JP2004511209A - 細胞の脱分化及び組織の再生のための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の背景
本発明は、細胞の脱分化及び組織の再生を促進する組成物を志向する。それは又、細胞の脱分化、増殖及び再生の方法をも志向する。
【0002】
Morgan(Morgan、1901)は、用語真再生を造り出して、細胞増殖が新たな解剖学的構造の発生に先行する再生過程に言及した。成体の有尾目の両生類例えばイモリ又はアホロートルは、その四肢、尾、上顎及び下顎、網膜、眼のレンズ、背部の突起(crest)、脊髄及び心臓の心室を再生することができることが知られている(Becker等、1974;Brockes、1997;Davis等、1990)が、硬骨魚類例えばDanio rerio(ゼブラフィッシュ)は、ひれ及び脊髄を再生させることが知られている(Johnson及びWeston、1995;Zottoli等、1994)。棘皮動物及び甲殻類が再生できることはありそうなことである。肝臓を除けば、哺乳動物例えばヒトは、この著しい再生能力を欠いている。
【0003】
哺乳動物は、典型的には、損傷を(外傷からのものであっても、退行性疾患によるものであっても)、失われた組織を瘢痕組織で置き換えることにより治癒する。傷の治癒(組織の再生とは異なる)は、瘢痕組織を生じるが、これは、組織の保全性と強度の性質を除いては、それが置き換わった細胞型の特定の機能を何ら有しない。例えば、心臓の損傷(心臓発作によるものなど)は、心筋死を生じる。新しい心筋が、死んだ細胞に置き換わるのではなく、瘢痕組織が形成される。今や失われた細胞によりかつて担われていた収縮の負担が、周辺領域に移り、そうして、存在している細胞の作業負荷が増大する。最適な心臓の動作のためには、死んだ組織は心臓の細胞により置き換わることが必要である。
【0004】
真再生性の再生を制御する分子的及び細胞機構は、不完全に定義されている。この過程における第一段階は、傷の上皮の形成であり、これは、切断後の最初の24時間以内に起きる。第二段階は、切断面に近い細胞の脱分化を含む。これらの細胞は、増殖して、再生芽として知られる多能性細胞塊を形成し、これは、最終的に再分化して失われた構造を形成する。細胞の脱分化がイモリにおいて示されているにもかかわらず、最終分化した哺乳動物細胞は、分化過程を逆行できないと考えられている(Andres及びWalsh、1996;Walsh及びPerlman、1997)。幾つかの機構が、哺乳動物細胞における細胞可塑性の欠如を説明できよう:(1)脱分化を開始する細胞外因子が切断後に十分発現されない;(2)脱分化のための固有の細胞性シグナリング経路が存在しない;(3)分化因子が、哺乳動物細胞において不可逆的に発現される;及び(4)哺乳動物細胞の構造的特徴が、脱分化を不可能にする。
【0005】
分化しても、イモリの筋管は、G0/G1状態に固定されておらず(Hay及びFischman、1961;Tanaka等、1997)、従って、脱分化することができる。対照的に、哺乳動物の骨格筋細胞は、最終分化していると考えられている(Andres及びWalsh、1996;Walsh及びPerlman、1997)。正常な(トランスフォームされおらず、腫瘍形成性でない)哺乳動物の筋管は、細胞周期に再び入るか脱分化することが、イン・ビトロでもイン・ビボでも認められていない。対照的に、腫瘍形成性の哺乳動物細胞は、細胞周期に再入して増殖することが認められている(Endo及びNadal−Ginard、1989;Endo及びNadal−Ginard、1998;Iujvidin等、1990;Novitch等、1996;Schneider等、1994;Tiainen等、1996)。しかしながら、これらの細胞は、異常であり、再生に参加することはできない。腫瘍形成性でない哺乳動物細胞を脱分化させる能力は、長い間求められてきたゴールであり、それを本発明が達成するものである。
【0006】
失われた組織、器官及び付属肢の代用となる人工臓器、臓器移植、プロテーゼ及び他の手段が、これらの問題に苦しむ多くの人々の生活の質を改善してきたが、これらの方法のすべては、合併症と高いコストに悩まされている。例えば、組織及び臓器移植を受けるだけ十分に幸運な者には、移植物を生かしておくために高価な抗拒絶薬を投与しなければならない。それらの高価なことに加えて、プロテーゼは、失われた付属肢の完全な機能に取って代わることはできないという欠点を有する。
【0007】
加えて、現在のバイオが媒介する組織及び器官の置換技術は又、重大な不都合をも被っている。ティシューエンジニアリングは、細胞を生体材料基材上でイン・ビトロで培養してから個体(哺乳動物、好ましくはヒト患者)に移植することによって組織を置き換えるアプローチであるが、コスト、時間に妨げられており、その結果は、それが置き換わった組織の固有の機能と形態のすべてを有してはいない構造である。同じ様に、エキス・ビボで幹細胞を利用するアプローチは、同様に、時間に妨げられており、該アプローチでは、幹細胞を骨髄又は中絶胎児から精製しなければならず(限られた起源と取り締まり的抵抗の代表でもある)、イン・ビトロで操作してから、それらの細胞を個体の損傷部位に導入しなければならない。
【0008】
本発明は、エキス・ビボ及びイン・ビトロのアプローチを回避し、並びに宿主の組織に似た組織の再生を可能にする。再生は、損傷部位での、細胞のイン・ビボでの脱分化、幹細胞の生成、及びその後の幹細胞の、宿主組織又は臓器の細胞及び構造への再分化又は新たな分化によって起きる。かかるアプローチは、広範囲の応用を有している。
【0009】
発明の簡単な概要
この発明は、細胞をイン・ビボ及びイン・ビトロで脱分化させるための組成物及び方法を提供する。この発明は又、細胞、組織及び器官をイン・ビボ及びイン・ビトロで再生させるための組成物及び方法をも提供する。本発明者は、今般、イモリの抽出物並びにそれから精製した化合物を用いて、この目的及び他の本願で議論する目的を達成することができるということを発見した。
【0010】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞を脱分化させるための方法及び組成物を提供する。分化の運命が決定されていると以前に考えられたにもかかわらず、分化した細胞は、脱分化させることができる。ある具体例においては、この発明の組成物は、ポリペプチド、核酸又はそれらの組合せを含むが、これらに限られない。脱分化は、イン・ビトロ、イン・ビボ及びエキス・ビボで達成することができる。
【0011】
再生用抽出物(RE;再生する任意の動物好ましくはイモリの抽出物をいい、最も好ましくはRNLE、hRNLE及びRNLE精製成分をいう)、成長因子(GF)、及びmsx1は、集合的に、再生/脱分化因子又はRDFと呼ばれる。
【0012】
I.具体例
以下の具体例を、この発明を実施する様々な方法の例として与える。多くの異なるバージョンが、直ちに、この発明の属する様々な分野の当業者には明らかとなろう。
【0013】
A.イン・ビボ
この発明の組成物は、細胞を脱分化させるために、イン・ビボで用いることができる。外傷によるものでも病気によるものであっても、損傷の部位での細胞の脱分化は、細胞、組織及び器官の再生の初期のステップである。この発明の方法及び組成物により脱分化された細胞は、幹細胞に似るように発生経路を後戻りして、多能性になり、全能性にさえなった。
【0014】
再生中のイモリの肢の抽出物(RNLE)又はその精製した因子を、損傷部位に、損傷後のある時点で又は損傷後速やかに適用する。幾つかの場合には、これらの組成物は、損傷に、瘢痕組織による治癒の後に適用することができ;かかる事例では、その組織を再損傷して細胞の脱分化を再開させることが望ましい。幾つかの場合には、これらの組成物の様々な成分を、順次的に適用して脱分化を増進させることができる。REは、製薬分野で公知の任意の方法によって、損傷部位に送達することができ;適用は、連続的でも、瞬間的でもよく、又は脱分化中に時間経過に伴って再度適用してもよい。REは、障害を受けた細胞、組織又は器官を再生させるために利用することができる。
【0015】
成長因子(GF)も又、損傷部位に適用して、細胞の脱分化を誘導することができる。ときには、一種類の成長因子のみを適用することができ;又は一度に幾つかを適用するのが一層有利でありえよう。GFは、損傷時に、損傷の後であるが瘢痕組織形成の開始前に;又は損傷が治癒した後に(この場合には、傷害を受けた組織又は瘢痕組織を除去して、損傷をデ・ノボで負わせてから成長因子を適用する)、損傷部位に適用することができる。GFは、製薬分野で公知の任意の方法にて送達することができ;適用は、連続的でも、瞬間的でもよく、又は脱分化中に時間経過と共に再度適用することができる。損傷は、病気により又は外傷により引き起こされるものであってよい。繊維芽細胞成長因子(Fgf)のファミリー由来のGFが、幾つかの事例においては、好適である。GFを用いて、傷害を受けた細胞、組織又は器官を再生させることができる。
【0016】
細胞内成分もまた、イン・ビボで損傷部位に適用して、細胞を脱分化させることができる(例えば、遺伝子msx1、そのポリペプチド産物又は、細胞による取り込みが誘導されるようにしたmsx1ポリペプチド融合体)。Msx1を、損傷時に、損傷後であるが瘢痕組織形成の前に、又は治癒した損傷部位に適用することができる(最後の事例では、組織を再損傷させてからmsx1を適用することができる)。Msx1は、製薬分野で公知の任意の方法にて適用することができ;適用は、連続的でも、瞬間的でもよく、又は脱分化中に時間経過に伴って再度適用することができる。この損傷は、病気によるものであっても外傷によるものであってもよい。Msx1は、傷害を受けた細胞、組織又は器官を再生させるために利用することができる。
【0017】
幾つかの事例においては、RE、GF及びmsx1の組み合わせが、好適である。他の事例においては、様々な成分のシーケンスが有利であり;例えば、REの適用が先ず望ましく、その後、GF及び/又はmsx1を適用する。
【0018】
B.エキス・ビボ/イン・ビトロ
病気又は外傷により生じた損傷を修復するために、この発明の組成物及び方法を、分化した細胞を損傷した患者から取り出し、培養にて脱分化させ、次いで、冒された個体の損傷部位に導入するか又は、培養したままで、脱分化した細胞を操作して特定の分化経路に従わせてからその個体に再導入する手順に適用することができる。分化経路は、含脂肪細胞、軟骨細胞、骨形成原細胞及び筋細胞を含むが、これらに限られない。
【0019】
細胞は、所望の細胞の位置に適当である医療分野で公知の任意の方法によって患者から取り出すことができる。次いで、細胞をイン・ビトロで培養し、そこでそれらを、この発明の任意の方法及び組成物(RDFの成分を適用することを含む)を利用して脱分化させることができる。この分野で公知の任意の細胞培養法を利用することができ、もし公知でなければ、当業者は、容易に適当な培養条件を決定することができる。所望であれば、これらの細胞を、拡張してから、冒された個体の損傷部位に再導入することができる。損傷は、新しいものでも、瘢痕組織の形成過程にあっても、又は治癒したものであってもよい。最後の事例では、損傷部位を、再度損傷させて再生に有利な環境を造ることができる。これらの細胞は、医療分野で公知で且つ損傷の位置に適当であって送達すべき細胞に適当である任意の方法によって損傷部位に送達することができる。
【0020】
C.特定の具体例
1.再生中のイモリの肢の抽出物を利用する細胞の脱分化
イモリの肢の再生の脱分化ステージ中に、分裂した筋細胞の生成物は、切断面近くで、再生芽の形成に有意に寄与する。脱分化した筋細胞は、細胞周期に再入して活発にタンパク質を合成する(すべて、切断後の第一週中)。筋芽細胞は、単核の骨格筋細胞であって、成長因子の存在下で培養すると増殖する。これらの細胞は、筋肉調節因子myoD及び/又はmyf−5の発現によって筋原性系列に決定される。集密的にまで成長して成長因子を奪われたならば、これらの筋細胞は、最終分化経路に入って、継続的に幾つかの筋分化因子を発現し始める。これらには、ミオゲニン、cdkインヒビターp21/WAF1、活性化網膜芽細胞腫タンパク質及び筋収縮タンパク質(例えば、ミオシン重鎖及びトロポニンT)が含まれる。これらの分化しつつある細胞は、それらの軸に沿って整列し、融合して最終分化した筋収縮しうる筋管を形成する。
【0021】
イモリの再生初期の肢組織(0〜5日目)からのタンパク質抽出物、RNLEは、培養において、イモリとマウスの筋管の脱分化を誘導した。従って、哺乳動物(マウス)の筋管は、再生中のイモリの肢から受けた脱分化シグナルに応答して脱分化することができる。従って、本発明は、哺乳動物組織を脱分化させるための組成物であって、イモリの組織から抽出された少なくとも一種のタンパク質を含む当該組成物を提供する。それ故、RNLE抽出物を用いて、例えば、ヒトからの組織を脱分化させることができる。RNLE抽出物は、イン・ビボで適用することができ、又はイン・ビトロで細胞に適用することができる。
【0022】
2.msx1の細胞を脱分化させるための利用
Msx1は、ホメオボックス含有転写リプレッサーである。Msx1は、初期再生芽において発現され(Simon等、1995)、発生中のマウスの肢におけるその発現は、未分化細胞(msx1が発現する)と分化中の細胞(msx1は発現しない)との間の境界を画定する(Hill等、1989;Robert等、1989;Simon等、1995)。その上、マウス又はヒトのmsx1の異所的発現は、培養マウス細胞において、イン・ビトロで筋発生を阻害する(Song等、1992;Woloshin等、1995)。
【0023】
msx1の発現により細胞を脱分化させる方法を提供する。マウスmsx1のヌクレオチド配列を、表1に与え(SEQ ID NO:1);SEQ ID NO:1によりコードされるポリペプチドを、表2(SEQ ID NO:2)に与える。本発明は、成長培地と異所的msx1発現との組合せ効果が、マウスのC2C12筋管の、増殖する多能性幹細胞への脱分化を引き起こすことができ、該細胞は、軟骨細胞、含脂肪細胞、骨形成原細胞及び筋管を含む種々の細胞型に再分化することができることを示す。従って、最終分化した哺乳動物細胞は、ここで提出するように、それらの対応する有尾目の両生類の細胞と同様に、適当なシグナルでチャレンジされた場合には多能性幹細胞へと脱分化することができる。Msx1及びmsx1類似体を、例えば、ヒトの細胞にイン・ビボ及びイン・ビトロで適用して、細胞の脱分化を誘導することができる。
【0024】
【表1】
【0025】
【表2】
【0026】
3.繊維芽細胞成長因子の、組織再生を促進するための利用
この発明は、ここで、Fgfシグナリングが、再生を媒介することができることを示す。Fgfは、Fgfレセプター(Fgfr)に結合するが、哺乳動物の傷の治癒及び腫瘍の血管形成に関与し、胚発生において、肢、歯、脳及び心臓の器官形成における誘導及び/又はパターン形成を含む多くの役割を有している。
【0027】
Fgfシグナリング経路のメンバーは、再生芽形成中及び伸出ステージにおいて、表皮並びに間充織で発現される。本発明者は、ゼブラフィッシュのひれの再生中のFgfシグナリングの機能を、Fgfr1の特異的な薬理学的阻害剤を用いて試験した。この薬剤の利用は、再生芽細胞の誘導及び維持におけるFgfシグナリングの明確な必要性を示し、再生体のパターニングにおける更なる役割を示唆した。従って、Fgf及び類似の因子を用いて、細胞を脱分化させ、ヒトを含む哺乳動物において組織を再生させることができる。
【0028】
4.幹細胞のイン・ビトロでの生成
一具体例において、この発明は、イン・ビトロで幹細胞を樹立する方法を提供する。かかる幹細胞は、例えば、個体又は組織培養細胞株から提供された細胞から脱分化される。脱分化は、RDFの成分を適用することにより達成することができる。これらの幹細胞は、次いで、イン・ビトロ操作により、又は個体に再移植することによって、下流の種々の分化経路に向かわせることができる。
【0029】
他の具体例において、この発明は、多能性細胞をイン・ビトロで樹立する方法を提供する。かかる多能性細胞は、例えば患者から又は組織培養細胞株から提供された細胞から導かれる。多能性は、RDF成分を適用して細胞に脱分化を引き起こして多能性特性を獲得することによって達成することができる。かかる細胞を、次いで、イン・ビトロ操作によって下流の種々の分化経路に向かわせてから患者に移植することができ、又は直接患者に移植することによって下流の種々の分化経路に向かわせることができる。
【0030】
他の具体例において、この発明は、筋肉由来の細胞を、これらの細胞が幹細胞又は多能性細胞に似るように分化させる方法を提供する。他の具体例において、これらの細胞は、含脂肪細胞、軟骨細胞、筋管又は骨芽細胞などの他の分化経路に進ませることができる。
【0031】
5.RDFの利用
REの利用は、損傷した細胞、組織又は器官を再生させる。損傷部位において、REを適用することができ、イモリにおいて見られる再生におけるステップを繰り返す。同様に、msx1及び/又はFgfを用いて、損傷部位で細胞を脱分化させて、細胞、組織又は器官の再生を促進することができる。例えば、損傷した組織は、哺乳動物のものであってよく;哺乳動物は、ヒトであってよく且つ損傷部位は、外傷又は病気の結果であってよい。
【0032】
再生療法により恩恵を受けるであろう退行性疾患及び他の医学的状態には、次のものが含まれるが、これらに限られない:アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患、閉塞性血管病、心筋梗塞、拡張型心筋症、心不全、心筋壊死、心臓弁膜症、僧帽弁逸脱、僧帽弁逆流、僧帽弁狭窄、大動脈弁狭窄及び大動脈弁逆流、頚動脈狭窄、大腿動脈狭窄、発作、跛行、及び動脈瘤;癌関連状態、例えば、癌又は癌治療の結果生じた構造的欠陥;癌例えば乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、皮膚癌、脳腫瘍及び尿生殖器癌(これらに限らない);皮膚疾患例えば乾癬;関節の病気例えば退行性関節疾患、リウマチ様関節炎、関節炎、骨関節症、骨粗鬆症及び強直性脊椎炎;眼に関連する退行変性例えば白内障、網膜及び黄斑変性(例えば、成人発症型黄斑変性)、色素性網膜炎及びシュタルガルト病;耳に関連する退行変性例えば聴力損失;肺関連疾患例えば慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性繊維症、間質性肺疾患、肺気腫;代謝異常例えば糖尿病;尿生殖器障害例えば腎不全及び糸球体腎障害;神経病学的疾患例えば痴呆、アルツハイマー病、血管性痴呆症及び脳卒中;及び内分泌疾患例えば甲状腺機能低下症。最後に、この発明の方法及び組成物に由来する再生療法は、例えば皮膚、骨、関節、眼、首、脊柱及び脳に対する外傷(通常、瘢痕形成を生じる損傷を生じるもの)に非常に有用であり且つ恩恵を与えることができる。
【0033】
イモリで見られる肢の再生に加えて、イモリのように、哺乳動物の他の構造例えば皮膚、骨、関節、眼(上皮、網膜、レンズ)、肺、心臓、血管及び他の脈管構造、腎臓、膵臓、生殖器及び神経組織(脳卒中、脊髄損傷)は、再生することができることが予測される。
【0034】
II.定義
別途規定しない限り、すべての技術及び科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味を有する。
【0035】
ここでは、命名法に関係した Demerec等、1966 の推奨を適合させる。遺伝子(及び関連核酸)とそれらがコードするタンパク質とを区別するために、遺伝子の略号は、イタリックで示し(又は、下線を引き)、タンパク質の略号は、イタリックにしない。従って、msx1又はmsx1は、ホメオボックスmsh1様(msx1)ポリペプチドをコードするホメオボックスmsh1様(msx1)ヌクレオチド配列を指す。
【0036】
分子に関して「単離された」は、同定され且つその天然環境の成分から分離され且つ/又は回収された分子を意味する。その天然環境の夾雑成分は、診断又は治療用途を邪魔する物質である。
【0037】
「真再生」は、細胞増殖が、新しい解剖学的構造の発生;失われ又は損傷を受けた部分の再生又は再構成に先行する過程(新生)をいう。再生は、胚発生を繰り返すことができるが、それは、変質形成(一つの分化した細胞型の他の型へのトランスフォーメーション)をも包含することができる。
【0038】
「全能性」である細胞は、任意の細胞型に分化することができ、そうして、新しい器官を形成し又は生物の任意の部分を再生することのできるものである。
【0039】
「多能性」細胞は、固定されてない分化経路を有し、従って、様々な特殊なタイプの組織要素(例えば、含脂肪細胞、軟骨細胞、筋細胞又は破骨細胞)に分化することのできるものである。多能性細胞は、それらが他の細胞型に発生することができる点において全能性細胞に似ているが、様々な多能性細胞は、進むことのできる発生経路の数が限られている。
【0040】
「マーカー」を用いて、細胞の分化状態を測定する。マーカーは、形態学的に又は生化学的(酵素的)に、特定の細胞型に特徴的であり、又はその細胞型により発現される分子に特徴的である。好ましくは、かかるマーカーは、タンパク質であり、一層好ましくは、当分野で利用可能な抗体その他の結合性分子に対するエピトープを有する。しかしながら、マーカーは、細胞中で見出される、タンパク質(ペプチド及びポリペプチド)、脂質、多糖類、核酸及びステロイドを含む任意の分子からなってよい(これらに限られない)。
【0041】
マーカーは、当業者が利用可能な任意の方法によって検出することができる。マーカー分子上の少なくとも1つのエピトープを認識して結合する抗体(及び、すべての抗体誘導体)に加えて、マーカーは、分析的技術を利用して検出することができ、例えば、タンパク質ドットブロット、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動(SDS−PAGE)又は他の任意のタンパク質を分離するゲルシステム及びその後のマーカーの可視化(ウエスタンブロットなど)、ゲル濾過、アフィニティーカラム精製によって;形態学適に、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)、マーカー分子と特異的な反応を有する染料(例えば、ルテニウムレッド及び細胞外マトリクス分子)による染色、特異的な形態学的特徴(例えば、上皮における微絨毛の存在、又は移動細胞例えば繊維芽細胞及び間充織における偽足/糸状偽足)により;及び生化学的に、例えば、酵素による生成物又は中間体、又は細胞の全体的組成、例えばタンパク質の脂質に対する比、又は脂質の糖質に対する比、又は2つの特定の脂質の相互の比又は多糖類に対する比をアッセイすることによって検出することができる。核酸マーカーの場合には、任意の公知の方法を利用することができる。かかるマーカーが核酸であれば、PCR、RT−PCR、イン・シトゥーハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、サザーンブロットなどを、適当な検出方法と結合させて利用することができる。
【0042】
任意の事例において(又は、一層普通に)、マーカーの組合せは、細胞型に対する特異性を示すであろう。例えば、筋原繊維は、単に筋細胞の特徴であり;軸索は、神経組織に所属し、カドヘリンは、上皮に典型的であり、β2−インテグリンは、免疫系の白血球細胞に、そして高脂質含量は、乏突起神経膠細胞に特徴的であり、脂質液滴は、含脂肪細胞に独特のものである。前述の一覧は、非制限的例の提供を意味するものである。
【0043】
「分化」は、元の細胞型と異なる少なくとも一つの特徴又は機能を獲得し又は有することをいう。分化した細胞は、周囲の構造又は前駆細胞と(たとえ同様の細胞でも)異なる特徴又は機能を有するものである。分化は、限られた細胞のセット(例えば、脊椎動物では、胚の3つの胚葉:外胚葉、中胚葉及び内胚葉)から細胞の多様性を生じさせて、個体を構成する多くの特殊な細胞型のすべてを造り出す。
【0044】
分化は、細胞が特殊化した表現型を呈するようになる、即ち、他の細胞型と異なる少なくとも一つの特徴又は機能を獲得する発生過程である。殆どの使用において、分化した表現型は、何れかの発生経路の成熟終了点にある細胞表現型をいう。多くの(すべてではない)組織において、分化過程は、細胞周期から出ることと結合しており、幾つかの場合には、それらの細胞は、増殖能を失い又は大幅に制限される。
【0045】
「脱分化」は、細胞が、発生の時間を「後戻り」して、その先祖の細胞に似る過程をいう。脱分化の例は、負傷して治癒する際に、上皮細胞の特徴が一時的に失われることである。脱分化は、種々の程度に起こりうるものであり:前述の傷の治癒の例では、脱分化は、細胞が認識できる上皮に再分化する少し前まで進んだだけである。大いに脱分化した細胞は、例えば、分化した細胞を生じさせることのできる幹細胞に似ているものである。
【0046】
「筋細胞」は、それらの主要な役割である収縮により特徴付けられる。筋細胞は、通常、イン・ビボで、伸長して、平行に整列されている。筋細胞の収縮に関係する主要な構成要素は、筋フィラメントである。次の2つの種類の筋フィラメントを区別することができる:(1)主としてアクチンよりなるもの、及び(2)主としてミオシンよりなるもの。アクチンとミオシンは、多くの他の細胞型においても見出され、それらの細胞(又はその部分)が動くことを可能にしているが、筋細胞は、莫大な数の整列された収縮用フィラメントを有していて、それらを利用して機械的仕事を遂行する。
【0047】
筋組織は、概観と収縮性細胞の配置に基づいて次の2つの主要なクラスに分類することができる:(1)横縞を含む横紋筋、及び(2)横縞を含まない平滑筋。横紋筋は、更に、骨格筋と心筋に細分類することができる。
【0048】
「骨格筋」組織は、イン・ビボで、平行な横紋筋細胞よりなり、結合組織により包まれている。横紋筋細胞も又、繊維と呼ばれる。骨格筋は、通常、長くて、多核であり、横縞を示す。ときには、それらの繊維に、骨格筋細胞より遥かに小さい外套細胞が結合している。
【0049】
「心筋」は、骨格筋のように横縞を有する長い繊維よりなる。これらの横縞に加えて、心筋は、骨格筋には存在しない特殊な横縞、横線をも含んでいる。筋繊維が単一の多核原形質単位である骨格筋とはやはり異なって、心筋では、その繊維は、エンド・トゥー・エンドで整列された単核(ときに、二核)細胞からなっている。心筋細胞は、しばしば、網状交差連絡し、多くの大きいミトコンドリアを含んでいる。通常、損傷を受けた心筋は、繊維性の結合組織で置き換わられ、心筋では置き換わられない。
【0050】
「平滑筋」は、20〜200μM長の紡錘状細胞よりなり、イン・ビボでは、中央部分で最も太く両端が先細になっている。平滑筋細胞は、ミクロフィラメントを有し、それらは、横紋筋の規則正しい準結晶様式では、配置されていない。これらの細胞は、多くの飲小胞を含み、サクロプラズミック・レティキュラム、隔離カルシウムを有する。平滑筋細胞は、ギャップ結合(又は、ネクサス)を介して互いに接触する。幾らかの平滑筋細胞例えば子宮で見出されるものは分裂することができるが、再生能は、限られており、ダメージを受けた領域は、通常、瘢痕形成により修復される。
【0051】
他の「収縮性細胞」には、筋線維芽細胞、筋上皮細胞、精巣筋様細胞、神経周膜細胞が含まれる(もっとも、通常、これらは、解剖学的に筋細胞に分類されない)。
【0052】
「幹細胞」は、娘細胞が他の細胞型に分化しうる任意の前駆細胞をいう。一般に、幹細胞は、大量増殖して、更なる幹細胞を生成すること(自己再生)並びに更に分化した子孫を生成することができる細胞である。従って、単一の幹細胞は、数百万の分化した細胞並びに少数の幹細胞を含むクローンを生成することができる。幹細胞は、それにより、長期間にわたる組織前駆体の継続的増殖を可能にする。哺乳動物造血幹細胞は、骨髄に移動し、その動物の生存期間にわたって、そこに居続ける。同様に、表皮及び精子のように連続的に再生される組織の幹細胞がある。骨格筋の幹細胞などの幾らかの幹細胞は、おそらく、胎児の発生中に存在している(Gilbert、1991)。
【0053】
幹細胞は、非対称的に分裂して、一方の娘細胞は、幹細胞状態を維持し、他方の娘細胞は、幾らか異なる他の特異的機能及び表現型を発現することができる。或は、集団中の幹細胞の幾らかが、対称的に2つの幹細胞に分裂し、そうして、集団中の幾らかの幹細胞は全部維持され、他の細胞は分化した子孫のみにすることができる。外見上、幹細胞として開始した細胞は、分化した表現型に向かって進み、次いで、「逆転」して幹細胞表現型を再発現することが可能である。
【0054】
奇形癌も又、胎生癌細胞と呼ばれる幹細胞を含んでいる。分裂可能であれば、それらは、消化管及び気道上皮、筋肉、神経、軟骨及び骨を含む広範囲の組織へと分化することができる(Gilbert、1991)。
【0055】
幹細胞と同様に、「前駆細胞」として開始した細胞は、分化した表現型に向かって進むが、次いで、「逆転」して前駆細胞表現型を再発現することができる。前駆細胞は、分化した細胞より一層原始的な細胞表現型を有しており;これらの細胞は、発生経路に沿って一層初期のステップにいるか又は完全に分化した細胞より一層初期の発達段階にいる。しばしば、前駆細胞は、有意の又は非常に高い潜在的増殖能力をも有している。前駆細胞は、発生経路に依り及び細胞が発生して分化する環境に依って、多くの異なる分化した細胞型又は単一の分化した細胞型を生じさせることができる。
【0056】
「増殖」は、細胞分裂による集団中の細胞数の増加(成長)をいう。細胞増殖は、多数のシグナル変換経路の共同作用的活性化から生じ、しばしば成長因子及び有糸分裂誘起物質に応答して生じる。細胞増殖は、細胞が、細胞内又は細胞外シグナルの作用及び細胞増殖をブロックし又はダウンレギュレートする機構から開放された場合にも促進されうる。
【0057】
「制御配列」は、操作可能に結合されたコード配列の特定の宿主生物における発現を可能にするDNA配列である。原核生物の制御配列には、プロモーター、オペレーター配列及びリボソーム結合部位が含まれる。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用する。
【0058】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係に位置された場合には、「操作可能に結合され」ている。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、もしそれが、コード配列の転写に影響を及ぼすならば、該コード配列に操作可能に結合されており、又はリボソーム結合部位は、もしそれが、翻訳を促進するように位置されているならば、コード配列に操作可能に結合されている。一般に、「操作可能に結合された」は、結合されたDNA配列が隣接していること、及び分泌リーダーの場合には隣接し且つ読み取りフェーズであることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。結合は、慣用の組換えDNA方法によって達成される。
【0059】
「単離された核酸」分子は、それが天然において見出される環境から精製され、少なくとも一つの夾雑核酸分子から分離されている。単離されたmsx1分子は、細胞中に存在している特異的msx1分子から区別される。しかしながら、単離されたmsx1分子は、通常msx1を発現している細胞に含まれるmsx1分子を含み、例えば、この核酸分子は、天然の細胞と異なる染色体上の位置にある。
【0060】
分子が「精製ポリペプチド」である場合には、そのポリペプチドを、(1)シーケネーターを用いて、少なくとも15残基のN末端又は内部アミノ酸配列を得るまで、又は(2)非還元条件下若しくは還元条件下でのクーマシーブルー若しくは銀染色を用いるSDS−PAGEによる均質性まで精製する。単離されたポリペプチドには、遺伝子工学処理された細胞において不均質に発現されたもの、又はイン・ビトロで発現されたものが含まれる(msx1自然環境の少なくとも一つの成分は存在しないので)。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも一つの精製ステップによって調製する。
【0061】
ポリペプチド又はポリペプチド断片は、ネイティブな又は天然のポリペプチドの生物学的及び/又は免疫学的活性を保持している。免疫学的活性は、ネイティブなポリペプチドに保持される抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力をいい;生物学的活性は、免疫学的活性を除くネイティブなmsx1により引き起こされる機能(阻害又は刺激機能)をいう。msx1の生物学的活性には、例えば、細胞分化の調節が含まれる。
【0062】
核酸配列又はアミノ酸配列の「誘導体」は、ネイティブな化合物から、直接、又は改変若しくは部分的置換によって形成される。「類似体」は、ネイティブ化合物に類似する(同じではない)構造を有するが、ある構成成分又は側鎖に関して異なっている核酸配列又はアミノ酸配列である。類似体は、合成のものであっても異なる進化的起源からのものであってもよく、野生型と比較して類似の又は反対の代謝的活性を有していてよい。同族体は、異なる種に由来する特定の遺伝子の核酸配列又はアミノ酸配列である。
【0063】
誘導体及び類似体は、上記のような改変された核酸又はアミノ酸を含むならば、完全長であっても完全長でなくてもよい。この発明の核酸又はタンパク質の誘導体又は類似体には、この発明の核酸又はタンパク質に実質的に相同な領域{様々な具体例において、同じサイズの核酸又はアミノ酸配列上で、又は整列させた配列(整列は、当分野で公知のコンピューターホモロジープログラムによって行う)と比較した場合に、少なくとも約70%、80%又は95%同一性(好ましくは、80〜95%同一性)、又はそのコードする核酸は、前述のタンパク質をコードする配列の相補鎖とストリンジェントな、中位にストリンジェントな又は低いストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる}を含む分子が含まれるが、これらに限られない(Ausubel等、1987)。
【0064】
「相同核酸配列」又は「相同アミノ酸配列」又はこれらの変異物は、上記の核酸レベル又はアミノ酸レベルでの相同性により特徴付けられる配列をいう。相同ヌクレオチド配列は、msx1のイソ型をコードする配列をコードする。イソ型は、例えば、RNAの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織で発現されうる。或は、異なる遺伝子は、イソ型をコードすることができる。相同ヌクレオチド配列には、他の種(脊椎動物、従って、例えば、ヒト、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ及びその他の生物を含むが、これらに限らない)のmsx1をコードするヌクレオチド配列が含まれる。相同ヌクレオチド配列には、ここに示したヌクレオチド配列の天然のアレル変異物及び変異体も含まれるが、これらに限られない。しかしながら、相同ヌクレオチド配列には、hummsx1をコードする正確なヌクレオチド配列は含まれない。相同核酸配列には、SEQ ID No.2の保存的アミノ酸置換体をコードする核酸配列(下記参照)並びにmsx1の生物学的活性を有するポリペプチドが含まれる。このmsx1の様々な生物学的活性は、以下に説明する。
【0065】
「オープンリーディングフレーム」(ORF)は、開始コドン(ATG)を有し且つ3つの「終止」コドン(TAA、TAG又はTGA)の1つで終了するヌクレオチド配列である。しかしながら、この発明では、ORFは、コード配列の任意の部分であってよく、開始コドン及び終止コドンを含んでも含まなくてもよい。例えば、msx1遺伝子のORFは、msx1をコードし;好ましくは、msx1ORFは、msx1の少なくとも50アミノ酸をコードする。
【0066】
一般に、「成長因子」は、細胞の成熟及び分化を指示することにより細胞成長及び発生を促進する物質である。成長因子は又、組織の維持及び修復をも媒介する。成長因子は、特異的レセプターに縛られており、非常に低濃度で作用する。
【0067】
「繊維芽細胞成長因子」(Fgf)は、細胞外に放出されて、ヘパリンと結合して二量体を形成し、特異的レセプターチロシンキナーゼ(Fgfr)を活性化する短いポリペプチドの大きいファミリーよりなる成長因子のクラスに属する。Fgfシグナリングは、哺乳動物の傷の治癒及び腫瘍の血管形成に関与しており(Ortega等、1998;Zetter、1998)、胚発生において、肢、歯、脳及び心臓の器官形成中の誘導及び/又はパターニングを含む多くの役割を有している(Crossley等、1996;Martin、1998;Ohuchi等、1997;Peters及びBalling、1999;Reifers等、1998;Vogel等、1996;Zhu等、1996)。
【0068】
Fgfは、機能的アッセイ(Baird及びKlagsbrun、1991;Moody、1993)又は抗体(Research Diagnostics;Flanders、ニュージャージー又はPromega、ウィスコンシン)を用いて、容易に検出することができる。
【0069】
ポリペプチド又はタンパク質の「成熟」型は、天然のポリペプチド又は前駆体型又はプロタンパク質の産物である。例えば、msx1は、成熟msx1をコードすることができる。天然のポリペプチド、前駆体又はプロタンパク質には、例えば、対応する遺伝子によりコードされる完全長遺伝子産物が含まれる。或は、それは、ここに記載のオープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチド、前駆体又はプロタンパク質として定義することができる。産物の「成熟」型は、この細胞内で又はこの遺伝子産物が生じる宿主細胞内で起こりうる少なくとも一つの天然のプロセッシングステップの結果として生じる。かかるポリペプチド又はタンパク質の「成熟」型へ導くプロセッシングステップの例には、オープンリーディングフレームの開始コドンによりコードされるN末端メチオニン残基の開裂、又はシグナルペプチド若しくはリーダー配列のタンパク質分解性の開裂が含まれる。従って、残基1〜Nを有する前駆体ポリペプチド又はタンパク質(残基1は、N末端メチオニンである)から生じる成熟型は、N末端メチオニンの除去後に残った残基2〜Nを有するであろう。或は、残基1〜Nを有する前駆体ポリペプチド又はタンパク質(残基1〜MのN末端シグナル配列は開裂される)から生じる成熟型は、残存する残基M+1〜Nを有するであろう。更に、ここで用いる場合、ポリペプチド又はタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解性開裂事象以外の翻訳後修飾ステップから生じうる。かかる付加的過程には、非制限的例として、グリコシル化、ミリストイル化又はリン酸化が含まれる。一般に、成熟ポリペプチド又はタンパク質は、これらの過程の唯一つの働きにより又はそれらの何れかの組合わせによって生じうる。
【0070】
「活性な」ポリペプチド又はポリペプチド断片は、この発明の天然の(野生型)ポリペプチド(成熟型を含む)の活性に類似する(必ずしも同一ではない)生物学的及び/又は免疫学的活性を保持している。生物学的アッセイ(投与量に依存するか又は依存しない)を用いて活性を測定することができる。ポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードする核酸断片は、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の一部分を単離し、そのポリペプチドのコードされた部分を発現させて、msx1のコードされた部分の活性をアッセイすることにより調製することができる。免疫学的活性は、ネイティブなmsx1が有する抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力をいい;生物学的活性は、免疫学的加勢を除くネイティブなmsx1により引き起こされる機能(阻害又は刺激機能)をいう。
【0071】
msx1に関して、この発明は、更に、遺伝コードの縮重によりSEQ ID NO:1に示したヌクレオチド配列と異なり、それ故、SEQ ID NO:1に示したヌクレオチド配列によりコードされるのと同じmsx1をコードする核酸分子の利用を包含する。この発明のために有用な単離された核酸分子は、SEQ ID NO:2に示したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【0072】
SEQ ID NO:1に示したmsx1配列に加えて、msx1のアミノ酸配列を変化させるDNA配列多形が、集団内に存在しうる。例えば、個体間のアレル変異は、msx1における遺伝的多形を示すであろう。用語「遺伝子」及び「組換え遺伝子」は、msx1好ましくは脊椎動物のmsx1をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む核酸分子をいう。かかる天然のアレル変異は、典型的には、msx1において、1〜5%の変化を生じる。任意の及びすべてのかかるヌクレオチド変異並びにその結果のmsx1におけるアミノ酸多形(天然のアレル変異の結果であって、msx1の機能的活性を変化させないもの)は、この発明の方法に有用である。
【0073】
その上、SEQ ID NO:1の配列と異なるヌクレオチド配列を有する他の種に由来するmsx1も又、有用である。天然のアレル変異体に対応する核酸分子及びこの発明のmsx1cDNAの同族体を、SEQ ID NO:1のmsx1に対する相同性に基づいて、相同なmsx1配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするcDNA由来のプローブを用いて単離することができる。
【0074】
「msx1変異型ポリヌクレオチド」又は「msx1変異型核酸配列」は、(1)完全長のネイティブmsx1、(2)シグナルペプチドを欠く完全長のネイティブmsx1、(3)msx1の細胞外ドメイン(シグナルペプチドを伴うか又は伴わないもの)、又は(4)完全長msx1の任意の他の断片をコードするヌクレオチド配列との少なくとも約80%の核酸配列同一性を有する、活性なmsx1をコードする核酸分子を意味する。通常、msx1変異型ポリヌクレオチドは、完全長のネイティブなmsx1をコードする核酸配列と、少なくとも約80%の核酸配列同一性を、一層好ましくは、約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%の核酸配列同一性を、更に一層好ましくは、少なくとも99%の核酸配列同一性を有するであろう。Msx1変異型ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドを欠く完全長のネイティブなmsx1、msx1の細胞外ドメイン(シグナル配列を伴うか又は伴わないもの)、又は完全長msx1の他の任意の断片をコードすることができる。変異体は、ネイティブなヌクレオチド配列を包含しない。
【0075】
通常、msx1変異型ポリヌクレオチドは、少なくとも約30ヌクレオチド長であり、しばしば、少なくとも約60、90、120、150、180、210、240、270、300、450又は600ヌクレオチド長であり、一層しばしば、少なくとも約900ヌクレオチド長であるか又はそれ以上である。
【0076】
ここで同定されたmsx1をコードする核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント(%)」は、配列を整列させ、必要ならばギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後の、関心あるmsx1配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。核酸配列同一性%を測定する目的でのアラインメントは、当分野の技能内にある様々な方法例えば公衆が利用できるコンピューターソフトウェア例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェアを利用することによって達成することができる。当業者は、アラインメントの測定のための適当なパラメーターを決定することができる(比較する配列の完全長の最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む)。
【0077】
ヌクレオチド配列を整列させる場合には、所定の核酸配列Cの所定の核酸配列Dとの(又は、に対する)核酸配列同一性%{これは、或は、所定の核酸配列Cが所定の核酸配列Dと(又は、に対して)ある%の核酸配列同一性を有し又は含むと表すこともできる}を、下記のように計算することができる:
【数1】
(式中、Wは、CとDの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムアラインメントにより同一的一致として記録されたヌクレオチド数であり、Zは、D中のヌクレオチドの総数である)。
【0078】
核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと等しくない場合には、CのDに対する核酸配列同一性%は、DのCに対する核酸配列同一性%と等しくない。
【0079】
同族体(即ち、他の種に由来するmsx1をコードする核酸)又は他の関連配列(例えば、パラログ)は、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングのための当業者に周知の方法を利用して、プローブとしてのSEQ ID NO:1の特定の配列の全部又は一部分との低い、中位の又は高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションによって得ることができる。
【0080】
一本鎖DNAの相補的断片にハイブリダイズする特異性は、反応条件の「ストリンジェンシー」によって測定される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、二本鎖DNA形成の傾向が減少するにつれて増大する。核酸ハイブリダイゼーション反応において、ストリンジェンシーは、例えば、ライブラリー由来の完全長クローンを同定するために利用できる特異的ハイブリダイゼーション(高ストリンジェンシー)に有利に選択することができる。一層特異性の低いハイブリダイゼーション(低ストリンジェンシー)を利用して、関連DNA分子(相同であるが同一でない分子)又はセグメントを同定することができる(但し正確ではない)。
【0081】
二本鎖DNAは、次により安定化される:(1)相補的塩基対の数、(2)塩基対の種類、(3)反応混合物の塩濃度(イオン強度)、(4)反応温度、及び(5)ある種の有機溶媒例えばホルムアミド(二本鎖DNAの安定性を減少させる)の存在。一般に、プローブが長いほど、適当なアニーリングに必要とされる温度は高い。一般的アプローチは、温度を変えることであり:一層高い相対的温度は、一層ストリンジェントな反応条件を生じる(Ausubel等、1987)(これは、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの優れた説明を提供する)。
【0082】
「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズさせるとは、互いに少なくとも60%相同であるヌクレオチド配列がハイブリダイズしたままでいるハイブリダイゼーションプロトコールをいう。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びpHでの特異的配列についての融点(Tm)より約5℃低く選択する。このTmは、標的配列に相補的なプローブの50%が、平衡時に、標的配列にハイブリダイズする温度である(規定のイオン強度、pH及び核酸濃度で)。標的配列は、一般に、過剰に存在するので、Tmで、プローブの50%が、平衡時に、占められる。
【0083】
(a)高ストリンジェンシー
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」条件は、プローブ、プライマー又はオリゴヌクレオチドがその標的配列にのみハイブリダイズすることを可能にする。ストリンジェントな条件は、配列依存性であって、異なるであろう。ストリンジェントな条件は、次を含む:(1)低イオン強度で高温の洗浄液(例えば、15mM 塩化ナトリウム、1.5mM クエン酸ナトリウム、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム、50℃);(2)ハイブリダイゼーション中の変性剤(例えば、50%(v/v)ホルムアミド、0.1% ウシ血清アルブミン、0.1% フィコール、0.1% ポリビニルピロリドン、50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5;750mM 塩化ナトリウム、75mM クエン酸ナトリウム、42℃);又は(3)50% ホルムアミド。洗浄液は、典型的には、5×SSC(0.75M NaCl、75mM クエン酸ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1% ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子DNA(50μg/ml)、0.1% SDS及び10% デキストラン硫酸(42℃)をも含み、0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中での42℃での洗浄を伴い、その後、EDTAを含む0.1×SSCの高ストリンジェンシー洗浄液(55℃)で洗浄する。好ましくは、これらの条件は、互いに少なくとも約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%又は99%相同な配列が、典型的には、互いにハイブリダイズしたままでいるようにするものである。これらの条件は、例として与えるものであり、制限を意味するものではない。
【0084】
(b)中ストリンジェンシー
「中位にストリンジェントな条件」は、一層厳しくない洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件(Sambrook、1989)を用いて、ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:1の全体、断片、誘導体又は類似体にハイブリダイズするようにする。一例は、6×SSC、5×デンハート溶液、0.5% SDS及び100mg/ml 変性サケ精子DNA中での55℃でのハイブリダイゼーションとその後の1×SSC、0.1% SDS中での少なくとも一回の37℃での洗浄を含む。この温度、イオン強度などは、プローブ長などの実験的因子に適応するように調節することができる。他の中ストリンジェンシー条件は、(Ausubel等、1987;Kriegler、1990)に記載されている。
【0085】
(c)低ストリンジェンシー
「低位にストリンジェントな条件」は、中ストリンジェンシーより一層厳しくない洗浄条件及びハイブリダイゼーション条件(Sambrook、1989)を用いて、ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:1の全体、断片、誘導体又は類似体とハイブリダイズするようにする。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非制限的例は、35% ホルムアミド、5×SSC、50mM トリス−HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.02% PVP、0.02% フィコール、0.2% BSA、100mg/ml 変性サケ精子DNA、10%(wt/vol)デキストラン硫酸(40℃)中でのハイブリダイゼーションとその後の少なくとも一回の2×SSC、25mM トリス−HCl(pH7.4)、5mM EDTA及び0.1% SDS(50℃)中での洗浄である。他の低ストリンジェンシー条件例えば種間ハイブリダイゼーションは、(Ausubel等、1987;Kriegler、1990;Shilo及びWeinberg、1981)に記載されている。
【0086】
msx1の天然のアレル変異体に加えて、コードされるmsx1のアミノ酸配列にmsx1機能を変化させない変化を招く突然変異によってSEQ ID NO:1配列に変化を導入することができる。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換へ導くヌクレオチド置換をSEQ ID NO:2の配列中に作ることができる。「非必須」アミノ酸残基は、msx1の野生型配列からそれらの生物学的活性を変化させることなく変化しうる残基であるが、「必須」アミノ酸残基は、かかる生物学的活性に必要とされる。例えば、msx1中で保存されているアミノ酸残基は、特に変化しにくいと予想される。保存的置換は、当分野において周知である。
【0087】
有用な保存的置換を、表A「好適な置換」に示す。一のクラスのアミノ酸を同じ種類の別のアミノ酸で置き換える保存的置換は、その置換が化合物の生物学的活性を著しく変えない限り、主題の発明の範囲内にある。もしかかる置換が、生物学的加勢の変化を生じるならば、表Bに例示した一層多くの変化を導入して、生成物をmsx1ポリペプチドの生物学的活性についてスクリーニングする。
【0088】
【表3】
【0089】
(1)ポリペプチド主鎖例えばβ−シート又はα−ヘリックスの構成、(2)電荷、(3)疎水性、又は(4)標的部位の側鎖の大部分に影響を及ぼす非保存的置換は、msx1ポリペプチドの機能又は免疫学的正体を改変しうる。残基は、表Bに示した一般的な側鎖特性に基づいてグループに分けられる。非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを伴う。置換は、保存的置換部位に導入することができ、一層好ましくは、非保存的部位に導入することができる。
【0090】
【表4】
【0091】
変異型ポリペプチドを、当分野で公知の方法例えばオリゴヌクレオチド媒介(位置指定)突然変異導入法、アラニンスキャニング及びPCR突然変異導入法を利用して作成することができる。位置指定突然変異導入法(Carter、1986;Zoller及びSmith、1987)、カセット突然変異導入法、制限選択突然変異導入法(Wells等、1985)又は他の公知の技術をクローン化DNAにおいて実施して、msx1変異型DNAを生成することができる(Ausubel等、1987;Sambrook、1989)。
【0092】
一具体例において、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、該タンパク質は、SEQ ID NO:1と約45%、好ましくは60%、一層好ましくは70%、80%又は90%、最も好ましくは約95%相同なアミノ酸配列を含む。
【0093】
この発明の一面は、例えば単離されたmsx1及びその生物学的に活性な部分、誘導体、断片、類似体又は同族体の利用である。しかしながら、続く節は、RDFの全成分に対して適用でき;msx1が、説明目的のための例として用いられる。やはり提供するのは、抗msx1Abを生成するための免疫原として利用するのに適したポリペプチド断片である。一具体例において、ネイティブなmsx1は、細胞又は組織起源から、標準的なタンパク質精製技術を用いる適当な精製スキームによって単離することができる。他の具体例において、msx1は、組換えDNA技術によって生成される。組換え発現に対する別法として、msx1を、標準的ペプチド合成技術を用いて化学合成することができる。
【0094】
(a)msx1ポリペプチド
msx1ポリペプチドは、msx1のアミノ酸配列を含み、該配列は、SEQ ID NO:2に与えられている。この発明は又、何れかの残基がSEQ ID NO:2に示された対応する残基から変化されているが依然としてmsx1活性及び生理的機能を保持しているタンパク質をコードする変異体若しくは変異型タンパク質又はその機能的断片をも包含する。
【0095】
(b)変異型msx1ポリペプチド
一般に、msx1様機能を保っているmsx1変異体は、配列中の特定の位置の残基が他のアミノ酸によって置換されている任意の変異体を包含し、更に、親の位置の2つの残基間への更なる残基の挿入の可能性並びに親配列からの少なくとも1つの残基の欠失の可能性をも包含する。任意のアミノ酸置換、挿入又は欠失が、この発明に包含される。有利な環境において、この置換は、上記の保存的置換である。
【0096】
「msx1ポリペプチド変異体」は、少なくとも次を有する活性なmsx1ポリペプチドを意味する:(1)完全長のネイティブ配列のmsx1ポリペプチド配列との約80%アミノ酸配列同一性、(2)シグナルペプチドを欠くmsx1ポリペプチド配列、(3)msx1ポリペプチドの細胞外ドメイン(シグナルペプチドを伴うか又は伴わないもの)、又は(4)完全長msx1ポリペプチド配列の任意の他の断片。例えば、msx1ポリペプチド変異体は、少なくとも一つのアミノ酸残基が完全長のネイティブなアミノ酸配列のN又はC末端で付加され又は欠失しているmsx1ポリペプチドを包含する。msx1ポリペプチド変異体は、完全長のネイティブな配列のmsx1ポリペプチド配列と少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を、好ましくは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性を、一層好ましくは少なくとも約82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%のアミノ酸配列同一性を、最も好ましくは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有する。msx1ポリペプチド変異体は、シグナルペプチド、msx1ポリペプチド(シグナルペプチドを有するか又は有しないもの)の細胞外ドメイン、又は完全長msx1ポリペプチド配列の任意の他の断片を欠く配列を有しうる。通常、msx1変異型ポリペプチドは、少なくとも約10アミノ酸長であり、しばしば少なくとも約20アミノ酸長であり、一層しばしば少なくとも約30、40、50、60、70、80、90、100、150、200又は300アミノ酸長又はそれ以上である。
【0097】
「アミノ酸配列同一性パーセント(%)」は、2つの配列を整列させた場合の、開示されたmsx1中のアミノ酸残基と同一の、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸同一性%を測定するためには、配列を整列させ、必要であれば、ギャップを導入して最大%配列同一性を達成し;保存的置換は、配列同一性部分とは考えない。同一性パーセントを測定するためのアミノ酸配列アラインメント手順は、当業者に周知である。しばしば、市販のコンピューターソフトウェア例えばBLAST、BLAST2、ALIGN2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェアが、ペプチド配列を整列させるために利用される。当業者は、アラインメントを測定するために、比較する配列の完全長全体にわたっての最大アラインメントを達成するのに必要なアルゴリズムを含む適当なパラメーターを決定することができる。
【0098】
アミノ酸配列を整列させた場合には、所定のアミノ酸配列Aの、所定のアミノ酸配列Bとの(又は、に対する)アミノ酸配列同一性%{或は、これは、所定のアミノ酸配列Aが、所定のアミノ酸配列Bと(又は、に対して)ある%のアミノ酸配列同一性を有し又は含むと表すこともできる}は、下記式により計算することができる:
【数2】
(式中、Xは、AとBの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムアラインメントにより同一的一致として記録されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である)。
【0099】
アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合には、AのBに対するアミノ酸配列同一性%は、BのAに対するアミノ酸配列同一性%と等しくない。
【0100】
(c)単離/精製されたポリペプチド
「単離された」又は「精製された」ポリペプチド、タンパク質又は生物学的に活性な断片は、その天然環境の成分から分離され且つ/又は回収される。夾雑成分には、典型的にはこのポリペプチドの診断又は治療用途を邪魔するであろう物質が含まれ、酵素、ホルモン及び他のタンパク質様又は非タンパク質様物質が含まれうる。好ましくは、このポリペプチドは、N末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度にまで精製する。実質的に単離されたとは、調製物が、乾量で、非msx1夾雑物質を30%未満、一層好ましくは20%、10%未満、最も好ましくは5%未満有することである。単離された、組換えにより生成されたmsx1又は生物学的に活性な部分は、好ましくは、実質的に、培養培地を含まず、即ち、培養培地は、msx1調製物の容積の20%未満を、一層好ましくは約10%未満を、最も好ましくは約5%未満を占める、夾雑物の例には、細胞残骸、培養培地及び、msx1のイン・ビトロ合成中に用いられた及び生成された物質が含まれる。
【0101】
(d)生物学的に活性な
msx1の生物学的に活性な部分(又は、タンパク質様の任意のRE成分)には、完全長msx1よりも一層少ないアミノ酸を含み且つmsx1の活性の少なくとも一つを示すmsx1のアミノ酸配列(SEQ ID NO:2)に十分に相同な又は該配列から誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。生物学的に活性な部分は、ネイティブなmsx1の少なくとも一つの活性を有するドメイン又はモチーフを含む。msx1の生物学的に活性な部分は、例えば、10、25、50、100又はそれより多いアミノ酸残基長であるポリペプチドであってよい。このタンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分を、組換え技術により調製して、ネイティブなmsx1の機能的活性の少なくとも一つについて評価することができる。
【0102】
msx1の生物学的に活性な部分は、SEQ ID NO:2に示したアミノ酸配列又は該配列に実質的に相同な配列を有し、且つSEQ ID NO:2のタンパク質の機能的活性を保持することができる(自然のアレル変化又は変異によりアミノ酸配列が異なっている)。他の生物学的に活性なmsx1は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも45%相同なアミノ酸配列を含み、且つネイティブなmsx1の機能的活性を保持することができる。
【0103】
(e)キメラ及び融合タンパク質
融合ポリペプチドは、発現研究、細胞局在化、バイオアッセイ、msx1の精製において有用であり、且つこの発明の方法の目的に関して、細胞外適用によるmsx1の細胞内導入に関して有用である。msx1「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、msx1を非msx1ポリペプチドに融合させて含む。非msx1ポリペプチドは、実質的に、msx1(SEQ ID NO:2)と相同でない。msx1融合タンパク質は、任意の数の生物学的に活性な部分を含む完全なmsx1の任意の部分を含むことができる。msx1は、GST(グルタチオンS−トランスフェラーゼ)配列のC末端に融合させることができる。かかる融合タンパク質は、組換えmsx1の精製を容易にする。ある宿主細胞(例えば、哺乳動物)において、異種性シグナル配列融合物は、msx1発現及び/又は細胞内への取り込みに従順でありうる。例えば、HIVtatタンパク質の残基を利用して、細胞内への取り込み及び核への送達を促進することができる。更なる典型的な融合物を表Cに与える。
【0104】
融合タンパク質は、組換え法を利用して容易に造ることができる。msx1をコードする核酸を、イン・フレームで、非msx1をコードする核酸と、msx1のNH2−若しくはCOO−末端又は内部に融合させることができる。融合遺伝子は又、自動化DNAシンセサイザーを含む慣用の技術によって合成することもできる。後でアニールさせて再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することのできる2つの連続する遺伝子断片間の相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを利用するPCR(Ausubel等、1987)も又、有用である。msx1をインフレームで融合部分にサブクローン化するのを容易にする多くのベクターが市販されている。
【0105】
【表5】
【0106】
G.生化学
抽出物は、最も容易に、その起源とは異なる形態の調製物である。細胞抽出物は、機械的に溶解させた細胞ほどに容易であってよい。かかる調製物は、遠心分離又は濾過によって清澄化して不溶性残骸を除去することができる。
【0107】
抽出物は又、溶媒の利用を含む調製物をも包含する。溶媒は、水、洗剤、又は有機化合物(非制限的例)であってよい。抽出物は、殆どの溶媒を除去して濃縮することができ;当業者に一般的な任意の方法(例えば、第二次抽出、ゲル濾過によるサイズ分画法、又は勾配遠心分離法など)を用いて分画することもできる。加えて、抽出物は又、幾つかの成分を保存するために混合物に加えられた物質、例えばタンパク質の寿命を延長するためのプロテアーゼインヒビター又は微生物汚染を防止するためのアジ化ナトリウムをも含むことができる。
【0108】
しばしば、細胞又は組織抽出物は、無傷の起源からある成分例えば成長因子、表面タンパク質、核酸、脂質、多糖類などを単離するために調製され、又は一層困難な細胞コンパートメント(ゴルジ体、リソゾーム、核、ミトコンドリア及び葉緑体を含む)を細胞から抽出することができる。
【0109】
III.この発明の実施
A.RNLE抽出物
以下は、本発明のために開発された再生中のイモリの肢の抽出物の調製法を記載する。実施例も参照されたい。以下の手順の多くの変形が、同様の活性を有する抽出物を生成しうることは、当業者には明らかであろう。一般に、この抽出物の活性(実施例参照)の少なくとも一つを有するイモリから生成される任意の抽出物は、本発明者によって企図されるものである。
【0110】
しかしながら、再生活性を含む任意の抽出物は、再生する任意の動物例えば有尾目の両生類(イモリ又はアホロートル)及び硬骨魚類例えばDanio rerio(ゼブラフィッシュ)から又は再生中の哺乳動物の肝臓から同様にして調製することができる。かかる抽出物は、少なくとも一つのREの活性を有するであろう。
【0111】
例えば、成体のイモリのNotophthalmus viridescenを、加湿室内に維持する。手術は、麻酔した動物に対して行なう。再生中の肢組織を、次のようにして採取する。前肢を、肘のすぐ近くで切ることにより切断し、軟組織を上げて骨を露出させる。この骨と軟組織を刈り込んで平らな切断表面を生成する。これらのイモリを、スルファメラジン溶液中に一晩置いてから、正常な水環境中に戻す。初期の再生組織(切断後1、3及び5日目)を、肢の傷の上皮に近い0.5〜1.0mmを再切断して、任意の残りの骨を除去することにより集める。再生中でない肢組織は、以前に切断したことのない肢から採取する。組織を前肢の肘に2〜3mmの近いところから採取し、すべての骨を除去する。採取の直後に、すべての組織を液体窒素中で瞬間冷凍して、−80℃に保存する。
【0112】
組織を解凍し、その後のすべての操作を、4℃又は氷上で行なう。6グラムの初期再生組織{1、3及び5日目由来(各2グラム)}又は6グラムの再生中でない組織を、別々に、3種類のプロテアーゼインヒビター(例えば、ロイペプチン、アプロチニン及びフェニルメチルスルホニルフルオリド)を含む適当な細胞培養培地中に置く。組織を組織ホモジェナイザー、ハンドホモジェナイザーを用いて破砕し、次いで、短時間超音波処理する。細胞残骸を2回の遠心分離で除去する。不溶性脂質層を吸引し、残りの上清をフィルター滅菌する。次いで、タンパク質含量をアッセイし、この抽出物を−80℃に保存する。
【0113】
B.hRNLE;RNLEの活性成分の同定
1.導入
この発明は、RNLEの少なくとも一つの活性を真似る組成物(これらの活性分子のヒト型を含む)をも包含する。例えば、もしFgfがRNLEの成分であれば(ありそうなことである;実施例参照)、ヒト型のFgfが、hRNLE組成物において代用されよう。RNLEの「ヒト化」配合物は、RNLE又はRNLE様組成物を必要とするヒト患者において免疫応答を刺激するのを回避するのに有利であろう。
【0114】
2.生化学的アプローチ
当業者には、如何にして、RNLEを出発点として、例えばイモリの肢の再生又は哺乳動物筋管の脱分化の誘導に基づく機能的アッセイを用いて、hRNLEの組成を決定するかは明らかとなろう。RNLEの組成物は、分画して、機能的アッセイで試験することができる。たとえ部分的又は僅かな効果であっても活性が見出された場合には、その単離された成分は、活性RNLEを構成する候補分子である。各成分は小さい効果を有していても、すべてのRNLE精製活性成分の総和は、RNLEの効果を真似るであろう。
【0115】
3.遺伝学的アプローチ
RNLE中の活性成分を並びに再生における事象の経路及び系列さえも同定するために、遺伝学的システムを利用することができる。この発明は、ゼブラフィッシュの遺伝学的に分析可能な生物のひれの再生がFgfシグナリングを必要とすることを示す。遺伝学的アプローチを用いて、RNLE様活性の原因因子をコードする個々の遺伝子を、マッピング及びクローニングによって同定することができる。一度クローン化されれば、ゼブラフィッシュ遺伝子配列を利用して、ヒトの同族体を、例えばヒトのライブラリーのcDNA又はゲノムDNAスクリーニングを利用して同定することができる。同様に、BLAST検索及び他のイン・シリコ方法は、同定された遺伝子の幾つかについてかかる実験の必要性を回避することができる。かかる方法において、hRNLE(又は、選択した生物のRNLE)を配合することができる。
【0116】
以下は、一つの遺伝学的アプローチを概説するものである。しかしながら、当業者は、変更し又は異なる遺伝学的アプローチを用いて同じゴールに達することができる。例えば、変異遺伝子のホモ接合性が致死を生じる場合には、当業者は、条件的アレル例えば温度感受性アレルを有する変異体を探すことができる。一般に、遺伝学的アプローチは、ゼブラフィッシュなどの適当な生物とスクリーニング又は選択を必要とする(スクリーニングは、多くの所望でない変異体の中の所望の変異体の同定を可能にし;選択は、所望の変異体のみを生じる)。ゼブラフィッシュにおけるひれの再生(実施例参照)は、容易に記録できる可視的スクリーニングとして利用することができる。望ましい変異体は、野生型(wt)のひれの完全な再生ができない個体、一層大きいがそれ以外は正常なひれを再生する個体、多数のひれを再生する個体、又は異なる身体部分を生じる個体である。
【0117】
当業者は、かかるスクリーニングを、先ず遺伝的に限定された(純粋な)魚の集団を、当分野で周知の方法を用いて突然変異導入することにより始めるであろう。突然変異誘発物質は、DNA配列に様々な突然変異を引き起こす。化学的突然変異誘発物質例えばEMS及びENUは、しばしば、単純な塩基対変化を引き起こす。一層激烈な突然変異誘発物質には、UV、高速中性子、及びX線(塩基対変化と、大小の欠失及び染色体再配列をも引き起こすことができる)が含まれる。当業者は、選択した生物、利用可能な遺伝子マッピング技術、所望の型の突然変異及び安全性を含む因子に基づいて突然変異誘発物質を選択するであろう。
【0118】
一度突然変異を起こさせた個体の集団を得たならば、ひれの再生についての最初のスクリーニングをM1世代(突然変異誘発後の第一世代)で行って、優性変異(その表現型を発揮するのに1コピーしか必要としない変異遺伝子)を探すことができる。ひれを切断してから、再生能力について、先ず視覚的に、そして必要であれば顕微鏡でスクリーニングする(生きた生物を使用)。遺伝子マッピング及びクローニングの目的のための優性変異は、wt表現型を劣性マーカーとして用いて調べることができる。
【0119】
しかしながら、多くの変異は、ホモ接合の劣性であろう。このM1集団を、自家交雑(交配)させて、ホモ接合性遺伝子座をM2集団中に達成する。ひれの再生についてのスクリーニングを繰り返す。
【0120】
変異個体を分離する場合、しばしば、特に突然変異誘発中に多くの突然変異が誘導されるならば、それらの遺伝的バックグラウンドを「浄化」することが望ましい(当業者は、突然変異の割合を、例えば、変異させた集団を一つの変異につき調べることにより、測定するであろう)。このステップは、一層困難であり、潜在的に仕事を混乱させる潜在的な多遺伝子欠損を排除する。一つの変異体から「バックグラウンド」変異を取り除くためには、それをwt個体と交雑(「戻し交雑」)させる。次いで、その子孫を自家交雑(自殖)させて、F2世代を変異型表現型の復帰について分析する。変異型表現型が現れた系統は、更なる分析のための優れた候補である。好ましくは、これらの変異体を2回以上戻し交雑する。
【0121】
試験で遺伝子数を同定するために、これらの変異体を互いに交雑させて、相補性グループを同定する。相補性は、野生型表現型がすべてのF2子孫において見出された場合に生じる。その最も簡単な解釈は、相補性は多くの理由のために少数の例において生じうる(又は、生じえない)という警告を伴って、変異した遺伝子が親と同じ遺伝子ではないということである。もし解釈が生じなければ、この結果は、通常、両親が同じ遺伝子に変異を有することを示している。各解釈グループは、単一の遺伝子を示す。すべての系統は、各解釈グループに維持される。
【0122】
変異した遺伝子を、次いで、当業者に周知の技術を用いてマッピングする。マッピングの特性、特に、連鎖マーカーの利用(例えば、形態的であっても又はDNA多型であっても)は、研究する生物にユニークである。一つのアプローチにおいては、変異型の個体を、「マッピング集団」(遺伝学的に又はクローン化により十分限定された遺伝マーカーを有する)に対して交雑させ、変異型個体を、そのマーカーに対する変異型表現型の連鎖について調べる。他の非常に有用なマッピング集団は、研究している生物の近縁系統(2系統間で、コードDNA配列の10bp中の1bp、100bp中の1bp、1000bp中の1bp、10,000bp中の1bpが異なる)である。かかる集団は、PCRベースのマーカーの容易な利用を可能にし、それらは、例外的に容易且つ迅速に記録することができる。
【0123】
マッピングがますます微細になった場合には、他の技術を利用して、変異した遺伝子のクローニングを容易にすることができる。例えば、突然変異が起きた領域が公知の配列であれば、候補の遺伝子を同定することができる。かかる遺伝子を、次いで、変異型個体において配列決定して有害な変異(アミノ酸配列の変化又は早すぎる停止コドンを含む)を同定することができる。もしこの領域が未知の配列を有するならば、表現型レスキューによるクローニングを利用することができる。突然変異が起きた領域をwt個体から単離して、一層小さい断片に切って(酵素的に又は物理的力により)、適当な発現ベクター中にサブクローン化してから変異型個体中にトランスフォームすることができる。もしこの変異型表現型をレスキューするならば(即ち、トランスフォームした個体が、スクリーニングアッセイにおいて、ひれを再生するならば)、これは、トランスフォームされたDNAのセグメントが関心ある遺伝子を有することの証拠である。この導入されたDNAを、次いで、周知の方法を用いて配列決定することができる。優性変異の場合には、変異型個体は、そのDNAを提供し、DNA断片をwt個体に導入して、変異型表現型を記録する。レスキューは、理想的には、各相補性グループからの少なくとも2つの異なる系統において確認する。加えて、候補遺伝子の位置でのすべてのメンバーの配列決定を行なって、変異遺伝子の様々なアレルを示す各系統で有害な突然変異が起きていることを確認する。しかしながら、注目すべきは、操作可能に結合された領域例えばプロモーター及びエンハンサー並びにスプライス部位内に起きた突然変異であり、これらは、単純な配列決定によっては同定するのが一層困難であろう。当業者は、この問題に如何にアプローチするかを知るであろう。
【0124】
一度遺伝子が手に入れば、その配列を利用して、プローブ又はプライマーをデザインして、ヒト(又は、任意の他の生物)の同族体を同定することができる。ヒトのcDNA又はゲノムライブラリーは、例外的に有用である。PCRベースのアプローチは、ヒトのゲノムのテンプレートのみを必要としうる。或は、イン・シリコ実験を行なって、ヒトの同族体を探すことができる(BLAST検索など)。ヒトの同族体が、それらを探すプローブとして用いた遺伝子と同様の活性を有することを確認するために、そのヒトの配列を元のスクリーニングからの変異型個体にトランスフォームして、変異型表現型レスキューについて試験することができる。しかしながら、もしそれが失敗したならば、そのヒト配列を発現ベクター中にサブクローン化して、適当な宿主(例えば、大腸菌、COS細胞、又はキイロショウジョウバエS2細胞)中にトランスフォームし、イン・ビトロで発現させて収穫してから、例えば、細胞分化アッセイ又は筋管開裂/増殖アッセイ例えば、以下に記載するもの(4(e、f))などに適用することができる。
【0125】
4.hRNLEを同定するための差次的遺伝子発現アプローチ
第一部において、細胞柔軟性を調節する候補遺伝子を、両差次的ディスプレー分析を利用することにより及び初期イモリ肢再生体と非再生肢との間のサプレッションサブトラクションcDNAライブラリーを調製することにより同定することができる。クローン化cDNA断片の差次的発現を、ドットブロットハイブリダイゼーション又はノーザンブロット分析によって確認することができる。選択した候補遺伝子の完全長cDNAクローンを、イモリの肢の再生cDNAライブラリーのスクリーニングによって生成することができる。かかるcDNAクローンを、次いで、配列決定して完全長のオープンリーディングフレームを同定することができる。
【0126】
第二部において、候補の細胞柔軟性遺伝子の配列をコンピューター化BLAST及びモチーフ検索によって分析して、候補のcDNAが公知の遺伝子の同族体であるか又はそれらが関心ある機能的ドメインを有するかを測定する。肢切断後のアップレギュレーションの程度を、ノーザンブロットのホスホルイメージ分析により評価することができる。候補遺伝子の細胞発現パターンを、再生中のイモリの肢の全載又は組織切片イン・シトゥーハイブリダイゼーションにより測定することができる。顕著なアップレギュレーションを示し及び、通常、成長因子、サイトカイン又は他のリガンド中に見出されるドメインを含む遺伝子が候補であることは、ありそうなことである。関心ある他の遺伝子には、メタロプロテイナーゼ(細胞外マトリクスを分解し、細胞脱分化を助成する酵素)、レセプター(脱分化過程を開始するリガンドと結合することができる)、転写因子(脱分化遺伝子又は下流応答遺伝子の潜在的なレギュレーター)、及び細胞内シグナリング分子(脱分化又は他の再生過程に関与しうる)が含まれる。
【0127】
第三部において、候補遺伝子は、細胞脱分化の開始における役割についてアッセイすることができる。一つのアプローチにおいて、候補遺伝子を、哺乳動物発現用ベクター中にクローン化してCOS−7細胞にトランスフェクトする。調整培地を、これらのトランスフェクトしたCOS−7細胞から集めて、C2C12筋管を処理するのに使う。これらの筋管を数日にわたって、細胞脱分化の兆候例えば細胞周期への再入、筋肉分化タンパク質のレベルの低下、並びに細胞の分裂及び増殖についてモニターする。2種以上のタンパク質が、細胞脱分化には必要とされうる。それ故、候補遺伝子の組合せを、2種以上の候補遺伝子をCOS−7細胞に同時トランスフェクトすることにより、又はトランスフェクションから生成した調整培地を種々の候補遺伝子と合せることによってアッセイすることができる。もし特定の候補遺伝子の配列及び発現パターンが、それがコードするタンパク質が、細胞内で、開始シグナルの下流で機能することを示唆するならば、その遺伝子をC2C12筋管中で異所的に発現させて、その細胞脱分化を誘導する能力を測定することができる。
【0128】
(a)差次的発現分析の実験的詳細
全RNAを、30の再生中のイモリの肢(切断後1、3及び5日目)から抽出する。次いで、再生中でない肢の組織を、同じイモリから、最初の切断の際に集める。同じイモリからの再生中の組織と再生中でない組織の比較は、野生型イモリ集団中に見出される多形による差次的にディスプレーされたcDNAにおける如何なる偽陽性をも排除するはずである。組織の総容積を評価し、全RNAを単離する。残留する夾雑DNAを、このRNAをRNアーゼを含まないDNアーゼIで処理し、試料をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールで抽出してからエタノールで沈殿させることにより破壊する。RNAの濃度及び純度を、260nmと280nmでの吸光度測定により測定する。RNAの完全性を、試料を0.1%アガロースゲル上で、0.5M ホルムアルデヒドの存在下でランすることにより評価する。分解してないRNAだけを差次的ディスプレー分析に用いる。
【0129】
差次的ディスプレー分析は、比較する2つの組織内で種々のレベルで発現される遺伝子から生じたRNA転写物の差次的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)増幅に基づいている。一つのアプローチにおいて、逆転写は、ポリ(A)トラクトに結合して、3’末端で単一ヌクレオチド(A、C又はG)により係留されるアンカープライマーを用いて実施する。その後のPCR増幅を、3’−アンカープライマー及び80種類の異なる配列にアニールするようにデザインされた異なるランダムプライマーの1つを用いて行う。それ故、240の異なるプライマーセットを用いて、第一鎖cDNA生成物を増幅する。このアプローチは、再生中の及び再生中でないイモリの肢において発現されるすべての転写物の殆ど完全な被覆を与える。差次的ディスプレー分析を、切断後1、3及び5日目に採取した再生中の及び再生中でない組織を用いて行う。増幅生成物を、熱変性させて0.4mmの5%ポリアクリルアミド/尿素ゲル上で、70Wで、約3時間にわたって分離する。これらのゲルを乾燥させて、Kodak のX線BMRフィルムを、12〜16時間露出させる。差次的にディスプレーされたcDNA断片を生成する反応を、組織の独立のセットから抽出した全RNAを用いて反復して、差次的ディスプレーパターンを確認する。
【0130】
差次的にディスプレーされたcDNA断片を、乾燥させたゲルから切り出し、そのゲルを100μlのTE(10mM トリス−HCl、pH7.5、0.1mM EDTA)中に置いて、一晩、一定速度で振盪しながら37℃に加熱することにより溶出する。ワットマンペーパー及びゲル残骸を遠心分離により除去して、cDNA含有上清をPCR増幅用に保存する。次いで、2つの増幅反応を行う。第一の反応においては、4μlの未希釈cDNA溶出液をテンプレートとして用い、第二の反応においては、溶出cDNAをTE中で1/10に希釈してから、テンプレートとして用いる。切り出したcDNAをPCRによって増幅し、増幅生成物を1.8%低融点アガロースゲル上で分離する。適当な断片を切り出してゲル精製する。精製した断片をT/Aクローニングベクター(pBluescript II SKなど)に連結し、トランスフォームした細菌コロニーを生育させてプラスミドDNAを単離する。次いで、組換えプラスミドをノーザンブロット用及び配列分析用プローブの作成に利用する。
【0131】
ノーザンブロット分析を実施して、差次的にディスプレーされたcDNA断片が、再生中の組織と再生中でない組織の間で真に差次的に発現された遺伝子を表すことを確認する。幾つかの差次的に発現された遺伝子は、低レベルで発現されうるし、全RNAから調製したノーザンを用いて検出されない。それ故、イモリの肢からの単一の選択したポリ(A)RNAから調製したノーザンを用いて差次的にディスプレーされたcDNAを利用する。ノーザンブロットは、再生中でない肢及び初期肢再生物のポリ(A)RNA(切断後1、3及び5日目)2μgを隣接するレーンでランすることにより調製する。10セットの初期肢再生物/再生中でない肢のレーンをランする。RNAを、0.5M ホルムアルデヒド、20mM MOPS、pH7.0、5mM 酢酸ナトリウム及び1mM EDTAを含む1%アガロースゲル中で80Vでの電気泳動により分離する。このRNAをナイロン膜上にブロットし、その膜にUV架橋して、0.04% メチレンブルー(0.5M 酢酸ナトリウム中)で染色する。このRNAを、ランダムヘキサマープライミング及び32P−dCMP取り込み(組換えプラスミドから精製したインサートを使用)により調製したcDNAプローブとハイブリダイズさせる。差次的発現を、オートラジオグラフィーシグナルの強度をレーン間で比較することにより測定する。ホスホルイメージ分析を実施して、アップ又はダウンレギュレーションのレベルを定量する。3倍以上の転写誘導を示すものは、候補の活性RNLE成分をコード化している。
【0132】
(b)サプレッションサブトラクションcDNAライブラリー実験の詳細
候補の再生及び脱分化遺伝子は又、サプレッションサブトラクションハイブリダイゼーションcDNAライブラリーを、テスターcDNAを調製するために初期イモリ肢再生物から単離したRNA及びドライバーcDNAを調製するために再生中でないイモリの肢から単離したRNAを用いて生成することによっても同定されうる。サプレッションサブトラクションハイブリダイゼーションは、次の2つの重要な現象に基づいている:(1)過剰なドライバーcDNAの、テスターcDNA集団中に見出される殆どすべての相補的cDNAに効果的にハイブリダイズしてユニークなテスター転写物をハイブリダイズしてない一本鎖として残す能力及び(2)同じcDNA分子の反対末端に位置する長い逆向き反復の、互いにアニールしてプライマーがアニールした末端に結合するのを防止する能力。
【0133】
単一の選択したポリ(A)RNAを、200の再生中のイモリの肢(切断後1、3及び5日目)から、及び600の再生中でない肢から上記のように抽出した全RNAから単離する。第二ラウンドのポリ(A)選択を、一度選択したポリ(A)RNAを2回目のオリゴ(dT)セルロースマトリクスに結合させ、そのセルロースを洗浄して、上記のRNAを溶出させて濃縮することによって実施する。
【0134】
第一鎖cDNAを、実験用テスター(初期肢再生物)及びドライバー(再生中でない肢)ポリ(A)RNAの両方から調製する。2μgのポリ(A)RNAを、42℃で、1.5時間、AMV逆転写酵素を用いて逆転写する。第二鎖cDNA合成を、16℃で、2時間、DNAポリメラーゼI、RNアーゼH及び大腸菌DNAリガーゼの存在下で実施する。T4DNAポリメラーゼを加えて、試料を、更に30分間、16℃でインキュベートする。第二鎖cDNA合成を、EDTA/グリコーゲン混合物の添加により停止させ、これらの試料を、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールで抽出し、そしてエタノールで沈殿させる。このcDNAをddH2Oに再懸濁させ、RsaIで消化して、フェノール:クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製する。
【0135】
再生中の肢に由来する精製したRsaI消化したcDNAを、2つのアリコートに分ける。アダプター1を、これらのアリコートの一方のcDNA末端に連結し、アダプター2Rを、第二のアリコートのcDNA末端に連結する。再生中の肢に由来するアダプターを連結したcDNA(アダプター1連結及びアダプター2R連結cDNA)を、別々に、2つの異なるバイアル中で、再生中でない肢に由来する30倍過剰のcDNA(アダプターを欠くもの)と混合する。これらの試料を、98℃で、1.5分間変性させてから、68℃で、6〜12時間にわたってアニールさせる。これらの2つの再生中の肢に由来する異なるアダプターを含むcDNA試料を、次いで、再生中でない肢に由来する新たに変性したcDNA(アダプターなし)と一緒に混合し、68℃で一晩アニールする。この第二ラウンドのハイブリダイゼーション後に、一本鎖5’末端を、熱安定性のDNAポリメラーゼとdNTPを用いて充填してから、ハイブリダイズした生成物を両アダプターに特異的なプライマーを用いる27サイクルの抑制PCRにかける。これらのPCR産物を、次いで、希釈し、アダプター1に特異的であるプライマーとアダプター2Rに特異的な第二のプライマーを用いるネステッドPCRにかける。これらのステップ中、両端に同じアダプターを有するテンプレートは効率的に増幅されない(何故なら、各テンプレートの2つの末端は、相補的塩基対の長いストレッチを含み、これは、互いにアニールして、標的配列に達するのを妨げるヘアピンループを形成するからである)。増幅されたcDNA産物を、次いで、T/Aクローニングベクター(pBluescript II SK)中に連結して、主として、初期再生中の肢で優先的に発現されるcDNAよりなるライブラリーを構築する。同じ手順に従って、再生中でない肢で優先的に発現されるcDNAのライブラリーを生成することができる。
【0136】
たとえこの手順が差次的に発現される遺伝子を富化しても、それは、偽陽性を生じうる。差次的発現を確認するためには、再生中の肢に由来する減算cDNAクローンを含むフィルターを、減算した再生中の肢由来の又は減算した再生中でない肢由来の標識cDNAでプローブすることによるドットブロット分析を実施する。これら2つのcDNAでプローブしたときに差次的ハイブリダイゼーションパターンを示すクローンを、ノーザンブロット及びホスホルイメージ分析による差次的発現の確認のために選択する。確認されたクローンのインサートを、次いで、当分野で周知の確立されたプロトコールを用いて配列決定する。
【0137】
(c)完全長の差次的に発現されるcDNAの生成及び配列決定の実験的詳細
下記のプロトコールを用いて、完全長のヒトcDNAを、ヒトcDNAライブラリーを利用して同定することができる。ストリンジェンシー条件は、調節する必要がありうる(Ausubel、1987)。
【0138】
完全長cDNAクローンを、選択したcDNAについて、イモリの初期肢再生物cDNAライブラリーを、元の差次的にディスプレーしたcDNA断片又は減算cDNAから作成したプローブを用いてスクリーニングすることによって生成する。プローブを、ランダムヘキサマープライミング及び32P−CMPの取り込みによって標識する。ファージベクター中にクローン化した百万のcDNAを高密度でプレートし、二連のリフトをナイロン膜上に調製する。これらの膜を、32Pで標識したcDNAプローブとハイブリダイズさせる。第二のスクリーニングを、陽性プラークを選択してからそれらを150mmプレート当たり300〜500プラークの密度で再プレートすることにより実施する。プラークをナイロン膜上にリフトして、特異的cDNAプレートとハイブリダイズさせる。第二のスクリーニングから単離した陽性プラークを選択して生育させる。これらのcDNAインサートをイン・ビボでRE704ヘルパーファージを用いてpBK−CMVプラスミド構築物として切り出して、これらのクローンを、50μg/ml カナマイシンを含む寒天上で選択する。コロニーを選択して、LB−カナマイシン培養にて生育させて、プラスミドを単離する。これらのクローンを、次いで、EcoRI及びXhoIで消化して、cDNAインサートを切り出し、消化物を1%アガロースゲル上で分離してインサートのサイズを測定する。各クローンのインサートのサイズを、ノーザンブロット分析により測定したその対応する転写物のサイズと比較して、そのクローンが完全長のcDNAを含みうるかどうかを評価する。これらのクローンの末端を配列決定する。もしcDNAが完全長でないならば、プローブを5’若しくは3’末端又は両方からデザインして(cDNAの何れの末端が失われているかによる)、ライブラリーを再度スクリーニングする。この工程を、完全長のオープンリーディングフレームが得られるまで反復する。ライブラリーのスクリーニングによって完全長オープンリーディングフレームを同定することができなかった場合には、5’又は3’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)を利用して、cDNAの失われた部分をクローン化することができる。
【0139】
(d)配列分析、アップレギュレーションレベル及び細胞発現パターンに基づく候補の細胞柔軟性遺伝子の選択
差次的に発現されたcDNAの配列分析 差次的に発現された遺伝子のcDNA配列を、ヌクレオチド及びタンパク質BLAST検索(Altschul及びGihs、1996;Altschul等、1997)により分析する。すべての候補の細胞柔軟性遺伝子が、特定の遺伝子ファミリーに属するものとして認められる訳ではない。これらの新規な遺伝子は、細胞柔軟性において重要な役割を演じうるであろうし;切断後に有意の転写誘導を示すものは、機能について試験する(下記参照)。
【0140】
リボプローブ合成 リボプローブを、全載及び組織切片イン・シトゥーハイブリダイゼーション手順で使用する。これらのプローブを、ジゴキシゲニン(DIG)を用いて標識する(これは、後で、アルカリホスファターゼと結合させた抗DIG抗体を用いて検出することができる)。cDNAインサートを含むベクター構築物を、BamHI(T7RNAポリメラーゼ用のテンプレートとして用いる場合)又はXhoI(T3RNAポリメラーゼ用のテンプレートとして用いる場合)による消化によって線状化する。リボプローブ合成を、次のように実施する:簡単にいえば、1μgの線状化cDNA含有ベクターを、DIG標識混合物、T3/T7RNAポリメラーゼ転写用緩衝剤、RNアーゼインヒビター、及びT3又はT7RNAを含む反応においてテンプレートとして利用する。転写を、37℃で、2時間にわたって行う。DNAを、DNアーゼIの添加によって破壊し、リボプローブを、2つの連続するエタノール沈殿工程により精製する。最終的な精製後に、リボプローブをddH2Oに再懸濁、ジエチルピロカーボネート(DEPC)で処理し、そして濃度及び純度を260及び280nmでの分光測光により測定する。1%アガロースゲルを1×TEにてランして、リボプローブの存在及び濃度を確認する。
【0141】
イモリの肢の粉末の製造 全載イン・シトゥーハイブリダイゼーション手順において、アルカリホスファターゼを結合させた抗DIG抗体をブロックするには、イモリの肢の粉末が必要とされる。抗体をブロックするためのイモリの粉末の使用は、抗体のイモリ組織への非特異的結合によるバックグラウンド染色を減じる。切断したイモリの肢を、液体窒素中で瞬間凍結して、イモリの肢の粉末の調製に使用するまで−80℃に保存する。これらの凍結した肢を液体窒素上で乳鉢と乳棒を用いて粉末に粉砕する。この肢の粉末を4容の氷冷アセトンで処理し、混合して、氷上に30分間置く。遠心分離後、このアセトンを除去して、試料をアセトンですすぎ、ワットマン紙の紙片に移す(微粉末にする場合)。風乾終了後、この肢粉末を気密性容器内に4℃で保存する。
【0142】
全載イン・シトゥーハイブリダイゼーション 初期肢再生体(1〜5日目)での全載イン・シトゥーハイブリダイゼーションを実施して、候補の細胞柔軟性遺伝子の発現パターンを測定する。染色した全載再生体の写真を撮ってから、それらの組織を切片に切る。切片化前の全載の分析は、これらの遺伝子の全体的な発現パターンの評価を可能にし、他方、その組織切片の分析は、特異的な細胞性発現パターンを明らかにする。
【0143】
イモリの肢の切断を上記のように実施する。それらの肢を最初の切断から5日以内に再切断して、その組織を直ちに3.7%緩衝パラホルムアルデヒド中で固定する。これらの組織を、0.1% ツイーン20を含む燐酸緩衝塩溶液(PBST)で徹底的に洗浄し、一連のメタノール/PBST及び溶液で脱水してから、100% メタノール中に−20℃で保存する。組織を、メタノール/PBST溶液中で再水和してから、PBST中で3回洗う。これらの試料を、20μg/mlプロテイナーゼKにより、37℃で、10、20又は30分間処理する。次いで、これらの組織を、PBSTで4℃で徹底的に洗って、プロテイナーゼK活性を除去し、0.1M トリエタノールアミン(pH7.9)中の0.5% 無水酢酸により10分間アセチル化する。これらの組織をPBSTで洗い、4% パラホルムアルデヒドで20分間再固定する。これらの試料をPBSTで徹底的に洗い、ハイブリダイゼーション溶液(50% ホルムアミド、5×SSC、1mg/ml酵母tRNA、100μg/ml ヘパリンナトリウム、1×デンハート溶液、0.1% ツイーン20、0.1% CHAPS及び5mM EDTA)中で洗ってから、回転ハイブリダイゼーションオーブン中で、一晩、60〜65℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で予備ハイブリダイズする。上記のように調製したリボプローブを95℃に30分間加熱して、肢組織に1μg/mlの濃度で加える。ハイブリダイゼーションを、48〜72時間にわたって、60〜65℃で行う。未結合のリボプローブを除去するために、これらの組織をハイブリダイゼーション溶液中で、20分間、65℃で洗浄し、次いで、2×SSC中で、65℃で、各20分ずつ3回洗い、そして0.2×SSC中で、65℃で、各30分ずつ2回洗う。
【0144】
ハイブリダイゼーションプローブを、試料をMAB(100mM マレイン酸、150mM NaCl、pH7.5)中で洗ってから、MAB−B(2mg/ml BASを含むMAB)中で洗うことによって検出する。これらの組織を、抗体ブロッキング溶液(MAB−B中の20% 熱不活化ヒツジ血清)で、一晩、4℃で処理する。同時に、アルカリホスファターゼを結合させた抗ジゴキシゲニン抗体(Roche、Boehringer−Mannheim)を、ブロッキング溶液中で1:400に希釈し、10mg/ml イモリ肢粉末と一晩4℃で予備吸着させる。予備吸着後に、このイモリ粉末を遠心分離により除去して、抗体を、ブロッキング溶液中で、1:1000に希釈(更なる2.5倍希釈)して、これらの組織試料に加える。抗体インキュベーションを一晩4℃で行う。組織を、MABで、室温で10回(各30分ずつ)洗浄してから、AP緩衝液(100mM トリス−HCl、pH9.5、100mM NaCl、50mM MgCl2)で2回洗う。これらの組織を、アルカリホスファターゼの基質NBT/BCIP(1mM レバミソールを含むAP緩衝液中)中で、1〜6時間、暗黒中でインキュベートする。これらの組織を、PBST中で数回洗ってから、緩衝された4% パラホルムアルデヒド中で、一晩、後固定する。試料を、70%エタノール中で一回洗浄してから、−20℃でメタノール中に保存する。組織を、1:2のベンジルアルコール:ベンジルベンゾエート溶液(BABB)中で清浄化する。全載組織を、写真に撮って、この遺伝子の全体的発現を測定する。
【0145】
全載イン・シトゥーハイブリダイゼーション及び写真撮影に続いて、それらの細胞発現パターンを、それらの組織をパラフィン中に埋めて12〜20μmのブロックに切片化することにより評価する。組織切片を調べて写真に撮る。
【0146】
組織切片のイン・シトゥーハイブリダイゼーション もし全載手順が、判読するのに弱すぎる発色シグナルを生成するならば、組織切片におけるイン・シトゥーハイブリダイゼーションを行うことができる。切断後に、組織をOCTにて直ちに凍結する。これらの組織を、クリオスタットを10μmで用いて切片化し、1時間、4% パラホルムアルデヒド DEPC−PBS中で固定する。これらのスライドを、2×SSC(DEPC処理済)中で洗ってから、0.2M HClで8分間処理する。これらの組織を0.1M トリエタノールアミン(pH7.9)ですすぎ、0.1M トリエタノールアミン中の0.25% 無水酢酸で15分間アセチル化する。これらのスライドを、2×SSCで洗い、ハイブリダイゼーション溶液(50% ホルムアミド、4×SSC、1×デンハート溶液、500μg/ml 熱変性ニシン精子DNA、250μg/ml 酵母tRNA及び10% デキストラン硫酸)中の熱変性リボプローブ(80℃、3分間)をこれらの組織切片に加える。カバーガラスをこれらの組織の上にシールして、ハイブリダイゼーションを、加湿チャンバー内で、一晩、55℃で行う。これらの組織を2×SSC中で洗ってから、STE(500mM NaCl、20mM トリス−HCl、pH7.5及び1mM EDTA)中で洗い、RNアーゼA(STE中の40μg/ml)で、30分間、37℃で処理する。切片を、2×SSC、50% ホルムアミドで、55℃で洗浄してから、1×SSCで、室温で洗い、最後に、0.5×SSCで、室温で洗浄する。
【0147】
結合したリボプローブは、スライドを、1分間緩衝液1(100mM トリス−HCl、pH7.5、150mM NaCl)中で洗った後に、それらの組織を緩衝液1中の2% ヒツジ血清でブロックすることにより検出する。アルカリホスファターゼに結合させたヒツジの抗ジゴキシゲニン抗体(Roche)を、1% ヒツジ血清を含む緩衝液1で1:500に希釈し、これらの組織に加えて、加湿チャンバー内で室温で1時間にわたってインキュベートする。次いで、スライドを、緩衝液1で洗い、その後、緩衝液2(100mM トリス−HCl、pH9.5、100mM NaCl、50mM MgCl2)で洗う。基質溶液(緩衝液2中のNBT/BCIP及び1mM レバミソール)をこれらの切片に加え、それらのスライドを暗黒中で4℃で一晩インキュベートする。この反応を、これらのスライドを緩衝液3(10mM トリス−HCl、pH8.0、1mM EDTA)中に置くことにより停止させる。これらの組織をマウントして、光学顕微鏡により発色染色につき観察する。
【0148】
候補の細胞柔軟性遺伝子の優先順位決定 候補の細胞柔軟性遺伝子を、それらの遺伝子ファミリー、転写誘導の程度及び細胞発現パターンによって優先順位を決定することができる。有意にアップレギュレートされた遺伝子及び潜在的な細胞外シグナリング分子(例えば、成長因子、サイトカイン又は他のリガンド)をコードする遺伝子は、直接的候補である。かかる遺伝子は、内部断端細胞の細胞脱分化を開始する因子をコードしうる。主要な関心ある他の遺伝子には、レセプター(開始リガンドと結合することができる)、キナーゼ(脱分化シグナルの細胞内変換において役割を演じることができる)、及び転写因子(脱分化又は分化状態の維持に関与する下流遺伝子を誘導し又は抑制する応答遺伝子でありうる)が含まれる。メタロプロテイナーゼは、細胞外マトリクスを中途妨害することによって細胞脱分化に関与しうる。最後に、切断後顕著にアップレギュレートされるが如何なる公知の遺伝子ファミリーにも属さない新規な遺伝子は、細胞柔軟性の調節において機能しうるので関心が持たれる。
【0149】
30〜100の差次的に発現される遺伝子を、このアプローチによって予想することができ、それら遺伝子の最大50%がミトコンドリア遺伝子、全体的細胞周期遺伝子、又は他のハウスキーピング遺伝子であることはありそうなことであり、それ故、RNLE成分であることはありそうもない。次いで、残りの候補の遺伝子を、下記のように、細胞脱分化の開始又は誘導における機能について試験する。
【0150】
(e)候補の遺伝子が細胞柔軟性に役割を演じるかどうかを測定するアッセイ
次いで、細胞柔軟性の調節のための候補である差次的に発現される遺伝子を試験して、それらが、培養マウスC2C12筋管における細胞脱分化を、又は他の具体例においては、イン・ビトロ培養ヒト細胞の脱分化を誘導するように機能するかどうかを測定する。マウスの筋管は、初期肢再生体(切断後1〜5日目)からのタンパク質抽出物で処理した場合又は成長因子の存在下でのmsx1の異所的発現を誘導した場合に脱分化を誘導することができる。同様のアプローチの利用により、候補の遺伝子が、細胞脱分化を誘導するかどうかを測定することができる。もし候補の遺伝子が、分泌タンパク質(多分、成長因子、サイトカイン又は他のリガンド)をコードしているようであれば、それを発現ベクター中にクローン化して、マウスの筋管をその発現されたタンパク質で処理することが細胞脱分化を誘導しうるかどうかを測定する。もしその遺伝子が細胞因子をコードして、下にある断端組織中で発現されるならば、それを、哺乳動物発現ベクター中にクローン化してその発現をマウスの筋管において誘導し、次いで、その遺伝子の異所的発現がマウスの筋管の脱分化を誘導することができるかどうかを測定する。もし単一遺伝子が、脱分化を誘導することができなければ、様々な候補遺伝子の組合せを、それらの細胞柔軟性を誘導する能力について試験する。遺伝子の組合せが細胞柔軟性を誘導できないならば、再生中でない肢の抽出物を調製してから、それらの抽出物(それら自身は、脱分化を誘導しない)が、候補遺伝子との組合せにおいて、脱分化を誘導できるかどうか測定する。
【0151】
候補のイモリ遺伝子のマウス筋管の脱分化を開始する能力についての試験 配列が、分泌される可溶性因子であることを示唆する遺伝子を、マウス筋管の細胞脱分化を開始するそれらの能力について試験する。分泌される遺伝子が細胞脱分化を開始することができるかどうかを測定する比較的容易なアプローチは、培養COS−7細胞を、哺乳動物プロモーター例えばCMVプロモーターにより駆動される候補遺伝子を含むプラスミド構築物でトランスフェクトすることである。トランスフェクションの数日後に、細胞培養培地を集める。COS−7細胞中で発現された分泌された可溶性タンパク質は、この調整培地中に存在する。次いで、この調整培地を用いて、最終分化したマウスの筋管又は培養ヒト細胞を処理して、発現されたタンパク質が脱分化過程を開始することができるかどうかを測定することができる。対照は、擬似的にトランスフェクトしたCOS−7細胞に由来する調整培地よりなる。
【0152】
単一の候補の遺伝子は、細胞脱分化を開始することができないが、候補遺伝子の組合せは、かかる応答を誘導することができる。それ故、単一の遺伝子が独力で脱分化を開始できないならば、候補の脱分化遺伝子の組合せのCOS−7細胞への同時トランスフェクションを行ってから、その結果生成した調整培地が細胞脱分化を誘導することができるかどうかを測定する。或は、単独遺伝子をトランスフェクトしたCOS−7細胞に由来する調整培地を合わせて、その合わせた培地を用いて、脱分化アッセイを行うことができる。
【0153】
COS−7細胞のトランスフェクション及び調整培地中の候補のタンパク質の存在の確認 COS−7L細胞を、0.1mM 非必須アミノ酸(NEAA)及び10% FBSを含むDMEMにて、37℃で、5% CO2中で生育させて継代する。トランスフェクションの前日に、2×106の細胞を、100mm ポリ−D−リジン被覆した組織培養プレート上の12mlの成長培地中に置く。ヘマグルチニンタグを完全長cDNAの3’末端に加えて、調整培地中のタンパク質の存在を確認できるようにする。完全な構築物をpBK−CMV発現ベクター中にクローン化し、リポソーム媒介のトランスフェクションを利用して培養COS−7L細胞中にトランスフェクトする。調整培地を集めて、トランスフェクションの開始後48時間で、脱分化アッセイに利用する。
【0154】
この調整培地を、ウエスタンブロット分析を用いて、候補の脱分化タンパク質の存在について調べる。タンパク質を、4〜20%の直線的勾ゲル上で分離してから、電気泳動によりナイロン膜に移す。これらの膜を風乾し、5%脱脂粉乳でブロックしてから、ブロッキング溶液中で1:1000に希釈した抗ヘマグルチニン抗体(monoHA.11、BabCo)を含む溶液中で、4℃で一晩インキュベートする。これらのブロットを徹底的に洗い、1時間にわたって、ペルオキシダーゼを結合した抗マウスIgG二次抗体(ブロッキング溶液で1:1000に希釈)とインキュベートする。これらのブロットを徹底的に洗い、増強化学発光を行って、候補の脱分化タンパク質が調整培地中に存在するかどうかを測定する。
【0155】
候補のタンパク質の、細胞周期再入を誘導する能力についての試験
候補のタンパク質が、マウスの筋管の細胞周期への再入を誘導することができるかどうかを測定するために、BrdU取り込み実験を実施する。簡単にいえば、C2C12筋管(又は、培養ヒト細胞)を、生育培地(GM20% FBS及び4mM グルタミンを加えたDMEM)中で、24ウェルプレート中で集密になるまで生育させてから、GMを分化用培地(DM2% ウマ血清及び4mM グルタミンを加えたDMEM)で置き換えることにより分化を誘導する。筋細胞を、4日間にわたって分化させる。次いで、異なるウェル中のC2C12筋管を調整培地の種々の希釈物(希釈なし、1/2、1/4、1/8、1/16倍希釈、及び調整培地を含まない対照用ウェル)で最長4日にわたって処理する。BrdUをこれらの培養に10nモル/mlの濃度で加えてから12時間後に、細胞周期への再入を調べる。BrdU取り込みを、5−ブロモ−2’−デオキシ−ウリジン標識を用いてアッセイする。簡単にいえば、これらの細胞を徹底的にPBSで洗い、20分間、−20℃で70%エタノール/15mM グリシン緩衝液(pH2.0)で固定して、再び洗う。次いで、細胞を、抗BrdU抗体の1:10希釈物中で30分間、37℃でインキュベートする。これらの細胞を洗ってから、フルオレセインを結合した抗マウスIgG中で30分間、37℃でインキュベートする。洗浄後に、これらの細胞を顕微鏡で観察し、FITCフィルターを用いて写真を撮る。緑色の蛍光を発する核を含む細胞は、DNA合成に際してBrdUを取り込んでおり、細胞周期に再入したものとみなす。細胞周期再入が細胞脱分化において重要な役割を演じるとすれば、細胞周期への再入を誘導する任意の候補のイモリ遺伝子は、細胞脱分化の開始及び柔軟性のための重要な遺伝子であると考えられる。
【0156】
候補のタンパク質の、筋肉分化タンパク質のレベルを下げる能力についての試験 候補の遺伝子が筋肉分化タンパク質のレベルを下げることができるかどうかを測定するために、上記のマウスの筋管(又は、培養ヒト筋細胞)を、候補の遺伝子を発現しているCOS−7L細胞に由来する調整培地で処理する。処理の3日後に、免疫蛍光アッセイを行って、MyoD、ミオゲニン、MRF4、トロポニンT及びp21のレベルの低下があったかどうかを測定する。MyoD、ミオゲニン及びMRF4は、筋発生の重要なレギュレーターであり、他方、p21は有糸分裂後状態の開始を知らせ、トロポニンTは、収縮装置の成分である。これらの因子の全部が、C2C12筋管中で正常に発現され、それらのレベルの減少は、細胞分化の逆転を意味する。これらの細胞を、PBSで洗い、ザンボニ固定液中で10分間固定し、再びPBSで洗って、DPBS中の0.2% トリトンX−100で20分間透過性にする。これらの細胞を、DPBS中の5% スキムミルクで、1時間、室温でブロックしてから、一次抗体に一晩、4℃でさらす(MyoD、ミオゲニン、MRF4、トロポニンT及びp21を認識する一次抗体を使用)。これらの細胞を洗ってから、用いた一次抗体に依って、Alexa488に結合させたヤギ抗ウサギIgG、ビオチンに結合させたヤギ抗マウスIgG又は両方の二次抗体で、45分間にわたって、37℃で処理する。これらの細胞を洗ってから、蛍光により観察し又はストレプトアビジン−Alexa594で、45分間にわたって、37℃で処理する。後者の細胞を洗ってから、FITCとテキサスレッドフィルターを用いて蛍光顕微鏡により観察する。細胞核を視覚的に観察して、筋発生調節因子MyoD、ミオゲニン及びMRF4、及びp21のレベルが低下したかどうかを測定する。細胞質を観察して、トロポニンTレベルが低下したかどうかを測定する。これらの筋肉分化タンパク質の低下したレベルは、筋管脱分化の別の指標である。対照用に、調整培地で処理してない細胞を利用する。それ故、これらの細胞変化を誘導することのできる任意の候補の遺伝子は、細胞脱分化の開始及び柔軟性のための重要な遺伝子と考えられる。
【0157】
候補のタンパク質の、筋管開裂及び細胞増殖を誘導する能力についての試験 細胞周期への再入及び/又は筋肉分化タンパク質レベルの低下を開始する任意の候補の遺伝子を、細胞の開裂及び増殖を誘導する能力について試験する。筋管(又は、ヒトの筋細胞)を上記のように生成させる(但し、多数を100mm組織培養プレート上にプレートする)。これらの細胞を精製して、低密度で再プレートする。残留単核細胞をニードルアブレーション及び致死的水注入により除去する。これらの細胞を写真に撮り、調整培地を加えて、視覚的検査及び写真撮影により最長7日間にわたってモニターする。調整培地を含む細胞培養培地を、毎日交換する。筋管の一層小さい筋管を形成する開裂又は増殖する単核細胞は、細胞脱分化を示すものと考えられる。筋管開裂を開始することのできる任意の候補の遺伝子は、細胞の脱分化及び柔軟性のための重要な遺伝子であると考えられる。
【0158】
(f)脱分化における可能な役割のための細胞タンパク質をコードする候補の遺伝子の試験
下にある断端中で発現されて細胞タンパク質例えばレセプター、転写因子又はシグナル変換タンパク質をコードするらしい候補の遺伝子を、それらをマウス(又はヒトの)筋管を異所的に発現させることにより、細胞脱分化における可能な役割について調べる。ドキシサイクリン抑制可能な候補の遺伝子を含むレトロウイルス構築物(LINX)を、CaPO4法を利用して、Phoenix−Amphotropic細胞にトランスフェクトし、その結果生成した組換えレトロウイルスを、調整培地を保存することにより収穫する。筋芽細胞にこの組換えレトロウイルスを、この調整培地を筋芽細胞に4μg/ml ポリブレンの存在下で加えることにより感染させて、12〜18時間にわたって感染を生じさせる。この感染培地を、2μg/ml ドキシサイクリンを含む筋芽細胞生育培地と交換して、候補の遺伝子の発現を阻止する。これらの細胞を48時間にわたって生育させ、サブクローン化し、2μg/ml ドキシサイクリン及び750μg/ml G418の存在下で生育させて、トランスダクションされた筋芽細胞について選択する。選択を14日にわたって続け、クローン化集団を導く。候補の遺伝子を、DM−doxをdoxを欠く培地で置き換えることにより、拡大したクローンにおける筋管形成後に誘導する。次いで、これらの細胞を、上記のように、細胞周期への再入、筋肉分化タンパク質の減少、並びに細胞の分裂及び増殖について試験する。細胞脱分化のこれらの指標の何れかを示す候補の遺伝子は、細胞脱分化経路における重要な応答遺伝子と考えられる。
【0159】
或は、他のアプローチは、細菌細胞又は真核生物細胞中で発現された候補のタンパク質の精製を含むことができる。これらの精製タンパク質を、次いで、特定の濃度で、この提案中に記載した細胞脱分化アッセイにおいて利用することができる。
【0160】
5.活性なRNLE成分を同定するための抗体の作成及び利用
RNLEの活性な成分がタンパク質、ポリペプチド又はペプチドであることはありそうなことである(実施例参照)から、特に、遺伝子又は差次的ディスプレーによるアプローチが困難であるか非生産的であるならば、抗体を用いるアプローチを採ることができる。
【0161】
このアプローチにおいては、抗体を、選択した宿主において、全RNLE中の又はRNLEの画分中の抗原に対して生成する。好ましくは、この宿主は、該宿主から最終的にモノクローナル抗体mAbを誘導することのできるものである。一度抗体が生成されたならば、それらを、先ずイン・ビトロで、次いで、イン・ビボで、RNLE依存性の過程例えば筋管の脱分化又はイモリの肢の再生をブロックする能力について試験する。次いで、かかる抗体を用いて、ヒト(又は、他の生物)の同族体を、様々なアプローチを利用して、例えばヒトの発現ライブラリーをスクリーニングし、抗原含有ポリペプチドを抗体アフィニティークロマトグラフィーにより単離して末端ペプチド配列決定を実施し、そしてかかる配列を利用して、対応するポリペプチドをコードする核酸を単離するためにイン・シリコ実験を行い又は核酸プローブ及びプライマーをデザインすることにより単離することができる。
【0162】
「抗体」(Ab)は、RNLEに対する単一のAb(抗RNLE Ab;アゴニスト、アンタゴニスト及び中和Abを含む)、抗RNLE Ab組成物(ポリエピトープ特性を有する)、一本鎖抗RNLE Ab及び抗RNLE Abの断片を含む。「モノクローナル抗体」は、実質的に均質なAbの集団から得られる(即ち、この集団を構成する個々のAbは、少数存在しうる可能な天然の突然変異を除いて同一である)。Abは、ポリクローナル(pAb)、モノクローナル(mAb)、ヒト化、二官能性(bsAb)及びヘテロ結合型Abを包含する。
【0163】
下記は、このアプローチの一変形を概説するものである。当業者は、他の変形を選択することができ、又は下記のものからそれてしかも尚同じ目的を達成することができる。
【0164】
イモリの肢の抽出物を上記(III.A)のようにして、多量に調製する。好ましくは、この抽出物を、透析などにより濃縮して水性成分を最少にする。或は、これらのタンパク質を、当分野で公知の任意の方法例えば硫安沈殿又はトリクロロ酢酸沈殿によって単離することができる。この調製物を抗原として利用する。
【0165】
(a)ポリクローナルAb(pAb)
ポリクローナルAbは、哺乳動物宿主において、例えば少なくとも一回の免疫原(RNLE)(及び、所望であればアジュバント)の注射により生成することができる。典型的には、この免疫原及び/又はアジュバントを、哺乳動物に、多数回の皮下注射又は腹腔内注射によって注射する。アジュバントの例には、完全フロイントアジュバント及びモノホスホリル脂質A合成トレハロースジコリノミコレート(MPL−TDM)が含まれる。免疫応答を改善するために、免疫原を、宿主において免疫原性であるタンパク質例えばカサガイヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及び大豆トリプシンインヒビターと結合することができる。抗体産生のプロトコールは、十分に記載されている(Ausubel等、1987;Harlow及びLane、1988)。或は、pAbを、ニワトリにおいて作成して、IgY分子を生成することができる(Schade等、1996)。
【0166】
(b)モノクローナルAb(mAb)
抗RNLE mAbを、ハイブリドーマ法(Milstein及びCuello、1983)を利用して製造することができる。ハイブリドーマ法は、少なくとも次の4つのステップを含む:(1)宿主又は宿主由来のリンパ球の免疫化;(2)mAbを分泌する(又は、潜在的に分泌する)リンパ球の収穫、(3)それらのリンパ球の不滅化細胞との融合、及び(4)所望(抗RNLE)のmAbを分泌する細胞の選択。
【0167】
マウス、ラット、テンジクネズミ、ハムスター、又は他の適当な宿主を免疫化して、免疫原に特異的に結合するAbを生成し又は生成しうるリンパ球を誘出する。或は、これらのリンパ球を、イン・ビトロで免疫化することができる。もしヒトの細胞が所望であれば、一般に、末梢血リンパ球(PBL)を使用するが;他の哺乳動物起源に由来する脾臓細胞又はリンパ球が好適である。免疫原には、典型的には、RNLE又は融合タンパク質が含まれる。
【0168】
これらのリンパ球を、次いで、不滅化した細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成するが、ポリエチレングリコール(Goding、1996)などの融合剤により促進する。トランスフォーメーションにより不滅化したゲッ歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞を利用することができる(又はラット若しくはマウスミエローマ細胞株)。未融合の不滅化細胞でないハイブリドーマ細胞の純粋な集団が好ましいので、融合後の細胞を、未融合の不滅化細胞の生育又は生存を阻止する少なくとも一種の物質を含む適当な培地で生育させる。一般的技術は、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠く親細胞を利用する。この場合には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンをこの培地(HAT培地)に加えて、ハイブリドーマの生育を許しつつ、HGPRT欠損細胞の生育を阻止する。
【0169】
好適な不滅化細胞は、効率的に融合して、HATなどの培地での選択により混合集団から単離することができ、そして融合後に抗体の安定且つ高レベルの発現を支持することができる。好適な不滅化細胞株は、マウスミエローマ株であり、American Type Culture Collection (バージニア、Manassas在)から入手可能である。ヒトのミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株も又、ヒトmAbの製造のために記載された(Kozbor等、1984;Schook、1987)。
【0170】
ハイブリドーマ細胞は抗体を細胞外に分泌するので、それらの培養培地を、RNLEに対するmAb(抗RNLEmAb)の存在についてアッセイすることができる。免疫沈殿又はイン・ビトロ結合アッセイ例えばラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、mAbの結合特異性を測定し(Harlow及びLane、1988;Harlow及びLane、1999)、スキャッチャード分析(Munson及びRodbard、1980)を含む。
【0171】
抗RNLEmAbを分泌するハイブリドーマ細胞を、単一クローンから限界希釈手順によって分離してサブクローン化することができる(Goding、1996)。適当な培養培地には、ダルベッコ改変イーグル培地、RPMI−1640、又は所望であれば無タンパク質若しくは低タンパク質の又は無血清の培地が含まれる(例えば、Ultra DOMA PF又はHL−1;メリーランド、Walkersville在、Biowhittaker)。これらのハイブリドーマ細胞は又、腹水としてイン・ビボで生育させることもできる。
【0172】
これらのmAbを、培養培地又は腹水液から慣用のIg精製手順例えばプロテインA−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫安沈殿又はアフィニティークロマトグラフィーにより、単離し又は精製することができる(Harlow及びLane、1988;Harlow及びLane、1999)。
【0173】
これらのmAbは又、組換え法によって作成することもできる(米国特許第4166452号、1979)。抗RNLE mAbをコードするDNAは、容易に単離することができ、慣用の手順を用いて配列決定をすることができ、例えば、マウスの抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、好ましくは、抗RNLE分泌性mAbハイブリドーマ細胞株から単離したDNAをプローブ検出することができる。一度単離すれば、それらの単離されたDNA断片を発現ベクター中にサブクローン化し、次いで、それらを宿主細胞例えばサルのCOS−7細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又はミエローマ細胞(トランスフェクトしなければ、Igタンパク質を生成しない)にトランスフェクトしてmAbを発現させる。これらの単離されたDNA断片を、例えば、ヒトの重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を相同なマウス配列の代りに代用することにより(米国特許第4816567号、1989;Morrison等、1987)、又はIgコード配列を非Igポリペプチドのコード配列の全部又は部分と融合させることによって改変することができる。かかる非Igポリペプチドは、抗体の定常ドメインの代用とすることができ、又は一つの抗原結合部位の可変ドメインの代用としてキメラの二価抗体を造ることができる。
【0174】
i.機能ブロッキング抗体のスクリーニング
もし機能ブロッキング抗体を所望するのであれば、プール中のハイブリドーマ上清のスクリーニングが魅力的な選択を代表する。単一細胞への限界希釈の前に、融合後のハイブリドーマを、2〜数千の細胞を含むプール(2以上の異なる抗体に相当する)に分ける。これらの上清又はその調製物を用いて、上記の筋管の脱分化などの任意のアッセイ(4(e、f))においてRNLE様活性を阻止する能力;好ましくは、イモリの肢の再生能力を阻止する能力についてスクリーニングすることができる。次いで、機能ブロッキング活性を示すプールを、一層小さいプールに希釈ことによりサブクローン化し、スクリーニングを繰り返し、そして活性プールの希釈を繰り返す。この工程をクローナルハイブリドーマ細胞が達成されるまで繰り返す。この場合、機能ブロッキングは、必ずしも、機能の全体的阻止を示すものではなく;RNLEの活性に反する効果を示す任意の抗体は候補である。
【0175】
一度かかるクローナル株が達成されたならば、それらの抗体を用いて、それらが結合するポリペプチドを単離することができ、ヒト又は他の動物の同族体の同定を進めることができる。
【0176】
ii.ヒトのRNLE成分の同定
上で同定された抗体を用いて、抗原含有ポリペプチドをアフィニティー精製することができる。一度これらのポリペプチドが単離されたならば、それらを、当業者に公知の多くの方法で分析して、それらの配列(例えば、N末端配列)を決定することができる。一度ペプチド断片配列が知れれば、その配列を利用して、同じか又は類似するタンパク質をタンパク質−タンパク質BLAST検索を利用して同定することができ、又は核酸プライマー及びプローブをデザインすることができる。かかるプローブ(遺伝コードの縮重のために縮重している)を用いて、抗体抗原の同族体をコードしている候補の核酸分子を同定することができる。好ましくは、cDNAライブラリーをスクリーニングし;一層好ましくは、ヒト由来のcDNAライブラリーをスクリーニングする。
【0177】
或は、これらの抗体自身を利用して、他の種に由来する類似の又は同一のタンパク質を直接同定することができる。例えば、発現ライブラリー(好ましくは、ヒト由来)を、これらの抗体を用いてスクリーニングすることができる。結合が認められた場合には、そのシグナルは、候補のヒトの同族体タンパク質を示す。或は、タンパク質のミスコンホメーションが細菌媒介の発現ライブラリーで生成されたタンパク質の抗体結合を妨げる場合には、パニングアプローチ又はアフィニティークロマトグラフィーを利用することができる。
【0178】
6.候補のアプローチ
本発明者は、表C1に列記したポリペプチド又はそれらの同族体がREの成分であることはありそうなことであると考えている。
【0179】
【表6】
【0180】
様々なアプローチを利用して、候補の化合物が、REにおいて活性であるかどうかを同定することができる。当業者は、このアプローチを選択するであろう。例えば、アンチセンス又はアプタマーアプローチを利用して、再生中のイモリの肢の細胞内の候補の成分の発現を、当分野で周知の技術を利用し、次いで、その肢についての再生する能力を試験することにより、阻止することができる。或は、当分野で利用可能な様々な成分に対する機能ブロッキング抗体を利用して、イモリの肢の再生を阻止することができる。もしこの肢が、完全に分化することができないならば、その成分が、REに含まれていることはありそうなことである。
【0181】
C.msx1
この発明は、細胞の脱分化及び再生(msx1を利用)の方法を提供する。msx1は細胞内因子であるので、それは、細胞に導入しなければならない。次の3つの方法が、企図される:(1)msx1を核酸ベクター内にサブクローン化してから他のベクター(アデノウイルスなど)によって関心ある細胞に送達するか又は直接送達する核酸及び遺伝子治療アプローチ;(2)msx1を通常細胞に入るポリペプチド例えばHIVtatタンパク質(表C参照)に融合させて;適当な医薬組成物に混合することにより送達に影響しうる融合msx1ポリペプチド;及び(3)msx1の、リポソームなどに入れての、細胞に取り込まれる組成物への混合。医薬組成物及びそれらの利用の詳細は、本明細書中に見出すことができる。
【0182】
以下の節はmsx1遺伝子治療及び分子操作に属するが、これらの方法は、やはり核酸を利用するこの発明の他の部分(例えば、差次的発現によるhRNLEの生成など)に適用可能である。
【0183】
1.遺伝子治療用組成物
このmsx1核酸分子(又は、任意の活性なRDF成分をコードする核酸分子)をベクターに挿入して、遺伝子治療用ベクターとして利用することができる。遺伝子治療用ベクターは、患者に、例えば、静脈注射、局所投与(Nabel及びNabel、米国特許第5,328,470号、1994)により又は定位注射によって送達することができる(Chen等、1994)。遺伝子治療用ベクターの医薬製剤は、許容しうる希釈剤を含むことができ、又は遺伝子送達用ビヒクルを埋め込んだ低速で放出するマトリクスを含むことができる。或は、完全な遺伝子送達用ベクターは、組換え細胞から無傷で生成することができ(例えば、レトロウイルスベクター)、この医薬製剤は、遺伝子送達システムを生成する少なくとも一つの細胞を含むことができる。
【0184】
2.ベクター
ベクターは、DNAを宿主細胞間で往復輸送するのに用いられ又はヌクレオチド配列を発現させる手段として用いられるツールである。幾つかのベクターは、原核生物においてのみ機能するが、他のものは、原核生物と真核生物の両方で機能して、真核生物での発現のための原核生物からの大規模なDNAの調製を可能にする。関心あるDNA例えばmsx1ヌクレオチド配列又は断片の挿入を連結技術及び/又は交配プロトコール(当業者に周知)により達成する。かかるDNAを、ベクターの如何なる機能的構成要素をも破壊しないように挿入する。導入したDNAは、転写及び翻訳を支配するベクターのエレメントに操作可能に結合する。
【0185】
ベクターは、2つの一般的なクラスに分けることができる:クローニングベクターは、適当な宿主細胞での増殖に必須でなく、外来DNAを挿入することのできる領域を有する複製するプラスミド又はファージであり;外来DNAは、そのベクターの構成要素であるかのように複製して増殖する。発現ベクター(例えば、プラスミド、酵母、又は動物ウイルスゲノム)は、外来DNAを転写させて翻訳するために、宿主細胞又は組織に外来遺伝物質を導入するために用いられる。発現ベクターにおいて、導入されたDNAは、宿主細胞に挿入されたDNAを転写するように合図するプロモーターなどのエレメントに操作可能に結合される。特異的な因子に応じて遺伝子の転写を制御する誘導性プロモーターなどの幾つかのプロモーターは、非常に有用である。誘導性プロモーターに操作可能に結合したmsx1又はアンチセンス構築物は、msx1若しくは断片又はアンチセンス構築物の発現を制御することができる。古典的な誘導性プロモーターの例には、α−インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、及びステロイド例えばグルココルチコイド(Kaufman、1990)及びテトラサイクリンに応答するものが含まれる。他の望ましい誘導性プロモーターには、構築物を導入される細胞にとって内因性でないが、誘導剤が外因的に供給された場合にそれらの細胞において応答性であるものが含まれる。
【0186】
ベクターは、多くの異なる表示を有する。「プラスミド」は、追加のDNAセグメントを導入することのできる環状二本鎖DNA分子である。ウイルスベクターは、追加のDNAセグメントをウイルスゲノム中に受け入れることができる。ある種のベクターは、宿主細胞中で自律的に複製することができる(例えば、細菌用の複製起点を有する細菌用ベクター及びエピソーム性哺乳動物用ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム性哺乳動物用ベクター)は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、その宿主ゲノムと共に複製される。しかしながら、他の形態の発現ベクター例えばウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)は、企図される。かかるベクターは、遺伝子治療応用において、極めて有用でありうる。
【0187】
msx1(又は、断片)を含む組換え発現ベクターは、msx1に操作可能に結合した少なくとも一つの宿主細胞応答性の(又は、イン・ビトロで操作することのできる)調節配列を利用することによりmsx1転写を調節する。「操作可能に結合した」は、関心あるヌクレオチド配列を調節配列にそのヌクレオチド配列の発現が達成されるように結合することを示す。
【0188】
ベクターを様々な生物及び/又は細胞に導入することができる(表D)。或は、これらのベクターを、例えばT7プロモーターの調節配列及びT7ポリメラーゼを利用して、イン・ビトロで、転写及び翻訳を行なうことができる。
【0189】
【表7】
【0190】
ベクターの選択は、用いる生物又は細胞及び所望のベクターの運命により指図される。ベクターは、一度標的細胞内に入れば複製することができ、又は「自殺」ベクターであってよい。一般に、ベクターは、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列を含む。これらのエレメントの選択は、ベクターを用いる生物に依存し、容易に決定できる。これらのエレメントの幾つかは、条件付きであってよく、例えば、誘導性又は条件付きプロモーターであってよく、これは、条件が適当であれば「オン」になる。誘導性プロモーターの例には、発現をある細胞型に属させる組織特異的なもの、ステロイド応答性のもの、又は熱ショック反応性のものが含まれる。幾つかの細菌性抑制システム(例えば、lacオペロン)は、哺乳動物細胞及びトランスジェニック動物において利用されてきた(Fieck等、1992;Wyborski等、1996;Wyborski及びShort、1991)。ベクターは、しばしば、選択マーカーを利用して、そのベクターを取り込んだ細胞の同定を容易にする。多くの選択マーカーが、原核生物を用いる利用技術において周知であり(通常、抗生物質耐性遺伝子)、又は独立栄養変異体及び栄養要求性変異体の利用技術において周知である。
【0191】
msx1発現を所望しないならば、アンチセンス及びセンスmsx1オリゴヌクレオチドを利用して、msx1ポリペプチド発現を阻止することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列に結合して二重鎖を形成し、これは、それらの二重鎖の分解を増進し、時期尚早に転写若しくは翻訳を終了し、又は他の手段によって、標的配列の転写又は翻訳をブロックする。
【0192】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、標的msx1mRNA(センス)又はmsx1DNA(アンチセンス)配列に結合することのできる一本鎖核酸(RNA又はDNA)である。本発明により、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも約14ヌクレオチドの(好ましくは、約14〜30ヌクレオチドの)msx1DNAコード領域の断片を含む。一般に、アンチセンスRNA又はDNA分子は、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100塩基長又はそれ以上を含むことができる。他の内で、(Stein及びCohen、1988;van der Krol等、1988)は、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを所定のcDNA配列から誘導する方法を記載している。
【0193】
アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドの修飾は、それらの有効性を増大させることができる。修飾された糖−ホスホジエステル結合又は他の糖結合(WO91/06629、1991)は、標的配列への結合特異性を破壊することなく内因性ヌクレアーゼに対する耐性を与えることによってイン・ビボ安定性を増大させる。共有結合した有機部分(WO90/10448、1990)又はポリ−(L)−リジンなどの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの標的への親和性を増大させることができる。金属錯体又はインターカレーティング剤(例えば、エリプチシン)及びアルキル化剤を含む他の付着物は、オリゴヌクレオチド標的への結合特異性を改変する。
【0194】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞(標的核酸配列を含む細胞)に導入するためには、任意の遺伝子トランスファー方法を利用することができ、これらの方法は、当業者は周知である。遺伝子トランスファー方法の例には、(1)生物学的方法、例えば、エプスタイン−バールウイルスのような遺伝子トランスファー用ベクター又は外因性DNAのリガンド結合分子への結合(WO91/04753、1991)、(2)物理的方法、例えば、エレクトロポレーション、及び(3)化学的方法、例えば、CaPO4沈殿及びオリゴヌクレオチド脂質複合体(WO90/10448、1990)が含まれる。
【0195】
用語「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」は、交換可能に用いる。かかる用語は、特定の主題の細胞をいうだけでなく、かかる細胞の子孫又は潜在的子孫をも指す。突然変異又は環境の影響のためにある種の変化が続く世代において生じうるので、かかる子孫は、実際は、親細胞と同じでないかもしれないが、やはり、この用語の範囲に含まれる。
【0196】
真核生物細胞のトランスフェクション及び原核生物細胞のトランスフォーメーションの方法は、当分野において周知である。宿主細胞の選択は、関心ある核酸を導入するために好適な技術を指図するであろう。表E(これは、制限を意味するものではない)に、当分野で公知の多くの技術をまとめた。核酸の生物への導入は、トランスフェクション法並びに確立された遺伝子技術(必要ならば、その特定の生物についての)を利用するエキス・ビボ技術を用いても行うことができる。
【0197】
【表8】
【0198】
ベクターは、しばしば、そのベクターを取り込んだ細胞の同定を容易にするために、特にイン・ビトロで、選択マーカーを利用する。多くの選択マーカーが、原核細胞選択のための技術において周知であり、それは、通常、抗生物質耐性遺伝子であり、又は独立栄養変異体及び栄養要求性変異体の利用である。表Fに、哺乳動物細胞トランスフェクション用の一般的な選択マーカーを列記した。
【0199】
【表9】
【0200】
3.msx1のイン・ビトロでの生成
宿主細胞例えば原核生物又は真核生物宿主細胞を用いて、msx1を生成することができる。msx1をコードする組換え発現ベクターを導入したmsx1又はmsx1融合ポリペプチドのイン・ビトロ生成に有用な宿主細胞には、非制限的例として、大腸菌、COS7及びDrosophila S2が含まれる。好ましくは、かかる細胞は、生成されたポリペプチドを、ヒトなどの患者に導入した場合に免疫応答が引き起こされるような仕方で修飾しない。例えば、ある種の糖の翻訳後修飾は、かかる応答を引き起こしうる。好ましくは、かかる細胞は、活性なポリペプチドを生成する。これらの細胞は、msx1又は所望のポリペプチドが生成されるような適当な培地で培養する。もし必要であれば、msx1を、培地又は宿主細胞から単離する。同じく、Fgfを、適当な対応するポリヌクレオチドを用いて、同様に、生成することができる。
【0201】
D.細胞培養
一次培養を生成するのに適当な培地及び条件は、当分野で周知であって、細胞型により変化し、経験的に決定することができる。例えば、骨格筋、骨、ニューロン、皮膚、肝臓及び胚性幹細胞は、すべて、特定の内容物において異なる培地中で生育する。更に、一つの細胞型のための培地は、研究室ごとに及び研究所ごとに有意に異なりうる。細胞分裂を維持するためには、血清例えばウシ胎児血清を培地に、比較的多量に(5〜30体積%)加える(やはり、細胞型に依存する)。特異的な精製した成長因子又は複数の成長因子のカクテルも加えることができ、ときには、血清の代用とされる。分化を所望し且つ増殖を望まない場合には、
一般に、有糸分裂誘起物質を含む血清を約0〜2体積%に制限する。分化を促進し及び/又は細胞周期停止状態を促進する特異的な因子又はホルモンを利用することもできる。
【0202】
培養中の細胞の生育及び分化中の任意の時間に、特異的な細胞表現型、特異的細胞型の生育及び増殖、又は特異的細胞型の分化の選択のための重要な補助として、生理的酸素条件及び準大気圧酸素条件を利用することができる。一般に、生理的又は低酸素レベル培養は、培養物のアシドーシスを制限する方法例えば強力な緩衝剤(例えば、HEPES)の培地への添加、及び頻繁な培地交換及びCO2濃度の変更によって達成される。
【0203】
酸素に加えて、培養のための他の気体は、典型的には、約5% 二酸化炭素であり、残りは、窒素であるが、適宜、変化する量の一酸化窒素(3ppmほどの低濃度から開始)、一酸化炭素及び他の気体(不活性なものと生物学的に活性なものの両方)を含むことができる。一酸化窒素及び一酸化炭素の両者は、必要であれば、典型的には、非常に少量(即ち、ppmの範囲)で投与する(経験的に又は文献により決定する)。
【0204】
この培地には、様々な成長因子、サイトカイン、血清などを補足することができる。適当な成長因子の例は、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)、トランスフォーミング成長因子(TGFα及びTGFβ)、血小板成長因子(PDGF)、肝細胞成長因子(HGF)、インシュリン様成長因子(IGF)、インシュリン、エリスロポエチン(EPO)及びコロニー刺激因子(CSF)である。適当なホルモン培地添加物の例は、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン又はグルココルチコイド例えばデキサメタゾンである。サイトカイン培地添加物の例は、インターフェロン、インターロイキン又は腫瘍壊死因子α(TNFα)である。当業者は、添加物及び培養成分を、細胞応答、添加物の活性寿命又はそれらの生物活性に影響を与える他の特徴を変えるような種々の培養条件で試験するであろう。加えて、これらの細胞が生育する表面に、それらの細胞の生存、生育及び/又は分化に寄与する様々な基材をプレートすることができる。これらの基材には、ラミニン、EHSマトリクス、コラーゲン、ポリ−L−リジン、ポリ−D−リジン、ポリオルニチン及びフィブロネクチンが含まれるが、これらに限られない。幾つかの例において、3次元培養が望ましい場合には、コラーゲン、EHSマトリクス又はゼラチンなどの細胞外マトリクスゲルを利用することができる。細胞をかかるマトリクスの上で生育させることができ、又はこれらのゲル自身の中へ投入することができる。
【0205】
E.分化中の細胞
1.イン・ビトロの筋管
患者(好ましくは、ヒト)から単離した又はマウス筋芽細胞株から生成させた筋管(実施例参照)を、適当な培地中で、イン・ビトロで培養する。
【0206】
当業者は、如何にして脱分化を達成するために示された条件を変えるかを知るであろう。以下の説明は、説明のための例として示すものである。
【0207】
培養において筋管の脱分化を誘導するためには、REを分化培地(実施例参照)に、細胞を低密度で適当な基材(例えば、組織培養用プラスチック、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、EHSマトリクスなどで被覆した表面)上にプレートした後に、適当な時点で添加する。培地及び抽出物を、好ましくは、毎日交換する。形態的な脱分化を同定するためには、個々の細胞を、0日目に、抽出物の添加前に写真に撮り、抽出物の添加後に、24時間ごとに、最長で10日間(又は、それより長期間)写真に撮る。
【0208】
2.イン・ビトロで分化した細胞
患者(好ましくは、ヒト)から単離した又は細胞株から生成させた細胞を適当な培地中で、イン・ビトロで培養する。
【0209】
当業者は、如何にして、脱分化を達成するために示された条件を変えるのかを知るであろう。以下の説明は、説明のための例として示すものである。
【0210】
培養中の細胞の脱分化を誘導するためには、REを、分化培地(実施例参照)に、細胞を低密度で適当な基材上(例えば、組織培養用プラスチック、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、EHSマトリクスなどを被覆した表面上又は懸濁液中)にプレートした後、適当な時点で添加する。培地及び抽出物を、好ましくは、毎日交換する。形態的な脱分化を同定するためには、個々の細胞を、0日目に、抽出物の添加前に写真に撮り、抽出物の添加後に、24時間ごとに、最長で10日間(又は、それより長期間)写真に撮る。
【0211】
3.イン・ビボの細胞
細胞(好ましくは、損傷部位の細胞)をREと接触させる。REは、医薬組成物に配合して、送達を確実にすることができる。
【0212】
F.医薬組成物
この発明の組成物(RDF成分)及びそれらの誘導体、断片、類似体及び同族体は、医薬組成物に混合することができる。かかる組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質、又は抗体及び製薬上許容しうるキャリアーを含む。「製薬上許容しうるキャリアー」は、任意の及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤など(医薬投与に適合性のもの)を包含する(Gennaro、2000)。かかるキャリアー又は希釈剤の好適な例には、水、塩溶液、リンゲル液、デキストロース溶液、及び5%ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限られない。リポソーム及び非水性ビヒクル例えば固定油を利用することもできる。慣用の媒質又は薬剤が活性化合物と相容れない場合を除いて、これらの組成物の利用は、企図される。補足の活性化合物も又、これらの組成物に混合することができる。
【0213】
これらの活性化合物の投与のための医薬組成物(例えば、RDFのもの)は、好都合にも、投薬単位形態で与えることができ、製薬業界で周知の任意の方法により製造することができる。すべての方法は、活性化合物を少なくとも一種の補助的成分を含むキャリアーと合わせるステップを含む。一般に、医薬組成物は、活性化合物を、液体キャリアー若しくは微粉末固体キャリアー又は両方と均一に且つ密接に合わせてから、必要であれば、製品を所望の配合物に成形する。医薬組成物において、活性化合物は、病気の進行又は病気状態において所望の効果を生じるのに十分量で含まれる。
【0214】
1.一般的考察
この発明の医薬組成物は、その意図した投与経路{皮内、皮下、経口(例えば、吸入)、経皮(即ち、局所)、経粘膜、及び直腸投与を含む}に適合するように配合する。非経口、皮内又は皮下適用のために用いられる溶液又は懸濁液は、無菌の希釈剤、例えば注射用の水、塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒;抗細菌剤例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン;抗酸化剤例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム;キレート剤例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA);緩衝剤例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩、及び張性調節剤例えば塩化ナトリウム又はデキストロースを含むことができる。このpHは、酸又は塩基(塩酸又は水酸化ナトリウムなど)を用いて調節することができる。非経口用製剤は、アンプル、ディスポーサブル注射器又はガラス若しくはプラスチックで作られた多数回投与用瓶に封入することができる。
【0215】
2.注射用配合物
注射に適した医薬組成物には、無菌の水溶液(水溶性の場合)又は分散及び無菌の粉末(無菌の注射溶液又は分散の即時調製用)が含まれる。静脈投与用には、無菌のキャリアーには、生理食塩水、静菌水、CREMOPHOR EL(商標)(ニュージャージー、Parsippany、BASF)又はリン酸緩衝塩溶液(PBS)が含まれる。すべての場合において、この組成物は無菌でなければならず、注射器を用いて投与できるだけ流動性であるべきである。かかる組成物は、製造中及び貯蔵中に安定であるべきであり、微生物(細菌及びカビなど)による汚染から保護されなければならない。キャリアーは、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール)、及び適当な混合物を含む溶媒又は分散媒であってよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、所望の粒径を維持することにより(分散の場合)及び界面活性剤を用いることにより維持することができる。様々な抗細菌剤及び抗カビ剤例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸及びチメロサールは、微生物汚染を含むことができる。等張剤例えば糖類、ポリアルコール例えばマンニトール、ソルビトール、及び塩化ナトリウムをこの組成物に含有させることができる。吸収を遅らせることのできる組成物は、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンなどの薬剤を含む。
【0216】
無菌の注射用溶液は、適当な溶媒中の所望量の活性化合物又は組成物を、所望の単一の成分又は組合せた成分と混合した後に、滅菌することによって調製することができる。一般に、分散は、活性化合物を、基礎分散媒及び論じたような他の所望の成分を含む無菌のビヒクルに混合することにより調製する。無菌の注射用溶液の調製のための無菌粉末の製造方法は、真空乾燥及び凍結乾燥を含み、これらは、活性成分及び任意の所望の成分(無菌溶液に由来する)を含む粉末を生成する。
【0217】
3.経口用組成物
経口用組成物は、一般に、不活性希釈剤又は食べられるキャリアーを含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入することができ、又は錠剤に圧縮することができる。経口治療剤投与の目的のために、活性化合物を賦形剤と混合することができ、錠剤、トローチ又はカプセルの形態で利用することができる。経口用組成物は又、液体キャリアーを口内洗浄剤としての利用のために用いて調製することもできる(この場合、この液体キャリアー中の化合物は、経口適用される)。製薬上適合性の結合剤及び/又は補助材を含むことができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、次の成分(又は、同様の性質の化合物)の何れでも含むことができる:結合剤例えば微晶質セルロース、トラガカントゴム又はゼラチン;賦形剤例えば澱粉又はラクトース、崩壊剤例えばアルギン酸、PRIMOGEL又はトウモロコシ澱粉;潤滑剤例えばマグネシウムステアレート又はSTEROTES;グリダント例えばコロイド状二酸化ケイ素;甘味剤例えばシュークロース又はサッカリン;又は調味剤例えばペパーミント、メチルサリチレート又はオレンジ調味剤。
【0218】
4.吸入用組成物
吸入による投与のためには、これらの化合物を、適当な噴射剤例えばガス(二酸化炭素など)を含む噴霧器又は加圧容器からエアゾールスプレーとして送達する。
【0219】
5.全身投与(パッチを含む)
全身投与も、経粘膜又は経皮的であってよい。経粘膜又は経皮的投与のためには、標的バリヤーを透過することのできる浸透剤を選択する。経粘膜浸透剤には、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与には、鼻スプレー又は坐薬を利用することができる。経皮投与のためには、これらの活性化合物を、軟膏、塗剤、ゲル又はクリームに配合する。
【0220】
これらの化合物は又、直腸投与のために、坐薬(例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどのベースを使用)又は停留浣腸の形態で製造することもできる。
【0221】
6.キャリアー
一具体例において、活性化合物は、その化合物を身体からの急速な排除から防護するキャリアーと共に調製する(例えば、インプラント及びマイクロカプセル封入した送達システムを含む制御された放出用の配合物)。生物分解性の、生体適合性ポリマー例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を利用することができる。かかる物質は、ALZA Corporation(カリフォルニア、Mountain View)及びNOVA Pharmaceuticals、Inc.(カリフォルニア、Lake Elsinore)から購入でき、又は当業者により製造されうる。リポソーム懸濁液も又、製薬上許容しうるキャリアーとして利用することができる。これらは、当業者に公知の方法(Eppstein等、米国特許第4,522,811号、1985年に記載のものなど)によって製造することができる。
【0222】
7.単位投薬
単位投薬形態の経口用配合物又は非経口用組成物を作成して、投与及び投薬量の均一性を促進することができる。単位投薬形態は、治療すべき患者への単一投薬に適した物理的に別個の単位(治療上有効な量の活性化合物を所望の製薬用キャリアーと合わせて含む)をいう。この発明の単位投薬形態の仕様は、活性化合物の独自の性質及び特定の所望する治療効果並びに活性化合物混合の固有の限界により指図される(これらに、直接、依存する)。
【0223】
8.投薬量
本発明の医薬組成物及び方法は、更に、ここに記した他の治療上活性な化合物(通常、傷又は他の関連する病的状態の治療に適用されるもの)を含むことができる。
【0224】
組織の再生又は細胞の脱分化を必要とする病気の治療においては、適当な投薬量レベルは、一般に、一日に患者の体重1kg当たり約0.01〜500mgであり、これは、単一の又は複数の投与量にて投与することができる。好ましくは、この投薬量レベルは、一日に約0.1〜250mg/kgであり;一層好ましくは、一日に約0.5〜100mg/kgである。適当な投薬量レベルは、一日に約0.01〜250mg/kg、一日に約0.05〜100mg/kg、又は一日に約0.1〜50mg/kgであってよい。この範囲内で、この投薬量は、一日に約0.05〜0.5、0.5〜5又は5〜50mg/kgでありうる。経口投与のためには、これらの組成物は、好ましくは、治療すべき患者への投薬量の、症状に基づく調節につき、1.0〜1000ミリグラムの活性成分、特に、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0及び1000.0ミリグラムの活性成分を含む錠剤の形態で与えられる。これらの化合物は、一日に1〜4回の、好ましくは一日に1回又は2回の養生法にて投与することができる。
【0225】
しかしながら、任意特定の患者についての特定の投与量レベル及び投薬頻度は変化しうるものであり、用いる特定の化合物の活性、その化合物の代謝的安定性及び作用の長さ、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与の方法及び時間、排出速度、薬物の組合せ、特定の病気の重さ、及び治療を受けている宿主を含む様々な因子に依存するものであるということは、理解されよう。加えて、送達部位も、投薬量及び頻度に強く影響するであろう。
【0226】
組織再生を生じる複合治療は、この発明の組成物と、かかる効用について知られている他の化合物との組合せによって説明される。
【0227】
9.医薬組成物のキット
これらの医薬組成物は、キット、容器、パック又はディスペンサーに、投与のための指示と共に含まれうる。この発明をキットとして供給する場合には、組成物の種々の化合物を別個の容器に納めて、使用直前に混合する。これらの成分をこのように別々に包装することは、活性化合物の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にしうる。
【0228】
(a)容器又は入れ物
これらのキットに含まれる試薬は、種々の成分の寿命が保護されて、容器の材料により吸着され又は変化されないように任意の種類の容器にて供給することができる。例えば、密閉されたガラスアンプルは、凍結乾燥したRE、RDF又は緩衝剤を含むことができる(これらは、中性の、非反応性気体例えば窒素の下でパッケージされている)。アンプルは、任意の適当な材料例えばガラス、有機ポリマー例えばポリカーボネート、ポリスチレンなど、セラミック、金属又は他の試薬を保持するために典型的に用いられる材料よりなってよい。適当な容器の他の例には、アンプルと同様の物質から加工することのできる単純な瓶、及び箔裏付きのインテリア(アルミニウム又は合金など)よりなるエンベロープが含まれる。他の容器には、試験管、小瓶、フラスコ、瓶、注射器などが含まれる。容器は、無菌的出入り口を有しうる(皮下注射針を刺し通すことのできる栓を有する瓶など)。他の容器は、取り外したときに成分を混合させる容易に取り外せる膜により分離された2つの区画を有することができる。取り外せる膜は、ガラス、プラスチック、ゴムなどであってよい。
【0229】
(b)教示材料
キットは又、教示材料を伴って供給することもできる。教示は、紙その他の基材上に印刷することができ、且つ/又は電子的に読むことのできる媒体例えばフロッピーディスク、CD−ROM、DVD−ROM、Zipディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどで与えることができる。詳しい教示は、キットと物理的に結合していなくてよく、ユーザーは、キットの製造業者又は配給業者により指定されたインターネットウェブサイトで指示を受けることができる。
【0230】
H.送達方法(この応用のために改変して適合させることの必要性)
1.間質送達
この発明の組成物を、動物の身体の組織の間隙(筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺及び結合組織の間隙を含む)に送達することができる。これらの組織の間隙は、臓器組織の網状繊維、脈管若しくは房の壁の中の弾性繊維、繊維組織のコラーゲン繊維の間の、細胞間の液体ムコ多糖マトリクス、又は筋細胞を包む結合組織内又は骨の裂孔内の同じマトリクスを含む。それは、同様に、循環する血漿及びリンパ管のリンパ液により占められた空間である。それらは、便利に、注射によって、これらの細胞を含む組織に送達することができる。それらは、好ましくは、損傷部位に送達することができ、好ましくは、生細胞及び細胞外マトリクス(死んだ組織及び死につつある組織と直接隣接している)に送達することができる。
【0231】
医療の当業者に公知の任意の装置を用いて、この発明の組成物を、間質損傷部位に送達することができる。これらは、注射器、ステント及びカテーテルを含むがこれらに限らない。
【0232】
2.全身送達
患者中の又は血管(若しくはリンパ系)自体の損傷した組織の場合には、循環系への送達が望ましいであろう。医療の当業者に公知の任意の装置を用いて、この発明の組成物を循環系に送達することができる。これらには、注射器、ステント及びカテーテルが含まれるがこれらに限られない。一つの便利な方法は、点滴静注による送達である。他のアプローチには、この発明の組成物を長期間にわたって送達するインプラント例えば経皮パッチが含まれる。かかるインプラントは、時間経過と共に患者によって吸収されてもされなくてもよい。
【0233】
3.外科的送達
外科的手順中に、この発明の方法及び組成物を、有利に、利用して、関心ある外科手術を容易にすることができ(介入の量を減らすなど)、並びに外科的手順により生じる損傷の回復を容易にすることができる。この発明の組成物は、外科手術に適した方法で送達することができ、これには、外科手術中の領域を浸すこと、移植可能な薬物送達システム、及びこの発明の組成物を含浸させたマトリクス(時間と共に身体により吸収される)が含まれる。
【0234】
4.表面送達
患者の外表面の損傷又は損傷した組織の場合には、この発明の組成物の直接的塗布が好適である。例えば、RDF組成物に浸漬したガーゼを、直接、損傷部位に適用することができ、その場所に包帯又は他の包むもので保持することができる。或は、この発明の組成物を、局所適用のために当分野で知られている塗剤、クリーム又は他の医薬組成物にて適用することができる。
【0235】
実施例
以下の実施例は、本発明の好適具体例を説明するために含まれるものである。以下の実施例で開示する技術は、この発明の実施において十分機能するように本発明者により発見された技術を表し、それ故、その実施のための好適な方法を構成するものと考えられるということを、当業者は認めるべきである。しかしながら、当業者は、本願の開示に照らして、多くの変形が、開示した特定の具体例において為されうること及びそれらはやはり似た又は同様の結果をこの発明の精神及び範囲から離れることなく得ることができるということを認めるべきである。
【0236】
1.1 動物/組織の採取
成体のイモリ Notophthalmus viridescens (テネシー、Charles Sullivan & Co.より購入)を、加湿した部屋に24℃で維持し、ツビフェクス属の蠕虫を2〜3×/週で給餌した。手術を、0.1% トリカインで約2〜3分間麻酔した動物に行った。再生中の肢の組織を次のようにして採取した。前肢を、肘の直ぐ近くで切ることにより切断し、軟組織を上げて骨を露出させた。この骨と軟組織を刈り込んで平らな切断表面を生成した。これらのイモリを、0.5% スルファメラジン溶液中に一晩置いてから、正常な水環境中に戻した。初期の再生組織(切断後1、3及び5日目)を、肢の傷の上皮に近い0.5〜1.0mmを再切断して、任意の残りの骨を除去することにより集めた。再生中でない肢組織は、以前に切断したことのない肢から採取した。組織を前肢の肘に2〜3mmの近いところから採取し、すべての骨を除去した。採取の直後に、すべての組織を液体窒素中で瞬間冷凍して、−80℃に保存した。
【0237】
1.2 タンパク質抽出物の製法
組織を解凍し、その後のすべての操作を、4℃又は氷上で行なった。6グラムの初期再生組織{1、3及び5日目由来(各2グラム)}又は6グラムの再生中でない組織を、別々に、プロテアーゼインヒビター(2μg/ml ロイペプチン、2μg/ml アプロチニン、及び1mM フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF))を含む10mlのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;カリフォルニア、Carlsbad;GIBCO−BRL No.11995−065)中に置く。これらの組織を、電子式組織ホモジェナイザーを用いて1〜2分間破砕し、ハンドホモジェナイザーを用いて10〜15分間破砕して、30秒間超音波処理した。細胞の残骸を、2回の遠心分離工程により除去した。ホモジェネートを先ず、2000gで25分間回転してから、その上清を再び100,000gで60分間回転させた。不溶性の脂質層を吸引して、残りの上清を0.45μmフィルターを通してフィルター滅菌した。タンパク質含量をBCAタンパク質アッセイキット(Pierce;イリノイ、Rockford)を用いてアッセイし、0.5mlアリコートにて−80℃に保存した。
【0238】
1.3 細胞培養
イモリのA1肢細胞を、Jeremy Brockes (ロンドン大学、Department of Biochemistry and Molecular Biology、英国、London) からの寄贈として得た。マウスのC2C12筋芽細胞株をATCCから購入した。イモリのA1細胞を、継代培養して、筋発生を誘導し、筋管を単離して低密度でプレートした(Ferretti及びBrockes、1988;Lo等、1993)。イモリのA1細胞を、24℃で、2% CO2中で生育させた。この培養培地を、Osmette A自動化オスモメーター(Precision Scientific、Inc.;バージニア、Winchester)を用いて、アホロートル血漿の重量オスモル濃度225Osmに合わせた(Ferretti及びBrockes、1988)。培養培地は、イーグルの塩を含む最少必須培地(MEM)、10% ウシ胎児血清(FBS、Clontech No. 8630−1)、100U/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン、0.28IU/ml ウシ膵臓インシュリン、2mM グルタミン及び蒸留水を含んだ。
【0239】
イモリのA1細胞における筋管形成を誘導するために、単核細胞を集密になるまで生育させ、上記の培地を、0.5% FBS(分化用培地;DM)を含む培地に、4〜6日間、置き換えた。これらの筋管を、残りの単核細胞から、穏やかなトリプシン処理(0.05% トリプシン)とそれに続く100μm及び35μmのナイロンメッシュを通すふるい分けによって単離した。一層大きい残骸及び凝集した細胞は、第一のふるい上に保持され、殆どの筋管は、第二のふるい上に保持され、殆どの単核細胞は両方のふるいを通過した。筋管を、35μmのふるいから穏やかに洗い去って、1〜2筋管/hpf又は<0.25筋管/hpfで、0.75% ゼラチンで予備被覆した35μmのふるいの上にプレートした。
【0240】
C2C12細胞を、前に記載されたように、継代培養して、筋発生を誘導する(Guo等、1995)。C2C12筋管を単離し、穏やかなトリプシン処理及び100μmメッシュを通すふるい分け後に、低密度でプレートした。筋管は、このふるいの上に保持されたが、単核細胞は、通過した。筋管を、このふるいから洗い去って、1〜2筋管/hpf又は<0.25筋管/hpfで、0.75% ゼラチンで予備被覆した35μmのプレート上にプレートした。
【0241】
筋管の脱分化を誘導するために、0.1〜0.3mg/mlのRNLEをDMに、35mmゼラチン被覆したプレートに低密度(<0.25筋管/hpf)でプレートした24時間後に添加した。培地及び抽出物を、毎日交換した。形態的な脱分化を同定するために、個々の筋管を、0日目に、抽出物の添加前に、写真に撮り、抽出物の添加後に、24時間ごとに、最長で10日目まで写真を撮った。筋特異的マーカーの筋管ダウンレギュレーション並びに細胞周期のS期への再入を調べるために、これらの細胞を、僅かに高密度(1〜2細胞/hpf)でプレートし、培地及び抽出物を毎日交換した。これらの細胞を、上記のように、4日目に染色した。DMだけで培養した細胞又は非RNLEを含むDM中で培養した細胞を、陰性対照として用いた。
【0242】
1.4 免疫蛍光顕微鏡観察
35mmプレート中に低密度でプレートした細胞を、リン酸緩衝塩溶液(PBS)で3回洗ってから、固定して免疫染色した。別途特定しない限り、すべての操作を室温で行い、すべての抗体希釈物をPBS中の2% 正常ヤギ血清(NGS)/0.1% ノニルフェノキシポリエトキシエタノール(NP−40)中で調製して、インキュベーション後に、PBS中の0.1% NP−40で洗った。細胞を、冷メタノール中で−20℃で10分間固定し、PBSで再水和して、10%NGSで15分間ブロックした。
【0243】
【表10】
【0244】
一次抗体を、1時間、37℃でインキュベートした。3回洗った後に、細胞を二次抗体と共に、45分間、37℃でインキュベートした。トロポニンTについては、Alexa594に結合したヤギ抗マウスIgG(1:100希釈、Molecular Probes;オレゴン、Eugene)を用いたが、他方、ミオゲニン及びmyoDは、ビオチン−xxヤギ抗マウスIgG(1:200希釈、Molecular Probes)とその後のストレプトアビジンAlexa594(1:100希釈、Molecular Probes)との45分間のインキュベーションを要した。一次抗体を省いた対照実験においては、二次抗体の交差反応は認められなかった。
【0245】
幾つかの実験において、細胞を、ブロモデオキシウリジン(BrdU)を用いて、12時間、対比染色した{5−ブロモ−2’−デオキシ−ウリジン標識及び検出キットIを、製造業者(Boehringer Mannheim (Roche);インジアナ、Indianapolis)の指示に従って使用}。細胞を顕微鏡で調べ、固定カメラを装着したZeiss Axiovert 100及び蛍光源を用いて写真に撮った。
【0246】
msx1でトランスフォームした細胞については(下記参照)、C2C12細胞、Fwdクローン及びRevクローンを、DM−ドキシサイクリン(DM−dox)の存在下で誘導して分化させると、筋管を生成した。次いで、筋管を穏やかにトリプシン処理して、低密度でDM−dox中に再プレートした。次の日に、その培地を生育培地(GM)で置き換えて、成長因子の存在下でmsx1発現を誘導した。細胞を、myoD、ミオゲニン及びp21発現について、免疫蛍光により、0日目(誘導前)から3日目(誘導後)まで分析した。二次抗体は、1:200希釈で利用し、ビオチン化ヤギ抗マウスIgG抗体(B−2763、Molecular Probes)及びAlexa488に結合されたヤギ抗ウサギIgG抗体(A−11034、Molecular Probes)を含んだ。筋管を、ダルベッコリン酸緩衝塩溶液(DPBS)で3回すすぎ、ザンボニー固定液で10分間処理し、DPBSで1回洗い、そして0.2% トリトン−X−100(DPBS中)で20分間透過性にした。これらの筋管を、5% スキムミルク(DPBS中)で、1時間ブロックしてから、2種の一次抗体にさらした(一つは、マウスモノクローナル抗体で、他は、ウサギポリクローナル抗体、一晩、4℃で)。これらの細胞を、DPBSで3回洗ってから、2種の二次抗体(Alexa488に結合させたヤギ抗ウサギIgG(Molecular Probes)及びビオチンに結合させたヤギ抗マウスIgG)で45分間37℃で処理した。筋管をDPBSで3回洗ってから、1μg/ml ストレプトアビジン−Alexa594(S−11227、Molecular Probes)に、45分間、37℃でさらした。これらの細胞を、DPBSで3回洗って、Zeiss Axiovert 100倒立顕微鏡(FITC及びテキサスレッドフィルター使用)を用いて観察した。
【0247】
1.5 イモリの再生溶解物活性の特性決定
C2C12筋管を、低密度でDM中に上記のようにプレートした。再生抽出物を、次の3つの方法の1つで処理した:(1)5分間煮沸する;(2)1% トリプシンで、30分間、37℃で消化する;又は(3)数回の凍結/融解サイクルを行なう。3つの別々の実験において、処理した抽出物を、培養筋管に、培地1ml当たり0.3mgの濃度で加え、抽出物を毎日交換した。抽出物を1% トリプシンで消化した直後に、そのトリプシンを、細胞を培養したDMにおける希釈によって不活性化した。凍結融解実験中に、抽出物の活性を、2〜3回の凍結/融解サイクルの後に試験した。予備処理した抽出物の筋管のS期再入への効果を、処理の4日後に、BrdU取り込みアッセイを行うことにより評価した。これらの結果をRNLEを含むDM中で培養した筋管(陽性対照)及びDMのみ又は非RNLE含有DM中で培養した筋管(陰性対照)におけるBrdU取り込みと比較した。
【0248】
1.6 レトロウイルスベクター中のmsx1の構築
マウスのmsx1遺伝子の完全なコード領域を含む1.2kbのDNA断片をプラスミドphox7XSからSacI及びXbaIを用いて切り出し、dNTP及びクレノー断片を用いて鈍端化し、LINXレトロウイルスベクターの鈍端化ClaI部位に連結した。このmsx1遺伝子を順方向(LINX−msx1−fwd)及び逆方向(LINX−msx1−rev)の両方の向きで含むクローンを同定して、形質導入研究に用いた。
【0249】
1.7 C2C12細胞の形質導入及び誘導性msx1を有するクローンの選択
Phoenix−Ampho 細胞(ATCC No.SD3443)を、10% テトラサイクリン試験したFBS、2mM グルタミン、100μg/mlペニシリン、100単位/ml ストレプトマイシン及びDMEMを含む生育培地(GM)中で集密の70〜80%にまで生育させた。細胞を、10時間にわたってトランスフェクトした。培地を置き換えて、細胞を更に48時間生育させた。次いで、このレトロウイルス含有調整培地を収穫して、生きた細胞を500gの遠心分離によって除去した。
【0250】
C2C12細胞を、20%テトラサイクリン試験したFBS、4mM グルタミン、2μg/ml ドキシサイクリン、及びDMEMを含むGM中で20%集密まで生育させた。C2C12細胞に、LINX−msx1−fwd又はLINX−msx1−rev組換えレトロウイルスを、T25組織培養フラスコ中で、GMを、1ml レトロウイルス調整培地、2ml GM及び4μg/ml ポリブレンよりなるレトロウイルス含有培地で置き換えることによって感染させた。細胞を、37℃/5% CO2中で、12〜18時間インキュベートし、培地を新鮮なGMで置き換えた。これらの細胞を、更に48時間インキュベートしてから、37℃/10% CO2インキュベーターに移した。細胞をそれらが集密に達する直前に分けて、G418(750μg/ml)中での選択を開始した。選択を6日間続けてから、それらの細胞を100mm組織培養プレートに50細胞/プレートの密度で分けた。選択を更に8日間継続した。個々の細胞コロニーを、クローニングシリンダーを利用して単離し、これらのクローンをGM−G418中で拡大させた。クローンを、誘導性msx1の発現について、全RNAのノーザン分析及び減じた成長因子の培地における筋細胞分化の阻止により試験した。
【0251】
1.8 形態的脱分化アッセイ
筋管を上記のように調製し、0.25% トリプシン/1mM EDTAで穏やかにトリプシン処理して、DM−dox中に2〜4筋管/mm2の密度で、碁盤目状の35mmゼラチン被覆プレート上に再プレートした。次の日に、残っている単核細胞を致死的な水注入及び/又はニードルアブレーション{エッペンドルフマイクロインジェクションシステム(ニューヨーク、Westbury)使用}によって破壊した。これらの筋管を、次いで、成長因子の存在下でmsx1を発現するように、培養培地をGM(ドキシサイクリンマイナス)で置き換えることによって誘導した。これらの細胞を、12〜24時間ごとに最長で7日間にわたって、観察して写真に撮った。
【0252】
1.9 脱分化細胞についての決定転換及び分化多能性アッセイ
msx1発現を、Fwdクローンにおいてドキシサイクリン(dox)の非存在下で5日間にわたって誘導してから、更なる5日間にわたって2μg/mlのドキシサイクリンの存在下で抑制した。対照用msx1−rev及びC2C12細胞を、同様に処理した。加えて、脱分化したFwd−2筋管に由来する細胞の2つのクローン集団を、96ウェルプレート中の限界希釈物にプレートすることにより得た。上記の細胞を次の決定転換及び分化多能性のアッセイにおいて利用した。
【0253】
軟骨形成能力
軟骨形成能力を、2μg/ml ドキシサイクリンの存在下で、公開されたプロトコール(Dennis等、1999;Mackay等、1998)に従って評価した。それらの細胞ペレットを、O.C.T.コンパウンド(Tissue−Tek)で処理して、ドライアイス/エタノール浴中で凍結させてから、−80℃に貯蔵した(プラスチックラップ中にラップして)。クリオスタットを利用して、6μm切片を調製した。或は、これらの細胞ペレットを、新たに調製した4% パラホルムアルデヒド中で、一晩4℃で固定し、一連のエタノール/Hemo DE洗液で処理して、パラフィン中に包埋した。ミクロトームを用いて、5μm切片を調製した。パラフィン包埋ペレットから調製した切片を、次の手順を用いてアルシアンブルーで染色した。試料を清浄化して水和し、1% アルシアンブルー(3% 酢酸、pH2.5中、又は10% 硫酸、pH0.2中)で30分間染色し、ddH2Oで3回洗い、アルコールで脱水して、Hemo DEにて清浄化した。凍結切片を、Vectastain Elite ABC キットを用いて、製造業者の指示に従って、2型コラーゲンについて染色した。但し、これらの試料を、水和に続いて3% H2O2(メタノール中)で30分間処理してから、50μU/ml コンドロイチナーゼABCで30分間処理した。抗2型コラーゲン抗体(NeoMarkers、Lab Vision Corp.;カリフォルニア、Fremont)を、1:50希釈で用い、二次ビオチン化抗体を、1:200で用いた。試料を、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。肥大化軟骨細胞を記載されたようにして(Mackay等、1998)誘導し、ペレットをアルシアンブルーを用いて10型コラーゲンについて染色した(1:50;NeoMarkers、Lab Vision Corp.)。
【0254】
脂質生成能力
脂質生成能力を評価するために、細胞を、最長で20日間にわたって、2μg/ml ドキシサイクリン、50μg/ml アスコルビン酸2−ホスフェート、10mM β−グリセロホスフェート及び10−6又は10−7M デキサメタゾンを含むGM中で培養した。培地を2日ごとに交換して、培養を、脂質生成分化の形態的兆候についてモニターした。分化誘導後14〜19日目に、これらの細胞を10% 中性緩衝ホルマリンで5分間固定し、ddH2Oで3回すすぎ、0.3% w/v オイルレッドOで7分間又は100ng/ml ナイルレッドで5分間染色し、そしてddH2Oで3回すすいだ。オイルレッドOで染色した細胞をヘマトキシリンで2分間対比染色し、水道水で3回すすぎ、ddH2Oで一度すすいだ。ナイルレッドで染色した細胞を、蛍光顕微鏡で観察した(ローダミン又はFITCフィルター使用)。
【0255】
骨形成能力
骨形成能力を、2μg/ml ドキシサイクリンの存在下で評価した(Jaiswal等、1997)。細胞を、製造業者の指示に従って、Sigma Kit 85を用いて、アルカリホスファターゼについて染色した。
【0256】
筋発生能力
筋発生能力を、形態的観察及びミオゲニンを認識する抗体を用いる免疫蛍光によって評価した(免疫蛍光研究と題した節を参照されたい)。筋管が、脂質形成能力又は骨形成能力を評価するために処理した培養にて認められた。
【0257】
1.10 ゼブラフィッシュ動物及びひれ切断
3〜6月齢のゼブラフィッシュを、EKK Will Waterlife Resources (フロリダ、Gibsonton)から得て、尾ひれの切断に用いた。魚をトリカインにて麻酔して、切断を、かみそりの刃を用いて行ない、尾ひれの1/2を切除した。動物を、温度を31〜33℃に保った水中で、様々な時間にわたって再生させたが;これらの温度は、一層普通に用いられている25〜28℃の温度(Johnson及びWeston、1995)よりも一層迅速な再生を促進する。次いで、魚を麻酔して、ひれ再生体を分析のために取り出した。
【0258】
1.11 ゼブラフィッシュの全載イン・シトゥーハイブリダイゼーション
プローブ
ジゴキシゲニン標識キット(Boehringer Mannheim)により抗血清RNAプローブを生成するために、2.8kb fgfr1cDNA断片、1.7kb fgfr2cDNA断片、0.6kb fgfr3cDNA断片、1.5kb fgfr4cDNA断片(Thisse等、1995)、1.2kb msxbcDNA断片、2.0kb msxccDNA(Akimento等、1995)、0.6kb fgf8(ace)cDNA断片(Reifers等、1998)、2.2kb fgf4.1 cDNA(Draper等、1999)、2.4kb wfgfcDNA(Draper等、1999)、3.8kb β−カテニンcDNA(Kelly等、1995)、2.6kb flk1cDNA断片(Liao等、1997)、及び1.8kb shhcDNA(Krauss等、1993)を用いた。ゼブラフィッシュfgfrcDNA配列を含む断片を、他の種の公知のfgfrチロシンキナーゼドメイン配列を用いる縮重PCRによって単離した。fgfr遺伝子の割り当ては、相同性の比較に基づき;これらの配列は、Genbankに寄託されている。
【0259】
イン・シトゥーハイブリダイゼーション
ひれの再生体を、リン酸緩衝塩溶液(PBS)中の4% パラホルムアルデヒド中で、4℃で一晩固定し、PBSを2回換えて簡単に洗い、そして−20℃での貯蔵のためにメタノール中に移した。ひれをPBS中のエタノールによって段階的に再水和し、次いで、PBS−0.1% ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(ツイーン−20;PBT)を4回換えて洗った。次いで、ひれを、PBT中の10μg/ml プロテイナーゼKと共に30分間インキュベートし、PBT中で2回すすいだ後に、20分間再固定した。PBTによる5回の洗浄の後に、ひれを、65℃で、1時間にわたって、50% ホルムアミド、5×SSC(750mM NaCl、75mM クエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.1% ツイーン−20、50μg/ml ヘパリン、及び500μg/ml酵母RNA(pHは、クエン酸により6.0にする)を含む緩衝液中で予備ハイブリダイズさせ、次いで、一晩、0.5μg/ml ジオキシゲニン標識RNAプローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイズさせた。ひれを、65℃で、各10分間ずつ、75% ハイブリダイゼーション緩衝液/25% 2×SSC、50% ハイブリダイゼーション緩衝液/50% 2×SSC、及び25% ハイブリダイゼーション緩衝液/75% 2×SSC中で洗い、その後、0.2×SSC中で、各30分ずつ、65℃で2回洗った。各5分間の更なる洗浄を室温で、75% 0.2×SSC/25% PBT、50% 0.2×SSC/50% PBT、及び25% 0.2×SSC/75% PBT中で行なった。2mg/ml ウシ血清アルブミンを含むPBT中での1時間のインキュベーション後に、ひれを、アルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim)に結合させたひれ予備吸着させた抗ジオキシゲニン抗体の1:2000希釈物を含む同じ溶液中で2時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ反応のために、ひれを、先ず、反応緩衝液(100mM トリス−HCl pH9.5、50mM MgCl2、100mM NaCl、0.1% ツイーン−20、1mM レバミゾール)中で3回洗ってから、1×ニトロブルーテラゾリウム/5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−ホスフェート(NBT/BCIP)基質を含む反応緩衝液中でインキュベートした。一般に、0.5〜3時間で、陽性シグナルが得られた。染色反応後に、ひれを、PBTを数回換えて洗い、PBS中の4% パラホルムアルデヒド中で固定した。ひれ再生体の切片を得るために、ひれを、先ず、1.5% アガロース/5% シュークロース中でマウントし、次いで、30%シュークロース中で、一晩インキュベートした。凍結ブロックを、14μmで切片化して、Nomarskiオプチクスを用いて観察した。
【0260】
各プローブについて、少なくとも7つのひれを、切断後、0、6、12、18、24、48、及び96時間の時点での発現について、fgfr1、msxb、msxc及びwfgfプローブを用いて試験し、25〜100のひれを幾つかの異なる実験において試験した。センス鎖RNAプローブを用いた実験を初期アンチセンス実験と共に行なって、シグナルの特異性を評価した。薬理学的に処理したひれにおける遺伝子発現を評価するために、同じ数の未処理のひれをも試験した。次いで、すべての染色反応を、強いシグナルが未処理のひれで低倍率で見られた後に停止した。
【0261】
1.12 ゼブラフィッシュにおけるfgfr1インヒビター処理
SU5402(Ri;SUGEN、カリフォルニア、South San Francisco)をジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解させて、魚水に、1.7μM又は17μM(0.01% DMSO)の終濃度で加えた。10匹以下の魚を、1リットルの水で処理し、タンクを暗黒中に31〜33℃で維持し、SU5402溶液を各24時間ごとに交換した。ゼブラフィッシュは、通常、生存し、このインヒビター溶液中でも異常な行動は示さなかった。
【0262】
1.13 ゼブラフィッシュにおけるBrdUの取り込み
BrdUをPBS中に溶解させて、魚を、100μg/mlの終濃度で処理した。一回の実験のために、ひれを切断して、17μM Riの非存在下又は存在下で、18〜24時間にわたって再生させた(BrdUは、再生の最後の6時間の間中存在する)。確立された再生芽におけるRiの増殖に対する効果を試験するために、ひれを、先ず、40時間にわたって再生させた。その後、未処理の魚を、更に2時間再生させてから、BrdUと共に6時間インキュベートしたが、他方、Ri処理した魚は、2時間のRi予備インキュベーション後に、Ri及びBrdUの両者と共に6時間インキュベートした。
【0263】
ひれを集めて、70% エタノール/2mM グリシン中で一晩固定し、10μmの切片を凍結ブロックから作成した。これらの切片を、BrdU取り込みについて検出キット(Roche;スイス国、Basel)を用いて染色し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。未処理の及びRi処理したひれからの切片を、同時に処理して現像した。8つのひれからの約100の切片を、18時間及び24時間の時点から試験したが、他方、6つのひれからの約50の切片を、48時間の時点から試験した。
【0264】
2.1 再生抽出物は、イモリの筋管の脱分化を誘導する
再生中のイモリの組織に含まれる因子が脱分化を示す細胞の形態的変化を誘導することができるかどうか測定するために、再生中のイモリの肢の抽出物(RNLE)を調製して、培養したイモリの筋管に加えて、それらの筋管を光学顕微鏡で追跡した。
【0265】
1〜5日目のイモリの肢の再生体に由来する傷付いた上皮及び隣接する組織を用いて、上記のように、RNLEを調製した。A1筋管を、非常に低密度(<0.25細胞/hpf)で、0.3mg/ml RNLEを含むDM中で培養して、各筋管を10日間にわたって密に追跡し、12〜24時間ごとに写真に撮った。形態的脱分化の最初の徴候は、3日目に、筋管がそれらの形状を変えて、一層小さい筋管に分裂したときに明白となった。10日目までに、16%の筋管が分裂して、一層小さい筋管又は単核細胞を形成した(表II)。DMだけ又はDMに非再生肢抽出物(陰性対照)を加えたもので培養した筋管では、形態的変化又は細胞分裂は見られなかった。これらの発見は、RNLEが、培養イモリ筋管において形態的脱分化を誘導することができるということを示している。
【0266】
RNLEの、通常休止している多核のイモリの筋管に対する効果を測定するために、RNLEをこれらの細胞に加えて、BrdU取り込みについて試験して、DNA合成をアッセイした。イモリのA1筋管を、低密度(1〜2細胞/hpf)でDM中に置き、0.3mg/ml RNLEと共に培養した(0日目)。培地及び抽出物を毎日交換し、筋管を、4日目に、BrdU取り込みについてアッセイした。休止中のイモリのA1筋管をRNLEを含むDM中で培養した場合には、これらの細胞の25%が細胞周期のS期に入るように刺激された(表II)。対照的に、DMだけで培養した筋管の2%だけが、及び0.3mg/ml 非再生抽出物を含むDM中で培養した筋管の3%が、BrdUを取り込んだ。これらのデータは、再生中のイモリの組織が、イモリの筋管の細胞周期への再入を誘導することのできる因子を含むことを示している。
【0267】
【表11】
【0268】
2.2 RNLEは、哺乳動物の筋管の分子及び細胞の脱分化を誘導する
RNLEが、哺乳動物筋管の形態的脱分化を誘導することができる因子を含むかどうかを測定するために、RNLEをC2C12筋管に加えて、それらの細胞を光学顕微鏡で追跡した。
【0269】
これらの筋管を非常に低密度(<0.25細胞/hpf)でプレートし、0.3mg/ml RNLEを含むDM中で培養して(0日目)、12〜24時間ごとに個別に写真に撮って、次の10日間にわたって起きる細胞形態の変化を記録した。この培地及び抽出物を、毎日交換した。細胞分裂は、2〜3日目までに、プレートした筋管の11%において認められ、分裂後に、これらの筋管の半数において細胞増殖が認められた(表III)。これらの細胞現象は、DMだけ又は0.3mg/ml 非RNLEを含むDMで培養した何れのC2C12筋管においても見られなかった。而して、RNLEと共に培養したマウス筋管は、サイトカインによる一層小さい筋管への分裂を、イモリの筋管と殆ど同じ頻度で受ける(11%対16%)。加えて、分裂の後に、しばしば、C2C12筋管における細胞増殖が起きるが、これは、RNLE処理したイモリの筋管は増殖しなかったので、予想外の発見である。これらのデータは、RNLEが、培養した哺乳動物の筋管の脱分化及び増殖を誘導するということを示している。
【0270】
RNLEが筋肉の決定及び分化のタンパク質の発現に影響を及ぼすかどうかを測定するために、RNLEをC2C12筋管に加えて、間接免疫蛍光アッセイを行って、筋分化タンパク質ミオゲニン及びmyoD並びに筋収縮タンパク質トロポニンTの変化した発現を測定した。これらの筋原性マーカーの各々は、RNLEと共に4日間培養した際に、C2C12筋管においてダウンレギュレートされた。ミオゲニンとMyoDの核におけるダウンレギュレーションが、それぞれ、筋管の15%及び19%において見られた。トロポニンTは、筋管の30%の細胞質においてダウンレギュレートされた。対照的に、myoDとミオゲニンは、一貫して、これらの対照中に存在し、トロポニンTは、これらの対照の約94〜97%において同定された(表III)。RNLE処理した筋管中のすべてのマーカーのダウンレギュレーションは、4日目までに最大となった。これらのデータは、イモリのRNLEが、培養哺乳動物筋管において、骨格筋分化因子をダウンレギュレートしたということを示している。
【0271】
再生中のイモリの組織がS期再入を最終分化した哺乳動物筋管において誘導することができるかどうかを測定するために、BrdUの取り込みをRNLE処理したC2C12筋管でアッセイした。C2C12筋管を低密度(1〜2細胞/hpf)でプレートして、0.3mg/mlのRNLEを含むDM中で培養した。抽出物を0日目に加え、培地と抽出物を毎日交換して、細胞をBrdU取り込みについて4日目にアッセイした。RNLE処理したC2C12筋管の18%が、S期再入を示した(図3、表1B)。対照的に、DMだけ又は非RNLEを含むDM中で培養した細胞においては、BrdU取り込みは、見られなかった(表II)。それ故、RNLEは、培養哺乳動物筋管において細胞周期再入を誘導することができる。
【0272】
【表12】
【0273】
2.3 脱分化シグナルがタンパク質よりなることは、ありそうなことである RNLE中で見出された脱分化シグナルは、タンパク質、脂質、核酸及び多糖類を含む多くの異なる種類の生体分子に属しうるものであった。これらのRNLEの活性成分の少なくとも一つの性質を特性決定するために、本発明者は、この抽出物を多くの異なる条件にかけた。これらの結果を、表IVにまとめた。
【0274】
RNLEの調製物は、脱分化因子が脂質であるという見込みを減じた(高速遠心分離ステップの後で、可溶性脂質が除去されなかったので)。RNLEの反復する凍結融解は、脱分化活性を減じたが、5分間の煮沸は、すべての活性をなくした。RNLEをプロテアーゼ、トリプシンで処理した場合には、脱分化シグナルは、完全に破壊され、これは、タンパク質がこの因子の主たる成分であることを示している。この脱分化シグナルは、単一のタンパク質又はタンパク質のグループを含むことができ;かかるタンパク質は、ある種の翻訳後修飾(例えば、グリコシル化)を含むことができる。
【0275】
【表13】
【0276】
2.4 誘導性msx1遺伝子を含むC2C12クローンの生成
マウスのmsx1遺伝子(SEQ ID NO:1)(Hill等、1989)を、LINXベクター中に、順方向(LINX−msx1−fwd)及び逆方向(LINX−msx1−rev)の両方の向きでクローン化した。LINXは、テトラサイクリン制御されるトランスアクチベーター(tTA)により調節される最小CMVプロモーターを含むレトロウイルスベクターである(Gossen及びBujard、1992;Hoshimaru等、1996)。テトラサイクリン又はその類似体、ドキシサイクリン(dox)は、tTAに結合して不活性化し、最小CMVプロモーターからの転写を阻止する。これらの抗生物質の非存在下では、tTAは、テトラサイクリン応答性エレメント(TRE)に結合して、転写を誘導する。
【0277】
LINX−msx1−fwd及びLINX−msx1−revを、C2C12筋管中に形質導入して、選択培地で生育したクローン(Fwd−2、Fwd−3及びRev−2)を、doxを用いて、msx1発現を誘導し又は抑制した。全RNAを抽出し、ノーザンブロットをmsx1転写物に相補的な40ヌクレオチドのオリゴマーをプローブとして調べた。Msx1を誘導し、抑制し、又は誘導してから抑制した。誘導の5日後に、2.1kbのmsx1シグナルが、C2C12−LINX−msx1−fwd(Fwd)クローンにおいて認められた。ホスホルイメージ分析は、msx1発現において、25倍の誘導を示した。msx1を2μg/ml ドキシサイクリンを含む培地での生育により再び抑制した場合には、誘導性発現を示すことができた。LINX−msx1−rev構築物(Rev)を含むC2C12筋管及びクローンは、msx1を発現しなかった。
【0278】
msx1の異所的発現は、マウスの筋芽細胞の筋管への分化を阻止することが示されている(Song等、1992)。誘導されたmsx1タンパク質が機能的であるかどうかを評価するために、トランスフェクトした筋芽細胞を、それらの分化する能力について試験した。クローンをdox中で生育させて、msx1発現を誘導し又は抑制した。一度集密に達したならば、GMをDMと交換して、msx1の誘導又は抑制を続けた。10日間にわたって、これらのクローンを、分化の形態的徴候について、位相差顕微鏡により観察した。msx1発現を抑制する条件下で培養したFwdクローンは、容易に、筋管を生成したが、msx1を発現するものは、筋管を生成できなかった。対照用C2C12筋管及びRevクローンは、誘導又は抑制条件で処理したときに正常に分化した。これらの結果は、Fwdクローンが、機能的msx1を生成する誘導性msx1遺伝子を含んでいたということを示している。2つのFwdクローン(Fwd−2及びFwd−3)及び1つのRevクローン(Rev−2)を、更なる研究のために選択した。
【0279】
2.5 Msx1は、マウス筋管における筋分化タンパク質の発現を逆転させる
筋管脱分化の一つの生化学的指標は、筋原性分化タンパク質のレベルの減少である。筋原性因子MyoD、ミオゲニン、MRF4及びp21が、msx1の発現の結果として減少するかどうかを測定するために、間接免疫蛍光アッセイを、GMの存在下でmsx1を発現するように誘導された筋管について行った。これらの筋原性因子のすべては、マウス筋管において変化する程度に減少した。msx1誘導のI日以内に、MRF4は、誘導された筋管の34%において検出不能なレベルに減少した。同様に、ミオゲニンは、すべての誘導された筋管の約26%において検出不能であった。検出不能なMRF4及びミオゲニンのレベルを示す筋管のパーセンテージは、2及び3日目までに、それぞれ50%及び38%に上昇した。MyoD発現は、msx1誘導の第2日まで影響を受けなかった。2日目に全筋管の10%が、MyoDレベルの顕著な減少を示し、このパーセンテージは、3日目までに28%に上昇した。検出不能なp21のレベルを示す筋管のパーセンテージは、誘導後の1日目の10%から3日目までに20%まで上昇した。試験筋管の筋原性タンパク質レベルの観察された減少は、筋管の加齢の結果ではないことを確実にするために、対照用筋管を同齢のものとした。筋タンパク質の正常な発現が、対照用C2C12筋管の90〜100%において認められた。これらの結果は、異所的msx1発現が、筋原性タンパク質レベルの減少を最終分化した哺乳動物筋管において引き起こすことができることを示している。
【0280】
2.6 Msx1は、マウス筋管の分裂及び細胞増殖を誘導する
異所的msx1発現及び成長因子刺激が最終分化した哺乳動物筋管の分裂を誘導することができるかどうかを試験するために、単離された筋管を低密度でプレートして、残りの単核細胞を致死的注入及び/又はアブレーションによって除去した(Kumar等、2000)。新鮮なDMをこれらの筋管に加えて、それらを一晩インキュベートした。これらの培養物を、再び、残留単核細胞につき検査し、存在しているものを除去してから、全グリッデド領域を写真に撮った。この手順の後では、Fwd又は対照用筋管において、残留単核細胞は認められなかった。次いで、msx1発現を一組のFwd筋管において誘導したが、一組の対照用筋管は、抑制されたままであった。両方の組の筋管を、GMで刺激し、その後、毎日、最長で7日目まで顕微鏡観察及び写真撮影を行った。脱分化を、次の基準を用いる形態的試験によって評価した:(1)筋管の単核細胞又は一層小さい筋管への分裂及び(2)筋管由来単核細胞の増殖。図3Aは、大きい多核の筋管(分裂して、2つの一層小さい多核筋管を形成する)の例を示している。この大きい筋管の分裂は、msx1誘導において、6日目に殆ど完了した。一度分裂すれば、それらの2つの筋管は、分離したままであって、脱分化の存続期間中、生存可能であった(対照用筋管培養物にて供給)。誘導条件で処理した148の試験筋管のうちで、13(8.8%)が、分裂して、一層小さい筋管又は単核細胞を形成した。脱分化の最初の徴候は、msx1の誘導2日後に明確になった。この時点で、脱分化する筋管は、完全に分裂して、単核細胞を形成した。細胞ストレッチ及び分裂開始などの切迫した分裂の徴候も又、認められた。かかる分裂は、最終的に、4.5日目までに増殖する、単核の細胞を生じた。これらの筋管から生じたこれらの単核細胞は、増殖し続け、7日目までに細胞集密に達した。その結果生じた単核細胞の増殖は、5日目までに明らかとなり、6日目には、多くの筋管由来の単核細胞が存在した。誘導条件で処理した148の試験筋管のうちで、8(5.4%)が、増殖する単核細胞のプールへと脱分化した。従って、msx1は、筋管を、ストレッチ及び分裂へと誘導し、一層小さい筋管又は増殖する単核細胞を生じる。
【0281】
筋管の単核細胞への分裂及びその後の増殖がmsx1発現から生じるものであって隠れた残留単核細胞のアーティファクトの結果ではないことを確認するために、これらの実験を、未誘導Fwd、Rev及び形質導入してないC2C12筋管よりなる対照用細胞を用いて繰り返した。研究した151の対照用筋管のうちで、唯一つの典型的でない筋管が分裂して、少数の単核細胞を形成した。しかしながら、これらの細胞は、GM中では、7日後でさえ、増殖しなかった。他の何れの対照用筋管も、ストレッチング及び分裂の証拠を示さなかったし、増殖する単核細胞は認められなかった。厳格なフィッシャー−アービン検定は、msx1発現筋管と対照用筋管との間の分裂頻度の差異が、p=0.0006で有意であることを示した。同様に、msx1発現筋管と対照用筋管との間の分裂/増殖頻度の差異は、p=0.003で有意である。従って、異所的msx1発現と成長因子による刺激との組合せは、脱分化させるべきマウスの筋管のあるパーセンテージを、一層小さい筋管又は増殖する単核細胞に誘導することができる。
【0282】
2.7 Msx1は、マウスの筋管の多能性幹細胞への脱分化を誘導する
脱分化した、増殖する単核細胞が多能性であるかどうかを測定するために、単一のFwd−2筋管に由来する細胞の2つのクローン集団を単離した。これらのクローンを、脂質生成、軟骨形成、骨生成又は筋発生に有利な条件下で培養した(Dennis等、1999;Grigoriadis等、1988;Jaiswal等、1997;Mackay等、1998;Pittenger等、1999)。Msx1発現を、これらの再分化アッセイ中抑制した。
【0283】
これらの脱分化クローンを、2.5×105細胞を軟骨形成性分化用培地中でペレット形成して、それらの細胞ペレットに2日ごとに新鮮な培地を供給することによって軟骨形成能力について試験した。これらの細胞は、容易に、アルシアンブルーでかすかに染色され、II型コラーゲンを含む細胞外マトリクスを生成する軟骨細胞に分化した。分化した細胞を、更に誘導して、アルシアンブルーで染色され、X型コラーゲンと反応する肥大性軟骨細胞を形成することができた。軟骨細胞又は肥大性軟骨細胞は、対照用C2C12又はmsx1−rev−2細胞において同定されなかった。
【0284】
脂質生成分化用培地(ADM)中で7〜16日間培養した場合には、脱分化したクローンは、含脂肪細胞の形態を示す細胞を生じた。これらの細胞を、親油性染料のオイルレッドO及びナイルレッドでの処理に際して明るいオレンジ色に染まる多くの液胞の存在により特性決定した(図4A)。ADMで処理した対照用C2C12又はRev−2細胞は、これらの脂質生成性の特徴を示さなかった(図4A)。この形態的特徴と脂質染色性液胞の組合せは、これらの細胞の幾つかが、含脂肪細胞に分化したことを示唆している。
【0285】
脱分化したクローンは又、骨形成誘導培地(OIM)での処理によって、骨形成マーカーを発現する細胞への分化を誘導することもできた。我々は、35mmプレート当たりの多くのアルカリホスファターゼ活性について陽性に染色される細胞フォーカスを観察したが、非常に僅かのアルカリホスファターゼが、対照用C2C12又はRev−2細胞において同定された。筋管は、容易にADM又はOIM中で形成されて、形態及び抗ミオゲニン抗体に対する反応性によって同定された(図4A)。予想されるように、対照用C2C12及びRev細胞も又、容易に筋管に分化する(図4A;データは示してない)。
【0286】
従って、異所的msx1発現と成長因子処理との組合せは、最終分化したマウス筋管の、増殖する、多能性幹細胞(幾つかの細胞系統に再分化することができる)のプールへの分化を誘導することができる。
【0287】
2.8 Msx1は、マウス筋芽細胞の決定転換を誘導する
本発明者は、もしmsx1発現が最終分化した筋管を完全に脱分化させたならば、msx1の異所的発現がC2C12筋芽細胞の決定転換を促進しうるであろうことを予期した。Msx1発現を、Fwd筋芽細胞中で5日間誘導してから、抑制した。適当な培地で処理した場合には、これらの細胞は、容易に、軟骨細胞、含脂肪細胞、筋管及び骨形成マーカーを発現する細胞に分化する(図5)。決定転換の証拠は、対照用細胞においては認められなかった。これらの結果は、筋芽細胞の決定転換が、msx1の異所的発現から生じたを示している。
【0288】
2.9 Fgfシグナリング経路のメンバーの、ゼブラフィッシュのひれ再生芽形成及び再生伸出中の発現
ゼブラフィッシュのひれは、幾つかの分節化した骨質のひれ鰭条又は鱗状鰭条よりなり、各々は、一対の凹面よりなり、それは、結合組織(繊維芽細胞を含む)並びに神経及び血管を囲む半鰭条に面している。鱗状鰭条は、血管化して神経分布した軟らかい間充織によって結合されている。鱗状鰭条再生中に起きる初期事象は、33℃に高めた場合には、4つのステージ(A〜D)に分けることができる(Goss及びStagg、1957;Johnson及びWeston、1995;Santamaria及びBecerra、1991)。第一ステージ中(切断の0〜12時間後)に、ひれの上皮細胞に由来する傷の上皮が、断端上に形成される。ステージB(切断の約12〜24時間後)に、傷の上皮細胞は、蓄積し続ける。一方、切断部位に最も近い1〜2分節及び半鰭条間に位置した繊維芽細胞及び骨片母細胞(又は、骨芽細胞)は、ゆるんで組織が乱れ、縦向きの形態となり、傷の上皮に向かって移動するように見える。ステージC(24〜48時間)までに、これらの細胞の遠方への移動及び増殖が、再生芽を生じている。ステージD(48時間及び再生の残りの期間中)に、再生芽は、次の2つの顕著な機能を有すると考えられる:(1)遠い部分が、細胞分裂により伸出を促進し;(2)近い部分は分化して、再生ひれの特異的構造を形成する。尾ひれの切断後には、完全な再生が、1〜2週間で起きる。
【0289】
Fgfシグナリングがゼブラフィッシュの尾ひれの再生に関与していることを示すために、4つのfgfr遺伝子の初期ひれ再生における発現を、切断後0〜96時間の時点で、イン・シトゥーハイブリダイゼーションを用いて評価した。かすかであるが一貫したfgfr1の発現がひれの再生で検出された最も初期の時点は、再生芽形成過程にあるらしい細胞において、切断後18時間であった。縦のひれの切片は、切断後18〜24時間で、fgfr転写物が、切断面にすぐ隣接する半鰭条と該面から遠い半鰭条との間の繊維芽細胞様細胞に局在することを示した。切断後48時間において、再生伸出中に、全載分析は、再生体の遠い部分と近い部分の両方で、一貫して、fgfrlの発現を示した。このステージの切片は、遠い再生芽を構成する細胞の小集団並びに再生上皮の基底層のかなりの部分において転写を示した。この上皮ドメインは、このステージにおいてソニックヘッジホッグ(shh)を発現する細胞と重複するようであった(Laforest等、1998)。これらの発現ドメインは又、切断後96時間でもはっきり見えた。加えて、fgfr2及びfgfr3の弱いが一貫した発現が、近いひれ再生体で、切断後48時間の早い時点で認められた。これらのレセプターは、拡散したドメインで同様に発現された。fgfr4発現は、再生中のひれにおいて検出されなかった。これらのデータは、このひれ再生体の細胞(再生芽前駆細胞並びに成熟再生芽細胞を含む)がFgfのレセプターを発現することを示している。
【0290】
msx遺伝子は、Fgfシグナリング経路における下流の転写標的として含まれており(Kettunen及びThesleff、1998;Vogel等、1995;Wang及びSassoon、1995)、胚の間充織の未分化状態(Song等、1992)並びに成体の有尾目両生類の肢再生芽(Koshiba等、1998)に重要であると仮定されてきたので、このひれ再生体におけるゼブラフィッシュのmsxb及びmsxcの発現の開始及びドメインを試験した。検出可能なmsxbのひれ再生体における発現は、切断の18時間後であった。切片は、再生芽形成中に、msxb転写物が、切断面のすぐ近く及び遠くの繊維芽細胞様細胞において、fgfr転写物と同様の仕方で分布していることを示した。再生の48時間目まで及び残りの期間中、すべてのmsxb陽性細胞は前に報告されたように(Akimenko等、1995)遠い再生芽領域内に含まれた。Msxcの発現ドメインは、事実上、すべての時点において、msxbのそれと同一であった。再生芽形成中及び再生伸出中のfgfrl転写物とmsxb及びmsxc転写物との同じ局在性は、Fgfシグナリングがこれらの過程において重要であるという仮説を支持している。
【0291】
Fgfが再生中のひれにおいて合成されることを示すために、特性決定されたゼブラフィッシュのfgf遺伝子を表すプローブをイン・シトゥーハイブリダイゼーション実験において使用した。fgf4.1又はfgf8(ace)転写物は、ひれ再生体において検出されなかった。しかしながら、Fgf8、Fgf17及びFgf18Fgfリガンドのサブクラスのメンバー「創傷(W)fgf」は、このひれ再生体において発現された(Draper等、1999)。wfgfの発現は、切断後48時間において、再生上皮の遠い殆どの細胞において、一貫して認められ、そこでは、それは、伸出中維持された。再生芽形成中のwfgf発現を調べる実験は、二義的であり、再生体の約50%におけるかすかな発現を示している。これらのデータは、少なくとも一つのFgfメンバーが再生中のひれに存在していることを示している。
【0292】
2.10 Fgfr1の阻害は、再生芽形成をブロックする
ひれの再生におけるFgfの役割を機能的に評価するために、親油性薬物SU5402(Ri)を利用した(該薬物は、Fgfr1の自己リン酸化及び基質のリン酸化を、そのチロシンキナーゼドメインに特異的に結合することにより破壊することが知られている)。哺乳動物細胞におけるFgfr活性についてのRiのIC50は、10〜20μMであることが以前に示された(Mohammadi等、1997)。この濃度のRiは、発生中のゼブラフィッシュ胚に加えると、尾部構造の劇的な切り詰めを引き起こす。かかる胚は、ドミナントネガティブFgfr1をコードするmRNAを注入されたものと著しく似ている(Griffin等、1995)。それ故、Riは、ゼブラフィッシュFgfr1活性を効果的にブロックした。
【0293】
以前の研究は、Riが、血小板由来成長因子、上皮成長因子及びインシュリンレセプターを哺乳動物細胞において、50μMより高濃度でブロックしないこと及び多くのセリンスレオニンキナーゼの活性に対して効果を有しないことを示している(Mohammadi等、1997;Sun等、1999)。しかしながら、Riは、Flk1、血管内皮成長因子及び内皮前駆細胞の最も初期に知られたマーカーを10〜20μMで阻害する(Liao等、1997)。ゼブラフィッシュのひれの再生では、flk1の一貫した発現は、それが再生芽細胞中に現れたときに(n=22)、切断後96時間まで認められなかった。flk1発現は、再生芽形成中に、切断後24時間では、イン・シトゥーハイブリダイゼーションによっては明白ではなかった(n=14)。
【0294】
Fgfr1によるシグナリングが再生に必要とされるかどうかを測定するために、ゼブラフィッシュをRiで96時間処理した直後に切断を行った。ゼブラフィッシュの1.7μM Ri(0.5mg/リットル)での処理は、変化する程度にひれの再生を阻止した。試験した10のひれのうち、4つは、正常に再生し、5つは、わずかに再生欠損であり、1つは、再生をブロックされた。しかしながら、17μM Ri(5mg/リットル)にさらされたすべての動物は、完全な再生ブロックを示した(n=9)。これらの結果は、Fgfシグナリングがゼブラフィッシュのひれの再生に必要であることを示した。
【0295】
再生芽がFgfシグナリングの非存在下で形成されるかどうかを測定するために、Ri処理したひれ再生体を、形態的に調べた。傷の上皮は、一貫して、Ri処理した魚のひれの断端上に形成されたが、再生芽の形態形成は起きなかった。しかしながら、切断面に近い間充織細胞は、組織の乱れ並びに遠い移動を示唆する縦向きを示した。
【0296】
BrdUの取り込みを利用して、DNA複製と細胞増殖を分析した。切断の後12〜18時間及び18〜24時間で、Ri処理したひれにおいて、正常な近い間充織細胞の標識が認められた。再生芽細胞が、Riの存在下でDNA複製するかどうかを測定するために、再生伸出中(切断後40〜48時間)に、Riで短く処理したひれにおけるBrdUの取り込みを分析した。これらのひれの再生芽細胞は、大いに減少したBrdUの取り込みを示した。遠い再生芽細胞は、未処理のひれの切片において日常的に標識されたが、これらの細胞の標識は、Ri処理したひれ由来の切片においては、決して認められなかった。その上、標識された近い再生芽細胞は、遠い再生芽における分裂によりBrdUを取り込んだということはありそうなことであり、未処理のひれの切片には多量に分布していたが、Ri処理したひれの切片にはまばらに分布していた。それにもかかわらず、切断面に近い間充織細胞の増殖は、やはり、未処理の及びRi処理したグループにおいて類似していた。近い間充織におけるRiによる効果の欠如は、乏しい組織透過のためではなかった(BrdU処理の前にRiで48時間処理したひれも、正常な近い間充織の取り込みを示したので)。これらの結果は、Fgfシグナリングが再生芽形成(おそらく、傷の上皮の近くの間充織細胞の増殖を促進することによる)に必須であることを示している。
【0297】
Ri処理したひれにおける再生のブロックの分子的効果を評価するために、β−カテニン、msxb及びmsxcの発現を分析した。β−カテニンは、未処理の再生中のひれの傷上皮において、切断後3時間という早期に及び再生過程を通して、高レベルで発現された。β−カテニンの発現は、Ri処理したひれにおいては正常であり、これは、かかるひれが傷の治癒に大きな欠損を有しないことを示唆している(n=7)。しかしながら、Ri処理したひれにおける再生芽マーカーmsxb及びmsxcの発現は、24時間の再生体において、極めて低いか又は検出不能であり、48時間の再生体においては検出不能であった(msxb:21ひれ、msxc:8ひれ)。これらのデータは、Fgfシグナリングがひれの再生体におけるmsxb/cの転写に必要であることを示している。
【0298】
2.11 Fgfr1阻害は、再生伸出をブロックする
wfgf及びfgfr1発現ドメインは、伸出中ひれ再生体に維持され、再生芽細胞のBrdU取り込みはRiによってブロックされるので、Fgfシグナリングが再生芽の維持/再生伸出に関与することは有りそうなことである。この仮説を試験するために、Riの進行中の再生体に対する効果を試験した。Ri処理は、更に、24〜72時間のひれ再生体の伸出を阻止し、しばしば、異常に厚い再生上皮の蓄積並びにメラノサイトの隣接鰭条への背腹移動を引き起こした。この結果は、通常新しい遠位成長と対をなす上皮及び色素細胞による細胞移動過程の結果でありうる。加えて、新たな骨の沈着は、伸出の欠如にも拘わらず、Ri処理によって中断されず、鱗状鰭条物質が、これらのひれの分節中の異常に遠い位置で認められた。
【0299】
このRiによる伸出阻止の分子効果を調べるために、マーカー発現を、Riの適用期間の24時間後に試験した。48又は72時間での上皮wfgf発現の有意の減少は、見られなかった(n=16)。しかしながら、msxbの発現は、既に24〜48時間にわたって正常に再生しているRi処理したひれにおいて減少した(18のRi処理したひれのうちの10が、検出可能なmsxb発現を有しなかったが、残りの8つのひれは、低レベルを示した)。msxc発現に対する類似の効果が認められた(n=8)。msxbの発現は、Riに48時間さらした24又は48時間のひれ再生体において検出されなかった(n=18)。従って、Fgfシグナリングは、再生芽形成及び再生伸出に必要であるが、メラノサイト移動又は骨の沈着を含む他の過程には、決定的ではない。
【0300】
最後に、fgfr1は又、再生伸出中に、上皮細胞においても発現されたので(図2C、D参照)、Fgfシグナリングは、再生体のパターニングに重要でありうる。この仮説を試験するために、Ri処理の、パターニング遺伝子shhの発現に対する効果を測定した。以前に報告されたように、shhは、切断の48時間後という早期に、ひれの上皮の基底層の両側ドメインに位置した(Laforest等、1998)。これらの細胞からのShhの放出は、再生芽細胞の骨片母細胞(再生体の新たな分節の形成において、骨を沈着させる)への分化を指示すると考えられる。48又は72時間のひれ再生体のRiでの処理は、shh発現を劇的に減少させた(18のひれのうちの0が、検出可能なshh転写物を有した;図6H)。これらのデータは、ひれ再生体におけるshhの正常な発現には、完全なFgfシグナリングが必要であることを示している。
【0301】
Claims (55)
- 哺乳動物組織を再生させる方法であって、
分化した哺乳動物細胞を、それらを脱分化、再生又は両方を誘導することのできる組成物と接触させることにより、脱分化させることを含み、
脱分化後に、それらの哺乳動物細胞が、再分化した又は新たに分化した哺乳動物細胞へと増殖し、再分化することができることを特徴とする、上記の方法。 - 脱分化させた哺乳動物細胞を、その後、増殖させることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 脱分化させた哺乳動物細胞に由来する哺乳動物細胞、組織又は臓器を再生させることを更に含む、請求項2に記載の方法。
- 脱分化を、イン・ビボで行う、請求項1に記載の方法。
- 脱分化を、エキソ・ビボで行う、請求項1に記載の方法。
- 脱分化が、哺乳動物細胞を脱分化を誘導することのできる組成物と、脱分化を誘導するのに十分な時間にわたって接触させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 脱分化を、損傷部位で行う、請求項1に記載の方法。
- 損傷が、病気又は外傷により引き起こされた、請求項7に記載の方法。
- 接触が、組成物を損傷部位に注入することを含む、請求項1に記載の方法。
- 接触が、組成物を全身に注入することを含む、請求項1に記載の方法。
- 接触が、組成物を、損傷部位に局所的に適用することを含む、請求項1に記載の方法。
- 接触が、送達用デバイスを移植することを含む、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物細胞を、筋肉、皮膚、骨、関節、眼、肺、心臓、脈管構造、腎臓、膵臓又は神経組織から単離する、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、筋細胞である、請求項1に記載の方法。
- 組成物が、繊維芽細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子レセプター、骨形成ポリペプチド、骨形成ポリペプチドレセプター、Wntポリペプチド、メタロプロテイナーゼポリペプチド、msx1、msx2、E2F、frizzled、SMADポリペプチド又は脂肪酸結合ポリペプチドである活性ポリペプチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 活性ポリペプチドが、融合ポリペプチドである、請求項15に記載の方法。
- 融合ポリペプチドが、活性ポリペプチド及び前記の細胞への取り込みを促進するポリペプチドを含む、請求項16に記載の方法。
- 組成物が、活性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、その活性ポリペプチドが、繊維芽細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子レセプター、骨形成ポリペプチド、骨形成ポリペプチドレセプター、Wntポリペプチド、メタロプロテイナーゼポリペプチド、msx1、msx2、E2F、frizzled、SMADポリペプチド又は脂肪酸結合ポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- ポリヌクレオチドが、操作可能にプロモーターに結合されている、請求項18に記載の方法。
- プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項19に記載の方法。
- ポリヌクレオチドが、ベクターである、請求項18に記載の方法。
- 活性ポリペプチドが、msx−1である、請求項15又は18に記載の方法。
- 活性ポリペプチドが、繊維芽細胞成長因子である、請求項15又は18に記載の方法。
- 2以上の活性ポリペプチドを含む、請求項15又は18に記載の方法。
- 3以上の活性ポリペプチドを含む、請求項15又は18に記載の方法。
- キャリアー及び、繊維芽細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子レセプター、骨形成ポリペプチド、骨形成ポリペプチドレセプター、Wntポリペプチド、メタロプロテイナーゼポリペプチド、msx1、msx2、E2F、frizzled、SMADポリペプチド又は脂肪酸結合ポリペプチドであるポリペプチドを含む組成物であって、
哺乳動物細胞を脱分化させる当該組成物。 - 分化した哺乳動物細胞を、それらを動物の再生部位からの抽出物を含む組成物と、その組成物又は抽出物が脱分化、再生又は両方を誘導するように接触させることにより脱分化させることを含む方法であって、
脱分化後に、それらの哺乳動物細胞が増殖することができて、再分化した哺乳動物細胞を再生することができる当該方法。 - 脱分化した哺乳動物細胞のその後の増殖を更に含む、請求項27に記載の方法。
- 脱分化細胞からの、哺乳動物細胞、組織又は臓器の再生を更に含む、請求項28に記載の方法。
- 脱分化をイン・ビボで行う、請求項27に記載の方法。
- 脱分化をエキス・ビボで行う、請求項27に記載の方法。
- キャリアー及び動物の再生部位からの抽出物を含む組成物であって、その抽出物が、分化した哺乳動物細胞を脱分化させる当該組成物。
- 哺乳動物細胞の脱分化を誘導するポリペプチドを同定する方法であって、下記
動物の再生部位からの細胞を抽出し、
その抽出物の成分を精製し、
その精製した成分を哺乳動物細胞に適用し、
その哺乳動物細胞の脱分化の量を観察し、そして
得られた脱分化の量を、哺乳動物細胞をイモリの再生部位からの抽出物と接触させることにより達成された脱分化の量と比較する
ことを含み、同等以上の脱分化活性が、そのポリペプチドの脱分化、再生又は両方を誘導する能力を示す、上記の方法。 - 下記、
マトリクス、及び
動物の再生部位からの抽出物
を含む膏薬であって、この抽出物が、分化した哺乳動物細胞を脱分化させる当該膏薬。 - 抽出物が、有尾目両生類、硬骨魚類、棘皮動物及び甲殻類からの抽出物である、請求項1、26、27、32、33又は34に記載の発明。
- 抽出物が、イモリからの抽出物である、請求項35に記載の方法。
- 抽出物を、ヒト化してある、請求項35に記載の方法。
- 分化した筋管細胞を、それらをイモリの肢の再生部位からの抽出物を含む組成物と、その組成物が脱分化、再生又は両方を誘導するように接触させることによって脱分化させることを含む方法。
- 前記の筋管細胞が、マウスの細胞である、請求項38に記載の方法。
- 前記の筋管細胞が、C2C12細胞である、請求項39に記載の方法。
- 前記の筋管細胞が、イモリの細胞である、請求項38に記載の方法。
- 前記の細胞が、イン・ビトロで培養した細胞である、請求項38に記載の方法。
- 前記の脱分化後に、筋管細胞を増殖させる、請求項38に記載の方法。
- 分化した筋管細胞を、それらの細胞をmsx1ポリヌクレオチドを含む組成物と接触させることによって脱分化させることを含む方法。
- 前記のmsx1ポリヌクレオチドを誘導性プロモーターに操作可能に結合する、請求項44に記載の方法。
- 前記の筋管細胞が、マウスの細胞である、請求項44に記載の方法。
- 前記の筋管細胞が、イン・ビトロで培養したものである、請求項44に記載の方法。
- 前記の脱分化後に、筋管細胞を増殖させる、請求項44に記載の方法。
- 前記の細胞が、多能性である、請求項44に記載の方法。
- 損傷部位における再生芽形成を、その損傷部位を繊維芽細胞成長因子を含む組成物と接触させることによって誘導することを含む方法。
- 前記の繊維芽細胞成長因子が、創傷繊維芽細胞成長因子である、請求項50に記載の方法。
- 損傷部位における再生芽形成を、該部位を繊維芽細胞成長因子レセプターのインヒビターと接触させることにより阻止することを含む方法。
- 前記のインヒビターが、SU5402である、請求項52に記載の方法。
- 前記の損傷が、ゼブラフィッシュの損傷である、請求項50又は52に記載の方法。
- 前記の損傷が、外傷又は病気により招かれたものである、請求項50又は52に記載の方法。
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