JP2001521740A

JP2001521740A - 遺伝子治療用の高温誘導性発現ベクター及びその使用方法

Info

Publication number: JP2001521740A
Application number: JP2000519075A
Authority: JP
Inventors: トム・ツァン; ユージーン・ダブリュー・ガーナー; デイビッド・ティ・ハリス; エバン・ハーシュ
Original assignee: Arizona Board of Regents of University of Arizona
Current assignee: Arizona Board of Regents of University of Arizona
Priority date: 1997-11-03
Filing date: 1998-11-03
Publication date: 2001-11-13
Also published as: IL135943A0; BR9813917A; CN1299411A; AU1377299A; KR20010031762A; EP1029041A2; CA2308575A1; WO1999023216A2; WO1999023216A3

Abstract

(57)【要約】標的細胞で導入遺伝子を発現させる方法と組成物を提供する。治療用遺伝子または他の興味ある遺伝子を哺乳類宿主細胞内で発現させるために誘導性増殖システムを使用した発現コンストラクトと、そのための方法を提供する。生理学的条件下に導入遺伝子の高レベルな誘導発現が、その宿主細胞の基礎温度と比して高温な条件による誘導からもたらされる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）１．発明の分野本発明は概して遺伝子治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、導入
遺伝子の発現量を増加させるための方法と組成物に関する。

【０００２】２．関連技術の説明現在、遺伝子治療は、様々な癌と数多くの他の疾患の治療に広く適用できると
考えられている。ウイルスベクターは遺伝子送達系として使用される一方法であ
る。実に多様なウイルス発現系が開発され、体細胞に遺伝子を導入するというそ
れらの能力について評価が行なわれている。とりわけレトロウイルスとアデノウ
イルスに基づくベクター系はこの十年間広範に研究されてきた。最近、より一般
的に使用されているレトロウイルスベクターとアデノウイルスベクターの代替候
補として、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）が登場した。陽イオン脂質とリポソー
ムを含む脂質ベクターも治療用遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡの送達に使用
される。

【０００３】遺伝子治療による疾患と障害の治療的処置には、細胞への新しい遺伝情報の移
入と安定な、または一過性の挿入が伴う。望ましい機能をコードする遺伝子の正
常な対立遺伝子を再導入することによる遺伝子欠損の矯正により、この概念が臨
床的に実施可能であることが証明されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｎｅｗ
Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２３：５７０（１９９０））。実際、遺伝子導入効率
、遺伝子発現の調節、ウイルスベクターを使用することの潜在的危険に関わる基
本的諸問題を解決するために、広範な遺伝障害を対象とする前臨床試験と臨床試
験が現在進行中である。ウイルスベクターを使用する臨床遺伝子導入試験の大半
では、標的細胞への遺伝子導入をエクスビボで行なった後、それらの標的細胞が
インビボに投与される。ウイルスベクターはインビボで与えることもできるが、
反復投与により中和抗体が誘導されうる。

【０００４】遺伝子治療の将来的な臨床適用が直面する主な問題は、患者の選択された組織
で異種遺伝子をどのようにして臨床的に有意義な量で発現させるかという問題で
ある。遺伝子調節配列はこの問題に有望な解答を与える。プロモーターやエンハ
ンサーなどの遺伝子調節配列は細胞タイプ特異的活性を有し、一定の誘導因子に
より応答配列を介して活性化されうる。プロモーターのような調節配列を使用し
て遺伝子を発現させることにより、ベクターコンストラクト中の異種遺伝子の制
御され制限された発現が容易になる。例えば熱ショックプロモーターは熱ショッ
ク後に異種遺伝子を発現させるために使用できる。

【０００５】米国特許第５，６１４，３８１号、第５，６４６，０１０号およびＷＯ８９／
００６０３は、４２℃を超える温度での熱ショックを使って導入遺伝子を発現さ
せることに言及している。これらの温度は、その個体を傷つけることなく一定期
間維持することができないので、ヒトの治療では実施不可能である。

【０００６】遺伝子治療は細胞毒療法や放射線療法などの様々な従来の癌治療法と組み合わ
せて使用できるだろう。高温（ハイパーサーミア）はインビトロで放射線の細胞
致死作用を増進し（Ｈａｒｉｓｉａｄｉｓら，Ｃａｎｃｅｒ，４１：２１３１−
２１４２（１９７８））、インビボで動物の腫瘍における腫瘍反応を有意に増進
し、無作為化臨床試験での成果を向上させることが明らかにされている。しかし
、高温処置の使用に伴う主な問題は、加温システムが大きく深い腫瘍を十分に加
熱できないことである。

【０００７】したがって、そのような発現を誘導する条件にさらされた身体の領域で治療用
遺伝子の発現が優先的に活性化されるように患者を処置するために、４２℃以下
の温度で全身または局所に使用できるベクターを開発することが有益だろう。

【０００８】（発明の要約）本発明は細胞内でポリヌクレオチドの誘導発現を達成する方法を提供する。特
に、哺乳類細胞内でポリヌクレオチドの誘導発現を達成する方法における熱ショ
ックプロモーターの使用を教示する。本発明は、４２℃以下の温度で使用できる
熱ショック制御ベクターを提供することにより、先行技術の欠点を克服するもの
である。これらの方法は治療用遺伝子の誘導発現による患者の処置に使用できる
。

【０００９】一態様として、本発明は哺乳類細胞内で導入遺伝子の発現を達成する方法であ
って、まず、（ｉ）トランス活性化因子をコードする遺伝子に作動可能に連結さ
れた誘導性プロモーターと（ｉｉ）選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連
結された第二のプロモーターとの両方を含んでなる発現コンストラクトを用意す
ることからなる方法を提供する。この第二プロモーターは同じコンストラクトに
よって発現されるトランス活性化因子によって活性化される。次に、この方法に
は、その発現コンストラクトを当該細胞に導入する段階が含まれる。最後に、そ
の細胞は上記誘導性プロモーターを活性化する条件にさらされ、選択されたポリ
ヌクレオチドの発現が起こる。

【００１０】本発明の好ましい態様では、誘導性プロモーターが熱ショックプロモーターで
あり、その熱ショックプロモーターを活性化する条件が高温条件である。この高
温条件は、基礎温度付近から約４２℃の間の温度からなりうる。ここに細胞の基
礎温度とは、その細胞がその自然の状態で通常見出される際の温度と定義され、
例えば哺乳動物の皮膚の細胞は３３℃ほどの低温であるのに対し、ある生物の肝
臓の細胞は３９℃もの高温になりうる。特定の態様では、高温の適用として、細
胞の温度を、基礎温度（最も典型的には３７℃）から約４２℃またはそれ以下ま
で上昇させる。また高温条件は、約３８℃から約４１℃まで、または約３９℃か
ら約４０℃までの範囲であってもよい。熱ショックプロモーターは、随意に、熱
ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーターＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ６
０、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ７３、ＨＳＰ２５およびＨＳＰ２８の群か
ら選択されるプロモーターに由来するものであってもよい。ユビキチンプロモー
ターも本発現コンストラクト中の熱ショック誘導性プロモーターとして使用でき
る。随意に、ＨＳＰ７０に由来しＨＳＰ７０Ｂプロモーターの最初のおよそ４０
０ｂｐを含んでなる最小熱ショックプロモーターを本発明に使用してもよい。

【００１１】これに代わる一態様では、誘導性プロモーターが低酸素応答配列（ＨＲＥ）を
含んでなる。この低酸素応答配列は随意に少なくとも一つの低酸素誘導性因子１
（ＨＩＦ−１）結合部位を含有してもよい。

【００１２】本発明の一態様として、第二プロモーターを、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩ
Ｖ−１）プロモーターとヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）プロモーターか
らなる群より選択してもよい。好ましい態様としてトランス活性化因子は転写の
トランスアクチベーター（ＴＡＴ）であってもよい。

【００１３】選択されたポリヌクレオチドはタンパク質またはポリペプチドをコードしうる
。例えば、選択されたポリヌクレオチドは次に挙げるタンパク質のいずれをコー
ドしてもよい：オルニチンデカルボキシラーゼアンチザイムタンパク質、ｐ５３
、ｐ１６、ｎｅｕ、インターロイキン１（ＩＬ１）、インターロイキン２（ＩＬ
２）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン７（ＩＬ７）、インタ
ーロイキン１２（ＩＬ１２）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、ＦＬＴ−３
リガンド、顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺
激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、γ−インターフェロン（ＩＦＮγ）、α−インターフェ
ロン（ＩＦＮα）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、単純ヘルペスウイルスチミジンキ
ナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、Ｉ−ＣＡＭ１、ヒト白血球抗原Ｂ７（ＨＬＡ−Ｂ７）
、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ−３）。このような態様
では、選択されたポリヌクレオチドが、第二プロモーターに関してセンス方向に
配置される。

【００１４】また、選択されたポリヌクレオチドの発現が転写を伴うが翻訳を伴わず、リボ
ザイムを生成するものであってもよい。この態様でも、選択されたリボヌクレオ
チドは、第二プロモーターに関してセンス方向に配置される。

【００１５】これに代わるさらにもう一つの態様では、選択されたポリヌクレオチドの発現
が転写を伴うが翻訳を伴わず、アンチセンス核酸として働くｍＲＮＡ分子をもた
らす。このような態様では、選択されたポリヌクレオチドが、発現コンストラク
ト中で該第二プロモーターに関してアンチセンス方向に配置された標的遺伝子ま
たはその断片でありうる。

【００１６】本発現コンストラクトはさらに、ハイグロマイシン耐性、ネオマイシン耐性、
ピューロマイシン耐性、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、ｇｐｔ、ＤＨＲＦ、緑色蛍
光タンパク質またはヒスタジノールなどの選択可能マーカーをコードする遺伝子
を含みうる。また、本発現コンストラクトはさらに、（ｉ）上記第二プロモータ
ーに作動可能に連結された第二の選択されたポリヌクレオチドと（ｉｉ）上記第
一および第二の選択されたポリヌクレオチドの間に配置された内部リボソームエ
ントリー部位（ＩＲＥＳ）を含んでもよい。

【００１７】細胞は腫瘍細胞でも、腫瘍内に位置する細胞でも、哺乳動物内に位置する細胞
でもよい。発現コンストラクトの細胞への導入はインビトロまたはインビボで行
なわれる。ある態様では、発現コンストラクトの細胞への導入が、リポソーム、
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、単純
ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスからなる群より選択される送達媒体によ
って媒介される。

【００１８】本発明のもう一つの態様として、治療有効量の、選択された遺伝子の産物を、
対象に与える方法が提供される。この方法では、トランス活性化因子をコードす
る遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含んでなる第一発現コン
ストラクトを用意すると共に、選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結さ
れた第二プロモーターを含んでなる第二発現コンストラクトを用意し、その第二
プロモーターは第一発現コンストラクトによってコードされるトランス活性化因
子によって活性化される。これら第一および第二の発現コンストラクトは上記対
象の望ましい細胞に導入され、選択されたポリヌクレオチドの発現が誘導される
ように、その細胞が、誘導性プロモーターを活性化する条件にさらされる。好ま
しい態様では、第一発現コンストラクトと第二発現コンストラクトが同じベクタ
ー上に存在する。また、誘導性プロモーターは好ましくは熱ショックプロモータ
ーであり、活性化条件は、基礎温度より高くしかも４２℃未満である温度からな
る。

【００１９】これら発現コンストラクトの一方または両方の導入はインビボでもエクスビボ
でも行いうる。選択されたポリヌクレオチドの発現産物は随意に、その対象の病
原体、例えばウイルス、細菌、菌類、寄生虫などに対して有害であってもよい。
また、選択されたポリヌクレオチドの発現産物は、その対象の細胞の成長を抑制
するものであってもよい。これに代わる本発明のさらにもう一つの態様では、選
択されたポリヌクレオチドの発現産物が、その対象中の欠損タンパク質を補充す
る。また、選択されたポリヌクレオチドの発現産物が、神経の再生を促進するも
のであってもよい。

【００２０】さらなる態様として、ヒトなどの哺乳動物の癌を処置する方法であって、（ａ
）（ｉ）トランス活性化因子をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性
プロモーター（好ましくは熱ショックプロモーター）と（ｉｉ）選択されたポリ
ヌクレオチドに作動可能に連結された第二プロモーターとを含んでなり、その第
二プロモーターがそのトランス活性化因子によって活性化される発現コンストラ
クトを用意し、（ｂ）該発現コンストラクトを腫瘍細胞に導入し、（ｃ）選択さ
れたポリヌクレオチドがその腫瘍細胞の成長を抑制するのに十分な量で発現され
るように、その腫瘍細胞を、その誘導性プロモーターを活性化する条件にさらす
という各段階を含んでなる方法が提供される。その誘導性プロモーターが熱ショ
ックプロモーターである場合、その活性化条件は、およそ基礎温度より高く約４
２℃より低い温度からなる。

【００２１】さらにこの方法は、外部ビーム放射線療法、小線源照射療法、化学療法、外科
手術からなる群より選択される確立された形の癌治療法による該腫瘍細胞の処置
を含んでもよい。癌は随意に、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、膵
臓、血球、結腸、胃、胸部、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、外陰、子宮頸、皮
膚、頭頚部、食道、骨髄および血液の癌からなる群より選択できる。

【００２２】本発明の具体的一態様では、選択されたポリヌクレオチドがオルニチンデカル
ボキシラーゼアンチザイムタンパク質である。腫瘍細胞中の発現コンストラクト
の誘導性プロモーターを活性化する条件に細胞をさらした後、その腫瘍細胞を放
射防護剤ＷＲ−３３２７８またはＷＲ−１０６５で処置する。最後にその腫瘍細
胞を放射線療法で処置する。

【００２３】ヒトなどの哺乳動物で免疫反応を惹起する方法も、本発明によって提供される
。惹起される免疫反応は体液性免疫反応と細胞性免疫反応のどちらを構成しても
よい。一態様としてこの方法は、（ａ）（ｉ）トランス活性化因子をコードする
遺伝子作動可能に連結された誘導性プロモーター（好ましくは熱ショックプロモ
ーター）と（ｉｉ）選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結された第二プ
ロモーターとを含んでなり、その第二プロモーターがそのトランス活性化因子に
よって活性化される発現コンストラクトを用意し、（ｂ）該発現コンストラクト
をその哺乳動物中の細胞に導入し、（ｃ）選択されたポリヌクレオチドがその哺
乳動物で免疫反応を惹起するのに十分な量で発現されるように、その誘導性プロ
モーターを活性化する条件にその細胞をさらすことからなる。その誘導性プロモ
ーターが熱ショックプロモーターである場合、その活性化条件は、およそ基礎温
度より高く約４２℃より低い温度からなる。

【００２４】ある態様では、惹起される免疫反応が、その発現コンストラクトを含有する哺
乳動物中の細胞に向けられる。この方法は、随意に、化学療法、外部ビーム放射
線療法、小線源照射療法および外科手術からなる群より選択される確立された形
の癌治療法によるその細胞の処置を伴ってもよい。

【００２５】もう一つの態様として、（ａ）トランス活性化因子をコードする遺伝子、（ｂ
）その遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーター、（ｃ）選択されたポ
リヌクレオチドおよび（ｄ）その選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結
された第二プロモーターを含んでなる発現コンストラクトが提供される。本コン
ストラクトの第二プロモーターは上記トランス活性化因子によって活性化される
。好ましい態様では、その誘導性プロモーターが熱ショックプロモーターであり
、選択されたポリヌクレオチドの発現を、約３７℃より高く約４２℃未満の温度
からなる高温条件によって誘導できる。これに代わる態様として、本発現コンス
トラクトの誘導性プロモーターは低酸素応答配列を含んでもよい。また本発現コ
ンストラクトは、やはり第二プロモーターに作動可能に連結されていて、ＩＲＥ
Ｓにより、第一の選択されたポリヌクレオチドで隔てられた、第二の選択された
ポリヌクレオチドを含んでもよい。

【００２６】本発現コンストラクトを含む細胞も提供される。提供される発現コンストラク
トは、随意に、哺乳動物の遺伝物質を改変する方法でも使用できる。

【００２７】本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだ
ろう。しかし、この詳細な説明と具体例は、本発明の好ましい態様を示している
と同時に、例示を目的とする記載に過ぎないと理解すべきである。本発明の精神
とその範囲に含まれる種々の変更と変形は、当業者には、この詳細な説明から明
らかになるからである。

【００２８】（図面の簡単な説明）下記の図面は本明細書の一部を構成し、本発明の特定の側面をいっそう具体的
に説明するべく添付するものである。本発明は、これらの図面の一つまたはそれ
以上を、ここに示す特定態様の詳細な説明と組み合わせて参照することによって
、より良く理解できる。図１は、熱ショックプロモーター活性を定量するために使用した基本ベクター
を示す図。このプラスミドは、ＨＳＰ７０Ｂプロモーター（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ
社）に由来する最小プロモーターを含有する。ＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎ
ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）、β−ｇａｌ、ＩＬ−
２などのリポーター遺伝子はマルチクローニングサイトに容易に挿入されて、そ
の最小ＨＳＰ７０Ｂプロモーターの制御下に発現されるようになる。このプラス
ミドは、細菌系で増殖するための標準的配列と共に、哺乳類細胞で選択できるよ
うにネオマイシン耐性遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子も含有する。Ｓ８プラス
ミドはここに示すプラスミドとそのマルチクローニング部位に挿入されたＥＧＦ
Ｐとからなる。図２は、Ｓ８プラスミドを安定にトランスフェクトしたＤＵ−１４５に関する
細胞蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）ヒストグラム。蛍光は左から右に向かって
増加する。上側のヒストグラムは熱ショックにさらされていないトランスフェク
トＤＵ−１４５細胞から得られるものである。下側のヒストグラムは４２℃の熱
ショックに１時間さらしたトランスフェクトＤＵ−１４５細胞から得られるもの
である。図３は、三種類のＳ８トランスフェクトＭＣＦ７細胞集団に関するＦＡＣＳヒ
ストグラム。Ｓ８コンストラクトをトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞をＦＡＣ
Ｓで選別した。元の集団はポリクローナル選択細胞株に由来した。その細胞株の
活性化型（すなわちＥＧＦＰを発現する細胞）集団を非活性化型集団から分離し
た。その選別後に、陽性集団を生育し、次に、より純粋に陽性な細胞株を得るた
めに再び選別を行なった。この場合は、ポリクローナルＭＣＦ７−Ｓ８−Ｐ細胞
を２回選別して、高度に陽性な集団ＭＣＦ７−Ｓ８−ＰＳ２を得た。図４は、様々な細胞株でのＥＧＦＰの発現をＦＡＣＳでアッセイした結果を示
すグラフ。細胞株にプラスミドＳ８をトランスフェクトした。次に、それらの細
胞をクローン化するか、ポリゴナル（ｐｏｌｙｇｏｎａｌ）株を生育した。場合
によっては、それらの細胞株をＥＧＦＰ発現に関してＦＡＣＳで選別した。総平
均蛍光を定量してグラフ化した。図５は、２回選別した安定トランスフェクトＤＵ−１４５細胞（ＤＵ−Ｓ８−
ＰＳ２）における熱ショック後のＥＧＦＰの発現を示すグラフ。ＤＵ−Ｓ８−Ｐ
Ｓ２細胞を４０℃または４２℃で加熱し、様々な時間、回復させた。次にその細
胞をＦＡＣＳで分析した。図６は、熱ストレスへのばく露の１６時間後の安定トランスフェクトＤＵ−１
４５細胞におけるＥＧＦＰの発現レベルを示すグラフ。一つの細胞集団（ＤＵ−
Ｓ８−ＰＳ２）にＳ８プラスミドを安定にトランスフェクトした。もう一つの集
団（ＤＵ−Ｖ９−ＰＳ２）にはＶ９プラスミド（Ｖ９プラスミドのＥＧＦＰがＨ
ＳＰ７０ＢではなくＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されている点以外はＳ
８と同じプラスミド）を安定にトランスフェクトした（図７参照）。それらの細
胞を様々な温度で加熱し、１６時間、回復させた。非トランスフェクトＤＵ−１
４５細胞を対照として含めた。図７は、ＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏ
ｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子に作動可能に連結されたＣＭＶプロモ
ーターを含有するプラスミドＶ９の概略図。図８は、熱ショック反応の増幅を可能にする第二プロモーターを含有するベク
ターのための基本ベクターデザインを示す図。このプラスミドはＨＳＰ７０Ｂプ
ロモーターに作動可能に連結されたマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含有す
るが、第二プロモーターに作動可能に連結された治療用遺伝子も含有する。また
このプラスミドはネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、細菌での
増殖に必要な標準的配列も含有する。プラスミドｐＣ８では、第二プロモーター
がＨＩＶ−１末端反復配列（ＬＴＲ）であり、治療用遺伝子がＩＬ２である。ｐ
ｆ１２では、ｔａｔがＭＣＳに挿入され、第２プロモーターはＨＩＶ−１ＬＴ
Ｒであり、治療用遺伝子はＩＬ２である。もう一つのプラスミドｐ００７は、Ｈ
ＩＶ−２ＬＴＲが第二プロモーターとして使用されること以外はｐｆ１２と同
じである。図９は、ＨＩＶ−１プロモーターまたはＨＩＶ−２プロモーターによって駆動
される治療用遺伝子ＩＬ−２を含有する増幅因子コンストラクトを示す図。増幅
因子部分はＣＭＶプロモーターまたはＨＳＰ７０プロモーターによるＴＡＴ発現
によって制御される。これらのプラスミドはネオマイシン耐性遺伝子と、細菌で
の増殖用の配列も含有する。これらのコンストラクトは実施例２と実施例３の増
幅因子試験で使用した。図９Ａは、ＣＭＶ−ＴＡＴ−ＨＩＶ−１−ＩＬ２発現カ
セットを含有するＸ１４と呼ばれるプラスミドを示し、図９ＢはＣＭＶ−ＴＡＴ
−ＨＩＶ−２−ＩＬ２発現カセットを含有するＹ１５と呼ばれるプラスミドを示
し、図９ＣはＨＳＰ−ＴＡＴ−ＨＩＶ−１−ＩＬ２発現カセットを含有するｐｆ
ｌ２と呼ばれるプラスミドを示し、図９ＤはＨＳＰ−ＴＡＴ−ＨＩＶ−２−ＩＬ
２発現カセットを含有するｐ００７と呼ばれるプラスミドを示す。図１０は、ＳｔｒｅｓｓＧｅｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のｐ１７３０
ＲのＢａｍＨ１−ＨｉｎｄＩＩＩ断片のＤＮＡ配列。この断片は、上記の具体例
、実施例１と３のコンストラクトで使用した約０．４ｋｂの最小ＨＳＰ７０Ｂプ
ロモーター断片を含有する。

【００２９】（具体的態様の説明）１．本発明遺伝子治療は、インビボでの治療用遺伝子発現をどのように調節し、かつ増進
するかという２つの主な技術的課題に直面する。本発明は、高温処置を誘導性発
現コンストラクトと組み合わせることにより、これらの問題の両方に対処するも
のである。本発明者らは特異的誘導性遺伝子発現の効率の増加を実証した。

【００３０】治療用遺伝子を極めて高いレベルで発現させうることと、発現のレベルを制御
できることは、遺伝子治療の開発における重要な目標である。本発明者らはこれ
らの目標と取り組むために新しいベクターセットを作成した。本発明者らは対象
遺伝子を発現させるために増幅因子法を使用する。これらの増幅因子は、リポー
ター遺伝子を駆動する他のプロモーターの転写活性化因子であるタンパク質を発
現させるヒトＨＳＰ７０Ｂプロモーターからなる。これら追加のプロモーターと
それらに作動可能に連結したリポーター遺伝子はＨＳＰ７０Ｂプロモータ配列お
よびトランス活性化タンパク質をコードする遺伝子と同じベクターに含まれるこ
とが好ましい。

【００３１】リポーター遺伝子としてヒトＩＬ−２を用いた哺乳類細胞のトランスフェクシ
ョン試験で、本発明者らは、その増幅因子コンストラクトを使用することにより
、構成性ＣＭＶプロモーターまたはＨＳＰ７０Ｂのみによってもたらされるリポ
ーター遺伝子発現と比較して、使用した全ての温度条件で、遺伝子発現が劇的も
増加することを明らかにした（下記の具体例、実施例３を参照されたい）。ヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｔａｔ遺伝子の上流にＨＳＰ７０Ｂプロモーターと
、インターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子の上流にＨＩＶ１またはＨＩＶ２末端
反復配列とを含有するコンストラクトは３７℃でプロモーター活性を示し、それ
は熱ショックによってさらに増幅された。同時トランスフェクション実験により
、哺乳類細胞で、ＨＳＰ、ＨＳＰ／ＨＩＶ１およびＨＳＰ／ＨＩＶ２プロモータ
ー発現コンストラクトの活性が、ＣＭＶプロモーター発現コンストラクトの活性
のそれぞれ０．４倍、６．９倍および８３．３倍であることが示された。これら
のデータは、この最小熱ショックプロモーターが、単独ではＣＭＶプロモーター
活性より活性が低いものの、第二のプロモーターと共に使用することにより、温
度依存性をいくらか維持したままで、遺伝子発現を著しく増幅させうることを示
している。

【００３２】他のタンパク質を条件付きで発現させるためのトランス活性化タンパク質の発
現を駆動するために熱ショックプロモーターを使用することは、先の研究によっ
て検討されている（Ｓｃｈｗｅｉｎｆｅｓｔら，Ｇｅｎｅ，７１（１）：２０７
−２１０，１９８８；ＥＰＯ０１１８３９３；ＷＯ８９／００６０３、米
国特許第５，６１４，３８１号；米国特許第５，６４６，０１０号；ＥＰ０
２９９１２７）。ここに記載する発明は、これらの先行する方法論とは、例え
ば、１）異なる熱ショックプロモーターを使用する点（Ｓｃｈｗｅｉｎｆｅｓｔ
らはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターを使用している）、２）異なる送達方法
を使用する点（本発明者らは両プロモーターを一つのコンストラクトに組み込ん
だが、他の研究者らは同時トランスフェクションを使用している）、３）誘導に
異なる温度を使用する点（先の研究では４２℃を越える温度が使用されたが、本
発明は４２℃またはそれ未満の温度で有利に機能する）、４）工業生産よりも遺
伝子治療に関連して使用される点で異なる。さらに本発明者らはＨＩＶ−１プロ
モーターまたはＨＩＶ−２プロモーターを使用でき、本発明はこれら２つのプロ
モーターがもたらす発現レベルの明確な相違を明らかにする。

【００３３】本発明の好ましい側面として、熱ショック誘導性配列を用いて哺乳類細胞内で
導入遺伝子の発現を達成する方法が提供される。熱ショック配列はトランス活性
化遺伝子の発現を駆動するために使用される。したがって、発現コンストラクト
を高温にさらすと、そのトランス活性化配列の発現が誘導される。このトランス
活性化遺伝子は第二のプロモーターに作用し、そのプロモーターが活性型になっ
て対象の治療用遺伝子の発現を駆動する。ある特定の態様では、ＨＳＰ７０プロ
モーターに由来するプロモーターを使用する。このプロモーターのとりわけ有用
な側面は、周囲温度での発現の基礎レベルが低く、誘導性であることである。さ
らに本発明は治療有効量の遺伝子産物を対象に与える方法と、細胞の成長を抑制
する、または免疫反応を惹起する方法も提供する。本発明の目標を満たすために使用する組成物と方法を以下にさらに詳しく説明
する。

【００３４】２．熱ショック応答熱ショック応答または熱ストレス応答は植物から霊長類に及ぶ生物で起こる普
遍的な反応である。これは、熱ショックの結果としてばかりではなく、虚血、低
酸素、グルコース欠乏、イオノフォアグルコースおよびアミノ酸類似体、エタノ
ール、遷移系列金属、薬物、ホルモン、細菌感染、ウイルス感染などといった他
の様々なストレスの結果としても起こりうる応答である。さらに、熱ショックタ
ンパク質遺伝子の過剰発現が腫瘍細胞の増進された増殖とストレスに関係しうる
という証拠もある（Ｆｉｎｃｈら，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈａｎｄＤｉｆｆ
ｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ３（５）：２６９−２７８，１９９２）。この応答は
、様々に誘導され局在する、分子サイズの異なるよく保存されたタンパク質のフ
ァミリーの合成を特徴とする。これらのタンパク質は最も系統的に保存されてい
るものに属し、それらの分子量に従って特徴づけられる。

【００３５】ストレスタンパク質コード遺伝子の転写活性化は、環境的および／または生理
学的外傷に反応して数分以内に起こる。この迅速な応答は、熱ショックタンパク
質の大多数にイントロンがないことに、その理由が帰されている。このイントロ
ンの欠如により、熱ショックタンパク質は、高温で起こるイントロンプロセッシ
ングの遮断を回避できる。熱ショックタンパク質は、このようにして極めて高い
効率で、しばしば他のタンパク質を犠牲にして、翻訳される。

【００３６】ストレス遺伝子の活性化は、既存の熱ショック転写因子（ＨＳＦ）の不活性型
または活性型からの転換によって媒介される。このＤＮＡ結合タンパク質の分子
量には大きな相違がある（例えばヒトでは８３ｋＤａ、酵母では１５０ｋＤａ）
。熱ショック配列はＨＳＰ７０の保存された上流調節配列であり、そこにＨＳＦ
が結合する。熱ショックタンパク質の主な機能はタンパク質の折りたたみを容易
にし凝集を防止することにあるが、これらのタンパク質が環境的傷害に対する防
護機構を生物に与える上で何らかの役割を果たし、外傷に続いて起こる回復を助
けることは明らかである。

【００３７】大半の真核配列特異的転写因子と同様に、ＨＳＦも、熱ショック遺伝子の上流
に多数のコピーとして見出される高度に保存された応答配列を介して作用する。
その熱ショック応答配列は隣接した３つの５塩基対配列の逆方向反復からなり、
それらのコンセンサスはｎＧＡＡｎと定められ、さらに最近になってＡＧＡＡｎ
と定められた。ＨＳＦの調節は、合成または安定性の改変よりも、主として活性
の変化からなる。

【００３８】３．高温療法放射線療法や化学療法と組み合わせて使用される場合、悪性腫瘍の補助処置と
しての高温療法の有効性は、多くの臨床試験によって示されている（Ｈａｈｎ，
Ｇ．Ｍ．，ＨｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａａｎｄＣａｎｃｅｒ，第二版，ニュー
ヨーク，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８２；Ｓｃｏｔｔら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ｏｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１０（１１）２２１９−２１２３，１９８４；Ｌｉｎｄｈ
ｏｌｍら，Ｒｅｃ．Ｒｅｓ．ｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１０７：１５２−１
５６，１９８８）。熱の適用、適応症および禁忌の理論的根拠は、望ましい生理
学的応答が熱の使用によってもたらされるという実験的証拠と管理下臨床試験に
基づいて展開される。Ｌｅｈｍａｎは他の応用例での熱の治療的使用に関して包
括的な論文を書いている（ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＨｅａｔａｎｄＣｏｌ
ｄ，ＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅＬｉｂｒａｒｙ，Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ発行，１９９０。参考文献として本明細書の
一部を構成する）。特に内科的および外科的な治療的介入に関して熱の使用が議
論されている第９章を参照されたい。

【００３９】「高温（ハイパーサーミア）」とは処置を施されている対象の周囲温度よりも
高い温度条件を指すものとする。したがって、ここにいう高温温度は、通例約３
７℃から約４２℃の範囲に及ぶだろう。好ましい態様ではその温度が約３８℃か
ら約４２℃の範囲に及び、他の態様では、その温度が約３８℃から約４１℃まで
であり、他の態様ではその温度が約４０℃だろう。補助療法で高温療法の実施に
現在利用できる装置を使えば、高温処置の温度を４２℃まで約０．５℃以内に維
持できる。したがって、本発明の治療的処置は、３７．０℃、３７．２℃、３７
．４℃、３７．６℃、３７．８℃、３８．２℃、３８．４℃、３８．６℃、３８
．８℃、３９．２℃、３９．４℃、３９．６℃、３９．８℃、４０．２℃、４０
．４℃、４０．６℃、４０．８℃、４１．２℃、４１．４℃、４１．６℃、４１
．８℃または４２．０℃で行いうる。本発明以前は、高温療法が有効であるには
、安全性を考慮して正常組織内の温度を４２℃未満に制限しつつ、腫瘍内温度を
約４３℃を超える温度に３０〜６０分維持する必要があった。腫瘍内で４２℃を
超える均一な温度を達成することは極めて難しく、しばしば不可能である。

【００４０】哺乳動物中の組織は、超音波技術、電磁気技術、例えば伝播波（例：マイクロ
波）法、抵抗（例：高周波）法、誘導（高周波または磁気）法を含む、いくつか
の技術を使って加熱できる（Ｈａｈｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ
ａｎｄＣａｎｃｅｒ，第二版，ニューヨーク，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８２；Ｌｅ
ｈｍａｎ，Ｌ．Ｂ．，ＰｏｓｔｇａｒｄＭｅｄ，８８（３）：２４０−２４３
，１９９０；共に参考文献として本明細書の一部を構成する）。いくつかの単純
な応用では、循環させた熱風または水を使って組織温度を上昇させうる。

【００４１】ＬｅＶｅｅｎに付与された米国特許第４，２３０，１２９号（参考文献とし
て本明細書の一部を構成する）は、体組織を加熱し、腫瘍の温度変化をシンチレ
ーション検出器を用いてリアルタイムでモニターする方法に言及している。この
方法は、脂肪組織での有意な熱吸収を避けるため、患者の身体への高周波（ＲＦ
）エネルギーのカップリングに備えている。これは、エネルギーが患者の体内の
同一の狭い領域に絶えず適用されることがないようにアプリケーターの軌道運動
でＲＦエネルギーを腫瘍に集中させることによって得られる。ＬｅＶｅｅｎに
付与された米国特許第３，９９１，７７０号（これも参考文献として本明細書の
一部を構成する）には、腫瘍を含有する人体の一部を高周波電磁場においてその
腫瘍組織を加熱し、隣接する正常組織を損傷することなくその腫瘍の壊死を引き
起こすことにより、ヒトの腫瘍を処置する方法が記載されている。

【００４２】本発明の好ましい態様では、特定の腫瘍部位での誘導遺伝子発現を達成するた
めに、ここに開示する遺伝子治療用ベクターと組み合わせて高温を適用する。さ
らに、その高温／遺伝子治療処置法を、他の従来の治療法、例えば後述の化学療
法や放射線療法などと組み合わせて使用して、癌を効率よく処置することもでき
る。当技術分野では他の高温誘導法も知られている。高温の局所的および／また
は全身的適用の方法と装置は当業者にはよく知られており、例えば米国特許第５
，２８４，１４４号、第４，２３０，１２９号、第４，１８６，７２９号、第４
，３４６，７１６号、第４，８４８，３６２号、第４，８１５，４７９号、第４
，６３２，１２８号など（いずれも参考文献として本明細書の一部を構成する）
に開示されている。

【００４３】４．発現コンストラクトの作成一定の態様では、本発明は、治療用遺伝子をコードする発現コンストラクトを
作成するために、遺伝物質の操作を伴う。このような方法には、例えば対象遺伝
子をコードする異種ＤＮＡとその発現のための手段を含有する発現コンストラク
トの使用、適当なヘルパー細胞でそのベクターを複製すること、そこから生産さ
れたウイルス粒子を得ること、細胞をその組換えウイルス粒子に感染させること
が含まれる。その遺伝子は、例えばがん細胞を処置するため、ウイルス感染に対
抗するための免疫調節遺伝子を発現させるため、または遺伝的欠損の結果として
の遺伝子の機能を代償するための治療用遺伝子だろう。遺伝子治療用ベクターに
関して、その遺伝子は異種ＤＮＡであり、ベクターの骨格となるウイルスゲノム
ＤＮＡ以外の供給源に由来するＤＮＡを含むものとする。最後に、ウイルスは生
ワクチンウイルスとして作用し、それに対する抗体を産生するために、対象とな
る抗原を発現させうる。遺伝子は細菌、ウイルス、酵母、寄生虫、植物または動
物などの原核もしくは真核供給源に由来しうる。異種ＤＮＡは２以上の供給源に
由来してもよい（すなわち多重遺伝子コンストラクトまたは融合タンパク質）。
異種ＤＮＡは、ある供給源に由来する調節配列と、異なる供給源から得た遺伝子
とを含んでもよい。

【００４４】ａ）治療用遺伝子本発明の選択されたポリヌクレオチドは随意に治療用遺伝子であってもよい。
多種多様な治療用遺伝子はいずれもここに記載するベクターと方法での使用に適
している。特定の傷害、医学的状態または疾患への本発明の適用に適した治療用
遺伝子は、当業者には識別できるだろう。

【００４５】本発明の一態様では、選択されたポリヌクレオチドがオルニチンデカルボキシ
ラーゼアンチザイムタンパク質をコードする遺伝子である。オルニチンデカルボ
キシラーゼ（ＯＤＣ）アンチザイムタンパク質は、細胞内ポリアミン貯蔵量のフ
ィードバック調節の重要な成分である（Ｈａｙａｓｈｉら，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ２１（１）：２７−３０，１９
９６，参考文献として本明細書の一部を構成する）。このタンパク質のレベルは
アンチザイムメッセージの翻訳を刺激する細胞内ポリアミンのレベルに直接関係
する。アンチザイムタンパク質はオルニチンデカルボキシラーゼ（ポリアミン合
成における最初の酵素であり、しばしば律速酵素である）を分解の標的とする。
このタンパク質はポリアミン取り込みも抑制する。したがって低レベルの内因性
ポリアミン類は低レベルのアンチザイムにつながり、それが結果としてＯＤＣに
よるポリアミン合成とポリアミンの取り込みを極限まで増加させる。逆に高レベ
ルの内因性ポリアミンは高レベルのアンチザイムタンパク質をもたらし、それが
結果としてＯＤＣによるポリアミン合成を最小限に抑え、ポリアミンの取り込み
を抑制する。

【００４６】放射線防護剤ＷＲ−３３２７８（Ｎ，Ｎ''−（ジチオジ−２，１−エタンジイ
ル）ビス−１，３−プロパンジアミン）はジスルフィド含有ポリアミン類似体で
あり、細胞にはポリアミン運搬体を使って取り込まれる（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，
Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１６：３０６３−３０６８，１９９５，参考文
献として本明細書の一部を構成する）。この運搬体はアンチザイムによって阻害
される。動物モデルから得られた証拠は、この放射線防護剤が少なくともいくつ
かの正常組織にいくつかの腫瘍よりも高度に取り込まれることを示している（Ｉ
ｔｏら，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＲａｄｉａｔｉ
ｏｎＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｈｙｓｉｃｓ２８：８９９−９
０３，１９９４）。ＷＲ−３３２７８のような薬剤は、放射線療法の腫瘍抑制有
効性を低下させることなく用量制限的正常組織を毒性から防護する試みとして臨
床放射線療法に使用されてきた（ＳｐｅｎｃｅｒおよびＧｏａ，Ｄｒｕｇｓ，５
０（６）：１００１−３１，１９９５，参考文献として本明細書の一部を構成す
る）。ＷＲ−３３２７８の取り込み量の相違に関する理論的根拠は、増殖性腫瘍
細胞がしばしば正常組織中の非増殖性細胞よりも高いレベルのポリアミンを含有
することかもしれない。したがって腫瘍は正常組織よりも高いレベルのアンチザ
イムを発現するだろう。

【００４７】本発明者らは、ポリアミン依存的調節に必要な配列を欠くアンチザイムｃＤＮ
Ａをヒト熱ショック７０Ｂプロモーターの制御下に置いた。本発明者らはヒト前
立腺癌由来のＤＵ−１４５細胞にこのコンストラクトを安定にトランスフェクト
し、ポリアミン取り込みの熱誘導性の抑制（熱誘導性のアンチザイム活性を示す
）を示すクローンを選択した。この遺伝子療法（アンチザイム発現のＨＳＰ７０
Ｂプロモーター調節）の治療への応用は、今後、限局性前立腺癌患者での臨床試
験で使用されるだろう。患者は、全身ＷＲ−３３２７８および局所放射線療法と
組み合わせて、腫瘍内に適用されるこの遺伝子治療で処置される。次に、腫瘍内
でのアンチザイムの発現が、局所的高温によって活性化される。これらの前立腺
腫瘍に隣接する用量制限的正常組織は高温に反応してアンチザイムを発現するこ
となく、放射線保護剤ＷＲ−３３２７８を取り込み、腫瘍組織は高温に反応して
アンチザイムを発現するので、それらの腫瘍組織は放射線保護剤を取り込まない
だろう。この方法は、前立腺癌の局所的抑制を向上させる目的で前立腺により高
い線量の放射線療法を施すことを可能にする。

【００４８】これに代わる態様として、細胞防護剤エチオール（ｅｔｈｙｏｌ）（アミフォ
スチン（ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ）、ＷＲ−２７２１、Ｓ−２−（３−アミノプロ
ピルアミノ）エチルホスホロオルニチン酸とも呼ばれる））のＷＲ３３２７８以
外の他の代謝産物を、ここに記載する発現コンストラクトと共に使用してもよい
。例えば、代わりにＷＲ−１０６５（２−（３−アミノプロピルアミノ）エタン
チオール）を放射線防護剤として使用できる。

【００４９】本発明のベクターを使って送達できる遺伝子は他にも数多くある。例えば、本
発明のベクターは、腫瘍抑制剤、アンチセンス癌遺伝子、癌処置用のプロドラッ
グ活性化剤、例えばＨＳＶ−ＴＫ遺伝子など（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ａｎｎａ
ｌｓｏｆＳｕｒｇｅｒｙ，２２５：６０９−６１８，１９９７；Ｅｓａｎｄ
ｉら，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，４：２８０−２８７，１９９７）を移入する
ために使用できる。本発明の発現コンストラクトで随意に使用できるであろう他
の遺伝子には、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、Ｃ−ＣＡＭ、ＨＬＡ−Ｂ７（
Ｇｌｅｉｃｈら，ＡｒｃｈＯｔｏｌａｒｙｎｇｏｌＨｅａｄＮｅｃｋＳ
ｕｒｇ，１２４：１０９７−１０４，１９９８；Ｈｅｏら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．９：２０３１−８，１９９８；Ｎａｂｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．ＳｃｉｅｎｃｅｓＵＳＡ，９０：１５３８８−１５３９３，１９９６
；Ｓｔｏｐｅｃｋら，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏ
ｇｙ，１５：３４１−３４９，１９９７）、ＩＬ２（Ｏ'Ｍａｌｌｅｙら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１：６６７−６７３，１９９
７；Ｏｔｏｖａら，ＦｏｌｉａＢｉｏｌｏｇｉｃａ，４３：２５−３２，１９
９７）、ＩＬ４（Ｋｌｉｎｇ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１
５：３１６−３１７，１９９７）、ＩＬ７（Ｔｏｌｏｚａら，Ａｎｎａｌｓｏ
ｆＳｕｒｇｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，４：７０−７９，１９９７；Ｓｈａ
ｒｍａら，ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，３：３０３−３１３，１
９９６）、ＩＬ１２（ＨｉｓｃｏｘおよびＪｉａｎｇ，ＩｎＶｉｖｏ，１１：
１２５−１３７，１９９７；Ｃｈｅｎら，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ，１５９：３５１−３５９，１９９７），ＧＭ−ＣＳＦ（Ｋｒｅｉｔｍ
ａｎｎおよびＰａｓｔａｎ，Ｂｌｏｏｄ，９０：２５２−２５９，１９９７；Ｈ
ｏｍｉｃｋら，Ｂｌｏｏｄ，８９：４４３７−４４４７，１９９７；Ｌａｎｚａ
ら，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，８２：２３９−２４５，１９９７）、ＩＦＮ
（Ｎｏｇｕｃｈｉら，ＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓ
ｅｓ，２４：９９２−９９４，１９９７；Ｋａｎｅｍａｒｕら，Ｅｕｒｏｐｅａ
ｎＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＯｔｏ−Ｒｈｉｎｏ−Ｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，
２５４：１５８−１６２，１９９７；Ｔａｎａｋａら，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
ＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙａｎｄＨｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１１：１
１５５−１１６０，１９９６；Ｉｍａｉら，Ｌｉｖｅｒ，１７：８８−９２，１
９９７）、Ｉ−ＣＡＭ１およびＴＮＦ（Ｃｏｒｃｉｏｎｅら，Ａｎｎａｌｓｏ
ｆｔｈｅＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，８１
５：３６４−３６６，１９９７）がある（この段落で引用した論文はすべて参考
文献として本明細書の一部を構成する）。

【００５０】現在ｐ５３は腫瘍抑制遺伝子であると認識されている（Ｍｏｎｔｅｎａｒｈ，
Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇｅｎ，３：２３３−２５６，１９９２）。化学発
癌、紫外線照射、ＳＶ４０を含む数種類のウイルスによって形質転換された多く
の細胞に高レベルの突然変異型ｐ５３が見出されている。ｐ５３遺伝子は多種多
様なヒト腫瘍での突然変異不活化の標的によくなり、一般的なヒトの癌で最も頻
繁に突然変異する遺伝子であることが既に論証されている。これはヒトＮＳＣＬ
Ｃの５０％以上と、広範囲にわたる他の腫瘍で突然変異している。

【００５１】Ｐ１６^INK4は新たに記載された種類のＣＤＫ阻害タンパク質群に属し、これに
はｐ１６^B、ｐ２１^{WAF1,CIP1,SDI1}、ｐ２７^KIP1も含まれる。ｐ１６^INK4遺伝子は多くの腫瘍タイプで頻繁に欠失が起こる染色体領域９ｐ２１にマッピングされ
る。ｐ１６^INK4のホモ接合性の欠失と突然変異はヒト腫瘍細胞株にはよくある。
この証拠は、ｐ１６^INK4遺伝子が腫瘍抑制遺伝子であることを示唆している。し
かしこの解釈は、ｐ１６^INK4遺伝子改変の頻度が初代未培養腫瘍では培養細胞株
よりもはるかに低いという観察から疑われてきた。プラスミド発現ベクターのト
ランスフェクションによる野生型ｐ１６^INK4機能の復活は、いくつかのヒト癌細
胞株によるコロニー形成を減少させた（Ｏｋａｍｏｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１０４５−１１０４９，１９９４；Ａｒ
ａｐら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５５：１３５１−１３５４，１９９５；共に
参考文献として本明細書の一部を構成する）。

【００５２】Ｃ−ＣＡＭは事実上すべての上皮細胞で発現される。１０５ｋＤという見かけ
の分子量を持つＣ−ＣＡＭは、元々は、細胞凝集を中和する特異抗体との反応に
より、ラット肝細胞の原形質膜から単離された。最近の研究は、Ｃ−ＣＡＭが構
造上、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属し、その配列は癌胎児性
抗原（ＣＥＡ）に高度に相同であることを示している。Ｃ−ＣＡＭの第一Ｉｇド
メインは細胞接着活性にとって必須であることが示されている。

【００５３】細胞接着分子（ＣＡＭ）は、器官発達と細胞分化を調節する分子相互作用の複
雑なネットワークに関与することが知られている（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ａｎｎｕ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４：１３５−１６９，１９８５）。最近のデータ
は、ＣＡＭの異常発現が、いくつかの新生物の腫瘍形成に関与するらしいことを
示している。例えば、主として上皮細胞で発現されるＥ−カドヘリンの発現量の
低下は数種類の新生物の進行と関係する。また、ＧｉａｎｃｏｔｔｉとＲｏｕｓ
ｌａｈｔｉ（Ｃｅｌｌ，６０：８４９−８５９，１９９０；参考文献として本明
細書の一部を構成する）は、遺伝子導入によってα₅β₁インテグリンの発現量を
増加させることにより、インビボでチャイニーズハムスター卵巣細胞の腫瘍形成
を減少させるうることを実証した。現在、Ｃ−ＣＡＭはインビトロとインビボで
腫瘍の成長を抑制することが明らかにされている。

【００５４】本発明に従って使用できる他の腫瘍抑制剤。例えば、選択されたポリヌクレオ
チドは、次に挙げる遺伝子のいずれであってもよい：網膜芽腫（Ｒｂ）遺伝子；
腺腫性結腸ポリポーシス遺伝子（ＡＰＣ）；ＤＣＣ（ｄｅｌｅｔｅｄｉｎｃ
ｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）遺伝子；神経繊維腫症１型（ＮＦ
−１）遺伝子；神経繊維腫症２型（ＮＦ−２）遺伝子；ウィルムス腫瘍抑制遺伝
子（ＷＴ−１）；多発性内分泌腺腫症２型（ＭＥＮ−２）遺伝子；ＢＲＣＡ１遺
伝子；フォン・ヒッペルリンダウ症候群（ＶＨＬ）遺伝子；ＭＣＣ（ｍｕｔａｔ
ｅｄｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ）遺伝子；ｐ１６；ｐ２１；
ｐ５７；ｐ２７およびＢＲＣＡ２。

【００５５】これに代わる本発明の一態様として、本発明の方法とベクターは、成長因子ま
たはサイトカインの産生を刺激することによって神経再生などの再生過程を促進
するために使用できる。このような態様では、選択されたポリヌクレオチドが神
経栄養因子でありうる。例えば、選択されたポリヌクレオチドは、毛様体神経栄
養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）またはグリア細胞株由来
神経栄養因子（ＧＤＮＦ）（Ｍｉｔｓｕｍｏｔｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：
１１０７−１１１０，１９９４；Ｇａｓｈら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４４（
３Ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ１２１−１２５，１９９８；共に参考文献として本明
細書の一部を構成する）をコードしうる。また随意に、発現コンストラクトの選
択されたポリヌクレオチドが、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰシクロヒドロ
キシラーゼ１または芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（Ｋａｎｇ，Ｍｏｖ
．Ｄｉｓｏｒｄ．，１３Ｓｕｐｐｌ１：５９−７２，１９９８；参考文献と
して本明細書の一部を構成する）をコードしてもよい。さらにもう一つの態様と
して、この治療用発現コンストラクトは、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１
）（Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｍｕｌｔ．Ｓｃｌｅｒ．３：１１３−１２０，１９９７；
参考文献として本明細書の一部を構成する）などの成長因子を発現してもよい。

【００５６】本ベクターが有効な他の疾患の例には、治療用遺伝子、例えば血管新生阻害剤
や細胞周期阻害剤をコードする遺伝子の移入による、慢性関節リウマチや再狭窄
などの過剰増殖性の疾患と障害があるが、これらに限らない。

【００５７】ｂ）アンチセンスコンストラクトｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ
、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｂｃｌおよびａｂｌなどの癌遺伝子も好適な標的で
ある。しかし、治療上の利益を得るには、癌遺伝子の発現が抑制されるようにこ
れらの癌遺伝子がアンチセンス核酸として発現されるだろう。「アンチセンス核
酸」という用語は、癌遺伝子をコードするＤＮＡとＲＮＡの塩基配列に相補的な
オリゴヌクレオチドを指すものとする。アンチセンス核酸は、標的細胞内で発現
されると、それらの標的核酸に特異的に結合し、転写、ＲＮＡプロセッシング、
輸送および／または翻訳を妨害する。ポリヌクレオチドによる二本鎖（ｄｓ）Ｄ
ＮＡのターゲティングは三重らせん形成をもたらし、ＲＮＡのターゲティングは
二重らせん形成をもたらすだろう。

【００５８】アンチセンスコンストラクトは、遺伝子のプロモーターと他の制御領域、エキ
ソン、イントロン、さらにはエキソン−イントロン境界に結合するように設計で
きる。アンチセンスＲＮＡコンストラクトまたはアンチセンスＲＮＡをコードす
るＤＮＡは、インビトロまたはインビボで、例えばヒト対象を含む宿主動物内で
、宿主細胞内での遺伝子の転写または翻訳もしくはその両方を抑制するために使
用できる。「相補的ヌクレオチド」からなる核酸配列は、標準的なワトソン−ク
リック相補規則に従って塩基対形成できるものである。すなわち、大きいプリン
類は小さいピリミジン類と塩基対を形成して、シトシンと対を形成したグアニン
（Ｇ：Ｃ）の組み合わせ、およびチミンと対を形成したアデニン（Ａ：Ｔ）（Ｄ
ＮＡの場合）またはウラシルと対を形成したアデニン（Ａ：Ｕ）（ＲＮＡの場合
）の組み合わせだけを形成する。

【００５９】ここで「相補的」とか「アンチセンス配列」という用語は、その全長にわたっ
て実質的に相補的であって極めてわずかな塩基ミスマッチしか持たない核酸配列
を意味する。例えば１５塩基長の核酸配列は、それらが１３または１４箇所で相
補的ヌクレオチドを持ちミスマッチを一つだけまたは二つだけしか持たない場合
に相補的であると呼べる。当然、「完全に相補的な」核酸配列とは、その全長に
わたって完全に相補的であり、塩基ミスマッチを持たない核酸配列になる。

【００６０】アンチセンスの構築については遺伝子配列の全部または一部を使用できるが、
統計的に１７塩基長の配列はいずれもヒトゲノムには１回しか現れないはずであ
り、したがってユニークな標的配列を特定するのに十分である。短いオリゴマー
ほど作成が容易でインビボでの接触性は増加するが、ハイブリッド形成の特異性
の決定には非常に多くの他の要因が関与する。オリゴヌクレオチドのその相補的
標的への結合親和力と配列特異性は長さが増すにつれて増加する。８，９、１０
、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以
上の塩基対を持つオリゴヌクレオチドが使用されると予期される。与えられたア
ンチセンス核酸が対応する宿主細胞遺伝子のターゲティングに有効であるかどう
かは、インビトロでそのコンストラクトを試験して、内因性遺伝子の機能が影響
を受けるかどうか、または相補配列を持つ関連遺伝子の発現が影響を受けるかど
うかを決定するだけで、容易に決定できる。

【００６１】一定の態様では、他の要素を含むアンチセンスコンストラクト（例えばＣ−５
プロピンピリミジンを含むものなど）の使用が望まれるかもしれない。ウリジン
とシチジンのＣ−５プロピン類似体を含有するオリゴヌクレオチドは、高い親和
力でＲＮＡを結合し、遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤であることが明ら
かにされている（Ｗａｇｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１５１０−１５１
３，１９９３；参考文献として本明細書の一部を構成する）。

【００６２】ｃ）リボザイムコンストラクト目標を定めたアンチセンスの送達に代わるものとして、目標を定めたリボザイ
ムも使用できる。「リボザイム」という用語は、ＤＮＡ中、あるいはより典型的
にはＲＮＡ中の特定の塩基配列を標的としてそれを切断できるＲＮＡ型酵素を指
す。本発明では、リボザイムは望ましいリボザイムＲＮＡをコードする発現コン
ストラクトとして細胞に導入される。リボザイムの標的はアンチセンス核酸につ
いて説明したものとほとんど同じである。

【００６３】多くのリボザイムは生理学的条件でホスホジエステル結合の加水分解を触媒す
ることが知られている。本発明のリボザイムは第二の核酸分子（好ましくはｍＲ
ＮＡ転写物、また随意に、癌遺伝子のｍＲＮＡ転写物）の配列特異的切断を触媒
する。一般にリボザイムは、リボザイムの酵素部分に隣接するリボザイムの標的
結合部分を介して標的ＲＮＡに結合する。リボザイムの酵素部分は標的ＲＮＡを
切断する。標的ＲＮＡの戦略的切断は、直接または間接にタンパク質をコードす
るというその能力を破壊する。標的の酵素的切断を行なった後、リボザイムは標
的から解放され、この過程を繰り返す新たな標的を探す。

【００６４】本発明の好ましい態様では、そのリボザイムが植物ウイロイド由来の小さいＲ
ＮＡ分子ハンマーヘッドリボザイムである（Ｓｙｍｏｎｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．６１：６４１−６７１，１９９２；Ｃｌｏｕｅｔ−Ｄ'ＯｒｖａｌおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ，ＲＮＡ，２：４８３−４９１，１９９６；Ｈａｓ
ｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ３３４：５８５−５９１，１
９８８；ＪｅｆｆｒｉｅｓａｎｄＳｙｍｏｎｓ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓＲｅｓ．１７：１３７１−１３７７，１９８９；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｎａ
ｔｕｒｅ３２８：５９６−６００，１９８７；すべて参考文献として本明細書
の一部を構成する）。

【００６５】他の態様では、リボザイムが、グループＩイントロン、ヘアピンリボザイム、
ＶＳＲＮＡ、肝炎デルタウイルスリボザイムまたはＲＮアーゼＰ−ＲＮＡリボ
ザイム（ＲＮＡガイド配列と結合したもの）であってもよい。ヘアピンモチーフ
の例はＨａｍｐｅｌら，ＮｕｃｌｅｉＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：２９９，１
９９０とＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：４
９２９，１９８９に記述されており、肝炎デルタウイルスモチーフの例はＰｅｒ
ｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：１６，１９９２
に記述されており、ＲＮアーゼＰモチーフ（外部ガイド配列と結合したもの）の
例はＹｕａｎら，特許第５，６２４，８２４号に記述されており、ニューロスポ
ラＶＳＲＮＡリボザイムモチーフはＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｃ
ｅｌｌ６１：６８５−６９６，１９９０、ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎ
ｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８８２６−８８３
０，１９９１、ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３２：２７９５−２７９９，１９９３に記述されており、グループＩイントロン
はＣｅｓｈらの米国特許第５，３５４，８５５号に記述されている。上に挙げた
モチーフは本発明に関する限定であるとみなすべきではなく、ここで使用しうる
リボザイムが標的ｍＲＮＡに相補的な特異的基質結合部位を含んでなることは当
業者には理解されるだろう。そのようなリボザイムはその分子にＲＮＡ切断活性
を付与する酵素部分も含む。酵素部分は基質結合部位の内部またはその周囲に存
在する。

【００６６】ｄ）選択可能マーカー本発明の一定の態様では、本発明の治療用ベクターが、その発現コンストラク
トにマーカーを含めることにより、その発現をインビトロまたはインビボで同定
しうる核酸コンストラクトを含有する。そのようなマーカーは細胞に同定可能な
変化を付与して、その発現コンストラクトを含有する細胞の同定を容易にする。
通常、薬物選択マーカーの包含は形質転換体のクローニングと選択を助ける。例
えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ
、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マ
ーカーである。また、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵
素も使用できる。免疫学的マーカーも使用できる。使用する選択可能マーカーは
、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されうる限り、重要でないと
考えられる。選択可能マーカーのさらなる例は当業者にはよく知られており、Ｅ
ＧＦＰ、β−ｇａｌ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）などのリポーターが含まれる。

【００６７】ｅ）多重遺伝子コンストラクトとＩＲＥＳ本発明の一定の態様では、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）配列の使用に
より、多重遺伝子（またはポリシストロン性）メッセージを作成する。ＩＲＥＳ
配列は５'メチル化Ｃａｐ依存的翻訳のリボゾームスキャニングモデルを迂回して、内部の部位で翻訳を開始できる。哺乳類メッセージ由来のＩＲＥＳの他に、
ピカノウイルス（ｐｉｃａｎｏｖｉｒｕｓ）ファミリーの２つのメンバー（ポリ
オと脳心筋炎）に由来するＩＲＥＳ配列が記述されている（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ
およびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０−３２５，１９８８
）。ＩＲＥＳ配列は異種オープンリーディングフレームに連結できる。複数のオ
ープンリーディングフレームは一緒に転写され、それぞれがＩＲＥＳによって隔
てられて、ポリシストロン性メッセージを生成しうる。ＩＲＥＳ配列のおかげで
、各オープンリーディングフレームはリボゾームに接近できて効率よく翻訳され
る。このように多重遺伝子は、単一のメッセージを転写するために単一のプロモ
ーター／エンハンサーを使用して、効率よく発現されうる。

【００６８】任意の異種オープンリーディングフレームをＩＲＥＳ配列に連結できる。これ
には分泌タンパク質、独立した遺伝子によってコードされる多サブユニットタン
パク質、細胞内または膜結合型タンパク質および選択マーカーの遺伝子が含まれ
る。

【００６９】ｆ）制御領域本発現コンストラクトが治療用遺伝子をコードする転写物の発現に影響を及ぼ
しうるように、その治療用遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、プロモータ
ーとポリアデニル化シグナルの転写制御下に置かれる。「プロモーター」とは、
その宿主細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識される、遺伝子
の特異的転写を開始するのに必要なＤＮＡ配列を指す。ポリアデニル化シグナル
とは、その宿主細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識される、
翻訳のために適切なプロセッシングとその転写物の核から細胞質への輸送を起こ
すための一連のヌクレオチドのｍＲＮＡ転写物の末端への付加を指示するのに必
要なＤＮＡ配列を指す。「転写制御下」という表現は、そのプロモーターがその
ポリヌクレオチドと正しい位置関係にあってＲＮＡポリメラーゼの開始とそのポ
リヌクレオチドの発現を制御することを意味する。

【００７０】プロモーターという用語は、ここではＲＮＡポリメラーゼＩＩ用の開始部位の
付近に集まっている一群の転写制御モジュールを指す。プロモーターがどうのよ
うにして組織化されるかに関する考察の大半は、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ
）とＳＶ４０初期転写単位のプロモーターを含む数種類のウイルスプロモーター
の分析に由来している。より最近の研究によって強化されたこれらの研究は、プ
ロモーターがそれぞれ約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり転写活性化または抑制タ
ンパク質の認識部位を一つまたはそれ以上含有する不連続な機能的モジュールか
ら構成されることを明らかにしている。

【００７１】各プロモーター中の少なくとも一つのモジュールは、ＲＮＡ合成の開始部位を
位置付ける機能を果たす。これの最もよく知られている例はＴＡＴＡボックスで
あるが、哺乳類デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモータ
ーやＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつか
のプロモーターでは、開始位置に重なった分離した配列自体が開始部位の位置を
固定するのを助ける。

【００７２】その他のプロモーター配列は転写開始の頻度を調節する。いくつかのプロモー
ターは開始部位の下流にも機能的配列を含有することが最近になって明らかにさ
れているが、一般的には、それらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位
置する。プロモーター配列間の間隔はしばしば融通が利くので、各配列を逆にし
たり互いを相対的に動かしても、プロモーター機能は保存される。ｔｋプロモー
ターでは、プロモーター配列間の間隔を増やしても５０ｂｐの隔たりまでは、活
性の低下が始まらない。プロモーターによって、個々の配列は協調してまたは独
立して機能することにより、転写を活性化できるようである。

【００７３】ヒト細胞を標的にする場合は、ヒト細胞で発現し得るプロモーターに隣接して
その制御下にポリヌクレオチドコード領域を置くことが好ましい。一般的に言う
と、そのようなプロモーターにはヒトまたはウイルスプロモーターが含まれるだ
ろう。プロモーターの一覧を表１に示す。

【表１】プロモーター免疫グロブリン重鎖免疫グロブリン軽鎖Ｔ細胞レセプターＨＬＡＤＱαおよびＤＱβ β−インターフェロンインターロイキン２インターロイキン２レセプターＭＨＣクラスＩＩ５ＭＨＣクラスＩＩＨＬＡ−ＤＲα β−アクチン筋クレアチンキナーゼプレアルブミン（トランスチレティン）エラスターゼＩメタロチオネインコラゲナーゼアルブミン遺伝子 α−フェタプロテイン（ｆｅｔａｐｒｏｔｅｉｎ） τ−グロビン β−グロビンｃ−ｆｏｓｃ−ＨＡ−ｒａｓインスリン神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ） α₁−アンチトリプシンＨ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストンマウスまたはＩ型コラーゲングルコース調節タンパク質（ＧＲＰ９４とＧＲＰ７８）ラット成長ホルモンヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）トロポニンＩ（ＴＮＩ）血小板由来成長因子デュシェンヌ型筋ジストロフィＳＶ４０ポリオーマレトロウイルスパピローマウイルスＢ型肝炎ウイルスヒト免疫不全ウイルスサイトメガロウイルステナガザル白血病ウイルス

【００７４】治療用遺伝子の発現を制御するために使用される個々のプロモーターは、それ
が誘導性プロモーターに連結された遺伝子産物によって活性化されうる限り、決
定的な問題ではないと考えられる。本発明の好ましい態様では、トランス活性化
タンパク質がｔａｔであり、治療用遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター
がＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ＬＴＲである。例えば、ＡＰ−１部位を含有す
るプロモーター配列はｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓタンパク質の誘導発現に応答
するだろう。その他の好適なトランス活性化因子／プロモーターの組み合わせは
当業者にはわかるだろう。

【００７５】トランス活性化因子をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターは誘導
性プロモーターでなければならない。誘導性プロモーターは、誘導物質の存在下
以外では不活性であるか比較的低い活性を示すプロモーターである。本発明の一
部として含まれうるプロモーターの例としては、ＭＴＩＩ、ＭＭＴＶ、コラゲ
ナーゼ、ストロメライシン、ＳＶ４０、マウスＭＸ遺伝子、α−２−マクログロ
ブリン、ＭＨＣクラスＩ遺伝子ｈ−２ｋｂ、プロリフェリン、腫瘍壊死因子、甲
状腺刺激ホルモンα遺伝子などが挙げられるが、これらに限るわけではない。こ
れらのプロモーター配列に関連する誘導因子を表２に示す。Ｅｇｒ−１プロモー
ターと多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）プロモーターも誘導性プロモーターの選択肢
である。好ましい態様では、誘導性プロモーターが熱ショック誘導性であって、
次に挙げるプロモーターの一つに由来する：ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ６
０、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ７３、ＨＳＰ２５、ユビキチンおよびＨＳ
Ｐ２８．もう一つの好ましい態様では、誘導性プロモーターが低酸素応答配列（
例えばＨＩＦ−１に応答するものなど）を含んでなる。本発明の実施には任意の
誘導性プロモーターを使用でき、そのようなプロモーターはすべてここに請求す
る発明の精神と範囲に包含されると解される。

【表２】配列誘導因子ＭＴＩＩホルボールエステル（ＴＰＡ）重金属ＭＭＴＶ（マウス乳がんウイルス）グルココルチコイド β−インターフェロンポリ（ｒＩ）Ｘポリ（ｒｃ）アデノウイルス５Ｅ２Ｅ１ａｃ−ｊｕｎホルボールエステル（ＴＰＡ），Ｈ₂Ｏ₂ コラゲナーゼホルボールエステル（ＴＰＡ）ストロメライシンホルボールエステル（ＴＰＡ），ＩＬ−１ＳＶ４０ホルボールエステル（ＴＰＡ）マウスＭＸ遺伝子インターフェロン，ニューカッスル病ウイルスＧＲＰ７８遺伝子Ａ２３１８７ α−２マクログロブリンＩＬ−６ビメンチン血清ＭＨＣクラスＩ遺伝子Ｈ−２ｋＢインターフェロンＨＳＰ７０Ｅ１ａ，ＳＶ４０ラージＴ抗原プロリフェリンホルボールエステル−ＴＰａ腫瘍壊死因子ＦＭＡ甲状腺刺激ホルモンα遺伝子甲状腺ホルモン

【００７６】とりわけ好ましい態様では、ｔａｔタンパク質がトランス活性化因子として使
用される。ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のゲノムはサル免疫不全ウイルスと多くの類
似性を有し、それらは詳細に研究されている。全てのレトロウイルスに共通する
ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ遺伝子に加えて、ＨＩＶ転写に重要ないくつかの調節遺
伝子があることが発見された。ウイルスｔａｔタンパク質はそのような調節因子
の一つであり、これはＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２プロモーターの活性を著しく
増加させるというその能力を特徴とする（Ｓｏｄｒｏｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．５５（３）：８３１−８３５，１９８５ａ；Ｓｏｄｒｏｓｋｉら，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２２９（４７０８）：７４−７７，１９８５ｂ；Ｓｏｄｏｒｏｓｋｉら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８（４７０６）：１４３０−１４３４；Ｓｏｄｒｏｓｋｉ
ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８（４７０６）：１４３０−１４３４，１９８５ｃ；
Ｓｏｒｏｓｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７（４６８３）：１７１−１７３，１
９８５ｄ；これらはすべて参考文献として本明細書の一部を構成する）。ｔａｔ
はＨＩＶＬＴＲ中のトランス活性化応答配列（ＴＡＲ）と結合し、ＨＩＶ特異
的ＲＮＡの定常状態レベルを増加させると考えられる。またｔａｔは、それが数
種類のトランス活性化因子タンパク質と相互作用できるという点で、むしろ伝統
的な転写因子のように作用できることを示唆する証拠もある。ｔａｔとアデノウ
イルストランス活性化因子ＥＩＡは相乗的に作用して定常状態ＲＮＡのレベルを
増加させる（Ｌａｓｐｉａら，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，４（１２Ｂ）：２３９７
−２４０８，１９９０；参考文献として本明細書の一部を構成する）。したがっ
て、ＨＩＶ−ＬＴＲ／ＴＡＴコンストラクトの活性をさらに増加させる一法は、
同じコンストラクトにＥ１Ａを組み込むことである。

【００７７】ｃＤＮＡインサートを使用する場合は、通例、遺伝子転写物の適切なポリアデ
ニル化を達成するためにポリアデニル化シグナルを含めることが望まれるだろう
。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功にとって決定的な問題
ではないと考えられ、そのような配列はいずれも使用できる。ＳＶ４０、ウシ成
長ホルモン、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子から得られるような
ポリアデニル化シグナルは、多くの標的細胞で十分に機能することが見出されて
いる。

【００７８】５．遺伝子導入の方法細胞内で導入遺伝子の発現を達成するために、まず、細胞に本発明の治療用発
現コンストラクトを導入または移入する必要がある。そのような移入には、遺伝
子導入のウイルスまたは非ウイルス法を使用できる。この項では、遺伝子導入の
方法と組成物について述べる。

【００７９】Ａ．非ウイルス型移入好ましい態様では、本発明の治療用コンストラクト、例えば様々な遺伝子（す
なわちＤＮＡ）コンストラクトが、細胞中に送達されなければならない。一定の
好ましい状況では、細胞への発現コンストラクトの導入が非ウイルス型手段によ
って媒介される。

【００８０】本発明では、培養哺乳類細胞への発現コンストラクトの移入に、いくつかの非
ウイルス法が予期される。それらには、リン酸カルシウム沈殿法（Ｇｒａｈａｍ
およびＶａｎＤｅｒＥｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７，１９
７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：２
７４５−２７５２，１９８７；Ｒｉｐｐｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
１０：６８９−６９５，１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｇｏｐａｌ，
Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０，１９８５）、エレク
トロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，６
：７１６−７１８，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５，１９８４）、直接微量注入（Ｈ
ａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１０１
：１０８４−１０９９，１９８５）、ＤＮＡ添加リポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕお
よびＳｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−
１９０，１９８２；Ｆｒａｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２，１９７９）、細胞超音波処理（Ｆｅｃｈｈ
ｅｉｍｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：８４６
３−８４６７，１９８７）、高速微粒子を用いる遺伝子射撃法（Ｙａｎｇら，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：９５６８−９５７２，１
９９０）およびレセプター媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２，１９８７；ＷｕおよびＷｕ
，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：８８７−８９２，１９８８）が含まれる（
この段落で引用した論文は参考文献として本明細書の一部を構成する）。

【００８１】コンストラクトが細胞に送達されると、治療用遺伝子をコードする核酸は異な
る部位に配置されて、そこで発現されうる。一定の態様では、治療用遺伝子をコ
ードする核酸が細胞のゲノムに安定に組み込まれうる。この組み込みは相同組換
えによるコグネイトな位置と向きをとる（遺伝子置換）か、ランダムで非特異的
な位置に組み込まれうる（遺伝子増強）。さらなる態様では、核酸が独立したエ
ピソーム型ＤＮＡ断片として細胞中に安定に維持されうる。そのような核酸断片
または「エピソーム」は、宿主細胞周期とは独立した、または宿主細胞周期と同
期した、維持と複製を許すのに足りる配列をコードする。発現コンストラクトが
どのようにして細胞に送達され、その細胞内のどこにその核酸がとどまるかは、
使用する発現コンストラクトのタイプに依存する。

【００８２】本発明の具体的一態様として、発現コンストラクトをリポソームに封入しても
よい。リポソームはリン脂質二重層膜と内部の水性媒質を特徴とする小胞構造で
ある。多重層リポソームは水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を持つ。リ
ン脂質を過剰の水溶液に懸濁すると、それらは自発的に形成する。脂質成分は閉
じた構造の形成に先立って自己再配列を起こし、水と溶解した溶質とを脂質二重
層の間に封入する。陽イオンリポソームへのＤＮＡの添加はリポソームから光学
的に複屈折性を示す液晶凝集小球へのトポロジー遷移を起こす。これらのＤＮＡ
−脂質複合体は遺伝子治療用の非ウイルスベクターになりうる。

【００８３】リポソームによる核酸送達とインビトロでの外来ＤＮＡの発現はとてもうまく
いっている。Ｗｏｎｇら（Ｇｅｎｅ，１０：８７−９４，１９８０）は、β−ラ
クタマーゼ遺伝子を用いて、培養ヒヨコ胚、ＨｅＬａおよび肝癌細胞でのリポソ
ームによる送達と外来ＤＮＡの発現の可能性を実証した。Ｎｉｃｏｌａｕら（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓＥＮｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６，１９８７；参考文
献として本明細書の一部を構成）は、ラットで静脈内注射によるリポソームを媒
介とした遺伝子導入を成功させた。また「リポフェクション」法を含めて様々な
市販の方法も含まれる。

【００８４】本発明の一定の態様では、リポソームをセンダイウイルス（ＨＶＪ）と複合体
化させうる。これは細胞膜との融合を容易にし、リポソームに封入されたＤＮＡ
の細胞進入を促進することが明らかにされている。別の態様では、リポソームを
核非ヒストンタンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体化させるか、ＨＭＧ−１と一緒
に使用しうる。さらなる態様として、リポソームをＨＶＪとＨＭＧ−１の両方と
複合体化させるか、その両方と一緒に使用してもよい。このような発現コンスト
ラクトはインビトロとインビボで核酸の移入と発現に成功裏に使用されているの
で、これらは本発明にも適用できる。

【００８５】治療用遺伝子をコードする核酸を細胞に送達するために使用できる他のベクタ
ー送達系は、レセプター媒介性の送達媒体である。これらは、ほとんど全ての真
核細胞で、レセプター依存性エンドサイトーシスによって高分子が選択的に取り
込まれることを利用するものである。様々なレセプターが細胞タイプ特異的に分
布しているので、送達は高度に特異的でありうる（ＷｕおよびＷｕ，Ａｄｖ．Ｄ
ｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖ．，１２：１５９−１６７，１９９３）。

【００８６】レセプター媒介性の遺伝子ターゲティング媒体は一般的には２つの成分、細胞
レセプター特異リガンドとＤＮＡ結合剤からなる。レセプターを媒介とする遺伝
子導入にはいくつかのリガンドが使用されている。最も詳細に特徴づけられてい
るリガンドはアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２，１９８７）とトランスフェリ
ン（Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７（９）：３
４１０−３４１４，１９９０）である。最近、ＡＳＯＲと同じレセプターを認識
する合成ネオグリコプロテインが遺伝子送達媒体として使用されており（Ｆｅｒ
ｋｏｌら，ＦＡＳＥＢＪ．，７：１０８１−１０９１，１９９３；Ｐｅｒａｌ
ｅｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４０８６−４
０９０，１９９４）、また上皮成長因子（ＥＧＦ）も扁平上皮癌細胞に遺伝子を
送達するために使用されている（Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ０２７３０８５）。

【００８７】別の態様では、送達媒体がリガンドとリポソームからなりうる。例えばＮｉｃ
ｏｌａｕら（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｏｌ．，１４９：１５７−１７６，
１９８７）は、リポソームに組み込まれたラクトシルセラミド（ガラクトース末
端アシアロガングリオシド）を使用して、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り
込み量の増加を観察した。このように、リポソームを使った、または使わない、
かなり多くのレセプター−リガンド系によって、治療用遺伝子をコードする核酸
も、前立腺、上皮または腫瘍細胞などの細胞タイプに特異的に送達することが可
能である。例えば、ヒト前立腺特異抗原（Ｗａｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ、８３（２）：３１６６−３１７０，１９８６）は、前立腺組織
での核酸の送達を媒介するレセプターとして使用できる。

【００８８】本発明のもう一つの態様として、発現コンストラクトは単に裸の組換えＤＮＡ
またはプラスミドからなりうる。コンストラクトの移入は、細胞膜を物理的また
は化学的に細胞膜を透過性にする上述の方法のいずれかによって行いうる。これ
は特にインビトロでの移入に適用できるが、インビボでの使用にも同様に適用で
きる。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８１：７５２９−７５３３，１９８４）は、ＣａＰＯ₄沈殿物の形でポリオーマウイルスＤＮＡをマウス成体またはマウス新生仔の肝臓と脾臓にうまく注射して
、活発なウイルス複製と急性感染を実証した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙとＮｅｓｈ
ｉｆ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：９５５１−９５
５５，１９８６）も、ＣａＰＯ₄沈殿したプラスミドの直接腹腔内注射がトランスフェクトされた遺伝子の発現をもたらすことを実証した。ＣＡＭをコードする
ＤＮＡもインビボで同様の方法で移入してＣＡＭを発現させうると考えられる。

【００８９】裸のＤＮＡ発現コンストラクトを細胞に移入するための本発明のもう一つの態
様は粒子射撃法に関係する。この方法はＤＮＡをコーティングした微粒子を高速
度に加速して、それらが細胞膜を貫いて細胞を殺すことなく細胞に進入するよう
にできるということによっている（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０
−７３，１９８７；参考文献として本明細書の一部を構成する）。小さい粒子を
加速するための装置はいくつか開発されている。そのような装置の一つは、高電
圧放電によって電流を生成して、その電流を推進力とすることによっている（Ｙ
ａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：９５６８−
９５７２，１９９０）。使用された微粒子は、タングステンビーズや金ビーズな
どの生物学的に不活性な物質からなっている。

【００９０】Ｂ．ウイルスベクターを媒介とする移入遺伝子導入を達成するもう一つの方法は、例えば後述するような本発明のアデ
ノウイルスベクターでの形質転換による、感染性ウイルス粒子を送達媒体とする
ウイルス形質導入によるものである。また、レトロウイルスやウシパピローマウ
イルスも使用でき、これらはどちらも、対象遺伝子による宿主細胞の持続的形質
転換を可能にする。したがって、ある例では、治療上有意義な遺伝子を細胞に送
達するために細胞のウイルス感染が使用される。一般的には、単にウイルスを生
理学的条件下で適当な宿主細胞にさらして、ウイルスを取り込ませることになる
。アデノウイルスを例に挙げるが、この方法は、後述するように、他のウイルス
ベクターでも有利に行いうる。そのような方法は当技術分野の通常の技術を有す
るものにはよく知られている。

【００９１】ａ）アデノウイルスアデノウイルスは、その中サイズのＤＮＡゲノム、操作の容易さ、高い力価、
広い標的細胞域および高い感染性ゆえに、遺伝子導入ベクターとしての使用にと
りわけ適している。ほぼ３６ｋＢのウイルスゲノムが１００〜２００塩基対（ｂ
ｐ）の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれていて、その中にウイルスＤＮＡ
複製とパッケージングに必要なシス作用性配列が含まれている。異なる転写単位
を含有するそのゲノムの初期（Ｅ）領域と後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複
製の開始によって分割される。

【００９２】Ｅ１領域（Ｅ１ＡとＥ１Ｂ）はウイルスゲノムと数個の細胞性遺伝子の転写の
調節を担うタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡとＥ２Ｂ）の発現はウイ
ルスＤＮＡ複製用のタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質はＤＮＡ
複製、後期遺伝子発現および宿主細胞停止に関与する（Ｒｅｎａｎ，１９９０）
。ウイルスキャプシドタンパク質の大半を含む後期遺伝子群（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３
、Ｌ４およびＬ５）の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じる
単一の初期転写物がかなりのプロセッシングを受けて初めて発現される。ＭＬＰ
（１６．８地図単位の位置にある）は感染の後期に特に効率がよく、このプロモ
ーターから生じるｍＲＮＡはすべて、それらを翻訳にとって好ましいｍＲＮＡに
する５'三分節リーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅｌｅａｄｅｒ；ＴＬ）配列を有する。

【００９３】アデノウイルスを遺伝子治療用として最適化するには、大きいＤＮＡ断片を含
ませることができるように、運搬能を最大にする必要がある。また、一定のアデ
ノウイルス産物に付随する毒性と免疫反応を低下させることも極めて望ましい。
これら２つの目標は、アデノウイルス遺伝子の除去がどちらの目的にもかなうと
いう点で、ある程度、共通する部分がある。本発明の実施により、治療用コンス
トラクトを比較的容易に操作できるという性質は保ったまま、これらの目的の両
方を達成することが可能である。

【００９４】ウイルスＤＮＡ複製に必要なシス配列はすべて線状ウイルスゲノムの両端にあ
る逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）（１００〜２００ｂｐ）中に局在しているので
、大きなＤＮＡ置換が可能である。ＩＴＲを含有するプラスミドは非欠損アデノ
ウイルスの存在下に複製できる。したがってこれらの配列をアデノウイルスベク
ターに含むことによって複製が可能になるはずである。

【００９５】また、ウイルスを封入するためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノム
の左端にある１９４〜３８５ｂｐ（０．５〜１．１地図単位）の間に局在する。
このシグナルは、バクテリオファージラムダＤＮＡ中のタンパク質認識部位（こ
の場合、左端近くにあるが付着端配列の外側にある特異配列が頭部構造へのＤＮ
Ａの挿入に必要なタンパク質への結合を媒介する）によく似ている。ＡｄのＥ１
置換ベクターにより、ウイルスゲノムの左端にある４５０ｂｐ（０〜１．２５地
図単位）断片が２９３細胞でのパッケージングを指図できることが実証されてい
る。

【００９６】アデノウイルスゲノムの一定の領域を哺乳類細胞のゲノムに組み込み、それら
がコードしている遺伝子を発現させうることは、先に示されている。これらの細
胞株は、その細胞株によってコードされるアデノウイルス機能が欠損したアデノ
ウイルスベクターの複製を助けることができる。また、「援助（ｈｅｌｐｉｎｇ
）」ベクター、例えば野生型ウイルスまたは条件的欠損突然変異株などによる、
複製欠損アデノウイルスベクターの補完も報告されている。

【００９７】複製欠損アデノウイルスベクターはヘルパーウイルスによってトランスに補完
できる。しかし、複製機能を与えるのに必要なヘルパーウイルスの存在がどんな
調製物も汚染してしまうので、この観察だけでは複製欠損ベクターの単離は可能
にならない。そこで、複製欠損ベクターの複製および／またはパッケージングに
特異性を付加する追加の配列が必要だった。本発明が備えるようなその配列は、
アデノウイルスのパッケージング機能に由来する。

【００９８】アデノウイルスにとってのパッケージングシグナルは従来のアデノウイルス地
図の左端に存在することが明らかにされている。その後の研究により、ゲノムの
Ｅ１Ａ（１９４〜３５８ｂｐ）領域に欠失を持つ突然変異体は、初期（Ｅ１Ａ）
機能を補完した細胞株中でさえ不十分にしか生育しないことが示された。補償ア
デノウイルスＤＮＡ（０〜３５３ｂｐ）を突然変異体の右端に結合しなおすと、
そのウイルスは正常にパッケージングされた。さらなる突然変異分析により、短
い反復した位置依存的配列がＡｄ５ゲノムの左端に同定された。その反復配列は
、それがゲノムのどちらかの端に存在するのであれば、１コピーで効率のよいパ
ッケージングに足りるが、それをＡｄ５ＤＮＡ分子の内部に向けて移動させた
場合は、そうでないことが見出された。

【００９９】突然変異型のパッケージングシグナルを使用することにより、様々な効率でパ
ッケージングされるヘルパーウイルスを作成することが可能である。通例、それ
らの突然変異は点変異または欠失である。低効率パッケージングのヘルパーウイ
ルスをヘルパー細胞中で生育させると、ウイルスは野生型ウイルスと比較すると
低い割合ではあるもののパッケージングされて、ヘルパーの増殖を可能にする。
しかし、これらのヘルパーウイルスを野生型パッケージングシグナルを含むウイ
ルスと一緒に細胞中で生育すると、野生型パッケージングシグナルが突然変異型
よりも優先して認識される。制限量のパッケージング因子なら、ヘルパーと比較
して野生型シグナルを含有するウイルスが選択的にパッケージングされる。その
選択性が十分に大きいなら、ほぼ均一に近い株が得られるはずである。

【０１００】ｂ）レトロウイルスレトロウイルスは、逆転写の過程により感染細胞内でそのＲＮＡを二本鎖ＤＮ
Ａに変換する能力を特徴とする一群の一本鎖ＲＮＡウイルスである。次に、その
結果生じたＤＮＡは、細胞の染色体にプロウイルスとして安定に組み込まれ、ウ
イルスタンパク質の合成を指示する。組み込みの結果、ウイルス遺伝子配列は受
容細胞とその子孫に保持されることになる。レトロウイルスゲノムは、それぞれ
キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、エンベロープ成分をコードする３つ
の遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含有する。ｇａｇ配列の上流に見出さ
れるΨと呼ばれる配列は、ウイルス粒子へのゲノムのパッケージングのシグナル
として機能する。２つの末端反復（ＬＴＲ）配列がウイルスゲノムの５'末端と３'末端に存在する。これらは強力なプロモーター配列とエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組込みにも必要である。

【０１０１】レトロウイルスベクターを構築するために、一定のウイルス配列に代えて、プ
ロモーターをコードする核酸をウイルスゲノムに挿入して、複製欠損性のウイル
スを作成する。ウイルス粒子を産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺
伝子を含有するがＬＴＲ成分とΨ成分を含有しないパッケージング細胞株を構築
する。レトロウイルスＬＴＲ配列とΨ配列と共にヒトｃＤＮＡを含有する組換え
プラスミドをこの細胞株に（例えばリン酸カルシウム沈殿法によって）導入する
と、そのΨ配列によって組換えプラスミドのＲＮＡ転写物のウイルス粒子へのパ
ッケージングが可能になり、次いでそれらのウイルス粒子が培養培地に分泌され
る。組換えレトロウイルスを含有する培地を集め、随意に濃縮して、遺伝子導入
に使用する。レトロウイルスベクターは多種多様な細胞タイプに感染できる。し
かし、多くのタイプのレトロウイルスの組み込みと安定な発現には、宿主細胞の
分裂が必要である。

【０１０２】最近、レトロウイルスベクターの特異的ターゲティングが可能なように設計さ
れた方法が、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレ
トロウイルスの化学修飾に基づいて開発された。この修飾によりアシアログリコ
プロテインレセプターを介した肝細胞などの細胞の特異的感染が可能になりうる
が、これは望ましいはずである。

【０１０３】レトロウイルスエンベロープタンパク質と特定の細胞レセプターに対するビオ
チニル化抗体を使用するもう一つの組換えレトロウイスのターゲティング法が設
計された。これらの抗体はストレプトアミジンを使ってビオチン成分を介して連
結された（Ｒｏｕｘら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６
：９０７９−９０８３，１９８９）。主要組織適合複合体クラスＩおよびクラス
ＩＩ抗原に対する抗体を使って、それらの表面抗原を有する種々のヒト細胞の感
染が、インビトロで、エコトロピックウイルスで実証された。

【０１０４】ｃ）アデノ関連ウイルスＡＡＶは約４７００塩基対の線状一本鎖ＤＮＡを使用する。逆方向末端反復配
列がゲノムの両側にある。ゲノム内に２つの遺伝子が存在して、いくつかの別個
の遺伝子産物をもたらす。第一のｃａｐ遺伝子は、３つの異なるビリオンタンパ
ク質（ＶＰ）（ＶＰ−１、ＶＰ−２、ＶＰ−３と呼ばれる）を産生する。第二の
ｒｅｐ遺伝子は４つの非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。これらｒｅｐ遺
伝子産物の一つまたはそれ以上がＡＡＶ転写のトランス活性化を担っている。

【０１０５】ＡＡＶ中の３つのプロモーターはそのゲノムでの（地図単位で表した）それら
の位置によって名付けられる。これらは左から右にｐ５、ｐ１９およびｐ４０で
ある。転写によって６つの転写物が生成し、３つのプロモーターのそれぞれで２
つが開始されて、それぞれのペアの一つがスプライスされる。地図単位４２〜４
６に由来するスプライス部位は各転写物で同じである。４つの非構造タンパク質
はより長い転写物から派生するようであり、３つのビリオンタンパク質はすべて
最小の転写物から生じる。

【０１０６】ＡＡＶはヒトのどんな病的状態とも関係しない。興味深いことに、効率のよい
複製に、ＡＡＶは単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウイルス、
仮性狂犬病ウイルス、そしてもちろんアデノウイルスなどのウイルスからの「援
助（ｈｅｌｐｉｎｇ）」機能を必要とする。これらヘルパーのうち最もよく特徴
づけられているものはアデノウイルスであり、このウイルスに関する多くの「初
期」機能はＡＡＶ複製を助けることが示されている。ＡＡＶｒｅｐタンパク質
の低レベルな発現がＡＡＶ構造の発現を阻止していると考えられ、ヘルパーウイ
ルス感染がこの遮断を取り除くのだと思われる。

【０１０７】ＡＡＶベクターの末端反復配列はＡＡＶまたは修飾ＡＡＶゲノムを含有するｐ
２０１（Ｓａｒｎｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６１（１０）：３０９６−３
１０１，１９８７；参考文献として本明細書の一部を構成する）などのプラスミ
ドの制限エンドヌクレアーゼ消化によって、あるいは当業者に知られている他の
方法、例えばＡＡＶの公表された配列に基づく末端反復配列の化学的または酵素
的合成（ただしこれに限るわけではない）などによって得ることができる。通常
の当業者は、欠失分析などの周知の方法により、機能（すなわち安定で部位特異
的な組み込み）を可能とするのに必要なＡＡＶＩＴＲの最小の配列または部分
を決定できる。また通常の当業者は、その配列の軽微な修飾のいずれが、安定で
部位特異的な組み込みを指図するという末端反復配列の能力を保ったまま、許容
されうるかも決定できる。

【０１０８】ＡＡＶ系ベクターはインビトロでの遺伝子送達用媒体として安全で効果的であ
ることがわかっており、これらのベクターは、エクスビボとインビボの両方で、
有望な遺伝子治療における広範な応用のために、開発中であり、前臨床段階と臨
床段階で試験されている。

【０１０９】肺での、ＡＡＶを媒介とする効率のよい遺伝子の移入と発現は、嚢胞性線維症
の治療に関する臨床試験につながった（ＣａｒｔｅｒおよびＦｌｏｔｔｅ，Ａｎ
ｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０：７９−９０，１９９５；Ｆｌｏｔｔ
ｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０６１３−１
０６１７，１９９３）。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のＡＶＶ媒介
遺伝子送達による筋ジストロフィーの治療、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺
伝子送達によるパーキンソン病の治療、肝臓への第ＩＸ因子遺伝子送達による血
友病Ｂの治療、そしてもしかすると心臓への血管内増殖因子遺伝子による心筋梗
塞の治療の見込みは、これらの器官におけるＡＡＶ媒介性の導入遺伝子発現が極
めて効率的であることが最近明らかにされているので、有望であると思われる（
Ｆｉｓｃｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，７０：５２０−５３２，１９９６；Ｆｌｏ
ｔｔｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０６１３
−１０６１７，１９９３；Ｋａｐｌｉｔｔら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，８：１４
８−１５３，１９９４；Ｋａｐｌｉｔｔら，ＡｒｍＴｈｏｒｄ．Ｓｕｒｇ．，
６２：１６６９−１６７６，１９９６；Ｋｏｅｂｅｒｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１４２６−１４３１，１９９７；ＭｃＣｏ
ｗｎら，ＢｒａｉｎＲｅｓ．，７１３：９９−１０７，１９９６；Ｐｉｎｇら
，Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，３：２２５−２２８，１９９６；Ｘｉａ
ｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８０９８−８１０８，１９９６）。

【０１１０】ｄ）他のウイルスベクター他のウイルスベクターも本発明の発現コンストラクトとして使用できる。ワク
シニアアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａｓｒｕｖｅｙｏ
ｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉ
ｒｕｓｅｓ（ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＲＬ，ＤｅｎｈａｒｄｔＤＴ編，ストー
ンハム，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ社，１９８８）の４６７−４９２頁；Ｂａｉｃ
ｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ（Ｋｕｃｈｅｒｌａ
ｐａｔｉＲ編，ニューヨーク，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ社，１９８６）の１
１７−１４８頁；Ｃｏｕｐａｒら，Ｇｅｎｅ，６８：１−１０，１９８８）、カ
ナリア痘瘡ウイルス、レンチウイルスなどのウイルスに由来するベクターを使用
できる。

【０１１１】６．細胞標的本発明の方法とベクターは、哺乳動物内の多種多様な細胞、器官および組織を
標的とするのに使用できる。

【０１１２】いくつかの態様では、ここに記載する発現コンストラクトが癌の処置に使用さ
れる。標的とする細胞は腫瘍細胞、腫瘍内の細胞、または腫瘍近くの細胞のいず
れでもよい。腫瘍は随意に脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、膀胱、リンパ節、小腸、
膵臓、結腸、胃、胸部、子宮内膜、前立腺、精巣、外陰、子宮頸、卵巣、皮膚、
頭頚部、食道、骨髄または血液にあってよい。通常の当業者は与えられた腫瘍タ
イプで発現させるべき適切な治療用遺伝子を容易に認識するだろう。

【０１１３】これに代わる態様では、癌以外の医学的状態が治療される。例えば、本発明は
著しく効果的なタンパク質代償療法に備えている。そのような場合、特定のタイ
プの細胞、組織または器官を、その対象内で発現不足であるタンパク質の発現の
標的にでき、そのタンパク質の活性がその特定の細胞タイプ、組織または器官に
限定される場合はとりわけそうである。ここでも通常の当業者はどの細胞が最も
適当な標的になるかを認識できるだろう。

【０１１４】発現コンストラクトは対象細胞にインビトロ、エクスビボまたはインビボ法で
導入できる。単離された細胞のトランスフェクションまたは形質導入の方がしば
しば効果的なので、ほとんどの遺伝子治療は現在、エクスビボで行なわれている
。導入方法の選択は標的とされる細胞タイプ、組織または器官ならびに選択した
その送達媒体に依存するだろう。通常の当業者はそのような選択を容易にこなし
うる。

【０１１５】本発明の発現コンストラクトは活性になるのに誘導が必要なので、多くの場合
、本発現コンストラクトは、対象の身体のうち、発現を望む細胞、組織または器
官ちょうどそのものよりも広い部分に送達してもよい。次に、移入された発現コ
ンストラクトの発現を誘導する活性化条件への対象のばく露を制限することによ
って、発現の特異性を達成できる。多くの場合、それが好ましい。例えば、放射
線療法への対象のばく露は、必要な領域だけに限定することが好ましい。高温の
適用も一般的にはその範囲に限定されるだろう。他の態様では、活性化条件が標
的とした細胞そのものに固有の条件でありうる。例えば、発現コンストラクトが
低酸素応答配列を含有する誘導性プロモーターを有する場合は、腫瘍の低酸素環
境が発現を誘発するだろう。そのような場合、その結果生じる発現は、必然的に
、たとえ発現コンストラクトの送達がそうでなくとも、極めて局在化するだろう
。

【０１１６】７．併用療法本発明の発現コンストラクトは、１またはそれ以上の伝統的臨床治療法と有利
に組み合わせうる。現行の癌研究の一つの目標は、化学療法と放射線療法の有効
性を向上させる方法を発見することである。一つの方法は、そのような伝統的治
療法を遺伝子治療と組み合わせることによる。例えば単純ヘルペスチミジンキナ
ーゼ（ＨＳ−ｔｋ）遺伝子は、レトロウイルスベクター系で脳腫瘍に送達される
と、抗ウイルス剤ガンシクロビルへの感受性をうまく誘導する。しかし、伝統的
癌療法と組み合わせた遺伝子治療の効果的な使用は、遺伝子がいったん標的細胞
に移入されたら、その遺伝子の臨床的に有意な発現が必要なことによって妨げら
れてきた。

【０１１７】本発明の方法と組成物を用いて細胞を殺し、細胞増殖を抑制し、転移を抑制し
、腫瘍サイズを減少させ、腫瘍細胞の悪性表現型をその他の方法で覆し、または
低下させるには、一般的には、本発明の発現コンストラクトを「標的」細胞に導
入し、高温または誘導性プロモーターを活性化する他の条件の適用によって発現
が誘導されるだろう。この遺伝子治療は癌の処置に有効な他の薬剤を含んでなる
組成物と併用できる。これらの組成物は、細胞を殺すか、その増殖を抑制するの
に有効な総量で与えられるだろう。この過程は、発現コンストラクトと薬剤また
は因子とを、その細胞に同時に導入することを伴いうる。これは、その細胞を、
両方の薬剤を含む単一の組成物または医薬製剤と接触させるか、その細胞を２つ
の別個の組成物または製剤（ここに一方の組成物は発現コンストラクトを含み、
他方はその薬剤を含む）に同時にばく露することによって達成できる。

【０１１８】あるいは、遺伝子治療／高温処置を他の薬剤処置に先立って、またはその後に
、数分から数週間の範囲の間隔で行なってもよい。他の薬剤と発現コンストラク
トとが細胞に個別に適用される態様では、一般的には、薬剤と発現コンストラク
トが細胞に対して依然として有利な併用効果を発揮できるように、各送達時の間
に有意な期間が経過していないことが保証されるだろう。そのような場合は、互
いに約１２〜２４時間以内、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に細胞を
両方のモダリティーと接触させるだろうと予想され、約１２時間だけの遅延時間
が最も好ましい。場合によって、処置期間をかなり延ばすことが望ましい場合が
あり、その場合は各投与の間に数日（２、３、４、５、６または７日）ないし数
週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）が経過する。

【０１１９】発現コンストラクトまたは他の薬剤の２回以上の投与が望ましいことも考えら
れる。発現コンストラクトを「Ａ」とし、他の薬剤を「Ｂ」として以下に例示す
るように、様々な組み合わせを使用できる。Ａ／Ｂ／ＡＢ／Ａ／ＢＢ／Ｂ／ＡＡ／Ａ／ＢＢ／Ａ／ＡＡ
／Ｂ／ＢＢ／Ｂ／Ｂ／ＡＢ／Ｂ／Ａ／ＢＡ／Ａ／Ｂ／ＢＡ／Ｂ
／Ａ／ＢＡ／Ｂ／Ｂ／ＡＢ／Ｂ／Ａ／ＡＢ／Ａ／Ｂ／ＡＢ／Ａ
／Ａ／ＢＢ／Ｂ／Ｂ／ＡＡ／Ａ／Ａ／ＢＢ／Ａ／Ａ／ＡＡ／Ｂ
／Ａ／ＡＡ／Ａ／Ｂ／ＡＡ／Ｂ／Ｂ／ＢＢ／Ａ／Ｂ／ＢＢ／Ｂ
／Ａ／Ｂ他の組み合わせも考えられる。ここでも、細胞を殺すために、両方の薬剤を細胞
を殺すのに有効な総量で細胞に送達する。

【０１２０】併用療法での使用に適した薬剤または因子は、細胞に適用した時にＤＮＡ損傷
を誘発する任意の化学化合物もしくは処置方法である。そのような薬剤と因子に
は、ＤＮＡ損傷を誘発する放射線と電磁波、例えばγ照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マ
イクロ波、電子発光などが含まれる。

【０１２１】本発明の一態様では、遺伝子治療と併用される放射線療法が外部ビーム放射線
を構成する。外部ビーム放射線処置は通例、高エネルギーｘ線ビームなどの高エ
ネルギー放射線を与える。

【０１２２】あるいは、内部放射または密封小線源療法を遺伝子治療と併用してもよい。密
封小線源療法を施す方法には、照射線源の洞内または組織間腔への設置、コロイ
ド溶液の点滴注入、腸管外または経口投与がある。密封線源は金属、線材、管、
針などに封入される。非密閉放射活性源は懸濁液または溶液中に調製される。

【０１２３】封入された放射活性元素は体腔に設置されるか、適当なアプリケーターで組織
に直接挿入される。アプリケーターは通常、体腔または組織内に外科的に、もし
くは蛍光透視法を使って設置される。通常、プラスチックまたは金属製の管であ
るアプリケーターは、それを所定の位置に保持するために、腫瘍の中またはその
近くに縫合しうる。その後、アプリケーターに放射活性同位体が設置される（「
後充填法」）。放射性インプラントは舌、唇、胸部、膣、子宮頸、子宮内膜、直
腸、膀胱および脳の癌の処置に使用される。封入された線源は永続的インプラン
トとして患者内に放置してもよい。放射活性物質の小さいビーズの「接種（ｓｅ
ｅｄｉｎｇ）」は、限局性前立腺癌と限局性であるが手術が不可能な肺がんの処
置に使用される方法である。

【０１２４】「化学療法剤」とも呼ばれる様々な化学化合物はＤＮＡ損傷を誘発するように
機能し、それらはすべてここに開示する併用処置法に有用であると考えられる。
有用であると予想される化学療法剤には、例えばアドリアマイシン、５−フルオ
ロウラシル（５ＦＵ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、カンプトセシン、アクチノ
マイシンＤ，マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、さらには過酸化水
素などが含まれる。本発明は、放射線に基づくものか現実の化合物であるかを問
わず１つまたはそれ以上のＤＮＡ損傷剤の併用、例えばＸ線とシスプラチンの併
用や、シスプラチンとエトポシドの併用なども包含する。

【０１２５】例えば、本発明に従って癌を処置する場合は、腫瘍細胞を発現コンストラクト
の他にある薬剤とも接触させ、高温の適用によりその遺伝子発現が誘導されるだ
ろう。これは、高温を腫瘍部位に局所的に、またはその個体の全身に適用するこ
とによって達成しうる。この処置はＸ線、ＵＶ光、γ線、さらにはマイクロ波な
どの放射線による腫瘍の照射と併用できる。あるいは、アドリアマイシン、５−
フルオロウラシル、エトポシド、カンプトセシン、アクチノマイシンＤ，マイト
マイシンＣ、より好ましくはシスプラチンなどの化合物を含んでなる医薬組成物
の治療有効量をその対象に投与することによって、腫瘍細胞を薬剤と接触させて
もよい。薬剤は、それを上述のような治療用発現コンストラクトと組み合わせる
ことにより、併用治療用の組成物またはキットとして調製し、使用できる。

【０１２６】核酸、具体的にはＤＮＡを直接架橋する薬剤はＤＮＡ損傷を容易にして、本発
明の発現コンストラクトとの相乗的な抗新生物性の組み合わせにつながることが
予想される。シスプラチンのような薬剤と他のＤＮＡアルキル化剤を使用できる
。シスプラチンは経口的には吸収されないので、静脈内、皮下、腫瘍内または腹
腔内注射によって送達されなければならない。

【０１２７】ＤＮＡに損傷を与える薬剤には、ＤＮＡ複製、有糸分裂、染色体分離を妨害す
る化合物も含まれる。そのような化学療法化合物には、ドキソルビシンとも呼ば
れるアドリアマイシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシンなどがあ
る。これらの化合物は臨床的に新生物の処置に広く使用されていて、これらの化
合物はアドリアマイシンについては２１日間隔で２５〜７５ｍｇ／ｍ²の用量で静脈内にボーラス注射で、エトポシドについては１００ｍｇ／ｍ²までの用量で静脈内に、経口的には静脈内用量の二倍で投与される。

【０１２８】核酸前駆体とサブユニットの合成と忠実度を乱す薬剤もＤＮＡ損傷をもたらす
。いくつかの核酸前駆体が開発されている。広範な試験を受けていて容易に入手
できる薬剤はとりわけ有用である。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの薬
剤は、新生物組織によって優先的に使用されるので、この薬剤は新生物細胞への
ターゲティングにとりわけ有用である。毒性は極めて高いものの、５−ＦＵは広
範な担体に適用でき、局所投与も含むが、一般的には４５０〜１０００ｍｇ／ｍ ² ／日の用量で静脈内投与が使用される。

【０１２９】ＤＮＡ損傷を引き起こす他の因子で広く使用されてきたものには、γ線、Ｘ線
として一般に知られてきたものおよび／または腫瘍細胞への放射性同位体の指向
的送達がある。マイクロ波やＵＶ照射など他の形態のＤＮＡ損傷因子も予想され
る。これらの因子はすべて、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製と修復およ
び染色体の組立と維持に対する広範な損傷を与えるに違いない。Ｘ線に関する線
量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたる５０〜２００レントゲンの一日線量か
ら、２０００〜６０００レントゲンの単回線量までにわたる。放射性同位体の用
量範囲は多様で、その同位体の半減期、放射される放射線の強度とタイプ、新生
物細胞による取り込みに依存する。

【０１３０】当業者は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」の第１５版、第３３章、特に６２４〜６５２頁を参照されたい。処
置する対象の状態に依存して、用量には多少の変動が必然的に起こる。投与の責
任者は、いずれにせよ、個々の対象について適当な用量を決定することになる。
さらに、ヒトへの投与については、製剤がＦＤＡ生物製剤局（ＦＤＡＯｆｆｉ
ｃｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）規格によって要求される滅菌性、発熱原性、
総括安全性および純度の基準を満たすべきである。

【０１３１】本発明の治療用発現コンストラクトの癌患者への局所送達は、処置される臨床
的疾患を抑制するために治療有効遺伝子を送達する好ましい方法である。同様に
、化学療法または放射線療法は、その対象の身体の特定の患部領域に向けること
ができる。あるいは、一定の状況、例えば広範な転移が起こっている場合などで
は、発現コンストラクトおよび／または薬剤の全身送達が適当な場合もある。

【０１３２】遺伝子治療と化学療法または放射線療法の併用に加えて、複数の遺伝子治療の
併用も有利だと予想される。例えば、同時のｐ５３とｐ１６突然変異のターゲテ
ィングは向上した抗がん処置をもたらしうる。例えばｐ２、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣ
Ｃ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＢＲＣＡ２、ｐ１６、ＦＨＩＴ、ＷＴ−１、ＭＥＮ−
Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎ
ｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈ
ｓｔ、ｂｃｌおよびａｂｌなど、他の腫瘍関連遺伝子はいずれも、この方法でタ
ーゲティングできる。

【０１３３】８．医薬組成物と投与の経路本発明の治療用組成物はインビトロ、エクスビボまたはインビボで投与できる
と予想される。したがって、複合体を意図した応用に適した医薬組成物として調
製することが望ましいだろう。一般にこれには、基本的に発熱原とヒトまたは動
物にとって有害でありうる他の不純物を一切含まない医薬組成物を調製する必要
がある。また一般的には、複合体を安定にし複合体が標的細胞に取り込まれうる
ように、適当な塩類と緩衝剤を使用することが望まれるだろう。

【０１３４】本発明の組成物は、薬学上許容できる担体または水性媒質中に溶解もしくは分
散した、有効量の発現コンストラクトまたは発現コンストラクトを保持するウイ
ルスベクターもしくはリポソームを含んでなる。そのような組成物は接種物と呼
ぶこともできる。「薬学上または薬理学上許容できる」という表現は、動物また
はヒトに適宜投与したときに、副作用、アレルギー反応または他の有害反応をも
たらさない分子状の物質または組成物を指す。ここでいう「薬学上許容できる担
体」には、任意のすべての溶媒、分散媒質、被覆剤、抗菌および抗カビ剤、等張
性吸収遅延剤などがある。医薬活性物質のそのような媒体と薬剤の使用は当技術
分野では周知である。従来の媒体または薬剤が活性成分と配合禁忌である場合以
外は、治療用組成物におけるその使用が予想される。補助活性成分も本組成物に
組み込むことができる。

【０１３５】遊離塩基または薬理学上許容できる塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキ
シプロピルセルロースなどの界面活性剤と適当に混合した水中に調製できる。分
散液はグリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合物中と、油中
に調製できる。通常の貯蔵および使用条件では、これらの調製物は微生物の成長
を防止するために保存剤を含有する。

【０１３６】本発明の治療用組成物には、ヒトへの投与を含む医療用の古典的医薬製剤が含
まれうる。本発明の治療用組成物の投与は、標的組織または細胞がその経路で利
用できる限り、任意の一般的経路によるだろう。これには経口、経鼻、口腔内、
直腸、膣または局所経路が含まれる。あるいは、投与は同所性、皮内、皮下、筋
肉内、腹腔内または静脈内注射によるだろう。そのような組成物は通常、生理学
的に許容できる担体、緩衝剤または他の添加剤を含む医薬上許容できる組成物と
して投与されるだろう。腫瘍への適用には、直接腫瘍内注射、切除腫瘍床の注射
、局所的（例：リンパ）または全身投与が考えられる。患部（例えば腫瘍または
腫瘍部位）へのカテーテルを通して数時間または数日にわたる持続灌流を行なう
ことも望ましいかもしれない。

【０１３７】本発明の治療用組成物は注射用組成物の形で液体の溶液または懸濁液として有
利に投与され、また注射に先立って液体に溶解または懸濁するのに適した固形も
調製できる。これらの調製物は乳化してもよい。そのような目的のための典型的
組成物は薬学上許容できる担体を含む。例えばその組成物はリン酸緩衝食塩水１
ｍｌにつき約１００ｍｇのヒト血清アルブミンを含有しうる。他の薬学上許容で
きる担体には水溶液、非毒性添加剤があり、塩類、保存剤、緩衝液などを使用で
きる。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物
油、オレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には水、アル
コール／水溶液、食塩溶液、非経口用媒体、例えば塩化ナトリウム、リンゲルデ
キストロースなどがある。静脈内用媒体には水分および栄養補給剤がある。保存
剤には抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスが含まれる。本医薬
組成物の様々な成分のｐＨと正確な濃度は周知のパラメーターに従って調節され
る。

【０１３８】経口投与に適した他の製剤も考えられる。経口用製剤には、例えば製薬用のマ
ンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナ
トリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの典型的添加剤が含まれる。本組
成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の形をと
る。経路が局所である場合は、剤形がクリーム剤、軟膏、塗剤またはスプレー剤
でありうる。

【０１３９】治療剤の有効量は意図する目標、例えば（ｉ）腫瘍細胞増殖の抑制、（ｉｉ）
腫瘍細胞の除去または致死、もしくは（ｉｉｉ）治療用遺伝子を短期間または長
期間発現させるための遺伝子導入などに基づいて決定される。「単位用量」とい
う用語は、対象での使用に適した物理的に分離した単位であって、各単位がその
投与、すなわち適当な経路と処置法に伴って、望ましい応答をもたらすように計
算された治療用組成物の前もって決定された量を含有するものを指す。投与され
るべき量は、処置の回数と単位用量の両方に応じて、処置される対象、その対象
の状態および望まれる結果に依存する。本発明者らは複数の遺伝子治療法を予想
している。

【０１４０】ある態様では、治療用遺伝子をコードするベクターを使って癌患者を処置する
。癌の遺伝子治療に使用されるウイルスベクターの典型的な量は１０⁶〜１０¹⁵ ＰＦＵ／投与（例えば１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹、１０¹⁰、１０¹¹、１０¹²、
１０¹³、１０¹⁴または１０¹⁵）であり、その用量は充実性腫瘍内の異なる部位で
の数回の注射に分割される。治療法には、３〜１０週間にわたる遺伝子導入ベク
ターの数サイクルの投与も伴う。継続的な治療効果を得るには、数ヶ月から数年
の長期間にわたるベクターの投与が必要かもしれない。

【０１４１】本発明のもう一つの態様として、治療用遺伝子をコードするウイルスベクター
を使ってヒトまたは他の哺乳動物を予防接種できる。この予防接種の場合、一般
的には、導入遺伝子の長期間発現が達成され、宿主免疫反応が発達するように、
所望の効果を生むのに有効なウイルスの量がヒトまたは他の哺乳動物に投与され
るだろう。長期免疫反応を誘導するには、一連の注射、例えば初回注射とその後
２回の追加免疫注射で足りると予想される。典型的用量は所望する結果に応じて
１０⁶ないし１０¹⁵ＰＦＵ／注射になるだろう。低用量の抗原は一般に抗体媒介性免疫反応を誘発する。治療用組成物の正確な量は医師の判断にも依存し、個々
人に特有である。

【０１４２】

【実施例】

以下の実施例は本発明を説明することを意図するものであり、特許請求の範囲
を限定するよう解釈すべきではない。

【０１４３】実施例１熱ショックプロモーターはリポーター遺伝子の発現を誘導するベクターコンストラクト遺伝子発現を誘導するＨＳＰ７０プロモーターの能力を研究するため、最小熱
ショック（ＨＳ）プロモーターか、又は最小ＣＭＶプロモーターを、ネオマイシ
ン及びアンピシリン選択可能なマーカーを含むプラスミド中のリポーター遺伝子
の上流に挿入した。ＨＳＰ７０に由来するプロモーターに作動可能な位置で１つ
の多重クローニングサイトを含むプラスミド（Ｍ５）の基本的デザインを図１に
示す。Ｍ５は、ｐｃＤＮＡ３．０（Invitorogen, Inc.）中のＣＭＶプロモーターを、最小ＨＳＰ７０Ｂプロモーター（配列番号１、図１０）、StressGen,Inc.
から得たヒト熱ショックタンパク質７０Ｂ（ＨＳＰ７０Ｂ）プロモーターの０．４ｋＢ断片(HindIII-BamH1)で置換した。

【０１４４】最小ＨＳ及びＣＭＶプロモーターの活性を、プラスミドＳ８で、ヒトの癌細胞
、ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞、及びＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞をトランスフェクト
することにより測定した。図１のＭ５ベクター由来のＳ８プラスミドは、エンハ
ンスドグリーンフルオレセンスプロテイン（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子に作
動可能に連結した最小ＨＳＰ７０Ｂプロモーターを含む。Ｓ８は、ｐＥＧＦＰ−
１（Clonetech, Inc.）からのＥＧＦＰ遺伝子をＭ５の多重クローニングサイトに挿入することによって構築した。

【０１４５】細胞培養及びトランスフェクションヒトＤＵ−１４５前立腺癌由来の細胞及びＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、上記Ｓ
８ベクターでトランスフェクトした。Ｓ８で安定にトランスフェクトした細胞を
単離するために、標準的なリン酸カルシウム沈殿法を用いて培養物をトランスフ
ェクトした。組み込まれたプラスミドを含む細胞を、ネオマイシン存在下におい
て増殖するそれらの能力について選択した。温度コントロールした（±０．１℃
）ウオーターバス中に培養フラスコを完全に沈めることにより、熱ショックを与
えた。１つの陽性のクローン、クローン４及びポリクローナルラインをＭＣＦ７細胞
トランスフェクションからジェネティシンで選択した。１つのポリクローナルラ
インをＤＵ−１４５細胞トランスフェクションからジェネティシンで選択した。
（それぞれの場合、細胞を２週間ジェネティシンで選択した。）次に、選択した
ラインを分析し、ＦＡＣＳによりソートした。

【０１４６】陽性セルラインの単離ヒト熱ショックに反応して高レベルのＥＧＦＰを発現する細胞を、従来の連続
希釈法を用い、及び蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）法により選択した
。ＥＧＦＰの発現をフローサイトメトリーを用いて定量した。エンハンスドグリ
ーンフルオレセンスプロテイン（ＥＧＦＰ）は４９０ランで励起し、蛍光顕微鏡
下で可視化でき、又はＦＡＣＳで分析できる。ＦＡＣＡ法を用いて、ＥＧＦＰを
発現する細胞をＥＧＦＰを発現しない細胞からソートした。これはジェネティシ
ンで選択したセルラインで行なった。これが必要な理由は、ポリクローナルセル
ラインでは、リポータータンパク質の発現を妨げる方法で組み込まれたＳ８プラ
スミドを有する集団があるからである。細胞をソートすることによって、これら
の集団は除去するすることができ、更なる分析のための純粋に陽性の集団を残す
。

【０１４７】図２に示すように、ＥＧＦＰを駆動する最小熱ショックプロモーター（Ｓ８）
で安定にトランスフェクトされ、３７℃で増殖するＤＵ−１４５細胞におけるＥ
ＧＦＰからの平均蛍光は１０比蛍光単位であった。１時間４２℃の熱ショックに
さらした４時間後、平均比蛍光は７−９倍大きくなった。安定にトランスフェク
トされた細胞における比蛍光の変化を測定することによって、次に比遺伝子発現
を定量した。Ｓ８プラスミドでトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞のＦＡＣＳに
よるソーティングを図３に説明する。

【０１４８】動力学的研究熱暴露生き残りの研究を、ＭＣＦ７細胞が大量の細胞死をおこすことなく加熱
できる最適時間／温度を決めるために行なった。１時間までの４０℃及び４２℃
の場合、細胞死は無視できることがわかり、３％未満の細胞死であった。４４℃
では、僅か３０分の間に細胞のほとんど５０％が死んだ。上記の最適生き残り時間を用い、最初の動力学的研究を行なった。トランスフ
ェクトしたＭＣＦ７細胞を１時間４０℃及び４２℃で加熱すると、ＦＡＣＳでア
ッセイした場合、３０分間の加熱より多くのＥＧＦＰを産性した。加熱後の細胞
の最適回収時間は４時間であった。さらなる回収時間はＥＧＦＰのレベルを増加
させなかった。４４℃で３０分間熱処理した場合、より長い回収時間を要し、８
時間が最大であった。

【０１４９】様々なセルラインにおける３７℃−４４℃でのＥＧＦＰ発現次の加熱／回収時間を用い、発明者のトランスフェクトしたセルラインのすべ
てにおけるＨＳＰ７０由来プロモーターにより駆動されるＥＧＦＰの誘導性を試
験する動力学的研究で同定した。４０℃−１時間熱処理、４時間回収４２℃−１時間熱処理、４時間回収４４℃−３０分熱処理、８時間回収これらの温度／時間を用いて以下のセルラインをＥＧＦＰ発現について試験した
。ＭＣＦ７：乳癌親セルラインＤｕ１４５：前立腺癌親セルラインＭＣＦ７−Ｓ８−Ｐ：Ｓ８プラスミドでトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞、ポ
リクローナルラインＭＣＦ７−Ｓ８−ＰＳ１：ＦＡＣＳによりＥＧＦＰ発現について一度ソートされ
たＭＣＦ７−Ｓ８−Ｐ細胞ＭＣＦ７−Ｓ８−ＰＳ２：ＦＡＣＳによりＥＧＦＰ発現についてソートされたＭ
ＣＦ７−Ｓ８−ＰＳ１細胞ＭＣＦ７−Ｓ８−４：ＭＣＦ７Ｓ８トランスフェクションのクローン４ＭＣＦ７−Ｓ８−４Ｓ１：ＥＧＦＰ発現について一度ソートされたＭＣＦ７−Ｓ
８−４Ｄｕ１４５−Ｓ８−Ｐ：Ｓ８プラスミドでトランスフェクトされたＤｕ１４５細
胞、ポリクローナルラインＨＳＰ由来プロモーターにより駆動されるＥＧＦＰのトランスフェクトされた
ラインからみられる発現を図４に示す。温度が上がるに従い、ＥＧＦＰの比量も
増加する。これらのデータは、発明者の熱ショックプロモーターが実際に熱に応
答することを示す。しかしがら、３７℃でなおＥＧＦＰの発現がある。

【０１５０】熱ショック後の安定にトランスフェクトされたＤＵ−１４５細胞におけるＥＧＦ
Ｐ発現内的な熱ショックプロモーターの誘導は一過的であり、熱依存性である。最小
ＨＳプロモーターが駆動するＥＧＦＰ発現（Ｓ８）で安定にトランスフェクトさ
れ、ＦＡＣＳで２度選択されたＤＵ−１４５細胞（ＤＵ−Ｓ８−ＰＳ２細胞）に
様々な時間及び様々な温度で熱ショックを与えた場合、リポーター遺伝子発現は
温度依存的であり、発現は一過性で誘導ストレスの１５−２４時間後に最大値を
有する（図５）。これらの結果は、そのプロモーターはここで用いた条件下で一
過的に活性化されること、及びＥＧＦＰは不安定であることを示す。何故なら蛍
光はこれらの細胞で１５−２４時間後減少するからである。その最小熱ショック
プロモーター活性は、１時間か２時間の４０℃の熱ショックの後、一過的に約３
倍増加する。プロモーター活性は、１時間か２時間の４２℃の熱ショックの後、
それぞれ１３倍及び２５倍増加する。

【０１５１】熱ショック及びＣＭＶプロモーターの調節下でのＥＧＦＰ発現の比較図６に示すデータは、ＤＵ−Ｓ８−ＰＳ２細胞における最小熱ショックプロモ
ーターの活性は、３７−４３℃の範囲にわたって温度依存性であることを示す。
対照的に、Ｖ９，即ちＣＭＶプロモーターがＥＧＦＰ発現を駆動するベクター（
図７）で安定にトランスフェクトされたＤＵ−１４５細胞は、最小熱ショックプ
ロモーターでトランスフェクトされ、４３℃の熱ショックで誘導された同じ細胞
よりほとんど５０％高いレベルのプロモーター活性を発揮する。ＣＭＶプロモー
ター活性は、これらの細胞において温度により本質的に影響を受けない。最小Ｈ
Ｓプロモーターの温度依存性はＤＵ−１４５細胞に特異的ではない。

【０１５２】実施例２ＩＬ−２の発現はコンストラクトにおけるＨＩＶプロモーター及びｔａｔの使用により増幅されうる。最初の増幅剤研究治療的遺伝子発現を増幅させることができる新規なコンストラクトを含む研究
を行った。増幅剤の考えの原理を証明するために、いくつかのコンストラクトを
製造した。そのコンストラクトは熱ショック誘導性のプロモーターではなく、構
成的なプロモーター、ＣＭＶプロモーターを含む。これらのコンストラクトはプ
ラスミドＬ−２７，Ｘ１４，ＲＲ１３，Ｙ１５及びＳＳ−１０である。下の表３
は、各プラスミドに存在するプロモーター／遺伝子及び製造されたＩＬ−２の量
を示す。プラスミドのうち４つは２つの多重クローニングサイトを含むプラスミ
ドから得た。これらの４つのプラスミドにおいて、ＣＭＶプロモーターをｔａｔ
遺伝子又は多重クローニングサイト（ＭＣＳ）の上流に挿入し、ＨＩＶ１又はＨ
ＩＶ２の長い末端反復配列（ＬＴＲｓ）をマウスインターロイキン２（ＩＬ−２
）の上流に挿入した。プラスミドＸ１４及びＹ１５を模式的に図９Ａ及び９Ｂに
示す。Ｌ−２７プラスミドを対照として用いた。ＩＬ−２は、ＩＬ−２ＥＡＳＩ
Ａキット（Medgenix Diagnostics, Fleurus, Belgium）を用い、ＥＬＩＳＡによ
り、組織培養上清から測定した。キットの感度は０．１ＩＵ／ｍｌと見積もった
。この研究で、ＳＷ４８０細胞を脂質Ｄｏｓｐｅｒでトランスフェクトした（実
施例３のトランスフェクションプロトコール参照）。

【０１５３】

【表３】プラスミド名プロモーター／遺伝子ＩＬ−２の量（Ｉ．Ｕ．）脂質のみＤｏｓｐｅｒ．４８Ｌ−２７ＣＭＶ／ＩＬ−２１５．６３ＲＲ１３ＨＩＶ／ＩＬ−２１７．５６ＣＭＶ／多重クローニングサイト X-14 ＨＩＶ１／ＩＬ−２１７３．７ＣＭＶ／ＴＡＴＳＳ１０ＨＩＶ２／ＩＬ−２１２．８３ＣＭＶ／多重クローニングサイトＹ１５ＨＩＶ２／ＩＬ−２４４０．５５ＣＭＶ／ＴＡＴ

【０１５４】これらの研究から、完全な増幅剤コンストラクトは、ＣＭＶプロモーター以上
に発現を増加させることができることがわかる。また、トランス活性化因子の製
造が、この製造の増加に必要である。

【０１５５】実施例３熱誘導増幅剤ベクターコンストラクト第２のプロモーターを用いて最小ＨＳプロモーターの活性を増加させることが
できるか否かを決定するために、ＭＣＦ−７細胞を、ｐＣ８，ｐｆｌ２及びｐ０
０７を含む一連のベクターで一過的にトランスフェクトした（図８及び９）。２
つの多重クローニングサイトを含むプラスミドを用いて、最小熱ショックプロモ
ーターをｔａｔ遺伝子か多重クローニングサイト（ＭＣＳ）の上流に挿入し、Ｈ
ＩＶ１又はＨＩＶ２の長い末端反復配列（ＬＴＲｓ）をマウスインターロイキン
２（ＩＬ−２）の上流に挿入した。各プラスミドは、ネオマイシン及びアンピシ
リンの選択可能なマーカーをも有する。

【０１５６】プラスミドＣ５からのインターロイキン２（ＩＬ−２）コード領域（ＧｅｎＢ
ａｎｋアクセッションＮｏ．５７７８３４参照）を含む０．５ｋｂのＥｃｏＲＩ
断片を、ベクターＭ５（具体例、実施例１参照）のＥｃｏＲＩ部位に挿入するこ
とによって、先ずプラスミドｆ１１を作った。プラスミドＢ４５２７（Tsang et
al., Biotechniques, 20:51-52, 1996, 及びTsang et al., Biotechniques, 22
:68, 1997、これらは本明細書の一部を構成する）からのＭＣｓの上流の０．４ｋｂのＨＳＰ７０Ｐ断片を含む１ｋｂのＢａｍＨＩ断片を、ＩＬ−２コード領域
の上流のＨＩＶ１ＬＴＲを含むプラスミドＤＮＰ−１（Tsang et al., 1996, 及
びTsang et al., 1997）のＢａｍＨＩ中へ挿入することにより、プラスミドＣ８
を構築した。次に、、ＨＩＶｔａｔ遺伝子のコード領域を含む０．４ｋｂのＮｏ
ｔＩ断片を、Ｃ８のＮｏｔＩ部位に挿入することにより、ベクターｆ１２（図９
）を構築した。最小ＨＳＰ７０Ｂプロモーターを含むその１ｋＢのＢａｍＨＩ断
片を、ＩＬ−２コード領域の上流にＨＩＶ２ＬＴＲを含むプラスミドＭＮＰ−７
（Tsang et al., 1996, 及びTsang et al., 1997）に挿入することにより、中間
ベクターＤ１０を構築した。ｔａｔ遺伝子をコードするその０．４ｋｂのＮｏｔ
Ｉ断片を、Ｄ１０のＮｏｔＩ部位に挿入することにより、プラスミド００７（図
９）を構築した。

【０１５７】トランスフェクションプロトコールトランスフェクションは、公開された方法に従って行なった（Stopeck, et al
., Cancer Gene Therapy, 5:119-126, 1998）。ＭＣＦ−７細胞を６ウエル又は１２ウエルプレートにプレートした。翌日、細胞をHanks緩衝食塩水溶液で洗浄し、１ｍｌのトランスフェクション溶液で置換えた。トランスフェクション溶液
は、血清を含まないOptiMEM(Gibco BRLから)中の、１．２５μｇ又は２．５μｇ
のプラスミドDNA とDosper(１，３−ジーオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド、Boehringer Mannheimから)又はDmrie C
(１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド、Gibco BRLから)との、４：１脂質対DNA質量比であった。ウシ胎児血清（FBS)を各ウエルに最終濃度１０％（体積／体積）まで直ちに加え
た。Dmrie CはDosperより良い脂質であることがわかった。ＩＬ−２定量の前に
細胞を加熱前に２４時間そして加熱後２４時間インキュベートした。

【０１５８】熱誘導増幅研究１セットの実験で、ｐＣ８，ｐｆ１２、又はｐ００７プラスミドでトランスフ
ェクトした細胞を、ＩＬ−２発現活性についてアッセイした。ＩＬ−２は、ＩＬ
−２ＥＡＳＩＡキット（Medgenix Diagnostics, Fleurus, Belgium）を用いてＥ
ＬＩＳＡにより組織培養上清から測定した。そのキットの感度は０．１ＩＵＩ
Ｌ−２／ｍｌと見積もられた。この実験のデータを表４に示す。この表は、ＭＣ
Ｆ７細胞におけるＩＬ−２発現レベルを示し、同細胞はDosperでトランスフェク
トし、２４時間後加熱し、次にトランスフェクションの４９時間後ＥＬＩＳＡに
よりアッセイした。プラスミドＬ−２７（ＣＭＶプラスミドで駆動されるＩＬ−
２を発現する対照のため用いたプラスミド）、００７、ｆ１２、及びＣ８をすべ
て試験した。

【０１５９】

【表４】ＩＬ−２のＩ．Ｕ．温度３７℃ ３９℃ ４１℃ ４２℃ ４４℃ 熱ショック時間連続連続１時間１時間０.５時間脂質単独 2.03 0.50 0.41 0.53 0.53 Ｌ−２７ 14.2 9.88 5.95 9.88 7.80 ００７ 336.76 318.49 334.02 373.74 389.27 Ｆ１２ 8.40 6.88 49.93 60.02 88.13Ｃ８ 9.19 8.03 11.74 8.73 16.37

【０１６０】この研究から、ｐｆ１２は熱に応答性であり、ｐＣ８又はｐＬ−２７より大量
の熱ショック増幅剤コンストラクトＩＬ−２を製造することがわかる。３７℃で
は、ｐｆ１２は、ＣＭＶ駆動対照、Ｌ−２７より５倍多いＩＬ−２を産性した。
細胞を３９℃で一晩熱ショックした場合、ｐｆ１２は、３７℃でのＣＭＶ駆動対
照より７倍多いＩＬ−２を産性した。４１℃又は４２℃で１時間熱ショック処理
すると、３７℃でのＣＭＶ駆動対照と比べ、２６倍も多く増幅剤コンストラクト
からの発現を増加させた。（しかしがら、３７℃でのｐ００７プラスミドはすで
にその最大活性に近く、熱で発現レベルを大きくは増加させない。）ｐｆ１２の
活性も３７℃で高いレベルにある。これらの結果は、増幅剤戦略は約３７℃及び
約４２℃の間の温度での遺伝子発現レベルを増加させ得ることを示す。

【０１６１】別の組の実験において、トランスフェクト効率の変化は、ＣＭＶプロモーター
がβ−ガラクトシダーゼの上流にあるコントロールプラスミドとのコトランスフ
ェクションにより説明された。これらの実験の一般的なプロトコールは、サブカ
ルチャーの２４時間後トランスフェクトし、更に２４時間後熱ショック培養し、
培養を交換し、次に、２４時間後ＩＬ−２の測定のため培地を集めるということ
である。表５に見られるように、ＣＭＶプロモーターの活性は熱ショックにより
最小限に影響されるのみであった。最小熱ショックプロモーター活性は３７℃に
維持した細胞では非常に小さく、４２℃での熱ショックにより２０倍以上誘導さ
れた。安定にトランスフェクトされた細胞で見られるように、最小熱ショックプ
ロモーター活性はＣＭＶプロモーターのおよそ半分にすぎなかった。

【０１６２】

【表５】インターロイキン−２（ＩＬ−２）発現^* ベクタープロモーター３７℃ ４２℃^** 倍（42/37）比^*** Ｌ２７ＣＭＶ−ＩＬ２ 82.6 93.4 1.1 1.0 Ｃ８ＨＳＰ−ＭＣＳ 84.7 70.6 0.8 1.9 ＨＩＶ１−ＩＬ２ｆ１１ＨＳＰ−ＩＬ２ 2.3 54.0 23.7 0.4 (1) ｆ１２ＨＳＰ−ＴＡＴ 107.6 347.4 3.2 6.9 （17) ＨＩＶ１−ＩＬ２００７ＨＳＰ−ＴＡＴ 747.5 1642.9 2.2 83.3 (208) ＨＩＶ１−ＩＬ２＊２４時間に細胞タンパク質ｍｇあたり製造されたＩＬ−２のＩＵ値＊＊熱ショックは１時間であった。＊＊＊４２℃での値及びＣＭＶ−β−ｇａｌとのコトランスフェクションを
ベースにする。

【０１６３】ｔａｔ発現がない場合のＨＩＶプロモーターは、ＣＭＶプロモーターのそれと
同様であり、熱ショックとほぼ独立であった。しかしがら、最小熱ショックプロ
モーターを用いてｔａｔを発現させる場合、リポーター遺伝子発現は４２℃の熱
ショック後、劇的に増加した。熱ショックプロモーター／ｔａｔ及びＨＩＶ１／
ＩＬ−２で一過的にトランスフェクトした細胞中では、ＩＬ−２産性は３７℃に
維持した細胞中での熱ショックプロモーター／ＭＣＳ及びＨＩＶ１／ＩＬ−２の
それと同様であった。この活性は、４２℃ＨＳ後、ＣＭＶプロモーター活性それ
自体と比べ３倍以上、ほぼ７倍レベルまで増加した。

【０１６４】ＨＳプロモーター／ｔａｔ及びＨＩＶ２／ＩＬ−２でトランスフェクトした細
胞は、３７℃に維持した及び４２℃の熱ショック後の細胞中での実質的なリポー
ター遺伝子発現を示した。ＩＬ−２産性により測定した比プロモーター活性は、
ＣＭＶプロモーター単独の場合のそれよりも８０倍以上大きかった。温度調節を
減少させ、リポーター遺伝子発現は、３７℃に維持した細胞における同じ活性に
比べ、４２℃熱ショック後約２倍大きかった。

【０１６５】リポーター遺伝子発現の温度依存性は第２のプロモーターの存在により影響さ
れなかった。表６に示すように、最小熱ショックプロモーター／ｔａｔ及びＨＩ
Ｖ２／ＩＬ−２を含むプラスミドで一過的にトランスフェクトした細胞中でのリ
ポーター遺伝子発現は３７及び４４℃の間で温度依存的に増加した。これらの結
果は最小熱ショックプロモーターでのみで安定にトランスフェクトした細胞につ
いて図４及び６において見られたのと定性的に類似である。

【０１６６】

【表６】ＩＬ−２発現（ＩＵ／ｍｌ）^* ベクタープロモーター３７℃ ３９℃ ４０℃ ４１℃ ４２℃ ４４℃ Ｃ８ＨＳＰ−ＭＣＳ 7.2 9.3 6.0 4.8 5.3 7.0 ＨＩＶ−ＩＬ２ｆｌ２ＨＳＰ−ＴＡＴ 40.6 - - - 133.1 - ＨＩＶ−ＩＬ２００７ＨＳＰ−ＴＡＴ 224 222 230 250 375 470 ＨＩＶ−ＩＬ２ＭＣＦ７乳癌細胞を示したベクターで一過的にトランスフェクトした；２４時間
後１時間熱ショック；熱ショックの２４時間後培地を集めＩＬ２を測定した。

【０１６７】実施例４動物での研究ヒトで見られる腫瘍と類似した組織学的特徴及び転移可能性を有するヒト癌の
マウスモデルを、本発明の治療用組成物で治療できる。本発明の１態様では、Ｈ
ＳＰ７０ＢプロモーターがＴＡＴの発現を駆動しており、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ
−２プロモーターがＥＧＦＰ又はＩＬ−２発現を駆動しているリポーターコンス
トラクトで安定にトランスフェクトしたヒト腫瘍細胞を、ＳＣＩＤマウスに注入
する。腫瘍を適当な大きさ、例えば直径１ｃｍまで成長させた後、その腫瘍を超
音波を用いて約４２℃まで加熱する。腫瘍を除去し、組織スライスを作り、ＥＧ
ＦＰからの蛍光を測定するか、或いはＥＬＩＳＡを用いて腫瘍組織のＩＬ２レベ
ルを測定することによって、遺伝子発現を定量する。本発明の他の態様を用いて
ヒト腫瘍細胞をＳＣＩＤマウスに注入する。その腫瘍が適当な測定可能な大きさ
に成長し、腫瘍にＤＮＡ−脂質複合体を注入する。超音波を用いて腫瘍を加熱し
、加熱後に時々遺伝子発現を測定する。これらの処置の有効性は、本発明の治療
用組成物の投与の結果として、腫瘍の大きさの減少、転移活性の減少、細胞増殖
の減少、又は腫瘍増殖の停止により示される。

【０１６８】本発明の様々な改変及び変形は、本発明の範囲及び思想から離れることなく当
業者に明らかであろう。本発明を具体的な好ましい態様に関して記載したが、特
許請求する該発明はそのような具体的な態様に不当に限定されるべきでないこと
が理解されるべきである。実際、当業者に自明である本発明を実施するための記
載した様式のさまざまな改変は特許請求の範囲内であることを意図する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】熱ショックプロモーター活性を定量するために使用した基本ベク
ターを示す図。

【図２】Ｓ８プラスミドを安定にトランスフェクトしたＤＵ−１４５に関
する細胞蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）ヒストグラム。

【図３】三種類のＳ８トランスフェクトＭＣＦ７細胞集団に関するＦＡＣ
Ｓヒストグラム。

【図４】様々な細胞株でのＥＧＦＰの発現をＦＡＣＳでアッセイした結果
を示すグラフ。

【図５】２回選別した安定トランスフェクトＤＵ−１４５細胞（ＤＵ−Ｓ
８−ＰＳ２）における熱ショック後のＥＧＦＰの発現を示すグラフ。

【図６】熱ストレスへのばく露の１６時間後の安定トランスフェクトＤＵ
−１４５細胞におけるＥＧＦＰの発現レベルを示すグラフ。

【図７】ＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰ
ｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子に作動可能に連結されたＣＭＶプ
ロモーターを含有するプラスミドＶ９の概略図。

【図８】熱ショック反応の増幅を可能にする第二プロモーターを含有する
ベクターのための基本ベクターデザインを示す図。

【図９AB】ＨＩＶ−１プロモーターまたはＨＩＶ−２プロモーターによっ
て駆動される治療用遺伝子ＩＬ−２を含有する増幅因子コンストラクトを示す図
。図９Ａは、ＣＭＶ−ＴＡＴ−ＨＩＶ−１−ＩＬ２発現カセットを含有するＸ１
４と呼ばれるプラスミドを示し、図９ＢはＣＭＶ−ＴＡＴ−ＨＩＶ−２−ＩＬ２
発現カセットを含有するＹ１５と呼ばれるプラスミドを示す。

【図９CD】ＨＩＶ−１プロモーターまたはＨＩＶ−２プロモーターによっ
て駆動される治療用遺伝子ＩＬ−２を含有する増幅因子コンストラクトを示す図
。図９ＣはＨＳＰ−ＴＡＴ−ＨＩＶ−１−ＩＬ２発現カセットを含有するｐｆｌ
２と呼ばれるプラスミドを示し、図９ＤはＨＳＰ−ＴＡＴ−ＨＩＶ−２−ＩＬ２
発現カセットを含有するｐ００７と呼ばれるプラスミドを示す。

【図１０】ＳｔｒｅｓｓＧｅｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のｐ１７
３０ＲのＢａｍＨ１−ＨｉｎｄＩＩＩ断片のＤＮＡ配列。この断片は、上記の具
体例、実施例１と３のコンストラクトで使用した約０．４ｋｂの最小ＨＳＰ７０
Ｂプロモーター断片を含有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者デイビッド・ティ・ハリスアメリカ合衆国85718アリゾナ州ツーソン、ノース・アルバーノン・ウェイ4110番 (72)発明者エバン・ハーシュアメリカ合衆国85718アリゾナ州ツーソン、カミノ・ラ・ゾレラ2321番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物細胞において選択さたポリヌクレオチドを発現させ
る方法であって、（ａ）（ｉ）トランス活性化因子をコードする遺伝子に作動可能に連結した誘導
性プロモーター；及び（ｉｉ）該選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結した第２のプロモータ
ー（該第２のプロモーターは該トランス活性化因子によって活性化される）を含む発現コンストラクトを供し；（ｂ）該発現コンストラクトを該細胞中に導入し；そして（ｃ）該細胞を、該誘導性プロモーターを活性化させる条件（該条件は該選択さ
れたポリヌクレオチドを発現させる）に置くことを含む方法。
【請求項２】該誘導性プロモーターは熱ショックプロモーターであり、該
誘導性プロモーターを活性化させる条件は高温条件である請求項１に記載の方法
。
【請求項３】該高温条件が、該細胞についてのおおよそ基礎温度〜約４２
℃の間の温度を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】該高温条件が、約３７℃〜約４２℃の間の温度を含む請求項
３に記載の方法。
【請求項５】該高温条件が、約３８℃〜約４１℃の間の温度を含む請求項
４に記載の方法。
【請求項６】該高温条件が、約３９℃〜約４０℃の間の温度を含む請求項
５に記載の方法。
【請求項７】該熱ショックプロモーターが、ＨＳＰ７０，ＨＳＰ９０、Ｈ
ＳＰ６０、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ７３、ＨＳＰ２５、ユビキチン、及
びＨＳＰ２８プロモーターよりなる群から選択されるプロモーターに由来する請
求項２に記載の方法。
【請求項８】該誘導性プロモーターが低酸素反応性の要素を含む請求項１
に記載の方法。
【請求項９】該第２のプロモーターが、ＨＩＶ−１プロモーター及びＨＩ
Ｖ−２プロモーターよりなる群から選択され、該トランス活性化因子がｔａｔで
ある請求項１に記載の方法。
【請求項１０】該選択されたポリヌクレオチドの発現によりポリペプチド
、タンパク質、リボザイム、アンチセンス核酸が製造される請求項１に記載の方
法。
【請求項１１】該選択されたポリヌクレオチドが、オルニチンデカルボキ
シラーゼ、アンチザイムタンパク質、ｐ５３、ｐ１６、ｎｅｕ、ＩＬ１，ＩＬ２
、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＦＬＴ−３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ，
Ｇ−ＣＳＦ，ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＴＮＦ，ＨＳＶ−ＴＫ，Ｉ−ＣＡＭ１，ＨＬ
Ａ−Ｂ７，及びＴＩＭＰ−３よりなる群から選択されるタンパク質をコードする
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】該発現コンストラクトが選択可能なマーカーをコードする
遺伝子を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】該発現コンストラクトが、（ｉ）該第２プロモーターに作動可能に連結した第２の選択されたポリヌクレオ
チド；及び（ｉｉ）該第１及び第２ポリヌクレオチドの間に配置された内部リボソームエン
トリー部位、を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】該細胞が腫瘍細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】該発現コンストラクトの該細胞中への導入が、リポソーム
、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、単
純ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスよりなる群から選択される運搬ビ
ークルにより媒介される請求項１に記載の方法。
【請求項１６】該発現コンストラクトの該細胞中への導入が、インビトロ
で行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項１７】該発現コンストラクトの該細胞中への導入が、インビボで
行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】選択されたポリヌクレオチドの発現生成物の治療的有効量
を患者に与える方法であって、（ａ）トランス活性化因子をコードする遺伝子に作動可能に連結した誘導性プロ
モーターを含む第１の発現コンストラクトを供し；；及び（ｂ）該選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結した第２のプロモーター
（該第２のプロモーターは該トランス活性化因子によって活性化される）を含む
第２の発現コンストラクトを供し；（ｃ）該第１及び第２の発現コンストラクトを該患者の細胞中に導入し；そして
（ｄ）該細胞を該誘導性プロモーターを活性化させる条件（該選択されたポリヌ
クレオチドの発現は該条件により誘導される）に置く、ことを含む方法。
【請求項１９】該誘導性プロモーターは熱ショックプロモーターであり、
該誘導性プロモーターを活性化させる条件は、おおよそ基礎温度〜約４２℃の間
の温度を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】該第１及び第２発現コンストラクトが同じベクター上にあ
る請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】該発現コンストラクトの細胞中への導入がエクスビボで行
なわれる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】該発現コンストラクトの細胞中への導入がインビボで行な
われる請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】該選択されたポリヌクレオチドの発現生成物が該患者の病
原体に有害であり、該病原体はウイルス、細菌、真菌、菌類、寄生虫よりなる群
から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】該選択されたポリヌクレオチドの発現生成物が該細胞の増
殖を阻害する請求項に記載の方法。
【請求項２５】該選択されたポリヌクレオチドの発現生成物が該患者の欠
損タンパク質を置換する請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】該選択されたポリヌクレオチドの発現生成物が神経再生を
促進する請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】哺乳動物細胞において癌を処置する方法であって、（ａ）（ｉ）トランス活性化因子をコードする遺伝子に作動可能に連結した誘導
性プロモーター；及び（ｉｉ）該選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結した第２のプロモータ
ー（該第２のプロモーターは該トランス活性化因子によって活性化される）を含む発現コンストラクトを供し；（ｂ）該発現コンストラクトを腫瘍細胞中に導入し；そして（ｃ）該腫瘍細胞を該誘導性プロモーターを活性化させる条件（該条件は該選択
されたポリヌクレオチドを発現させ、選択されたポリヌクレオチドの発現生成物
は該腫瘍細胞の増殖を抑制するのに有効な量発現する）に置く、ことを含む方法。
【請求項２８】該誘導性プロモーターは熱ショックプロモーターであり、
該誘導性プロモーターを活性化させる条件は、おおよそ基礎温度〜約４２℃の間
の温度を含む高温条件である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】外的ビーム照射療法、短距離療法、化学療法、及び外科手
術よりなる群から選択される、癌の治療のための、少なくとも１つの確立された
治療形で該腫瘍細胞を処置することを更に含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】（ｄ）細胞を高温条件に置いた後、腫瘍細胞をラジオプロ
テクターＷＲ−３３２７８又はＷＲ−１０６５で処理し；そして（ｅ）最後に、照射療法で該腫瘍細胞を処置すること（該選択されたポリヌクレ
オチドはオルニチンデカルボキシラーゼアンチザイムタンパク質をコードする）
を更に含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】該哺乳動物がヒトである請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】該癌が、脳、肺、肝臓、膀胱、脾臓、腎臓、リンパ、結節
、小腸、膵臓、血液細胞、結腸、胃、乳房、子宮内膜、前立腺、睾丸、卵巣、皮
膚、外陰、頚部、頭及び首、食道、骨髄、及び血液の癌よりなる群から選択され
る請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】（ａ）（ｉ）トランス活性化因子をコードする遺伝子に作
動可能に連結した誘導性プロモーター；及び（ｉｉ）選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結した第２のプロモーター
（該第２のプロモーターは該トランス活性化因子によって活性化される）を含む発現コンストラクトを供し；（ｂ）該発現コンストラクトを哺乳動物細胞中に導入し；そして（ｃ）該細胞を該誘導性プロモーターを活性化させる条件に置くことを含む哺乳動物細胞において免疫応答を誘発する方法であって、該条件は該選択されたポリヌクレオチドを発現させ、選択されたポリヌクレオ
チドの発現生成物は該哺乳動物において免疫応答を誘発するのに効果的な量発現
され、該免疫応答は体液性免疫応答及び細胞性免疫応答よりなる群から選択され
る方法。
【請求項３４】該誘導性プロモーターは熱ショックプロモーターであり、
該誘導性プロモーターを活性化させる条件は、おおよそ基礎温度〜約４２℃の間
の温度を含む高温条件である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】免疫応答が該細胞に対して行なわれる請求項３３に記載の
方法。
【請求項３６】化学療法、外的ビーム照射療法、短距離療法、及び外科手
術よりなる群から選択される、癌の治療のための、確立された治療形で該細胞を
処置することを更に含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】該哺乳動物がヒトである請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】哺乳動物の遺伝物質を改変する方法であって、（ａ）（ｉ）トランス活性化因子をコードする遺伝子に作動可能に連結した誘導
性プロモーター；及び（ｉｉ）該選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結した第２のプロモータ
ー（該第２のプロモーターは該トランス活性化因子によって活性化される）を含む発現コンストラクトを供し；（ｂ）該発現コンストラクトを該哺乳動物の細胞中に導入する、ことを含む方法。
【請求項３９】（ａ）トランス活性化因子をコードする遺伝子；（ｂ）該遺伝子に作動可能に連結した誘導性プロモーター；（ｃ）選択されたポリヌクレオチド（ｄ）該選択されたポリヌクレオチドに作動可能に連結した第２のプロモーター
（該第２のプロモーターは該トランス活性化因子によって活性化される）を含む発現コンストラクト。
【請求項４０】該誘導性プロモーターは熱ショックプロモーターであり、
該選択されたポリヌクレオチドの発現は高温条件により誘導され、高温条件は約
３７℃〜約４２℃の間の温度を含む請求項３９に記載の発現コンストラクト。
【請求項４１】該熱ショックプロモーターが、ＨＳＰ７０，ＨＳＰ９０、
ＨＳＰ６０、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ７３、ＨＳＰ２５、ユビキチン、
及びＨＳＰ２８プロモーターよりなる群から選択されるプロモーターに由来する
請求項４０に記載の発現コンストラクト。
【請求項４２】該誘導性プロモーターが低酸素反応性の要素を含む請求項
３９に記載の発現コンストラクト。
【請求項４３】該第２のプロモーターが、ＨＩＶ−１プロモーター及びＨ
ＩＶ−２プロモーターよりなる群から選択され、該トランス活性化因子がｔａｔ
よりなる群から選択される請求項３９に記載の発現コンストラクト。
【請求項４４】該選択されたポリヌクレオチドの発現によりポリペプチド
、タンパク質、リボザイム、アンチセンス分子が製造される請求項３９に記載の
発現コンストラクト。
【請求項４５】該発現コンストラクトが、（ｉ）該第２プロモーターに作動可能に連結した第２の選択されたポリヌクレオ
チド；及び（ｉｉ）該第１及び第２の選択されたポリヌクレオチドの間に配置された内部リ
ボソームエントリー部位を更に含む請求項３９に記載の発現コンストラクト。
【請求項４６】請求項３９に記載の発現コンストラクトを含む細胞。