CN116376975A - 激活异染色质基因的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了激活异染色质基因的方法及应用，具体地，本发明将Cas蛋白(比如dCas蛋白)进行拆分，同时与转录激活因子(比如VP64)和任选的靶向元件(比如HP1α)组合，可定向富集于异染色质，有效激活转录Xi异染色质内的基因。本发明的方法为X相关疾病提供了新的研究工具与治疗方案。本发明的方法也可用于异染色质内基因的编辑及调控。

Description

激活异染色质基因的方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及激活异染色质基因的方法及应用，更具体地，涉及截短型的dSaCas9蛋白、异染色质靶向元件HP1α的异染色质靶向的基因表达激活系统的设计及其应。
背景技术
人类的基因组储存于染色质之中，大部分染色质是开放可转录的，称为常染色质，也存在部分固缩、转录不活跃的染色质，称为异染色质。激活异染色质的基因表达有利于一些疾病的诊疗，但目前技术尚不成熟。下面以激活X染色体上的CDKL5为例进行进一步介绍。
人类的性别由X及Y染色体决定，男性的性别决定基因为一条X和一条Y染色体，而女性为两条X染色体。在人类胚胎发育16-18天后，女性的两条X染色质中的一条会随机失活，固缩为异染色质(下称Xi)而失去功能，男性则仅有一条X染色体，所以虽然性别决定基因型不同，但在细胞中男性与女性都只有一条X染色体主要行使功能。
X基因的失活涉及DNA甲基化等，并由相关蛋白及RNA的液相-液相相分离介导。其原理为相关蛋白与RNA以X染色质为核心和骨架发生相分离，凝聚成液态凝胶状，将X染色质包裹并压缩。此凝胶物质形成物理屏障，既阻碍X上的基因暴露，也阻碍转录相关分子的靠近，从而导致X染色质固缩失活，成为Xi。
X染色体上的基因突变导致的疾病被称为X连锁疾病(X-linked disorders)，其中如FXR1，Mecp2，LAMP-2等基因的突变会导致智力发育障碍并导致其他严重的疾病症状。CDKL5基因也位于X染色体，其突变会导致CDKL5综合症，发病概率约1/60,000-1/40,000，且患者以女性居多。CDKL5综合症致病突变被认为导致CDKL5蛋白的功能缺失，表型有早发性婴儿癫痫，智力发育障碍，自闭，运动障碍等，目前没有通用而有效的治疗方案或药物。CDKL5基因的蛋白质产物对神经细胞的形态发生，树突棘正常功能与形态是必须的，其缺失会导致神经细胞发育不正常，功能受损。
人类基因组为二倍体，除性染色体外有22对常染色体，通常一个基因有两个拷贝各位于一个染色体，它们称为等位基因。基因突变导致人类疾病时通常为杂合突变，即两条等位基因中仅有一条基因突变，而另一条正常。X连锁疾病的女性患者也是如此，患者通常仅有一条X染色体上的基因发生突变。对于常染色体，当杂合突变发生，致一个基因失去功能导致疾病时，可以通过上调另一条染色体上正常等位基因的转录，来弥补突变基因带来的功能缺失，达到治疗目的。同理，由于女性有两条X染色体，对于杂合突变的X连锁疾病的女性患者，若能上调另外一条X染色体上正常等位基因的转录，可达到治疗效果。但与位于非性染色体的杂合突变不同，女性杂合X连锁疾病患者病变细胞的正常等位基因一般位于异染色质化的Xi中，鉴于前文提及的异染色质固缩和封闭的特性，目前对异染色质的调控十分困难。
目前包括CRISPRa系统在内的CRISPR工具并不能有效操控异染色质内的基因。CRISPRa系统主要依靠sgRNA的引导来定位目标基因，而sgRNA无法区分等位基因，因为它们序列一致。加之异染色质基因不仅被相分离形成的屏障包被，还被甲基化，依靠CRISPRa系统自身不仅无法特异靶向Xi，甚至难以接触到Xi上的基因。
因此，本领域迫切需要开发一种对异染色质内基因进行编辑及调控的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对异染色质内基因进行编辑及调控的方法。
本发明的目的在于提供一种激活染色质基因表达的激活系统A。本发明还提供了运用HP1α元件把感兴趣的分子定位至异染色质的方法。结合上述两种方法，本发明还提供用于激活异染色质基因的激活系统B。本发明提供的方法可应用于研究或诊疗试剂盒的开发。
本发明第一方面提供了一种核酸构建物组合，包括第一核酸构建物和第二核酸构建物，其中，所述第一核酸构建物具有从5’-3’的式I结构：
P1-Z1-Z2-Z5-Y3-Z3-Z4(I)；
其中，P1为第一启动子序列；
Z1为任选的入核信号肽的编码序列；
Z2为任选的第一标签序列；
Y3为任选的转录激活因子的编码序列；
Z3为Cas蛋白的N端片段的编码序列；
Z4为任选的第一柔性短肽序列；
Z5为任选的靶向元件的编码序列；
所述第二核酸构建物具有从5’-3’的式II结构：
P2-Y1-Y2-Z1-Y3-Z5-Z1-Y4(II)；
其中，P2为第二启动子序列；
Y1为任选的第二柔性短肽序列；
Y2为Cas蛋白的C端片段的编码序列；
Z1为任选的入核信号肽的编码序列；
Y3为转录激活因子编码序列；
Z5为任选的靶向元件的编码序列；
Z1为任选的入核信号肽的编码序列；
Y4为任选的第二标签序列；
并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。
在另一优选例中，所述的第一启动子和第二启动子各自独立地选自下组：Cag、CMV、CBA、鸡β-actin、或其组合。
在另一优选例中，所述入核信号肽包括SV40。
在另一优选例中，所述入核信号肽的氨基酸序列如KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ IDNO.1)或PAAKRVKLD(SEQ ID NO.2)所示或所述入核信号肽包括一个或多个PKKKRKV序列。
在另一优选例中，所述一个或多个PKKKRKV序列中含有连接序列。
在另一优选例中，所述入核信号肽具有从5’-3’的式III所示的结构：
A-B-C(III)；
其中，A为PKKKRKV；
B为连接序列；
C为PKKKRKV；
并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。
在另一优选例中，所述核酸构建物组合还包括第三核酸构建物，具有从5’-3’的式V结构：
D-Y3(IV)；
其中，D为连接元件的编码序列；
Y3为转录激活因子编码序列；
并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。
在另一优选例中，所述Y3选自下组：VP64、P65、HSF1、RTA、或其组合。
在另一优选例中，所述D包括MS2。
在另一优选例中，第一标签序列选自下组：Myc、HA、Flag、V5、或其组合。
在另一优选例中，所述第一柔性短肽序列选自下组：GGGGSGGGGS、GGGSGGGGS、GGSGGGGSGGGGSGG、GGAGGG、GGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGCTCC、或其组合。
在另一优选例中，所述第二柔性短肽序列选自下组：GGGSGGGGS、GGGSGGGGS、GGSGGGGSGGGGSGG、GGAGGG、GGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGCTCC、或其组合。
在另一优选例中，所述转录激活因子选自下组：VP64、P65、HSF1、RTA、或其组合。
在另一优选例中，所述转录激活因子为VP64。
在另一优选例中，所述转录激活因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.3(RADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLYID)所示。
在另一优选例中，所述靶向元件选自下组：HP1α、SATB1、SHARP、或其组合。
在另一优选例中，所述靶向元件为HP1α。
在另一优选例中，所述靶向元件为HP1α的氨基酸序列如SEQ ID NO.4(GKKTKRTADSSSSEDEEEYVVEKVLDRRVVKGQVEYLLKWKGFSEEHNTWEPEKNLDCPELISEFMKKYKKMKEGENNKPREKSESNKRKSNFSNSADDIKSKKKREQSNDIARGFERGLEPEKIIGATDSCGDLMFLMKWKDTDEADLVLAKEANVKCPQIVIAFYEERLTWHAYPEDAENKEKETAKS)所示。
在另一优选例中，所述第二标签序列选自下组：HA、Flag、V5、Myc、或其组合。
在另一优选例中，所述Cas蛋白为突变剪切域，使其缺失剪切功能的Cas蛋白(即dCas蛋白)。
在另一优选例中，所述Cas蛋白选自下组：Cas9、Cas12、CasMINI、或其组合。
在另一优选例中，所述Cas蛋白的来源选自下组：酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、或其组合。
在另一优选例中，所述Cas12选自下组：Cas12a、Cas12b、Cas12f、Cas12i。
在另一优选例中，所述Cas蛋白的N端片段包括Cas1-(420-446)片段，优选Cas1-426片段。
在另一优选例中，所述Cas1-(420-446)片段对应于Cas9蛋白的SEQ ID NO.5的1-420位、或1-421位、或1-422位，或1-423位，或1-424位，或1-425位，或1-426位，或1-427位，或1-428位，或1-429位，或1-430位，或1-431位，或1-432位，或1-433位，或1-434位，或1-435位，或1-436位，或1-437位，或1-438位，或1-439位，或1-440位，或1-441位，或1-442位，或1-443位，或1-444位，或1-445位，或1-446位氨基酸，优选所述Cas1-(420-446)片段对应于Cas9蛋白的SEQ ID NO.5的或1-426位。
AKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG(SEQID NO.5)
在另一优选例中，所述Cas蛋白的C端片段包括Cas(421-447)-1053片段，优选Cas427-1053。
在另一优选例中，所述Cas(421-447)-1053对应于Cas9蛋白的SEQ ID NO.5的421-1053位，或422-1053位，或423-1053位，或424-1053位，425-1053位，或426-1053位，或427-1053位，或428-1053位，或429-1053位，或430-1053位，或431-1053位，或432-1053位，或433-1053位，或434-1053位，或435-1053位，或436-1053位，或437-1053位，或438-1053位，或439-1053位，或440-1053位，或441-1053位，或442-1053位，或443-1053位，或444-1053位，或445-1053位，或446-1053位，或447-1053位氨基酸，优选所述Cas(421-447)-053对应于Cas9蛋白的SEQ ID NO.5的427-1053位。
在另一优选例中，所述第一核酸构建物的长度≤4.7kb，较佳地，≤4.5kb，更佳地，3.0-4.5kb。
在另一优选例中，所述第二核酸构建物的长度≤4.7kb，较佳地，≤4.5kb，更佳地，3.0-4.5kb。
本发明第二方面提供了一种载体组合，包括第一载体和第二载体，所述第一载体含有第一核酸构建物，所述第二载体含有所述第二核酸构建物，所述的第一核酸构建物和第二核酸构建物如本发明第一方面中所定义。
在另一优选例中，所述载体组合还含有第三载体，所述第三载体为编码sgRNA的第三载体。
在另一优选例中，所述载体组合还包括第四载体，所述第四载体表达第三核酸构建物，所述第三核酸构建物如本发明第一方面中所定义。
在另一优选例中，所述第一载体、第二载体、第三载体和第四载体包括病毒载体和非病毒载体。
在另一优选例中，所述病毒载体选自下组：腺相关病毒载体、慢病毒载体、或其组合。
在另一优选例中，所述非病毒载体包括质粒。
本发明第三方面提供了一种基因工程细胞，所述细胞被本发明第一方面所述的构建物所转化；或被本发明第二方面所述的载体组合所转化或转染。
在另一优选例中，所述的载体组合包括第一载体和第二载体。
在另一优选例中，所述载体组合还包括第四载体，所述第四载体表达第三核酸构建物，所述第三核酸构建物如本发明第一方面中所定义。
在另一优选例中，所述第一载体、第二载体和第四载体包括病毒载体和非病毒载体。
在另一优选例中，所述病毒载体选自下组：腺相关病毒载体、慢病毒载体、或其组合。
在另一优选例中，所述非病毒载体包括质粒、。
在另一优选例中，所述基因工程细胞为真核细胞。
在另一优选例中，所述真核细胞选自下组：哺乳动物细胞(如HEK293T细胞)、人细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述真核细胞为具有X染色体的细胞。
在另一优选例中，所述真核细胞包括胚胎干细胞、神经元细胞、神经胶质细胞
在另一优选例中，所述的基因工程细胞是第一病毒载体和第二病毒载体通过病毒制备的。
本发明第四方面提供了一种调控特异性染色质上基因的方法，包括步骤：
(i)提供一细胞以及第一载体和第二载体，其中所述第一载体含有第一核酸构建物，所述第二载体含有所述第二核酸构建物，所述的第一核酸构建物和第二核酸构建物如本发明第一方面中所定义；
(ii)用所述的载体感染所述的细胞，从而调控特异性染色质上基因。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，还包括用编码gRNA的第三载体同时感染所述细胞。
在另一优选例中，在步骤(ii)中，还包括用编码第三核酸构建物的第四载体同时感染所述细胞。
在另一优选例中，所述的第一载体和/或第二载体还携带表达gRNA表达盒。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性。
在另一优选例中，所述的细胞来自以下物种：人、非人哺乳动物、家禽。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、牛、猪、羊、马、狗、猫、非人灵长动物(如猴)。
在另一优选例中，所述的细胞包括：体细胞、肿瘤细胞、干细胞、生殖细胞、非分裂细胞、或其组合。
另一优选例中，所述的细胞包括：胚肾细胞、脑神经瘤细胞、胚胎干细胞、上皮细胞、内皮细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述调控特异性染色质上基因包括上调特异性染色质上基因的表达。
在另一优选例中，所述染色质上基因包括异染色质区上的基因。
在另一优选例中，所述染色质上基因包括失活X染色体(巴氏小体)上的基因。
在另一优选例中，所述染色质上基因包括CDKL5、FXR1、Mecp2、LAMP-2。
本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的第一载体；和
(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的第二载体。
在另一优选例中，所述第一容器和第二容器是不同的容器。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有说明书，所述说明书中记载了如下说明：将第一载体和第二载体感染细胞，从而调控特异性染色质上基因的方法。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有(c1)第三容器，以及含有编码gRNA的第三载体的第三容器。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有(d1)第四容器，以及含有编码第三核酸构建物的第四载体的第四容器，所述第三核酸构建物如本发明第一方面中所定义。
在另一优选例中，所述的第一载体和/或第二载体还携带表达gRNA表达盒。
附图说明
图1显示了系统A的组分一和组分二的关键片段细胞定位检测。
图2显示了系统A激活CDKL5基因表达。
图3显示了HP1α元件助感兴趣分子定位至异染色质区。
图4显示了HP1α元件助系统B中组分定位异染色质区。
图5显示了特异性激活CDKL5基因表达。
图6显示了对非目标基因的邻近基因表达影响。
图7显示了系统B激活位于Xi上的CDKL5蛋白表达。
图8显示了系统A和系统B特异性激活Xi上的CDKL5基因表达。
图9显示了与其他已有系统相比，系统B对位于Xi上的CDKL5基因调控。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现，将Cas蛋白(比如dCas蛋白)进行拆分，同时与转录激活因子(比如VP64)和任选的靶向元件(比如HP1α)组合，可定向富集于异染色质，有效激活转录Xi异染色质内的基因。本发明的方法为X相关疾病提供了新的研究工具与治疗方案。本发明的方法也可用于异染色质内基因的编辑及调控。在此基础上，本发明人完成了本发明。
dCas蛋白
如本文所用，dCas蛋白是一种核酸酶，在RNA的引导下，能特异性切割染色质上的DNA片段。在去除剪切域后，保留其识别基因片段的能力。
转录激活因子
如本文所用，转录激活蛋白因子是能与基因表达的启动子区结合并激活基因转录反应的蛋白质分子。
靶向元件
如本文所用，靶向元件是蛋白质分子，利用蛋白质本身特异性定位在Xi上的特质，定向结合特定的染色体。
本发明的构建物组合
本发明提供了一种核酸构建物组合，包括第一构建物和第二构建物，其是利用Cas蛋白的结构信息及其拆分方法，与转录激活因子和任选的靶向元件组合，可包装进病毒载体，并可定向富集于异染色质，有效激活转录Xi异染色质内的基因。本发明的构建物组合如本发明第一方面所述。
本发明的构建物组合中所用的各种元件都是本领域中已知的，因此本领域技术人员可以用常规方法，如PCR方法、全人工化学合成法、酶切方法获得相应的元件，然后通过熟知的DNA连接技术连接在一起，就形成了本发明的构建物组合。
将本发明的构建物组合(第一构建物和第二构建物)插入外源载体，就构成了本发明的载体组合(第一载体和第二载体)。
为达到转录激活位于Xi中基因从而挽救X连锁疾病表型的目的，本发明设计了HP1α元件，该元件起到特异靶向异染色质的作用。连接Hp1α可使CRISPRa系统元件穿透并富集于异染色质，使得对Xi特异操控成为可能。此外，为提高效率，我们也对CRISPRa系统进行了改造，将改造所得的Xi靶向的CRISPRa系统命名为HP1α-Split-dSaCas9系统，并以位于X染色体的CDKL5为目的基因进行了转录激活测试。测试结果显示HP1α-Split-dSaCas9系统可以定向富集于异染色质，有效激活转录Xi异染色质内的CDKL5基因。
因此，HP1α元件可使其它分子工具靶向异染色质，HP1α-Split-dSaCas9系统可转录激活Xi上的基因，而配合靶向CDKL5基因的sgRNA，HP1α-Split-dSaCas9系统可转录激活Xi上的CDKL5基因。此套Xi靶向系统为X相关疾病提供了新的研究工具与治疗方案。此外，此系统也可用于异染色质内基因的编辑及调控。
HP1α元件的运用方法
借助生物化学方法，如以融合蛋白形式共同表达、标签和识别元件特异结合等，以共价或不共价的方式，将HP1α元件连接于希望进入异染色质的任意生物大分子上。
激活系统A设计方法
目前最常用的CRISPR Cas9系统为SpCas9与SaCas9，这两个Cas9蛋白的分子量分别为158KDa与124KDa。较大的分子量使得它们入核的效率较低，但较其它小型的Cas9蛋白，SpCas9与SaCas9的活性更高，研究更透彻。激活系统A的设计原理为对SaCas9进行截断处理以获得更高的入核效率，将此系统命名为Split-dSaCas9系统。其具体设计方法如下：
选取KKH SaCas9(staphylococcus aureus)蛋白，对其切割活性相关位点进行突变(D10Aand N580A)，使其不再具备切割活性，即产生dSaCas9。再在其420号残基至446号残基之间(SEQ ID No.5)的任意位置将蛋白截断(示例中为426号残基后断裂)，产生约52kDa大小的dSaCas9蛋白的N端蛋白片段即组分一，和约72kDa大小的C端片段即组分二，此截断型dSaCas9蛋白较全长dSaCas9可更多定位于细胞核，同时也更短小利于病毒包装。经测试组分一与组分二无需连接仍能发挥作用。
在不影响dSaCas9功能的前提下，将转录激活元件如VP64连接于适合位置，如组分二的C端或组分一的N端。给组分一与组分二连接标签蛋白及入核信号肽。
根据SaCas9系统的sgRNA设计原则设计sgRNA，即组分三。将所有元件放入所需的表达系统，如质粒或病毒进行测试，根据测试结果和预期，可在gRNA设计，转录激活元件选择，SaCas9断裂位置，入核信号肽标签肽位置及数目等方面进行调整。
系统A示例
组分一:dSaCas9蛋白N片段，N端依次连接有入核信号肽SV40、Myc标签；C端连接有柔性短肽序列。
SV40：PKKKRKV
Myc：EQKLISEEDL
Split-dSaCas9：dSaCas9的对应于SEQ ID NO.5中的1-(420-446)位氨基酸，优选1-426位氨基酸
柔性短肽：GGGGSGGGGS。
组分一中可加入转录激活因子。
组分二:dSaCas9蛋白C片段，N端连接有柔性保护短肽序列，C端依次连接有入核信号肽SV40，转录激活因子VP64序列，入核信号肽SV40、HA标签。
柔性短肽：GGGSGGGGS
Split-dSaCas9：dSaCas9的对应于SEQ ID NO.5中的(421-447)-1053位氨基酸，优选427-1053位氨基酸。
SV40：PKKKRKV；
VP64：SEQ ID NO.3
SV40：PKKKRKV
HA：YPYDVPDYA。
组分三：靶向位于X染色体的CDKL5基因的sgRNA序列
Sa-sgRNA-6：tcgtgtagtagagggctagaaca
在系统A中，启动子包括Cag、CMV、CBA、鸡β-actin。
激活系统B设计方法
作为异染色质形成与维持的核心蛋白，HP1α具有特异定位并富集于异染色质，结合异染色质内DNA的能力，也有将连接于其上的其它蛋白质序列带入异染色质的能力。激活系统B的设计原理为利用HP1α的特性将CRISPRa系统引导并富集于异染色质，以获得更高的对Xi上基因的激活效率，以及对Xi上基因的特异激活。所谓Xi的特异激活，即常染色质Xa和异染色质Xi上存在着等位基因，但在SgRNA无法区分Xa和Xi上的两个结合位点的情况下，系统B偏向激活Xi上的基因，而较少甚至不激活Xa上的等位基因。根据包含的核心元件，此系统在上文中也被称为HP1α-Split-dSaCas9系统。其具体设计方法如下：
依照激活系统A设计方法所述，对dSaCas9进行截断，并添加转录激活元件，标签蛋白，入核信号肽等，获得组分一、组分二。
在不影响CRISPRa系统功能的前提下，将HP1α蛋白序列连接至CRISPRa系统部分或所有元件的适当位置。如将Hp1α蛋白序列连接至dSaCas9的N端片段的N端，及表达转录激活因子如VP64的C端。融合有Hp1α的蛋白片段可定位于异染色质，而无Hp1α的元件若与有Hp1α的元件之间存在相互作用，则也可通过蛋白质相互作用被定位至异染色质，所以并无必要给所有CRISPRa系统元件连接HP1α。连接和未连接有HP1α的元件，及连接位置不同的元件互相组合能改变激活效率，可尝试不同搭配来达到预期效率。
根据SaCas9系统的sgRNA设计原则设计sgRNA，即组分三。将所有元件放入所需的表达系统，如质粒或病毒进行测试，根据测试结果和预期，可在连接有HP1α的CRISPRa系统元件数量，连接HP1α元件的位置，转录激活元件选择，SaCas9断裂位置，入核信号肽标签肽位置及数目等方面进行调整。
系统B示例组分一：的dSaCas9蛋白N片段，N端依次连接有入核信号肽SV40、Myc标签，HP1α；C端连接有柔性保护短肽序列。
SV40：PKKKRKV
Myc：EQKLISEEDL
HP1α：SEQ ID NO.4
Split-dSaCas9：dSaCas9的对应于SEQ ID NO.5中的1-(420-446)位氨基酸，优选1-426位氨基酸
Linker：GGGGSGGGGS
组分一中可加入转录激活因子。
组分二：dSaCas9蛋白C片段，N端连接有柔性保护短肽序列，C端依次连接有入核信号肽SV40，转录激活因子VP64序列，HP1α序列，入核信号肽SV40、HA标签。
Linker：GGGSGGGGS
Split-dSaCas9：dSaCas9的对应于SEQ ID NO.5中的(421-447)-1053位氨基酸，优选427-1053位氨基酸。
SV40：PKKKRKV
VP64：SEQ ID NO.3
Hp1α：SEQ ID NO.4
SV40：PKKKRKV
HA：YPYDVPDYA
组分三：靶向位于X染色体的CDKL5基因的sgRNA序列
Sa-sgRNA-6：tcgtgtagtagagggctagaaca
在系统B中，启动子包括Cag、CMV、CBA、鸡β-actin。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，将Cas蛋白(比如dCas蛋白)进行拆分，同时与转录激活因子(比如VP64)和任选的靶向元件(比如HP1α)组合，可定向富集于异染色质，有效激活转录Xi异染色质内的基因。本发明的方法为X相关疾病提供了新的研究工具与治疗方案。本发明的方法也可用于异染色质内基因的编辑及调控。
(2)本发明设计了HP1α元件，该元件起到特异靶向异染色质的作用。连接Hp1α可使CRISPRa系统元件穿透并富集于异染色质，使得对Xi特异操控成为可能。此外，为提高效率，我们也对CRISPRa系统进行了改造，将改造所得的Xi靶向的CRISPRa系统命名为HP1α-Split-dSaCas9系统，并以位于X染色体的CDKL5为目的基因进行了转录激活测试。测试结果显示HP1α-Split-dSaCas9系统可以定向富集于异染色质，有效激活转录Xi异染色质内的CDKL5基因。
(3)本发明首次发现，HP1α元件可使其它分子工具靶向异染色质，HP1α-Split-dSaCas9系统可转录激活Xi上的基因，而配合靶向CDKL5基因的sgRNA，HP1α-Split-dSaCas9系统可转录激活Xi上的CDKL5基因。此套Xi靶向系统为X相关疾病提供了新的研究工具与治疗方案。此外，此系统也可衍生运用于异染色质内基因的编辑及调控。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料和试剂如无特殊说明均可从市售渠道获得。
实施例1系统A的组分一和组分二的关键片段细胞定位检测
质粒的构建与抽提
本实施例使用的组分一关键片段为dSaCas9蛋白N片段，N端依次连接有入核信号肽SV40、Myc标签；C端连接有柔性短肽序列。
启动子：CAG启动子
SV40：PKKKRKV
Myc：EQKLISEEDL
Split-dSaCas9：dSaCas9的对应于SEQ ID NO.5中的1-(420-446)位氨基酸，优选1-426位氨基酸
柔性短肽：GGGGSGGGGS。
本实施例使用的组分二关键片段为的dSaCas9蛋白C片段，N端连接有柔性保护短肽序列，C端依次连接有入核信号肽SV40，转录激活因子VP64序列，入核信号肽SV40、HA标签。
启动子：CAG启动子。
柔性短肽：GGGSGGGGS
Split-dSaCas9：dSaCas9的对应于SEQ ID NO.5中的(421-447)-1053位氨基酸，优选427-1053位氨基酸。
SV40：PKKKRKV
VP64：SEQ ID NO.3
SV40：PKKKRKV
HA：YPYDVPDYA。
全长蛋白dSaCas9(SEQ ID NO.5)作为对照。
关键片段为dSaCas9全长蛋白，N端连接有入核信号肽SV40、Flag标签；C端连接有HA蛋白。
启动子：CAG启动子。
SV40：PKKKRKV
Flag：DYKDDDDKDYKDDDDKDYKDDDDK
HA：YPYDVPDYA。
全长蛋白dSpCas9(SEQ ID NO.6)作为对照。
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO.6)
关键片段为dSpCas9全长蛋白，N端连接HA标签。
启动子：EF-1α。
HA：YPYDVPDYA
按常规方法构建质粒。使用无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118，天根)提取质粒备用。
细胞培养及转染
人胚肾细胞HEK-293T购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(中国上海),培养基为含有10％FBS(Gibco公司，美国Waltham)的DMEM培养基(Coring公司，美国Manassas)。培养环境为37℃、含5％CO2、有湿润空气的培养箱。隔2天传代一次，使用0.05％胰酶进行消化，离心重悬，按照1:7的比例进行传代种植培养。
培养所用到的细胞爬片先进行预处理。首先在浓盐酸里浸泡，之后浸泡蒸馏水。在换过3次水以后，依次浸泡在由蒸馏水配置的50％，75％，100％的酒精中。每次浸泡时间不短于2天。用镊子取出爬片，在酒精灯上短暂的烤一下，去除两面附着的酒精，放置于细胞培养板中。将0.05％胰酶消化的HEK-293T细胞，使用培养基重悬。按照铺满培养板1/3的细胞密度进行接种，加入适量培养基，十字法摇匀。培养14h左右，在细胞密度为50％-60％的状态下加入对应的质粒进行转染。转染过夜后，从培养箱中取出，准备细胞免疫组化。
吸干培养板中残留的培养基，加入PBS，洗一遍。每次加液与换液时，均要小心避免冲起爬片上的细胞团。之后加入4％多聚甲醛+4％蔗糖的混合液，室温固定10min。PBS洗3次，每次清洗间隔，放置摇床摇动5分钟，充分去除上一步的溶液残留。加入0.2％ Triton-X100破膜打孔5分钟，后无需PBS清洗，直接加入3％ BSA溶液，室温封闭1h以上。配置所需的一抗稀释液，按照1:1000到1:2000的浓度，溶于3％ BSA溶液。小心取出爬片，细胞面朝上，放置可避光的湿盒中。孵育一抗稀释液，4℃过夜。第二天重新转移爬片到原培养板中。PBS清洗3次，每次5分钟。配置所需的二抗稀释液，按照1:2000到1:4000的浓度，溶于3％ BSA溶液。Hoechst按照1:4000的比例在这一步中配置添加。将清洗好的样本爬片转移回湿盒中，按照孵育一抗的方式孵育二抗稀释液。避光室温孵育2h。这一步之后，样品全程需要避光，以免破坏实验结果。依旧按照上文操作，用PBS清洗3次，每次5分钟。在载玻片上滴加适量细胞封片剂，爬片的细胞面朝下，润在封片剂中。用指甲油三点固定爬片，避光晾干，4℃保存，以待显微镜下观察。
所用一抗，如下所示：
Anti-HA High Affinity from rat IgG1(roche,11867423001)
Myc-Tag(9B11)Mouse mAb(Cell Signaling Technology#2276)
所用二抗，如下所示：
Chicken anti-rat IgG(H+L)Highly cross-adsorbed secondary antibody,Alexa Fluor 488(Invitrogen，A-21470)
Donkey anti-Mouse IgG(H+L)Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa FluorTM 546(Invitrogen，A10036)
核标记物：Hoechst(碧云天)
显微镜观察及图像采集
制作好的样本用荧光显微镜以60x/1.4NA oil油浸接物镜采集，像素分辨率为1024x 1024，以0.3μm的间隔进行Z轴采集，每个图像平均两次。
结果如图1所示。dSaCas9的N端与C端蛋白片段，定位于HEK-293T细胞核中，且共定位(图1左)。而全长dSaCas9主要定位在胞浆(图1右上)。传统的CRISPRa系统对目的基因的激活效率高，但其使用的全长蛋白dCas9较大，入核效率低，免疫组化无法观察到核定位(图1右下)。
实施例2系统A的制备及在激活CDKL5基因表达中的应用
质粒的构建与抽提
本实施例使用的系统A包含组分一、组分二和组分三，并搭配多种激活元件。其中组分一和组分二的具体序列及制备如实施例1所述。本实施例所使用到的转录激活因子元件构成为MS2-P65-HSF1:Addgene Plasmid#61423
组分三：靶向位于X染色体的CDKL5基因的sgRNA序列
Sa-sgRNA-6：tcgtgtagtagagggctagaaca，所使用的质粒骨架Addgene Plasmid#61424
对照组dSaCas9系统使用全长蛋白dSaCas9，具体序列如实施例1所示，所使用的靶向位于X染色体的CDKL5基因的sgRNA序列为：
Sa-sgRNA-6：tcgtgtagtagagggctagaaca，所使用的质粒骨架Addgene Plasmid#61424
搭配的的激活元件构成为
MS2-P65-HSF1:Addgene Plasmid#61423
对照组SAM系统使用全长蛋白dCas9，具体序列如实施例1所示，所使用的靶向位于X染色体的CDKL5基因的sgRNA序列为：
sgRNA-6：cagcccaggttgctagggcc，所使用的质粒骨架Addgene Plasmid#61424搭配的激活元件构成为
MS2-P65-HSF1:Addgene Plasmid#61423
按常规方法构建质粒。使用无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118,天根)提取质粒备用。
细胞培养及转染
小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(中国上海)，培养基为含有10％FBS(Gibco公司，美国Waltham)的DMEM培养基(Coring公司，美国Manassas)。培养环境为37℃、含5％CO2、有湿润空气的培养箱。隔2天传代一次，使用0.05％胰酶进行消化，离心重悬，按照1:7的比例进行传代种植培养。
将0.05％胰酶消化的Neuro-2a细胞，使用培养基重悬。按照铺满培养板1/3的细胞密度进行接种，加入适量培养基，十字法摇匀。培养14h左右，在细胞密度为50％-60％的状态下加入对应的质粒进行转染。转染24小时后，从培养箱中取出，准备提取RNA。
RNA提取和反转录
用DEPC-PBS清洗一遍后，用试剂盒(EZB,B0004DP)抽提mRNA。最后使用25ul DEPC-ddH2O溶解24孔板一个孔的样品量。待彻底溶解，用Nanodrop 2000定量仪进行浓度测定，浓度一般在300ng/ul左右。准备进行反转录，使用Bio-Rad的试剂盒(iScript cDNASynthesis kit)进行实验。体系如下：
2ul 5X iScript Reaction Mix Buffer，0.5ul iScript ReverseTranscriptase，X ul RNA template(1.5ug)，(7.5-X)ul Nuclease-free water，总体积10ul。
反转录程序，如下：
25℃，5min；42℃，30min；85℃，5min；10℃，∞。所得样品进行RT-PCR反应。所用试剂盒为
Figure BDA0004104330920000181
RNA Master SYBR Green I kit(Roche)试剂盒
通过RT-PCR，检测系统A对CDKL5转录激活水平影响。
RT-PCR荧光定量检测以及数据分析采用
Figure BDA0004104330920000182
480
Real-Time PCR System。所用引物如下：
GAPDH-F ATCCCAGAGCTGAACGGGAAGC
GAPDH-R TTGGGGGTAGGAACACGGAAGG
CDKL5-2000-F CGTCCTCACAGGCATTCCAT
CDKL5-2000-R TCTCCAGGCTGGGGTGATAA
反应体系：10ul SYBR Green Mix，1ul引物F加1ul引物R，1ul cDNA template，7ulddH2O，总体积为20ul。
反应程序：95℃，5min；95℃，10s，58℃，20s，72℃，20s，循环40次；95℃，5s；65℃，1min。
反应结束后确认RT-PCR的扩增曲线和溶解曲线，使用2-△△Ct进行分析和计算。
结果如图2所示，与空白对照组相比，系统A可上调CDKL5的转录拷贝数，且上调倍数高于dSaCas9系统和SAM系统。
实施例3 HP1α元件在定位感兴趣分子至异染色质的应用
质粒的构建与抽提
HP1α蛋白特异性定位在异染色质区且参与巴氏小体的形成与维持。基于MS2-P65-HSF1(Addgene Plasmid#61423)，构建不同质粒。在C端添加EGFP序列，构建P65-HSF1-EGFP；
EGFP:
VSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK(SEQ ID NO.7)
在N端添加HA标签，C端添加HP1α序列，构建HA-P65-HSF1-HP1α质粒,
HA：YPYDVPDYA
HP1α：SEQ ID NO.4。
使用无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118,天根)提取质粒。
细胞培养及转染方法同实施例1，每孔转染1ug EGFP-P65-HSF1或HA-P65-HSF1-HP1α质粒。显微镜观察及图像采集同实施例1。H3K27me3识别的是组蛋白3上第27号赖氨酸上的甲基化，这种甲基化特异性地出现在异染色质区。
另用一抗：Tri-Methyl-Histone H3(Lys27)(C36B11)Rabbit mAb(CellSignaling Technology#9733)
另用二抗：
Donkey anti-Rabbit IgG(H+L)Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa FluorTM Plus 555(Invitrogen，A32794)
结果如图3所示，融合了HP1α的p65蛋白，细胞亚定位发生了改变，从核内弥散分布转变为聚集分布在核边缘处且与H3K27me3信号共标。
实施例4 HP1α元件助系统B中组分一和组分二定位异染色质区的应用
质粒的构建与抽提
按本发明所示的设计方法，根据系统A中的组分一和组分二，添加HP1α元件，分别构建系统B中的组分一和组分二。本实施例用到的具体序列如下所述。组分一：dSaCas9蛋白N片段，N端依次连接有入核信号肽SV40、Myc标签，HP1α；C端连接有柔性保护短肽序列。
SV40：PKKKRKV
Myc：EQKLISEEDL
HP1α：SEQ ID NO.4
Split-dSaCas9：dSaCas9的对应于SEQ ID NO.5中的1-(420-446)位氨基酸，优选1-426位氨基酸
Linker：GGGGSGGGGS
组分二：dSaCas9蛋白C片段，N端连接有柔性保护短肽序列，C端依次连接有入核信号肽SV40，转录激活因子VP64序列，Hp1α序列，入核信号肽SV40、HA标签。
Linker：GGGSGGGGS
Split-dSaCas9：dSaCas9的对应于SEQ ID NO.5中的(421-447)-1053位氨基酸，优选427-1053位氨基酸。
SV40：PKKKRKV
VP64：SEQ ID NO.3
Hp1α：SEQ ID NO.4
SV40：PKKKRKV
HA：YPYDVPDYA
用无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118,天根)提取质粒。
细胞培养及转染方法同实施例1，将系统A中的组分一和组分二，和系统B中的组分一和组分二分别转染至HEK-293T细胞系。显微镜观察及图像采集同实施例1，用抗HA和抗Myc的一抗及H3K27me3标记物进行免疫荧光染色和图像采集。
其中改用二抗：Donkey anti-mouse IgG(H+L)Highly cross-adsorbedsecondary antibody,Alexa Fluor 488(Invitrogen，1820538)
结果显示，携带HP1α元件的系统B组分在系统A组分大量入核的基础上，能够更为特异性地定位至异染色质区，并和异染色区标记物明显共标(图4)。
实施例5系统B的制备及在激活CDKL5基因表达中的应用
本实施例使用的系统B包含组分一、组分二和组分三，并搭配多种激活元件。其中组分一和组分二的具体序列及制备如实施例4所述。本实施例所使用到组分三和激活元件的具体序列及制备如实施例2所述。
对照组使用的SAM系统，具体序列和构成如实施例1和实施例2所示。
Cdkl5 620stop/+；Xa/Xi细胞品系构建
为测定激活效率，我们构建了Cdkl5 620stop/+；Xa/Xi细胞系。现简述构建方法。从孕鼠体内获得的胚胎干细胞，单细胞团培养，扩增。取少量消化细胞，离心去上清，PBS清洗一遍，蛋白酶K法消化，得到基因组模板。使用PCR法鉴定筛选出雌性细胞株。针对Y染色体独有的Sry，Rbmy基因设计引物，如下：
Sry-f TTGGCAGCCTGTTGATATCCCCA
Sry-r GGTGTATGCTCACCAGTGATG
Rbmy-f GGAAGATTCCATGAGGCACCATCTGC
Rbmy-r CCACGACCTCCATGGGATCCCCCA
针对X染色体上的CDKL5基因设计引物，如下：
CDKL5-F CCACCCTCTCAGTAAGGCAGCAG
CDKL5-R GTCCTTTTGCCACTCAATTCCATCC
通过电泳，含有CDKL5 PCR条带，且没有Sry，Rbmy的细胞为雌株。通过CRISPR/Cas9技术靶向编辑，使CDKL5的第2109位碱基G缺失，造成移码突变，于620aa处提前终止转录。CRISPR/Cas9系统由含有Cas9全长蛋白质粒和含有同源臂质粒构成
Cas9全长蛋白质粒骨架：Addgene Plasmid#42230
sgRNA序列为：
620-sgRNA-1GCATTCCATGTACGTGACCC
620-sgRNA-2CGGGACAAAGTGAGAGCGAA
同源臂片段：NC_000086中159918-161530位碱基，缺失第160722位碱基
流式技术筛选细胞，培养扩增所得的单细胞克隆。由于，Xi上的基因难以编辑，CRISPR/Cas9技术靶向编辑Xa上基因。所得细胞株Xa上为620截短突变型CDKL5,Xi上为野生型CDKL5，即为Cdkl5 620stop/+；Xa/Xi细胞品系。细胞系的PCR鉴定引物如下：
620-J-F：TTGCTCAGCCCTTCCGGTCG
620-J-R：GTGCTAGGACATGCCTGTGTCT
细胞培养及转染
细胞培养基为含有15％FBS(Gibco公司，美国Waltham)的DMEM培养基(Coring公司，美国Manassas)。每500ml培养基中添加5mL NEAA(Gibco)；5mL Nucleosides(Milipore)；5mL Pen-Strep；5mL L-Glutamine(Gibco)；β-ME(Milipore)；50μL PD0325901(Selleck)；50μL CHIR99021(Selleck)；50μL mouse LIF(Milipore)。过滤后分装，4℃保存。培养环境为37℃、含5％CO2、有湿润空气的培养箱。隔2天传代一次，使用0.25％胰酶进行消化，离心重悬，按照1:6的比例进行传代种植培养。
将0.25％胰酶消化的细胞，使用培养基重悬。按照铺满培养板1/3的细胞密度进行接种，加入适量培养基，十字法摇匀。培养14h左右，在细胞密度为50％-60％的状态下加入对应的质粒进行转染。转染24小时后，从培养箱中取出，准备提取RNA。
通过RT-PCR，检测系统B对位于Xa上和总CDKL5转录激活水平影响。
基因表达拷贝数检测方法同实施例2，将系统B和SAM组分别共转染Cdkl5620stop /+；Xa/Xi细胞系，对CDKL5 mRNA总拷贝数变化进行检测，同时使用特异性引物对检测截短突变型CDKL5 mRNA拷贝数变化。所用引物对如下：
CDKL5-620-F CATTCCATGTACGTGACCCAGA
CDKL5-2000-R TCTCCAGGCTGGGGTGATAA
结果如图5所示：系统B明显地上调了CDKL5总拷贝数，且上调倍数远高于SAM(dCas9)组。与空白组相比，系统B组中总拷贝数倍数增长，但其CDKL5V620X截短型拷贝数并没有明显上调趋势；而SAM组中总拷贝数和突变型拷贝数均上调，且变化量的趋势一致，比例相似。因此，相对于传统的CRISPRa系统，系统B对位于Xi上表达的野生型CDKL5有较强的激活活性和较好的靶向性。
实施例6系统B对非目标基因的邻近基因影响的应用
系统B具体序列及制备如实施例5所述。
为检测系统B对目的基因附近基因的影响，我们挑选了位于CDKL5附近的两个X染色体基因进行检测。将实施例5所述的系统B组成成分共转染Cdkl5620stop/+；Xa/Xi细胞系，通过RT-PCR，对CDKL5、Phka2和Rai2 mRNA进行检测，具体操作同实施例5。
所用引物如下：
GAPDH-F ATCCCAGAGCTGAACGGGAAGC
GAPDH-R TTGGGGGTAGGAACACGGAAGG
CDKL5-2000-F CGTCCTCACAGGCATTCCAT
CDKL5-2000-R TCTCCAGGCTGGGGTGATAA
Phka2-F GTCCAGAGCATTGCTGATGTGC
Phka2-R ACCAATGTGCCGATACGGTCGA
Rai2-F CCACTCTGGAAAAGGACGAACTG
Rai2-R GCACTGACTTCATGGACAGATCC
结果如图6所示，在Cdkl5620stop/+；Xa/Xi细胞品系中，与SAM系统相比，系统A和系统B均高效地激活了CDKL5表达。系统B对邻近基因表达的影响最小，更为接近空白对照组。
实施例7系统B激活位于Xi上的CDKL5蛋白表达的应用
本实施例使用的系统B如实施例5所示，构建入慢病毒载体中。按照常规方法包装慢病毒，浓缩病毒上清，分装在-80℃冰箱保存。
病毒感染和蛋白样品收集
Cdkl5620stop/+；Xa/Xi细胞品系培养方法如实施例5所示。在铺盘后6小时加入慢病毒，之后每天半数换液，感染5天后收取蛋白样品。
细胞取出后，使用PBS溶液清洗一遍后，加入LBA-300裂解液。细胞刮下细胞样品置于离心管中，冰上反应30分钟。按照4℃，14000g的程序离心15分钟。样品取出，置于冰上，保留样本上清，即为所需要的蛋白溶液。混合样品与蛋白上样缓冲液，于80℃水浴7分钟。简短离心，充分振荡，置于冰上，以备免疫印记实验。
免疫印记实验
提前配制好含9％ SDS-PAGE分离胶和5％ SDS-PAGE浓缩胶的电泳胶。制备好的样品添加到样品槽中，连接电源。按照60V,1h；110V,2h的程序进行电泳。电泳结束后准备转膜。
取出电泳胶，仅保留分离胶层。提前将PVDF膜浸泡于纯甲醇中，按照海绵层，滤纸层，电泳胶，PVDF膜，滤纸层，海绵层的顺序进行组装。按照350mA,2h的程序进行转膜。
将脱脂奶粉溶解于TBST中，配制5％的牛奶，备用。转膜结束后，取出杂交膜，置于牛奶中，室温孵育1h。按照1:1000比例使用牛奶稀释一抗，所用一抗，如下所示：
Sheep polyclonal anti-CDKL5(MRC PPU，SA145)
样品孵育一抗，4℃，过夜。取出杂交膜，新鲜的TBST清洗3遍，每次5分钟。按照1:2000比例使用牛奶稀释二抗，所用HRP偶联的二抗，如下所示：
Donkey anti-sheep IgG(H+L)(Invitrogen，1458623)
室温孵育二抗，2h。内参选用Actin，室温孵育2h。所用抗体：
β-Actin(8H10D10)Mouse mAb(HRP Conjugate)(Invitrogen#12262)
孵育结束后，用TBST洗膜3次，每次5分钟，最后用显影试剂ECL(TIANGEN，中国)在化学显影仪中进行曝光。
结果如图7所示：与空白组相比，系统B明显地上调了CDKL5全长蛋白(115kDa处)表达；但在截短型CDKL5蛋白位置(74kDa处)没有看到条带。以此可说明系统B能够成功激活位于Xi上的基因上调，促使蛋白表达；而对于Xa上的蛋白表达则没有影响。
实施例8系统A和系统B特异性激活Xi上的CDKL5基因表达
本实施例使用的系统A如实施例2所示,本实施例使用的系统B如实施例5所示。所用细胞系和具体实施步骤按照实施例5所示。
结果如图8所示：系统A和系统B明显地上调了CDKL5总拷贝数，且上调倍数远高于空白组。系统A和系统B两组相对比，系统B组比系统A组，总拷贝数倍数更高且表现更为稳定，而其CDKL5 V620X截短型拷贝数并没有明显上调趋势。两组对位于Xi上表达的野生型CDKL5有较强的激活活性和较好的靶向性，系统B组优于系统A组。
实施例9与其他已有系统相比，系统B对位于Xi上的CDKL5基因调控质粒的构建与抽提
对照组使用的Tet-dCas9组，包含两部分组分。组分一：关键片段为dCas9全长蛋白，HA标签蛋白，入核信号肽SV40，C端连接Tet1CD元件。
dCas9序列为：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGA
LLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHR
LEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKAD
LRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPI
NASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNF
KSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAIL
LSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFF
DQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQ
RTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGP
LARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLP
NEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLL
FKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKD
KDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKR
RRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLT
FKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMG
RHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVE
NTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDS
IDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDN
LTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDK
LIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALI
KKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFK
TEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKK
TEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVV
AKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIK
LPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLK
GSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNK
HRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD；(SEQ ID NO.8)
HA序列为：YPYDVPDYA；
SV40：PKKKRKV；
Tet1CD序列为:
ELPTCSCLDRVIQKDKGPYYTHLGAGPSVAAVREIMENRYGQKGNAIRI
EIVVYTGKEGKSSHGCPIAKWVLRRSSDEEKVLCLVRQRTGHHCPTAV
MVVLIMVWDGIPLPMADRLYTELTENLKSYNGHPTDRRCTLNENRTCT
CQGIDPETCGASFSFGCSWSMYFNGCKFGRSPSPRRFRIDPSSPLHEKNL
EDNLQSLATRLAPIYKQYAPVAYQNQVEYENVARECRLGSKEGRPFSG
VTACLDFCAHPHRDIHNMNNGSTVVCTLTREDNRSLGVIPQDEQLHVLP
LYKLSDTDEFGSKEGMEAKIKSGAIEVLAPRRKKRTCFTQPVPRSGKKR
AAMMTEVLAHKIRAVEKKPIPRIKRKNNSTTTNNSKPSSLPTLGSNTETV
QPEVKSETEPHFILKSSDNTKTYSLMPSAPHPVKEASPGFSWSPKTASAT
PAPLKNDATASCGFSERSSTPHCTMPSGRLSGANAAAADGPGISQLGEV
APLPTLSAPVMEPLINSEPSTGVTEPLTPHQPNHQPSFLTSPQDLASSPME
EDEQHSEADEPPSDEPLSDDPLSPAEEKLPHIDEYWSDSEHIFLDANIGGV
AIAPAHGSVLIECARRELHATTPVEHPNRNHPTRLSLVFYQHKNLNKPQ
HGFELNKIKFEAKEAKNKKMKASEQKDQAANEGPEQSSEVNELNQIPSHKALTLTHDNVVTVSPYALTHVAGPYNHWV(SEQ ID NO.9)
组分二：靶向位于X染色体的CDKL5基因的sgRNA-6序列，如实施例2所示。
对照组使用的Tet-dCas9+P65-HSF1组,包含两部分组分。组分一和组分二和Tet-dCas9组一致；组分三为搭配的的激活元件MS2-P65-HSF1，如实施例2所示。
对照组使用的SAM(dCas9组)系统如实施例5所示。
本实施例使用的系统B如实施例5所示。所用细胞系和具体实施步骤按照实施例5所示。
结果如图9所示：系统B明显地上调了CDKL5总拷贝数，上调倍数远高于其他对照组；且其CDKL5 V620X截短型拷贝数相较其他对照组，上调变化最小，最接近空白组对照。Tet-dCas9为现今常用于激活异染色质区的基因，而系统B的效率远优于Tet-dCas9组及其改良组。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种核酸构建物组合，其特征在于，包括第一核酸构建物和第二核酸构建物，其中，所述第一核酸构建物具有从5’-3’的式I结构：
P1-Z1-Z2-Z5-Y3-Z3-Z4(I)；
其中，P1为第一启动子序列；
Z1为任选的入核信号肽的编码序列；
Z2为任选的第一标签序列；
Y3为任选的转录激活因子的编码序列；
Z3为Cas蛋白的N端片段的编码序列；
Z4为任选的第一柔性短肽序列；
Z5为任选的靶向元件的编码序列；
所述第二核酸构建物具有从5’-3’的式II结构：
P2-Y1-Y2-Z1-Y3-Z5-Z1-Y4(II)；
其中，P2为第二启动子序列；
Y1为任选的第二柔性短肽序列；
Y2为Cas蛋白的C端片段的编码序列；
Z1为任选的入核信号肽的编码序列；
Y3为转录激活因子编码序列；
Z5为任选的靶向元件的编码序列；
Z1为任选的入核信号肽的编码序列；
Y4为任选的第二标签序列；
并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。
2.如权利要求1所述的核酸构建物组合，其特征在于，所述入核信号肽包括SV40。
3.如权利要求1所述的核酸构建物组合，其特征在于，所述核酸构建物组合还包括第三核酸构建物，具有从5’-3’的式V结构：
D-Y3(IV)；
其中，D为连接元件的编码序列；
Y3为转录激活因子编码序列；
并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。
4.如权利要求1所述的核酸构建物组合，其特征在于，所述Y3选自下组：VP64、P65、HSF1、RTA、或其组合。
5.如权利要求1所述的核酸构建物组合，其特征在于，所述转录激活因子选自下组：VP64、P65、HSF1、RTA、或其组合。
6.如权利要求1所述的核酸构建物组合，其特征在于，所述靶向元件选自下组：HP1α、SATB1、SHARP、或其组合。
7.一种载体组合，其特征在于，包括第一载体和第二载体，所述第一载体含有第一核酸构建物，所述第二载体含有所述第二核酸构建物，所述的第一核酸构建物和第二核酸构建物如权利要求1中所定义。
8.一种基因工程细胞，其特征在于，所述细胞被权利要求1所述的构建物所转化；或被权利要求7所述的载体组合所转化或转染。
9.一种调控特异性染色质上基因的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供一细胞以及第一载体和第二载体，其中所述第一载体含有第一核酸构建物，所述第二载体含有所述第二核酸构建物，所述的第一核酸构建物和第二核酸构建物如权利要求1中所定义；
(ii)用所述的载体感染所述的细胞，从而调控特异性染色质上基因。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的第一载体；和
(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的第二载体。
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