BR112021006885A2

BR112021006885A2 - células, ilhotas e organoides que escapam da detecção de imunidade e autoimunidade, métodos de produção e uso dos mesmos

Info

Publication number: BR112021006885A2
Application number: BR112021006885-6A
Authority: BR
Inventors: Eiji Yoshihara; Ruth Yu; Michael Downes; Ronald Evans; Annette Atkins
Original assignee: Salk Institute For Biological Studies
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2019-10-11
Publication date: 2021-07-13
Also published as: AU2019358184A1; IL281896A; JP2022504640A; WO2020077204A1; US20210363490A1; CN113474002A; WO2020077204A9; CA3115118A1; EP3863659A4; EP3863659A1; KR20210075136A; MX2021004140A

Abstract

CÉLULAS, ILHOTAS E ORGANOIDES QUE ESCAPAM DA DETECÇÃO DE IMUNIDADE E AUTOIMUNIDADE, MÉTODOS DE PRODUÇÃO E USO DOS MESMOS. A invenção apresenta células, células semelhantes a ilhotas, ilhotas pancreáticas e organoides (por exemplo, organoides semelhantes a ilhotas humanas ou HILOs), bem como culturas de células e métodos que são úteis para a geração rápida e confiável de células e organoides, como ilhotas e organoides pancreáticos, que são sustentáveis in vivo e que escapam da detecção imunológica, rejeição e autoimunidade. A invenção também apresenta métodos de tratamento de doenças pancreáticas, como diabetes tipo 2 e câncer pancreático, usando as células, células semelhantes a ilhotas, ilhotas e organoides pancreáticos (por exemplo, HILOs) que são projetados para modular a atividade de células imunes que de outro modo reagiriam contra eles.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “CÉLULAS,

ILHOTAS E ORGANOIDES QUE ESCAPAM DA DETECÇÃO DE IMUNIDADE E AUTOIMUNIDADE, MÉTODOS DE PRODUÇÃO E USO DOS MESMOS” REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade e o benefício do Pedido Provisório dos EUA No. 62/795.284, depositado em 22 de janeiro de 2019, e do Pedido Provisório dos EUA No. 62/745.086, depositado em 12 de outubro de 2018, todo o conteúdo de cada um dos quais está incorporado por referência neste documento em sua totalidade.

DECLARAÇÃO DE DIREITOS ÀS INVENÇÕES FEITAS SOB PESQUISA PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL

[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo nos termos da concessão No. DK057978, DK090962, HL088093, HL105278 e ES010337 concedida pelo National Institutes of Health, e da concessão No. P30 014195 concedida pelo National Institutes of Health e pelo National Cancer Institute. O governo tem certos direitos sobre a invenção.

FUNDAMENTOS

[003] Para o tratamento de diabetes insulino- dependente, como diabetes tipo 1 e diabetes tipo 2 em estágio avançado, a escassez de ilhotas humanas limita o número de pacientes que podem se beneficiar desta terapia.

Apesar do progresso no campo da diferenciação in vitro de células-tronco de pluripotência induzidas por humanos

(hiPSCs) em células semelhantes a , as células semelhantes a  geradas desta maneira tipicamente exibem deficiências na secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) e função metabólica mitocondrial, bem como detecção e destruição pelo sistema imunológico de um receptor após a administração. Assim, mais melhorias no processo de maturação são necessárias para capturar totalmente a fisiologia das ilhotas pancreáticas e a geração de organoides funcionais e duradouros.

[004] São necessários na técnica métodos para gerar órgãos humanos funcionais que sobrevivam ao transplante para o tratamento de doenças, bem como novas plataformas para triagem de drogas e modelagem de doenças para fornecer novas estratégias de tratamento e terapêuticas para pacientes com falência de órgãos.

SUMÁRIO DAS MODALIDADES DESCRITAS

[005] São fornecidos composições e métodos para gerar uma célula imunoprotegida, ilhota, organoide ou organoide semelhante a uma ilhota, incluindo, mas não se limitando a, um organoide de ilhota pancreática humana ou um organoide pancreático, em particular, um organoide semelhante a uma ilhota humana (abreviado como "HILO" neste documento), que sobrevive e evita a detecção pelo sistema imunológico (autoimunidade) após a administração, o transplante ou o implante em um indivíduo. Em uma modalidade, a célula, a ilhota, o organoide, o organoide semelhante a uma ilhota (e as células contidas nele) expressa receptores de interferon gama (IFN). Em uma modalidade, a célula, a ilhota, o organoide ou o organoide semelhante a uma ilhota (e células contidas nele) é humano.

[006] Em um aspecto, é fornecido um método para aumentar a sobrevivência ou reduzir a morte celular de uma célula doadora transplantada, no qual o método compreende contactar a célula doadora com múltiplas exposições intermitentes ao interferon gama (IFN) ao longo de um determinado período de tempo, por exemplo, um período de tempo de pelo menos 24 horas, aumentando assim a sobrevivência da célula do doador transplantado. Em uma modalidade, a célula doadora transplantada é uma célula organoide, uma célula de ilhota, uma célula organoide semelhante a uma ilhota ou uma célula de ilhota semelhante a . Em uma modalidade, a célula do doador transplantado é singênica para o indivíduo que recebe o transplante. Em uma modalidade, a célula do doador transplantado é autóloga para o indivíduo que recebe o transplante. Em uma modalidade, a célula do doador transplantado é alogênica ou xenogênica para o indivíduo que recebe o transplante. Em uma modalidade, a célula doadora transplantada é uma célula que expressa o receptor do interferon gama (IFN). Em uma modalidade, a célula doadora transplantada é uma célula humana.

[007] Em outro aspecto, é fornecido um método de geração de uma célula imunoprotegida, uma ilhota ou um organoide que sobrevive à detecção por células do sistema imunológico, por exemplo, células T ou células B, em que o método compreende submeter uma célula que expressa o receptor de interferon gama (IFN), ilhota ou organoide, ou células do mesmo, à exposição intermitente múltipla a IFN ao longo de um determinado período de tempo, por exemplo, um período de pelo menos 24 horas, induzindo assim a expressão de uma proteína de ponto de controle imunológico pela célula, ilhota ou organoide e permitir que a referida célula, ilhota ou organoide sobreviva à detecção imunológica ou autoimunidade.

[008] Em um aspecto, o organoide semelhante a uma ilhota (HILO) humano e as células que compreendem o HILO, a saber, células semelhantes a beta (), expressam ou são induzidas a expressar após a exposição a IFN uma ou mais moléculas envolvidas na modulação da resposta imune ou autoimunidade, tal como uma proteína de ponto de verificação imunológico, para superar a rejeição imunológica ou autoimunidade de células "não próprias" ou HILOs introduzidas, por exemplo, transplantadas ou implantadas, em um indivíduo. Em uma modalidade, a proteína de ponto de verificação imunológico é PD-L1. Em uma modalidade, o indivíduo em quem os HILOs são introduzidos, transplantados ou implantados tem diabetes. Em uma modalidade, o indivíduo no qual os HILOs são introduzidos, transplantados ou implantados tem diabetes tipo 1, tipo 2 ou diabetes tipo 2 em estágio avançado. Em uma modalidade, o indivíduo em quem os HILOs são introduzidos, transplantados ou implantados tem diabetes tipo 1. Em uma modalidade, o indivíduo no qual os HILOs são introduzidos, transplantados ou implantados é um indivíduo ou paciente humano. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são expressas de forma recombinante nas células introduzidas, transplantadas ou implantadas ou HILOs. Os termos "transplante" e "implante" podem ser usados indistintamente neste documento para se referir a células, ilhotas ou organoides (e células dos mesmos) que são introduzidos ou transferidos para um indivíduo por procedimentos praticados nas técnicas médicas para efetuar ou fornecer uma função neles, especialmente uma função terapêutica para tratar uma doença, um distúrbio ou uma patologia.

[009] Em um aspecto, é fornecido um método para gerar um organoide de ilhota pancreática no qual células-tronco de pluripotência induzidas (iPSC) derivadas de células beta () são cultivadas em uma matriz tridimensional contendo goma gelana, gerando assim um organoide de ilhota pancreática em que as células organoides expressam uma ou mais proteínas de ponto de verificação. Também é fornecida uma cultura de células incluindo uma célula semelhante a beta derivada de iPSC, que expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, em uma matriz tridimensional contendo goma gelana. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1.

[0010] Em um aspecto, é fornecida uma cultura de células incluindo uma célula semelhante a beta derivada de iPSC humana, uma célula-tronco derivada de tecido adiposo humano (hADSC) e uma célula endotelial da veia umbilical humana (HUVEC) em uma matriz tridimensional contendo goma gelana, em que as células da cultura expressam uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico.

[0011] Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, a cultura de células inclui uma célula-tronco derivada de tecido adiposo e/ou uma célula endotelial.

[0012] Em um aspecto, é fornecido um organoide semelhante a uma ilhota pancreática contendo uma célula semelhante a beta derivada de iPSC que expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, em que o organoide é vascularizado e exibe secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) e em que as células do organoide e o organoide expressam uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico. Em uma modalidade, o organoide semelhante a uma ilhota pancreática é um organoide semelhante a uma ilhota pancreática humana. Em uma modalidade, uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1.

[0013] Em um aspecto, é fornecido um organoide de ilhota pancreática contendo uma célula semelhante a beta () derivada de iPSC, uma célula alfa () derivada de iPSC, uma célula delta () derivada de iPSC, uma célula de duto derivada de iPSC, uma célula-tronco derivada de tecido adiposo humano (hADSC) e uma célula endotelial, em que a célula iPSC expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, o organoide é vascularizado e exibe secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS), secreção de insulina estimulada por KCl, secreção de insulina estimulada por GLP-1, secreção de somatostatina e secreção de glucagon.

[0014] Em um aspecto relacionado, é fornecido um organismo não humano transplantado ou implantado com o organoide de qualquer aspecto delineado neste documento.

[0015] Em um aspecto, é fornecido um método de tratamento de uma doença pancreática em um indivíduo, no qual um organoide de ilhota pancreática, ou HILO, é introduzido ou transplantado ou implantado no indivíduo, em que o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, contém células semelhantes a beta derivadas de iPSC, que expressam uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico para evitar a detecção imunológica; em que o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, é vascularizado e exibe secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS). Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1. Em uma modalidade, o indivíduo é humano e o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, é gerado a partir de tecido ou células humanos.

[0016] Em um aspecto, é fornecido um método de tratamento de diabetes tipo 1 em um indivíduo, no qual um organoide de ilhota pancreática, ou HILO, é introduzido, transplantado ou implantado no indivíduo, em que o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, contém células semelhantes a beta derivadas de iPSC, que expressam uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico para evitar a detecção imunológica; em que o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, é vascularizado e exibe secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS). Em uma modalidade, o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, expressa uma proteína de ponto de verificação para evitar a detecção imunológica. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1. Em uma modalidade, o indivíduo é humano e o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, é gerado a partir de tecido ou células humanos.

[0017] Em um aspecto, é fornecido um organoide de ilhota pancreática ou HILO, em que o organoide de ilhota pancreática ou HILO é gerado por cultura de uma célula- tronco de pluripotência induzida (iPSC) derivada de células semelhantes a beta em uma matriz tridimensional contendo goma gelana. Em uma modalidade, o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico para evitar a detecção imunológica. Em uma modalidade, o indivíduo é humano e o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, é gerado a partir de tecido ou células humanos. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1.

[0018] Em outro aspecto, é fornecido um organoide pancreático ou HILO gerado pela cultura de uma célula- tronco de pluripotência induzida (iPSC) derivada de células semelhantes a beta e uma célula componente exócrina derivada de iPSC em uma matriz tridimensional contendo goma gelana. Em uma modalidade, o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico para evitar a detecção imunológica. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1. Em uma modalidade, o indivíduo é humano e o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, é gerado a partir de tecido ou células humanos.

[0019] Em outro aspecto, é fornecido um organoide pancreático ou HILO gerado pela cultura de uma célula- tronco de pluripotência induzida (iPSC) derivada de células semelhantes a beta e uma célula componente exócrina derivada de iPSC em um meio de cultura, como uma matriz tridimensional contendo goma gelana e um agente que estimula a expressão e a produção de uma proteína de ponto de verificação nas células do organoide pancreático (células ) ou HILO. Sem desejar estar limitado pela teoria, o PD-L1 é produzido nas células  ou HILO através do mecanismo de memória transcricional. Em uma modalidade, o meio de cultura ou a matriz compreende interferon gama (IFN). Em uma modalidade, o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico para evitar a detecção imunológica. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1. Em uma modalidade, o indivíduo é humano e o organoide de ilhota pancreática, ou HILO, é gerado a partir de tecido ou células humanos.

[0020] Em outro aspecto, a invenção fornece um organoide do fígado gerado pela cultura de um hepatócito derivado de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSC) em uma matriz tridimensional contendo goma gelana; em que o hepatócito derivado de iPSC expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, de modo que o organoide do fígado evita a detecção imunológica. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1.

[0021] Em outro aspecto, a invenção fornece um organoide cardíaco gerado pela cultura de uma célula-tronco de pluripotência induzida (iPSC) de cardiomiócito derivado de uma matriz tridimensional contendo goma gelana em que o cardiomiócito derivado de iPSC expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, de modo que o organoide cardiáco evita a detecção imunológica. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1.

[0022] Em outro aspecto, a invenção fornece um organoide intestinal gerado pela cultura de uma célula intestinal derivada de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSC) em uma matriz tridimensional contendo goma gelana, em que a célula intestinal derivada de iPSC expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, tais que o organoide intestinal evita a detecção imunológica. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1.

[0023] Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o método envolve cultivar a célula semelhante a beta derivada de iPSC, que expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, com uma célula-tronco derivada de tecido adiposo e/ou uma célula endotelial. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1. Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o método envolve cultivar a célula semelhante a beta derivada de iPSC, que expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, com uma célula semelhante a alfa derivada de iPSC, uma célula semelhante a delta derivada de iPSC, e/ou uma célula semelhante a duto derivada de iPSC.

[0024] Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o organoide de ilhota pancreática contém uma célula semelhante a alfa derivada de iPSC, uma célula semelhante a delta derivada de iPSC e/ou uma célula semelhante a duto derivada de iPSC. Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o organoide de ilhota pancreática inclui uma célula-tronco derivada de tecido adiposo e/ou uma célula endotelial. Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o organoide de ilhota pancreática exibe secreção de insulina estimulada por KCl, secreção de insulina estimulada por GLP-1, secreção de somatostatina, expressão de peptídeo c e/ou secreção de glucagon. Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o organoide de ilhota pancreática expressa um ou mais dos fatores de transcrição de células beta Pdx1, MafA, Pax4, Pax6, NeuroD1, Nkx6-1, Gata6 e Foxa2. Em certas modalidades, o organoide de ilhota pancreática contém uma célula semelhante a beta derivada de iPSC, que expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, uma célula alfa derivada de iPSC, uma célula delta derivada de iPSC, uma célula de duto derivada de iPSC, uma célula- tronco derivada de tecido adiposo humano (hADSC) e uma célula endotelial, onde o organoide é vascularizado e exibe secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS), secreção de insulina estimulada por KCl, secreção de insulina estimulada por GLP-1, secreção de somatostatina e secreção de glucagon. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1. Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o organoide de ilhota pancreática é rodeado por um componente exócrino derivado de iPSC. Em várias modalidades, o componente exócrino derivado de iPSC expressa um ou mais dos marcadores PDX1, Nkx6-1 e Ptf1.

[0025] Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o organoide do fígado expressa um ou mais dos marcadores AFP, ALB e Cyp3a7. Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o organoide do fígado exibe sinalização de insulina, resistência à insulina por ácidos palmíticos e acúmulo de lipídios.

[0026] Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o organoide do coração expressa um ou mais dos marcadores hMlc2a, hNkx2-5, alphaMHC e KCNQ1. Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o coração organoide exibe batimento cardíaco.

[0027] Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o organoide intestinal expressa um ou mais dos marcadores CDX2, Muc2 e Lgr5. Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o organoide intestinal exibe brotamento em resposta à R- espondina.

[0028] Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, a célula semelhante a beta derivada de iPSC, célula semelhante a alfa derivada de iPSC, célula semelhante a delta derivada de iPSC e/ou célula semelhante a duto derivada de iPSC é humana. Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, a célula semelhante a beta derivada de iPSC, célula de componente exócrino derivada de iPSC, hepatócito derivado de iPSC, cardiomiócito derivado de iPSC ou célula intestinal derivada de iPSC é humana. Em várias modalidades, a célula-tronco derivada do tecido adiposo é uma célula-tronco derivada de tecido adiposo humano (hADSC). Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, a célula endotelial é uma célula endotelial de veia umbilical humana (HUVEC). Em várias modalidades, os organoides são gerados a partir de células humanas.

[0029] Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o organoide de ilhota pancreática, organoide pancreático, organoide do fígado, organoide do coração ou organoide intestinal, contém uma célula-tronco derivada de tecido adiposo e/ou uma célula endotelial. Em várias modalidades de qualquer aspecto delineado neste documento, o organoide de ilhota pancreática, organoide pancreático, organoide do fígado, organoide do coração ou organoide intestinal é vascularizado.

[0030] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para gerar um organoide de ilhota pancreática de HILO, o método compreendendo cultivar uma célula-tronco de pluripotência induzida (iPSC) derivada de células semelhantes a beta, que expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, em um meio que compreende

Proteína Wnt4 ou Wnt5a. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1. Em uma modalidade, a célula semelhante a beta derivada de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSC) é cultivada em uma matriz tridimensional. Em uma modalidade do aspecto anterior, a proteína Wnt4 ou Wnt5a é uma proteína Wnt4 ou Wnt5a humana recombinante. Em uma modalidade particular, o meio compreende proteína Wnt4 humana recombinante. Em outra modalidade particular, o meio compreende proteína Wnt5a humana recombinante. Em uma modalidade particular, um organoide de ilhota humana induzida por Wnt4 ou Wnt5 ou HILO é uma ilhota madura ou um HILO maduro.

[0031] Em outro aspecto, a invenção fornece uma cultura de células compreendendo uma célula semelhante a beta derivada de iPSC humana, que expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico e proteína Wnt4 ou Wnt5a. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1. Em uma modalidade, a célula semelhante a beta derivada de iPSC humana está em uma matriz tridimensional que compreende goma gelana. Em uma modalidade, a proteína Wnt4 ou Wnt5a é uma proteína Wnt4 ou Wnt5a humana recombinante. Em uma modalidade particular, o meio compreende proteína Wnt4 humana recombinante. Em outra modalidade particular, o meio compreende proteína Wnt5a humana recombinante. Em uma modalidade particular, um organoide de ilhota humana induzida por Wnt4 ou Wnt5 ou HILO é uma ilhota madura ou HILO maduro.

[0032] Em outro aspecto, a invenção fornece um organoide de ilhota pancreática compreendendo uma célula semelhante a beta derivada de iPSC, que expressa uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, cultivadas em meio compreendendo proteína Wnt4 ou Wnt5a, em que o organoide é vascularizado e exibe secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS). Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1. Em uma modalidade, o organoide exibe ainda secreção de insulina estimulada por KCl ou secreção de insulina estimulada por glicose. Em uma modalidade, o organoide de ilhota pancreática expressa os genes Fltp e Esrrg. Em uma modalidade, a proteína Wnt4 ou Wnt5a é uma proteína Wnt4 ou Wnt5a humana recombinante. Em uma modalidade particular, o meio compreende proteína Wnt4 humana recombinante. Em outra modalidade particular, o meio compreende proteína Wnt5a humana recombinante. Em uma modalidade particular, um organoide de ilhota humana induzida por Wnt4 ou Wnt5 ou HILO é uma ilhota madura ou um HILO maduro.

[0033] Em outro aspecto, a invenção fornece um organismo não humano transplantado ou implantado com o organoide definido nos aspectos descritos acima.

[0034] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para aumentar a auto-organização de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) para gerar um organoide derivado de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSC), que evita a vigilância imunológica e rejeição, o método compreendendo a cultura de ADSCs em um meio de matriz de cultura tridimensional (3-D) compreendendo uma proteína Wnt5a. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1. Em uma modalidade do método, os ADSCs são cultivados em uma matriz de cultura 3-D que compreende goma gelana. Em uma modalidade, os ADSCs são cultivados no meio de matriz de cultura 3-D compreendendo uma proteína Wnt5 e uma célula derivada de iPSC selecionada a partir de uma célula semelhante a beta derivada de iPSC, uma célula componente exócrina derivada de iPSC, um hepatócito derivado de iPSC, um cardiomiócito derivado de iPSC ou uma célula intestinal derivada de iPSC, que expressa uma ou mais proteínas inibidoras do ponto de verificação imunológico. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1. Em uma modalidade do método, o organoide derivado de iPSC é selecionado a partir de um organoide de ilhota pancreática, organoide pancreático, um organoide do fígado, um organoide do coração ou um organoide intestinal. Em uma modalidade do método, o organoide derivado de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSC) é um organoide derivado de células-tronco de pluripotência induzidas por humanos (hiPSC). Em uma modalidade do método, a proteína Wnt5a é uma proteína Wnt5a humana recombinante. Em uma modalidade do método, o organoide de ilhota pancreática, organoide pancreático, organoide do fígado, organoide do coração ou organoide intestinal é derivado de uma célula derivada de iPSC selecionada a partir de uma célula semelhante a beta derivada de iPSC, uma célula componente exócrina derivada de iPSC, um hepatócito derivado de iPSC, um cardiomiócito derivado de iPSC ou uma célula intestinal derivada de iPSC, respectivamente. Em uma modalidade, de qualquer uma das anteriores, a célula derivada de iPSC é humana.

[0035] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para aumentar a auto-organização de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) para gerar uma ilhota pancreática ou organoide pancreático que evita a rejeição imunológica ou autoimunidade, compreendendo cultivar ADSCs, que expressam uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, em meio compreendendo proteína Wnt5a. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico são PD-L1. Em uma modalidade, as ADSCs são cultivadas em uma matriz tridimensional que compreende goma gelana. Em outra modalidade, a proteína Wnt5a é uma proteína Wnt5a humana recombinante.

[0036] Em outro aspecto, a invenção fornece um organoide de ilhota pancreática, organoide pancreático, um organoide do fígado, um organoide do coração ou organoide intestinal produzido por qualquer um dos métodos delineados acima e suas modalidades.

[0037] Em vários aspectos de qualquer uma das modalidades anteriores, a proteína de ponto de verificação imunológico, ou uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, ou um fragmento ou porção da proteína de ponto de verificação imunológico que se liga ao ligante cognato, é expressa de forma recombinante ou introduzida molecularmente nas células de um organoide (por exemplo, células semelhantes a  que constituem HILOs) que expressam uma ou mais proteínas de ponto de verificação como proteínas de superfície de membrana que se ligam a um ligante cognato em uma célula imune, por exemplo, uma célula T, que está envolvida na autoimunidade, ou que reage contra uma célula estranha ou "não própria", de modo a suprimir ou bloquear a resposta da célula T (uma resposta imune alogênica ou resposta autoimune) e, assim, escapar da vigilância e rejeição do sistema imunológico em um receptor.

[0038] Em modalidades, as células de um organoide (por exemplo, células semelhantes a  que constituem HILOs) expressam uma ou mais proteínas ou moléculas de ponto de verificação que se ligam a ligantes cognatos na superfície de uma célula imune para suprimir a atividade imune alogênica ou autoimunidade contra as células e o organoide.

Em uma modalidade particular, as células de um organoide (por exemplo, uma célula semelhante a ) e do organoide (por exemplo, HILO) expressam a proteína de ponto de verificação imunológico PD-L1, ligante de morte celular programada 1, que se liga a PD-1, proteína de morte celular programada 1, que é expressa, por exemplo, em células T.

PD-L2, ligante de morte celular programada 2, também se liga a PD-1, mas com um Kd diferente. Em outras modalidades, as células de um organoide (por exemplo, uma célula semelhante a ) e o organoide (por exemplo, HILO) são modificados molecularmente para expressar uma molécula que se liga a uma proteína de ponto de verificação expressa na superfície de uma célula imune, como uma célula T (por exemplo, uma célula T efetora), em que a proteína de ponto de verificação expressa na superfície de uma célula imune é CTLA-4 (proteína T-linfócito citotóxica 4, também chamada de CD152); LAG-3, proteína do gene 3 de ativação de linfócitos; KIR, receptor tipo imunoglobulina de células assassinas; IDO1, indolamina 2,3-dioxigenase 1; 4-1BB, um membro 9 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (também conhecido como CD137); GITR, “gene relacionado à família TNFR induzida por glicocorticoides”; TIM-3, "domínio de imunoglobulina e domínio de mucina de células T"; OX40, membro 4 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (também conhecido como CD134); A2AR, receptor de adenosina A2A; B7-H3 (também denominado CD276); B7-H4 (também denominado VTCN1); B7-1/B7-2; BTLA (também denominado CD272); VISTA, "supressor de Ig de domínio V de ativação de células T"; ou uma combinação de qualquer um dos anteriores.

[0039] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades anteriores, a proteína de ponto de verificação imunológico compreende a totalidade ou uma parte, por exemplo, o domínio extracelular, da proteína de ponto de verificação (também chamada de "molécula de ponto de verificação" neste documento). Em uma modalidade particular, a proteína do ponto de verificação imunológico é PD-L1 ou uma porção de ligação da mesma. Em uma modalidade, a proteína de ponto de verificação é o domínio extracelular da proteína PD-L1.

[0040] Outro aspecto fornece uma célula-tronco de pluripotência induzida humana (hiPSC), célula beta () humana ou organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) gerada a partir da mesma, modificada molecularmente para expressar uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico que se ligam a um ligante cognato em uma célula imune, como uma célula T. Em uma modalidade, a uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico expressas por um hiPSC, célula beta () humana ou organoide semelhante a uma ilhotas humanas (HILO) se liga a um ligante cognato expresso em célula imune selecionado a partir da proteína de morte celular programada 1 (PD-1); proteína T-linfócito citotóxica 4 (CTLA-4); proteína do gene 3 de ativação de linfócitos (LAG-3); receptor tipo imunoglobulina de células assassinas (KIR); indolamina 2,3-dioxigenase 1 (IDO1); membro 9 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (4-1BB); gene relacionado com a família TNFR induzido por glicocorticoides (GITR); domínio de imunoglobulina e domínio de mucina de células T (TIM-3); membro 4 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, (OX40); receptor de adenosina A2A (A2AR); B7-H3; B7-H4; B7-1/B7-2; BTLA; supressor de Ig de domínio V da ativação de células T (VISTA); ou uma combinação de qualquer um dos anteriores. Em uma modalidade particular, o hiPSC, célula beta () humana ou HILO expressa a proteína de ponto de verificação imunológico, proteína-ligante de morte celular programada 1 (PD-L1), que se liga a PD-1.

[0041] Em outro aspecto, um método de geração de células, ilhotas, organoides que sobrevivem e têm morte celular reduzida após transplante, implantação ou transferência é fornecido, em que o método compreende: (a)

contactar células que expressam receptor de interferon gama

(IFN), ilhotas ou organoides com interferon gama (IFN)

por pelo menos 0,5 hora ou pelo menos uma hora em um ponto de tempo predeterminado; e (b) repetir a etapa (a) pelo menos cerca de duas vezes durante um período de tempo de cerca de ou igual a 72 horas; em que as células, ilhotas ou organoides são mantidos na ausência de IFN entre os momentos de contato com IFN; e em que as etapas (a) e (b)

induzem a expressão sustentada de PD-Ll nas células,

ilhotas ou organoides.

Em uma modalidade do método, as células, ilhotas ou organoides são colocados em contato com

IFN por um período de tempo selecionado a partir de cerca de ou igual a pelo menos 0,5 hora, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, ou mais do que 2 horas na etapa (a). Em outra modalidade do método, as células, ilhotas ou organoides são colocados em contato com IFN por um período de tempo selecionado a partir de cerca de ou igual a 0,5 hora, ou cerca de ou igual a 1 hora, ou cerca de ou igual a

2 horas, ou cerca de ou igual a 12 horas na etapa (a). Em outra modalidade do método, a etapa (a) é repetida pelo menos três vezes por pelo menos cerca de 0,5 hora de cada vez, ou por pelo menos cerca de 1 hora de cada vez, ou por pelo menos cerca de 2 horas de cada vez em cerca de ou igual a um período de tempo de 72 horas da etapa (b). Em outra modalidade do método, as células, ilhotas ou organoides são lavados para remover a presença de IFN entre a etapa (a) e a etapa (b). Em outra modalidade do método, IFN é usado em uma quantidade de 1 a 25 ng/ml. Em outra modalidade do método, IFN é usado em uma quantidade de 10 ng/ml. Em outra modalidade do método, a expressão de PD-L1 nas células, ilhotas ou organoides é mantida após a etapa (b) por mais do que cerca de ou igual a 7 dias. Em uma modalidade, a expressão sustentada de PD-L1 compreende cerca de ou igual a 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, ou mais, da expressão de PD-L1 em uma célula.

[0042] Em outro aspecto, é fornecido um método de geração de ilhotas ou organoides e as células dos mesmos que sobrevivem e têm morte celular reduzida após transplante, implante ou transferência, em que o método compreende: (a) contactar o receptor de interferon gama (IFN) que expressa ilhotas ou organoides e as células dos mesmos com interferon gama (IFN) em uma quantidade de cerca de 1 ng/ml a 25 ng/ml por mais de 1 hora em um primeiro ponto de tempo durante um determinado período de tempo, por exemplo, um período de cerca de ou igual a 24 horas; e (b) contactar as ilhotas ou organoides e as células dos mesmos com IFN em uma quantidade de cerca de 1 ng/ml a 25 ng/ml por mais de cerca de 0,5 a 1 hora ou mais em dois ou mais pontos de tempo adicionais durante um período de tempo seguinte, por exemplo, um período de tempo de 48 horas, seguindo a etapa (a); em que as referidas ilhotas ou organoides são lavadas e colocadas em repouso em meio na ausência de IFN entre o contato com IFN; e em que as etapas (a) e (b) induzem a expressão sustentada de PD-Ll nas referidas ilhotas ou organoides. Em uma modalidade do método, as ilhotas ou os organoides são colocados em contato com IFN em uma quantidade de 10 ng/ml por pelo menos 2 horas na etapa (a) e na etapa (b). Em outra modalidade do método, as ilhotas ou os organoides são colocados em contato com IFN por pelo menos cerca de 2 horas em 3 pontos de tempo durante o período de tempo de 72 horas.

[0043] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos indicados acima, as células, as ilhotas ou os organoides são células, ilhotas ou organoides humanos. Em outra modalidade dos métodos acima, os organoides são HILOs ou HILOs humanos. Em outra modalidade dos métodos acima, as ilhotas são ilhotas de cadáveres humanos que são protegidas da destruição ou da eliminação pelo sistema imunológico.

[0044] Em outro aspecto, é fornecido um método de geração de células humanas, ilhotas ou organoides semelhantes a ilhotas humanas (HILOs) que evitam a detecção imunológica ou autoimunidade, em que o método envolve (a)

contactar as células humanas, as ilhotas ou os HILOs com interferon gama (IFN) por mais de uma hora em um ponto de tempo predeterminado; repetir a etapa (a) pelo menos duas vezes durante um determinado período de tempo, por exemplo,

um período de 72 horas; em que as células humanas, as ilhotas ou os HILOs são mantidos na ausência de IFN entre os tempos de contato com IFN; e em que as etapas (a) e (b)

induzem a expressão sustentada de PD-L1 nas ilhotas humanas ou nos HILOs.

Em uma modalidade do método, as células humanas, as ilhotas ou os HILOs são colocados em contato com IFN por 2 horas ou mais na etapa (a). Em outra modalidade do método, as células humanas, as ilhotas ou os

HILOs são colocados em contato com IFN por 2 horas ou 12 horas na etapa (a). Em outra modalidade do método, a etapa

(a) é repetida três vezes por pelo menos 2 horas de cada vez no período de tempo determinado, isto é, um período de tempo de 72 horas.

Em outra modalidade do método, as células humanas, as ilhotas ou os HILOs são lavados para remover IFN entre a etapa (a) e a etapa (b). Em outra modalidade do método, IFN é usado em uma quantidade de 1 a

25 ng/ml.

Em outra modalidade do método, IFN é usado em uma quantidade de 10 ng/ml.

Em outra modalidade do método,

a expressão de PD-L1 nas ilhotas ou nos HILOs é mantida ou sustentada após a etapa (b) por mais de 7 dias.

[0045] Em outro aspecto, é fornecido um método de geração de células humanas, ilhotas ou organoides semelhantes a ilhotas humanas (HILOs) que evitam a detecção imunológica ou autoimunidade, em que o método envolve (a)

contactar as células humanas, as ilhotas ou os HILOs com interferon gama (IFN) em uma quantidade de cerca de

1 ng/ml a 25 ng/ml por mais de 1 hora em um primeiro ponto de tempo durante um determinado período de tempo, por exemplo, um período de tempo de 24 horas; e (b) contactar as células humanas, as ilhotas ou os HILOs com IFN em uma quantidade de cerca de 1 ng/ml a 25 ng/ml por mais de 1 hora, pelo menos, dois pontos de tempo adicionais durante um próximo período de tempo, por exemplo, um período de tempo de 48 horas, seguindo a etapa (a); em que as células humanas, as ilhotas ou os HILOs são lavados e colocados em repouso em meio na ausência de IFN entre o contato com

IFN; e em que as etapas (a) e (b) induzem a expressão sustentada de PD-L1 nas ilhotas humanas ou nos HILOs.

Em uma modalidade do método, as ilhotas humanas ou os HILOs são colocados em contato com interferon gama (IFN) em uma quantidade de 10 ng/ml por pelo menos 2 horas na etapa (a)

e na etapa (b). Em outra modalidade do método, as ilhotas humanas ou os HILOs são colocados em contato com interferon gama (IFN) por pelo menos 2 horas em 3 intervalos diferentes (pontos de tempo) durante um determinado período de tempo, como um período de 72 horas.

Em uma modalidade do método dos aspectos anteriores, as ilhotas humanas ou os

HILOs são ilhotas humanas maduras ou HILOs.

Em uma modalidade, a expressão sustentada de PD-L1 compreende cerca de ou igual a 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias,

8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, ou mais, da expressão de PD-L1 em uma célula.

Em modalidades do método, as células compreendem células cardíacas, células do cólon, células renais, células da bexiga, células do fígado (hepatócitos), células esofágicas, células gastrointestinais, células gástricas

(estômago), células pulmonares, células ovarianas, células cervicais, células uterinas, células testiculares, células pancreáticas, células  pancreáticas, células retinais,

células da córnea, células cerebrais, células musculares,

células hematopoiéticas, células imunes (células B, células

T), células T receptoras de antígeno quimérico (células

CAR-T), células da medula óssea, células mononucleares,

neurônios, células neuronais, células  pancreáticas produtoras de insulina derivadas de células da pele humana,

células do sangue do cordão umbilical (SCU), células do estroma mesenquimal (tronco) derivadas de tecido adiposo,

células-tronco cardíacas, células-tronco do cólon, células-

tronco dos rins, células-tronco hepáticas (hepatócitos),

células-tronco gastrointestinais, células-tronco gástricas,

células-tronco pulmonares, células-tronco pancreáticas, células-tronco  pancreáticas, células-tronco musculares, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco de células imunes (células T ou B), célula-tronco da medula óssea, células-tronco CD133+, células hematopoiéticas CD34+, células-tronco hematopoiéticas CD34+, células-tronco mesenquimais, células-tronco mesenquimais do cordão umbilical, células-tronco retinais, células-tronco neuronais, células neuronais derivadas de ectoderma, células precursoras neuronais dopaminérgicas imortalizadas e organoides gerados a partir de ou contendo as referidas células. Em uma modalidade do método, os organoides compreendem organoides cardíacos, organoides intestinais/gastrointestinais, organoides do cólon, organoides hepáticos, organoides renais, organoides da bexiga, organoides ovarianos, organoides cervicais, organoides neurais ou organoides pulmonares (pulmão).

[0046] Em uma modalidade dos métodos de qualquer um dos aspectos delineados acima, as células, as ilhotas ou os organoides que expressam o receptor de interferon gama (IFN) são colocados em contato com IFN em meio de cultura ou uma solução fisiologicamente aceitável, ou em uma matriz tridimensional. Em uma modalidade, as células, as ilhotas ou os organoides que expressam o receptor de interferon gama (IFN) são colocados em contato com IFN em uma matriz tridimensional (3D), por exemplo, goma gelana, como descrito neste documento.

[0047] Em outro aspecto, é fornecido um método para gerar um organoide semelhante a uma ilhota que evita a detecção imunológica ou autoimunidade, em que o método compreende cultivar células progenitoras endócrinas em uma matriz tridimensional compreendendo proteína Wnt4 ou Wnt5a por um tempo suficiente para gerar um organoide semelhante a uma ilhota compreendendo dois ou mais tipos de células selecionados a partir de células beta (), células alfa (), células delta (), células épsilon () e células semelhantes a dutos; em que o organoide semelhante a uma ilhota secreta insulina em resposta à glicose; e submeter o organoide semelhante a uma ilhota a múltiplas exposições intermitentes ao interferon gama (IFN) ao longo de um determinado período de tempo, por exemplo, um período de tempo de pelo menos 24 horas; induzindo assim a expressão sustentada de uma proteína de ponto de verificação imunológico pelo organoide semelhante a uma ilhota e permitindo que o organoide semelhante a uma ilhota evite a detecção imunológica ou autoimunidade. Em uma modalidade do método, o organoide semelhante a uma ilhota é exposto a IFN pelo menos duas vezes ao longo de um período de pelo menos dois dias. Em outra modalidade do método, o organoide semelhante a uma ilhota é exposto a IFN pelo menos três vezes ao longo de um período de três dias. Em outra modalidade do método, o organoide semelhante a uma ilhota é exposto a IFN por mais de uma hora, pelo menos, duas vezes ao longo de um período de dois dias. Em outra modalidade do método, o organoide semelhante a uma ilhota é exposto a IFN por mais de uma hora, pelo menos, três vezes ao longo de um período de três dias. Em outra modalidade do método, o organoide semelhante a uma ilhota é exposto a IFN por duas horas, pelo menos, duas vezes ao longo de um período de dois dias. Em outra modalidade do método, o organoide semelhante a uma ilhota é exposto a IFN por duas horas, pelo menos, três vezes ao longo de um período de três dias.

Em modalidades do método, o organoide semelhante a uma ilhota é exposto de forma intermitente a IFN ao longo de um período de tempo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dias, ou mais.

[0048] Em outro aspecto, é fornecido um método para gerar um organoide semelhante a uma ilhota que evita a detecção imunológica ou autoimunidade, em que o método compreende cultivar células progenitoras endócrinas que expressam de forma recombinante uma proteína de ponto de verificação imunológico em uma matriz tridimensional compreendendo proteína Wnt4 ou Wnt5a por um tempo suficiente para gerar um organoide multicelular semelhante a uma ilhota compreendendo dois ou mais tipos de células selecionados a partir de células beta (), células alfa (), células delta (), células épsilon () e células semelhantes a dutos; em que o organoide semelhante a uma ilhota secreta insulina em resposta à glicose e em que o organoide semelhante a uma ilhota evita a detecção imunológica e autoimunidade. Em uma modalidade, a expressão recombinante da proteína do ponto de verificação imunológico resulta da transdução de células organoides semelhantes a ilhotas com um vetor contendo um polinucleotídeo que codifica a proteína do ponto de verificação imunológico.

[0049] Em uma modalidade dos métodos dos aspectos anteriores, a matriz tridimensional compreende uma proteína Wnt4 humana, uma proteína Wnt4 humana recombinante, uma proteína Wnt5 humana ou uma proteína Wnt5a humana recombinante. Em uma modalidade particular, a matriz tridimensional compreende uma proteína Wnt4 humana recombinante.

[0050] Em uma modalidade dos métodos anteriores de geração de um organoide semelhante a uma ilhota que evita a detecção imunológica ou autoimunidade, a matriz tridimensional compreende goma gelana. Em uma modalidade, a matriz tridimensional compreende a proteína Wnt4 humana recombinante. Em modalidades dos métodos anteriores, a proteína de ponto de verificação imunológico se liga a um ligante cognato expresso em células imunes selecionado a partir da proteína de morte celular programada 1 (PD-1); proteína T-linfócito citotóxica 4 (CTLA-4); proteína do gene 3 de ativação de linfócitos (LAG-3); receptor tipo imunoglobulina de células assassinas (KIR); indolamina 2,3- dioxigenase 1 (IDO1); membro 9 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (4-1BB); gene relacionado com a família TNFR induzido por glicocorticoides (GITR); domínio de imunoglobulina e domínio de mucina de células T (TIM-3); membro 4 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, (OX40); receptor de adenosina A2A (A2AR); B7-H3; B7-H4; B7-1/B7-2; BTLA; supressor de Ig de domínio V da ativação de células T (VISTA); ou uma combinação de qualquer um dos anteriores. Em uma modalidade particular, a proteína do ponto de verificação imunológico é o ligante de morte celular programada 1 (PD-L1).

[0051] Em uma modalidade dos métodos dos aspectos anteriores, as células progenitoras endócrinas são selecionadas a partir de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSCs), células-tronco de pluripotência embrionárias (ePSCs) e/ou células progenitoras pancreáticas.

[0052] Em uma modalidade dos métodos dos aspectos anteriores, as células progenitoras endócrinas expressam pelo menos um dentre os biomarcadores neurogenina 3,

neurod1, Nkx2.2 e Pax4.

[0053] Em uma modalidade dos métodos dos aspectos anteriores, o organoide semelhante a uma ilhota é um organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO). Em uma modalidade particular, o organoide semelhante a uma ilhota é vascularizado. Em uma modalidade particular, o organoide semelhante a uma ilhota compreende ainda uma célula-tronco derivada de tecido adiposo e/ou uma célula endotelial. Em uma modalidade, a célula-tronco derivada de tecido adiposo é uma célula-tronco derivada de tecido adiposo humano (hADSC) e/ou a célula endotelial é uma célula endotelial de veia umbilical humana (HUVEC).

[0054] Em uma modalidade dos métodos dos aspectos anteriores, o organoide semelhante a uma ilhota exibe ainda pelo menos um dentre secreção de insulina estimulada por KCl, secreção de insulina estimulada por GLP-1, secreção de somatostatina, secreção de glucagon.

[0055] Em uma modalidade dos métodos dos aspectos anteriores, o organoide semelhante a uma ilhota expressa um marcador de linhagem de células beta selecionado do grupo que consiste em NKX2-2, NEUROD1, RFX6, GCK, INS, NKX6-1, UCN3, MAFB e SYT4 e um marcador de linhagem de células alfa ARX.

[0056] Em uma modalidade dos métodos dos aspectos anteriores, o organoide semelhante a uma ilhota exibe expressão aumentada de receptor relacionado ao estrogênio gama (ERR).

[0057] Em outra modalidade dos métodos dos aspectos anteriores, o organoide semelhante a uma ilhota exibe aumento do metabolismo oxidativo caracterizado por aumento da taxa de consumo de oxigênio (OCR) e diminuição da taxa de acidificação celular (ECAR).

[0058] Em uma modalidade dos métodos dos aspectos anteriores, o organoide semelhante a uma ilhota é um organoide de ilhota pancreática, um organoide pancreático, um organoide do fígado, um organoide do coração ou organoide intestinal. Em uma modalidade particular dos métodos, o organoide semelhante a uma ilhota é um organoide de ilhota pancreática humana.

[0059] Em outro aspecto, é fornecido um método para gerar um organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) que evita a detecção imunológica ou autoimunidade, em que o método compreende (a) cultivar células progenitoras endócrinas em meio de cultura ou uma matriz tridimensional compreendendo proteína Wnt4 ou Wnt5a por um tempo suficiente para gerar um organoide semelhante a uma ilhota humana multicelular compreendendo dois ou mais tipos de células selecionadas a partir de células beta (), células alfa (), células delta (), células épsilon () e células semelhantes a dutos; em que o organoide semelhante a uma ilhota humana secreta insulina em resposta à glicose; (b)

contactar o HILO da etapa (a) com interferon gama (IFN)

duas ou três vezes por mais de uma hora de cada vez ao longo de um período de tempo total de pelo menos 48 a 72 horas; em que as ilhotas humanas ou os HILOs são mantidos na ausência de IFN entre os tempos de contato com IFN; e em que as etapas (a) e (b) induzem a expressão sustentada do ligante da morte celular programada 1 da proteína de ponto de verificação imunológico (PD-L1) no HILO.

Em uma modalidade do método, o HILO é colocado em contato com IFN por 2 horas na etapa (b). Em outra modalidade do método, o

HILO é colocado em contato com IFN duas vezes por duas horas de cada vez, durante pelo menos 48 horas.

Em outra modalidade do método, o HILO é colocado em contato com IFN três vezes por duas horas de cada vez, durante pelo menos

72 horas.

Em outra modalidade do método, as células progenitoras endócrinas são selecionadas a partir de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSCs), células-

tronco de pluripotência embrionárias (ePSCs) e/ou células progenitoras pancreáticas.

Em outra modalidade do método,

as células progenitoras endócrinas expressam pelo menos um dentre os biomarcadores neurogenina 3, neurod1, Nkx2.2 e

Pax4. Em outra modalidade do método, o HILO é vascularizado e exibe metabolismo oxidativo aumentado caracterizado por aumento da taxa de consumo de oxigênio (OCR) e diminuição da taxa de acidificação celular (ECAR).

[0060] Em uma modalidade dos métodos dos aspectos anteriores, IFN é usado em uma quantidade de 1 a 25 ng/ml.

Em uma modalidade dos métodos dos aspectos anteriores, IFN é usado em uma quantidade de 10 ng/ml. Em uma modalidade dos métodos dos aspectos anteriores, a expressão de PD-L1 no organoide semelhante a uma ilhota ou HILO é mantida por mais de 7 dias.

[0061] Em um aspecto, um organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática tendo expressão sustentada de uma proteína de ponto de verificação imunológico é produzido pelo método conforme descrito nos aspectos delineados acima. Em uma modalidade, o organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática exibe uma expressão sustentada da proteína de ponto de verificação imunológico PD-L1.

[0062] Em outro aspecto, é fornecido um organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) derivado de células progenitoras endócrinas cultivadas em meio de cultura ou uma matriz tridimensional compreendendo proteína Wnt4 ou Wnt5 e compreendendo células multi-linhagem compreendendo pelo menos duas das células beta (), células alfa (), células delta (), células epsilon () e células semelhantes a dutos, em que o HILO é vascularizado, exibe secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) e exibe expressão sustentada de uma proteína de ponto de verificação imunológico.

Em uma modalidade, o organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) é um organoide semelhante a uma ilhota pancreática ou um organoide pancreático.

Em uma modalidade, o organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) exibe ainda secreção de insulina estimulada por KCl ou secreção de insulina estimulada por glicose.

Em outra modalidade, a matriz tridimensional para a cultura do organoide semelhante a uma ilhota humana

(HILO) compreende goma gelana.

Em outra modalidade, a matriz tridimensional para a cultura do organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) compreende a proteína

Wnt4 humana recombinante.

Em uma modalidade, o organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) é derivado de células progenitoras endócrinas que são selecionadas a partir de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSCs), células-

Em uma modalidade, as células progenitoras endócrinas expressam pelo menos um dentre os biomarcadores neurogenina 3, neurod1, Nkx2.2 e Pax4. Em uma modalidade, o organoide semelhante a uma ilhota humana

(HILO) expressa os genes FLTP e ESRR gama.

Em uma modalidade, o organoide semelhante a uma ilhota humana

(HILO) compreende ainda uma célula-tronco derivada de tecido adiposo e/ou uma célula endotelial.

Em uma modalidade particular, a célula-tronco derivada do tecido adiposo é uma célula-tronco derivada de tecido adiposo humano (hADSC) e/ou a célula endotelial é uma célula endotelial de veia umbilical humana (HUVEC). Em outra modalidade, o organoide semelhante a uma ilhota humana

(HILO) exibe ainda secreção de insulina estimulada por KCl,

secreção de insulina estimulada por GLP-1, secreção de somatostatina ou secreção de glucagon.

Em outra modalidade,

o organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) expressa um marcador de linhagem de células beta selecionado do grupo que consiste em NKX2-2, NEUROD1, RFX6, GCK, INS,

NKX6-1, UCN3, MAFB e SYT4 e um marcador de linhagem de célula alfa ARX.

Em outra modalidade, o organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) é um HILO pancreático que expressa um fator de transcrição de células beta selecionado do grupo que consiste em Pdx1, MafA, Pax4,

Pax6, NeuroD1, Nkx6-1, Gata6 e Foxa2. Em modalidades, o organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) exibe expressão sustentada de uma proteína de ponto de verificação imunológico que se liga a um ligante cognato expresso em células imunes selecionado a partir da proteína de morte celular programada 1 (PD-1); proteína T-linfócito citotóxica 4 (CTLA-4); proteína do gene 3 de ativação de linfócitos (LAG-3); receptor tipo imunoglobulina de células assassinas (KIR); indolamina 2,3-dioxigenase 1 (IDO1);

membro 9 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (4-1BB); gene relacionado com a família TNFR induzido por glicocorticoides (GITR); domínio de imunoglobulina e domínio de mucina de células T (TIM-3); membro 4 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, (OX40); receptor de adenosina A2A (A2AR); B7-H3; B7-H4; B7-1/B7-2; BTLA; supressor de Ig de domínio V da ativação de células T (VISTA); ou uma combinação de qualquer um dos anteriores. Em uma modalidade, o organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 54, caracterizado pelo fato de que a proteína de ponto de verificação imunológico é ligante de morte programada-1 (PD-L1).

[0063] Em outro aspecto, é fornecido um organismo não humano transplantado ou implantado com o organoide de ilhota humana, organoide de ilhota pancreática ou HILO conforme descrito nos aspectos anteriores delineados acima.

Em uma modalidade, o organismo não humano é um mamífero. Em uma modalidade, o organismo não humano é um camundongo.

[0064] Em outro aspecto, é fornecido um método de tratamento de uma doença pancreática em um indivíduo, em que o método compreende transplantar ou implantar um organoide de ilhota ou um organoide de ilhota pancreática no indivíduo, em que o organoide de ilhota ou um organoide de ilhota pancreática compreende células progenitoras endócrinas derivadas de células multi-linhagens, incluindo células beta, alfa, delta, épsilon, células semelhantes a dutos, ou uma combinação das mesmas, é vascularizado, exibe secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) e exibe expressão sustentada de uma proteína de ponto de verificação imunológico para escapar da detecção imunológica ou autoimunidade.

[0065] Em outro aspecto, é fornecido um método de tratamento de diabetes tipo 1 em um indivíduo, em que o método compreende transplantar ou implantar um organoide de ilhota ou um organoide de ilhota pancreática no indivíduo, em que o organoide de ilhota ou um organoide de ilhota pancreática compreende células multi-linhagens derivadas de células progenitoras endócrinas, incluindo células beta, alfa, delta, épsilon, células semelhantes a dutos ou uma combinação das mesmas, é vascularizado, exibe secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) e exibe expressão sustentada de uma proteína de ponto de verificação imunológico para escapar da detecção imunológica ou autoimunidade.

[0066] Em uma modalidade dos métodos delineados nos aspectos descritos acima, o organoide semelhante a uma ilhota ou organoide de ilhota pancreática exibe ainda secreção de insulina estimulada por KCl, secreção de insulina estimulada por GLP-1, secreção de somatostatina ou secreção de glucagon.

Em uma modalidade dos métodos delineados nos aspectos descritos acima, o organoide semelhante a uma ilhota ou organoide de ilhota pancreática expressa um marcador de linhagem de células beta selecionado do grupo que consiste em NKX2-2, NEUROD1, RFX6,

GCK, INS, NKX6-1, UCN3, MAFB e SYT4 e um marcador de linhagem de células alfa ARX.

Em uma modalidade dos métodos delineados nos aspectos descritos acima, as células progenitoras endócrinas são selecionadas a partir de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSCs), células-

Em uma modalidade, as células progenitoras endócrinas expressam pelo menos um dentre os biomarcadores neurogenina 3, neurod1, Nkx2.2 e Pax4. Em uma modalidade dos métodos delineados nos aspectos descritos acima, o organoide semelhante a uma ilhota ou organoide de ilhota pancreática expressa um fator de transcrição de células beta selecionado do grupo que consiste em Pdx1,

MafA, Pax4, Pax6, NeuroD1, Nkx6-1, Gata6 e Foxa2. Em uma modalidade dos métodos de tratamento, conforme descrito nos aspectos delineados acima, a proteína de ponto de verificação imunológico se liga a um ligante cognato expresso em células imunes selecionado a partir da proteína de morte celular programada 1 (PD-1); proteína T-linfócito citotóxica 4 (CTLA-4); proteína do gene 3 de ativação de linfócitos (LAG-3); receptor tipo imunoglobulina de células assassinas (KIR); indolamina 2,3-dioxigenase 1 (IDO1);

membro 9 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (4-1BB); gene relacionado com a família TNFR induzido por glicocorticoides (GITR); domínio de imunoglobulina e domínio de mucina de células T (TIM-3);

membro 4 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, (OX40); receptor de adenosina A2A (A2AR); B7-H3;

B7-H4; B7-1/B7-2; BTLA; supressor de Ig de domínio V da ativação de células T (VISTA); ou uma combinação de qualquer um dos anteriores.

Em uma modalidade particular, a proteína do ponto de verificação imunológico é o ligante de morte programada 1 (PD-L1). Em uma modalidade dos métodos de tratamento, conforme descrito nos aspectos delineados acima, o organoide semelhante a uma ilhota ou organoide de ilhota pancreática é produzido por um método descrito nos aspectos acima.

Em uma modalidade dos métodos de tratamento conforme descritos nos aspectos delineados acima, o organoide semelhante a uma ilhota ou organoide de ilhota pancreática é o organoide conforme descrito nos aspectos delineados acima.

Em uma modalidade dos métodos de tratamento, conforme descrito nos aspectos delineados acima, um agente imunossupressor é administrado ao indivíduo.

Em uma modalidade dos métodos de tratamento,

conforme descrito nos aspectos delineados acima, o indivíduo é humano. Em uma modalidade dos métodos de tratamento, conforme descrito nos aspectos delineados acima, a doença pancreática é diabetes tipo 1 ou diabetes tipo 2.

[0067] Em outro aspecto, é fornecido um método de transplante de células, em que o método compreende administrar a um indivíduo com necessidade uma célula imunoprotegida, organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhotas pancreáticas conforme descrito nos aspectos delineados acima. Em uma modalidade, a célula imunoprotegida, organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática é singênica, autóloga, alogênica ou xenogênica para o indivíduo que recebe o transplante.

[0068] Em outro aspecto, é fornecido um kit contendo uma célula imunoprotegida, organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática conforme descrito nos aspectos delineados acima, ou uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo a célula imunoprotegida, organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática. Em uma modalidade, o kit contém uma célula imunoprotegida, organoide de ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática que é singênica, autóloga, alogênica ou xenogênica.

[0069] Outras características e vantagens serão evidentes a partir da descrição detalhada das modalidades e das reivindicações.

Definições

[0070] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o significado comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. As seguintes referências fornecem a uma pessoa versada na técnica pertinente uma definição geral de muitos dos termos usados nesta invenção: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2ª ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5ª Ed., R. Rieger et al.

(eds.), Springer Verlag (1991); e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Conforme usado neste documento, os termos a seguir têm os significados atribuídos a eles abaixo, a menos que especificado de outra forma.

[0071] Por "polipeptídeo AFP" ou "alfa-fetoproteína" entende-se uma proteína ou fragmento desta tendo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_001125.1 e tendo uma atividade biológica de um polipeptídeo AFP.

Atividades biológicas exemplares de um polipeptídeo AFP incluem ligação a cobre, níquel, ácidos graxos e bilirrubina. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_001125.1 é mostrada abaixo: 1 MKWVESIFLI FLLNFTESRT LHRNEYGIAS ILDSYQCTAE ISLADLATIF FAQFVQEATY 61 KEVSKMVKDA LTAIEKPTGD EQSSGCLENQ LPAFLEELCH EKEILEKYGH SDCCSQSEEG 121 RHNCFLAHKK PTPASIPLFQ VPEPVTSCEA YEEDRETFMN KFIYEIARRH PFLYAPTILL 181 WAARYDKIIP SCCKAENAVE CFQTKAATVT KELRESSLLN QHACAVMKNF GTRTFQAITV 241 TKLSQKFTKV NFTEIQKLVL DVAHVHEHCC RGDVLDCLQD GEKIMSYICS QQDTLSNKIT 301 ECCKLTTLER GQCIIHAEND EKPEGLSPNL NRFLGDRDFN QFSSGEKNIF LASFVHEYSR 361 RHPQLAVSVI LRVAKGYQEL LEKCFQTENP LECQDKGEEE LQKYIQESQA LAKRSCGLFQ 421 KLGEYYLQNA FLVAYTKKAP QLTSSELMAI TRKMAATAAT CCQLSEDKLL ACGEGAADII 481 IGHLCIRHEM TPVNPGVGQC CTSSYANRRP CFSSLVVDET YVPPAFSDDK FIFHKDLCQA 541 QGVALQTMKQ EFLINLVKQK PQITEEQLEA VIADFSGLLE KCCQGQEQEV CFAEEGQKLI 601 SKTRAALGV

[0072] Por "polinucleotídeo AFP" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo AFP ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica de AFP exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_001134.2. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_001134.2 é reproduzida abaixo: 1 atattgtgct tccaccactg ccaataacaa aataactagc aaccatgaag tgggtggaat 61 caattttttt aattttccta ctaaatttta ctgaatccag aacactgcat agaaatgaat 121 atggaatagc ttccatattg gattcttacc aatgtactgc agagataagt ttagctgacc 181 tggctaccat attttttgcc cagtttgttc aagaagccac ttacaaggaa gtaagcaaaa 241 tggtgaaaga tgcattgact gcaattgaga aacccactgg agatgaacag tcttcagggt 301 gtttagaaaa ccagctacct gcctttctgg aagaactttg ccatgagaaa gaaattttgg 361 agaagtacgg acattcagac tgctgcagcc aaagtgaaga gggaagacat aactgttttc 421 ttgcacacaa aaagcccact ccagcatcga tcccactttt ccaagttcca gaacctgtca 481 caagctgtga agcatatgaa gaagacaggg agacattcat gaacaaattc atttatgaga 541 tagcaagaag gcatcccttc ctgtatgcac ctacaattct tctttgggct gctcgctatg 601 acaaaataat tccatcttgc tgcaaagctg aaaatgcagt tgaatgcttc caaacaaagg 661 cagcaacagt tacaaaagaa ttaagagaaa gcagcttgtt aaatcaacat gcatgtgcag 721 taatgaaaaa ttttgggacc cgaactttcc aagccataac tgttactaaa ctgagtcaga 781 agtttaccaa agttaatttt actgaaatcc agaaactagt cctggatgtg gcccatgtac 841 atgagcactg ttgcagagga gatgtgctgg attgtctgca ggatggggaa aaaatcatgt 901 cctacatatg ttctcaacaa gacactctgt caaacaaaat aacagaatgc tgcaaactga 961 ccacgctgga acgtggtcaa tgtataattc atgcagaaaa tgatgaaaaa cctgaaggtc 1021 tatctccaaa tctaaacagg tttttaggag atagagattt taaccaattt tcttcagggg 1081 aaaaaaatat cttcttggca agttttgttc atgaatattc aagaagacat cctcagcttg 1141 ctgtctcagt aattctaaga gttgctaaag gataccagga gttattggag aagtgtttcc 1201 agactgaaaa ccctcttgaa tgccaagata aaggagaaga agaattacag aaatacatcc 1261 aggagagcca agcattggca aagcgaagct gcggcctctt ccagaaacta ggagaatatt 1321 acttacaaaa tgcgtttctc gttgcttaca caaagaaagc cccccagctg acctcgtcgg 1381 agctgatggc catcaccaga aaaatggcag ccacagcagc cacttgttgc caactcagtg 1441 aggacaaact attggcctgt ggcgagggag cggctgacat tattatcgga cacttatgta 1501 tcagacatga aatgactcca gtaaaccctg gtgttggcca gtgctgcact tcttcatatg

1561 ccaacaggag gccatgcttc agcagcttgg tggtggatga aacatatgtc cctcctgcat 1621 tctctgatga caagttcatt ttccataagg atctgtgcca agctcagggt gtagcgctgc 1681 aaacgatgaa gcaagagttt ctcattaacc ttgtgaagca aaagccacaa ataacagagg 1741 aacaacttga ggctgtcatt gcagatttct caggcctgtt ggagaaatgc tgccaaggcc 1801 aggaacagga agtctgcttt gctgaagagg gacaaaaact gatttcaaaa actcgtgctg 1861 ctttgggagt ttaaattact tcaggggaag agaagacaaa acgagtcttt cattcggtgt 1921 gaacttttct ctttaatttt aactgattta acactttttg tgaattaatg aaatgataaa 1981 gacttttatg tgagatttcc ttatcacaga aataaaatat ctccaaatgt ttccttttca 2041 aaaaaaaaaa aaaaaaa

[0073] Por "polipeptídeo ALB" ou "albumina" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_000468.1 e tendo uma atividade biológica do polipeptídeo ALB. As atividades biológicas exemplares do polipeptídeo ALB incluem a ligação a ácidos graxos, íons cálcio, íons sódio, íons potássio, hormônios e bilirrubina; estabilização do volume do líquido extracelular; e transporte de zinco plasmático. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_000468.1 é mostrada abaixo: 1 MKWVTFISLL FLFSSAYSRG VFRRDAHKSE VAHRFKDLGE ENFKALVLIA FAQYLQQCPF 61 EDHVKLVNEV TEFAKTCVAD ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRETYGE MADCCAKQEP 121 ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTA FHDNEETFLK KYLYEIARRH PYFYAPELLF 181 FAKRYKAAFT ECCQAADKAA CLLPKLDELR DEGKASSAKQ RLKCASLQKF GERAFKAWAV 241 ARLSQRFPKA EFAEVSKLVT DLTKVHTECC HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK 301 ECCEKPLLEK SHCIAEVEND EMPADLPSLA ADFVESKDVC KNYAEAKDVF LGMFLYEYAR 361 RHPDYSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP HECYAKVFDE FKPLVEEPQN LIKQNCELFE 421 QLGEYKFQNA LLVRYTKKVP QVSTPTLVEV SRNLGKVGSK CCKHPEAKRM PCAEDYLSVV 481 LNQLCVLHEK TPVSDRVTKC CTESLVNRRP CFSALEVDET YVPKEFNAET FTFHADICTL 541 SEKERQIKKQ TALVELVKHK PKATKEQLKA VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEGKKLV 601 AASQAALGL

[0074] Por "polinucleotídeo ALB" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo ALB ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica de AFP exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_000477.5. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_000477.5 é reproduzida abaixo: 1 agtatattag tgctaatttc cctccgtttg tcctagcttt tctcttctgt caaccccaca 61 cgcctttggc acaatgaagt gggtaacctt tatttccctt ctttttctct ttagctcggc 121 ttattccagg ggtgtgtttc gtcgagatgc acacaagagt gaggttgctc atcggtttaa 181 agatttggga gaagaaaatt tcaaagcctt ggtgttgatt gcctttgctc agtatcttca 241 gcagtgtcca tttgaagatc atgtaaaatt agtgaatgaa gtaactgaat ttgcaaaaac 301 atgtgttgct gatgagtcag ctgaaaattg tgacaaatca cttcataccc tttttggaga 361 caaattatgc acagttgcaa ctcttcgtga aacctatggt gaaatggctg actgctgtgc 421 aaaacaagaa cctgagagaa atgaatgctt cttgcaacac aaagatgaca acccaaacct 481 cccccgattg gtgagaccag aggttgatgt gatgtgcact gcttttcatg acaatgaaga 541 gacatttttg aaaaaatact tatatgaaat tgccagaaga catccttact tttatgcccc 601 ggaactcctt ttctttgcta aaaggtataa agctgctttt acagaatgtt gccaagctgc 661 tgataaagct gcctgcctgt tgccaaagct cgatgaactt cgggatgaag ggaaggcttc 721 gtctgccaaa cagagactca agtgtgccag tctccaaaaa tttggagaaa gagctttcaa 781 agcatgggca gtagctcgcc tgagccagag atttcccaaa gctgagtttg cagaagtttc 841 caagttagtg acagatctta ccaaagtcca cacggaatgc tgccatggag atctgcttga 901 atgtgctgat gacagggcgg accttgccaa gtatatctgt gaaaatcaag attcgatctc 961 cagtaaactg aaggaatgct gtgaaaaacc tctgttggaa aaatcccact gcattgccga 1021 agtggaaaat gatgagatgc ctgctgactt gccttcatta gctgctgatt ttgttgaaag 1081 taaggatgtt tgcaaaaact atgctgaggc aaaggatgtc ttcctgggca tgtttttgta 1141 tgaatatgca agaaggcatc ctgattactc tgtcgtgctg ctgctgagac ttgccaagac 1201 atatgaaacc actctagaga agtgctgtgc cgctgcagat cctcatgaat gctatgccaa 1261 agtgttcgat gaatttaaac ctcttgtgga agagcctcag aatttaatca aacaaaattg 1321 tgagcttttt gagcagcttg gagagtacaa attccagaat gcgctattag ttcgttacac 1381 caagaaagta ccccaagtgt caactccaac tcttgtagag gtctcaagaa acctaggaaa 1441 agtgggcagc aaatgttgta aacatcctga agcaaaaaga atgccctgtg cagaagacta 1501 tctatccgtg gtcctgaacc agttatgtgt gttgcatgag aaaacgccag taagtgacag 1561 agtcaccaaa tgctgcacag aatccttggt gaacaggcga ccatgctttt cagctctgga 1621 agtcgatgaa acatacgttc ccaaagagtt taatgctgaa acattcacct tccatgcaga 1681 tatatgcaca ctttctgaga aggagagaca aatcaagaaa caaactgcac ttgttgagct 1741 cgtgaaacac aagcccaagg caacaaaaga gcaactgaaa gctgttatgg atgatttcgc 1801 agcttttgta gagaagtgct gcaaggctga cgataaggag acctgctttg ccgaggaggg 1861 taaaaaactt gttgctgcaa gtcaagctgc cttaggctta taacatcaca tttaaaagca 1921 tctcagccta ccatgagaat aagagaaaga aaatgaagat caaaagctta ttcatctgtt 1981 tttctttttc gttggtgtaa agccaacacc ctgtctaaaa aacataaatt tctttaatca 2041 ttttgcctct tttctctgtg cttcaattaa taaaaaatgg aaagaatcta atagagtggt 2101 acagcactgt tatttttcaa agatgtgttg ctatcctgaa aattctgtag gttctgtgga 2161 agttccagtg ttctctctta ttccacttcg gtagaggatt tctagtttct tgtgggctaa 2221 ttaaataaat cattaatact cttctaaaaa aaaaaaaaaa aaaa

[0075] Por "agente" entende-se qualquer composto químico de molécula pequena, anticorpo, molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo, ou fragmentos dos mesmos.

[0076] Por "melhorar" entende-se reduzir, suprimir, atenuar, diminuir, interromper ou estabilizar o desenvolvimento ou progressão de uma doença.

[0077] Por “alterado” entende-se um aumento ou diminuição. Um aumento é qualquer mudança positiva, por exemplo, em pelo menos cerca de 5%, 10% ou 20%; em pelo menos cerca de 25%, 50%, 75% ou mesmo em 100%, 200%, 300% ou mais. Uma diminuição é uma mudança negativa, por exemplo, uma diminuição de pelo menos cerca de 5%, 10% ou 20%; em pelo menos cerca de 25%, 50%, 75%; ou mesmo um aumento de 100%, 200%, 300% ou mais.

[0078] Nesta divulgação, "compreende", "compreendendo", "contendo" e "tendo" e semelhantes pode ter o significado atribuído a eles na lei de patentes dos EUA e pode significar "inclui", "incluindo" e semelhantes; "consistindo essencialmente em" ou "consiste essencialmente em" da mesma forma tem o significado atribuído na lei de patentes dos EUA e o termo é aberto, permitindo a presença de mais do que o que é citado, desde que características básicas ou novas daquilo que é citado não é alterado pela presença de mais do que o que é citado, mas exclui modalidades da técnica anterior.

[0079] Por "polipeptídeo CDX2" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_001256.3 e tendo atividade de fator de transcrição. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_001256.3 é mostrada abaixo:

1 MYVSYLLDKD VSMYPSSVRH SGGLNLAPQN FVSPPQYPDY GGYHVAAAAA AAANLDSAQS 61 PGPSWPAAYG APLREDWNGY APGGAAAAAN AVAHGLNGGS PAAAMGYSSP ADYHPHHHPH 121 HHPHHPAAAP SCASGLLQTL NPGPPGPAAT AAAEQLSPGG QRRNLCEWMR KPAQQSLGSQ 181 VKTRTKDKYR VVYTDHQRLE LEKEFHYSRY ITIRRKAELA ATLGLSERQV KIWFQNRRAK 241 ERKINKKKLQ QQQQQQPPQP PPPPPQPPQP QPGPLRSVPE PLSPVSSLQA SVSGSVPGVL 301 GPTGGVLNPT VTQ

[0080] Por "polinucleotídeo CDX2" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CDX2 ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica de CDX2 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_001265.4. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_001265.4 é reproduzida abaixo: 1 ctccaaccat tggtgtctgt gtcattacta atagagtctt gtaaacactc gttaatcacg 61 gaaggccgcc ggcctggggc tccgcacgcc agcctgtggc gggtcttccc cgcctctgca 121 gcctagtggg aaggaggtgg gaggaaagaa ggaagaaagg gagggaggga ggaggcaggc 181 cagagggagg gaccgcctcg gaggcagaag agccgcgagg agccagcgga gcaccgcggg 241 ctggggcgca gccacccgcc gctcctcgag tcccctcgcc cctttccctt cgtgcccccc 301 ggcagcctcc agcgtcggtc cccaggcagc atggtgaggt ctgctcccgg accctcgcca 361 ccatgtacgt gagctacctc ctggacaagg acgtgagcat gtaccctagc tccgtgcgcc 421 actctggcgg cctcaacctg gcgccgcaga acttcgtcag ccccccgcag tacccggact 481 acggcggtta ccacgtggcg gccgcagctg cagcggcagc gaacttggac agcgcgcagt 541 ccccggggcc atcctggccg gcagcgtatg gcgccccact ccgggaggac tggaatggct 601 acgcgcccgg aggcgccgcg gccgccgcca acgccgtggc tcacggcctc aacggtggct 661 ccccggccgc agccatgggc tacagcagcc ccgcagacta ccatccgcac caccacccgc 721 atcaccaccc gcaccacccg gccgccgcgc cttcctgcgc ttctgggctg ctgcaaacgc 781 tcaaccccgg ccctcctggg cccgccgcca ccgctgccgc cgagcagctg tctcccggcg 841 gccagcggcg gaacctgtgc gagtggatgc ggaagccggc gcagcagtcc ctcggcagcc 901 aagtgaaaac caggacgaaa gacaaatatc gagtggtgta cacggaccac cagcggctgg 961 agctggagaa ggagtttcac tacagtcgct acatcaccat ccggaggaaa gccgagctag 1021 ccgccacgct ggggctctct gagaggcagg ttaaaatctg gtttcagaac cgcagagcaa 1081 aggagaggaa aatcaacaag aagaagttgc agcagcaaca gcagcagcag ccaccacagc 1141 cgcctccgcc gccaccacag cctccccagc ctcagccagg tcctctgaga agtgtcccag 1201 agcccttgag tccggtgtct tccctgcaag cctcagtgtc tggctctgtc cctggggttc 1261 tggggccaac tgggggggtg ctaaacccca ccgtcaccca gtgacccacc gggttctgca 1321 gcggcagagc aattccaggc tgagccatga ggagcgtgga ctctgctaga ctcctcagga 1381 gagacccctc ccctcccacc cacagccata gacctacaga cctggctctc agaggaaaaa 1441 tgggagccag gagtaagaca agtgggattt ggggcctcaa gaaatatact ctcccagatt 1501 tttacttttt cccatctggc tttttctgcc actgaggaga cagaaagcct ccgctgggct 1561 tcattccgga ctggcagaag cattgcctgg actgaccaca ccaaccaggc cttcatcctc 1621 ctccccagct cttctcttcc tagatctgca ggctgcacct ctggctagag ccgaggggag 1681 agagggactc aagggaaagg caagcttgag gccaagatgg ctgctgcctg ctcatggccc 1741 tcggaggtcc agctgggcct cctgcctccg ggcaggcaag gtttacactg cggaagccaa 1801 aggcagctaa gatagaaagc tggactgacc aaagactgca gaacccccag gtggcctgcg 1861 tcttttttct cttcccttcc cagaccagga aaggcttggc tggtgtatgc acagggtgtg 1921 gtatgagggg gtggttattg gactccaggc ctgaccaggg ggcccgaaca gggacttgtt 1981 tagagagcct gtcaccagag cttctctggg ctgaatgtat gtcagtgcta taaatgccag 2041 agccaacctg gacttcctgt cattttcaca atcttggggc tgatgaagaa gggggtgggg 2101 ggagtttgtg ttgttgttgc tgctgtttgg gttgttggtc tgtgtaacat ccaagccaga 2161 gtttttaaag ccttctggat ccatgggggg agaagtgata tggtgaaggg aagtggggag 2221 tatttgaaca cagttgaatt ttttctaaaa agaaaaagag ataaatgagc tttccagatt 2281 tcagattctg tatttatctt cagattttgt ctgcaactat tttttatttt ttaaagaaat

2341 gaaatatctt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa

[0081] Por "polipeptídeo CYP3A7" ou "citocromo P450" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_000756.3 e tendo atividade mono-oxigenase. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_000756.3 é mostrada abaixo: 1 MDLIPNLAVE TWLLLAVSLI LLYLYGTRTH GLFKKLGIPG PTPLPFLGNA LSFRKGYWTF 61 DMECYKKYRK VWGIYDCQQP MLAITDPDMI KTVLVKECYS VFTNRRPFGP VGFMKNAISI 121 AEDEEWKRIR SLLSPTFTSG KLKEMVPIIA QYGDVLVRNL RREAETGKPV TLKHVFGAYS 181 MDVITSTSFG VSIDSLNNPQ DPFVENTKKL LRFNPLDPFV LSIKVFPFLT PILEALNITV 241 FPRKVISFLT KSVKQIKEGR LKETQKHRVD FLQLMIDSQN SKDSETHKAL SDLELMAQSI 301 IFIFAGYETT SSVLSFIIYE LATHPDVQQK VQKEIDTVLP NKAPPTYDTV LQLEYLDMVV 361 NETLRLFPVA MRLERVCKKD VEINGMFIPK GVVVMIPSYV LHHDPKYWTE PEKFLPERFS 421 KKNKDNIDPY IYTPFGSGPR NCIGMRFALV NMKLALVRVL QNFSFKPCKE TQIPLKLRFG 481 GLLLTEKPIV LKAESRDETV SGA

[0082] Por "polinucleotídeo CYP3A7" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CYP3A7 ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica de AFP exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_000765.4. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_000765.4 é reproduzida abaixo: 1 aatcactgct gtgcagggca ggaaagctcc acacacacag cccagcaaac agcagcacgc 61 tgctgaaaaa aagactcaga ggagagagat aaggaaggaa agtagtgatg gatctcatcc 121 caaacttggc cgtggaaacc tggcttctcc tggctgtcag cctgatactc ctctatctat 181 atggaacccg tacacatgga ctttttaaga agcttggaat tccagggccc acacctctgc 241 cttttttggg aaatgctttg tccttccgta agggctattg gacgtttgac atggaatgtt 301 ataaaaagta tagaaaagtc tggggtattt atgactgtca acagcctatg ctggctatca 361 cagatcccga catgatcaaa acagtgctag tgaaagaatg ttattctgtc ttcacaaacc 421 ggaggccttt cgggccagtg ggatttatga aaaatgccat ctctatagct gaggatgaag 481 aatggaagag aatacgatca ttgctgtctc caacattcac cagcggaaaa ctcaaggaga 541 tggtccctat cattgcccag tatggagatg tgttggtgag aaatctgagg cgggaagcag 601 agacaggcaa gcctgtcacc ttgaaacacg tctttggggc ctacagcatg gatgtgatca 661 ctagcacatc atttggagtg agcatcgact ctctcaacaa tccacaagac ccctttgtgg 721 aaaacaccaa gaagctttta agatttaatc cattagatcc attcgttctc tcaataaaag 781 tctttccatt ccttacccca attcttgaag cattaaatat cactgtgttt ccaagaaaag 841 ttataagttt tctaacaaaa tctgtaaaac agataaaaga aggtcgcctc aaagagacac

901 aaaagcaccg agtggatttc cttcagctga tgattgactc tcagaattca aaagactctg 961 agacccacaa agctctgtct gatctggagc tcatggccca atcaattatc tttatttttg 1021 ctggctatga aaccacgagc agtgttctct ccttcattat atatgaactg gccactcacc 1081 ctgatgtcca gcagaaagtg cagaaggaaa ttgatacagt tttacccaat aaggcaccac 1141 ccacctatga tactgtgcta cagttggagt atcttgacat ggtggtgaat gaaacactca 1201 gattattccc agttgctatg agacttgaga gggtctgcaa aaaagatgtt gaaatcaatg 1261 ggatgtttat tcccaaaggg gtggtggtga tgattccaag ctatgttctt catcatgacc 1321 caaagtactg gacagagcct gagaagttcc tccctgaaag gttcagtaaa aagaacaagg 1381 acaacataga tccttacata tacacaccct ttggaagtgg acccagaaac tgcattggca 1441 tgaggtttgc tctcgtgaac atgaaacttg ctctagtcag agtccttcag aacttctcct 1501 tcaaaccttg taaagaaaca cagatccccc tgaaattacg ctttggagga cttcttctaa 1561 cagaaaaacc cattgttcta aaggctgagt caagggatga gaccgtaagt ggagcctgat 1621 ttccctaagg acttctggtt tgctctttaa gaaagctgtg ccccagaaca ccagagacct 1681 caaattactt tacaaataga accctgaaat gaagacgggc ttcatccaat gtgctgcata 1741 aataatcagg gattctgtac gtgcattgtg ctctctcatg gtctgtatag agtgttatac 1801 ttggtaatat agaggagatg accaaatcag tgctggggaa gtagatttgg cttctctgct 1861 tctcatagga ctatctccac cacccccagt tagcaccatt aactcctcct gagctctgat 1921 aacataatta acatttctca ataatttcaa ccacaatcat taataaaaat aggaattatt 1981 ttgatggctc taacagtgac atttatatca tgtgttatat ctgtagtatt ctatagtaag 2041 ctttatatta agcaaatcaa taaaaacctc tttacaaaag taaaaaaaaa aaaaaaaaa

[0083] "Autólogo" se refere a material biológico, por exemplo, células, tecidos, ilhotas, organoides ou organoides semelhantes a ilhotas autólogos, que são obtidos ou derivados do mesmo indivíduo, sujeito ou paciente. A título de exemplo, os transplantes autólogos (por exemplo, células, tecidos, órgãos, ilhotas, organoides ou organoides semelhantes a ilhotas doadores) envolvem um indivíduo, sujeito ou paciente como doador e receptor. "Singeneico" se refere a células, tecidos, órgãos, ilhotas, organoides, organoides semelhantes a ilhotas ou organismos (ou outro material biológico) que são geneticamente semelhantes ou idênticos (e da mesma espécie) e, portanto, são imunologicamente compatíveis. O material biológico do doador singênico é tipicamente tão intimamente relacionado que o transplante não provoca uma resposta imunológica no receptor. "Alogênico" se refere a material biológico, por exemplo, células alogênicas de doador, tecidos, órgãos, ilhotas, organoides ou organoides semelhantes a ilhotas, que são geneticamente diferentes do receptor. O material biológico alogênico é normalmente obtido ou derivado de indivíduos da mesma espécie. Além disso, o material biológico alogênico pode ser de um doador não relacionado ou de um doador compatível com o(s) tipo(s) de antígeno de histocompatibilidade de MHC ou HLA com o do receptor.

"Xenogênico" se refere a material biológico (por exemplo, células, tecidos, órgãos, ilhotas, organoides ou organoides semelhantes a ilhotas) que são derivados ou obtidos de indivíduos de uma espécie diferente. A título de exemplo, células autólogas, singênicas, alogênicas ou xenogênicas, tecidos, órgãos, ilhotas, organoides ou organoides semelhantes a ilhotas podem ser usados para transplante ou implante, particularmente, aqueles gerados pelos métodos que envolvem tratamento com IFN (por exemplo, tratamento com IFN MPS) como neste documento descrito para produzir material biológico de longo prazo, imune evasivo, transplantado ou implantado. Em uma modalidade, tal material biológico é obtido ou gerado a partir de um doador vivo (indivíduo, sujeito ou organismo). Em uma modalidade, tal material biológico é obtido ou gerado a partir de um doador não vivo, por exemplo, ilhotas cadavéricas humanas ou ilhotas cadavéricas de doador compatível.

[0084] Tal como neste documento utilizado, o termo "transportador" se refere a um diluente, excipiente, tampão ou veículo fisiologicamente aceitável com o qual uma composição (por exemplo, uma composição fisiologicamente ou farmaceuticamente aceitável), por exemplo, compreendendo uma célula, ilhota, organoide semelhante a uma ilhota, ou organoide, pode ser administrado a um indivíduo ou no qual pode ser armazenado. Os veículos farmacêuticos e farmaceuticamente aceitáveis incluem líquidos estéreis, tais como meio, solução salina, tampões e semelhantes. Em modalidades, os veículos fisiologicamente aceitáveis são usados em composições farmacêuticas que são administradas ou transplantadas em um indivíduo, incluindo, mas não se limitando a, um indivíduo ou paciente humano. Em algumas modalidades, água ou soluções salinas aquosas e soluções aquosas de dextrose e glicerol podem ser empregadas como veículos, particularmente para soluções injetáveis. Os veículos farmacêuticos (e composições farmacêuticas) adequados são conhecidos e utilizados pelos profissionais da área e são descritos em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20ª ed.), Ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000, e suas edições posteriores.

[0085] Por "fragmento" entende-se uma porção de um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico. Esta porção contém pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de todo o comprimento da molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo de referência. Um fragmento pode conter 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 nucleotídeos ou aminoácidos.

[0086] Tal como utilizado neste documento, o termo "resposta imunológica" se refere à resposta do sistema imunológico de um indivíduo ou reação a um ou mais antígenos (por exemplo, uma proteína ou peptídeo imunogênico) e/ou os epítopos dos antígenos, reconhecidos pelo sistema imunológico como estrangeiro, alogênico ou heterólogo. As respostas imunes incluem ambas as respostas imunes mediadas por células (ou seja, respostas mediadas por células T efetoras, como células T específicas ou não específicas para antígenos, como células T CD8+, células Th1, células Th2 e células Th17), bem como respostas imunes humorais (isto é, respostas caracterizadas pela ativação de células B e a produção de anticorpos específicos para o antígeno). O termo "resposta imune" abrange tanto as respostas imunes inatas a um antígeno ou imunógeno, bem como as respostas de memória que são um resultado da imunidade adquirida e podem envolver células B ou células T, ou ambas.

[0087] Por "proteína de ponto de verificação imunológico" ou "molécula de ponto de verificação imunológico", ou simplesmente, "proteína ou molécula de ponto de verificação" significa uma proteína ou molécula que pode induzir ou impedir a ativação de células T, ou um processo específico em uma via celular ou do sistema imunológico, por exemplo, para evitar erros ou uma atividade ou condição anormal ou patológica.

Em uma resposta imune, a interação crucial entre as células apresentadoras de antígeno (APCs) e as células T é rigidamente regulada por um 'modelo de três sinais': (1)

exibição de um complexo de superfície que consiste em um antígeno ligado a uma molécula de proteína de classe I ou

II (MHC I ou II) do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) para um receptor de célula T

(TCR) em uma célula T (CD8+ ou CD4+); (2) coestimulação por proteínas de ponto de verificação imunológico e (3)

citocinas.

As proteínas de ponto de verificação imunológico compreendem proteínas coestimulatórias e inibitórias que podem induzir ou inibir a ativação de células T.

As células

T virgens (naive) que apenas recebem o sinal 1 sem o sinal coestimulatório 2 tornam-se anérgicas ou morrem por apoptose.

O envolvimento de pares de ligante/receptor coestimulatório desencadeia um acúmulo de receptores e complexos de proteínas no centro da sinapse imunológica,

que então amplifica e aumenta a duração da sinalização de

TCR (Wulfing, C. e Davis, MM, 1998, Science, 282: 2266 a

2269). O ambiente de citocinas, sinal 3, induz então células T CD4+ virgens a se diferenciarem em vários subconjuntos de células T, como células T auxiliares (Th)1, células Th2, células Th17 e células T regulatórias (Tregs), cada uma das quais produz e libera um conjunto distinto de citocinas após ativação (Foks, A.C. e Kuiper, J., 2017, Br.

J. Pharmacol., 174: 3940 a 3955).

[0088] O sistema imunológico fornece uma grande variedade de proteínas de ponto de verificação imunológico estimulantes e inibitórias (sinal 2), e cada via tem seu próprio efeito exclusivo sobre o destino de células imunológicas individuais. A sinalização por meio de proteínas de ponto de verificação imunológico estimulante pode promover a sobrevivência celular, progressão do ciclo celular e diferenciação em células efetoras e de memória, enquanto a sinalização de proteína de ponto de verificação imunológico inibitória pode encerrar esses processos direta ou indiretamente pela indução de Tregs. A coestimulação pode ser fornecida em cis, ou seja, ambos os sinais 1 e 2 são fornecidos pelo mesmo APC, ou em trans, ou seja, o sinal 2 é fornecido por um APC diferente ou 'observador' do sinal 1 (Roska, AK e Lipsky, PE , 1985, J. Immunol., 135: 2953 a 2961; Liu, Y. e Janeway, CA, Jr., 1992, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 89: 3845 a 3849; Ding, L. e Shevach, EM, 1994, Eur. J. Immunol., 24: 859 a 866).

[0089] As proteínas de ponto de verificação são reguladoras do sistema imunológico e frequentemente são ligadas ou interagem com ligantes (ligantes cognatos), que podem causar um determinado efeito, por exemplo, estimulação celular, anergia ou apoptose. Em uma modalidade, a proteína de ponto de verificação imunológico é aquela que se liga a um ligante cognato (por exemplo, um ligante de receptor) em uma superfície de célula imune, por exemplo, um receptor de superfície de célula T. Em uma modalidade específica, a proteína de ponto de verificação imunológico é PD-L1 ou uma porção de ligação da mesma, em que o ligante cognato de PD-L1 é PD-1 expresso na superfície das células T. Em uma modalidade, a proteína de ponto de verificação é o domínio extracelular da proteína de ponto de verificação.

[0090] O termo "ligante cognato" se refere ao parceiro de ligação específico, membro de ligação ou ligante com o qual uma proteína de ponto de verificação imunológico interage especificamente ou com o qual se liga especificamente. Por exemplo, um ligante específico ao qual uma proteína receptora se liga ou com o qual interage é um "ligante cognato" para essa proteína receptora. Da mesma forma, a proteína receptora é um ligante cognato para uma molécula de ligando ou proteína específica.

[0091] Por "expressão constitutiva" entende-se a expressão de um gene que é transcrito continuamente em comparação com um gene facultativo que é transcrito apenas quando necessário. Os genes expressos constitutivamente são transcritos de maneira contínua, com controle limitado ao que está diretamente associado ao estado metabólico de uma célula, tecido ou organismo. O nível de expressão de um gene expresso constitutivamente pode ser modificado, por exemplo, via modificação pós-transcricional ou pós- tradução. Em uma modalidade, o gene é PD-L1 que codifica o polipeptídeo PD-L1.

[0092] “Detectar” se refere à identificação da presença, ausência ou quantidade do analito a ser detectado.

[0093] Por "marcador detectável" entende-se uma composição que, quando ligada a uma molécula de interesse, torna a última detectável, através de meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos ou químicos. Por exemplo, marcadores úteis incluem isótopos radioativos, contas magnéticas, contas metálicas, partículas coloidais, corantes fluorescentes, reagentes densos de elétrons, enzimas (por exemplo, como comumente usado em um ELISA), biotina, digoxigenina ou haptenos.

[0094] “Diferenciação” se refere ao processo de desenvolvimento do comprometimento com a linhagem. A diferenciação pode ser testada medindo um aumento em um ou mais marcadores específicos de células em relação à sua expressão em uma célula de controle indiferenciada correspondente. Uma "linhagem" se refere a uma via de desenvolvimento celular, na qual células precursoras ou "progenitoras" sofrem mudanças fisiológicas progressivas para se tornarem um tipo de célula especificado com uma função característica. Em algumas modalidades, o tipo de célula é uma célula beta. Em algumas modalidades, o tipo de célula é uma célula alfa, célula delta ou célula de duto.

Em algumas outras modalidades, o tipo de célula é um hepatócito. Em ainda outras modalidades, o tipo de célula é um cardiomiócito. Em algumas modalidades, o tipo de célula é uma célula intestinal. A diferenciação ocorre em estágios, em que as células gradualmente se tornam mais especificadas até atingirem a maturidade total, o que também é conhecido como "diferenciação terminal". Uma "célula diferenciada terminalmente" é uma célula que se comprometeu com uma linhagem específica e atingiu o estágio final de diferenciação (ou seja, uma célula que amadureceu totalmente). Em algumas modalidades, uma célula-tronco de pluripotência induzida (iPSC) é diferenciada em uma célula semelhante a beta, uma célula semelhante a alfa, uma célula semelhante a delta ou uma célula semelhante a duto. Em algumas outras modalidades, uma célula-tronco de pluripotência induzida (iPSC) é diferenciada em um hepatócito, cardiomiócito ou célula intestinal.

[0095] Uma “célula desdiferenciada” é uma célula em que o processo de diferenciação foi, pelo menos em algum grau, revertido. A desdiferenciação pode ser testada, por exemplo, identificando uma redução na expressão de um ou mais marcadores específicos de células em relação à sua expressão em uma célula de controle correspondente.

Alternativamente, a desdiferenciação pode ser testada medindo um aumento em um ou mais marcadores tipicamente expressos em uma célula-tronco embrionária, um tipo de célula de pluripotência ou multi-potente, ou expresso em um estágio anterior de desenvolvimento. Em algumas modalidades, a célula desdiferenciada é uma célula-tronco de pluripotência induzida (iPSC). Em certas modalidades, a célula desdiferenciada é uma célula-tronco de pluripotência induzida por humanos (iPSC).

[0096] Por "doença" entende-se qualquer condição ou distúrbio que afete adversamente, danifique ou interfira com a função normal de uma célula, tecido ou órgão, ou uma parte do corpo, como autoimunidade ou doença autoimune.

Exemplos de doenças incluem diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 e câncer pancreático. Uma doença autoimune é aquela em que o corpo produz células imunes (por exemplo, células T efetoras ou células NK) e/ou anticorpos produzidos por células B que reagem imunologicamente contra (atacam) seus próprios tecidos ou órgãos (ou transplantes ou implantes de tecidos ou órgãos), levando à deterioração e, em alguns casos, à destruição do tecido ou órgão (ou tecido ou transplante ou implante de órgão).

[0097] Por "quantidade eficaz" entende-se a quantidade de um agente terapêutico ou organoide necessária para melhorar os sintomas de uma doença em um indivíduo em relação a um indivíduo não tratado. A quantidade eficaz de um agente terapêutico usado para praticar a presente invenção para o tratamento terapêutico de uma doença varia dependendo da forma de administração, da idade, do peso corporal e da saúde geral do indivíduo. Em última análise, o médico assistente ou veterinário decidirá a quantidade e o regime de dosagem apropriados. Essa quantidade é referida como uma quantidade "efetiva". Em algumas modalidades, o organoide terapêutico é um organoide de ilhotas pancreáticas. Em algumas outras modalidades, uma quantidade eficaz de um organoide de uma ilhota pancreática é administrada a um indivíduo com diabetes tipo 1 ou tipo 2.

[0098] Por "polipeptídeo ESRRG" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_001230448.1 e tendo atividade de receptor de hormônio nuclear. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_001230448.1 é mostrada abaixo: 1 MSNKDRHIDS SCSSFIKTEP SSPASLTDSV NHHSPGGSSD ASGSYSSTMN GHQNGLDSPP 61 LYPSAPILGG SGPVRKLYDD CSSTIVEDPQ TKCEYMLNSM PKRLCLVCGD IASGYHYGVA 121 SCEACKAFFK RTIQGNIEYS CPATNECEIT KRRRKSCQAC RFMKCLKVGM LKEGVRLDRV 181 RGGRQKYKRR IDAENSPYLN PQLVQPAKKP YNKIVSHLLV AEPEKIYAMP DPTVPDSDIK 241 ALTTLCDLAD RELVVIIGWA KHIPGFSTLS LADQMSLLQS AWMEILILGV VYRSLSFEDE 301 LVYADDYIMD EDQSKLAGLL DLNNAILQLV KKYKSMKLEK EEFVTLKAIA LANSDSMHIE 361 DVEAVQKLQD VLHEALQDYE AGQHMEDPRR AGKMLMTLPL LRQTSTKAVQ HFYNIKLEGK 421 VPMHKLFLEM LEAKV

[0099] Por "polinucleotídeo ESRRG" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo ESRRG ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica ESRRG exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_001243519.1. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_001243519.1 é reproduzida abaixo: 1 aagctccaat cggggcttta agtccttgat taggagagtg tgagagcttt ggtcccaact 61 ggctgtgcct ataggcttgt cactaggaga acatttgtgt taattgcact gtgctctgtc 121 aaggaaactt tgatttatag ctggggtgca caaataatgg ttgccggtcg cacatggatt 181 cggtagaact ttgccttcct gaatcttttt ccctgcacta cgaggaagag tagacttgaa 241 tgagacctgc ctcatcagtc atgggatcat agtgtcacag atggaaaagc aactatcagc 301 tgaattgtac tgaactacac acttggctaa ttcatcttat tgctctacac atctaaagga 361 aggctcattc tgttcttgga gtctagacag catcaggagt tgggctcagt gaacaaaact 421 ttaatgtcta gagcatttat gagggtttta atgattggaa aatctatcct gagaatgtgg 481 tcaccatatg tgacagcctt gctttctatc ttgtcttcag tttctggggc ttctctgcag 541 aatgtcaaac aaagatcgac acattgattc cagctgttcg tccttcatca agacggaacc 601 ttccagccca gcctccctga cggacagcgt caaccaccac agccctggtg gctcttcaga 661 cgccagtggg agctacagtt caaccatgaa tggccatcag aacggacttg actcgccacc 721 tctctaccct tctgctccta tcctgggagg tagtgggcct gtcaggaaac tgtatgatga 781 ctgctccagc accattgttg aagatcccca gaccaagtgt gaatacatgc tcaactcgat 841 gcccaagaga ctgtgtttag tgtgtggtga catcgcttct gggtaccact atggggtagc 901 atcatgtgaa gcctgcaagg cattcttcaa gaggacaatt caaggcaata tagaatacag 961 ctgccctgcc acgaatgaat gtgaaatcac aaagcgcaga cgtaaatcct gccaggcttg 1021 ccgcttcatg aagtgtttaa aagtgggcat gctgaaagaa ggggtgcgtc ttgacagagt 1081 acgtggaggt cggcagaagt acaagcgcag gatagatgcg gagaacagcc catacctgaa 1141 ccctcagctg gttcagccag ccaaaaagcc atataacaag attgtctcac atttgttggt 1201 ggctgaaccg gagaagatct atgccatgcc tgaccctact gtccccgaca gtgacatcaa 1261 agccctcact acactgtgtg acttggccga ccgagagttg gtggttatca ttggatgggc 1321 gaagcatatt ccaggcttct ccacgctgtc cctggcggac cagatgagcc ttctgcagag 1381 tgcttggatg gaaattttga tccttggtgt cgtataccgg tctctttcgt ttgaggatga 1441 acttgtctat gcagacgatt atataatgga cgaagaccag tccaaattag caggccttct 1501 tgatctaaat aatgctatcc tgcagctggt aaagaaatac aagagcatga agctggaaaa 1561 agaagaattt gtcaccctca aagctatagc tcttgctaat tcagactcca tgcacataga 1621 agatgttgaa gccgttcaga agcttcagga tgtcttacat gaagcgctgc aggattatga 1681 agctggccag cacatggaag accctcgtcg agctggcaag atgctgatga cactgccact 1741 cctgaggcag acctctacca aggccgtgca gcatttctac aacatcaaac tagaaggcaa 1801 agtcccaatg cacaaacttt ttttggaaat gttggaggcc aaggtctgac taaaagctcc 1861 ctgggccttc ccatccttca tgttgaaaaa gggaaaataa acccaagagt gatgtcgaag

1921 aaacttagag tttagttaac aacatcaaaa atcaacagac tgcactgata atttagcagc 1981 aagactatga agcagctttc agattcctcc ataggttcct gatgagtttc tttctacttt 2041 ctccatcatc ttctttcctc tttcttccca catttctctt tctctttatt ttttctcctt 2101 ttcttctttc acctccctta tttctttgct tctttcattc ctagttccca ttctccttta 2161 ttttcttccc gtctgcctgc cttctttctt ttctttacct actctcattc ctctcttttc 2221 tcatccttcc ccttttttct aaatttgaaa tagctttagt ttaaaaaaaa atcctccctt 2281 ccccctttcc tttccctttc tttccttttt ccctttcctt ttccctttcc tttcctttcc 2341 tcttgacctt ctttccatct ttctttttct tccttctgct gctgaacttt taaaagaggt 2401 ctctaactga agagagatgg aagccagccc tgccaaagga tggagatcca taatatggat 2461 gccagtgaac ttattgtgaa ccatactgtc cccaatgact aaggaatcaa agagagagaa 2521 ccaacgttcc taaaagtaca gtgcaacata tacaaattga ctgagtgcag tattagattt 2581 catgggagca gcctctaatt agacaactta agcaacgttg catcggctgc ttcttatcat 2641 tgcttttcca tctagatcag ttacagccat ttgattcctt aattgttttt tcaagtcttc 2701 caggtatttg ttagtttagc tactatgtaa ctttttcagg gaatagttta agctttattc 2761 attcatgcaa tactaaagag aaataagaat actgcaattt tgtgctggct ttgaacaatt 2821 acgaacaata atgaaggaca aatgaatcct gaaggaagat ttttaaaaat gttttgtttc 2881 ttcttacaaa tggagatttt tttgtaccag ctttaccact tttcagccat ttattaatat 2941 gggaatttaa cttactcaag caatagttga agggaaggtg catattatca cggatgcaat 3001 ttatgttgtg tgccagtctg gtcccaaaca tcaatttctt aacatgagct ccagtttacc 3061 taaatgttca ctgacacaaa ggatgagatt acacctacag tgactctgag tagtcacata 3121 tataagcact gcacatgaga tatagatccg tagaattgtc aggagtgcac ctctctactt 3181 gggaggtaca attgccatat gatttctagc tgccatggtg gttaggaatg tgatactgcc 3241 tgtttgcaaa gtcacagacc ttgcctcaga aggagctgtg agccagtatt catttaagag 3301 gcaataaggc aaatgccaga attaaaaaaa aaaatcatca aagacagaaa atgcctgacc 3361 aaattctaaa acctaatcca tataagttta ttcatttagg aatgttcgtt taaattaatc 3421 tgcagttttt accaagagct aagccaatat atgtgctttt caaccagtat tgtcacagca 3481 tgaaagtcaa gtcaggttcc agactgttaa gaggtgtaat ctaatgaaga aatcaattag 3541 atgccccgaa atctacagtc gctgaataac caataaacag taacctccat caaatgctat 3601 accaatggac cagtgttagt agctgctccc tgtattatgt gaacagtctt attctatgta 3661 cacagatgta attaaaattg taatcctaac aaacaaaaga aatgtagttc agcttttcaa 3721 tgtttcatgt ttgctgtgct tttctgaatt ttatgttgca ttcaaagact gttgtcttgt 3781 tcttgtggtg tttggattct tgtggtgtgt gcttttagac acagggtaga attagagaca 3841 atattggatg tacaattcct caggagacta cagtagtata ttctattcct taccagtaat 3901 aaggttcttc ctaataataa ttaagagatt gaaactccaa acaagtattc attatgaaca 3961 gatacacatc aaaatcataa taatattttc aaaacaagga ataatttctc taatggttta 4021 ttatagaata ccaatgtata gcttagaaat aaaactttga atatttcaag aatatagata 4081 agtctaattt ttaaatgctg tatatatggc tttcactcaa tcatctctca gatgttgtta 4141 ttaactcgct ctgtgttgtt gcaaaacttt ttggtgcaga ttcgtttcca aaactattgc 4201 tactttgtgt gctttaaaca aaataccttg ggttgatgaa acatcaaccc agtgctagga 4261 atactgtgta tctatcatta gctatatggg actatattgt agattgtggt ttctcagtag 4321 agaagtgact gtagtgtgat tctagataaa tcatcattag caattcattc agatggtcaa 4381 taacttgaaa tttatagctg tgataggagt tcagaaattg gcacatccct ttaaaaataa 4441 caacagaaaa tacaactcct gggaaaaaag gtgctgattc tataagatta tttatatatg 4501 taagtgttta aaaagattat tttccagaaa gtttgtgcag ggtttaagtt gctactattc 4561 aactacacta tatataaata aaatatatac aatatataca ttgttttcac tgtatcacat 4621 taaagtactt gggcttcaga agtaagagcc aaccaactga aaacctgaga tggagatatg 4681 ttcaaagaat gagatacaat tttttagttt tcagtttaag taactctcag cattacaaaa 4741 gagtaagtat ctcacaaata ggaaataaaa ctaaaacgtg gatttaaaaa gaactgcacg 4801 ggctttaggg taaatgctca tcttaaacct cactagaggg aagtcttctc aagtttcaag 4861 caagaccatt tacttaatgt gaagttttgg aaagttataa aggtgtatgt tttagccata 4921 tgattttaat tttaattttg cttcttttag gttcgttctt atttaaagca atatgattgt 4981 gtgactcctt gtagttacac ttgtgtttca atcagatcag attgttgtat ttattccact 5041 attttgcatt taaatgataa cataaaagat ataaaaaatt taaaactgct atttttctta 5101 tagaagagaa aatgggtgtt ggtgattgta ttttaattat ttaagcgtct ctgtttacct 5161 gcctaggaaa acattttatg gcagtcttat gtgcaaagat cgtaaaagga caaaaaattt 5221 aaactgctta taataatcca ggagttgcat tatagccagt agtaaaaata ataataataa 5281 taataaaacc atgtctatag ctgtagatgg gcttcacatc tgtaaagcaa tcaattgtat 5341 atttttgtga tgtgtaccat actgtgtgct ccagcaaatg tccatttgtg taaatgtatt

5401 tattttatat tgtatatatt gttaaatgca aaaaggagat atgattctgt aactccaatc 5461 agttcagatg tgtaactcaa attattatgc ctttcaggat gatggtagag caatattaaa 5521 caagcttcca cttttgactg ctaaaaaaaa aaaaaaaaa

[00100] Tal como utilizado neste documento, "endócrino" se refere à secreção de um agente (por exemplo, um hormônio) na corrente sanguínea. “Exócrino” se refere à secreção de um agente em uma superfície epitelial por meio de um duto.

[00101] Por "fragmento" entende-se uma porção de um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico. Esta porção contém pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de todo o comprimento da molécula de ácido nucleico de referência ou polipeptídeo. Um fragmento pode conter 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 nucleotídeos ou aminoácidos.

[00102] Por "polipeptídeo FOXA2" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_068556.2 e tendo atividade de fator de transcrição. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_068556.2 é mostrada abaixo: 1 MHSASSMLGA VKMEGHEPSD WSSYYAEPEG YSSVSNMNAG LGMNGMNTYM SMSAAAMGSG 61 SGNMSAGSMN MSSYVGAGMS PSLAGMSPGA GAMAGMGGSA GAAGVAGMGP HLSPSLSPLG 121 GQAAGAMGGL APYANMNSMS PMYGQAGLSR ARDPKTYRRS YTHAKPPYSY ISLITMAIQQ 181 SPNKMLTLSE IYQWIMDLFP FYRQNQQRWQ NSIRHSLSFN DCFLKVPRSP DKPGKGSFWT 241 LHPDSGNMFE NGCYLRRQKR FKCEKQLALK EAAGAAGSGK KAAAGAQASQ AQLGEAAGPA 301 SETPAGTESP HSSASPCQEH KRGGLGELKG TPAAALSPPE PAPSPGQQQQ AAAHLLGPPH 361 HPGLPPEAHL KPEHHYAFNH PFSINNLMSS EQQHHHSHHH HQPHKMDLKA YEQVMHYPGY 421 GSPMPGSLAM GPVTNKTGLD ASPLAADTSY YQGVYSRPIM NSS

[00103] Por "polinucleotídeo FOXA2" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo FOXA2 ou fragmento do mesmo. Uma sequência de polinucleotídeo FOXA2 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_021784.4. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_021784.4 é reproduzida abaixo: 1 cccgcccact tccaactacc gcctccggcc tgcccaggga gagagaggga gtggagccca 61 gggagaggga gcgcgagaga gggagggagg aggggacggt gctttggctg actttttttt 121 aaaagagggt gggggtgggg ggtgattgct ggtcgtttgt tgtggctgtt aaattttaaa 181 ctgccatgca ctcggcttcc agtatgctgg gagcggtgaa gatggaaggg cacgagccgt 241 ccgactggag cagctactat gcagagcccg agggctactc ctccgtgagc aacatgaacg 301 ccggcctggg gatgaacggc atgaacacgt acatgagcat gtcggcggcc gccatgggca 361 gcggctcggg caacatgagc gcgggctcca tgaacatgtc gtcgtacgtg ggcgctggca 421 tgagcccgtc cctggcgggg atgtcccccg gcgcgggcgc catggcgggc atgggcggct 481 cggccggggc ggccggcgtg gcgggcatgg ggccgcactt gagtcccagc ctgagcccgc 541 tcggggggca ggcggccggg gccatgggcg gcctggcccc ctacgccaac atgaactcca 601 tgagccccat gtacgggcag gcgggcctga gccgcgcccg cgaccccaag acctacaggc 661 gcagctacac gcacgcaaag ccgccctact cgtacatctc gctcatcacc atggccatcc 721 agcagagccc caacaagatg ctgacgctga gcgagatcta ccagtggatc atggacctct 781 tccccttcta ccggcagaac cagcagcgct ggcagaactc catccgccac tcgctctcct 841 tcaacgactg tttcctgaag gtgccccgct cgcccgacaa gcccggcaag ggctccttct 901 ggaccctgca ccctgactcg ggcaacatgt tcgagaacgg ctgctacctg cgccgccaga 961 agcgcttcaa gtgcgagaag cagctggcgc tgaaggaggc cgcaggcgcc gccggcagcg 1021 gcaagaaggc ggccgccgga gcccaggcct cacaggctca actcggggag gccgccgggc 1081 cggcctccga gactccggcg ggcaccgagt cgcctcactc gagcgcctcc ccgtgccagg 1141 agcacaagcg agggggcctg ggagagctga aggggacgcc ggctgcggcg ctgagccccc 1201 cagagccggc gccctctccc gggcagcagc agcaggccgc ggcccacctg ctgggcccgc 1261 cccaccaccc gggcctgccg cctgaggccc acctgaagcc ggaacaccac tacgccttca 1321 accacccgtt ctccatcaac aacctcatgt cctcggagca gcagcaccac cacagccacc 1381 accaccacca accccacaaa atggacctca aggcctacga acaggtgatg cactaccccg 1441 gctacggttc ccccatgcct ggcagcttgg ccatgggccc ggtcacgaac aaaacgggcc 1501 tggacgcctc gcccctggcc gcagatacct cctactacca gggggtgtac tcccggccca 1561 ttatgaactc ctcttaagaa gacgacggct tcaggcccgg ctaactctgg caccccggat 1621 cgaggacaag tgagagagca agtgggggtc gagactttgg ggagacggtg ttgcagagac 1681 gcaagggaga agaaatccat aacaccccca ccccaacacc cccaagacag cagtcttctt 1741 cacccgctgc agccgttccg tcccaaacag agggccacac agatacccca cgttctatat 1801 aaggaggaaa acgggaaaga atataaagtt aaaaaaaagc ctccggtttc cactactgtg 1861 tagactcctg cttcttcaag cacctgcaga ttctgatttt tttgttgttg ttgttctcct 1921 ccattgctgt tgttgcaggg aagtcttact taaaaaaaaa aaaaaatttt gtgagtgact 1981 cggtgtaaaa ccatgtagtt ttaacagaac cagagggttg tactattgtt taaaaacagg 2041 aaaaaaaata atgtaagggt ctgttgtaaa tgaccaagaa aaagaaaaaa aaagcattcc 2101 caatcttgac acggtgaaat ccaggtctcg ggtccgatta atttatggtt tctgcgtgct 2161 ttatttatgg cttataaatg tgtattctgg ctgcaagggc cagagttcca caaatctata 2221 ttaaagtgtt atacccggtt ttatcccttg aatcttttct tccagatttt tcttttcttt 2281 acttggctta caaaatatac aggcttggaa attatttcaa gaaggaggga gggataccct 2341 gtctggttgc aggttgtatt ttattttggc ccagggagtg ttgctgtttt cccaacattt 2401 tattaataaa attttcagac ataaaaaa

[00104] Por "polipeptídeo GATA6" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_005248.2 e tendo atividade de fator de transcrição. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_005248.2 é mostrada abaixo: 1 MALTDGGWCL PKRFGAAGAD ASDSRAFPAR EPSTPPSPIS SSSSSCSRGG ERGPGGASNC 61 GTPQLDTEAA AGPPARSLLL SSYASHPFGA PHGPSAPGVA GPGGNLSSWE DLLLFTDLDQ 121 AATASKLLWS SRGAKLSPFA PEQPEEMYQT LAALSSQGPA AYDGAPGGFV HSAAAAAAAA 181 AAASSPVYVP TTRVGSMLPG LPYHLQGSGS GPANHAGGAG AHPGWPQASA DSPPYGSGGG 241 AAGGGAAGPG GAGSAAAHVS ARFPYSPSPP MANGAAREPG GYAAAGSGGA GGVSGGGSSL 301 AAMGGREPQY SSLSAARPLN GTYHHHHHHH HHHPSPYSPY VGAPLTPAWP AGPFETPVLH 361 SLQSRAGAPL PVPRGPSADL LEDLSESREC VNCGSIQTPL WRRDGTGHYL CNACGLYSKM 421 NGLSRPLIKP QKRVPSSRRL GLSCANCHTT TTTLWRRNAE GEPVCNACGL YMKLHGVPRP 481 LAMKKEGIQT RKRKPKNINK SKTCSGNSNN SIPMTPTSTS SNSDDCSKNT SPTTQPTASG 541 AGAPVMTGAG ESTNPENSEL KYSGQDGLYI GVSLASPAEV TSSVRPDSWC ALALA

[00105] Por "polinucleotídeo GATA6" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GATA6 ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica KCNK3 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_005257.5. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_005257.5 é reproduzida abaixo: 1 agttccgacc cacagcctgg cacccttcgg cgagcgctgt ttgtttaggg ctcggtgagt 61 ccaatcagga gcccaggctg cagttttccg gcagagcagt aagaggcgcc tcctctctcc 121 tttttattca ccagcagcgc ggcgcagacc ccggactcgc gctcgcccgc tggcgccctc 181 ggcttctctc cgcgcctggg agcaccctcc gccgcggccg ttctccatgc gcagcgcccg 241 cccgaggagc tagacgtcag cttggagcgg cgccggaccg tggatggcct tgactgacgg 301 cggctggtgc ttgccgaagc gcttcggggc cgcgggtgcg gacgccagcg actccagagc 361 ctttccagcg cgggagccct ccacgccgcc ttcccccatc tcttcctcgt cctcctcctg 421 ctcccggggc ggagagcggg gccccggcgg cgccagcaac tgcgggacgc ctcagctcga 481 cacggaggcg gcggccggac ccccggcccg ctcgctgctg ctcagttcct acgcttcgca 541 tcccttcggg gctccccacg gaccttcggc gcctggggtc gcgggccccg ggggcaacct 601 gtcgagctgg gaggacttgc tgctgttcac tgacctcgac caagccgcga ccgccagcaa 661 gctgctgtgg tccagccgcg gcgccaagct gagccccttc gcacccgagc agccggagga 721 gatgtaccag accctcgccg ctctctccag ccagggtccg gccgcctacg acggcgcgcc 781 cggcggcttc gtgcactctg cggccgcggc ggcagcagcc gcggcggcgg ccagctcccc 841 ggtctacgtg cccaccaccc gcgtgggttc catgctgccc ggcctaccgt accacctgca 901 ggggtcgggc agtgggccag ccaaccacgc gggcggcgcg ggcgcgcacc ccggctggcc 961 tcaggcctcg gccgacagcc ctccatacgg cagcggaggc ggcgcggctg gcggcggggc 1021 cgcggggcct ggcggcgctg gctcagccgc ggcgcacgtc tcggcgcgct tcccctactc 1081 tcccagcccg cccatggcca acggcgccgc gcgggagccg ggaggctacg cggcggcggg 1141 cagtgggggc gcgggaggcg tgagcggcgg cggcagtagc ctggcggcca tgggcggccg

1201 cgagccccag tacagctcgc tgtcggccgc gcggccgctg aacgggacgt accaccacca 1261 ccaccaccac caccaccacc atccgagccc ctactcgccc tacgtggggg cgccactgac 1321 gcctgcctgg cccgccggac ccttcgagac cccggtgctg cacagcctgc agagccgcgc 1381 cggagccccg ctcccggtgc cccggggtcc cagtgcagac ctgctggagg acctgtccga 1441 gagccgcgag tgcgtgaact gcggctccat ccagacgccg ctgtggcggc gggacggcac 1501 cggccactac ctgtgcaacg cctgcgggct ctacagcaag atgaacggcc tcagccggcc 1561 cctcatcaag ccgcagaagc gcgtgccttc atcacggcgg cttggattgt cctgtgccaa 1621 ctgtcacacc acaactacca ccttatggcg cagaaacgcc gagggtgaac ccgtgtgcaa 1681 tgcttgtgga ctctacatga aactccatgg ggtgcccaga ccacttgcta tgaaaaaaga 1741 gggaattcaa accaggaaac gaaaacctaa gaacataaat aaatcaaaga cttgctctgg 1801 taatagcaat aattccattc ccatgactcc aacttccacc tcttctaact cagatgattg 1861 cagcaaaaat acttccccca caacacaacc tacagcctca ggggcgggtg ccccggtgat 1921 gactggtgcg ggagagagca ccaatcccga gaacagcgag ctcaagtatt cgggtcaaga 1981 tgggctctac ataggcgtca gtctcgcctc gccggccgaa gtcacgtcct ccgtgcgacc 2041 ggattcctgg tgcgccctgg ccctggcctg agcccacgcc gccaggaggc agggagggct 2101 ccgccgcggg cctcactcca ctcgtgtctg cttttgtgca gcggtccaga cagtggcgac 2161 tgcgctgaca gaacgtgatt ctcgtgcctt tattttgaaa gagatgtttt tcccaagagg 2221 cttgctgaaa gagtgagaga agatggaagg gaagggccag tgcaactggg cgcttgggcc 2281 actccagcca gcccgcctcc ggggcggacc ctgctccact tccagaagcc aggactagga 2341 cctgggcctt gcctgctatg gaatattgag agagattttt taaaaaagat tttgcatttt 2401 gtccaaaatc atgtgcttct tctgatcaat tttggttgtt ccagaatttc ttcatacctt 2461 ttccacatcc agatttcatg tgcgttcatg gagaagatca cttgaggcca tttggtacac 2521 atctctggag gctgagtcgg ttcatgaggt ctcttatcaa aaatattact cagtttgcaa 2581 gactgcattg taactttaac atacactgtg actgacgttt ctcaaagttc atattgtgtg 2641 gctgatctga agtcagtcgg aatttgtaaa cagggtagca aacaagatat ttttcttcca 2701 tgtatacaat aattttttta aaaagtgcaa tttgcgttgc agcaatcagt gttaaatcat 2761 ttgcataaga tttaacagca ttttttataa tgaatgtaaa cattttaact taatggtact 2821 taaaataatt taaaagaaaa atgttaactt agacattctt atgcttcttt tacaactaca 2881 tcccatttta tatttccaat tgttaaagaa aaatatttca agaacaaatc ttctctcagg 2941 aaaattgcct ttctctattt gttaagaatt tttatacaag aacaccaata tacccccttt 3001 attttactgt ggaatatgtg ctggaaaaat tgcaacaaca ctttactacc taacggatag 3061 catttgtaaa tactctaggt atctgtaaac actctgatga agtctgtata gtgtgactaa 3121 cccacaggca ggttggttta cattaatttt tttttttgaa tgggatgtcc tatggaaacc 3181 tatttcacca gagttttaaa aataaaaagg gtattgtttt gtcttctgta cagtgagttc 3241 cttccctttt caaagctttc tttttatgct gtatgtgact atagatattc atataaaaca 3301 agtgcacgtg aagtttgcaa aatgctttaa ggccttcctt tcaaagcata gtccttttgg 3361 agccgttttg taccttttat accttggctt atttgaagtt gacacatggg gttagttact 3421 actctccatg tgcattgggg acagttttta taagtgggaa ggactcagta ttattatatt 3481 tgagatgata agcattttgt ttgggaacaa tgcttaaaaa tattccagaa agttcagatt 3541 ttttttcttt gtgaatgaaa tatattctgg cccacgaaca gggcgatttc ctttcagttt 3601 tttccttttg caacgtgcct tgaagtctca aagctcacct gaggttgcag acgttacccc 3661 caacagaaga taggtagaaa tgattccagt ggcctctttg tattttcttc attgttgagt 3721 agatttcagg aaatcaggag gtgtttcaca atacagaatg atggccttta actgtgaaaa 3781 aaaaa

[00106] Por "goma gelana" entende-se um polissacarídeo com uma cadeia linear com uma unidade de repetição que tem qualquer uma das seguintes estruturas moleculares: Goma gelana - forma de alto acila

Goma gelana - forma de baixo acila

[00107] Nas estruturas anteriores, "Ac" se refere a um grupo acetato e "Gly" se refere a um grupo glicerato e "M+" é um cátion monovalente. Em algumas modalidades, a goma gelana é a goma gelana KELCOGEL®.

[00108] "Hibridização" significa ligação de hidrogênio, que pode ser ligação de hidrogênio de Watson- Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversa, entre nucleobases complementares. Por exemplo, adenina e timina são nucleobases complementares que emparelham através da formação de ligações de hidrogênio.

[00109] Por "agente imunossupressor" ou "imunossupressor" entende-se um agente que inibe ou evita uma reação imune, como rejeição, de um órgão transplantado ou implantado, ilhota ou organoide em um indivíduo.

Exemplos de imunossupressores incluem, mas não estão limitados a, basilizimabe, globulina antitimócito, alemtuzumabe, prednisona, azatioprina, micofenolato,

ciclosporina, sirolimus, metotrexato, interferon e tacrolimus.

[00110] Por "célula-tronco de pluripotência induzida" ou "iPSC" entende-se uma célula somática diferenciada que adquire pluripotência pela expressão exógena de um ou mais fatores de transcrição na célula. Uma "célula derivada de iPSC" é uma célula derivada de uma célula-tronco de pluripotência induzida. Uma “célula semelhante a beta derivada de iPSC”, “célula semelhante a alfa derivada de iPSC”, “célula semelhante a delta derivada de iPSC” ou “célula semelhante a duto derivada de iPSC” é uma célula derivada de uma célula-tronco de pluripotência induzida e tem características de uma célula beta, célula alfa, célula delta ou célula de duto, respectivamente.

[00111] Células que expressam o receptor de interferon gama (IFN) (por exemplo, células doadoras), ilhotas, organoides (e as células contidas neles) se referem a células, ilhotas, organoides (e as células contidas neles) que expressam o receptor de IFN em sua superfície em uma quantidade ou nível suficiente para responder a IFN após contato ou exposição a IFN, por exemplo, exposição a IFN MPS de acordo com os métodos descritos neste documento e, por sua vez, para expressar ou regular positivamente a expressão de um gene que codifica uma proteína de ponto de verificação ou uma proteína de ponto de verificação, por exemplo, PD-L1 (proteína marcadora PD-L1). Em uma modalidade, a proteína PD-L1 é expressa na superfície das células (expressão da membrana celular). Em uma modalidade, a expressão ou a regulação positiva da proteína de ponto de verificação, por exemplo, PD-L1 é sustentada, por exemplo, por mais de ou igual a 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou mais. Em uma modalidade, a expressão ou regulação positiva da proteína de ponto de verificação, por exemplo, PD-L1 é sustentada, por exemplo, por mais de ou igual a 7 dias ou mais. (por exemplo, mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6 semanas ou mais). A expressão de PD-L1 ou o nível de expressão de PD-L1 nas células, por exemplo, pode ser detectada ou determinada por qualquer ensaio que seja rotineiramente conhecido ou usado por aquelas pessoas versadas na técnica para detectar ou determinar os níveis de proteínas ou polinucleotídeos, por exemplo, sem limitação, imunoensaio enzimático, fluorescente, quimioluminescente ou eletroquimioluminescente, citometria de fluxo, espectrometria (espectrometria de massa); PCR ou métodos de detecção de RNA ou DNA.

[00112] A exposição intermitente, tal como utilizado neste documento, refere-se à exposição repetida, por exemplo, exposição repetida curta, de células, ilhotas, organoides (organoides semelhantes a ilhotas, por exemplo, organoides semelhantes a ilhotas humanas e as células contidas neles), especialmente de interferon-gama (IFN) células que expressam receptor, ilhotas, organoides (organoides semelhantes a ilhotas e as células contidas neles), a pulsos múltiplos, por exemplo, pulsos repetidos curtos, chamados de estimulação de pulso múltiplo (MPS), de IFN, conforme usado nos protocolos descritos para gerar células imunoprotegidas, ilhotas ou organoides que sobrevivem e têm morte celular reduzida, por exemplo, evitam a detecção imunológica, após o transplante, o implante ou a transferência, conforme descrito neste documento. A duração de cada um dos pulsos repetidos de exposição ao IFN é normalmente um período de tempo curto, como minutos ou algumas horas, em vez de um período de tempo prolongado. A título de exemplo, a exposição ao IFN pode compreender um período de tempo de 0,5 hora, 1 hora, 2 horas ou 3 horas e semelhantes, várias vezes ao longo de um determinado período de tempo ou total, por exemplo, horas (por exemplo, 2, 4, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 144 ou mais horas, ou intervalos entre elas), dias (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14 ou mais dias), ou semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais semanas), conforme descrito neste documento.

[00113] Os termos "isolado", "purificado" ou "biologicamente puro" se referem ao material que está livre em vários graus de componentes que normalmente o acompanham como encontrado em seu estado nativo. "Isolar" denota um grau de separação da fonte original ou arredores.

"Purificar" denota um grau de separação que é maior do que o isolamento. Uma proteína "purificada" ou "biologicamente pura" é suficientemente livre de outros materiais, de modo que quaisquer impurezas não afetem materialmente as propriedades biológicas da proteína ou causem outras consequências adversas. Ou seja, um ácido nucleico ou peptídeo desta invenção é purificado se estiver substancialmente livre de material celular, material viral ou meio de cultura quando produzido por técnicas de DNA recombinante, ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizado. Pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas usando técnicas de química analítica, por exemplo, eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho.

O termo "purificado" pode denotar que um ácido nucleico ou proteína dá origem a essencialmente uma banda em um gel eletroforético. Para uma proteína que pode ser submetida a modificações, por exemplo, fosforilação ou glicosilação, diferentes modificações podem dar origem a diferentes proteínas isoladas, que podem ser purificadas separadamente.

[00114] Por "polinucleotídeo isolado" entende-se um ácido nucleico (por exemplo, um DNA) que está livre dos genes que, no genoma de ocorrência natural do organismo do qual a molécula de ácido nucleico da invenção é derivada, flanqueiam o gene. O termo, portanto, inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor; em um plasmídeo ou vírus que se replica autonomamente; ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto; ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento genômico ou cDNA produzido por PCR ou digestão com endonuclease de restrição) independente de outras sequências. Além disso, o termo inclui uma molécula de RNA que é transcrita de uma molécula de DNA, bem como um DNA recombinante que faz parte de um gene híbrido que codifica uma sequência polipeptídica adicional.

[00115] Por um "polipeptídeo isolado" entende-se um polipeptídeo da invenção que foi separado dos componentes que o acompanham naturalmente. Normalmente, o polipeptídeo é isolado quando está pelo menos 60%, em peso, livre de proteínas e moléculas orgânicas de ocorrência natural com as quais está naturalmente associado. A preparação pode ser pelo menos 75%, pelo menos 90% e pelo menos 99%, em peso, de um polipeptídeo da invenção. Um polipeptídeo isolado da invenção pode ser obtido, por exemplo, por extração de uma fonte natural, por expressão de um ácido nucleico recombinante que codifica tal polipeptídeo; ou sintetizando quimicamente a proteína. A pureza pode ser medida por qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida ou por análise de HPLC.

[00116] Por "polipeptídeo KCNK3" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_002237.1 e tendo atividade de canal de potássio. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_002237.1 é mostrada abaixo: 1 MKRQNVRTLA LIVCTFTYLL VGAAVFDALE SEPELIERQR LELRQQELRA RYNLSQGGYE 61 ELERVVLRLK PHKAGVQWRF AGSFYFAITV ITTIGYGHAA PSTDGGKVFC MFYALLGIPL 121 TLVMFQSLGE RINTLVRYLL HRAKKGLGMR RADVSMANMV LIGFFSCIST LCIGAAAFSH 181 YEHWTFFQAY YYCFITLTTI GFGDYVALQK DQALQTQPQY VAFSFVYILT GLTVIGAFLN 241 LVVLRFMTMN AEDEKRDAEH RALLTRNGQA GGGGGGGSAH TTDTASSTAA AGGGGFRNVY 301 AEVLHFQSMC SCLWYKSREK LQYSIPMIIP RDLSTSDTCV EQSHSSPGGG GRYSDTPSRR 361 CLCSGAPRSA ISSVSTGLHS LSTFRGLMKR RSSV

[00117] Por "polinucleotídeo KCNK3" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo KCNK3 ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica KCNK3 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_002246.2. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_002246.2 é reproduzida abaixo: 1 ggcggcggcg gcggcggcgg ccccgggcgc tgagcgggtg cccggcgcgg agagcggcga 61 gcgcagccat gccccaggcc gcctccgggg cagcagcagc ggcggccggg gccgaggcgc 121 gggccggggg cgccgggggg ccggcggcgg cccgggcggg acgatgaagc ggcagaacgt 181 gcgcacgctg gcgctcatcg tgtgcacctt cacctacctg ctggtgggcg ccgcggtctt 241 cgacgcgctg gagtcggagc ccgagctgat cgagcggcag cggctggagc tgcggcagca 301 ggagctgcgg gcgcgctaca acctcagcca gggcggctac gaggagctgg agcgcgtcgt 361 gctgcgcctc aagccgcaca aggccggcgt gcagtggcgc ttcgccggct ccttctactt 421 cgccatcacc gtcatcacca ccatcggcta cgggcacgcg gcacccagca cggatggcgg 481 caaggtgttc tgcatgttct acgcgctgct gggcatcccg ctcacgctcg tcatgttcca 541 gagcctgggc gagcgcatca acaccttggt gaggtacctg ctgcaccgcg ccaagaaggg 601 gctgggcatg cggcgcgccg acgtgtccat ggccaacatg gtgctcatcg gcttcttctc 661 gtgcatcagc acgctgtgca tcggcgccgc cgccttctcc cactacgagc actggacctt

721 cttccaggcc tactactact gcttcatcac cctcaccacc atcggcttcg gcgactacgt 781 ggcgctgcag aaggaccagg ccctgcagac gcagccgcag tacgtggcct tcagcttcgt 841 ctacatcctt acgggcctca cggtcatcgg cgccttcctc aacctcgtgg tgctgcgctt 901 catgaccatg aacgccgagg acgagaagcg cgacgccgag caccgcgcgc tgctcacgcg 961 caacgggcag gcgggcggcg gcggaggggg tggcagcgcg cacactacgg acaccgcctc 1021 atccacggcg gcagcgggcg gcggcggctt ccgcaacgtc tacgcggagg tgctgcactt 1081 ccagtccatg tgctcgtgcc tgtggtacaa gagccgcgag aagctgcagt actccatccc 1141 catgatcatc ccgcgggacc tctccacgtc cgacacgtgc gtggagcaga gccactcgtc 1201 gccgggaggg ggcggccgct acagcgacac gccctcgcga cgctgcctgt gcagcggggc 1261 gccacgctcc gccatcagct cggtgtccac gggtctgcac agcctgtcca ccttccgcgg 1321 cctcatgaag cgcaggagct ccgtgtgact gccccgaggg gcctggagca cctgggggcg 1381 cgggcggggg acccctgctg ggaggccagg agactgcccc tgctgccttc tgcccagtgg 1441 gaccccgcac aacatccctc accactctcc cccagcaccc ccatctccga ctgtgcctgc 1501 ttgcaccagc cggcaggagg ccgggctctg aggacccctg gggcccccat cggagccctg 1561 caaattccga gaaatgtgaa acttggtggg gtcagggagg aaaggcagaa gctgggagcc 1621 tcccttccct ttgaaaatct aagaagctcc cagtcctcag agaccctgct ggtacccaga 1681 cccccacctt cggaggggac ttcatgttcc gtgtacgttt gcatctctat ttatacctct 1741 gtcctgctag gtctcccacc ttcccttggt tccaaaagcc agggtgtcta tgtccaagtc 1801 acccctactc agccccactc cccttcctca tccccagctg tgtctcccaa cctcccttcg 1861 tgttgttttg catggctttg cagttatgga gaaagtggaa acccagcagt ccctaaagct 1921 ggtccccaga aagcaggaca gaaagaagga gggacaggca ggcagcagga ggggcgagct 1981 gggaggcagg aggcagcggc ctgtcagtct gcagaatggt cgcactggag gttcaagcta 2041 actggcctcc agccacattc tcatagcagg taggacttca gccttccaga cactgccctt 2101 agaatctgga acagaagact tcagactcac cataattgct gataattacc cactcttaaa 2161 tttgtcgagt gatttttagc ctctgaaaac tctatgctgg ccactgattc ctttgagtct 2221 cacaaaaccc tacttaggtc atcagggcag gagttctcac tcccatttta cagatgagaa 2281 tactgaggcc tggacaggtg aagtgaccag agagcaaaag gcaaaggggt gggggctggg 2341 tgcagtggct cacacctgta ttcccaacac ttttggaggc tgaggttgga ggattgcttg 2401 agcccaggaa tttgagacca gcctaggtga catagtgaga ccccatctct acaaaaaata 2461 aaaaattaac caggtgtggt ggcacgtgcc tgggagtccc agcgacttgg gaggctgagg 2521 tgggaggatt gtttgagcct gggaggtcga ggctgtagtg agccctgatt gcaccactgt 2581 actccagcct gggtgacagg gcaagaccct gtctcaaaaa aaaaaaaaaa aatggcaaag 2641 ggagacaaga gcccagcctg cttgttgcta gccaaagtgt tctttccttc cagcttggcc 2701 tgctcttaaa agcaaagctc ctgcagtgta catcctggca ttgtgtggct acctgggttt 2761 taaaccagaa tcagaagtcc cggatcagag ggcactgctg aggttcagcc tcttctcttc 2821 ttggccagga ggcagcagct ctgaatgggc ccctgaggct gcacaggggc ctttgtcact 2881 ggggcgcatg cttacaaaca gtgcagttct tgggaccgag gtaagcaggg ctgggtctca 2941 tggcagaaag gccaggatct ggggctctag gaatttggga attgggcaga gtggccaaga 3001 aagctggcag gcatatccta tgggacatca cacctggcac cattgtcatt gttggtgcct 3061 gtgtcccaag tagctagtga taagctgagg ctgcagcaag aaacaccctt cccaggtggg 3121 ggagtttgga ccagaggtgc cctctgccca ccacacctgc aacccagaag cccagatgga 3181 acgcagctga cgaaggtgat gcttgaggct cacttttggg gccccacagc tggagccggt 3241 ataatgactg ggacaacatc aaggggtgga tgaggggcct ctcctcccgc aacactgcct 3301 tcccatgctg ttcccctgcc agctccttaa cactgccgac caaggccagc cctggcattc 3361 agggaaattg gagggcagca cccgtagggt ggccagcctc aggccccacc ccagctgtgt 3421 cctctagtct ctggggaccc ctggggggaa gaagtctacc ctgcttgtga gtcccgtctc 3481 agtgtggagg aactggctgc acgtgggacc tgaaggtgcc ctctgtgttt atgttggggg 3541 tgggggggca gtgctggctg cctctgtcct gtgtgtgacc ctgccctcga agggtcctgt 3601 cctgtcagtc ccgagggagc cacaaccaaa gctgcggaga gaaggtgggg aagggtgcag 3661 aatggccgtg gggcacagcg tggcagactg ttcagtctct gctgggtctt tcctagggac 3721 ctggaaggcc agtgttgctt ccccctcact ccctttcact gcaggcagcc tctctgcttc 3781 cccaatgcct tatgcctggg cacactgcca cagaatatgc aatatgtgtg ggtgaccatg 3841 ccctcacgac cacaccccca ccccgggcag cccccggact ccaaaggtcg tggctgccac 3901 agcctccctc agctcttcct gcctatctgt cttcacactg agaatggcgc ccaataaatg 3961 ctatccacgg agaccagg

[00118] Por "polipeptídeo KCNQ1" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_000209.2 (isoforma 1) ou No. de Acesso NP_861463.1 (isoforma 2) e tendo atividade de canal de potássio. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_000209.2 é mostrada abaixo: 1 MAAASSPPRA ERKRWGWGRL PGARRGSAGL AKKCPFSLEL AEGGPAGGAL YAPIAPGAPG 61 PAPPASPAAP AAPPVASDLG PRPPVSLDPR VSIYSTRRPV LARTHVQGRV YNFLERPTGW 121 KCFVYHFAVF LIVLVCLIFS VLSTIEQYAA LATGTLFWME IVLVVFFGTE YVVRLWSAGC 181 RSKYVGLWGR LRFARKPISI IDLIVVVASM VVLCVGSKGQ VFATSAIRGI RFLQILRMLH 241 VDRQGGTWRL LGSVVFIHRQ ELITTLYIGF LGLIFSSYFV YLAEKDAVNE SGRVEFGSYA 301 DALWWGVVTV TTIGYGDKVP QTWVGKTIAS CFSVFAISFF ALPAGILGSG FALKVQQKQR 361 QKHFNRQIPA AASLIQTAWR CYAAENPDSS TWKIYIRKAP RSHTLLSPSP KPKKSVVVKK 421 KKFKLDKDNG VTPGEKMLTV PHITCDPPEE RRLDHFSVDG YDSSVRKSPT LLEVSMPHFM 481 RTNSFAEDLD LEGETLLTPI THISQLREHH RATIKVIRRM QYFVAKKKFQ QARKPYDVRD 541 VIEQYSQGHL NLMVRIKELQ RRLDQSIGKP SLFISVSEKS KDRGSNTIGA RLNRVEDKVT 601 QLDQRLALIT DMLHQLLSLH GGSTPGSGGP PREGGAHITQ PCGSGGSVDP ELFLPSNTLP 661 TYEQLTVPRR GPDEGS

[00119] Por "polinucleotídeo KCNQ1" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo KCNQ1 ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica KCNQ1 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_000218.2. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_000218.2 é reproduzida abaixo: 1 gcggcggggc tggcagcagt ggctgcccgc actgcgcccg ggcgctcgcc ttcgctgcag 61 ctcccggtgc cgccgctcgg gccggccccc cggcaggccc tcctcgttat ggccgcggcc 121 tcctccccgc ccagggccga gaggaagcgc tggggttggg gccgcctgcc aggcgcccgg 181 cggggcagcg cgggcctggc caagaagtgc cccttctcgc tggagctggc ggagggcggc 241 ccggcgggcg gcgcgctcta cgcgcccatc gcgcccggcg ccccaggtcc cgcgccccct 301 gcgtccccgg ccgcgcccgc cgcgccccca gttgcctccg accttggccc gcggccgccg 361 gtgagcctag acccgcgcgt ctccatctac agcacgcgcc gcccggtgtt ggcgcgcacc 421 cacgtccagg gccgcgtcta caacttcctc gagcgtccca ccggctggaa atgcttcgtt 481 taccacttcg ccgtcttcct catcgtcctg gtctgcctca tcttcagcgt gctgtccacc 541 atcgagcagt atgccgccct ggccacgggg actctcttct ggatggagat cgtgctggtg 601 gtgttcttcg ggacggagta cgtggtccgc ctctggtccg ccggctgccg cagcaagtac 661 gtgggcctct gggggcggct gcgctttgcc cggaagccca tttccatcat cgacctcatc 721 gtggtcgtgg cctccatggt ggtcctctgc gtgggctcca aggggcaggt gtttgccacg 781 tcggccatca ggggcatccg cttcctgcag atcctgagga tgctacacgt cgaccgccag 841 ggaggcacct ggaggctcct gggctccgtg gtcttcatcc accgccagga gctgataacc 901 accctgtaca tcggcttcct gggcctcatc ttctcctcgt actttgtgta cctggctgag

961 aaggacgcgg tgaacgagtc aggccgcgtg gagttcggca gctacgcaga tgcgctgtgg 1021 tggggggtgg tcacagtcac caccatcggc tatggggaca aggtgcccca gacgtgggtc 1081 gggaagacca tcgcctcctg cttctctgtc tttgccatct ccttctttgc gctcccagcg 1141 gggattcttg gctcggggtt tgccctgaag gtgcagcaga agcagaggca gaagcacttc 1201 aaccggcaga tcccggcggc agcctcactc attcagaccg catggaggtg ctatgctgcc 1261 gagaaccccg actcctccac ctggaagatc tacatccgga aggccccccg gagccacact 1321 ctgctgtcac ccagccccaa acccaagaag tctgtggtgg taaagaaaaa aaagttcaag 1381 ctggacaaag acaatggggt gactcctgga gagaagatgc tcacagtccc ccatatcacg 1441 tgcgaccccc cagaagagcg gcggctggac cacttctctg tcgacggcta tgacagttct 1501 gtaaggaaga gcccaacact gctggaagtg agcatgcccc atttcatgag aaccaacagc 1561 ttcgccgagg acctggacct ggaaggggag actctgctga cacccatcac ccacatctca 1621 cagctgcggg aacaccatcg ggccaccatt aaggtcattc gacgcatgca gtactttgtg 1681 gccaagaaga aattccagca agcgcggaag ccttacgatg tgcgggacgt cattgagcag 1741 tactcgcagg gccacctcaa cctcatggtg cgcatcaagg agctgcagag gaggctggac 1801 cagtccattg ggaagccctc actgttcatc tccgtctcag aaaagagcaa ggatcgcggc 1861 agcaacacga tcggcgcccg cctgaaccga gtagaagaca aggtgacgca gctggaccag 1921 aggctggcac tcatcaccga catgcttcac cagctgctct ccttgcacgg tggcagcacc 1981 cccggcagcg gcggcccccc cagagagggc ggggcccaca tcacccagcc ctgcggcagt 2041 ggcggctccg tcgaccctga gctcttcctg cccagcaaca ccctgcccac ctacgagcag 2101 ctgaccgtgc ccaggagggg ccccgatgag gggtcctgag gaggggatgg ggctggggga 2161 tgggcctgag tgagagggga ggccaagagt ggccccacct ggccctctct gaaggaggcc 2221 acctcctaaa aggcccagag agaagagccc cactctcaga ggccccaata ccccatggac 2281 catgctgtct ggcacagcct gcacttgggg gctcagcaag gccacctctt cctggccggt 2341 gtgggggccc cgtctcaggt ctgagttgtt accccaagcg ccctggcccc cacatggtga 2401 tgttgacatc actggcatgg tggttgggac ccagtggcag ggcacagggc ctggcccatg 2461 tatggccagg aagtagcaca ggctgagtgc aggcccaccc tgcttggccc agggggcttc 2521 ctgaggggag acagagcaac ccctggaccc cagcctcaaa tccaggaccc tgccaggcac 2581 aggcagggca ggaccagccc acgctgacta cagggccgcc ggcaataaaa gcccaggagc 2641 ccatttggag ggcctgggcc tggctccctc actctcagga aatgctgacc catgggcagg 2701 agactgtgga gactgctcct gagcccccag cttccagcag gagggacagt ctcaccattt 2761 ccccagggca cgtggttgag tggggggaac gcccacttcc ctgggttaga ctgccagctc 2821 ttcctagctg gagaggagcc ctgcctctcc gcccctgagc ccactgtgcg tggggctccc 2881 gcctccaacc cctcgcccag tcccagcagc cagccaaaca cacagaaggg gactgccacc 2941 tccccttgcc agctgctgag ccgcagagaa gtgacggttc ctacacagga caggggttcc 3001 ttctgggcat tacatcgcat agaaatcaat aatttgtggt gatttggatc tgtgttttaa 3061 tgagtttcac agtgtgattt tgattattaa ttgtgcaagc ttttcctaat aaacgtggag 3121 aatcacaggc tgggctgggc actgctctca ccttggttcc tggggcatcc atggggtctc 3181 tcacagacag gacccctgca gttcccctgg aagcagtgcc caggtggctg tggaatagga 3241 acgctaaaaa aaaaaaaaaa aa

[00120] Por "polipeptídeo LGR5" entende-se uma proteína ou fragmento do mesmo tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_003658.1 (isoforma 1), No. de Acesso NP_001264155.1 (isoforma 2), ou No. de Acesso NP_001264156.1 (isoforma 3) e tendo atividade do receptor de sinalização transmembrana ou atividade do receptor acoplado à proteína G. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_003658.1 é mostrada abaixo: 1 MDTSRLGVLL SLPVLLQLAT GGSSPRSGVL LRGCPTHCHC EPDGRMLLRV DCSDLGLSEL 61 PSNLSVFTSY LDLSMNNISQ LLPNPLPSLR FLEELRLAGN ALTYIPKGAF TGLYSLKVLM 121 LQNNQLRHVP TEALQNLRSL QSLRLDANHI SYVPPSCFSG LHSLRHLWLD DNALTEIPVQ 181 AFRSLSALQA MTLALNKIHH IPDYAFGNLS SLVVLHLHNN RIHSLGKKCF DGLHSLETLD 241 LNYNNLDEFP TAIRTLSNLK ELGFHSNNIR SIPEKAFVGN PSLITIHFYD NPIQFVGRSA 301 FQHLPELRTL TLNGASQITE FPDLTGTANL ESLTLTGAQI SSLPQTVCNQ LPNLQVLDLS 361 YNLLEDLPSF SVCQKLQKID LRHNEIYEIK VDTFQQLLSL RSLNLAWNKI AIIHPNAFST 421 LPSLIKLDLS SNLLSSFPIT GLHGLTHLKL TGNHALQSLI SSENFPELKV IEMPYAYQCC 481 AFGVCENAYK ISNQWNKGDN SSMDDLHKKD AGMFQAQDER DLEDFLLDFE EDLKALHSVQ 541 CSPSPGPFKP CEHLLDGWLI RIGVWTIAVL ALTCNALVTS TVFRSPLYIS PIKLLIGVIA 601 AVNMLTGVSS AVLAGVDAFT FGSFARHGAW WENGVGCHVI GFLSIFASES SVFLLTLAAL 661 ERGFSVKYSA KFETKAPFSS LKVIILLCAL LALTMAAVPL LGGSKYGASP LCLPLPFGEP 721 STMGYMVALI LLNSLCFLMM TIAYTKLYCN LDKGDLENIW DCSMVKHIAL LLFTNCILNC 781 PVAFLSFSSL INLTFISPEV IKFILLVVVP LPACLNPLLY ILFNPHFKED LVSLRKQTYV 841 WTRSKHPSLM SINSDDVEKQ SCDSTQALVT FTSSSITYDL PPSSVPSPAY PVTESCHLSS 901 VAFVPCL

[00121] Por "polinucleotídeo LGR5" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo LGR5 ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica LGR5 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_003667.3. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_003667.3 é reproduzida abaixo: 1 aaaaaacgag cgtgcaagca gagatgctgc tccacaccgc tcaggccgcg agcagcagca 61 aggcgcaccg ccactgtcgc cgctgcagcc agggctgctc cgaaggccgg cgtggcggca 121 accggcacct ctgtccccgc cgcgcttctc ctcgccgccc acgccgtggg gtcaggaacg 181 cggcgtctgg cgctgcagac gcccgctgag ttgcagaagc ccacggagcg gcgcccggcg 241 cgccacggcc cgtagcagtc cggtgctgct ctccgcccgc gtccggctcg tggcccccta 301 cttcgggcac catggacacc tcccggctcg gtgtgctcct gtccttgcct gtgctgctgc 361 agctggcgac cgggggcagc tctcccaggt ctggtgtgtt gctgaggggc tgccccacac 421 actgtcattg cgagcccgac ggcaggatgt tgctcagggt ggactgctcc gacctggggc 481 tctcggagct gccttccaac ctcagcgtct tcacctccta cctagacctc agtatgaaca 541 acatcagtca gctgctcccg aatcccctgc ccagtctccg cttcctggag gagttacgtc 601 ttgcgggaaa cgctctgaca tacattccca agggagcatt cactggcctt tacagtctta 661 aagttcttat gctgcagaat aatcagctaa gacacgtacc cacagaagct ctgcagaatt 721 tgcgaagcct tcaatccctg cgtctggatg ctaaccacat cagctatgtg cccccaagct 781 gtttcagtgg cctgcattcc ctgaggcacc tgtggctgga tgacaatgcg ttaacagaaa 841 tccccgtcca ggcttttaga agtttatcgg cattgcaagc catgaccttg gccctgaaca 901 aaatacacca cataccagac tatgcctttg gaaacctctc cagcttggta gttctacatc 961 tccataacaa tagaatccac tccctgggaa agaaatgctt tgatgggctc cacagcctag 1021 agactttaga tttaaattac aataaccttg atgaattccc cactgcaatt aggacactct 1081 ccaaccttaa agaactagga tttcatagca acaatatcag gtcgatacct gagaaagcat 1141 ttgtaggcaa cccttctctt attacaatac atttctatga caatcccatc cagtttgttg 1201 ggagatctgc ttttcaacat ttacctgaac taagaacact gactctgaat ggtgcctcac

1261 aaataactga atttcctgat ttaactggaa ctgcaaacct ggagagtctg actttaactg 1321 gagcacagat ctcatctctt cctcaaaccg tctgcaatca gttacctaat ctccaagtgc 1381 tagatctgtc ttacaaccta ttagaagatt tacccagttt ttcagtctgc caaaagcttc 1441 agaaaattga cctaagacat aatgaaatct acgaaattaa agttgacact ttccagcagt 1501 tgcttagcct ccgatcgctg aatttggctt ggaacaaaat tgctattatt caccccaatg 1561 cattttccac tttgccatcc ctaataaagc tggacctatc gtccaacctc ctgtcgtctt 1621 ttcctataac tgggttacat ggtttaactc acttaaaatt aacaggaaat catgccttac 1681 agagcttgat atcatctgaa aactttccag aactcaaggt tatagaaatg ccttatgctt 1741 accagtgctg tgcatttgga gtgtgtgaga atgcctataa gatttctaat caatggaata 1801 aaggtgacaa cagcagtatg gacgaccttc ataagaaaga tgctggaatg tttcaggctc 1861 aagatgaacg tgaccttgaa gatttcctgc ttgactttga ggaagacctg aaagcccttc 1921 attcagtgca gtgttcacct tccccaggcc ccttcaaacc ctgtgaacac ctgcttgatg 1981 gctggctgat cagaattgga gtgtggacca tagcagttct ggcacttact tgtaatgctt 2041 tggtgacttc aacagttttc agatcccctc tgtacatttc ccccattaaa ctgttaattg 2101 gggtcatcgc agcagtgaac atgctcacgg gagtctccag tgccgtgctg gctggtgtgg 2161 atgcgttcac ttttggcagc tttgcacgac atggtgcctg gtgggagaat ggggttggtt 2221 gccatgtcat tggttttttg tccatttttg cttcagaatc atctgttttc ctgcttactc 2281 tggcagccct ggagcgtggg ttctctgtga aatattctgc aaaatttgaa acgaaagctc 2341 cattttctag cctgaaagta atcattttgc tctgtgccct gctggccttg accatggccg 2401 cagttcccct gctgggtggc agcaagtatg gcgcctcccc tctctgcctg cctttgcctt 2461 ttggggagcc cagcaccatg ggctacatgg tcgctctcat cttgctcaat tccctttgct 2521 tcctcatgat gaccattgcc tacaccaagc tctactgcaa tttggacaag ggagacctgg 2581 agaatatttg ggactgctct atggtaaaac acattgccct gttgctcttc accaactgca 2641 tcctaaactg ccctgtggct ttcttgtcct tctcctcttt aataaacctt acatttatca 2701 gtcctgaagt aattaagttt atccttctgg tggtagtccc acttcctgca tgtctcaatc 2761 cccttctcta catcttgttc aatcctcact ttaaggagga tctggtgagc ctgagaaagc 2821 aaacctacgt ctggacaaga tcaaaacacc caagcttgat gtcaattaac tctgatgatg 2881 tcgaaaaaca gtcctgtgac tcaactcaag ccttggtaac ctttaccagc tccagcatca 2941 cttatgacct gcctcccagt tccgtgccat caccagctta tccagtgact gagagctgcc 3001 atctttcctc tgtggcattt gtcccatgtc tctaattaat atgtgaagga aaatgttttc 3061 aaaggttgag aacctgaaaa tgtgagattg agtatatcag agcagtaatt aataagaaga 3121 gctgaggtga aactcggttt aaaaaccaaa aaagaatctc tcagttagta agaaaaggct 3181 gaaaacctct tgatacttga gagtgaatat aagtctaaat gctgctttgt ataatttgtt 3241 cagctaaggg atagatcgat cacactattt aagtgagccc agatcaaaaa agcagattga 3301 aattttcttt agaaaagatt ctccatgatt tgaattgcat tctctttaaa ctcaccaatg 3361 taatcatttt gggaggaggg agaacccact tgctttccaa atgggtttat ttaaacccac 3421 aaactcaaga ggttgttggg ggaattagga aaataagggt tttcaatgac ctacattgct 3481 aggtagaggc tgtgatccat gggatttcat tctaatgacc atgtgaagat gtttgagtcc 3541 tcctttgcct ttcctcagaa agaatccttc taaggcacaa atcccttaga tggataatgt 3601 aaggtattgt taactcactc atattgagat catttttaga gataccaggt tttatgtatc 3661 agcactagat ggttccaccc tcatgggata aaactgctta caagtatttt gaaagaaaaa 3721 ctgaccaaaa ttcttaaatt gttactaagg caatcatgca caggtgacgt atgtcttatc 3781 tgatttgttt ttaactcctt ggtgcccaaa gctcagaagg gaattccact gccagcaatg 3841 aacatacctg gaaaagaaag taagcaatct gggatttttt ttctgggtta gtaaagaatt 3901 tttgcaataa gttttatcag ttgattcaaa ctgatgtgca tcttaatgat caaatgtgca 3961 cattacataa attaagtcca ctgatacaac ttcttacaca tgtatctcta gtagctctgg 4021 caaacccaat atctgacacc actttggact caagagactc agtaacgtat tatcctgttt 4081 atttagcttg gttttagctg tgttctctct ggataaccca cttgatgtta ggaacattac 4141 ttctctgctt attccatatt aatactgtgt taggtatttt aagaagcaag ttattaaata 4201 agaaaagtca aagtattaat tcttaccttc tattatccta tattagcttc aatacatcca 4261 aaccaaatgg ctgttaggta gatttatttt tatataagca tgtttatttt gatcagatgt 4321 tttaacttgg atttgaaaaa atacatttat gagatgtttt ataagatgtg taaatataga 4381 actgtattta ttactatagt aaaggttcag taacattaag gaccatgata atgataataa 4441 accttgtaca gtggcatatt ctttgattta tattgtgttt ctctgcccat tttctttaaa 4501 ttcattaact gtatatatgt aaatatatag tacttgtaaa tagattccaa atttgctttt 4561 ctattgggta aaaaataaat ttgtaataaa atgtgtgact atgaaacaaa aaaaaaaaaa 4621 aaaaa

[00122] Por "polipeptídeo LDHA" ou "polipeptídeo lactato desidrogenase A" entende-se uma proteína ou fragmento desta tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_005557.1 (isoforma 1), No. de Acesso NP_001128711.1 (isoforma 2), No. de Acesso NP_001158886.1 (isoforma 3), No. de Acesso NP_001158887.1 (isoforma 4) ou No. de Acesso NP_001158888.1 (isoforma 5) e tendo atividade da desidrogenase. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_005557.1 é mostrada abaixo: 1 MATLKDQLIY NLLKEEQTPQ NKITVVGVGA VGMACAISIL MKDLADELAL VDVIEDKLKG 61 EMMDLQHGSL FLRTPKIVSG KDYNVTANSK LVIITAGARQ QEGESRLNLV QRNVNIFKFI 121 IPNVVKYSPN CKLLIVSNPV DILTYVAWKI SGFPKNRVIG SGCNLDSARF RYLMGERLGV 181 HPLSCHGWVL GEHGDSSVPV WSGMNVAGVS LKTLHPDLGT DKDKEQWKEV HKQVVESAYE 241 VIKLKGYTSW AIGLSVADLA ESIMKNLRRV HPVSTMIKGL YGIKDDVFLS VPCILGQNGI 301 SDLVKVTLTS EEEARLKKSA DTLWGIQKEL QF

[00123] Por "polinucleotídeo LDHA" ou "polinucleotídeo lactato desidrogenase A" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo LDHA ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica de LDHA exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_005566.3. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_005566.3 é reproduzida abaixo: 1 gtctgccggt cggttgtctg gctgcgcgcg ccacccgggc ctctccagtg ccccgcctgg 61 ctcggcatcc acccccagcc cgactcacac gtgggttccc gcacgtccgc cggccccccc 121 cgctgacgtc agcatagctg ttccacttaa ggcccctccc gcgcccagct cagagtgctg 181 cagccgctgc cgccgattcc ggatctcatt gccacgcgcc cccgacgacc gcccgacgtg 241 cattcccgat tccttttggt tccaagtcca atatggcaac tctaaaggat cagctgattt 301 ataatcttct aaaggaagaa cagacccccc agaataagat tacagttgtt ggggttggtg 361 ctgttggcat ggcctgtgcc atcagtatct taatgaagga cttggcagat gaacttgctc 421 ttgttgatgt catcgaagac aaattgaagg gagagatgat ggatctccaa catggcagcc 481 ttttccttag aacaccaaag attgtctctg gcaaagacta taatgtaact gcaaactcca 541 agctggtcat tatcacggct ggggcacgtc agcaagaggg agaaagccgt cttaatttgg

601 tccagcgtaa cgtgaacatc tttaaattca tcattcctaa tgttgtaaaa tacagcccga 661 actgcaagtt gcttattgtt tcaaatccag tggatatctt gacctacgtg gcttggaaga 721 taagtggttt tcccaaaaac cgtgttattg gaagcggttg caatctggat tcagcccgat 781 tccgttacct aatgggggaa aggctgggag ttcacccatt aagctgtcat gggtgggtcc 841 ttggggaaca tggagattcc agtgtgcctg tatggagtgg aatgaatgtt gctggtgtct 901 ctctgaagac tctgcaccca gatttaggga ctgataaaga taaggaacag tggaaagagg 961 ttcacaagca ggtggttgag agtgcttatg aggtgatcaa actcaaaggc tacacatcct 1021 gggctattgg actctctgta gcagatttgg cagagagtat aatgaagaat cttaggcggg 1081 tgcacccagt ttccaccatg attaagggtc tttacggaat aaaggatgat gtcttcctta 1141 gtgttccttg cattttggga cagaatggaa tctcagacct tgtgaaggtg actctgactt 1201 ctgaggaaga ggcccgtttg aagaagagtg cagatacact ttgggggatc caaaaggagc 1261 tgcaatttta aagtcttctg atgtcatatc atttcactgt ctaggctaca acaggattct 1321 aggtggaggt tgtgcatgtt gtccttttta tctgatctgt gattaaagca gtaatatttt 1381 aagatggact gggaaaaaca tcaactcctg aagttagaaa taagaatggt ttgtaaaatc 1441 cacagctata tcctgatgct ggatggtatt aatcttgtgt agtcttcaac tggttagtgt 1501 gaaatagttc tgccacctct gacgcaccac tgccaatgct gtacgtactg catttgcccc 1561 ttgagccagg tggatgttta ccgtgtgtta tataacttcc tggctccttc actgaacatg 1621 cctagtccaa cattttttcc cagtgagtca catcctggga tccagtgtat aaatccaata 1681 tcatgtcttg tgcataattc ttccaaagga tcttattttg tgaactatat cagtagtgta 1741 cattaccata taatgtaaaa agatctacat acaaacaatg caaccaacta tccaagtgtt 1801 ataccaacta aaacccccaa taaaccttga acagtgacta ctttggttaa ttcattatat 1861 taagatataa agtcataaag ctgctagtta ttatattaat ttggaaatat taggctattc 1921 ttgggcaacc ctgcaacgat tttttctaac agggatatta ttgactaata gcagaggatg 1981 taatagtcaa ctgagttgta ttggtaccac ttccattgta agtcccaaag tattatatat 2041 ttgataataa tgctaatcat aattggaaag taacattcta tatgtaaatg taaaatttat 2101 ttgccaactg aatataggca atgatagtgt gtcactatag ggaacacaga tttttgagat 2161 cttgtcctct ggaagctggt aacaattaaa aacaatctta aggcagggaa aaaaaaaaaa 2221 aaaaaa

[00124] Por "polipeptídeo MAFA" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_963883.2 e tendo atividade de fator de transcrição. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_963883.2 é mostrada abaixo: 1 MAAELAMGAE LPSSPLAIEY VNDFDLMKFE VKKEPPEAER FCHRLPPGSL SSTPLSTPCS 61 SVPSSPSFCA PSPGTGGGGG AGGGGGSSQA GGAPGPPSGG PGAVGGTSGK PALEDLYWMS 121 GYQHHLNPEA LNLTPEDAVE ALIGSGHHGA HHGAHHPAAA AAYEAFRGPG FAGGGGADDM 181 GAGHHHGAHH AAHHHHAAHH HHHHHHHHGG AGHGGGAGHH VRLEERFSDD QLVSMSVREL 241 NRQLRGFSKE EVIRLKQKRR TLKNRGYAQS CRFKRVQQRH ILESEKCQLQ SQVEQLKLEV 301 GRLAKERDLY KEKYEKLAGR GGPGSAGGAG FPREPSPPQA GPGGAKGTAD FFL

[00125] Por "polinucleotídeo MAFA" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo MAFA ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica de MAFA exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_201589.3. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_201589.3 é reproduzida abaixo: 1 gcgcggccgg gcgcgggccc cgggcgatgg ccgcggagct ggcgatgggc gccgagctgc 61 ccagcagccc gctggccatc gagtacgtca acgacttcga cctgatgaag ttcgaggtga 121 agaaggagcc tcccgaggcc gagcgcttct gccaccgcct gccgccaggc tcgctgtcct 181 cgacgccgct cagcacgccc tgctcctccg tgccctcctc gcccagcttc tgcgcgccca 241 gcccgggcac cggcggcggc ggcggcgcgg ggggcggcgg cggctcgtct caggccgggg 301 gcgcccccgg gccgccgagc gggggccccg gcgccgtcgg gggcacctcg gggaagccgg 361 cgctggagga tctgtactgg atgagcggct accagcatca cctcaacccc gaggcgctca 421 acctgacgcc cgaggacgcg gtggaggcgc tcatcggcag cggccaccac ggcgcgcacc 481 acggcgcgca ccacccggcg gccgccgcag cctacgaggc tttccgcggc ccgggcttcg 541 cgggcggcgg cggagcggac gacatgggcg ccggccacca ccacggcgcg caccacgccg 601 cccaccatca ccacgccgcc caccaccacc accaccacca ccaccaccat ggcggcgcgg 661 gacacggcgg tggcgcgggc caccacgtgc gcctggagga gcgcttctcc gacgaccagc 721 tggtgtccat gtcggtgcgc gagctgaacc ggcagctccg cggcttcagc aaggaggagg 781 tcatccggct caagcagaag cggcgcacgc tcaagaaccg cggctacgcg cagtcctgcc 841 gcttcaagcg ggtgcagcag cggcacattc tggagagcga gaagtgccaa ctccagagcc 901 aggtggagca gctgaagctg gaggtggggc gcctggccaa agagcgggac ctgtacaagg 961 agaaatacga gaagctggcg ggccggggcg gccccgggag cgcgggcggg gccggtttcc 1021 cgcgggagcc ttcgccgccg caggccggtc ccggcggggc caagggcacg gccgacttct 1081 tcctgtaggc gccggacccc gagcccgcgc cgccgtcgcc ggggacaagt tcgcgcaggc 1141 ctctcggggc ctcggctcgg actccgcggt acaggacgtg gacaccaggc ccggcccggc 1201 cgtgctggcc ccggtgccaa gtctgcgggc gcggggctgg aggccccttc gctcccggtc 1261 cccgttcgcg cgcgtcggcc cgggtcgccg tcctgaggtt gagcggagaa cggtgatttc 1321 taaggaaact tgagccaggt ctaacttctt tccaagcgtc cgcttgtaca tacgttgaac 1381 gtggttctcc gttcccacct tcgccctgcc agcctagagg gaccgcgctg ccgtcccttc 1441 ccgggtggcc cctgcctgcc cccgccctcc ttcgttctct tctcagcctc cctttccttg 1501 ccttttttaa cttcccctcc ccgttttaaa atcggtctta ttttcgaagt atttataatt 1561 attatgcttg gtgattagaa aagaaaacct tggaggaagc cccttctttc cccagccggg 1621 gtccgccctc agtcgcgagt cacagcatga gtcgctcgcc aggaggggcc cggcccctgc 1681 ctgccccctc cccgcttgcc cccgaccctg ctaccggcgt tccttggagg tcgaagccag 1741 ggacgtcacc cgtgctgtgt ccaggcctgc tgtcctacta tgctcaaccg ggggtggggg 1801 gaggggggtg agtcctgtgc tcagtcgggt gggggctggc ccggatcccg agctgctgtc 1861 tctctatgca ccagaacata tctgtaactc ctggggaaat acatcttgtt ttaaccttca 1921 agagaagtga aagaaaaaag taatgcacag tatttctagc agaaaatttt tttttttaag 1981 aggaggcttg ggccagagcc ttctggcatg gggcgggtgg agaaagtgtt tttattttaa 2041 tttaaattgt gtttcgtttt gtttgtggaa tctttcttta atgcttcgtc gctctttgga 2101 ctagccggga gagagggcga ggaggcgggt gctccaggcc ctgtaggctg ggccaggcgc 2161 ctgggggatc tgcccgtttt cggaggccct caggggccat cagtgggatt ccagccgctc 2221 cacacccctc ccctgagcac tcggagtgga aggcgcgccg actcgttgaa agttttgttg 2281 tgtagttggt tttcgttgag ttcttttttc atttgctacg aaactgagaa aaagaaaaaa 2341 atacacaaaa taaatctgtt cagatccaag tca

[00126] Tal como utilizado neste documento, um "marcador" significa qualquer proteína ou polinucleotídeo com uma alteração no nível de expressão ou atividade que está associada a uma doença ou distúrbio ou que está associada a um tipo de célula particular. Em algumas modalidades, um marcador para uma célula beta é Pdx1, MafA, Pax4, Pax6, NeuroD1, Nkx6-1, Gata6 ou Foxa2. Em algumas modalidades, um marcador para um hepatócito é AFP, ALB ou Cyp3a7. Em algumas outras modalidades, um marcador para um cardiomiócito é hMlc2a, hNkx2-5, alphaMHC ou KCNQ1. Em ainda outras modalidades, um marcador para uma célula do intestino delgado é CDX2, Muc2 ou Lgr5.

[00127] Por "polipeptídeo alfaMHC" ou "polipeptídeo alfa de cadeia pesada de miosina (MHC)" entende-se uma proteína ou fragmento desta tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácido para a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_002462.2 e tendo atividade de ligação à actina. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_002462.2 é mostrada abaixo: 1 MTDAQMADFG AAAQYLRKSE KERLEAQTRP FDIRTECFVP DDKEEFVKAK ILSREGGKVI 61 AETENGKTVT VKEDQVLQQN PPKFDKIEDM AMLTFLHEPA VLFNLKERYA AWMIYTYSGL 121 FCVTVNPYKW LPVYNAEVVA AYRGKKRSEA PPHIFSISDN AYQYMLTDRE NQSILITGES 181 GAGKTVNTKR VIQYFASIAA IGDRGKKDNA NANKGTLEDQ IIQANPALEA FGNAKTVRND 241 NSSRFGKFIR IHFGATGKLA SADIETYLLE KSRVIFQLKA ERNYHIFYQI LSNKKPELLD 301 MLLVTNNPYD YAFVSQGEVS VASIDDSEEL MATDSAFDVL GFTSEEKAGV YKLTGAIMHY 361 GNMKFKQKQR EEQAEPDGTE DADKSAYLMG LNSADLLKGL CHPRVKVGNE YVTKGQSVQQ 421 VYYSIGALAK AVYEKMFNWM VTRINATLET KQPRQYFIGV LDIAGFEIFD FNSFEQLCIN 481 FTNEKLQQFF NHHMFVLEQE EYKKEGIEWT FIDFGMDLQA CIDLIEKPMG IMSILEEECM 541 FPKATDMTFK AKLYDNHLGK SNNFQKPRNI KGKQEAHFSL IHYAGTVDYN ILGWLEKNKD 601 PLNETVVALY QKSSLKLMAT LFSSYATADT GDSGKSKGGK KKGSSFQTVS ALHRENLNKL 661 MTNLRTTHPH FVRCIIPNER KAPGVMDNPL VMHQLRCNGV LEGIRICRKG FPNRILYGDF 721 RQRYRILNPV AIPEGQFIDS RKGTEKLLSS LDIDHNQYKF GHTKVFFKAG LLGLLEEMRD 781 ERLSRIITRM QAQARGQLMR IEFKKIVERR DALLVIQWNI RAFMGVKNWP WMKLYFKIKP 841 LLKSAETEKE MATMKEEFGR IKETLEKSEA RRKELEEKMV SLLQEKNDLQ LQVQAEQDNL 901 NDAEERCDQL IKNKIQLEAK VKEMNERLED EEEMNAELTA KKRKLEDECS ELKKDIDDLE

961 LTLAKVEKEK HATENKVKNL TEEMAGLDEI IAKLTKEKKA LQEAHQQALD DLQVEEDKVN 1021 SLSKSKVKLE QQVDDLEGSL EQEKKVRMDL ERAKRKLEGD LKLTQESIMD LENDKLQLEE 1081 KLKKKEFDIN QQNSKIEDEQ VLALQLQKKL KENQARIEEL EEELEAERTA RAKVEKLRSD 1141 LSRELEEISE RLEEAGGATS VQIEMNKKRE AEFQKMRRDL EEATLQHEAT AAALRKKHAD 1201 SVAELGEQID NLQRVKQKLE KEKSEFKLEL DDVTSNMEQI IKAKANLEKV SRTLEDQANE 1261 YRVKLEEAQR SLNDFTTQRA KLQTENGELA RQLEEKEALI SQLTRGKLSY TQQMEDLKRQ 1321 LEEEGKAKNA LAHALQSARH DCDLLREQYE EETEAKAELQ RVLSKANSEV AQWRTKYETD 1381 AIQRTEELEE AKKKLAQRLQ DAEEAVEAVN AKCSSLEKTK HRLQNEIEDL MVDVERSNAA 1441 AAALDKKQRN FDKILAEWKQ KYEESQSELE SSQKEARSLS TELFKLKNAY EESLEHLETF 1501 KRENKNLQEE ISDLTEQLGE GGKNVHELEK VRKQLEVEKL ELQSALEEAE ASLEHEEGKI 1561 LRAQLEFNQI KAEIERKLAE KDEEMEQAKR NHQRVVDSLQ TSLDAETRSR NEVLRVKKKM 1621 EGDLNEMEIQ LSHANRMAAE AQKQVKSLQS LLKDTQIQLD DAVRANDDLK ENIAIVERRN 1681 NLLQAELEEL RAVVEQTERS RKLAEQELIE TSERVQLLHS QNTSLINQKK KMESDLTQLQ 1741 SEVEEAVQEC RNAEEKAKKA ITDAAMMAEE LKKEQDTSAH LERMKKNMEQ TIKDLQHRLD 1801 EAEQIALKGG KKQLQKLEAR VRELEGELEA EQKRNAESVK GMRKSERRIK ELTYQTEEDK 1861 KNLLRLQDLV DKLQLKVKAY KRQAEEAEEQ ANTNLSKFRK VQHELDEAEE RADIAESQVN 1921 KLRAKSRDIG AKQKMHDEE

[00128] Por "polinucleotídeo alfaMHC" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo alfaMHC ou fragmento do mesmo. Uma sequência de polinucleotídeo alfaMHC exemplar é fornecida em NCBI Ref: NM_002471.3. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_002471.3 é reproduzida abaixo: 1 agatagagag actcctgcgg cccagattct tcaggattct ccgtgaaggg ataaccaggg 61 gaagcaccaa gatgaccgat gcccagatgg ctgactttgg ggcagcggcc cagtacctcc 121 gcaagtcaga gaaggagcgt ctagaggccc agacccggcc ctttgacatt cgcactgagt 181 gcttcgtgcc cgatgacaag gaagagtttg tcaaagccaa gattttgtcc cgggagggag 241 gcaaggtcat tgctgaaacc gagaatggga agacggtgac tgtgaaggag gaccaggtgt 301 tgcagcagaa cccacccaag ttcgacaaga ttgaggacat ggccatgctg accttcctgc 361 acgagcccgc ggtgcttttc aacctcaagg agcgctacgc ggcctggatg atatatacct 421 actcgggcct cttctgtgtc actgtcaacc cctacaagtg gctgccggtg tacaatgccg 481 aggtggtggc cgcctaccgg ggcaagaaga ggagtgaggc cccgccccac atcttctcca 541 tctccgacaa cgcctatcag tacatgctga cagatcggga gaaccagtcc atcctcatca 601 cgggagaatc cggggcgggg aagactgtga acaccaagcg tgtcatccag tactttgcca 661 gcattgcagc cataggtgac cgtggcaaga aggacaatgc caatgcgaac aagggcaccc 721 tggaggacca gatcatccag gccaaccccg ctctggaggc cttcggcaat gccaagactg 781 tccggaacga caactcctcc cgctttggga aattcattag gatccacttt ggggccactg 841 gaaagctggc ttctgcagac atagagacct acctgctgga gaagtcccgg gtgatcttcc 901 agctgaaagc tgagagaaac taccacatct tctaccagat tctgtccaac aagaagccgg 961 agttgctgga catgctgctg gtcaccaaca atccctacga ctacgccttc gtgtctcagg 1021 gagaggtgtc cgtggcctcc attgatgact ccgaggagct catggccacc gatagtgcct 1081 ttgacgtgct gggcttcact tcagaggaga aagctggcgt ctacaagctg acgggagcca 1141 tcatgcacta cgggaacatg aagttcaagc agaagcagcg ggaggagcag gcggagccag 1201 acggcaccga agatgctgac aagtcggcct acctcatggg gctgaactca gctgacctgc 1261 tcaaggggct gtgccaccct cgggtgaaag tgggcaacga gtatgtcacc aaggggcaga 1321 gcgtgcagca ggtgtactac tccatcgggg ctctggccaa ggcagtgtat gagaagatgt 1381 tcaactggat ggtgacgcgc atcaacgcca ccctggagac caagcagcca cgccagtact 1441 tcataggagt cctggacatc gctggcttcg agatcttcga cttcaacagc tttgagcagc

1501 tctgcatcaa cttcaccaac gagaagctgc agcagttctt caaccaccac atgttcgtgc 1561 tggagcagga ggagtacaag aaggagggca ttgagtggac attcattgac tttggcatgg 1621 acctgcaggc ctgcattgac ctcatcgaga agcccatggg catcatgtcc atcctggagg 1681 aggagtgcat gttccccaag gccactgaca tgaccttcaa ggccaagctg tacgacaacc 1741 acctgggcaa gtccaacaat ttccagaagc cacgcaacat caaggggaag caggaagccc 1801 acttctccct gatccactac gccggcactg tggactacaa catcctgggc tggctggaaa 1861 aaaacaagga tcctctcaac gagactgttg tggccctgta ccagaagtcc tccctcaagc 1921 tcatggccac tctcttctcc tcctacgcaa ctgccgatac tggggacagt ggtaaaagca 1981 aaggaggcaa gaaaaagggc tcatccttcc agacggtgtc ggctctccac cgggaaaatc 2041 tcaacaagct aatgaccaac ctgaggacca cccatcctca ctttgtgcgt tgcatcatcc 2101 ccaatgagcg gaaggctcca ggggtgatgg acaaccccct ggtcatgcac cagctgcgct 2161 gcaatggcgt gctggagggc atccgcatct gcaggaaggg cttccccaac cgcatcctct 2221 acggggactt ccggcagagg tatcgcatcc tgaacccagt ggccatccct gagggacagt 2281 tcattgatag caggaagggg acagagaagc tgctcagctc tctggacatt gatcacaacc 2341 agtacaagtt tggccacacc aaggtgttct tcaaggcagg gctgcttggg ctgctggagg 2401 agatgcggga tgagaggctg agccgcatca tcacgcgcat gcaggcccaa gcccggggcc 2461 agctcatgcg cattgagttc aagaagatag tggaacgcag ggatgccctg ctggtaatcc 2521 agtggaacat tcgggccttc atgggggtca agaattggcc ctggatgaag ctctacttca 2581 agatcaagcc gctgctgaag agcgcagaga cggagaagga gatggccacc atgaaggaag 2641 agttcgggcg catcaaagag acgctggaga agtccgaggc tcgccgcaag gagctggagg 2701 agaagatggt gtccctgctg caggagaaga atgacctgca gctccaagtg caggcggaac 2761 aagacaacct caatgatgct gaggagcgct gcgaccagct gatcaaaaac aagattcagc 2821 tggaggccaa agtaaaggag atgaatgaga ggctggagga tgaggaggag atgaacgcgg 2881 agctcactgc caagaagcgc aagctggaag acgagtgctc agagctcaag aaggacattg 2941 atgacctgga gctgacactg gccaaggtgg agaaggagaa gcatgcaaca gagaacaagg 3001 tgaagaacct aacagaggag atggctgggc tggatgaaat catcgctaag ctgaccaagg 3061 agaagaaagc tctacaagag gcccatcagc aggccctgga tgaccttcag gttgaggaag 3121 acaaggtcaa cagcctgtcc aagtctaagg tcaagctgga gcagcaggtg gatgatctgg 3181 agggatccct agagcaagag aagaaggtgc gcatggacct ggagcgagca aagcggaaac 3241 tggagggcga cctgaagctg acccaggaga gcatcatgga cctggaaaat gataaactgc 3301 agctggaaga aaagcttaag aagaaggagt ttgacattaa tcagcagaac agtaagattg 3361 aggatgagca ggtgctggcc cttcaactac agaagaaact gaaggaaaac caggcacgca 3421 tcgaggagct ggaggaggag ctggaggccg agcgcaccgc cagggctaag gtggagaagc 3481 tgcgctcaga cctgtctcgg gagctggagg agatcagcga gcggctggaa gaggccggcg 3541 gggccacgtc cgtgcagatc gagatgaaca agaagcgcga ggccgagttc cagaagatgc 3601 ggcgggacct ggaggaggcc acgctgcagc acgaggccac tgccgcggcc ctgcgcaaga 3661 agcacgccga cagcgtggcc gagctgggcg agcagatcga caacctgcag cgggtgaagc 3721 agaagctgga gaaggagaag agcgagttca agctggagct ggatgacgtc acctccaaca 3781 tggagcagat catcaaggcc aaggcaaacc tggagaaagt gtctcggacg ctggaggacc 3841 aggccaatga gtaccgcgtg aagctagaag aggcccaacg ctccctcaat gatttcacca 3901 cccagcgagc caagctgcag accgagaatg gagagttggc ccggcagcta gaggaaaagg 3961 aggcgctaat ctcgcagctg acccggggga agctctctta tacccagcaa atggaggacc 4021 tcaaaaggca gctggaggag gagggcaagg cgaagaacgc cctggcccat gcactgcagt 4081 cggcccggca tgactgcgac ctgctgcggg agcagtacga ggaggagaca gaggccaagg 4141 ccgagctgca gcgcgtcctg tccaaggcca actcggaggt ggcccagtgg aggaccaagt 4201 atgagacgga cgccattcag cggactgagg agctcgaaga ggccaaaaag aagctggccc 4261 agcggctgca ggatgccgag gaggccgtgg aggctgttaa tgccaagtgc tcctcactgg 4321 agaagaccaa gcaccggcta cagaatgaga tagaggactt gatggtggac gtagagcgct 4381 ccaatgctgc tgctgcagcc ctggacaaga agcagagaaa ctttgacaag atcctggccg 4441 agtggaagca gaagtatgag gagtcgcagt ctgagctgga gtcctcacag aaggaggctc 4501 gctccctcag cacagagctc ttcaagctca agaacgccta cgaggagtcc ctggagcacc 4561 tagagacctt caagcgggag aacaagaacc ttcaggagga aatctcggac cttactgagc 4621 agctaggaga aggaggaaag aatgtgcatg agctggagaa ggtccgcaaa cagctggagg 4681 tggagaagct ggagctgcag tcagccctgg aggaggcaga ggcctccctg gagcacgagg 4741 agggcaagat cctccgggcc cagctagagt tcaaccagat caaggcagag atcgagcgga 4801 agctggcaga gaaggacgag gagatggaac aggccaagcg caaccaccag cgggtggtgg 4861 actcgctgca gacctccctg gatgcagaga cacgcagccg caacgaggtc ctgagggtga 4921 agaagaagat ggaaggagac ctcaatgaga tggagatcca gctcagccac gccaaccgca

4981 tggctgccga ggcccagaag caagtcaaga gcctccagag cttgctgaag gacacccaga 5041 tccagctgga cgatgcggtc cgtgccaacg acgacctgaa ggagaacatc gccatcgtgg 5101 agcggcgcaa caacctgctg caggctgagc tggaggagct gcgtgccgtg gtggagcaga 5161 cagagcggtc ccggaagctg gcggagcagg agctgattga gaccagcgag cgggtgcagc 5221 tgctgcattc ccagaacacc agcctcatca accagaagaa gaagatggag tcggatctga 5281 cccagctcca gtcggaagtg gaggaggcag tgcaggagtg cagaaacgcc gaggagaagg 5341 ccaagaaggc catcacggat gccgccatga tggcagagga gctgaagaag gagcaggaca 5401 ccagcgccca cctggagcgc atgaagaaga acatggagca gaccattaag gacctgcagc 5461 accggctgga cgaggccgag cagatcgccc tcaagggagg caagaagcag ctgcagaagc 5521 tggaagcgcg ggtgcgggag ctggagggtg agctggaggc cgagcagaag cgcaacgcag 5581 agtcggtgaa gggcatgagg aagagcgagc ggcgcatcaa ggagctcacc taccagacag 5641 aggaagacaa aaagaacctg ctgcggctac aggacctggt ggacaagctg caactgaagg 5701 tcaaggccta caagcgccag gccgaggagg cggaggagca agccaacacc aacctgtcca 5761 agttccgcaa ggtgcagcat gagctggatg aggcagagga gcgggcggac atcgctgagt 5821 cccaggtcaa caagcttcga gccaagagcc gtgacattgg tgccaagcaa aaaatgcacg 5881 atgaggagtg acactgcctc gggaacctca ctcttgccaa cctgtaataa atatgagtgc 5941 c

[00129] Por "polipeptídeo MLC2A" ou "polipeptídeo MLSC2A (hMLC2A) humano" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_067046.1 e tendo atividade de ligação de cálcio. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_067046.1 é mostrada abaixo: 1 MASRKAGTRG KVAATKQAQR GSSNVFSMFE QAQIQEFKEA FSCIDQNRDG IICKADLRET 61 YSQLGKVSVP EEELDAMLQE GKGPINFTVF LTLFGEKLNG TDPEEAILSA FRMFDPSGKG 121 VVNKDEFKQL LLTQADKFSP AEVEQMFALT PMDLAGNIDY KSLCYIITHG DEKEE

[00130] Por "polinucleotídeo MLC2A" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo MLC2A ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica MLC2A exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_021223.2. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_021223.2 é reproduzida abaixo: 1 tctgcagaga gaatggccag caggaaggcg gggacccggg gcaaggtggc agccaccaag

61 caggcccaac gtggttcttc caacgtcttt tccatgtttg aacaagccca gatacaggag 121 ttcaaagaag ccttcagctg tatcgaccag aatcgtgatg gcatcatctg caaggcagac 181 ctgagggaga cctactccca gctggggaag gtgagtgtcc cagaggagga gctggacgcc 241 atgctgcaag agggcaaggg ccccatcaac ttcaccgtct tcctcacgct ctttggggag 301 aagctcaatg ggacagaccc cgaggaagcc atcctgagtg ccttccgcat gtttgacccc 361 agcggcaaag gggtggtgaa caaggatgag ttcaagcagc ttctcctgac ccaggcagac 421 aagttctctc cagctgaggt ggagcagatg ttcgccctga cacccatgga cctggcgggg 481 aacatcgact acaagtcact gtgctacatc atcacccatg gagacgagaa agaggaatga 541 ggggcagggc caggcccacg ggggggcacc tcaataaact ctgttgcaaa attggaaaaa 601 aaaaaaaaaa aaaaaaaaa

[00131] Por "polipeptídeo MUC2" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_002448.3 e tendo e tendo uma atividade biológica de um polipeptídeo MUC2. As atividades biológicas exemplares de um polipeptídeo MUC2 incluem a polimerização em um gel e o revestimento do epitélio dos intestinos e de outros órgãos contendo a membrana mucosa. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_002448.3 é mostrada abaixo: 1 MGLPLARLAA VCLALSLAGG SELQTEGRTR NHGHNVCSTW GNFHYKTFDG DVFRFPGPCD 61 YNFASDCRGS YKEFAVHLKR GPGQAEAPAG VESILLTIKD DTIYLTRHLA VLNGAVVSTP 121 HYSPGLLIEK SDAYTKVYSR AGLTLMWNRE DALMLELDTK FRNHTCGLCG DYNGLQSYSE 181 FLSDGVLFSP LEFGNMQKIN QPDVVCEDPE EEVAPASCSE HRAECERLLT AEAFADCQDL 241 VPLEPYLRAC QQDRCRCPGG DTCVCSTVAE FSRQCSHAGG RPGNWRTATL CPKTCPGNLV 301 YLESGSPCMD TCSHLEVSSL CEEHRMDGCF CPEGTVYDDI GDSGCVPVSQ CHCRLHGHLY 361 TPGQEITNDC EQCVCNAGRW VCKDLPCPGT CALEGGSHIT TFDGKTYTFH GDCYYVLAKG 421 DHNDSYALLG ELAPCGSTDK QTCLKTVVLL ADKKKNVVVF KSDGSVLLNE LQVNLPHVTA 481 SFSVFRPSSY HIMVSMAIGV RLQVQLAPVM QLFVTLDQAS QGQVQGLCGN FNGLEGDDFK 541 TASGLVEATG AGFANTWKAQ STCHDKLDWL DDPCSLNIES ANYAEHWCSL LKKTETPFGR 601 CHSAVDPAEY YKRCKYDTCN CQNNEDCLCA ALSSYARACT AKGVMLWGWR EHVCNKDVGS 661 CPNSQVFLYN LTTCQQTCRS LSEADSHCLE GFAPVDGCGC PDHTFLDEKG RCVPLAKCSC 721 YHRGLYLEAG DVVVRQEERC VCRDGRLHCR QIRLIGQSCT APKIHMDCSN LTALATSKPR 781 ALSCQTLAAG YYHTECVSGC VCPDGLMDDG RGGCVVEKEC PCVHNNDLYS SGAKIKVDCN 841 TCTCKRGRWV CTQAVCHGTC SIYGSGHYIT FDGKYYDFDG HCSYVAVQDY CGQNSSLGSF 901 SIITENVPCG TTGVTCSKAI KIFMGRTELK LEDKHRVVIQ RDEGHHVAYT TREVGQYLVV 961 ESSTGIIVIW DKRTTVFIKL APSYKGTVCG LCGNFDHRSN NDFTTRDHMV VSSELDFGNS 1021 WKEAPTCPDV STNPEPCSLN PHRRSWAEKQ CSILKSSVFS ICHSKVDPKP FYEACVHDSC 1081 SCDTGGDCEC FCSAVASYAQ ECTKEGACVF WRTPDLCPIF CDYYNPPHEC EWHYEPCGNR 1141 SFETCRTING IHSNISVSYL EGCYPRCPKD RPIYEEDLKK CVTADKCGCY VEDTHYPPGA

1201 SVPTEETCKS CVCTNSSQVV CRPEEGKILN QTQDGAFCYW EICGPNGTVE KHFNICSITT 1261 RPSTLTTFTT ITLPTTPTTF TTTTTTTTPT SSTVLSTTPK LCCLWSDWIN EDHPSSGSDD 1321 GDRETFDGVC GAPEDIECRS VKDPHLSLEQ LGQKVQCDVS VGFICKNEDQ FGNGPFGLCY 1381 DYKIRVNCCW PMDKCITTPS PPTTTPSPPP TSTTTLPPTT TPSPPTTTTT TPPPTTTPSP 1441 PITTTTTPPP TTTPSPPIST TTTPPPTTTP SPPTTTPSPP TTTPSPPTTT TTTPPPTTTP 1501 SPPTTTPITP PASTTTLPPT TTPSPPTTTT TTPPPTTTPS PPTTTPITPP TSTTTLPPTT 1561 TPSPPPTTTT TPPPTTTPSP PTTTTPSPPT ITTTTPPPTT TPSPPTTTTT TPPPTTTPSP 1621 PTTTPITPPT STTTLPPTTT PSPPPTTTTT PPPTTTPSPP TTTTPSPPIT TTTTPPPTTT 1681 PSSPITTTPS PPTTTMTTPS PTTTPSSPIT TTTTPSSTTT PSPPPTTMTT PSPTTTPSPP 1741 TTTMTTLPPT TTSSPLTTTP LPPSITPPTF SPFSTTTPTT PCVPLCNWTG WLDSGKPNFH 1801 KPGGDTELIG DVCGPGWAAN ISCRATMYPD VPIGQLGQTV VCDVSVGLIC KNEDQKPGGV 1861 IPMAFCLNYE INVQCCECVT QPTTMTTTTT ENPTPPTTTP ITTTTTVTPT PTPTGTQTPT 1921 TTPITTTTTV TPTPTPTGTQ TPTTTPITTT TTVTPTPTPT GTQTPTTTPI TTTTTVTPTP 1981 TPTGTQTPTT TPITTTTTVT PTPTPTGTQT PTTTPITTTT TVTPTPTPTG TQTPTTTPIT 2041 TTTTVTPTPT PTGTQTPTTT PITTTTTVTP TPTPTGTQTP TTTPITTTTT VTPTPTPTGT 2101 QTPTTTPITT TTTVTPTPTP TGTQTPTTTP ITTTTTVTPT PTPTGTQTPT TTPITTTTTV 2161 TPTPTPTGTQ TPTTTPITTT TTVTPTPTPT GTQTPTTTPI TTTTTVTPTP TPTGTQTPTT 2221 TPITTTTTVT PTPTPTGTQT PTTTPITTTT TVTPTPTPTG TQTPTTTPIT TTTTVTPTPT 2281 PTGTQTPTTT PITTTTTVTP TPTPTGTQTP TTTPITTTTT VTPTPTPTGT QTPTTTPITT 2341 TTTVTPTPTP TGTQTPTTTP ITTTTTVTPT PTPTGTQTPT TTPITTTTTV TPTPTPTGTQ 2401 TPTTTPITTT TTVTPTPTPT GTQTPTTTPI TTTTTVTPTP TPTGTQTPTT TPITTTTTVT 2461 PTPTPTGTQT PTTTPITTTT TVTPTPTPTG TQTPTTTPIT TTTTVTPTPT PTGTQTPTTT 2521 PITTTTTVTP TPTPTGTQTP TTTPITTTTT VTPTPTPTGT QTPTTTPITT TTTVTPTPTP 2581 TGTQTPTTTP ITTTTTVTPT PTPTGTQTPT TTPITTTTTV TPTPTPTGTQ TPTTTPITTT 2641 TTVTPTPTPT GTQTPTTTPI TTTTTVTPTP TPTGTQTPTT TPITTTTTVT PTPTPTGTQT 2701 PTTTPITTTT TVTPTPTPTG TQTPTTTPIT TTTTVTPTPT PTGTQTPTTT PITTTTTVTP 2761 TPTPTGTQTP TTTPITTTTT VTPTPTPTGT QTPTTTPITT TTTVTPTPTP TGTQTPTTTP 2821 ITTTTTVTPT PTPTGTQTPT TTPITTTTTV TPTPTPTGTQ TPTTTPITTT TTVTPTPTPT 2881 GTQTPTTTPI TTTTTVTPTP TPTGTQTPTT TPITTTTTVT PTPTPTGTQT PTTTPITTTT 2941 TVTPTPTPTG TQTPTTTPIT TTTTVTPTPT PTGTQTPTTT PITTTTTVTP TPTPTGTQTP 3001 TTTPITTTTT VTPTPTPTGT QTPTTTPITT TTTVTPTPTP TGTQTPTTTP ITTTTTVTPT 3061 PTPTGTQTPT TTPITTTTTV TPTPTPTGTQ TPTTTPITTT TTVTPTPTPT GTQTPTTTPI 3121 TTTTTVTPTP TPTGTQTPTT TPITTTTTVT PTPTPTGTQT PTTTPITTTT TVTPTPTPTG 3181 TQTPTTTPIT TTTTVTPTPT PTGTQTPTTT PITTTTTVTP TPTPTGTQTP TTTPITTTTT 3241 VTPTPTPTGT QTPTTTPITT TTTVTPTPTP TGTQTPTTTP ITTTTTVTPT PTPTGTQTPT 3301 TTPITTTTTV TPTPTPTGTQ TPTTTPITTT TTVTPTPTPT GTQTPTTTPI TTTTTVTPTP 3361 TPTGTQTPTT TPITTTTTVT PTPTPTGTQT PTTTPITTTT TVTPTPTPTG TQTPTTTPIT 3421 TTTTVTPTPT PTGTQTPTTT PITTTTTVTP TPTPTGTQTP TTTPITTTTT VTPTPTPTGT 3481 QTPTTTPITT TTTVTPTPTP TGTQTPTTTP ITTTTTVTPT PTPTGTQTPT TTPITTTTTV 3541 TPTPTPTGTQ TPTTTPITTT TTVTPTPTPT GTQTPTTTPI TTTTTVTPTP TPTGTQTPTT 3601 TPITTTTTVT PTPTPTGTQT PTTTPITTTT TVTPTPTPTG TQTPTTTPIT TTTTVTPTPT 3661 PTGTQTPTTT PITTTTTVTP TPTPTGTQTP TTTPITTTTT VTPTPTPTGT QTPTTTPITT 3721 TTTVTPTPTP TGTQTPTTTP ITTTTTVTPT PTPTGTQTPT TTPITTTTTV TPTPTPTGTQ 3781 TPTTTPITTT TTVTPTPTPT GTQTPTTTPI TTTTTVTPTP TPTGTQTPTT TPITTTTTVT 3841 PTPTPTGTQT PTTTPITTTT TVTPTPTPTG TQTPTTTPIT TTTTVTPTPT PTGTQTPTTT 3901 PITTTTTVTP TPTPTGTQTP TTTPITTTTT VTPTPTPTGT QTPTTTPITT TTTVTPTPTP 3961 TGTQTPTTTP ITTTTTVTPT PTPTGTQTPT TTPITTTTTV TPTPTPTGTQ TPTTTPITTT 4021 TTVTPTPTPT GTQTPTTTPI TTTTTVTPTP TPTGTQTPTT TPITTTTTVT PTPTPTGTQT 4081 PTTTPITTTT TVTPTPTPTG TQTPTTTPIT TTTTVTPTPT PTGTQTPTTT PITTTTTVTP 4141 TPTPTGTQTP TTTPITTTTT VTPTPTPTGT QTPTTTPITT TTTVTPTPTP TGTQTGPPTH 4201 TSTAPIAELT TSNPPPESST PQTSRSTSSP LTESTTLLST LPPAIEMTST APPSTPTAPT 4261 TTSGGHTLSP PPSTTTSPPG TPTRGTTTGS SSAPTPSTVQ TTTTSAWTPT PTPLSTPSII 4321 RTTGLRPYPS SVLICCVLND TYYAPGEEVY NGTYGDTCYF VNCSLSCTLE FYNWSCPSTP 4381 SPTPTPSKST PTPSKPSSTP SKPTPGTKPP ECPDFDPPRQ ENETWWLCDC FMATCKYNNT 4441 VEIVKVECEP PPMPTCSNGL QPVRVEDPDG CCWHWECDCY CTGWGDPHYV TFDGLYYSYQ 4501 GNCTYVLVEE ISPSVDNFGV YIDNYHCDPN DKVSCPRTLI VRHETQEVLI KTVHMMPMQV 4561 QVQVNRQAVA LPYKKYGLEV YQSGINYVVD IPELGVLVSY NGLSFSVRLP YHRFGNNTKG 4621 QCGTCTNTTS DDCILPSGEI VSNCEAAADQ WLVNDPSKPH CPHSSSTTKR PAVTVPGGGK

4681 TTPHKDCTPS PLCQLIKDSL FAQCHALVPP QHYYDACVFD SCFMPGSSLE CASLQAYAAL 4741 CAQQNICLDW RNHTHGACLV ECPSHREYQA CGPAEEPTCK SSSSQQNNTV LVEGCFCPEG 4801 TMNYAPGFDV CVKTCGCVGP DNVPREFGEH FEFDCKNCVC LEGGSGIICQ PKRCSQKPVT 4861 HCVEDGTYLA TEVNPADTCC NITVCKCNTS LCKEKPSVCP LGFEVKSKMV PGRCCPFYWC 4921 ESKGVCVHGN AEYQPGSPVY SSKCQDCVCT DKVDNNTLLN VIACTHVPCN TSCSPGFELM 4981 EAPGECCKKC EQTHCIIKRP DNQHVILKPG DFKSDPKNNC TFFSCVKIHN QLISSVSNIT 5041 CPNFDASICI PGSITFMPNG CCKTCTPRNE TRVPCSTVPV TTEVSYAGCT KTVLMNHCSG 5101 SCGTFVMYSA KAQALDHSCS CCKEEKTSQR EVVLSCPNGG SLTHTYTHIE SCQCQDTVCG 5161 LPTGTSRRAR RSPRHLGSG

[00132] Por "polinucleotídeo MUC2" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo MUC2 ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica MUC2 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_002457.3. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_002457.3 é reproduzida abaixo: 1 caacccacac cgcccctgcc agccaccatg gggctgccac tagcccgcct ggcggctgtg 61 tgcctggccc tgtctttggc agggggctcg gagctccaga cagagggcag aacccgaaac 121 cacggccaca acgtctgcag cacctggggc aacttccact acaagacctt cgacggggac 181 gtcttccgct tccccggccc ctgcgactac aacttcgcct ccgactgccg aggctcctac 241 aaggaatttg ctgtgcacct gaagcggggt ccgggccagg ctgaggcccc cgccggggtg 301 gagtccatcc tgctgaccat caaggatgac accatctacc tcacccgcca cctggctgtg 361 cttaacgggg ccgtggtcag caccccgcac tacagccccg ggctgctcat tgagaagagc 421 gatgcctaca ccaaagtcta ctcccgcgcc ggcctcaccc tcatgtggaa ccgggaggat 481 gcactcatgc tggagctgga cactaagttc cggaaccaca cctgtggcct ctgcggggac 541 tacaacggcc tgcagagcta ttcagaattc ctctctgacg gcgtgctctt cagtcccctg 601 gagtttggga acatgcagaa gatcaaccag cccgatgtgg tgtgtgagga tcccgaggag 661 gaggtggccc ccgcatcctg ctccgagcac cgcgccgagt gtgagaggct gctgaccgcc 721 gaggccttcg cggactgtca ggacctggtg ccgctggagc cgtatctgcg cgcctgccag 781 caggaccgct gccggtgccc gggcggtgac acctgcgtct gcagcaccgt ggccgagttc 841 tcccgccagt gctcccacgc cggcggccgg cccgggaact ggaggaccgc cacgctctgc 901 cccaagacct gccccgggaa cctggtgtac ctggagagcg gctcgccctg catggacacc 961 tgctcacacc tggaggtgag cagcctgtgc gaggagcacc gcatggacgg ctgtttctgc 1021 ccagaaggca ccgtatatga cgacatcggg gacagtggct gcgttcctgt gagccagtgc 1081 cactgcaggc tgcacggaca cctgtacaca ccgggccagg agatcaccaa tgactgcgag 1141 cagtgtgtct gtaacgctgg ccgctgggtg tgcaaagacc tgccctgccc cggcacctgt 1201 gccctggaag gcggctccca catcaccacc ttcgatggga agacgtacac cttccacggg 1261 gactgctact atgtcctggc caagggtgac cacaacgatt cctacgctct cctgggcgag 1321 ctggccccct gtggctccac agacaagcag acctgcctga agacggtggt gctgctggct 1381 gacaagaaga agaatgtggt ggtcttcaag tccgatggca gtgtactgct caacgagctg 1441 caggtgaacc tgccccacgt gaccgcgagc ttctctgtct tccgcccgtc ttcctaccac 1501 atcatggtga gcatggccat tggcgtccgg ctgcaggtgc agctggcccc agtcatgcaa 1561 ctctttgtga cactggacca ggcctcccag gggcaggtgc agggcctctg cgggaacttc 1621 aacggcctgg aaggtgacga cttcaagacg gccagcgggc tggtggaggc cacgggggcc 1681 ggctttgcca acacctggaa ggcacagtca acctgccatg acaagctgga ctggttggac 1741 gatccctgct ccctgaacat cgagagcgcc aactacgccg agcactggtg ctccctcctg 1801 aagaagacag agaccccctt tggcaggtgc cactcggctg tggaccctgc tgagtattac 1861 aagaggtgca aatatgacac gtgtaactgt cagaacaatg aggactgcct gtgcgccgcc 1921 ctgtcctcct acgcgcgcgc ctgcaccgcc aagggcgtca tgctgtgggg ctggcgggag 1981 catgtctgca acaaggatgt gggctcctgc cccaactcgc aggtcttcct gtacaacctg 2041 accacctgcc agcagacctg ccgctccctc tccgaggccg acagccactg tctcgagggc

2101 tttgcgcctg tggacggctg cggctgccct gaccacacct tcctggacga gaagggccgc 2161 tgcgtacccc tggccaagtg ctcctgttac caccgcggtc tctacctgga ggcgggggac 2221 gtggtcgtca ggcaggaaga acgatgtgtg tgccgggatg ggcggctgca ctgtaggcag 2281 atccggctga tcggccagag ctgcacggcc ccaaagatcc acatggactg cagcaacctg 2341 actgcactgg ccacctcgaa gccccgagcc ctcagctgcc agacgctggc cgccggctat 2401 taccacacag agtgtgtcag tggctgtgtg tgccccgacg ggctgatgga tgacggccgg 2461 ggtggctgcg tggtggagaa ggaatgccct tgcgtccata acaacgacct gtattcttcc 2521 ggcgccaaga tcaaggtgga ctgcaatacc tgcacctgca agagaggacg ctgggtgtgc 2581 acccaggctg tgtgccatgg cacctgctcc atttacggga gtggccacta catcaccttt 2641 gacgggaagt actacgactt tgacggacac tgctcctacg tggctgttca ggactactgc 2701 ggccagaact cctcactggg ctcattcagc atcatcaccg agaacgtccc ctgtggcact 2761 acgggcgtca cctgctccaa ggccatcaag atcttcatgg ggaggacgga gctgaagttg 2821 gaagacaagc accgtgtggt gatccagcgt gatgagggtc accacgtggc ctacaccacg 2881 cgggaggtgg gccagtacct ggtggtggag tccagcacgg gcatcatcgt catctgggac 2941 aagaggacca ccgtgttcat caagctggct ccctcctaca agggcaccgt gtgtggcctg 3001 tgtgggaact ttgaccaccg ctccaacaac gacttcacca cgcgggacca catggtggtg 3061 agcagcgagc tggacttcgg gaacagctgg aaggaggccc ccacctgccc agatgtgagc 3121 accaaccccg agccctgcag cctgaacccg caccgccgct cctgggccga gaagcagtgc 3181 agcatcctca aaagcagcgt gttcagcatc tgccacagca aggtggaccc caagcccttc 3241 tacgaggcct gtgtgcacga ctcgtgctcc tgtgacacgg gtggggactg tgagtgcttc 3301 tgctctgccg tggcctccta cgcccaggag tgtaccaaag agggggcctg cgtgttctgg 3361 aggacgccgg acctgtgccc catattctgc gactactaca accctccgca tgagtgtgag 3421 tggcactatg agccatgtgg gaaccggagc ttcgagacct gcaggaccat caatggcatc 3481 cactccaaca tctccgtgtc ctacctggag ggctgctacc cccggtgccc caaggacagg 3541 cccatctatg aggaggatct gaagaagtgt gtcactgcag acaagtgtgg ctgctatgtc 3601 gaggacaccc actacccacc tggagcatcg gttcccaccg aggagacctg caagtcctgc 3661 gtgtgtacca actcctccca agtcgtctgc aggccggagg aaggaaagat tcttaaccag 3721 acccaggatg gcgccttctg ctactgggag atctgtggcc ccaacgggac ggtggagaag 3781 cacttcaaca tctgttccat tacgacacgc ccgtccaccc tgaccacctt caccaccatc 3841 accctcccca ccacccccac caccttcacc actaccacca ccaccaccac cccgacctcc 3901 agcacagttt tatcaacaac tccgaagctg tgctgcctct ggtctgactg gatcaatgag 3961 gaccacccca gcagtggcag cgacgacggt gaccgagaaa catttgatgg ggtctgcggg 4021 gcccctgagg acatcgagtg caggtcggtc aaggatcccc acctcagctt ggagcagcta 4081 ggccagaagg tgcagtgtga tgtctctgtt gggttcattt gcaagaatga agaccagttt 4141 ggaaatggac catttggact gtgttacgac tacaagatac gtgtcaattg ttgctggccc 4201 atggataagt gtatcaccac tcccagccct ccaactacca ctcccagccc tccaccaacc 4261 agcacgacca cccttccacc aaccaccacc cccagccctc caaccaccac cacaaccacc 4321 cctccaccaa ccaccacccc cagccctcca ataaccacca cgaccacccc tccaccaacc 4381 accactccca gccctccaat aagcaccaca accacccctc caccaaccac cactcccagc 4441 cctccaacca ccactcccag ccctccaacc accactccca gccctccaac aaccaccaca 4501 accacccctc caccaaccac cactcccagc cctccaacga ctacgcccat cactccacca 4561 gccagcacta ccacccttcc accaaccacc actcccagcc ctccaacaac caccacaacc 4621 acccctccac caaccaccac tcccagtcct ccaacgacta cgcccatcac tccaccaacc 4681 agcactacta cccttccacc aaccaccact cccagccctc caccaaccac cacaaccacc 4741 cctccaccaa ccaccactcc cagccctcca acaaccacca ctcccagtcc tccaacaatc 4801 accacaacca cccctccacc aaccaccact cccagccctc caacaacgac cacaaccacc 4861 cctccaccaa ccaccactcc cagccctcca acgactacac ccatcactcc accaaccagc 4921 actaccaccc ttccaccaac caccactccc agccctccac caaccaccac aaccacccct 4981 ccaccaacca ccactcccag ccctccaaca accaccactc ccagccctcc aataaccacc 5041 acaaccaccc ctccaccaac caccactccc agctctccaa taaccaccac tcccagccct 5101 ccaacaacca ccatgaccac cccttcacca accaccaccc ccagctctcc aataaccacc 5161 acaaccaccc cttcctcaac taccactccc agccctccac caaccaccat gaccacccct 5221 tcaccaacca ccactcccag ccctccaaca accaccatga ccacccttcc accaaccacc 5281 acttccagcc ctctaacaac tactcctcta cctccatcaa taactcctcc tacattttca 5341 ccattctcaa cgacaacccc tactacccca tgcgtgcctc tctgcaattg gactggctgg 5401 ctggattctg gaaaacccaa ctttcacaaa ccaggtggag acacagaatt gattggagac 5461 gtctgtggac caggctgggc agctaacatc tcttgcagag ccaccatgta tcctgatgtt 5521 cccattggac agcttggaca aacagtggtg tgtgatgtct ctgtggggct gatatgcaaa

5581 aatgaagacc aaaagccagg tggggtcatc cctatggcct tctgcctcaa ctacgagatc 5641 aacgttcagt gctgtgagtg tgtcacccaa cccaccacca tgacaaccac caccacagag 5701 aacccaactc cgccaaccac gacacccatc accaccacca ctacggtgac cccaacccca 5761 acacccaccg gcacacagac cccaaccacg acacccatca ccaccaccac tacggtgacc 5821 ccaaccccaa cacccaccgg cacacagacc ccaaccacga cacccatcac caccaccact 5881 acggtgaccc caaccccaac acccaccggc acacagaccc caaccacgac acccatcacc 5941 accaccacta cggtgacccc aaccccaaca cccaccggca cacagacccc aaccacgaca 6001 cccatcacca ccaccactac ggtgacccca accccaacac ccaccggcac acagacccca 6061 accacgacac ccatcaccac caccactacg gtgaccccaa ccccaacacc caccggcaca 6121 cagaccccaa ccacgacacc catcaccacc accactacgg tgaccccaac cccaacaccc 6181 accggcacac agaccccaac cacgacaccc atcaccacca ccactacggt gaccccaacc 6241 ccaacaccca ccggcacaca gaccccaacc acgacaccca tcaccaccac cactacggtg 6301 accccaaccc caacacccac cggcacacag accccaacca cgacacccat caccaccacc 6361 actacggtga ccccaacccc aacacccacc ggcacacaga ccccaaccac gacacccatc 6421 accaccacca ctacggtgac cccaacccca acacccaccg gcacacagac cccaaccacg 6481 acacccatca ccaccaccac tacggtgacc ccaaccccaa cacccaccgg cacacagacc 6541 ccaaccacga cacccatcac caccaccact acggtgaccc caaccccaac acccaccggc 6601 acacagaccc caaccacgac acccatcacc accaccacta cggtgacccc aaccccaaca 6661 cccaccggca cacagacccc aaccacgaca cccatcacca ccaccactac ggtgacccca 6721 accccaacac ccaccggcac acagacccca accacgacac ccatcaccac caccactacg 6781 gtgaccccaa ccccaacacc caccggcaca cagaccccaa ccacgacacc catcaccacc 6841 accactacgg tgaccccaac cccaacaccc accggcacac agaccccaac cacgacaccc 6901 atcaccacca ccactacggt gaccccaacc ccaacaccca ccggcacaca gaccccaacc 6961 acgacaccca tcaccaccac cactacggtg accccaaccc caacacccac cggcacacag 7021 accccaacca cgacacccat caccaccacc actacggtga ccccaacccc aacacccacc 7081 ggcacacaga ccccaaccac gacacccatc accaccacca ctacggtgac cccaacccca 7141 acacccaccg gcacacagac cccaaccacg acacccatca ccaccaccac tacggtgacc 7201 ccaaccccaa cacccaccgg cacacagacc ccaaccacga cacccatcac caccaccact 7261 acggtgaccc caaccccaac acccaccggc acacagaccc caaccacgac acccatcacc 7321 accaccacta cggtgacccc aaccccaaca cccaccggca cacagacccc aaccacgaca 7381 cccatcacca ccaccactac ggtgacccca accccaacac ccaccggcac acagacccca 7441 accacgacac ccatcaccac caccactacg gtgaccccaa ccccaacacc caccggcaca 7501 cagaccccaa ccacgacacc catcaccacc accactacgg tgaccccaac cccaacaccc 7561 accggcacac agaccccaac cacgacaccc atcaccacca ccactacggt gaccccaacc 7621 ccaacaccca ccggcacaca gaccccaacc acgacaccca tcaccaccac cactacggtg 7681 accccaaccc caacacccac cggcacacag accccaacca cgacacccat caccaccacc 7741 actacggtga ccccaacccc aacacccacc ggcacacaga ccccaaccac gacacccatc 7801 accaccacca ctacggtgac cccaacccca acacccaccg gcacacagac cccaaccacg 7861 acacccatca ccaccaccac tacggtgacc ccaaccccaa cacccaccgg cacacagacc 7921 ccaaccacga cacccatcac caccaccact acggtgaccc caaccccaac acccaccggc 7981 acacagaccc caaccacgac acccatcacc accaccacta cggtgacccc aaccccaaca 8041 cccaccggca cacagacccc aaccacgaca cccatcacca ccaccactac ggtgacccca 8101 accccaacac ccaccggcac acagacccca accacgacac ccatcaccac caccactacg 8161 gtgaccccaa ccccaacacc caccggcaca cagaccccaa ccacgacacc catcaccacc 8221 accactacgg tgaccccaac cccaacaccc accggcacac agaccccaac cacgacaccc 8281 atcaccacca ccactacggt gaccccaacc ccaacaccca ccggcacaca gaccccaacc 8341 acgacaccca tcaccaccac cactacggtg accccaaccc caacacccac cggcacacag 8401 accccaacca cgacacccat caccaccacc actacggtga ccccaacccc aacacccacc 8461 ggcacacaga ccccaaccac gacacccatc accaccacca ctacggtgac cccaacccca 8521 acacccaccg gcacacagac cccaaccacg acacccatca ccaccaccac tacggtgacc 8581 ccaaccccaa cacccaccgg cacacagacc ccaaccacga cacccatcac caccaccact 8641 acggtgaccc caaccccaac acccaccggc acacagaccc caaccacgac acccatcacc 8701 accaccacta cggtgacccc aaccccaaca cccaccggca cacagacccc aaccacgaca 8761 cccatcacca ccaccactac ggtgacccca accccaacac ccaccggcac acagacccca 8821 accacgacac ccatcaccac caccactacg gtgaccccaa ccccaacacc caccggcaca 8881 cagaccccaa ccacgacacc catcaccacc accactacgg tgaccccaac cccaacaccc 8941 accggcacac agaccccaac cacgacaccc atcaccacca ccactacggt gaccccaacc 9001 ccaacaccca ccggcacaca gaccccaacc acgacaccca tcaccaccac cactacggtg

9061 accccaaccc caacacccac cggcacacag accccaacca cgacacccat caccaccacc 9121 actacggtga ccccaacccc aacacccacc ggcacacaga ccccaaccac gacacccatc 9181 accaccacca ctacggtgac cccaacccca acacccaccg gcacacagac cccaaccacg 9241 acacccatca ccaccaccac tacggtgacc ccaaccccaa cacccaccgg cacacagacc 9301 ccaaccacga cacccatcac caccaccact acggtgaccc caaccccaac acccaccggc 9361 acacagaccc caaccacgac acccatcacc accaccacta cggtgacccc aaccccaaca 9421 cccaccggca cacagacccc aaccacgaca cccatcacca ccaccactac ggtgacccca 9481 accccaacac ccaccggcac acagacccca accacgacac ccatcaccac caccactacg 9541 gtgaccccaa ccccaacacc caccggcaca cagaccccaa ccacgacacc catcaccacc 9601 accactacgg tgaccccaac cccaacaccc accggcacac agaccccaac cacgacaccc 9661 atcaccacca ccactacggt gaccccaacc ccaacaccca ccggcacaca gaccccaacc 9721 acgacaccca tcaccaccac cactacggtg accccaaccc caacacccac cggcacacag 9781 accccaacca cgacacccat caccaccacc actacggtga ccccaacccc aacacccacc 9841 ggcacacaga ccccaaccac gacacccatc accaccacca ctacggtgac cccaacccca 9901 acacccaccg gcacacagac cccaaccacg acacccatca ccaccaccac tacggtgacc 9961 ccaaccccaa cacccaccgg cacacagacc ccaaccacga cacccatcac caccaccact 10021 acggtgaccc caaccccaac acccaccggc acacagaccc caaccacgac acccatcacc 10081 accaccacta cggtgacccc aaccccaaca cccaccggca cacagacccc aaccacgaca 10141 cccatcacca ccaccactac ggtgacccca accccaacac ccaccggcac acagacccca 10201 accacgacac ccatcaccac caccactacg gtgaccccaa ccccaacacc caccggcaca 10261 cagaccccaa ccacgacacc catcaccacc accactacgg tgaccccaac cccaacaccc 10321 accggcacac agaccccaac cacgacaccc atcaccacca ccactacggt gaccccaacc 10381 ccaacaccca ccggcacaca gaccccaacc acgacaccca tcaccaccac cactacggtg 10441 accccaaccc caacacccac cggcacacag accccaacca cgacacccat caccaccacc 10501 actacggtga ccccaacccc aacacccacc ggcacacaga ccccaaccac gacacccatc 10561 accaccacca ctacggtgac cccaacccca acacccaccg gcacacagac cccaaccacg 10621 acacccatca ccaccaccac tacggtgacc ccaaccccaa cacccaccgg cacacagacc 10681 ccaaccacga cacccatcac caccaccact acggtgaccc caaccccaac acccaccggc 10741 acacagaccc caaccacgac acccatcacc accaccacta cggtgacccc aaccccaaca 10801 cccaccggca cacagacccc aaccacgaca cccatcacca ccaccactac ggtgacccca 10861 accccaacac ccaccggcac acagacccca accacgacac ccatcaccac caccactacg 10921 gtgaccccaa ccccaacacc caccggcaca cagaccccaa ccacgacacc catcaccacc 10981 accactacgg tgaccccaac cccaacaccc accggcacac agaccccaac cacgacaccc 11041 atcaccacca ccactacggt gaccccaacc ccaacaccca ccggcacaca gaccccaacc 11101 acgacaccca tcaccaccac cactacggtg accccaaccc caacacccac cggcacacag 11161 accccaacca cgacacccat caccaccacc actacggtga ccccaacccc aacacccacc 11221 ggcacacaga ccccaaccac gacacccatc accaccacca ctacggtgac cccaacccca 11281 acacccaccg gcacacagac cccaaccacg acacccatca ccaccaccac tacggtgacc 11341 ccaaccccaa cacccaccgg cacacagacc ccaaccacga cacccatcac caccaccact 11401 acggtgaccc caaccccaac acccaccggc acacagaccc caaccacgac acccatcacc 11461 accaccacta cggtgacccc aaccccaaca cccaccggca cacagacccc aaccacgaca 11521 cccatcacca ccaccactac ggtgacccca accccaacac ccaccggcac acagacccca 11581 accacgacac ccatcaccac caccactacg gtgaccccaa ccccaacacc caccggcaca 11641 cagaccccaa ccacgacacc catcaccacc accactacgg tgaccccaac cccaacaccc 11701 accggcacac agaccccaac cacgacaccc atcaccacca ccactacggt gaccccaacc 11761 ccaacaccca ccggcacaca gaccccaacc acgacaccca tcaccaccac cactacggtg 11821 accccaaccc caacacccac cggcacacag accccaacca cgacacccat caccaccacc 11881 actacggtga ccccaacccc aacacccacc ggcacacaga ccccaaccac gacacccatc 11941 accaccacca ctacggtgac cccaacccca acacccaccg gcacacagac cccaaccacg 12001 acacccatca ccaccaccac tacggtgacc ccaaccccaa cacccaccgg cacacagacc 12061 ccaaccacga cacccatcac caccaccact acggtgaccc caaccccaac acccaccggc 12121 acacagaccc caaccacgac acccatcacc accaccacta cggtgacccc aaccccaaca 12181 cccaccggca cacagacccc aaccacgaca cccatcacca ccaccactac ggtgacccca 12241 accccaacac ccaccggcac acagacccca accacgacac ccatcaccac caccactacg 12301 gtgaccccaa ccccaacacc caccggcaca cagaccccaa ccacgacacc catcaccacc 12361 accactacgg tgaccccaac cccaacaccc accggcacac agaccccaac cacgacaccc 12421 atcaccacca ccactacggt gaccccaacc ccaacaccca ccggcacaca gaccccaacc 12481 acgacaccca tcaccaccac cactacggtg accccaaccc caacacccac cggcacacag

12541 accccaacca cgacacccat caccaccacc actacggtga ccccaacccc aacacccacc 12601 ggcacacaga ccgggccccc cacccacaca agcacagcac cgattgctga gttgaccaca 12661 tccaatcctc cgcctgagtc ctcaacccct cagacctctc ggtccacctc ttcccctctc 12721 acggagtcaa ccacccttct gagtacccta ccacctgcca ttgagatgac cagcacggcc 12781 ccaccctcca cacccacggc acccacgacc acgagcggag gccacacact gtctccaccg 12841 cccagcacca ccacgtcccc tccaggcacc cccactcgcg gtaccacgac tgggtcatct 12901 tcagccccca cccccagcac tgtgcagacg accaccacca gtgcctggac ccccacgccg 12961 accccactct ccacacccag catcatcagg accacaggcc tgaggcccta cccttcctct 13021 gtgcttatct gctgtgtcct gaacgacacc tactacgcac caggtgagga ggtgtacaac 13081 ggcacatacg gagacacctg ttatttcgtc aactgctcac tgagctgtac gttggagttc 13141 tataactggt cctgcccatc cacgccctcc ccaacaccca cgccctccaa gtcgacgccc 13201 acgccttcca agccatcgtc cacgccctcc aagccgacgc ccggcaccaa gccccccgag 13261 tgcccagact ttgatcctcc cagacaggag aacgagactt ggtggctgtg cgactgcttc 13321 atggccacgt gcaagtacaa caacacggtg gagatcgtga aggtggagtg tgagccgccg 13381 cccatgccca cctgctccaa cggcctccaa cccgtgcgcg tcgaggaccc cgacggctgc 13441 tgctggcact gggagtgcga ctgctactgc acgggctggg gcgacccgca ctatgtcacc 13501 ttcgacggac tctactacag ctaccagggc aactgcacct acgtgctggt ggaggagatc 13561 agcccctccg tggacaactt cggagtttac atcgacaact accactgcga tcccaacgac 13621 aaggtgtcct gcccccgcac cctcatcgtg cgccacgaga cccaggaggt gctgatcaag 13681 accgtgcata tgatgcccat gcaggtgcag gtgcaggtga acaggcaggc ggtggcactg 13741 ccctacaaga agtacgggct ggaggtgtac cagtctggca tcaactacgt ggtggacatc 13801 cccgagctgg gtgtcctcgt ctcctacaat ggcctgtcct tctccgtcag gctgccctac 13861 caccggtttg gcaacaacac caagggccag tgtggcacct gcaccaacac cacctccgac 13921 gactgcattc tgcccagcgg ggagatcgtc tccaactgtg aggctgcggc tgaccagtgg 13981 ctggtgaacg acccctccaa gccacactgc ccccacagca gctccacgac caagcgcccg 14041 gccgtcactg tgcccggggg cggtaaaacg accccacaca aggactgcac cccatctccc 14101 ctctgccagc tcatcaagga cagcctgttt gcccagtgcc acgcactggt gcccccgcag 14161 cactactacg atgcctgcgt gttcgacagc tgcttcatgc cgggctcgag cctggagtgc 14221 gccagtctgc aggcctacgc agccctctgt gcccagcaga acatctgcct cgactggcgg 14281 aaccacacgc atggggcctg cttggtggag tgcccatctc acagggagta ccaggcctgt 14341 ggccctgcag aagagcccac gtgcaaatcc agctcctccc agcagaacaa cacagtcctg 14401 gtggaaggct gcttctgtcc tgagggcacc atgaactacg ctcctggctt tgatgtctgc 14461 gtgaagacct gcggctgtgt gggacctgac aatgtgccca gagagtttgg ggagcacttc 14521 gagttcgact gcaagaactg tgtctgcctg gagggtggaa gtggcatcat ctgccaaccc 14581 aagaggtgca gccagaagcc cgttacccac tgcgtggaag acggcaccta cctcgccacg 14641 gaggtcaacc ctgccgacac ctgctgcaac attaccgtct gcaagtgcaa caccagcctg 14701 tgcaaagaga agccctccgt gtgcccgctg ggattcgaag tgaagagcaa gatggtgcct 14761 ggaaggtgct gtcctttcta ctggtgtgag tccaaggggg tgtgtgttca cgggaatgct 14821 gagtaccagc ccggttctcc agtttattcc tccaagtgcc aggactgcgt gtgcacggac 14881 aaggtggaca acaacaccct gctcaacgtc atcgcctgca cccacgtgcc ctgcaacacc 14941 tcctgcagcc ctggcttcga actcatggag gcccccgggg agtgctgtaa gaagtgtgaa 15001 cagacgcact gtatcatcaa acggcccgac aaccagcacg tcatcctgaa gcccggggac 15061 ttcaagagcg acccgaagaa caactgcaca ttcttcagct gcgtgaagat ccacaaccag 15121 ctcatctcgt ccgtctccaa catcacctgc cccaactttg atgccagcat ttgcatcccg 15181 ggctccatca cattcatgcc caatggatgc tgcaagacct gcacccctcg caatgagacc 15241 agggtgccct gctccaccgt ccccgtcacc acggaggttt cgtacgccgg ctgcaccaag 15301 accgtcctca tgaatcattg ctccgggtcc tgcgggacat ttgtcatgta ctcggccaag 15361 gcccaggccc tggaccacag ctgctcctgc tgcaaagagg agaaaaccag ccagcgtgag 15421 gtggtcctga gctgccccaa tggcggctcg ctgacacaca cctacaccca catcgagagc 15481 tgccagtgcc aggacaccgt ctgcgggctc cccaccggca cctcccgccg ggcccggcgc 15541 tcccctaggc atctggggag cgggtgagcg gggtgggcac agcccccttc actgccctcg 15601 acagctttac ctcccccgga ccctctgagc ctcctaagct cggcttcctc tcttcagata 15661 tttattgtct gagtctttgt tcagtccttg ctttccaata ataaactcag ggggacatgc

[00133] Por "polipeptídeo NKX2-5" ou "polipeptídeo

NKX2-5 humano (hNKX2-5)" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_004378.1 (isoforma 1), No. de Acesso NP_001159647.1 (isoforma 2) ou No. de Acesso NP_001159648.1 (isoforma 3) e tendo atividade de fator de transcrição. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_004378.1 é mostrada abaixo: 1 MFPSPALTPT PFSVKDILNL EQQQRSLAAA GELSARLEAT LAPSSCMLAA FKPEAYAGPE 61 AAAPGLPELR AELGRAPSPA KCASAFPAAP AFYPRAYSDP DPAKDPRAEK KELCALQKAV 121 ELEKTEADNA ERPRARRRRK PRVLFSQAQV YELERRFKQQ RYLSAPERDQ LASVLKLTST 181 QVKIWFQNRR YKCKRQRQDQ TLELVGLPPP PPPPARRIAV PVLVRDGKPC LGDSAPYAPA 241 YGVGLNPYGY NAYPAYPGYG GAACSPGYSC TAAYPAGPSP AQPATAAANN NFVNFGVGDL 301 NAVQSPGIPQ SNSGVSTLHG IRAW

[00134] Por "polinucleotídeo NKX2-5" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo NKX2-5 ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica NKX2-5 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_004387.3. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_004387.3 é reproduzida abaixo: 1 gctcctgtca tcgaggcccc tggcccaatg gcaggctgag tccccctcct ctggcctggt 61 cccgcctctc ctgccccttg tgctcagcgc tacctgctgc ccggacacat ccagagctgg 121 ccgacgggtg cgcgggcggg cggcggcacc atgcagggaa gctgccaggg gccgtgggca 181 gcgccgcttt ctgccgccca cctggcgctg tgagactggc gctgccacca tgttccccag 241 ccctgctctc acgcccacgc ccttctcagt caaagacatc ctaaacctgg aacagcagca 301 gcgcagcctg gctgccgccg gagagctctc tgcccgcctg gaggcgaccc tggcgccctc 361 ctcctgcatg ctggccgcct tcaagccaga ggcctacgct gggcccgagg cggctgcgcc 421 gggcctccca gagctgcgcg cagagctggg ccgcgcgcct tcaccggcca agtgtgcgtc 481 tgcctttccc gccgcccccg ccttctatcc acgtgcctac agcgaccccg acccagccaa 541 ggaccctaga gccgaaaaga aagagctgtg cgcgctgcag aaggcggtgg agctggagaa 601 gacagaggcg gacaacgcgg agcggccccg ggcgcgacgg cggaggaagc cgcgcgtgct 661 cttctcgcag gcgcaggtct atgagctgga gcggcgcttc aagcagcagc ggtacctgtc 721 ggcccccgaa cgcgaccagc tggccagcgt gctgaaactc acgtccacgc aggtcaagat 781 ctggttccag aaccggcgct acaagtgcaa gcggcagcgg caggaccaga ctctggagct 841 ggtggggctg cccccgccgc cgccgccgcc tgcccgcagg atcgcggtgc cagtgctggt 901 gcgcgatggc aagccatgcc taggggactc ggcgccctac gcgcctgcct acggcgtggg 961 cctcaatccc tacggttata acgcctaccc cgcctatccg ggttacggcg gcgcggcctg

1021 cagccctggc tacagctgca ctgccgctta ccccgccggg ccttccccag cgcagccggc 1081 cactgccgcc gccaacaaca acttcgtgaa cttcggcgtc ggggacttga atgcggttca 1141 gagccccggg attccgcaga gcaactcggg agtgtccacg ctgcatggta tccgagcctg 1201 gtagggaagg gacccgcgtg gcgcgaccct gaccgatccc acctcaacag ctccctgact 1261 ctcgggggga gaaggggctc ccaacatgac cctgagtccc ctggattttg cattcactcc 1321 tgcggagacc taggaacttt ttctgtccca cgcgcgtttg ttcttgcgca cgggagagtt 1381 tgtggcggcg attatgcagc gtgcaatgag tgatcctgca gcctggtgtc ttagctgtcc 1441 ccccaggagt gccctccgag agtccatggg cacccccggt tggaactggg actgagctcg 1501 ggcacgcagg gcctgagatc tggccgccca ttccgcgagc cagggccggg cgcccgggcc 1561 tttgctatct cgccgtcgcc cgcccacgca cccacccgta tttatgtttt tacctattgc 1621 tgtaagaaat gacgatcccc ttcccattaa agagagtgcg ttgaccccg

[00135] Por "polipeptídeo NEUROD1" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_002491.2 e tendo atividade de fator de transcrição. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_002491.2 é mostrada abaixo: 1 MTKSYSESGL MGEPQPQGPP SWTDECLSSQ DEEHEADKKE DDLEAMNAEE DSLRNGGEEE 61 DEDEDLEEEE EEEEEDDDQK PKRRGPKKKK MTKARLERFK LRRMKANARE RNRMHGLNAA 121 LDNLRKVVPC YSKTQKLSKI ETLRLAKNYI WALSEILRSG KSPDLVSFVQ TLCKGLSQPT 181 TNLVAGCLQL NPRTFLPEQN QDMPPHLPTA SASFPVHPYS YQSPGLPSPP YGTMDSSHVF 241 HVKPPPHAYS AALEPFFESP LTDCTSPSFD GPLSPPLSIN GNFSFKHEPS AEFEKNYAFT 301 MHYPAATLAG AQSHGSIFSG TAAPRCEIPI DNIMSFDSHS HHERVMSAQL NAIFHD

[00136] Por "polinucleotídeo NEUROD1" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo NEUROD1 ou fragmento do mesmo. Uma sequência de polinucleotídeo NEUROD1 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_002500.4. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_002500.4 é reproduzida abaixo: 1 ggggaggagg ggagaacggg gagcgcacag cctggacgcg tgcgcaggcg tcaggcgcat 61 agacctgcta gcccctcagc tagcggcccc gcccgcgctt agcatcacta actgggctat 121 ataacctgag cgcccgcgcg gccacgacac gaggaattcg cccacgcagg aggcgcggcg 181 tccggaggcc ccagggttat gagactatca ctgctcagga cctactaaca acaaaggaaa

241 tcgaaacatg accaaatcgt acagcgagag tgggctgatg ggcgagcctc agccccaagg 301 tcctccaagc tggacagacg agtgtctcag ttctcaggac gaggagcacg aggcagacaa 361 gaaggaggac gacctcgaag ccatgaacgc agaggaggac tcactgagga acgggggaga 421 ggaggaggac gaagatgagg acctggaaga ggaggaagaa gaggaagagg aggatgacga 481 tcaaaagccc aagagacgcg gccccaaaaa gaagaagatg actaaggctc gcctggagcg 541 ttttaaattg agacgcatga aggctaacgc ccgggagcgg aaccgcatgc acggactgaa 601 cgcggcgcta gacaacctgc gcaaggtggt gccttgctat tctaagacgc agaagctgtc 661 caaaatcgag actctgcgct tggccaagaa ctacatctgg gctctgtcgg agatcctgcg 721 ctcaggcaaa agcccagacc tggtctcctt cgttcagacg ctttgcaagg gcttatccca 781 acccaccacc aacctggttg cgggctgcct gcaactcaat cctcggactt ttctgcctga 841 gcagaaccag gacatgcccc cccacctgcc gacggccagc gcttccttcc ctgtacaccc 901 ctactcctac cagtcgcctg ggctgcccag tccgccttac ggtaccatgg acagctccca 961 tgtcttccac gttaagcctc cgccgcacgc ctacagcgca gcgctggagc ccttctttga 1021 aagccctctg actgattgca ccagcccttc ctttgatgga cccctcagcc cgccgctcag 1081 catcaatggc aacttctctt tcaaacacga accgtccgcc gagtttgaga aaaattatgc 1141 ctttaccatg cactatcctg cagcgacact ggcaggggcc caaagccacg gatcaatctt 1201 ctcaggcacc gctgcccctc gctgcgagat ccccatagac aatattatgt ccttcgatag 1261 ccattcacat catgagcgag tcatgagtgc ccagctcaat gccatatttc atgattagag 1321 gcacgccagt ttcaccattt ccgggaaacg aacccactgt gcttacagtg actgtcgtgt 1381 ttacaaaagg cagccctttg ggtactactg ctgcaaagtg caaatactcc aagcttcaag 1441 tgatatatgt atttattgtc attactgcct ttggaagaaa caggggatca aagttcctgt 1501 tcaccttatg tattattttc tatagctctt ctatttaaaa aataaaaaaa tacagtaaag 1561 tttaaaaaat acaccacgaa tttggtgtgg ctgtattcag atcgtattaa ttatctgatc 1621 gggataacaa aatcacaagc aataattagg atctatgcaa tttttaaact agtaatgggc 1681 caattaaaat atatataaat atatattttt caaccagcat tttactactt gttacctttc 1741 ccatgctgaa ttattttgtt gtgattttgt acagaatttt taatgacttt ttataatgtg 1801 gatttcctat tttaaaacca tgcagcttca tcaattttta tacatatcag aaaagtagaa 1861 ttatatctaa tttatacaaa ataatttaac taatttaaac cagcagaaaa gtgcttagaa 1921 agttattgtg ttgccttagc acttctttcc tctccaattg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1981 aaaaaaaaaa aaaaattgca caatttgagc aattcatttc actttaaagt ctttccgtct 2041 ccctaaaata aaaaccagaa tcataatttt caagagaaga aaaaattaag agatacattc 2101 cctatcaaaa catatcaatt caacacatta cttgcacaag cttgtatata catattataa 2161 ataaatgcca acataccctt ctttaaatca aaagctgctt gactatcaca tacaatttgc 2221 actgttactt tttagtcttt tactcctttg cattccatga ttttacagag aatctgaagc 2281 tattgatgtt tccagaaaat ataaatgcat gattttatac atagtcacaa aaatggtggt 2341 ttgtcatata ttcatgtaat aaatctgagc ctaaatctaa tcaggttgtt aatgttggga 2401 tttatatcta tagtagtcaa ttagtacagt agcttaaata aattcaaacc atttaattca 2461 taattagaac aatagctatt gcatgtaaaa tgcagtccag aataagtgct gtttgagatg 2521 tgatgctggt accactggaa tcgatctgta ctgtaatttt gtttgtaatc ctgtatatta 2581 tggtgtaatg cacaatttag aaaacattca tccagttgca ataaaatagt attgaaagtg 2641 agagcaattg ttgcatttct tcttaaaggg attctgtttt tatttttggg gaaagtagtt 2701 gcttttttgc tgagttaaaa aatactaaac actatatgta gaataaaaga aaagaaaaaa 2761 gtttaccttg gcatatgctc ttgtctgttt atcttgcaca gggagtcacc agttctatgt 2821 agataatgaa aagacctaac tgatatttca ttatttggaa tatgggactg gacggcagta 2881 caaacagtgt gtttttttct ttgttttaag tggcttagcc tttaggtttt ttatttccat 2941 ttttaaaaat gattgttaca tgttttcttc tatttctttt tttaaaaggt ggattttaat 3001 aa

[00137] Por "polipeptídeo NKX6-1" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_006159.2 e tendo atividade de fator de transcrição. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_006159.2 é mostrada abaixo: 1 MLAVGAMEGT RQSAFLLSSP PLAALHSMAE MKTPLYPAAY PPLPAGPPSS SSSSSSSSSP 61 SPPLGTHNPG GLKPPATGGL SSLGSPPQQL SAATPHGIND ILSRPSMPVA SGAALPSASP 121 SGSSSSSSSS ASASSASAAA AAAAAAAAAA SSPAGLLAGL PRFSSLSPPP PPPGLYFSPS 181 AAAVAAVGRY PKPLAELPGR TPIFWPGVMQ SPPWRDARLA CTPHQGSILL DKDGKRKHTR 241 PTFSGQQIFA LEKTFEQTKY LAGPERARLA YSLGMTESQV KVWFQNRRTK WRKKHAAEMA 301 TAKKKQDSET ERLKGASENE EEDDDYNKPL DPNSDDEKIT QLLKKHKSSS GGGGGLLLHA 361 SEPESSS

[00138] Por "polinucleotídeo NKX6-1" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo NKX6-1 ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica NKX6-1 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_006168.2. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_006168.2 é reproduzida abaixo: 1 cgtgggatgt tagcggtggg ggcaatggag ggcacccggc agagcgcatt cctgctcagc 61 agccctcccc tggccgccct gcacagcatg gccgagatga agaccccgct gtaccctgcc 121 gcgtatcccc cgctgcctgc cggccccccc tcctcctcgt cctcgtcgtc gtcctcctcg 181 tcgccctccc cgcctctggg cacccacaac ccaggcggcc tgaagccccc ggccacgggg 241 gggctctcat ccctcggcag ccccccgcag cagctctcgg ccgccacccc acacggcatc 301 aacgatatcc tgagccggcc ctccatgccc gtggcctcgg gggccgccct gccctccgcc 361 tcgccctccg gttcctcctc ctcctcttcc tcgtccgcct ctgcctcctc cgcctctgcc 421 gccgccgcgg ctgctgccgc ggccgcagcc gccgcctcat ccccggcggg gctgctggcc 481 ggactgccac gctttagcag cctgagcccg ccgccgccgc cgcccgggct ctacttcagc 541 cccagcgccg cggccgtggc cgccgtgggc cggtacccca agccgctggc tgagctgcct 601 ggccggacgc ccatcttctg gcccggagtg atgcagagcc cgccctggag ggacgcacgc 661 ctggcctgta cccctcatca aggatccatt ttgttggaca aagacgggaa gagaaaacac 721 acgagaccca ctttttccgg acagcagatc ttcgccctgg agaagacttt cgaacaaaca 781 aaatacttgg cggggcccga gagggctcgt ttggcctatt cgttggggat gacagagagt 841 caggtcaagg tctggttcca gaaccgccgg accaagtgga ggaagaagca cgctgccgag 901 atggccacgg ccaagaagaa gcaggactcg gagacagagc gcctcaaggg ggcctcggag 961 aacgaggaag aggacgacga ctacaataag cctctggatc ccaactcgga cgacgagaaa 1021 atcacgcagc tgttgaagaa gcacaagtcc agcagcggcg gcggcggcgg cctcctactg 1081 cacgcgtccg agccggagag ctcatcctga acgccg

[00139] Por "polipeptídeo NDUFA4" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%

de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_002480.1 e possuindo atividade NADH desidrogenase e atividade oxidorredutase. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_002480.1 é mostrada abaixo: 1 MAAELAMGAE LPSSPLAIEY VNDFDLMKFE VKKEPPEAER FCHRLPPGSL SSTPLSTPCS 61 SVPSSPSFCA PSPGTGGGGG AGGGGGSSQA GGAPGPPSGG PGAVGGTSGK PALEDLYWMS 121 GYQHHLNPEA LNLTPEDAVE ALIGSGHHGA HHGAHHPAAA AAYEAFRGPG FAGGGGADDM 181 GAGHHHGAHH AAHHHHAAHH HHHHHHHHGG AGHGGGAGHH VRLEERFSDD QLVSMSVREL 241 NRQLRGFSKE EVIRLKQKRR TLKNRGYAQS CRFKRVQQRH ILESEKCQLQ SQVEQLKLEV 301 GRLAKERDLY KEKYEKLAGR GGPGSAGGAG FPREPSPPQA GPGGAKGTAD FFL

[00140] Por "polinucleotídeo NDUFA4" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo NDUFA4 ou fragmento do mesmo. Uma sequência de polinucleotídeo NDUFA4 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_002489.3. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_002489.3 é reproduzida abaixo: 1 gggtccttca ggtaggaggt cctgggtgac tttggaagtc cgtagtgtct cattgcagat 61 aatttttagc ttagggcctg gtggctaggt cggttctctc ctttccagtc ggagacctct 121 gccgcaaaca tgctccgcca gatcatcggt caggccaaga agcatccgag cttgatcccc 181 ctctttgtat ttattggaac tggagctact ggagcaacac tgtatctctt gcgtctggca 241 ttgttcaatc cagatgtttg ttgggacaga aataacccag agccctggaa caaactgggt 301 cccaatgatc aatacaagtt ctactcagtg aatgtggatt acagcaagct gaagaaggaa 361 cgtccagatt tctaaatgaa atgtttcact ataacgctgc tttagaatga aggtcttcca 421 gaagccacat ccgcacaatt ttccacttaa ccaggaaata tttctcctct aaatgcatga 481 aatcatgttg gagatctcta ttgtaatctc tattggagat tacaatgatt aaatcaataa 541 ataactgaaa cttgatatgt gtcacttttt tatgctgaaa gtatgctctg aactttagag 601 tataggaaat taactattag aatttaaaga atttcttgaa tttctgtagt ttgaaaatac 661 gactttaagc tgctttagta aaacacttcc attttgtgta tagactgttg gtaacttcac 721 tagagcatac ataacaactg gaactggaaa ttatacaaaa gtaaattggg aaggatactc 781 cagcatctga cactggcaaa atggaaacct ttgagtttct cttactggct gttgaagtgt 841 gtgcagtttt taacaatggt ttttacttgg catctctttg ttgtgatttt caaggttata 901 agttgctttg gtcctaggat tgaagttgaa atctgagttt atcagtgcta accatggtgc 961 tagtagtcaa gagatcttga gaattttggc tgctgagtct tggtgcaggg tgcaggtttt 1021 cttttctttt ttcttttttt tttttttgag atagtctctg tcacccaggc tggagtgcag 1081 tggtacaaac atggatcact gcagcctcta cctcccgggc ttaagtgatc ctcctgcctc 1141 agcccctaag tagccgggac tacaggtatg tgccaccatg cccagttaat ttttgtaatt 1201 ttttttagag acagggtttt gccatgttgc ccaggctggt ctcaaactct tgagctcaag 1261 cgatccattc tcctcagcct cccagggtgc tgggattaca ggcgtgagcc attgcgctta 1321 gccatggtgc aggttttcaa aggccaggaa gtatattcat aattttaaga tggggaatat 1381 agcaagtttt cacataggtg tgtgtaagtc atcacatcat agaaacttga ggaattcagt 1441 gacattaatt ttggattttc atacgtaagt atacaattaa atgtttacag ggtagtagaa 1501 gcacatttta aatgtcagga actgaactaa gtatttgaat tacgtggatt atctcaaaaa 1561 ttttgaaatt gttaaacgag ttgaattact tgaattcatt ctgttagtca aatggtggat

1621 atttacaccc atgtagtttt gaatttagag tgtgtagagt gttttcagtt accagactcc 1681 atgcttttac ctcctatgtg tcaggtataa tttgaacctc taagaacagg gtttctcaac 1741 cttgccactg ttgactattt ctgaaagaca gtttggttta gcagaccatc ccatgcgctt 1801 tagcttgttt agtagctaac ttgggctctg ccactacaga caaaaagcac tctttccctc 1861 caattcccac aggctatgag aagaatggag acattaccaa atgtccattg gtgggcaaaa 1921 ttgcttcatt cctacctctg ttgagaatta ctctagatcc tttggcacaa attacctcaa 1981 agtttaaaat tgtgtaaaca aacagtgtgt catgtaattg aaaaacatta agcaactcca 2041 aataaatgct acattaag

[00141] Conforme usado neste documento, "obter" como em "obter um agente" inclui sintetizar, comprar, adquirir, derivar ou de outra forma adquirir o agente.

[00142] Por "órgão" entende-se uma coleção de células que desempenham uma função biológica. Em uma modalidade, um órgão inclui, mas não está limitado a, bexiga, cérebro, tecido nervoso, tecido glial, esôfago, trompa de Falópio, coração, pâncreas, intestinos, vesícula biliar, rim, fígado, pulmão, ovários, próstata, medula espinhal, baço, estômago, testículos, timo, tireoide, traqueia, trato urogenital, ureter, uretra, útero, mama, músculo esquelético, pele, osso e cartilagem. A função biológica de um órgão pode ser avaliada usando métodos padrão conhecidos da pessoa versada na técnica.

[00143] Por "organoide" entende-se um corpo gerado in vitro que imita a estrutura e a função do órgão.

"Organoide" e "mini órgão" são usados indistintamente neste documento. Um "organoide semelhante a uma ilhota", "organoide de ilhota pancreática", "ilhota pancreática" ou "organoide pancreático" é um agrupamento de células gerado in vitro que imita a estrutura e a função de uma ilhota pancreática. Funções exemplares de uma ilhota pancreática incluem, sem limitação, secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS), secreção de insulina estimulada por cloreto de potássio (KCl), secreção de insulina estimulada por GLP- 1, secreção de somatostatina ou secreção de glucagon.

"Organoide de ilhotas pancreáticas", "organoides semelhantes a ilhotas", "organoides pancreáticos" e "minilhotas pancreáticas" são usados indistintamente neste documento. Em uma modalidade, um "organoide pancreático" é um corpo gerado in vitro que imita a estrutura e a função de um pâncreas. Funções exemplares de um pâncreas incluem, sem limitação, secreção endócrina de hormônios, como glicose e glucagon, que regulam o metabolismo da glicose e a concentração de glicose no sangue, e secreção exócrina de enzimas digestivas que ajudam a quebrar carboidratos, proteínas e lipídios. "Organoide pancreático" e "mini pâncreas" também são usados neste documento indistintamente. Em uma modalidade, um organoide é um organoide semelhante a uma ilhota humana ("HILO"), conforme descrito neste documento. Em uma modalidade, um HILO é gerado a partir de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSCs). Em uma modalidade, o HILO é funcionalmente maduro e contém tipos de células do tipo endócrino que, após o transplante, reestabelecem efetivamente a homeostase da glicose, por exemplo, em um modelo de camundongo diabético (camundongo NOD-SCID). Em uma modalidade, o HILO é um HILO tratado com WNT4 (wHILOs).

Em uma modalidade, a superexpressão da proteína de ponto de verificação PD-L1 em HILOs permitiu que os HILOs evitassem uma reação imune ou vigilância por células T de modo que fossem capazes de manter a homeostase da glicose em camundongos diabéticos imunocompetentes (camundongos NOD- SCID) por um longo período de tempo, por exemplo, pelo menos 50 dias. Em uma modalidade, a indução da expressão endógena de PD-L1 em HILOs após múltiplas exposições intermitentes ex vivo ao interferon gama (IFN) ao longo de um determinado período de tempo, por exemplo, pelo menos 24 horas, restringe a ativação de células T e a rejeição de enxerto. Em modalidades, a exposição intermitente múltipla de células ou HILOs e as células neles contidas ao IFN abrange a exposição (por exemplo, em cultura, como cultura líquida ou cultura de matriz 3D) de células ou HILOs e as células contidas em uma quantidade (por exemplo, níveis baixos) de IFN por várias vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vezes, ao longo de um determinado período de tempo, com períodos de nenhuma exposição a IFN entre eles. Em uma modalidade, os HILOs que foram submetidos a múltiplas exposições intermitentes ao IFN de modo a expressar o polipeptídeo PD-L1, conforme descrito neste documento, podem ser referidos como HILOs imuno-

evasivos, wHILOs ou wHILOie neste documento.

[00144] Por "polipeptídeo PD-L1" (também chamado de CD274) entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no número de acesso UniProt Q9NZQ7-1 e tendo atividade de fator de transcrição.

A sequência de aminoácidos é fornecida no NCBI No. de Acesso NP_006184.2 é mostrada abaixo:

MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEME DKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGG ADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTT TTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTH LVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET

[00145] Por "polinucleotídeo PD-L1" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo PD-L1 ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica PD-L1 exemplar é fornecida no NCBI No. de Acesso CCDS59118.1. A sequência fornecida no NCBI No. de Acesso CCDS59118.1 é reproduzida abaixo: - Sequência de nucleotídeos (531 nt): atgaggatatttgctgtctttatattcatgacctactggcatttgctgaacgccccatacaaca aaatcaaccaaagaattttggttgtggatccagtcacctctgaacatgaactgacatgtcaggc tgagggctaccccaaggccgaagtcatctggacaagcagtgaccatcaagtcctgagtggtaag accaccaccaccaattccaagagagaggagaagcttttcaatgtgaccagcacactgagaatca acacaacaactaatgagattttctactgcacttttaggagattagatcctgaggaaaaccatac agctgaattggtcatcccagaactacctctggcacatcctccaaatgaaaggactcacttggta attctgggagccatcttattatgccttggtgtagcactgacattcatcttccgtttaagaaaag ggagaatgatggatgtgaaaaaatgtggcatccaagatacaaactcaaagaagcaaagtgatac acatttggaggagacgtaa

[00146] Por "polipeptídeo PAX4" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_006184.2 e tendo atividade de fator de transcrição. A sequência de aminoácidos é fornecida no NCBI No. de Acesso NP_006184.2 é mostrada abaixo: 1 MNQLGGLFVN GRPLPLDTRQ QIVRLAVSGM RPCDISRILK VSNGCVSKIL GRYYRTGVLE 61 PKGIGGSKPR LATPPVVARI AQLKGECPAL FAWEIQRQLC AEGLCTQDKT PSVSSINRVL 121 RALQEDQGLP CTRLRSPAVL APAVLTPHSG SETPRGTHPG TGHRNRTIFS PSQAEALEKE 181 FQRGQYPDSV ARGKLATATS LPEDTVRVWF SNRRAKWRRQ EKLKWEMQLP GASQGLTVPR 241 VAPGIISAQQ SPGSVPTAAL PALEPLGPSC YQLCWATAPE RCLSDTPPKA CLKPCWGHLP 301 PQPNSLDSGL LCLPCPSSHC HLASLSGSQA LLWPGCPLLY GLE

[00147] Por "polinucleotídeo PAX4" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo PAX4 ou fragmento do mesmo. Uma sequência de polinucleotídeo PAX4 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_006193.2. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_006193.2 é reproduzida abaixo: 1 caaagactca cccgtgagcc agctctcaaa gaaagcagct tgcgttgaca gcctgggggc 61 agcaaggatg cagtctccca ggagaggatg cactcggtgg tgggaagcca ggctggaggg 121 gcctgagtga ccctctccac aggcgggcag ggcagtggga gaggtggtgt gtggatacct 181 ctgtctcacg cccagggatc agcagcatga accagcttgg ggggctcttt gtgaatggcc 241 ggcccctgcc tctggatacc cggcagcaga ttgtgcggct agcagtcagt ggaatgcggc 301 cctgtgacat ctcacggatc cttaaggtat ctaatggctg tgtgagcaag atcctagggc 361 gttactaccg cacaggtgtc ttggagccaa agggcattgg gggaagcaag ccacggctgg 421 ctacaccccc tgtggtggct cgaattgccc agctgaaggg tgagtgtcca gccctctttg 481 cctgggaaat ccaacgccag ctttgtgctg aagggctttg cacccaggac aagactccca 541 gtgtctcctc catcaaccga gtcctgcggg cattacagga ggaccaggga ctaccgtgca 601 cacggctcag gtcaccagct gttttggctc cagctgtcct cactccccat agtggctctg 661 agactccccg gggtacccac ccagggaccg gccaccggaa tcggactatc ttctccccaa 721 gccaagcaga ggcactggag aaagagttcc agcgtgggca gtatcctgat tcagtggccc 781 gtggaaagct ggctactgcc acctctctgc ctgaggacac ggtgagggtc tggttttcca

841 acagaagagc caaatggcgt cggcaagaga agctcaagtg ggaaatgcag ctgccaggtg 901 cttcccaggg gctgactgta ccaagggttg ccccaggaat catctctgca cagcagtccc 961 ctggcagtgt gcccacagca gccctgcctg ccctggaacc actgggtccc tcctgctatc 1021 agctgtgctg ggcaacagca ccagaaaggt gtctgagtga caccccacct aaagcctgtc 1081 tcaagccctg ctggggccac ttgcccccac agccgaattc cctggactca ggactgcttt 1141 gccttccttg cccttcctcc cactgtcacc tggccagtct tagtggctct caggccctgc 1201 tctggcctgg ctgcccacta ctgtatggct tggaatgagg caggagtggg aaggagatgg 1261 catagagaag atctaatacc atcctgccca ttgtccttac cgtcctgccc atacagactg 1321 tggctccttc ctccttcctg tgattgctcc ctcctgtgtg gacgttgcct ggccctgcct 1381 cgatgcctct ctggcgcatc acctgattgg aggggctggt aaagcaacac ccacccactt 1441 ctcacactag ccttaagagg cctccactca gcagtaataa aagctgtttt tattagcagt 1501 agttctgttg tccatcatgt tttccctatg agcaccccta tgcccactct aatattcaac 1561 aattatagac aatttgccct atcatttatt tacatctatg tatctaccat ctaatctatg 1621 catgtatgta ggcaatacat gtatctaaac aatgtatttg tcaatgcatc aatttaccta 1681 ctctatgtat gcatctatat gtgtattatg tatgcgtgca tgcgtgcgcg cacacacaca 1741 cacacacaca cacactgaca ttatatcatg gcattttatt cctaaatctt ccagcatgca 1801 tccccaaaaa acaagaaact tgtcttacat aatcacaata atatatccac atctaagaaa 1861 atttactgta acttcttaat ctaagaaaat tatgtatttt tgtcatatgt attttgtcat 1921 atgtattttg tatttgcata tgtattttgt atttgcatat gtatttttgt catagcagca 1981 aacagagtga aatgccattt ttcatattct

[00148] Por "polipeptídeo PAX6" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_001297090.1 e tendo atividade de fator de transcrição. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_001297090.1 é mostrada abaixo: 1 MGADGMYDKL RMLNGQTGSW GTRPGWYPGT SVPGQPTQDG CQQQEGGGEN TNSISSNGED 61 SDEAQMRLQL KRKLQRNRTS FTQEQIEALE KEFERTHYPD VFARERLAAK IDLPEARIQV 121 WFSNRRAKWR REEKLRNQRR QASNTPSHIP ISSSFSTSVY QPIPQPTTPV SSFTSGSMLG 181 RTDTALTNTY SALPPMPSFT MANNLPMQPP VPSQTSSYSC MLPTSPSVNG RSYDTYTPPH 241 MQTHMNSQPM GTSGTTSTGL ISPGVSVPVQ VPGSEPDMSQ YWPRLQ

[00149] Por "polinucleotídeo PAX6" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo PAX6 ou fragmento do mesmo. Uma sequência de polinucleotídeo PAX6 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_001310161.1. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_001310161.1 é reproduzida abaixo:

1 cttttcaatt agccttccat gcatgatccg gagcgacttc cgcctatttc cagaaattaa 61 gctcaaactt gacgtgcagc tagttttatt ttaaagacaa atgtcagaga ggctcatcat 121 attttccccc ctcttctata tttggagctt atttattgct aagaagctca ggctcctggc 181 gtcaatttat cagtaggctc caaggagaag agaggagagg agaggagagc tgaacaggga 241 gccacgtctt ttcctgggag ggctgctatc taagtcgggg ctgcaggtca cagcggagtg 301 aatcagctcg gtggtgtctt tgtcaacggg cggccactgc cggactccac ccggcagaag 361 attgtagagc tagctcacag cggggcccgg ccgtgcgaca tttcccgaat tctgcagacc 421 catgcagatg caaaagtcca agtgctggac aatcaaaacg tgtccaacgg atgtgtgagt 481 aaaattctgg gcaggtatta cgagactggc tccatcagac ccagggcaat cggtggtagt 541 aaaccgagag tagcgactcc agaagttgta agcaaaatag cccagtataa gcgggagtgc 601 ccgtccatct ttgcttggga aatccgagac agattactgt ccgagggggt ctgtaccaac 661 gataacatac caagcgtgtc atcaataaac agagttcttc gcaacctggc tagcgaaaag 721 caacagatgg gcgcagacgg catgtatgat aaactaagga tgttgaacgg gcagaccgga 781 agctggggca cccgccctgg ttggtatccg gggacttcgg tgccagggca acctacgcaa 841 gatggctgcc agcaacagga aggaggggga gagaatacca actccatcag ttccaacgga 901 gaagattcag atgaggctca aatgcgactt cagctgaagc ggaagctgca aagaaataga 961 acatccttta cccaagagca aattgaggcc ctggagaaag agtttgagag aacccattat 1021 ccagatgtgt ttgcccgaga aagactagca gccaaaatag atctacctga agcaagaata 1081 caggtatggt tttctaatcg aagggccaaa tggagaagag aagaaaaact gaggaatcag 1141 agaagacagg ccagcaacac acctagtcat attcctatca gcagtagttt cagcaccagt 1201 gtctaccaac caattccaca acccaccaca ccggtttcct ccttcacatc tggctccatg 1261 ttgggccgaa cagacacagc cctcacaaac acctacagcg ctctgccgcc tatgcccagc 1321 ttcaccatgg caaataacct gcctatgcaa cccccagtcc ccagccagac ctcctcatac 1381 tcctgcatgc tgcccaccag cccttcggtg aatgggcgga gttatgatac ctacaccccc 1441 ccacatatgc agacacacat gaacagtcag ccaatgggca cctcgggcac cacttcaaca 1501 ggactcattt cccctggtgt gtcagttcca gttcaagttc ccggaagtga acctgatatg 1561 tctcaatact ggccaagatt acagtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagg aaaggaaata 1621 ttgtgttaat tcagtcagtg actatgggga cacaacagtt gagctttcag gaaagaaaga 1681 aaaatggctg ttagagccgc ttcagttcta caattgtgtc ctgtattgta ccactgggga 1741 aggaatggac ttgaaacaag gacctttgta tacagaaggc acgatatcag ttggaacaaa 1801 tcttcatttt ggtatccaaa cttttattca ttttggtgta ttatttgtaa atgggcattt 1861 gtatgttata atgaaaaaaa gaacaatgta gactggatgg atgtttgatc tgtgttggtc 1921 atgaagttgt tttttttttt tttaaaaaga aaaccatgat caacaagctt tgccacgaat 1981 ttaagagttt tatcaagata tatcgaatac ttctacccat ctgttcatag tttatggact 2041 gatgttccaa gtttgtatca ttcctttgca tataattaaa cctggaacaa catgcactag 2101 atttatgtca gaaatatctg ttggttttcc aaaggttgtt aacagatgaa gtttatgtgc 2161 aaaaaagggt aagatataaa ttcaaggaag aaaaaaagtt gatagctaaa aggtagagtg 2221 tgtcttcgat ataatccaat ttgttttatg tcaaaatgta agtatttgtc ttccctagaa 2281 atcctcagaa tgatttctat aataaagtta atttcattta tatttgacaa gaatatagat 2341 gttttataca cattttcatg caatcatacg tttctttttt ggccagcaaa agttaattgt 2401 tcttagatat agttgtatta ctgttcacgg tccaatcatt ttgtgcatct agagttcatt 2461 cctaatcaat taaaagtgct tgcaagagtt ttaaacttaa gtgttttgaa gttgttcaca 2521 actacatatc aaaattaacc attgttgatt gtaaaaaacc atgccaaagc ctttgtattt 2581 cctttattat acagttttct ttttaacctt atagtgtggt gttacaaatt ttatttccat 2641 gttagatcaa cattctaaac caatggttac tttcacacac actctgtttt acatcctgat 2701 gatccttaaa aaataatcct tatagatacc ataaatcaaa aacgtgttag aaaaaaattc 2761 cacttacagc agggtgtaga tctgtgccca tttataccca caacatatat acaaaatggt 2821 aacatttccc agttagccat ttaattctaa agctcaaagt ctagaaataa tttaaaaatg 2881 caacaagcga ttagctagga attgtttttt gaattaggac tggcattttc aatctgggca 2941 gatttccatt gtcagcctat ttcaacaatg atttcactga agtatattca aaagtagatt 3001 tcttaaagga gactttctga aagctgttgc ctttttcaaa taggccctct cccttttctg 3061 tctccctccc ctttgcacaa gaggcatcat ttcccattga accactacag ctgttcccat 3121 ttgaatcttg ctttctgtgc ggttgtggat ggttggaggg tggagggggg atgttgcatg

3181 tcaaggaata atgagcacag acacatcaac agacaacaac aaagcagact gtgactggcc 3241 ggtgggaatt aaaggccttc agtcattggc agcttaagcc aaacattccc aaatctatga 3301 agcagggccc attgttggtc agttgttatt tgcaatgaag cacagttctg atcatgttta 3361 aagtggaggc acgcagggca ggagtgcttg agcccaagca aaggatggaa aaaaataagc 3421 ctttgttggg taaaaaagga ctgtctgaga ctttcatttg ttctgtgcaa catataagtc 3481 aatacagata agtcttcctc tgcaaacttc actaaaaagc ctgggggttc tggcagtcta 3541 gattaaaatg cttgcacatg cagaaacctc tggggacaaa gacacacttc cactgaatta 3601 tactctgctt taaaaaaatc cccaaaagca aatgatcaga aatgtagaaa ttaatggaag 3661 gatttaaaca tgaccttctc gttcaatatc tactgttttt tagttaagga attacttgtg 3721 aacagataat tgagattcat tgctccggca tgaaatatac taataatttt attccaccag 3781 agttgctgca catttggaga caccttccta agttgcagtt tttgtatgtg tgcatgtagt 3841 tttgttcagt gtcagcctgc actgcacagc agcacatttc tgcaggggag tgagcacaca 3901 tacgcactgt tggtacaatt gccggtgcag acatttctac ctcctgacat tttgcagcct 3961 acattccctg agggctgtgt gctgagggaa ctgtcagaga agggctatgt gggagtgcat 4021 gccacagctg ctggctggct tacttcttcc ttctcgctgg ctgtaatttc caccacggtc 4081 aggcagccag ttccggccca cggttctgtt gtgtagacag cagagacttt ggagacccgg 4141 atgtcgcacg ccaggtgcaa gaggtgggaa tgggagaaaa ggagtgacgt gggagcggag 4201 ggtctgtatg tgtgcacttg ggcacgtata tgtgtgctct gaaggtcagg attgccaggg 4261 caaagtagca cagtctggta tagtctgaag aagcggctgc tcagctgcag aagccctctg 4321 gtccggcagg atgggaacgg ctgccttgcc ttctgcccac accctaggga catgagctgt 4381 ccttccaaac agagctccag gcactctctt ggggacagca tggcaggctc tgtgtggtag 4441 cagtgcctgg gagttggcct tttactcatt gttgaaataa tttttgttta ttatttattt 4501 aacgatacat atatttatat atttatcaat ggggtatctg cagggatgtt ttgacaccat 4561 cttccaggat ggagattatt tgtgaagact tcagtagaat cccaggacta aacgtctaaa 4621 ttttttctcc aaacttgact gacttgggaa aaccaggtga atagaataag agctgaatgt 4681 tttaagtaat aaacgttcaa actgctctaa gtaaaaaaat gcattttact gcaatgaatt 4741 tctagaatat ttttccccca aagctatgcc tcctaaccct taaatggtga acaactggtt 4801 tcttgctaca gctcactgcc atttcttctt actatcatca ctaggtttcc taagattcac 4861 tcatacagta ttatttgaag attcagcttt gttctgtgaa tgtcatctta ggattgtgtc 4921 tatattcttt tgcttatttc tttttactct gggcctctca tactagtaag attttaaaaa 4981 gccttttctt ctctgtatgt ttggctcacc aaggcgaaat atatattctt ctctttttca 5041 tttctcaaga ataaacctca tctgcttttt tgtttttctg tgttttggct tggtactgaa 5101 tgactcaact gctcggtttt aaagttcaaa gtgtaagtac ttagggttag tactgcttat 5161 ttcaataatg ttgacggtga ctatctttgg aaagcagtaa catgctgtct tagaaatgac 5221 attaataatg ggcttaaaca aatgaatagg ggggtccccc cactctcctt ttgtatgcct 5281 atgtgtgtct gatttgttaa aagatggaca gggaattgat tgcagagtgt cgcttccttc 5341 taaagtagtt ttattttgtc tactgttagt atttaaagat cctggaggtg gacataagga 5401 ataaatggaa gagaaaagta gatattgtat ggtggctact aaaaggaaat tcaaaaagtc 5461 ttagaacccg agcacctgag caaactgcag tagtcaaaat atttatctca tgttaaagaa 5521 aggcaaatct agtgtaagaa atgagtacca tatagggttt tgaagttcat atactagaaa 5581 cacttaaaag atatcatttc agatattacg tttggcattg ttcttaagta tttatatctt 5641 tgagtcaagc tgataattaa aaaaaatctg ttaatggagt gtatatttca taatgtatca 5701 aaatggtgtc tatacctaag gtagcattat tgaagagaga tatgtttatg tagtaagtta 5761 ttaacataat gagtaacaaa taatgtttcc agaagaaagg aaaacacatt ttcagagtgc 5821 gtttttatca gaggaagaca aaaatacaca cccctctcca gtagcttatt tttacaaagc 5881 cggcccagtg aattagaaaa acaaagcact tggatatgat ttttggaaag cccaggtaca 5941 cttattattc aaaatgcact tttactgagt ttgaaaagtt tcttttatat ttaaaataag 6001 ggttcaaata tgcatattca atttttatag tagttatcta tttgcaaagc atatattaac 6061 tagtaattgg ctgttaattt tatagacatg gtagccaggg aagtatatca atgacctatt 6121 aagtattttg acaagcaatt tacatatctg atgacctcgt atctcttttt cagcaagtca 6181 aatgctatgt aattgttcca ttgtgtgttg tataaaatga atcaacacgg taagaaaaag 6241 gttagagtta ttaaaataat aaactgacta aaatactcat ttgaatttat tcagaatgtt 6301 cataatgctt tcaaaggaca tagcagagct tttgtggagt atccgcacaa cattatttat 6361 tatctatgga ctaaatcaat tttttgaagt tgctttaaaa tttaaaagca cctttgctta 6421 atataaagcc ctttaatttt aactgacaga tcaattctga aactttattt tgaaaagaaa 6481 atggggaaga atctgtgtct ttagaattaa aagaaatgaa aaaaataaac ccgacattct 6541 aaaaaaatag aataagaaac ctgattttta gtactaatga aatagcgggt gacaaaatag 6601 ttgtcttttt gattttgatc acaaaaaata aactggtagt gacaggatat gatggagaga

6661 tttgacatcc tggcaaatca ctgtcattga ttcaattatt ctaattctga ataaaagctg 6721 tatacagtaa aa

[00150] Por "polipeptídeo PDX1" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_000200.1 e tendo atividade de fator de transcrição. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_000200.1 é mostrada abaixo: 1 MNGEEQYYAA TQLYKDPCAF QRGPAPEFSA SPPACLYMGR QPPPPPPHPF PGALGALEQG 61 SPPDISPYEV PPLADDPAVA HLHHHLPAQL ALPHPPAGPF PEGAEPGVLE EPNRVQLPFP 121 WMKSTKAHAW KGQWAGGAYA AEPEENKRTR TAYTRAQLLE LEKEFLFNKY ISRPRRVELA 181 VMLNLTERHI KIWFQNRRMK WKKEEDKKRG GGTAVGGGGV AEPEQDCAVT SGEELLALPP 241 PPPPGGAVPP AAPVAAREGR LPPGLSASPQ PSSVAPRRPQ EPR

[00151] Por "polinucleotídeo PDX1" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo PDX1 ou fragmento do mesmo. Uma sequência de polinucleotídeo PDX1 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_000209.3. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_000209.3 é reproduzida abaixo: 1 gggtggcgcc gggagtggga acgccacaca gtgccaaatc cccggctcca gctcccgact 61 cccggctccc ggctcccggc tcccggtgcc caatcccggg ccgcagccat gaacggcgag 121 gagcagtact acgcggccac gcagctttac aaggacccat gcgcgttcca gcgaggcccg 181 gcgccggagt tcagcgccag cccccctgcg tgcctgtaca tgggccgcca gcccccgccg 241 ccgccgccgc acccgttccc tggcgccctg ggcgcgctgg agcagggcag ccccccggac 301 atctccccgt acgaggtgcc ccccctcgcc gacgaccccg cggtggcgca ccttcaccac 361 cacctcccgg ctcagctcgc gctcccccac ccgcccgccg ggcccttccc ggagggagcc 421 gagccgggcg tcctggagga gcccaaccgc gtccagctgc ctttcccatg gatgaagtct 481 accaaagctc acgcgtggaa aggccagtgg gcaggcggcg cctacgctgc ggagccggag 541 gagaacaagc ggacgcgcac ggcctacacg cgcgcacagc tgctagagct ggagaaggag 601 ttcctattca acaagtacat ctcacggccg cgccgggtgg agctggctgt catgttgaac 661 ttgaccgaga gacacatcaa gatctggttc caaaaccgcc gcatgaagtg gaaaaaggag 721 gaggacaaga agcgcggcgg cgggacagct gtcgggggtg gcggggtcgc ggagcctgag 781 caggactgcg ccgtgacctc cggcgaggag cttctggcgc tgccgccgcc gccgcccccc 841 ggaggtgctg tgccgcccgc tgcccccgtt gccgcccgag agggccgcct gccgcctggc 901 cttagcgcgt cgccacagcc ctccagcgtc gcgcctcggc ggccgcagga accacgatga

961 gaggcaggag ctgctcctgg ctgaggggct tcaaccactc gccgaggagg agcagagggc 1021 ctaggaggac cccgggcgtg gaccacccgc cctggcagtt gaatggggcg gcaattgcgg 1081 ggcccacctt agaccgaagg ggaaaacccg ctctctcagg cgcatgtgcc agttggggcc 1141 ccgcgggtag atgccggcag gccttccgga agaaaaagag ccattggttt ttgtagtatt 1201 ggggccctct tttagtgata ctggattggc gttgtttgtg gctgttgcgc acatccctgc 1261 cctcctacag cactccacct tgggacctgt ttagagaagc cggctcttca aagacaatgg 1321 aaactgtacc atacacattg gaaggctccc taacacacac agcggggaag ctgggccgag 1381 taccttaatc tgccataaag ccattcttac tcgggcgacc cctttaagtt tagaaataat 1441 tgaaaggaaa tgtttgagtt ttcaaagatc ccgtgaaatt gatgccagtg gaatacagtg 1501 agtcctcctc ttcctcctcc tcctcttccc cctccccttc ctcctcctcc tcttcttttc 1561 cctcctcttc ctcttcctcc tgctctcctt tcctccccct cctcttttcc ctcctcttcc 1621 tcttcctcct gctctccttt cctccccctc ctctttctcc tcctcctcct cttcttcccc 1681 ctcctctccc tcctcctctt cttccccctc ctctccctcc tcctcttctt ctccctcctc 1741 ttcctcttcc tcctcttcca cgtgctctcc tttcctcccc ctcctcttgc tccccttctt 1801 ccccgtcctc ttcctcctcc tcctcttctt ctccctcctc ttcctcctcc tctttcttcc 1861 tgacctcttt ctttctcctc ctcctccttc tacctcccct tctcatccct cctcttcctc 1921 ttctctagct gcacacttca ctactgcaca tcttataact tgcacccctt tcttctgagg 1981 aagagaacat cttgcaaggc agggcgagca gcggcagggc tggcttagga gcagtgcaag 2041 agtccctgtg ctccagttcc acactgctgg cagggaaggc aaggggggac gggcctggat 2101 ctgggggtga gggagaaaga tggacccctg ggtgaccact aaaccaaaga tattcggaac 2161 tttctattta ggatgtggac gtaattcctg ttccgaggta gaggctgtgc tgaagacaag 2221 cacagtggcc tggtgcgcct tggaaaccaa caactattca cgagccagta tgaccttcac 2281 atctttagaa attatgaaaa cgtatgtgat tggagggttt ggaaaaccag ttatcttatt 2341 taacatttta aaaattacct aacagttatt tacaaacagg tctgtgcatc ccaggtctgt 2401 cttcttttca aggtctgggc cttgtgctcg ggttatgttt gtgggaaatg cttaataaat 2461 actgataata tgggaagaga tgaaaactga ttctcctcac tttgtttcaa acctttctgg 2521 cagtgggatg attcgaattc acttttaaaa ttaaattagc gtgttttgtt ttg

[00152] Por "polipeptídeo PTF1" entende-se uma proteína ou fragmento da mesma tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência fornecida no NCBI No. de Acesso NP_835455.1 e tendo atividade de fator de transcrição. A sequência de aminoácidos fornecida no NCBI No. de Acesso NP_835455.1 é mostrada abaixo: 1 MDAVLLEHFP GGLDAFPSSY FDEDDFFTDQ SSRDPLEDGD ELLADEQAEV EFLSHQLHEY 61 CYRDGACLLL QPAPPAAPLA LAPPSSGGLG EPDDGGGGGY CCETGAPPGG FPYSPGSPPS 121 CLAYPCAGAA VLSPGARLRG LSGAAAAAAR RRRRVRSEAE LQQLRQAANV RERRRMQSIN 181 DAFEGLRSHI PTLPYEKRLS KVDTLRLAIG YINFLSELVQ ADLPLRGGGA GGCGGPGGGG 241 RLGGDSPGSQ AQKVIICHRG TRSPSPSDPD YGLPPLAGHS LSWTDEKQLK EQNIIRTAKV 301 WTPEDPRKLN SKSSFNNIEN EPPFEFVS

[00153] Por "polinucleotídeo PTF1" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo PTF1 ou fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica de PTF1 exemplar é fornecida no NCBI Ref: NM_178161.2. A sequência fornecida no NCBI Ref: NM_178161.2 é reproduzida abaixo: 1 atggacgcgg tgttgctgga gcacttcccc gggggcctag acgcctttcc ttcttcgtac 61 ttcgacgagg acgacttctt caccgaccag tcttcacggg accccctgga ggacggcgat 121 gagctgctgg cggacgagca ggccgaggtg gagttcctta gccaccagct ccacgagtac 181 tgctaccgcg acggggcgtg cctgctgctg cagcccgcgc ccccggccgc cccgctagcg 241 ctcgccccgc cgtcctcggg gggcctcggt gagccagacg acggcggcgg cggcggctac 301 tgctgcgaga cgggggcgcc cccaggcggc ttcccctact cgcccggctc gccgccctcg 361 tgcctggcct acccgtgcgc cggggcggca gtactgtctc ccggggcgcg gctgcgcggc 421 ctgagcggag cggcggctgc ggcggcgcgg cgccggcggc gggtgcgctc cgaggcggag 481 ctgcagcagc tgcggcaggc ggccaacgtg cgcgagcggc ggcgcatgca gtccatcaac 541 gacgccttcg aggggctgcg ctcgcacatc cccacgctgc cctacgagaa gcgcctctcc 601 aaggtggaca cgctgcgcct ggccatcggc tacatcaact tcctcagcga gctcgtgcag 661 gccgacctgc ccttgcgcgg cggtggcgcg ggcggctgcg gggggccggg cggcggcggg 721 cgcctgggcg gggacagccc gggcagccag gcccagaagg tcatcatctg ccatcggggc 781 acccggtccc cctcccccag cgaccctgat tatggcctcc ctcccctagc aggacactct 841 ctctcatgga ctgatgaaaa acaactcaag gaacaaaata ttatccgaac agccaaagtc 901 tggaccccag aggaccccag aaaactcaac agcaaatctt ccttcaacaa catagaaaac 961 gaaccaccat ttgagtttgt gtcctgagaa gtcccagact cggctgaaga tctgattatg 1021 tctctgtgca tattgtacat gtaaatatct ataatgtaaa tgtaatttaa gaatcaaatt 1081 tttcgaatgg caatcaactg tttattattt atctatttat tatcctgttg agttgatgaa 1141 atagatgatt tctttttaaa tatataattt atataactta tcctgatttt ctgaaaatat 1201 gcaatagcct atgattttcc tgaactctgt gttgttggga gaactctggc cagaaaacgt 1261 cctgcttatt tattgccaga tatggtttat ttctaagcgt tgtcaataaa tgctatttac 1321 accttttcct gaaaaaaaa

[00154] Por "polinucleotídeo Wnt3a" entende-se um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo Wnt3a ou um fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica Wnt3a humana exemplificativa é fornecida no NCBI GenBank No. de Acesso AB060284.1. A sequência polinucleotídica fornecida no NCBI GenBank No. de Acesso AB060284.1 é reproduzida abaixo: 1 cggcgatggc cccactcgga tacttcttac tcctctgcag cctgaagcag gctctgggca 61 gctacccgat ctggtggtcg ctggctgttg ggccacagta ttcctccctg ggctcgcagc 121 ccatcctgtg tgccagcatc ccgggcctgg tccccaagca gctccgcttc tgcaggaact 181 acgtggagat catgcccagc gtggccgagg gcatcaagat tggcatccag gagtgccagc 241 accagttccg cggccgccgg tggaactgca ccaccgtcca cgacagcctg gccatcttcg

301 ggcccgtgct ggacaaagct accagggagt cggcctttgt ccacgccatt gcctcagccg 361 gtgtggcctt tgcagtgaca cgctcatgtg cagaaggcac ggccgccatc tgtggctgca 421 gcagccgcca ccagggctca ccaggcaagg gctggaagtg gggtggctgt agcgaggaca 481 tcgagtttgg tgggatggtg tctcgggagt tcgccgacgc ccgggagaac cggccagatg 541 cccgctcagc catgaaccgc cacaacaacg aggctgggcg ccaggccatc gccagccaca 601 tgcacctcaa gtgcaagtgc cacgggctgt cgggcagctg cgaggtgaag acatgctggt 661 ggtcgcaacc cgacttccgc gccatcggtg acttcctcaa ggacaagtac gacagcgcct 721 cggagatggt ggtggagaag caccgggagt cccgcggctg ggtggagacc ctgcggccgc 781 gctacaccta cttcaaggtg cccacggagc gcgacctggt ctactacgag gcctcgccca 841 acttctgcga gcccaaccct gagacgggct ccttcggcac gcgcgaccgc acctgcaacg 901 tcagctcgca cggcatcgac ggctgcgacc tgctgtgctg cggccgcggc cacaacgcgc 961 gagcggagcg gcgccgggag aagtgccgct gcgtgttcca ctggtgctgc tacgtcagct 1021 gccaggagtg cacgcgcgtc tacgacgtgc acacctgcaa gtaggcaccg gccgcggctc 1081 cccctggacg gggcgggccc tgcctgaggg tgggcttttc cctgggtgga gcaggactcc 1141 cacctaaacg gggcagtact cctccctggg ggcgggactc ctccctgggg gtggggctcc 1201 tacctggggg cagaactcct acctgaaggc agggctcctc cctggagcta gtgtctcctc 1261 tctggtggct gggctgctcc tgaatgaggc ggagctccag gatggggagg ggctctgcgt 1321 tggcttctcc ctggggacgg ggctcccctg gacagaggcg gggctacaga ttgggcgggg 1381 cttctcttgg gtgggacagg gcttctcctg cgggggcgag gcccctccca gtaagggcgt 1441 ggctctgggt gggcggggca ctaggtaggc ttctacctgc aggcggggct cctcctgaag 1501 gaggcggggc tctaggatgg ggcacggctc tggggtaggc tgctccctga gggcg

[00155] Por "polipeptídeo Wnt3a" entende-se um polipeptídeo Wnt3a ou um fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência polipeptídica Wnt3a humana. Uma sequência polipeptídica Wnt3a humana exemplificativa é fornecida no NCBI GenBank: AAI03924.1. A sequência fornecida no GenBank: AAI03924.1 é reproduzida abaixo: 1 MAPLGYFLLL CSLKQALGSY PIWWSLAVGP QYSSLGSQPI LCASIPGLVP KQLRFCRNYV 61 EIMPSVAEGI KIGIQECQHQ FRGRRWNCTT VHDSLAIFGP VLDKATRESA FVHAIASAGV 121 AFAVTRSCAE GTAAICGCSS RHQGSPGKGW KWGGCSEDIE FGGMVSREFA DARENRPDAR 181 SAMNRHNNEA GRQAIASHMH LKCKCHGLSG SCEVKTCWWS QPDFRAIGDF LKDKYDSASE 241 MVVEKHRESR GWVETLRPRY TYFKVPTERD LVYYEASPNF CEPNPETGSF GTRDRTCNVS

301 SHGIDGCDLL CCGRGHNARA ERRREKCRCV FHWCCYVSCQ ECTRVYDVHT CKNPGSRAGN 361 SAHQPPHPQP PVRFHPPLRR AGKVP

[00156] Por "polinucleotídeo Wnt4" entende-se um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo Wnt4 ou um fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica Wnt4 humana exemplar é fornecida no NCBI GenBank No. de Acesso AY009398.1. O número de acesso NCBI Ref NG_008974.1 é uma sequência de polinucleotídeo Wnt4a padrão de referência. A sequência polinucleotídica fornecida no NCBI GenBank No. de Acesso AY009398.1 é reproduzida abaixo: 1 atgagtcccc gctcgtgcct gcgttcgctg cgcctcctcg tcttcgccgt cttctcagcc 61 gccgcgagca actggctgta cctggccaag ctgtcgtcgg tggggagcat ctcagaggag 121 gagacgtgcg agaaactcaa gggcctgatc cagaggcagg tgcagatgtg caagcggaac 181 ctggaagtca tggactcggt gcgccgcggt gcccagctgg ccattgagga gtgccagtac 241 cagttccgga accggcgctg gaactgctcc acactcgact ccttgcccgt cttcggcaag 301 gtggtgacgc aagggattcg ggaggcggcc ttggtgtacg ccatctcttc ggcaggtgtg 361 gcctttgcag tgacgcgggc gtgcagcagt ggggagctgg agaagtgcgg ctgtgacagg 421 acagtgcatg gggtcagccc acagggcttc cagtggtcag gatgctctga caacatcgcc 481 tacggtgtgg ccttctcaca gtcgtttgtg gatgtgcggg agagaagcaa gggggcctcg 541 tccagcagag ccctcatgaa cctccacaac aatgaggccg gcaggaaggc catcctgaca 601 cacatgcggg tggaatgcaa gtgccacggg gtgtcaggct cctgtgaggt aaagacgtgc 661 tggcgagccg tgccgccctt ccgccaggtg ggtcacgcac tgaaggagaa gtttgatggt 721 gccactgagg tggagccacg ccgcgtgggc tcctccaggg cactggtgcc acgcaacgca 781 cagttcaagc cgcacacaga tgaggacttg gtgtacttgg agcctagccc cgacttctgt 841 gagcaggaca tgcgcagcgg cgtgctgggc acgaggggcc gcacatgcaa caagacgtcc 901 aaggccatcg acggctgtga gctgctgtgc tgtggccgcg gcttccacac ggcgcaggtg 961 gagctggctg aacgctgcag ctgcaaattc cactggtgct gcttcgtcaa gtgccggcag 1021 tgccagcggc tcgtggagtt gcacacgtgc cgatga

[00157] Por "polipeptídeo Wnt4" entende-se um polipeptídeo Wnt4 ou um fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de polipeptídeo Wnt4 humano. Uma sequência polipeptídica Wnt4 humana exemplificativa é fornecida no NCBI GenBank No. de Acesso AAG38658.1. A sequência fornecida no GenBank Nº de acesso AAG38658.1 é reproduzida abaixo: 1 MSPRSCLRSL RLLVFAVFSA AASNWLYLAK LSSVGSISEE ETCEKLKGLI QRQVQMCKRN 61 LEVMDSVRRG AQLAIEECQY QFRNRRWNCS TLDSLPVFGK VVTQGIREAA LVYAISSAGV 121 AFAVTRACSS GELEKCGCDR TVHGVSPQGF QWSGCSDNIA YGVAFSQSFV DVRERSKGAS 181 SSRALMNLHN NEAGRKAILT HMRVECKCHG VSGSCEVKTC WRAVPPFRQV GHALKEKFDG 241 ATEVEPRRVG SSRALVPRNA QFKPHTDEDL VYLEPSPDFC EQDMRSGVLG TRGRTCNKTS 301 KAIDGCELLC CGRGFHTAQV ELAERCSCKF HWCCFVKCRQ CQRLVELHTC R

[00158] Por "polinucleotídeo Wnt5a" entende-se um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo Wnt5a ou um fragmento do mesmo. Uma sequência polinucleotídica exemplar que codifica para Wnt5a humano é fornecida no NCBI GenBank Ref: NM_003392, uma sequência padrão de referência. Os nucleotídeos 658-1800 da sequência genômica Wnt5a com 6194 nucleotídeos codificam um polipeptídeo Wnt5a humano. A sequência de polinucleotídeo da sequência de codificação de Wnt5a humano fornecida nas bases 658-1800 do NCBI GenBank Ref: NM_003392 é reproduzida abaixo: 658 atg 661 aagaagtcca ttggaatatt aagcccagga gttgctttgg ggatggctgg aagtgcaatg 721 tcttccaagt tcttcctagt ggctttggcc atatttttct ccttcgccca ggttgtaatt 781 gaagccaatt cttggtggtc gctaggtatg aataaccctg ttcagatgtc agaagtatat 841 attataggag cacagcctct ctgcagccaa ctggcaggac tttctcaagg acagaagaaa 901 ctgtgccact tgtatcagga ccacatgcag tacatcggag aaggcgcgaa gacaggcatc 961 aaagaatgcc agtatcaatt ccgacatcga aggtggaact gcagcactgt ggataacacc 1021 tctgtttttg gcagggtgat gcagataggc agccgcgaga cggccttcac atacgcggtg 1081 agcgcagcag gggtggtgaa cgccatgagc cgggcgtgcc gcgagggcga gctgtccacc 1141 tgcggctgca gccgcgccgc gcgccccaag gacctgccgc gggactggct ctggggcggc

1201 tgcggcgaca acatcgacta tggctaccgc tttgccaagg agttcgtgga cgcccgcgag 1261 cgggagcgca tccacgccaa gggctcctac gagagtgctc gcatcctcat gaacctgcac 1321 aacaacgagg ccggccgcag gacggtgtac aacctggctg atgtggcctg caagtgccat 1381 ggggtgtccg gctcatgtag cctgaagaca tgctggctgc agctggcaga cttccgcaag 1441 gtgggtgatg ccctgaagga gaagtacgac agcgcggcgg ccatgcggct caacagccgg 1501 ggcaagttgg tacaggtcaa cagccgcttc aactcgccca ccacacaaga cctggtctac 1561 atcgacccca gccctgacta ctgcgtgcgc aatgagagca ccggctcgct gggcacgcag 1621 ggccgcctgt gcaacaagac gtcggagggc atggatggct gcgagctcat gtgctgcggc 1681 cgtggctacg accagttcaa gaccgtgcag acggagcgct gccactgcaa gttccactgg 1741 tgctgctacg tcaagtgcaa gaagtgcacg gagatcgtgg accagtttgt gtgcaagtag

[00159] Por "polipeptídeo Wnt5a" entende-se um polipeptídeo Wnt5a ou um fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência polipeptídica Wnt5a humana. Uma sequência polipeptídica Wnt5a (isoforma 1) humana exemplificativa é fornecida no Identificador UniProtKB: P41221-1. A sequência fornecida no Identificador UniProtKB: P41221-1 é reproduzida abaixo: 1 MKKSIGILSP GVALGMAGSA MSSKFFLVAL AIFFSFAQVV IEANSWWSLG 51 MNNPVQMSEV YIIGAQPLCS QLAGLSQGQK KLCHLYQDHM QYIGEGAKTG 101 IKECQYQFRH RRWNCSTVDN TSVFGRVMQI GSRETAFTYA VSAAGVVNAM 151 SRACREGELS TCGCSRAARP KDLPRDWLWG GCGDNIDYGY RFAKEFVDAR 201 ERERIHAKGS YESARILMNL HNNEAGRRTV YNLADVACKC HGVSGSCSLK 251 TCWLQLADFR KVGDALKEKY DSAAAMRLNS RGKLVQVNSR FNSPTTQDLV 301 YIDPSPDYCV RNESTGSLGT QGRLCNKTSE GMDGCELMCC GRGYDQFKTV 351 QTERCHCKFH WCCYVKCKKC TEIVDQFVCK

[00160] Uma "proteína ou molécula de ponto de verificação imunológico" ou "ponto de verificação imunológico" se refere a um subtipo específico de molécula de proteína transmembrana que fornece o ajuste fino da resposta imune. Em tecidos normais, os pontos de controle imunológicos são sinais inibitórios e desempenham um papel importante na função das células imunológicas, prevenindo a autoimunidade. Em um indivíduo com um tumor ou um câncer, a regulação positiva das proteínas do ponto de verificação imunológico no tumor ou nas células cancerosas permite que os tumores e os cânceres escapem da vigilância imunológica e evitem a imunidade antitumoral. Exemplos não limitativos de proteínas de ponto de verificação imunológico que têm sido o foco de imunoterapêuticos clínicos são o antígeno 4 associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4), proteína de morte celular programada 1 (PD-1) e ligante de proteína de morte celular programada 1 (PD- L1). CTLA-4, também conhecido como CD152, é essencial para a ativação das células T CD4+ e para a fase inicial da resposta imune.

PD-1, também conhecido como CD279 e anteriormente como B7.1, é um receptor chave de ponto de verificação imunológico expresso por células T ativadas, células B e células mieloides e medeia a imunossupressão. PD-L1, também conhecido como CD274 e anteriormente como B7-H1, é uma proteína reguladora imunológica que desempenha um papel significativo na supressão do sistema imunológico durante certos estados de doença, incluindo câncer e doenças autoimunes. PD-L1 é o ligante cognato que se liga a PD-1 para modular a ativação ou inibição de células imunes. Em circunstâncias normais, o sistema imunológico reage a antígenos estranhos que estão associados a agentes exógenos ou endógenos, por exemplo, microrganismos ou células, o que desencadeia a proliferação de células T citotóxicas CD8+ específicas do antígeno e/ou células T auxiliares CD4+. A ligação de PD-L1 a PD-1 transmite um sinal inibitório que reduz a proliferação das células T específicas do antígeno em nódulos linfáticos, enquanto simultaneamente reduz a apoptose em células T reguladoras (células T anti- inflamatórias, supressoras).

[00161] A Kd (constante de dissociação), que reflete a afinidade de ligação entre PD-L1 e PD-1, é 770 nM. PD-L1 também tem uma afinidade apreciável para a molécula coestimuladora CD80 (B7-1), mas não para CD86 (B7-2). A afinidade de PD-L1 de CD80 é 1,4 M, que é um valor que é intermediário entre a afinidade de PD-L1 para CD28 e CTLA-4 (4,0 M e 400 nM, respectivamente). A molécula PD-L2 relacionada não tem afinidade para CD80 ou CD86, mas compartilha PD-1 como um receptor (com um Kd mais forte de 140 nM). PD-1 é regulado positivamente nas células T CD4 ativadas e pode se ligar a monócitos que expressam PD-L1 para induzir a produção de IL-10. (E.A. Said et al., 2010, Nature Medicine, 16 (4): 452 a 459). A interação de PD-L1 com seu receptor PD-1 nas células T fornece um sinal que inibe a ativação da produção de IL-2 e proliferação de células T mediada pelo receptor de células T (TCR). A interação PD-1/PD-L1 foi implicada na autoimunidade. A título de exemplo, os camundongos NOD, um modelo animal para autoimunidade, exibem uma suscetibilidade ao desenvolvimento espontâneo de diabetes tipo I e outras doenças autoimunes e demonstraram desenvolver um início precipitado de diabetes a partir do bloqueio de PD-1 ou PD- L1 (mas não PD-L2), (MJ Ansari et al., 2003, J. Exp. Med., 198 (1): 63 a 69).

[00162] Por "vigilância imune" ou "vigilância imunológica" entende-se um processo de monitoramento por células do sistema imunológico para detectar e destruir células que são reconhecidas como não próprias, outras ou alogênicas nos tecidos e nos órgãos do corpo. Por exemplo, tais células não próprias podem ser infectadas com vírus, mutadas, transformadas neoplasticamente ou podem expressar uma molécula de superfície celular que não é reconhecida como uma molécula própria ou autóloga pelas células do sistema imunológico.

[00163] Por "célula progenitora" entende-se uma célula que é uma célula-tronco multipotente que é capaz de gerar (por exemplo, por diferenciação ou divisão) uma célula endotelial. Uma célula progenitora que é capaz de gerar uma célula endotelial pode expressar esta capacidade quando cultivada em condições in vitro ou in vivo apropriadas, tais como aquelas descritas neste documento.

[00164] Por "progênie" entende-se uma célula derivada de uma célula-tronco multipotente da invenção. A progênie inclui, sem limitação, células progenitoras, células diferenciadas e células terminalmente diferenciadas.

[00165] Por "derivado de" significa "obtido de" ou o processo de obtenção de uma célula descendente.

[00166] Por "reduz" entende-se uma alteração negativa de pelo menos 10%, 25%, 50%, 75% ou 100%.

[00167] Por “referência” ou “controle” entende-se uma condição padrão. Por exemplo, uma célula, um tecido ou um órgão não tratado ou saudável (não doente) que é usado como referência.

[00168] Uma "sequência de referência" é uma sequência definida usada como base para a comparação de sequências. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência especificada; por exemplo, um segmento de um cDNA completo ou sequência de gene, ou o cDNA completo ou sequência de gene. Para polipeptídeos, o comprimento da sequência polipeptídica de referência será geralmente de pelo menos cerca de 16 aminoácidos, pelo menos cerca de 20 aminoácidos ou pelo menos cerca de 25 aminoácidos. O comprimento da sequência polipeptídica de referência pode ser de cerca de 35 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos ou cerca de 100 aminoácidos. Para ácidos nucleicos, o comprimento da sequência de ácido nucleico de referência será geralmente de pelo menos cerca de 50 nucleotídeos, pelo menos cerca de 60 nucleotídeos ou pelo menos cerca de 75 nucleotídeos. O comprimento da sequência de ácido nucleico de referência pode ser de cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 300 nucleotídeos ou qualquer número inteiro ao redor ou entre eles.

[00169] Uma célula "somática" se refere a uma célula que é obtida de um tecido de um indivíduo. Tais indivíduos estão em um estágio pós-natal de desenvolvimento (por exemplo, adulto, bebê, criança). Em contraste, uma “célula embrionária” ou “célula-tronco embrionária” é derivada de um embrião em um estágio de desenvolvimento pré-natal.

[00170] Por "se liga especificamente" entende-se um composto ou anticorpo que reconhece e se liga a um polipeptídeo da invenção, mas que não reconhece e se liga substancialmente a outras moléculas em uma amostra, por exemplo, uma amostra biológica, que naturalmente inclui um polipeptídeo da invenção.

[00171] As moléculas de ácido nucleico úteis nos métodos da invenção incluem qualquer molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção ou um fragmento do mesmo. Tais moléculas de ácido nucléico não precisam ser 100% idênticas a uma sequência de ácido nucléico endógena, mas tipicamente exibirão identidade substancial. Os polinucleotídeos com "identidade substancial" com uma sequência endógena são tipicamente capazes de hibridizar com pelo menos uma fita de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla. As moléculas de ácido nucleico úteis nos métodos da invenção incluem qualquer molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção ou um fragmento do mesmo. Tais moléculas de ácido nucléico não precisam ser 100% idênticas a uma sequência de ácido nucléico endógena, mas exibirão tipicamente identidade substancial. Os polinucleotídeos com "identidade substancial" com uma sequência endógena são tipicamente capazes de hibridizar com pelo menos uma fita de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla. Por "hibridizar" pretende-se significar emparelhar para formar uma molécula de cadeia dupla entre sequências polinucleotídicas complementares (por exemplo, um gene descrito neste documento), ou porções do mesmo, sob várias condições de restringência. (Ver, por exemplo, Wahl, G. M.

e S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399; Kimmel, A.

R. (1987) Methods Enzymol. 152: 507).

[00172] Por exemplo, a concentração de sal rigorosa será normalmente inferior a cerca de 750 mM de NaCl e 75 mM de citrato trissódico, inferior a cerca de 500 mM de NaCl e 50 mM de citrato trissódico, ou inferior a cerca de 250 mM de NaCl e 25 mM de citrato trissódico. A hibridização de baixo rigor pode ser obtida na ausência de solvente orgânico, por exemplo, formamida, enquanto a hibridização de alto rigor pode ser obtida na presença de pelo menos cerca de 35% de formamida, ou pelo menos cerca de 50% de formamida. Condições de temperatura restritas normalmente incluirão temperaturas de pelo menos cerca de 30 °C, pelo menos cerca de 37 °C e pelo menos cerca de 42 °C.

Parâmetros adicionais variados, tais como tempo de hibridização, concentração de detergente, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS), e a inclusão ou exclusão de DNA transportador, são bem conhecidas das pessoas versadas na técnica. Vários níveis de rigor são alcançados combinando essas várias condições conforme necessário. Em uma modalidade, a hibridização ocorrerá a 30 °C em 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato trissódico e 1% de SDS. Em outra modalidade, a hibridização ocorrerá a 37 °C em 500 mM de NaCl, 50 mM de citrato trissódico, 1% de SDS, 35% de formamida e 100 g/ml de DNA de espermatozóide de salmão desnaturado (ssDNA). Em ainda outra modalidade, a hibridização ocorrerá a 42 °C em 250 mM de NaCl, 25 mM de citrato trissódico, 1% de SDS, 50% de formamida e 200 g/ml de ssDNA. Variações úteis nestas condições serão prontamente evidentes para as pessoas versadas na técnica.

[00173] Para a maioria das aplicações, as etapas de lavagem que seguem a hibridização também variam em rigor.

As condições de rigor da lavagem podem ser definidas pela concentração de sal e pela temperatura. Como acima, o rigor da lavagem pode ser aumentado diminuindo a concentração de sal ou aumentando a temperatura. Por exemplo, a concentração rigorosa de sal para as etapas de lavagem será inferior a cerca de 30 mM de NaCl e 3 mM de citrato trissódico, ou inferior a cerca de 15 mM de NaCl e 1,5 mM de citrato trissódico. Condições de temperatura restritivas para as etapas de lavagem normalmente incluirão uma temperatura de pelo menos cerca de 25 °C, pelo menos cerca de 42 °C e pelo menos cerca de 68 °C. Em uma modalidade, as etapas de lavagem ocorrerão a 25 °C em 30 mM de NaCl, 3 mM de citrato trissódico e 0,1% de SDS. Em outra modalidade, as etapas de lavagem ocorrerão a 42 °C em 15 mM de NaCl, 1,5 mM de citrato trissódico e 0,1% de SDS. Em ainda outra modalidade, as etapas de lavagem ocorrerão a 68 °C em 15 mM de NaCl, 1,5 mM de citrato trissódico e 0,1% de SDS.

Variações adicionais nestas condições serão facilmente evidentes para as pessoas versadas na técnica. As técnicas de hibridização são bem conhecidas das pessoas versadas na técnica e são descritas, por exemplo, em Benton e Davis (Science 196: 180, 1977); Grunstein e Hogness (Proc. Natl.

Acad. Sei., USA 72: 3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nova

Iorque, 2001); Berger e Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nova Iorque); e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque.

[00174] Por "substancialmente idêntico" entende-se um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico exibindo pelo menos 50% de identidade com uma sequência de aminoácidos de referência (por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas neste documento) ou sequência de ácido nucleico (por exemplo, qualquer uma das sequências de ácido nucleico descritas neste documento). Tal sequência é pelo menos 60%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mesmo pelo menos 99% idêntica no nível de aminoácido ou ácido nucleico à sequência usada para comparação.

[00175] A identidade de sequência é normalmente medida usando software de análise de sequência (por exemplo, Pacote de software de análise de sequência do Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis.

53705, programas BLAST, BESTFIT, GAP ou PILEUP/PRETTYBOX).

Tal software combina sequências idênticas ou semelhantes atribuindo graus de homologia a várias substituições, deleções e/ou outras modificações. As substituições conservativas incluem tipicamente substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. Em uma abordagem exemplar para determinar o grau de identidade, um programa BLAST pode ser usado, com uma pontuação de probabilidade entre e-3 e e-100 indicando uma sequência intimamente relacionada.

[00176] O termo "auto-renovação", tal como utilizado neste documento, refere-se ao processo pelo qual uma célula-tronco se divide para gerar uma (divisão assimétrica) ou duas (divisão simétrica) células-filhas com potenciais de desenvolvimento que são indistinguíveis daqueles da célula-mãe. A auto-renovação envolve a proliferação e a manutenção de um estado indiferenciado.

[00177] O termo "célula-tronco" significa uma célula de pluripotência ou célula-tronco multipotente com a capacidade de se auto-renovar e se diferenciar em várias linhagens celulares.

[00178] Por "indivíduo" entende-se um mamífero, incluindo, mas não se limitando a, um mamífero humano ou não humano, como um primata não humano, bovino, equino, canino, ovino, roedor ou felino. Em uma modalidade particular, um indivíduo é um indivíduo humano, como um paciente humano.

[00179] As faixas fornecidas neste documento são entendidas como uma abreviação para todos os valores dentro da faixa, incluindo o primeiro e o último valores. A título de exemplo não limitativo, uma faixa de 1 a 50 é entendida como incluindo qualquer número, combinação de números ou sub-faixa do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50.

[00180] Por "tecido" entende-se uma coleção de células com morfologia e função semelhantes.

[00181] Conforme usado neste documento, os termos "tratar", "tratando", "tratamento" e semelhantes se referem a reduzir ou melhorar um distúrbio e/ou sintomas associados ao mesmo. Será reconhecido que, embora não impedido, o tratamento de um distúrbio ou condição não requer que o distúrbio, condição ou sintomas associados sejam completamente eliminados.

[00182] Por “vascularizado” entende-se ter um vaso sanguíneo. Em algumas modalidades, o organoide de ilhota pancreática ou organoide pancreático é vascularizado.

[00183] A menos que especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, conforme usado neste documento, o termo "ou" é entendido como inclusivo. A menos que especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, conforme usado neste documento, os termos "um", "uma" e

"o/a" são entendidos no singular ou no plural.

[00184] A menos que especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, conforme usado neste documento, o termo "cerca de" é entendido como dentro de uma faixa de tolerância normal na técnica, por exemplo, dentro de 2 desvios padrão da média. Cerca de pode ser entendido como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% do valor declarado. A menos que de outra forma claro a partir do contexto, todos os valores numéricos fornecidos neste documento são modificados pelo termo cerca de.

[00185] A citação de uma lista de grupos químicos em qualquer definição de uma variável neste documento inclui definições dessa variável como qualquer grupo único ou combinação de grupos listados. A citação de uma modalidade para uma variável ou um aspecto neste documento inclui essa modalidade como qualquer modalidade única ou em combinação com quaisquer outras modalidades ou porções das mesmas.

[00186] Quaisquer composições ou métodos fornecidos neste documento podem ser combinados com uma ou mais de qualquer uma das outras composições e métodos fornecidos e descritos neste documento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00187] A FIGs. 1A a 1G fornecem imagens, um diagrama esquemático e gráficos relacionados ao aprimoramento da funcionalidade de células semelhantes a  derivadas de hiPSC por meio de diafonia celular em culturas à base de polímero. A FIG. 1A (topo) mostra os resultados de uma análise de componente principal de transcriptomas de iPSCs humanas (hiPSCs), células epiteliais pancreáticas humanas primárias (hPanc epitelial), células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hADSCs), fibroblastos pancreáticos humanos (fibroblastos hPanc), células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) e células endoteliais microvasculares pancreáticas humanas (hPanc endotelial). A FIG. 1A (inferior) mostra um curso de tempo de cultura de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hADSC) em Matrigel (diluição 1:1 em meio hADSC, 2 milhões de células em 300 l) mostrando auto-organização intrínseca (barra de escala 1 mm). A FIG. 1B mostra um esquema da geração de esferoides multicelulares semelhantes a ilhotas (MCS) e esferoides semelhantes a ilhotas (IS).

Células progenitoras endócrinas (EP) derivadas de hiPSC foram co-cultivadas com hADSC e células endoteliais (ECs, HUVECs) em sistema de cultura 3D à base de goma gelana (esquerda). EPs são células multipotentes que se diferenciam em células endócrinas, incluindo polipeptídeo pancreático , , , , e células G, conforme definido pela expressão de biomarcadores neurogenina 3, neurod1, Nkx2.2 e Pax4 (Rezania, A. et al., 2014, Nature Biotechnology, 32:

1121 a 1133). MCS gerado no ambiente matrigel mostra a incorporação de ECs (expressão de mCherry) e expressão de insulina conforme detectado pela expressão de Proteína

Fluorescente Verde (GFP), direita). (Barra de escala

100 m). A FIG. 1C ilustra esferoides multicelulares semelhantes a ilhotas (MCS) cultivados no sistema de goma gelana 3D mostrando expressão de insulina (GFP, painel superior). Imagens de microscopia eletrônica de MCS mostrando grânulos de insulina (canto inferior direito) e gotículas de lipídios no hADSC (canto inferior direito). A

FIG. 1D apresenta gráficos de expressão gênica em células classificadas de expressão de insulina (GFP+) em esferoides semelhantes a ilhotas (IS; células semelhantes a  derivadas de hiPSC geradas na ausência de hADSCs e ECs),

MCSs ou ilhotas humanas (hislets). A FIG. 1E apresenta um gráfico que demonstra a secreção de peptídeo c humano em resposta a 3 mM (G3) ou 20 mM (G20) de glicose de IS, MCS e hislets.

A FIG. 1F apresenta um gráfico que demonstra os níveis de glicose no sangue alimentados aleatoriamente em camundongos NOD-SCID diabéticos induzidos por STZ após tratamento simulado ou transplante de MCS (500) ou ilhotas humanas.

A FIG. 1G apresenta um gráfico que demonstra os níveis séricos de peptídeo c humano durante os ciclos de alimentação, jejum e realimentação em camundongos a partir de 4 semanas após o transplante.

Barras de erro representam

± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

[00188] As FIGs. 2A a 2F fornecem um mapa de calor, gráficos e plotagens que demonstram a expressão de Wnts não canônicos em células endócrinas e de suporte em ilhotas humanas. A FIG. 2A apresenta um mapa de calor de mudanças de expressão durante a cultura hADSC em Matrigel. Uma categoria de ontologia de gene significativamente afetada é apresentada à direita, a saber, Wnt5a e sinalização a jusante (5.1e -03). A FIG. 2B apresenta um gráfico que mostra o agrupamento tSNE da expressão temporal de WNTs durante a auto-organização de hADSC como mostrado na FIG. 2A. A FIG. 2C apresenta um gráfico e mapa de calor mostrando a expressão relativa de WNTs em ilhotas humanas (n = 5). A FIG. 2D mostra agrupamento t-SNE de transcriptomas de células individuais de ilhotas humanas (n = 3245). Os tipos de células anotados são atribuídos com base na expressão do gene marcador conhecido. As FIGs. 2E e 2F mostram um gráfico de célula única e gráficos de violino, respectivamente, da expressão de WNT2B, WNT4, WNT5A, WNT7A, WNT7B e WNT9A em ilhotas humanas. A barra de erro representa ± SEM.

[00189] As FIGs. 3A a 3K fornecem esquemas, imagens, mapas de calor e gráficos relacionados à geração de ilhotas humanas como organoides (HILOs) e a indução da maturação funcional de HILOs por WNT4. A FIG. 3A apresenta um esquema da geração de organoides semelhantes a ilhotas humanas

(HILO). A FIG. 3B mostra imagens representativas de HILOs em cultura 3D (esquerda) e expressão de insulina (GFP impulsionado pelo promotor de insulina humano (direita,

barra de escala, 100 m). A FIG. 3C representa imagens de microscopia eletrônica que mostram grânulos de insulina e glucagon em células  e , respectivamente, em HILOs tratados com WNT4 ("wHILOs") e ilhotas humanas.

Barra de escala, 1 m.

A FIG. 3D-1 apresenta um mapa de calor da expressão relativa de genes de ilhotas chave em hiPSCs,

HILOs tratados com PBS (P) ou WNT4 (W), e em ilhotas humanas (expressão log2 com pontuação Z). A FIG. 3D-2 apresenta gráficos que mostram a expressão relativa de

ISL1, SYT4, PDX1, GCK, NEUROD1, NKX2-2, INSULINA, NKX6-1,

MAFA, MAFB e UCN3 em wHILOs e ilhotas humanas conforme determinado por qPCR (n = 8 por tipo de amostra). A FIG. 3E é um mapa de ontologia genética de genes que são supra e infra regulados em HILOs por tratamento com WNT4 (100 ng/ml do dia 26 ao dia 33). A FIG. 3F mostra a expressão relativa de ERR, NDUFA7 e COX7A2 em HILOs tratados com concentrações crescentes de WNT4 (0, 10, 25, 50, 200 ng/ml)

por 5 dias.

A FIG. 3G apresenta um mapa de calor de expressões relativas de genes de fosforilação oxidativa em hiPSCs cultivados em 3D, HILOs com PBS e HILOs com tratamento WNT4 (wHILOs) e ilhotas humanas (pontuação Z). A

FIG. 3H é um gráfico que demonstra as taxas de consumo de oxigênio (OCRs) medidas em esferoides hiPSC no dia 0 (triângulo de cabeça para baixo), HILOs tratados com PBS (triângulo vertical), HILOs tratados com WNT4 (quadrado) e ilhotas humanas (círculo). A FIG. 3I apresenta um gráfico que mostra a secreção de peptídeo c humano in vitro em resposta a 3mM (G3) ou 20 mM (G20) de glicose ou 20mM (K20) de KCl de HILOs gerados com e sem tratamento com WNT4. A FIG. 3J apresenta um desenho esquemático representando as condições de cultura para células semelhantes a  derivadas de hiPSC disponíveis comercialmente (esquerda) e imagens de microscopia de luz de células cultivadas (direita). A FIG. 3K apresenta um gráfico de barras que mostra a secreção de peptídeo c in vitro em resposta a 3 mM (G3) e 20 mM (G20) de glicose de culturas descritas na FIG. 7D-2.

[00190] As FIGs. 4A a 4M fornecem plotagens, gráficos, uma imagem de microscopia, resultados de citometria de fluxo e um esquema relacionado a estudos de funcionalidade estendida de wHILOs que expressam PD-L1 e controle de glicose em camundongos imunocompetentes e perfil imunológico de enxertos wHILO em camundongos C57BL6J. A FIG. 4A mostra agrupamento tSNE de transcriptomas de células únicas de HILOs tratados com WNT4 (wHILOs, n = 4840). A FIG. 4B é um gráfico que mostra populações de tipos de células relativas em HILOs e ilhotas humanas. A FIG. 4C apresenta um gráfico que demonstra os níveis de glicose no sangue alimentados aleatoriamente após o transplante de wHILOs com ou sem expressão de PD-L1 (em cápsula de rim/rim de camundongos C57BL6J diabéticos induzidos (n = 11 e 9 camundongos, respectivamente). A plotagem superior no gráfico representa wHILOs (-); a plotagem do meio no gráfico representa wHILOs (expressão de PD-L1); a plotagem inferior no gráfico representa ilhotas m. A FIG. 4D apresenta a análise de citometria de fluxo de células que expressam insulina e imunes a camundongos (CD45+) recuperadas enxertos de cápsula de rim 27 dias após o transplante de wHILOs com e sem expressão de PD-L1.

Enxertos contendo HILOs que expressam PD-L1, que podem potencialmente se ligar a PD-1 em células T (por exemplo, células CD45+), suprimindo assim a ativação de células T e matando a atividade, mostram menos células T CD45+ infiltrantes em comparação com enxertos contendo HILOs que não expressam PD-L1. A FIG. 4E mostra a quantificação da análise dos níveis de glicose no sangue em camundongos diabéticos induzidos por STZ após o transplante de wHILOs com ou sem expressão de PD-L1, como mostrado na FIG. 4D (as barras de erro representam ± SEM. *P < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). A FIG. 4F apresenta uma análise de citometria de fluxo de expressão de insulina e células imunes de camundongo (CD45+) recuperadas de enxertos de cápsula de rim 27 dias após o transplante de wHILOs com e sem expressão de PD-L1. As células CD45+ foram ainda categorizadas como células B (CD19+), células T (CD3+) e células NK (NK1.1+). A FIG. 4G mostra gráficos de pontos da quantificação da análise descrita para a FIG. 4F (n = 6 e

6). A FIG. 4H mostra uma imagem de células wHILO (PD-L1) em um enxerto de rim 27 dias após o transplante (expressão de

GFP conduzida pelo promotor de insulina). Barra de escala,

100 m, barras de erro representam ± SEM. *p < 0,05. A

FIG. 4I apresenta um esquema que mostra o transplante de wHILOs com e sem superexpressão de PD-L1 (500 HILOs por camundongo) em camundongos Hu-PBMC-NSG diabéticos induzidos por estreptozotocina de dose baixa múltipla (MLD-STZ,

50 mg/kg/dia por 5 dias). A FIG. 4J apresenta uma análise de citometria de fluxo de células T humanas (células CD4+ e

CD8+ na população CD45+/CD3+) em PBMC de camundongos Hu-

PBMC-NSG (n = 15 camundongos) 3 semanas após o transplante de PBMC humano.

A FIG. 4K mostra um gráfico de níveis de glicose no sangue alimentados aleatoriamente em camundongos

Hu-PBMC-NSG diabéticos induzidos por MLD-STZ após o transplante de wHILOs com ou sem expressão de PD-L1 (n = 6 e 6 camundongos). A FIG. 4L mostra um gráfico de níveis séricos de peptídeo c humano em camundongos descritos na

FIG. 4 K.

A FIG. 4M apresenta uma análise de citometria de fluxo de células imunes que expressam insulina e CD45+ humanas recuperadas de enxertos de cápsula de rim 27 dias após o transplante de wHILOs, com e sem expressão de PD-L1.

A FIG. 4N apresenta gráficos de plotagem de pontos que quantificam os resultados das análises mostradas na FIG. 4M (as barras de erro representam ± SEM. *P < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

[00191] As FIGs. 5A a 5K fornecem gráficos e diagramas esquemáticos que demonstram que a tolerância imunológica é induzida pela memória epigenética. A FIG. 5A apresenta um gráfico que mostra a expressão de PD-L1 em células de ilhotas (wHILOs) classificadas por citometria de fluxo com base na expressão de insulina (GFP+ e GFP-, respectivamente) após o tratamento com IFN (10 ng/ml, 12 horas). As células GFP+ compreendem células semelhantes a ; as células GFP- compreendem células alfa (), delta () e épsilon (). A FIG. 5B apresenta um gráfico que mostra a expressão temporal de PD-L1 em wHILOs após um único tratamento com IFN (10 ng/ml, 2 horas). A FIG. 5C é um esquema que ilustra o tratamento de pulso de IFN (10 ng/ml) de wHILOs (tratamento MPS). A FIG. 5D apresenta um gráfico que mostra a expressão de PD-L1 induzida por ciclos indicados de tratamento com IFN, 7 dias após o último tratamento. A FIG. 5E apresenta um gráfico dos níveis de proteína PD-L1 1 e 7 dias após os tratamentos indicados com IFN (10 ng/ml). PD-L1 superexpressando wHILOs (PDL1OE) e uma única exposição de 12 h ao IFN foi usada como um controle positivo.

A FIG. 5F apresenta um gráfico de pontos mostrando a secreção de peptídeo c humano de wHILOs tratados com IFN em resposta a 3 mM (G3) ou

20 mM (G20) de glicose.

A FIG. 5G é um esquema que ilustra o tratamento com IFN em combinação com um desafio de tratamento com IL-1 (10 ng/ml por 24 horas) para induzir a desdiferenciação de células . A FIG. 5H apresenta um gráfico que mostra a expressão de INS e UCN3 após os tratamentos indicados de IFN e IL-1 (10ng/ml, 24 horas)

de wHILOs.

A FIG. 5I apresenta um esquema de um protocolo experimental para o transplante in vivo de wHILOs em animais diabéticos induzidos.

Camundongos C57BL6J diabéticos induzidos por estreptozotocina em alta dose

(HD-STZ, 180 mg/kg) receberam transplantes de wHILOs que foram ou não submetidos ao protocolo de tratamento com IFN mostrado na FIG. 5C, (n = 6 e 6, 500 wHILOs/camundongo). A

FIG. 5J apresenta um gráfico que mostra os níveis de glicose no sangue em camundongos receptores (camundongos

C57BL6J diabéticos tratados com STZ (180 mg/kg) no dia 17 após o transplante de cápsula de rim de wHILOs e wHILO estimulado por pulso de IFN ("wHILOs imunes evasivos" ou

"wHILOie"). A FIG. 5K apresenta um gráfico que mostra os níveis de peptídeo c humano no soro em camundongos tratados como descrito na FIG. 5I. Barras de erro representam ± SEM.

*p < 0,05, **p < 0,01.

[00192] As FIGs. 6A a 6F fornecem imagens, gráficos e resultados relacionados a esferoides multicelulares (MCSs), conforme descrito neste documento. A FIG. 6A mostra uma suspensão de goma gelana de 3D de esferoides multicelulares (MCS, topo), imagens de microscopia de luz de MCS único (parte inferior esquerda) e ilhotas humanas (parte inferior direita). A FIG. 6B mostra imagens de expressão de GPF conduzida pelo promotor de insulina e células endoteliais (EC, marcadas pela expressão de mCherry) em MCS. A FIG. 6C apresenta imagens que mostram o desenvolvimento progressivo de estruturas semelhantes a vasculares em MCSs que foram cultivadas com meio de crescimento endotelial no sistema Matrigel. A FIG. 6D é um esquema para análises de RNA-seq de célula única. A FIG. 6E apresenta um mapa de calor de expressão dos 10 principais genes de assinatura em aglomerados de células de ilhotas humanas da FIG. 2D. A FIG. 6F apresenta gráficos que mostram a expressão de t-SNE_2 de uma única célula de genes específicos de tipos de células e hormonais de assinatura em ilhotas humanas. Escala de expressão relativa: baixa (0,5, menos intensa), a alta (5, mais intensa).

[00193] As FIGs. 7A a 7F fornecem um esquema,

gráficos, imagens e dados relacionados à caracterização de

HILOs maduros.

A FIG. 7A representa um diagrama de knockin baseado em CRISPR-Cas9 para expressão de GFP conduzida pelo promotor de insulina humana em hiPSC.

A FIG. 7B apresenta uma imagem de contraste de interferência diferencial (DIC)

de wHILOs com expressão de insulina-GFP e UCN3-RFP (barra de escala, 100 m). A FIG. 7C apresenta uma análise

Seahorse da taxa de acidificação extracelular (ECAR) medida nos esferoides hiPSC do dia 0 (quadrado aberto), HILOs

(tratado com veículo/PBS, triângulo preenchido), wHILOs

(tratado com Wnt4, círculo preenchido) e ilhotas humanas

(círculo aberto). 20 mM de Glicose (Glu), oligomicina

(Olig), Fccp, antimicina + Rotenon (Ant + Rot) foram tratados em ordem.

A FIG. 7D-1 apresenta um gráfico que mostra a cinética da secreção de peptídeo c humano de HILOs tratados com WNT4 em resposta à exposição progressiva dos

HILOs a 3 mM de glicose, 20 mM de glicose, 20 mM de glicose

+ 100 mM de GLP-1, 3 mM de glicose, e 3 mM de glicose +

20 mM de KCl ao longo do tempo.

A FIG. 7D-2 apresenta um gráfico de barras que mostra a secreção de peptídeo c humano estimulada por glicose de wHILOs tratados com e sem

XAV939 para promover a degradação de -catenina (XAV939,

1 M por 3 dias). A FIG. 7E apresenta dados que ilustram o enriquecimento do motivo em regiões da cromatina com acessibilidade aprimorada após o tratamento com WNT4. A

FIG. 7F representa a acessibilidade da cromatina em genes alvo ERR (determinados por ATAC-Seq) em células que expressam insulina classificadas de HILO tratadas com PBS ou WNT4 por 7 dias (alteração de vezes > 1,5).

[00194] As FIGs. 8A a 8H fornecem imagens, gráficos, um esquema e um diagrama mostrando resultados relacionados à expressão de insulina-GFP mediada por WNT4 e maturação metabólica conduzida por WNT4. A FIG. 8A apresenta imagens representativas do conteúdo mitocondrial, indicadas pela coloração com MitoTracker (vermelho), em HILOs tratados com PBS e WNT4 (barra de escala, 100 m). A FIG. 8B apresenta gráficos de quantificação de citometria de fluxo da expressão de insulina (GFP) e conteúdo mitocondrial em HILOs tratados com WNT4 humano recombinante (rhWNT4), WNT5A (rhWNT5A) ou meio condicionado (CM) de controle ou fibroblastos que superexpressam WNT5A (n = 3). Barras de erro representam ± SEM. *p < 0,05. A FIG. 8C apresenta uma ontologia genética das alterações transcricionais induzidas pelo tratamento com WNT4 (100 ng/ml de WNT4 do dia 26 ao dia 33) em HILOs. A FIG. 8D apresenta um gráfico que demonstra os níveis de glicose no sangue em camundongos NOD-SCID diabéticos induzidos por STZ após o transplante (TP) de 500 wHILOs ou ilhotas humanas, ou cirurgia simulada foi realizada no dia 3 (n = 7, wHILOs; n = 6, ilhotas humanas; n = 3, Sham). Barras de erro representam ± SEM.

*p < 0,05. A FIG. 8E apresenta um diagrama de Venn que mostra a sobreposição entre aumentos induzidos por WNT4 na acessibilidade à cromatina em células GFP+ e aumentos na expressão do gene HILO (painel superior) e vias de ontologia gênica enriquecidas no conjunto de genes de interseção. A FIG. 8F mostra motivos que são enriquecidos no conjunto de genes de interseção mostrado na FIG. 8E. As FIGs. 8G e 8H demonstram os resultados de experiências em que ilhotas pós-natais (dia P11-14) de WT e camundongos ERRKO específicos de células  foram cultivadas com ou sem rhWNT4 (100 ng/ml) por > 5 dias. A FIG. 8G mostra a expressão relativa do gene medida por qPCR e a FIG. 8H mostra a secreção de insulina em resposta a 3 mM e 20 mM de glicose. *p < 0,05, ***p < 0,001. Para as FIGs. 8G e 8H, ilhotas pós-natais (dia P11-14) de WT e camundongos ERRKO específicos de células  foram cultivados com ou sem rhWNT4 (100 ng/ml) por > 5 dias.

[00195] As FIGs. 9A a 9M fornecem imagens microscópicas (confocais), gráficos, mapas de calor e gráficos que demonstram a caracterização imunofluorescente de wHILOs, análise de citometria de fluxo de HILOs e análise de célula única de wHILOs. As FIGs. 9AB, 9C e 9D apresentam imagens confocais de wHILOs corados para o peptídeo C. A FIG. 9A mostra resultados de coloração imunofluorescente representativos para glucagon,

somatostatina e polipeptídeo pancreático (PP) em wHILOs.

A

FIG. 9B apresenta imagens confocais de wHILOs corados para o peptídeo C.

A FIG. 9C apresenta imagens confocais de wHILOs corados para marcadores enriquecidos com células 

NKX2-2, NKX6-1, MAFA, MAFB, PDX1. As imagens são representativas de três experimentos independentes.

A

FIG. 9D apresenta imagens confocais de wHILOs corados para marcadores endócrinos cromogranina A (CHGA), sinaptofisina

(imagens do meio em vermelho) com visualização de Insulina-

GFP (imagens em verde à esquerda). A coloração dos núcleos

Hoechst é mostrada nos painéis da direita (fusão). Barra de escala, 100 m.

As imagens são representativas de três experimentos independentes.

A FIG. 9E mostra resultados de citometria de fluxo representativos para células  e co-

coloração de marcador endócrino em HILOs com e sem tratamento com WNT4. A FIG. 9F representa graficamente a quantificação dos resultados apresentados na FIG. 9E (n = 6 e 6). A FIG. 9G mostra agrupamento tSNE de transcriptomas de células únicas de HILOs tratados com WNT4 (wHILOs, n =

4840). As FIGs. 9H e 9I mostram gráficos de violino (9H) e expressão de célula única (9I) de INS, CHGA, SOX9, HES1 em wHILOs.

A FIG. 9J mostra a expressão de células  enriquecidas (INS, PDX1, NKX6-1, NKX2-2, NEUROD1, NPTX2,

ITGA1, PCSK1, MAFA, MAFB, UCN3, CHGA), células  enriquecidas (GCG, ARX) e genes enriquecidos de células 

(SST, RBP4) sobrepostos no agrupamento tSNE. A FIG. 9K apresenta um mapa de calor dos 10 principais genes expressos diferencialmente em cada agrupamento de células.

A FIG. 9L apresenta agrupamentos tSNE de acordo com o tipo de célula (Panc P = progenitor pancreático, Rep = replicando, UK = desconhecido). A FIG. 9M apresenta agrupamento tSNE de conjuntos de dados de célula única HILOs e wHILO combinados (painel direito) e tipos de células definidas por análise de agrupamento.

[00196] As FIGs. 10A a 10C fornecem gráficos que mostram análises de qualidade de scRNA-seq. A FIG. 10A mostra gráficos que ilustram uma correlação do número de genes detectados e UMIs em HILO, wHILO e ilhotas humanas. A FIG. 10B apresenta agrupamento tSNE de wHILO combinados (pontos azuis, n = 4840) e ilhotas humanas (pontos vermelhos, n = 3245) transcriptomas de célula única (painel esquerdo) e tipos de células definidas por análise de agrupamento (esquerda). A FIG. 10C mostra a expressão de genes específicos endócrinos (INS, NKX2-2, GCG, SST, PPY), marcador de duto (KRT19) e marcador de célula estrelada (ACTA2) na visualização de tSNE de conjuntos de dados de célula única mesclados para wHILO e ilhotas humanas.

[00197] As FIGs. 11A a 11D fornecem uma representação esquemática, plotagens e gráficos relacionados à análise de scRNA-seq baseada em placa. A

FIG. 11A é um esquema de scRNA-seq com base em placa. As células individuais dissociadas de wHILO foram classificadas por FACS em uma placa de cultura de tecidos de 96 poços (microplaca). As FIGs. 11B e 11C: um gráfico de caixa mostrando contagens médias de genes por células (FIG. 11B) e identificação de 45 células individuais com detecção de genes de alta qualidade (FIG. 11C). A FIG. 11D ilustra que RNA-seq de célula única revelou células que expressam insulina, glucagon, somatostatina em wHILOs.

[00198] As FIGs. 12A a 12F fornecem gráficos e imagens relacionados ao gene PD-L1 e à expressão de proteínas em células  e HILOs. A FIG. 12A (esquerda) mostra a expressão endógena de tSNE de PD-L1 em células de ilhotas humanas (as células  estão delineadas) e (direita) um mapa de calor dos principais genes expressos diferencialmente entre células PD-L1+ e PD-L1-. A FIG. 12B apresenta sobreposição de resultados de imunohistoquímica da expressão de PD-L1 dirigida por lentivírus e expressão de GFP dirigida pelo promotor de insulina em wHILOs (barra de escala, 100 m). A FIG. 12C apresenta gráficos de barras que mostram a expressão de PD-L1 humano (esquerda) e expressão de insulina humana (direita) em wHILOs, com e sem superexpressão de PD-L1 lentiviral, medida por qPCR. A FIG. 12D (topo) apresenta uma representação esquemática de um estudo experimental in vivo conduzido em camundongos

C57BL6J diabéticos induzidos. Camundongos C57BL6J diabéticos induzidos por estreptozotocina em alta dose (HD- STZ, 180 mg/kg) receberam transplantes de wHILOs com e sem superexpressão de PD-L1 (n = 500), ou ilhotas de camundongo; a FIG. 12D (parte inferior) mostra os resultados após o transplante de PD-L1 com superexpressão de wHILOs na cápsula de rim de camundongos diabéticos induzidos por STZ. A FIG. 12E apresenta um gráfico de barras que mostra a expressão de PD-L1 em wHILOs 12 horas após a estimulação de IFN indicada. Barras de erro representam ± SEM. ***p < 0,001. A FIG. 12F apresenta um gráfico de barras que mostra a expressão do gene PD-L1 em ilhotas humanas 12 horas após a estimulação com INF (ng/ml). Barras de erro representam ± SEM. ***p < 0,001.

[00199] A FIG. 13 fornece um diagrama esquemático da estratégia para geração de wHILOs evasivos imunológicos maduros (wHILOies).

[00200] As FIGs. 14A a 14D apresentam um diagrama de Venn, mapa de calor, gráfico de ontologia do gene e trilha do navegador relacionados a estudos que investigam mudanças induzidas por IFN em wHILOs. A FIG. 14A mostra um diagrama de Venn de genes regulados diferencialmente após tratamento agudo (12 h a 10 ng/ml) e estimulado por múltiplos pulsos (MPS), (2 h a 10 ng/ml por 3 dias) tratamento com IFN de wHILOs. No diagrama, o círculo mais à esquerda representa

"tratamento com IFN MPS" e o círculo mais à direita representa "tratamento com IFN agudo". A FIG. 14B mostra um mapa de calor de genes expressos diferencialmente após estimulação aguda com IFN e MPS. A expressão de genes PD- L1 sustentáveis por MPS é destacada. A FIG. 14C mostra a ontologia gênica de genes regulados seletivamente após tratamentos com MPS-IFN (painel superior) e IFN agudo (painel inferior). A FIG. 14D mostra painéis de faixas de navegador indicando acessibilidade à cromatina em genes selecionados 7 dias após o último tratamento com IFN no método MPS, ou 12 horas após a estimulação aguda de IFN em wHILOs.

[00201] As FIGs. 15A a 15C apresentam um esquema, plotagem e gráficos de citometria de fluxo relacionados a estudos que demonstram a evasividade imunológica de wHILOs por expressão aumentada de PD-L1 endógena. A FIG. 15A mostra um esquema de um regime de tratamento envolvendo tratamento com estreptozotocina de dose baixa múltipla (MLD-STZ, 50 mg/kg/dia por 5 dias) de camundongos Hu-PBMC- NSG para produzir um modelo animal diabético imunocompetente. PD-L1 induzido por MPS expressos wHILOs (n = 500) foram transplantados sob cápsula de rim. A FIG. 15B mostra um gráfico de níveis de glicose no sangue alimentados aleatoriamente em camundongos Hu-PBMC-NSG diabéticos induzidos por STZ após o transplante de wHILOs que foram submetidos ou não a MPS (n = 6 camundongos, respectivamente). Os dados wHILOs (-) da FIG. 4K e da FIG. 4G são replicados, uma vez que esses experimentos foram realizados paralelamente. A FIG. 15C mostra uma análise de citometria de fluxo de células que expressam insulina e células imunes humanas (CD45+) recuperadas de enxertos de cápsula de rim 27 dias após o transplante de wHILOs com ou sem MPS. Barras de erro representam ± SEM.

*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES

[00202] São apresentados neste documento métodos e sistemas para a geração e utilização de ilhotas humanas derivadas de células-tronco e organoides semelhantes a ilhotas humanas, que fornecem uma estratégia promissora para o tratamento terapêutico de doenças e patologias, como doenças pancreáticas e diabetes dependente de insulina, uma doença causada pela perda de células  produtoras de insulina endógena. Vantajosamente, os métodos e sistemas descritos podem gerar produtos biológicos, por exemplo, células, organoides semelhantes a ilhotas humanas e células dos mesmos, como terapêuticas que podem aliviar a escassez de ilhotas humanas cadavéricas compatíveis com doador, que atualmente estão sendo usadas para tratar pacientes.

[00203] Conforme descrito neste documento, organoides semelhantes a ilhotas humanas funcionais (HILOs)

são gerados a partir de células-tronco de pluripotência humanas, tais como células-tronco de pluripotência induzidas (iPSCs). Em uma modalidade, um sistema de cultura que permite a sinalização WNT4 não canônica é empregado para gerar HILOs. Sem desejar estar limitado pela teoria, a sinalização de WNT4 em células como iPSCs, ilhotas humanas e células HILO conduz a maturação metabólica necessária para a secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) robusta. As ilhotas derivadas de células-tronco e HILOs conforme descrito neste documento atingem maturidade funcional e exibem secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) robusta através da capacidade oxidativa responsiva à glicose aumentada, que é regulada pela via metabólica WNT4-ERR (Receptor Relacionado a Estrogênio). Os HILOs funcionalmente maduros contêm tipos de células do tipo endócrino que, após o transplante, restabelecem rapidamente a homeostase da glicose em camundongos NOD-SCID diabéticos (por exemplo, exemplos 4 e 5). Em uma modalidade e conforme descrito neste documento, os HILOs e as células dos mesmos evitam a rejeição por células imunes em condições imunocompetentes.

[00204] Em um aspecto, a análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA) de HILOs funcionais, bem como ilhotas cadavéricas humanas, revelou heterogeneidade transcricional de células derivadas de HILO, incluindo uma pequena população de células  imunoevasivas. Conforme descrito em um aspecto neste documento, HILOs foram projetados molecularmente para expressar uma proteína de ponto de verificação, por exemplo, PD-L1, a fim de imitar o programa de transcrição de células  imunoevasivas. Quando os HILOs que expressam PD-L1 foram avaliados, verificou-se que a expressão de PD-L1 superou a rejeição autoimune dos HILOs, que foram transplantados em camundongos imunocompetentes com diabetes tipo 1. Assim, a geração, de forma escalável, de células  funcionais e HILOs que podem evitar a detecção imunológica, ativação autoimune e rejeição de transplante ou implante proporcionam tratamentos e terapias vantajosas e benéficas para diabetes, em particular, diabetes tipo 1 e estágio avançado de diabetes tipo 2. Em uma modalidade, as células , HILOs humanos e ilhotas humanas são manipuladas molecularmente (por exemplo, transduzidas ou transfectadas) para expressar uma proteína de ponto de verificação, como PD-L1. Em uma modalidade, as células , HILOs humanas e ilhotas humanas são induzidas a expressar a proteína PD-L1 como neste documento descrito.

Métodos de proteção de ilhotas, organoides e as células neles contidas da vigilância imunológica e eliminação e depuração de células imunológicas

[00205] Em um aspecto, métodos, particularmente métodos in vitro ou ex vivo, são fornecidos para gerar ilhotas e organoides, incluindo as células neles contidas (por exemplo, células doadoras, ilhotas e células organoides) que sobrevivem, têm morte celular reduzida e/ou podem melhor evadir a detecção imunológica por células do sistema imunológico, especialmente após o transplante, o implante ou a transferência para um indivíduo, como um indivíduo receptor. Em uma modalidade, o transplante, o implante ou a transferência envolve células alogênicas, ilhotas e/ou organoides que sobrevivem e têm morte e detecção reduzidas por células imunes, por exemplo, células T, células B, monócitos, macrófagos e semelhantes, subsequente à prática dos métodos descritos neste documento.

[00206] Em um aspecto, a expressão (ou expressão regulada positivamente) de um gene que codifica uma proteína de ponto de verificação e/ou seu produto codificado, em particular, PD-L1 e/ou a proteína PD-L1, em ou por ilhotas que expressam o receptor de IFN, organoides (por exemplo, HILOs), ou células (por exemplo, células  de HILOs) após múltiplas exposições intermitentes ao interferon gama (IFN) durante um determinado período de tempo (como pelo menos 24 horas) permite que os HILOs mantenham a homeostase da glicose, por exemplo, em camundongos diabéticos imunocompetentes por um longo período de tempo, por exemplo, pelo menos 50 dias, bem como para evitar uma resposta imune por células T ativadas e/ou rejeição de enxerto. Em uma modalidade, as ilhotas, organoides ou células são ilhotas, organoides ou células humanas. Em modalidades, tais ilhotas, organoides ou células expressam receptores de IFN e/ou são responsivos ao tratamento com IFN. Em uma modalidade, as ilhotas, os organoides ou as células expressam naturalmente os receptores de IFN. Em uma modalidade, os receptores de IFN podem ser introduzidos nas ilhotas, nos organoides ou nas células, por exemplo, sem limitação, por técnicas recombinantes, virais ou de biologia molecular como conhecidas e praticadas na técnica. Em uma modalidade, a expressão do gene PD-L1 e/ou da proteína (ou expressão regulada positivamente) nas ilhotas, nos organoides e nas células que expressam o receptor de IFN constituem um marcador detectável, que é indicativo da resposta das ilhotas, dos organoides e das células à exposição ao IFN.

A expressão de PD-L1 ou expressão regulada positivamente de PD-L1 como um marcador de responsividade a IFN após a exposição de ilhotas, organoides e células a IFN pode ser avaliada por métodos de detecção de polinucleotídeo e/ou proteína rotineiramente usados e conhecidos na técnica, e não são pretendem ser limitativos.

[00207] Em modalidades, o método compreende estimular as células com interferon gama (IFN) em baixas quantidades ou doses, por exemplo, 0,5 a 100 ng/ml, 1 a

50 ng/ml, 1 a 25 ng/ml, 1 a 20 ng/ml, 1 a 10 ng/ml,

10 ng/ml ou 20 ng/ml.

Em uma modalidade, isso é conseguido submetendo as ilhotas, os organoides e/ou as células, por exemplo, HILOs, a IFN por períodos de tempo discretos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou

15 horas, ou mais, em particular, por cerca de ou igual a 2 horas ou 12 horas, por exemplo, várias vezes, por exemplo,

2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes ou mais,

durante um determinado período de tempo.

Em algumas modalidades, as múltiplas exposições ou pulsos são realizados ao longo de um período de tempo de pelo menos 24 horas (cerca de 1 dia), um período de 48 horas, um período de 72 horas ou ao longo de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dias.

Em algumas modalidades, as células são expostas a IFN por um total de 0,5 a 3 horas, 0,5 a 4 horas, 0,5 a 5 horas, 0,5 a

6 horas, 0,5 a 7 horas ou 0,5 a 10 horas.

Entre exposições a IFN ou pulsos, as células podem "repousar", por exemplo,

em meio de cultura ou matriz 3D, na ausência de IFN entre os períodos de tempo de exposição a IFN. Em algumas modalidades, as células podem "repousar" na ausência de

IFN por pelo menos cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas entre a exposição ao IFN. Em outras modalidades, as células podem "repousar" na ausência de

IFN por cerca de 1, 2, 3, 4 ou 5 dias.

Em uma modalidade,

o tratamento com IFN causa uma suprarregulação constitutiva (prolongada) e expressão (e manutenção) da expressão de PD-L1 nas ilhotas, nos organoides e/ou nas células, por exemplo, HILOs.

Este procedimento envolve estimulação de pulso múltiplo (MPS), também conhecida como exposição intermitente, de células, ilhotas, organoides,

por exemplo, HILOs ou ilhotas e das células neles contidas,

ao IFN. A expressão de PD-L1 pelas células, ilhotas e/ou organoides é de longa duração após MPS, particularmente, se as ilhotas, os organoides e/ou as células (por exemplo,

HILOs) experimentam pelo menos 3 pulsos ou exposições intermitentes a IFN (por exemplo, 10 ng/ml) por cerca de ou igual a um período de 2 horas por pulso de IFN. Por exemplo, por este regime, a expressão sustentada de PD-L1 é encontrada nas ilhotas, nos organoides e/ou nas células,

por exemplo, HILOs, por pelo menos 7 dias após submeter as ilhotas, os organoides e/ou as células, por exemplo, HILOs,

ao procedimento MPS.

Em uma modalidade, ilhotas, organoides

(por exemplo, HILOs) ou células geradas pelo método sobrevivem em um indivíduo receptor após o transplante, o implante ou a transferência por pelo menos cerca de ou igual a 50 dias.

[00208] Sem desejar ou pretender estar limitado pela teoria, o procedimento de exposição IFN MPS resulta na expressão de PD-L1 (ou regulação positiva da expressão de PD-L1) em ilhotas, organoides e/ou células (por exemplo, HILOs e as células neles contidas (por exemplo, células )), que envolve um mecanismo de memória transcricional. O procedimento descrito compreendendo a exposição de células, ilhotas e/ou organoides ao IFN MPS pode estimular ou criar uma cascata de sinalização intracelular na qual a desdiferenciação das células, ilhotas e/ou organoides é inibida ou bloqueada. Os pulsos curtos de IFN (IFN MPS) aos quais as células, as ilhotas ou os organoides são expostos nos métodos podem, em última análise, envolver uma alteração da estrutura da cromatina, protegendo assim as células, as ilhotas ou os organoides da desdiferenciação e proporcionando as células, as ilhotas ou os organoides expostos ao IFN MPS, a capacidade de sobreviver (por exemplo, pela redução da morte celular pelas células do sistema imunológico), bem como de ser imune aos efeitos de citocinas inflamatórias e quimiocinas, por exemplo, interleucina-1B (IL-1B) conforme descrito abaixo, de modo a proporcionar um efeito anti-inflamatório para as células, as ilhotas ou os organoides. A ausência ou a redução da inflamação associada a células, ilhotas ou organoides expostos a IFN MPS gerados a partir dos métodos descritos pode aumentar seu potencial de sobrevivência e redução na morte por células imunes após o transplante, o implante ou a transferência para um indivíduo. Os métodos descritos geram, assim, células doadoras, ilhotas e organoides que melhoraram a sobrevivência e retêm suas funcionalidades após transplante, implante ou transferência para um indivíduo e oferecem uma série de vantagens benéficas em seu uso como terapêutico.

[00209] Em uma modalidade particular, um método é fornecido para gerar ilhotas humanas, organoides (por exemplo, HILOs) e várias células primárias ou diferenciadas (de linhagens diferentes) que sobrevivem, têm morte celular reduzida e podem escapar melhor da detecção imunológica ou autoimunidade em que o método envolve (a) contactar as ilhotas humanas, organoides (por exemplo, HILOs), ou células com interferon gama (IFN) por mais de uma hora em um ponto de tempo predeterminado; repetir a etapa (a) pelo menos cerca de duas vezes durante um determinado período de tempo, por exemplo, um período de tempo de cerca de ou igual a 72 horas; em que as ilhotas humanas, os organoides (por exemplo, HILOs) ou as células são mantidas na ausência de IFN entre os tempos de contato com IFN; e em que as etapas (a) e (b) induzem a expressão sustentada de PD-Ll nas ilhotas humanas, nos organoides (por exemplo, HILOs) ou nas células.

Em uma modalidade do método, as ilhotas humanas, os organoides (por exemplo, HILOs) ou as células são colocadas em contato com IFN por um período de tempo de cerca de ou igual a pelo menos 1 hora, ou pelo menos 2 horas, ou mais de 2 horas na etapa (a). Em uma modalidade particular do método, as ilhotas humanas, os organoides

(por exemplo, HILOs) ou as células são colocados em contato com IFN por um período de tempo de cerca de ou igual a 2 horas ou cerca de ou igual a 12 horas na etapa (a). Em outra modalidade particular do método, a etapa (a) é repetida três vezes por pelo menos cerca de ou igual a 2 horas de cada vez no período de tempo determinado, por exemplo, um período de tempo de cerca de ou igual a 72 horas.

Em outra modalidade do método, as ilhotas humanas,

os organoides (por exemplo, HILOs) ou as células são lavadas para remover a presença de IFN entre a etapa (a) e a etapa (b). Em outra modalidade do método, IFN é usado em uma quantidade de 1 a 25 ng/ml.

Em outra modalidade do método, IFN é usado em uma quantidade de 10 ng/ml.

Em outra modalidade do método, a expressão de PD-L1 nas ilhotas humanas, organoides (por exemplo, HILOs) ou células é mantida após a etapa (b) por mais do que cerca de ou igual a 7 dias.

Em uma modalidade, o método gera ilhotas cadavéricas humanas (por exemplo, singênicas ou alogênicas)

que são protegidas da destruição ou da eliminação pelo sistema imunológico.

[00210] Em outro aspecto particular, um método de geração de várias células, ilhotas ou organoides (por exemplo, HILOs), incluindo células humanas, ilhotas ou organoides, que sobrevivem, têm morte celular reduzida e/ou evitam a detecção imunológica ou autoimunidade é fornecido em que o método envolve (a) contactar as células, as ilhotas humanas ou os organoides (por exemplo, HILOs) com interferon gama (IFN) em uma quantidade de cerca de 1 ng/ml a 25 ng/ml por mais de 1 hora em um primeiro momento durante um determinado período de tempo, por exemplo, um período de tempo de cerca de ou igual a 24 horas; e (b) contactar as células, as ilhotas humanas ou os HILOs com IFN em uma quantidade de cerca de 1 ng/ml a 25 ng/ml por mais do que cerca de ou igual a 0,5 horas ou mais, ou cerca de ou igual a 1 hora em pelo menos dois pontos de tempo adicionais durante um período de tempo seguinte, por exemplo, um período de tempo de 48 horas, seguindo a etapa (a); em que as ilhotas ou os organoides (por exemplo, HILOs) são lavados e colocados em repouso em meio na ausência de IFN entre o contato com IFN; e em que as etapas (a) e (b) induzem a expressão sustentada de PD-Ll nas ilhotas ou nos organoides (por exemplo, HILOs). Em uma modalidade particular do método, as células, ilhotas ou organoides (por exemplo, HILOs) são colocados em contato com IFN em uma quantidade de 10 ng/ml por pelo menos 2 horas na etapa (a) e etapa (b). Em outra modalidade particular do método, as células, as ilhotas ou os organoides (por exemplo, HILOs) são contactados com IFN por pelo menos cerca de ou igual a 2 horas em 3 pontos de tempo (pontos de tempo diferentes) durante um período de tempo de 72 horas.

[00211] A prática dos métodos descritos acima para a evasão imune de ilhotas, organoides e células que expressam o receptor de IFN fornecem vantagens para tais ilhotas, organoides e células, particularmente, células humanas, ilhotas e organoides, usados para transplantes, implantes ou transferência de um indivíduo para o outro como terapêutica e tratamento terapêutico de doenças, distúrbios e patologias. A prática dos métodos descritos fornece imunoproteção e sobrevivência aprimorada de ilhotas, organoides e células que são transplantadas, implantadas ou transferidas para um indivíduo receptor (por exemplo, um receptor adotivo, receptor de transplante e semelhantes), de modo que as ilhotas, os organoides ou as células transplantados, implantados ou transferidos são mantidos e são funcionais no receptor por vários dias, ou semanas, ou mais, por exemplo, por cerca de 2 dias ou mais para 1, 2, 3, 4 ou mais semanas, ou mais tempo.

[00212] Os métodos e sistemas descritos neste documento são adequados para uso com uma variedade de células e tipos de células, ou células de doadores para transplante, particularmente, células que expressam o receptor IFN, derivadas de linhagens diferentes, bem como ilhotas e organoides, por exemplo, para fornecer proteção imunológica após transplante, implante, administração ou transferência para um indivíduo receptor. Em geral, a título de exemplo não limitativo, podem ser utilizadas células-tronco, células primárias, células diferenciadas de várias linhagens e tipos ou células de um tipo derivadas de células de uma fonte diferente. Em modalidades, tais células adequadas expressam receptores de IFN e/ou são responsivas ao tratamento com IFN podem ser usadas de acordo com os métodos descritos acima. A capacidade de resposta ao tratamento com IFN nos métodos descritos pode ser determinada ou identificada por ensaio para a expressão detectável de PD-L1 ou da proteína PD-L1 pelas células, ilhotas ou organoides (e células nos mesmos) que expressam o receptor de IFN.

[00213] A título de exemplo particular, mas não limitativo, os métodos descritos neste documento, que envolvem a indução de expressão sustentada de PD-L1 por IFN MPS, podem ser adequados ou aplicáveis para uso com uma variedade de células e tipos de células, ou células doadoras para transplante, incluindo, sem limitação,

células cardíacas, células do cólon, células do rim,

células da bexiga, células do fígado (hepatócitos), células gastrointestinais, células gástricas (estômago), células do pulmão, células ovarianas, células cervicais, células uterinas, células testiculares, células pancreáticas,

células  pancreáticas, células musculares, células hematopoiéticas, células imunes (células B, células T),

células retinais, células da córnea, células cerebrais,

células T receptoras de antígeno quimérico (células CAR-T),

células da medula óssea, por exemplo, células mononucleares, neurônios, células neuronais, células  pancreáticas produtoras de insulina derivadas de células da pele humana (por exemplo, conforme relatado por Li, K. et al., 2014, Cell Stem Cell, 14 (2): 228 a 236); células do sangue do cordão umbilical (SCU), células estromais

(tronco) mesenquimais derivadas do tecido adiposo, células-

tronco cardíacas, células-tronco do cólon, células-tronco renais, células-tronco do fígado (hepatócitos), células-

tronco gastrointestinais, células-tronco gástricas

(estômago), células-tronco do pulmão, células-tronco pancreáticas, células-tronco  pancreáticas, células-tronco musculares, células-tronco hematopoéticas, células-tronco de células imunes (células T ou B), células-tronco da medula óssea, células-tronco CD133+, células-tronco CD34+ hematopoiéticas, células-tronco CD34+, células-tronco mesenquimais, células-tronco mesenquimais do cordão umbilical, células-tronco da retina, células-tronco neuronais e semelhantes, bem como ilhotas e organoides gerados a partir de ou contendo tais células. A título de exemplo, os seguintes tipos de organoides são adequados para uso nos métodos: organoides intestinais, organoides hepáticos, organoides neurais, organoides pulmonares, por exemplo, como podem ser produzidos usando procedimentos descritos na técnica, ou comercialmente disponíveis, por exemplo, Stemcell™ Technology, Cambridge, MA.

[00214] Outras células adequadas são aquelas derivadas de células-tronco embrionárias que dão origem a vários tipos de células diferenciadas, por exemplo, células derivadas de ectoderma, tais como células neuronais, células neuronais dopaminérgicas (por exemplo, células precursoras neuronais dopaminérgicas imortalizadas (LUHMES) comercialmente disponíveis na abm, Vancouver, British Columbia); células derivadas da córnea (por exemplo, células epiteliais da córnea humana normais, comercialmente disponíveis na LifeLine Cell Technology, Oceanside, CA); células derivadas da endoderme, tais como células do fígado (por exemplo, hepatócitos humanos de tipo selvagem, disponíveis em DefiniGEN, Cambridge, UK); e células derivadas do mesoderma, tais como células musculares, células da medula óssea, células renais e células do músculo esquelético (por exemplo, células do músculo esquelético humano (skMDC), comercialmente disponíveis na Cook MyoSite®, Pittsburgh, PA). Exemplos não limitativos de células  (por exemplo, tendo características/função de células  pancreáticas) ou ilhotas que podem ser utilizadas nos métodos descritos podem ser encontrados, por exemplo, em WO 2016/100898, WO 2016/100909, WO 2016/100921, WO 2016/100925, WO 2016/100930, WO 2014/145625.

[00215] Por conseguinte, os métodos, sistemas e composições conforme apresentados e descritos neste documento são úteis e aplicáveis para gerar células, tecidos e organoides, que exibem viabilidade de longa duração e atividade funcional após a administração, por exemplo, via transplante, implante, injeção e semelhantes, a um indivíduo com necessidade, com base na expressão sustentada de uma proteína de ponto de verificação, como PD-L1 pelas células, tecidos e organoides, e sua evasão e proteção resultante da vigilância imunológica e destruição por células do sistema imunológico, por exemplo, como ocorre na reação enxerto versus hospedeiro.

[00216] Em um aspecto particular, os métodos, sistemas e composições conforme apresentados e descritos neste documento são úteis para gerar organoides vascularizados, funcionais e escalonáveis in vitro, particularmente organoides pancreáticos humanos ou de ilhotas pancreáticas (HILOs), que podem escapar da detecção imunológica após o transplante ou o implante. Em uma modalidade, o cultivo de células semelhantes a beta derivadas de iPSC, que expressam uma proteína de ponto de verificação imunológico, com células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hADSC) e células endoteliais de veia umbilical humana (Huvec) em uma matriz tridimensional contendo goma gelana também são fornecidos organoides de ilhotas pancreáticas e pancreáticas funcionais gerados.

[00217] Os HILOs gerados de acordo com os métodos descritos eram vascularizados e exibiam propriedades funcionais, como secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS). Embora estudos recentes tenham relatado a possibilidade de gerar células semelhantes a beta, produtoras de insulina e responsivas à glicose a partir de células-tronco de pluripotência (PSCs) humanas, a geração organoides de ilhotas pancreáticas vascularizadas de PSCs que secretam insulina, glucagon e somatostatina em resposta a nutrientes e que são capazes de evadir a detecção imunológica e enxerto ou transplante ou rejeição de implante por células do sistema imunológico por períodos de tempo substanciais é vantajosamente fornecido neste documento.

[00218] Conforme descrito neste documento, a função de auto-organização de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hADSC), HUVEC e células semelhantes a beta derivadas de iPSC humanas permite a geração in vitro de organoides semelhantes a ilhotas secretores de insulina responsivos à glicose com a capacidade para formar a vasculatura funcional. Além disso, é alcançado o dimensionamento bem-sucedido da produção de organoides semelhantes a ilhotas por meio do uso de sistemas de cultura 3D baseados em goma gelana. Usando um repórter de luciferase da Gaussia para medir a secreção de insulina, foi caracterizada a heterogeneidade funcional em organoides semelhantes a ilhotas derivados de hiPSC. Sem a intenção de se limitar à teoria, os resultados neste documento sugerem que os organoides humanos semelhantes a ilhotas (HILOs) que expressam uma proteína de ponto de verificação podem oferecer um tratamento terapêutico benéfico para diabetes e um novo tratamento para falência de órgãos, bem como uma plataforma para rastreamento de drogas, edição do genoma e modelagem da organogênese e patogênese do diabetes.

Proteínas de ponto de verificação imunológico

[00219] Manter a homeostase imunológica é fundamental para a sobrevivência do hospedeiro. Respostas imunes abertas ou não controladas a patógenos ou a autoantígenos mutados, modificados ou superexpressos podem causar danos inflamatórios ao tecido e doenças autoimunes.

Para evitar isso, a amplitude e a magnitude da resposta imune são reguladas por um equilíbrio entre os sinais coestimuladores e inibitórios. Esses sinais são chamados coletivamente de pontos de verificação imunológicos, que são necessários para manter a autotolerância e proteger um indivíduo de danos aos tecidos.

[00220] As células T ativadas são os mediadores primários das funções efetoras imunes e, como tal, expressam vários receptores co-inibitórios, como, por exemplo, gene de ativação de linfócitos 3 (LAG-3), proteína de morte celular programada 1 (PD-1) e proteína T-linfócito citotóxica 4 (CTLA-4). Estas moléculas de ponto de verificação imunológico demonstraram modular as respostas das células T às proteínas "próprias", bem como a infecções crônicas e antígenos tumorais. É importante ressaltar que as vias utilizadas por essas proteínas de ponto de verificação são únicas e não redundantes, refletindo assim o importante papel dos pontos de verificação imunes na regulação da homeostase imune.

[00221] Como observado acima, uma “proteína de ponto de verificação imunológico” ou “molécula de ponto de verificação imunológico” ou simplesmente, “proteína ou molécula de ponto de verificação” é uma proteína ou molécula que regula o sistema imunológico e frequentemente se liga a ou interage com ligantes (ligantes cognatos), que podem causar um determinado efeito, por exemplo,

estimulação celular, anergia ou apoptose. Em uma modalidade, a proteína de ponto de verificação imunológico é aquela que se liga a um ligante cognato (por exemplo, um ligante de receptor) na superfície da membrana de uma célula imune, por exemplo, um receptor de superfície de célula T. Em uma modalidade específica, uma proteína de ponto de verificação imunológico é PD-L1 ou uma porção de ligação da mesma, em que o ligante cognato de PD-L1 é PD-1, por exemplo, conforme expresso na superfície das células T.

Em uma modalidade, a proteína de ponto de verificação é o domínio extracelular da proteína.

[00222] Em um aspecto, uma proteína de ponto de verificação se liga ao seu ligante cognato, que também pode ser um receptor de proteína de ponto de verificação em uma célula imune, como uma célula T, e bloqueia ou interrompe a sinalização, atividade ou função da célula que expressa o ligante cognato ou receptor. Alternativamente, os inibidores de ponto de verificação imunológico, que incluem anticorpos e fragmentos dos anticorpos que retêm a ligação a proteínas de ponto de verificação, podem se ligar a proteínas de ponto de verificação em células, como células imunes (por exemplo, células T efetoras) e bloquear ou interromper a sinalização, a atividade ou a função da célula. A ligação de um inibidor de proteína de ponto de verificação a uma proteína de ponto de verificação expressa em uma célula pode causar a inativação da atividade normal da célula que expressa a proteína de ponto de verificação.

Em modalidades, um inibidor de proteína de ponto de verificação é um anticorpo, como um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo de cadeia única, etc., ou um fragmento do mesmo que se liga a uma proteína de ponto de verificação (ligante cognato).

[00223] Exemplos não limitativos de proteínas de ponto de verificação imunológico, ou porções de ligação de ligante cognato das mesmas, que podem ser expressas em uma célula, um iPSC, uma célula beta e semelhantes, ou um organoide, por exemplo, HILOs e outros organoides como descritos neste documento, incluem PD- 1, proteína de morte celular programada 1, PD-L1, ligante de morte celular programada 1, que é o ligante de ligação cognato de PD-1; PD-L2, ligante de morte celular programada 2, que também se liga a PD-1; CTLA-4 (proteína T-linfócito citotóxica 4, também chamada de CD152); LAG-3, proteína do gene 3 de ativação de linfócitos; KIR, receptor tipo imunoglobulina de células assassinas; IDO1, indolamina 2,3-dioxigenase 1; 4-1BB, um membro 9 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (também conhecido como CD137); 4-1BBL (liga-se a 4-1BB); GITR, “gene relacionado à família TNFR induzido por glicocorticoides”; TIM-3, "domínio de imunoglobulina e domínio de mucina de células T”; OX40,

membro 4 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (também conhecido como CD134); OX40L (liga-se a OX40), CD40, CD40L, A2AR, receptor de adenosina A2A; B7-H3 (também denominado CD276); B7-H4 (também denominado VTCN1); B7-1/B7-2; BTLA (também denominado CD272); VISTA, "supressor de Ig de domínio V de ativação de células T"; e similares.

[00224] Em modalidades, a molécula de proteína do ponto de verificação imunológico é, sem limitação, PD-L1 ou o domínio extracelular de PD-L1, que se liga a PD-1 expresso por células T. Em uma modalidade, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de ponto de verificação imunológico é utilizado para manipular molecularmente uma célula para expressar uma proteína de ponto de verificação, ou uma ou mais proteínas de ponto de verificação, tal como infectando a célula com um vetor viral ou bacteriano contendo o polinucleotídeo que codifica a proteína de ponto de verificação. Em algumas modalidades, uma célula (por exemplo, uma célula beta ou célula HILO) expressa mais de uma proteína de ponto de verificação imunológico ou uma porção de ligação ao ligante da mesma.

Em algumas modalidades, a célula é modificada molecularmente para conter uma, ou mais de uma proteína de ponto de verificação imunológico, ou porção de ligação ao ligante da mesma, que é expressa pela célula. Em uma modalidade, a célula é infectada com um vetor viral, por exemplo, um vetor lentiviral ou vetor viral adeno- associado, ou mais de um vetor viral, que contém um ou mais polinucleotídeo(s) que codifica(m) uma ou mais proteínas de ponto de verificação ou uma porção de ligação de ligante das mesmas, usando procedimentos e métodos que são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a célula é transformada ou transfectada com um vetor de plasmídeo, ou mais de um vetor de plasmídeo, que contém um ou mais polinucleotídeo(s) que codifica(m) uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico ou uma porção de ligação de ligante das mesmas, usando procedimentos e métodos que são bem conhecidos na técnica.

[00225] PD-1, a proteína da morte programada 1 (PD- 1), é uma proteína de ponto de verificação imunológico chave (proteína receptora) que é expressa por células T ativadas, bem como células B, células apresentadoras de antígeno (APCs) e células assassinas naturais (células NK) e medeia a imunossupressão. PD-1 funciona principalmente em tecidos periféricos onde as células T podem encontrar os ligantes imunossupressores PD-L1 (B7-H1) e PD-L2 que são expressos por outras células, como células modificadas molecularmente para expressar PD-L1, como bem como, por exemplo, células tumorais, células estromais ou ambas. Sem a intenção de ser limitado pela teoria e por meio de exemplo particular não limitativo, PD-L1 expresso por células beta () transplantadas, implantadas ou enxertadas, células organoides, incluindo células HILO conforme descrito neste documento, liga-se a PD-1 expresso por células T efetoras, suprimindo assim efetivamente uma resposta de células T dirigida contra as células beta, células organoides ou células HILO e mediando a resposta de células T normais de modo a conter ou bloquear a autoimunidade e inativar a resposta imune contra as células beta, células organoides ou HILOs. Em uma modalidade, as células beta, células organoides ou HILOs expressam a proteína de ponto de verificação imunológico in situ, na área localizada de um transplante, um implante ou um enxerto; portanto, a capacidade das células e HILOs de evadir a autoimunidade ocorre dentro e ao redor da área localizada do transplante, do implante ou do enxerto e resulta em menos risco de uma modulação sistêmica ou mais disseminada da atividade das células imunológicas em um indivíduo receptor.

Pâncreas

[00226] Em alguns aspectos, é fornecido um organoide pancreático ou um organoide de ilhota pancreática, também chamado de um organoide semelhante a uma ilhota humana, ou HILO, neste documento. O pâncreas é um órgão que fica no abdômen e tem funções endócrinas e exócrinas. A porção do pâncreas com função endócrina são aglomerados de células chamados “ilhotas pancreáticas” (também conhecidas como ilhotas de Langerhans). As secreções endócrinas pancreáticas incluem hormônios que regulam o metabolismo da glicose e a concentração de glicose no sangue. Quatro tipos principais de células estão presentes nas ilhotas: células alfa, que secretam glucagon (um hormônio que aumenta a concentração de glicose no sangue); células beta, que secretam insulina (um hormônio que diminui a concentração de glicose no sangue); células delta, que secretam somatostatina (um hormônio que regula as células alfa e beta), e células gama, que secretam polipeptídeo pancreático.

[00227] A parte do pâncreas que desempenha um papel exócrino é chamada de componente exócrino. As secreções pancreáticas exócrinas contêm enzimas digestivas que passam para o intestino delgado e ajudam a quebrar os carboidratos, proteínas e lipídios. O componente exócrino possui dutos dispostos em grupos chamados ácinos pancreáticos. As secreções exócrinas pancreáticas são secretadas no lúmen do ácino; as secreções se acumulam e drenam para o duto pancreático e duodeno.

[00228] Organoides de ilhotas pancreáticas, organoides pancreáticos e HILOs como descritos neste documento imitam a estrutura de uma ilhota pancreática e de um pâncreas, respectivamente. Em algumas modalidades, o organoide de ilhota pancreática ou organoide pancreático contém qualquer uma ou mais das seguintes células: uma célula semelhante a beta derivada de iPSC, uma célula semelhante a alfa derivada de iPSC, uma célula semelhante a delta derivada de iPSC e uma célula semelhante a duto derivada de iPSC. Em algumas modalidades, o organoide pancreático contém um componente exócrino derivado de iPSC.

Em algumas modalidades, o iPSC é um iPSC humano (hiPSC).

Células-tronco embrionárias humanas e células-tronco de pluripotência induzidas por humanos estão disponíveis comercialmente (por exemplo, da WiCell, que fornece iPS (IMR-90)-1, iPS (IMR-90)-4 e iPS (Foreskin)-1). As células- tronco de pluripotência induzidas por humanos também podem ser geradas usando métodos conhecidos na técnica a partir de uma variedade de tipos de células somáticas (Yu, J., K.

Hu, et al. (2009). "Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences" Science, 324 (5928): 797 a 801).

[00229] Organoides de ilhotas pancreáticas, organoides pancreáticos e HILOs como descritos neste documento também exibem função(ões) de uma ilhota pancreática e de um pâncreas. Em certas modalidades, o organoide de ilhota pancreática ou organoide pancreático exibe qualquer uma ou mais das seguintes funções: secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS), secreção de insulina estimulada por KCl, secreção de insulina estimulada por GLP-1, secreção de somatostatina e secreção de glucagon. Em algumas modalidades, a ilhota pancreática ou o organoide pancreático expressa qualquer um ou mais dos fatores de transcrição Pdx1, MafA, Pax4, Pax6, NeuroD1, Nkx6-1, Gata6 e Foxa2. Em algumas modalidades, os HILOs expressam uma proteína de ponto de verificação, ou uma porção funcional da mesma, que funciona para permitir que os HILOs evitem a detecção e a destruição imunológica pelas células do sistema imunológico. Em algumas modalidades, os HILOs expressam mais de um tipo de proteína ou molécula de ponto de verificação, ou uma porção funcional da mesma.

Geração de organoides de ilhotas pancreáticas e pancreáticas

[00230] Em outros aspectos, são descritos métodos de geração de um organoide de ilhota pancreática ou pancreática. Estudos recentes mostraram que, embora fosse possível gerar células semelhantes à beta, produtoras de insulina e responsivas à glicose, esforços para gerar ilhotas pancreáticas capazes de secretar insulina, glucagon e somatostatina em resposta aos nutrientes, bem como esforços para obter vascularização de células-tronco, não tiveram sucesso. São descritos neste documento resultados que demonstram que usando a função de auto-organização de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hADSCs), células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) e células semelhantes a beta derivadas de iPSC humanas, organoides semelhantes a ilhotas secretoras de insulina responsivas à glicose (HILOs) capazes de vascularização funcional são gerados com sucesso in vitro. Além disso, os métodos de geração de organoides semelhantes a ilhotas foram ampliados com sucesso usando sistemas de cultura 3D baseados em goma gelana. A heterogeneidade funcional em organoides semelhantes a ilhotas humanas derivados de hiPSC também foi investigada usando um repórter de luciferase Gaussia para medir a secreção de insulina.

[00231] A geração de órgãos humanos funcionais fornece novas estratégias terapêuticas na triagem de drogas, modelagem de doenças e inibição ou prevenção de falência de órgãos terminais. Foram demonstrados métodos eficientes de diferenciação gradual de células-tronco embrionárias humanas (hESC) e células-tronco de pluripotência induzidas por humanos (hiPSC) em células semelhantes a  produtoras de insulina. Por exemplo, D’Amour et al. e Kroon E. et al. relataram a diferenciação eficiente de hESCs em células produtoras de insulina que, após 4 a 5 meses de maturação in vivo, foram capazes de secretar insulina em resposta à glicose (D'Amour et al., 2006, Nature Biotechnology, 24, 1392 a 1401; Kroon et al.,

2008, Nature Biotechnology, 26, 443 a 452). Recentemente, Rezania et al. e Pagliuca et al. relataram métodos de diferenciação in vitro que induziram a formação de células semelhantes a beta humanas maduras que expressaram os marcadores de células  terminais MAFA e Nkx6-1, e exibiram funcionalidade parcial (por exemplo, secreção de insulina) (Rezania et al., 2014, Nature Biotechnology, 32 (11): 1121 a 33; Pagliuca et al., 2014, Cell, 159, 428 a 439). No entanto, em contraste com as ilhotas humanas cadavéricas, essas células semelhantes a beta exigiam maturação funcional in vivo por alguns meses e não tinham a funcionalidade fornecida pelos outros tipos de células das ilhotas pancreáticas, como o controle glicêmico por células  (secreção de glucagon) e células  (secreção de somatostatina). Além disso, as células semelhantes a beta careciam de um mesênquima e de células endoteliais vascularizadas, que as ilhotas humanas possuem naturalmente. Essas diferenças cruciais entre células semelhantes a beta derivadas de hPSCs e ilhotas humanas podem comprometer a capacidade das terapias baseadas em hPSCs para tratar diabetes insulino-dependente (como diabetes tipo 1 ou estágio avançado de tipo 2).

[00232] Anteriormente, foi identificado que uma transição metabólica ocorre durante a maturação neonatal para adulta de células  nas quais o receptor nuclear órfão relacionado ao estrogênio  (ERR) regula um aumento no metabolismo oxidativo necessário para células  totalmente funcionais. Consistente com este resultado, células semelhantes a  derivadas de iPSC humanas que expressam insulina, MAFA e Nkx6-1 podem ser maturadas metabolicamente através da superexpressão de ERR para aumentar seu metabolismo oxidativo e, assim, aumentar sua funcionalidade de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS).

Estes resultados indicaram que, além da expressão de fatores de determinação de linhagem, como PDX1, MAFA, Nkx6- 1 e insulina, a sinalização celular adicional que amadurece o metabolismo das células  é necessária para gerar células  totalmente funcionais (FIG. 13).

[00233] Durante a organogênese inicial do pâncreas, as células pancreáticas recém-especificadas se originam da camada endodérmica do intestino anterior e formam um broto pancreático, uma massa de tecido condensada que logo é vascularizada. Uma progressão semelhante também foi observada na organogênese do fígado. Essas mudanças morfogenéticas em larga escala dependem da orquestração requintada de sinais entre os progenitores epiteliais endodérmicos, mesenquimais e endoteliais antes da perfusão sanguínea. Takebe et al. gerou com sucesso brotos de órgãos hepáticos através da cultura de células endodermas hepáticas com linhagens endoteliais e mesenquimais que se vascularizaram rapidamente e amadureceram funcionalmente in vivo (Takebe et al., 2013, Nature, 499: 481 a 484).

[00234] Trabalhos anteriores não revelaram a possibilidade de gerar in vitro outros tipos de tecidos organoides, como os organoides do pâncreas, que eram maduros, funcionais e vascularizados. Além disso, trabalhos anteriores mostraram falta de escalabilidade porque os organoides foram gerados usando a matriz MATRIGEL®, que não é eficiente para uso em produção em escala.

[00235] São descritos neste documento estudos que demonstram a geração bem-sucedida em grande escala de organoides semelhantes a ilhotas humanas (HILOs) que podem secretar insulina e são vascularizados, como visto em ilhotas humanas, e que expressam uma ou mais proteínas de ponto de verificação imunológico, proporcionando assim aos HILOs a capacidade de evadir a autoimunidade ou a detecção imunológica vigiando as células imunológicas, por exemplo, células T. É demonstrado neste documento que (1) células- tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (hADSCs) têm uma capacidade de auto-organização (FIGs. 1A e 1B); (2) os progenitores pancreáticos em estágio avançado são capazes de formar um grupo semelhante a uma ilhota (brotos de órgãos) quando co-cultivados com HUVECs e hADSCs com eficiência comparável às células semelhantes a beta; (FIGs. 1A a 1C, FIG. 1E e FIGs. 3A a 3C); (3) organoides semelhantes a ilhotas humanas melhoraram a expressão de fatores de determinação de linhagem, bem como genes reguladores metabólicos incluindo ERR; (4) ensaios de secreção de insulina de ilhotas revelaram que organoides humanos semelhantes a ilhotas contêm células funcionais capazes de secretar insulina em resposta à glicose (por exemplo, exemplo 8); (5) organoides semelhantes a ilhotas humanas (HILOs) exibiram vascularização (FIG. 6C); (6)

organoides semelhantes a ilhotas humanas derivados de hiPSC, como descrito neste documento, organogênese de ilhotas humanas recapturadas e patogênese de diabetes tipo

1 e tipo 2 em um prato; (7) organoides semelhantes a ilhotas humanas derivados de hiPSC, conforme descrito neste documento, ofereceram um novo recurso substituível para o transplante de ilhotas humanas para tratar diabetes tipo 1 e tipo 2; (8) organoides semelhantes a ilhotas humanas transplantados para um modelo de camundongo NODSCID induzido por STZ de diabetes tipo 1 melhorou o diabetes tipo 1 nos animais receptores (FIGs. 1F e 1G); e (9) Wnt4 e

Wnt5a aumentaram o número de células  enriquecidas com mitocôndrias em HILOs (FIGs. 8A a 8D), sugerindo assim que

Wnt4 e Wnt5a (derivados de células endócrinas pancreáticas e células de suporte, respectivamente) aumentam a função metabólica mitocondrial para promover a maturação das células  e função GSIS sustentável.

[00236] Também são descritos neste documento estudos em que o papel de certas proteínas Wnt (também "WNT" neste documento) foi avaliado no desenvolvimento de organoides semelhantes a ilhotas humanas que são capazes de secretar insulina e que são vascularizados, como visto em ilhotas humanas. A família de genes WNT consiste em genes estruturalmente relacionados que codificam proteínas de sinalização secretadas, que têm sido implicadas na oncogênese e em vários processos de desenvolvimento, incluindo a regulação do destino celular e a padronização durante a embriogênese. As proteínas Wnt compreendem uma grande família de moléculas de sinalização que orquestram e influenciam uma variedade de processos biológicos e de desenvolvimento celular. As proteínas Wnt passam por um conjunto complexo de modificações pós-tradução envolvendo várias enzimas de processamento altamente especializadas.

Após a liberação da célula, as proteínas Wnt interagem com uma série de moléculas no ambiente extracelular, como glicanos, parceiros de ligação de proteínas (por exemplo, WIF, Sfrp) e receptores de superfície celular. (Willert, K.

et al., 2012, Cold Spring Harbor, Perspectives in Biology, 2012). Dos estudos descritos neste documento, Wnt5a é a proteína Wnt predominante que induz a auto-organização de hADSCs; (2) Wnt5a, bem como Wnt4, ativam a via metabólica mitocondrial ERR; (3) Wnt4 é suficiente para induzir a maturação funcional in vitro de organoides semelhantes a ilhotas derivados de hiPSC na ausência de tipos de células adicionais, como hADSC e HUVECs.

Geração de HILOs maduros que evitam a detecção imunológica

[00237] In vivo, as células  tornam-se funcionalmente maduras por meio de um longo processo de maturação pós-natal. Até o momento, as células-tronco de pluripotência induzidas por humanos (hiPSCs) não foram transformadas com sucesso em células  totalmente funcionais por meio da duplicação deste processo in vitro.

Além disso, embora as células  derivadas de hiPSCs sejam imunocompatíveis com o paciente, a imunossupressão ao longo da vida ainda pode ser necessária para proteger contra a rejeição do transplante após as células  serem transplantadas para um paciente, particularmente, pacientes com diabetes tipo 1 que geralmente têm um sistema imunológico hiper-reativo. Assim, a geração de PSCs universais que resistem à rejeição imunológica pela expressão de uma ou mais moléculas de ponto de verificação é altamente benéfica, pois isso eliminaria a necessidade de terapias personalizadas caras.

[00238] Uma arquitetura de tecido auto-organizada e tridimensional (3D) é necessária para a formação de órgãos e a diferenciação terminal de tipos de células específicas de órgãos. Conforme descrito neste documento, foram gerados organoides estruturados em 3D compreendendo tecido de ilhotas pancreáticas humanas. A produção de células  funcionais requer diversidade celular dentro das ilhotas em desenvolvimento, bem como interações celulares que podem influenciar a diferenciação funcional das ilhotas de hiPSCs.

[00239] Conforme descrito neste documento, é fornecido um método para a geração escalonável de organoides semelhantes a ilhotas humanas (HILOs) a partir de hiPSC. O método utiliza uma via de diferenciação que resulta em maturação funcional aprimorada e confere aos HILOs resultantes a função imune evasiva. Vantajosamente, o método descrito não requer o uso de instrumentos, como um spinner magnético ou uma superfície ar-líquido, resultando assim em um procedimento simplificado e altamente reprodutível. A escalabilidade do sistema permite a produção em grande e pequena escala de HILOs maduros. A maturidade do tecido é crítica para recapitular todos os aspectos da função das ilhotas pancreáticas. Uma vez que os progenitores pancreáticos derivados de hiPSC ou células semelhantes a  atingem a maturação funcional com níveis fisiológicos de secreção de insulina in vivo dentro de alguns meses, as células semelhantes a  diferenciadas in vitro têm o potencial de serem células semelhantes a  totalmente funcionais e maduras.

[00240] O processo escalável para gerar organoides semelhantes a ilhotas a partir de hiPSCs, conforme descrito neste documento, inclui sinais eficazes para a maturação funcional das células e heterogeneidade celular. Em um aspecto, um sistema de cultura funcional, baseado em polímero, tridimensional (3D) e ativação de sinalização não canônica Wnt (por exemplo, Wnt4) são fornecidos para gerar organoides semelhantes a ilhotas humanas (HILOs) estruturadas em 3D que contêm tipos de células de ilhotas pancreáticas críticas, incluindo células beta () (insulina), células alfa () (glucagon), células delta () (somatostatina), células gama () (PPY) e células  (grelina (GHRL)).

[00241] O sistema 3D escalável para gerar organoides semelhantes a ilhotas humanas maduras (HILOs) envolve a estimulação da via Wnt não canônica para atingir a função OxPhos mitocondrial e a secreção de insulina funcional, conforme descrito neste documento, fornece material biológico terapêutico clinicamente útil para o tratamento de doenças, tais como como diabetes. Conforme descrito neste documento, as ilhotas maduras derivadas de células- tronco ou HILOs podem expressar uma molécula de ponto de verificação imunológico; portanto, são capazes de escapar da rejeição imune alogênica e, assim, fornecer uma cura fundamental para diabetes insulino-dependente, sem recorrer a imunossupressores. Tais HILOs podem servir como ilhotas pancreáticas universais (alogênicas), em vez de ilhotas específicas do paciente ou autólogas, levando a uma maior disponibilidade de materiais biológicos terapêuticos e redução de custos no tratamento de diabetes dependente de insulina.

[00242] Conforme descrito neste documento, a via do IFN foi avaliada quanto à capacidade de minimizar as respostas imunes do hospedeiro contra wHILOs transplantados ou implantados. Após uma curta exposição de wHILOs à estimulação de IFN, verificou-se que IFN induziu rapidamente e de forma robusta a expressão de PD-L1 em wHILOs (FIGs. 12E e 12F). Notavelmente, IFN induziu a expressão de PD-L1 a níveis semelhantes àqueles em ambas as células que expressam e não expressam insulina (células GFP+ e GFP-, respectivamente), (FIGs. 5A e 5B). A exposição repetida de HILOs a IFN (estimulação de IFN) induziu um efeito semelhante em wHILOs, especificamente, uma indução sustentada de PD-L1 nos HILOs. Em um aspecto, exposições curtas repetidas a IFN (estimulação de pulso múltiplo, MPS) levaram à expressão sustentada de PD-L1 e aumentos concomitantes nos níveis de proteína PD-L1 (FIGs. 5C, 5D e 5E). Em modalidades, ilhotas humanas ou HILOs, por exemplo, ilhotas maduras ou HILOs são expostos (em contato com) IFN por pelo menos 0,5 a 5 horas, pelo menos 1 a 5 horas, pelo menos 1 a 3 horas, pelo menos 1 a 2,5 horas, ou pelo menos

1 a 2 horas.

Em modalidades particulares, ilhotas humanas ou HILOs, por exemplo, ilhotas maduras ou HILOs são expostos (em contato com) IFN por mais de 1 hora, mais de

2 horas, por 1 hora, por 2 horas ou por 3 horas, antes da lavagem as ilhotas ou HILOs e permitindo-lhes descansar em meio sem IFN. Nas modalidades, cada exposição das ilhotas humanas ou HILOs ao IFN é denominada um "pulso". Em modalidades, as ilhotas humanas ou HILOs são expostas,

contactadas ou pulsadas com IFN pelo menos uma vez, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes, etc., ou 1, 2, 3, 4 ou 5 vezes, em um protocolo de um dia ou de vários dias (por exemplo, ao longo de um período de 72 horas ou um período de tempo mais longo) em que as células podem se recuperar

(por exemplo, em meio ou matriz sem IFN) entre os pulsos de IFN por cerca de 24 horas.

Em uma modalidade particular, as ilhotas humanas ou os HILOs são pulsados com

IFN três vezes ao longo de 3 dias, (72 horas), por 2 horas por período de pulso, para atingir um nível constitutivo de expressão de PD-L1 nas ilhotas ou nos HILOs.

Seguindo este regime de IFN MPS, as ilhotas humanas ou os HILOs estimulados por IFN mostraram altos níveis de expressão da proteína PD-L1 em 7 dias após MPS.

Em modalidades, as ilhotas humanas ou os HILOs são expostos a (contactados ou pulsados com) IFN em uma quantidade de 1 a 100 ng/ml, 1 a 50 ng/ml, 1 a 25 ng/ml, 1 a 20 ng/ml, 1 a 10 ng/ml, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 ng/ml. Em uma modalidade particular, IFN está em uma quantidade de 10 ng/ml ou 20 ng/ml para cada exposição ou período de pulso. Em uma modalidade particular, as ilhotas humanas ou os HILOs, incluindo ilhotas humanas maduras ou os HILOs, são expostos, contactados ou pulsados com 2 pulsos de IFN por 2 horas por pulso em um período de 2 dias. Em uma modalidade particular, as ilhotas humanas ou os HILOs, incluindo ilhotas humanas maduras ou HILOs, são expostos, contactados ou pulsados com 3 pulsos de IFN por 2 horas por pulso durante um período de 3 dias (dia 3).

[00243] A funcionalidade GSIS não foi comprometida pela exposição dos wHILOs a MPS por IFN (FIG. 5F). Além disso, wHILOs tratados com IFN foram protegidos contra a desdiferenciação de células  induzida por IL-1, conforme revelado pela expressão dos marcadores de identidade de células  INS e UCN3 (FIG. 5H).

[00244] O desenvolvimento normal no útero de um pâncreas humano leva mais de 280 dias e a maturidade funcional completa não é alcançada até alguns anos após o nascimento; portanto, obter uma compreensão completa das complexas vias envolvidas no desenvolvimento e maturação de ilhotas humanas é um passo necessário para a geração de ilhotas funcionais in vitro. Um aspecto fundamental para a maturidade funcional das células  é a ativação da via metabólica mitocondrial, que ocorre naturalmente na maturação pós-natal e é necessária para a função nutricional da secreção de insulina das células  funcionais. Para HILOs, a ativação mitocondrial sustentável pode ser alcançada através da regulação metabólica mitocondrial conduzida por Wnt4.

[00245] Em um aspecto, o aumento da capacidade das células  transplantadas para evadir a detecção imunológica, conforme descrito neste documento, fornece uma estratégia alternativa ou adjunta à correspondência de MHC (A. Morizane et al., 2017, Nature Communications, 8: 385) para reduzir o risco de rejeição autoimune de células de ilhotas transplantadas, ilhotas pancreáticas, organoides e HILOS. Os tratamentos para diabetes à base de células- tronco, ilhotas e organoides devem alcançar a proteção das células transplantadas, ilhotas e organoides da rejeição autoimune, além de sua maturidade funcional. Quando HILOs maduros negativos para PD-L1 foram transplantados em camundongos C57BL/6J imunocompetentes diabéticos, o xenoenxerto foi rejeitado e não conseguiu produzir quantidades detectáveis de peptídeo c humano. Em contraste, os HILOs maduros que expressaram PD-L1 (por meio de engenharia molecular ou indução da expressão de PD-L1 em células organoides, conforme descrito neste documento), sobreviveram com sucesso mais de 50 dias após o transplante em animais imunocompetentes (FIGs. 4D a 4E e FIGs. 12A a 12C). Além disso, a aquisição de tolerância imunológica não exigiu a presença de Tregs. Assim, em um aspecto, a proteção imune adicional pode ser alcançada através da co- cultura de Tregs no sistema à base de gel usado para produzir HILOs maduros. Durante a apresentação do antígeno, as interações entre o antígeno 4 do linfócito T citotóxico (CTLA-4) e as moléculas B7, bem como a proteína de morte programada 1 (PD-1) e seu ligante PD-L1, regulam negativamente as respostas imunes em uma forma não redundante. Conforme descrito neste documento, os HILOs de controle negativos para PD-L1 foram rejeitados em camundongos C57BL6J competentes para células T e B, mas não foram rejeitados em camundongos NOD-SCID deficientes para células T e B (por exemplo, exemplo 8), sugerindo que a rejeição alogênica para HILOs maduros de controle negativo PD-L1 ocorreram principalmente por meio da reação de células T e células B in vivo.

[00246] A geração de iPSCs por reprogramação de células somáticas fornece uma fonte de células específicas do paciente (por exemplo, células autólogas) que podem ser diferenciadas em qualquer linhagem. Além disso, a geração de células produtoras de insulina a partir de iPSCs fornece uma ferramenta inestimável para o transplante autólogo, o que reduziria muito o risco de rejeição autoimune. Embora o transplante alogênico de enxertos compatíveis com MHC tenha se mostrado eficaz na redução das respostas imunológicas e seja útil, essa técnica pode não resultar em evasão completa do sistema imunológico e vigilância imunológica, mesmo em locais menos imunológicos, como o cérebro. Assim, uma combinação de correspondência de MHC e a indução de tolerância imunológica pode fornecer uma abordagem adicional para controlar as respostas imunológicas contra células-tronco transplantadas, ilhotas e organoides. Em alguns casos, esses procedimentos podem evitar a necessidade de medicamentos imunossupressores.

[00247] Como a autoimunidade contínua em pacientes com diabetes tipo 1 ainda pode resultar em imunogenicidade quando as ilhotas derivadas de células-tronco específicas do paciente são transplantadas, ou abordagens de substituição de células de ilhotas baseadas em células- tronco são usadas, empregando hiPSCs alogênicas juntamente com tratamentos imunossupressores ou tolerogênicos (para controlar tanto a alorreatividade quanto a autorreatividade) fornecem terapias vantajosas para pacientes com diabetes tipo 1. Além disso, os procedimentos de bloqueio de coestimulação envolvendo a expressão de uma ou mais moléculas inibidoras de ponto de verificação, bem como uma proteína de ponto de verificação para escapar da vigilância imunológica, por exemplo, CTLA4Ig e PD-L1 expressando células-tronco humanas, células , células de ilhotas ou células de organoides, podem fornecer materiais clinicamente relevantes para o transplante/implante bem- sucedido em indivíduos para tratamento de diabetes. Ao proteger HILOs através da expressão de PD-L1 para promover a sobrevivência do enxerto/transplante/implante, os aloenxertos HILO podem sofrer infiltração reduzida de células imunes, na ausência de drogas imunossupressoras. No entanto, será reconhecido que um ou mais imunossupressores podem ser usados se clinicamente necessário ou desejado.

Métodos de Tratamento

[00248] O transplante de ilhotas é uma terapia para o tratamento de diabetes com deficiência de insulina, como diabetes tipo 1 e diabetes tipo 2 em estágio avançado.

Assim, em um aspecto, é fornecido um método de tratamento de uma doença pancreática, como diabetes tipo 1 ou tipo 2, em que o método compreende administrar um organoide de ilhota pancreática ou organoide pancreático, em particular, um HILO expressando uma proteína de ponto de verificação conforme descrito, em um indivíduo (por exemplo, um indivíduo mamífero, como um ser humano ou paciente humano) por transplante (ou implante). Em uma modalidade, o método trata um indivíduo que sofre, é suscetível a ou está em risco de ter uma doença pancreática (por exemplo, diabetes tipo 1), distúrbio ou sintoma da mesma. O método inclui a etapa de transplantar um organoide de ilhota pancreática ou organoide pancreático (HILO) no mamífero suficiente para tratar a doença, o distúrbio ou o sintoma da mesma, em condições tais que a doença, o distúrbio ou o sintoma seja tratado.

[00249] Tal como utilizado neste documento, os termos "tratar", "tratando", "tratamento" e semelhantes se referem a reduzir, diminuir, melhorar, anular ou aliviar uma doença, um distúrbio e/ou sintomas associados à mesma.

Será reconhecido que, embora não impedido, o tratamento de uma doença, um distúrbio, uma condição ou um sintoma da mesma não requer que o distúrbio, a condição ou os sintomas associados sejam completamente eliminados.

[00250] Tal como utilizado neste documento, os termos "prevenir", "prevenindo", "prevenção", "tratamento profilático" e semelhantes se referem à redução da probabilidade de desenvolver um distúrbio ou uma condição em um indivíduo, que não tem, mas está em risco de, ou suscetível a, desenvolver ou ter um distúrbio ou uma condição.

[00251] Os métodos terapêuticos (que incluem tratamento profilático) geralmente compreendem administrar,

em particular, transplantar ou implantar, uma quantidade eficaz de uma ilhota pancreática ou organoide de ilhota pancreática (por exemplo, um HILO) a um indivíduo (por exemplo, animal, mamífero, humano) com necessidade,

incluindo um mamífero, particularmente um ser humano.

Em particular, a ilhota pancreática ou o organoide de ilhota pancreática (por exemplo, HILO) é molecularmente projetada para expressar uma ou mais proteínas de ponto de verificação.

Em uma modalidade, a proteína de ponto de verificação é PD-L1. Em uma modalidade, uma célula, uma ilhota ou um organoide é submetido a múltiplas exposições intermitentes ao interferon gama (IFN), (estimulação de pulso múltiplo ou MPS), de acordo com os métodos descritos neste documento.

Os métodos MPS produzem células, ilhotas ou organoides nos quais a expressão de uma proteína de ponto de verificação, como PD-L1 é mantida por longos períodos de tempo após o transplante ou a administração a um indivíduo, permitindo assim que as células, as ilhotas ou os organoides transplantados ou administrados funcionem,

evitando a autoimunidade ou detecção imunológica.

Em uma modalidade, a administração de uma ilhota pancreática ou organoide de ilhota pancreática (por exemplo, HILO) pode ser por qualquer meio adequado que resulte em uma quantidade do organoide que, combinada com outros componentes, é eficaz na melhoria, redução, anulação, diminuição, ou estabilização de uma doença pancreática, como diabetes tipo 1 ou tipo 2.

[00252] Em certos aspectos, o indivíduo pode ainda receber a administração de um imunossupressor. O imunossupressor pode ser administrado ao indivíduo antes, durante ou após o indivíduo ser administrado (por exemplo, transplantado ou implantado) com o organoide. O agente imunossupressor pode ser um agente que inibe ou previne a rejeição (por exemplo, rejeição aguda) do organoide transplantado após o transplante, ou um agente que mantém a imunossupressão após o transplante. Os imunossupressores incluem, mas não estão limitados a, basilizimabe, globulina antitimócito, alemtuzumabe, prednisona, azatioprina, micofenolato, ciclosporina, sirolimus e tacrolimus.

[00253] Em algumas modalidades, pelo menos cerca de

100.000, pelo menos cerca de 200.000, pelo menos cerca de

300.000, pelo menos cerca de 400.000, pelo menos cerca de

500.000, pelo menos cerca de 600.000, pelo menos cerca de

700.000, pelo menos cerca de 800.000, pelo menos cerca de

900.000 ou pelo menos pelo menos cerca de 1 milhão de organoides de ilhotas pancreáticas (HILOs) são transplantados ou implantados no indivíduo. Em algumas modalidades, as ilhotas do indivíduo são removidas antes do transplante ou implante dos organoides da invenção. Em algumas outras modalidades, os organoides das ilhotas pancreáticas (HILOs) são transplantados ou implantados em um indivíduo por injeção na parte superior do abdômen dos indivíduos. Em algumas modalidades, os organoides das ilhotas pancreáticas (HILOs) são injetados no fígado. Os organoides das ilhotas pancreáticas podem ser injetados no indivíduo usando um cateter. Em algumas outras modalidades, o organoide pancreático ou organoide de ilhota pancreática (HILO) é administrado ao indivíduo por cirurgia, por exemplo, cirurgia de transplante. Em outra modalidade, os organoides das ilhotas pancreáticas (HILOs) são transplantados para o omento. Para o transplante de omento, uma técnica de estratificação pode ser usada em que o organoide de ilhota (ou células do mesmo) são combinados com plasma autólogo e são colocados por laparoscopia no omento. Uma solução (20 ml) contendo trombina recombinante (1000 U/ml) é em seguida colocada sobre a organoide de ilhota, seguida por outra camada de plasma autólogo para produzir uma estrutura biológica biodegradável que pode sobreviver e funcionar no paciente por pelo menos um ano (ver, por exemplo, Baidal, D. et al., 2017, N. Engl. J.

Med., 376: 19). Em outra modalidade, biomateriais de hidrogel que mitigam uma resposta imune do receptor podem ser usados para o transplante de organoide de ilhotas.

(ver, por exemplo, Vegas, A. et al., 2016, Nature Biotechnology, 34: 345 a 352).

[00254] Embora os organoides, organoides pancreáticos ou organoides das ilhotas pancreáticas (por exemplo, HILOs) sejam preferencialmente projetados para expressar uma ou mais proteínas de ponto de verificação, conforme descrito neste documento, uma reação imune ao organoide transplantado (por exemplo, HILO) pode ser ainda mais reduzida no indivíduo por encapsulamento do organoide, organoide pancreático ou organoide de ilhota pancreática (HILO) em um hidrogel antes do transplante no indivíduo.

Esses métodos de transplante são ainda descritos em Vegas et al., 2016, Nature Medicine. doi: 10.1038/nm.4030; Vegas et al., 2016, Nature Biotechnology, doi: 10.1038/nbt.3462.

Em algumas modalidades, o hidrogel contém um alginato ou derivado de alginato (por exemplo, dióxido de triazol- tiomorfolina). Várias modificações de hidrogéis de alginato que reduzem substancialmente os efeitos inflamatórios ou fibróticos dos hidrogéis de alginato também foram identificadas (Vegas et al., 2016, Nature Biotechnology, doi: 10.1038/nbt.3462). Assim, em algumas outras modalidades, o hidrogel contém uma modificação química que reduz um efeito inflamatório do organoide transplantado no indivíduo.

Ensaios de triagem

[00255] Organoides de ilhotas pancreáticas e organoides pancreáticos (HILOs), como descritos neste documento, podem ser empregados para modelar doenças do pâncreas in vitro ou in vivo. Esses modelos de doença do pâncreas podem identificar drogas que são úteis para o tratamento de uma doença pancreática. Assim, em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para identificar moduladores, ou seja, compostos ou agentes candidatos ou de teste (por exemplo, proteínas, peptídeos, peptidomiméticos, peptoides, polinucleotídeos, moléculas pequenas ou outras drogas) que podem tratar uma doença pancreática, particularmente diabetes tipo 2 e/ou câncer pancreático. Em uma modalidade, o composto ou o agente modula uma atividade de um organoide pancreático ou organoide de ilhota pancreática (HILO), conforme descrito neste documento.

[00256] Os compostos ou os agentes de teste podem ser obtidos isoladamente ou usando qualquer uma das numerosas abordagens em métodos de biblioteca combinatória conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, bibliotecas biológicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas tendo as funcionalidades de peptídeos, mas com uma nova estrutura não peptídica que são resistentes à degradação enzimática e permanecem bioativas; ver, por exemplo, Zuckermann, RN et al., 1994, J. Med.

Chem., 37: 2678 a 2685; fase sólida paralela espacialmente endereçável ou bibliotecas de fase de solução; métodos de biblioteca sintética que requerem deconvolução; o método de biblioteca 'um-grânulo um-composto'; e métodos de biblioteca sintética usando seleção de cromatografia de afinidade. As abordagens da biblioteca biológica e da biblioteca de peptoides são limitadas a bibliotecas de peptídeos, enquanto as outras quatro abordagens são aplicáveis a bibliotecas de compostos de peptídeos, oligômeros não peptídicos ou moléculas pequenas (Lam, 1997, Anticancer Drug Des., 12: 145).

[00257] Exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas moleculares podem ser encontrados na técnica, por exemplo em: DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S. A., 90: 6909; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al., 1993, Science, 261: 1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33: 2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33: 2061; e Gallop et al., 1994, J. Med. Chem., 37: 1233.

[00258] Bibliotecas de compostos podem ser apresentadas em solução (por exemplo, Houghten, 1992, Biotechniques, 13: 412 a 421) ou em contas (Lam, 1991, Nature, 354: 82 a 84), chips (Fodor, 1993, Nature, 364: 555 a 556), bactérias (Ladner, Patente No. US 5.223.409), esporos (Patente de Ladner No. US 5.223.409), plasmídeos

(Cull et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89: 1865 a 1869) ou em fago (Scott e Smith, 1990, Science, 249: 386 a 390; Devlin, 1990, Science, 249: 404 a 406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378 a 6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol., 222: 301 a 310; e Ladner, Ibid., acima).

[00259] Os compostos químicos a serem usados como agentes de teste (isto é, potenciais inibidores, antagonistas, agonistas) podem ser obtidos a partir de fontes comerciais ou podem ser sintetizados a partir de materiais de partida prontamente disponíveis usando técnicas sintéticas padrão e metodologias conhecidas pelas pessoas versadas na técnica. As transformações de química sintética e metodologias de grupo de proteção (proteção e desproteção) úteis na síntese dos compostos identificados pelos métodos descritos neste documento são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, aqueles como descrito em R.

Larock, 1989, Comprehensive Organic Transformations, VCH Editores; T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser e M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); e L.

Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), e suas edições subsequentes.

[00260] As combinações de substituintes e variáveis em compostos abrangidos por estes métodos são apenas aquelas que resultam na formação de compostos estáveis. O termo "estável", tal como utilizado neste documento, refere-se a compostos que possuem estabilidade suficiente para permitir a fabricação e que mantêm a integridade do composto por um período de tempo suficiente para ser útil para os fins detalhados neste documento (por exemplo, transporte, armazenamento, ensaio, atividade, administração terapêutica a um indivíduo).

[00261] Os compostos descritos neste documento podem conter um ou mais centros assimétricos e, assim, ocorrer como racematos e misturas racêmicas, enantiômeros individuais, diastereômeros individuais e misturas diastereoméricas. Todas essas formas isoméricas destes compostos estão expressamente incluídas nos métodos descritos. Os compostos descritos neste documento também podem ser representados em múltiplas formas tautoméricas, todas as quais estão incluídas neste documento. Os compostos também podem ocorrer em formas isoméricas de ligação dupla cis ou trans ou E ou Z. Todas essas formas isoméricas de tais compostos estão expressamente incluídas.

[00262] Os agentes, as moléculas e os compostos de teste também podem ser peptídeos (por exemplo, fatores de crescimento, citocinas, ligantes de receptor) ou polinucleotídeos que codificam esses peptídeos e semelhantes.

[00263] Os métodos de triagem identificam os agentes que aumentam ou diminuem a atividade biológica dos organoides pancreáticos e dos organoides das ilhotas pancreáticas (por exemplo, HILOs), conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, uma doença pancreática, como diabetes (por exemplo, diabetes tipo 2) ou câncer pancreático, é induzida ou mimetizada no organoide de ilhota pancreática (por exemplo, HILO) ou organoide pancreático. O diabetes tipo 2 no organoide pancreático ou no organoide de ilhota pancreática (por exemplo, HILO) pode ser induzido, por exemplo, pelo contato do organoide com ácidos graxos livres (FFAs), glicose e citocinas (em particular, altos níveis de glicose e/ou altos níveis de FFAs). Em uma modalidade, um organoide pancreático ou organoide de ilhota pancreática (por exemplo, HILO) é co- cultivado com células de câncer pancreático, células estreladas e células imunes para criar um microambiente de câncer pancreático humano in vitro.

[00264] Em algumas modalidades, o organoide é colocado em contato com um agente, uma molécula ou um composto candidato e um efeito do agente, da molécula ou do composto candidato em uma atividade, uma função ou um evento biológico é testado. Em algumas modalidades, o agente, a molécula ou o composto candidato é um medicamento aprovado pela Food and Drug Administration (FDA). Por exemplo, atividades biológicas de um organoide pancreático ou organoide de ilhota pancreática (por exemplo, HILO) ensaiadas nos métodos de triagem incluem secreção de insulina (por exemplo, secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS)), apoptose de células beta, atividade de LDHA, atividade de canal K (ATP), função mitocondrial, nível ou atividade de polipeptídeos NDUFA4, ESRRG, KCNK3 ou MAFA ou polinucleotídeos codificadores, morte celular, crescimento celular e metástase. Em algumas modalidades, o agente, a molécula ou o composto aumenta a GSIS.

[00265] Em outras modalidades, as células das ilhotas pancreáticas, organoides pancreáticos ou organoides das ilhotas pancreáticas (por exemplo, HILO) são transplantadas ou implantadas em um hospedeiro para modelar a doença pancreática, como diabetes tipo 2 ou câncer pancreático, in vivo. Os métodos de transplante ou implante de um órgão ou organoide são conhecidos na técnica. O hospedeiro pode ser qualquer mamífero não humano, como um rato ou camundongo.

[00266] Além da expressão de uma proteína de ponto de verificação em células, ilhotas, organoides, células de ilhotas pancreáticas, organoides pancreáticos ou organoides de ilhotas pancreáticas (por exemplo, HILOs) para escapar da autoimunidade e detecção imunológica, a reação imunológica de um receptor ao material biológico transplantado, tais como um organoide (por exemplo, HILO), pode ser reduzida ainda mais, se desejado, encapsulando o organoide (por exemplo, HILO) em um hidrogel e, em seguida, transplantando o organoide encapsulado (por exemplo, HILO) no animal. Tais métodos de transplante são descritos em Vegas et al., 2016, Nature Medicine, doi: 10.1038/nm.4030; e Vegas et al., 2016, Nature Biotechnology, doi:

10.1038/nbt.3462. Em algumas modalidades, o hidrogel contém um alginato ou derivado de alginato (por exemplo, dióxido de triazol-tiomorfolina). Várias modificações de hidrogéis de alginato que reduzem substancialmente os efeitos inflamatórios ou fibróticos dos hidrogéis de alginato também foram identificadas (Vegas et al., 2016, Nature Biotechnology, Ibid.). Em ainda outras modalidades, o hidrogel contém uma modificação química que reduz um efeito inflamatório do organoide transplantado no hospedeiro.

[00267] Em algumas modalidades, um organoide pancreático ou organoide de ilhota pancreática (por exemplo, HILO) e um organoide de fígado são co- transplantados ou implantados no animal. O fígado é o principal órgão alvo da metástase do câncer pancreático. Em camundongos, as células endoteliais in vivo no minipâncreas e no minifígado são conectadas umas às outras e criam uma rede de vasculatura do pâncreas-fígado para a metástase do câncer pancreático. Portanto, um animal co-transplantado com um organoide pancreático ou organoide de ilhota pancreática (por exemplo, HILO) e um organoide de fígado pode ser útil para estudos de metástase de câncer pancreático humano em fígado humano. Em algumas modalidades, os organoides co-transplantados são submetidos a múltiplas exposições intermitentes ao IFN (procedimento MPS) de acordo com os métodos descritos neste documento.

[00268] Em algumas modalidades, a um animal transplantado com um organoide (por exemplo, HILO), conforme descrito neste documento, é administrado um estresse ambiental (por exemplo, uma dieta rica em gordura/alta glicose ou é administrado células de câncer pancreático) para induzir ou imitar a doença pancreática no animal. Em algumas outras modalidades, o animal é transplantado com uma ilhota pancreática, organoide pancreático ou organoide de ilhota pancreática (por exemplo, HILO) e/ou um organoide do fígado no qual uma doença (por exemplo, diabetes tipo 2 ou câncer pancreático) foi induzida.

[00269] Em algumas modalidades, um agente, uma molécula ou um composto candidato é administrado a um animal. Em certas modalidades, o agente, a molécula ou o composto candidato é um medicamento aprovado pela Food and

Drug Administration (FDA). Em algumas modalidades, um efeito do agente, da molécula ou do composto candidato em um fenótipo no animal (como atividade biológica ou função associada ao pâncreas, ou atividades associadas a uma doença, como doença pancreática) é testado. Atividades biológicas exemplares, mas não limitativas, incluem uma ou mais secreção de insulina (por exemplo, secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS)), apoptose de células beta, atividade de lactato desidrogenase (LDHA), atividade do canal K (ATP), função mitocondrial, nível ou atividade do polipeptídeo NDUFA4 (subunidade NDUFA4 da citocromo c oxidase), ESRRG ou MAFA (família do oncogene do fibrosarcoma musculoaponeurótico, proteína A) ou polinucleotídeo codificador, morte celular, crescimento celular e metástase. Em algumas modalidades, o agente, a molécula ou o composto candidato aumenta a GSIS.

[00270] Em qualquer uma das modalidades neste documento, o efeito do agente, da molécula ou do composto candidato (isto é, a capacidade de modular uma atividade ou uma função pancreática) é medido em relação a uma referência ou controle. A referência pode ser, por exemplo, um organoide pancreático não tratado ou organoide de ilhota pancreática. Em algumas modalidades, a referência é um hospedeiro transplantado com um organoide (por exemplo, HILO) conforme descrito neste documento, em que o hospedeiro não recebe um agente, uma molécula ou um composto candidato.

[00271] Agentes, moléculas ou compostos úteis nos métodos descritos neste documento também podem ser detectados pela identificação de um aumento na expressão de um marcador desejável (por exemplo, MAFA como um marcador de destino de células beta). O nível de expressão pode ser medido de várias maneiras, incluindo, mas não se limitando a, medição do mRNA codificado pelos marcadores genéticos; medição da quantidade de proteína codificada pelos marcadores genéticos; ou medição da atividade da proteína codificada pelos marcadores genéticos.

[00272] O nível de mRNA correspondente a um marcador pode ser determinado tanto por formatos in situ quanto in vitro. O mRNA isolado pode ser usado em ensaios de hibridização ou amplificação que incluem, mas não estão limitados a, análises Southern ou Northern, análises de reação em cadeia da polimerase (PCR) e matrizes de sondas.

Em um formato, o mRNA (ou cDNA) é imobilizado em uma superfície e contactado com as sondas, por exemplo, executando o mRNA isolado em um gel de agarose e transferindo o mRNA do gel para uma membrana, como nitrocelulose. Em um formato alternativo, as sondas são imobilizadas em uma superfície e o mRNA (ou cDNA) é colocado em contato com as sondas, por exemplo, em uma matriz de chip de gene bidimensional descrita abaixo. O especialista pode adaptar métodos de detecção de mRNA conhecidos para uso na detecção do nível de mRNA codificado pelos marcadores descritos neste documento.

[00273] O nível de mRNA em uma amostra pode ser avaliado com amplificação de ácido nucleico, por exemplo, por rtPCR (C. Mullis, 1987, Patente No. US 4.683.202), reação em cadeia da ligase (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 88: 189 a 193), replicação de sequência auto- sustentada (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 87: 1874 a 1878), sistema de amplificação transcricional (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 86: 1173 a 1177), Q-Beta Replicase (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology, 6: 1197), replicação por círculo rolante (Lizardi et al., Patente No. US 5.854.033), ou qualquer outro método de amplificação de ácido nucleico, seguido pela detecção das moléculas amplificadas usando técnicas conhecidas na arte. Tal como utilizado neste documento, os iniciadores de amplificação são definidos como sendo um par de moléculas de ácido nucleico que podem hibridizar às regiões 5' ou 3' de um gene (cadeias positivas e negativas, respectivamente, ou vice-versa) e conter uma região curta no meio. Em geral, os iniciadores de amplificação têm cerca de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento e flanqueiam uma região de cerca de 50 a 200 nucleotídeos de comprimento. Sob condições apropriadas e com reagentes apropriados, tais iniciadores permitem a amplificação de uma molécula de ácido nucleico (polinucleotídeo) compreendendo a sequência de nucleotídeos flanqueada pelos iniciadores.

Kits

[00274] Também são fornecidos kits contendo uma célula imunoprotegida, organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática como descrito neste documento, ou uma composição farmaceuticamente aceitável (composição terapêutica) contendo a célula imunoprotegida, organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, para administração ou transplante para um indivíduo com necessidade. Como será reconhecido pela pessoa versada na técnica, tal kit compreende um recipiente estéril que contém a composição terapêutica; tais recipientes podem ser caixas, ampolas, garrafas, frascos, tubos, sacos, bolsas ou outras formas de recipientes adequadas conhecidas na técnica. Os recipientes podem ser feitos de plástico, vidro ou outros materiais adequados para conter medicamentos biológicos. Em algumas modalidades, um kit pode incluir vários recipientes que alojam a célula imunoprotegida, organoide de ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática, uma composição dos mesmos, diluentes, veículos ou excipientes, conforme necessário, e instruções de uso. As instruções geralmente incluirão informações sobre o uso da célula imunoprotegida, organoide de ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática ou sua composição para o tratamento de uma doença, tal como uma doença pancreática ou diabetes. Em outras modalidades, as instruções incluem pelo menos um dos seguintes: descrição do agente terapêutico (célula imunoprotegida, organoide de ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática); esquema de dosagem e administração para tratamento da doença ou transplante; precauções; avisos; indicações; contra-indicações; informações de superdosagem; reações adversas; farmacologia animal; estudos clínicos; e/ou referências. As instruções podem ser impressas diretamente no recipiente (quando presente), ou como uma etiqueta aplicada ao recipiente, ou como uma folha separada, panfleto, cartão ou pasta fornecida no ou com o recipiente.

Vantagens e aplicabilidade das modalidades

[00275] Uma combinação de fatores genéticos e ambientais está por trás da destruição autoimune das células  e, embora a insulina exógena forneça controle glicêmico, as complicações de longo prazo associadas ao diabetes tipo 1 são uma preocupação contínua. Assim, a capacidade de gerar células  adequadas para transplante tem o potencial de melhorar significativamente a vida dos pacientes. Embora o transplante de células de ilhotas cadavéricas ofereça um modo de terapia, abordagens alternativas baseadas em células-tronco continuam a enfrentar numerosos desafios na geração de células  competentes para GSIS em grande escala e na proteção das células transplantadas contra autoimunidade e rejeição alogênica. Para o último, geralmente considera-se que são necessários dispositivos de transplante autônomos, terapias imunossupressoras ou ambos.

[00276] Os métodos e sistemas descritos neste documento fornecem protocolos úteis, tais como condições de cultura 3D que conduzem sistematicamente a diferenciação de células-tronco de pluripotência (por exemplo, hiPSCs), células-tronco ou células-tronco embrionárias (ES), em células semelhantes  insulino-positivas e sensíveis à glicose, e levam à geração de organoides semelhantes a ilhotas humanas evasivas e metabolicamente maduras (wHILOie), capazes de secretar insulina em resposta a um desafio de glicose. Além disso, esses HILOs funcionalmente maduros restabelecem rapidamente a homeostase da glicose após o transplante em camundongos diabéticos e imunocompetentes. Uma característica dos protocolos descritos favorece as constatações dos inventores de que o metabolismo mitocondrial oxidativo era central para a maturação das células  pós-natal e que o fator de transcrição ERR era necessário e suficiente para este programa metabólico. A identificação de WNT4 como um fator de maturação potente para induzir a expressão de ERR e para aumentar a fosforilação oxidativa mitocondrial permitiu a produção de wHILOs em meio totalmente definido quimicamente (FIGs. 3F e 3H).

[00277] Como seria reconhecido pelo especialista, os desafios para a terapêutica baseada em células-tronco incluem a rejeição autoimune de células transplantadas, além da maturidade metabólica e funcional das células. No entanto, os métodos, os sistemas e os produtos biológicos gerados e fornecidos neste documento fornecem soluções vantajosas para tais desafios. A título de exemplo, a constatação de que wHILOs manteve a funcionalidade em NOD- SCID, mas não em camundongos C57BL6J, implica células T e células B na rejeição de xenoenxerto (FIG. 3K e FIG. 7C).

Durante a apresentação do antígeno, as interações entre o antígeno-4 do linfócito T citotóxico (CTLA-4) e as moléculas B7, bem como o receptor da proteína de morte celular programada 1 (PD1) e seu ligante PD-L1, regulam negativamente as respostas imunológicas de uma forma não redundante. Conforme descrito e exemplificado neste documento, HILOs, tais como wHILOs, que superexpressam PD-L1 são protegidos de rejeição de xenoenxerto (FIG. 4C) e alogênica (FIG. 4K). Conforme descrito e exemplificado neste documento, métodos e sistemas foram desenvolvidos em que exposições múltiplas e repetidas a concentrações limitadas de IFN (método de tratamento de IFN MPS) ao longo do período de tempo levaram à expressão de PD-L1 endógena sustentada sem comprometer a atividade GSIS das células (por exemplo, células ), HILOs e células dos mesmos. Notavelmente, os HILOs evasivos imunológicos resultantes mantiveram a homeostase da glicose em camundongos diabéticos imunocompetentes e humanizados na ausência de um dispositivo de transplante.

[00278] A geração de iPSCs por reprogramação de células somáticas fornece uma fonte de células singênicas ou autólogas específicas do paciente que podem ser potencialmente diferenciadas em qualquer linhagem. Assim, a geração de células produtoras de insulina a partir de iPSCs para transplante autólogo pode reduzir drasticamente o risco de rejeição autoimune. No entanto, em termos práticos, a geração de transplantes autólogos de grau clínico que atendam aos padrões de fabricação, garantia de qualidade e conformidade regulatória envolve procedimentos caros e demorados. Embora o transplante alogênico de enxertos compatíveis com MHC tenha se mostrado eficaz na redução das respostas imunológicas, essa técnica geralmente não resulta em evasão completa do sistema imunológico,

mesmo em locais menos imunológicos, como o cérebro. Além disso, permanece a possível destruição das células produtoras de insulina transplantadas por células T autorreativas. Assim, os presentes métodos e suas células e produtos resultantes (por exemplo, células e HILOs imunes evasivos) fornecem terapêuticas benéficas e de longa duração que mantêm a função (por exemplo, GSIS) e a integridade por períodos de tempo significativos após o transplante ou a administração a um indivíduo com necessidade. Em modalidades, a correspondência de MHC e/ou a indução de tolerância imunológica podem ainda ser empregadas para controlar as respostas imunológicas, de forma ideal sem drogas imunossupressoras.

[00279] São fornecidos e descritos em uma modalidade neste documento métodos e sistemas de cultura vantajosos (por exemplo, um sistema de cultura 3D) para a geração de organoides semelhantes a ilhotas humanas (HILOs). Os métodos e sistemas incorporam a sinalização WNT não canônica para promover a maturação metabólica e a secreção de insulina sensível à glicose em HILOs e células dos mesmos, e exposição limitada a IFN, ou seja, estimulação de pulso múltiplo com IFN, para conduzir a expressão sustentada de PD-L1 endógeno nos HILOs e nas células neles contidas. A capacidade de gerar HILOs evasivos imunológicos funcionais, por exemplo, wHILOie, que são capazes de evitar a detecção imunológica durante um período significativo de tempo (mais de 50 dias ou mais) representa um grande avanço que oferece uma alternativa viável ao uso atual de ilhotas cadavéricas ou tecnologias dependentes de dispositivo.

[00280] A prática dos métodos e dos protocolos descritos neste documento emprega, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão bem dentro do alcance da pessoa versada na técnica. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura, como em “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edição (Sambrook, 1989), bem como nas edições subsequentes; “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller e Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991). Estas técnicas são aplicáveis à produção dos polinucleotídeos e polipeptídeos descritos neste documento e, como tal, podem ser consideradas e empregadas na preparação e na prática da invenção.

[00281] Técnicas particularmente úteis para modalidades particulares são discutidas nos exemplos a seguir, que são apresentados para fornecer às pessoas versadas na técnica uma divulgação e uma descrição completa de como fazer e usar os produtos, ensaios, procedimentos, triagem e métodos terapêuticos conforme descrito, sem a intenção de limitar a descrição e a divulgação neste documento.

EXEMPLOS Exemplo 1: Geração e caracterização de organoides de ilhotas pancreáticas e organoides pancreáticos

[00282] Embora um modelo de doença animal possa fornecer informações sobre a patogênese das doenças, os medicamentos identificados a partir de triagens usando modelos animais muitas vezes deixam de ser adotados em pacientes humanos. A geração de organoides humanos funcionais fornece uma nova estratégia terapêutica na triagem de drogas e modelagem de doenças. Neste documento é descrita uma técnica para gerar um miniorgão pancreático humano 3D, ou organoide (por exemplo, HILO), em um prato.

Usando esta técnica, doenças como o diabetes tipo 2 humano podem ser modeladas in vitro para encontrar drogas eficazes em doenças genéticas, de pacientes ou ambientais específicas, como diabetes tipo 2 humano.

Desenvolvimento de sistema de cultura 3D baseado em goma gelana para diferenciação de células semelhantes a 

[00283] Sabe-se que os sistemas de cultura tridimensional (3D) contribuem para facilitar a auto-

organização e a integração das células.

Portanto, a matriz

MATRIGEL® contendo componentes da matriz extracelular, como colágeno e fibronectina, é frequentemente usada como base de um sistema de cultura 3D.

No entanto, os sistemas de cultura 3D baseados em matriz MATRIGEL® não são ideais para a geração de organoides humanos em grande escala devido ao seu custo e às dificuldades de aumento de escala.

São descritos a seguir sistemas de cultura 3D baseados em goma gelana e métodos para diferenciação de células do tipo ,

que são econômicos e facilmente escaláveis.

Em uma modalidade, usando um protocolo de diferenciação passo a passo totalmente definido quimicamente, as células de pluripotência humanas (hPSCs) são diferenciadas em grupos de células esféricas semelhantes a ilhotas produtoras de insulina com alta eficiência e reprodutibilidade em sistemas de cultura 3D baseados em goma gelana.

Células-

tronco de pluripotência dissociadas individuais (PSCs)

formaram-se com sucesso em esferas dentro de 5 dias em goma gelana contendo meio STEMCELL™ TeSR™. Quinze (15) a 21 dias após a diferenciação em goma gelana contendo Custom TeSR™ com estimulação de molécula pequena definida, agrupamentos de GFP positivos para insulina foram observados.

A análise do transcriptoma global por RNA-seq revelou a diferenciação gradual de hiPSCs em células positivas para insulina que expressam genes marcadores específicos da linhagem de células , incluindo Pdx1, Nkx6-1, GATA6 e MAFB. A diferenciação de hiPSCs, bem como das linhagens ESC humanas HuES8 e H1ES, em grupos de células semelhantes a ilhotas foi ainda confirmada pela perda progressiva do marcador de pluripotência Nanog, a indução do marcador específico para células  Nkx6-1 e a progressiva indução dos hormônios endócrinos insulina, somatostatina e glucagon, conforme determinado por qPCR. Estes resultados demonstraram que os sistemas de cultura 3D baseados em goma gelana são adequados para a geração de organoides semelhantes a ilhotas em grande escala a partir de hPSCs.

Geração de organoides humanos escalonáveis semelhantes a ilhotas in vitro

[00284] As células semelhantes a  derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESC) ou células- tronco de pluripotência induzidas por humanos (hiPSC) têm funcionalidade limitada e não possuem a característica morfológica e funcional de ilhotas humanas. Estudos anteriores revelaram que a co-cultura de hepatócitos derivados de hiPSC com células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) e células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana (hMSC) gera esferas de broto de fígado 3D auto-organizadas em matrigel (Takebe et al., 2013, Nature, 499: 481 a 484). Este estudo constatou que os “organoides” do fígado tinham expressão superior de fatores determinantes de linhagem em comparação com a diferenciação de hepatócitos isolados e que esses organoides vascularizaram rapidamente e amadureceram funcionalmente in vivo.

[00285] Estudos constataram que as células progenitoras pancreáticas derivadas de hiPSC (hiPSC-PP) geradas usando um protocolo de diferenciação 2D (Yoshihara et al, 2016, Cell Metab. 23, 622 a 634) não se auto- organizaram na matriz 3D MATRIGEL® (ver, por exemplo, WO 2017/205511). Em contraste, as células HUVEC formaram rapidamente uma estrutura semelhante à vasculatura, enquanto as células-tronco derivadas de tecido adiposo humanos (hADSCs) se auto-organizaram na matriz 3D MATRIGEL®. Na matriz MATRIGEL®, as células hADSC dispersas projetaram processos em 4 horas, formaram um envoltório semelhante a um pano em 12 horas e adotaram uma formação semelhante a esférica em 24 a 48 horas. Além disso, uma densidade celular mínima para auto-organização foi identificada (ou seja, ~10.000 a 20.000 células em 300 l de matriz MATRIGEL® em poço de ~2 cm2. A análise de RNA-seq identificou mudanças transcricionais dinâmicas durante a auto-organização hADSC 3D, sugerindo que a capacidade de se auto-organizar em condições de cultura 3D é uma característica inerente aos hADSCs virgens. Esses resultados identificam o hADSC mesenquimal como um recurso para a geração de organoides auto-organizados.

[00286] Para explorar a organogênese pancreática, células hiPSC-PP (1 x 106 células) foram co-cultivadas com HUVECs (7 x 105 células) e hADSCs (1 a 2 x 105 células) (FIGs. 1A e 1B) na matriz Matrigel. Esta co-cultura produziu aglomerados de células 3D macroscopicamente visíveis 48 horas após a semeadura. Além disso, a expressão de insulina, com base na expressão de um repórter GFP, foi detectada 5 dias após a semeadura e aumentou com o tempo em cultura em organoides semelhantes a ilhotas humanas. Além disso, as células endoteliais baseadas em HUVECs são integradas dentro dos organoides, conforme mostrado por HUVECs marcados com fluorescência (mCherry). As limitações da matriz MATRIGEL® para produção de organoide incluem alto custo, difícil recuperação de organoide, restrições de escala e variabilidades de lote para lote.

[00287] Os métodos para gerar organoides semelhantes a ilhotas humanas morfologicamente idênticas usando culturas 3D à base de goma gelana são descritos neste documento abaixo e em WO 2017/205511. Progenitores pancreáticos derivados de células-tronco de pluripotência induzidas humanas (hiPSC-PPs) (1 x 108 células) foram cultivadas com uma população de células estromais, como células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) (2 a

7 x 106 células) e células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hADSCs) (2 a 7 x 106) em 50 ml de meio de cultura 3D à base de goma gelana. HiPSC-PP formou rapidamente a formação de esfera semelhante a uma ilha com HUVECs e hADSCs dentro de 5 dias após a semeadura no meio de cultura 3D à base de goma gelana. Ilhotas humanas como miniorgãos expressaram repórter de GFP de insulina humana em 5 dias após a semeadura com aumento gradual da intensidade de GFP. A co-cultura de hiPSC-PP, hADSCs e HUVECs de acordo com este método gerou organoides semelhantes a ilhotas humanas com alta reprodutibilidade que eram morfologicamente semelhantes às ilhotas humanas.

Além disso, os organoides semelhantes a ilhotas humanas gerados continham grânulos de insulina em células semelhantes a . As análises de expressão gênica revelaram expressão aumentada de genes determinantes do destino das células  (Insulina, Nkx6-1, PCSK1 e UCN3) e genes metabólicos mitocondriais relacionados (Esrrg, Ndufal, Ndufa 12, Cox7a2. Atp5b) na população de células que expressam insulina (GFP enriquecido (GFP+)) em organoides semelhantes a ilhotas em comparação com aqueles preparados sem co-cultura de hADSC e HUVEC. O ensaio de secreção de peptídeo c humano estimulado por glicose revelou que organoides semelhantes a ilhotas gerados por este método são capazes de secretar peptídeo c humano em resposta a glicose elevada (20 mM).

[00288] Um teste de vascularização funcional in vitro foi realizado. Miniórgãos semelhantes a ilhotas gerados em goma gelana foram transferidos para a matriz MATRIGEL® e cultivados em meio de crescimento endotelial (EGM). A fluorescência verde indica a expressão dos genes da insulina. Dentro de 24 horas a 48 horas após a estimulação por EGM, o crescimento de células HUVEC foi observado, indicando que organoides humanos semelhantes a ilhotas gerados pelo método possuíam a capacidade de formar estruturas vasculares.

Estabelecimento de ensaio de secreção de insulina de ilhota única usando o sistema de ensaio Luciferase de Gaussia Proinsulin-NanoLuc

[00289] Foi publicado anteriormente que um construto repórter, no qual a luciferase de Gaussia é colocada dentro da porção do peptídeo c da pró-insulina, mede com precisão a secreção de insulina sem afetar a função das células  (Burns et al., 2015, Cell metabolism, 21, 126 a 137).

Usando um sistema lentiviral, foram geradas células INS-1 que expressam esta luciferase de Gaussia de forma estável.

A secreção de luciferase de células INS-1 expressando de forma estável Proinsulin-NanoLuc aumentou com alta glicose (20 mM), alta glicose com Exendin-4 (G20 mM + Ex4) e o agente despolarizante, cloreto de potássio, confirmando a utilidade deste sistema repórter. Em seguida, foi avaliada a utilidade deste repórter para medir a secreção de insulina em ilhotas de camundongos ou humanos transitoriamente infectados com o repórter Proinsulin- NanoLuc. A secreção de luciferase em resposta a 20 mM de glicose elevada foi detectada em camundongos infectados transitoriamente e em ilhotas humanas. É importante ressaltar que a sensibilidade do ensaio foi suficiente para que a secreção de insulina pudesse ser qualificada no nível de ilhotas individuais. Estes resultados indicam que o ensaio de secreção de insulina baseado em repórter de luciferase Proinsulin-NanoLuc é aplicável não apenas às células da linhagem de células beta de rato INS-1, mas também a células  primárias de camundongo e humanas (ver, por exemplo, WO 2017/205511).

Estabelecimento de células hiPSC e hESC incorporando linhagem dupla e repórteres funcionais

[00290] IPSCs humanos e hESCs expressando de forma estável repórteres para linhagem de células  (repórter de insulina humana) e função de células  (repórter Proinsulin-NanoLuc) foram gerados, hiPSChINS-GFP/Sec-Luc e hESChINS-GFP/Sec-Luc, respectivamente. Em primeiro lugar, um construto resistente à neomicina do repórter GFP de insulina humana foi gerado pela inserção da sequência do promotor de insulina humana de pGreenZeo lenti-repórter

(SR10028PA-1, System Bioscience) no plasmídeo pGreenFire Lenti-Reporter (TR019PA-1, System Bioscience) (denominado hINS-GFP-EF1a-Neo). O lenti vírus hINS-GFP-EF1a-Neo foi infectado em hiPSC e hESC por spin fection (800 g, 1 hora, 37 °C) seguido por um meio alterado para meio STEMCELL™ TeSR™ fresco. Três (3) dias após a primeira infecção, as células foram tratadas com 100 g/ml de G418 em meio STEMCELL™ TeSR™ durante 7 dias. Células selecionadas hiPSC e hESC que expressam estavelmente hINS-GFP-EF1a-Neo foram subsequentemente infectadas com o lentivírus Proinsulin- NanoLuc (Addgene, Plasmid # 62057) por spin fection (800 g, 1 hora, 37 °C) seguido por uma mudança de meio para meio STEMCELL™ TeSR™ fresco. Três (3) dias após a segunda infecção, as células foram tratadas com 5 g/ml de blasticisina e 100 g/ml de G418 em meio STEMCELL™ TeSR™ por 7 dias. Posteriormente, as células foram mantidas em meio STEMCELL™ TeSR™. As linhagens celulares estáveis geradas incorporando os repórteres duais mantiveram as capacidades de autorrenovação e pluripotência, bem como a capacidade de se diferenciar em células do tipo  produtoras de insulina (ver, por exemplo, WO 2017/205511).

Culturas de organoides semelhantes a ilhotas humanas apresentam secreção consistente de insulina, apesar da funcionalidade variável observada em organoides individuais

[00291] Estudos recentes relataram a geração de células  produtoras de insulina de hESC e hiPSC capazes de secretar insulina em resposta à glicose (Pagliuca et al., 2014, Cell, 159, 428 a 439; Rezania et al., 2014, Nature Biotechnology, 32 (11): 1121 a 1133; Russ et al., 2015, EMBO Journal, 34: 1759 a 1772). No entanto, grupos semelhantes a ilhotas humanas totalmente funcionais, capazes de secretar insulina de forma adequada em resposta a sinais nutricionais, incluindo glicose, aminoácidos, ácidos graxos e incretinas, como GLP-1, ainda precisam ser demonstrados. Até à data, os esforços têm-se concentrado na geração independente de células semelhantes a  produtoras de insulina, células semelhantes a  produtoras de glucagon e células semelhantes a  produtoras de somatostatina a partir de hPSC. No entanto, essas abordagens carecem de células de suporte importantes para a regulação, como células mesenquimais, células adiposas e células da vasculatura. Uma vez que a estrutura 3D das ilhotas aumenta naturalmente sua função, esses componentes celulares ausentes podem comprometer a funcionalidade dos aglomerados de células semelhantes às ilhotas. Além disso, a organogênese das ilhotas pancreáticas envolve a expansão clonal das células , sugerindo que essas células podem ter funções múltiplas em organoides semelhantes às ilhotas.

Para testar essa ideia, ensaios de secreção de pró-insulina de organoide único foram realizados. Organoides semelhantes a ilhotas humanas gerados por métodos descritos neste documento são morfologicamente idênticos às ilhotas humanas. No entanto, foi observada variabilidade significativa nas capacidades de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) de organoides semelhantes a ilhotas humanas em comparação com ilhotas humanas, conforme medido pelo ensaio de secreção de pró-insulina luciferase.

A funcionalidade GSIS consistente foi demonstrada em organoides agrupados (10 a 100 organoides por ensaio). Além disso, as ilhotas humanas agrupadas como organoides demonstram GSIS aprimorado quando coestimulação com GLP-1, bem como secreção de insulina estimulada por KCl robusta.

[00292] Organoides semelhantes a ilhotas pancreáticas humanas cultivadas in vitro, derivadas de iPSC, geradas aqui mantiveram sua capacidade de responder à glicose, GLP1 e KCl após um período prolongado (133 dias) em cultura.

Exemplo 2: Transplante de organoides de ilhotas pancreáticas funcionais resgatados de camundongos diabéticos tipo 1

[00293] A expressão de marcadores de ilhotas funcionais específicos, como MAFA, UCN3 e genes oxidativos mitocondriais, como ERR (Esrrg), Ndufa 1, Ndufa 12, Cox7a2 e Atp5b em organoides semelhantes a ilhotas humanas derivados de hiPSC foi observada, conforme descrito nos exemplos abaixo. Notavelmente, esses organoides semelhantes a ilhotas recapturam em um prato tanto o desenvolvimento de ilhotas humanas quanto a patogênese do diabetes. O transplante desses organoides funcionais semelhantes a ilhotas resgata camundongos diabéticos tipo 1 com longa sobrevida, vascularização rápida e rejeição imunológica reduzida.

Exemplo 3: Proteínas Wnt na maturação metabólica de organoides de ilhotas derivados de iPSC

[00294] Os genes Fltp e Esrrg foram encontrados para serem expressos em organoides de ilhotas derivados de iPSC (dia 21, gerado sem co-cultura com hADSCs ou HUVECs) após o tratamento com PBS, WNT3a (500 ng/ml), (rh)WNT4 (100 ng/ml) ou rhWNT5a (400 ng/ml) humanos recombinantes por 5 dias. A expressão do gene Esrrg foi induzida em organoides de ilhotas derivados de hiPSC que foram gerados na ausência de hADSC ou HUVECs de suporte, em resposta a doses crescentes de rhWNT4 (0, 10, 25, 50, 100, 200 ng/ml) e de rhWNT5a (0, 25, 50, 100, 200, 400 ng/ml). Além disso, os genes mitocondriais envolvidos na fosforilação oxidativa (Cox7a2, Ndufa1, Ndufa7), lactato desidrogenase (Ldha) e Fltp (um efetor de Wnt/polaridade celular planar (PCP) e gene repórter) foram induzidos em organoides de ilhotas derivados de hiPSC que foram gerados na ausência de hADSC ou HUVECs de suporte, em resposta a doses crescentes de rhWNT4 (0, 10, 25, 50, 100, 200 ng/ml) e de rhWNT5a (0, 25, 50, 100, 200, 400 ng/ml). Os níveis mitocondriais (Mitotracker; Mito-Red) e de insulina (Insulina-GFP) foram aumentados em organoides das ilhotas derivadas de hiPSC (dia 27) após 8 dias de tratamento com PBS ou WNT4 (100 ng/ml). Organoides de ilhotas derivados de iPSC humanos (dia 27) foram gerados após 8 dias de tratamento com PBS ou WNT4 (100 ng/ml). A produção de insulina foi encontrada em organoides de ilhotas derivados de hiPSC (dia 27) após 8 dias de tratamento com rhWNT4 (100 ng/ml), rhWNT5a (400 ng/ml) ou meio condicionado de fibroblastos secretores de WNT5a (50%), em comparação com PBS e controle de meio condicionado de fibroblasto (50%). Organoides de ilhotas derivados de iPSC humano (hiPSC) (dia 22) tratados com rhWnt4 (100 ng/ml) por 12 dias mostraram maturação funcional com base em sua secreção de peptídeo c humano, conforme medido em resposta à baixa glicose (3 mM, “G3mM"), glicose elevada (20 mM,"G20mM") ou níveis elevados de KCl (20 mM, "KCL20mM"), (ver, por exemplo, WO 2017/205511).

Exemplo 4: Geração de organoides semelhantes a ilhotas humanas funcionais (HILOs) a partir de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSC) usando um sistema de cultura 3D à base de polímero funcional

[00295] Ilhotas humanas derivadas de células-tronco são promissoras como terapia para diabetes dependente de insulina. Este exemplo descreve a geração de organoides semelhantes a ilhotas humanas (HILOs) a partir de células- tronco de pluripotência induzidas (iPSCs) e mostra que a ativação da via WNT não canônica conduz uma etapa de maturação metabólica necessária para a secreção de insulina estimulada por glicose robusta. Estes HILOs funcionalmente maduros contendo vários tipos de células endócrinas mantêm a homeostase da glicose após o transplante em camundongos NOD-SCID diabéticos. Além disso, a superexpressão de PD-L1 gerou HILOs imunologicamente evasivos e imunologicamente protegidos que mantiveram a homeostase da glicose em camundongos diabéticos tipo 1 imunocompetentes por pelo menos 50 dias. A capacidade de gerar, de forma escalável, organoides funcionais semelhantes a ilhotas que evitam a detecção imunológica fornece uma nova terapia vantajosa e benéfica para o diabetes.

[00296] O transplante de ilhotas fornece controle superior de glicose no sangue a longo prazo para diabéticos tipo 1 e tipo 2 em estágio avançado; no entanto, a disponibilidade e a qualidade das ilhotas cadavéricas são atualmente limitantes. Embora a diferenciação de células- tronco de pluripotência induzidas (iPSCs) em células semelhantes a  produtoras de insulina represente um avanço no campo, os métodos para gerar células semelhantes a  funcionais apropriadas para terapia e tratamento humanos fornecidos neste documento fornecem células biologicamente funcionais e produtos de HILO adequados para uso como terapêutica e em transplantes.

[00297] Conforme descrito, uma etapa de maturação metabólica pós-natal orientada por ERR é necessária para a secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) nas células . Além disso, a superexpressão de ERR em células semelhantes a  derivadas de iPSC foi suficiente para a funcionalidade in vitro e in vivo. Para gerar células funcionais adequadas para transplante, foram desenvolvidas condições de cultura que replicam a arquitetura celular, bem como a complexidade do tipo de célula das ilhotas. Por conseguinte, como modelos transcricionalmente semelhantes de fibroblasto pancreático e células epiteliais, células- tronco derivadas de tecido adiposo humano (hADSCs) e células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) foram usadas por suas habilidades intrínsecas de células de formar estruturas semelhantes a órgãos e vasculares, respectivamente, quando cultivado em culturas Matrigel tridimensionais (3D) (FIG. 1A). A incorporação de hADSCs e HUVECs durante a diferenciação de células-tronco de pluripotência induzidas por humanos (hiPSC)-progenitores endócrinos (EPs) em um gel à base de polissacarídeo tridimensional (goma gelana) levou à formação de esferoides multicelulares (MCSs), comparáveis em tamanho a ilhotas humanas (FIG. 1B; FIGs. 6 a 6F). Estes MCSs contêm células produtoras de insulina, como visto a partir da expressão de GFP conduzida pelo promotor de insulina e a presença de grânulos de insulina (FIG. 1C); a incorporação de hADSCs foi confirmada pela presença de células contendo lipídios em estruturas do tipo gotícula (FIG. 1E). Em comparação com os progenitores endócrinos (EPs) diferenciados na ausência de hADSCs e HUVECS (IS), a expressão de ERR e os genes mitocondriais NDUFA1 e COX7A2 foram aumentados em MCSs, consistente com a maturação metabólica funcional (FIG. 1D).

Consistente com a sua maturação funcional, os MCSs exibiram secreção de insulina melhorada em resposta a um desafio de glicose (medido por secreção de peptídeo c), (FIG. 1E).

Além disso, os MCSs desenvolveram estruturas semelhantes a vasculares quando estimulados com meio de crescimento endotelial, sugerindo a possibilidade de funcionalidade in vivo estendida (FIG. 6C). Na verdade, MCSs transplantados para a cápsula renal foram capazes de manter a homeostase da glicose por aproximadamente 40 dias em camundongos NOD- SCID diabéticos induzidos por STZ (modelo de camundongo diabético), exibindo eficácia semelhante aos transplantes de ilhotas humanas (FIG. 1F). Além disso, os MCSs transplantados permaneceram responsivos à glicose, regulando apropriadamente a secreção de insulina nos estados de alimentação, jejum e realimentação conforme indicado pelos níveis de peptídeo c (FIG. 1G); (os níveis de insulina no camundongo eram < 0,2 ng/ml, não mostrado).

[00298] Os resultados obtidos suportam o papel das interações multicelulares 3D na organogênese, como mostrado anteriormente para os organoides do fígado. As alterações transcricionais induzidas durante as 48 horas iniciais de cultura de hADSC de célula única do tipo 3D foram avaliadas para compreender os sinais moleculares que direcionam a capacidade intrínseca da célula de automontagem (FIG. 2A).

A análise da ontologia genética identificou as vias de sinalização metabólica e de citocinas, bem como a sinalização WNT, enriquecida nos transcritos alterados (FIG. 2A). Consistente com isso, as expressões temporais de WNTs durante a automontagem de hADSC revelaram um aumento transitório de aproximadamente 2 vezes na expressão de WNT5a que coincidiu com as interações célula-célula iniciais observadas em culturas tridimensionais (3D) (FIG.

2B).

Exemplo 5: A via não canônica Wnt regula a expressão gênica para permitir a fosforilação oxidativa e a maturação de HILOs

[00299] A via WNT não canônica é um marcador para células  maduras não proliferativas, e a expressão de WNT4 é aumentada durante a maturação funcional pós-natal de ilhotas de camundongo. Em estudos experimentais usando ilhotas humanas, constatou-se que WNT4 era altamente expresso nas ilhotas humanas (FIG. 2C), de acordo com esses achados. Além disso, o sequenciamento de células únicas de ilhotas humanas identificou a expressão generalizada de WNT4 em células  e , juntamente com a expressão de WNT5A mais restrita predominantemente em células estreladas (FIGs. 2D, 2E, 2F; FIGs. 6D a 6F). Para demonstrar que a sinalização WNT não canônica foi suficiente para a maturação funcional de células  derivadas de iPSC ou células semelhantes a , a edição do genoma CRISPR-Cas9 foi usada para inserir as sequências de codificação de GFP a jusante do promotor de insulina em hiPSCs (FIG. 7A), para gerar um repórter para a atividade do promotor da insulina endógena e para permitir que a atividade do promotor da insulina endógena seja visualizada. Essas hiPSCs projetadas foram posteriormente diferenciadas em um sistema de cultura 3D totalmente definido quimicamente que incorporou WNT4 na etapa de maturação do progenitor endócrino (EP) final (FIG.

3A). Este protocolo de diferenciação 3D otimizado levou à formação de organoides semelhantes a ilhotas humanas (HILOs) que expressaram insulina (FIGs. 3A e 3B). Além disso, a expressão de urocortina-3, secretada de células  para regular a secreção de somatostatina das células  (delta), co-localizada com insulina em HILOs (FIG. 2B). A análise dos HILOs por microscopia eletrônica revelou semelhança estrutural com ilhotas humanas, mais notavelmente, pela presença de insulina e grânulos de glucagon nos HILOs (FIG. 3C).

[00300] As análises transcricionais comparativas confirmaram a indução de marcadores de células de ilhotas chave em HILOs tratados com WNT4 (wHILOs) em níveis comparáveis aos observados em ilhotas humanas, incluindo genes específicos de células  (NKX2-2, NEUROD1, RFX6, GCK) e genes específicos de células  (ARX), (FIGs. 3D-1 e 3D- 2). É importante ressaltar que a expressão de marcadores de especificação de linhagem celular , incluindo INS, NKX6-1, UCN3, MAFB e SYT4, não foi afetada pela adição de WNT4, indicando assim que esta sinalização WNT não canônica não estava afetando a determinação do destino celular. Em contraste, WNT4 aumentou de forma dependente da dose a expressão de ERR (codificado por ESRRG), bem como componentes da cadeia respiratória mitocondrial NDUFA7 e COX7A2 em HILOs (FIG. 3F). Consistente com essas induções, os HILOs gerados na presença de WNT4 exibiram aumento do metabolismo oxidativo, conforme medido por um aumento na taxa de consumo de oxigênio (OCR) e diminuição da taxa de acidificação extracelular (ECAR), replicando as características metabólicas de ilhotas humanas saudáveis (FIG. 3H e FIG. 7C). Os HILOs tratados com WNT4 mostraram GSIS in vitro melhorado; um efeito que não foi bloqueado pelo inibidor de -catenina XAV939 (FIG. 3I; FIGs. 7D-1 e 7D-2). Da mesma forma, a cultura de células derivadas de hiPSC disponíveis comercialmente em meio de diferenciação 3D contendo WNT4 promoveu a formação de pseudo-ilhotas e a funcionalidade GSIS. (FIG. 3J e FIG. 3K). É importante ressaltar que wHILOs (isto é, HILOs cultivados em cultura ou meio de diferenciação contendo WNT4) restauraram o controle glicêmico após o transplante em camundongos diabéticos NOD-SCID induzidos por STZ e mantiveram a homeostase da glicose por mais de 6 semanas (FIG. 8D). Em combinação, esses resultados indicam que a sinalização não canônica de WNT é suficiente para induzir uma maturação metabólica de HILOs necessária para GSIS robusta, de uma maneira que imita a maturação pós-natal de ilhotas humanas.

Assim, a cultura de células-tronco (por exemplo, hiPSCs, PSCs ou células-tronco embrionárias (ES)) em meio contendo WNT (por exemplo, WNT4) gera ilhotas e organoides semelhantes a ilhotas (wHILOs) que são funcionalmente maduros e semelhantes a ilhotas e que expressam mais marcadores de células  maduros e produzem insulina.

[00301] Para entender as transformações moleculares que conduzem a maturação de HILOs, as alterações transcricionais induzidas pelo tratamento de WNT4 de HILOs foram avaliadas. A expressão dos genes 1581 e 1354 foi aumentada e diminuída, respectivamente, pelo tratamento com

WNT4 (100 ng/ml para os dias 26 a 33). A análise da ontologia genética identificou as vias metabólicas, mais notavelmente a fosforilação oxidativa, enriquecida neste conjunto de genes, FIG. 3E. Os genes associados ao ribossomo incluem a tradução mitocondrial e grupos de genes de alongamento, conforme determinado pela análise GOTERM_BP por DAVID, FIG. 8C). Consistente com um efeito sobre o metabolismo celular, o tratamento com WNT4 aumentou de forma abrangente a expressão dos genes OxPhos em HILOs para níveis semelhantes aos observados em ilhotas humanas e aumentou o número mitocondrial (FIG. 3G e FIG. 8A).

[00302] Para examinar os efeitos específicos na população de células semelhantes a , as células que expressam insulina foram classificadas com base na expressão de GFP de HILOs com e sem tratamento com WNT4 ou WNT5a. A proporção de células que expressam insulina não foi afetada pelo tratamento com WNT, de acordo com a expressão do marcador de linhagem celular  invariante durante a maturação de HILO (FIG. 8B). No entanto, o tratamento com WNT4 e WNT5a aumentou o conteúdo mitocondrial das células que expressam a insulina, apoiando a noção de uma maturação metabólica das células  (FIG.

8B). Para identificar os efetores genéticos desta etapa de maturação, as alterações induzidas por WNT4 na acessibilidade à cromatina foram mapeadas nas células GFP+ classificadas por ATAC-Seq. Alterações generalizadas na acessibilidade da cromatina foram observadas com o tratamento com WNT4, de acordo com a extensão das alterações transcricionais. Uma sobreposição das regiões com acessibilidade aumentada à cromatina com os genes HILO induzidos pelo tratamento com WNT4 identificou 123 genes (FIG. 8E). A ontologia genética identificou vias metabólicas, incluindo fosforilação oxidativa, enriquecida neste conjunto de genes. Além disso, a análise do motivo em genes onde o aumento da acessibilidade à cromatina correspondeu ao aumento da expressão gênica identificou fatores de maturação de células , incluindo Foxa2 e ERRs (FIG. 8F). Consistente com isto, aumentos induzidos por WNT4 na acessibilidade à cromatina foram observados em genes de fosforilação oxidativa incluindo genes alvo ERR NDUFA4, NDUFA7 e ATP5E (FIG. 7F). Apoiando ainda mais o papel essencial da sinalização ERR, WNT4 (100 ng/ml por 5 dias) induziu a expressão de genes metabólicos mitocondriais e melhorou a função GSIS em ilhotas neonatais isoladas de WT, mas não de camundongos knockout específico para células  ERR (KO) (ratos ERRKO), (FIG. 8G e FIG.

8H). Sem desejar estar limitado pela teoria, esses resultados, tomados em conjunto, suportam o conceito de que a sinalização não canônica de WNT4 aumenta a função mitocondrial, em grande parte por meio da indução de ERR,

para conduzir a maturação metabólica de células semelhantes a .

Exemplo 6: Complexidade celular de HILOs maduros

[00303] As análises imunohistoquímica e de citometria de fluxo revelaram que aproximadamente 50 a 60% das células wHILO co-expressaram insulina e marcadores de células , bem como baixos níveis de células endócrinas adicionais (glucagon+, somatostatina+, polipeptídeo pancreático+ (PP+)) (FIGs. 9A a 9F). De acordo com as comparações transcricionais, a composição celular de HILOs não foi alterada pelo tratamento com WNT4 (FIG. 9F). Para caracterizar de forma abrangente a complexidade celular de HILOs metabolicamente maduros e obter informações sobre o programa de maturação in vitro, os transcriptomas de célula única de HILOs (tratados com PBS, n = 4078) e wHILOs (tratados com WNT4, n = 4840) foram comparados com aqueles de ilhotas humanas (n = 3245) (Tabela 1). Os transcriptomas celulares em cada análise foram agrupados por análise de componente principal de contagens de leitura com redução de dimensionalidade usando incorporação de vizinhança estocástica com distribuição t (t-SNE). O agrupamento de wHILOs revelou populações enriquecidas em marcadores de células , bem como em agrupamentos de progenitores pancreáticos Sox9+ HES1+ (FIGs. 9G a 9J). As análises de expressão gênica de assinatura distinguiram ainda células bipotentes ductal-endócrinas (+/-TOP2A), células endócrinas enriquecidas com hormônio positivo (GCG+, SST+), células semelhantes a ductais (KRT19+) e uma pequena população de células com função desconhecida (UK) (FIG. 9K e FIG. 9L). O co-agrupamento de conjuntos de dados HILO e wHILO forneceu evidência adicional para a presença de vários tipos de células endócrinas (com base nos genes altamente expressos em cada agrupamento) que eram amplamente independentes do tratamento com WNT4 (FIG. 9M). Para confirmar a presença de vários tipos de células endócrinas, foi realizada uma análise integrada dos conjuntos de dados de células individuais wHILO e ilhotas humanas (FIGs. 10A a 10C).

Embora as diferenças fossem evidentes, células wHILO foram encontradas agrupando-se com células endócrinas de ilhotas, incluindo células , ,  e , indicando semelhanças transcricionais (FIG. 10B). Notavelmente, uma classificação funcional com base no co-agrupamento com tipos de células de ilhotas revelou uma predominância de células semelhantes a  e  em wHILOs (FIG. 10B).

Tabela 1 Identificação da amostra HILO wHILO Ilhotas humanas Número estimado de células 4.078 4.840 3.245 Leituras de frações em 88,90% 89,20% 79,70% células Média de leituras por 16.482 13.496 22.195 célula Genes medianos por célula 1.582 1.455 1.486 Total de genes detectados 22.003 22.076 21.007 Contagens medianas de UMI 4.754 4.220 5.618

Identificação da amostra HILO wHILO Ilhotas humanas por célula Número de leituras 67.216.051 65.324.121 72.025.806 Códigos de Barras Válidos 98,50% 98,50% 98,60% Leituras mapeadas com 58,30% 58,10% 64,40% confiança para o transcriptoma Leituras mapeadas com 62,20% 62,00% 68,10% confiança para as regiões exônicas Leituras mapeadas com 24% 23,70% 19,00% confiança para as regiões intergênicas Leituras mapeadas com 4,70% 4,70% 4,20% confiança para as regiões intergênicas Leituras mapeadas com 4,10% 4,00% 4,40% confiança anti-sentido para o gene Saturação de Sequenciamento 32,30% 27,00% 38,60% Bases Q30 em código de 96,80% 96,80% 96,80% barras Bases Q30 em leitura de RNA 80,50% 79,40% 80,40% Bases Q30 em UMI 96,40% 96,40% 96,40% Modificação Genômica Repórter CRISPR-InsulinGFP nenhum Transcriptoma GRCh38 Química Célula única 3′ v2 Cell Ranger Versão 2.0.2 Exemplo 7: PD-L1 fornece proteção imunológica para HILOs

[00304] A utilidade clínica das ilhotas transplantadas é limitada por respostas alogênicas e autoimunes. Dada a capacidade das moléculas de ponto de verificação de suprimir as respostas imunes, a expressão endógena de proteínas de ponto de verificação imunológico em ilhotas humanas foi investigada. Um pequeno subconjunto de células  em ilhotas saudáveis mostrou uma assinatura de expressão de gene única que incluiu a expressão de PD-L1 (FIG. 12A), um determinante da tolerância imunológica em células . Para criar wHILOs que exibiram expressão de PD- L1 exógena para protegê-los após o transplante, clones de hiPSC que expressam PD-L1 foram gerados usando um sistema lentiviral e subsequentemente diferenciados em wHILOs metabolicamente maduros, conforme delineado na FIG. 3A. A superexpressão de PD-L1 nos HILOs não afetou a expressão de insulina (FIGs. 12B e 12C). WHILOs que expressam PD-L1 e aqueles que não expressam PD-L1 foram transplantados nas cápsulas de rim de camundongos diabéticos imunocompetentes (camundongos C57BL6J tratados com STZ), (FIG. 12D). wHILOs com e sem superexpressão de PD-L1 foram capazes de restaurar o controle glicêmico dentro de dias de transplante com eficácia semelhante (FIG. 4C). No entanto, a funcionalidade de wHILOs sem expressão de PD-L1 foi perdida progressivamente ao longo de um período de semanas, conforme monitorado pelos aumentos nos níveis de glicose no sangue. Em contraste, os PD-L1 + wHILOs foram capazes de manter a homeostase da glicose por > 50 dias na ausência de drogas imunossupressoras (FIG. 4C).

[00305] Para confirmar as ações imunossupressoras de PD-L1, wHILOs transplantados foram recuperados de camundongos receptores 27 dias após o transplante e as composições celulares foram comparadas por citometria de fluxo. A infiltração de células imunes CD45+, incluindo células T e NKT, foi acentuadamente diminuída em enxertos que receberam wHILOs que expressaram PD-L1 (FIGs. 4D a 4G).

Além disso, números insignificantes de células que expressam insulina foram encontrados em enxertos que receberam wHILOs sem expressão de PD-L1, de acordo com os níveis de glicose no sangue amplamente desregulados observados 27 dias após o transplante (FIG. 4D, FIG. 4F e FIG. 4H).

[00306] A persistência de wHILO (PD-L1) como xenoenxertos levou a uma avaliação de sua funcionalidade em um modelo que incorpora um repertório de células T humanas reconstituídas. Depois de confirmar a presença de células T humanas, camundongos HuPBMS-NSG-SGM3 foram tornados diabéticos por tratamento de STZ de dose múltipla (50 mg/kg/dia por 5 dias, MLD-STZ) e foram posteriormente transplantados com wHILO (FIG. 4I e FIG. 4J). WHILOs transplantados (PD-L1) forneceram controle sustentado da glicose no sangue em comparação com aqueles sem expressão de PD-L1, com níveis de peptídeo c humano correlacionados com a extensão do controle glicêmico (FIG. 4K e FIG. 4L). O rápido desenvolvimento de hiperglicemia após a remoção cirúrgica dos rins transplantados implicou a insulina derivada do enxerto como o efetor primário (FIG. 4K). A análise subsequente dos enxertos recuperados revelou uma redução marcada no número de células que expressam insulina em wHILOs e um aumento correspondente em linfócitos humanos

(FIG. 4E e FIG. 4M).

Exemplo 8: A memória epigenética conduz wHILOs tolerantes a imunidade

[00307] A expressão de PD-L1 é induzida por estimulação de IFN em múltiplos cânceres; no entanto, a exposição prolongada a citocinas, incluindo IFN, mostrou induzir a morte de células  e/ou desdiferenciação. Neste exemplo, os experimentos foram realizados para avaliar se a via do IFN era capaz de minimizar as respostas imunes do hospedeiro contra wHILOs transplantados. Após a exposição de wHILOs à estimulação de IFN, verificou-se que IFN induziu rápida e fortemente a expressão de PD-L1 em wHILOs (FIGs. 12E e 12F). Em particular, um aumento de aproximadamente 20 vezes na expressão de PD-L1 foi observado 12 horas após o tratamento com IFN (FIG. 12F).

Notavelmente, IFN induziu a expressão de PD-L1 em wHILOs a níveis semelhantes em células que expressam e não expressam insulina (células GFP+ e GFP-, respectivamente), (FIG. 5A).

Estudos subsequentes de escalonamento de dose em wHILOs identificaram indução máxima de PD-L1 após 2 horas de exposição a IFN de 10 ng/ml (FIG. 12E). No entanto, a indução foi transitória, com a expressão de PD-L1 diminuindo rapidamente nos dias após a exposição a IFN (FIG. 5B). Como a tolerância a estímulos inflamatórios,

como lipopolissacarídeo, foi associada a alterações epigenéticas, foram realizados experimentos para investigar se a estimulação sequencial de IFN induziu efeitos de longo prazo ou sustentados em wHILOs, especificamente, uma indução sustentada de PD-L1 nos HILOs. Na verdade, foi constatado que exposições curtas repetidas (exposição intermitente) ao IFN (estimulação de pulso múltiplo, "MPS") levaram à expressão sustentada de PD-L1 e aumentos concomitantes nos níveis de proteína PD-L1 (FIGs. 5C, 5D e 5E). É importante ressaltar que a funcionalidade GSIS não foi comprometida pela exposição dos wHILOs ao IFN MPS (FIG. 5F). Além disso, os wHILOs tratados com IFN MPS foram protegidos contra a desdiferenciação de células  induzida por IL-1, conforme revelado pela expressão dos marcadores de identidade de células  INS e UCN3 (FIG. 5G e FIG. 5H).

[00308] O ATAC-Seq foi usado em estudos para fornecer uma visão mecanicista das mudanças induzidas pelo IFN em wHILOs. Conforme medido por ATAC-Seq, as alterações transcricionais em todo o genoma induzidas por tratamentos agudos (12h de exposição) e MPS foram associadas a alterações na acessibilidade à cromatina. Conjuntos de genes amplamente sobrepostos foram induzidos pelos tratamentos com IFN que incluíram PD-L1, enquanto aproximadamente metade dos genes regulados negativamente foram comumente afetados (FIG. 14A e FIG. 14B). A ontologia gênica do conjunto de genes comumente regulados positivamente identificou as vias de IFN (não mostradas).

Em contraste, as vias que refletem o estado de inflamação celular, incluindo a regulação negativa da produção de IL- 1 e as vias inflamatórias, foram identificadas apenas no conjunto de genes regulados positivamente para MPS, enquanto a regulação positiva da sinalização de NFkB e apoptose foram encontradas seletivamente no conjunto de genes regulados para baixo de MPS (FIG. 14C). As mudanças de sobreposição na acessibilidade à cromatina revelaram aumentos persistentes nos loci gênicos, incluindo PD-L1, IRF9, JUNB e JUND após o tratamento com IFN MPS, de acordo com os aumentos sustentados nos níveis de transcrição gênica. Em contraste, embora o aumento da acessibilidade tenha sido visto em genes responsivos a IFN conhecidos, incluindo IRF1 e STAT1, após o tratamento agudo, esses aumentos não foram sustentados (FIG. 14D).

[00309] Para confirmar que o tratamento com IFN gerou wHILOs imunoevasivos (wHILOie), foi avaliada a capacidade de wHILOie de fornecer regulação de glicose de longo prazo em camundongos imunocompetentes. O transplante de wHILOie em camundongos C56BL6J diabéticos induzidos por STZ baixou os níveis de glicose no sangue nos camundongos em poucos dias e manteve os níveis reduzidos por > 40 dias (FIG. 5I, FIG. 5J). Em contraste, a eficácia de wHILOs virgens transplantados (sem exposição a IFN) diminuiu progressivamente, o que foi consistente com os níveis reduzidos de peptídeo c humano observados no soro de camundongos receptores (FIG. 5K). Resultados semelhantes foram encontrados com transplante em camundongos diabéticos humanizados. Notavelmente, os níveis de glicose reduzidos alcançados com o transplante wHILO (tratado com MPS) foram perdidos após a remoção cirúrgica do rim receptor (FIGs.

15A e 15B). Como suporte para o papel imunossupressor de PD-L1 induzido por IFN nos wHILOs transplantados, a infiltração de linfócitos reduzida, bem como uma diminuição no número relativo de células T auxiliares ativadas (CD4+, CD3+), foram observadas nos enxertos recuperados. Além disso, o número de células que expressam insulina foi acentuadamente aumentado em enxertos wHILO (tratados com MPS) (FIG. 15C).

[00310] Sem a intenção de se limitar à teoria, os resultados descritos neste documento sugerem que a estimulação anterior de IFN, ou seja, a exposição de células, como wHILOs, ao protocolo IFN MPS, induz uma memória epigenética que leva à tolerância a citocinas e expressão de PD-L1 de novo sustentado em wHILOs. Tais wHILOs estimulados por IFN (wHILOie) oferecem utilidade como uma terapia para aliviar doenças, tais como doenças pancreáticas ou diabetes dependente de insulina, por exemplo, diabetes tipo 1 ou tipo 2.

[00311] As constatações, com base nos experimentos descritos acima, que wHILOs mantiveram a funcionalidade em NOD-SCID, mas não em camundongos C57BL6J, implica células T e células B em sua rejeição alogênica. Durante a apresentação do antígeno, as interações entre o antígeno do T-linfócito citotóxico 4 (CTLA-4) e as moléculas B7, bem como a proteína de morte celular programada 1 (PD1) e seu ligante PD-L1, regulam negativamente as respostas imunes de maneira não redundante. Os resultados dos experimentos demonstram que wHILOs que expressam PD-L1, tal como por indução ou superexpressão como descrito neste documento, estão protegidos da rejeição alogênica. Além disso, como descrito acima, é fornecido um protocolo no qual a exposição repetida a concentrações limitadas de IFN leva à expressão de PD-L1 endógena sustentada sem comprometer a atividade de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS). De nota e inesperadamente, os HILOs imunoevasivos resultantes descritos neste documento foram capazes de manter a homeostase da glicose em camundongos diabéticos tipo 1 imunocompetentes por ~50 dias na ausência de um dispositivo de transplante. As células imunes evasivas (como em HILOs) que resultam da exposição a IFN de acordo com o método descrito neste documento não só exibem maturidade metabólica e funcional, mas superam a rejeição autoimune de células transplantadas, o que fornece uma solução para um problema geral que existe para outros terapêuticas baseadas em células-tronco.

Exemplo 9: Métodos usados nos exemplos descritos acima Manutenção de linhagens de camundongo

[00312] Os animais foram mantidos em instalações específicas para animais livres de patógenos em um ciclo claro-escuro de 12 horas a uma temperatura ambiente de 23 °C. Água e comida foram fornecidas ad libitum. Os experimentos com animais usaram C57BL6J machos de mesma idade e origem (estoque No. 000664), camundongos NOD-SCID (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, estoque No. 005557), camundongos knockout ERR específicos para células  (Yoshihara, E. et al., 2016, Cell metabolism 23, 622 a 634, doi: 10.1016/j.cmet.2016.03.005), camundongos hu-PBMC-SGM3, denominados 'camundongos humanizados'. Camundongos NSG™ fêmeas foram injetados com células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) na cepa NSG-SGM3 (Jackson 013062). Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo IACUC e Departamento de Recursos Animais do Instituto Salk de Estudos Biológicos.

Geração de repórter de insulina humana e linhagens de iPSC humanas que superexpressam PD-L1

[00313] Para marcar a especificação das células , células-tronco de pluripotência induzidas por humanos (hiPSCs) derivadas de HUVECs foram infectadas com um repórter GFP de insulina humana, conforme descrito por E.

Yoshihara et al. (2016, Cell metabolism, 23: 622 a 634).

Para visualizar a atividade do promotor de insulina endógena, a edição do genoma CRISPR/Cas9 foi usada para adicionar (knockin) GFP no promotor de insulina (Tabelas 1 e 2).

Tabela 2 ID do banco Genes Espécies Iniciadores (avanço) Iniciadores (Reverso) NCBI ou Iniciador (PB) NM_206594.2 ESRRG (ERRγ) hu* gctaacactgtcgcagtttga cgaacagctggaatcaatgtg 316659406c1 (PB) NDUFA7 hu tgcagctacgctaccagga ggaggctgagttcgcttgg 103472000b1 (PB) COX7A2 hu ctcggaggtagttccggttc tctgcccaatctgacgaagag 316659406c1 (PB) NDUFA1 hu atgctccgccagatcatcg tgccagacgcaagagatacag NM_002509.4 NKX2-2 hu ggccttcagtactccctgca gggacttggagcttgagtcct 115387113c1 (PB) ISL1 hu gcggagtgtaatcagtatttgga gcatttgatcccgtacaacct NM_005461.4 MAFB hu gcctgcgctaattgtaggag cgcacttgaaagttgcaaaa NM_020783.3 STY4 hu ttcaggacggggtgagttac tttggcatggtacaggttca NM_000162.3 GlucoKinase hu gctggaatcaatttcccaga ctccccacacaggatgagtt NM_000207.2 INSULIN hu agcctttgtgaaccaacacc gctggtagagggagcagatg NM_002054.4 GLUCAGON hu aggcagacccactcagtga aacaatggcgacctcttctg NM_001048.3 SOMATOSTATIN hu gtacttcttggcagagctgctg cagaagaaattcttgcagccag NM_000209.3 PDX-1 hu ggatgaagtctaccaaagctcacgc ccagatcttgatgtgtctctcggtc NM_201589 MAFA hu cttcagcaaggaggaggtcatc ctcgtatttctccttgtacaggtcc NM_006168.2 NKX6-1 hu attcgttggggatgacagag tcaacagctgcgtgattttc NM_053049.3 UCN3 hu gatgggcttggctttgtaga ggagggaagtccactctgc NM_002500.4 NEUROD1 hu gttctcaggacgaggagcac cttgggcttttgatcgtcat NM_014143.3 CD274 (PD-L1) hu tatggtggtgccgactacaa tgcttgtccagatgacttcg NM_001002.3 U36B4 (RPLP0) hu/mo gtgctgatgggcaagaac aggtcctccttggtgaac NM_021893.3 CD274 (PD-L1) mo tgctgcataatcagctacgg gctggtcacattgagaagca NM_001243792.1 Esrrg (ERRγ) mo gcaaggcattcttcaagagg ggctgggcagctgtactcta NM_009943.2 COX6a2 mo ctctcgactgggtgaaggag gaagagccagcacaaaggtc NM_008618.3 MDH1 mo gaagccctgaaagacgacag tcgacacgaactctccctct NM_153064.4 NDUFS2 mo gatccgagtgctctttggag atgtcatccagaagcccaag Espécie *: hu: humano; mo: camundongo Tabela 3 Nome da Sequência Vetor sequência Insulina GTGGTTGACGCTGTCCGTCA Vetor pCas-

Nome da Sequência Vetor sequência humana guia 1 Guide-EF1a- GFP (Origene 100018) Insulina CTGTTCGTCCTTCATCAAGA Vetor pCas- humana guia 2 Guide-EF1a- GFP (Origene 100018) Braço ATAAGACACAGTTATGCTTATGGAAGCGTGCTGACAAACA Luc-LoxP- esquerdo GTAATTACAGAGCTGAGGATCATCTGTTCAGTCTTGAAAAT PGK-Puro- AAAAGTTTTATTCTGCTCATAATAAAATGATTGCAGCATCAG LoxP

AATGAGGAAGGAAAGGTAGAATGAGGATAAATACAATTTT AGAAATGGTATAGACTTTGCAAATCACCACCTCTTCCATTGA TAAATTTAGAATCTAGAGTTGAGTTAGATATTGACACTGGTT CTCCAAGAGAAAGGTAAAATAAAAGCAATCGGACTCTTTAG AGCTTTTGTTTATGGCCTGTCTGGGCCCTTTGTTGTAACCCTG TCATGCCCTTATGCTGATTACCTTCTTGTAGAACAAGAAGTAT TGACTAGAGAATGAATGATGTGTAGTCCCTAGCCCTTAGGAA ACTCTCTCAAAGAGCAATGTCTTTAACATATGAATTCTGTTTTT TTCCTCCTTTTACCTTTCCCTTTCCCTTTCTCTATTTTTCACCATC TCTTTTGTTTCTACCTCTTTTGGTCTCTGTGCTTGACACTCTCTC CTCTTTCTGTCTCTCTTTGTATCTCCTCAATCTCAGGCTTCTCTG

CAGA Braço direito CTGGTGGCTCTTCAGACGCCAGTGGGAGCTA

CAGTTCAACCATGAATGGCCATCAGAACGGA CTTGACTCGCCACCTCTCTACCCTTCTGCTCCT ATCCTGGGAGGTAGTGGGCCTGTCAGGAAAC TGTATGATGACTGCTCCAGCACCATTGTTGAA GATCCCCAGACCAAGTGTGAATACATGCTCAA CTCGATGCCCAAGAGACTGTGTTTAGTGTGTG GTGACATCGCTTCTGGGTACCACTATGGGGTA GCATCATGTGAAGCCTGCAAGGCATTCTTCAA GAGGACAATTCAAGGTTAGTGTCGGACCTGG GAATACTCTCCCCACTTCCAACCTCACATGATG GGTTTTTGTTTTTCCTTATTCTTATTCTCATAAGT CAAGTATCATAGTTTTAATTCTCTCTTGAGTAGA AAATGGAAATAGATTACAATTGATAGTGGAAGA TTTATAGAATAAAATCCCCCCAGATATACTCCAT ATCTATTAATTTTCCTCTTACTGTTAAGCTTTAAT GGTGCAAGGATAATAAACTTTGGGTAGAGTT TACAAGAGCATAGTTATTATTAGAGCAATGTG GGTCTATATAGCAACT

[00314] PD-L1 que expressam hiPSCs foram gerados infectando hiPSCs com um lentivírus (abm, LV113090) que codifica CD274 humano (PD-L1) com seleção de puromicina (Tabela 4). A sequência promotora proximal UCN3 humana (-1298/+103) foi introduzida por clonagem In-Fusion (Clonetech) na estrutura pLV-Cherry-Picker1 sem promotor (Clontech, 632574) usando os locais de enzima de restrição

ApaI/NotI. As sequências de iniciador para amplificação por PCR da sequência do promotor do DNA genômico foram 5’- GTCCATGCTGATCCATCCTT-3’ (avanço) e 5’-TGCTTCTCCGGTATTGTTCC- 3’ (reverso). Uma linha de repórter dupla para mcherry UCN3 humano e insulina GFP humana (hINS-GFP-EF1-Neo), Yoshihara et al., Ibid., foi gerada em hiPSC.

Tabela 4 Informação de Plasmídeo Sistema Nome Espécie Caráter Iniciador Fw/Rv (Doador)/No. de Sequência do catálogo Lentivírus Vetor de Humano Superexpressão lentivírus CD274 (PD- L1)/(abm LV113090) Lentivírus Repórter Humano Repórter 5’- UCN3-Cherry mCherry GTCCATGCTGATCCAT CCTT-3’ (avanço) 5’-

TGCTTCTCCGGTATTG TTCC-3’ (reverso) Produção de vírus

[00315] Os lentivírus foram produzidos usando sistemas lentivirais de segunda ou terceira geração na linhagem celular HEK293T usando métodos como descritos neste documento (por exemplo, métodos do exemplo 10) e como conhecidos e praticados por aqueles versados na técnica.

Meio de cultura de goma gelan 3D (3DKG)

[00316] Soluções aquosas de goma gelana de baixo acila (Kelcogel F GG-LA), (Modernist pantry), 0,3% p/v, foram esterilizadas em autoclave antes da diluição em mTeSR1 ou meio Custom TeSR (StemCell Technologies, concentração final 0,015%) e da adição de metilcelulose (R&D Systems, concentração final 0,3%) e penicilina/ estreptozocina.

[00317] Mais especificamente, a título de exemplo, Kelcogel F de baixo acila GG GG-LA (Modernist pantry) foi suspenso em água pura 0,3% (p/v) e dissolvido por agitação a 90 °C ou por micro-ondas. A solução aquosa foi esterilizada a 121 °C durante 20 minutos em autoclave. A solução foi adicionada a TeSR ou Custam TeSR a uma concentração final de 0,015%. A solução estoque de metilcelulose (MC) foi adicionada a uma concentração final de 0,3% (R&D Systems) (por exemplo, 0,3% de estoque Kelcogel; Kelcogel F baixo acila GG GG-LA 300 mg + água MilliQ 100 ml: 3DKG meio base Stem TeSR; Stem TeSR 95 ml + 0,3% de Kelcogel 5 ml + MC solução estoque 300 L. Uma concentração final de 1% de Penicilina/estreptozocina foi adicionada a 3DKG Stem TeSR.

Esferoides multicelulares humanos (MCSs)

[00318] As células endócrinas pancreáticas (PE) foram preparadas a partir de iPSC humana conforme descrito na publicação de Yoshihara, E. et al. (2016, Cell Metabolism, 23 (4): 622 a 634). Em resumo, hiPSC derivado de HUVEC, obtido da Salk Stem Cell Core Facility, foram mantidos em placas revestidas com matrigel (BD) em meio

Stem TeSR completo a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2. Antes da diferenciação pancreática, hiPSC foram infectados com um lentivírus repórter de insulina humana (insulina humana repórter pGreenZero lenti, System Biosciences) por Spinfection (800 g, 1 hora) e, em seguida, o meio celular foi alterado para 100 ng/ml de Activina humana (R&D Systema), 3 M de CHIR99021 (Selleckchem) em meio de diferenciação (800 ml de DMEM/F12, 13,28g de BSA, 10 ml de Glutamax, 560 mg de NaHCO3, 330 mg de tiamina, 100 mg de glutationa reduzida, 3300 mg de Vitamina C, 14 g de selênio, 10 ml de NEAA, 2 ml de Traço de Elemento B, 1 ml Elemento C, 7 l de -ME, 2 ml de DLC, 2 ml de GABA, 2 ml de LiCl, 129,7 g de PA, 2 mg de insulina, feita até 1000 ml) por 2 dias, e então as células foram mantidas em 100 ng/ml de activina humana em meio de diferenciação por mais 2 dias (estágio 1, endoderme pancreático).

Posteriormente, este meio foi substituído por meio de diferenciação contendo 1 M de dorsomorfina (Calbiochem), 2 M de ácido retinóico (Sigma), 10 M de SB431542 e 1% de suplemento B27 por 7 dias (estágio 2). O meio foi então substituído por meio de diferenciação contendo 10 M de forscolina (Sigma), 10 M de dexametasona (Stemgent), 10 M de inibidor de TGF RI quinase II/inibidor de Alk5 II (Calbiochem ou Enzo), 10 M de nicotinamida (Sigma), 1 M de Sal de sódio de 3,3',5-tri-iodo-L-tironina (T3) e suplemento de 1% de B27 por 4 a 5 dias (dia 15 a dia 19, desenvolvimento de progenitores endócrinos pancreáticos). O meio foi substituído todos os dias (estágio 1) e, em seguida, a cada dois dias (estágio 2 e estágio 3).

[00319] Células HUVEC primárias e células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hADSC) (Invitrogen ou PromoCell) foram cultivadas em placas de 15 cm com meio EBM (Lonza, cc-3121) ou meio MesenProRS (GIBCO, 12747-010 ou kit de meio de crescimento Preadipocyte, C-27417), respectivamente, a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2 umidificada. Para experimentos de co-cultura, progenitores endócrinos pancreáticos derivados de iPSC humano foram tratados com Accutase, enquanto HUVECs e hADSC foram tratados com TrypLE (GIBCO, 12604-013). As células foram coletadas em tubos de 50 ml. hiPSC-EP (1 x 106 células), HUVECs (7 x 106 células) e hADSCs (1 a 2 x 105 células) foram co-cultivadas em um único poço de uma placa de 24 poços com 300 l de matrigel.

[00320] Para a geração de MCS, hiPSC-EP (dia 15 a dia 21, 1 x 106 células), HUVECs (7 x 106 células) e hADSCs (1 a 2 x 105 células) foram co-cultivadas em 3D Kelco Gel Custom TeSR com 10 M de forscolina (Sigma), 10 M de dexametasona (agente de origem), 10 M de inibidor de TGF RI quinase II/Alk5 inibidor II (Calbiochem ou Enzo), 10 M de nicotinamida (Sigma), 1 M de sal de sódio de 3,3',5- tri-iodo-L-tironina (T3) e 1% de suplemento B27, R428 (2 M), Sulfato de zinco (10 M) e N-Cys (1 mM). O meio foi trocado a cada dois dias, e aglomerados semelhantes a ilhotas se formaram em poucos dias (FIGs. 6A a 6F).

Culturas organoides semelhantes a ilhotas pancreáticas humanas (HILO)

[00321] hiPSCs foram cultivadas em placas revestidas com matrigel. As suspensões de células individuais foram preparadas usando Accutase, lavadas em PBS e coletadas por centrifugação (1000 a 1300 rpm por 5 minutos). As células foram ressuspensas com meio de base 3D Kelco Gel Stem TeSR™ na presença do inibidor ROCK (10 M Y-27632, StemCell) durante 5 a 7 dias até que os esferoides atingissem 50 a 100 m de diâmetro. O meio foi então substituído por 0,015% de gel Kelco contendo 0,3% de metilcelulose e suplementado com 100 ng/ml de activina A humana (R&D Systems), 3 M de CHIR99021 (Axon ou Selleckchem) em meio de diferenciação (S1) por 1 dia, e então 100 ng/ml de ativina humana em meio de diferenciação (S1) por mais 2 dias (estágio 1, endoderme definitiva).

Posteriormente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S2) com 50 ng/ml de FGF7 (R&D Systems) por 2 dias, meio de diferenciação (S3) com 50 ng/ml de FGF7, 0,25 M de SANT-1 (Sigma), 1 M de ácido retinóico (Sigma), 100 nM de LDN193189, 10 M de inibidor II de Alk5 e 200 nM do modulador da proteína precursora -amiloide TPB por 3 dias, então 50 ng/ml de FGF7, 0,25 M de SANT-1 (Sigma), 1 M de ácido retinóico (Sigma), 100 nM de LDN193189, 10 M de inibidor II de Alk5 e 100 nM do modulador da proteína precursora -amilóide TPB por 2 dias.

Subsequentemente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S4) com 0,25 M de SANT-1, 50 nM de ácido retinóico, 100 nM de LDN193189, 10 M de inibidor Alk5 II, 1 M de T3 durante 3 dias.

Subsequentemente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S5) com 100 nM de LDN193189, 100 nM de inibidor XX da -secretase (GSiXX, Millipore), 10 M de inibidor II de Alk5, 1 M de T3 durante 7 dias.

Posteriormente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S5) com 10 M de Trolox (Calbiochem), 2 M de R428 (Selleckchem), 1 mM de N-acetil cisteína, 10 M de inibidor Alk5 II, 1 M de T3 por mais 7 a 20 dias. Após a confirmação da expressão de insulina por qPCR ou atividade repórter (normalmente dias 20 a 30), o meio foi alterado para meio de diferenciação (S5) com 10 M de Trolox (Calbiochem), 2 M de R428

(Selleckchem), 1 mM de N-acetil cisteína, 10 M de inibidor de Alk5 II, 1 M de T3 e 100 ng/ml de rhWnt4 (R&D Sistemas) com ou sem a adição de lamininas (LM- 511/521 e LM-411/421) por 5 a 10 dias.

Meio condicional WNT5A

[00322] Fibroblastos produtores de WNT5A (ATCC CRL- 2814) e fibroblastos de controle (ATCC CRL-2648) foram cultivados em DMEM contendo 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina (meio completo). Ao atingir a confluência, as células foram lavadas com PBS antes da incubação em meio completo por uma semana. O meio condicionado foi subsequentemente coletado, filtrado através de um filtro estéril de 0,2 m e congelado a -80 ºC em alíquotas de 50 ml. O meio condicionado foi misturado com meio de diferenciação (S5 com 10 M de Trolox, 2 M de R428, 1 mM de N-acetil cisteína, 10 M de inibidor Alk5 II, 1 M de T3) a uma razão de 1:1 e, em seguida, foi usado para tratar HILOs por 5 a 10 dias.

Indução de PD-L1 em ilhotas humanas e wHILOs

[00323] A expressão de PD-L1 foi induzida por IFN humano recombinante (R&D Sistemas, 285-IF, tratamento de 2 a 12 horas a concentração final de 1 a 50 ng/mL). Para o tratamento agudo, wHILOs foram tratados com 10 ng/ml de IFNg no meio de diferenciação (S5 com 10 M de Trolox,

2 M de R428, 1 mM de N-acetil cisteína, 10 M de inibidor de Alk5 II, 1 M de T3 e 100 ng/ml de rhWnt4 (Wnt4 humano recombinante)) por 2 horas. As células foram então lavadas duas vezes com PBS antes da cultura em meio de diferenciação (S5 com 10 M de Trolox, 2 M de R428, 1 mM de N-acetil cisteína, 10 M de inibidor Alk5 II, 1 M de T3 e 100 ng/ml de rhWnt4) (estimulação de pulso único). A exposição ao IFN foi repetida 3 vezes com lavagem e 24 horas de repouso em meio de diferenciação (S5 com 10 M de Trolox, 2 M de R428, 1 mM de N-acetil cisteína, 10 M de inibidor de Alk5 II, 1 M de T3 e 100ng/ml de rhWnt4) entre cada exposição de IFN (estimulação MPS) para gerar wHILOie.

Após o pulso final de IFN, as células foram cultivadas na incubadora de cultura de tecidos por uma semana antes das análises de RNA-seq (FIGs. 14A a 14C), análises de ATAC-seq (FIG. 14D) e transplante em camundongos C57BL6J diabéticos induzidos por STZ (FIG. 5J) ou camundongos humanizados (FIG. 15B).

Isolamento de ilhotas pancreáticas

[00324] Ilhotas pancreáticas de camundongo foram isoladas conforme descrito anteriormente por E. Yoshihara et al., 2010, Nature Communications, 1: 127, com ligeiras modificações. Resumidamente, 0,5 mg/ml de colagenase P (Roche REF11213873001, diluído em tampão HBSS, GIBCO,

14170-112) foi injetado através do duto biliar comum e o pâncreas perfundido foi dissecado e incubado a 37 °C por 21 minutos. As células exócrinas digeridas e as ilhotas intactas foram separadas por centrifugação em Histopaque- 1077 (Sigma, H8889) a 900xg por 15 minutos, e as ilhotas intactas foram selecionadas manualmente. Ilhotas humanas foram fornecidas pelo Programa de Distribuição de Ilhotas Integradas sob um protocolo aprovado.

Ensaios de secreção de insulina/peptídeo c

[00325] A liberação de insulina de ilhotas intactas foi monitorada usando métodos de incubação em batelada, conforme relatado por E. Yoshihara et al., 2016, Cell metabolism, 23: 622 a 634. Resumidamente, ilhotas pancreáticas isoladas cultivadas durante a noite (meio RPMI-1640 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino e 1% (v/v) de antibiótico-antimicótico (Gibco)) foram pré- cultivadas a 37 °C por 30 minutos em tampão de bicarbonato Krebs-Ringer (KRBB) contendo 129,4 mM de NaCl, 3,7 mM de KCl, 2,7 mM de CaCl2, 1,3 mM de KH2PO4, 1,3 mM de MgSO4, 24,8 mM de NaHCO3 (equilibrado com 5% de CO2, 95% de O2, pH 7,4), 10 mM de HEPES e 0,2% (v/v) de BSA (fração V, Sigma) (KRBH) com 3 mM de glicose). As ilhotas pancreáticas foram incubadas em tampão de bicarbonato HEPES (KRBH) Krebs- Ringer (500 l/10 ilhotas) com 3 mM ou 20 mM de glicose por 30 minutos para determinar os níveis de secreção de insulina. Após 30 minutos, as ilhotas foram sedimentadas por centrifugação e os níveis de insulina secretada foram determinados no meio por Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), (KIT ELISA de rato/camundongo insulina (Millipore) e KIT ELISA de Insulina Humana ou KIT ELISA de peptídeo c humano ultrassensível (Millipore) para ilhotas de camundongos e humanos, respectivamente). Para células humanas derivadas de iPSC, as células (1 x 106 células/poço em placas de cultura de 24 poços) foram pré-cultivadas em tampão KRBH de 3 mM de glicose (500 l/poço). As células foram então incubadas em KRBB (200 l/poço) com 3 mM ou 20 mM de glicose durante 30 minutos para determinar os níveis de secreção do peptídeo c como um indicador dos níveis de secreção de insulina. Após 30 minutos, as células foram sedimentadas por centrifugação e os níveis de peptídeo c foram determinados no meio sobrenadante utilizando o KIT ELISA de peptídeo c humano (Millipore).

(por exemplo, FIGs. 7D-1 e 7D-2).

Consumo de oxigênio e taxas de acidificação extracelular

[00326] A taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) (por exemplo, de ilhotas) foram registradas em placas de 24 poços usando um Seahorse XF24 (Seahorse Biosciences) (FIG. 7C).

Resumidamente, ilhotas humanas de tamanho igual a 70, esferoides hiPSC ou HILOs foram pré-cultivados em meio XF

DMEM de 3 mM de glicose (pH 7,4) suplementado para conter 1 mM de piruvato de sódio (meio de base) por 1 hora antes da transferência para placas de cultura de ilhotas XF24 no meio de base. OCRs (relatados como alteração percentual em comparação com 3 mM de glicose) foram registrados durante a adição incremental de glicose, até uma concentração final de 20 mM de glicose. Posteriormente, reagentes de estresse mitocondrial (oligomicina, Fccp, rotenona e antimicina A), foram adicionados conforme as instruções do Kit Mitostress (Seahorse Biosciences).

Estudos de transplante de ilhotas e HILO

[00327] Camundongos imunodeficientes NOD-SCID, C57BL6J e Hu-PBMC-SGM3 foram adquiridos do Jackson Laboratory e mantidos em gaiolas autoclavadas em uma instalação SPF no Salk Institute. Os camundongos tornaram- se diabéticos por uma única injeção de alta dose (180 mg/kg) ou 5 vezes com uma injeção de múltiplas doses baixas (MLD, 50 mg/kg) de estreptozotocina (STZ; i.p., Sigma S0130–500MG). Uma semana após a injeção de STZ, camundongos com níveis de glicose no sangue superiores a 300 mg/dl foram usados como receptores de transplante.

Ilhotas humanas e de camundongo (200 a 500 ilhotas ou 500 a

1.000 IEQ para ilhotas de camundongo, 500 a 1.000 ilhotas ou 1.000 a 2.000 IEQ para ilhotas humanas por animal) ou HILOs (500 grupos) foram ressuspensos em 200 l de meio

RPMI-1640, carregados em tubos de laboratório (SiLastic, 508-004) e centrifugados (400 xg por 1 a 2 minutos) para gerar aglomerados de células no centro do tubo. Os agrupamentos de células foram transplantados (aproximadamente 30 a 50 l) sob as cápsulas de rim em camundongos diabéticos injetados com STZ de 8 a 16 semanas de idade. Cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) foram usados como anestésicos cirúrgicos, e os camundongos foram colocados em almofadas de aquecimento a 37 °C para se recuperarem. Os níveis de glicose no sangue foram monitorados usando um monitor de glicose no sangue/cetona disponível comercialmente (Nova Max Plus). Nefrectomia (Nx) para experimentos de remoção de enxerto foram realizadas para confirmar a eficácia para a regulação da glicose nos wHILOs transplantados. O rim com enxerto foi ligado no hilo renal usando seda 4-0 (LOOK, SP116) e, em seguida, foi ressecado. Os enxertos removidos foram processados para análises de perfil imunológico.

ATAC-seq

[00328] ATAC-seq foi realizada em 5 x 104 células GFP-positivas (GFP+) isoladas usando Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) de HILOs tratados com PBS ou com 100 ng/ml rhWnt4 do dia 27 ao dia 34, conforme descrito em JD Buenrostro et al., 2015, Current Protocols in Molecular Biology, 109: 21 a 29. As leituras foram alinhadas por

Bowtie a hg19 e os picos foram chamados por HOMER usando as configurações padrão. Picos diferenciais e análises de motivos de 2 duplicatas biológicas foram identificados usando HOMER essencialmente como instruído (ver, por exemplo, S. Heinz et al., 2010, J. Mol. Cell, 38: 576 a 589). Métodos detalhados para o HOMER estão disponíveis gratuitamente, por exemplo, em http://homer.salk.edu/homer/. Resumidamente, o programa pesquisa contra as sequências alvo e de origem para enriquecimento de motivos conhecidos e retorna motivos enriquecidos com um limite de mudança de 1,5 vezes e um valor p inferior a 0,05. As regiões promotoras, definidas como 1 quilobase (kB) a montante do local de início da transcrição, de genes com acessibilidade à cromatina aprimorada após o tratamento com Wnt4, foram interrogadas para motivos enriquecidos de 8 a 16 bp usando análise de motivo HOMER.

Geração de biblioteca Bulk RNA-Seq

[00329] O RNA total foi isolado de pellets celulares tratados com RNAlater (Invitrogen) usando o micro kit RNeasy (Qiagen) e tratado com DNaseI (Qiagen) por 30 minutos em temperatura ambiente. Bibliotecas de sequenciamento foram preparadas a partir de 100 a 500 ng de RNA total usando o Kit TruSeq RNA Sample Preparation v2 (Illumina) de acordo com o protocolo do fabricante.

Resumidamente, o mRNA foi purificado, fragmentado e usado para a síntese da primeira e da segunda cadeia de cDNA seguida por adenilação das extremidades 3'. As amostras foram ligadas a adaptadores únicos e amplificadas por PCR.

As bibliotecas foram então validadas usando o 2100 BioAnalyzer (Agilent), normalizadas e agrupadas para sequenciamento.

Sequenciamento e análise de alto rendimento

[00330] Bibliotecas de RNA-Seq preparadas a partir de 3 réplicas biológicas para cada condição experimental foram sequenciadas na Illumina HiSeq 2500 usando multiplexação com código de barras e um comprimento de leitura de 100 bp. A análise de imagem e a chamada de base foram geradas automaticamente com o software de análise em tempo real Illumina HiSeq. Isso resultou em uma mediana de 29,9 milhões de leituras utilizáveis por amostra.

Sequências de leitura curta foram mapeadas para uma sequência de referência UCSC hg19 usando o alinhador STAR de RNA-Seq (A. Dobin et al., 2013, Bioinformatics, 29: 15 a 21). Junções de emenda conhecidas de hg19 foram fornecidas ao alinhador e a descoberta de junção de novo também foi permitida. A análise da expressão diferencial do gene, o teste estatístico e a anotação foram realizados usando Cuffdiff 2 (C. Trapnell et al., 2013, Nature Biotechnology, 31: 46 a 53). A expressão do transcrito foi calculada como abundância relativa de nível de gene em fragmentos por quilobase de modelo de exon por milhão (fpkm) de fragmentos mapeados e correção empregada para viés de abundância de transcrição (A. Roberts et al., 2011, Bioinformatics, 27: 2325 a 2329). Os resultados de RNA-Seq para genes de interesse também foram explorados visualmente usando o navegador do genoma UCSC. Os mapas de calor foram gerados por R-Script com o software heatmap.2 (gplot) ou agrupamento com o software Javatree View. A escala dos mapas de calor foi determinada pela pontuação Z (FIG. 2A, FIG. 3D e FIG. 3G).

Sequência de RNA de célula única baseada em gotículas

[00331] Três réplicas biológicas (200 grupos por réplica) de células progenitoras endócrinas derivadas de hiPSC (dia 15), HILOs e HILOs tratados com WNT4 (100 ng/ml de rhWNT4 por 5 dias), bem como ilhotas humanas (doador IIDP ID 1874), foram dissociadas em suspensões de células únicas usando TrypLE. As células individuais foram processadas através da plataforma de célula única do Chromium usando os kits GemCode Gel Bead, Chip e Library (10X Genomics) de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, 8.800 células individuais foram classificadas em 0,4% de BSA em PBS para uma recuperação de 5000 células direcionada. As células foram transferidas para esferas de gel (Chromium Single Cell 3" v2) em emulsão no instrumento

Chromium, onde a lise celular e a transcrição reversa em código de barras do RNA foi realizada, seguida de amplificação, cisalhamento e adaptador 5′ e fixação de índice de amostra. As bibliotecas foram sequenciadas em um instrumento Illumina HiSeq 4000.

Análise de dados scRNA-seq

[00332] O processamento inicial de dados, incluindo desmultiplexação, alinhamento ao transcriptoma GRCh38 e colapso do identificador molecular único (UMI), foram realizados usando o software Cell Ranger (10x Genomics, versão 2.0.2). Uma visão geral das informações de amostra de célula única foi gerada a partir dos resultados dos dutos Cell Ranger. R studio (https: www.rstudio.com), Cell Ranger R Kit, Seurat, monóculo e outros scripts R personalizados foram usados. Para a identificação dos tipos de células, foi utilizada a função de células agrupadas do monóculo (FIG. 4B). O agrupamento de células foi realizado usando o pacote Seurat R em duas rodadas iterativas de análise de componentes principais.

[00333] As células com contagens de genes únicos inferiores a 200 foram removidas (função FilterCells) antes da normalização das matrizes de expressão gênica digital por expressão total, multiplicadas por um fator de escala (configuração padrão de 10.000) e transformadas por log (função NormalizeData). Um conjunto de genes variáveis foi então identificado pela categorização da expressão média de todos os genes e dispersão (variância dividida pela média) para cada gene, colocando esses genes em caixas e, em seguida, calculando a pontuação z para dispersão dentro de cada caixa (Função FindValiableGenes). A redução dimensional linear foi realizada usando a configuração padrão de RunPCA, e os componentes principais foram avaliados para sinais de expressão gênica estatisticamente significativos usando o método Jackstraw (função JackStraw, não mostrada). No máximo, 12 componentes principais foram usados nesta segunda rodada de agrupamento. O mapeamento de incorporação de vizinhança estocástica com distribuição t (t-SNE) foi usado para visualizar os resultados de scRNA- seq.

[00334] As populações de células agrupadas foram classificadas e os 10 principais genes diferencialmente expressos foram identificados (função FindAllMarkers). Os tipos de células dentro das populações de células agrupadas foram verificados examinando a expressão de genes marcadores canônicos, incluindo insulina (células ), glucagon (células ), somatocaína (células ), polipeptídeo pancreático (células ), grelina (células ), Prss1 (células acíneras), Krt19 (células ductais) e Acta2 (células estreladas) (FIGs. 2D, 2E, FIG. 4A e FIsa. 6D a 6F).

[00335] Os dados de scRNA-seq de HILOs tratados com WNT4 (4.840 células) e ilhotas humanas (7.248 células) foram combinados em 1 objeto Seurat, e os genes altamente variáveis foram identificados como descrito acima. Os tipos de células nas populações agrupadas foram identificados por referência a genes expressos diferencialmente em células de ilhotas humanas. As populações de células  identificadas em HILOs e ilhotas humanas tratadas com WNT4 foram comparadas para identificar genes expressos diferencialmente (FIGs. 10A a 10C; FIGs. 11A a 11D).

Software e programa para análise de bioinformática

[00336] O seguinte software ou programas foram usados para análise de dados genômicos: R studio (https://www.rstudio.com/); Cell Ranger R Kit (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene- expression/software/pipelines/latest/rkit); Seurat (https://satijalab.org/seurat/); Monocle (http://cole- trapnell-lab.github.io/monocle-release/); DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp); GOplot (https://wencke.github.io); Navegador do genoma UCSC (http://genome.ucsc.edu); e Homer (http://homer.ucsd.edu/homer/).

Imunohistoquímica (IHC)

[00337] A imunohistoquímica (IHC) de seções congeladas ou embebidas em parafina de pâncreas e ilhotas humanas ou células ieta na cápsula renal (4% de células fixadas com PFA) foi realizada usando anticorpos para insulina (anticorpo anti-insulina, 1/100, Abcam ab7842), peptídeo c (anticorpo anti-peptídeo c, 1/100, Abcam ab30477), glucagon (anticorpo anti-glucagon, 1/100, Abcam ab10988), somatostatina (anticorpo anti-somatostatina, 1/100, Abcam ab103790), polipeptídeo pancreático (anticorpo anti-polipeptídeo pancreático, 1/100, Abcam, ab113694), NKX2-2 (anticorpo anti-NKX2-2, 1/100, DSHB, 74.5A5), NKX6-1 (anticorpo anti-NKX6-1, 1/100, DSHB, F55A12), MAFA (anticorpo anti-MAFA, 1/100, Abcam, ab26405), MAFB (anticorpo anti-MAFB, 1/100, Abcam, ab26405), PDX-1 (anti- PDX-1 anticorpo, 1/100, R&D, AF2419), CHGA (anticorpo anti- CHGA, 1/100, Abcam, ab15160), sinaptofisina (anticorpo anti-sinaptofisina, 1/100, Biogenex, MU363-UC) e PD-L1 (anticorpo anti-PD-L1, 1/100, Abcam, ab20592) (Tabela 5).

Os anticorpos secundários foram acoplados a Alexa 568, 647 (Life Technologies) e a coloração IHC foi visualizada por microscopia confocal (ZEISS) ou microscopia de fluorescência. Hoechst 33342 (Thermo Scientific, 62249, concentração final de 1 g/ml) foi usado para coloração nuclear.

Tabela 5 Nome do Fonte/ ID do anticorpo (Ab) Espécie* Hospedeiro Tipo de Ab Aplicações empresa catálogo Porquinho- Insulina H, M, R da-Índia Policlonal IHC abcam ab7842 peptídeo c H, M Porquinho- Policlonal IHC abcam ab30477

Nome do Fonte/ ID do anticorpo (Ab) Espécie* Hospedeiro Tipo de Ab Aplicações empresa catálogo Porquinho- Insulina H, M, R da-Índia Policlonal IHC abcam ab7842 da-Índia Glucagon H, M, R Camundongo Monoclonal IHC abcam ab10988 Somatostatina H, M, R Coelho Policlonal IHC abcam ab103790 Polipeptídeo pancreático H Coelho Policlonal IHC abcam ab113694 H, M, R, NKX2-2 C Frango Monoclonal IHC DSHB 74.5A5 NKX6-1 H, M, R Rato Monoclonal IHC DSHB F55A12 IHC/ Citometria de Novus MAFA H, M Coelho Policlonal fluxo Biologicals NB400-137 IHC/Citometria MAFB H, M, R Coelho Policlonal de fluxo abcam ab66506 PDX-1 H, M Cabra Policlonal IHC R&D Systems AF2419 H, M, Cromogranina Mon Coelho Policlonal IHC abcam ab15160 Monoclonal/ Sinaptofisina H Camundongo Policlonal IHC BioGenex MU363-UC Anticorpo PD- L1 H Coelho Monoclonal IHC abcam ab205921 CromograninaA- Monoclonal/ Citometria de BD PE H Camundongo Policlonal fluxo Bioscience 564563 NKX6-1- Monoclonal/ Citometria de BD Alexa647 H, M Camundongo Policlonal fluxo Bioscience 563338 Monoclonal/ Policlonal Citometria de BD 562161 PDX-1-PE H, M Camundongo fluxo Bioscience anti- 103138 camundongo Citometria de CD45-510 M Rato Monoclonal fluxo BioLegend anti- 100229 camundongo Citometria de CD3-650 M Rato Monoclonal fluxo BioLegend anti- camundongo CD19- Citometria de PerCP/Cy5.5 M Rato Monoclonal fluxo BioLegend 115533 anti- camundongo Citometria de 12-5941- NK1.1-PE M Camundongo Monoclonal fluxo eBioscience 82 anti- camundongo Citometria de 17-5773- FoxP3-APC M Rato Monoclonal fluxo eBioscience 80 anti-humano Citometria de CD45-510 H Camundongo Monoclonal fluxo BioLegend 368526 anti-humano Citometria de CD3-650 H Camundongo Monoclonal fluxo BioLegend 317324 anti-humano- Citometria de CD4-PE/Cy7 H Rato Monoclonal fluxo BioLegend 357410 anti-humano- Citometria de CD8-FITC H Camundongo Monoclonal fluxo BioLegend 368524 anti-humano CD19- Citometria de PerCP/Cy5.5 H Camundongo Monoclonal fluxo BioLegend 363016 Espécie *: H = Humano; M = camundongo; R = Rato; C = Frango; Mon =

Macaco

Citometria de fluxo

[00338] Os agrupamentos nos estágios indicados foram dissociados com TrypLE (GIBCO) com 20 ug/ml de DNase por 12 minutos a 37 °C e, em seguida, foram fixados com PFA a 4% por 10 minutos em temperatura ambiente. Os agrupamentos foram então permeabilizados com 0,2% de Triton X por 10 minutos, bloqueados com 10% de soro de cabra por 30 minutos e corados para vários marcadores intracelulares com anticorpos, peptídeo c, (1/100, abcam, ab30477), PDX-1 (1/100, BD, 562161), NKX6-1 (1/100, BD, 563338), cromogranina A (1/100, BD, 564583), MAFA (1/100, abcam, ab264583), MAFB (1/100, abcam, ab66506), Glucagon (1/100, abcam, ab82270), somatostatina (1/100, abcam, 108456) para análise em um instrumento BD Biosciences LSRII. Os dados foram analisados pelo software FlowJo. Os anticorpos secundários para o peptídeo c, glucagon e somatostatina foram acoplados a Alexa 647 (Life Technologies).

Análise de Microscopia Eletrônica (EM)

[00339] Ilhotas humanas e HILOs em suspensão foram sedimentados em agarose de baixo ponto de fusão a 2% e subsequentemente fixadas em glutaraldeído a 2,5% com paraformaldeído a 2% em tampão cacodilato 0,15 M contendo 2 mM de cloreto de cálcio (pH 7,4) por uma hora a 4 °C. O excesso de agarose foi removido e o sedimento foi lavado em tampão antes da fixação secundária em 1% de tetróxido de ósmio/0,3% de ferrocianeto de potássio em tampão. Após lavagem em água, o sedimento foi corado em bloco com acetato de uranila a 2%, seguido por desidratação gradual em etanol (35%, 50%, 70%, 90%, 100%, 100%). As amostras foram então rapidamente infiltradas na resina de Spurr usando uma unidade de processamento de micro-ondas Pelco BioWave (Ted Pella, Redding, CA), incorporada em molde de ponta de Pirâmide Pelco (Ted Pella, Redding, CA) e curada a 60 °C durante a noite. Seções ultrafinas de 70 nm foram cortadas em um ultramicrótomo Leica UC7 (Leica, Viena) e examinadas em uma Libra120 (Zeiss, Oberkochen, Alemanha) a 120V.

Perfil imunológico de HILOs transplantados

[00340] HILOs transplantados foram colhidos no dia 26 após o transplante e foram dissociados em células individuais usando TrypLE. Depois de bloquear um epítopo comum encontrado em regiões extracelulares de receptores Fc de camundongo por bloqueio Fc (anti-CD16/CD32 de camundongo (Fc Shield) (70-0161-U500) coloração, anticorpos (diluição 1:100) para os marcadores de superfície celular CD19 (PerCP/Cy5.5 anti-rato CD19, BioLegend, 115533), Nk1.1 (anti-rato Nk1.1 PE, eBioscience, 12-5941-81), CD45 (violeta brilhante510 anti-rato CD45, BioLegend, 103138), CD3 (violeta brilhante650 anti-CD3 de camundongo, BioLegend, 100229), Cd11b (anti-humano/camundongo APC- cianina, TONBO, 25-0112U100) foram usados para perfil imunológico baseado em FACS. Para análises de citometria de fluxo, os dados foram coletados usando BD Biosciences LSRII. Para classificação de células, um BD Influx foi usado (ponta de bico de 100 mícrons e 1x fluido de invólucro PBS com pressão de invólucro ajustada para 18,5 PSI) com amostra e refrigeração de coleta configurada para 4 graus C. Células únicas viáveis (corante Zombie-UV negativo) foram selecionadas para FACS ou análises usando portas de dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC), seguidas por discriminação de largura de pulso para FSC e SSC.

[00341] O protocolo descrito ensaia a infiltração de linfócitos (células T, células B) em um órgão ou tecido, por exemplo, rim ou cápsula de rim, após transplante, implante ou transferência de células de doador, ilhotas, organoides (e células neles contidas). O número reduzido de células T CD45+ que se infiltram em tecidos, como rins após o transplante de PD-L1 + wHILOs produtoras de insulina versus PD-L1-wHILOs produtoras de insulina demonstra que as HILOs (e células neles contidas) que expressam PD-L1 estão protegidas do reconhecimento como estranhas por células T e pela morte de células T após o transplante (por exemplo, 27 dias após o transplante), (FIGs. 4D e 4E).

Detecção de células imunoprotegidas, ilhotas ou organoides (e células dos mesmos) após transplante, implante ou transferência para um indivíduo receptor

[00342] Células humanas primárias, ilhotas e/ou organoides derivados de tecidos humanos são marcados via infecção com uma TYF-CMV-eGFP mediada por lentivírus (proteína fluorescente verde), (Mao, Y. et al., 2015, International Journal of Medical Sciences, 12 (5), 407 a

415. Doi: 10.7150/ijms.11270), que foi mostrado para produzir elevada expressão de GFP sustentada. As células/ilhotas/organoides que expressam GFP são então expostas a 2 a 3 tratamentos de IFN (por exemplo, exposições IFN MPS descritas acima) e a indução subsequente da expressão de PDL-1 é confirmada por qPCR.

Células expostas a IFN, ilhotas e/ou organoides são transplantadas para a cápsula renal de um camundongo imunocompetente, com células/ilhotas/organoides virgens (isto é, sem exposição a IFN) transplantadas para a cápsula renal ipsilateral como controle. Os camundongos são sacrificados 2 a 3 semanas após o transplante e as células GFP-positivas residentes no rim são quantificadas por análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Aumentos nas células/ilhotas/ organoides que sobrevivem após a exposição ao IFN são determinados quantitativamente, com base no número de células GFP+ em cada rim, conforme determinado a partir de camundongos individuais.

Análise quantitativa de RT-PCR

[00343] O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen) e o KIT RNeasy (Qiagen). A transcrição reversa foi realizada com um kit SuperScript III First- Strand Synthesis System (Invitrogen) ou kit de reagente PrimeScript RT (TAKARA). RT-PCR quantitativo em tempo real (qPCR) foi realizado usando SYBR Green (Bio-Rad). As informações do iniciador estão listadas na Tabela 2.

Vascularização in vitro

[00344] Esferoides multicelulares humanos (MCSs) foram incluídos em 300 l de Matrigel com meio EBM (Ronza, cc-3121) em placas de cultura de tecidos de 24 poços. A vascularização foi observada nas 24 a 72 horas seguintes.

Métodos estatísticos

[00345] Os resultados foram expressos como a média ± SEM. As comparações estatísticas foram feitas usando o teste t de Student. As diferenças estatisticamente significativas são indicadas como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Exemplo 10: Organoides humanos semelhantes a ilhotas

[00346] A geração de órgãos humanos funcionais de acordo com os métodos descritos neste documento fornece novas estratégias para a triagem de drogas e modelagem de doenças. Especificamente, os organoides funcionais podem ser usados como modelos de diabetes tipo 2 para rastreamento de drogas. Organoides humanos semelhantes a ilhotas responderam à toxicidade do polipeptídeo amiloide (hIAPP), um indutor de perda de células  em pacientes diabéticos tipo 2 e disfunção de ilhotas após transplante em pacientes hiperglicêmicos, parada de G0/G1 induzida de forma dependente da dose de hIAPP em 24 horas em ilhotas humanas como organoides (ver, por exemplo, WO 2017/205511).

Esses organoides semelhantes aos humanos também podem ser induzidos a expressar PD-L1 de acordo com os métodos e sistemas descritos neste documento, de modo a evitar a detecção e a destruição imunológica quando usados para transplante, implante ou administração a um indivíduo com necessidade.

[00347] Em um ensaio exemplar, mini-órgãos 3D são expostos a estressores que induzem diabetes tipo 2, como altos níveis de ácidos graxos livres (FFAs) e/ou glicose e citocinas selecionadas. Os mini-órgãos 3D estressados são então tratados com vários medicamentos. Em algumas modalidades, o medicamento é aprovado pela Food and Drug Administration (FDA).

[00348] Como saída, o seguinte é testado em organoides de ilhotas pancreáticas humanas: secreção de insulina, apoptose de células beta (coloração PI), expressão de lactato desidrogenase A (LDHA) por meio de um repórter de luciferase e alterações na expressão de genes marcadores, incluindo NDUFA4 (fosforilação oxidativa mitocondrial), ESRRG (função mitocondrial), KCNK3 (atividade do canal Katp) e MAFA (marcador de destino da célula beta). Para o organoide de pâncreas humano, a secreção de amilase e a apoptose de células exócrinas (coloração com PI) são testadas.

[00349] Em um ensaio exemplar para modelar a tumorigênese e metástase do câncer pancreático humano em um prato e o potencial de triagem de drogas que visam essas doenças, um mini pâncreas humano 3D é co-cultivado com células cancerosas pancreáticas, células estreladas e células imunes para criar um microambiente de células humanas de câncer pancreático em um prato. Vários fármacos (por exemplo, fármacos aprovados pela FDA) são então selecionados para encontrar compostos que suprimem eficazmente o crescimento do câncer de pâncreas ou metástases em um mini microambiente do pâncreas humano.

Como saída, o seguinte é medido para o organoide do pâncreas: apoptose de células exócrinas (coloração PI), síntese de colágeno (coloração Trichrome) e ativação de células estreladas (GFAP-repórter). As drogas candidatas potenciais identificadas nestes ensaios são testadas em modelos de camundongos com tumorigênese e metástase de câncer de pâncreas. A expressão e a morfologia dos genes, bem como o grau de morte celular, crescimento celular e metástase são investigados.

[00350] Em um ensaio exemplar para modelagem de diabetes tipo 2 humano em camundongos, organoides de ilhotas humanas e/ou organoides de fígado humano são transplantados para camundongos. Os camundongos são então administrados com vários estressores que induzem o diabetes tipo 2, como uma dieta rica em gordura (HFD) ou injeção de citocinas. As drogas candidatas potenciais identificadas neste ensaio são ainda testadas em modelo de camundongo diabético tipo 2 humano. A expressão e a morfologia dos genes, bem como o grau de diabetes, são investigados.

[00351] Em um ensaio exemplar para modelagem de tumorigênese e metástase de câncer de pâncreas humano em camundongos, organoides de pâncreas humano e/ou organoides de fígado humano são transplantados em camundongos.

Camundongos transplantados com um minipâncreas são usados para estudar o crescimento do câncer de pâncreas humano no microambiente do pâncreas humano. Em outro ensaio exemplar, um minipâncreas e um minifígado são co-transplantados em camundongos. O fígado é o principal local de metástase do câncer pancreático. In vivo, as células endoteliais no minipâncreas e no minifígado criam uma rede de vasculatura de pâncreas-fígado para a metástase do câncer pancreático.

Assim, camundongos co-transplantados com um minipâncreas e um minifígado são usados para estudar a metástase do câncer de pâncreas humano no fígado humano. A geração de agrupamentos semelhantes a órgãos funcionais a partir de células-tronco de pluripotência (PSC) e ilhotas humanas e HILOs, conforme descrito neste documento, fornece uma visão sobre os mecanismos subjacentes às doenças humanas, bem como a terapêutica biológica que funciona após a introdução ou o transplante em um indivíduo receptor.

[00352] Os resultados acima foram obtidos usando os seguintes materiais e métodos: Meio de cultura 3D KELCOGEL® (3DKG)

[00353] A goma gelana de baixo acila KELCOGEL® F (GG-LA) obtida da Modernist Pantry foi suspensa em água pura 0,3% (p/v) e dissolvida por agitação a 90 °C ou por micro-ondas. A solução aquosa foi esterilizada a 121 °C durante 20 minutos em autoclave. A solução foi adicionada ao meio TeSR™ (Ludwid et al., Nature Methods, 3, 637 a 646) ou meio TeSR™ personalizado (800 ml de DMEM/F12, 13,28 g de BSA, 10 ml de Glutamax, 560 mg de NaHCO3, 330 mg de tiamina, 100 mg de glutationa reduzida, 3300 mg de vitamina C, 14 g de selênio, 10 ml de NEAA, 2 ml de elemento traço B, 1 m1 de elemento traço C, 7 l de -ME, 2 ml de DLC, 2 ml de GABA, 2 ml de LiCl, 129,7 g de ácido pipecólico, 2 mg de insulina até 1000 ml) no final concentração de 0,015%. A solução estoque de metilcelulose (MC) foi adicionada a uma concentração final de 0,3% (R&D Systems)

(por exemplo, estoque KELCOGEL® a 0,3%: KELCOGEL® F 300 mg de GG-LA de baixo acila + 100 ml de água MilliQ; meio de base de 3D-KELCOGEL® (3DKG) Haste TeSR™: 95 ml de STEMCELL™ TeSR™ + 5 ml de KELCOGEL® 0,3% + 300 ul de solução estoque MC; meio de base de 3DKG Custom TeSR™: 95 ml de meio personalizado de TeSR™ + 5 ml de estoque de KELCOGEL® 0,3% + 300 ul de solução estoque MC; 1% de concentração final de penicilina/estreptozocina foi adicionada ao meio 3DKG.

Preparação de células progenitoras endócrinas pancreáticas humanas e células semelhantes a  in vitro

[00354] As células endócrinas pancreáticas (hiPSC- PEs) foram preparadas a partir de iPSC humana usando métodos de diferenciação conforme descrito anteriormente.

Resumidamente, células-tronco de pluripotência induzidas por humanos (hiPSC) derivadas de HUVECs foram obtidas de Stem Cell Core (Salk Institute). As células foram mantidas em placas revestidas com MATRIGEL® (BD) em meio STEMCELL™ TeSR™ completo a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5% umidificada. Para a diferenciação pancreática, hiPSC foram infectados com um lentivírus repórter de insulina humana (insulina humana repórter pGreenZero lenti, Biosciences Systems) por Spinfection (800 g, 1 hora). Métodos 1: O meio foi alterado para 100 ng/ml de Activina humana (R&D Systems), 25 ng/ml de Wnt3a humano recombinante (R&D Systems) em meio TeSR™ personalizado (800 ml de DMEM/F12,

13,28 g de BSA, 10 ml de Glutamax, 560 mg de NaHCO3, 330 mg de tiamina, 100 mg de glutationa reduzida, 3300 mg de vitamina C, 14 g de selênio, 10 ml de NEAA, 2 ml de elemento traço B, 1 ml de elemento traço C, 7 l de -ME, 2 ml de DLC, 2 ml de GABA, 2 ml de LiCl, 129,7 g de PA, 2 mg de insulina até 1000 ml) por 2 dias e então 100 ng/ml de Activina humana em meio de diferenciação por mais 2 dias (Estágio 1, Endoderme pancreático). Posteriormente, o meio foi substituído por meio TeSR™ personalizado com 1 M de dorsomorfina (Calbiochem), 2 M de ácido retinóico (Sigma), 10 M de SB431542 e 1% de suplemento B27 por 7 dias (Fase 2). O meio foi então substituído por um meio TeSR™ personalizado com 10 uM de forscolina (Sigma), 10 M de dexametasona (Stemgent), 10 M de inibidor de TGF RI quinase II/inibidor Alk5 II (Calbiochem ou Enzo), 10 M de nicotinamida (Sigma), 1 M de Sal de sódio de 3,3',5-Tri- iodo-L-tironina (T3) e 1% de suplemento de B27 por 4 a 5 dias (dia 15 a dia 21, progenitores endócrinos pancreáticos). O meio foi substituído todos os dias (estágio 1) ou em dias alternados (estágio 2 e estágio 3).

[00355] Métodos 2: O meio foi alterado para 100 ng/ml de ativina humana (R&D Systems), 25 ng/ml de Wnt3a humano recombinante (R&D Systems) ou 3 M de CHIR99021 (Axon ou Selleckchem) em meio de diferenciação

(S1) por 1 dia e depois 100 ng/ml de activina humana em meio de diferenciação (S1) por mais 2 dias (Fase 1, endoderme pancreático). Posteriormente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S2) com 50 ng/ml de FGF7 (R&D Systems) por 2 dias e, em seguida, meio de diferenciação (S3) com 50 ng/ml de FGF7, 0,25 M de SANT-1 (Sigma), 1 M de ácido retinóico (Sigma), 100 nM de LDN193189 e 100 nM de modulador de proteína precursor de -amiloide TPB por 3 dias. Subsequentemente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S4) com 0,25 M de SANT-1, 50 nM de ácido retinóico, 10 M de inibidor II de Alk5, 1 M de T3 durante 3 dias. Subsequentemente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S5) com 100 nM de LDN193189, 100 nM de inibidor da gama secretase XX GSiXX (Millipore), 10 M de inibidor II de Alk5, 1 M de T3 durante 7 dias. Posteriormente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S5) com 10 M de Trolox (Calbiochem), 2 M de R428 (Selleckchem), 1 mM de N-acetil cisteína, 10 M de inibidor Alk5 II, 1 M de T3 por mais 7 a 20 dias.

[00356] Meio S1 (Meio MCDB131, 8 mM de glicose, 2,46 g/L de NaHCO3, BSA livre de ácido graxo a 2%, 0,25 mM de ácido L-ascórbico, 0,002% de Insulina-Transferrina- Selênio ITS-X (GIBCO), 2 mM de Glutamax, Penicilina-

Estreptomicina a 1%), Meio S2 (Meio MCDB131, 8 mM de glicose, 1,23 g/L de NaHCO3, 2% de BSA livre de ácido graxo, 0,25 mM de ácido L-ascórbico, 0,002% de Insulina- Transferrina-Selênio ITS-X (GIBCO), 2 mM de Glutamax, 1% de Penicilina-estreptomicina), meio S3 (meio MCDB131, 8 mM de glicose, 1,23 g/L de NaHCO3, BSA livre de ácidos graxos a 2%, 0,25 mM de ácido L-ascórbico, 0,5% de insulina- transferrina-selênio ITS-X (GIBCO), 2 mM de glutamax, 1% de Penicilina-Estreptomicina), Meio S4 (Meio MCDB131, 8 mM de glicose, 1,23 g/L de NaHCO3, 2% de BSA livre de ácidos graxos, 0,25 mM de Ácido L-ascórbico, 0,002% de Insulina- Transferrina-Selênio ITS-X (GIBCO), 2 mM de Glutamax, 1% de Penicilina-Estreptomicina, 10 g/ml de Heparina, 10 M de Sulfato de Zinco), Meio S5 (Meio MCDB131 ou Meio BLAR, 20 mM de glicose, 1,754 g/L de NaHCO3, BSA livre de ácidos graxos a 2%, 0,25 mM de Ácido L-ascórbico, 0,002% de Insulina-Transferrina-Selênio ITS-X (GIBCO), 2 mM de Glutamax, 1% de Penicilina-Estreptomicina). Para cultura tridimensional (3D), hiPSC ou hESC foram cultivados em meio de base 3DKG Stem TeSR™ com 10 M de Y-27632 por 5 a 7 dias e, em seguida, cada meio de diferenciação foi substituído por 0,015% de Kelcogel e 0,3% de metilcelulose.

Geração de brotos de ilhotas pancreáticas tridimensionais in vitro: organoides semelhantes a ilhotas em Matrigel por meio de co-cultura com hADSCs e HUVECs

[00357] HUVECs primários e células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hADSC) (Invitrogen ou PromoCell)

foram cultivadas em placas de 15 cm com meio EBM (Ronza,

cc-3121) ou meio MesenProRS™ (GIBCO, 12747-010 ou kit de meio de crescimento pré-adipócito, C-27417),

respectivamente, a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2 umidificada.

Para experimentos de co-cultura, progenitores endócrinos pancreáticos derivados de iPSC humano foram tratados com Accutase, enquanto HUVECs e hADSC foram tratados com TrypLE (GIBCO, 12604-013) e células coletadas em um tubo de 50 ml, respectivamente.

Após as células serem contadas, 1 x 106 células de hiPS-PP, 7 x 106 células de

HUVEC e 1 a 2 x 105 células de hADSC foram co-cultivadas em

1 poço de 24 poços com 300 ul de matriz MATRIGEL®. Para fins de geração escalonável de ilhotas humanas como organoides, 1 x 106 células de hiPS-PP (dia 15 a dia 21), 7 x 106 células de HUVEC e 1 a 2 x 105 células de hADSC foram co-cultivadas em meio 3DKG Custom TeSR® com 10 M de forskolina (Sigma), 10 M de dexametasona (Stemgent), 10 M de inibidor de TGF RI quinase II/inibidor de Alk5 II

(Calbiochem ou Enzo), 10 M de nicotinamida (Sigma), 1 uM de sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3) e 1% de suplemento B27, R428 (2 M), sulfato de zinco (10 M) e N-

Cys (1 mM). (Métodos 1) ou co-cultivados em meio de diferenciação (S5) com 100 nM de LDN193189, 100 nM de inibidor de gama secretase XX GSiXX (Millipore), 10 M de inibidor de Alk5 II, 1 M de T3 por 7 dias. Posteriormente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S5) com 10 M de Trolox (Calbiochem), 2 M de R428 (Selleckchem), 1 mM de N-acetilcisteína, 10 M de inibidor Alk5 II, 1 M de T3 por mais 7 a 20 dias (Métodos 2). As células mistas formaram aglomerados esféricos semelhantes a ilhotas em poucos dias. O meio foi mudado a cada dois dias.

Geração de brotos de ilhotas pancreáticas 3D (tridimensionais) in vitro: organoides semelhantes a ilhotas em goma gelana escalonável por meio de co-cultura com hADSCs e HUVECs

[00358] As células foram preparadas conforme descrito acima. Resumidamente, 1 x 108 células de hiPS-PP, 2 a 7 x 107 células de HUVECs e 5 a 7 x 106 células de hADSC foram co-cultivadas em 60 a 100ml de 3DKG Custom TeSR™ com 10 M de forscolina (Sigma), 10 M de dexametasona (Stemgent), 10 M de Inibidor de TGF RI quinase II/Alk5 inibidor II (Calbiochem ou Enzo), 10 M de nicotinamida (Sigma), 1 M de sal de sódio de 3,3',5-Tri- iodo-L-tironina (T3) e 1% de suplemento B27, R428 (2 M), sulfato de zinco (10 M) e N-Cys (1 mM) (Métodos 1) ou co- cultivados em meio de diferenciação (S5) com 100 nM de LDN193189, 100 nM de inibidor de gama secretase XX GSiXX

(Millipore), 10 µM de inibidor de Alk5 II, 1 M de T3 por 7 dias. Posteriormente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S5) com 10 M de Trolox (Calbiochem), 2 M de R428 (Selleckchem), 1 mM de N-acetilcisteína, 10 M de inibidor Alk5 II, 1 µM de T3 por mais 7 a 20 dias (Métodos 2). As células mistas formaram aglomerados esféricos semelhantes a ilhotas em poucos dias. O meio era trocado todos os dias ou em dias alternados.

Geração de brotos de ilhotas pancreáticas 3D (tridimensionais) in vitro: Organoides semelhantes a ilhotas em métodos de cultura 3D escalonáveis de goma gelana sem (w/o) usar hADSC e HUVECs

[00359] PSCs humanos, incluindo iPSC ou ESC, foram inicialmente cultivados em placas revestidas com matrigel (culturas bidimensionais (2D). As células foram então tratadas com Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc., San Diego, CA) para gerar uma suspensão de célula única, lavadas com PBS e centrifugadas a 1000 a 1300 rpm por 5 minutos para células sedimentadas. As células foram ressuspensas com meio base 3DKG Stem TeSR™ (Stemcell Technologies, Cambridge, MA) com 10 M Y-27632 (um composto inibidor da via RHO/ROCK) e cultivado por um período adicional de 5 a 7 dias até que o crescimento da esfera de PSC atingisse 50 a 100 m de diâmetro. O meio foi então substituído por meio de diferenciação suplementado com

0,015% de Kelcogel e 0,3% de metilcelulose.

O meio de cultura foi alterado para meio de diferenciação (S1)

contendo 100 ng/ml de ativina humana (R&D Systems),

25 ng/ml de Wnt3a humano recombinante (R&D Systems) ou 3 M de CHIR99021, um inibidor de glicogênio sintase quinase

GSK-3 (Axon Medchem, Reston, VA; ou Selleckchem) por 1 dia e, em seguida, para meio de diferenciação (S1) contendo

100 ng/ml de ativina humana por mais 2 dias (estágio 1,

endoderme pancreático). Posteriormente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S2) contendo

50 ng/ml de FGF7 (R&D Systems) por 2 dias e, em seguida,

por meio de diferenciação (S3) contendo 50 ng/ml de FGF7,

0,25 uM de SANT-1 (Sigma), 1 M de ácido retinóico (Sigma),

100 nM de LDN193189 (um inibidor de ALK2 e ALK3, Sigma) e

100 nM de modulador de proteína precursora -amilóide TPB por 3 dias.

Posteriormente, este meio foi substituído por meio de diferenciação (S4) contendo 0,25 M de SANT-1,

50 nM de ácido retinóico, 10 M de inibidor Alk5 II, 1 M de T3 por 3 dias.

Posteriormente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S5) contendo 100 nM de

LDN193189, 100 nM de inibidor de gama secretase XX GSiXX

(Millipore), 10 M de inibidor de Alk5 II, 1 M de T3 por 7 dias.

Posteriormente, o meio foi substituído por meio de diferenciação (S5) contendo 10 M de Trolox (Calbiochem),

2 M de R428 (Selleckchem), 1 mM de N-acetilcisteína, 10 M de inibidor Alk5 II, 1 M de T3 por mais 7 a 20 dias.

[00360] Após a confirmação da expressão do gene da insulina por expressão de repórter ou qPCR (normalmente no dia 20 a 30), o meio foi alterado para meio de diferenciação (S5) contendo 10 M de Trolox (Calbiochem), 2 M de R428 (Selleckchem), 1 mM de N-acetilcisteína, 10 M de inibidor de Alk5 II, 1 M de T3 e 100 ng/ml de Wnt4 humano recombinante (rh) (R&D Systems), 400 ng/ml de rhWnt5a ou meio condicionado de 50% de Wnt5a por 1 a 20 dias. O meio condicionado de Wnt5a foi preparado cultivando uma linhagem de células L-Wnt5a (ATCC, CRL-2814) em DMEM com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina por 4 dias após as células terem atingido 70 a 100% de confluência nos frascos de cultura de células T175-T225.

Geração de brotos de fígado 3D (tridimensionais) in vitro: brotos de órgãos

[00361] As células de hepatócitos (hiPSC-HEs) de iPSC humana foram preparadas usando métodos de diferenciação conforme descrito anteriormente.

Resumidamente, as hiPSCs foram mantidas em placas revestidas com MATRIGEL® (BD) em meio STEMCELL™ TeSR™ completo a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Para a diferenciação hepática, hiPSC (90% de confluência em 6 poços) foram cultivados com 100 ng/ml de ativina humana (Sigma) e 25 ng/ml de Wnt3a humana recombinante (sistemas R&D) ou 3 M de CHIR99021 e 1% de suplemento B27 menos insulina em meio RPMI-1640 por 1 dia e, em seguida, 100 ng/ml de ativina humana e suplemento de

B27 a 1% sem insulina em meio RPMI por mais 4 dias (Estágio

1 Hepático-Endoderma). Posteriormente, o meio foi substituído por meio de diferenciação com 10 ng/ml de bFGF,

20 ng/ml de BMP4 e 1% de suplemento B27 em meio RPMI-1640 por 3 dias (Etapa 2). O meio foi então substituído por meio de diferenciação com 0,1 M de dexametasona, 20 ng/ml

OncostatinM (R&D Systems) e 10 a 20ng/ml de fator de crescimento hepático (HGF, R&D Systems) e 1% de suplemento

B27 em meio de cultura de hepatócitos (Lonza, MD , CC-3198,

retira EGF e Gentamicina/Anfotericina-B) por 4 a 22 dias

(dia 15 a dia 19, progenitores endócrinos pancreáticos). O meio foi substituído todos os dias (estágio 1) ou em dias alternados (estágio 2 e estágio 3). Células HUVECs primárias e células-tronco derivadas de tecido adiposo humana (hADSC) (InVitrogen ou PromoCell) foram cultivadas em placas de 15 cm com meio EBM (Ronza, cc-3121) ou meio

MesenProRS (GIBCO, 12747-010 ou kit de meio de crescimento pré-adipócito, C-27417), respectivamente, a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2 umidificada.

Para experimentos de co-cultura, hepatócitos do dia 10 derivados de iPSC humano foram tratados com Accutase, enquanto HUVECs e hADSC foram tratados com TrypLE (GIBCO, 12604-013) e as células foram coletadas em tubos de 50 ml, respectivamente. Após as células serem contadas, 1 x 106 células de hiPS-PP, 7 x 106 células de HUVEC e 1 a 2 x 105 células de hADSC foram co- cultivadas em 1 poço de 24 poços com 300 ul de matrigel.

Organoides semelhantes ao fígado foram formados em 1 a 2 dias. Em seguida, organoides semelhantes ao fígado foram retirados da matriz MATRIGEL® e cultivados em 3DKG Custom TeSR™. Em uma modalidade, as células (hepatócitos) dos organoides semelhantes ao fígado foram manipuladas molecularmente para expressar uma ou mais proteínas de ponto de verificação.

Geração de brotos de coração 3D (tridimensionais) in vitro: brotos de órgãos

[00362] As células de cardiomiócitos (hiPSC-CDs) foram preparadas a partir de iPSC humana usando métodos de diferenciação conforme descrito anteriormente.

Resumidamente, as hiPSCs foram mantidas em placas revestidas com MATRIGEL® (BD) em meio Stemcell™ TeSR™ completo a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2 umidificada. Para diferenciação cardíaca, hiPSC (90% de confluência em 6 poços) foram cultivados com 100ng/ml de ativina humana (R&D Systems) e 10 M de CHIR99021 e 1% de suplemento B27 menos insulina em meio RPMI1640 por 1 dia e, em seguida, 1% de suplemento B27 menos insulina em Meio

RPMI por mais 2 dias (Fase 1 cardíaca-Mesoderma).

Posteriormente, o meio foi substituído por RPMI1640 com 5 M de IWP-2 e 1% de suplemento de B27 sem insulina em meio RPMI por 1 dia (Estágio 2). O meio foi então substituído por suplemento de B27 a 1% sem insulina em meio RPMI por 6 dias ou mais (Estágio 3). A contração cardíaca começou por volta do dia 13. O meio foi substituído todos os dias (estágio 1) ou em dias alternados (estágio 2 e estágio 3). Células HUVECs primárias e células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hADSC) (Invitrogen ou PromoCell) foram cultivadas em placas de 15 cm com meio EBM (Ronza, cc-3121) ou meio MesenProRS™ (GIBCO, 12747-010 ou kit de meio de crescimento pré-adipócito, C-27417), respectivamente, a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5% umidificada. Para experimentos de co-cultura, cardiomiócitos do dia 13 ao dia 15 derivados de iPSC humano foram tratados com Dispase, enquanto HUVECs e hADSC foram tratados com TrypLE (GIBCO, 12604-013) e as células coletadas em tubos de 50 ml, respectivamente. Após as células serem contadas, 1 x 106 células de hiPS-PP, 7 x 106 células de HUVEC e 1 a 2 x 105 células de hADSC foram co- cultivadas em meio 3DKG Custom TeSR™. Órgãos semelhantes a um coração, capazes de se contrair, foram formados em poucos dias. Em uma modalidade, as células (cardiomiócitos) dos mini-organoides semelhantes ao coração foram manipuladas molecularmente para expressar uma ou mais proteínas de ponto de verificação.

Geração de brotos intestinais 3D (tridimensionais) in vitro: brotos de órgãos

[00363] As células intestinais (hiPSC-ITs) foram preparadas a partir de iPSC humana usando métodos de diferenciação conforme descrito anteriormente.

Resumidamente, hiPSCs foram mantidos em placas revestidas com Matrigel® (BD) em meio Stemcell™ TeSR™ completo a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2 umidificada. Para diferenciação de células intestinais, hiPSC (90% de confluência em placas de 6 poços) foram cultivadas com 100 ng/ml de Activina humana (R&D Systems), 3 M de CHIR99021, 2 mM de Glutamax e 1% de suplemento de B27 menos insulina em meio RPMI1640 por 1 dia e depois 100 ng/ml de ativina humana (R&D Systems), 2 mM de Glutamax e suplemento de B27 a 1% sem insulina em meio RPMI1640 por mais 3 dias (Estágio 1 Forgut-Endoderma). Posteriormente, o meio foi substituído por 500 ng/ml de Wnt3a, 500 ng/ml de FGF4 e suplemento de B27 a 1% em meio RPMI 1640 por 4 dias (Estágio 2). As células foram transferidas para a matriz Matrigel® e, em seguida, um dormitório 3D-esferoide Matrigel® foi feito no fundo de 24 poços. O meio foi então substituído por 1% de suplemento de B27, 1% de suplemento de N2, 500 ng/ml de R-espondina, 100 ng/ml de Noggin,

50 ng/ml de EGF, 2 mM de suplemento de Glutamax™, 10 M de HEPES em meio DMEM/F12 por 7 dias ou mais (estágio3).

Esferoides organoides semelhantes ao intestino foram observados dentro de uma semana. O meio foi substituído todos os dias (estágio 1) e em dias alternados (estágio 2 e estágio 3). Células HUVECs primárias e células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hADSC) (Invitrogen ou PromoCell) foram cultivadas em uma placa de 15 cm com meio EBM (Ronza, cc-3121) ou meio MesenProRS™ (GIBCO®, 12747-010 ou kit de meio de crescimento de pré-adipócitos, C-27417), respectivamente, a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2 umidificada. Para experimentos de co-cultura, progenitores intestinais (dia 7) derivados de iPSC humano foram tratados com Accutase, enquanto HUVECs e hADSC foram tratados com TrypLE (GIBCO®, 12604-013) e as células foram coletadas em tubos de 50 ml, respectivamente. Após a contagem das células, 1 x 106 células de hiPS-PP, 7 x 106 células HUVEC e 1 a 2 x 105 células hADSC foram co-cultivadas em meio 3DKG Custom TeSR™. Em uma modalidade, as células intestinais dos organoides semelhantes ao intestino foram manipuladas molecularmente para expressar uma ou mais proteínas de ponto de verificação.

Ensaio de secreção de insulina (ilhotas pancreáticas primárias de camundongo e humano e células humanas derivadas de iPSC)

[00364] A liberação de insulina de ilhotas intactas foi monitorada usando métodos de incubação em lote (Yoshihara et al., 2010, Nat. Commun. 1: 127).

Resumidamente, ilhotas pancreáticas isoladas cultivadas durante a noite (RPMI-1640 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino e 1% (v/v) Antibiótico-Antimicótico (Gibco)) foram pré-cultivadas a 37 °C por 30 minutos (Tampão de bicarbonato Krebs-Ringer (KRBB) contendo 129,4 mM de NaCl, 3,7 mM de KCl, 2,7 mM de CaCl2, 1,3 mM de KH2PO4, 1,3 mM de MgSO4, 24,8 mM de NaHCO3 (equilibrado com 5% de CO2, 95% de O2, pH 7,4), 10mM de HEPES e 0,2% (v/v) de BSA (fração V, Sigma) (KRBH) com 3 mM de glicose). As ilhotas pancreáticas foram então incubadas em tampão KRBH (500 l/10 ilhotas) com 3 mM ou 20 mM de glicose para determinar os níveis de secreção de insulina. Após 30 minutos, as ilhotas foram sedimentadas por centrifugação e os níveis de insulina determinados por ELISA (KIT ELISA de insulina de rato/camundongo (Millipore) e KIT ELISA de insulina humana (Millipore) para ilhotas de camundongo e humano, respectivamente). Para células humanas derivadas de iPSC, as células (1 x 106 células/poço em 24 poços) foram pré-cultivadas em tampão KRBH de 3 mM de glicose (500 l/poço). As células foram então incubadas em KRBB (200 l/poço) com 3 mM ou 20 mM de glicose para determinar os níveis de secreção do peptídeo c como indicador dos níveis de secreção de insulina. Após 30 minutos, as células foram sedimentadas por centrifugação e os níveis de peptídeo c foram determinados pelo KIT ELISA de peptídeo c humano (Millipore).

Métodos do Exemplo 10 Análise quantitativa de RT-PCR

[00365] O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen) e RNeasy KIT (Qiagen). A transcrição reversa foi realizada com um kit SuperScript III First- Strand Synthesis Systme (Invitrogen) ou kit de reagente PrimeScript RT (TAKARA). RT-PCR quantitativo em tempo real (qPCR) foi realizado usando SYBR Green (Bio-Rad).

Produção de lentivírus para Proinsulin-NanoLuc

[00366] Proinsulin-NanoLuc em pLX304 (Addgene, # 62057) foi obtido na Addgene. O lentivírus Proinsulin- NanoLuc foi produzido usando um sistema de empacotamento viral de segunda geração. Resumidamente, 14 g de Proinsulin-NanoLuc, 6,6 g de plasmídeo de empacotamento PsPAX2 (Addgene 12260), 5,4 g de plasmídeo de envelope pMD2.G (Addgene 12259) e 54 l de Lipofectamin2000 (Invitrogen) foram usados para transfectar um frasco T75 de células de empacotamento HEK293LTV. Vinte e quatro (24) horas após a transfecção, o meio foi mudado para DMEM fresco com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptozocina.

Quarenta e oito (48) horas e 96 horas após a transfecção,

os vírus foram coletados no dia 1 e no dia 3, respectivamente, e passados por filtros de acetato de celulose de 0,2 m (VWR). Os vírus foram divididos em alíquotas e congelados a -80 °C até o uso.

Ensaio de Luciferase de Gaussia para medição de secreção de insulina

[00367] Ilhotas de camundongo, ilhotas humanas e ilhotas humanas como organoides foram semeadas em seus respectivos meios de crescimento com 10 g/ml de polímero Polybrene® (Santacruz). Os vírus foram então adicionados.

Após cultura durante a noite, as células foram colocadas em meio de crescimento fresco. Quarenta e oito (48) a 72 horas após a infecção, ilhotas de camundongos, ilhotas humanas e organoides semelhantes a ilhotas humanas foram recolhidos à mão e colocados em 96 poços com uma única ilhota ou organoide. Em seguida, foram realizados ensaios de secreção de insulina. Resumidamente, uma única ilhota ou organoide foi pré-incubada com 3mM de glicose KRBB a 37 °C por 30 minutos a 1 hora. As células foram então incubadas em KRBB (100 l/poço) com 3 mM por 30 minutos e, em seguida, incubadas sequencialmente com 20 mM de glicose com ou sem 100 nM de Exendin-4 ou 3 mM de glicose com 20 mM de KCl (100 l/poço). Para determinar a atividade da Luciferase de Gaussia como indicador dos níveis de secreção de insulina, 10 l de amostras são usados para o ensaio da Luciferase usando o Kit de Ensaio Pierce Gaussia Luciferase Flash (Prod # 16159, Thermo Scientific).

[00368] As células INS-1 foram infectadas com o vírus por spinfection (800 g, 1 hora a 37 °C e, em seguida, alteradas para meio de crescimento INS-1 fresco. Setenta e duas (72) horas após a transfecção, as células INS-1 foram tratadas com 5 g/ml de Blasticidina (Invitrogen) por 7 dias para selecionar células que expressam Proinsulin- NanoLuc. Para o ensaio de secreção de insulina, as células (5 x 104 a 1 x 105 células/poço em 96 poços) foram pré- cultivadas em 3mM de glicose KRBB (100 l/poço). As células foram então incubadas em KRBB (100 l/poço) com 3 mM e, em seguida, incubadas sequencialmente com 20 mM de glicose com ou sem 100 nM de Exendine-4 ou 3 mM de glicose com 20 mM de KCl (100 l/poço). Para determinar a atividade de luciferase de Gaussia como indicador dos níveis de secreção de insulina, 10 l de amostras são usados para o ensaio de luciferase usando o Kit de Ensaio Pierce Gaussia Luciferase Flash (Prod # 16159, Thermo Scientific).

Teste de vascularização in vitro

[00369] Organoides humanos semelhantes a ilhotas foram incorporados em 1 poço de placa de 24 poços com 300 l de matriz Matrigel® com EBM Media (Ronza, cc-3121). A vascularização foi observada dentro de 24 a 72 horas.

Cultura 3D de hADSCs e expressão da proteína WNT

[00370] As hADSCs sofrem alterações na expressão de genes Wnt, em particular genes na via Wnt5a, durante a auto- organização espontânea que ocorre na cultura 3D. Verificou- se que Wnt5a é a proteína predominante expressa entre as proteínas Wnt na cultura hADSC 3D ao longo do tempo.

Outras modalidades

[00371] A partir da descrição anterior, será evidente que variações e modificações podem ser feitas à invenção descrita neste documento para adotá-la em vários usos e condições. Tais modalidades também estão dentro do escopo das reivindicações seguintes.

[00372] A citação de uma lista de elementos em qualquer definição de uma variável neste documento inclui definições dessa variável como qualquer elemento único ou combinação (ou subcombinação) de elementos listados. A citação de uma modalidade neste documento inclui essa modalidade como qualquer modalidade única ou em combinação com quaisquer outras modalidades ou porções das mesmas.

[00373] Todas as patentes e publicações mencionadas neste relatório descritivo são incorporadas neste documento por referência na mesma extensão como se cada patente independente e publicação fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para aumentar a sobrevivência ou reduzir a morte celular de uma célula doadora transplantada, o método caracterizado pelo fato de compreender contactar a célula do doador com múltiplas exposições intermitentes com o interferon gama (IFN), aumentando assim a sobrevivência ou reduzindo a morte celular da célula do doador transplantado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula doadora é uma célula organoide, uma célula de ilhota, uma célula organoide semelhante a uma ilhota, uma célula de ilhota semelhante a .

3. Método para gerar um organoide semelhante a uma ilhota que evita a detecção imunológica ou autoimunidade, o método caracterizado pelo fato de compreender: cultivar células progenitoras endócrinas em uma matriz tridimensional compreendendo a proteína Wnt4 ou Wnt5a por um tempo suficiente para gerar um organoide multicelular semelhante a uma ilhota compreendendo dois ou mais tipos de células selecionados a partir de células beta (), células alfa (), células delta (), células épsilon () e células semelhantes a dutos; em que o organoide semelhante a uma ilhota secreta insulina em resposta à glicose; e submeter o organoide semelhante a uma ilhota a múltiplas exposições intermitentes ao interferon gama (IFN); induzindo assim a expressão sustentada de uma proteína de ponto de verificação imunológico pelo organoide semelhante a uma ilhota e permitindo que o organoide semelhante a uma ilhota evite a detecção imunológica ou autoimunidade.

4. Método para gerar um organoide semelhante a uma ilhota que evita a detecção imunológica ou autoimunidade, o método caracterizado pelo fato de compreender: cultivar células progenitoras endócrinas que expressam de forma recombinante uma proteína de ponto de verificação imunológico em uma matriz tridimensional que compreende a proteína Wnt4 ou Wnt5a por um tempo suficiente para gerar um organoide semelhante a uma ilhota multicelular compreendendo dois ou mais tipos de células selecionadas a partir de células beta (), células alfa (), células delta (), células épsilon () e células semelhantes a dutos; em que o organoide semelhante a uma ilhota secreta insulina em resposta à glicose e em que o organoide semelhante a uma ilhota evita a detecção imunológica e autoimunidade.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a matriz tridimensional compreende goma gelana.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 5, caracterizado pelo fato de que a matriz tridimensional compreende a proteína Wnt4 humana recombinante.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a expressão recombinante da proteína do ponto de verificação imunológico resulta da transdução de células organoides semelhantes a ilhotas com um vetor contendo um polinucleotídeo que codifica a proteína do ponto de verificação imunológico.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 7, caracterizado pelo fato de que a proteína de ponto de verificação imunológico se liga a um ligante cognato expresso em células imunes selecionado a partir da proteína programada 1 da morte celular (PD-1); proteína T-linfócito citotóxica 4 (CTLA-4); proteína do gene 3 de ativação de linfócitos (LAG-3); receptor tipo imunoglobulina de células assassinas (KIR); indolamina 2,3- dioxigenase 1 (IDO1); membro 9 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (4-1BB); gene relacionado com a família TNFR induzido por glicocorticoides (GITR); domínio de imunoglobulina de células T e domínio de mucina (TIM-3); membro 4 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, (OX40); receptor de adenosina A2A (A2AR); B7-H3; B7-H4; B7-1/B7-2; BTLA; supressor de Ig de domínio V da ativação de células T (VISTA); ou uma combinação de qualquer um dos anteriores.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 8, caracterizado pelo fato de que a proteína de ponto de verificação imunológico é ligante de morte programada-1 (PD-L1).

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula, ilhota, organoide ou organoide semelhante a uma ilhota é exposto a IFN pelo menos duas vezes ao longo de um período de pelo menos dois dias.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula, ilhota, organoide ou organoide semelhante a uma ilhota é exposto a IFN pelo menos três vezes ao longo de um período de pelo menos três dias.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula, ilhota, organoide ou organoide semelhante a uma ilhota é exposto a IFN por mais de uma hora pelo menos duas vezes ao longo de um período de pelo menos dois dias.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula, ilhota, organoide ou organoide semelhante a uma ilhota é exposto a IFN por mais de uma hora pelo menos três vezes ao longo de um período de pelo menos três dias.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13,

caracterizado pelo fato de que a célula, ilhota, organoide ou organoide semelhante a uma ilhota é exposto a IFN por duas horas pelo menos três vezes ao longo de um período de pelo menos três dias.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 14, caracterizado pelo fato de que as células progenitoras endócrinas são selecionadas a partir de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSCs), células-tronco de pluripotência embrionárias (ePSCs) e/ou células progenitoras pancreáticas.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 15, caracterizado pelo fato de que as células progenitoras endócrinas expressam pelo menos um dentre os biomarcadores neurogenina 3, neurod1, Nkx2.2 e Pax4.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 16, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota é um organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO).

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota é vascularizado.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 17, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota compreende ainda uma célula-tronco derivada de tecido adiposo e/ou uma célula endotelial.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco derivada de tecido adiposo é uma célula-tronco derivada de tecido adiposo humano (hADSC) e/ou a célula endotelial é uma célula endotelial de veia umbilical humana (HUVEC).

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 20, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota exibe ainda pelo menos um dentre secreção de insulina estimulada por KCl, secreção de insulina estimulada por GLP-1, secreção de somatostatina, secreção de glucagon.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 21, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota expressa um marcador de linhagem de células beta selecionado a partir do grupo que consiste em NKX2-2, NEUROD1, RFX6, GCK, INS, NKX6-1, UCN3, MAFB e SYT4 e um marcador de linhagem de células alfa ARX.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a matriz tridimensional compreende uma proteína Wnt4 humana, uma proteína Wnt4 humana recombinante, uma proteína Wnt5 humana ou uma proteína Wnt5a humana recombinante.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23,

caracterizado pelo fato de que a matriz tridimensional compreende uma proteína Wnt4 humana recombinante.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 24, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota exibe expressão aumentada de receptor relacionado ao estrogênio gama (ERR).

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 25, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota exibe aumento do metabolismo oxidativo definido pelo aumento da taxa de consumo de oxigênio (OCR) e diminuição da taxa de acidificação celular (ECAR).

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 26, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota é um organoide de ilhota pancreática, um organoide pancreático, um organoide do fígado, um organoide do coração ou um organoide intestinal.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o organoide de ilhota é um organoide de ilhota pancreática humana.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a célula do doador é selecionada a partir de uma célula cardíaca, célula do cólon, célula do rim, célula do fígado (hepatócito), células do esôfago, célula gastrointestinal,

célula gástrica (estômago), célula do pulmão, célula do pâncreas, célula  pancreática, célula muscular, célula hematopoiética, célula B, célula T, células hematopoiéticas

CD34+, célula T receptor de antígeno quimérico (célula CAR-

T), célula da medula óssea, neurônio, célula neuronal,

célula retinal, célula da córnea, célula cerebral, célula  pancreática produtora de insulina derivada de célula de pele humana, célula ovariana, célula cervical, célula testicular, célula mononuclear, células do sangue do cordão umbilical (SCU), células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo (tronco), célula-tronco cardíaca, célula-

tronco do cólon, célula-tronco renal, célula-tronco hepática (hepatócito), célula-tronco gastrointestinal,

célula-tronco gástrica (estômago), célula-tronco pulmonar,

célula-tronco pancreática, célula-tronco pancreática ,

célula-tronco muscular, célula-tronco hematopoiética,

célula-tronco de célula T ou célula B, célula-tronco da medula óssea, células-tronco células hematopoiéticas de

CD133+, CD34+, células-tronco retinais, células-tronco neuronais, células-tronco mesenquimais, células-tronco mesenquimais do cordão umbilical, células neuronais derivadas de ectoderma, célula neuronal dopaminérgica derivada de ectoderma, célula derivada da córnea, célula epitelial da córnea humana normal, célula de precursor neuronal dopaminérgico imortalizado, célula de fígado derivada de endoderme, célula de músculo derivada de mesoderme, célula de medula óssea, célula de rim e célula de músculo esquelético, ou organoides gerados a partir de ou contendo as referidas células; organoides intestinais, organoides hepáticos, organoides colônicos, organoides hepáticos, organoides renais, organoides da bexiga, organoides ovarianos, organoides cervicais, organoides neurais ou organoides pulmonares (pulmão).

30. Método para gerar um organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) que evita a detecção imunológica ou autoimunidade, o método caracterizado pelo fato de compreender: (a) cultivar células progenitoras endócrinas em uma matriz tridimensional compreendendo proteína Wnt4 ou Wnt5a por um tempo suficiente para gerar um organoide semelhante a uma ilhota humana multicelular compreendendo dois ou mais tipos de células selecionadas a partir de células beta (), células alfa (), células delta (), células épsilon () e células semelhantes a dutos; em que o organoide semelhante a uma ilhota humana secreta insulina em resposta à glicose; (b) contactar o HILO da etapa (a) com interferon gama (IFN) duas ou três vezes por mais de uma hora de cada vez ao longo de um período de tempo total de pelo menos 48 a 72 horas; em que as ilhotas humanas ou HILOs são mantidos na ausência de IFN entre os tempos de contato com IFN; e em que as etapas (a) e (b) induzem a expressão sustentada do ligante programada 1 da morte (PD-L1) da proteína do ponto de verificação imunológico no HILO.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o HILO é colocado em contato com IFN por 2 horas na etapa (b).

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que o HILO é contactado com IFN duas vezes por duas horas de cada vez, durante pelo menos 48 horas.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que o HILO é contactado com IFN três vezes por duas horas de cada vez, durante pelo menos 72 horas.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a 33, caracterizado pelo fato de que as células progenitoras endócrinas são selecionadas a partir de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSCs), células-tronco de pluripotência embrionárias (ePSCs) e/ou células progenitoras pancreáticas.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a 34, caracterizado pelo fato de que as células progenitoras endócrinas expressam pelo menos um dentre os biomarcadores neurogenina 3, neurod1, Nkx2.2 e

Pax4.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30 a 35, caracterizado pelo fato de que o HILO é vascularizado e exibe metabolismo oxidativo aumentado definido pelo aumento da taxa de consumo de oxigênio (OCR) e diminuição da taxa de acidificação celular (ECAR).

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 36, caracterizado pelo fato de que IFN é usado em uma quantidade de 1 a 25 ng/ml.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que IFN é usado em uma quantidade de 10 ng/ml.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 36, caracterizado pelo fato de que a expressão de PD-L1 no organoide semelhante a uma ilhota ou HILO é mantida por mais de 7 dias.

40. Célula imunoprotegida, organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática, tendo a expressão sustentada de uma proteína de ponto de verificação imunológico, o referido organoide caracterizado pelo fato de ser produzido pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 39.

41. Organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhotas pancreáticas, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que exibe uma expressão sustentada da proteína de ponto de verificação imunológico PD-L1.

42. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) caracterizado pelo fato de ser derivado de células progenitoras endócrinas cultivadas em uma matriz tridimensional compreendendo proteína Wnt4 ou Wnt5 e compreendendo células multi-linhagem compreendendo pelo menos duas de células beta (), células alfa (), células delta (), células épsilon () e células semelhantes a dutos, em que o HILO é vascularizado, exibe secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) e exibe expressão sustentada de uma proteína de ponto de verificação imunológico.

43. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que é um organoide semelhante a uma ilhota pancreática ou um organoide pancreático.

44. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 ou 43, caracterizado pelo fato de que o organoide exibe ainda secreção de insulina estimulada por KCl ou secreção de insulina estimulada por glicose.

45. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 44,

caracterizado pelo fato de que a matriz tridimensional compreende goma gelana.

46. Organoide semelhante a uma ilhota humanas (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 45, caracterizado pelo fato de que a matriz tridimensional compreende a proteína Wnt4 humana recombinante.

47. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 46, caracterizado pelo fato de que a matriz tridimensional compreende a proteína Wnt5 humana recombinante.

48. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 47, caracterizado pelo fato de que as células progenitoras endócrinas são selecionadas a partir de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSCs), células-tronco de pluripotência embrionárias (ePSCs) e/ou células progenitoras pancreáticas.

49. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 48, caracterizado pelo fato de que as células progenitoras endócrinas expressam pelo menos um dentre os biomarcadores neurogenina 3, neurod1, Nkx2.2 e Pax4.

50. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 49, caracterizado pelo fato de que expressa os genes FLTP e

ESRR gama.

51. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 50, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente uma célula-tronco derivada de tecido adiposo e/ou uma célula endotelial.

52. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco derivada do tecido adiposo é uma célula-tronco derivada de tecido adiposo humano (hADSC) e/ou a célula endotelial é uma célula endotelial de veia umbilical humana (HUVEC).

53. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 52, caracterizado pelo fato de que exibe ainda secreção de insulina estimulada por KCl, secreção de insulina estimulada por GLP-1, secreção de somatostatina ou secreção de glucagon.

54. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a 53, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO) expressa um marcador de linhagem de células beta selecionado a partir do grupo que consiste em NKX2-2, NEUROD1, RFX6, GCK, INS, NKX6-1, UCN3, MAFB e SYT4 e um marcador de linhagem de células alfa ARX.

55. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a 52, caracterizado pelo fato de que o HILO pancreático expressa um fator de transcrição de células beta selecionado a partir do grupo que consiste em Pdx1, MafA, Pax4, Pax6, NeuroD1, Nkx6-1, Gata6 e Foxa2.

56. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO), de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 55, caracterizado pelo fato de que a proteína de verificação imunológica se liga a um ligante cognato expresso em células imunes selecionado da proteína de morte celular programada 1 (PD-1); proteína T-linfócito citotóxica 4 (CTLA-4); proteína do gene 3 de ativação de linfócitos (LAG-3); receptor tipo imunoglobulina de células assassinas (KIR); indolamina 2,3-dioxigenase 1 (IDO1); membro 9 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (4- 1BB); gene relacionado com a família TNFR induzido por glicocorticoides (GITR); domínio de imunoglobulina de células T e domínio de mucina (TIM-3); membro 4 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, (OX40); receptor de adenosina A2A (A2AR); B7-H3; B7-H4; B7- 1/B7-2; BTLA; supressor de Ig de domínio V da ativação de células T (VISTA); ou uma combinação de qualquer um dos anteriores.

57. Organoide semelhante a uma ilhota humana (HILO),

de acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 a 56, caracterizado pelo fato de que a proteína do ponto de verificação imunológico é ligante de morte programada-1 (PD-L1).

58. Organismo não humano caracterizado pelo fato de ser transplantado ou implantado com o organoide semelhante a uma ilhota humana, organoide de ilhota pancreática ou HILO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 42 a 57.

59. Organismo não humano, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o organismo não humano é um mamífero.

60. Organismo não humano, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o organismo não humano é um camundongo.

61. Método de tratamento de uma doença pancreática em um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de compreender transplantar ou implantar um organoide semelhante a uma ilhota imunoprotegida ou um organoide de ilhota pancreática no indivíduo, em que o organoide semelhante a uma ilhota ou um organoide de ilhota pancreática compreende células progenitoras endócrinas, células derivadas de várias linhagens, incluindo células beta, alfa, delta, épsilon, células semelhantes a dutos ou uma combinação das mesmas, são vascularizadas, exibem secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) e exibem expressão sustentada de uma proteína de ponto de verificação imunológico para escapar da detecção do sistema imunológico ou autoimunidade.

62. Método de tratamento de diabetes tipo 1 em um indivíduo, o método caracterizado pelo fato de compreender transplantar ou implantar um organoide semelhante a uma ilhota imunoprotegida ou um organoide de ilhota pancreática no indivíduo, em que o organoide semelhante a uma ilhota ou um organoide de ilhota pancreática compreende células progenitoras endócrinas, células multi-linhagens derivadas, incluindo células beta, alfa, delta, épsilon, células semelhantes a dutos ou uma combinação das mesmas, são vascularizadas, exibem secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) e exibem expressão sustentada de uma proteína de ponto de verificação imunológico para evitar a detecção imunológica ou autoimunidade.

63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota ou organoide de ilhotas pancreáticas exibe ainda secreção de insulina estimulada por KCl, secreção de insulina estimulada por GLP-1, secreção de somatostatina ou secreção de glucagon.

64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 63, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota ou organoide de ilhota pancreática expressa um marcador de linhagem de células beta selecionado a partir do grupo que consiste em NKX2-2, NEUROD1, RFX6, GCK, INS, NKX6-1, UCN3, MAFB e SYT4 e um marcador de linhagem de células alfa ARX.

65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 64, caracterizado pelo fato de que as células progenitoras endócrinas são selecionadas a partir de células-tronco de pluripotência induzidas (iPSCs), células-tronco de pluripotência embrionárias (ePSCs) e/ou células progenitoras pancreáticas.

66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 65, caracterizado pelo fato de que as células progenitoras endócrinas expressam pelo menos um dentre os biomarcadores neurogenina 3, neurod1, Nkx2.2 e Pax4.

67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 66, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota ou organoide de ilhota pancreática expressa um fator de transcrição de células beta selecionado a partir do grupo que consiste em Pdx1, MafA, Pax4, Pax6, NeuroD1, Nkx6-1, Gata6 e Foxa2.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 67, caracterizado pelo fato de que a proteína de ponto de verificação imunológico se liga a um ligante cognato expresso em células imunes selecionado a partir da proteína de morte celular programada 1 (PD-1); proteína T-linfócito citotóxica 4 (CTLA-4); proteína do gene 3 de ativação de linfócitos (LAG-3); receptor tipo imunoglobulina de células assassinas (KIR); indolamina 2,3- dioxigenase 1 (IDO1); membro 9 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (4-1BB); gene relacionado com a família TNFR induzido por glicocorticoides (GITR); domínio de imunoglobulina de células T e domínio de mucina (TIM-3); membro 4 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, (OX40); receptor de adenosina A2A (A2AR); B7-H3; B7-H4; B7-1/B7-2; BTLA; supressor de Ig de domínio V da ativação de células T (VISTA); ou uma combinação de qualquer um dos anteriores.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 68, caracterizado pelo fato de que a proteína de ponto de verificação imunológico é ligante de morte programada-1 (PD-L1).

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 69, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota ou organoide de ilhota pancreática é produzido pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 37.

71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 70, caracterizado pelo fato de que o organoide semelhante a uma ilhota ou organoide de ilhota pancreática é o organoide conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 57.

72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 71, caracterizado pelo fato de que um agente imunossupressor é administrado ao indivíduo.

73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 61 a 72, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano.

74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 ou de 63 a 73, caracterizado pelo fato de que a doença pancreática é diabetes tipo 1 ou diabetes tipo

2.

75. Método de geração de células, ilhotas ou organoides que sobrevivem e têm morte celular reduzida após transplante ou implante, o método caracterizado pelo fato de compreender: (a) contactar células, ilhotas ou organoides que expressam receptor de interferon gama (IFN) com interferon gama (IFN) por pelo menos 0,5 hora ou pelo menos uma hora em um ponto de tempo predeterminado; e (b) repetir a etapa (a) pelo menos cerca de duas vezes durante um período de tempo de cerca de ou igual a pelo menos cerca de 72 horas; em que as células, as ilhotas ou os organoides são mantidos na ausência de IFN entre os momentos de contato com IFN; e em que as etapas (a) e (b) induzem a expressão sustentada de PD-Ll nas células, nas ilhotas ou nos organoides.

76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que as células, as ilhotas, os organoides ou as células são colocadas em contato com IFN por um período de tempo selecionado a partir de pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas ou mais de 2 horas na etapa (a).

77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 ou 76, caracterizado pelo fato de que as células, as ilhotas ou os organoides contactados com IFN por um período de tempo selecionado a partir de cerca de ou igual a 2 horas ou cerca de ou igual a 12 horas na etapa (a).

78, Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 75 a 77, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é repetida pelo menos três vezes por pelo menos cerca de 2 horas de cada vez no período de pelo menos cerca de ou igual a 72 horas na etapa (b).

79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 75 a 78, caracterizado pelo fato de que as células, as ilhotas ou os organoides são lavados para remover a presença de IFN entre a etapa (a) e a etapa (b).

80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 75 a 79, caracterizado pelo fato de que IFN é usado em uma quantidade de 1 a 25 ng/ml.

81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 75 a 79, caracterizado pelo fato de que IFN é usado em uma quantidade de 10 ng/ml.

82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 75 a 81, caracterizado pelo fato de que a expressão de PD-L1 nas células, nas ilhotas ou nos organoides é mantida após a etapa (b) por mais de cerca de 7 dias.

83. Método de geração de células, ilhotas ou organoides e células dos mesmos que evitam a detecção imunológica ou autoimunidade, o método caracterizado pelo fato de compreender: (a) contactar o receptor de interferon gama (IFN) que expressa células, ilhotas ou organoides e as células dos mesmos com interferon gama (IFN) em uma quantidade de cerca de 1 ng/ml a 25 ng/ml por mais de 1 hora em um primeiro ponto no tempo durante um período de tempo de pelo menos cerca de ou igual a 24 horas; e (b) contactar as referidas células, ilhotas ou organoides e as células dos mesmos com IFN em uma quantidade de cerca de 1 ng/ml a 25 ng/ml por mais de cerca de 0,5 horas ou mais em dois ou mais pontos de tempo adicionais durante um período de tempo seguinte de pelo menos cerca de 48 horas após a etapa (a); em que as referidas células, ilhotas ou organoides são lavadas e colocadas em repouso em meio na ausência de IFN entre o contato com IFN; e em que as etapas (a) e (b) induzem a expressão sustentada de PD-Ll nas referidas células, ilhotas ou organoides.

84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que as células, as ilhotas ou os organoides são contactados com IFN em uma quantidade de 10 ng/ml por pelo menos 2 horas na etapa (a) e na etapa (b).

85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 ou 84, caracterizado pelo fato de que as células, as ilhotas ou os organoides são contactados com IFN por pelo menos cerca de 2 horas em 3 pontos de tempo durante um período de 72 horas.

86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou de 75 a 85, caracterizado pelo fato de que as células, as ilhotas ou os organoides são células, ilhotas ou organoides humanos.

87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que os organoides são HILOs ou HILOs humanos.

88. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que as células compreendem células cardíacas, células do cólon, células renais,

células da bexiga, células do fígado (hepatócitos), células do esôfago, células gastrointestinais, células gástricas

(estômago), células do pulmão, células do ovário, células do colo do útero, células uterinas, células testiculares,

células pancreáticas, células  pancreáticas, células retinais, células da córnea, células cerebrais, células musculares, células hematopoiéticas, células imunes

(células B, células T), células T receptoras de antígenos quiméricos (células CAR-T), células da medula óssea,

células mononucleares, neurônios, células neuronais,

células  pancreáticas produtoras de insulina derivadas de células da pele humana, células do sangue do cordão umbilical (SCU), células do estroma mesenquimal (tronco)

derivadas de tecido adiposo, células-tronco cardíacas,

células-tronco do cólon, células-tronco renais, células-

tronco hepáticas (hepatócitos), células-tronco gastrointestinais, células-tronco gástricas, células-tronco pulmonares, células-tronco pancreáticas, células-tronco  pancreáticas, células-tronco musculares, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco de células imunes (células

T ou B), células-tronco de medula óssea, células-tronco

CD133+, células hematopoiéticas CD34+, células-tronco hematopoiéticas CD34+, células-tronco mesenquimais,

células-tronco mesenquimais do cordão umbilical, células-

tronco retinais, células-tronco neuronais, células neuronais derivadas de ectoderma, células precursoras neuronais dopaminérgicas imortalizadas e organoides gerados a partir de ou contendo as referidas células.

89. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que os organoides compreendem organoides cardíacos, organoides intestinais/ gastrointestinais, organoides do cólon, organoides hepáticos, organoides renais, organoides da bexiga, organoides ovarianos, organoides cervicais, organoides neurais ou organoides pulmonares (pulmão).

90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou de 75 a 87, caracterizado pelo fato de que as ilhotas são ilhotas de cadáveres humanos que são protegidas da destruição ou eliminação por células do sistema imunológico.

91. Método de transplante de células, o método caracterizado pelo fato de compreender administrar a um indivíduo com necessidade de uma célula imunoprotegida, organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhotas pancreáticas, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 57.

92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que a célula imunoprotegida, organoide de ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática é singênica, autóloga, alogênica ou xenogênica.

93. Kit caracterizado pelo fato de compreender uma célula imunoprotegida, organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 40 a 57, ou uma composição farmaceuticamente aceitável que compreende a referida célula imunoprotegida, organoide semelhante a uma ilhota humana ou organoide de ilhota pancreática.