CN111607610A - 癌症特异性反式剪接核酶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及癌症特异性反式剪接核酶及其的用途。根据本发明的反式剪接核酶不作用于正常组织，而是在癌症组织中特异性表达，从而安全性高，并且在转录后水平上表达效率优异，因此可有效地用于癌症的治疗。具体地，根据本发明的重组载体由于含有CMV启动子、SD/SA和WPRE序列，从而具有较高的核酶的表达效率，并且由于含有miR‑122T，而可以通过miR‑122调节活性，因此具有优异的安全性。因此，在以HCV为起因的肝癌中，除了miR‑122在癌组织中的表达高于正常组织的部分肝癌之外，根据本发明的反式剪接核酶可以有效地用于治疗所有肝癌，也可有效地用于治疗实质上不本表达miR‑122的其他癌症。
Description
技术领域
本发明涉及癌症特异性反式剪接核酶及其用途。
背景技术
端粒酶(telomerase)是一种核糖核蛋白(ribonucleoprotein)，通过将TTAGGG序列重复添加至位于染色体3'端的端粒末端，以恢复在DNA复制时缩短的端粒部位，从而使得细胞能够永生性增殖。端粒酶是调节癌细胞永生性和增殖能力的最重要的酶之一，造血细胞和80-90％的癌细胞具有端粒酶活性，而癌细胞附近的正常细胞不具有此活性，端粒酶的再激活进一步对晚期转移性癌症的无限生长产生主要影响。
人的端粒酶由用作底物RNA的人端粒酶RNA(hTR)和起到催化作用的端粒酶逆转录酶(hTERT)两个部分组成。人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达与端粒酶活性成比例，并且细胞内hTERT水平与细胞的端粒酶活性之间存在很强的相关性。尤其，在超过90％的癌症患者中观察到了TERT活性。
近来，在已知靶向上述hTERT的反式剪接核酶的同时，也积极地尝试使用这种酶来开发癌症治疗剂。但是，反式剪接核酶和组织特异性启动子的组合显示出高度的组织特异性，而表达效率却极低，因此在治疗效率方面的存在缺陷。此外，由于端粒酶活性也在如干细胞、造血干细胞、生殖细胞和再生正常肝细胞等的正常细胞中表达，所以靶向hTERT的治疗会引起对这些细胞的毒性。已知，尽管肝细胞较弱，但5％的正常肝细胞仍具有端粒酶活性，且再生肝(regenerating liver)的端粒酶活性会有增加。尤其，肝细胞癌(HCC)大部分伴随有肝硬化，虽然TERT在肝硬化部位构成再生性结节的非肿瘤性肝细胞(non-tumoroushepatocytes)中的表达水平较低，但仍然会表达TERT。
韩国专利第10-2016-0038674号公开了一种重组载体及由该载体表达的核酶在预防或治疗癌症中的用途，所述重组载体在核酶目的基因表达盒中与用于识别微小RNA-122(microRNA-122、miR-122)的核酸序列进一步连接，所述核酶目的基因表达盒包含组织特异性启动子、靶向癌症特异性基因的反式剪接核酶以及与所述核酶的3'外显子连接的目的基因。所述miR-122是一种已知的在正常肝脏中极为过度表达的微小RNA，并在进展为肝癌时，其表达会下降。基于这种现象，虽然现有技术通过将miR-122靶位点引入至核酶表达载体的3'UTR位点，以使递送至肝脏的核酶不会被过度表达于正常肝脏中的miR-122所表达，但能在miR-122水平下降的肝癌中表达并发挥作用。
然而，现有技术的问题在于，为了显示出治疗效果，需要使用高浓度的导入有载体的病毒进行处理。此外，据报道，与正常肝脏相比，在由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的肝癌组织中，大多情况下miR-122的表达有增加。因此，问题在于能否应用于miR-122的表达有增加的肝癌、或肝癌之外的其他癌症。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：韩国专利公开号10-2016-0038674。
发明内容
技术问题
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种具有优异的安全性和表达效果的癌症特异性反式剪接核酶在癌症治疗中的用途。
技术方案
本发明提供一种重组载体，其特征在于，包含
(i)巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子；和
(ii)含有靶向癌症特异性基因序列的反式剪接核酶、及与所述核酶的3'外显子连接的目的基因的核酶目的基因表达盒，
所述表达盒在核酶目的基因表达盒的5'端与剪接供体/剪接受体序列(SD/SA序列)相连，3'端与WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)相连，
(ⅲ)所述WPRE的3'端进一步与用于识别微小RNA-122(microRNA-122，miR-122)的核酸序列连接。
此外，本发明还提供给一种基因传递系统，其包含所述重组载体。
此外，本发明还提供给一种核酶，其由所述重组载体表达。
此外，本发明还提供给一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含作为有效成分的所述重组载体、基因传递系统、或者核酶。
有益效果
根据本发明的反式剪接核酶不作用于正常组织，而是在癌症组织中特异性表达，从而安全性高，并且在转录后水平上表达效率优异，因此可有效地用于癌症的治疗。具体地，根据本发明的重组载体由于含有CMV启动子、SD/SA和WPRE序列，从而具有较高的核酶的表达效率，并且由于含有miR-122T，而可以通过miR-122调节活性，因此具有优异的安全性。因此，在起因为HCV的肝癌中，除了miR-122在癌组织中的表达高于正常组织的部分肝癌之外，根据本发明的反式剪接核酶可以有效地用于治疗所有肝癌，也可有效地用于治疗实质上不本表达miR-122的其他癌症。
附图说明
图1示出了本发明的基于CMV启动子的hTERT靶反式剪接核酶和目的基因表达盒的组成的示意图。
图2示出了在不表达miR-122的Hep3B细胞株(a)和表达miR-122的Huh-7.5细胞株(b)中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的细胞存活率的图。
图3示出了在不表达miR-122的细胞株(a：Hep3B、b：SNU398、c：SNU449)中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的细胞存活率的图。
图4示出了在表达miR-122的细胞株(a:Huh-7、b:Huh-7.5)中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的细胞存活率的图。
图5示出了在表达或不表达miR-122的各种肝癌细胞株中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的细胞存活率的图。
图6示出了在源自肝癌患者的对索拉非尼(Sorafenib)具有敏感性、或不具有敏感性的细胞株中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的细胞存活率的图。
图7示出了在动物肝癌模型中，根据表达ECRT或ECRT-122T的腺病毒的注射剂量，对肿瘤的重量(a)、肿瘤组织(b)和肝酶(GOT：谷氨酸草酰乙酸转氨酶、GPT：谷氨酸丙酮酸转氨酶)的确认结果。
图8示出了在表达miR-122的Huh-7细胞株中，根据转导的重组载体的MOI的RNA表达量(a:E4、b:核酶、c:miR-122)的图。
图9示出了在表达miR-122的Huh-7.5细胞株中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的RNA表达量(a:E4、b:核酶、c:miR-122)的图。
图10示出了在具有miR-122四环素可调控系统的Hep3B稳定的细胞株克隆(#7-14、7-4和7-2)中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI和四环素浓度的细胞存活率、miR-122表达量和核酶表达量的图。
图11示出了肝癌患者的正常肝组织和肝癌组织中的miR-122的表达量的比较图(a：所有患者组、b：HBV相关患者组、c：HCV相关患者组、d：酒精相关患者组、e：HBV和HCV相关的患者除外的慢性乙型肝炎患者组、f：其他病因患者组)。
图12示出了源自患者的肝癌细胞的肝癌细胞株中的hTERT的mRNA(a)、蛋白水平(b)、及miR-122水平(c)的分析结果。
图13示出了在结直肠癌细胞株、胶质母细胞瘤细胞株、黑素瘤细胞株、宫颈癌细胞株、肺癌细胞株、骨肉瘤细胞株和乳腺癌细胞株中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的细胞存活率的图。
图14示出了在胆道癌细胞株(a：SNU478，b：SNU869)中，根据转导的ECRT-122T腺病毒的MOI的细胞存活率的图。
图15示出了向裸鼠注射作为胶质母细胞瘤细胞的LN229细胞株以诱导肿瘤形成之后，施用ECRT-122T腺病毒的肿瘤大小(a)和肿瘤重量(b)的确认图。
图16示出了向裸鼠注射作为胶质母细胞瘤细胞的U87MG细胞株以诱导肿瘤形成之后，施用ECRT-122T腺病毒的肿瘤大小的确认图。
图17示出了用ECRT-122T腺病毒对正常ICR小鼠进行静脉注射后，重组载体在主要组织中的分布程度图。
图18示出了用ECRT-122T腺病毒对大鼠进行肝动脉注射后，重组载体在主要组织中的分布程度图。
图19示出了用ECRT-122T腺病毒对大鼠进行肝动脉注射后，通过从各脏器分离基因组DNA(gDNA)来定量HSVtk DNA的结果图。
图20示出了用ECRT-122T腺病毒对大鼠进行肝动脉注射后，从分离自肝脏的RNA中确认核酶的表达水平的结果图。
图21示出了向正常ICR小鼠注射ECRT-122T腺病毒并处理GCV之后，对AST和ALT水平的测量结果图。
图22示出了向正常ICR小鼠注射ECRT-122T腺病毒并处理GCRT之后，对小鼠的体重(a)、饲料消耗量(b)和肝脏重量(c)的测量结果图。
图23示出了向正常ICR小鼠注射不同剂量的ECRT-122T腺病毒并处理GCV之后，所进行的肝脏组织病理学检测的结果。
图24示出了向正常ICR小鼠注射ECRT-122T腺病毒注射到之后，对AST和ALT水平的测量结果图。
图25示出了向正常ICR小鼠注射ECRT-122T腺病毒之后，对小鼠的体重(a)、饲料消耗量(b)和肝脏重量(c)的测量结果图。
图26示出了向正常ICR小鼠注射不同剂量的ECRT-122T腺病毒后，所进行的肝脏组织病理学检测的结果。
图27示出了通过向小鼠注射Hep3B细胞以诱导肝癌形成之后，对施用CRT-122T或ECRT-122T腺病毒的抗癌功效的比较结果。
图28示出了通过向小鼠异种移植皮下模型注射SNU398细胞以诱导肿瘤形成之后，对施用CRT-122T或ECRT-122T腺病毒的抗癌功效的比较结果。
图29示出了向正常ICR小鼠注射ECRT或ECRT-122T腺病毒之后，对AST和ALT水平的测量结果图。
具体实施方式
以下，将详述本发明。
在本发明中，当某个部分“包括”某个元件时，除非另有说明，否则该元件可进一步包括其他元件，而非排除。
重组载体
一个方面，本发明提供一种重组载体，其特征在于，包含：
(i)巨细胞病毒启动子；和
(ii)含有靶向癌症特异性基因序列的反式剪接核酶，及与所述核酶的3'外显子连接的目的基因的核酶目的基因表达盒，
所述表达盒在核酶目的基因表达盒的5'端与剪接供体/剪接受体序列(SD/SA序列)相连，3'端与WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)相连，
(ⅲ)所述WPRE的3'端进一步与用于识别微小RNA-122(microRNA-122，miR-122)的核酸序列连接。
根据本发明的重组载体的特征在于，当使用巨细胞病毒(CMV)启动子，并在核酶及目的基因的两端将SD/SA序列和WPRE作为元件进行包含时，基于在体内具有卓越的癌症治疗效果，该重组载体通过同时使用CMV启动子、SD/SA序列和WPRE，通过进一步包含用于识别miR-122的核酸序列，不仅能治疗肝癌细胞，还能治疗各种癌细胞。
在本发明中，所使用的术语“载体”是指，能够在合适的宿主细胞中表达目的基因的表达载体，并且是指包含必需调控元件的基因构建体，载体内包含的基因插入物可操作地连接至所述必需调控元件以被表达。
在本发明中，所使用的术语“可操作地连接(operably linked)”是指，执行常规功能的核酸表达调控序列与编码目的基因的核酸序列的功能性连接(functional linkage)。
例如，当将核酶编码序列与启动子可操作地连接时，核酶编码序列的表达可处于启动子的影响或调控之下。当诱导启动子的作用以转录核酶编码序列时，使得两个核酸序列(核酶编码序列和该序列的5'端启动子区域序列)可操作地连接，所述两个序列之间的连接特性不诱导移码突变，且在表达调控序列不抑制核酶的表达时，则可以认为所述两个核酸序列是可操作地连接的。可使用本领域公知的基因重组技术来实现与重组载体的可操作连接，并且可以采用本领域公知的酶来进行位点特异性DNA的切割和连接。
除了如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、增强子的表达调控元件以外，根据本发明的载体还包括用于膜靶向或分泌的信号序列或前导序列，并可以根据目的以各种方式进行制备。载体的启动子可为组成型或诱导型。此外，表达载体包含用于选择含有载体的宿主细胞的选择标记，并且当表达载体为可复制的表达载体时，可包括复制子。载体可自我复制或整合到宿主DNA中。
优选地，根据本发明的载体可为质粒载体、粘粒载体或病毒载体等，最优选为病毒载体。优选地，所述病毒载体可为来源于逆转录病毒(Retrovirus)(例如，人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)、小鼠白血病病毒(Murine leukemia virus，MLV)、禽肉瘤/白血病病毒(Avian sarcoma/leucosis virus，ASLV)、脾脏坏死病毒(Spleennecrosis virus，SNV)、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(Mouse mammary tumor virus，MMTV)等)、腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)、或单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)等的载体，但不限于此。最优选地，根据本发明的重组载体可为重组腺病毒载体。
在本说明书中，所使用的术语“表达盒”是指用于表达反式剪接核酶目的基因的单位盒，其特征在于，包括CMV启动子和反式剪接核酶目的基因，并在反式剪接核酶目的基因的各个端位存在SD/SA序列和WPRE序列，且在所述WPRE的3'端进一步连接有用于识别miR-122的核酸序列。
根据本发明的反式剪接核酶目的基因表达盒是在所述剪接核酶和目的基因相连的序列中可进一步包含有用于调控转录水平的序列，即调控诱导物的表达盒。虽然本发明不限于此，但特别地，在本发明中，可连接有剪接供体/剪接受体序列(SD/SA序列)和/或WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virusPosttranscriptional Regulatory Element))连接，并在所述WPRE的3'端进一步连接有用于识别miR-122的序列。因此，根据本发明的基因表达盒可以调控核酶目的基因的表达水平，并且仅在miR-122低于一定水平时，才使得核酶表达，从而可以最大程度地减少对正常肝细胞的影响。
优选地，根据本发明的核酶目的基因表达盒可以为，在核酶的5'端连接有剪接供体/剪接受体序列(SD/SA)，在目的基因的3'端连接有WPRE，且在所述WPRE的3'端连接有用于识别miR-122的序列。
根据本发明的SD/SA可增加转录起始(transcription initiation)和RNA聚合酶II的加工(processing)，以及mRNA的核质输出(nucleocytoplasmic export)，根据本发明的WPRE可通过增加mRNA的加工和核质输出，从而可以提高各前体mRNA(pre-mRNA)的水平。通过通过上述的构成，可以显著提高细胞中核酶的RNA水平，从而在增加体内癌细胞死亡的同时，通过实现在癌细胞中的特异性表达，以降低对正常细胞的毒性。
根据本发明的SD/SA序列为，在去除RNA转录物中内含子的剪接反应中，对应于被切除的内含子的起始端和末端的序列，通常，SD序列可为内含子的5'端的GU序列，SA序列可为内含子的3'端的AG序列。
根据本发明的WPRE是指，通过诱导用于促进转录的DNA三级结构来使基因的表达增加的序列。
在本发明中，所述SD/SA序列和WPRE序列可分别包括SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的序列，但不限于此，只要是在目的基因表达盒中存在并能促进目的基因的表达的序列即可。
在本说明书中，根据本发明的用于识别miR-122的核酸序列被称为miR-122T(微小RNA-122靶位点(microRNA-122target site))。所述miR-122T可包含一次或以上的SEQ IDNO：5所示的序列，例如，可重复地包含一至十次，优选为可重复地包含一至五次，更优选为可重复地包含一至三次。miR-122的特征在于，其在正常肝细胞中正常表达，但在肝癌细胞中的表达量会有降低。基于此，可以利用miR-122来开发出对肝癌细胞具有更高的敏感度和特异性的治疗剂，在本发明中，通过将用于识别miR-122的核酸序列连接至与目的基因连接的核酶，从而可以使肝癌细胞特异性核酶进行表达。
在本发明的一个实施例中，当进一步连接有SD/SA和WPRE时，核酶的表达会增加，从而进一步增强诱导细胞凋亡的作用。此外，可通过连接用于靶向miR-122的miR-122T，以仅诱导miR-122的表达有降低的肝癌细胞的死亡，而不会诱导miR-122的表达正常的正常肝细胞的死亡，从而证实了可对肝癌细胞进行特异性治疗(图2)。
在本发明中，所使用的术语“癌症特异性基因”是指仅在癌细胞中特异性表达或显著过度表达的基因。所述癌症特异性基因可附加有根据本发明的核酶的可特异性地作用于癌症的特征。优选地，这些癌症特异性基因可为TERT(端粒酶逆转录酶(Telomerasereverse transcriptase))mRNA序列、AFP(甲胎蛋白(alphafetoprotein))mRNA序列、CEA(癌胚抗原(carcinoembryonic antigen))mRNA序列、PSA(前列腺特异性抗原(Prostate-specific antigen))mRNA序列、CKAP2(细胞骨架相关蛋白2(Cytoskeleton-associatedprotein 2))mRNA序列、或突变型RAS(大鼠肉瘤(Rat sarcoma))mRNA序列，更优选为TERT(端粒酶逆转录酶)mRNA序列，最优选为hTERT(人端粒酶逆转录酶)mRNA序列。
在本发明中，所使用的术语“TERT”是指，用于调节癌细胞的永生性(immortality)和增殖能力的最重要的酶之一，是一种通过在染色体上形成端粒(telomere)结构以保护染色体末端来抑制细胞衰老的酶。在正常细胞中，每当细胞分裂时，端粒的长度会一点一点变短，从而导致遗传物质的损失，最终使细胞凋亡。但是，在癌细胞中，由于该酶会持续地延长端粒，因此细胞不会死亡，并且由于其直接促进了癌细胞的永生性而成为了癌症治疗时的极大阻碍。在本发明中，虽然将包含SEQ ID NO：2所示的序列的hTERT mRNA用作癌症特异性基因，但不限于此。
在本发明中，所使用的术语“启动子”为DNA的一部分，其参与RNA聚合酶的结合以启动转录。通常，启动子位于目的基因附近并在其上游，其作为与RNA聚合酶结合的位置或用于诱导RNA聚合酶的蛋白的转录因子结合的位置，可诱导所述酶或蛋白位于正确的转录起始位点。也就是说，启动子具有特定基因序列，该基因序列位于有义链(sense strand)上待转录基因的5'位点，以诱导RNA聚合酶直接或通过转录因子结合至该位置上，从而启动目的基因的mRNA合成。
从增加基因表达的观点出发，根据本发明的启动子优选为包含SEQ ID NO：1所示的序列的巨细胞病毒(CMV)启动子。
经本发明的一个实施例确认，当CMV启动子被引入至本发明的重组载体时，核酶的表达效率优异，虽然因重组载体含有miR-122T而受到miR-122的调控，但由于核酶表达较高，因此即使存在一定程度的miR-122表达，仍能诱导细胞凋亡并显示出抗癌效果(图3和图4)。
在本说明书中，所使用的术语“核酶”为，作用如同酶的RNA分子或由包含该RNA分子的蛋白质组成的分子，也被称为RNA酶或催化RNA。核酶是通过具有清晰的三级结构的RNA分子进行化学反应，核酶具有催化或自催化的特性。已知，部分核酶通过自我切割或切割其他RNA分子来抑制活性，而另一部分的核酶则催化核糖体的氨基转移酶(aminotransferase)活性。这些核酶可包括锤头状核酶、VS核酶和发夹状核酶等。
根据本发明的核酶不仅可以通过反式剪接反应来抑制癌症特异性基因的活性而表现出选择性的抗癌效果，还可以与癌症治疗基因缀合的形式进行表达，以激活癌症治疗基因。因此，核酶可以用作任何形式，只要其表现出能够使癌症特异性基因失活和激活癌症治疗基因的特性即可。
优选地，根据本发明的核酶可为靶向上述hTERT mRNA的核酶，其可以通过靶向hTERT过度表达的癌细胞来特异性切割hTERT mRNA，从而可以起到抑制表达并特异性地表达治疗基因的作用。
在本发明中，所使用的术语“反式剪接(trans-splicing)”是指将来自不同基因的RNA彼此连接。优选地，可以使用靶向hTERT的反式剪接I型核酶，其被证明为对癌症特异的hTERT的mRNA具有识别和反式剪接的能力。
在本发明中，所使用的术语“目的基因”是指，通过所述核酶与癌症特异性基因的mRNA连接而被诱导表达的基因。
优选地，根据本发明的目的基因可为用于治疗癌症的基因或报告基因。最优选地，所述目的基因可为用于治疗癌症的基因。
在本发明中，所使用的术语“癌症治疗基因(anti-cancer therapeutic gene)”是指，多核苷酸序列，其用于编码在癌细胞中表达时显示出治疗作用的多肽。所述癌症治疗基因可以与核酶缀合的形式表达，或者单独表达，从而表现出抗癌活性。优选地，这些癌症治疗基因选自药物敏感性基因、细胞凋亡基因、细胞增值抑制基因、细胞毒性基因、肿瘤抑制因子基因、抗原基因、细胞因子基因和抗血管生成基因中的一种或多种基因，最优选为药物敏感性基因。
在本发明中，可以单独使用所述癌症治疗基因，或者可以组合使用两种或两种以上的基因。
根据本发明的药物敏感性基因为用于编码酶的基因，所述酶使得无毒的前体药物(prodrug)转化为有毒物质，从而使导入有该基因的细胞凋亡，因此也被称为自杀基因(suicide gene)。也就是说，当将对正常细胞无毒的前体药物施用于全身时，该前体药物仅在癌细胞中转化为毒性代谢产物(toxic metabolite)，从而通过改变对药物的敏感性来破坏癌细胞。优选地，这些药物敏感性基因可为以更昔洛韦(ganciclovir)作为前体药物的HSVtk(单纯疱疹病毒-胸苷激酶(Herpes simplex virus-thymidine kinase))基因或以5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)作为前体药物的大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶(cytosinedeaminase，CD)基因，最优选为包含SEQ ID NO：4所示的序列的HSVtk基因。
根据本发明的细胞凋亡基因(proapoptotic gene)是指，当被表达时诱导程序性细胞凋亡的核苷酸序列。本领域技术人员已知的细胞凋亡基因可包括用于编码p53、腺病毒E3-11.6K(源自Ad2和Ad5)或腺病毒E3-10.5K(源自Ad)、腺病毒E4基因、p53通路基因和胱天蛋白酶(Caspase)的基因。
根据本发明的细胞生长抑制基因(cytostatic gene)是指，在细胞中表达并在细胞周期中使细胞周期终止的核苷酸序列。例如，有p21、视网膜母细胞瘤基因、E2F-Rb融合蛋白基因、用于编码细胞周期素依赖性激酶抑制因子的基因(例如p16、p15、p18和p19)、生长终止特异性同源盒(growth arrest specific homeobox，GAX)基因等，但不限于此。
根据本发明的细胞毒性基因是指，在细胞中表达并显示出毒性作用的核苷酸序列。例如，有用于编码假单胞菌外毒素、赖氨酸毒素、白喉毒素等的核苷酸序列等，但不限于此。
根据本发明的肿瘤抑制基因是指，可以在靶细胞中表达以抑制肿瘤表型或诱导细胞凋亡的核苷酸序列。代表性地，可包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、p53基因、APC基因、DPC-4/Smad4基因、BRCA-1基因、BRCA-2基因、WT-1基因、成视网膜细胞瘤基因、MMAC-1个基因、腺瘤性结肠息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli protein)、结直肠癌缺失(DCC)基因、MMSC-2基因、NF-1基因、位于染色体3p21.3的鼻咽喉癌抑制因子基因，MTS1基因、CDK4基因、NF-1基因、NF-2基因、VHL基因或sPD-1(程序性死亡受体1)。
根据本发明的抗原基因是指，在靶细胞中表达以产生可被免疫系统识别的细胞表面抗原蛋白的核苷酸序列。本领域技术人员已知的抗原基因的实例可包括癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和p53。
根据本发明的细胞因子基因是指，在细胞中表达以生成细胞因子的核苷酸序列。代表性地，可包括GMCSF、白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-4、IL-12、IL-10、IL-19、IL-20)、干扰素α、β、γ(干扰素α-2b)和干扰素α-2α-1的融合体等。
根据本发明的抗血管生成基因(anti-angiogenic gene)是指，通过表达将抗血管生成因子释放至细胞外的核苷酸序列。例如，可包括血管生成抑制素、血管内皮生长因子(VEGF)的抑制因子、内皮抑制素等。
在本发明中，所使用的术语“HSV-tk(单纯疱疹病毒胸苷激酶)”是指，源自单纯疱疹病毒的胸苷激酶。该酶通过将无毒前体药物转化为有毒物质，从而使导入有该基因的细胞凋亡，是药物敏感性基因的代表性例子。在本发明中，HSVtk基因可以用作癌症治疗基因，其以与本发明的核酶缀合的形式表达以显示出抗癌活性。这些HSVtk基因优选为录入在GenBank登录号AAP13943、P03176、AAA45811、P04407、Q9QNF7、KIBET3、P17402、P06478、P06479、AAB30917、P08333、BAB84107、AAP13885、AAL73990、AAG40842、BAB11942、NP_044624、NP_044492、CAB06747等中的基因。
在本发明中,所使用的术语“报告基因”为用于监测本发明的一个实施例的重组载体的导入与否或核酶的表达效率的基因，只要是可在不破坏被感染的基因或组织的情况下进行检测的基因，可不受限制地使用。优选地，可为萤光素酶(luciferase)、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰型绿色荧光蛋白(modified green fluorescent protein，mGFP)、增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescentprotein，EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)、修饰型红色荧光蛋白(modified red fluorescent protein，mRFP)、增强型红色荧光蛋白(ERFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增型黄色荧光蛋白(EYFP)、青色荧光蛋白(CFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。
通过将报告基因插入于目的基因中，可以观察到癌细胞特异性核酶的表达水平，尤其，本发明的核酶包括启动子和微小RNA靶位点，因此可以不在正常细胞中表达，而在癌细胞中特异性表达。对于本领域技术人员来说，可以理解的是，可用这种方法来诊断特定组织中是否已发生癌症。
基因传递系统
另一方面，本发明提供一种基因传递系统，其包含根据本发明的重组载体。
在本发明中，所使用的术语“基因传递系统(gene delivery system)”是指，可以提高将目的基因和/或核酸序列递送至细胞内的递送效率的系统，分为病毒介导系统和非病毒系统。
已知，由于病毒介导系统使用如逆转录病毒载体和腺病毒载体的病毒载体，并利用在人细胞内引起感染的病毒固有的细胞内渗透机制，因此细胞内基因递送效率高于非病毒系统。此外，进入细胞内后，非病毒载体的问题在于待内体与溶酶体融合后，基因在内体性噬溶酶体(endolysosome)内被降解掉；病毒载体的优点在于，其不通过溶酶体，而是通过将基因递送至细胞核内的机制，使得基因损失较少，从而提高了基因递送效率。
参考所述重组载体中所述，可用于本发明的病毒载体可为源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等中的载体。可将这些病毒载体载入至病毒颗粒内之后，通过如感染的转导方法，将其导入细胞内。
在本发明的一个实施例中，以包含上述重组载体的重组腺病毒作为基因载体的示例。也就是说，所述重组腺病毒的功能在于，将用于表达对癌症特异性基因特异的反式剪接核酶的重组载体递送至目标细胞(例如，癌细胞)，被递送至细胞内的重组载体会通过细胞内转录系统进行表达。经表达的反式剪接核酶可以将与核酶连接的目的基因插入至癌细胞内大量存在的癌症特异性基因的转录组(Transcriptome)。
所述非病毒系统为，将阳离子脂质体载体或阳离子聚合物载体等用作核酸和/或基因的递送介质，或者使用电穿孔法。
阳离子脂质体载体是一种通过利用主要由阳离子脂质体组成的纳米级脂质体或脂质纳米颗粒的正电荷与作为负电荷的基因、包含基因的表达载体或核酸形成复合物，然后通过吞噬作用将该复合物递送至细胞内的方法。被递送至细胞内的复合物先从内体被递送到溶酶体，然后退出并进入细胞质来进行表达。阳离子聚合物载体以类似于阳离子脂质体载体的方式递送基因，不同之处在于使用聚合物代替脂质，具有代表性的阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)、聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine)、壳聚糖(chitosan)等。
因此，可将通过将本发明的重组载体与阳离子脂质体载体或阳离子聚合物载体相结合所形成的复合物用作基因载体。
在本发明中，所述基因传递系统包括上述重组载体，并且可以使用病毒介导系统和非病毒系统，但优选使用病毒介导系统。
核酶
又一方面，本发明提供一种核酶，其由根据本发明的重组载体表达。
关于根据本发明的重组载体或核酶的内容，请参考如上所述。
药物组合物
又一方面，本发明提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含作为有效成分的根据本发明的重组载体、含有所述重组载体的基因传递系统、或核酶。
根据本发明的重组载体、基因传递系统或核酶的相关内容，请参考如上所述。
在本发明中，所使用的术语“癌症”是指调节细胞正常分裂、分化和死亡的功能出现异常，从而发生异常地过度增殖，并侵袭周围的组织和器官，形成肿块，破坏或改变现有结构的状态。
优选地，根据本发明的癌症可为肝癌、胶质母细胞瘤、胆道癌、肺癌、胰腺癌、黑素瘤、骨癌、乳腺癌、结直肠癌(Colorectal cancer)、胃癌、前列腺癌、白血病、子宫癌、卵巢癌、淋巴瘤或脑癌，更优选为肝癌、胶质母细胞瘤或胆道癌，最优选为肝癌。
此外，优选地，根据本发明的癌症可优选为，在癌组织中所表达的miR-122的拷贝数(表达量)小于通过所述药物组合物在癌组织中所表达的核酶的拷贝数的100倍的癌症。
在本发明的一个实施例中，将含有能够诱导细胞凋亡的miR-122T的hTERT靶核酶和细胞中miR-122的表达水平进行比较，其结果为，核酶的表达会随着相对于核酶的miR-122的比例增加而降低，从而降低了诱导细胞凋亡的作用(图4、图8和图9)。由此，可根据癌组织中miR-122的表达量来类推出具有抗癌作用的核酶的量，从而可确定用来表达核酶的腺病毒的注入量。具体地，由于当miR-122的最少拷贝数为核酶拷贝数的约100倍或以上时，具有miR-122靶位点的核酶的功能(表达)会被削弱，因此可确定，当在癌症组织中所表达的miR-122的拷贝数小于通过根据本发明的药物组合物在癌组织中所表达的核酶的拷贝数的100倍时，可以获得高效的抗癌功效(图10)。
此外，根据本发明的癌症可优选为miR-122在癌症组织中实质上不表达的癌症。所述“miR-122在癌组织中实质上不表达的癌症”是指虽然miR-122在癌组织中有表达，但miR-122在癌组织中表达的拷贝数极低至实质上不会影响具有miR-122靶位点的核酶的功能。
经本发明的一个实施例中确认，根据本发明的核酶对miR-122在癌组织中实质上不表达的结直肠癌、胶质母细胞瘤、黑素瘤、宫颈癌、肺癌、骨肉瘤、乳腺癌和胆道癌细胞株的抗癌功效(图13和图14)。
此外，根据本发明的肝癌的起因可选自乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)、miR-122在肝癌组织中的表达减少的丙型肝炎病毒、酒精、慢性肝炎、肝硬化、非酒精性脂肪肝、黄曲霉毒素和家族病史中的任意一种或多种原因。
在本发明的一个实施例中，分析了由多种病因引起的肝癌中的miR-122表达量。结果显示，在病因为HCV的一部分肝癌和其他病因引起的肝癌中，miR-122在正常肝组织中的表达量高于在肝癌组织中的表达量。由此证实,由于miR-122的存在,根据本发明的核酶在正常肝组织中的作用被减弱，而在miR-122表达降低的肝癌组织中起到作用(图11)。
此外，根据本发明的肝癌可为对索拉非尼(sorafenib)具有耐药性的肝癌。索拉非尼是晚期肝癌的一线治疗药，在本发明的一个实施例中，由于根据本发明的核酶在对索拉非尼敏感和不敏感的所有细胞株中均能诱导细胞凋亡，因此证实了也可应用于无法用索拉非尼治疗的、对索拉非尼具有耐药性的肝癌患者组(图6)。
在本发明中，所使用的术语“预防”是指通过施用包含根据本发明的重组载体的组合物来抑制癌症，或延迟癌症发作的所有行为。
在本发明中，所使用的术语“治疗”是指通过施用包含根据本发明的载体的组合物来使癌症好转或发生有益的转变的所有行为。
根据本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。可用于本发明的药物组合物的药学上可接受的载体，赋形剂和稀释剂可以例如为乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸胶、明胶、磷酸钙、硅酸钙、碳酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。
根据本发明的药物组合物可以根据期望的方法进行肠道给药或非肠道给药，但优选非肠道给药。
根据本发明的一个实施例，根据本发明的药物组合物可以通过静脉内、动脉内、癌组织内或皮下直接进行给药，并可以注射剂的形式进行给药。根据本发明的注射剂可为分散在无菌介质中的形式，以在对患者进行给药时可直接使用，也可通过添加注射用蒸馏水以将其分散为适当的浓度后进行给药。此外，当制备为注射剂时，该药物组合物还可以与缓冲剂、保存剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等混合，并可制备为单位计量的安瓿或各种剂型。
虽然本发明药物组合物的剂量取决于患者的状态和体重、疾病程度、药物形式、给药途径和时间，但可以由本领域技术人员进行适当地选择。同时，根据本发明的药物组合物可单独使用，或者可与外科手术等的辅助疗法结合使用。
以下，将参考实施例详细描述本发明。然而，根据本说明书的实施例可修改为各种其他形式，并且本说明书的范围不应解释为限于以下描述的实施例。提供本说明书的实施例的目的在于向本领域技术人员更充分地描述本说明书。
【实施例1】hTERT靶向反式剪接核酶重组载体的制备
通过对现有的反式剪接核酶的修饰而设计出一种重组载体，以制备具有作为miR-122靶位点的miR-122T且表现出高表达率的hTERT靶向反式剪接核酶。
具体地，在以hTERT mRNA的+21位点作为靶位点、具有长度为326个核苷酸的反义(antisense)序列(SEQ ID NO：8)且具有作为治疗基因的HSV-tk的现有的反式剪接核酶中导入CMV(巨细胞病毒)启动子。在CMV启动子和核酶之间插入SV40内含子剪接供体/受体(SV40 intron splicing donor/acceptor,SD/SA)序列，以提高转录效率。在作为治疗基因的HSV-tk的3'位点中插入作为土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus)的转录后调控元件(posttranscriptional Regulatory Element)的WPRE，以提高治疗基因的蛋白质表达效率，在构建体(construct)的3'端位点插入3个拷贝(copy)数的miR-122T，以通过miR-122进行调控。
设计出的反式剪接核酶的整体载体结构如图1所示，且将其命名为ECRT-122T。
【实施例2】用于表达miR-122的Hep3B稳定细胞株(stable cell line)的制备
将2x105个Hep3B细胞分株到35mm培养皿中，然后在37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。在1.5ml的试管中加入1μg的Tet阻遏蛋白(Tet-repressor，TetR)miR-122表达载体和100μl的Opti-MEM并进行混合，在另一个1.5ml的试管中加入5μl的Lipofectamin2000和100μl的无血清培养基并进行混合后，在室温下放置5分钟。然后，将上述两个试管的内容物进行混合，并在室温下保管20分钟以形成脂质体(liposome)形态的复合体。待20分钟后，将试管进行10秒的离心分离后分别撒在各个细胞上以进行转染(transfection)，并在4小时后更换至新培养基中。在37℃、5％CO2的培养箱中进行24小时的培养后，通过用1X PBS对细胞进行洗涤，用胰蛋白酶(trypsin)进行处理以分离出细胞，然后转移到100mm培养皿中进行培养。每隔两至三天更换至含有浓度为5μg/ml的作为抗生素的杀稻瘟菌素(blasticidin)的培养基中。选择多个克隆细胞并分别进行培养后，通过RT-PCR来确认TetR的表达。
【实验实施例1】ECRT-122T的抗癌功效的确认(体外)
1-1.根据miR-122表达的ECRT-122T的抗癌功效比较
对实施例1中制备的ECRT-122T的抗癌功效是否随miR-122的表达与否而变化进行确认。
分别准备表达hTERT并不表达miR-122的Hep3B细胞系、和表达hTERT及miR-122的Huh-7.5肝癌细胞株，然后将1x104个细胞分株于96孔板中。次日，根据待细胞处理的感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)，将腺病毒(5型)分阶段稀释于细胞培养基中并将总体积制成100μl后，在每个孔中进行处理。使用的载体为如下：具有miR-122T的ECRT-122T；不具有miR-122T的ECRT；以及由CMV启动子、hTERT靶向反式剪接核酶和HSVtk组成的CRT。用腺病毒处理24小时后，将GCV(更昔洛韦，ganciclovir)稀释于细胞培养基中，直到混合至200μM后处理于每个孔中。以两天为间隔，共进行三次的GCV处理，待最后一次GCV处理24小时后，添加MTS分析试剂，然后在450nm波长下测量吸光度，以确认活细胞。
其结果如图2(a)所示，在不表达miR-122的Hep3B细胞株中，无论是否具有miR-122靶位点(ECRT，ECRT-122T)都诱导了相同的细胞凋亡。不具有SD/SA、WPRE及miR-122T的CRT虽然能诱导细胞凋亡，但其效果不及ECRT和ECRT-122T，由此可知，由于在ECRT和ECRT-122T中导入的因子，使得核酶的作用效率提高。
相反地，如图2(b)所示，在表达miR-122的Huh-7.5细胞株中，细胞凋亡诱导效果因ECRT-122T而降低，由此可知，由于miR-122作用于导入ECRT-122T的miR-122靶位点，从而干扰了核酶的作用。然而，ECRT-122T仍诱导了CRT处理水平的细胞凋亡，由此可确认，虽然因miR-122T而受miR-122的调节，尽管有一定程度的miR-122表达，但由于核酶的高表达仍可表现出抗癌效果。
1-2.根据启动子的ECRT-122T的抗癌功效比较
将实施例1中制备的ECRT-122T的抗癌效果与具有不同组成的其他载体进行比较。
具体地，分别准备表达hTERT并不表达miR-122的Hep3B、SNU398及SNU449细胞株、以及表达hTERT和miR-122的Huh-7及Huh-7.5肝癌细胞株。通过利用ECRT-122T、ECRT、CRT中导入有作为肝特异性启动子的PEPCK启动子、SD/SA、WPRE及miR-122T的EPRT-122T、或不具有miR-122T的EPRT来对上述细胞株进行处理后，比较相对细胞生存率。按照与实验实施例1-1相同的方法进行细胞增殖分析。
其结果如图3所示，在不表达miR-122的细胞株中，无论是否具有miR-122靶位点(ECRT，ECRT-122T)都诱导了相同的细胞凋亡。与EPRT-122T相比，ECRT-122T在更低的病毒MOI处理样品中也诱导了高比例的细胞凋亡。由此可知，与作为组织特异性启动子的PEPCK相比，CMV启动子会更强有力地增加核酶的表达，从而在用少量病毒处理的样品中也可表现出高抗癌功效。此外，ECRT-122T表现出与不具有miR-122T的ECRT相同的抗癌功效，由此可知，不存在因导入miR-122T而引起的核酶活性的降低。
另一方面，如图4所示，在表达miR-122的细胞株中未观察到由EPRT-122T导致的细胞凋亡，由此可知，因miR-122作用于miR-122T而降低了核酶的表达。然而，尽管存在miR-122的表达，ECRT-122T仍诱导细胞凋亡，由此可知，CMV启动子比PEPCK更强有力地增加核酶的表达。然而，与不具有miR-122的细胞株不同，由ECRT-122T导致的细胞凋亡程度低于ECRT，由此可知，ECRT-122T的miR-122T受miR-122的调节，使得核酶的表达出现降低。
此外，在各种肝癌细胞株中比较CRT-122T、ECRT-122T及EPRT-122T的抗癌效果。其结果如图5所示，在几乎所有肝癌细胞株中，细胞凋亡随着ECRT-122T的MOI增加而增加，并且ECRT-122T的抗癌效果优于比较组(CRT-122T和EPRT-122T)。
根据该实验实施例的结果可知，通过向核酶中导入CMV启动子、SD/SA及WPRE来增加核酶的表达以提高抗癌功效，由于miR-122T的导入，可通过miR-122来调节核酶的活性，因此在治疗肝癌领域ECRT-122T是抗癌功效和安全性最佳的物质。
1-3.ECRT-122T在索拉非尼(sorafenib)耐药性肝癌中的应用
针对晚期肝癌，在对用作一线治疗药的索拉非尼具有敏感性的肝癌中，确认ECRT-122T的抗癌功效。
具体地，准备源自对索拉非尼具有敏感性的肝癌患者或无敏感性(具有耐药性)的肝癌患者的细胞株，用ECRT-122T或ECRT进行处理后比较相对细胞存活率。按照与实验实施例1-1相同的方法进行细胞增殖分析。
其结果如图6所示，在对索拉非尼具有敏感性的细胞株和无敏感性的细胞株中均观察到细胞凋亡。由此可知，ECRT-122T可应用于无法用索拉非尼治疗的索拉非尼耐药性肝癌患者组。
【实验实施例2】ECRT-122T的抗癌功效的确认(体内)
在肝癌动物模型中确认ECRT-122T的抗癌功效和肝毒性。
向脾肝转移小鼠模型的脾脏中注射不表达miR-122的Hep3B细胞株以诱发原位(orthotopic)多灶性(multifocal)肝癌，将表达ECRT或ECRT-122T的腺病毒通过尾静脉注射(tail-vein injection)来进行全身给药后，注射GCV以确认抗癌功效。
其结果如图7(a)和图7(b)所示，与对照组(注射PBS)相比，在注射ECRT-122T的实验组中大多数癌被杀灭。此时，在注射相同量病毒的实验组中，与不具有miR-122T的ECRT相比，ECRT-122T表现出更加优异的抗癌功效。由此可知，因miR-122T的导入而在正常肝组织中抑制核酶的表达，从而在正常肝中可确保安全性，且在癌症组织中表现出高抗癌功效。此外，如图7(c)所示，与对照组(注射PBS)相比，注射ECRT-122T的实验组显示出相似水平的肝毒性数值，由此可知，利用腺病毒进行的ECRT-122T体内递送是适宜的。
【实验实施例3】miR-122表达量与核酶表达量之间的相关性
分析miR-122表达量与核酶表达量之间的相关性，以分析根据miR-122表达量的核酶的作用。
准备表达hTERT及miR-122的Huh-7和Huh-7.5肝癌细胞株，通过用表达ECRT、ECRT-122T、EPRT或EPRT-122T的腺病毒进行处理后，使用TRI试剂提取5μg的总RNA。
通过使用随机引物(5'-NNNNNN-3')，对提取的总RNA执行逆转录过程，以合成cDNA。将10xPCR缓冲液、10mM的dNTP、10pmole的各个引物、2.5unit的taq聚合酶、1μl的10x赛博绿(Cybergreen)添加到2μl的合成cDNA中，用dH2O将最终体积调整为70μl。将其以20μl为单位进行分株，在95℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，40个循环下，执行实时PCR以确认核酶的表达量。用于核酶PCR的引物序列为如下表1所示。
【表1】
| 引物序列(5'-3') | 序列(5'-3') |
| 核酶正向引物 | TTCCGGAGGACAGACACATCGA(SEQ ID NO：10) |
| 核酶反向引物 | GCAGATACCGCACCGTATTGGC(SEQ ID NO：11) |
然后，通过利用成熟的miR-122探针(ABI)，从提取的总RNA中合成cDNA，将3.5μl的20x Taqman小RNA测试、35μl的2x Taqman Universal PCR Master Mix II(ABI)添加到2μl的合成cDNA中，并用dH2O将最终体积调整为70μl。将其以20μl为单位进行分株，在95℃15秒、60℃60秒，40个循环的条件下，执行PCR以确认miR-122的表达量。通过使用ABI公司提供的Taqman探针进行miR-122的PCR(测定ID：002245)。
其结果如图8(c)所示，在Huh-7细胞株中表达出约1000至2000拷贝数的miR-122，如图8(b)所示，可知ECRT-122T或ECRT处理组的核酶表达量均随MOI的增加而增加。此外，在感染浓度为5MOI或以下时，ECRT-122T处理组的核酶表达量高于ECRT处理组，但以10MOI处理时，相比于ECRT处理组，ECRT-122T处理组的核酶表达量在减少。由此可知，由Huh-7中所表达的miR-122作用于miR-122T，从而使核酶的表达量减少。
另一方面，当以10MOI处理ECRT-122T时，核酶和miR-122的拷贝数之比为约1∶2.5(600个拷贝：1500个拷贝)，而在根据MOI的细胞凋亡比例的图4(a)中可知，在10MOI下ECRT-122T可诱导细胞凋亡的原因在于，由于miR-122相对于核酶的比例低，因此miR-122无法充分抑制核酶的表达。
另一方面，如图9(c)所示，在Huh-7.5细胞株中表达出约10000至15000个拷贝的miR-122，该数值高于Huh-7，由此可知，由核酶诱导的细胞凋亡程度低于Huh-7。此外，如图9(b)所示，与Huh-7细胞株相反，在相同的感染条件下，ECRT处理组的核酶表达量与ECRT-122T处理组的核酶表达量相同或比ECRT-122T处理组更高，并且当处理10MOI时表达出的核酶拷贝数(约120个拷贝)低于Huh-7(约600个拷贝)。从上述结果和表示，根据MOI的细胞凋亡比率的图4(b)的结果可知，核酶与miR-122的比例越高，核酶的表达越少，因此会降低细胞凋亡诱导效果。
【实验实施例4】根据miR-122表达量的核酶的作用
分析根据miR-122表达量的核酶的作用，以更为详细地分析miR-122表达量与核酶之间的相互作用。
在实施例2中所制备的具有miR-122四环素调控系统的稳定细胞株(Hep3B)中，为了防止与EPRT、EPRT-122T或miR-122的结合，处理用于表达EPRT-mt 122T载体的腺病毒，其中EPRT-mt 122T载体具有随机变换序列的突变miR-122靶位点，然后比较相对的细胞存活率。在实施例2中所制备的细胞株中，miR-122的表达会根据四环素处理浓度而增加，且利用具有不同表达程度的三个克隆的稳定细胞株进行实验。按照与实验实施例1-1相同的方法进行细胞增殖分析。
其结果如图10所示，随着四环素处理浓度的增加，EPRT-122T处理组的miR-122拷贝数也有增加，从而EPRT-122T所引起的细胞凋亡在减少。相反地，在EPRT、EPRT-mt 122T处理组或作为阳性对照组的PT中，无论miR-122表达量多少，细胞凋亡诱导效果均得以维持。此外，随着四环素处理浓度的增加，miR-122拷贝数也有增加，因此核酶的拷贝数在减少。在实验中所使用的三个独立克隆中，均出现相同的上述效果。
将在上述实验中所确认的miR-122与核酶的拷贝数之间的相关性进行定量化。其结果如下表2所示，在各个细胞株中比例虽不同，但如果miR-122的最小拷贝数约为核酶拷贝数的100倍或以上，则具有miR-122靶位点的核酶的功能会显著减弱。根据该结果可知，可通过miR-122来调控具有miR-122靶位点的反式剪接核酶的表达，从而根据miR-122的表达量可推断表现出抗癌效果的核酶的量，以确定用于表达核酶的腺病毒的注入量。
【表2】
【实验实施例5】在肝癌患者组织中miR-122表达的分析
通过实时PCR，分析miR-122在肝癌患者的正常肝组织和肝癌组织中的表达。
具体地，通过获取韩国国内70位肝癌患者的人源组织来分析miR-122的表达。将肝癌患者的正常肝组织、肝癌组织分别浸入1ml的Trizol溶液中，然后进行均质化(homogenization)、粉碎，然后在室温下放置5分钟。然后，加入0.2ml的氯仿并在室温下放置3分钟，将其在4℃下、按12,000rpm进行30分钟的离心分离，以分离出上清液。将0.5ml的异丙醇添加至所分离的上清液中，并在-20℃下进行反应，再次将其在4℃下以14,000rpm进行20分钟的离心分离，获得RNA沉淀，然后将其溶解于100μl的无RNase水中。按照TaqManmiRNA逆转录试剂盒法，对提取的50ng RNA进行逆转录以合成cDNA，将1μl合成的cDNA与TaqMan 2XUniversal PCR Master Mix预混液进行混合并使用ABI StepOne plus设备进行PCR。通过使用由ABI公司提供的Taqman探针进行PCR(测定ID：002245)。
其结果如图11(a)所示，在70名患者中的48名患者(68.6％)表现出，肝癌组织中的miR-122表达量低于正常肝组织。根据病因的分析结果如图11(b)、11(d)至11(f)所示，在8名HBV相关患者中的8名、2名酒精相关患者中的2名、7名慢性肝炎相关患者中的6名、35名其他肝癌病因患者中的26名的肝癌组织中的miR-122表达低于正常肝组织。相反地，如图11(c)所示，在HCV相关患者组中，18名中只有6名患者的肝癌组织中miR-122表达较低。由此可知，与其他病因相反，在HCV为病因的肝癌中，反而当肝癌进展时miR-122表达增加或维持的患者更多。
此外，进行统计分析的结果如下表3所示，在HCV相关患者的情况下，在肝癌组织中的miR-122表达高于正常肝组织的现象具备统计学意义，而在作为其他肝炎病毒HBV的情况下，在所有肝癌组织中，miR-122的表达均降低的现象具备统计学意义。由此可知，在HCV相关患者的肝癌组织中miR-122的表达未减少或增加的结果具有统计学意义，这是HCV特异性现象，而不是由肝炎病毒引起的普遍现象。
【表3】
根据上述结果，在病因为HCV的肝癌中，如果将ECRT-122T用于除在肝癌组织中的miR-122表达高于正常肝组织的患者以外的其他肝癌患者，则因miR-122而在正常肝组织中无法起作用，而在miR-122的表达降低的肝癌组织中起作用，因此可表现出癌症特异性的抗癌作用。
进一步地，在源自患者肝癌细胞的肝癌细胞株中分析hTERT的mRNA、蛋白质水平及miR-122水平。对肝癌细胞株进行培养并按照本领域已知的方法分离RNA及蛋白质。RNA用于qRT-PCT，对蛋白质通过电泳进行蛋白质印迹分析。
其结果如图12(a)和图12(b)所示，在大多数肝癌细胞株中可确认到作为ECRT-122T的靶分子的hTERT mRNA的表达，hTERT蛋白水平也显示出相似的趋势。此外，如在肝癌中表达减少的报告一样，确认到在各肝癌细胞株中几乎不表达miR-122(图12(c))。
【实验实施例6】在不表达miR-122的除肝癌以外的其他癌症中的应用
6-1.细胞实验(体外)
在实质上不表达miR-122的组织的癌细胞株中确认ECRT-122T的抗癌功效。
具体地，在表达hTERT的胶质母细胞瘤细胞株、结直肠癌细胞株、黑素瘤细胞株、宫颈癌细胞株、肺癌细胞株、骨肉瘤细胞株、乳腺癌细胞株及胆道癌细胞株中，用表达ECRT-122T的腺病毒进行处理后，比较相对的细胞存活率。按照与实验实施例1-1相同的方法进行细胞增殖分析。
其结果如图13所示，在几乎所有癌细胞株中，细胞凋亡随着MOI增加而增加，并且ECRT-122T的抗癌效果优于对照组(CRT-122T和EPRT-122T)。具体地，包含肝组织特异性启动子的EPRT-122T不能诱导细胞凋亡的情况较多，虽然CRT-122T能诱导细胞凋亡，但其效率低于ECRT-122T。
在作为胶质母细胞瘤细胞株的T98G和U87MG细胞株中，在约1MOI或以下时显示出约90％的细胞凋亡，而在LN229细胞株中，在5MOI或以上时显示出约90％的细胞凋亡。此外，在作为宫颈癌细胞株的HeLa细胞株中，在0.5MOI或以下时显示出90％或以上的细胞凋亡，而在作为黑素瘤细胞株的SK-MEL2细胞株中，在约1MOI或以下时显示出约90％的细胞凋亡。
此外，如图14所示，在作为胆道癌细胞的SNU478和SNU869细胞株中，细胞凋亡也随着MOI的增加而增加。
6-2.动物实验(体内)
向6周龄的雄性Balb/c-nunu小鼠的皮下注射1x107个(100μl)的作为胶质母细胞瘤细胞的LN229细胞株或5x106个(100μl)的U87MG细胞株，以诱导肿瘤的形成。当肿瘤长到一定大小时，以1.0x109VP(100μl)的剂量，每两天注射一次用于表达ECRT-122T的腺病毒，共注射3次。从首次注射病毒的24小时后开始，以50mg/kg的剂量，每天给药GCV两次，持续10天(共20次)。
实验结果如图15所示，在对照组(注射Ad-EGFP)中，肿瘤大小继续增加，而在注射ECRT-122T的实验组中，肿瘤几乎没有生长，且在注射ECRT-122T的实验组中肿瘤重量也较少。此外，如图16所示，在使用U87MG细胞株的实验中也可确认到ECRT-122T的抑制肿瘤生长的作用。
根据该实验实施例的结果，确认到由ECRT-122T表达的核酶也可能有效地应用于除肝癌以外不表达miR-122的各种癌症。此外，如果将ECRT-122T作为针对除肝癌之外的其他癌症的抗癌剂进行全身或局部给药，则可能会导入至正常肝中，但此时因miR-122T的作用而可抑制在正常肝中的毒性诱导。
【实验实施例7】ECRT-122T在体内分布的确认
7-1.静脉注射
将用于表达ECRT-122T的腺病毒以2.5x1010VP的剂量通过静脉注射到正常ICR小鼠体内，在第8、11及15天后，分别分离出各个主要器官以提取DNA。以提取的DNA为模板，通过用于检测核酶的引物组(Primer set)来进行PCR，以确认ECRT-122T在主要组织中的分布。
其结果如图17所示，确认到注射的大多数腺病毒分布在肝脏中，表明腺病毒适合于递送靶向肝癌的ECRT-122T。此外，可确认到注射的ECRT-122T在全身导入后第11天，在血液中完全消失，而全身导入8天后至2周内70％的病毒性DNA会消失。
7-2.肝动脉注射(hepatic artery injection)
将用于表达ECRT-122T的腺病毒以2.5x1011VP的剂量通过肝动脉注射(hepaticartery injection)注射至大鼠体内，按照与上述7-1相同的方法确认ECRT-122T在主要组织中的分布。
其结果如图18所示，可确认注射后第2天在肝脏中出现的ECRT-122T DNA最多，且这种趋势一直维持到注射后14天。注射后第14天，肝脏中的病毒性DNA消失98％，在其他组织中也大部分会消失。
此外，从大鼠的各个器官中分离出基因组DNA(gDNA)以对HSVtk DNA进行定量化。其结果如图19所示，可知注射后第14天在几乎所有器官中HSVtk DNA会消失。
从大鼠肝脏中提取总RNA，通过qRT-PCR来确认核酶的表达程度。其结果如图20(a)所示，可知从注射ECRT-122T后第2天开始表达核酶，注射后第14天仅表达相对于第2天的约3.85％的核酶。如在基因组DNA中所确认的，如图20(b)所示，与注射后第2天相比，腺病毒的gDNA在第14天几乎消失，仅残留约2.23％。
通过该结果可知，无论将ECRT-122T腺病毒通过静脉或动脉注射，其体内分布均相似，且在注射14天后病毒性DNA会几乎消失。
【实验实施例8】根据GCV处理与否的ECRT-122T的毒性确认
8-1.未处理GCV
向正常ICR小鼠注射一次ECRT-122T腺病毒，并在注射后15天、29天分别测量AST和ALT水平。
其结果如图21所示，在2.5x1010VP实验组中显示出弱毒性，而在其他剂量的实验组中显示出与PBS注射组相似程度的AST和ALT水平，因此可知几乎没有毒性。
此外，如图22所示，在实验期间未观察到小鼠的体重、饲料消耗量和肝重量的异常。在静脉内施用1次腺病毒后第29天实施的肝组织病理学检查结果如图23所示，在2.5x1010VP实验组(G3)中观察到肝细胞坏死(箭头)和炎症，由此可知诱发了轻微的肝损伤。在1.0x1010VP实验组(G2)中炎症性细胞被局部浸润(箭头)，但可确认未诱发肝损伤。在图21中，cv表示中央静脉(central vein)，p表示门管区(portal area)。
将组织病理学检查结果汇总于下表4中。
【表4】
8-2.GCV处理
向正常ICR小鼠注射ECRT-122T腺病毒，以每天两次持续给药10天后，测量AST和ALT水平。
其结果如图24所示，在除2.5x1010VP实验组以外的其他剂量的实验组中显示出与对照组(PBS注射组)相似程度的AST和ALT水平，因此可知几乎没有毒性。
此外，如图25(a)和图25(b)所示，在实验过程中小鼠的体重、饲料消耗量没有有意义的变化，如图25(c)所示，肝脏的重量也没有异常。
肝脏的组织病理学分析结果如图26所示，在PBS注射组(G1)、PBS+GCV给药组(G2)和0.25x1010VP+GCV给药组(G5)中未确认到异常。相反地，在1.0x1010VP+GCV给药组(G3)中，可确认到因中性粒细胞的浸润而形成的局部微小脓肿(microabscess)(粗箭头)，但并未诱发肝损伤。在2.5x1010VP+GCV给药组(G4)中，观察到具有大核的增大的肝细胞、坏死性肝细胞(粗箭头)、多发性炎症细胞浸润(圆圈)、肝细胞有丝分裂增加(粗箭头)及胆管(b)周围的淋巴母细胞浸润，由此可知诱导了肝损伤。在未施用GCV的G6(1.0x1010VP注射组)中进行有丝分裂的肝细胞(箭头)数量稍有增加。
将组织病理学检查结果汇总于下表5中。
【表5】
AST及ALT水平和组织病理学检查结果显示，如果以2.5x1010VP/只的剂量通过静脉内注射腺病毒，且每天两次并持续10天施用GCV时，则会诱发肝细胞坏死和炎症等，从而诱导肝损伤。但当以0.25x1010VP/只及1.0x 1010VP/只的剂量、单独或与GCV联合施用时，直至施用后15天为止与肝损伤相关的AST和ALT水平虽有升高，但到第29天实施的组织学检查中，在肝脏中未观察到具有有意义的与腺病毒给药有关的毒理学变化。
【比较例1】CRT-122T和ECRT-122T的功效比较
1-1.抗癌功效的比较
将3x106个Hex3B细胞注射到小鼠国际标准模型中以诱导肝癌的形成，通过施用包含CRT-122T或ECRT-122T载体的腺病毒来比较抗癌效果。上述CRT-122T为，在ECRT-122T中切除SV40内含子剪接供体/受体(SD/SA)序列及WPRE的形态。
其结果如图27所示，当注射2.5x1010VP(virus particle)的腺病毒时，ECRT-122T的抗癌功效更优于CRT-122T。CRT-122T的抗癌功效与施用剂量为1.25x1010VP的ECRT-122T的抗癌功效相当。
1-2.抗癌功效的比较
将SNU398细胞注射到小鼠异种移植皮下模型(mouse xenograft subcutaneousmodel)中以诱导肿瘤的形成，如果肿瘤生长到一定大小，则以1x109VP的剂量将包含CRT-122T或ECRT-122T载体的腺病毒注射到癌组织中(肿瘤内注射,I.T.injection)，每两天注射一次，共注射2次。注射腺病毒后，饲养小鼠的同时每隔3天测量肿瘤大小、体重，在22天后处死小鼠以测量最终的肿瘤大小、肝脏重量、AST(天冬氨酸转氨酶)和ALT(丙氨酸转氨酶)的水平。
其结果如图28(a)和28(b)所示，可确认到ECRT-122T的抗癌功效更优于CRT-122T。在实验组之间小鼠的体重和肝脏重量没有有意义的差异，且从AST和ALT水平可知，腺病毒没有诱导肝毒性(图28(c)至图28(e))。
通过以上结果，确认到仅注射少量腺病毒也可获得充分的抗癌效果，并且可知ECRT-122T的抗癌功效显著优于CRT-122T。
1-3.毒性比较
将ECRT或ECRT-122T腺病毒注射到正常的ICR小鼠中，并在注射后第2天、第7天及第14天测量AST和ALT水平，以确认根据腺病毒注射剂量的毒性。
其结果如图29所示，在以2.5x1010VP的剂量施用ECRT的小鼠中，极高的肝毒性维持至注射后的第14天，而在以2.5x1010VP的剂量施用ECRT-122T的小鼠中，与ECRT相比肝毒性非常低。
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<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV promoter sequence
<400> 1
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgc 255
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hTERT mRNA sequence
<400> 2
caggcagcgc tgcgtcctgc tgcgcacgtg ggaagccctg gccccggcca cccccgcgat 60
gccgcgcgct ccccgctgcc gagccgtgcg ctccctgctg cgcagccact accgcgaggt 120
gctgccgctg gccacgttcg tgcggcgcct ggggccccag ggctggcggc tggtgcagcg 180
cggggacccg gcggctttcc gcgcgctggt ggcccagtgc ctggtgtgcg tgccctggga 240
cgcacggccg ccccccgccg ccccctcctt ccgccaggtg tcctgcctga aggagctggt 300
ggcccgagtg ctgcagaggc tgtgcgagcg cggcgcgaag aacgtgctgg ccttcggctt 360
cgcgctgctg gacggggccc gcgggggccc ccccgaggcc ttcaccacca gcgtgcgcag 420
ctacctgccc aacacggtga ccgacgcact gcgggggagc ggggcgtggg ggctgctgct 480
gcgccgcgtg ggcgacgacg tgctggttca cctgctggca cgctgcgcgc tctttgtgct 540
ggtggctccc agctgcgcct accaggtgtg cgggccgccg ctgtaccagc tcggcgctgc 600
cactcaggcc cggcccccgc cacacgctag tggaccccga aggcgtctgg gatgcgaacg 660
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gaggaggcgc gggggcagtg ccagccgaag tctgccgttg cccaagaggc ccaggcgtgg 780
cgctgcccct gagccggagc ggacgcccgt tgggcagggg tcctgggccc acccgggcag 840
gacgcgtgga ccgagtgacc gtggtttctg tgtggtgtca cctgccagac ccgccgaaga 900
agccacctct ttggagggtg cgctctctgg cacgcgccac tcccacccat ccgtgggccg 960
ccagcaccac gcgggccccc catccacatc gcggccacca cgtccctggg acacgccttg 1020
tcccccggtg tacgccgaga ccaagcactt cctctactcc tcaggcgaca aggagcagct 1080
gcggccctcc ttcctactca gctctctgag gcccagcctg actggcgctc ggaggctcgt 1140
ggagaccatc tttctgggtt ccaggccctg gatgccaggg actccccgca ggttgccccg 1200
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gcagtgcccc tacggggtgc tcctcaagac gcactgcccg ctgcgagctg cggtcacccc 1320
agcagccggt gtctgtgccc gggagaagcc ccagggctct gtggcggccc ccgaggagga 1380
ggacacagac ccccgtcgcc tggtgcagct gctccgccag cacagcagcc cctggcaggt 1440
gtacggcttc gtgcgggcct gcctgcgccg gctggtgccc ccaggcctct ggggctccag 1500
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caagctctcg ctgcaggagc tgacgtggaa gatgagcgtg cgggactgcg cttggctgcg 1620
caggagccca ggggttggct gtgttccggc cgcagagcac cgtctgcgtg aggagatcct 1680
ggccaagttc ctgcactggc tgatgagtgt gtacgtcgtc gagctgctca ggtctttctt 1740
ttatgtcacg gagaccacgt ttcaaaagaa caggctcttt ttctaccgga agagtgtctg 1800
gagcaagttg caaagcattg gaatcagaca gcacttgaag agggtgcagc tgcgggagct 1860
gtcggaagca gaggtcaggc agcatcggga agccaggccc gccctgctga cgtccagact 1920
ccgcttcatc cccaagcctg acgggctgcg gccgattgtg aacatggact acgtcgtggg 1980
agccagaacg ttccgcagag aaaagagggc cgagcgtctc acctcgaggg tgaaggcact 2040
gttcagcgtg ctcaactacg agcgggcgcg gcgccccggc ctcctgggcg cctctgtgct 2100
gggcctggac gatatccaca gggcctggcg caccttcgtg ctgcgtgtgc gggcccagga 2160
cccgccgcct gagctgtact ttgtcaaggt ggatgtgacg ggcgcgtacg acaccatccc 2220
ccaggacagg ctcacggagg tcatcgccag catcatcaaa ccccagaaca cgtactgcgt 2280
gcgtcggtat gccgtggtcc agaaggccgc ccatgggcac gtccgcaagg ccttcaagag 2340
ccacgtctct accttgacag acctccagcc gtacatgcga cagttcgtgg ctcacctgca 2400
ggagaccagc ccgctgaggg atgccgtcgt catcgagcag agctcctccc tgaatgaggc 2460
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ctgcagcctg tgctacggcg acatggagaa caagctgttt gcggggattc ggcgggacgg 2640
gctgctcctg cgtttggtgg atgatttctt gttggtgaca cctcacctca cccacgcgaa 2700
aaccttcctc aggaccctgg tccgaggtgt ccctgagtat ggctgcgtgg tgaacttgcg 2760
gaagacagtg gtgaacttcc ctgtagaaga cgaggccctg ggtggcacgg cttttgttca 2820
gatgccggcc cacggcctat tcccctggtg cggcctgctg ctggataccc ggaccctgga 2880
ggtgcagagc gactactcca gctatgcccg gacctccatc agagccagtc tcaccttcaa 2940
ccgcggcttc aaggctggga ggaacatgcg tcgcaaactc tttggggtct tgcggctgaa 3000
gtgtcacagc ctgtttctgg atttgcaggt gaacagcctc cagacggtgt gcaccaacat 3060
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ggggaggtgc tgtgggagta aaatactgaa tatatgagtt tttcagtttt gaaaaaaa 4018
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atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 8
<211> 326
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ribozyme antisense sequence
<400> 8
aaggccagca cgttcttcgc gccgcgctcg cacagcctct gcagcactcg ggccaccagc 60
tccttcaggc aggacacctg gcggaaggag ggggcggcgg ggggcggccg tgcgtcccag 120
ggcacgcaca ccaggcactg ggccaccagc gcgcggaaag ccgccgggtc cccgcgctgc 180
accagccgcc agccctgggg ccccaggcgc cgcacgaacg tggccagcgg cagcacctcg 240
cggtagtggc tgcgcagcag ggagcgcacg gctcggcagc ggggagcgcg cggcatcgcg 300
ggggtggccg gggccagggc ttccca 326
<210> 9
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta-globin poly(A) signal
<400> 9
aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctca 56
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ribozyme forward primer
<400> 10
ttccggagga cagacacatc ga 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ribozyme reverse primer
<400> 11
gcagataccg caccgtattg gc 22
Claims (19)
1.一种重组载体，其包含:
(i)巨细胞病毒(CMV)启动子；和
(ii)含有靶向癌症特异性基因序列的反式剪接核酶，及与所述核酶的3'外显子连接的目的基因的核酶目的基因表达盒，
所述表达盒在核酶目的基因表达盒的5'端与剪接供体/剪接受体序列(SD/SA序列)相连，3'端与WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)相连，
(ⅲ)所述WPRE的3'端进一步与用于识别微小RNA-122(miR-122)的核酸序列连接。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述癌症特异性基因序列为选自TERT(端粒酶逆转录酶)mRNA、AFP(甲胎蛋白)mRNA、CEA(癌胚抗原)mRNA、PSA(前列腺特异性抗原)mRNA、CKAP2(细胞骨架相关蛋白2)mRNA和突变型RAS(大鼠肉瘤)mRNA的基因序列。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述TERT mRNA序列包含SEQ ID NO：2所示的核酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述反式剪接核酶包含SEQ ID NO：3所示的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述目的基因为用于治疗癌症的基因或报告基因。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述用于治疗癌症的基因为选自药物敏感性基因、细胞凋亡基因、细胞增值抑制基因、细胞毒性基因、肿瘤抑制基因、抗原基因、细胞因子基因和抗血管生成基因的基因。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述药物敏感性基因为HSVtk(单纯疱疹病毒胸苷激酶)基因。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述HSVtk基因包含SEQ ID NO：2所示的核酸序列。
9.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述报告基因为萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰型绿色荧光蛋白(mGFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)、修饰型红色荧光蛋白(mRFP)、增强型红色荧光蛋白(ERFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、青色荧光蛋白(CFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。
10.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，用于识别所述微小RNA-122的核酸序列包含一个拷贝或以上的SEQ ID NO：5所示的核酸序列。
11.一种基因传递系统，其包含根据权利要求1所述的重组载体。
12.一种核酶，其由根据权利要求1所述的重组载体表达。
13.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含作为有效成分的根据权利要求1所述的重组载体、根据权利要求11所述的基因传递系统、或根据权利要求12所述的核酶。
14.根据权利要求13所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述癌症为肝癌、胶质母细胞瘤、胆道癌、肺癌、胰腺癌、黑素瘤、骨癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、前列腺癌、白血病、子宫癌、卵巢癌、淋巴瘤或脑癌。
15.根据权利要求13所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述癌症在癌组织中所表达的miR-122的拷贝数小于所述药物组合物在癌组织中所表达的核酶的拷贝数的100倍。
16.根据权利要求15所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述癌症为miR-122在癌组织中实质上不表达的癌症。
17.根据权利要求14所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，引起所述肝癌的原因选自乙型肝炎病毒、肝癌组织中miR-122的表达减少的丙型肝炎病毒、酒精、慢性肝炎、肝硬化、非酒精性脂肪肝、黄曲霉毒素和家族病史中的任意一种或多种原因。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药途径选自静脉内给药、动脉内给药、癌组织内给药以及皮下给药。
19.根据权利要求13-17中任一项所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以注射剂的形式进行给药。
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