JP2022504640A - 免疫検出および自己免疫を回避する細胞、島、およびオルガノイド、ならびにそれらの産生および使用の方法 - Google Patents

免疫検出および自己免疫を回避する細胞、島、およびオルガノイド、ならびにそれらの産生および使用の方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2022504640000001
本発明は、細胞、島様細胞、膵島、および膵臓オルガノイド（例えばヒト島様オルガノイドまたはHILO）と、インビボで持続可能である細胞およびオルガノイドならびに免疫検出、拒絶、および自己免疫を回避する細胞およびオルガノイド、例えば膵島および膵臓オルガノイドの迅速で信頼のおける生成に有用な細胞培養物ならびに方法とを特徴とする。本発明は、該細胞、島様細胞、膵島、および膵臓オルガノイド（例えばHILO）を使って膵臓疾患、例えば2型糖尿病および膵がんを処置する方法も特徴とし、該細胞、島様細胞、膵島、および膵臓オルガノイド（例えばHILO）は、それらに対して本来であれば反応する免疫細胞の活性をモジュレートするように設計されている。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2019年1月22日に出願された米国特許仮出願第62/795,284号および2018年10月12日に出願された米国特許仮出願第62/745,086号に基づく優先権と、その恩典を主張する。これら米国特許仮特許出願の全内容は参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
連邦政府支援の研究において行われた発明に対する権利の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって交付された助成金番号DK057978、DK090962、HL088093、HL105278、およびES010337、ならびに米国国立衛生研究所および米国国立癌研究所によって交付された助成金番号P30 014195の下に、政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明にある特定の権利を有する。
背景
1型糖尿病および後期2型糖尿病などのインスリン依存性糖尿病の処置では、ヒト島の不足により、この治療の恩恵を受けることができる患者の数が限られている。ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）のβ様細胞へのインビトロ分化の分野は進歩しているにもかかわらず、この方法で生成されるβ様細胞は、通例、グルコース刺激インスリン分泌（glucose-stimulated insulin secretion:GSIS）とミトコンドリア代謝機能の欠陥を呈し、また投与後にレシピエントの免疫系によって検出されて破壊される。したがって、膵島の生理機能を完全に獲得し、機能的で耐久性があるオルガノイドの生成を達成するには、成熟化プロセスのさらなる改良が必要である。
当技術分野において求められているのは、疾患を処置するための移植に耐えて生残する機能的ヒト臓器を生成させるための方法、ならびに臓器不全を持つ患者に新しい処置戦略および新しい治療法を提供するための薬物スクリーニングおよび疾患モデリングのための新しいプラットホームである。
記載する態様の概要
対象への投与または移植もしくは埋植の後に生残しかつ免疫系（自己免疫）による検出を回避する、免疫保護された細胞、島、オルガノイド、または島様オルガノイド、例えば限定するわけではないが、ヒト膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイド、特にヒト島様オルガノイド（本明細書では「HILO」と略記する）を生成させるための組成物および方法が提供される。ある態様において、細胞、島、オルガノイド、島様オルガノイド（およびその中の細胞）はインターフェロンγ（IFNγ）受容体を発現する。ある態様において、細胞、島、オルガノイド、または島様オルガノイド（およびその中の細胞）は、ヒトのものである。
ある局面では、移植されたドナー細胞の生残を向上させるかまたは移植されたドナー細胞の細胞死を低減する方法が提供され、該方法は、ドナー細胞を所与の期間、例えば少なくとも24時間の期間の間に、複数回の間欠的ばく露で、インターフェロンγ（IFNγ）に接触させ、それによって、移植されたドナー細胞の生残を向上させる工程を含む。ある態様において、移植されるドナー細胞は、オルガノイド細胞、島細胞、島様オルガノイド細胞、またはβ様島細胞である。ある態様において、移植されるドナー細胞は、移植を受ける対象にとって同系である。ある態様において、移植されるドナー細胞は、移植を受ける対象にとって自家である。ある態様において、移植されるドナー細胞は、移植を受ける対象にとって同種異系または異種である。ある態様において、移植されるドナー細胞はインターフェロンγ（IFNγ）受容体発現細胞である。ある態様において、移植されるドナー細胞はヒト細胞である。
別の局面では、T細胞またはB細胞などの免疫系細胞による検出に耐えて生残する、免疫保護された細胞、島、またはオルガノイドを生成させる方法が提供され、該方法は、インターフェロンγ（IFNγ）受容体を発現する細胞、島、またはオルガノイドもしくはそれらの細胞を、所与の期間、例えば少なくとも24時間の期間の間に、IFNγへの複数回の間欠的ばく露に供し、それによって、細胞、島、またはオルガノイドによる免疫チェックポイントタンパク質の発現を誘導し、かつ免疫検出または自己免疫に耐えて該細胞、島、またはオルガノイドが生残することを可能にする工程を含む。
ある局面において、ヒト島様オルガノイド（HILO）およびHILOを構成する細胞、すなわちベータ（β）様細胞は、対象に導入された、例えば移植または埋植された、「非自己」細胞またはHILOの免疫拒絶または自己免疫を克服するために、免疫応答または自己免疫のモジュレーションに関与する1種類または複数種類の分子、例えば免疫チェックポイントタンパク質を発現するように、またはIFNγへのばく露後にそれらの分子を発現するように誘導される。ある態様において、免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。ある態様において、HILOが導入され、移植されまたは埋植される対象は、糖尿病を有する。ある態様において、HILOが導入され、移植されまたは埋植される対象は、1型糖尿病、2型糖尿病、または後期2型糖尿病を有する。ある態様において、HILOが導入され、移植されまたは埋植される対象は、1型糖尿病を有する。ある態様において、HILOが導入され、移植または埋植される対象は、ヒト対象またはヒト患者である。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質は、導入、移植、または埋植される細胞またはHILOにおいて、組換えにより発現される。「移植物」および「埋植物」という用語は、本明細書では、対象における機能、特に疾患、障害または病態を処置するための治療機能を達成しまたは提供するために、医学技術分野において実践されている手法によって対象に導入または移入される細胞、島、またはオルガノイド（およびその中の細胞）を指すために、相互可換的に使用されうる。
一局面では、膵島オルガノイドを生成させる方法が提供され、該方法は、誘導多能性幹細胞（iPSC）由来のベータ（β）様細胞が、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で培養され、それによって、1種類または複数種類のチェックポイントタンパク質を膵島オルガノイド細胞が発現する膵島オルガノイドを生成させる工程を含む。ジェランガムを含有する三次元マトリックス中の、1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現するiPSC由来のβ様細胞を含む、細胞培養物も提供される。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。
ある局面では、ジェランガムを含有する三次元マトリックス中の、ヒトiPSC由来のβ様細胞、ヒト脂肪由来幹細胞（human adipose-derived stem cell:hADSC）およびヒト臍帯静脈内皮細胞（human umbilical vein endothelial cell:HUVEC）を含む細胞培養物が提供され、培養物の細胞が、1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現する。
本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、細胞培養物は脂肪由来幹細胞および/または内皮細胞を含む。
ある局面では、1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現するiPSC由来のβ様細胞を含有する膵島様オルガノイドが提供され、オルガノイドは血管新生化されかつグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を呈し、オルガノイドの細胞およびオルガノイドが、1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現する。ある態様において、膵島様オルガノイドはヒト膵島様オルガノイドである。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。
ある局面では、iPSC由来のベータ（β）様細胞、iPSC由来のアルファ（α）細胞、iPSC由来のデルタ（δ）細胞、iPSC由来の導管細胞、脂肪由来幹細胞（hADSC）および内皮細胞を含有する膵島オルガノイドが提供されiPSC細胞は1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現し、オルガノイドは血管新生化され、かつグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、およびグルカゴン分泌を呈する。
ある関連局面では、本明細書に記載される任意の局面のオルガノイドを移植または埋植されたヒト以外の生物が提供される。
ある局面では、膵島オルガノイドまたはHILOが対象に導入または移植または埋植される、対象における膵臓疾患を処置する方法が提供され、膵島オルガノイドまたはHILOは、免疫検出を回避するために1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現するiPSC由来のβ様細胞を含有し、膵島オルガノイドまたはHILOは血管新生化されかつグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を呈する。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。ある態様において、対象はヒトであり、膵島オルガノイドまたはHILOはヒト組織またはヒト細胞から生成される。
ある局面では、膵島オルガノイドまたはHILOが対象に導入、移植、または埋植される、対象における1型糖尿病を処置する方法が提供され、膵島オルガノイドまたはHILOは、免疫検出を回避するために1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現するiPSC由来のβ様細胞を含有し、膵島オルガノイドまたはHILOは血管新生化されかつグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を呈する。ある態様において、膵島オルガノイドまたはHILOは、免疫検出を回避するためにチェックポイントタンパク質を発現する。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。ある態様において、対象はヒトであり、膵島オルガノイドまたはHILOはヒト組織またはヒト細胞から生成される。
ある局面では、膵島オルガノイドまたはHILOが提供され、膵島オルガノイドまたはHILOは、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で誘導多能性幹細胞（iPSC）由来のβ様細胞を培養することによって生成される。ある態様において、膵島オルガノイドまたはHILOは、免疫検出を回避するために1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現する。ある態様において、対象はヒトであり、膵島オルガノイドまたはHILOはヒト組織またはヒト細胞から生成される。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。
別の局面では、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で誘導多能性幹細胞（iPSC）由来のβ様細胞およびiPSC由来の外分泌成分細胞を培養することによって生成される膵臓オルガノイドまたはHILOが提供される。ある態様において、膵島オルガノイドまたはHILOは、免疫検出を回避するために1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現する。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。ある態様において、対象はヒトであり、膵島オルガノイドまたはHILOはヒト組織またはヒト細胞から生成される。
別の局面では、培養培地、例えばジェランガムと膵臓オルガノイドまたはHILOの細胞（β細胞）におけるチェックポイントタンパク質の発現および産生を刺激する作用物質とを含有する3次元マトリックス中で、誘導多能性幹細胞（iPSC）由来のβ様細胞およびiPSC由来の外分泌成分細胞を培養することによって生成される、膵臓オルガノイドまたはHILOが提供される。理論に束縛されることは望まないが、PD-L1は、β細胞またはHILOにおいて、転写記憶の機序によって産生される。ある態様において、培養培地または培養マトリックスはインターフェロンγ（IFNγ）を含む。ある態様において、膵島オルガノイドまたはHILOは、免疫検出を回避するために1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現する。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。ある態様において、対象はヒトであり、膵島オルガノイドまたはHILOはヒト組織またはヒト細胞から生成される。
別の局面において、本発明は、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で誘導多能性幹細胞（iPSC）由来の肝細胞を培養することによって生成される肝臓オルガノイドを提供し、肝臓オルガノイドが免疫検出を回避するように、iPSC由来の肝細胞が1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現する。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。
別の局面において、本発明は、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で誘導多能性幹細胞（iPSC）由来の心筋細胞を培養することによって生成される心臓オルガノイドを提供し、心臓オルガノイドが免疫検出を回避するように、iPSC由来の心筋細胞が1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現する。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。
別の局面において、本発明は、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で誘導多能性幹細胞（iPSC）由来の腸細胞を培養することによって生成される腸オルガノイドを提供し、腸オルガノイドが免疫検出を回避するように、iPSC由来の腸細胞が1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現する。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。
本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、本方法は、1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現するiPSC由来のβ様細胞を、脂肪由来幹細胞および/または内皮細胞と共に培養する工程を含む。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、本方法は、1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現するiPSC由来のβ様細胞を、iPSC由来のα様細胞、iPSC由来のδ様細胞、および/またはiPSC由来の導管様細胞と共に培養する工程を含む。
本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、膵島オルガノイドは、iPSC由来のα様細胞、iPSC由来のδ様細胞および/またはiPSC由来の導管様細胞を含有する。本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、本方法は、1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現するiPSC由来のβ様細胞を、iPSC由来のα様細胞、iPSC由来のδ様細胞、および／またはiPSC由来の導管様細胞と培養する工程を含む。
本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、膵島オルガノイドは、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、c-ペプチド発現および/またはグルカゴン分泌を呈する。本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、膵島オルガノイドは、β細胞転写因子Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6、およびFoxa2のうちの1つまたは複数を発現する。ある特定の態様において、膵島オルガノイドは、1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現するiPSC由来のβ様細胞、iPSC由来のα細胞、iPSC由来のδ細胞、iPSC由来の導管細胞、脂肪由来幹細胞（hADSC）および内皮細胞を含有し、オルガノイドは血管新生化され、かつグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、およびグルカゴン分泌を呈する。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、膵島オルガノイドはiPSC由来の外分泌成分に取り囲まれている。さまざまな態様において、iPSC由来の外分泌成分は、マーカーPDX1、Nkx6-1、およびPtf1のうちの1つまたは複数を発現する。
本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、肝臓オルガノイドは、マーカーAFP、ALB、およびCyp3a7のうちの1つまたは複数を発現する。本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、肝臓オルガノイドは、インスリンシグナリング、パルミチン酸によるインスリン抵抗性、および脂質蓄積を呈する。
本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、心臓オルガノイドは、マーカーhMlc2a、hNkx2-5、αMHC、およびKCNQ1のうちの1つまたは複数を発現する。本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、心臓オルガノイドは心拍動を呈する。
本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、腸オルガノイドは、マーカーCDX2、Muc2、およびLgr5のうちの1つまたは複数を発現する。本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、腸オルガノイドはR-スポンジンに応答して出芽を呈する。
本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、iPSC由来のβ様細胞、iPSC由来のα様細胞、iPSC由来のδ様細胞および/またはiPSC由来の導管様細胞は、ヒト細胞である。本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、iPSC由来のβ様細胞、iPSC由来の外分泌成分細胞、iPSC由来の肝細胞、iPSC由来の心筋細胞またはiPSC由来の腸細胞は、ヒト細胞である。さまざまな態様において、脂肪由来幹細胞はヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）である。本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、内皮細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）である。さまざまな態様において、オルガノイドはヒト細胞から生成される。
本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドは、脂肪由来幹細胞および/または内皮細胞を含有する。本明細書に記載される任意の局面のさまざまな態様において、膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドは、血管新生化される。
別の局面において、本発明は、膵島オルガノイドまたはHILOを生成させる方法を提供し、該方法は、Wnt4タンパク質またはWnt5aタンパク質を含む培地中で、1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現する誘導多能性幹細胞（iPSC）由来のβ様細胞を培養する工程を含む。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。ある態様において、誘導多能性幹細胞（iPSC）由来のβ様細胞は、3次元マトリックス中で培養される。前述した局面の一態様において、Wnt4タンパク質またはWnt5aタンパク質は、組換えヒトWnt4またはWnt5aタンパク質である。特定の態様において、培地は組換えヒトWnt4タンパク質を含む。別の特定の態様において、培地は組換えヒトWnt5aタンパク質を含む。特定の態様において、Wnt4誘導またはWnt5誘導ヒト島オルガノイドまたはHILOは、成熟した島または成熟したHILOである。
別の局面において、本発明は、1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現するヒトiPSC由来のβ様細胞とWnt4タンパク質またはWnt5aタンパク質とを含む細胞培養物を提供する。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。ある態様において、ヒトiPSC由来のβ様細胞は、ジェランガムを含む三次元マトリックス中に存在する。ある態様において、Wnt4タンパク質またはWnt5aタンパク質は、組換えヒトWnt4またはWnt5aタンパク質である。特定の態様において、培地は組換えヒトWnt4タンパク質を含む。別の特定の態様において、培地は組換えヒトWnt5aタンパク質を含む。特定の態様において、Wnt4誘導またはWnt5誘導ヒト島オルガノイドまたはHILOは、成熟した島または成熟したHILOである。
別の局面において、本発明は、Wnt4タンパク質またはWnt5aタンパク質を含む培地中で培養された、1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現するiPSC由来のβ様細胞を含む膵島オルガノイドを提供し、オルガノイドは血管新生化されかつグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を呈する。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。ある態様において、オルガノイドはKCl刺激インスリン分泌またはグルコース刺激インスリン分泌をさらに呈する。ある態様において、膵島オルガノイドはFltpおよびEsrrg遺伝子を発現する。ある態様において、Wnt4タンパク質またはWnt5aタンパク質は、組換えヒトWnt4またはWnt5aタンパク質である。特定の態様において、培地は組換えヒトWnt4タンパク質を含む。別の特定の態様において、培地は組換えヒトWnt5aタンパク質を含む。特定の態様において、Wnt4誘導またはWnt5誘導ヒト島オルガノイドまたはHILOは、成熟した島または成熟したHILOである。
別の局面において、本発明は、上述の局面で規定されたオルガノイドを移植または埋植されたヒト以外の生物を提供する。
別の局面において、本発明は、免疫監視機構および免疫拒絶を回避する誘導多能性幹細胞（iPSC）由来のオルガノイドを生成させるための脂肪由来幹細胞（ADSC）の自己組織化を強化する方法を提供し、該方法は、Wnt5aタンパク質を含む3次元（3D）培養マトリックス培地中でADSCを培養する工程を含む。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。本方法のある態様において、ADSCは、ジェランガムを含む3D培養マトリックス中で培養される。ある態様では、Wnt5タンパク質と、1種類または複数種類の免疫チェックポイント阻害タンパク質を発現するiPSC由来のβ様細胞、iPSC由来の外分泌成分細胞、iPSC由来の肝細胞、iPSC由来の心筋細胞またはiPSC由来の腸細胞より選択されるiPSC由来の細胞とを含む3D培養マトリックス培地中で、ADSCが培養される。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。本方法のある態様において、iPSC由来のオルガノイドは、膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドより選択される。本方法のある態様において、誘導多能性幹細胞（iPSC）由来のオルガノイドはヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）由来のオルガノイドである。本方法のある態様において、Wnt5aタンパク質は組換えヒトWnt5aタンパク質である。本方法のある態様において、膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドは、それぞれ、iPSC由来のβ様細胞、iPSC由来の外分泌成分細胞、iPSC由来の肝細胞、iPSC由来の心筋細胞、またはiPSC由来の腸細胞より選択されるiPSC由来の細胞に由来する。上記のうちのいずれかのある態様において、iPSC由来の細胞はヒト細胞である。
別の局面において、本発明は、免疫拒絶または自己免疫を回避する膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドを生成させるための脂肪由来幹細胞（ADSC）の自己組織化を強化する方法を提供し、該方法は、Wnt5aタンパク質を含む培地中で1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現するADSCを培養する工程を含む。ある態様において、前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1である。ある態様において、ADSCはジェランガムを含む3次元マトリックス中で培養される。別の態様において、Wnt5aタンパク質は組換えヒトWnt5aタンパク質である。
別の局面において、本発明は、上述の方法およびそれらの態様のいずれかによって産生される膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドを提供する。
前述した態様のさまざまな局面において、免疫チェックポイントタンパク質、または1種類もしくは複数種類の免疫チェックポイントタンパク質、またはコグネイトリガンドに結合する免疫チェックポイントタンパク質のフラグメントもしくは一部分は、T細胞応答（同種異系免疫応答または自己免疫応答）を抑制または遮断し、よってレシピエントにおける免疫系の監視機構および拒絶が回避されるように、1種類または複数種類のチェックポイントタンパク質を、自己免疫に関与する免疫細胞上の、または外来細胞もしくは「非自己」細胞に反応する免疫細胞上の、例えばT細胞上の、コグネイトリガンドに結合する膜表面タンパク質として発現させるオルガノイドの細胞（例えばHILOを構成するβ様細胞）において組換えにより発現されるか、前記オルガノイドの細胞に分子的に導入される。
複数の態様において、オルガノイドの細胞（例えばHILOを構成するβ様細胞）は、1種類もしくは複数種類のチェックポイントタンパク質、または免疫細胞の表面にあるコグネイトリガンドに結合することでその細胞およびオルガノイドに対する同種異系免疫活性または自己免疫を抑制する分子を発現する。特定の態様において、オルガノイドの細胞（例えばβ様細胞）およびオルガノイド（例えばHILO）は、免疫チェックポイントタンパク質PD-L1、すなわち例えばT細胞上に発現するPD-1（プログラム細胞死タンパク質1）に結合するプログラム細胞死リガンド1を発現する。PD-L2（プログラム細胞死リガンド2）もPD-1に結合するが、そのKdは異なる。他の態様では、オルガノイドの細胞（例えばβ様細胞）およびオルガノイド（例えばHILO）は、T細胞（例えばエフェクターT細胞）などの免疫細胞の表面に発現するチェックポイントタンパク質に結合する分子を発現するように分子的に改変され、ここで、免疫細胞の表面に発現するチェックポイントタンパク質は、CTLA-4（細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4、CD152とも呼ばれる）;LAG-3、リンパ球活性化遺伝子3タンパク質;KIR、キラー細胞免疫グロブリン様受容体;IDO1、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1;4-1BB、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（CD137としても公知）;GITR、「グルココルチコイド誘導性TNFRファミリー関連遺伝子（glucocorticoid-induced TNFR family related gene）;TIM-3、「T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain）」;OX40、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（CD134としても公知）;A2AR、アデノシンA2A受容体;B7-H3（CD276とも呼ばれている）;B7-H4（VTCN1とも呼ばれている）;B7-1/B7-2;BTLA（CD272とも呼ばれている）;VISTA、「T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー（V-domain Ig suppressor of T cell activation）」;または前述のうちのいずれかの組合せである。
前述した態様のいずれかのある局面において、免疫チェックポイントタンパク質は、チェックポイントタンパク質（本明細書では「チェックポイント分子」ともいう）のすべてまたは一部分、例えば細胞外ドメインを含む。特定の態様において、免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1またはその結合部分である。ある態様において、チェックポイントタンパク質はPD-L1タンパク質の細胞外ドメインである。
別の局面は、T細胞などの免疫細胞上のコグネイトリガンドに結合する1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現するように分子的に改変された、ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）、ヒトベータ（β）細胞、またはそれから生成されるヒト島様オルガノイド（HILO）を提供する。ある態様において、hiPSC、ヒトベータ（β）細胞、またはヒト島様オルガノイド（HILO）によって発現される前記1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質は、免疫細胞で発現するコグネイトリガンドに結合し、該コグネイトリガンドは、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）;細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4（CTLA-4）;リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3）;キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）;インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（4-1BB）;グルココルチコイド誘導性TNFRファミリー関連遺伝子（GITR）;T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン（TIM-3）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（OX40）;アデノシンA2A受容体（A2AR）;B7-H3;B7-H4;B7-1/B7-2;BTLA;T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー（VISTA）;または前述のうちのいずれかの組合せより選択される。特定の態様において、hiPSC、ヒトベータ（β）細胞またはHILOは、PD-1に結合する免疫チェックポイントタンパク質であるプログラム細胞死タンパク質リガンド1（PD-L1）を発現する。
別の局面では、移植、埋植、または移入の後に生残しかつ細胞死が低減している、細胞、島、オルガノイドを生成させる方法が提供され、該方法は、（a）インターフェロンγ（IFNγ）受容体を発現する細胞、島、またはオルガノイドを、インターフェロンγ（IFNγ）と、予め決められた時点において少なくとも0.5時間または少なくとも1時間接触させる工程、および（b）72時間または約72時間の期間中に、工程（a）を少なくとも約2回繰り返す工程を含み、IFNγとの接触時間同士の間は細胞、島、またはオルガノイドがIFNγの非存在下で維持され、かつ工程（a）および工程（b）によって、細胞、島、またはオルガノイドにおけるPD-L1の持続的発現が誘導される。本方法のある態様では、細胞、島、オルガノイド、または細胞を、工程（a）において、少なくとも約0.5時間もしくは少なくとも0.5時間、少なくとも約1時間もしくは少なくとも1時間、少なくとも約2時間もしくは少なくとも2時間、または約2時間超もしくは2時間超より選択される期間にわたって、IFNγと接触させる。本方法の別の態様では、細胞、島、またはオルガノイドを、工程（a）において、約0.5時間もしくは0.5時間、または約1時間もしくは1時間、または約2時間もしくは2時間、または約12時間もしくは12時間より選択される期間にわたって、IFNγと接触させる。本方法の別の態様では、工程（a）は、工程（b）の72時間または約72時間の期間中に少なくとも3回繰り返され、各回が少なくとも約0.5時間にわたるか、または各回が少なくとも約1時間にわたるか、または各回が少なくとも約2時間にわたる。本方法の別の態様では、工程（a）と工程（b）の間で、IFNγの存在を除去するために細胞、島、またはオルガノイドが洗浄される。本方法の別の態様において、IFNγは1～25ng/mlの量で使用される。本方法の別の態様において、IFNγは10ng/mlの量で使用される。本方法の別の態様では、細胞、島、またはオルガノイドにおけるPD-L1発現が、工程（b）後に、7日超または約7日超の期間にわたって維持される。ある態様において、PD-L1の持続的発現は、細胞における3日もしくは約3日、4日もしくは約4日、5日もしくは約5日、6日もしくは約6日、7日もしくは約7日、8日もしくは約8日、9日もしくは約9日、10日もしくは約10日、11日もしくは約11日、12日もしくは約12日、13日もしくは約13日、14日もしくは約14日、またはそれ以上にわたるPD-L1発現を含む。
別の局面では、移植、埋植、または移入の後に生残しかつ細胞死が低減している島またはオルガノイドおよびそれらの細胞を生成させる方法が提供され、該方法は、（a）インターフェロンγ（IFNγ）受容体を発現する島またはオルガノイドおよびそれらの細胞を、所与の期間中、例えば24時間または約24時間の期間中の第1の時点において1時間超にわたって、約1ng/ml～25ng/mlの量のインターフェロンγ（IFNγ）と接触させる工程、ならびに（b）島またはオルガノイドおよびそれらの細胞を、工程（a）後の後続する期間中、例えば48時間の期間中の2つまたはそれ以上の追加の時点において、約0.5～1時間超またはそれ以上にわたって、1ng/ml～25ng/mlの量のIFNγと接触させる工程を含み、IFNγと接触させること同士の間は島またはオルガノイドを洗浄してIFNγの非存在下の培地中で休止させ、かつ工程（a）および工程（b）によって、島またはオルガノイドにおけるPD-L1の持続的発現が誘導される。本方法のある態様では、工程（a）および工程（b）において、島またはオルガノイドを、10ng/mlの量のIFNγと、少なくとも2時間にわたって接触させる。本方法の別の態様では、島またはオルガノイドを、72時間の期間中の3つの時点において少なくとも約2時間にわたって、IFNγと接触させる。
上記の方法のうちのいずれかのある態様において、細胞、島、またはオルガノイドはヒトの細胞、島、またはオルガノイドである。上記方法の別の態様において、オルガノイドはHILOまたはヒトHILOである。上記方法の別の態様において、島は、免疫系による破壊またはクリアランスから保護されたヒト死体島である。
別の局面では、免疫検出または自己免疫を回避するヒトの細胞、島、またはヒト島様オルガノイド（HILO）を生成させる方法が提供され、該方法は、（a）ヒトの細胞、島、またはHILOを、予め決められた時点において1時間超にわたって、インターフェロンγ（IFNγ）と接触させる工程;所与の期間中、例えば72時間の期間中に、工程（a）を少なくとも2回繰り返す工程を含み、IFNγとの接触時間同士の間はヒトの細胞、島、またはHILOがIFNγの非存在下で維持され、かつ工程（a）および工程（b）によって、ヒト島またはHILOにおけるPD-L1の持続的発現が誘導される。本方法のある態様では、工程（a）において、ヒトの細胞、島、またはHILOをIFNγと2時間またはそれ以上接触させる。本方法の別の態様では、工程（a）において、ヒトの細胞、島、またはHILOをIFNγと2時間または12時間接触させる。本方法の別の態様では、工程（a）は、所与の期間、すなわち72時間の期間中に3回繰り返され、各回が少なくとも2時間にわたる。本方法の別の態様では、工程（a）と工程（b）の間で、IFNγを除去するためにヒトの細胞、島、またはHILOが洗浄される。本方法の別の態様において、IFNγは1～25ng/mlの量で使用される。本方法の別の態様において、IFNγは10ng/mlの量で使用される。本方法の別の態様では、島またはHILOにおけるPD-L1発現が、工程（b）後に、7日超にわたって維持または持続される。
別の局面では、免疫検出または自己免疫を回避するヒトの細胞、島、またはヒト島様オルガノイド（HILO）を生成させる方法が提供され、該方法は、（a）ヒトの細胞、島、またはHILOを、所与の期間中、例えば24時間の期間中の第1の時点において1時間超にわたって、約1ng/ml～25ng/mlの量のインターフェロンγ（IFNγ）と接触させる工程、および（b）ヒトの細胞、島、またはHILOを、工程（a）後の後続する所与の期間中、例えば48時間の期間中の少なくとも2つの追加の時点において1時間超にわたって、約1ng/ml～25ng/mlの量のIFNγと接触させる工程を含み、IFNγと接触させること同士の間はヒトの細胞、島、またはHILOを洗浄してIFNγの非存在下の培地中で休止させ、かつ工程（a）および工程（b）によって、ヒト島またはHILOにおけるPD-L1の持続的発現が誘導される。本方法のある態様では、工程（a）および工程（b）において、ヒト島またはHILOを、10ng/mlの量のインターフェロンγ（IFNγ）と、少なくとも2時間にわたって接触させる。本方法の別の態様では、ヒト島またはHILOを、所与の期間中、例えば72時間の期間中の3つの異なる間隔（時点）で少なくとも2時間にわたって、インターフェロンγ（IFNγ）と接触させる。前述した局面の方法のある態様において、ヒト島またはHILOは成熟したヒト島またはHILOである。ある態様において、PD-L1の持続的発現は、細胞における3日もしくは約3日、4日もしくは約4日、5日もしくは約5日、6日もしくは約6日、7日もしくは約7日、8日もしくは約8日、9日もしくは約9日、10日もしくは約10日、11日もしくは約11日、12日もしくは約12日、13日もしくは約13日、14日もしくは約14日、またはそれ以上にわたるPD-L1発現を含む。本方法の態様において、細胞は、心臓細胞、結腸細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、肝臓細胞（肝細胞）、食道細胞、胃腸細胞、胃部（胃）細胞、肺細胞、卵巣細胞、子宮頸部細胞、子宮細胞、精巣細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、網膜細胞、角膜細胞、脳細胞、筋細胞、造血細胞、免疫細胞（B細胞、T細胞）、キメラ抗原受容体-T細胞（CAR-T細胞）、骨髄細胞、単核球、ニューロン、神経細胞、ヒト皮膚細胞に由来するインスリン産生膵臓β細胞、臍帯血（UCB）細胞、脂肪由来間葉系間質（幹）細胞、心臓幹細胞、結腸幹細胞、腎臓幹細胞、肝臓（肝細胞）幹細胞、胃腸幹細胞、胃部幹細胞、肺幹細胞、膵臓幹細胞、膵臓β幹細胞、筋幹細胞、造血幹細胞、免疫細胞（T細胞またはB細胞）幹細胞、骨髄幹細胞、CD133＋幹細胞、CD34＋造血細胞、CD34＋造血幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、網膜幹細胞、神経幹細胞、外胚葉由来の神経細胞、不死化ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞、および該細胞から生成されるまたは該細胞を含有するオルガノイドを含む。本方法のある態様において、オルガノイドは、心臓オルガノイド、腸/胃腸オルガノイド、結腸オルガノイド、肝オルガノイド、腎臓オルガノイド、膀胱オルガノイド、卵巣オルガノイド、子宮頸部オルガノイド、神経オルガノイド、または肺臓（肺）オルガノイドを含む。
上述の局面のうちのいずれかの方法のある態様では、インターフェロンγ（IFNγ）受容体を発現する細胞、島、またはオルガノイドを、培養培地もしくは生理的に許容される溶液中または三次元マトリックス中で、IFNγと接触させる。ある態様では、インターフェロンγ（IFNγ）受容体を発現する細胞、島、またはオルガノイドを、本明細書に記載するように、三次元（3D）マトリックス中、例えばジェランガム中で、IFNγと接触させる。
別の局面では、免疫検出または自己免疫を回避する島様オルガノイドを生成させる方法が提供され、該方法は、Wnt4タンパク質またはWnt5aタンパク質を含む三次元マトリックス中で、多細胞島様オルガノイドを生成させるのに十分な時間、内分泌前駆細胞を培養する工程であって、多細胞島様オルガノイドが、ベータ（β）細胞、アルファ（α）細胞、デルタ（δ）細胞、イプシロン（ε）細胞、および導管様細胞より選択される2つまたはそれ以上の細胞タイプを含み、島様オルガノイドがグルコースに応答してインスリンを分泌する、工程、ならびに、島様オルガノイドを、所与の期間、例えば少なくとも24時間の期間の間に、インターフェロンγ（IFNγ）への複数回の間欠的ばく露に供し、それによって、島様オルガノイドによる免疫チェックポイントタンパク質の持続的発現を誘導し、かつ免疫検出または自己免疫を島様オルガノイドが回避することを可能にする工程を含む。本方法のある態様において、島様オルガノイドは、少なくとも2日間の間に少なくとも2回、IFNγにばく露される。本方法の別の態様では、島様オルガノイドは、3日間の間に少なくとも3回、IFNγにばく露される。本方法の別の態様では、島様オルガノイドは、2日間の間に少なくとも2回、1時間超にわたって、IFNγにばく露される。本方法の別の態様では、島様オルガノイドは、3日間の間に少なくとも3回、1時間超にわたって、IFNγにばく露される。本方法の別の態様では、島様オルガノイドは、2日間の間に少なくとも2回、2時間にわたって、IFNγにばく露される。本方法の別の態様では、島様オルガノイドは、3日間の間に少なくとも3回、2時間にわたって、IFNγにばく露される。本方法の態様では、島様オルガノイドが、1日、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、もしくは10日間またはそれ以上の期間にわたって、IFNγに間欠的にばく露される。
別の局面では、免疫検出または自己免疫を回避する島様オルガノイドを生成させる方法が提供され、該方法は、Wnt4タンパク質またはWnt5aタンパク質を含む三次元マトリックス中で、多細胞島様オルガノイドを生成させるのに十分な時間、免疫チェックポイントタンパク質を組換えにより発現する内分泌前駆細胞を培養する工程であって、多細胞島様オルガノイドが、ベータ（β）細胞、アルファ（α）細胞、デルタ（δ）細胞、イプシロン（ε）細胞、および導管様細胞より選択される2つまたはそれ以上の細胞タイプを含み、島様オルガノイドが、グルコースに応答してインスリンを分泌し、かつ免疫検出および自己免疫を回避する、工程を含む。ある態様において、免疫チェックポイントタンパク質の組換え発現は、免疫チェックポイントタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターによる島様オルガノイド細胞の形質導入に起因する。
前述した局面の方法のある態様において、三次元マトリックスは、ヒトWnt4タンパク質、組換えヒトWnt4タンパク質、ヒトWnt5タンパク質、または組換えヒトWnt5aタンパク質を含む。特定の態様において、三次元マトリックスは組換えヒトWnt4タンパク質を含む。
免疫検出または自己免疫を回避する島様オルガノイドを生成させる前述の方法のある態様において、三次元マトリックスはジェランガムを含む。ある態様において、三次元マトリックスは組換えヒトWnt4タンパク質を含む。前述した方法の態様において、免疫チェックポイントタンパク質は、免疫細胞で発現するコグネイトリガンドに結合すし、該コグネイトリガンドは、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）;細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4（CTLA-4）;リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3）;キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）;インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（4-1BB）;グルココルチコイド誘導性TNFRファミリー関連遺伝子（GITR）;T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン（TIM-3）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（OX40）;アデノシンA2A受容体（A2AR）;B7-H3;B7-H4;B7-1/B7-2;BTLA;T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー（VISTA）;または前述のうちのいずれかの組合せより選択される。特定の態様において、免疫チェックポイントタンパク質はプログラム死リガンド-1（PD-L1）である。
前述した局面の方法のある態様において、内分泌前駆細胞は、誘導多能性幹細胞（iPSC）、胚性多能性幹細胞（ePSC）、および/または膵臓前駆細胞より選択される。
前述した局面の方法のある態様において、内分泌前駆細胞は、ニューロゲニン3、neurod1、Nkx2.2、およびPax4バイオマーカーのうちの少なくとも1つのバイオマーカーを発現する。
前述した局面の方法のある態様において、島様オルガノイドはヒト島様オルガノイド（HILO）である。特定の態様において、島様オルガノイドは血管新生化される。特定の態様において、島様オルガノイドは脂肪由来幹細胞および/または内皮細胞をさらに含む。ある態様において、脂肪由来幹細胞はヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）であり、かつ/または内皮細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）である。
前述した局面の方法のある態様において、島様オルガノイドは、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、グルカゴン分泌のうちの少なくとも1つをさらに呈する。
前述した局面の方法のある態様において、島様オルガノイドは、NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB、およびSYT4からなる群より選択されるβ細胞系列マーカーと、ARXα細胞系列マーカーとを発現する。
前述した局面の方法のある態様において、島様オルガノイドはエストロゲン関連受容体γ（ERRγ）の発現の増大を呈する。
前述した局面の方法の別の態様において、島様オルガノイドは、酸素消費速度（OCR）の増加と細胞酸性化速度（ECAR）の減少とを特徴とする増大した酸化的代謝を呈する。
前述した局面の方法のある態様において、島様オルガノイドは、膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドである。本方法の特定の態様において、島様オルガノイドはヒト膵島オルガノイドである。
別の局面では、免疫検出または自己免疫を回避するヒト島様オルガノイド（HILO）を生成させる方法が提供され、該方法は、（a）Wnt4タンパク質またはWnt5aタンパク質を含む培養培地または三次元マトリックス中で、多細胞ヒト島様オルガノイドを生成させるのに十分な時間、内分泌前駆細胞を培養する工程であって、多細胞ヒト島様オルガノイドが、ベータ（β）細胞、アルファ（α）細胞、デルタ（δ）細胞、イプシロン（ε）細胞、および導管様細胞より選択される2つまたはそれ以上の細胞タイプを含み、ヒト島様オルガノイドがグルコースに応答してインスリンを分泌する、工程;（b）工程（a）のHILOを、少なくとも48～72時間の全期間の間に2回または3回、各回1時間超にわたって、インターフェロンγ（IFNγ）と接触させる工程を含み、IFNγとの接触時間同士の間はヒト島またはHILOがIFNγの非存在下で維持され、かつ工程（a）および工程（b）によって、HILOにおける免疫チェックポイントタンパク質プログラム死リガンド-1（PD-L1）の持続的発現が誘導される。本方法のある態様では、工程（b）において、HILOを、2時間にわたってIFNγと接触させる。本方法の別の態様では、HILOを、少なくとも48時間の間に2回、各回2時間にわたって、IFNγと接触させる。本方法の別の態様では、HILOを、少なくとも72時間の間に3回、各回2時間にわたって、IFNγと接触させる。本方法の別の態様において、内分泌前駆細胞は、誘導多能性幹細胞（iPSC）、胚性多能性幹細胞（ePSC）、および/または膵臓前駆細胞より選択される。本方法の別の態様において、内分泌前駆細胞は、ニューロゲニン3、neurod1、Nkx2.2、およびPax4バイオマーカーのうちの少なくとも1つのバイオマーカーを発現する。本方法の別の態様において、HILOは、血管新生化され、かつ酸素消費速度（OCR）の増加と細胞酸性化速度（ECAR）の減少とを特徴とする増大した酸化的代謝を呈する。
前述した局面の方法のある態様において、IFNγは1～25ng/mlの量で使用される。前述した局面の方法のある態様において、IFNγは10ng/mlの量で使用される。前述した局面の方法のある態様において、島様オルガノイドまたはHILOにおけるPD-L1発現は、7日超にわたって維持される。
ある局面において、免疫チェックポイントタンパク質の持続的発現を有する、ヒト島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドは、上述した局面に記載の方法によって産生される。ある態様において、ヒト島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドは、免疫チェックポイントタンパク質PD-L1の持続的発現を呈する。
別の局面では、Wnt4タンパク質またはWnt5タンパク質を含む培養培地または三次元マトリックス中で培養された内分泌前駆細胞に由来し、かつ多系列細胞を含む、ヒト島様オルガノイド（HILO）が提供され、多系列細胞が、ベータ（β）細胞、アルファ（α）細胞、デルタ（δ）細胞、イプシロン（ε）細胞、および導管様細胞のうちの少なくとも2つを含み、HILOが、血管新生化され、グルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を呈し、かつ免疫チェックポイントタンパク質の持続的発現を呈する。ある態様において、ヒト島様オルガノイド（HILO）は膵島様オルガノイドまたは膵臓オルガノイドである。ある態様において、ヒト島様オルガノイド（HILO）はKCl刺激インスリン分泌またはグルコース刺激インスリン分泌をさらに呈する。別の態様において、ヒト島様オルガノイド（HILO）を培養するための三次元マトリックスはジェランガムを含む。別の態様において、ヒト島様オルガノイド（HILO）を培養するための三次元マトリックスは組換えヒトWnt4タンパク質を含む。ある態様において、ヒト島様オルガノイド（HILO）は、誘導多能性幹細胞（iPSC）、胚性多能性幹細胞（ePSC）、および/または膵臓前駆細胞より選択される内分泌前駆細胞に由来する。ある態様において、内分泌前駆細胞は、ニューロゲニン3、neurod1、Nkx2.2、およびPax4バイオマーカーのうちの少なくとも1つのバイオマーカーを発現する。ある態様において、ヒト島様オルガノイド（HILO）はFLTP遺伝子およびESRRγ遺伝子を発現する。ある態様において、ヒト島様オルガノイド（HILO）は、脂肪由来幹細胞および/または内皮細胞をさらに含む。特定の態様において、脂肪由来幹細胞はヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）であり、かつ/または内皮細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）である。別の態様において、ヒト島様オルガノイド（HILO）は、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、またはグルカゴン分泌をさらに呈する。別の態様において、ヒト島様オルガノイド（HILO）は、NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB、およびSYT4からなる群より選択されるβ細胞系列マーカーと、ARXα細胞系列マーカーとを発現する。別の態様において、ヒト島様オルガノイド（HILO）は、Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6、およびFoxa2からなる群より選択されるβ細胞転写因子を発現する膵臓HILOである。複数の態様において、ヒト島様オルガノイド（HILO）は、免疫細胞で発現するコグネイトリガンドに結合する免疫チェックポイントタンパク質の持続的発現を呈し、該コグネイトリガンドは、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）;細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4（CTLA-4）;リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3）;キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）;インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（4-1BB）;グルココルチコイド誘導性TNFRファミリー関連遺伝子（GITR）;T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン（TIM-3）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（OX40）;アデノシンA2A受容体（A2AR）;B7-H3;B7-H4;B7-1/B7-2;BTLA;T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー（VISTA）;または前述のうちのいずれかの組合せより選択される。ある態様では、免疫チェックポイントタンパク質がプログラム死リガンド-1（PD-L1）である、請求項40～54のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
別の局面では、上述の前記局面に記載されるヒト島様オルガノイド、膵島オルガノイド、またはHILOを移植または埋植されたヒト以外の生物が提供される。ある態様において、ヒト以外の生物は哺乳動物である。ある態様において、ヒト以外の生物はマウスである。
別の局面では、対象における膵臓疾患を処置する方法が提供され、該方法は島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドを対象に移植または埋植する工程を含み、島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドは、β細胞、α細胞、δ細胞、ε細胞、導管様細胞、またはそれらの組合せを含み内分泌前駆細胞に由来する多系列細胞を含み、血管新生化され、かつ、グルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を呈し、免疫検出または自己免疫を回避するために免疫チェックポイントタンパク質の持続的発現を呈する。
別の局面では、対象における1型糖尿病を処置する方法が提供され、該方法は、島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドを対象に移植または埋植する工程を含み、島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドは、β細胞、α細胞、δ細胞、ε細胞、導管様細胞、またはそれらの組合せを含み内分泌前駆細胞に由来する多系列細胞を含み、血管新生化され、かつ、グルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を呈し、免疫検出または自己免疫を回避するために免疫チェックポイントタンパク質の持続的発現を呈する。
上述の局面で述べた方法のある態様において、島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドは、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、またはグルカゴン分泌をさらに呈する。上述の局面で述べた方法のある態様において、島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドは、NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB、およびSYT4からなる群より選択されるβ細胞系列マーカーと、ARXα細胞系列マーカーとを発現する。上述の局面で述べた方法のある態様において、内分泌前駆細胞は、誘導多能性幹細胞（iPSC）、胚性多能性幹細胞（ePSC）、および/または膵臓前駆細胞より選択される。ある態様において、内分泌前駆細胞は、ニューロゲニン3、neurod1、Nkx2.2、およびPax4バイオマーカーのうちの少なくとも1つのバイオマーカーを発現する。上述の局面で述べた方法のある態様において、島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドは、Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6、およびFoxa2からなる群より選択されるβ細胞転写因子を発現する。前述した局面で述べた処置方法のある態様において、免疫チェックポイントタンパク質は、免疫細胞で発現するコグネイトリガンドに結合し、該コグネイトリガンドは、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）;細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4（CTLA-4）;リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3）;キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）;インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（4-1BB）;グルココルチコイド誘導性TNFRファミリー関連遺伝子（GITR）;T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン（TIM-3）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（OX40）;アデノシンA2A受容体（A2AR）;B7-H3;B7-H4;B7-1/B7-2;BTLA;T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー（VISTA）;または前述のうちのいずれかの組合せより選択される。特定の態様において、免疫チェックポイントタンパク質はプログラム死リガンド-1（PD-L1）である。前述した局面で述べた処置方法のある態様において、島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドは、上記局面で述べた方法によって産生される。前述した局面で述べた処置方法のある態様において、島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドは、前述の局面で述べたオルガノイドである。前述した局面で述べた処置方法のある態様では、免疫抑制物質が対象に投与される。前述した局面で述べた処置方法のある態様において、対象はヒトである。前述した局面で述べた処置方法のある態様において、膵臓疾患は1型糖尿病または2型糖尿病である。
別の局面では、細胞移植の方法が提供され、該方法は、その必要がある対象に、上述の局面で述べた免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドを投与する工程を含む。ある態様において、免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドは、移植を受ける対象にとって同系、自家、同種異系、または異種である。
別の局面では、上述の局面において述べた免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドもしくは膵島オルガノイドを含有するキット、または免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドもしくは膵島オルガノイドを含む薬学的に許容される組成物が提供される。ある態様において、キットは、同系、自家、同種異系、または異種である免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドを含有する。
他の特徴および利点は、態様の詳細な説明および特許請求の範囲から明白になるであろう。
定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が関係する技術分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。以下の参考文献は、関連技術分野の当業者に、本発明において使用される用語の多くについて、その一般的定義を提供している:Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（2nd ed.1994）;The Cambridge Dictionary of Science and Technology（Walker ed.,1988）;The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.（eds.）,Springer Verlag（1991）およびHale＆Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology（1991）。本明細書において使用される以下の用語は、別段の指定がある場合を除き、以下の説明でそれぞれに割り当てられる意味を有する。
「AFPポリペプチド」または「α-フェトプロテイン」とは、NCBIアクセッション番号NP＿001125.1において提供されている配列に対して少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有し、AFPポリペプチドの生物学的活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。AFPポリペプチドの例示的な生物学的活性には、銅、ニッケル、脂肪酸およびビリルビンへの結合が含まれる。NCBIアクセッション番号NP＿001125.1に提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000002
「AFPポリヌクレオチド」とは、AFPポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なAFPポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿001134.2で提供されている。NCBI Ref:NM＿001134.2において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000003
「ALBポリペプチド」または「アルブミン」とは、NCBIアクセッション番号NP＿000468.1において提供されている配列に対して少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有し、ALBポリペプチドの生物学的活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。ALBポリペプチドの例示的な生物学的活性には、脂肪酸、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ホルモンおよびビリルビンへの結合、細胞外液量の安定化、および血漿中亜鉛の輸送が含まれる。NCBIアクセッション番号NP＿000468.1で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000004
「ALBポリヌクレオチド」とは、ALBポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なAFPポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿000477.5で提供されている。NCBI Ref:NM＿000477.5において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000005
「作用物質」とは、任意の低分子化学化合物、抗体、核酸分子もしくはポリペプチドまたはそれらのフラグメントを意味する。
「改善する」とは、疾患の発生または進行を減少させるか、抑制するか、減弱するか、漸減するか、停止させるか、または安定化することを意味する。
「変化した」とは増大または減少を意味する。増大は、任意の正の変化、例えば少なくとも約5％、10％または20％の変化、少なくとも約25％、50％、75％の変化、さらには100％、200％、300％、またはそれ以上の変化である。減少は、任意の負の変化、例えば少なくとも約5％、10％、または20％の減少、少なくとも約25％、50％、75％の減少、さらには100％、200％、300％、またはそれ以上の増大である。
この開示において、「を含む（comprise）」、「を含む（comprising）」、「含有する（containing）」および「有する（having）」などは、米国特許法においてそれらに割り当てられた意味を有する場合があり、「を包含する（includes）」、「を包含する（including）」などを意味する場合もある。同様に、「から本質的になる（consisting essentially of）」、「から本質的になる（consist essentially）」も米国特許法において割り当てられた意味を有し、この用語はオープンエンドであり、具陳されたものの基本的特徴または新規な特徴が、具陳されていないものの存在によって変化しない限り、具陳されていないものの存在も許されるが、先行技術態様は除外される。
「CDX2ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿001256.3において提供されている配列に対して少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有し、転写因子活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿001256.3で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000006
「CDX2ポリヌクレオチド」とは、CDX2ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なCDX2ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿001265.4で提供されている。NCBI Ref:NM＿001265.4において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000007
「CYP3A7ポリペプチド」または「シトクロムP450」とは、NCBIアクセッション番号NP＿000756.3において提供されている配列に対して少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有し、モノオキシゲナーゼ活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿000756.3で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000008
「CYP3A7ポリヌクレオチド」とは、CYP3A7ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なAFPポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿000765.4で提供されている。NCBI Ref:NM＿000765.4において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000009
「自家」は、同じ個体、対象、または患者から取得または誘導される生体材料、例えば自家の細胞、組織、島、オルガノイド、または島様オルガノイドを指す。例えば、自家移植物（例えばドナー細胞、ドナー組織、ドナー臓器、ドナー島、ドナーオルガノイドまたはドナー島様オルガノイド）には、ドナーとしてもレシピエントとしても、1つの個体、対象または患者が関わる。「同系」は、遺伝的に類似しているか同一（かつ同じ種のもの）であり、したがって免疫学的に適合する、細胞、組織、臓器、島、オルガノイド、島様オルガノイド、または生物（または他の生体材料）を指す。同系ドナー生体材料は、通例、非常に近い関係にあるので、移植はレシピエントにおける免疫応答を惹起しない。「同種異系」は、レシピエントとは遺伝的に似ていない生体材料、例えばドナー同種異系細胞、ドナー同種異系組織、ドナー同種異系臓器、ドナー同種異系島、ドナー同種異系オルガノイド、またはドナー同種異系島様オルガノイドを指す。同種異系生体材料は、通例、同じ種の個体から取得または誘導される。加えて、同種異系生体材料は、非血縁ドナーからのもの、またはMHCもしくはHLA組織適合性抗原タイプに関してレシピエントのそれと適合するドナーからのものであってもよい。「異種」は、異なる種の個体から誘導または取得される生体材料（例えば細胞、組織、臓器、島、オルガノイド、または島様オルガノイド）を指す。例えば、自家、同系、同種異系、または異種の細胞、組織、臓器、島、オルガノイド、または島様オルガノイド、特に長期免疫回避性の移植または埋植生体材料を得るために本明細書に記載するIFNγ処理（例えばMPS IFNγ処理）を含む方法によって生成されたものは、移植または埋植に使用しうる。ある態様において、そのような生体材料は生きているドナー（個体、対象、または生物）から取得または生成される。ある態様において、そのような生体材料は、例えば死体ヒト島またはドナー適合死体ヒト島など、生きていないドナーから取得または生成される。
本明細書において使用される用語「担体」は、生理学的に許容される希釈剤、賦形剤、緩衝液、またはビヒクルを指し、組成物（例えば生理学的に許容される組成物または薬学的組成物）、例えば細胞、島、島様オルガノイド、またはオルガノイドを含む組成物は、それらと一緒に対象に投与されうるか、または、それらの中に保存されうる。薬学的担体および薬学的に許容される担体としては、滅菌された液体、例えば培地、食塩水、緩衝液などが挙げられる。複数の態様において、生理学的に許容される担体は、対象、例えば限定するわけではないがヒト対象またはヒト患者に投与または移植される薬学的組成物において、使用される。いくつかの態様において、特に注射用溶液剤には、水または食塩水溶液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液が担体として使用されうる。適切な薬学的担体（および薬学的組成物）は公知であり当業者に使用されており、Remington:The Science and Practice of Pharmacy（20th ed.）,ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams＆Wilkins,2000およびその後発版に記載されている。
「フラグメント」とは、ポリペプチド分子または核酸分子の一部分を意味する。この一部分は、リファレンス核酸分子またはリファレンスポリペプチドの全長の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％を含有する。フラグメントは、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有しうる。
本明細書において使用される用語「免疫応答」は、免疫系によって外来、同種異系、または異種と認識される1種類もしくは複数種類の抗原（例えば免疫原性タンパク質または免疫原性ペプチド）および/または抗原のエピトープに対する、対象の免疫系の応答または反応を指す。免疫応答には、細胞媒介性免疫応答（すなわちエフェクターT細胞、例えば抗原特異的T細胞または非特異的T細胞、例えばCD8＋T細胞、Th1細胞、Th2細胞およびTh17細胞によって媒介される応答）と、体液性免疫応答（すなわちB細胞活性化と抗原特異的抗体の産生とを特徴とする応答）がどちらも含まれる。用語「免疫応答」は、抗原または免疫原に対する先天性免疫応答と、獲得免疫の結果でありB細胞もしくはT細胞またはその両方が関与するメモリー応答を、どちらも包含する。
「免疫チェックポイントタンパク質」または「免疫チェックポイント分子」または単に「チェックポイントタンパク質もしくはチェックポイント分子」とは、T細胞の活性化または細胞経路もしくは免疫系経路の特定のプロセスを、例えばエラーまたは異常なもしくは病的な活性もしくは状態を防止するなどの目的で、誘導しまたは妨げることができる、タンパク質または分子を意味する。免疫応答では、抗原提示細胞（APC）とT細胞との間の決定的な相互作用が、次の「3シグナルモデル（three signal model）」によって厳重に調節されている:（1）主要組織適合遺伝子複合体（MHC）タンパク質クラスIまたはII（MHC IまたはII）に結合した抗原からなる表面複合体の、T細胞（CD8＋またはCD4＋）上のT細胞受容体（TCR）へのディスプレイ、（2）免疫チェックポイントタンパク質による共刺激、および（3）サイトカイン。免疫チェックポイントタンパク質は、T細胞の活性化を誘導するかまたは抑制することができる共刺激タンパク質および抑制タンパク質を含む。共刺激シグナル2なしでシグナル1だけを受取ったナイーブT細胞は、アネルギー状態になるか、アポトーシスによって死ぬ。共刺激リガンド/受容体ペアのエンゲージメントは、免疫シナプスの中心における受容体およびタンパク質複合体の集積をトリガーし、次にそれがTCRシグナリングを増幅し、その持続時間を延ばす（Wulfing,C. and Davis,M.M.,1998,Science,282:2266-2269）。次に、サイトカイン環境、シグナル3が、ナイーブCD4＋T細胞のさまざまなT細胞サブセット、例えばTヘルパー（Th）1細胞、Th2細胞、Th17細胞および制御性T細胞（Treg）への分化を誘導し、そのそれぞれが活性化すると相異なるサイトカインのセットを産生し、放出する（Foks,A.C. and Kuiper,J.,2017,Br.J.Pharmacol.,174:3940-3955）。
免疫系は、多種多様な刺激性および抑制性の免疫チェックポイントタンパク質（シグナル2）を用意しており、各経路は個々の免疫細胞の運命に対してそれぞれユニークな効果を持つ。刺激性免疫チェックポイントタンパク質によるシグナリングは、細胞の生残、細胞周期進行ならびにエフェクター細胞およびメモリー細胞への分化を促進し、一方、抑制性免疫チェックポイントタンパク質シグナリングは、直接的に、またはTregの誘導によって間接的に、これらのプロセスを終結させることができる。共刺激はシスに提供されること、すなわちシグナル1とシグナル2がどちらも同じAPCによって提供されることも、トランスに提供されること、すなわちシグナル2がシグナル1とは異なるAPC、すなわち「バイスタンダー」APCによって提供されることもある（Roska,A.K. and Lipsky,P.E.,1985,J.Immunol.,135:2953-2961、Liu,Y. and Janeway,C.A.,Jr.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3845-3849、Ding,L. and Shevach,E.M.,1994,Eur.J.Immunol.,24:859-866）。
チェックポイントタンパク質は免疫系の制御因子であり、多くの場合、リガンド（コグネイトリガンド）によって結合されるか、またはリガンド（コグネイトリガンド）と相互作用し、それが所与の効果、例えば細胞刺激、アネルギーまたはアポトーシスを引き起こしうる。ある態様において、免疫チェックポイントタンパク質は、免疫細胞表面上のコグネイトリガンド（例えば受容体リガンド）、例えばT細胞表面受容体に結合するものである。ある具体的態様において、免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1またはその結合部分であり、PD-L1のコグネイトリガンドはT細胞の表面に発現するPD-1である。ある態様において、チェックポイントタンパク質はチェックポイントタンパク質の細胞外ドメインである。
用語「コグネイトリガンド」は、免疫チェックポイントタンパク質が特異的に相互作用するか特異的に結合する、特異的結合パートナー、結合メンバー、またはリガンドを指す。例えば、受容体タンパク質が結合しまたは相互作用する特異的リガンドは、その受容体タンパク質にとって「コグネイトリガンド」である。同様に、受容体タンパク質は、特異的リガンド分子または特異的リガンドタンパク質にとってのコグネイトリガンドである。
「構成的発現」とは、必要な時だけ転写される条件的遺伝子と比べて、絶えず転写されている遺伝子の発現を意味する。構成的に発現する遺伝子は継続的に転写され、制御は、細胞、組織、または生物の代謝状態と直接的に関連するものに限られる。構成的に発現される遺伝子の発現レベルは、例えば転写後修飾または翻訳後修飾によって調整されうる。ある態様において、遺伝子はPD-L1ポリペプチドをコードするPD-L1である。
「検出する」とは、検出しようとする分析物の存在、非存在、または量を同定することを指す。
「検出可能標識」とは、関心対象の分子に連結された時に、関心対象の分子を、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段による検出が可能な分子にする組成物を意味する。例えば有用な標識として、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばELISAにおいてよく使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが挙げられる。
「分化」は分化系列決定の発生プロセスを指す。分化は、1種類または複数種類の細胞特異的マーカーの増大を、対応する未分化対照細胞におけるそれらの発現と比較して測定することによって、アッセイすることができる。「系列」は、前駆体または「前駆」細胞が漸進的な生理学的変化を起こして、特徴的な機能を有する特定化された細胞タイプになる、細胞発生の経路を指す。いくつかの態様において、細胞タイプはβ細胞である。いくつかの態様において、細胞タイプはα細胞、δ細胞または導管細胞である。他のいくつかの態様において、細胞タイプは肝細胞である。さらに他の態様において、細胞タイプは心筋細胞である。いくつかの態様において、細胞タイプは腸細胞である。分化は段階的に起こり、細胞は、「最終分化」とも呼ばれる完全な成熟に到達するまで、徐々に、より特定化された状態になっていく。「最終分化細胞」とは、特定の系列に深く関与しておりかつ、分化の最終段階に到達した細胞（すなわち完全に成熟した細胞）である。いくつかの態様では、誘導多能性幹細胞（iPSC）を、β様細胞、α様細胞、δ様細胞または導管様細胞に分化させる。他のいくつかの態様では、誘導多能性幹細胞（iPSC）を、肝細胞、心筋細胞または腸細胞に分化させる。
「脱分化細胞」とは、分化のプロセスが少なくともある程度は反転した細胞である。脱分化は、例えば1種類または複数種類の細胞特異的マーカーの発現の低減を、対応する対照細胞におけるそれらの発現と比較して同定することによって、アッセイすることができる。あるいは、脱分化は、胚性幹細胞、多能性細胞タイプまたは複能性細胞タイプによって典型的に発現されるか、またはより初期の発生段階で典型的に発現される1種類または複数種類のマーカーの増大を測定することによって、アッセイすることもできる。いくつかの態様において、脱分化細胞は誘導多能性幹細胞（iPSC）である。ある特定の態様において、脱分化細胞はヒト誘導多能性幹細胞（iPSC）である。
「疾患」とは、細胞、組織もしくは臓器または身体の一部の正常な機能に有害な影響を及ぼし、それらを損傷しまたは妨害する任意の状態または障害、例えば自己免疫または自己免疫疾患を意味する。疾患の例として、1型糖尿病、2型糖尿病および膵がんが挙げられる。自己免疫疾患は、身体が、それ自身の組織または臓器（または組織移植物もしくは臓器移植物または組織埋植物もしくは臓器埋植物）に免疫学的に反応（攻撃）する免疫細胞（例えばエフェクターT細胞またはNK細胞）および/またはB細胞によって産生される抗体を産生して、組織または臓器（または組織移植物もしくは臓器移植物または組織埋植物もしくは臓器埋植物）の劣化、そして場合によっては、破壊をもたらすものである。
「有効量」とは、対象における疾患の症状を無処置の対象と比較して改善するのに必要な、治療剤またはオルガノイドの量を意味する。疾患の治療的処置のための本発明の実施に使用される治療薬の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重および全身の健康状態に依存して変動する。最終的には、主治医または獣医師が、適当な量と投薬レジメンとを決定することになる。そのような量を「有効」量という。いくつかの態様において、治療用オルガノイドは膵島オルガノイドである。他のいくつかの態様では、有効量の膵島オルガノイドが、1型糖尿病または2型糖尿病を有する対象に投与される。
「ESRRGポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿001230448.1において提供されている配列に対して少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有し、核ホルモン受容体活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿001230448.1で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000010
「ESRRGポリヌクレオチド」とは、ESRRGポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なESRRGポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿001243519.1で提供されている。NCBI Ref:NM＿001243519.1において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000011
Figure 2022504640000012
Figure 2022504640000013
本明細書で使用される「内分泌」は、血流への作用物質（例えばホルモン）の分泌を指す。「外分泌」は、導管を使った上皮表面への作用物質の分泌を指す。
「フラグメント」とは、ポリペプチド分子または核酸分子の一部分を意味する。この一部分は、リファレンス核酸分子またはリファレンスポリペプチドの全長の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％を含有する。フラグメントは、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有しうる。
「FOXA2ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿068556.2において提供されている配列に対して少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有し、転写因子活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿068556.2で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000014
「FOXA2ポリヌクレオチド」とは、FOXA2ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なFOXA2ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿021784.4で提供されている。NCBI Ref:NM＿021784.4において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000015
「GATA6ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿005248.2において提供されている配列に対して少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有し、転写因子活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿005248.2で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000016
「GATA6ポリヌクレオチド」とは、GATA6ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なKCNK3ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿005257.5で提供されている。NCBI Ref:NM＿005257.5において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000017
Figure 2022504640000018
Figure 2022504640000019
「ジェランガム」とは、以下の分子構造:
ジェランガム-高アシル型
Figure 2022504640000020
ジェランガム-低アシル型
Figure 2022504640000021
のいずれか一方を有する繰り返し単位を持つ直鎖を有する多糖を意味する。
前述の構造において、「Ac」は酢酸エステル基を指し、「Gly」はグリセリン酸エステル基を指し、「M＋」は一価カチオンである。いくつかの態様において、ジェランガムはKELCOGEL（登録商標）ジェランガムである。
「ハイブリダイゼーション」は相補的核酸塩基間の水素結合形成を意味し、これはワトソン-クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型水素結合形成でありうる。例えばアデニンとチミンは水素結合の形成を介して対合する相補的核酸塩基である。
「免疫抑制物質」または「免疫抑制薬」とは、移植または埋植された臓器、島、またはオルガノイドの、対象における免疫反応、例えば拒絶を抑制または防止する作用物質を意味する。免疫抑制薬の例としては、バシリジマブ（basilizimab）、抗胸腺細胞グロブリン、アレムツズマブ、プレドニゾン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリン、シロリムス、メトトレキサート、インターフェロン、およびタクロリムスが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
「誘導多能性幹細胞」または「iPSC」とは、細胞における1種類または複数種類の転写因子の外因性発現によって多能性を獲得した分化体細胞を意味する。「iPSC由来の細胞」は誘導多能性幹細胞に由来する細胞である。「iPSC由来のβ様細胞」、「iPSC由来のα様細胞」、「iPSC由来のδ様細胞」、または「iPSC由来の導管様細胞」は、誘導多能性幹細胞に由来し、かつそれぞれβ細胞、α細胞、δ細胞、または導管細胞の特徴を有する細胞である。
「インターフェロンγ（IFNγ）受容体（を）発現（する）」細胞（例えばドナー細胞）、島、オルガノイド（およびその中の細胞）は、IFNγへの接触またはばく露後に、例えば本明細書記載の方法によるMPS IFNγばく露後に、IFNγに応答し、その結果として、チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子またはチェックポイントタンパク質、例えばPD-L1（PD-L1マーカータンパク質）を発現するのにまたはその発現をアップレギュレートするのに十分な量またはレベルで、IFNγ受容体をその表面に発現する細胞、島、オルガノイド（およびその中の細胞）を指す。ある態様では、PD-L1タンパク質が細胞の表面に発現する（細胞膜発現）。ある態様において、チェックポイントタンパク質、例えばPD-L1の発現またはアップレギュレーションは、例えば、1、2、3、4、5、6、もしくは7日、またはそれ以上を超える期間または1、2、3、4、5、6、もしくは7日、またはそれ以上の期間にわたって、持続する。ある態様において、チェックポイントタンパク質、例えばPD-L1の発現またはアップレギュレーションは、例えば7日以上またはそれより長い期間（例えば1、2、3、4、5、6週超またはそれより長い期間）にわたって、持続する。細胞内または細胞上でのPD-L1の発現またはPD-L1の発現のレベルは、例えば、タンパク質またはポリヌクレオチドを検出しまたはそのレベルを決定するために当業者が当然のように知っていて、または使用している任意のアッセイ、例えば、限定するわけではないが、酵素的、蛍光的、化学発光的または電気化学発光的イムノアッセイ、フローサイトメトリー、スペクトロメトリー（質量分析）、PCR、またはRNAもしくはDNA検出方法などによって、検出しまたは決定しうる。
本明細書で使用される間欠的ばく露とは、本明細書に記載するように、移植、埋植、または移入の後に、生残しかつ細胞死が低減している、例えば免疫検出を回避する、免疫保護された細胞、島、またはオルガノイドを生成させるために、記載のプロトコールにおいて使用される、IFNγの多重パルス刺激（MPS）と呼ばれる多重パルス、例えば短い反復パルスへの、細胞、島、オルガノイド（島様オルガノイド、例えばヒト島様オルガノイド、およびその中の細胞）の、とりわけインターフェロン-γ（IFNγ）受容体を発現する細胞、島、オルガノイド（島様オルガノイドおよびその中の細胞）の、反復ばく露、例えば短い反復ばく露を指す。IFNγばく露の反復パルスのそれぞれの持続時間は、長期間ではなく、典型的には短期間、例えば数分または数時間である。例えば、IFNγへのばく露は、本明細書において記載するように、所与の期間または全期間の間に、例えば、複数時間（例えば2、4、6、12、24、36、48、72、144時間、もしくはそれ以上、またはそれらの間の間隔）、複数日間（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日間、もしくはそれ以上）、または複数週間（1、2、3、4、5、6、7、8週間、もしくはそれ以上）の間に、0.5時間、1時間、2時間、または3時間などの期間を複数回含みうる。
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その材料のネイティブ状態で見られるように通常はその材料に付随する成分を、さまざまな程度に含まない材料を指す。「単離」とは、元の供給源または周囲からの分離の程度を表す。「精製」とは、単離よりも高い分離の程度を表す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、他の材料が十分に少なく、いかなる不純物もタンパク質の生物学的性質に大きな影響を及ぼさず、他の有害な帰結も引き起こさない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えDNA技法によって産生された場合に細胞材料、ウイルス材料または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合に化学前駆体その他の化学物質を実質的に含まないのであれば、精製されている。純度および均一性は、典型的には、分析化学の技法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使って決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に一本のバンドを生じることを表す場合もある。リン酸化またはグリコシル化などの修飾の対象となりうるタンパク質の場合は、異なる修飾が、別々に精製されうる異なる単離されたタンパク質を生じさせる場合もある。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然のゲノムにおいて当該遺伝子に隣接している遺伝子を含まない核酸（例えばDNA）を意味する。したがってこの用語には、ベクターに組み込まれた組換えDNA、自律複製プラスミドもしくはウイルスに組み込まれた組換えDNA、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA、あるいは、他の配列に依存せず独立した分子として存在する組換えDNA（例えばcDNAまたはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じるゲノムもしくはcDNAのフラグメント）が含まれる。加えて、この用語には、DNA分子から転写されたRNA分子、および追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含まれる。
「単離されたポリペプチド」とは、本来はそれに付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。通例、ポリペプチドは、それが、本来それに付随しているタンパク質および天然有機分子を重量で少なくとも60％含まない場合に、単離されている。調製物は、本発明のポリペプチドが、重量で、少なくとも75％、少なくとも90％および少なくとも99％でありうる。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば天然源からの抽出、当該ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、またはタンパク質の化学合成などによって得ることができる。純度は、任意の適当な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC分析によって測定することができる。
「KCNK3ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿002237.1において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、カリウムチャネル活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿002237.1で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000022
「KCNK3ポリヌクレオチド」とは、KCNK3ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なKCNK3ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿002246.2で提供されている。NCBI Ref:NM＿002246.2において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000023
Figure 2022504640000024
「KCNQ1ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿000209.2（アイソフォーム1）またはNP＿861463.1（アイソフォーム2）において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、カリウムチャネル活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿000209.2で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000025
「KCNQ1ポリヌクレオチド」とは、KCNQ1ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なKCNQ1ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿000218.2で提供されている。NCBI Ref:NM＿000218.2において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000026
Figure 2022504640000027
「LGR5ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿003658.1（アイソフォーム1）、NP＿001264155.1（アイソフォーム2）またはNP＿001264156.1（アイソフォーム3）において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、膜貫通シグナリング受容体活性またはGタンパク質共役受容体活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿003658.1で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000028
「LGR5ポリヌクレオチド」とは、LGR5ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なLGR5ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿003667.3で提供されている。NCBI Ref:NM＿003667.3において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000029
Figure 2022504640000030
「LDHAポリペプチド」または「乳酸デヒドロゲナーゼAポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿005557.1（アイソフォーム1）、NP＿001128711.1（アイソフォーム2）、NP＿001158886.1（アイソフォーム3）、NP＿001158887.1（アイソフォーム4）またはNP＿001158888.1（アイソフォーム5）において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿005557.1で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000031
「LDHAポリヌクレオチド」または「乳酸デヒドロゲナーゼAポリヌクレオチド」とは、LDHAポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なLDHAポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿005566.3で提供されている。NCBI Ref:NM＿005566.3において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000032
「MAFAポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿963883.2において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、転写因子活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿963883.2で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000033
「MAFAポリヌクレオチド」とは、MAFAポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なMAFAポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿201589.3で提供されている。NCBI Ref:NM＿201589.3において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000034
本明細書で使用される「マーカー」とは、疾患または障害に関連して、または特定の細胞タイプと関連して、発現レベルまたは活性が変化する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。いくつかの態様において、β細胞のマーカーは、Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6、またはFoxa2である。いくつかの態様において、肝細胞のマーカーは、AFP、ALBまたはCyp3a7である。他のいくつかの態様において、心筋細胞のマーカーは、hMlc2a、hNkx2-5、αMHC、またはKCNQ1である。さらに他の態様において、小腸細胞のマーカーは、CDX2、Muc2、またはLgr5である。
「αMHCポリペプチド」または「ミオシン重鎖（MHC）αポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿002462.2において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、アクチン結合活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿002462.2で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000035
「αMHCポリヌクレオチド」とは、αMHCポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なαMHCポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿002471.3で提供されている。NCBI Ref:NM＿002471.3において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000036
Figure 2022504640000037
Figure 2022504640000038
「MLC2Aポリペプチド」または「ヒトMLSC2A（hMLC2A）ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿067046.1において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、カルシウム結合活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿067046.1で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000039
「MLC2Aポリヌクレオチド」とは、MLC2Aポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なMLC2Aポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿021223.2で提供されている。NCBI Ref:NM＿021223.2において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000040
「MUC2ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿002448.3において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、MUC2ポリペプチドの生物学的活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。MUC2ポリペプチドの例示的な生物学的活性として、ゲルへの重合ならびに腸および他の粘膜含有臓器の上皮のコーティングが挙げられる。NCBIアクセッション番号NP＿002448.3で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000041
Figure 2022504640000042
「MUC2ポリヌクレオチド」とは、MUC2ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なMUC2ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿002457.3で提供されている。NCBI Ref:NM＿002457.3において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000043
Figure 2022504640000044
Figure 2022504640000045
Figure 2022504640000046
Figure 2022504640000047
Figure 2022504640000048
「NKX2-5ポリペプチド」または「ヒトNKX2-5（hNKX2-5）ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿004378.1（アイソフォーム1）、NP＿001159647.1（アイソフォーム2）またはNP＿001159648.1（アイソフォーム3）において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、転写因子活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿004378.1で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000049
「NKX2-5ポリヌクレオチド」とは、NKX2-5ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なNKX2-5ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿004387.3で提供されている。NCBI Ref:NM＿004387.3において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000050
「NEUROD1ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿002491.2において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、転写因子活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿002491.2で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000051
「NEUROD1ポリヌクレオチド」とは、NEUROD1ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なNEUROD1ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿002500.4で提供されている。NCBI Ref:NM＿002500.4において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000052
「NKX6-1ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿006159.2において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、転写因子活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿006159.2で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000053
「NKX6-1ポリヌクレオチド」とは、NKX6-1ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なNKX6-1ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿006168.2で提供されている。NCBI Ref:NM＿006168.2において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000054
「NDUFA4ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿002480.1において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、NADHデヒドロゲナーゼ活性およびオキシドレダクターゼ活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿002480.1で提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000055
「NDUFA4ポリヌクレオチド」とは、NDUFA4ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なNDUFA4ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿002489.3で提供されている。NCBI Ref:NM＿002489.3において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000056
「作用物質を取得する」などにおいて本明細書で使用される「取得する」には、その作用物質を合成する、購入する、調達する、誘導する、または他の形で獲得することが含まれる。
「臓器」とは、生物学的機能を遂行する細胞の集合体を意味する。一態様において、臓器としては、膀胱、脳、神経組織、神経膠組織、食道、ファロピウス管、心臓、膵臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮、乳房、骨格筋、皮膚、骨および軟骨が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。臓器の生物学的機能は、当業者に公知の標準的方法を使ってアッセイすることができる。
「オルガノイド」とは、臓器の構造と機能を模倣するインビトロ生成体（in vitro generated body）を意味する。「オルガノイド」と「ミニ臓器」は本明細書では相互可換的に使用される。「島様オルガノイド」、「膵島オルガノイド」、「膵島」、または「膵臓オルガノイド」は、膵島の構造と機能を模倣するインビトロ生成細胞クラスターである。膵島の例示的な機能としては、グルコース刺激インスリン分泌（GSIS）、塩化カリウム（KCl）刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、またはグルカゴン分泌が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。「膵島オルガノイド」、「島様オルガノイド」、「膵臓オルガノイド」および「ミニ膵島」は本明細書では相互可換的に使用される。ある態様において、「膵臓オルガノイド」は、膵臓の構造と機能を模倣するインビトロ生成体である。膵臓の例示的な機能としては、グルコース代謝および血中グルコース濃度を調節するグルコースおよびグルカゴンなどのホルモンの内分泌、ならびに糖質、タンパク質および脂質の分解を助ける消化酵素の外分泌が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。「膵臓オルガノイド」と「ミニ膵臓」も本明細書では相互可換的に使用される。ある態様において、オルガノイドは、本明細書に記載のヒト島様オルガノイド（「HILO」）である。ある態様において、HILOは誘導多能性幹細胞（iPSC）から生成される。ある態様において、HILOは機能的に成熟しており、例えば糖尿病マウスモデル（NOD-SCIDマウス）において移植後にグルコースホメオスタシスを効果的に再建する内分泌様細胞タイプを含有する。ある態様において、HILOはWNT4処理HILO（wHILO）である。ある態様において、HILOにおけるチェックポイントタンパク質PD-L1の過剰発現によって、HILOがT細胞による免疫反応または免疫監視を回避することが可能になり、その結果、HILOは、免疫正常糖尿病マウス（NOD-SCIDマウス）において、長期間にわたって、例えば少なくとも50日にわたって、グルコースホメオスタシスを維持することができた。ある態様において、所与の期間、例えば少なくとも24時間の間に、インターフェロンγ（IFNγ）への複数回の間欠的エクスビボばく露を行った後の、HILOにおける内因性PD-L1発現の誘導は、T細胞活性化および移植片拒絶を制限する。複数の態様において、細胞またはHILOおよびその中の細胞の、IFNγへの複数回の間欠的ばく露は、例えば、IFNγばく露がない途中の期間を含む所与の期間での、複数回、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10回、またはそれ以上にわたる、細胞またはHILOおよびその中の細胞の、ある量の（例えば低レベルの）IFNγへの（例えば液体培養または3Dマトリックス培養などの培養における）ばく露を包含する。ある態様において、本明細書に記載するとおり、PD-L1ポリペプチドを発現させるためにIFNγへの複数回の間欠的ばく露を受けたHILOを、本明細書では、免疫回避性HILO、wHILOまたはwHILOieと呼ぶことがある。
「PD-L1ポリペプチド」（CD274とも呼ばれる）は、UniProtアクセッション番号Q9NZQ7-1において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、転写因子活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿006184.2において提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000057
「PD-L1ポリヌクレオチド」とは、PD-L1ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なPD-L1ポリヌクレオチド配列はNCBIアクセッション番号CCDS59118.1において提供されている。NCBIアクセッション番号CCDS59118.1において提供されている配列を以下に転記する。
ヌクレオチド配列（531nt）:
Figure 2022504640000058
「PAX4ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿006184.2において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、転写因子活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿006184.2において提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000059
「PAX4ポリヌクレオチド」とは、PAX4ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なPAX4ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿006193.2において提供されている。NCBI Ref:NM＿006193.2において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000060
「PAX6ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿001297090.1において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、転写因子活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿001297090.1において提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000061
「PAX6ポリヌクレオチド」とは、PAX6ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なPAX6ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿001310161.1において提供されている。NCBI Ref:NM＿001310161.1において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000062
Figure 2022504640000063
Figure 2022504640000064
「PDX1ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿000200.1において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、転写因子活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿000200.1において提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000065
「PDX1ポリヌクレオチド」とは、PDX1ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なPDX1ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿000209.3において提供されている。NCBI Ref:NM＿000209.3において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000066
「PTF1ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP＿835455.1において提供されている配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有し、転写因子活性を有する、タンパク質またはそのフラグメントを意味する。NCBIアクセッション番号NP＿835455.1において提供されているアミノ酸配列を以下に示す。
Figure 2022504640000067
「PTF1ポリヌクレオチド」とは、PTF1ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なPTF1ポリヌクレオチド配列はNCBI Ref:NM＿178161.2において提供されている。NCBI Ref:NM＿178161.2において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000068
「Wnt3aポリヌクレオチド」とは、Wnt3aポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なヒトWnt3aポリヌクレオチド配列はNCBI GenBankアクセッション番号AB060284.1において提供されている。NCBI GenBankアクセッション番号AB060284.1において提供されているポリヌクレオチド配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000069
「Wnt3aポリペプチド」とは、Wnt3aポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはヒトWnt3aポリペプチド配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味する。例示的なヒトWnt3aポリペプチド配列はNCBI GenBank:AAI03924.1において提供されている。GenBank:AAI03924.1において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000070
「Wnt4ポリヌクレオチド」とは、Wnt4ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なヒトWnt4ポリヌクレオチド配列は、NCBI GenBankアクセッション番号AY009398.1において提供されている。アクセッション番号NCBI Ref NG＿008974.1はリファレンス基準（reference standard）Wnt4aポリヌクレオチド配列である。NCBI GenBankアクセッション番号AY009398.1において提供されているポリヌクレオチド配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000071
「Wnt4ポリペプチド」とは、Wnt4ポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはヒトWnt4ポリペプチド配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味する。例示的なヒトWnt4ポリペプチド配列はNCBI GenBankアクセッション番号:AAG38658.1において提供されている。GenBankアクセッション番号AAG38658.1において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000072
「Wnt5aポリヌクレオチド」とは、Wnt5aポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを意味する。ヒトWnt5aをコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、リファレンス基準配列NCBI Ref:GenBank NM＿003392において提供されている。6194ヌクレオチドを有するWnt5aゲノム配列のヌクレオチド658～1800がヒトWnt5aポリペプチドをコードしている。NCBI Ref:GenBank NM＿003392の塩基658～1800に提供されているヒトWnt5aコード配列のポリヌクレオチド配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000073
「Wnt5aポリペプチド」とは、Wnt5aポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはヒトWnt5aポリペプチド配列に対して少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％もしくは少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味する。例示的なヒトWnt5a（アイソフォーム1）ポリペプチド配列は、UniProtKB識別名P41221-1において提供されている。UniProtKB識別名:P41221-1において提供されている配列を以下に転記する。
Figure 2022504640000074
「免疫チェックポイントタンパク質もしくは免疫チェックポイント分子」または「免疫チェックポイント」は、免疫応答の微調整をもたらす膜貫通タンパク質分子の特定サブタイプを指す。正常組織において、免疫チェックポイントは抑制性シグナルであり、自己免疫を防止することにより、免疫細胞機能における重要な役割を果たしている。腫瘍またはがんを持つ対象では、腫瘍細胞またはがん細胞上の免疫チェックポイントタンパク質のアップレギュレーションにより、腫瘍およびがんが、免疫監視機構を免れ、腫瘍免疫を回避することが可能になる。臨床的免疫治療の中心となっている免疫チェックポイントタンパク質の非限定的な例は、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）およびプログラム細胞死タンパク質リガンド1（PD-L1）である。CD152としても公知であるCTLA-4はCD4＋T細胞の活性化および免疫応答のプライミング相にとって不可欠である。CD279としても公知であり、以前はB7.1とも呼ばれていたPD-1は、活性化したT細胞、B細胞、および骨髄性細胞が発現する重要な免疫チェックポイント受容体であり、免疫抑制を媒介する。CD274としても公知であり、以前はB7-H1とも呼ばれていたPD-L1は、がんおよび自己免疫疾患を含むある特定の疾患状態における免疫系の抑制に重要な役割を果たす免疫制御タンパク質である。PD-L1はPD-1に結合して免疫細胞の活性化または抑制をモジュレートするコグネイトリガンドである。正常な状況下では、免疫系は、微生物または細胞などの外因性作用物質または内因性作用物質に関連する外来抗原と反応し、それが、抗原特異的細胞傷害性CD8＋T細胞および/またはCD4＋ヘルパーT細胞の増殖をトリガーする。PD-1へのPD-L1の結合は、リンパ節における抗原特異的T細胞の増殖を低減する抑制性シグナルを伝達すると同時に、制御性T細胞（抗炎症性抑制性T細胞）におけるアポトーシスも低減する。
PD-L1とPD-1の間の結合アフィニティーを反映するKd（解離定数）は770nMである。PD-L1は、共刺激分子CD80（B7-1）にもかなりのアフィニティーを有するが、CD86（B7-2）に対するアフィニティーはそうでもない。CD80に対するPD-L1のアフィニティーは1.4μMであり、これはCD28とCTLA-4に対するPD-L1のアフィニティー（それぞれ4.0μMおよび400nM）の中間の値である。関連分子PD-L2はCD80またはCD86に対するアフィニティーを有しないが、受容体としてPD-1を共有している（Kdはさらに強く、140nMである）。PD-1は、活性化CD4 T細胞ではアップレギュレートされ、PD-L1発現単球に結合して、IL-10の産生を誘導することができる（E.A.Said et al.,2010,Nature Medicine,16（4）:452-459）。PD-L1がT細胞上のその受容体PD-1と相互作用すると、IL-2産生のT細胞受容体（TCR）媒介活性化とT細胞増殖とを抑制するシグナルが送達される。PD-1/PD-L1相互作用は自己免疫と関係づけられている。例えば自己免疫の動物モデルであるNODマウスは、I型糖尿病および他の自己免疫疾患の自然発生を起こしやすく、PD-1またはPD-L1の遮断により早期発症が起こること（PD-L2の遮断では起こらない）が示されている（M.J.Ansari et al.,2003,J.Exp.Med.,198（1）:63-69）。
「免疫監視機構」または「免疫学的監視機構」とは、身体の組織および臓器において非自己、異物、または同種異系と認識される細胞を検出し破壊するための、免疫系の細胞によるモニタリングプロセスを意味する。例えばそのような非自己細胞は、ウイルス感染細胞、変異細胞、腫瘍性形質転換細胞であるか、免疫系の細胞によって自己または自家分子とは認識されない細胞表面分子を発現しうる。
「前駆細胞」とは、内皮細胞を（例えば分化または分裂によって）生成させる能力を有する複能性幹細胞を意味する。内皮細胞を生成させる能力を有する前駆細胞は、本明細書に記載するような適当なインビトロまたはインビボ条件下で生育した場合に、この能力を発現しうる。
「子孫」とは、本発明の複能性幹細胞に由来する細胞を意味する。子孫には、前駆細胞、分化細胞および最終分化細胞が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
「に由来する」とは、「から取得された」ことまたは子孫細胞を取得するプロセスを意味する。
「低減する」とは、少なくとも10％、25％、50％、75％、または100％の負の変化を意味する。
「リファレンス」または「対照」とは標準状態を意味する。例えば、無処理のまたは健常な（非疾患性の）細胞、組織、または臓器がリファレンスとして使用される。
「リファレンス配列」は配列比較の基礎として使用される所定の配列である。リファレンス配列は、指定された配列のサブセットまたは全体、例えば完全長cDNAもしくは完全長遺伝子配列のセグメント、または完全なcDNA配列もしくは完全な遺伝子配列でありうる。ポリペプチドの場合、リファレンスポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約16アミノ酸、少なくとも約20アミノ酸、または少なくとも約25アミノ酸であると考えられる。リファレンスポリペプチド配列の長さは、約35アミノ酸、約50アミノ酸または約100アミノ酸であることができる。核酸の場合、リファレンス核酸配列の長さは、一般に少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約60ヌクレオチド、または少なくとも約75ヌクレオチドであると考えられる。リファレンス核酸配列の長さは、約100ヌクレオチド、約300ヌクレオチド、またはその前後もしくはその間の任意の整数であることができる。
「体」細胞とは、対象の組織から取得される細胞を指す。そのような対象は、出生後の発生段階にある（例えば成人、乳幼児、小児）。これに対し、「胚細胞」または「胚性幹細胞」は、出生前の発生段階にある胚に由来する。
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識し結合するが、本発明のポリペプチドを天然に含む試料中の、例えば生物学的試料中の他の分子を認識し結合することは実質的にない、化合物または抗体を意味する。
本発明の方法において有用な核酸分子としては、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする任意の核酸分子が挙げられる。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100％同一である必要はないが、典型的には実質的同一性を呈すると考えられる。内因性配列に対して「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズする能力を有する。本発明の方法において有用な核酸分子としては、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする任意の核酸分子が挙げられる。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100％同一である必要はないが、典型的には実質的同一性を呈すると考えられる。内因性配列に対して「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズする能力を有する。「ハイブリダイズする」とは、さまざまなストリンジェンシー条件下で相補的ポリヌクレオチド配列間の二本鎖分子（例えば本明細書記載の遺伝子）またはその一部分を形成するペアを意味する。（例えばWahl,G.M. and S.L.Berger（1987）Methods Enzymol.152:399、Kimmel,A.R.（1987）Methods Enzymol.152:507参照）。
例えばストリンジェントな塩濃度は、通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満、約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満、または約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満であると考えられる。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができ、一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35％ホルムアミドまたは少なくとも約50％ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、少なくとも約37℃、および少なくとも約42℃の温度を含むと考えられる。さらなるパラメータ、例えばハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム」（SDS）などの界面活性剤の濃度を変化させること、およびキャリアDNAの組入れまたは除外は、当業者には周知である。これらさまざまな条件を必要に応じて組み合わせることにより、さまざまなレベルのストリンジェンシーが達成される。一態様において、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウムおよび1％SDS中、30℃で行われると考えられる。別の態様において、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミドおよび100μg/ml変性サケ精子DNA（ssDNA）中、37℃で行われると考えられる。さらに他の態様において、ハイブリダイゼーションは、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミドおよび200μg/ml ssDNA中、42℃で行われると考えられる。これらの条件の有用な変更は当業者にはすぐにわかると考えられる。
ほとんどの適用では、ハイブリダイゼーション後に行われる洗浄工程も、ストリンジェンシーがさまざまであると考えられる。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度と温度とによって規定することができる。上述のとおり、塩濃度を減少させるか、温度を上昇させることによって、洗浄ストリンジェンシーを増加させることができる。例えば洗浄工程用のストリンジェントな塩濃度は、約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウム未満または約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウム未満であると考えられる。洗浄工程用のストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、少なくとも約42℃および少なくとも約68℃の温度を含むと考えられる。一態様において、洗浄工程は、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中、25℃で行われると考えられる。別の態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中、42Cで行われると考えられる。さらに他の態様において、洗浄工程は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1％SDS中、68℃で行われると考えられる。これらの条件のさらなる変更は当業者にはすぐにわかると考えられる。ハイブリダイゼーション技法は当業者には周知であり、例えばBenton and Davis（Science 196:180,1977）、Grunstein and Hogness（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975）、Ausubel et al.（Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience,New York,2001）、Berger and Kimmel（Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York）およびSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New Yorkに記載されている。
「実質的に同一」とは、リファレンスアミノ酸配列（例えば本明細書記載のアミノ酸配列のいずれか一つ）またはリファレンス核酸配列（例えば本明細書記載の核酸配列のいずれか一つ）に対して少なくとも50％の同一性を呈するポリペプチド分子または核酸分子を意味する。そのような配列は、比較に使用される配列に対して、アミノ酸レベルでまたは核酸において、少なくとも60％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、さらには少なくとも99％同一である。
配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェア（例えばUniversity of Wisconsin Biotechnology Center（ウィスコンシン州マディソン53705ユニバーシティ・アベニュー1710）、Genetics Computer Groupの配列解析ソフトウェアパッケージ、BLAST、BESTFIT、GAPまたはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を使って測定される。そのようなソフトウェアは、さまざまな置換、欠失および/または他の修飾に相同性度を割り当てることによって、同一配列または類似配列を照合する。保存的置換には、通例、以下のグループ内での置換が含まれる:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リジン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシン。同一性度を決定するためのある例示的なアプローチでは、BLASTプログラムを使用しうる。この場合は、e-3～e-100の確率スコアが密接に関係した配列を示す。
本明細書において使用される用語「自己複製」は、幹細胞が分裂して、母細胞のそれと区別がつかない発生能を持つ1つ（非対称分裂）または2つ（対称分裂）の娘細胞を生成するプロセスを指す。自己複製は、増殖と未分化状態の維持の両方を伴う。
「幹細胞」という用語は、自己複製する能力と複数の細胞系列へと分化する能力とを有する多能性細胞または複能性幹細胞を意味する。
「対象」とは哺乳動物、例えば限定するわけではないが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、齧歯類、またはネコを意味する。特定の態様において、対象はヒト対象、例えばヒト患者である。
本明細書に記載される範囲は、最初の値と最後の値を含むその範囲内の値のすべてを略記したものであると理解される。非限定的な例として、1～50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。
「組織」とは、類似する形態と機能を有する細胞の集合体を意味する。
本明細書において使用される「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、障害および/またはそれに関連する症状を低減しまたは改善することを指す。障害または状態の処置は、障害、状態、またはそれに関連する症状が完全に取り除かれることを排除するものではないが、それを必要としないことは、理解されるであろう。
「血管新生化された」とは血管を有することを意味する。いくつかの態様において、膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドは血管新生化される。
特に言明した場合または文脈から自明である場合を除き、本明細書において使用される用語「または」は、包括的（inclusive）であると理解される。特に言明した場合または文脈から自明である場合を除き、本明細書において使用される用語「a」、「an」および「the」は、単数または複数であると理解される。
特に言明した場合または文脈から自明である場合を除き、本明細書において使用される用語「約」は、当技術分野における通常の許容誤差範囲内、例えば平均から2標準偏差以内と理解される。約は、言明された値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、または0.01％以内と理解することができる。文脈からそうでないことが明らかである場合を除き、本明細書に掲載される数値はすべて、約という用語で修飾される。
本明細書における可変部の任意の定義における化学基の一覧の記載は、列挙された基の任意の単一基または組合せとしての当該可変部の定義を含む。本明細書における可変部または局面に関する態様の記載は、任意の単一態様としての、または他の任意の態様もしくはその一部分との組合せでの、当該態様を包含する。
本明細書において提供される任意の組成物または方法は、本明細書において提供され説明される他の組成物および方法のいずれかのうちの1つまたは複数と組み合わせることができる。
図1A～図1Gは、ポリマーベースの培養物における細胞クロストークによるhiPSC由来β様細胞の機能性の強化に関する画像、模式図およびグラフである。図1A（上）に、ヒトiPSC（hiPSC）、初代ヒト膵臓上皮細胞（hPanc上皮）、ヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）、ヒト膵臓線維芽細胞（hPanc線維芽細胞）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト膵臓微小血管内皮細胞（hPanc内皮）からのトランスクリプトームの主成分分析の結果を示す。図1A（下）は、固有の自己組織化を示す、マトリゲル（Matrigel）（hADSC培地に1:1希釈）におけるヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）培養（300μl中に200万細胞）の時間経過を表す（スケールバー1mm）。図1Bは、多細胞島様スフェロイド（MCS）および島様スフェロイド（IS）の概略図である。hiPSC由来の内分泌前駆細胞（EP）を、ジェランガムベースの3D培養システム中で、hADSCおよび内皮細胞（EC、HUVEC）と共培養した（左）。EPは、ニューロゲニン3、neurod1、Nkx2.2、およびPax4バイオマーカーの発現によって規定される、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、膵ポリペプチド細胞およびG細胞を含む内分泌細胞に分化する複能性細胞である（Rezania,A.et al.,2014,Nature Biotechnology,32:1121-1133）。マトリゲル環境中で生成したMCSは、ECの組込み（mCherry発現）および緑色蛍光タンパク質（GFP）発現によって検出されるインスリン発現を示す（右）。（スケールバー100μm）。図1Cは、インスリン発現（GFP、上）を示す、3Dジェランガムシステムで培養された多細胞島様スフェロイド（MCS）を図示している。hADSC中のインスリン顆粒（右下）および脂質滴（右下）を示すMCSの電子顕微鏡像。図1Dは、島様スフェロイド（IS;hADSCおよびECの非存在下で生成させたhiPSC由来β様細胞）、MCSまたはヒト島（hislet）中の選別されたインスリン発現細胞（GFP＋）における遺伝子発現のグラフである。図1Eは、3mMグルコース（G3）または20mMグルコース（G20）に応答して起こるIS、MCSおよびhisletからのヒトc-ペプチドの分泌を示すグラフである。図1Fは、シャム処置後またはMCS（500）もしくはヒト島の移植後のSTZ誘導性糖尿病NOD-SCIDマウスにおけるランダム採食（random fed）血中グルコースレベルを示すグラフである。図1Gは、移植4週間後からのマウスにおける給餌、絶食および再給餌サイクル中の血清ヒトc-ペプチドレベルを示すグラフである。エラーバーは±SEMを表す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001。 図2A～図2Fは、ヒト島中の内分泌細胞および支持細胞における非古典的Wntの発現を示すヒートマップ、グラフおよびプロットである。図2Aは、マトリゲルにおけるhADSC培養中の発現変化のヒートマップを表す。有意な影響を受けた遺伝子オントロジーカテゴリー、すなわちWnt5aおよび下流シグナリング（5.1e-03）が、右側に示されている。図2Bは、図2Aに示すhADSC自己組織化中のWNTの時間的発現のtSNEクラスタリングを示すグラフである。図2Cは、ヒト島（n＝5）におけるWNTの相対的発現を示すグラフとヒートマップを表す。図2Dは、ヒト島単一細胞トランスクリプトームのt-SNEクラスタリングを表す（n＝3245）。アノテーションされた細胞タイプは公知のマーカー遺伝子発現に基づいて割り当てられている。図2Eおよび図2Fは、ヒト島におけるWNT2B、WNT4、WNT5A、WNT7A、WNT7B、およびWNT9A発現の、それぞれ単一細胞プロットおよびバイオリンプロットである。エラーバーは±SEMを表す。 図3A～図3Kは、ヒト島様オルガノイド（HILO）の生成およびWNT4によるHILOの機能的な成熟化の誘導に関する概略図、画像、ヒートマップおよびグラフである。図3Aは、ヒト島様オルガノイド（HILO）生成の概略図を表す。図3Bは、3D培養中のHILO（左）およびインスリン発現（ヒトインスリンプロモーターが駆動するGFP、右）の代表的画像を示す（スケールバー100μm）。図3Cは、WNT4処理HILO（「wHILO」）およびヒト島における、それぞれβ細胞およびα細胞中のインスリン顆粒およびグルカゴン顆粒を示す電子顕微鏡像を表す。スケールバー、1μm。図3D-1は、hiPSC、PBSで処理したHILO（P）またはWNT4で処理したHILO（W）およびヒト島における重要な島遺伝子の相対的発現のヒートマップを表す（Zスコアによるlog2発現量）。図3D-2は、qPCR（試料タイプ1種類あたりn＝8）によって決定されるwHILOおよびヒト島におけるISL1、SYT4、PDX1、GCK、NEUROD1、NKX2-2、インスリン（INSULIN）、NKX6-1、MAFA、MAFB、およびUCN3の相対的発現を示すプロットである。図3Eは、WNT4による処理（26日目から33日目まで100ng/ml）でHILOにおいてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされる遺伝子の遺伝子オントロジーマップである。図3Fは、一連の濃度のWNT4（0、10、25、50、200ng/ml）で5日間処理されたHILOにおけるERRγ、NDUFA7、およびCOX7A2の相対的発現を表す。図3Gは、3D培養されたhiPSC、PBS処理HILOおよびWNT4処理HILO（wHILO）ならびにヒト島における酸化的リン酸化遺伝子の相対的発現のヒートマップを表す（Zスコア）。図3Hは、0日目のhiPSCスフェロイド（下向きの三角）、PBS処理したHILO（上向きの三角）、WNT4処理したHILO（四角）およびヒト島（丸）において測定された酸素消費速度（OCR）を示すグラフである。図3Iは、3mMグルコース（G3）もしくは20mMグルコース（G20）または20mM KCl（K20）に応答して起こる、WNT4処理ありおよびWNT4処理なしで生成させたHILOからの、インビトロヒトc-ペプチド分泌を示すグラフである。図3Jは、市販のhiPSC由来β様細胞（左）のための培養条件を表した模式的概略図と培養細胞の光学顕微鏡像（右）である。図3Kは、3mMグルコース（G3）および20mMグルコース（G20）に応答して起こる、図7D-2に記載の培養物からのインビトロc-ペプチド分泌を示す棒グラフである。 図4A～図4Mは、免疫正常マウスにおけるPD-L1発現wHILOの拡張された機能およびグルコース管理ならびにC57BL6JマウスにおけるwHILO移植片の免疫プロファイリングの研究に関するプロット、グラフ、顕微鏡像、フローサイトメトリー結果および概略図である。図4Aは、WNT4処理HILO（wHILO、n＝4840）からの単一細胞トランスクリプトームのtSNEクラスタリングを表す。図4Bは、HILOおよびヒト島における相対的細胞タイプ数を表すグラフである。図4Cは、PD-L1発現ありまたはPD-L1発現なしのwHILOを誘導性糖尿病C57BL6Jマウスの腎臓/腎被膜に移植した後のランダム摂食血中グルコースレベルを示すグラフである（それぞれn＝11匹および9匹）。グラフの一番上のプロットはwHILO（-）を表し、グラフの真ん中のプロットはwHILO（PD-L1発現）を表し、グラフの一番下のプロットはmisletを表す。図4Dは、PD-L1発現ありおよびPD-L1発現なしのwHILOを移植した27日後に腎被膜移植片から回収されたインスリン発現細胞およびマウス免疫（CD45＋）細胞のフローサイトメトリー解析を表す。T細胞（例えばCD45＋細胞）上のPD-1に結合することによってT細胞の活性化および殺滅活性を抑制することが潜在的に可能なPD-L1発現HILOを含有する移植片は、PD-L1を発現しないHILOを含有する移植片と比べて、浸潤CD45＋T細胞が少ない。図4Eは、図4Dに示すようにPD-L1発現ありまたはPD-L1発現なしのwHILOを移植した後のSTZ誘導性糖尿病マウスにおける血中グルコースレベルの分析の定量化を示している（エラーバーは±SEMを表す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001）。図4Fは、PD-L1発現ありおよびPD-L1発現なしのwHILOを移植した27日後に腎被膜移植片から回収されたインスリン発現細胞およびマウス免疫（CD45＋）細胞のフローサイトメトリー解析を表す。CD45＋細胞を、B細胞（CD19＋）、T細胞（CD3＋）およびNK細胞（NK1.1＋）として、さらに分類した。図4Gは、図4Fについて述べた解析を定量化したドットプロットである（n＝6および6）。図4Hは、移植27日後の腎臓移植片中のwHILO（PD-L1）細胞の画像である（インスリンプロモーターが駆動するGFP発現）。スケールバー、100μm。エラーバーは±SEMを表す。＊p＜0.05。図4Iは、多重低用量ストレプトゾトシン（MLD-STZ、50mg/kg/日で5日間）誘導性糖尿病Hu-PBMC-NSGマウスへの、PD-L1過剰発現ありおよびPD-L1過剰発現なしのwHILO（マウス1匹あたり500HILO）の移植を表す概略図である。図4Jは、ヒトPBMC移植3週間後のHu-PBMC-NSGマウス（n＝15匹）からのPBMC中のヒトT細胞（CD45＋/CD3＋集団中のCD4＋細胞およびCD8＋細胞）のフローサイトメトリー解析を表す。図4Kは、PD-L1発現ありまたはPD-L1発現なしのwHILOを移植した後の、MLD-STZ誘導性糖尿病Hu-PBMC-NSGマウスにおけるランダム摂食血中グルコースレベルのグラフである（n＝6匹および6匹）。図4Lは、図4Kに記載したマウスにおける血清ヒトc-ペプチドレベルのグラフである。図4Mは、PD-L1発現ありおよびPD-L1発現なしのwHILOを移植した27日後に腎被膜移植片から回収されたインスリン発現細胞およびヒトCD45＋免疫細胞のフローサイトメトリー解析を表す。図4Nは、図4Mに示す解析の結果を定量化したドットプロットグラフである。（エラーバーは±SEMを表す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001。） 図5A～図5Kは、免疫寛容がエピジェネティックメモリーによって誘導されることを示すグラフおよび模式図である。図5Aは、IFNγ処理（10ng/ml、12時間）後にインスリン発現に基づいてフローサイトメトリーによって選別された島（wHILO）細胞（それぞれGFP＋およびGFP-）におけるPD-L1発現を示すグラフである。GFP＋細胞はβ様細胞を含み、GFP-細胞はアルファ（α）、デルタ（δ）、およびイプシロン（ε）細胞を含む。図5Bは、単回IFNγ処理（10ng/ml、2時間）後のwHILOにおける時間的PD-L1発現を示すグラフである。図5Cは、wHILOのIFNγ（10ng/ml）パルス処理（MPS処理）を図示する概略図である。図5Dは、最後の処理の7日後に、表示のサイクル数のIFNγ処理によって誘導されたPD-L1発現を示すグラフである。図5Eは、表示のIFNγ（10ng/ml）処理の1日後および7日後のPD-L1タンパク質レベルのグラフである。PD-L1を過剰発現するwHILO（PDL1OE）とIFNγへの単回12時間ばく露を陽性対照として使用した。図5Fは、3mMグルコース（G3）または20mMグルコース（G20）に応答して起こるIFNγ処理wHILOからのヒトc-ペプチド分泌を示すドットプロットである。図5Gは、β細胞脱分化を誘導するためのIL-1β処理負荷（10ng/mlで24時間）と組み合わされたIFNγ処理を図示する概略図である。図5Hは、wHILOの表示のIFNγ処理およびIL-1β処理（10ng/ml、24時間）後のINS発現およびUCN3発現を示すグラフである。図5Iは、誘導性糖尿病動物へのwHILOのインビボ移植に関する実験プロトコールの概略図である。図5Cに示すIFNγ処理プロトコールに供したまたは供していないwHILOをストレプトゾシン（HD-STZ、180mg/kg）誘導性糖尿病C57BL6Jマウスに移植した（n＝6および6、500wHILO/マウス）。図5Jは、wHILOおよびIFNγパルス刺激wHILO（「免疫回避性wHILO」または「wHILOie」）の腎被膜移植後、17日目の、レシピエントマウス（STZ処置（180mg/kg）糖尿病C57BL6Jマウス）における血中グルコースレベルを示すグラフである。図5Kは、図5Iに記載するように処置したマウスにおける血清ヒトc-ペプチドレベルを示すグラフである。エラーバーは±SEMを表す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01。 図6A～図6Fは、本明細書に記載する多細胞スフェロイド（multicellular spheroid:MCS）に関する画像、グラフおよび結果である。図6Aは、多細胞スフェロイドの3Dジェランガム懸濁液（MCS、上）、単一MCS（左下）およびhislet（右下）の光学顕微鏡像を示す。図6Bは、MCSにおける、インスリンプロモーターが駆動するGPF発現と内皮細胞（EC、mCherry発現でマーキング）の画像である。図6Cは、マトリックスゲルシステムにおいて内皮増殖培地で培養されたMCSにおける血管様構造の漸進的発生を示す画像である。図6Dは単一細胞RNA-seq解析に関する概略図である。図6Eは、図2Dからのヒト島細胞クラスターにおける上位10種類のシグネチャー遺伝子の発現のヒートマップである。図6Fは、ヒト島におけるシグネチャーホルモン遺伝子および細胞タイプ特異的遺伝子のt-SNE＿2単一細胞発現を示すプロットである。相対的発現尺度:低（0.5、最も弱い）～高（5、最も強い）。 図7A～図7Fは、成熟HILOの特徴決定に関する概略図、グラフ、画像およびデータである。図7Aは、hiPSCにおける、ヒトインスリンプロモーターが駆動するGFP発現のための、CRISPR-Cas9に基づくノックインの図である。図7Bは、インスリン-GFP発現およびUCN3-RFP発現を示すwHILOの微分干渉コントラスト（differential interference contrast:DIC）像である（スケールバー、100μm）。図7Cは、0日目のhiPSCスフェロイド（白丸）、HILO（ビヒクル/PBS処理、黒三角）、wHILO（Wnt4処理、黒丸）およびヒト島（白丸）の細胞外酸性化速度（extracellular acidification rate:ECAR）のSeahorse解析を表す。20mMグルコース（Glu）、オリゴマイシン（Olig）、Fccp、アンチマイシン＋ロテノン（Ant＋Rot）を順番に処理した。図7D-1は、経時的な3mMグルコース、20mMグルコース、20mMグルコース＋100mM GLP-1、3mMグルコースおよび3mMグルコース＋20mM KClへのHILOの段階的ばく露に応答して起こるWNT4処理HILOからのヒトc-ペプチド分泌のカイネティクスを示すグラフである。図7D-2は、β-カテニン分解を促進するためのXAV939処理（XAV939、1μMで3日間）を行ったおよび行っていないwHILOからのグルコース刺激ヒトc-ペプチド分泌を示す棒グラフである。図7Eは、WNT4処理後にアクセシビリティが向上しているクロマチン領域におけるモチーフ濃縮を図示するデータを表す。図7Fは、PBSまたはWNT4で7日間処理されたHILOから選別されたインスリン発現細胞におけるERRγ標的遺伝子でのクロマチンアクセシビリティ（ATAC-Seqによって決定されたもの）を図示している（変化倍率＞1.5）。 図8A～8Hは、WNT4が媒介するインスリン-GFP発現およびWNT4が駆動する代謝の成熟化に関する結果を示す画像、グラフ、概略図およびダイアグラムである。図8Aは、PBS処理HILOおよびWNT4処理HILOにおける、MitoTracker（赤）染色によって示されるミトコンドリア含量の代表的画像である（スケールバー、100μm）。図8Bは、組換えヒトWNT4（rhWNT4）、WNT5A（rhWNT5A）または対照線維芽細胞もしくはWNT5A過剰発現線維芽細胞からの調整培地（CM）で処理されたHILOにおけるインスリン発現（GFP）およびミトコンドリア含量のフローサイトメトリー定量のグラフである（n＝3）。エラーバーは±SEMを表す。＊p＜0.05。図8Cは、HILOにおけるWNT4処理（26日目から33日目まで100ng/ml WNT4）によって誘導される転写変化の遺伝子オントロジーを表す。図8Dは、500のwHILOもしくはhisletの移植（TP）またはシャム手術を3日目に行った後のSTZ誘導性糖尿病NOD-SCIDマウスにおける血中グルコースレベルを示すグラフである（n＝7、wHILO;n＝6、hislet;n＝3、シャム）。エラーバーは±SEMを表す。＊p＜0.05。図8Eは、GFP＋細胞においてWNT4が誘導するクロマチンアクセシビリティの増大とHILO遺伝子発現の増大との重なりを示すベン図（上）と、交差遺伝子セットが濃縮されている遺伝子オントロジー経路を表す。図8Fは、図8Eに示す交差遺伝子セットが濃縮されているモチーフを表す。図8Gおよび図8Hは、WTマウスおよびβ細胞特異的ERRγKOマウスからの出生後の島（P11～14日目）を、rhWNT4（100ng/ml）ありまたはなしで＞5日間培養した実験の結果を示している。図8Gは、qPCRによって測定される相対的遺伝子発現を示し、図8Hは、3mMグルコースおよび20mMグルコースに応答して起こるインスリン分泌を示している。＊p＜0.05、＊＊＊p＜0.001。図8Gおよび図8Hについては、WTマウスおよびβ細胞特異的ERRγKOマウスからの出生後の島（P11～14日目）を、rhWNT4（100ng/ml）ありまたはなしで＞5日間培養した。 図9A～図9Mは、wHILOの免疫蛍光特性解析、HILOのフローサイトメトリー解析およびwHILOの単一細胞解析を示す顕微鏡（共焦点）像、プロット、ヒートマップおよびグラフである。図9AB、図9Cおよび図9Dは、C-ペプチドに関して染色されたwHILOの共焦点像である。図9Aは、wHILO中のグルカゴン、ソマトスタチンおよび膵ポリペプチド（PP）に関する代表的免疫蛍光染色結果を表す。図9Bは、C-ペプチドについて染色されたwHILOの共焦点像である。図9Cは、β細胞濃縮マーカー（β cell enriched marker）NKX2-2、NKX6-1、MAFA、MAFB、PDX1について染色されたwHILOの共焦点像である。画像は3回の独立した実験を代表している。図9Dは、内分泌マーカーであるクロモグラニンA（CHGA）、シナプトフィジン（赤、中央の画像）について染色されたwHILOの共焦点像とインスリン-GFP（緑、左側の画像）視覚化である。ヘキスト（Hoechst）核染色を右側（マージ）の図に示す。スケールバー、100μm。画像は3回の独立した実験を代表している。図9Eは、WNT4処理ありおよびWNT4処理なしのHILOにおけるβ細胞および内分泌マーカー共染色に関する代表的フローサイトメトリー結果を表す。図9Fは、図9Eに提示した結果の定量化のグラフ表示である（n＝6および6）。図9Gは、WNT4処理HILO（wHILO、n＝4840）からの単一細胞トランスクリプトームのtSNEクラスタリングを表す。図9Hおよび図9Iは、wHILO中のINS、CHGA、SOX9、HES1のバイオリンプロット（9H）および単一細胞発現（9I）を表す。図9Jは、tSNEクラスタリング上に重ね合わされたβ細胞濃縮遺伝子（β cell-enriched gene）（INS、PDX1、NKX6-1、NKX2-2、NEUROD1、NPTX2、ITGA1、PCSK1、MAFA、MAFB、UCN3、CHGA）、α細胞濃縮遺伝子（α cell-enriched gene）（GCG、ARX）、およびδ細胞濃縮遺伝子（δ cell-enriched gene）（SST、RBP4）の発現を示す。図9Kは、各細胞クラスターにおける上位10種類の差次的発現遺伝子のヒートマップである。図9Lは、細胞タイプに従ってtSNEクラスターを表す（Panc P＝膵臓前駆細胞、Rep＝複製、UK＝未知）。図9Mは、混合HILOおよびwHILO単一細胞データセットのtSNEクラスタリング（右）およびクラスタリング解析によって画定された細胞タイプを表す。 図10A～図10Cは、scRNA-seqの品質解析を示すプロットである。図10Aは、HILO、wHILO、およびヒト島での検出された遺伝子の数とUMIの数の相関を図示するプロットである。図10Bは、合わせたwHILO（青いドット、n＝4840）およびヒト島（赤いドット、n＝3245）単一細胞トランスクリプトーム（左）のtSNEクラスタリングならびにクラスタリング解析によって画定された細胞タイプ（左）を表す。図10Cは、wHILOおよびhisletについてマージされた単一細胞データセットのtSNE視覚化における内分泌特異的遺伝子（INS、NKX2-2、GCG、SST、PPY）、導管マーカー（KRT19）および星細胞（stellate cell）マーカー（ACTA2）発現を表す。 図11A～図11Dは、プレートベースのscRNA-seq分析に関する模式図、グラフおよびプロットである。図11Aは、プレートベースのscRNA-seqのスキームである。wHILOからの解離された単一細胞をFACSによって96ウェル組織培養プレート（マイクロプレート）に選別した。図11Bおよび図11C: 細胞1個あたりの平均遺伝子カウントを示す箱ひげ図（図11B）および高品質遺伝子検出を伴う45個の単一細胞の同定（図11C）。図11Dは、単一細胞RNA-seqにより、wHILO中の単一ホルモン発現インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン細胞が明らかになったことを図示している。 図12A～図12Fは、β細胞およびHILOにおけるPD-L1の遺伝子発現およびタンパク質発現に関するグラフおよび画像を提供する。図12Aは、（左）ヒト島細胞（β細胞の輪郭が描かれている）におけるPD-L1のtSNE内因性発現、および（右）PD-L1＋β細胞とPD-L1-β細胞の間の上位差次的発現遺伝子のヒートマップを表す。図12Bは、wHILOにおけるレンチウイルスが駆動するPD-L1発現とインスリンプロモーターが駆動するGFP発現の免疫組織化学結果のオーバーラップを表す（スケールバー、100μm）。図12Cは、qPCRによって測定した、レンチウイルスPD-L1過剰発現を有するwHILOおよび有しないwHILOにおける、ヒトPD-L1発現（左）およびヒトインスリン発現（右）を表す棒グラフである。図12D（上）は、誘導性糖尿病C57BL6Jマウスにおいて行われたインビボ実験研究の模式図である。高用量ストレプトゾトシン（HD-STZ、180mg/kg）誘導性糖尿病C57BL6Jマウスに、PD-L1過剰発現ありおよびPD-L1過剰発現なしのwHILO（n＝500）またはマウス島を移植した。図12D（下）は、STZ誘導性糖尿病マウスの腎被膜にPD-L1過剰発現wHILOを移植した後の結果を示している。図12Eは、表示したIFNγ刺激の12時間後のwHILOにおけるPD-L1発現を示す棒グラフである。エラーバーは±SEMを表す。＊＊＊p＜0.001。図12Fは、INFγ（ng/ml）刺激の12時間後のヒト島におけるPD-L1遺伝子発現を示す棒グラフである。エラーバーは±SEMを表す。＊＊＊p＜0.001。 成熟免疫回避性wHILO（wHILOie）を生成させるための戦略の模式図である。 図14A～図14Dは、wHILOにおけるIFNγ誘導性変化を調べる研究に関するベン図、ヒートマップ、遺伝子オントロジーチャートおよびブラウザトラックである。図14Aは、wHILOの急性IFNγ処理（10ng/mlで12時間）および多重パルス刺激（MPS）IFNγ処理（3日にわたり10ng/mlで2時間）後に差次的に調節される遺伝子のベン図である。この図では、左端の円が「MPS IFNγ処理」を表し、右端の円は「急性IFNγ処理」を表す。図14Bは、急性IFNγ刺激およびMPS IFNγ刺激後の差次的発現遺伝子のヒートマップである。MPSによる持続可能なPD-L1遺伝子発現が強調されている。図14Cは、MPS-IFNγ処理後（上）および急性IFNγ処理後（下）に選択的に調節される遺伝子の遺伝子オントロジーを示す。図14Dは、MPS法における最後のIFNγ処理の7日後、または急性IFNγ刺激の12時間後の、wHILOにおける選択された遺伝子におけるクロマチンアクセシビリティを示すブラウザトラックのパネルである。 図15A～図15Cは、強化された内因性PD-L1発現によるwHILOの免疫回避性を示す研究に関する概略図、グラフおよびフローサイトメトリープロットである。図15Aは、免疫正常糖尿病動物モデルを作出するためのHu-PBMC-NSGマウスの多重低用量ストレプトゾトシン処置（MLD-STZ、50mg/kg/日で5日間）を伴う処置レジメンの概略図である。MPS誘導性PD-L1発現wHILO（n＝500）を腎被膜下に移植した。図15Bは、MPSを受けたまたは受けていないwHILOを移植した後のSTZ誘導性糖尿病Hu-PBMC-NSGマウス（それぞれn＝6匹）におけるランダム摂食血中グルコースレベルのグラフである。wHILO（-）データは図4Kおよび図4Gから複写されている。というのも、これらの実験は並行して行われたからである。図15Cは、MPSありまたはMPSなしのwHILOを移植した27日後に腎被膜移植片から回収されたインスリン発現細胞およびヒト免疫（CD45＋）細胞のフローサイトメトリー解析を表す。エラーバーは±SEMを表す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001。
態様の詳細な説明
本明細書では、幹細胞由来のヒト島およびヒト島様オルガノイドを生成しかつ用いるための方法およびシステムを取り上げる。これは、膵臓疾患や、内因性インスリン産生β細胞の喪失が引き起こす疾患であるインスリン依存性糖尿病などの疾患および病態を治療的に処置するための有望な戦略になる。有利なことに、記載する方法およびシステムは、患者の処置に現在使用されているドナー適合死体ヒト島の不足を緩和することができる治療法として、生物由来物質、例えば細胞、ヒト島様オルガノイド、およびその細胞を生成させることができる。
本明細書に記載するとおり、機能的なヒト島様オルガノイド（HILO）が、誘導多能性幹細胞（iPSC）などのヒト多能性幹細胞から生成される。ある態様では、非古典的WNT4シグナリングを可能にする培養システムが、HILOを生成させるために使用される。理論に束縛されることは望まないが、iPSCなどの細胞、ヒト島およびHILO細胞におけるWNT4シグナリングは、頑健なグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）にとって必要な代謝の成熟化を駆動する。本明細書に記載する幹細胞由来の島およびHILOは機能的成熟を果たし、WNT4-ERR（Estrogen-Related Receptor:エストロゲン関連受容体）代謝経路によって調節される、強化されたグルコース応答性酸化能による頑健なグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を呈する。機能的に成熟したHILOは、移植後に糖尿病NOD-SCIDマウスにおけるグルコースホメオスタシスを迅速に再建する内分泌様細胞タイプを含有する（例えば実施例4および実施例5）。本明細書に記載するように、ある態様では、HILOおよびその細胞が、免疫正常条件下で、免疫細胞による拒絶を避ける。
ある局面では、機能的HILOおよびヒト死体島の単一細胞RNA（scRNA）シーケンシング解析により、免疫回避性β細胞の小集団を含むHILO由来細胞の転写不均一性が明らかになった。本明細書におけるある局面で記載するように、HILOは、免疫回避性β細胞の転写プログラムを模倣するために、PD-L1などのチェックポイントタンパク質を発現するよう、分子的に改変された。PD-L1発現HILOを評価したところ、PD-L1発現は、1型糖尿病を持つ免疫正常マウスに移植されたHILOの自己免疫拒絶を克服したことがわかった。したがって、免疫検出、自己免疫活性化、および移植または埋植の拒絶を避けることができる機能的β細胞およびHILOのスケーラブルな生成は、糖尿病、特に1型糖尿病および後期2型糖尿病のための有利で有益な処置および治療法を与える。ある態様において、β細胞、ヒトHILOおよびヒト島は、PD-L1などのチェックポイントタンパク質を発現するように、分子的に改変（例えば形質導入またはトランスフェクト）される。ある態様では、β細胞、ヒトHILOおよびヒト島を、本明細書に記載するとおり、PD-L1タンパク質を発現するように誘導する。
島、オルガノイド、およびそれらの中の細胞を免疫監視機構ならびに免疫細胞による殺滅およびクリアランスから保護する方法
ある局面では、とりわけレシピエント個体などの対象への移植、埋植、または移入の後に、生残し、細胞死が低減しており、かつ/または免疫系の細胞による免疫検出をより良く回避することができる、島およびオルガノイドを、それらの中の細胞（例えばドナー細胞、島細胞、およびオルガノイド細胞）を含めて、生成させるための方法、特にインビトロ法またはエクスビボ法が提供される。ある態様では、本明細書記載の方法を実施した後の、生残し、免疫細胞、例えばT細胞、B細胞、単球、マクロファージなどによる殺滅および検出が低減する、同種異系の細胞、島、および/またはオルガノイドが、移植、埋植または移入に関わる。
ある局面において、IFNγ受容体を発現する島、オルガノイド（例えばHILO）、もしくは細胞（例えばHILOのβ細胞）における、またはIFNγ受容体を発現する島、オルガノイド（例えばHILO）、もしくは細胞（例えばHILOのβ細胞）による、チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子および/またはそれがコードする産物、特にPD-L1および/またはPD-L1タンパク質の発現（またはアップレギュレートされた発現）によって、所与の期間（例えば少なくとも24時間）でのインターフェロンγ（IFNγ）への複数回の間欠的ばく露後に、HILOが、例えば免疫正常糖尿病マウスにおけるグルコースホメオスタシスを、長期間にわたって、例えば少なくとも50日にわたって、維持すること、ならびに活性化T細胞による免疫応答および/または移植片拒絶を回避することが可能になる。ある態様において、島、オルガノイド、または細胞は、ヒトの島、オルガノイド、または細胞である。複数の態様において、そのような島、オルガノイド、または細胞はIFNγ受容体を発現し、かつ/またはIFNγによる処理に対して応答性である。ある態様において、島、オルガノイド、または細胞は、IFNγ受容体を天然に発現する。ある態様において、IFNγ受容体は、島、オルガノイド、または細胞に、例えば限定するわけではないが、当技術分野において公知であり実施されている組換え技法、ウイルス技法または分子生物学的技法などによって導入しうる。ある態様において、IFNγ受容体を発現する島、オルガノイドおよび細胞におけるPD-L1遺伝子および/またはPD-L1タンパク質の発現（またはアップレギュレートされた発現）は、IFNγばく露に対する島、オルガノイドおよび細胞の応答を示す検出可能なマーカーを構成する。島、オルガノイドおよび細胞をIFNγにばく露した後のIFNγ応答性のマーカーとしてのPD-L1の発現またはPD-L1のアップレギュレートされた発現は、当技術分野において日常的に使用されており公知であるポリヌクレオチド検出方法および/またはタンパク質検出方法によってアッセイすることができるが、それらに限定しようとするものではない。
複数の態様において、本方法は、少量または低用量の、例えば0.5～100ng/ml、1～50ng/ml、1～25ng/ml、1～20ng/ml、1～10ng/ml、10ng/ml、または20ng/mlのインターフェロンγ（IFNγ）で、細胞を刺激する工程を含む。ある態様において、これは、島、オルガノイド、および/または細胞、例えばHILOを、所与の期間の間に、離散した期間にわたって、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、もしくは15時間、またはそれ以上にわたって、特に約2時間もしくは約12時間または2時間もしくは12時間にわたって、例えば複数回、例えば2回、3回、4回、5回、6回、またはそれ以上、IFNγにさらすことによって達成される。いくつかの態様では、少なくとも24時間（約1日）、48時間もしくは72時間の間に、または4、5、6、7、8、9、もしくは10日間の間に、複数回のばく露またはパルスが行われる。いくつかの態様では、細胞が、合計0.5～3時間、0.5～4時間、0.5～5時間、0.5～6時間、0.5～7時間または0.5～10時間にわたって、IFNγにばく露される。IFNγばく露同士の間またはIFNγパルス同士の間は、例えば培養培地または3Dマトリックス中、IFNγへのばく露期間同士の間IFNγの非存在下で、細胞を「休止」させておく。いくつかの態様では、IFNγへのばく露同士の間は、少なくとも約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間にわたって、細胞をIFNγの非存在下で「休止」させておく。他の態様では、約1、2、3、4、または5日にわたって、細胞をIFNγの非存在下で「休止」させておく。一態様では、IFNγ処理が、島、オルガノイドおよび/または細胞、例えばHILOにおけるPD-L1発現の構成的（長期間にわたる）アップレギュレーションならびに発現（および維持）を引き起こす。この手順は、多重パルス刺激（MPS）を伴い、これを、細胞、島、オルガノイド、例えばHILOまたは島およびその中の細胞の、IFNγへの間欠的ばく露ともいう。細胞、島、および/またはオルガノイドによるPD-L1の発現は、MPS後、長時間持続し、島、オルガノイド、および/または細胞（例えばHILO）が、IFNγのパルス1回あたり2時間または約2時間にわたって、少なくとも3回のパルスまたはIFNγ（例えば10ng/ml）への間欠的ばく露を受ける場合は、特にそうである。例えばこのレジメンにより、島、オルガノイド、および/または細胞、例えばHILOには、島、オルガノイド、および/または細胞、例えばHILOをMPS手順に供した後、少なくとも7日にわたって、PD-L1の持続的発現が認められる。ある態様において、本方法によって生成される島、オルガノイド（例えばHILO）、または細胞は、移植、埋植、または移入の後に、レシピエント対象において、少なくとも約50日または少なくとも50日にわたって生残する。
理論に束縛されることを望んでいるわけでも意図しているわけでもないが、MPS IFNγばく露手順は、島、オルガノイド、および/または細胞（例えばHILOおよびその中の細胞（例えばβ細胞））におけるPD-L1発現（またはPD-L1発現のアップレギュレーション）をもたらし、これには転写記憶の機序が関わる。細胞、島、および/またはオルガノイドのMPS IFNγばく露を含む記載の手順は、細胞、島、および/またはオルガノイドの脱分化が抑制または遮断される細胞内シグナリングカスケードを刺激または作出しうる。本方法において細胞、島、またはオルガノイドがばく露されるIFNγの短いパルス（MPS IFNγ）は、最終的には、クロマチン構造の変化を伴い、それによって、細胞、島、またはオルガノイドを脱分化から保護し、MPS IFNγにばく露された細胞、島、またはオルガノイドに、（例えば免疫系の細胞による細胞死の低減によって）生残し、炎症性のサイトカインおよびケモカイン、例えば後述のインターロイキン-1B（IL-1B）の効果を免れる能力を与えることで、細胞、島またはオルガノイドに抗炎症性効果を提供する。記載の方法によって生成されるMPS IFNγにばく露された細胞、島またはオルガノイドに付随する炎症の不在または低減は、対象への移植、埋植、または移入の後のそれらの生残能および免疫細胞による殺滅の低減を強化しうる。こうして記載の方法は、対象への移植、埋植、または移入の後の生残が改良されていてそれらの機能性を保つドナー細胞、ドナー島、およびドナーオルガノイドを生成させ、治療法としてのそれらの使用にいくつかの有益な利点を提供する。
特定の態様では、生残し、細胞死が低減しており、かつ免疫検出または自己免疫をより良く回避することができる、ヒト島、オルガノイド（例えばHILO）、およびさまざまな初代細胞または（異なる系列の）分化細胞を生成させるための方法が提供され、該方法は、（a）ヒト島、オルガノイド（例えばHILO）、または細胞を、予め決められた時点において1時間超にわたって、インターフェロンγ（IFNγ）と接触させる工程;所与の期間中、例えば72時間または約72時間の期間中に、工程（a）を少なくとも約2回繰り返す工程を含み、IFNγとの接触時間同士の間はヒト島、オルガノイド（例えばHILO）、または細胞がIFNγの非存在下で維持され、かつ工程（a）および工程（b）によって、ヒト島、オルガノイド（例えばHILO）、または細胞におけるPD-L1の持続的発現が誘導される。本方法のある態様では、ヒト島、オルガノイド（例えばHILO）、または細胞を、工程（a）において、少なくとも約1時間もしくは少なくとも1時間、または少なくとも約2時間もしくは少なくとも2時間、または約2時間超もしくは2時間超の期間にわたって、IFNγと接触させる。本方法の特定の態様では、ヒト島、オルガノイド（例えばHILO）、または細胞を、工程（a）において、約2時間もしくは2時間、または約12時間もしくは12時間の期間にわたって、IFNγと接触させる。本方法の別の特定の態様では、工程（a）は、所与の期間中、例えば72時間または約72時間の期間中に3回繰り返され、各回が少なくとも約2時間または少なくとも2時間にわたる。本方法の別の態様では、工程（a）と工程（b）の間で、IFNγの存在を除去するためにヒト島、オルガノイド（例えばHILO）、または細胞が洗浄される。本方法の別の態様において、IFNγは1～25ng/mlの量で使用される。本方法の別の態様において、IFNγは10ng/mlの量で使用される。本方法の別の態様では、ヒト島、オルガノイド（例えばHILO）、または細胞におけるPD-L1発現が、工程（b）後に、7日超または約7日超の期間にわたって維持される。ある態様において、本方法は、免疫系による破壊またはクリアランスから保護されるヒト死体島（例えば同系または同種異系）を生成させる。
別の特定の局面では、生残し、細胞死が低減しており、かつ/または免疫検出または自己免疫を回避する、ヒトの細胞、島、またはオルガノイドを含むさまざまな細胞、島、またはオルガノイド（例えばHILO）を生成させる方法が提供され、該方法は、（a）細胞、ヒト島、またはオルガノイド（例えばHILO）を、所与の期間中、例えば24時間または約24時間の期間中の第1の時点において1時間超にわたって、約1ng/ml～25ng/mlの量のインターフェロンγ（IFNγ）と接触させる工程、および（b）細胞、ヒト島、またはHILOを、工程（a）後の後続する期間中、例えば48時間の期間中の少なくとも2つの追加の時点において、約0.5時間もしくはそれ以上もしくは0.5時間もしくはそれ以上または約1時間もしくは1時間を超える時間にわたって、約1ng/ml～25ng/mlの量のIFNγと接触させる工程を含み、IFNγと接触させること同士の間は島またはオルガノイド（例えばHILO）を洗浄してIFNγの非存在下の培地中で休止させ、かつ工程（a）および工程（b）によって、島またはオルガノイド（例えばHILO）におけるPD-L1の持続的発現が誘導される。本方法の特定の態様では、工程（a）および工程（b）において、細胞、島、またはオルガノイド（例えばHILO）を、10ng/mlの量のIFNγと、少なくとも2時間にわたって接触させる。本方法の別の特定の態様では、細胞、島、またはオルガノイド（例えばHILO）を、72時間の期間中の少なくとも3つの時点（異なる時点）において少なくとも約2時間または少なくとも2時間にわたって、IFNγと接触させる。
IFNγ受容体を発現する島、オルガノイドおよび細胞の免疫回避のための上述の方法の実施は、疾患、障害および病態の治療法および治療的処置として、ある対象から別の対象への移植、埋植または移入に使用されるそのような島、オルガノイドおよび細胞、特にヒトの細胞、島、およびオルガノイドに利益を与える。記載の方法の実施は、移植、埋植または移入された島、オルガノイド、または細胞がレシピエントにおいて数日間、もしくは数週間、またはそれ以上にわたって、例えば約2日もしくはそれ以上または1、2、3、4週間、もしくはそれ以上にわたって、維持され機能的であるように、レシピエント対象（例えば養子レシピエント、移植レシピエントなど）に移植、埋植または移入された島、オルガノイドおよび細胞の免疫保護および強化された生残を提供する。
本明細書に記載する方法およびシステムは、例えばレシピエント対象への移植、埋植、投与、または移入の後に免疫保護を提供するために、さまざまな細胞および細胞タイプ、または異なる系列に由来する移植用ドナー細胞、特にIFNγ受容体発現細胞、ならびに島およびオルガノイドでの使用に適している。一般に、非限定的な例として、さまざまな系統およびタイプの幹細胞、初代細胞、分化細胞、または異なる供給源の細胞に由来する一タイプの細胞を、使用しうる。複数の態様において、IFNγ受容体を発現しかつ/またはIFNγによる処置に対して応答性であるような適切な細胞を、上述の方法に従って使用しうる。記載の方法におけるIFNγ処理に対する応答性は、IFNγ受容体を発現する細胞、島、またはオルガノイド（およびその中の細胞）によるPD-L1またはPD-L1タンパク質の検出可能な発現についてアッセイすることによって、決定または同定しうる。
具体的な、ただし限定ではない例として、IFNγ MPSによる持続的PD-L1発現の誘導を含む本明細書記載の方法は、限定するわけではないが以下に挙げるものを含む、さまざまな細胞および細胞タイプ、または移植用ドナー細胞での使用に適しうるまたは適用可能でありうる:心臓細胞、結腸細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、肝臓細胞（肝細胞）、胃腸細胞、胃部（胃）細胞、肺細胞、卵巣細胞、子宮頸部細胞、子宮細胞、精巣細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、筋細胞、造血細胞、免疫細胞（B細胞、T細胞）、網膜細胞、角膜細胞、脳細胞、キメラ抗原受容体-T細胞（CAR-T細胞）、骨髄細胞、例えば単核球、ニューロン、神経細胞、ヒト皮膚細胞由来のインスリン産生膵臓β細胞（例えばLi,K.et al.,2014,Cell Stem Cell,14（2）:228-236によって報告されているもの）;臍帯血（UCB）細胞、脂肪由来間葉系間質（幹）細胞、心臓幹細胞、結腸幹細胞、腎臓幹細胞、肝臓（肝細胞）幹細胞、胃腸幹細胞、胃部（胃）幹細胞、肺幹細胞、膵臓幹細胞、膵臓β幹細胞、筋幹細胞、造血幹細胞、免疫細胞（T細胞またはB細胞）幹細胞、骨髄幹細胞、CD133＋幹細胞、CD34＋造血細胞、CD34＋幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、網膜幹細胞、神経幹細胞など、ならびにそのような細胞から生成されるまたはそのような細胞を含有する島およびオルガノイド。例えば、以下のタイプのオルガノイドは、本方法における使用に適している:当技術分野記載の手順を使って産生されうる、または市販の、例えばStemcell（商標）Technology（マサチューセッツ州ケンブリッジ）の、腸オルガノイド、肝オルガノイド、神経オルガノイド、肺オルガノイド。
他の適切な細胞は、例えば外胚葉由来細胞、例えば神経細胞、ドーパミン作動性神経細胞（例えばabm（ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）から市販されている不死化ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞（LUHMES））;角膜由来の細胞（例えばLifeLine Cell Technology（カリフォルニア州オーシャンサイド）から市販されている正常ヒト角膜上皮細胞）;内胚葉由来細胞、例えば肝臓細胞（例えばDefiniGEN（英国ケンブリッジ）から市販されているヒト肝細胞野生型）;ならびに中胚葉由来細胞、例えば筋細胞、骨髄細胞、腎臓細胞、および骨格筋細胞（例えばCook MyoSite（登録商標）（ペンシルベニア州ピッツバーグ）から市販されているヒト骨格筋細胞（skMDC））など、さまざまな分化細胞タイプを生じる胚性幹細胞に由来するものである。記載の方法において使用しうるβ細胞（例えば膵臓β細胞の特徴/機能を有するもの）または島の非限定的な例は、例えばWO 2016/100898、WO 2016/100909、WO 2016/100921、WO 2016/100925、WO 2016/100930、WO 2014/145625に見いだしうる。
したがって、本明細書で取り上げて記載する方法、システム、および組成物は、細胞、組織、およびオルガノイドによるPD-L1などのチェックポイントタンパク質の持続的発現と、その結果としてそれらが獲得する、例えば移植片対宿主反応で起こるような免疫監視機構および免疫系の細胞による破壊の回避およびそれらからの保護に基づいて、それを必要とする対象への例えば移植、埋植、注入などによる投与後に、長時間持続する生存能および機能的活性を呈する細胞、組織、およびオルガノイドを生成させるのに役立ち、そのために適用することができる。
特定の局面において、本明細書で取り上げて記載する方法、システム、および組成物は、移植または埋植の後に免疫検出を回避することができる、インビトロのスケーラブルな、機能的で血管新生化されたオルガノイド、特にヒト膵臓または膵島オルガノイド（HILO）を生成させるのに役立つ。ある態様では、ジェランガムを含有する三次元マトリックス中で、免疫チェックポイントタンパク質を発現するiPSC由来β様細胞を、ヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）およびヒト臍帯静脈内皮細胞（Huvec）と共に培養すると、機能的な膵臓オルガノイドおよび膵島オルガノイドが生成されることも提供される。
記載の方法に従って生成させたHILOは、血管新生化され、かつグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）などの機能的性質を呈した。最近の研究により、ヒト多能性幹細胞（PSC）からグルコース応答性インスリン産生β様細胞を生成させうることは報告されているが、本明細書では、有利なことに、栄養素に応答してインスリン、グルカゴンおよびソマトスタチンを分泌し、かなりの期間にわたって免疫検出および免疫系の細胞による移植片拒絶または移植拒絶もしくは埋植拒絶を回避する能力を有する、PSCからの機能的で血管新生化された膵島オルガノイドの生成が提供される。
本明細書に記載するとおり、ヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）、HUVEC、およびヒトiPSC由来β様細胞の自己組織化機能は、機能的血管系を形成する能力を持つグルコース応答性インスリン分泌島様オルガノイドのインビトロ生成を可能にする。加えて、ジェランガムベースの3D培養システムの使用によって、島様オルガノイド産生のスケーリングにも成功する。ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼレポーターを使ってインスリン分泌を測定することにより、hiPSC由来島様オルガノイドの機能的不均一性を特徴決定した。理論に束縛されるものではないが、本明細書における結果は、チェックポイントタンパク質を発現するヒト島様オルガノイド（HILO）が、糖尿病の有益な治療的処置および臓器不全の新しい処置を提供しうると共に、薬物スクリーニング、ゲノム編集、ならびに器官形成および糖尿病の病理発生のモデリングのためのプラットホームを提供しうることを示唆している。
免疫チェックポイントタンパク質
免疫ホメオスタシスを維持することは宿主の生存にとって不可欠である。病原体に対する、または変異し、修飾されもしくは過剰発現した自己抗原に対する、あからさまなまたは制御されない免疫応答は、炎症性組織損傷および自己免疫疾患を引き起こす場合がある。これを防ぐために、免疫応答の幅と強さは、共刺激シグナルと抑制シグナルの間のバランスによって調節されている。これらのシグナルは、免疫チェックポイントと総称されており、これらは自己寛容を維持し、対象を組織損傷から保護するために必要である。
活性化T細胞は免疫エフェクター機能の一次メディエーターであり、そういうものとして、例えばリンパ球活性化遺伝子3（LAG-3）、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）および細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）などといった複数の共抑制性受容体を発現する。これらの免疫チェックポイント分子は、慢性感染および腫瘍抗原に対するT細胞応答だけでなく、「自己」タンパク質に対するT細胞応答もモジュレートすることが示されている。注目すべきことに、これらのチェックポイントタンパク質を利用する経路はユニークで、非冗長的であり、よって、免疫ホメオスタシスの調節における免疫チェックポイントの重要な役割を反映している。
前記のように、免疫チェックポイントタンパク質」または「免疫チェックポイント分子」または単に「チェックポイントタンパク質またはチェックポイント分子」とは、免疫系を調節し、多くの場合、例えば細胞の刺激、アネルギーまたはアポトーシスなどといった所与の効果を引き起こしうるリガンド（コグネイトリガンド）に結合するまたはそれらと相互作用する、タンパク質または分子である。ある態様において、免疫チェックポイントタンパク質は、免疫細胞の膜表面上のコグネイトリガンド（例えば受容体リガンド）、例えばT細胞表面受容体に結合するものである。ある具体的態様において、免疫チェックポイントタンパク質はPD-L1またはその結合部分であり、PD-L1のコグネイトリガンドは、例えばT細胞の表面に発現するPD-1である。ある態様において、チェックポイントタンパク質はそのタンパク質の細胞外ドメインである。
ある局面において、チェックポイントタンパク質は、T細胞などの免疫細胞上のチェックポイントタンパク質受容体であることもできるそのコグネイトリガンドに結合し、そのコグネイトリガンドまたは受容体を発現する細胞のシグナリング、活性または機能を遮断または中断する。あるいは、免疫チェックポイント阻害剤、例えば抗体およびチェックポイントタンパク質への結合を保っている抗体のフラグメントは、免疫細胞（例えばエフェクターT細胞）上のチェックポイントタンパク質に結合して、その細胞のシグナリング、活性または機能を遮断または中断することができる。細胞上に発現したチェックポイントタンパク質へのチェックポイントタンパク質阻害剤の結合は、チェックポイントタンパク質を発現する細胞の正常な活性の不活化を引き起こしうる。複数の態様において、チェックポイントタンパク質阻害剤は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体などの抗体、またはチェックポイントタンパク質（コグネイトリガンド）に結合するそれらのフラグメントである。
細胞、iPSC、β細胞など、またはオルガノイド、例えばHILOおよび本明細書記載の他のオルガノイドにおいて発現されうる免疫チェックポイントタンパク質またはそのコグネイトリガンド結合部分の非限定的な例としては、PD-1、プログラム細胞死タンパク質1、PD-1のコグネイト結合リガンドであるPD-L1、プログラム細胞死リガンド1;同じくPD-1に結合するPD-L2、プログラム細胞死リガンド2;CTLA-4（細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4、CD152とも呼ばれる）;LAG-3、リンパ球活性化遺伝子3タンパク質;KIR、キラー細胞免疫グロブリン様受容体;IDO1、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1;4-1BB、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（CD137としても公知）;4-1BBL（4-1BBに結合する）;GITR、「グルココルチコイド誘導性TNFRファミリー関連遺伝子;TIM-3,「T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン」;OX40、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4,（CD134としても公知）;OX40L（OX40に結合する）、CD40、CD40L、A2AR、アデノシンA2A受容体;B7-H3（CD276とも呼ばれている）;B7-H4（VTCN1とも呼ばれている）;B7-1/B7-2;BTLA（CD272とも呼ばれている）;VISTA、「T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー」などが挙げられる。
複数の態様において、免疫チェックポイントタンパク質分子は、限定するわけではないが、T細胞によって発現されるPD-1に結合する、PD-L1またはPD-L1の細胞外ドメインである。ある態様では、チェックポイントタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターまたは細菌ベクターを細胞に感染させることなどにより、1種類のチェックポイントタンパク質または1種類もしくは複数種のチェックポイントタンパク質を発現するように細胞を分子的に改変するために、免疫チェックポイントタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いる。いくつかの態様では、細胞（例えばβ細胞またはHILO細胞）が、2種類以上の免疫チェックポイントタンパク質またはそのリガンド結合部分を発現する。いくつかの態様において、細胞は、その細胞によって発現される1種類または2種類以上の免疫チェックポイントタンパク質またはそのリガンド結合部分を含有するように、分子的に改変される。ある態様では、1種類もしくは複数種類の免疫チェックポイントタンパク質またはそのリガンド結合部分をコードする1種類または複数種類のポリヌクレオチドを含有するウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルスベクター、または2種類以上のウイルスベクターを、当技術分野において周知の手順および方法を使って、細胞に感染させる。ある態様では、当技術分野において周知の手順および方法を使って、1種類もしくは複数種類の免疫チェックポイントタンパク質またはそのリガンド結合部分をコードする1種類または複数種類のポリヌクレオチドを含有するプラスミドベクターまたは2種類以上のプラスミドベクターで細胞を形質転換するか、または該プラスミドベクターを細胞にトランスフェクトする。
PD-1、プログラム死1（PD-1）タンパク質は、活性化T細胞ならびにB細胞、抗原提示細胞（APC）およびナチュラルキラー細胞（NK細胞）によって発現され、免疫抑制を媒介する、重要な免疫チェックポイントタンパク質（受容体タンパク質）である。PD-1は、主に、PD-L1を発現するように分子的に改変された細胞および例えば腫瘍細胞、間質細胞またはその両方などといった他の細胞によって発現される免疫抑制性PD-1リガンドPD-L1（B7-H1）およびPD-L2にT細胞が遭遇しうる末梢組織において、機能する。理論に束縛されるものではないが、具体的で非限定的な例として、移植され、埋植されまたは生着したベータ（β）細胞、オルガノイド細胞、例えば本明細書記載のHILO細胞によって発現されるPD-L1は、エフェクターT細胞によって発現されるPD-1に結合し、よって、β細胞、オルガノイド細胞、またはHILO細胞に向けられるT細胞応答を効果的に抑制し、自己免疫を弱めまたは遮断し、β細胞、オルガノイド細胞またはHILOに対する免疫応答を不活化するように、正常なT細胞応答を媒介する。ある態様においてβ細胞、オルガノイド細胞またはHILOは免疫チェックポイントタンパク質をインサイチューで、移植物、埋植物または移植片の限局された領域において発現する。それゆえに、自己免疫を回避する細胞およびHILOの能力は移植物、埋植物または移植片の限局された領域内とその周囲において発生し、その結果、レシピエント対象における免疫細胞活性のモジュレーションがより広範囲または全身に及ぶリスクは低くなる。
膵臓
いくつかの局面では、膵臓オルガノイド、または本明細書においてヒト島様オルガノイドもしくはHILOとも呼ぶ膵島オルガノイドが提供される。膵臓は、腹部にあって内分泌機能および外分泌機能を有する臓器である。膵臓のうち内分泌を担う部分は「膵島」（ランゲルハンス島としても公知）と呼ばれる細胞クラスターである。膵臓の内分泌物は、グルコース代謝および血中グルコース濃度を調節するホルモンを含む。島には、グルカゴン（血中グルコース濃度を増加させるホルモン）を分泌するα細胞、インスリン（血中グルコース濃度を減少させるホルモン）を分泌するβ細胞、ソマトスタチン（α細胞およびβ細胞を調節するホルモン）を分泌するδ細胞、ならびに吸いポリペプチドを分泌するγ細胞という、4種類の主要細胞タイプが存在する。
膵臓のうち外分泌を担う部分は、外分泌成分（exocrine component）と呼ばれる。外分泌膵臓分泌物は、小腸に排出されて糖質、タンパク質および脂質の分解を助ける消化酵素を含有する。外分泌成分は膵腺房と呼ばれるクラスターに配置された導管を有する。膵臓外分泌物は腺房の内腔に分泌され、分泌物が蓄積して膵導管および十二指腸に排出される。
本明細書に記載する膵島オルガノイド、膵臓オルガノイドおよびHILOは、それぞれ膵島および膵臓の構造を模倣している。いくつかの態様において、膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドは、以下の細胞のうちの任意の1つまたは複数を含有する:iPSC由来β様細胞、iPSC由来α様細胞、iPSC由来δ様細胞、およびiPSC由来導管様細胞。いくつかの態様において、膵臓オルガノイドはiPSC由来の外分泌成分を含有する。いくつかの態様において、iPSCはヒトiPSC（hiPSC）である。ヒト胚性幹細胞およびヒト誘導多能性幹細胞は市販されている（例えばWiCellは、iPS（IMR-90）-1、iPS（IMR-90）-4およびiPS（包皮）-1を提供している）。ヒト誘導多能性幹細胞は、当技術分野において公知の方法を使って、さまざまな体細胞タイプから生成させることもできる（Yu,J.,K.Hu,et al.（2009）「Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences」Science,324（5928）:797-801）。
本明細書に記載する膵島オルガノイド、膵臓オルガノイドおよびHILOは、膵島および膵臓の機能も呈する。ある特定の態様において、膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドは、以下の機能の任意の1つまたは複数を呈する:グルコース刺激インスリン分泌（GSIS）、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌およびグルカゴン分泌。いくつかの態様において、膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドは、転写因子Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6、およびFoxa2のうちの任意の1つまたは複数を発現する。いくつかの態様において、HILOは、免疫検出および免疫系の細胞による破壊をHILOが回避することを可能にするように機能するチェックポイントタンパク質またはその機能的部分を発現する。いくつかの態様において、HILOは、2タイプ以上のチェックポイントタンパク質もしくはチェックポイント分子またはその機能的部分を発現する。
膵臓オルガノイドおよび膵島オルガノイドの生成
他の局面では、膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイドを生成させる方法が記載される。最近の研究により、グルコース応答性インスリン産生β様細胞を生成させることは可能であるものの、栄養素に応答してインスリン、グルカゴンおよびソマトスタチンを分泌する能力を有する膵島を生成させようとする努力、および幹細胞から血管新生化を達成しようとする努力は成功していないことが示されている。本明細書には、ヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒトiPSC由来β様細胞の自己組織化機能を使用すれば、機能的血管新生化能を有するグルコース応答性インスリン分泌島様オルガノイド（HILO）がインビトロでうまく生成されることを実証する結果を記載する。さらに、ジェランガムベースの3D培養システムを使って、島様オルガノイド生成方法をスケールアップすることにも成功した。インスリン分泌を測定するためにガウシアルシフェラーゼレポーターを使用することにより、hiPSC由来ヒト島様オルガノイドにおける機能的不均一性も調べた。
機能的ヒト臓器の生成は、薬物スクリーニング、疾患モデリングおよびエンドポイント臓器不全の抑制または防止における、新しい治療戦略を提供する。ヒト胚性幹細胞（hESC）およびヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）からインスリン産生β様細胞への効率のよい段階的分化方法は実証されている。例えばD’AmourらとKroon E.らは、4～5ヶ月のインビボ成熟化後にグルコースに応答してインスリンを分泌することができるインスリン産生細胞へのhESCの効率のよい分化を報告した（D’Amour et al.,2006,Nature Biotechnology,24,1392-1401、Kroon et al.,2008,Nature Biotechnology,26,443-452）。最近、RezaniaらとPagliucaらは、末端（terminal）β細胞マーカーMAFAおよびNkx6-1を発現し部分的な機能性（例えばインスリン分泌）を呈する成熟ヒトβ様細胞の形成を誘導するインビトロ分化方法を報告した（Rezania et al.,2014,Nature Biotechnology,32（11）:1121-33、Pagliuca et al.,2014,Cell,159,428-439）。しかし、死体ヒト島とは対照的に、これらのβ様細胞は、数ヶ月にわたるインビボでの機能的な成熟化を必要とし、他の膵島細胞タイプによって提供される機能性、例えばα細胞（グルカゴン分泌）およびδ細胞（ソマトスタチン分泌）による血糖管理を欠いていた。さらに、これらのβ様細胞は、ヒト島が本来有する間葉および血管新生化された内皮細胞を、どちらも欠いていた。hPSC由来β様細胞とヒト島の間のこれらの決定的相違は、インスリン依存性糖尿病（例えば1型糖尿病または後期2型糖尿病）を処置するhPSCベースの治療法の能力を損ないうる。
新生仔から成体へのβ細胞の成熟化中に代謝遷移が起こり、そこでは、オーファン核内受容体であるエストロゲン関連受容体γ（ERRγ）が完全に機能的なβ細胞にとって必要な酸化的代謝の増大を調節することは、以前に突きとめられた。この結果と合致して、インスリン、MAFA、およびNkx6-1を発現するヒトiPSC由来のβ様細胞は、ERRγの過剰発現によってそれらの酸化的代謝を増大させ、それによって、それらのグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）機能性を強化することで、代謝的に成熟させることができる。これらの結果から、完全に機能的なβ細胞を生成させるには、PDX1、MAFA、Nkx6-1、およびインスリンなどの系列決定因子の発現に加えて、β細胞の代謝を成熟させるさらなる細胞シグナリングが必要であることが示された（図13）。
初期膵臓器官形成中、新たに特定化された膵臓細胞は、前腸内胚葉シートを起源とし、すぐに血管新生化する凝縮された組織塊である膵臓原基を形成する。同様の経過が肝臓器官形成でも観察されている。そのような大規模な形態変化は、血液灌流前の内胚葉上皮前駆体と間葉前駆体と内皮前駆体との間でのシグナルの精緻な統合に依存する。Takebeらは、肝内胚葉細胞を内皮系列および間葉系列と共に培養することにより、インビボで迅速に血管新生化し機能的に成熟する肝臓器官原基を生成させることに成功した（Takebe et al.,2013,Nature,499:481-484）。
先行研究では、成熟した、機能的で、血管新生化された膵臓オルガノイドなどの他のオルガノイド組織タイプをインビトロで生成させることの可能性は、明らかにならなかった。さらに先行研究では、スケールアップ産生に使用するには効率的でないMATRIGEL（登録商標）マトリックスを使ってオルガノイドを生成させたので、スケーラビリティの欠如が示された。
本明細書には、ヒト島に見られるようにインスリンを分泌することができ、血管新生化されると共に、1種類または複数種類の免疫チェックポイントタンパク質を発現し、よって、監視免疫細胞、例えばT細胞による自己免疫または免疫検出を回避する能力をHILOに与える、ヒト島様オルガノイド（HILO）の大規模生成の成功を実証する研究を記載する。本明細書では、（1）ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（hADSC）が自己組織化能を有すること（図1Aおよび図1B）、（2）後期膵臓前駆体が、HUVECおよびhADSCと共培養した場合に、β様細胞に匹敵する効率で、島様クラスター（器官原基）を形成する能力を有すること（図1A～図1C、図1Eおよび図3A～図3C）、（3）ヒト島様オルガノイドでは、系列決定因子の発現およびERRγを含む代謝制御遺伝子の発現が改良されていたこと、（4）島インスリン分泌アッセイにより、ヒト島様オルガノイドは、グルコースに応答してインスリンを分泌する能力を有する機能的細胞を含有することが明らかになったこと（例えば実施例8）、（5）ヒト島様オルガノイド（HILO）が血管新生化を呈したこと（図6C）、（6）本明細書記載のhiPSC由来のヒト島様オルガノイドが、ヒト島器官形成ならびに1型糖尿病および2型糖尿病の病理発生を、ディッシュ中で再現したこと、（7）本明細書記載のhiPSC由来のヒト島様オルガノイドが、1型糖尿病および2型糖尿病を処置するためのヒト島移植用に、新しい代替可能な供給源を提供したこと、（8）1型糖尿病のSTZ誘導性NOD SCIDマウスモデルに移植されたヒト島様オルガノイドが、レシピエント動物における1型糖尿病を改善したこと（図1Fおよび図1G）、ならびに（9）Wnt4およびWnt5aが、HILOにおけるミトコンドリアに富むβ細胞の数を増加させ（図8A～図8D）、したがって（それぞれ膵臓の内分泌細胞と支持細胞に由来する）Wnt4とWnt5aはどちらも、ミトコンドリアの代謝機能を強化することでβ細胞の成熟化と持続可能なGSIS機能を促進することが示唆されたことが、実証される。
本明細書には、ヒト島に見られるようにインスリンを分泌する能力を有し、血管新生化される、発生中のヒト島様オルガノイドにおいて、ある特定のWnt（本明細書では「WNT」とも書く）タンパク質の役割を評価した研究も記載する。WNT遺伝子ファミリーは、発がんおよびいくつかの発生プロセス、例えば胚発生中の細胞運命とパターン形成の調節に関係づけられた、分泌型シグナリングタンパク質をコードする構造的に関連する遺伝子からなる。Wntタンパク質は、さまざまな細胞生物学的プロセスおよび発生プロセスを統合しそれらに影響を及ぼす大きなシグナリング分子ファミリーを含む。Wntタンパク質は、いくつかの高度に専門化したプロセシング酵素が関与する一連の複雑な翻訳後修飾を受ける。細胞から放出されると、Wntタンパク質は細胞外環境においていくつかの分子、例えばグリカン、タンパク質結合パートナー（例えばWIF、Sfrp）および細胞表面受容体と相互作用する（Willert,K.et al.,2012,Cold Spring Harbor,Perspectives in Biology,2012）。本明細書に記載の研究から、Wnt5aは、hADSCの自己組織化を誘導する主要なWntタンパク質であり、（2）Wnt5aおよびWnt4は、ERRγミトコンドリア代謝経路を活性化し、（3）Wnt4は、hADSCおよびHUVECなどの追加の細胞タイプの非存在下で、hiPSC由来島様オルガノイドの機能的な成熟化をインビトロで誘導するのに十分である。
免疫検出を回避する成熟HILOの生成
インビボでβ細胞は長い出生後成熟化プロセスを経て機能的に成熟した状態になる。今のところ、このプロセスをインビトロで再現することによって、ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）を、完全に機能的なβ細胞に形質転換させることは、成功していない。そのうえ、hiPSCに由来するβ細胞が患者と免疫的に適合しているとしても、β細胞が患者に、特に一般に免疫系の反応性が過剰な1型糖尿病患者に、移植された後に、移植拒絶から保護するには、生涯にわたる免疫抑制が依然として必要となりうる。したがって、1種類または複数種類のチェックポイント分子を発現することによって免疫拒絶に抵抗するユニバーサルPSCの生成は極めて有益である。それにより、多額の費用がかかる個別化治療が回避されるからである。
器官形成および臓器特異的細胞タイプの最終分化には、自己組織化三次元（3D）組織アーキテクチャが必要である。本明細書に記載するように、ヒト膵島組織を含む3D構造のオルガノイドを生成させた。機能的なβ細胞の産生には、発生中の島内での細胞の多様性とhiPSCからの島の機能分化に影響を及ぼしうる細胞相互作用とが必要である。
本明細書に記載するように、hiPSCからのヒト島様オルガノイド（HILO）のスケーラブルな生成方法が提供される。本方法では、機能的な成熟化の強化をもたらす分化経路を利用し、結果として生じるHILOに免疫回避機能を付与する。有利なことに、記載の方法は、磁気スピナーなどの機器または気液界面の使用を必要としないので、簡略化された再現性の高い手順がもたらされる。このシステムのスケーラビリティが、成熟HILOの大規模産生と小規模産生をどちらも可能にする。膵島機能のすべての局面を再現するには、組織の成熟が極めて重要である。hiPSC由来の膵臓前駆体またはβ様細胞はインビボでは数ヶ月以内に生理的レベルのインスリンを分泌する機能的な成熟化に達するので、インビトロ分化β様細胞は完全に機能的な成熟β様細胞になる能力を有する。
本明細書に記載する、hiPSCから島様オルガノイドを生成させるためのスケーラブルなプロセスは、細胞の機能的な成熟化のための効果的なシグナルと、細胞の不均一性とを含む。ある局面では、ベータ（β）細胞（インスリン）、アルファ（α）細胞（グルカゴン）、デルタ（δ）細胞（ソマトスタチン）、ガンマ（γ）細胞（PPY）、およびε細胞（グレリン（GHRL））を含む重要な膵島細胞タイプを含有する3D構造のヒト島様オルガノイド（HILO）を生成させるために、機能的なポリマーベースの3次元（3D）培養システムと、非古典的Wnt（例えばWnt4）シグナリングの活性化とが提供される。
成熟ヒト島様オルガノイド（HILO）を生成させるためのスケーラブルな3Dシステムでは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化（OxPhos）機能を実現するために非古典的Wnt経路が刺激され、本明細書記載の機能的インスリン分泌は、糖尿病などの疾患を処置するための医学的に有用な治療用生体材料を提供する。本明細書に記載するように、幹細胞由来の成熟した島またはHILOは免疫チェックポイント分子を発現することができるので、それらは同種異系免疫拒絶を回避する能力を有し、したがって、インスリン依存性糖尿病の、免疫抑制薬に頼ることのない根本的治療法になる。そのようなHILOは、患者特異的な島または自家島の代わりに、ユニバーサルな（同種異系）膵島として役立ち、インスリン依存性糖尿病の処置における治療用生体材料の入手可能性の向上とコスト低減につながりうる。
本明細書に記載するように、移植または埋植されたwHILOに対する宿主免疫応答を最小限に抑える能力について、IFNγ経路を評価した。IFNγ刺激へのwHILOの短いばく露後に、IFNγはwHILOにおけるPD-L1発現を迅速かつ頑健に誘導することがわかった（図12Eおよび図12F）。注目すべきことに、IFNγは、インスリン発現細胞とインスリン非発現細胞（それぞれGFP＋細胞およびGFP-細胞）の両方におけるレベルと類似するレベルまで、PD-L1発現を誘導した（図5Aおよび図5B）。IFNγ（IFNγ刺激）へのHILOの反復ばく露は、wHILOにおいて類似する効果、特にHILOにおけるPD-L1の持続的誘導を引き起こした。ある局面において、IFNγへの反復短時間ばく露（多重パルス刺激、MPS）は、持続的PD-L1発現と、それに伴うPD-L1タンパク質レベルの増加につながった（図5C、図5Dおよび図5E）。複数の態様では、ヒト島またはHILO、例えば成熟した島またはHILOを、少なくとも0.5～5時間、少なくとも1～5時間、少なくとも1～3時間、少なくとも1～2.5時間または少なくとも1～2時間にわたって、IFNγにばく露する（接触させる）。特定の態様では、ヒト島またはHILO、例えば成熟した島またはHILOを、1時間超、2時間超、1時間、2時間、または3時間にわたって、IFNγにばく露した後で（接触させた後で）、島またはHILOを洗浄し、かつIFNγを含まない培地中でそれらを休止させる。複数の態様において、IFNγへのヒト島またはHILOの各ばく露は「パルス」と呼ばれる。複数の態様では、ヒト島またはHILOを、IFNγパルス同士の間は約24時間にわたって（例えばIFNγを含まない培地またはマトリックスにおいて）細胞を回復させる1日または数日の（例えば72時間もしくはそれ以上の期間にわたる）プロトコールで、少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回など、または1、2、3、4もしくは5回、IFNγにばく露するか、IFNγと接触させるか、またはIFNγでパルス処理する。特定の態様では、島またはHILOにおいて構成的PD-L1発現レベルを達成するために、ヒト島またはHILOを、3日（72時間）の間に、1パルスあたり2時間にわたって、IFNγで3回パルス処理する。このIFNγ MPSレジメン後に、IFNγで刺激されたヒト島またはHILOは、MPSの7日後に高レベルのPD-L1タンパク質発現を示した。複数の態様では、ヒト島またはHILOを、1～100ng/ml、1～50ng/ml、1～25ng/ml、1～20ng/ml、1～10ng/ml、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30ng/mlの量のIFNγにばく露する（接触させるかまたはパルス処理する）。特定の態様において、IFNγの量は、各ばく露期間またはパルス期間につき10ng/mlまたは20ng/mlである。特定の態様では、成熟したヒト島または成熟したHILOを含むヒト島またはHILOを、2日間で、1パルスあたり2時間にわたって、2回のIFNγパルスにばく露するか、接触させるか、またはパルス処理する。特定の態様では、成熟したヒト島または成熟したHILOを含むヒト島またはHILOを、3日間（3日目）での、1パルスあたり2時間にわたる3回のIFNγパルスにばく露するか、接触させるか、またはパルス処理する。
GSIS機能性は、IFNγによるMPSにwHILOをばく露しても損なわれなかった（図5F）。さらにまた、IFNγで処理したwHILOは、IL-1βが誘導するβ細胞脱分化から保護されることが、β細胞アイデンティティマーカーINSおよびUCN3の発現によって明らかになった（図5H）。
ヒト膵臓の正常な子宮内発生は280日超を要し、完全な機能的成熟化には誕生後数年後まで到達しない。したがって、ヒト島の発生と成熟化に関与する複雑な経路を完全に理解することが、インビトロで機能的な島を生成させるのに必要な一段階である。β細胞の機能的な成熟化にとって極めて重要な一局面は、ミトコンドリア代謝経路の活性化であり、これは天然には出生後成熟化中に起こり、機能的β細胞の栄養感知インスリン分泌機能にとって必要である。HILOの場合、持続可能なミトコンドリア活性化は、Wnt4が駆動するミトコンドリア代謝調節によって達成されうる。
ある局面において、移植されたβ細胞が免疫検出を回避する能力を本明細書に記載するように強化することは、移植された島細胞、膵島、オルガノイドおよびHILOの自己免疫拒絶のリスクを低減するための、MHC適合（A.Morizane et al.,2017,Nature communications,8:385）に代わるまたはそれを補助する戦略になる。幹細胞、島、およびオルガノイドにそれぞれ基づく糖尿病の処置は、移植される細胞、島、およびオルガノイドの機能的成熟に加えて、自己免疫拒絶からのそれらの保護を達成しなければならない。糖尿病免疫正常C57BL/6JマウスにPD-L1陰性成熟HILOを移植した場合、その異種移植片は拒絶され、検出可能な量のヒトc-ペプチドを産生することはできなかった。対照的に、PD-L1を（本明細書に記載するようにオルガノイド細胞におけるPD-L1発現の分子的改変または誘導のどちらかによって）発現する成熟HILOは、免疫正常動物への移植後50日を超えて生残することに成功した（図4D～図4Eおよび図12A～図12C）。そのうえ、免疫寛容の獲得にTregの存在は必要なかった。したがって、ある局面では、成熟HILOを産生するために使用されるゲルベースのシステムにおいてTregを共培養することにより、追加の免疫保護が達成されうる。抗原提示中は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4）とB7分子の間の相互作用およびプログラム死1（PD-1）タンパク質とそのリガンドPD-L1の間の相互作用が、免疫応答を非冗長的に負に調節する。本明細書に記載するように、PD-L1陰性対照HILOは、T細胞およびB細胞正常C57BL6Jマウスによって拒絶されたが、T細胞およびB細胞欠損NOD-SCIDマウスでは拒絶されなかったことから（例えば実施例8）、PD-L1陰性対照成熟HILOの同種異系拒絶は主にインビボでのT細胞反応およびB細胞反応によることが示唆された。
体細胞リプログラミングによるiPSCの生成は、任意の系列に分化させうる患者特異的細胞（例えば自家細胞）の供給源を提供する。そのうえ、iPSCからのインスリン産生細胞の生成は、自家移植のための非常に貴重なツールとなり、それは自己免疫拒絶のリスクを著しく低減すると考えられる。MHC適合移植片の同種異系移植は免疫応答の低減に有効であることが判明しており、有用であるが、この技法では、脳など、免疫原性の低い部位でさえ、免疫系および免疫監視機構の完全な回避は得られない場合もある。したがって、MHC適合と免疫寛容の誘導との組合せは、移植された幹細胞、島、およびオルガノイドに対する免疫応答を制御するためのさらなるアプローチになりうる。場合によっては、そのような手順により、免疫抑制薬の必要を回避しうる。
1型糖尿病患者において進行中の自己免疫は、患者特異的な幹細胞由来の島を移植するか、幹細胞ベースの島細胞補充アプローチを使用した場合でも、依然として免疫原性をもたらしうるので、（アロ反応性と自己反応性の両方を制御するために）同種異系hiPSCを免疫抑制処置または免疫寛容誘発処置と共に使用することは、1型糖尿病患者にとって有益な治療法になる。加えて、免疫監視機構を回避するために1種類または複数種類のチェックポイント阻害分子およびチェックポイントタンパク質の発現を伴う共刺激遮断手順、例えばCTLA4IgおよびPD-L1を発現するヒトの幹細胞、β細胞、島細胞、またはオルガノイド細胞は、糖尿病処置のために対象において移植/埋植を成功させるための臨床的に重要な材料になりうる。移植片/移植物/埋植物の生残を助長するためにPD-L1発現によってHILOを保護することにより、HILO同種移植片は、免疫抑制剤が存在しなくても、低減した免疫細胞浸潤の低減を起こしうる。ただし、医学的に必要であるか望まれる場合に、1種類または複数種類の免疫抑制剤を使用しうることは、理解されるであろう。
処置の方法
島移植は1型糖尿病および後期2型糖尿病などのインスリン欠乏糖尿病を処置するための治療である。したがってある局面では、1型糖尿病または2型糖尿病などの膵臓疾患を処置する方法が提供され、該方法は、膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイド、特に記載のとおりチェックポイントタンパク質を発現するHILOを、対象（例えばヒトまたはヒト患者などの哺乳動物対象）に移植（または埋植）によって投与する工程を含む。ある態様において、本方法では、膵臓疾患（例えば1型糖尿病）、障害またはその症状を患っているか、それらを起こしやすいか、またはそれらを起こすリスクを有する対象が処置される。本方法は、疾患、障害、または症状が処置されるような条件下で、疾患、障害、またはその症状を処置するのに十分な膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイド（HILO）を、哺乳動物に移植する工程を含む。
本明細書において使用される「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、疾患、障害および/またはそれに関連する症状を低減、漸減、改善、抑止、または緩和することを指す。疾患、障害、状態、またはその症状の処置は、該障害、状態、またはそれに関連する症状が完全に取り除かれることを、排除するものではないものの、必要としないことは、理解されるであろう。
本明細書において使用される「防止する」、「防止すること」、「防止」、「予防的処置」などの用語は、障害または状態を有するわけではないが、それを発生しまたは有するリスクがあるか、そうなりやすい対象において、障害または状態が発生する確率を低減することを指す。
治療方法（予防的処置を含む）は一般に、哺乳動物、特にヒトなどといった、それを必要とする対象（例えば動物、哺乳動物、ヒト）への、有効量の膵島または膵島オルガノイド（例えばHILO）の投与、特に移植または埋植を含む。特に、膵島または膵島オルガノイド（例えばHILO）は、1種類または複数種類のチェックポイントタンパク質を発現するように分子的に改変される。ある態様において、チェックポイントタンパク質はPD-L1である。ある態様では、細胞、島、またはオルガノイドが、本明細書記載の方法に従って、インターフェロンγ（IFNγ）への複数回の間欠的ばく露（多重パルス刺激またはMPS）に供される。MPS法は、PD-L1などのチェックポイントタンパク質の発現が対象への移植または投与後、長期間持続する細胞、島、またはオルガノイドを与え、それによって、移植または投与された細胞、島、またはオルガノイドが、自己免疫または免疫検出を避けつつ機能することを可能にする。ある態様において、膵島または膵島オルガノイド（例えばHILO）の投与は、オルガノイドが、他の成分と合わせて、1型糖尿病または2型糖尿病などの膵臓疾患を改善し、提言し、抑止し、漸減しまたは安定化するのに有効な量になる任意の適切な手段によって行われうる。
ある特定の局面では、さらに免疫抑制薬を対象に投与してもよい。免疫抑制薬は、対象へのオルガノイド投与（例えば移植または埋植）の前、間または後に対象に投与することができる。免疫抑制物質は、移植後に、移植されたオルガノイドの拒絶（例えば急性拒絶）を抑制しまたは防止する作用物質、または移植後の免疫抑制を維持する作用物質であることができる。免疫抑制薬としては、バシリジマブ、抗胸腺細胞グロブリン、アレムツズマブ、プレドニゾン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリン、シロリムスおよびタクロリムスが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
いくつかの態様では、少なくとも約100,000、少なくとも約200,000、少なくとも約300,000、少なくとも約400,000、少なくとも約500,000、少なくとも約600,000、少なくとも約700,000、少なくとも約800,000、少なくとも約900,000、または少なくとも約100万個の膵島オルガノイド（HILO）が、対象に移植または埋植される。いくつかの態様では、本発明のオルガノイドを移植または埋植する前に、対象の島が除去される。他のいくつかの態様では、膵島オルガノイド（HILO）が、対象の上腹部への注射によって対象に移植または埋植される。いくつかの態様では、膵島オルガノイド（HILO）が肝臓に注射される。膵島オルガノイドはカテーテルを使って対象に注射することができる。他のいくつかの態様では、膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイド（HILO）が外科手術、例えば移植手術によって対象に投与される。別の態様では、膵島オルガノイド（HILO）が網上に移植される。網移植には、島オルガノイド（またはその細胞）を自家血漿と混合し、腹腔鏡下で網上に積層する、積層技法（layering technique）を使用することができる。次に、組換えトロンビン（1000U/ml）を含有する溶液（20ml）を島オルガノイド上に重層した後、さらにもう一層の自家血漿を重層することで、少なくとも1年間は患者内で生残して機能することができる生分解性の生物学的足場を作る（例えばBaidal,D.et al.,2017,N.Engl.J.Med.,376:19参照）。別の態様では、レシピエントによる免疫応答を軽減するヒドロゲル生体材料を、島オルガノイド移植に使用することができる。（例えばVegas,A.et al.,2016,Nature Biotechnology,34:345-352参照。）
オルガノイド、膵臓オルガノイド、または膵島オルガノイド（例えばHILO）は、好ましくは、本明細書に記載するとおり、1種類または複数種類のチェックポイントタンパク質を発現するように改変されるが、移植されたオルガノイド（例えばHILO）に対する免疫反応は、対象への移植に先だってオルガノイド、膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイド（HILO）をヒドロゲルにカプセル化することにより、対象においてさらに低減されうる。そのような移植方法は、Vegas et al.,2016,Nature Medicine.doi:10.1038/nm.4030、Vegas et al.,2016,Nature Biotechnology,doi:10.1038/nbt.3462に、さらに記載されている。いくつかの態様において、ヒドロゲルは、アルギネートおよびアルギネート誘導体（例えばトリアゾール-チオモルホリンジオキシド）を含有する。アルギネートヒドロゲルの炎症効果または線維化効果を実質的に低減するアルギネートヒドロゲルのさまざまな修飾も同定されている（Vegas et al.,2016,Nature Biotechnology,doi:10.1038/nbt.3462）。したがって他のいくつかの態様において、ヒドロゲルは、対象における移植されたオルガノイドの炎症効果を低減する化学修飾を含有する。
スクリーニングアッセイ
本明細書記載の膵島オルガノイドおよび膵臓オルガノイド（HILO）はインビトロまたはインビボで膵臓の疾患をモデル化するために使用することができる。そのような膵臓疾患モデルは膵臓疾患の処置に有用な薬物を同定することができる。したがって、いくつかの局面において本発明は、モジュレーター、すなわち膵臓疾患、特に2型糖尿病および/または膵がんを処置することができる候補化合物もしくは候補作用物質または試験化合物もしくは試験作用物質（例えばタンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、ペプトイド、ポリヌクレオチド、低分子または他の薬物）を同定するための方法を提供する。一態様において、化合物または作用物質は、本明細書記載の膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイド（HILO）の活性をモジュレートする。
試験化合物または試験作用物質は単独に取得するか、数あるアプローチのいずれかを使って、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法、例えば限定するわけではないが、生物学的ライブラリー;ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有するが新規な非ペプチドバックボーンを有し、酵素分解に抵抗して生物活性を保つ分子のライブラリー、例えばZuckermann,R.N.et al.,1994,J.Med.Chem.,37:2678-85参照;空間的にアドレス可能な（spatially addressable）パラレル固相または液相ライブラリー;デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法;「OBOC（one-bead one-compound）」ライブラリー法;およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法で取得することができる。生物学的ライブラリーアプローチとペプトイドライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子化合物ライブラリーに適用可能である（Lam,1997,Anticancer Drug Des.,12:145）。
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野においては、例えばDeWitt et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:6909、Erb et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:11422、Zuckermann et al.,1994,J.Med.Chem.,37:2678、Cho et al.,1993,Science,261:1303、Carrell et al.,1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,33:2059、Carell et al.,1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,33:2061およびGallop et al.,1994,J.Med.Chem.,37:1233に見いだすことができる。
化合物ライブラリーは、溶液状態で（例えばHoughten,1992,Biotechniques,13:412-421）、またはビーズ上（Lam,1991,Nature,354:82-84）、チップ上（Fodor,1993,Nature,364:555-556）、細菌上（Ladner、米国特許第5,223,409号）、胞子上（Ladner、米国特許第5,223,409号）、プラスミド上（Cull et al.,1992,Proc Natl Acad Sci USA,89:1865-1869）またはファージ上（Scott and Smith,1990,Science,249:386-390、Devlin,1990,Science,249:404-406、Cwirla et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378-6382、Felici,1991,J.Mol.Biol.,222:301-310およびLadner、同上書、前記）に提示することができる。
試験作用物質（すなわち潜在的な阻害剤、アンタゴニスト、アゴニスト）として使用される化学化合物は、商業的供給源から取得するか、容易に入手できる出発材料から当業者に公知の標準的な合成技法および合成方法を使って合成することができる。本明細書記載の方法によって同定された化合物を合成するのに有用な合成化学変換および保護基方法論（保護および脱保護）は、当技術分野において公知であり、例えばR.Larock,1989,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers、T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,2nd ed.,John Wiley and Sons（1991）、L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons（1994）;and L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons（1995）およびその後続版に記載されているものなどが挙げられる。
これらの方法によって包含される化合物中の置換基と可変部の組合せは、安定な化合物の形成をもたらすものに限られる。「安定」という用語は、本明細書において使用される場合、製造が可能であるように十分な安定性を有し、かつ本明細書において詳述する目的（例えば輸送、貯蔵、アッセイ、活性、対象への治療的投与）に役立つように十分な期間にわたってその完全性を保つ化合物を指す。
本明細書に記載の化合物は1つまたは複数の不斉中心を含有することができ、したがってラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として存在することができる。これらの化合物のそのような異性体型はすべて、記載の方法に、明示的に包含される。本明細書記載の化合物は複数の互変異性体型で表すこともでき、それらはすべて本明細書に包含される。化合物はシス-もしくはトランス-またはE-もしくはZ-二重結合異性体型としても存在することができる。そのような化合物のそのような異性体型はすべて明示的に包含される。
試験作用物質、試験分子、および試験化合物は、ペプチド（例えば増殖因子、サイトカイン、受容体リガンド）またはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドなどであることもできる。
スクリーニング方法では、本明細書記載の膵臓オルガノイドおよび膵島オルガノイド（例えばHILO）の生物学的活性を増大または減少させる作用物質が同定される。いくつかの態様では、膵島オルガノイド（例えばHILO）または膵臓オルガノイドにおいて、糖尿病（例えば2型糖尿病）または膵がんなどの膵臓疾患が誘導されまたは模倣される。膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイド（例えばHILO）では、例えばオルガノイドを遊離脂肪酸（FFA）、グルコース、およびサイトカイン（特に高レベルのグルコースおよび/または高レベルのFFA）と接触させることなどによって、2型糖尿病を誘導することができる。ある態様では、ヒト膵がん微小環境をインビトロで作出するために、膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイド（例えばHILO）が、膵がん細胞、星細胞および免疫細胞と共培養される。
いくつかの態様では、オルガノイドを候補作用物質、候補分子または候補化合物と接触させ、生物学的活性、生物学的機能または生物学的事象に対するそれら候補作用物質、候補分子または候補化合物の効果をアッセイする。いくつかの態様において、候補作用物質、候補分子または候補化合物は、食品医薬品局（FDA）によって承認された薬物である。例えば、本スクリーニング方法でアッセイされる膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイド（例えばHILO）の生物学的活性には、インスリン分泌（例えばグルコース刺激インスリン分泌（GSIS））、β細胞アポトーシス、LDHA活性、K（ATP）チャネル活性、ミトコンドリア機能、NDUFA4、ESRRG、KCNK3、もしくはMAFAポリペプチド、またはそれらをコードするポリヌクレオチドのレベルまたは活性、細胞死、細胞増殖、および転移が含まれる。いくつかの態様において、作用物質、分子、または化合物はGSISを増大させる。
他の態様において、膵島細胞、膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイド（例えばHILO）は、2型糖尿病または膵がんなどの膵臓疾患をインビボでモデル化するために、宿主に移植または埋植される。臓器またはオルガノイドを移植または埋植する方法は当技術分野において公知である。宿主は、ラットまたはマウスなど、任意の非ヒト哺乳動物であることができる。
自己免疫および免疫検出を回避するための細胞、島、オルガノイド、膵島細胞、膵臓オルガノイド、または膵島オルガノイド（例えばHILO）におけるチェックポイントタンパク質の発現に加えて、所望であれば、オルガノイド（例えばHILO）をヒドロゲルにカプセル化し、カプセル化されたオルガノイド（例えばHILO）を動物に移植することによって、移植された生体材料、例えばオルガノイド（例えばHILO）に対するレシピエントの免疫反応をさらに低減することができる。そのような移植方法は、Vegas et al.,2016,Nature Medicine,doi:10.1038/nm.4030およびVegas et al.,2016,Nature Biotechnology,doi:10.1038/nbt.3462に記載されている。いくつかの態様において、ヒドロゲルは、アルギネートおよびアルギネート誘導体（例えばトリアゾール-チオモルホリンジオキシド）を含有する。アルギネートヒドロゲルの炎症効果または線維化効果を実質的に低減するアルギネートヒドロゲルのさまざまな修飾も同定されている（Vegas et al.,2016,Nature Biotechnology、同書）。さらに他の態様において、ヒドロゲルは、宿主における移植されたオルガノイドの炎症効果を低減する化学修飾を含有する。
いくつかの態様では、膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイド（例えばHILO）と肝臓オルガノイドが動物に共移植または共埋植される。肝臓は膵がんの転移にとって主要な標的臓器である。マウスでは、ミニ膵臓中およびミニ肝臓中のインビボ内皮細胞が互いにつながって、膵がん転移のための膵臓-肝臓血管系ネットワークを作り出す。それゆえに、膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイド（例えばHILO）と肝臓オルガノイドとが共移植された動物は、ヒト肝臓へのヒト膵がん転移の研究に役立ちうる。いくつかの態様において、共移植されるオルガノイドは、本明細書記載の方法に従って、IFNγへの複数回の間欠的ばく露（MPS手順）に供される。
いくつかの態様において、本明細書記載のオルガノイド（例えばHILO）を移植された動物には、その動物における膵臓疾患を誘導または模倣するために、環境ストレスが与えられる（例えば高脂肪/高グルコース食または膵がん細胞が投与される）。他のいくつかの態様では、疾患（例えば2型糖尿病または膵がん）が導入された動物は、膵島、膵臓オルガノイド、または膵島オルガノイド（例えばHILO）および/または肝臓オルガノイドを移植される。
いくつかの態様では、候補作用物質、候補分子または候補化合物を動物に投与する。ある特定の態様において、候補作用物質、候補分子、または候補化合物は、食品医薬品局（FDA）によって承認された薬物である。いくつかの態様では、動物における表現型（例えば膵臓に関連する生物学的活性もしくは機能、または膵臓疾患などの疾患に関連する活性）に対する候補作用物質、候補分子または候補化合物の効果をアッセイする。例示的な、ただし非限定的な、生物学的活性としては、インスリン分泌（例えばグルコース刺激インスリン分泌（GSIS））、β細胞アポトーシス、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDHA）活性、K（ATP）チャネル活性、ミトコンドリア機能、NDUFA4（シトクロムcオキシダーゼサブユニットNDUFA4）、ESRRGもしくはMAFA（筋腱膜性線維肉腫がん遺伝子ファミリータンパク質A（musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family,protein A））ポリペプチドもしくはそれをコードするポリヌクレオチドのレベルまたは活性、細胞死、細胞増殖および転移のうちの1つまたは複数が挙げられる。いくつかの態様において、候補作用物質、候補分子または候補化合物はGSISを増大させる。
本明細書記載の態様のいずれか1つにおいて、候補作用物質、候補分子、または候補化合物の効果（すなわち膵臓の活性または機能をモジュレートする能力）は、リファレンスまたは対象と比較して測定される。リファレンスは例えば無処理の膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイドであることができる。いくつかの態様において、リファレンスは、本明細書記載のオルガノイド（例えばHILO）を移植された宿主であり、ここで該宿主は、候補作用物質、候補分子、または候補化合物を投与されていない。
本明細書記載の方法において有用な作用物質、分子、または化合物は、所望のマーカー（例えばβ細胞運命マーカーとしてのMAFA）の発現量の増加を同定することによっても検出することができる。発現レベルは、いくつかの方法で、例えば限定するわけではないが、その遺伝子マーカーがコードするmRNAを測定すること、その遺伝子マーカーがコードするタンパク質の量を測定すること、またはその遺伝子マーカーがコードするタンパク質の活性を測定することなどによって、測定することができる。
マーカーに対応するmRNAのレベルは、インサイチュー形式でもインビトロ形式でも決定することができる。限定するわけではないが例えばサザン解析またはノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）解析およびプローブアレイなどのハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイには、単離されたmRNAを使用することができる。あるフォーマットでは、例えば単離されたmRNAをアガロースゲル上で泳動し、そのmRNAをゲルからニトロセルロースなどのメンブレン上に転写することなどによって、mRNA（またはcDNA）を表面に固定化し、プローブと接触させる。代替的フォーマットでは、例えば後述の二次元遺伝子チップアレイなどにおいて、プローブを表面に固定化し、mRNA（またはcDNA）をプローブと接触させる。当業者は、本明細書記載のマーカーがコードするmRNAのレベルの検出に使用するために、公知のmRNA検出方法を適合させることができる。
試料中のmRNAのレベルは、核酸増幅を使って、例えばrtPCR（C.Mullis,1987、米国特許第4,683,202号）、リガーゼ連鎖反応（Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189-193）、自己持続的配列複製法（self-sustained sequence replication）（Guatelli et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1874-1878）、転写増幅システム（transcriptional amplification system）（Kwoh et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173-1177）、Q-βレプリカーゼ（Lizardi et al.,1988,Bio/Technology,6:1197）、ローリングサークル複製（Lizardi et al.、米国特許第5,854,033号）、または他の任意の核酸増幅法と、それに続く当技術分野において公知の技法を使った増幅分子の検出によって、評価することができる。本明細書で使用される増幅プライマーは、遺伝子の5’領域または3’領域（それぞれプラス鎖およびマイナス鎖またはその逆）にアニールすることができ、その間に短い領域を含有することができる、一対の核酸分子と定義される。一般に、増幅プライマーは約10～30ヌクレオチド長であり、約50～200ヌクレオチド長の領域に隣接している。適当な条件下で適当な試薬を使うことにより、そのようなプライマーは、それらプライマーに挟まれたヌクレオチド配列を含む核酸分子（ポリヌクレオチド）の増幅を可能にする。
キット
本明細書記載の免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドもしくは膵島オルガノイドを含有するキット、またはそれを必要とする対象に投与しもしくは移植するための、免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドもしくは膵島オルガノイドと薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含有する薬学的に許容される組成物（治療組成物）を含有するキットも提供される。当業者には理解されるとおり、そのようなキットは、前記治療組成物を含有する滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、バッグ、小袋、または当技術分野において公知の他の適切な容器形態であることができる。容器は、プラスチック製、ガラス製、または生物学的医薬を保持するのに適した他の材料製であることができる。いくつかの態様において、キットは、免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドまたは膵島オルガノイド、その組成物、必要に応じて希釈剤、ビヒクル、または賦形剤、および使用説明書を収納する複数の容器を含みうる。説明書は一般に、膵臓疾患または糖尿病などの疾患を処置するための、免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドもしくは膵島オルガノイドまたはそれらの組成物の使用に関する情報を含むと考えられる。他の態様において、説明書は、以下の少なくとも1つを含む:治療剤（免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドまたは膵島オルガノイド）の説明;疾患の処置または移植のための投薬スケジュールおよび投与;注意;警告;適応症;禁忌症;過量情報;有害反応;動物薬理学;臨床研究;および/または参考文献。説明書は、容器（容器が存在する場合）の上に直接印刷されるか、容器に貼付されるラベルとして印刷されるか、容器に入れてまたは容器と共に供給される別個のシート、パンフレット、カード、またはフォルダーとして印刷されうる。
複数の態様の利点および利用可能性
β細胞の自己免疫破壊の根底には遺伝的因子と環境因子の組合せがあり、外因性インスリンは血糖管理を提供するが、1型糖尿病に関連する長期合併症は引き続き懸念される。したがって、移植に適したβ細胞を生成させることができれば、患者の生活を著しく改良できる可能性がある。死体島細胞移植は治療様式の一つになるが、これに代わる幹細胞ベースのアプローチは、GSIS能を有するβ細胞を大規模に生成させる点で、また移植された細胞を自己免疫および同種異系拒絶から保護する点で、数多くの難題に直面し続けている。後者については、一般に、自己充足型移植デバイス、免疫抑制治療、またはその両方が必要であると考えられる。
本明細書記載の方法およびシステムは、例えば、多能性幹細胞（例えばhiPSC）、幹細胞または胚性幹（ES）細胞のインスリン陽性グルコース感受性β様細胞への分化を体系的に駆動し、グルコース負荷に応答してインスリンを分泌する能力を有する代謝的に成熟した免疫回避性ヒト島様オルガノイド（wHILOie）の生成をもたらす3D培養条件などといった、有用なプロトコールを提供する。さらにまた、これらの機能的に成熟したHILOは、糖尿病免疫正常マウスへの移植後に、グルコースホメオスタシスを迅速に再建する。記載するプロトコールの特徴は、酸化的ミトコンドリア代謝が出生後β細胞成熟化の中心であり、この代謝プログラムにとっては転写因子ERRγが必要かつ十分であったという、本発明者らの発見を推進する。ERRγ発現の誘導にとってもミトコンドリアの酸化的リン酸化の強化にとってもWNT4が強力な成熟化因子であると同定されたことにより、完全合成培地（fully chemically defined medium）におけるwHILOの産生が可能になった（図3Fおよび図3H）。
当業者には理解されるとおり、幹細胞ベースの治療法にとっての難題には、細胞の代謝的および機能的成熟に加えて、移植された細胞の自己免疫拒絶が含まれる。しかし、本明細書において生成され提供される方法、システムおよび生物由来物質は、そのような難題に対する有利な解決策を提供する。例えば、wHILOがNOD-SCIDでは機能性を維持したものの、C57BL6Jマウスではそうでなかったという知見は、T細胞およびB細胞を異種移植片拒絶と関連づけるものである（図3Kおよび図7C）。抗原提示中は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4）とB7分子の間の相互作用およびプログラム細胞死タンパク質1（PD1）受容体とそのリガンドPD-L1の間の相互作用が、免疫応答を非冗長的に負に調節する。本明細書において記載し例証するように、PD-L1を過剰発現するwHILOなどのHILOは、異種移植片拒絶（図4C）および同種異系拒絶（図4K）から保護される。本明細書においてさらに記載し例証するように、ある期間での限定的IFNγ濃度への複数回の反復ばく露（IFNγ MPS処理法）が、細胞（例えばβ細胞）、HILOおよびその中の細胞のGSIS活性を損なうことなく、持続的な内因性PD-L1発現をもたらす方法およびシステムを開発した。注目すべきことに、結果として生じる免疫回避性HILOは、免疫正常マウスでもヒト化糖尿病マウスでも、移植デバイスの非存在下で、グルコースホメオスタシスを維持した。
体細胞リプログラミングによるiPSCの生成は、任意の系列に分化させることが潜在的に可能な、患者特異的同系細胞または自家細胞の供給源を提供する。したがって、自家移植のためにiPSCからインスリン産生細胞を生成させることで、自己免疫拒絶のリスクは劇的に低減するかもしれない。しかし実際面では、製造基準および品質保証を満たし法規則を遵守した自家移植物を生成させるには、多くの費用と時間のかかる手順が必要になる。MHC適合移植片の同種異系移植は免疫応答の低減に有効であることが判明しているが、この技法は、一般に、脳など、免疫原性の低い部位でさえ、免疫系の完全な回避をもたらさない。そのうえ、移植されたインスリン産性細胞が自己反応性T細胞によって破壊される可能性は残る。したがって、本方法と、その結果得られる細胞および産物（例えば免疫回避性のHILOおよび細胞）は、必要に迫られた対象への移植または投与後、かなりの期間にわたって機能（例えばGSIS）および完全性を維持する有益で長時間持続する治療法を提供する。複数の態様では、免疫応答を、最適には免疫抑制薬なしで、管理するために、MHC適合および/または免疫寛容の誘導をさらに使用しうる。
ヒト島様オルガノイド（HILO）を生成させるための有利な方法および培養システム（例えば3D培養システム）を、本明細書における態様において提供し、記載する。本方法およびシステムには、HILOおよびその中の細胞における代謝の成熟化とグルコース感受性インスリン分泌を促進するための非古典的WNTシグナリング、ならびにHILOおよびその中の細胞における内因性PD-L1の持続的発現を駆動するための限定的IFNγばく露、すなわちIFNγによる多重パルス刺激が組み入れられている。免疫検出をかなりの期間（50日またはそれ以上の間）避ける能力を有する機能的免疫回避性HILO、例えばwHILOieを生成させることができれば、それは、現在の死体島使用またはデバイスに依存する技術に代わる実用的選択肢を提供する大きな進歩になる。
本明細書記載の方法およびプロトコールの実施には、別段の表示がある場合を除き、十分に当業者の範囲内である分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法が使用される。そのような技法は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」第2版（Sambrook,1989）とその後続版、「Oligonucleotide Synthesis」（Gait,1984）、「Animal Cell Culture」（Freshney,1987）、「Methods in Enzymology」、「Handbook of Experimental Immunology」（Weir,1996）、「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」（Miller and Calos,1987）、「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubel,1987）、「PCR:The Polymerase Chain Reaction」（Mullis,1994）、「Current Protocols in Immunology」（Coligan,1991）などの文献に詳述されている。これらの技法は、本明細書記載のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本発明を行い実施する際に、考慮され、使用されうる。
特定の態様に特に有用な技法については以下の実施例で論じる。以下の実施例は、記載の製品、アッセイ、手順、スクリーニング、および治療方法を製造し、使用する方法を、当業者に完全に開示し説明するために記載しており、本明細書の記載および開示を限定しようとするものではない。
実施例1:膵臓オルガノイドおよび膵島オルガノイドの生成および特徴決定
動物疾患モデルでは疾患の病理発生について洞察を得ることができるが、動物モデルを用いるスクリーニングによって同定された薬物は、ヒト患者では採用できないことも多い。機能的ヒトオルガノイドの生成は、薬物スクリーニングおよび疾患モデリングにおける新しい治療戦略を提供する。本明細書では、ディッシュ中で3Dヒト膵臓ミニ臓器またはオルガノイド（例えばHILO）を生成させるための技法を記載する。この技法を使用することで、ヒト2型糖尿病などの遺伝子、患者または環境に特異的な疾患において有効な薬物を見いだすために、ヒト2型糖尿病などの疾患をインビトロでモデル化することができる。
β様細胞分化のためのジェランガムベースの3D培養システムの開発
3次元（3D）培養システムが細胞の自己組織化および統合の促進に寄与することは公知である。それゆえに、3D培養システムの土台として、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞外マトリックス成分を含有するMATRIGEL（登録商標）マトリックスがしばしば使用されている。しかしMATRIGEL（登録商標）マトリックスベースの3D培養システムは、その費用とスケールアップが困難なことから、大規模ヒトオルガノイド生成にとって理想的ではない。本明細書では以下に、費用効率が高くスケール変更が容易な、β様細胞分化のためのジェランガムベースの3D培養システムおよび方法を記載する。ある態様では、完全合成段階的分化プロトコール（fully chemically-defined stepwise differentiation protocol）を使用し、ジェランガムベースの3D培養システムにおいて、高い効率および高い再現性で、ヒト多能性細胞（hPSC）をインスリン産生島様球状細胞クラスターに分化させる。単一解離多能性幹細胞（PSC）は、ジェランガム含有STEMCELL（商標）TeSR（商標）培地中で5日以内に、球体を順調に形成した。所定の低分子刺激によるジェランガム含有カスタムTeSR（商標）における分化の15～21日後に、インスリン陽性GFPクラスターが観察された。RNA-seqによるグローバルトランスクリプトーム解析で、hiPSCからPdx1、Nkx6-1、GATA6、およびMAFBを含むβ細胞系列特異的マーカー遺伝子を発現するインスリン陽性細胞への段階的分化が明らかになった。島様細胞クラスターへのhiPSCならびにヒトESC株HuES8およびH1ESの分化は、qPCRによって決定された多能性マーカーNanogの漸進的喪失、β細胞特異的マーカーNkx6-1の誘導ならびに内分泌ホルモンであるインスリン、ソマトスタチンおよびグルカゴンの漸進的誘導によって、さらに確認された。これらの結果は、ジェランガムベースの3D培養システムがhPSCからの大規模島様オルガノイドの生成に適していることを実証している。
インビトロでのスケーラブルなヒト島様オルガノイドの生成
ヒト胚性幹細胞（hESC）またはヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）由来のβ様細胞は、機能性が限定的であり、ヒト島の形態的および機能的特徴を欠いていた。hiPSC由来肝細胞をヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMSC）と共培養するとマトリゲル中で自己組織化3D肝臓原基球体が生成することは、先行研究によって明らかになった（Takebe et al.,2013,Nature,499:481-484）。この研究では、肝臓「オルガノイド」は単離された肝細胞の分化と比較して系列決定因子の発現に優れていること、およびこれらのオルガノイドはインビボで迅速に血管新生化され、機能的に成熟することが見いだされた。
2D分化プロトコール（Yoshihara et al,2016,Cell Metab.23,622-634）を使って生成させたhiPSC由来の膵臓前駆細胞（hiPSC-PP）が、3D MATRIGEL（登録商標）マトリックスにおいて自己組織化しないことは、研究によって見いだされている（例えばWO 2017/205511参照）。これに対し、HUVEC細胞は血管系様構造を迅速に形成し、一方、ヒト脂肪細胞由来幹細胞（hADSC）は3D MATRIGEL（登録商標）マトリックス中で自己組織化した。MATRIGEL（登録商標）マトリックスでは、分散したhADSC細胞が4時間以内に突起を突き出し、12時間以内に布様の包み（wrapper）を形成し、24～48時間以内に球体様構成をとった。さらにまた、自己組織化のための最小細胞密度が突きとめられた（すなわち約2cm2ウェル中のMATRIGEL（登録商標）マトリックス300μlに約10,000～20,000細胞）。RNA-seq解析により、hADSC 3D自己組織化中の動的転写変化が同定されたことから、3D培養条件下での自己組織化能力は、ナイーブhADSCに固有の特徴であることが示唆された。これらの結果から、間葉hADSCは、自己組織化オルガノイドを生成させるためのリソースであると同定される。
膵臓器官形成を探究するために、hiPSC-PP（1×106細胞）細胞をマトリゲルマトリックス中でHUVEC（7×105細胞）およびhADSC（1～2×105細胞）と共培養した（図1Aおよび図1B）。この共培養により、播種の48時間後に肉眼で目視可能な3D細胞クラスターが得られた。さらにまた、GFPレポーターの発現に基づくインスリン発現が播種の5日後に検出され、ヒト島様オルガノイドでは培養時間と共に増大した。加えてHUVECに基づく内皮細胞は、蛍光標識（mCherry）HUVECによって示されるとおり、オルガノイドの内側に統合される。オルガノイド産生にとってMATRIGEL（登録商標）マトリックスの弱みとしては、高コスト、オルガノイド回収の難しさ、スケーリングの制約、およびバッチ間のばらつきが挙げられる。
ジェランガムベースの3D培養を使って形態学的に同一なヒト島様オルガノイドを生成させるための方法は、以下本明細書において、およびWO2017/205511に記載されている。ヒト誘導多能性幹細胞由来の膵臓前駆体（hiPSC-PP）（1×108細胞）を、ジェランガムベースの3D培養培地50ml中で、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）などの間質細胞集団（2～7×106細胞）およびヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）（2～7×106）と共に培養した。hiPSC-PPは、ジェランガムベースの3D培養培地への播種後5日以内に、HUVECおよびhADSCと共に島様球体構成を迅速に形成した。ヒト島様ミニ臓器は播種後5日でヒトインスリンGFPレポーターを発現し、GFP強度は徐々に増大した。この方法に従ってhiPSC-PP、hADSCおよびHUVECを共培養すると、形態学的にヒト島に類似するヒト島様オルガノイドが高い再現性で生成した。加えて、生成したヒト島様オルガノイドは、β様細胞中にインスリン顆粒を含有していた。遺伝子発現解析により、島様オルガノイド中のインスリン発現細胞集団（GFP濃縮（GFP＋））におけるβ細胞運命決定遺伝子（インスリン、Nkx6-1、PCSK1およびUCN3）とミトコンドリア関連代謝遺伝子（Esrrg、Ndufal、Ndufa12、Cox7a2、Atp5b）の発現が、hADSCおよびHUVECとの共培養なしで調製されたものと比較して増大していることが明らかになった。グルコース刺激ヒトc-ペプチド分泌アッセイにより、この方法によって生成した島様オルガノイドは高（20mM）グルコースに応答してヒトc-ペプチドを分泌できることが明らかになった。
インビトロ機能的血管新生化試験を行った。ジェランガム中で生成した島様ミニ臓器を、MATRIGEL（登録商標）マトリックスに移し、内皮増殖培地（endothelial growth media:EGM）中で培養した。緑色蛍光はインスリン遺伝子の発現を示す。EGMによる刺激後24時間～48時間以内に、HUVEC細胞のアウトグロースが観察されたことから、本方法によって生成させたヒト島様オルガノイドは血管構造を形成する能力を保持することが示された。
プロインスリン-NanoLucガウシアルシフェラーゼアッセイシステムを用いる単一島インスリン分泌アッセイの確立
ガウシアルシフェラーゼがプロインスリンのc-ペプチド部分内に配置されているレポーターコンストラクトにより、β細胞機能に影響を及ぼすことなく、インスリン分泌が正確に測定されることは、以前に公表されている（Burns et al.,2015,Cell metabolism,21,126-137）。レンチウイルスシステムを使って、このガウシアルシフェラーゼを安定に発現するINS-1細胞を生成させた。プロインスリン-NanoLucを安定に発現するINS-1細胞からのルシフェラーゼ分泌は、高グルコース（20mM）、高グルコースとエキセンディン4（G20mM＋Ex4）および脱分極剤塩化カリウムによって増大したことから、このレポーターシステムの有用性が確認された。次に、プロインスリン-NanoLucレポーターを一過性に感染させたマウス島またはヒト島におけるインスリン分泌を測定するためのこのレポーターの有用性を評価した。20mM高グルコースに応答して起こるルシフェラーゼ分泌は、一過性に感染させたマウス島およびヒト島の両方で検出された。重要なことに、アッセイ感度は十分に高く、インスリン分泌を単一島のレベルで定量することができた。プロインスリン-NanoLucルシフェラーゼレポーターに基づくインスリン分泌アッセイは、ラットβ細胞株INS-1細胞だけでなく、初代マウスβ細胞およびヒト初代β細胞にも適用できることを、これらの結果は示している（例えばWO 2017/205511参照）。
系列・機能二重レポーターを組み入れたhiPSC細胞およびhESC細胞の樹立
β細胞系列用レポーター（ヒトインスリンレポーター）およびβ細胞機能用レポーター（プロインスリン-NanoLucレポーター）を安定に発現するヒトiPSCおよびhESC、それぞれhiPSChINS-GFP/Sec-LucおよびhESChINS-GFP/Sec-Lucを生成させた。まず、pGreenZeo lenti-reporter（SR10028PA-1、System Bioscience）のヒトインスリンプロモーター配列を、pGreenFire Lenti-Reporterプラスミド（TR019PA-1、System Bioscience）に挿入することによって、ヒトインスリンGFPレポーターのネオマイシン耐性コンストラクトを生成させた（hINS-GFP-EF1a-Neoと名付けた）。hINS-GFP-EF1a-Neoレンチウイルスをスピンフェクション（800g、1時間、37℃）によってhiPSCおよびhESCに感染させた後、新鮮なSTEMCELL（商標）TeSR（商標）培地に培地交換した。最初の感染の3日後に、細胞を、STEMCELL（商標）TeSR（商標）培地中で7日間、100μg/mlのG418で処理した。次に、hINS-GFP-EF1a-Neoを安定に発現する選択されたhiPSC細胞およびhESC細胞に、プロインスリン-NanoLuc（Addgene、プラスミド＃62057）レンチウイルスをスピンフェクション（800g、1時間、37℃）で感染させた後、新鮮なSTEMCELL（商標）TeSR（商標）培地に培地交換した。2回目の感染の3日後に、細胞を、STEMCELL（商標）TeSR（商標）培地中で7日間、5μg/mlのブラスチシシン（blasticysin）および100μg/mlのG418で処理した。次に、細胞をSTEMCELL（商標）TeSR（商標）培地中に維持した。二重レポーターが組み入れられている生成した安定細胞株は、自己複製能および多能性を、インスリン産生β様細胞に分化する能力と共に維持していた（例えばWO 2017/205511参照）。
プールしたヒト島様オルガノイド培養物は、個々のオルガノイドにはさまざまな機能性が見られるにもかかわらず、一貫したインスリン分泌を示す
グルコースに応答してインスリンを分泌する能力を有するインスリン産生β様細胞のhESCおよびhiPSCからの生成は、最近の研究によって報告されている（Pagliuca et al.,2014,Cell,159,428-439、Rezania et al.,2014,Nature Biotechnology,32（11）:1121-33、Russ et al.,2015,EMBO Journal,34:1759-1772）。しかし、グルコースを含む栄養シグナル、アミノ酸、脂肪酸およびGLP-1などのインクレチンに応答してインスリンを適当に分泌することができる完全に機能的なヒト島様クラスターは、まだ実証されていない。今までは、hPSCからのインスリン産生β様細胞、グルカゴン産生α様細胞およびソマトスタチン産生δ様細胞を別々に生成させることに、努力が集中していた。しかしこれらのアプローチは、調節にとって重要な支持細胞、例えば間葉細胞、脂肪細胞および血管系細胞を欠く。島の3D構造はそれらの機能を天然に強化するので、これらの細胞成分が欠落していることは島様細胞クラスターの機能性を損ないうる。加えて、膵島の器官形成にはβ細胞のクローン拡大が必要であることから、島様オルガノイドではこれらの細胞が複数の機能を有しうることが示唆される。この考えを検証するために、単一オルガノイドプロインスリン分泌アッセイを行った。本明細書記載の方法によって生成されるヒト島様オルガノイドは、形態学的にヒト島と同一である。しかし、プロインスリンルシフェラーゼ分泌アッセイで測定すると、個々のヒト島様オルガノイドのグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）能には、ヒト島と比較して有意なばらつきが見られる。プールしたオルガノイド（1アッセイにつき10～100オルガノイド）では一貫したGSIS機能性が実証された。さらにまた、プールしたヒト島様オルガノイドは、GLP-1で共刺激するとGSISの強化を示し、頑健なKCl刺激インスリン分泌も示す。
本明細書において生成されるインビトロ培養iPSC由来ヒト膵島様オルガノイドは、長期間（133日）にわたる培養後も、グルコース、GLP1およびKClに応答する能力を保っていた。
実施例2:機能的膵島オルガノイドの移植は1型糖尿病マウスを救済した
hiPSC由来ヒト島様オルガノイドにおける特異的な機能島マーカー、例えばMAFA、UCN3、ならびにミトコンドリア酸化遺伝子、例えばERRγ（Esrrg）、Ndufa1、Ndufa12、Cox7a2およびAtp5bの発現を、以下の実施例でさらに説明するように観察した。注目すべきことに、これらの島様オルガノイドは、ディッシュ中で、ヒト島の発生と糖尿病の病理発生をどちらも再現する。これらの機能的島様オルガノイドの移植は1型糖尿病マウスを救済し、長期生存、迅速な血管新生化、および免疫拒絶の低減を伴う。
実施例3:iPSC由来島オルガノイドの代謝の成熟化におけるWntタンパク質
Fltp遺伝子およびEsrrg遺伝子は、PBS、WNT3a（500ng/ml）、組換えヒト（rh）WNT4（100ng/ml）またはrhWNT5a（400ng/ml）による5日間の処理後に、iPSC由来島オルガノイド（21日目、hADSCまたはHUVECとの共培養なしで生成させたもの）において、発現することがわかった。支持hADSCまたはHUVECの非存在下で生成させたhiPSC由来島オルガノイドでは、rhWNT4（0、10、25、50、100、200ng/ml）およびrhWNT5a（0、25、50、100、200、400ng/ml）の用量を増加させると、それに応答して、Esrrg遺伝子発現が誘導された。加えて、支持hADSCまたはHUVECの非存在下で生成させたhiPSC由来島オルガノイドでは、rhWNT4（0、10、25、50、100、200ng/ml）およびrhWNT5a（0、25、50、100、200、400ng/ml）の用量を増加させると、それに応答して、酸化的リン酸化に関与するミトコンドリア遺伝子（Cox7a2、Ndufa1、Ndufa7）、乳酸デヒドロゲナーゼ（Ldha）およびFltp（Wnt/平面内細胞極性（PCP）エフェクターおよびレポーター遺伝子）も誘導された。PBSまたはWNT4（100ng/ml）で8日間処理した後のhiPSC由来島オルガノイド（27日目）では、ミトコンドリアレベル（Mitotracker;Mito-Red）およびインスリンレベル（インスリン-GFP）が増加した。PBSまたはWNT4（100ng/ml）による8日間の処理後にヒトiPSC由来島オルガノイド（27日目）が生成した。PBSおよび対照線維芽細胞調整培地（50％）と比較して、rhWNT4（100ng/ml）、rhWNT5a（400ng/ml）またはWNT5a分泌線維芽細胞調整培地（50％）による8日間の処理後に、hiPSC由来島オルガノイド（27日目）にインスリン産生が見いだされた。rhWnt4（100ng/ml）で12日間処理したヒトiPSC（hiPSC）由来島オルガノイド（22日目）は、低グルコース（3mM,「G3mM」）、高グルコース（20mM,「G20mM」）または高KClレベル（20mM,「KCL20mM」）に応答して測定されるそのヒトc-ペプチド分泌に基づいて、機能的な成熟化を示した（例えばWO 2017/205511参照）。
実施例4:機能的なポリマーベースの3D培養システムを使った誘導多能性幹細胞（iPSC）からの機能的ヒト島様オルガノイド（HILO）の生成
幹細胞由来ヒト島はインスリン依存性糖尿病の治療法として期待できる。この実施例では、誘導多能性幹細胞（iPSC）からのヒト島様オルガノイド（HILO）の生成を記載し、頑健なグルコース刺激インスリン分泌に必要な代謝の成熟化段階を非古典的WNT経路の活性化が駆動することを示す。複数の内分泌細胞タイプを含有するこれらの機能的に成熟したHILOは、糖尿病NOD-SCIDマウスに移植されると、グルコースホメオスタシスを維持する。さらにまた、PD-L1の過剰発現により、免疫正常1型糖尿病マウスにおいて少なくとも50日にわたってグルコースホメオスタシスを維持する、免疫回避性で免疫学的に保護されたHILOが生成した。免疫検出を避ける機能的島様オルガノイドをスケーラブルに生成させることができれば、有利で有益な新しい糖尿病の治療法になる。
島移植は、1型糖尿病および後期2型糖尿病に優れた長期血中グルコース管理を与えるが、現在は死体島の入手可能性と品質が制約になっている。インスリン産生β様細胞への誘導多能性幹細胞（iPSC）の分化は、この分野における進歩を象徴しているが、本明細書において提供されるヒトの治療および処置にとって適当な機能的β様細胞を生成させるための方法は、治療法として移植に使用するのに適した生物学的に機能的な細胞およびHILO産物を提供する。
記載のとおり、ERRγが駆動する出生後の代謝の成熟化段階は、β細胞のグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）にとって必要である。加えて、iPSC由来β様細胞におけるERRγ過剰発現は、インビトロ機能性およびインビボ機能性にとって十分である。移植に適した機能的細胞を生成させるために、細胞アーキテクチャおよび島の細胞タイプの複雑性を再現する培養条件を開発した。したがって、膵臓の線維芽細胞および上皮細胞の転写的に類似するモデルとして、ヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）およびヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、3次元（3D）マトリゲル培養で増殖させた場合にそれぞれ臓器様構造および血管構造を形成するというそれらの細胞固有の能力ゆえに使用した（図1A）。3次元の多糖ベースのゲル（ジェランガム）におけるヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）由来内分泌前駆体（EP）の分化中にhADSCおよびHUVECを組み入れることにより、ヒト島に匹敵するサイズの多細胞スフェロイド（MCS）の形成がもたらされた（図1B、図6A～図6F）。これらのMCSは、インスリンプロモーターによって駆動されるGFPの発現およびインスリン顆粒の存在からわかるように、インスリン産生細胞を含有し（図1C）、hADSCの組入れは、液滴様構造中に脂質を含有する細胞の存在によって確認された（図1E）。内分泌前駆体（EP）をhADSCおよびHUVECの非存在下で分化させた場合（IS）と比較して、MCSでは、ERRγならびにミトコンドリア遺伝子NDUFA1およびCOX7A2の発現が増大しており、機能的な代謝の成熟化と合致した（図1D）。MCSは、その機能的な成熟化と合致して、グルコース負荷に応答して改良されたインスリン分泌（c-ペプチド分泌によって測定）を呈した（図1E）。加えて、MCSは、内皮増殖培地で刺激すると血管様構造を発生したことから、拡張されたインビボ機能性の可能性が示唆された（図6C）。実際、腎被膜に移植されたMCSは、STZ誘導性糖尿病NOD-SCIDマウス（糖尿病マウスモデル）においてグルコースホメオスタシスを約40日にわたって維持することができ、ヒト島移植と類似する効力を呈した（図1F）。さらにまた、移植されたMCSはグルコース応答性を保っていて、給餌、絶食および再給餌状況でのインスリン分泌を、c-ペプチドレベルによって示されるとおり、適当に調節した（図1G）（マウスインスリンレベルは＜0.2ng/mlであった。図示せず）。
得られた結果は、肝臓オルガノイドについて以前に示されているように、器官形成における3D多細胞相互作用の役割を裏付けている。細胞固有の自己集合能力を駆動する分子シグナルを理解するために、hADSC単一細胞タイプ3D培養の最初の48時間中に誘導される転写変化を評価した（図2A）。遺伝子オントロジー解析により、変化した転写産物が濃縮されている代謝経路およびサイトカインシグナリング経路ならびにWNTシグナリングが同定された（図2A）。これと合致して、hADSC自己集合中のWNTの時間的発現は、WNT5a発現の一過性の約2倍の増加を明らかにし、それは三次元（3D）培養物において観察された初期細胞間相互作用と同時に起こった（図2B）。
実施例5:非古典的Wnt経路はHILOの酸化的リン酸化および成熟化を可能にするように遺伝子発現を調節する
非古典的WNT経路は非増殖性成熟β細胞のマーカーであり、WNT4発現はマウス島の出生後の機能的な成熟化中に強化される。これらの知見と合致して、ヒト島を使った実験的研究では、WNT4がヒト島において高度に発現していることが見いだされた（図2C）。そのうえ、ヒト島の単一細胞シーケンシングによって、β細胞およびα細胞におけるWNT4の広範な発現が、主として星細胞における、それより制限されたWNT5A発現と共に同定された（図2D、図2E、図2F、図6D～図6F）。非古典的WNTシグナリングがiPSC由来β細胞またはβ様細胞の機能的な成熟化にとって十分であることを実証するために、CRISPR-Cas9ゲノム編集を使って、hiPSC中のインスリンプロモーターの下流にGFPコード配列を挿入することで（図7A）、内因性インスリンプロモーター活性に関するレポーターを生成し、内因性インスリンプロモーター活性を視覚化することができるようにした。次に、これらの改変hiPSCを、内分泌前駆体（EP）成熟化段階においてWNT4を組み入れる完全合成3D培養システム（fully chemically-defined 3D culture system）中で分化させた（図3A）。この最適化された3D分化プロトコールは、インスリンを発現するヒト島様オルガノイド（HILO）の形成をもたらした（図3Aおよび図3B）。加えて、δ（デルタ）細胞ソマトスタチン分泌を調節するためにβ細胞から分泌されるウロコルチン-3の発現は、HILOではインスリンと共局在した（図2B）。電子顕微鏡法でHILOを分析したところ、ヒト島との構造的類似性が、最も注目すべきはHILOにおけるインスリン顆粒およびグルカゴン顆粒の存在によって、明らかになった（図3C）。
比較転写解析により、WNT4処理HILO（wHILO）では、β細胞特異的遺伝子（NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK）およびα細胞特異的遺伝子（ARX）を含む重要な島細胞マーカーが、ヒト島に見られるものに匹敵するレベルまで誘導されることが確認された（図3D-1および図3D-2）。重要なことに、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB、およびSYT4を含むβ細胞系列特定マーカーはWNT4の添加による影響を受けず、この非古典的WNTシグナリングが細胞運命の決定には影響していないことが示された。対照的に、WNT4は、HILOにおけるERRγ（ESRRGによってコードされる）ならびにミトコンドリア呼吸鎖の成分NDUFA7およびCOX7A2の発現を、用量依存的に増大させた（図3F）。これらの誘導と合致して、WNT4の存在下で生成させたHILOは、酸素消費速度（OCR）の増加および細胞外酸性化速度（ECAR）の減少によって測定される増大した酸化的代謝を呈して、健常なヒト島の代謝的特徴を再現した（図3Hおよび図7C）。WNT4処理HILOは改良されたインビトロGSISを示し、この効果はβ-カテニン阻害剤XAV939によって遮断されなかった（図3I、図7D-1および図7D-2）。同様に、市販のhiPSC由来のβ様細胞をWNT4を含有する3D分化培地で培養すると、擬似島の形成とGSIS機能性が促進された（図3Jおよび図3K）。重要なことに、wHILO（すなわちWNT4を含有する培養培地または分化培地中で培養されたHILO）は、STZ誘導性NOD-SCID糖尿病マウスに移植すると血糖管理を回復させ、グルコースホメオスタシスを6週間超にわたって維持した（図8D）。これらの結果は、全体として、頑健なGSISに必要なHILOの代謝の成熟化を、ヒト島の出生後の成熟化を模倣する形で誘導するには、非古典的WNTシグナリングで十分であることを示している。したがって、WNT（例えばWNT4）を含有する培地で幹細胞（例えばhiPSC、PSCまたは胚性幹（ES）細胞）を培養すると、機能的に成熟していて島様であり、より多くの成熟β細胞マーカーを発現しインスリンを産生する、島および島様オルガノイド（wHILO）が生成する。
HILOの成熟化を駆動する分子変換を理解するために、HILOのWNT4処理によって誘導される転写変化を評価した。WNT4処理（26日目～33日目に100ng/ml）により、1581遺伝子および1354遺伝子の発現が、それぞれ増大および減少した。遺伝子オントロジー解析により、この遺伝子セットが濃縮されている代謝経路、最も注目すべきは酸化的リン酸化が同定された（図3E）。リボソームに関連する遺伝子には、DAVIDによるGOTERM＿BP解析によって決定されるミトコンドリア翻訳伸長遺伝子クラスター（mitochondrial translation and elongation gene cluster）が含まれる（図8C）。細胞代謝に対する効果と合致して、WNT4処理は、HILOにおけるOxPhos遺伝子の発現を、ヒト島に見られるレベルと類似するレベルまで包括的に増大させ、ミトコンドリア数を増加させた（図3Gおよび図8A）。
β様細胞集団に対する特異的効果を調べるために、WNT4処理またはWNT5a処理ありおよびなしのHILOから、インスリン発現細胞をGFP発現に基づいて選別した。インスリン発現細胞の比率はWNT処理によって左右されず、HILO成熟化中にβ細胞系列マーカー発現が変化しないことと合致した（図8B）。しかし、WNT4処理およびWNT5a処理はインスリン発現細胞のミトコンドリア含量を増加させたことから、β細胞の代謝の成熟化という見解が裏付けられた（図8B）。この成熟化段階の遺伝的エフェクターを同定するために、WNT4が誘導するクロマチンアクセシビリティの変化を、ATAC-Seqにより、選別されたGFP＋細胞においてマッピングした。WNT4処理ではクロマチンアクセシビリティの広範な変化が見られ、転写変化の程度と合致した。クロマチンアクセシビリティが増大している領域とWNT4処理によって誘導されるHILO遺伝子とのオーバーラップにより、123遺伝子が同定された（図8E）。遺伝子オントロジーにより、この遺伝子セットが濃縮されている代謝経路が、酸化的リン酸化を含めて同定された。さらにまた、クロマチンアクセシビリティの増大が遺伝子発現の増大と一致する遺伝子におけるモチーフ解析により、Foxa2およびERRを含むβ細胞成熟化因子が同定された（図8F）。これと合致して、WNT4が誘導するクロマチンアクセシビリティの増大が、ERRγ標的遺伝子NDUFA4、NDUFA7およびATP5Eを含む酸化的リン酸化遺伝子において見られた（図7F）。ERRγシグナリングが重要な役割を果たすことのさらなる裏付けとして、WNT4（100ng/mlで5日間）は、WTマウスから単離された新生児島では、ミトコンドリア代謝遺伝子の発現を誘導し、GSIS機能を改良したが、ERRγβ細胞特異的ノックアウト（KO）マウス（ERRγKOマウス）からの新生児島ではそうならなかった（図8Gおよび図8H）。理論に束縛されることは望まないが、これらの結果は、全体として、非古典的WNT4シグナリングがミトコンドリア機能を、大部分はERRγの誘導によって、強化することで、β様細胞の代謝の成熟化を駆動するという概念を裏付けている。
実施例6:成熟HILOの細胞の複雑性
免疫組織化学およびフローサイトメトリー解析により、wHILO細胞のおよそ50～60％がインスリンとβ細胞マーカーを共発現すること、および低レベルの追加内分泌細胞（グルカゴン＋、ソマトスタチン＋、膵ポリペプチド＋（PP＋））が明らかになった（図9A～図9F）。転写比較と合致して、HILOの細胞組成はWNT4処理では変化しなかった（図9F）。代謝的に成熟したHILOの細胞の複雑性を包括的に特徴決定、インビトロ成熟化プログラムについての洞察を得るために、HILO（PBS処理、n＝4078）およびwHILO（WNT4処理、n＝4840）の単一細胞トランスクリプトームをヒト島（n＝3245）のそれと比較した（表1）。各解析における細胞トランスクリプトームを、t分布型確率的近傍埋め込み法（t-distributed stochastic neighbor embedding:t-SNE）を使って次元を削減するリードカウントの主成分分析によってクラスター化した。wHILOのクラスタリングにより、β細胞マーカーが濃縮された集団と、Sox9＋HES1＋膵臓前駆体クラスターが明らかになった（図9G～図9J）。シグネチャー遺伝子発現解析により、非複製性および複製性導管-内分泌両能性（bipotent）細胞（＋/-TOP2A）、ホルモン陽性内分泌濃縮細胞（hormone positive endocrine enriched cell）（GCG＋、SST＋）、導管様細胞（KRT19＋）および機能未知（UK）の小さな細胞集団が、さらに識別された（図9Kおよび図9L）。HILOデータセットとwHILOデータセットの共クラスタリングにより、WNT4処理にはほとんど依存しない複数の内分泌様細胞タイプ（各クラスター中で高度に発現する遺伝子に基づく）の存在に関する追加の証拠が得られた（図9M）。複数の内分泌様細胞タイプの存在を確認するために、wHILOとヒト島の複合単一細胞データセットの統合解析を行った（図10A～図10C）。違いは明白だが、wHILO細胞はβ、α、δおよびγ細胞を含む島内分泌細胞と共にクラスター化することがわかった（図10B）。注目すべきことに、島細胞タイプとの共クラスタリングに基づく機能的分類により、wHILOにおけるβ様細胞とα様細胞の優勢が明らかになった（図10B）。
（表１）
Figure 2022504640000075
実施例7:PD-L1はHILOに免疫保護を与える
移植された島の臨床的有用性は同種異系応答および自己免疫応答の両方によって制限される。免疫応答を抑制するチェックポイント分子の能力を考えて、ヒト島における免疫チェックポイントタンパク質の内因性発現を調べた。健常な島中のβ細胞の小さな部分集合が、β細胞における免疫寛容の決定因子であるPD-L1発現を含むユニークな遺伝子発現シグネチャーを示した（図12A）。移植時にwHILOが保護されるように外因性PD-L1発現を呈するwHILOを作出するために、レンチウイルスシステムを使ってPD-L1発現hiPSCクローンを生成させ、次に、図3Aに図示するように、代謝的に成熟したwHILOに分化させた。HILOにおけるPD-L1の過剰発現はインスリン発現に影響を及ぼさなかった（図12Bおよび図12C）。PD-L1を発現するwHILOとPD-L1を発現しないものとを免疫正常糖尿病マウス（STZ処置C57BL6Jマウス）の腎被膜に移植した（図12D）。PD-L1過剰発現ありおよびPD-L1過剰発現なしのwHILOは、移植後数日以内に類似する効力で血糖管理を回復することができた（図4C）。しかし、PD-L1発現を欠くwHILOの機能性は、血中グルコースレベルの増加によってモニターした場合、数週間の間に次第に失われた。対照的に、PD-L1＋wHILOは、免疫抑制薬の非存在下で＞50日にわたってグルコースホメオスタシスを維持することができた（図4C）。
PD-L1の免疫抑制作用を確認するために、移植されたwHILOを移植の27日後にレシピエントマウスから回収し、フローサイトメトリーによって細胞組成を比較した。T細胞およびNKT細胞を含むCD45＋免疫細胞の浸潤は、PD-L1を発現するwHILOを与えられた移植片では著しく減少していた（図4D～図4G）。さらにまた、PD-L1発現を欠くwHILOを与えられた移植片に見いだされるインスリン発現細胞の数は無視できる程度であり、移植の27日後には血中グルコースレベルがほとんど調節されなかったことと合致した（図4D、図4Fおよび図4H）。
異種移植片としてのwHILO（PD-L1）の存続は、再構成されたヒトT細胞レパートリーを組み入れたモデルにおけるそれらの機能性の評価につながった。ヒトT細胞の存続を確認した後、HuPBMS-NSG-SGM3マウスを多重低用量STZ処置（50mg/kg/日で5日間、MLD-STZ）によって糖尿病にし、次にwHILOを移植した（図4Iおよび図4J）。移植されたwHILO（PD-L1）は、PD-L1発現を欠くものと比較して持続的な血中グルコース管理を提供し、ヒトc-ペプチドレベルは血糖管理の程度と相関した（図4Kおよび図4L）。移植された腎臓を外科的に除去した後の高血糖の迅速な発症は、移植片由来のインスリンが一次エフェクターであることを示唆した（図4K）。回収された移植片のその後の解析により、wHILOにおけるインスリン発現細胞数の顕著な低減と、それに対応するヒトリンパ球の増加が明らかになった（図4Eおよび図4M）。
実施例8:エピジェネティックメモリーが免疫寛容wHILOを駆動する
複数のがんにおいてPD-L1発現はIFNγ刺激によって誘導されるが、IFNγを含むサイトカインへの長期間にわたるばく露は、β細胞の死および/または脱分化を誘導することが見いだされている。この実施例では、移植されたwHILOに対する宿主免疫応答を最小限に抑える能力をIFNγ経路が有するかどうかを評価するための実験を行った。IFNγ刺激へのwHILOのばく露後に、IFNγはwHILOにおけるPD-L1発現を迅速かつ頑健に誘導することがわかった（図12Eおよび図12F）。具体的には、IFNγ処理の12時間後に、PD-L1発現のおよそ20倍の増加が観察された（図12F）。注目すべきことに、IFNγは、wHILOにおいて、インスリン発現細胞でもインスリン非発現細胞でも（それぞれGFP＋細胞およびGFP-細胞）、類似するレベルまでPD-L1発現を誘導した（図5A）。続いて行われたwHILOにおける用量漸増研究では、2時間の10ng/ml IFNγばく露後に、最大のPD-L1誘導が同定された（図12E）。しかし、この誘導は一過性であり、IFNγへのばく露後数日でPD-L1発現は迅速に減少した（図5B）。リポ多糖などの炎症性刺激に対する寛容はエピジェネティック変化と関連づけられているので、連続的なIFNγ刺激がwHILOにおける長期効果または持続的効果、具体的にはHILOにおけるPD-L1の持続的誘導を引き起こすかどうかを、調べるための実験を行った。実際、IFNγへの反復短時間ばく露（間欠的ばく露）（多重パルス刺激、「MPS」）は、持続的PD-L1発現と、それに伴うPD-L1タンパク質レベルの増加につながることが見いだされた（図5C、図5Dおよび図5E）。重要なことに、MPS IFNγへのwHILOのばく露によってGSIS機能性が損なわれることはなかった（図5F）。さらにまた、MPS IFNγで処理したwHILOは、IL-1βが誘導するβ細胞脱分化から保護されることが、β細胞アイデンティティマーカーINSおよびUCN3の発現によって明らかになった（図5Gおよび図5H）。
wHILOにおいてIFNγが駆動する変化について、機序に関する洞察を得るための研究では、ATAC-Seqを使用した。ATAC-Seqによって測定されるとおり、急性（12時間のばく露）およびMPS処理によって誘導されるゲノムワイドな転写変化は、クロマチンアクセシビリティの変化と関連していた。IFNγ処理によって誘導される遺伝子セットは、PD-L1を含めて大きくオーバーラップしており、一方、ダウンレギュレートされる遺伝子で共通して影響を受けるものは、およそ半分だった（図14Aおよび図14B）。共通してアップレギュレートされる遺伝子セットの遺伝子オントロジーにより、IFNγ経路が同定された（図示せず）。対照的に、IL-1β産生や炎症経路の負の調節など、細胞炎症状態を反映する経路は、MPSによってアップレギュレートされた遺伝子セットにのみ同定され、一方、NFkBシグナリングおよびアポトーシスの正の調節は、MPSによってダウンレギュレートされる遺伝子セットに選択的に見いだされた（図14C）。クロマチンアクセシビリティの変化を重ね合わせると、MPS IFNγ処理後のPD-L1、IRF9、JUNB、およびJUNDを含む遺伝子座における継続的な増大が明らかになり、遺伝子転写物レベルの持続的増加と合致した。対照的に、急性処理後も、IRF1およびSTAT1を含む公知のIFNγ応答性遺伝子においてアクセシビリティの増大が見られたものの、これらの増大は持続しなかった（図14D）。
IFNγ処理が免疫回避性wHILO（wHILOie）を生成させることを確認するために、免疫正常マウスにおいて長期グルコース調節を提供するwHILOieの能力を評価した。STZ誘導性糖尿病C56BL6JマウスへのwHILOieの移植は、数日以内にマウスにおける血中グルコースレベルを低下させ、低減したレベルを＞40日にわたって維持した（図5I、図5J）。対照的に、移植されたナイーブwHILO（IFNγばく露なし）の効力は次第に減少し、レシピエントマウスの血清中に観察されるヒトc-ペプチドレベルの低減と合致した（図5K）。ヒト化糖尿病マウスへの移植でも同様の結果が認められた。注目すべきことに、wHILO（MPS処理）移植で達成されるグルコースレベルの低減は、レシピエント腎臓を外科的に切除すると失われた（図15Aおよび図15B）。移植されたwHILOにおいてIFNγによって誘導されたPD-L1が免疫抑制的役割を果たすことの裏付けとして、リンパ球浸潤の低減と、活性化Tヘルパー細胞（CD4＋CD3＋）の相対数の減少とが、回収された移植片に観察された。そのうえ、wHILO（MPS処理）移植片では、インスリン発現細胞の数が著しく増加した（図15C）。
理論に束縛されるものではないが、本明細書記載の結果は、事前のIFNγ刺激、すなわちMPS IFNγプロトコールへのwHILOなどの細胞のばく露が、wHILOにおけるサイトカイン耐性および持続的デノボPD-L1発現につながるエピジェネティックメモリーを誘導することを示唆している。IFNγで刺激されたwHILO（wHILOie）は、膵臓疾患またはインスリン依存性糖尿病、例えば1型糖尿病もしくは2型糖尿病などの疾患を緩和するための治療として有用である。
wHILOがNOD-SCIDでは機能性を維持したものの、C57BL6Jマウスではそうでなかったという、上記の実験に基づく知見は、T細胞およびB細胞を同種異系拒絶と関連づけるものである。抗原提示中は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4）とB7分子の間の相互作用およびプログラム細胞死タンパク質1（PD1）とそのリガンドPD-L1の間の相互作用が、免疫応答を非冗長的に負に調節する。これらの実験の結果は、本明細書に記載の誘導または過剰発現などによってPD-L1を発現するwHILOが、同種異系拒絶から保護されることを実証している。さらにまた、前記のとおり、限られたIFNγ濃度への反復ばく露が、グルコース刺激インスリン分泌（GSIS）活性を損なうことなく、持続的内因性PD-L1発現をもたらすプロトコールが提供される。注目すべきことに、また予想外なことに、結果として生じる本明細書記載の免疫回避性HILOは、移植デバイスの非存在下で、免疫正常1型糖尿病マウスにおけるグルコースホメオスタシスを約50日にわたって維持することができた。本明細書記載の方法によるIFNγばく露によってもたらされる免疫回避性細胞（HILOに含まれるものなど）は、代謝的および機能的成熟を呈するだけでなく、移植された細胞の自己免疫拒絶を克服し、それが、他の幹細胞ベースの治療法に見られる一般的課題に対する解決策を提供する。
実施例9:上述の実施例において使用した方法
マウス系統の維持
動物は、特定病原体フリー動物施設で、12時間の明暗周期、23℃の周囲温度で維持した。水および食物は自由に摂取させた。動物実験では同齢同バックグラウンドの（age-and background-matched）雄C57BL6J（ストック番号000664）、NOD-SCIDマウス（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ、ストック番号005557）、β細胞特異的ERRγノックアウトマウス（Yoshihara,E.et al.,2016,Cell metabolism 23,622-634、doi:10.1016/j.cmet.2016.03.005）、「ヒト化マウス」と呼ばれるhu-PBMC-SGM3マウスを使用した。NSG-SGM3（Jackson 013062）株で、雌NSG（商標）マウスに、ヒト末梢血単核球（PBMC）を注射した。動物に関わる手順はすべて、ソーク研究所（Salk Institute for Biological Studies）のIACUCおよび動物リソース部門（IACUC and Animal Resources Department）によって承認されたプロトコールに従って行った。
ヒトインスリンレポーターおよびPD-L1を過剰発現するヒトiPSC株の生成
β細胞特定にしるしをつけるために、E.Yoshiharaらに記載されているように（2016,Cell metabolism,23:622-634）、ヒトインスリンGFPレポーターをHUVEC由来のヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）に感染させた。内因性インスリンプロモーター活性を視覚化するために、CRISPR/Cas9ゲノム編集を使ってインスリンプロモーターにGFPをノックインした（表1および表2）。
（表２）
Figure 2022504640000076
種＊: hu:ヒト、mo:マウス
（表３）
Figure 2022504640000077
ヒトCD274（PD-L1）をコードするレンチウイルス（abm、LV113090）をhiPSCに感染させてピューロマイシン選択することにより、PD-L1発現hiPSCを生成させた（表4）。ヒトUCN3近位プロモーター配列（-1298/＋103）を、In-Fusionクローニング（Clonetech）により、ApaI/NotI制限酵素部位を使って、プロモーターレスpLV-Cherry-Picker1バックボーン（Clontech、632574）に導入した。ゲノムDNAからプロモーター配列をPCR増幅するためのプライマー配列は
Figure 2022504640000078
（フォワード）および
Figure 2022504640000079
（リバース）であった。ヒトUCN3 mcherryおよびヒトインスリンGFPの二重レポーター株（hINS-GFP-EF1α-Neo）、Yoshihara et al.（同上）を、hiPSCで生成させた。
（表４）プラスミド情報
Figure 2022504640000080
ウイルス産生
レンチウイルスは、本明細書記載の方法（例えば実施例10の方法）を使って、また当業者が公知であり実施しているように、第二世代または第三世代のレンチウイルスシステムを使用して、HEK293T細胞株中で産生した。
3Dジェランガム（3DKG）培養培地
低アシルジェランガム（Kelcogel F GG-LA）（Modernist pantry）の0.3％w/v水溶液を、オートクレーブで滅菌してから、mTeSR1培地またはカスタムTeSR培地（StemCell Technologies）で希釈し（最終濃度0.015％）、メチルセルロース（R＆D systems、最終濃度0.3％）およびペニシリン/ストレプトゾシンを加えた。
より具体的には、例えばKelcogel F低アシルGG GG-LA（Modernist pantry）を純水に懸濁し（0.3％（w/v））、90℃での撹拌またはマイクロ波によって溶解させた。その水溶液をオートクレーブ中、121℃で20分間滅菌した。その溶液を最終濃度が0.015％になるようにTeSRまたはカスタムTeSRに加えた。メチルセルロース（MC）保存液を最終濃度が0.3％になるように加えた（R＆D systems）（例えば0.3％Kelcogel保存品;Kelcogel F低アシルGG GG-LA 300mg＋MilliQ水100ml:3DKG Stem TeSR基本培地;Stem TeSR 95ml＋0.3％Kelcogel 5ml＋MC保存溶液300μl。最終濃度1％のペニシリン/ストレプトゾシンを3DKG Stem TeSRに加えた。
ヒト多細胞スフェロイド（MCS）
Yoshihara,E.らの刊行物（2016,Cell Metabolism,23（4）:622-634）に記載されているように、ヒトiPSCから膵臓内分泌（PE）細胞を調製した。簡単に述べると、Salk Stem Cell Core Facilityから入手したHUVEC由来hiPSCを、加湿5％CO2インキュベータにおいて、マトリゲル（BD）被覆ディッシュ上、完全Stem TeSR培地中、37℃で維持した。膵臓分化に先だって、スピンフェクション（800g、1時間）によってヒトインスリンレポーターレンチウイルス（pGreenZeroレンチレポーターヒトインスリン、System Biosciences）をhiPSCに感染させ、次に、細胞培地を2日にわたって分化培地（800ml DMEM/F12、13.28g BSA、10ml Glutamax、560mg NaHCO3、330mgチアミン、100mg還元型グルタチオン、3300mgビタミンC、14μgセレン、10ml NEAA、2ml微量元素（Trace Element）B、1ml微量元素C、7μl β-ME、2ml DLC、2ml GABA、2ml LiCl、129.7μg PA、インスリン2mg、1000mlにする）中の100ng/mlヒトアクチビン（R＆D Systems）、3μM CHIR99021（Selleckchem）に変えた後、細胞をさらに2日にわたって分化培地中の100ng/mlヒトアクチビンに維持した（ステージ1、膵臓内胚葉）。次にこの培地を、7日にわたって、1μMドルソモルフィン（Calbiochem）、2μMレチノイン酸（Sigma）、10μM SB431542および1％のB27サプリメントを含有する分化培地で置き換えた（ステージ2）。次に、培地を、4～5日にわたって、10μMフォルスコリン（Sigma）、10μMデキサメタゾン（Stemgent）、10μM TGFβ RIキナーゼインヒビターII/Alk5インヒビターII（CalbiochemまたはEnzo）、10μMニコチンアミド（Sigma）、1μM 3,3’,5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩（T3）および1％のB27サプリメントを含有する分化培地で置き換えた（15日目～19日目、膵臓内分泌前駆体が発生）。培地は毎日置き換え（ステージ1）、その後は1日おきに置き換えた（ステージ2およびステージ3）。
初代HUVEC細胞およびヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）（InvitrogenまたはPromoCell）は、EBM培地（Lonza、cc-3121）またはMesenProRS培地（GIBCO、12747-010または脂肪前駆細胞増殖培地キット（Preadipocyte Growth Medium Kit）、C-27417）をそれぞれ使用し、15cmディッシュにおいて、加湿5％CO2インキュベータ中、37℃で培養した。共培養実験のために、ヒトiPSC由来の膵臓内分泌前駆体をAccutaseで処理し、一方、HUVECおよびhADSCをTrypLE（GIBCO、12604-013）で処理した。細胞を50mlチューブに収集した。hiPSC-EP（1×106細胞）、HUVEC（7×106細胞）およびhADSC（1～2×105細胞）を、24ウェルプレートの単一ウェル中、300μlのマトリゲルで共培養した。
MCS生成のために、hiPSC-EP（15日目～21日目、1×106細胞）、HUVEC（7×106細胞）およびhADSC（1～2×105細胞）を、10μMフォルスコリン（Sigma）、10μMデキサメタゾン（Stemgent）、10μM TGFβ RIキナーゼインヒビターII/Alk5インヒビターII（CalbiochemまたはEnzo）、10μMニコチンアミド（Sigma）、1μM 3,3’,5-トリヨード-L-チオニンナトリウム塩（T3）および1％のB27サプリメント、R428（2μM）、硫酸亜鉛（10μM）およびN-Cys（1mM）を含む3D Kelco GelカスタムTeSR中で共培養した。培地は1日おきに替え、島様クラスターが数日以内に形成した（図6A～図6F）。
ヒト膵島様オルガノイド（HILO）培養物
hiPSCをマトリゲル被覆プレート中で培養した。Accutaseを使って単一細胞懸濁液を調製し、PBS中で洗浄し、遠心分離（1000～1300rpmで5分間）によって収集した。細胞を、スフェロイドの直径が50～100μmに達するまで5～7日にわたって、ROCK阻害剤（10μM Y-27632、StemCell）の存在下、3D Kelco Gel Stem TeSR（商標）基本培地で再懸濁した。次に培地を、0.3％メチルセルロースを含有する0.015％Kelcoゲルで置き換え、1日にわたって、分化培地（S1）中の100ng/mlヒトアクチビンA（R＆D Systems）、3μM CHIR99021（AxonまたはSelleckchem）を補足し、次にさらに2日にわたって分化培地（S1）中の100ng/mlヒトアクチビンを補足した（ステージ1、決定的内胚葉（Definitive Endoderm））。次に培地を、2日にわたって、50ng/ml FGF7（R＆D Systems）を含む分化培地（S2）で置き換え、3日にわたって、50ng/ml FGF7、0.25μM SANT-1（Sigma）、1μMレチノイン酸（Sigma）、100nM LDN193189、10μM Alk5インヒビターIIおよび200nMのβ-アミロイド前駆体タンパク質モジュレーターTPBを含む分化培地（S3）で置き換え、次に2日にわたって、50ng/ml FGF7、0.25μM SANT-1（Sigma）、1μMレチノイン酸（Sigma）、100nM LDN193189、10μM Alk5インヒビターIIおよび100nMのβ-アミロイド前駆体タンパク質モジュレーターTPBで置き換えた。次に培地を、3日にわたって、0.25μM SANT-1、50nMレチノイン酸、100nM LDN193189、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含む分化培地（S4）で置き換えた。次に培地を、7日にわたって、100nM LDN193189、100nM γ-セクレターゼインヒビターXX（GSiXX、Millipore）、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含む分化培地（S5）で置き換えた。次に培地を、さらに7～20日にわたって、10μMトロロックス（Trolox）（Calbiochem）、2μM R428（Selleckchem）、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含む分化培地（S5）で置き換えた。qPCRまたはレポーター活性によってインスリン発現を確認した後（典型的には20～30日目）、培地を、5～10日にわたって、ラミニン（LM-511/521およびLM-411/421）の添加ありまたはなしで、10μMトロロックス（Calbiochem）、2μM R428（Selleckchem）、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3および100ng/ml rhWnt4（R＆D Systems）を含む分化培地（S5）に変えた。
WNT5A条件培地
WNT5A産生線維芽細胞（ATCC CRL-2814）および対照線維芽細胞（ATCC CRL-2648）を、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するDMEM（完全培地）中で培養した。コンフルエントになったら、細胞をPBSで洗浄してから、完全培地中で1週間インキュベートした。次に調整培地を集め、0.2μm滅菌フィルタで濾過し、50mlずつに小分けして-80℃で凍結した。調整培地は、分化培地（10μMトロロックス、2μM R428、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含むS5）と1:1の比で混合してから、5～10日にわたってHILOを処理するために使用した。
ヒト島およびwHILOにおけるPD-L1誘導
組換えヒトIFNγ（R＆D Systems、285-IF、最終濃度1～50ng/mlで2～12時間の処理）によってPD-L1発現を誘導した。急性処理の場合は、wHILOを、分化培地（10μMトロロックス、2μM R428、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3および100ng/ml rhWnt4（組換えヒトWnt4）を含むS5）中の10ng/ml IFNγで、2時間にわたって処理した。次に細胞をPBSで2回洗浄してから、分化培地（10μMトロロックス、2μM R428、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3および100ng/ml rhWnt4を含むS5）中で培養した（単一パルス刺激）。wHILOieを生成させるために、各IFNγばく露の間に洗浄と分化培地（10μMトロロックス、2μM R428、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3および100ng/ml rhWnt4を含むS5）における24時間の休止時間を挟んで、IFNγばく露を3回繰り返した（MPS刺激）。最後のIFNγパルス後に、組織培養インキュベータにおいて細胞を1週間培養してから、RNA-seq解析（図14A～図14C）、ATAC-seq解析（図14D）およびSTZ誘導性糖尿病C57BL6Jマウス（図5J）またはヒト化マウス（図15B）への移植を行った。
膵島の単離
マウス膵島は、E.Yoshihara et al.,2010,Nature communications,1:127の既述のとおり、ただしわずかな変更を加えて単離した。簡単に述べると、0.5mg/mlコラゲナーゼP（Roche REF11213873001、HBSS緩衝液（GIBCO、14170-112）に希釈）を総胆管から注入し、灌流された膵臓を切離して、37℃で21分間インキュベートした。消化された外分泌細胞と無傷の島を、Histopaque-1077（Sigma、H8889）を使った900×gで15分間の遠心分離によって分離し、無傷の島を用手的に選択した。ヒト島は、承認されたプロトコールの下、Integrated Islets Distribution Programによって提供された。
インスリン/c-ペプチド分泌アッセイ
無傷の島から放出されるインスリンは、E.Yoshihara et al.,2016,Cell metabolism,23:622-634に報告されたバッチ式インキュベーション法を使ってモニターした。簡単に述べると、終夜培養した単離膵島（10％（v/v）ウシ胎仔血清および1％（v/v）抗生物質-抗真菌剤（Antibiotic-Antimycotic）（Gibco）を補足したRPMI-1640培地）を、129.4mM NaCl、3.7mM KCl、2.7mM CaCl2、1.3mM KH2PO4、1.3mM MgSO4、24.8mM NaHCO3を含有するクレブス・リンガー重炭酸塩緩衝液（KRBB）（5％CO2、95％O2、pH7.4と平衡化したもの）、10mM HEPESおよび0.2％（v/v）BSA（フラクションV、Sigma）（KRBH）に3mMグルコースを加えた溶液中、37℃で30分間、予備培養した。インスリン分泌レベルを決定するために、膵島を、3mMまたは20mMグルコースを含むクレブス・リンガー重炭酸塩HEPES（KRBH）緩衝液（500μl/10島）中で30分間インキュベートした。30分後に、島を遠心分離によってペレット化し、培地中の分泌インスリンレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）（マウス島およびヒト島について、それぞれラット/マウスインスリンELISAキット（Millipore）およびヒトインスリンELISAキットまたは超高感度ヒトc-ペプチドELISAキット（Millipore））によって決定した。ヒトiPSC由来細胞の場合は、細胞（24ウェル培養プレート中、1×106細胞/ウェル）を、3mMグルコースKRBH緩衝液（500μl/ウェル）中で予備培養した。次に、インスリン分泌レベルの指標としてc-ペプチド分泌レベルを決定するために、細胞を、3mMまたは20mMグルコースを含むKRBB（200μl/ウェル）中で、30分間インキュベートした。30分後に、細胞を遠心分離によってペレット化し、ヒトc-ペプチドELISAキット（Millipore）を使って、上清培地中のc-ペプチドレベルを決定した（例えば図7D-1および図7D-2）。
酸素消費速度および細胞外酸性化速度
（例えば島の）酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化速度（ECAR）は、XF24 sea horse（Seahorse Biosciences）を使って、24ウェルプレートで記録した（図7C）。簡単に述べると、70個の同サイズ（size matched）のヒト島、hiPSCスフェロイド、またはHILOを、1mMピルビン酸ナトリウムを含有するように補足した3mMグルコースXF DMEM培地（pH7.4）（基本培地）中で1時間予備培養してから、基本培地でXF24島培養プレートに移した。最終濃度20mMグルコースまでのグルコースの追加中に、OCR（3mMグルコースと比較した変化百分率として報告する）を記録した。次に、ミトコンドリアストレス試薬（オリゴマイシン、Fccp、ロテノンおよびアンチマイシンA）を、Mitostressキット（Seahorse Biosciences）の指示どおりに加えた。
島およびHILOの移植研究
免疫不全NOD-SCIDマウス、C57BL6JマウスおよびHu-PBMC-SGM3マウスはJackson Laboratoryから購入し、ソーク研究所のSPF施設において、オートクレーブしたケージで維持した。ストレプトゾトシン（STZ、i.p.、Sigma S0130-500MG）の単回高用量（180mg/kg）注射または5回の多重低用量（MLD、50mg/kg）注射によって、マウスを糖尿病にした。STZ注射の1週間後に、血中グルコースレベルが300mg/dlより高いマウスを移植レシピエントとして使用した。ヒト島およびマウス島（動物1匹あたり、マウス島の場合は200～500個の島または500～1,000IEQ、ヒト島の場合は500～1,000個の島または1,000～2,000IEQ）またはHILO（500クラスター）を、200μlのRPMI-1640培地に再懸濁し、実験用チューブ（SiLastic、508-004）にローディングし、遠心分離（400×gで1～2分間）することで、チューブの中央に細胞クラスターを生成させた。細胞クラスターを、8～16週齢のSTZ注射糖尿病マウスの腎被膜下に移植した（およそ30～50μl）。ケタミン（80mg/kg）およびキシラジン（10mg/kg）を外科用麻酔薬として使用し、マウスを37℃の加温パッド上に置いて回復させた。市販の血中グルコース/ケトンモニター（Nova Max Plus）を使って血中グルコースレベルをモニターした。移植片摘出実験のための腎臓切除（Nx）を行って、移植されたwHILOにおけるグルコース調節の効力を確認した。移植片を持つ腎臓を4-0絹糸（LOOK、SP116）を使って腎門で結紮してから、切除した。取り出した移植片を免疫プロファイリングの解析のために処理した。
ATAC-seq
27日目から34日目までPBSまたは100ng/ml rhWnt4で処理されたHILOから蛍光活性化細胞選別（FACS）を使って単離した5×104個のGFP陽性（GFP＋）細胞に対して、J.D.Buenrostro et al.,2015,Current Protocols in Molecular Biology,109:21-29に記載されているように、ATAC-seqを行った。リードをBowtieによってhg19にアラインメントし、HOMERをデフォルト設定で使用することにより、ピークコールを行った。HOMERを本質的に説明書どおりに使用して、2つの生物学的レプリケートから差分ピーク解析およびモチーフ解析を確認した（例えばS.Heinz et al.,2010,J.Mol.Cell,38:576-589参照）。HOMERに関する詳細な方法は例えばhttp:// http://homer.salk.edu/homer/において無料で入手できる。簡単に述べると、このプログラムは、標的配列およびバックグラウンド配列に対して公知のモチーフの濃縮を検索し、変化倍率1.5およびp値0.05未満で濃縮されているモチーフを返す。Wnt4処理時にクロマチンアクセシビリティが強化される遺伝子のプロモーター領域（これは転写開始部位の1キロベース（kB）上流と定義される）を、8～16bpの濃縮されたモチーフについて、HOMERモチーフ解析を使って調べた。
バルクRNA-Seqライブラリー作製
RNAlater（Invitrogen）で処理した細胞ペレットからRNeasyマイクロキット（Qiagen）を使って全RNAを単離し、DNaseI（Qiagen）により、室温で30分間処理した。TruSeq RNAサンプル調製キットv2（Illumina）を製造者のプロトコールに従って使用することにより、100～500ngの全RNAからシーケンシングライブラリーを調製した。簡単に述べると、mRNAを精製し、断片化し、それを使って第1鎖および第2鎖cDNA合成を行った後、3’端をアデニル化した。試料をユニークアダプターにライゲートし、PCR増幅した。次に2100 BioAnalyzer（Agilent）を使ってライブラリーを検証し、標準化し、シーケンシングのためにプールした。
ハイスループットシーケンシングおよび解析
各実験条件につき3つの生物学的レプリケートから調製されたRNA-Seqライブラリーを、Illumina HiSeq 2500で、バーコードマルチプレックス化（bar-coded multiplexing）および100bpのリード長を使ってシーケンスした。画像解析およびベースコーリングはIllumina HiSeqリアルタイム解析ソフトウェアで自動的に生成された。これにより、中央値で1試料あたり29.9Mの使用可能なリード（usable read）を得た。RNA-SeqアライナーSTAR（A.Dobin et al.,2013,Bioinformatics,29:15-21）を使って、短いリード配列をUCSC hg19リファレンス配列にマッピングした。hg19の公知のスプライスジャンクションをアライナーに供給し、デノボジャンクション検出も許した。差次的遺伝子発現解析、統計的検定およびアノテーションはCuffdiff2（C.Trapnell et al.,2013,Nature Biotechnology,31:46-53）を使って行った。転写産物発現を、fpkm（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）での遺伝子レベル相対量として計算し、転写産物量バイアスの補正に使用した（A.Roberts et al.,2011,Bioinformatics,27:2325-2329）。関心対象の遺伝子に関するRNA-Seq結果をUCSCゲノムブラウザを使って視覚的にも調べた。ヒートマップはR-Scriptによりheatmap.2（gplot）ソフトウェアで生成させるかClusterによりJavatree viewソフトウェアで生成させた。ヒートマップのスケールはZスコアによって決定した（図2A、図3Dおよび図3G）。
ドロップレットベースの単一細胞RNAシーケンス
hiPSC由来の内分泌前駆細胞（15日目）、HILOおよびWNT4処理HILO（100ng/ml rhWNT4で5日間）、ならびにヒト島（IIDPドナーID1874）の3つの生物学的レプリケート（1レプリケートあたり200クラスター）を、TrypLEを使って単一細胞懸濁液に解離した。単一細胞を、Chromiumシングルセルプラットホームにより、GemCodeゲルビーズ、チップ、およびライブラリーキット（10X Genomics）を製造者のプロトコールどおりに使用して処理した。簡単に述べると、5000細胞の回収を目標として、8,800個の単一細胞を、PBS中の0.4％BSAに選別した。細胞を、Chromium機器中のエマルジョンのゲルビーズ（Chromiumシングルセル3’’ v2）に移し、そこで細胞溶解とRNAのバーコード化逆転写を行った後、増幅、せん断ならびに5’アダプターとサンプルインデックスの付加を行った。ライブラリーをIllumina HiSeq 4000機器でシーケンスした。
scRNA-seqデータ解析
デマルチプレックス化、GRCh38トランスクリプトームへのアラインメント、およびユニーク分子識別子（unique molecular identifier:UMI）コラプシング（collapsing）を含む初期データ処理は、Cell Rangerソフトウェア（10x Genomics、ver2.0.2）を使って行った。単一細胞試料情報の概要は、Cell Ranger pipelineの結果から生成された。R studio（https:www.rstudio.com）、Cell Ranger R Kit、Seurat、monocle、および他のカスタムRスクリプトを使用した。細胞タイプの同定には、monocleのcluster cell関数（cluster cell function）を使用した（図4B）。細胞のクラスタリングは、Seurat Rパッケージを使って、2反復ラウンドの主成分分析で行った。
200個未満のユニーク遺伝子カウントを有する細胞を除去してから（FilterCells関数）、総発現量によるデジタル遺伝子発現行列の標準化を行い、スケール因子（10,000のデフォルト設定）を乗じて、対数変換した（NormalizeData関数）。次に、全遺伝子の平均発現量および各遺伝子についての散布度（dispersion）（分散を平均で割ったもの）をビニング処理し、これらの遺伝子をビンに入れてから、各ビン内で散布度に関するzスコアを計算することにより（FindValiableGenes関数）、可変遺伝子のセットを同定した。RunPCAのデフォルト設定を使って線形次元削減を行い、Jackstraw法（JackStraw関数、図示せず）を使って主成分を統計的に有意な遺伝子発現シグナルについて評価した。この第2ラウンドのクラスタリングでは多くて12の主成分を使用し、t分布型確率的近傍埋め込み法（t-SNE）マッピングを使ってscRNA-seq結果を視覚化した。
クラスター化された細胞集団を分類し、上位10種類の差次的発現遺伝子を同定した（FindAllMarkers関数）。インスリン（β細胞）、グルカゴン（α細胞）、ソマトスタチン（δ細胞）、膵ポリペプチド（γ細胞）、グレリン（ε細胞）、Prss1（腺房細胞）、Krt19（導管細胞）およびActa2（星細胞）を含む古典的（canonical）マーカー遺伝子の発現を調べることによって、クラスター化された細胞集団内の細胞タイプを証明した（図2D、図2E、図4Aおよび図6D～図6F）。
WNT4処理HILO（4,840細胞）およびヒト島（7,248細胞）からのscRNA-seqデータを合わせて1つのSeuratオブジェクトとし、高度に可変な遺伝子を上述のように同定した。クラスター化された集団内の細胞タイプは、ヒト島細胞における差次的発現遺伝子を参照することによって同定した。差次的発現遺伝子を同定するためにWNT4処理HILOおよびヒト島中に同定されるβ細胞集団を比較した（図10A～図10C、図11A～図11D）。
バイオインフォマティクス解析のためのソフトウェアおよびプログラム
ゲノムデータ解析には以下のソフトウェアまたはプログラムを使用した:R studio（https://www.rstudio.com/）、Cell Ranger R Kit（https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/rkit）、Seurat（https://satijalab.org/seurat/）、Monocle（http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/）、DAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）、GOplot（https://wencke.github.io）、UCSC genome browser（http://genome.ucsc.edu）およびHomer（http://homer.ucsd.edu/homer/）。
免疫組織化学（IHC）
インスリンに対する抗体（抗インスリン抗体、1/100、Abcam ab7842））、c-ペプチドに対する抗体（抗c-ペプチド抗体、1/100、Abcam ab30477）、グルカゴンに対する抗体（抗グルカゴン抗体、1/100、Abcam ab10988）、ソマトスタチンに対する抗体（抗ソマトスタチン抗体、1/100、Abcam ab103790）、膵ポリペプチドに対する抗体（抗膵ポリペプチド抗体、1/100、Abcam、ab113694）、NKX2-2に対する抗体（抗NKX2-2抗体、1/100、DSHB、74.5A5）、NKX6-1に対する抗体（抗NKX6-1抗体、1/100、DSHB、F55A12）、MAFAに対する抗体（抗MAFA抗体、1/100、Abcam、ab26405）、MAFBに対する抗体（抗MAFB抗体、1/100、Abcam、ab26405）、PDX-1に対する抗体（抗PDX-1抗体、1/100、R＆D、AF2419）、CHGAに対する抗体（抗CHGA抗体、1/100、Abcam、ab15160）、シナプトフィジンに対する抗体（抗シナプトフィジン抗体、1/100、Biogenex、MU363-UC）およびPD-L1に対する抗体（抗PD-L1抗体、1/100、Abcam、ab20592）を使って、膵臓およびヒト島または腎被膜中のiβeta細胞（4％PFA固定細胞）の凍結またはパラフィン包埋切片免疫組織化学（IHC）を行った（表5）。二次抗体にはAlexa 568、647（Life Technologies）をカップリングし、共焦点顕微鏡法（ZEISS）または蛍光顕微鏡法によってIHC染色を視覚化した。核染色にはHoechst 33342（Thermo Scientific、62249、最終濃度1μg/ml）を使用した。
（表５）
Figure 2022504640000081
Figure 2022504640000082
種＊: H＝ヒト、M＝マウス、R＝ラット、C＝ニワトリ、Mon＝サル
フローサイトメトリー
表示したステージにおけるクラスターを、20ug/ml DNaseを含むTrypLE（GIBCO）により、37℃で12分間、解離させた後、4％PFAにより、室温で10分間固定した。次にクラスターを0.2％Triton Xで10分間透過処理し、10％ヤギ血清で30分間ブロックし、BD Biosciences LSRII機器での解析用に、種々の細胞内マーカー:c-ペプチド（1/100、abcam、ab30477）、PDX-1（1/100、BD、562161）、NKX6-1（1/100、BD、563338）、クロモグラニンA（1/100、BD、564583）、MAFA（1/100、abcam、ab264583）、MAFB（1/100、abcam、ab66506）、グルカゴン（1/100、abcam、ab82270）、ソマトスタチン（1/100、abcam、108456）について、抗体で染色した。データはFlowJoソフトウェアで解析した。c-ペプチド、グルカゴンおよびソマトスタチン用の二次抗体にはAlexa 647（Life Technologies）をカップリングした。
電子顕微鏡法（EM）分析
懸濁状態のヒト島およびHILOを2％低融点アガロース中にペレット化し、次に、2mM塩化カルシウムを含有する0.15Mカコジル酸緩衝液（pH7.4）中の2.5％グルタルアルデヒドおよび2％パラホルムアルデヒドで、4℃において1時間、固定した。過剰のアガロースを除去し、ペレットを緩衝液中で洗浄してから、緩衝液中の1％四酸化オスミウム/0.3％フェロシアン化カリウムで二次固定を行った。水で洗浄した後、ペレットを2％酢酸ウラニルでアンブロック（en bloc）染色し、次にエタノール（35％、50％、70％、90％、100％、100％）で段階的に脱水した。次に、Pelco BioWaveマイクロ波処理ユニット（Ted Pella、カリフォルニア州レディング）を使って試料にSpurr樹脂を素早く浸透させ、Pelcoピラミッドチップモールド（Ted Pella、カリフォルニア州レディング）を使って包埋し、60℃で終夜硬化させた。70nm超薄切片をLeica UC7ウルトラミクロトーム（Leica、ウィーン）で切断し、Libra120（Zeiss、ドイツ・オーバーコッヘン）により、120Vで調べた。
移植されたHILOの免疫プロファイリング
移植されたHILOを移植後26日目に収穫し、TrypLEを使って単一細胞に解離させた。マウスFc受容体の細胞外領域に見いだされる共通エピトープをFc block（抗マウスCD16/CD32（Fc Shield）（70-0161-U500）でブロックした後、細胞表面マーカーCD19（PerCP/Cy5.5抗マウスCD19、BioLegend、115533）、Nk1.1（抗マウスNk1.1 PE、eBioscience、12-5941-81）、CD45（brilliant violet510抗マウスCD45、BioLegend、103138）、CD3（brilliant violet650抗マウスCD3、BioLegend、100229）、Cd11b（抗ヒト/マウスAPC-シアニン、TONBO、25-0112U100）に対する染色抗体（1:100希釈）を使って、FACSに基づく免疫プロファイリングを行った。フローサイトメトリー解析のために、BD Biosciences LSRIIを使ってデータを収集した。細胞選別にはBD Influx（100ミクロンノズルチップおよびシース圧を18.5PSIに設定した1×PBSシース流体）を、試料冷却および収集物冷却を4℃に設定して使用した。生きている（Zombie-UV色素陰性）単一細胞をFACSまたは前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）ゲーティングとそれに続くFSCおよびSSCに関するパルス幅識別を使った解析のために選択した。
記載のプロトコールでは、ドナー細胞、島、オルガノイド（およびその中の細胞）の移植、埋植、または移入の後の臓器または組織、例えば腎臓または腎被膜へのリンパ球（T細胞、B細胞）の浸潤がアッセイされる。インスリン産生PD-L1-wHILOと比べてインスリン産生PD-L1＋wHILOの移植後に腎臓などの組織に浸潤するCD45＋T細胞の数が低減することは、PD-L1を発現するHILO（およびその中の細胞）が、移植後（例えば移植の27日後）に、T細胞による外来性であるという認識およびT細胞殺滅から保護されていることを実証している（図4Dおよび図4E）。
レシピエント対象への移植、埋植、または移入の後の免疫保護された細胞、島、またはオルガノイド（およびその中の細胞）の検出
ヒト組織由来の初代ヒト細胞、島、および/またはオルガノイドは、持続的高GFP発現をもたらすことが示されているレンチウイルス媒介TYF-CMV-eGFP（緑色蛍光タンパク質）の感染によって標識される（Mao,Y.et al.,2015,International Journal of Medical Sciences,12（5）,407-15.doi:10.7150/ijms.11270）。次に、GFP発現細胞/島/オルガノイドを2～3回のIFNγ処理（例えば前記のMPS IFNγばく露）にばく露し、続いて起こるPDL-1発現の誘導をqPCRによって確認する。IFNγにばく露された細胞、島、および/またはオルガノイドを免疫正常マウスの腎被膜下に移植し、対照としてナイーブな細胞/島//オルガノイド（すなわちIFNγばく露なし）を同側腎被膜に移植する。移植の2～3週間後にマウスを屠殺し、腎臓常在GFP陽性細胞を蛍光活性化細胞選別（FACS）解析によって定量する。生残する細胞/島/オルガノイドのIFNγばく露後の増大を、個々のマウスから決定される各腎臓中のGFP＋細胞数に基づいて、定量的に決定する。
定量的RT-PCR解析
TRIzol試薬（Invitrogen）およびRNeasyキット（Qiagen）を使って全RNAを抽出した。逆転写はSuperScript III第一鎖合成システムキット（Invitrogen）またはPrimeScript RT試薬キット（TAKARA）で行った。SYBR Green（Bio-Rad）を使ってリアルタイム定量的RT-PCR（qPCR）を行った。プライマー情報は表2に列挙されている。
インビトロ血管新生化
ヒト多細胞スフェロイド（MCS）を、24ウェル組織培養プレートにおいて、EBM培地（Ronza、cc-3121）を含むマトリゲル300μlに包埋した。続く24～72時間の間、血管新生化を観察した。
統計的方法
平均±SEMとして結果を表した。統計比較はスチューデントのt検定を使って行った。統計的有意差は＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001として示す。
実施例10:ヒト島様オルガノイド
本明細書記載の機能的なヒト臓器の生成は、薬物スクリーニングおよび疾患モデル化のための新しい戦略を提供する。具体的に述べると、機能的なオルガノイドは薬物スクリーニングのための2型糖尿病のモデルとして使用することができる。ヒト島様オルガノイドは、2型糖尿病患者および高血糖患者への移植後の島機能障害におけるβ細胞喪失の誘導因子であるアミロイドポリペプチド（hIAPP）毒性に応答し、hIAPPはヒト島様オルガノイドにおいて24時間でのG0/G1停止を用量依存的に誘導した（例えばWO 2017/205511参照）。そのようなヒト様オルガノイドは、それを必要とする対象への移植、埋植または投与に使用した場合に、免疫検出および破壊を避けるために、本明細書記載の方法およびシステムに従って、PD-L1を発現するように誘導することもできる。
ある例示的なアッセイでは、3Dミニ臓器を2型糖尿病を誘導するストレス要因、例えば高レベルの遊離脂肪酸（FFA）および/またはグルコースもしくは選択されたサイトカインにばく露する。次に、ストレスを受けた3Dミニ臓器をさまざまな薬物で処理する。いくつかの態様において薬物は食品医薬品局（FDA）によって承認されたものである。
アウトプットとして、以下の項目がヒト膵島オルガノイドにおいてアッセイされる:インスリン分泌、β細胞アポトーシス（PI染色）、ルシフェラーゼレポーターによる乳酸デヒドロゲナーゼA（LDHA）発現、ならびにNDUFA4（ミトコンドリアの酸化的リン酸化）、ESRRG（ミトコンドリア機能）、KCNK3（Katpチャネル活性）およびMAFA（β細胞運命マーカー）を含むマーカー遺伝子の発現の変化。ヒト膵臓オルガノイドの場合、アミラーゼ分泌および外分泌細胞のアポトーシス（PI染色）がアッセイされる。
ディッシュでのヒト膵がんの腫瘍形成および転移をモデル化するための例示的なアッセイ、ならびにこれらの疾患を標的とする薬物をスクリーニングする能力に関する例示的なアッセイでは、ディッシュにおいてヒト膵がん微小環境を作出するために、3Dミニヒト膵臓が膵がん細胞、星細胞および免疫細胞と共培養される。次に、ミニヒト膵臓微小環境において膵がんの成長または転移を効果的に抑制する化合物を見つけるために、さまざまな薬物（例えばFDA承認薬）がスクリーニングされる。アウトプットとして、以下の項目が膵臓オルガノイドについて測定される:外分泌細胞のアポトーシス（PI染色）、コラーゲン合成（トリクローム染色）および星細胞活性化（GFAPレポーター）。これらのアッセイにおいて同定された潜在的候補薬物は、膵がん腫瘍形成・転移マウスモデルで試験される。遺伝子発現および形態ならびに細胞死、細胞増殖および転移の程度が調べられる。
マウスにおけるヒト2型糖尿病のモデル化のための例示的なアッセイでは、ヒト島オルガノイドおよび/またはヒト肝臓オルガノイドがマウスに移植される。次に、そのマウスに、2型糖尿病を誘導するさまざまなストレス要因、例えば高脂肪食（HFD）またはサイトカイン注射が投与される。このアッセイで同定された潜在的候補薬は、ヒト2型糖尿病マウスモデルで、さらに試験される。遺伝子発現および形態ならびに糖尿病の程度が調べられる。
マウスにおいてヒト膵がん腫瘍形成および転移をモデル化するための例示的なアッセイでは、ヒト膵臓オルガノイドおよび/またはヒト肝臓オルガノイドがマウスに移植される。ヒト膵臓微小環境におけるヒト膵がんの成長を研究するために、ミニ膵臓を移植したマウスが使用される。別の例示的なアッセイでは、ミニ膵臓とミニ肝臓がマウスに共移植される。肝臓は膵がんの主要な転移部位である。インビボでは、ミニ膵臓中およびミニ肝臓中のインビボ内皮細胞が膵がん転移のための膵臓-肝臓血管系ネットワークを作り出す。したがって、ヒト肝臓へのヒト膵がんの転移を研究するには、ミニ膵臓とミニ肝臓が共移植されたマウスが使用される。多能性幹細胞（PSC）およびヒト島および本明細書記載のHILOからの機能的な臓器様クラスターの生成は、ヒト疾患の基礎をなす機序についての洞察、およびレシピエント対象への導入または移植後に機能する生物学的治療薬を与える。
上述の結果は、以下の材料および方法を使って得た。
3D KELCOGEL（登録商標）（3DKG）培養培地
Modernist Pantryから入手したKELCOGEL（登録商標）F低アシルジェランガム（GG-LA）を純水に懸濁し（0.3％（w/v））、90℃での撹拌またはマイクロ波によって溶解させた。その水溶液をオートクレーブ中、121℃で20分間滅菌した。その溶液をTeSR（商標）培地（Ludwid et al.,Nature Methods,3,637-646）またはカスタムTeSR（商標）培地（800ml DMEM/F12、13.28g BSA、10ml Glutamax、560mg NaHCO3、330mgチアミン、100mg還元型グルタチオン、3300mgビタミンC、14μgセレン、10ml NEAA、2ml微量元素B、1ml微量元素C、7μl β-ME、2ml DLC、2ml GABA、2ml LiCl、129.7μgピペコリン酸、インスリン2mg、1000mlにする）に、0.015％の最終濃度になるように加えた。メチルセルロース（MC）保存液を最終濃度が0.3％になるように加えた（R＆D systems）（例えば0.3％KELCOGEL（登録商標）保存品:KELCOGEL（登録商標）F低アシルGG-LA 300mg＋MilliQ水100ml;3D-KELCOGEL（登録商標）（3DKG）Stem TeSR（商標）基本培地:STEMCELL（商標）TeSR（商標）95ml＋0.3％KELCOGEL（登録商標）保存品5ml＋MC保存液300ul;3DKGカスタムTeSR（商標）基本培地:カスタムTeSR（商標）培地95ml＋0.3％KELCOGEL（登録商標）保存品5ml＋MC保存液300ul;最終濃度1％のペニシリン/ストレプトゾシンを、3DKG培地に加えた）。
インビトロでのヒト膵臓内分泌前駆体およびβ様細胞の調製
既述の分化方法を使ってヒトiPSCから膵臓内分泌細胞（hiPSC-PE）を調製した。簡単に述べると、HUVEC由来のヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）をStem Cell Core（ソーク研究所）から入手した。細胞は、加湿5％CO2インキュベータ中、37℃において、MATRIGEL（登録商標）（BD）被覆ディッシュ上、完全STEMCELL（商標）TeSR（商標）培地で維持した。膵臓分化のために、hiPSCに、スピンフェクション（800g、1時間）で、ヒトインスリンレポーターレンチウイルス（pGreenZero lenti reporterヒトインスリン、System Biosciences）を感染させた。方法1:培地を、2日にわたって、カスタムTeSR（商標）培地（800ml DMEM/F12、13.28g BSA、10ml Glutamax、560mg NaHCO3、330mgチアミン、100mg還元型グルタチオン、3300mgビタミンC、14μgセレン、10ml NEAA、2ml微量元素B、1ml微量元素C、7μl β-ME、2ml DLC、2ml GABA、2ml LiCl、129.7μg PA、インスリン2mg、1000mlにする）中の100ng/mlヒトアクチビン（R＆D Systems）、25ng/ml組換えヒトWnt3a（R＆D Systems）に変え、次に、さらに2日にわたって、分化培地中の100ng/mlヒトアクチビンに変えた（ステージ1、膵臓内胚葉）。次に、培地を、7日にわたって、1μMドルソモルフィン（Calbiochem）、2μMレチノイン酸（Sigma）、10μM SB431542および1％のB27サプリメントを含むカスタムTeSR（商標）培地で置き換えた（ステージ2）。次に、培地を、4～5日にわたって、10uMフォルスコリン（Sigma）、10μMデキサメタゾン（Stemgent）、10μM TGFβ RIキナーゼインヒビターII/Alk5インヒビターII（CalbiochemまたはEnzo）、10μMニコチンアミド（Sigma）、1μM 3,3’,5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩（T3）および1％のB27サプリメントを含むカスタムTeSR（商標）培地で置き換えた（15日目～21日目、膵臓内分泌前駆体）。培地は毎日置き換えるか（ステージ1）、1日おきに置き換えた（ステージ2およびステージ3）。
方法2:培地を、1日間、分化培地（S1）中の100ng/mlヒトアクチビン（R＆D Systems）、25ng/ml組換えヒトWnt3a（R＆D Systems）または3μM CHIR99021（AxonまたはSelleckchem）に変え、次にさらに2日にわたって、分化培地（S1）中の100ng/mlヒトアクチビンに変えた（ステージ1、膵臓内胚葉）。次に、培地を、2日にわたって、50ng/ml FGF7（R＆D Systems）を含む分化培地（S2）で置き換え、次に、3日にわたって、50ng/ml FGF7、0.25μM SANT-1（Sigma）、1μMレチノイン酸（Sigma）、100nM LDN193189および100nM α-アミロイド前駆体タンパク質モジュレーターTPBを含む分化培地（S3）で置き換えた。次に培地を、3日にわたって、0.25μM SANT-1、50nMレチノイン酸、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含む分化培地（S4）で置き換えた。次に培地を、7日にわたって、100nM LDN193189、100nMγ・セクレターゼインヒビターXX GSiXX（Millipore）、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含む分化培地（S5）で置き換えた。次に培地を、さらに7～20日にわたって、10μMトロロックス（Calbiochem）、2μM R428（Selleckchem）、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含む分化培地（S5）で置き換えた。
S1培地（MCDB131培地、8mMグルコース、2.46g/L NaHCO3、2％脂肪酸フリーBSA、0.25mM L-アスコルビン酸、0.002％インスリン-トランスフェリン-セレンITS-X（GIBCO）、2mM Glutamax、1％ペニシリン-ストレプトマイシン）、S2培地（MCDB131培地、8mMグルコース、1.23g/L NaHCO3、2％脂肪酸フリーBSA、0.25mM L-アスコルビン酸、0.002％インスリン-トランスフェリン-セレンITS-X（GIBCO）、2mM Glutamax、1％ペニシリン-ストレプトマイシン）、S3培地（MCDB131培地、8mMグルコース、1.23g/L NaHCO3、2％脂肪酸フリーBSA、0.25mM L-アスコルビン酸、0.5％インスリン-トランスフェリン-セレンITS-X（GIBCO）、2mM Glutamax、1％ペニシリン-ストレプトマイシン）、S4培地（MCDB131培地、8mMグルコース、1.23g/L NaHCO3、2％脂肪酸フリーBSA、0.25mM L-アスコルビン酸、0.002％インスリン-トランスフェリン-セレンITS-X（GIBCO）、2mM Glutamax、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、10μg/mlヘパリン、10μM硫酸亜鉛）、S5培地（MCDB131培地またはBLAR培地、20mMグルコース、1.754g/L NaHCO3、2％脂肪酸フリーBSA、0.25mM L-アスコルビン酸、0.002％インスリン-トランスフェリン-セレンITS-X（GIBCO）、2mM Glutamax、1％ペニシリン-ストレプトマイシン）。3次元（3D）培養のために、hiPSCまたはhESCを、5～7日にわたって、10μM Y-27632を含む3DKG Stem TeSR（商標）基本培地中で培養し、次に培地を、0.015％Kelcogelおよび0.3％メチルセルロースを含む各分化培地で置き換えた。
インビトロでの三次元膵島原基の生成:hADSCおよびHUVECとの共培養によるマトリゲル中の島様オルガノイド
初代HUVEC細胞およびヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）（InvitrogenまたはPromoCell）は、EBM培地（Ronza、cc-3121）またはMesenProRS（商標）培地（GIBCO、12747-010または脂肪前駆細胞増殖培地キット、C-27417）をそれぞれ使用し、15cmディッシュにおいて、加湿5％CO2インキュベータ中、37℃で培養した。共培養実験のために、ヒトiPSC由来の膵臓内分泌前駆体をAccutaseで処理し、一方、HUVECおよびhADSCをTrypLE（GIBCO、12604-013）で処理して、細胞をそれぞれ50mlチューブに収集した。細胞を計数した後、1×106細胞のhiPS-PP、7×106細胞のHUVECおよび1～2×105細胞のhADSCを、300ulのMATRIGEL（登録商標）マトリックスを使って、24ウェル中の1ウェルで共培養した。ヒト島様オルガノイドのスケーラブルな生成のために、1×106細胞のhiPS-PP（15日目～21日目）、7×106細胞のHUVECおよび1～2×105細胞のhADSCを、7日間にわたって、10μMフォルスコリン（Sigma）、10μMデキサメタゾン（Stemgent）、10μM TGFβ RIキナーゼインヒビターII/Alk5インヒビターII（CalbiochemまたはEnzo）、10μMニコチンアミド（Sigma）、1uM 3,3’,5-トリヨード-L-チオニンナトリウム塩（T3）および1％のB27サプリメント、R428（2μM）、硫酸亜鉛（10μM）およびN-Cys（1mM）を含む3DKGカスタムTeSR（登録商標）培地で共培養するか（方法1）、または100nM LDN193189、100nMγ-セクレターゼインヒビターXX GSiXX（Millipore）、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含む分化培地（S5）で共培養した。次に培地を、さらに7～20日にわたって、10μMトロロックス（Calbiochem）、2μM R428（Selleckchem）、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含む分化培地（S5）で置き換えた（方法2）。混合された細胞は、数日以内に球状の島様クラスターを形成した。培地は1日おきに交換した。
インビトロでの3D（三次元）膵島原基の生成:hADSCおよびHUVECとの共培養によるスケーラブルなジェランガム中の島様オルガノイド
細胞は上述のように調製した。簡単に述べると、1×108細胞のhiPS-PP、2～7×107細胞のHUVECおよび5～7×106細胞のhADSCを、7日にわたって、10μMフォルスコリン（Sigma）、10μMデキサメタゾン（Stemgent）、10μM TGFβ RIキナーゼインヒビターII/Alk5インヒビターII（CalbiochemまたはEnzo）、10μMニコチンアミド（Sigma）、1μM 3,3’,5-トリヨード-L-チオニンナトリウム塩（T3）および1％のB27サプリメント、R428（2μM）、硫酸亜鉛（10μM）およびN-Cys（1mM）を含む60～100mlの3DKGカスタムTeSR（商標）で共培養するか（方法1）、または100nM LDN193189、100nMγ-セクレターゼインヒビターXX GSiXX（Millipore）、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含む分化培地（S5）で共培養した。次に培地を、さらに7～20日にわたって、10μMトロロックス（Calbiochem）、2μM R428（Selleckchem）、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含む分化培地（S5）で置き換えた（方法2）。混合された細胞は、数日以内に球状の島様クラスターを形成した。培地は毎日または1日おきに交換した。
インビトロでの3D（三次元）膵島原基の生成:hADSCおよびHUVECの使用を伴わないスケーラブルなジェランガム3D培養法における島様オルガノイド
iPSCまたはESCを含むヒトPSCを、まずマトリゲル被覆プレート（2次元（2D）培養で培養した。次に細胞をAccutase（Innovative Cell Technologies,Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ）で処理することで単一細胞懸濁液を生成させ、PBSで洗浄し、細胞をペレット化するために1000～1300rpmで5分間遠心分離した。細胞を、10μM Y-27632（RHO/ROCK経路阻害化合物）を含む3DKG Stem TeSR（商標）基本培地（Stemcell Technologies、マサチューセッツ州ケンブリッジ）で再懸濁し、PSC球体の成長が直径50～100μmに達するまでさらに5～7日にわたって培養した。次に培地を、0.015％Kelcogelおよび0.3％メチルセルロースを補足した分化培地で置き換えた。培養培地を、1日間、100ng/mlヒトアクチビン（R＆D Systems）、25ng/ml組換えヒトWnt3a（R＆D Systems）または3μM CHIR99021、グリコーゲンシンターゼキナーゼGSK-3阻害剤（Axon Medchem、バージニア州レストン、またはSelleckchem）を含有する分化培地（S1）に変え、次に、さらに2日にわたって、100ng/mlヒトアクチビンを含有する分化培地（S1）に変えた（ステージ1、膵臓内胚葉）。次に、培地を、2日にわたって、50ng/ml FGF7（R＆D Systems）を含有する分化培地（S2）で置き換え、次に、3日にわたって、50ng/ml FGF7、0.25uM SANT-1（Sigma）、1μMレチノイン酸（Sigma）、100nM LDN193189（ALK2およびALK3阻害剤、Sigma）および100nM α-アミロイド前駆体タンパク質モジュレーターTPBを含む分化培地（S3）で置き換えた。次にこの培地を、3日にわたって、0.25μM SANT-1、50nMレチノイン酸、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含む分化培地（S4）で置き換えた。次に培地を、7日にわたって、100nM LDN193189、100nMγ-セクレターゼインヒビターXX GSiXX（Millipore）、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含む分化培地（S5）で置き換えた。次に培地を、さらに7～20日にわたって、10μMトロロックス（Trolox）（Calbiochem）、2μM R428（Selleckchem）、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3を含有する分化培地（S5）で置き換えた。
レポーター発現またはqPCRによってインスリン遺伝子発現を確認した後（典型的には20～30日目）、培地を、1～20日にわたって、10μMトロロックス（Calbiochem）、2μM R428（Selleckchem）、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5インヒビターII、1μM T3および100ng/ml組換えヒト（rh）Wnt4（R＆D Systems）、400ng/ml rhWnt5aまたは50％Wnt5a調整培地を含有する分化培地（S5）に変えた。Wnt5a調整培地は、T175～T225細胞培養フラスコにおいて細胞が70～100％コンフルエントに到達してから4日間、10％FBS、1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM中でL-Wnt5a細胞株（ATCC、CRL-2814）を培養することによって調製した。
インビトロでの3D（三次元）肝臓原基の生成:器官原基
既述の分化方法を使ってヒトiPSCから肝細胞（hiPSC-HE）を調製した。簡単に述べると、hiPSCを、加湿5％CO2インキュベータ中、37℃において、MATRIGEL（登録商標）（BD）被覆ディッシュ上、完全STEMCELL（商標）TeSR（商標）培地で維持した。肝分化のために、hiPSC（6ウェルにおいて90％コンフルエント）を、RPMI-1640培地中の100ng/mlヒトアクチビン（Sigma）および25ng/ml組換えヒトWnt3a（R＆D systems）または3μM CHIR99021および1％インスリン非含有B27サプリメント（B27 supplement minus Insulin）で、1日培養し、次に、RPMI培地中の100ng/mlヒトアクチビンおよび1％インスリン非含有B27サプリメントで、さらに4日にわたって培養した（ステージ1肝内胚葉）。次に培地を、3日にわたって、RPMI-1640培地中の10ng/ml bFGF、20ng/ml BMP4および1％のB27サプリメントで置き換えた（ステージ2）。次に培地を、4～22日にわたって、肝細胞培養培地（Lonza、メリーランド州、CC-3198、EGFおよびゲンタマイシン/アンホテリシン-Bを除く）中に0.1μMデキサメタゾン、20ng/mlオンコスタチンM（R＆D Systems）および10～20ng/ml肝増殖因子（HGF、R＆D Systems）および1％のB27サプリメントを含む分化培地で置き換えた（15日目～19日目、膵臓内分泌前駆体）。培地は毎日置き換えるか（ステージ1）、1日おきに置き換えた（ステージ2およびステージ3）。初代HUVEC細胞およびヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）（InVitrogenまたはPromoCell）は、EBM培地（Ronza、cc-3121）またはMesenProRS培地（GIBCO、12747-010または脂肪前駆細胞増殖培地キット、C-27417）をそれぞれ使用し、15cmディッシュにおいて、加湿5％CO2インキュベータ中、37℃で培養した。共培養実験のために、ヒトiPSCに由来する10日目の肝細胞をAccutaseで処理し、一方、HUVECおよびhADSCをTrypLE（GIBCO、12604-013）で処理して、細胞をそれぞれ50mlチューブに収集した。細胞を計数した後、1×106細胞のhiPS-PP、7×106細胞のHUVECおよび1～2×105細胞のhADSCを、300ulのマトリゲルを使って、24ウェル中の1ウェルで共培養した。肝臓様オルガノイドが1～2日以内に形成された。次に、肝臓様オルガノイドをMATRIGEL（登録商標）マトリックスから取り出し、3DKGカスタムTeSR（商標）で培養した。ある態様では、1種類または複数種類のチェックポイントタンパク質を発現するように、肝臓様オルガノイドの細胞（肝細胞）を分子的に改変した。
インビトロでの3D（三次元）心臓原基の生成:器官原基
既述の分化方法を使ってヒトiPSCから心筋細胞（hiPSC-CD）を調製した。簡単に述べると、hiPSCを、加湿5％CO2インキュベータ中、37℃において、MATRIGEL（登録商標）（BD）被覆ディッシュ上、完全Stemcell（商標）TeSR（商標）培地で維持した。心臓分化のために、hiPSC（6ウェルにおいて90％コンフルエント）を、RPMI-1640培地中の100ng/mlヒトアクチビン（R＆D Systems）および10μM CHIR99021および1％インスリン非含有B27サプリメントで、1日培養し、次に、RPMI培地中の1％インスリン非含有B27サプリメントで、さらに2日にわたって培養した（ステージ1心臓内胚葉）。次に培地を、1日間、RPMI培地中に5μM IWP-2および1％インスリン非含有B27サプリメントを含むRPMI1640で置き換えた（ステージ2）。次に培地を、6日またはそれ以上にわたって、RPMI培地中の1％インスリン非含有B27サプリメントで置き換えた（ステージ3）。心収縮は13日目前後に始まった。培地は毎日置き換えるか（ステージ1）、1日おきに置き換えた（ステージ2およびステージ3）。初代HUVEC細胞およびヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）（InvitrogenまたはPromoCell）は、EBM培地（Ronza、cc-3121）またはMesenProRS（商標）培地（GIBCO、12747-010または脂肪前駆細胞増殖培地キット、C-27417）をそれぞれ使用し、15cmディッシュにおいて、加湿5％CO2インキュベータ中、37℃で培養した。共培養実験のために、ヒトiPSCに由来する13～15日目の心筋細胞をディスパーゼで処理し、一方、HUVECおよびhADSCをTrypLE（GIBCO、12604-013）で処理して、細胞をそれぞれ50mlチューブに収集した。細胞を計数した後、1×106細胞のhiPS-PP、7×106細胞のHUVECおよび1～2×105細胞のhADSCを、3DKGカスタムTeSR（商標）培地で共培養した。収縮能を有するミニ心臓様臓器が数日以内に形成された。ある態様では、1種類または複数種類のチェックポイントタンパク質を発現するように、ミニ心臓様オルガノイドの細胞（心筋細胞）を分子的に改変した。
インビトロでの3D（三次元）腸原基の生成:器官原基
既述の分化方法を使ってヒトiPSCから腸細胞（hiPSC-IT）を調製した。簡単に述べると、hiPSCを、加湿5％CO2インキュベータ中、37℃において、Matrigel（登録商標）（BD）被覆ディッシュ上、完全Stemcell（商標）TeSR（商標）培地で維持した。腸細胞分化のために、hiPSC（6ウェルプレートにおいて90％コンフルエント）を、RPMI-1640培地中の100ng/mlヒトアクチビン（R＆D Systems）、3μM CHIR99021、2mM Glutamaxおよび1％インスリン非含有B27サプリメントで、1日間培養し、次に、RPMI1640培地中の100ng/mlヒトアクチビン（R＆D Systems）、2mM Glutamaxおよび1％インスリン非含有B27サプリメントで、さらに3日にわたって培養した（ステージ1前腸内胚葉（Forgut-Endoderm））。次に培地を、4日にわたって、RPMI1640培地中の500ng/ml Wnt3a、500ng/ml FGF4および1％B27サプリメントで置き換えた（ステージ2）。細胞をMatrigel（登録商標）マトリックスに移した後、24ウェルの底に3D-スフェロイドMatrigel（登録商標）ドーム（dorm）を作製した。次に培地を、7日またはそれ以上にわたって、DMEM/F12培地中の1％B27サプリメント、1％N2サプリメント、500ng/ml R-スポンジン、100ng/mlノギン、50ng/ml EGF、2mM Glutamax（商標）サプリメント、10μM HEPESで置き換えた（ステージ3）。腸様オルガノイドスフェロイドが1週間以内に観察された。培地は毎日（ステージ1）および1日おき（ステージ2およびステージ3）に置き換えた。初代HUVEC細胞およびヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）（InvitrogenまたはPromoCell）は、EBM培地（Ronza、cc-3121）またはMesenProRS（商標）培地（GIBCO（登録商標）、12747-010または脂肪前駆細胞増殖培地キット、C-27417）をそれぞれ使用し、15cmディッシュにおいて、加湿5％CO2インキュベータ中、37℃で培養した。共培養実験のために、ヒトiPSCに由来する腸前駆体（7日目）をAccutaseで処理し、一方、HUVECおよびhADSCをTrypLE（GIBCO（登録商標）、12604-013）で処理して、細胞をそれぞれ50mlチューブに収集した。細胞を計数した後、1×106細胞のhiPS-PP、7×106個のHUVEC細胞および1～2×105個のhADSC細胞を3DKGカスタムTeSR（商標）培地で共培養した。ある態様では、1種類または複数種類のチェックポイントタンパク質を発現するように、腸様オルガノイドの腸細胞を分子的に改変した。
インスリン分泌アッセイ（初代マウス膵島および初代ヒト膵島ならびにヒトiPSC由来細胞）
無傷の島から放出されるインスリンはバッチ式インキュベーション法（Yoshihara et al.,2010,Nat.Commun.1:127）を使ってモニターした。簡単に述べると、終夜培養した単離膵島（10％（v/v）ウシ胎仔血清および1％（v/v）抗生物質-抗真菌剤（Gibco）を補足したRPMI-1640）を、37℃で30分間、予備培養した（129.4mM NaCl、3.7mM KCl、2.7mM CaCl2、1.3mM KH2PO4、1.3mM MgSO4、24.8mM NaHCO3を含有するクレブス・リンガー重炭酸塩緩衝液（KRBB）（5％CO2、95％O2、pH7.4と平衡化したもの）、10mM HEPESおよび0.2％（v/v）BSA（フラクションV、Sigma）（KRBH）に3mMグルコースを加えたもの）。次に、インスリン分泌レベルを決定するために、膵島を、3mMまたは20mMグルコースを含むKRBH緩衝液（500μl/10島）中でインキュベートした。30分後に、島を遠心分離によってペレット化し、ELISA（マウス島用およびヒト島用に、それぞれラット/マウスインスリンELISAキット（Millipore）およびヒトインスリンELISAキット（Millipore））を使ってインスリンレベルを決定した。ヒトiPSC由来細胞の場合は、細胞（24ウェル中、1×106細胞/ウェル）を、3mMグルコースKRBH緩衝液（500μl/ウェル）中で予備培養した。次に、インスリン分泌レベルの指標としてc-ペプチド分泌レベルを決定するために、細胞を、3mMまたは20mMグルコースを含むKRBB（200μl/ウェル）中でインキュベートした。30分後に、細胞を遠心分離によってペレット化し、ヒトc-ペプチドELISAキット（Millipore）によって、c-ペプチドレベルを決定した。
実施例10:方法
定量的RT-PCR解析
TRIzol試薬（Invitrogen）およびRNeasyキット（Qiagen）を使って全RNAを抽出した。逆転写はSuperScript III第一鎖合成システムキット（Invitrogen）またはPrimeScript RT試薬キット（TAKARA）で行った。SYBR Green（Bio-Rad）を使ってリアルタイム定量的RT-PCR（qPCR）を行った。
プロインスリン-NanoLuc用のレンチウイルス産生
pLX304中のプロインスリン-NanoLuc（Addgene、＃62057）をAddgeneから入手した。第二世代のウイルスパッケージングシステムを使ってプロインスリン-NanoLucレンチウイルスを産生した。簡単に述べると、14μgのプロインスリン-NanoLuc、6.6μgのPsPAX2パッケージングプラスミド（Addgene 12260）、5.4μgのpMD2.Gエンベローププラスミド（Addgene 12259）および54μlのLipofectamin2000（Invitrogen）を使って、T75フラスコのHEK293LTVパッケージング細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、培地を、10％FBSと1％ペニシリン/ストレプトゾシンとを含む新鮮なDMEMに変えた。トランスフェクションの48時間および96時間後に、ウイルスをそれぞれ1日目および3日目として収集し、0.2μm酢酸セルロースフィルタ（VWR）に通した。ウイルスを小分けし、使用時まで-80℃で凍結しておいた。
インスリン分泌測定のためのガウシアルシフェラーゼアッセイ
マウス島、ヒト島、およびヒト島様オルガノイドを、10μg/mlポリブレン（Polybrene（登録商標））ポリマー（Santacruz）を含むそれぞれの増殖培地にプレーティングした。次にウイルスを加えた。終夜培養後に、細胞を新鮮な増殖培地に入れた。感染の48～72時間後に、マウス島、ヒト島およびヒト島様オルガノイドを用手的に拾い上げて、96ウェルに島またはオルガノイドを1つずつ入れた。次にインスリン分泌アッセイを行った。簡単に述べると、単一の島またはオルガノイドを、3mMグルコースKRBBと共に、37℃で30分～1時間、予備インキュベートした。次に細胞をKRBB（100μl/ウェル）中で3mMグルコースと共に30分間インキュベートし、続いて100nMエキセンディン-4ありまたはなしで20mMグルコースと共にインキュベートするか、20mM KClを含む3mMグルコース（100μl/ウェル）と共にインキュベートした。インスリン分泌レベルの指標としてガウシアルシフェラーゼ活性を決定するには、試料のうち10μlを、Pierceガウシアルシフェラーゼフラッシュアッセイキット（製品番号16159、Thermo Scientific）を用いるルシフェラーゼアッセイに使用する。
スピンフェクション（800g、37℃で1時間によってウイルスをINS-1細胞に感染させた後、新鮮なINS-1増殖培地に変えた。トランスフェクションの72時間後に、プロインスリン-NanoLuc発現細胞を選択するために、INS-1細胞を5μg/mlブラストサイジン（Invitrogen）で7日間処理した。インスリン分泌アッセイのために、細胞（96ウェル中、5×104～1×105細胞/ウェル）を3mMグルコースKRBB（100μl/ウェル）中で予備培養した。次に細胞をKRBB（100μl/ウェル）中で3mMグルコースと共にインキュベートし、続いて100nMエキセンディン-4ありまたはなしで20mMグルコースと共にインキュベートするか、20mM KClを含む3mMグルコース（100μl/ウェル）と共にインキュベートした。インスリン分泌レベルの指標としてガウシアルシフェラーゼ活性を決定するには、試料のうち10μlを、Pierceガウシアルシフェラーゼフラッシュアッセイキット（製品番号16159、Thermo Scientific）を用いるルシフェラーゼアッセイに使用する。
インビトロでの血管新生化試験
ヒト島様オルガノイドを24ウェルプレートの1ウェルにおいてEBM培地（Ronza、cc-3121）を含む300μlのMatrigel（登録商標）マトリックスで包埋した。血管新生化は24～72時間以内に観察された。
hADSCの3D培養およびWNTタンパク質発現
hADSCは、3D培養で起こる自発的自己組織化の最中に、Wnt遺伝子、特にWnt5a経路の遺伝子の発現に変化を起こす。Wnt5aは、経時的に、hADSC 3D培養におけるWntタンパク質のうち、発現する主要なタンパク質であることがわかった。
他の態様
上述の説明から、本明細書記載の発明をさまざまな使用法および条件に採用するために、本明細書記載の発明に変形および変更を加えうることは明らかであると考えられる。そのような態様も後述する請求項の範囲内である。
本明細書における可変部の任意の定義における要素の一覧の記載は、列挙された要素の任意の単一要素または組合せ（または副組合せ）としての当該可変部の定義を含む。本明細書における態様の記載は、任意の単一態様または他の任意の態様もしくはその一部分との組合せとしての当該態様を包含する。
本明細書において言及する特許および刊行物はすべて、個々の特許および刊行物について参照により本明細書に組み入れられることを具体的かつ個別に示した場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (93)

  1. 移植されたドナー細胞を複数回の間欠的ばく露でインターフェロンγ（IFNγ）に接触させ、それによって、移植されたドナー細胞の生残を向上させるかまたは移植されたドナー細胞の細胞死を低減する工程
    を含む、移植されたドナー細胞の生残を向上させるかまたは移植されたドナー細胞の細胞死を低減する方法。
  2. 前記ドナー細胞がオルガノイド細胞、島細胞、島様オルガノイド細胞、β様島細胞である、請求項1記載の方法。
  3. Wnt4タンパク質またはWnt5aタンパク質を含む三次元マトリックス中で、多細胞島様オルガノイドを生成させるのに十分な時間、内分泌前駆細胞を培養する工程であって、該多細胞島様オルガノイドが、ベータ（β）細胞、アルファ（α）細胞、デルタ（δ）細胞、イプシロン（ε）細胞、および導管様細胞より選択される2つまたはそれ以上の細胞タイプを含み、該島様オルガノイドがグルコースに応答してインスリンを分泌する、該工程、ならびに
    該島様オルガノイドを、インターフェロンγ（IFNγ）への複数回の間欠的ばく露に供し、それによって、該島様オルガノイドによる免疫チェックポイントタンパク質の持続的発現を誘導し、かつ免疫検出または自己免疫を該島様オルガノイドが回避することを可能にする工程
    を含む、免疫検出または自己免疫を回避する島様オルガノイドを生成させる方法。
  4. Wnt4タンパク質またはWnt5aタンパク質を含む三次元マトリックス中で、多細胞島様オルガノイドを生成させるのに十分な時間、免疫チェックポイントタンパク質を組換えにより発現する内分泌前駆細胞を培養する工程であって、該多細胞島様オルガノイドが、ベータ（β）細胞、アルファ（α）細胞、デルタ（δ）細胞、イプシロン（ε）細胞、および導管様細胞より選択される2つまたはそれ以上の細胞タイプを含み、該島様オルガノイドが、グルコースに応答してインスリンを分泌し、かつ免疫検出および自己免疫を回避する、該工程
    を含む、免疫検出または自己免疫を回避する島様オルガノイドを生成させる方法。
  5. 前記三次元マトリックスがジェランガムを含む、請求項3または請求項4記載の方法。
  6. 前記三次元マトリックスが組換えヒトWnt4タンパク質を含む、請求項3～5のいずれか一項記載の方法。
  7. 前記免疫チェックポイントタンパク質の組換え発現が、該免疫チェックポイントタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターによる島様オルガノイド細胞の形質導入に起因する、請求項4記載の方法。
  8. 前記免疫チェックポイントタンパク質が、免疫細胞で発現するコグネイトリガンドに結合し、該コグネイトリガンドが、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）;細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4（CTLA-4）;リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3）;キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）;インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（4-1BB）;グルココルチコイド誘導性TNFRファミリー関連遺伝子（GITR）;T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン（TIM-3）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（OX40）;アデノシンA2A受容体（A2AR）;B7-H3;B7-H4;B7-1/B7-2;BTLA;T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー（VISTA）;または前述のうちのいずれかの組合せより選択される、請求項3～7のいずれか一項記載の方法。
  9. 前記免疫チェックポイントタンパク質がプログラム死リガンド-1（PD-L1）である、請求項3～8のいずれか一項記載の方法。
  10. 前記細胞、島、オルガノイド、または島様オルガノイドが、少なくとも2日間の間に少なくとも2回、IFNγにばく露される、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  11. 前記細胞、島、オルガノイド、または島様オルガノイドが、少なくとも3日間の間に少なくとも3回、IFNγにばく露される、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  12. 前記細胞、島、オルガノイド、または島様オルガノイドが、少なくとも2日間の間に少なくとも2回、1時間超にわたってIFNγにばく露される、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  13. 前記細胞、島、オルガノイド、または島様オルガノイドが、少なくとも3日間の間に少なくとも3回、1時間超にわたってIFNγにばく露される、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  14. 前記細胞、島、オルガノイド、または島様オルガノイドが、少なくとも3日間の間に少なくとも3回、2時間にわたってIFNγにばく露される、請求項13記載の方法。
  15. 前記内分泌前駆細胞が、誘導多能性幹細胞（iPSC）、胚性多能性幹細胞（ePSC）、および/または膵臓前駆細胞より選択される、請求項3～14のいずれか一項記載の方法。
  16. 前記内分泌前駆細胞が、ニューロゲニン3、neurod1、Nkx2.2、およびPax4バイオマーカーのうちの少なくとも1つのバイオマーカーを発現する、請求項3～15のいずれか一項記載の方法。
  17. 前記島様オルガノイドがヒト島様オルガノイド（HILO）である、請求項2～16のいずれか一項記載の方法。
  18. 前記島様オルガノイドが血管新生化される、請求項17記載の方法。
  19. 前記島様オルガノイドが脂肪由来幹細胞および/または内皮細胞をさらに含む、請求項2～17のいずれか一項記載の方法。
  20. 前記脂肪由来幹細胞がヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）であり、かつ/または前記内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）である、請求項19記載の方法。
  21. 前記島様オルガノイドが、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、グルカゴン分泌のうちの少なくとも1つをさらに呈する、請求項2～20のいずれか一項記載の方法。
  22. 前記島様オルガノイドが、NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB、およびSYT4からなる群より選択されるβ細胞系列マーカーと、ARXα細胞系列マーカーとを発現する、請求項2～21のいずれか一項記載の方法。
  23. 前記三次元マトリックスが、ヒトWnt4タンパク質、組換えヒトWnt4タンパク質、ヒトWnt5タンパク質、または組換えヒトWnt5aタンパク質を含む、請求項3または請求項4記載の方法。
  24. 前記三次元マトリックスが組換えヒトWnt4タンパク質を含む、請求項23記載の方法。
  25. 前記島様オルガノイドがエストロゲン関連受容体γ（ERRγ）の発現の増大を呈する、請求項2～24のいずれか一項記載の方法。
  26. 前記島様オルガノイドが、酸素消費速度（OCR）の増加と細胞酸性化速度（ECAR）の減少とを特徴とする増大した酸化的代謝を呈する、請求項2～25のいずれか一項記載の方法。
  27. 前記島様オルガノイドが、膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドである、請求項2～26のいずれか一項記載の方法。
  28. 前記島様オルガノイドがヒト膵島オルガノイドである、請求項27記載の方法。
  29. 前記ドナー細胞が、心臓細胞、結腸細胞、腎臓細胞、肝臓細胞（肝細胞）、食道細胞、胃腸細胞、胃部（胃）細胞、肺細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、筋細胞、造血細胞、B細胞、T細胞、CD34＋造血細胞、キメラ抗原受容体-T細胞（CAR-T細胞）、骨髄細胞、ニューロン、神経細胞、網膜細胞、角膜細胞、脳細胞、ヒト皮膚細胞に由来するインスリン産生膵臓β細胞、卵巣細胞、子宮頸部細胞、精巣細胞、単核球、臍帯血（UCB）細胞、脂肪由来間葉系間質（幹）細胞、心臓幹細胞、結腸幹細胞、腎臓幹細胞、肝臓（肝細胞）幹細胞、胃腸幹細胞、胃部（胃）幹細胞、肺幹細胞、膵臓幹細胞、膵臓β幹細胞、筋幹細胞、造血幹細胞、T細胞幹細胞またはB細胞幹細胞、骨髄幹細胞、CD133＋幹細胞、CD34＋造血幹細胞、網膜幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、外胚葉由来の神経細胞、外胚葉由来のドーパミン作動性神経細胞、角膜由来の細胞、正常ヒト角膜上皮細胞、不死化ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞、内胚葉由来の肝臓細胞、中胚葉由来の筋細胞、骨髄細胞、腎臓細胞、および骨格筋細胞、または該細胞から生成されるもしくは該細胞を含有するオルガノイド;腸オルガノイド、肝オルガノイド、結腸オルガノイド、肝オルガノイド、腎臓オルガノイド、膀胱オルガノイド、卵巣オルガノイド、子宮頸部オルガノイド、神経オルガノイド、または肺臓（肺）オルガノイドより選択される、請求項1または請求項2記載の方法。
  30. （a）Wnt4タンパク質またはWnt5aタンパク質を含む三次元マトリックス中で、多細胞ヒト島様オルガノイドを生成させるのに十分な時間、内分泌前駆細胞を培養する工程であって、該多細胞ヒト島様オルガノイドが、ベータ（β）細胞、アルファ（α）細胞、デルタ（δ）細胞、イプシロン（ε）細胞、および導管様細胞より選択される2つまたはそれ以上の細胞タイプを含み、該ヒト島様オルガノイドがグルコースに応答してインスリンを分泌する、該工程、
    （b）工程（a）のHILOを、少なくとも48～72時間の全期間の間に2回または3回、各回1時間超にわたって、インターフェロンγ（IFNγ）と接触させる工程
    を含む、免疫検出または自己免疫を回避するヒト島様オルガノイド（HILO）を生成させる方法であって、
    IFNγとの接触時間同士の間はヒト島またはHILOがIFNγの非存在下で維持され、かつ工程（a）および工程（b）によって、該HILOにおける免疫チェックポイントタンパク質プログラム死リガンド-1（PD-L1）の持続的発現が誘導される、該方法。
  31. 工程（b）において、前記HILOを2時間にわたってIFNγと接触させる、請求項30記載の方法。
  32. 前記HILOを、少なくとも48時間の間に2回、各回2時間にわたって、IFNγと接触させる、請求項30または請求項31記載の方法。
  33. 前記HILOを、少なくとも72時間の間に3回、各回2時間にわたって、IFNγと接触させる、請求項30または請求項31記載の方法。
  34. 前記内分泌前駆細胞が、誘導多能性幹細胞（iPSC）、胚性多能性幹細胞（ePSC）、および/または膵臓前駆細胞より選択される、請求項30～33のいずれか一項記載の方法。
  35. 前記内分泌前駆細胞が、ニューロゲニン3、neurod1、Nkx2.2、およびPax4バイオマーカーのうちの少なくとも1つのバイオマーカーを発現する、請求項30～34のいずれか一項記載の方法。
  36. 前記HILOが、血管新生化され、かつ酸素消費速度（OCR）の増加と細胞酸性化速度（ECAR）の減少とを特徴とする増大した酸化的代謝を呈する、請求項30～35のいずれか一項記載の方法。
  37. IFNγが1～25ng/mlの量で使用される、請求項1～36のいずれか一項記載の方法。
  38. IFNγが10ng/mlの量で使用される、請求項37記載の方法。
  39. 前記島様オルガノイドまたはHILOにおけるPD-L1発現が7日超にわたって維持される、請求項8～36のいずれか一項記載の方法。
  40. 免疫チェックポイントタンパク質の持続的発現を有する、免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドであって、
    該オルガノイドが、請求項1～39のいずれか一項記載の方法によって産生される、該免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドまたは膵島オルガノイド。
  41. 免疫チェックポイントタンパク質PD-L1の持続的発現を呈する、請求項40記載のヒト島様オルガノイドまたは膵島オルガノイド。
  42. Wnt4タンパク質またはWnt5タンパク質を含む三次元マトリックス中で培養された内分泌前駆細胞に由来し、かつ多系列細胞を含む、ヒト島様オルガノイド（HILO）であって、
    該多系列細胞が、ベータ（β）細胞、アルファ（α）細胞、デルタ（δ）細胞、イプシロン（ε）細胞、および導管様細胞のうちの少なくとも2つを含み、該HILOが、血管新生化され、グルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を呈し、かつ免疫チェックポイントタンパク質の持続的発現を呈する、該ヒト島様オルガノイド（HILO）。
  43. 膵島様オルガノイドまたは膵臓オルガノイドである、請求項42記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  44. KCl刺激インスリン分泌またはグルコース刺激インスリン分泌をさらに呈する、請求項42または請求項43記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  45. 前記三次元マトリックスがジェランガムを含む、請求項42～44のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  46. 前記三次元マトリックスが組換えヒトWnt4タンパク質を含む、請求項42～45のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  47. 前記三次元マトリックスが組換えヒトWnt5タンパク質を含む、請求項42～46のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  48. 前記内分泌前駆細胞が、誘導多能性幹細胞（iPSC）、胚性多能性幹細胞（ePSC）、および/または膵臓前駆細胞より選択される、請求項42～47のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  49. 前記内分泌前駆細胞が、ニューロゲニン3、neurod1、Nkx2.2、およびPax4バイオマーカーのうちの少なくとも1つのバイオマーカーを発現する、請求項42～48のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  50. FLTP遺伝子およびESRRγ遺伝子を発現する、請求項42～49のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  51. 脂肪由来幹細胞および/または内皮細胞をさらに含む、請求項42～50のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  52. 前記脂肪由来幹細胞がヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）であり、かつ/または前記内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）である、請求項51記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  53. KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、またはグルカゴン分泌をさらに呈する、請求項42～52のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  54. NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB、およびSYT4からなる群より選択されるβ細胞系列マーカーと、ARXα細胞系列マーカーとを発現する、請求項40～53のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  55. 膵臓HILOが、Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6、およびFoxa2からなる群より選択されるβ細胞転写因子を発現する、請求項40～52のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  56. 前記免疫チェックポイントタンパク質が、免疫細胞で発現するコグネイトリガンドに結合し、該コグネイトリガンドが、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）;細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4（CTLA-4）;リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3）;キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）;インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（4-1BB）;グルココルチコイド誘導性TNFRファミリー関連遺伝子（GITR）;T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン（TIM-3）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（OX40）;アデノシンA2A受容体（A2AR）;B7-H3;B7-H4;B7-1/B7-2;BTLA;T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー（VISTA）;または前述のうちのいずれかの組合せより選択される、請求項42～55のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  57. 前記免疫チェックポイントタンパク質がプログラム死リガンド-1（PD-L1）である、請求項42～56のいずれか一項記載のヒト島様オルガノイド（HILO）。
  58. 前記ヒト島様オルガノイド、膵島オルガノイド、または請求項42～57のいずれか一項記載のHILOを移植または埋植されたヒト以外の生物。
  59. 哺乳動物である、請求項58記載のヒト以外の生物。
  60. マウスである、請求項58記載のヒト以外の生物。
  61. 免疫保護された島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドを対象に移植または埋植する工程を含む、該対象における膵臓疾患を処置する方法であって、
    該島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドが、β細胞、α細胞、δ細胞、ε細胞、導管様細胞、またはそれらの組合せを含み内分泌前駆細胞に由来する多系列細胞を含み、血管新生化され、グルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を呈し、かつ免疫検出または自己免疫を回避するために免疫チェックポイントタンパク質の持続的発現を呈する、該方法。
  62. 免疫保護された島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドを対象に移植または埋植する工程を含む、該対象における1型糖尿病を処置する方法であって、
    該島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドが、β細胞、α細胞、δ細胞、ε細胞、導管様細胞、またはそれらの組合せを含み内分泌前駆細胞に由来する多系列細胞を含み、血管新生化され、グルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を呈し、かつ免疫検出または自己免疫を回避するために免疫チェックポイントタンパク質の持続的発現を呈する、該方法。
  63. 前記島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドが、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、またはグルカゴン分泌をさらに呈する、請求項61または請求項62記載の方法。
  64. 前記島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドが、NKX2-2、NEUROD1、RFX6、GCK、INS、NKX6-1、UCN3、MAFB、およびSYT4からなる群より選択されるβ細胞系列マーカーと、ARXα細胞系列マーカーとを発現する、請求項61～63のいずれか一項記載の方法。
  65. 前記内分泌前駆細胞が、誘導多能性幹細胞（iPSC）、胚性多能性幹細胞（ePSC）、および/または膵臓前駆細胞より選択される、請求項61～64のいずれか一項記載の方法。
  66. 前記内分泌前駆細胞が、ニューロゲニン3、neurod1、Nkx2.2、およびPax4バイオマーカーのうちの少なくとも1つのバイオマーカーを発現する、請求項61～65のいずれか一項記載の方法。
  67. 前記島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドが、Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6、およびFoxa2からなる群より選択されるβ細胞転写因子を発現する、請求項61～66のいずれか一項記載の方法。
  68. 前記免疫チェックポイントタンパク質が、免疫細胞で発現するコグネイトリガンドに結合し、該コグネイトリガンドが、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）;細胞傷害性Tリンパ球タンパク質4（CTLA-4）;リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3）;キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）;インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9（4-1BB）;グルココルチコイド誘導性TNFRファミリー関連遺伝子（GITR）;T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン（TIM-3）;腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（OX40）;アデノシンA2A受容体（A2AR）;B7-H3;B7-H4;B7-1/B7-2;BTLA;T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー（VISTA）;または前述のいずれかの組合せより選択される、請求項61～67のいずれか一項記載の方法。
  69. 前記免疫チェックポイントタンパク質がプログラム死リガンド-1（PD-L1）である、請求項61～68のいずれか一項記載の方法。
  70. 前記島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドが、請求項1～37のいずれか一項記載の方法によって産生される、請求項61～69のいずれか一項記載の方法。
  71. 前記島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドが、請求項40～57のいずれか一項記載のオルガノイドである、請求項61～70のいずれか一項記載の方法。
  72. 免疫抑制物質が前記対象に投与される、請求項61～71のいずれか一項記載の方法。
  73. 前記対象がヒトである、請求項61～72のいずれか一項記載の方法。
  74. 前記膵臓疾患が1型糖尿病または2型糖尿病である、請求項61または請求項63～73のいずれか一項記載の方法。
  75. 移植または埋植の後に生残しかつ細胞死が低減している細胞、島、またはオルガノイドを生成させる方法であって、
    （a）インターフェロンγ（IFNγ）受容体を発現する細胞、島、またはオルガノイドを、インターフェロンγ（IFNγ）と、予め決められた時点において少なくとも0.5時間または少なくとも1時間接触させる工程、および
    （b）約72時間または少なくとも約72時間の期間中に、工程（a）を少なくとも2回繰り返す工程
    を含み、
    IFNγとの接触時間同士の間は該細胞、島、またはオルガノイドがIFNγの非存在下で維持され、かつ工程（a）および工程（b）によって、該細胞、島、またはオルガノイドにおけるPD-L1の持続的発現が誘導される、
    該方法。
  76. 工程（a）において、前記細胞、島、オルガノイド、または細胞を、少なくとも1時間、少なくとも2時間、または2時間超より選択される期間にわたって、IFNγと接触させる、請求項75記載の方法。
  77. 工程（a）において、前記細胞、島、またはオルガノイドを、約2時間もしくは2時間または約12時間もしくは12時間より選択される期間にわたって、IFNγと接触させる、請求項75または請求項76記載の方法。
  78. 工程（a）が、工程（b）の少なくとも約72時間または少なくとも72時間の期間中に少なくとも3回繰り返され、各回が少なくとも約2時間にわたる、請求項75～77のいずれか一項記載の方法。
  79. 工程（a）と工程（b）の間で、IFNγの存在を除去するために前記細胞、島、またはオルガノイドが洗浄される、請求項75～78のいずれか一項記載の方法。
  80. IFNγが1～25ng/mlの量で使用される、請求項75～79のいずれか一項記載の方法。
  81. IFNγが10ng/mlの量で使用される、請求項75～79のいずれか一項記載の方法。
  82. 前記細胞、島、またはオルガノイドにおけるPD-L1発現が、工程（b）後に約7日超にわたって維持される、請求項75～81のいずれか一項記載の方法。
  83. 免疫検出または自己免疫を回避する細胞、島、またはオルガノイドおよびそれらの細胞を生成させる方法であって、
    （a）インターフェロンγ（IFNγ）受容体を発現する細胞、島、またはオルガノイドおよびそれらの細胞を、少なくとも約24時間または少なくとも24時間の期間中の第1の時点において1時間超にわたって、約1ng/ml～25ng/mlの量のインターフェロンγ（IFNγ）と接触させる工程、ならびに
    （b）該細胞、島、またはオルガノイドおよびそれらの細胞を、工程（a）後の後続する少なくとも約48時間の期間中の2つまたはそれ以上の追加の時点において、約0.5時間またはそれ以上を超える時間にわたって、約1ng/ml～25ng/mlの量のIFNγと接触させる工程
    を含み、
    IFNγと接触させること同士の間は、該細胞、島、またはオルガノイドを洗浄してIFNγの非存在下の培地中で休止させ、かつ工程（a）および工程（b）によって、該細胞、島、またはオルガノイドにおけるPD-L1の持続的発現が誘導される、
    該方法。
  84. 工程（a）および工程（b）において、前記細胞、島、またはオルガノイドを、10ng/mlの量のIFNγと、少なくとも2時間にわたって接触させる、請求項83記載の方法。
  85. 前記細胞、島、またはオルガノイドを、72時間の期間中の3つの時点において少なくとも約2時間にわたって、IFNγと接触させる、請求項83または請求項84記載の方法。
  86. 前記細胞、島、またはオルガノイドがヒトの細胞、島、またはオルガノイドである、請求項1または請求項75～85のいずれか一項記載の方法。
  87. 前記オルガノイドがHILOまたはヒトHILOである、請求項86記載の方法。
  88. 前記細胞が、心臓細胞、結腸細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、肝臓細胞（肝細胞）、食道細胞、胃腸細胞、胃部（胃）細胞、肺細胞、卵巣細胞、子宮頸部細胞、子宮細胞、精巣細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、網膜細胞、角膜細胞、脳細胞、筋細胞、造血細胞、免疫細胞（B細胞、T細胞）、キメラ抗原受容体-T細胞（CAR-T細胞）、骨髄細胞、単核球、ニューロン、神経細胞、ヒト皮膚細胞に由来するインスリン産生膵臓β細胞、臍帯血（UCB）細胞、脂肪由来間葉系間質（幹）細胞、心臓幹細胞、結腸幹細胞、腎臓幹細胞、肝臓（肝細胞）幹細胞、胃腸幹細胞、胃部幹細胞、肺幹細胞、膵臓幹細胞、膵臓β幹細胞、筋幹細胞、造血幹細胞、免疫細胞（T細胞またはB細胞）幹細胞、骨髄幹細胞、CD133＋幹細胞、CD34＋造血細胞、CD34＋造血幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、網膜幹細胞、神経幹細胞、外胚葉由来の神経細胞、不死化ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞、および該細胞から生成されるまたは該細胞を含有するオルガノイドを含む、請求項86記載の方法。
  89. 前記オルガノイドが、心臓オルガノイド、腸/胃腸オルガノイド、結腸オルガノイド、肝オルガノイド、腎臓オルガノイド、膀胱オルガノイド、卵巣オルガノイド、子宮頸部オルガノイド、神経オルガノイド、または肺臓（肺）オルガノイドを含む、請求項86記載の方法。
  90. 前記島が、免疫系の細胞による破壊またはクリアランスから保護されたヒト死体島である、請求項1、請求項2、または請求項75～87のいずれか一項記載の方法。
  91. その必要がある対象に、請求項40～57のいずれか一項記載の免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドを投与する工程を含む、細胞移植の方法。
  92. 前記免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドまたは膵島オルガノイドが、同系、自家、同種異系、または異種である、請求項91記載の方法。
  93. 請求項40～57のいずれか一項記載の免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドもしくは膵島オルガノイドまたは該免疫保護された細胞、ヒト島様オルガノイドもしくは膵島オルガノイドを含む薬学的に許容される組成物を含む、キット。
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