作2型糖尿病的模型以进行药物筛选。人胰岛样类器官对淀粉样多肽(hIAPP)毒性有反应，hIAPP是2型糖尿病患者中β细胞丢失的诱导剂，高血糖患者移植后胰岛功能障碍，hIAPP剂量依赖性诱导人胰岛24小时内G0/G1停滞。像类器官(参见，例如，WO 2017/205511)。根据本文所述的方法和系统，还可以诱导此类类人类器官来表达PD-L1，从而当用于移植、植入或施用于需要其的受试者时避免免疫检测和破坏。
在示例性测定中，使3D微型器官暴露于诱导2型糖尿病的应激源，例如高水平的游离脂肪酸(FFA)和/或葡萄糖和选定的细胞因子。然后用各种药物治疗受压的3D微型器官。在一些实施方案中，所述药物由食品和药物管理局(FDA)批准。
作为输出，在人胰岛类器官中测定以下各项：胰岛素分泌，β细胞凋亡(PI染色)，通过荧光素酶报道分子的乳酸脱氢酶A(LDHA)表达以及包括NDUFA4在内的标记基因表达变化(线粒体氧化磷酸化)、ESRRG(线粒体功能)、KCNK3(Katp通道活性)和MAFA(β细胞命运标记)。对于人胰腺类器官，测定了外分泌细胞的淀粉酶分泌和凋亡(PI染色)。
在模拟人类胰腺癌在盘中的肿瘤发生和转移以及筛选针对这些疾病的药物的潜力的示例性测定方法中，将3D微型人类胰腺与胰腺癌细胞，星状细胞和免疫细胞共培养以创建人类盘中的胰腺癌微环境。然后筛选各种药物(例如，FDA批准的药物)以找到在微型人胰腺微环境中有效抑制胰腺癌生长或转移的化合物。作为输出，测量以下胰腺类器官：外分泌细胞的凋亡(PI染色)、胶原蛋白合成(三色染色)和星状细胞激活(GFAP报告基因)。在这些试验中鉴定出的潜在候选药物在胰腺癌的肿瘤发生和转移小鼠模型中进行了测试。研究了基因的表达和形态，以及细胞死亡、细胞生长和转移的程度。
在用于对小鼠中的人2型糖尿病建模的示例性测定中，将人胰岛类器官和/或人肝类器官移植到小鼠中。然后给小鼠施用诱导2型糖尿病的各种应激源，例如高脂饮食(HFD)或细胞因子注射。在人类2型糖尿病小鼠模型中进一步测试了此测定法中鉴定出的潜在候选药物。研究了基因表达和形态以及糖尿病的程度。
在模拟人胰腺癌在小鼠中的肿瘤发生和转移的示例性测定中，将人胰腺类器官和/或人肝类器官移植到小鼠中。用微型胰腺移植的小鼠用于研究人类胰腺微环境中人类胰腺癌的生长。在另一个示例性测定中，将小胰腺和小肝脏共移植到小鼠中。肝脏是胰腺癌转移的主要部位。在体内，小胰和小肝中的内皮细胞产生胰腺-肝脉管系统网络，用于胰腺癌转移。因此，用小胰和小肝共同移植的小鼠被用于研究人胰腺癌向人肝的转移。如本文所述，从多能干细胞(PSC)和人胰岛和HILO产生功能性器官样簇提供了对人类疾病基础机制的了解，以及在引入或移植到受体受试者后起作用的生物疗法的见解。
以上结果是使用以下材料和方法获得的：
Figure BDA0003112862220001411
(3DKG)培养基
从Modernist Pantry获得的F低酰基吉兰糖胶(GG-LA)悬浮在0.3％(w/v)的纯水中，并在90℃搅拌或通过微波溶解。将所述水溶液在高压釜中在121℃下灭菌20分钟。将所述溶液添加至TeSRTM培养基(Ludwid等，Nature Methods，3，637-646)或定制的TeSRTM培养基(800ml DMEM/F12、13.28g BSA、10ml Glutamax、560mg NaHCO3、330mg硫胺素、100mg还原型谷胱甘肽)、3300毫克维生素C、14克硒、10毫升NEAA、2毫升微量元素B、1毫升微量元素C、7毫升β-ME、2毫升DLC、2毫升GABA、2毫升LiCl、129.7克胡椒酸、2毫克至1000毫升的胰岛素)浓度为0.015％。添加甲基纤维素(MC)储备溶液至终浓度0.3％(R&D系统)(例如0.3％储备：
Figure BDA0003112862220001412
F低酰基GG-LA 300mg+MilliQ水100ml；3D-
Figure BDA0003112862220001413
(3DKG)茎TeSRTM基础培养基：STEMCELLTMTeSRTM95毫升+0.3％
Figure BDA0003112862220001414
储备液5ml+MC储备溶液300ul；3DKG定制TeSRTM基础培养基：定制TeSRTM培养基95ml+0.3％
Figure BDA0003112862220001415
储备液5ml+MC储备溶液300ul；1％最终含量对于3DKG培养基，加入浓度为青霉素/链霉素的青霉素/链霉菌素。
人胰腺内分泌祖细胞和β样细胞的体外制备
胰腺内分泌细胞(hiPSC-PEs)是使用如前所述的分化方法从人iPSC制备的。简而言之，从HUVEC衍生的人诱导多能干细胞(hiPSC)是从干细胞核心(Salk研究所)获得的。将细胞保持在
Figure BDA0003112862220001421
(BD)包被的皿中，在STEMCELLTMTeSRTM完全培养基中于37℃的潮湿5％CO2培养箱中保存。对于胰腺分化，通过Spinfection(800g，1小时)将hiPSC感染人胰岛素报告慢病毒(pGreenZero慢报告人胰岛素，System Biosciences)。方法1：在定制的TeSRTM培养基(800ml DMEM/F12、13.28g BSA、10ml Glutamax、560mg NaHCO3、330mg硫胺素、100mg还原型谷胱甘肽、3300mg维生素C、14μg硒、10ml NEAA、2ml痕量元素B、1ml痕量元素C、7μlβ-ME、2ml DLC、2ml GABA、2ml LiCl、129.7μgPA、2mg胰岛素至1000毫升)2天，然后再在分化培养基中将100ng/ml人激活素再放置2天(第1阶段，胰腺内胚层)。随后，将培养基替换为含有1μMdorsomorphin(Calbiochem)、2μM视黄酸(Sigma)、10μMSB431542和1％B27补充剂的定制TeSRTM培养基，持续7天(阶段2)。然后将培养基替换为定制的TeSRTM培养基，其中包含10uM福司可林(Sigma)、10μM地塞米松(Stemgent)、10μMTGFβRI激酶抑制剂II/Alk5抑制剂II(Calbiochem或Enzo)、10μM烟酰胺(Sigma)、1μM3,3',5-Triiodo-L-甲状腺素钠盐(T3)和1％的B27补充剂持续4-5天(第15天到21天，胰腺内分泌祖细胞)。每天(第1阶段)或隔天(第2阶段和第3阶段)更换培养基。
方法2：在分化培养基(S1)中将培养基分别更换为100ng/ml人类激活素(R&DSystems)、25ng/ml重组人类Wnt3a(R&D Systems)或3μM CHIR99021(Axon或Selleckchem)1天，然后再改变为100ng/ml人激活素在分化培养基(S1)中再培养2天(第1阶段，胰腺内胚层)。随后，将培养基用含50ng/ml FGF7的分化培养基(S2)替换2天，然后用含50ng/mlFGF7、0.25μM SANT-1(Sigma)、1μM维甲酸(Sigma)的分化培养基(S3)替换。)、100nMLDN193189和100nMα-淀粉样蛋白前体蛋白调节剂TPB 3天。随后，用0.25μMSANT-1、50nM视黄酸、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3的分化培养基(S4)替换培养基3天。随后，用100nMLDN193189、100nMγ分泌酶抑制剂XX GSiXX(Millipore)、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3的分化培养基(S5)替换培养基7天。随后，将培养基替换为分化培养基(S5)，再加入7至20天，分化培养基(S5)含10μMTrolox(Calbiochem)、2μMR428(Selleckchem)、1mM N-乙酰半胱氨酸、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3。
S1培养基(MCDB131培养基、葡萄糖8mM、2.46g/L NaHCO3、2％不含脂肪酸的BSA、0.25mM L-抗坏血酸0.002％胰岛素-转铁蛋白-硒ITS-X(GIBCO)、2mM Glutamax、1％青霉素-链霉素、S2培养基(MCDB131培养基、8mM葡萄糖、1.23g/L NaHCO3、2％不含脂肪酸的BSA、0.25mM L-抗坏血酸、0.002％胰岛素-转铁蛋白-硒ITS-X(GIBCO)、2mM Glutamax、1％青霉素-链霉素、S3培养基(MCDB131培养基、8mM葡萄糖、1.23g/L NaHCO3、2％无脂肪酸BSA、0.25mM L-抗坏血酸、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒ITS-X(GIBCO)、2mM Glutamax、1％青霉素-链霉素)、S4培养基(MCDB131培养基、8mM葡萄糖、1.23g/L NaHCO3、2％不含脂肪酸的BSA、0.25mM L-抗坏血酸、0.002％胰岛素-转铁蛋白-硒ITS-X(GIBCO)、2mM Glutamax、1％青霉素-链霉素、10μg/ml肝素、10μM硫酸锌、S5培养基(MCDB131培养基或BLAR培养基、20mM葡萄糖、1.754g/L NaHCO3、2％不含脂肪酸的BSA、0.25mM L-抗坏血酸、0.002％胰岛素-转铁蛋白-硒ITS-X(GIBCO)、2m M Glutamax、1％青霉素-链霉素。对于3维(3D)培养，将hiPSC或hESC在具有10μMY-27632的3DKG Stem TeSRTM基础培养基中培养5至7天，然后将每种分化培养基分别替换为0.015％的Kelcogel和0.3％的甲基纤维素。
体外三维胰岛芽的产生：通过与hADSC和HUVEC共同培养，基质胶中的胰岛样类器官
将原代HUVEC和人类脂肪干细胞(hADSC)(Invitrogen或PromoCell)与EBM培养基(Ronza，cc-3121)或MesenProRSTM培养基(GIBCO，12747-010或前脂肪细胞生长培养基试剂盒，C-27417)分别在37℃的潮湿5％CO2培养箱中。对于共培养实验，使用Accutase处理源自人iPSC的胰腺内分泌祖细胞，同时使用TrypLE(GIBCO，12604-013)处理HUVEC和hADSC，并将细胞分别收集到50ml试管中。计数细胞后，将hix-PP的1x106细胞、HUVEC的7x106细胞和hADSC的1-2x105细胞与300ul基质一起在24孔的1孔中共培养。为了可扩展生成类器官之类的人类胰岛，在3DKG
Figure BDA0003112862220001431
培养基和10μM毛喉素中共培养了1x106个hiPS-PP细胞(第15天到第21天)、7x106个HUVEC细胞和1-2x105个hADSC细胞在3DKG
Figure BDA0003112862220001432
培养基中与10μM毛喉素(Sigma)、10μM地塞米松(Stemgent)、10μMTGFβRI激酶抑制剂II/Alk5抑制剂II(Calbiochem或Enzo)、10μM烟酰胺(Sigma)、1uM 3,3',5-Triiodo-L-甲状腺素钠盐(T3)和1％的B27补充剂、R428(2μM)、硫酸锌(10μM)和N-Cys(1mM)共培养。(方法1)或在分化培养基(S5)中与100nM LDN193189、100nMγ分泌酶抑制剂XX GSiXX(Millipore)、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3共培养7天。随后，将培养基替换为分化培养基(S5)，再加入7至20天，方法是将分化培养基(S5)用10μM Trolox(Calbiochem)、2μM R428(Selleckchem)、1mM N-乙酰基半胱氨酸、10μM Alk5抑制剂II、1μM T3替代(方法2)。混合细胞在几天内形成球形、胰岛状簇。每隔一天更换一次介质。
体外生成3D(三维)胰岛芽：通过与hADSC和HUVEC共同培养，可缩放结冷胶中的胰岛样类器官
如上所述制备细胞。简要地说，将1x108细胞的hiPS-PP、2-7x107的HUVEC细胞和5-7x106的hADSC细胞在60-100ml的3DKG Custom TeSR TM中与10μM毛喉素(Sigma)、10μM地塞米松(Stemgent)、10μM共培养。TGFβRI激酶抑制剂II/Alk5抑制剂II(Calbiochem或Enzo)、10μM烟酰胺(Sigma)、1μM 3,3'，5-三碘代-L-甲状腺素钠盐(T3)和1％的B27补充剂、R428(2μM)、硫酸锌(10μM)和N-Cys(1mM)共培养(方法1)，或在分化培养基(S5)中与100nMLDN193189、100nMγ分泌酶抑制剂XX GSiXX(Millipore)、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3共培养7天。随后，将培养基替换为分化培养基(S5)，再加入7至20天，分别是10μMTrolox(Calbiochem)、2μMR428(Selleckchem)、1mM N-乙酰基半胱氨酸、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3(方法2)。混合细胞在几天内形成球形、胰岛状簇。每天或每隔一天更换一次媒体。
体外3D(三维)胰岛芽的生成：可扩展的Gellan Gum 3D培养方法中的胰岛样类器官，无需使用wADSC和HUVEC的(w/o)
首先将人类iPSC(包括iPSC或ESC)在基质胶包被的平板(二维(2D)培养物中)中培养，然后用Accutase(Innovative Cell Technologies，Inc.，San Diego，CA)处理细胞以产生单细胞悬液，用PBS洗涤并在1000-1300rpm下离心5分钟以沉淀细胞，然后将细胞用3DKGStem TeSRTM基础培养基(Stemcell Technologies，Cambridge，MA)和10μMY-27632(RHO/ROCK途径抑制剂化合物)重悬。再培养5至7天，直到PSC球体直径达到50-100μm，然后用添加有0.015％Kelcogel和0.3％甲基纤维素的分化培养基替换培养基，将培养基更改为包含100ng/ml人激活素(R&D Systems)、25ng/ml重组人Wnt3a(R&D Systems)或3μMCHIR99021(糖原合酶激酶GSK-3抑制剂)(Axon Medchem，Reston，VA；或Selleckchem)的分化培养基(S1)治疗1天，然后分化中(S1)中含有100ng/ml的人类激活素，持续2天(第1阶段，胰腺内胚层)。随后，将培养基替换为含50ng/ml FGF7的分化培养基(S2)(R&D Systems)2天，然后替换为含50ng/ml FGF7、0.25uM SANT-1(Sigma)的分化培养基(S3)、1μM视黄酸(Sigma)、100nM LDN193189(ALK2和ALK3抑制剂，Sigma)和100nMα-淀粉样前体蛋白调节剂TPB持续3天。随后，将所述培养基替换为含有0.25μMSANT-1、50nM视黄酸、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3的分化培养基(S4)，持续3天。随后，将培养基替换为含有100nM LDN193189、100nMγ分泌酶抑制剂XX GSiXX(Millipore)10μMAlk5抑制剂II、1μMT3的分化培养基(S5)，持续7天。随后，将培养基换成含有10μMTrolox(Calbiochem)、2μMR428(Selleckchem)、1mM N-乙酰半胱氨酸、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3的分化培养基(S5)，持续7至20天。
通过报告基因表达或qPCR确认胰岛素基因表达后(通常在第20-30天)，将培养基更改为含有10μMTrolox(Calbiochem)、2μMR428(Selleckchem)、1mM N-乙酰半胱氨酸、10μMAlk5抑制剂II、1μMT3和100ng/ml重组人(rh)Wnt4(R&D Systems)、400ng/ml rhWnt5a或50％Wnt5a条件培养基的分化培养基(S5)，持续1-20天。通过在T175-T225细胞培养液中达到70-100％融合后，在具有10％FBS、1％青霉素-链霉素的DMEM中培养L-Wnt5a细胞系(ATCC，CRL-2814)4天来制备Wnt5a条件培养基烧瓶。
体外生成3D(三维)肝芽：器官芽
如前所述，使用分化方法制备了来自人iPSC的肝细胞(hiPSC-HEs)。简而言之，将hiPSC保持在
Figure BDA0003112862220001451
(BD)包被的皿中，并在STEMCELLTMTeSRTM完全培养基中于37℃的潮湿5％CO2培养箱中保持。对于肝细胞分化，将hiPSC(6个孔中的90％融合)与100ng/ml人类激活素(Sigma)和25ng/ml重组人类Wnt3a(R&D系统)或3μMCHIR99021和1％B27补充品减去胰岛素在RPMI-1640培养基中培养持续1天，然后再将100ng/ml人激活素和1％B27补充品减去RPMI培养基中的胰岛素再放置4天(第1阶段肝内胚层)。随后，用RPMI-1640培养基中的10ng/ml bFGF、20ng/ml BMP4和1％B27补充剂替代分化培养基3天(阶段2)。然后将培养基替换为分化培养基，所述培养基中含有0.1μM地塞米松、20ng/ml的OncostatinM(R&DSystems)和10-20ng/ml的肝生长因子(HGF，R&D Systems)和在肝细胞培养基(Lonza,MD,CC-3198，撤回EGF和庆大霉素/两性霉素B)中4-22天(第15天至第19天，胰腺内分泌祖细胞)的1％B27补充物。每天(阶段1)或隔天(阶段2和阶段3)更换培养基。将HUVECs原代细胞和人脂肪干细胞(hADSC)(InVitrogen或PromoCell)与EBM培养基(Ronza，cc-3121)或MesenProRS培养基(GIBCO，12747-010或前脂肪细胞生长培养基试剂盒，C-27417)分别在37℃的潮湿5％CO2培养箱中。为了进行共培养实验，将第10天的人iPSC肝细胞用Accutase处理，而HUVEC和hADSC用TrypLE(GIBCO，12604-013)处理，并将细胞分别收集到50ml试管中。计数细胞后，将1×106个hiPS-PP细胞、7×106个HUVEC细胞和1-2×105个hADSC细胞在24孔的1孔中与300ul基质胶共培养。肝样类器官在1至2天内形成。然后，从基质中取出肝脏样器官，并在3DKG Custom TeSRTM中培养。在一个实施方案中，肝样类器官的细胞(肝细胞)被分子工程化以表达一种或多种检查点蛋白。
体外生成3D(三维)心脏芽：器官芽
使用先前描述的分化方法从人iPSC制备心肌细胞(hiPSC-CD)。简而言之，将hiPSC保持在
Figure BDA0003112862220001461
(BD)包被的培养皿中，并在37℃的湿式5％CO2培养箱中于完全StemcellTMTeSRTM培养基中保存。为了进行心脏分化，将hiPSC(6孔中90％的融合度)与100ng/ml人激活素(R&D Systems)和10μMCHIR99021和1％B27补充剂减去胰岛素在RPMI1640培养基中培养1天，然后再对1％B27补充剂减去胰岛素进行培养。RPMI介质再放置2天(第1阶段中胚层)。随后，用RPMI1640和5μM IWP-2和1％B27补充剂减去胰岛素在RPMI培养基中的溶液替换培养基1天(第2阶段)。然后用RPMI培养基中的1％B27补充剂减去胰岛素代替培养基6天或更长时间(阶段3)。心脏收缩在第13天左右开始。每天(第1阶段)或隔天(第2阶段和第3阶段)更换培养基。将HUVECs原代细胞和人脂肪干细胞(hADSC)(Invitrogen或PromoCell)分别在37℃的潮湿5％CO2培养箱中与EBM培养基(Ronza，cc-3121)或MesenProRSTM培养基(GIBCO，12747-010或前脂肪细胞生长培养基试剂盒，C-27417)在15cm的培养皿中一起培养。对于共培养实验，用Dispase处理源自人iPSC的第13天到第15天的心肌细胞，而用TrypLE(GIBCO，12604-013)处理HUVEC和hADSC，分别将细胞收集到50ml试管中。计数细胞后，在3DKG Custom TeSRTM培养基中共培养1x106个hiPS-PP细胞，7x106个HUVEC细胞和1-2x105个hADSC细胞。几天后形成了能够收缩的小心脏样器官。在一个实施方案中，将小心脏样类器官的细胞(心肌细胞)分子工程化以表达一种或多种检查点蛋白。
体外3D(三维)肠芽的产生：器官芽
使用先前描述的分化方法从人iPSC制备肠细胞(hiPSC-IT)。简而言之，将hiPSC保持在
Figure BDA0003112862220001471
(BD)包被的培养皿中，并在37℃的湿式5％CO2培养箱中于完全StemcellTMTeSRTM培养基中保存。为了进行肠道细胞分化，将hiPSC(在6个孔板中汇合90％)与100ng/ml人激活素(R&D Systems)、3μM CHIR99021、2mM Glutamax和1％B27补充品减去胰岛素在RPMI1640培养基中培养1天，然后100ng/ml每毫升人类激活素(R&D Systems)、2mMGlutamax和1％B27补充品减去RPMI1640培养基中的胰岛素再放置3天(第1阶段Forgut-内胚层)。随后，用RPMI 1640培养基中的500ng/ml Wnt3a、500ng/ml FGF4和1％B27补充剂替换培养基4天(阶段2)。将细胞转移至
Figure BDA0003112862220001472
基质，然后在24孔底部制成3D球形
Figure BDA0003112862220001473
宿舍。然后用DMEM/F12培养基中的1％B27补充剂、1％N2补充剂、500ng/ml R-spondin、100ng/ml Noggin、50ng/ml EGF、2mM GlutamaxTM补充剂、10μM HEPES替换培养基7天或更长时间(stage3)。在一周内观察到肠样类器官球体。每天(阶段1)和隔天(阶段2和阶段3)更换培养基。将HUVEC原代细胞和人类脂肪干细胞(hADSC)(Invitrogen或PromoCell)与EBM Media(Ronza，cc-3121)或MesenProRSTM培养基(
Figure BDA0003112862220001481
12747-010或前脂肪细胞生长培养基试剂盒)在15厘米培养皿中培养，C-27417)分别在37℃的5％CO2潮湿培养箱中进行。对于共培养实验，使用Accutase处理源自人iPSC的肠祖细胞(第7天)，同时使用TrypLE(
Figure BDA0003112862220001482
12604-013)处理HUVEC和hADSC，并将细胞分别收集到50ml试管中。计数细胞后，在3DKG Custom TeSRTM培养基中共培养1x106个hiPS-PP细胞、7x106个HUVEC细胞和1-2x105个hADSC细胞。在一个实施方案中，肠样类器官的肠细胞被分子工程化以表达一种或多种检查点蛋白。
胰岛素分泌测定(原代小鼠和人类胰岛以及人类iPSC衍生的细胞)
使用分批孵育方法监测从完整胰岛释放的胰岛素(Yoshihara等人，2010，Nat.Commun.1:127)。简而言之，将过夜培养的分离的胰岛(RPMI-1640补充有10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)抗生素-抗真菌药(Gibco))在37℃下预培养30分钟(含有129.4mM NaCl、3.7mM KCl、2.7mM CaCl2、1.3mM KH2PO4、1.3mM MgSO4、24.8mM NaHCO3(用5％CO2、95％O2、pH7.4平衡)的克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液(KRBB)HEPES和0.2％(v/v)BSA(fraction V，Sigma)(KRBH)含3mM葡萄糖)。然后将胰岛与3mM或20mM葡萄糖在KRBH缓冲液(500μl/10胰岛)中孵育，以确定胰岛素分泌水平。30分钟后，通过离心沉淀胰岛，并通过ELISA(分别针对小鼠和人类胰岛的大鼠/小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Millipore)和人胰岛素ELISA试剂盒(Millipore))测定胰岛素水平。对于人类iPSC衍生的细胞，将细胞(24孔中的1x106个细胞/孔)在3mM葡萄糖KRBH缓冲液(500μl/孔)中进行预培养。然后将细胞与3mM或20mM葡萄糖一起在KRBB(200μl/孔)中孵育，以确定c肽的分泌水平作为胰岛素分泌水平的指标。30分钟后，通过离心沉淀细胞，并通过人c肽ELISA KIT(Millipore)测定c肽水平。
实施例10方法
定量RT-PCR分析
使用TRIzol试剂(Invitrogen)和RNeasy KIT(Qiagen)提取总RNA。用SuperScriptIII第一链合成系统试剂盒(Invitrogen)或PrimeScript RT试剂盒(TAKARA)进行逆转录。使用SYBR Green(Bio-Rad)进行实时定量RT-PCR(qPCR)。
胰岛素原-NanoLuc的慢病毒生产
从Addgene获得pLX304中的胰岛素原-NanoLuc(Addgene，#62057)。胰岛素原-NanoLuc慢病毒是使用第二代病毒包装系统生产的。简而言之，将14μg胰岛素原-NanoLuc、6.6μgPsPAX2包装质粒(Addgene 12260)、5.4μgpMD2.G包膜质粒(Addgene 12259)和54μlLipofectamin2000(Invitrogen)用于转染HEK293LTV包装细胞的T75烧瓶。转染后二十四(24)小时，将培养基更换为含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的新鲜DMEM。转染后四十八(48)小时和96小时，分别在第1天和第3天收集病毒，并通过0.2μm醋酸纤维素滤膜(VWR)。将病毒等分并在-80℃下冷冻直至使用。
高斯荧光素酶测定法测定胰岛素分泌
将小鼠胰岛，人类胰岛和类器官等人类胰岛分别接种在10μg/ml
Figure BDA0003112862220001491
聚合物(Santacruz)的生长培养基中。然后添加病毒。过夜培养后，将细胞置于新鲜的生长培养基中。感染后四十八(48)到72小时，用手拾取小鼠胰岛、人类胰岛和人类胰岛样类器官，然后将其放入具有单个胰岛或类器官的96孔中。然后，进行胰岛素分泌测定。简而言之，将单个胰岛或类器官与3mM葡萄糖KRBB在37℃下预孵育30分钟至1小时。然后将细胞在3mM的KRBB(100μl/孔)中孵育30分钟，然后依次与20mM葡萄糖(含或不含100nM Exendin-4)或3mM葡萄糖和20mM KCl(100μl/孔)一起孵育。为了确定作为胰岛素分泌水平指标的高斯荧光素酶活性，使用皮尔斯高斯荧光素酶快速测定试剂盒(产品编号16159，Thermo Scientific)将10μl样品用于荧光素酶测定。
INS-1细胞通过转染(800g，在37℃下1小时)感染病毒，然后更换为新鲜的INS-1生长培养基。转染后七十二(72)小时，用5μg/ml Blasticidin(Invitrogen)的剂量处理INS-1细胞7天以选择表达Proinsulin-NanoLuc的细胞。为了进行胰岛素分泌测定，将细胞(5x104-1x105细胞/孔，置于96孔中)在3mM葡萄糖KRBB(100μl/孔)中预培养。然后将细胞在3mM的KRBB(100μl/孔)中温育，然后依次与20mM葡萄糖(含或不含100nM Exendine-4)或3mM葡萄糖和20mM KCl(100μl/孔)温育。萤光素酶活性作为胰岛素分泌水平的指标，使用Pierce Gaussia萤光素酶快速测定试剂盒(产品编号16159，Thermo Scientific)将10μl样品用于萤光素酶测定。
体外血管化测试
将人类胰岛样类器官植入带有300μl带EBM培养基(Ronza，CC-3121)的
Figure BDA0003112862220001501
基质的24孔板的1孔中。在24-72小时内观察到血管化。
hADSCs的3D培养和WNT蛋白表达
在3D培养中发生的自发自组织过程中，hADSC经历了Wnt基因(特别是Wnt5a途径中的基因)表达的变化。随着时间的推移，发现Wnt5a是hADSC 3D培养中Wnt蛋白中表达的主要蛋白。
其他实施方式
从前面的描述中，将显而易见的是，可以对本文描述的发明进行变型和修改，以将其应用于各种用途和条件。这样的实施例也在所附权利要求的范围内。
本文对变量的任何定义中的元素列表的列举包括将所述变量定义为所列元素的任何单个元素或组合(或子组合)。本文对实施例的叙述包括所述实施例作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分组合。
本说明书中提到的所有专利和出版物都以相同的程度通过引用并入本文，就如同每个独立的专利和出版物都被具体地和单独地指出通过引用并入一样。

Claims (93)

1.一种增加移植的供体细胞存活或减少其细胞死亡的方法，所述方法包括使所述供体细胞通过多次间歇暴露与干扰素γ(IFNγ)接触，从而提高所述移植的供体细胞的存活率或减少其细胞死亡。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述供体细胞是类器官细胞、胰岛细胞、胰岛样类器官细胞、β类胰岛细胞。
3.一种产生逃避免疫检测或自身免疫的胰岛样类器官的方法，所述方法包括：
在包含Wnt4或Wnt5a蛋白的三维基质中培养内分泌祖细胞一段足以产生多细胞胰岛样类器官的时间，所述多细胞胰岛样类器官包含两种或更多种选自β细胞、α细胞、δ细胞、ε细胞和导管样细胞的细胞类型；其中，所述胰岛样类器官响应葡萄糖而分泌胰岛素；以及
使所述胰岛样类器官经受干扰素γ(IFNγ)的多次间歇暴露；从而诱导所述胰岛样类器官持续免疫表达免疫检查点蛋白，并使所述胰岛样类器官逃避免疫检测或自身免疫。
4.一种产生逃避免疫检测或自身免疫的胰岛样类器官的方法，所述方法包括：
在包含Wnt4或Wnt5a蛋白的三维基质中培养重组表达免疫检查点蛋白的内分泌祖细胞一段足以产生包含两种或更多种选自β细胞、α细胞、δ细胞、ε细胞和导管样细胞的多细胞胰岛样类器官的时间；其中，所述胰岛样类器官响应葡萄糖而分泌胰岛素，并且其中所述胰岛样类器官逃避免疫检测和自身免疫。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述三维基质包括结冷胶。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述三维基质包含重组人Wnt4蛋白。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白的重组表达是通过用含有编码所述免疫检查点蛋白的多核苷酸的载体转导胰岛样类器官细胞而产生的。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白与选自程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA-4)；淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)；吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)；肿瘤坏死因子受体超家族成员9(4-1BB)；糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)；T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域(TIM-3)；肿瘤坏死因子受体超家族成员4(OX40)；腺苷A2A受体(A2AR)；B7-H3；B7-H4；B7-1/B7-2；BTLA；T细胞激活的V结构域Ig抑制剂(VISTA)；或上述任何一项的组合的免疫细胞表达的同源配体结合。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是程序化死亡配体-1(PD-L1)。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述细胞、胰岛、类器官或胰岛样类器官在至少两天的时段暴露于IFNγ至少两次。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在至少三天的时段，将所述细胞、胰岛、类器官或胰岛样类器官暴露于IFNγ至少三次。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在至少两天的时段，将所述细胞、胰岛、类器官或胰岛样类器官暴露于IFNγ大于一小时至少两次。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在至少三天的时间段内，将所述细胞、胰岛、类器官或胰岛样类器官暴露于IFNγ大于一小时至少三次。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，在至少三天的时间段内，将所述细胞、胰岛、类器官或胰岛样类器官暴露于IFNγ两小时至少三次。
15.根据权利要求3至14中任一项所述的方法，其中所述内分泌祖细胞选自诱导性多能干细胞(iPSCs)、胚胎多能干细胞(ePSCs)和/或胰腺祖细胞。
16.根据权利要求3至15中任一项所述的方法，其中所述内分泌祖细胞表达神经生成素3、neurod1、Nkx2.2和Pax4生物标记中的至少一种。
17.根据权利要求2至16中任一项所述的方法，其中所述胰岛样类器官是人胰岛样类器官(HILO)。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述胰岛样类器官被血管化。
19.根据权利要求2至17中任一项所述的方法，其中，所述胰岛样类器官还包括脂肪来源干细胞和/或内皮细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述脂肪来源干细胞是人脂肪来源干细胞(hADSC)和/或所述内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
21.根据权利要求2至20中任一项所述的方法，其中，所述胰岛样类器官还表现出KCl刺激的胰岛素分泌、GLP-1刺激的胰岛素分泌、生长抑素分泌、胰高血糖素分泌中的至少一种。
22.权利要求2至21中任一项所述的方法，其中所述胰岛样类器官表达选自由NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB和SYT4所组成群组的β细胞谱系标记物以及ARXα细胞谱系标记物。
23.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述三维基质包括人Wnt4蛋白、重组人Wnt4蛋白、人Wnt5蛋白或重组人Wnt5a蛋白。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述三维基质包含重组人Wnt4蛋白。
25.根据权利要求2至24中任一项所述的方法，其中所述胰岛样类器官显示出增加的雌激素相关受体γ(ERRγ)的表达。
26.根据权利要求2至25中任一项所述的方法，其中，所述胰岛样类器官表现出增加的氧化代谢，其特征在于增加的耗氧率(OCR)和降低的细胞酸化率(ECAR)。
27.根据权利要求2至26中任一项所述的方法，其中所述胰岛样类器官是胰岛类器官、胰腺类器官、肝脏类器官、心脏类器官或肠类器官。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述胰岛样类器官是人胰岛类器官。
29.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述供体细胞选自心脏细胞、结肠细胞、肾细胞、肝脏细胞(肝细胞)、食道细胞、胃肠细胞、胃部(胃)细胞、肺细胞、胰腺细胞、胰腺β细胞、肌肉细胞、造血细胞、B细胞、T细胞、CD34+造血细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、骨髓细胞、神经元、神经元细胞、视网膜细胞、角膜细胞、脑细胞、源自人皮肤细胞的产生胰岛素的胰腺β细胞、卵巢细胞、宫颈细胞、睾丸细胞、单核细胞、脐带血(UCB)细胞、脂肪来源的间充质基质(干)细胞、心脏干细胞、结肠干细胞、肾干细胞、肝脏(肝细胞)干细胞、胃肠干细胞、胃部(胃)干细胞、肺干细胞、胰腺干细胞、胰腺β干细胞、肌肉干细胞、造血干细胞、T细胞或B细胞干细胞、骨髓干细胞、CD133+干细胞、CD34+造血干细胞、视网膜干细胞、神经元干细胞、间充质干细胞、脐带间充质干细胞、外胚层来源的神经元细胞、外胚层来源的多巴胺能神经元细胞、角膜来源的细胞、正常人角膜上皮细胞、永生化的多巴胺能神经元前体细胞、内胚层来源的肝细胞、中胚层来源的肌肉细胞、骨髓细胞、肾细胞和骨骼肌细胞或由或含有所述细胞的类器官；肠类器官、肝类器官、结肠类器官、肝类器官、肾脏类器官、膀胱类器官、卵巢类器官、宫颈类器官、神经类器官或肺(肺部)类器官。
30.一种产生逃避免疫检测或自身免疫的人胰岛样类器官(HILO)的方法，所述方法包括：
(a)在包含Wnt4或Wnt5a蛋白的三维基质中培养内分泌祖细胞一段足以产生多细胞人胰岛样类器官的时间，所述多细胞人胰岛样类器官包含两种或更多种选自β细胞、α细胞、δ细胞、ε细胞和导管样细胞的细胞类型；其中，所述人胰岛样类器官响应葡萄糖而分泌胰岛素；
(b)在至少48至72小时的整个时段，使步骤(a)的HILO与干扰素γ(IFNγ)接触两次或三次，每次超过一小时；
其中所述人胰岛或HILOs在与IFNγ接触的时间之间不存在IFNγ的情况下维持；以及其中步骤(a)和(b)诱导HILO中免疫检查点蛋白程序化死亡配体1(PD-L1)的持续表达。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在步骤(b)中将所述HILO与IFNγ接触2小时。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述HILO与IFNγ接触两次且每次两个小时，至少48小时。
33.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中使所述HILO与IFNγ接触三次且每次两个小时，至少72小时。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述内分泌祖细胞选自诱导多能干细胞(iPSCs)、胚胎多能干细胞(ePSCs)和/或胰腺祖细胞。
35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述内分泌祖细胞表达神经元素3、neurod1、Nkx2.2和Pax4生物标记中的至少一种。
36.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述HILO被血管化并且表现出增加的氧化代谢，其特征在于增加的耗氧率(OCR)和降低的细胞酸化率(ECAR)。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述IFNγ是以1至25ng/ml的量使用。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述IFNγ是以10ng/ml的量使用。
39.根据权利要求8至36中任一项所述的方法，其中所述胰岛样类器官或HILO中的PD-L1表达维持超过7天。
40.一种具有免疫检查点蛋白的持续表达的免疫保护细胞、人胰岛样类器官或胰岛类器官，所述类器官通过权利要求1至39中任一项所述的方法产生。
41.根据权利要求40所述的人胰岛样类器官或胰岛类器官，其显示免疫检查点蛋白PD-L1的持续表达。
42.一种源自内分泌祖细胞的人胰岛样类器官(HILO)，所述内分泌祖细胞在包含Wnt4或Wnt5蛋白以及包含多谱系细胞的三维基质中培养，所述多谱系细胞包含β细胞、α细胞、δ细胞、ε细胞和导管样细胞中的至少两个，其中所述HILO是被血管化的，表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)，并且表现出免疫检查点蛋白的持续表达。
43.根据权利要求42所述的人胰岛样类器官(HILO)，其是胰岛样类器官或胰腺类器官。
44.根据权利要求42或43所述的人胰岛样类器官(HILO)，其中所述类器官还表现出KCl刺激的胰岛素分泌或葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的人胰岛样类器官(HILO)，其中所述三维基质包括结冷胶。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的人胰岛样类器官(HILO)，其中所述三维基质包含重组人Wnt4蛋白。
47.根据权利要求42至46中任一项所述的人胰岛样类器官(HILO)，其中所述三维基质包含重组人Wnt5蛋白。
48.根据权利要求42至47中任一项所述的人胰岛样类器官(HILO)，其中所述内分泌祖细胞选自诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎多能干细胞(ePSC)和/或胰腺祖细胞。
49.根据权利要求42至48中任一项所述的人胰岛样类器官(HILO)，其中所述内分泌祖细胞表达神经元素3、neurod1、Nkx2.2和Pax4生物标记中的至少一种。
50.根据权利要求42至49中任一项所述的人胰岛样类器官(HILO)，其表达FLTP和ESRRγ基因。
51.根据权利要求42至50中任一项所述的人胰岛样类器官(HILO)，其进一步包含脂肪来源干细胞和/或内皮细胞。
52.根据权利要求51所述的人胰岛样类器官(HILO)，其中所述脂肪来源干细胞是人脂肪来源干细胞(hADSC)和/或所述内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
53.根据权利要求42至52中任一项所述的人胰岛样类器官(HILO)，其进一步表现出KCl刺激的胰岛素分泌、GLP-1刺激的胰岛素分泌、生长抑素分泌或胰高血糖素分泌。
54.根据权利要求40至53中任一项所述的人胰岛样类器官(HILO)，其中所述人胰岛样类器官(HILO)表达选自由NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB和SYT4所组成群组的β细胞谱系标记物以及ARXα细胞谱系标记物。
55.根据权利要求40至52中任一项所述的人胰岛样类器官(HILO)，其中所述胰腺HILO表达选自由Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6和Foxa2所组成群组的β细胞转录因子。
56.根据权利要求42至55中任一项所述的人胰岛样类器官(HILO)，其中所述免疫检查点蛋白与选自程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA-4)；淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)；吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)；肿瘤坏死因子受体超家族成员9(4-1BB)；糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)；T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域(TIM-3)；肿瘤坏死因子受体超家族成员4(OX40)；腺苷A2A受体(A2AR)；B7-H3；B7-H4；B7-1/B7-2；BTLA；T细胞激活的V域Ig抑制剂(VISTA)；或上述任何一项的组合的免疫细胞表达的同源配体结合。
57.根据权利要求42至56中任一项所述的人胰岛样类器官(HILO)，其中所述免疫检查点蛋白是程序化死亡配体-1(PD-L1)。
58.一种非人类生物，其移植或植入权利要求42至57中任一项所述的人胰岛样类器官、胰岛类器官或HILO。
59.根据权利要求58所述的非人类生物，其中所述非人类生物是哺乳动物。
60.根据权利要求58所述的非人类生物，其中所述非人类生物是小鼠。
61.一种治疗受试者的胰腺疾病的方法，所述方法包括将免疫保护的胰岛样类器官或胰岛类器官移植或植入受试者，其中所述胰岛样类器官或胰岛类器官包括内分泌祖细胞-衍生的多谱系细胞，所述多谱系细胞包括β、α、δ、ε细胞、导管样细胞或其组合，且被血管化，表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)并表现出免疫检查点蛋白的持续表达以逃避免疫检测或自身免疫。
62.一种治疗受试者的1型糖尿病的方法，所述方法包括将免疫保护的胰岛样类器官或胰岛类器官移植或植入所述受试者中，其中所述胰岛样类器官或胰岛类器官包括内分泌祖细胞-衍生的多谱系细胞，所述多谱系细胞包括β、α、δ、ε细胞、导管样细胞或其组合，且被血管化，表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)，并表现出免疫检查点蛋白的持续表达，从而逃避免疫检测或自身免疫。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中所述胰岛样类器官或胰岛类器官进一步表现出KCl刺激的胰岛素分泌、GLP-1刺激的胰岛素分泌、生长抑素分泌或胰高血糖素分泌。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的方法，其中所述胰岛样类器官或胰岛类器官表达选自由NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB和SYT4所组成群组的β细胞谱系标记物以及ARXα细胞谱系标记物。
65.根据权利要求61至64中任一项所述的方法，其中所述内分泌祖细胞选自诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎多能干细胞(ePSC)和/或胰腺祖细胞。
66.根据权利要求61至65中任一项所述的方法，其中所述内分泌祖细胞表达神经元素3、neurod1、Nkx2.2和Pax4生物标记中的至少一种。
67.根据权利要求61至66中任一项所述的方法，其中所述胰岛样类器官或胰岛类器官表达选自由Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6和Foxa2所组成群组的的β细胞转录因子。
68.根据权利要求61至67中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白与选自程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)；细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA-4)；淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)；吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)；肿瘤坏死因子受体超家族成员9(4-1BB)；糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)；T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域(TIM-3)；肿瘤坏死因子受体超家族成员4(OX40)；腺苷A2A受体(A2AR)；B7-H3；B7-H4；B7-1/B7-2；BTLA；T细胞激活的V域Ig抑制剂(VISTA)；或上述任何一项的组合的免疫细胞表达的同源配体结合。
69.权利要求61至68中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是程序化死亡配体-1(PD-L1)。
70.权利要求61至69中任一项所述的方法，其中所述胰岛样类器官或胰岛类器官是通过权利要求1至37中任一项所述的方法产生的。
71.权利要求61至70中任一项所述的方法，其中所述胰岛样类器官或胰岛类器官是权利要求40至57中任一项所述的类器官。
72.根据权利要求61至71中任一项所述的方法，其中将免疫抑制剂施用于所述受试者。
73.根据权利要求61至72中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
74.根据权利要求61或63至73中任一项所述的方法，其中所述胰腺疾病是1型糖尿病或2型糖尿病。
75.一种在移植或植入后产生存活并减少细胞死亡的细胞，胰岛或类器官的方法，所述方法包括：
(a)在预定时间点使表达干扰素γ(IFNγ)的细胞，胰岛或类器官与干扰素γ(IFNγ)接触至少0.5小时或至少1小时；和
(b)在约或等于至少约72小时的时间段内重复步骤(a)至少约两次；
其中在与IFNγ接触的时间之间在不存在IFNγ的情况下维持细胞、胰岛或类器官；并且其中步骤(a)和(b)诱导PD-L1在细胞、胰岛或类器官中的持续表达。
76.根据权利要求75所述的方法，其中在步骤(a)中使所述细胞、胰岛、类器官或细胞与IFNγ接触选自至少1小时、至少2小时或超过2小时的时间段。
77.根据权利要求75或权利要求76所述的方法，其中在步骤(a)中使所述细胞、胰岛或类器官与IFNγ接触一段时间，所述时间选自约或等于2小时或约或等于12小时。
78.根据权利要求75至77中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)的至少约或等于72小时的时间段内，将步骤(a)重复至少3次，每次至少约2小时。
79.权利要求75至78中任一项所述的方法，其中在步骤(a)和步骤(b)之间洗涤细胞、胰岛或类器官以除去IFNγ的存在。
80.根据权利要求75至79中任一项所述的方法，其中以1至25ng/ml的量使用IFNγ。
81.根据权利要求75至79中任一项所述的方法，其中以10ng/ml的量使用IFNγ。
82.根据权利要求75至81中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之后，所述细胞、胰岛或类器官中的PD-L1表达维持大于约7天。
83.一种产生逃避免疫检测或自身免疫的细胞、胰岛或类器官及其细胞的方法，所述方法包括：
(a)首先使表达干扰素(IFNγ)受体的细胞、胰岛或类器官及其细胞与约1ng/ml至25ng/ml的量的干扰素γ(IFNγ)在至少约或等于24小时的时间段内的第一时间点接触大于1小时；和
(b)在步骤(a)之后至少约48小时的后续时间段内两个或多个额外时间点，使所述细胞、胰岛或类器官及其细胞与约1ng/ml至25ng/ml的量的IFNγ接触大于约0.5小时或更久；
其中所述细胞、胰岛或类器官被洗涤并在与IFNγ接触之间不存在IFNγ的情况下置于培养基中；并且其中步骤(a)和(b)诱导PD-L1在所述细胞、胰岛或类器官中的持续表达。
84.根据权利要求83所述的方法，其中在步骤(a)和步骤(b)中使所述细胞、胰岛或类器官与10ng/ml的量的IFNγ接触至少2小时。
85.根据权利要求83或84所述的方法，其中在72小时的时间段中的三个时间点使所述细胞、胰岛或类器官与IFNγ接触至少约2小时。
86.根据权利要求1或75至85中任一项所述的方法，其中所述细胞、胰岛或类器官是人细胞、胰岛或类器官。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述类器官是HILOs或人HILOs。
88.根据权利要求86所述的方法，其中所述细胞包括心脏细胞、结肠细胞、肾细胞、膀胱细胞、肝脏细胞(肝细胞)、食道细胞、胃肠细胞、胃部(胃)细胞、肺细胞、卵巢细胞、宫颈细胞、子宫细胞、睾丸细胞、胰腺细胞、胰腺β细胞、视网膜细胞、角膜细胞、脑细胞、肌肉细胞、造血细胞、免疫细胞(B细胞、T细胞)、嵌合抗原受体-T细胞(CAR-T细胞)、骨髓细胞、单核细胞、神经元、神经元细胞、源自人皮肤细胞的产生胰岛素的胰腺β细胞、脐带血(UCB)细胞、脂肪来源的间充质基质(干)细胞、心脏干细胞、结肠干细胞、肾干细胞、肝干细胞、胃肠干细胞、胃干细胞、肺干细胞、胰腺干细胞、胰腺β干细胞、肌肉干细胞、造血干细胞、免疫细胞(T细胞或B细胞)干细胞、骨髓干细胞、CD133+干细胞、CD34+造血细胞、CD34+造血干细胞、间充质干细胞、脐带间充质干细胞、视网膜干细胞、神经元干细胞、外胚层衍生的神经元细胞、永生化的多巴胺能神经元前体细胞和产生自或包含所述细胞的类器官。
89.根据权利要求86所述的方法，其中所述类器官包括心脏类器官、肠/胃肠类器官、结肠类器官、肝类器官、肾脏类器官、膀胱类器官、卵巢类器官、宫颈类器官、神经类器官或肺(肺部)类器官。
90.根据权利要求1、2或75至87中任一项所述的方法，其中所述胰岛是人尸体胰岛，其被保护免于被免疫系统的细胞破坏或清除。
91.一种细胞移植的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求40至57中任一项所述的免疫保护细胞、人胰岛样类器官或胰岛类器官。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述免疫保护细胞、人胰岛样类器官或胰岛类器官是同源的、自体的、同种异体的或异种的。
93.一种试剂盒，其包含权利要求40至57中任一项所述的免疫保护细胞、人胰岛样类器官或胰岛类器官，或包含所述免疫保护细胞、人胰岛样类器官或胰岛类器官的药学上可接受的组合物。
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