JP2000201680A - エピソ―ム的に複製するベクタ―、その製造および使用 - Google Patents

エピソ―ム的に複製するベクタ―、その製造および使用

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JP2000201680A JP11200371A JP20037199A JP2000201680A JP 2000201680 A JP2000201680 A JP 2000201680A JP 11200371 A JP11200371 A JP 11200371A JP 20037199 A JP20037199 A JP 20037199A JP 2000201680 A JP2000201680 A JP 2000201680A
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アルミン、バイカー
Juergen Bode
ユルゲン、ボーデ
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クリスティアーン、フェツァー
Hans-Joachim Lipps
ハンス‐ヨアヒム、リップス
Christoph Piechaczek
クリストフ、ピーヒャツェック
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本質的にあらゆる型の細胞形質転換または免
疫反応を回避し、先行技術と比較して遺伝子の保持を改
良すること。 【解決手段】 少なくとも１個のスカフォールド／マト
リックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）と、少なくとも１個の
ウイルスまたは真核性の複製起源（ＯＲＩ）を含んでな
る、エピソーム的に複製するベクター、これらを含んで
なる細胞、それらの作成法、およびそれらの、特に医薬
または診断薬としての使用。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、少なくとも１個の
スカフォールド／マトリックス付着領域（scaffold/mat
rix attached region）（Ｓ／ＭＡＲ）と、少なくとも
１個のウイルスまたは真核性の複製起源（ＯＲＩ）を含
んでなる、エピソーム的に複製するベクター、これらを
含んでなる細胞、それらの作成法、およびそれらの、特
に医薬または診断薬としての使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在では、ベクターは、研究や治療に広
く用いられている。このような状況においては、ベクタ
ーは、特に真核および原核細胞または細胞系のトランス
フェクションまたは形質転換、およびこれらの細胞中に
おいて、例えば薬学／医学的に関連のあるタンパク質ま
たはペプチドをコードするエフェクターを作用させるの
に用いられるが、ベクター自身の複製にも用いられる。
エフェクターは、一般に宿主細胞において代謝または治
療性の特定の効果を生じる物質を意味するものとして理
解されている。通常のエフェクターは、タンパク質また
はペプチドをコードする核酸、リボザイムまたはアンチ
センスＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡである。
【０００３】ベクターは、遺伝子治療に特に重要であ
る。遺伝子治療の基本的目的は、核酸を細胞中に導入し
て、エフェクター遺伝子を発現することである。この点
において、遺伝子治療には三つの根源的な問題点があ
る：a)遺伝子の導入（遺伝子送達）、b)遺伝子の保持
（遺伝子保持）、およびc)遺伝子の発現（遺伝子発
現）。これに関して、遺伝子の保持、従って安定且つ持
続的な遺伝子の発現が遺伝子治療の成功の基本的条件で
あるが、この問題点は今日までのところは十分満足には
解決されていないのである。従って、これに対する前提
条件は、適当なベクターの使用である。これに関して、
遺伝子治療では、イン・ビトロおよびイン・ビボ法が原
則として区別されている。イン・ビトロ法では、細胞を
身体から取り出して、ベクターと共にエクス・ビボでト
ランスフェクションした後、同じまたは別の身体へ再度
導入するのである。イン・ビボでの遺伝子治療では、ベ
クターは全身に血流などを介して投与される。しかしな
がら、局所投与により、遺伝子治療ベクターを、組織、
例えば血管の患部に局所的に投与することも可能である
（例えば、ＷＯ９５／２７０７０号明細書を参照された
い）。
【０００４】従って、選択された症例で治療用遺伝子を
局所投与するには、例えばバルーンカテーテル変法に基
づいた様々な方法であって、物質または遺伝子を血管壁
に直接投与することができるようにする方法が開発され
た。二重バルーンカテーテルを用いる局所投与の後に、
例えばNabel, E.R. et al. (1990) Science, 249, 1285
は、リポソームおよびレトロウイルストランスフェクシ
ョンによるブタの大腿動脈のトランスフェクション細胞
でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の一過性発現を検出する
ことができた。
【０００５】ベクターは、特に、糖尿病、血友病、ＡＤ
Ａ、筋ジストロフィー、家族性高コレステロール血症、
またはリウマチのような慢性疾患や遺伝性疾患の治療に
用いられるだけでなく、血管障害−動脈硬化症またはそ
の後遺症（狭窄、再狭窄、心筋梗塞）−のような急性疾
患や、腫瘍にも用いることができる組織特異的発現の最
適化に用いられる。最後に、遺伝子の発現、従って、特
に病理学的または遺伝学的修飾のために、標的生物、例
えばインシュリン、または血管細胞、第VII因子などに
は適正な程度には存在せずまたは最早存在しない治療タ
ンパク質やペプチドの細胞内形成を組織指定遺伝子導入
によって起こすこともできる。
【０００６】従って、体細胞遺伝子治療の本質的目的
は、治療用遺伝子を全身または局所投与の後に身体の標
的細胞に特異的に取り込み、同時に標的細胞の形質転換
または免疫反応を誘発させることなくこれらの細胞中で
治療用遺伝子を発現させることである。
【０００７】今日までのところ、これに利用することが
できる２種類のベクター、すなわち本明細書では、a)
エピソーム的に複製するベクターと、b) ＤＮＡに組込
むベクターとに分類しなければならないウイルス性ベク
ターと、c) ランダム挿入（組込み）により安定なトラ
ンスフェクションが行われる、またはd) （一過性の）
一時的トランスフェクションだけが存在する非ウイルス
性ベクターとがある。組込みベクターを用いる方法での
宿主ゲノムへのランダム組込みでは、組込み点によって
は、挿入変異誘発、および挿入遺伝子の読取りまたは発
現が起こらないいわゆる「サイレンシング(silencin
g)」を生じることができる。一過性発現ベクターは、時
間に関してその寿命に限られており、安定ではなく、場
合によっては組込みを受け易いが、宿主細胞を形質転換
することもある。しかしながら、その最も重大な欠陥
は、発現が限定されておりしかも寿命が短いという性質
のために頻繁に繰返し使用しなければならないことであ
る。従って、これらのベクターは、本発明で求められる
有効性、再現性および安全性に関してかなりの問題点を
引き起こすのである。
【０００８】ウイルス性のエピソーム的に複製するベク
ター群は、宿主ゲノムに組込まれず、宿主細胞中で自己
複製形態で保持されるので、このような欠点を持たな
い。エピソーム的に複製する(episomally replicating)
という用語は、本発明では、ベクターが宿主細胞のゲノ
ムに組み込まれないが、平行に存在し、細胞周期中およ
びこのベクターコピーが−細胞分割の前後に存在するコ
ピーの数によって−生成する細胞中に統計学的に分布す
る経過中にも複製される意味として理解される。プラス
ミドベクター、例えばｐＧＦＰ−Ｃ１ベクター(Clontec
h UK Ltd.)であって、変更によって研究および他の応用
目的に最適化されたものは、ウイルスベクターから誘導
される。現在のところは、ウイルス起源から出発して、
真核細胞、例えばＳＶ４０、ＢＰＶまたはＥＢＶベクタ
ーでエピソーム的に複製する少数のベクターだけが知ら
れている。しかしながら、これらのベクターの複製起点
は、１個以上のウイルスによってコードされたトランス
作用因子との相互作用を必要とする。これらの因子は、
ベクターの安定性のためにも必要であるが、宿主細胞を
不死化し、形質転換したり、または身体に免疫反応を誘
発することが多い(Ascenzioni et al. (1997) Cancer L
etters 118, 135-142)。
【０００９】例えば、真核ウイルスＳＶ４０（シミアン
ウイルス）は、サル細胞中、およびある種の哺乳類細胞
および細胞系でエピソーム的に複製する。このために
は、ウイルスは、宿主細胞中でそれが存在するためのい
わゆる「ラージＴ抗原」を必要とする。「ラージＴ抗
原」の機能は、細胞中でのウイルスの複製にとって極め
て重要である。「ラージＴ抗原」は、取り分け、複製の
起点の領域中のウイルスＤＮＡに結合して、そこでその
複製を開始する(Mohr et al. (1987) EMBO J. 6, 153-1
60)。しかしながら、「ラージＴ抗原」は、ウイルスに
とって重要なこれらの活性の他に、細胞の機能にも影響
を与える。これは、取り分け、細胞周期の調節に関与し
ているタンパク質（サイクリン、チューブリン、ｃｄｃ
２）に結合する。従って、ＳＶ４０の感染またはＳＶ４
０「ラージＴ抗原」をコードする遺伝子を有するベクタ
ーによるトランスフェクションは、一次細胞を不死化
し、動物の腫瘍形成を誘発することがある(Fried, M.
(1965) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 486-491; Ec
khart, W. (1969) Virology, 38, 120-125; Di Mayorca
etal. (1969) Virology, 830, 126-133)。
【００１０】ＷＯ９８／２７２００号明細書には、環状
ベクターでクローニングしたヒトまたは哺乳類の複製起
点を含む構築物であって、宿主ゲノムに組み込まれるこ
となくヒト細胞でエピソーム的に複製するものが開示さ
れている。しかしながら、エピソーム的複製は、（選択
的抗生物質を用いて培養する）選択圧力によってのみ維
持することができ、それでさえ、限定された有効性でし
か起こらないのである。
【００１１】
【発明の実施の形態】従って、以前に知られていたベク
ターは、概してかなりの欠陥を有し、特に哺乳類の細胞
では、遺伝子導入の適合性は極めて限定されている。従
って、本発明の目的は、トランス作用性ウイルス因子に
依存しまたはウイルスタンパク質を発現することなくウ
イルスベクターをエピソーム的に複製する利点を有する
ベクターを開発し、従って本質的にあらゆる型の細胞形
質転換または免疫反応を回避し、先行技術と比較して遺
伝子の保持を改良することであった。
【００１２】従って、本発明は、少なくとも１個のスカ
フォールド／マトリックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）と、
少なくとも１個のウイルスまたは真核生物の複製起源
（ＯＲＩ）を含むことを特徴とする、エピソーム的に複
製するベクターに関する。
【００１３】スカフォールド／マトリックス付着領域
は、真核生物の染色体のクロマチンを個別のドメイン、
特にトポロジー的に結合したいわゆるループドメインに
再分割することができ、これによって特に真核生物の染
色体の構造および機能に決定的な重要性を有する核酸の
配列を意味するものと理解される（Luderus, M.E. et a
l. (1994) マトリックス付着領域のラミンポリマーへの
結合は一本鎖領域と副溝を伴う, Mol. Cell Biol., 14,
6297-6305）。これらのループドメインは、本質的に、
いわゆる「ドメイン」内の遺伝子の協調発現のための総
ての必要なシス調節要素を含んでいる。これらのドメイ
ンは、核マトリックスまたは核構造（スカフォールド）
上に特異的に蓄積する配列によって限定される。これら
の配列はＳ／ＭＡＲと呼ばれ、通常は数百塩基の長さで
あり、アデノシンおよびチミジンが多い（７０％）。ク
ローニングしたＳＡＲおよびＭＡＲ要素は共通の構造特
性を有するが、現在までのところコンセンサス配列は同
定されていない(Boulikas, T. (1993) J. Cell. Bioche
m., 42, 14-22)。Ｓ／ＭＡＲ要素は、ゲノム組込みの
後、異種遺伝子の発現を増加することができる(Klehr,
D. et al. (1991) Biochem. 30, 1264-1270)。Ｓ／ＭＡ
Ｒは、ＤＮＡのトポロジー的ら旋形成に重要であると考
えられる(Bode, J. et al., (1992) Science 2555, 195
-197)。Ｓ／ＭＡＲ要素は、一方では核マトリックスに
イン・ビボで結合したＤＮＡを特性決定することによっ
て、他方ではＤＮＡ不含核マトリックスにイン・ビボで
結合することができるＤＮＡ断片の特性決定によって単
離し、同定することができる(Lewin, B. (1994) 遺伝子
Ｖ(Genes V), Oxford University Press, 776-778; M
ielke et al. (1990) Biochem. 29, 7475-7485)。同定
および特性決定の例は、BodeJ. et al., (1995) （スカ
フォールドマトリックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）：転写
活性を有する座を生成する構造特性(Scaffold Matrix A
ttachment Regions (S/MAR): Structural properties c
reating transcriptionally active loci), Int. Rev.
Cytol. 162A, 389ff., Academic Press, オーラン
ド）、およびBode J.et al. (1992; 上記引用）に記載
されている。この記載および当業者の知識から、適当な
単離の可能性が生じる。
【００１４】「複製の起点」（ＯＲＩ）という表現は、
真核または原核細胞およびウイルスにおける複製の一般
的出発点または起点を意味するものと理解される。これ
らのＯＲＩは複製を支持し、様々なレプリケーターにつ
いての付着点を形成する。
【００１５】動物細胞からＯＲＩ配列を単離する方法は
当業者に知られており、例えばDePamphilus, M.L. (199
3) Annu. Rev. Biochem. 62, 29-63の総説に記載されて
いる。典型的な方法は、例えば「新生鎖の突出(nascent
strand extrusion)」(Kaufmann, G. et al. (1985) Mo
l. Cell. Biol., 5, 721-727)または「抗十字形免疫ア
フィニティー精製(anticruciform immunoaffinity puri
fication)」(Bell, D.et al. (1991) Biochem. Biophy
s. Acta, 1089, 299-308)である。
【００１６】従って、１個のみまたはそれ以上のＳ／Ｍ
ＡＲ要素が１個以上の真核生物またはウイルスＯＲＩに
結合しているベクターが、一方において、通常は先行技
術によって予想されるようにゲノム中に組込まれず(Weg
ner et al. (1989) NucleicAcids Research 17, 9909-9
932)、他方において、その複製について（ウイルス起源
の）イントランス作用因子(in-trans-acting factors)
に依存することなくエピソーム的に複製されることは極
めて意外であった。本発明によるベクターが安定であり
かつ約１００世代以上まで抗生物質による選択なしに保
持されることも意外にも明らかになっているので、これ
は遺伝子治療、研究、およびあらゆる種類の他の応用分
野についての有利な手段である。従って、本発明による
ベクターは、一方において、ランダム組込みに関する問
題が起こらないという利点を有する。他方において、安
定なエピソーム的複製の結果として、長時間持続する作
用を行うことができ、繰返し処理は必要なく、すなわち
形質転換細胞での遺伝子保持の問題（遺伝子保持）が本
質的に解決される。あるいは、多くの不死化細胞におけ
る宿主ゲノムに配列も既に存在しているイントランス作
用因子なしでは、宿主細胞の形質転換または不死化、ま
たはウイルスタンパク質による免疫反応の誘発は恐ろし
いものではない。発現系も、全く染色体要素に基づいて
いる。従って、本発明によるベクターは、必要な有効
性、再現性および安全性を提供する。
【００１７】概して、ベクター成分は一般に一緒に作用
し、Ｓ／ＭＡＲは、ベクターを宿主ゲノムに組込んだり
または細胞にとって異種の複製因子をこのためにＯＲＩ
に加えなければならないことなしにエピソーム的複製を
行うことができる。この程度までのＳ／ＭＡＲが複製因
子にとって代わり、または内因性複製因子の活性を提供
する。ＯＲＩのＳ／ＭＡＲによる拡大により、少なくと
もプラスミドにおけるその機能性が確保される。
【００１８】特に、本発明によるベクターは、発現ベク
ターであることができる。発現ベクターは、宿主細胞中
の極めて様々な型の遺伝子を発現することができるとい
う利点を有する。発現ベクターとは、ペプチドまたはタ
ンパク質をコードする遺伝子が宿主特異的遺伝子調節配
列の制御下にあるベクターを意味するものと理解され
る。本発明の意味においては、これらは、遺伝子の（エ
ピソーム的）発現に適しており、相当する遺伝子配列の
他に、更に転写のためのプロモーター、オペレーターお
よびターミネーター配列および翻訳のためのリボソーム
結合部位の配列も有するベクターである。直鎖状発現ベ
クターは、遺伝子治療、または真核生物または原核生物
の様々な遺伝子のイン・ビトロ発現に極めて適してい
る。
【００１９】本発明によるベクターは、トランスに作用
する複製因子をコードする任意の核酸を含まないという
点で識別することもできる。上記のように、特に、ベク
ター上でコードされた情報の複製に必要なウイルスＯＲ
Ｉと共に通常は先行技術で以前から知られているベクタ
ー中のイントランス因子は不利である。従って、本発明
の態様の特別な利点は、本発明において、これらの複製
因子を特にトランス作用を示しかつ同時に例えば宿主細
胞で変化を引起すものと調合することができることであ
る。
【００２０】本発明の意味での発現複製因子は、一般に
ベクターの複製に必要な、すなわち例えばＯＲＩに結合
し核酸の倍加(doubling)を引起す因子を意味するものと
理解される。このような複製因子は、タンパク質および
ペプチドであることができる。これに関して記載される
トランス作用という表現は、本発明の意味において広義
に解釈される。トランス作用は、複製因子をコードする
配列の比較的近接した環境で直接には指定されない複製
因子の任意の作用である。本発明の意味における複製因
子の例は、ＳＶ４０ラージＴ抗原、トランス活性化因
子、例えばＥＢＶベクターからのＥＢＮＡ１およびＢＰ
ＶベクターのＥ１およびＥ２である。
【００２１】もう一つの態様では、ベクターは、トラン
スに作用するかまたは作用しないかとは完全に独立な複
製因子−特に、ウイルス起源のもの−をコードする核酸
を全く含まない。これは、本発明では、ウイルス複製因
子への機能的依存は全くなく、かつ形質転換の危険性も
更に除外されるので、可能である。
【００２２】ウイルスタンパク質をコードする核酸を全
く含まないベクターが、特に好ましい。この態様の利点
は、ウイルスタンパク質は最早全く発現されず、従って
他の頻繁に起こる免疫反応の誘発は完全に抑制され、こ
れによりこの態様が治療に極めて適することである。同
時に複製因子でありかつトランスに作用するウイルスタ
ンパク質の一例は、腫瘍誘発または不死化作用が知られ
ているＳＶ４０ウイルスの既知の「ラージＴ抗原」であ
る。
【００２３】本発明は、「複製の起点（ＯＲＩ）」が真
核生物での増殖に用いられ、好ましくはＥＢＶ−ＯＲ
Ｉ、ＢＰＶ−ＯＲＩ、または特にＳＶ４０−ＯＲＩのよ
うなウイルスＯＲＩの群から選択されたベクターにも関
する。真核生物での増殖は、特に治療用およびこの応用
分野での研究目的に用いられる。
【００２４】ＯＲＩが真核生物での増殖に用いられる本
発明によるベクターであって、この場合には好ましくは
ｐＵＣ−ＯＲＩも、本発明の範囲内にある。この方法を
備えたベクターは、真核生物におけるベクターの複製に
利用することができ、従って比較的簡単に高収率で複製
することができるという利点を有する。
【００２５】ベクターの特に好ましい態様では、真核生
物での増殖には１個以上の「複製の起点」が含まれ、原
核生物での増殖には１個以上が含まれ、好ましくは、真
核生物での増殖には少なくとも１個、および原核生物で
の増殖には少なくとも１個含まれる。この態様の利点
は、一方ではベクターが原核生物で容易に複製すること
ができ、他方では真核生物での使用も同時に可能である
点である。
【００２６】本発明によるベクターは、Ｓ／ＭＡＲが哺
乳類に由来し、好ましくはヒト起源のものであるもので
もある。この態様の利点は、真核生物で特に良好な増殖
を、特に遺伝子治療の経過中に行うことができることで
ある。本発明の特に好ましいＳ／ＭＡＲは、プラスミド
ｐＴＺ−Ｅ２０から２．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩ
Ｉ断片として単離されたヒト起源のインターフェロンβ
遺伝子の５′領域から選択されるものである（Bode et
al. (1992) 上記引用；図４）。
【００２７】エピソーム的に複製するベクターは、抗生
物質耐性を伝達する１個以上の遺伝子を含むこともでき
る。これらは、特にベクターで処理された細胞のトラン
スフェクションまたは形質転換が良好に行われるかどう
かを選択し、制御するのに用いられる。この場合に、当
業者に知られているカナマイシン、ゲネチシン、ゲンタ
マイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、ストレプ
トマイシン、スペクチノマイシン、ナリジクス酸、リフ
ァンピシン、クロラムフェニコール、および／またはゼ
オシンが選択に適しており、これらに専門家としての知
識から任意の他のものに添加することが可能であるの
で、これらの抗生物質から選択される抗生物質に対する
耐性を伝達する遺伝子が特に好ましい。
【００２８】ベクターの特に好ましい態様は、ＳＶ４０
ＯＲＩと、プラスミドｐＴＺ−Ｅ２０から２．０ｋｂ
のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片として単離されたインタ
ーフェロンβ遺伝子の５′領域からのスカフォールド／
マトリックス付着領域配列を含む（Bode et al. (1992)
上記引用；図４）。原核生物ＯＲＩ、他とｐＵＣＯＲ
Ｉ、特にカナマイシンに対する耐性を伝達する遺伝子、
および各種のエフェクターを加えることができる。様々
な上記量の挿入によって修飾し、本発明のベクターを提
供する適当な出発ベクターは、Clontech UK Ltd.社のｐ
ＧＦＰ−Ｃ１ベクターである（図２を参照されたい）。
【００２９】他の例では、本発明によるベクターは、１
個以上のプロモーターまたはアクチベーター配列および
／または１個以上のエフェクターを含む点で識別され
る。
【００３０】プロモーターは、読み取られかつ遺伝子の
転写速度を調節する配列からの通常は５′にある核酸配
列を意味するものと理解される。ここでは、遺伝子活性
を増加または減少させるそれぞれアクチベーターおよび
リプレッサー配列が区別される。「エンハンサー」はア
クチベーターに入れることができ、プロモーター５′ま
たは３′からかなり離れており、例えばヒトサイトメガ
ロウイルス（ＥＰ ０１７３ １７７号明細書）、ＣＭ
Ｖ前初期ポリペプチド(Pos. 216-809/Genbank Accessio
n No.: K03104)から位置とは独立して転写活性を増加す
ることができる点で他の調節要素とは異なる。
【００３１】本発明で好ましいアクチベーター配列およ
びプロモーターの特定の群は、構成的、細胞周期特異
的、組織特異的、代謝調節しおよび／または誘発可能な
プロモーターまたはアクチベーター配列である。概し
て、これらは、選択によって、細胞位置に適当であり、
細胞の特定の代謝条件または治療上必要なものを考慮
し、または複製または発現を外部因子によって制御する
ことができる。
【００３２】好ましいエフェクターは、タンパク質、ペ
プチド、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡから選択
されたある種の物質をコードするか、またはアンチセン
スＤＮＡである。ペプチドは、本発明では、天然または
合成型の、タンパク質の一部、またはアミノ酸配列を意
味するものと理解される。これらのエフェクターの機能
は、非常に広汎であり、特定の治療上必要なものに適合
させることができる。多種多様な文献において、これの
多くの例が利用でき、特に治療タンパク質に対するコー
ド配列が知られている。本発明によるベクターの応用の
可能性を限定することなく、またはこのリストを完全に
するため、ここでは、タンパク質またはこれらのタンパ
ク質をコードする遺伝子をこれに関して治療に用いるこ
とができる若干の例を挙げる：一酸化窒素シンターゼ
（例えば、ＷＯ９５／２７０２０号明細書を参照）、イ
ンシュリン（例えば、ＥＰ−Ｂ １００ ０１ ９２９
号明細書を参照）、エリトロポエチン（例えば、ＥＰ−
Ｂ１−０ １４８ ６０５号明細書を参照）、または血
液凝固因子、例えば第VII因子、インターフェロン、サ
イトカイン、ホルモン、成長因子など。ベクターに用い
られる適当なエフェクターの選択は、当業者の知識の範
囲内にある。
【００３３】本発明のもう一つの課題は、上記のベクタ
ーを１個以上含む１個以上の細胞でもある。従って、本
発明の態様を、既に細胞中に含まれているベクターの保
管または増殖について詳細に説明する。本発明で特に好
ましいものは、真核または原核細胞、特に細菌、酵母、
昆虫、両生類、魚類または哺乳類の細胞である。この場
合に、例えば、魚類細胞の場合には、異種ＤＮＡの微量
注射の後に発現が起こることも知られている(Winkle et
al. (1991) Mol. Gen. Genet. 226, 129-140)。トラン
スジェニック魚類も同様に生成することができる（ＷＯ
９６／０３０３４号明細書、ＷＯ９６／３２０８７号明
細書、ＷＯ９８／１５６２７号明細書）。
【００３４】特に、遺伝子治療では、ヒト由来の非不死
化細胞が好ましい。「非不死化」という用語は、本明細
書では、細胞がゲノムで形質転換されず、すなわち自由
に複製可能ではないが、天然の細胞周期を受けやすく、
腫瘍細胞とは対照的に、それ自体限定された寿命であ
り、限定された枠内でのみ複製することができることを
意味するものと理解すべきである（Alberts et al., 細
胞の分子生物学：癌(Molecular Biology of the Cell:
Cancer) (1995) 第３版）。
【００３５】本発明のもう一つの態様は、トランスジェ
ニック、好ましくは胚幹細胞であって、本発明によるベ
クターおよび／またはそれから産生される核酸を含み、
例えばトランスジェニック動物、並びにトランスジェニ
ック動物自身であって、動物の幾つかのまたは総ての細
胞が本発明によるベクター、それから産生される核酸お
よび／または場合によっては、発現生成物または遺伝子
を含むものを産生することができるものである（ＷＯ９
０／０３４３２号明細書、ＷＯ９５／０６７１６号明細
書、ＥＰ ０ １６９ ６７２号明細書、ＤＥ １９６
３２ ５３２号明細書、ＷＯ９６／０３０３４号明細
書、ＷＯ９６／３２０８７号明細書、ＷＯ９８／１５６
２７号明細書を参照されたい）。
【００３６】本発明のもう一つの課題は、本発明による
ベクターの製造法であって、１個以上のスカフォールド
／マトリックス付着領域を少なくとも１個のＯＲＩと組
み合わせる方法でもある。最善の既知の製造法は、プラ
スミドまたは他の核酸からある領域を分離し、制限エン
ドヌクレアーゼ（制限酵素）によってベクター、プラス
ミドまたは他の核酸に挿入または連結することである。
【００３７】この方法の特定の形態は、元のベクターに
おける複製因子をコードする１個以上の核酸を少なくと
も１個のＳ／ＭＡＲ領域で置換することにある。これ
は、これらの領域を制限酵素によって切出し、Ｓ／ＭＡ
Ｒ断片を、当業者に知られている方法を用いてベクター
に挿入することによって行われる。
【００３８】この方法のもう一つの態様は、少なくとも
１個のＯＲＩおよび／または抗生物質耐性を伝達する遺
伝子を更に挿入することにある。ベクターに少なくとも
１個の、好ましくはペプチドまたはタンパク質をコード
するエフェクターを挿入することも必要であり、多くの
応用分野で用いられる。ここでは、既に記載した手法に
よって行われる。
【００３９】本発明によるベクターや細胞には多くの応
用があり、例えば物質、特に遺伝子導入のための特に薬
学活性化合物、の導入である。遺伝子導入は、例えば血
管および／または器官障害の診断または治療に用いられ
る。遺伝子治療は、ここでは特に重要である。この場合
に、ベクターに組み込まれる遺伝子は、標的細胞で、例
えば発現ベクターの作用によって発現される。これは、
特に薬学上および医学上関連したタンパク質をコードす
る遺伝子に当てはまる。特に、本発明によるエピソーム
的に複製ベクターは、治療に関して特に副作用なしで使
用することができ、特に好ましい用途は遺伝子治療にお
ける「シャトルベクター」としての使用である。「シャ
トルベクター」は、少なくとも２種類の細胞型、または
生物で増殖することができるベクター、例えば最初に原
核生物で増殖または複製した後、次に例えば真核細胞を
これらでトランスフェクションすることができるように
するベクターを意味するものと理解される。
【００４０】１個以上の遺伝子のイン・ビトロ発現も、
本発明によるベクターまたはその細胞の使用として同様
に重要である。例えば、ベクターは遺伝子の強力発現を
行うことができ、従ってタンパク質収率に悪影響を与
え、工程コストを増加させる選択圧力下に細胞を連続的
に置くことなく、真核および原核細胞の各種細胞および
細胞系でタンパク質およびペプチドを多量に製造するこ
とができる。ベクターを用いると、タンパク質またはペ
プチドをコードし、現在までは、特に感受性細胞系では
困難なしに発現させることができなかった遺伝子を発現
させることも可能である。
【００４１】本発明のもう一つの態様は、細胞のトラン
スフェクションのための本発明によるベクターの使用で
ある。トランスフェクションは、細胞中のベクターの封
入を意味するものと理解される。従って、一方では、遺
伝子治療に必要なトランスフェクション段階を意味する
と同時に、例えばベクターの増殖のための原核細胞の形
質転換をも意味する。
【００４２】あるいは、本発明によるベクターは、特に
真核細胞で使用しかつ研究目的で使用するのに適するの
で、これらのベクターは、トランスジェニック動物また
は幹細胞の産生のための本発明によるベクターの使用も
包含する。トランスジェニック動物は、細胞中に、本発
明によるベクターおよび場合によってはそれによって増
殖したエフェクターが存在するものを意味するものと理
解すべきである。トランスジェニック幹細胞は、本発明
によるベクターを用いてトランスフェクションし、例え
ばトランスジェニック動物を産生し、飼育することがで
きる細胞を意味するものと理解される。例は、ＷＯ９６
／０３０３４号明細書、ＷＯ９６／３２０８７号明細
書、ＷＯ９８／１５６２７号明細書、ＷＯ９０／０３４
３２号明細書、ＷＯ９５／０６７１６号明細書、ＥＰ
１６９ ６７２号明細書、およびＤＥ １９ ６３２
５３２号明細書に開示されている。
【００４３】この場合の本発明は、もう一つの課題とし
て本発明によるベクターを少なくとも１個および／また
はこのようなベクターを含む細胞、および適当な添加剤
および／または助剤を含む組成物も包含する。
【００４４】適当な添加剤および助剤は、特にアジュバ
ント、安定剤、および／またはトランスフェクション促
進物質を意味するものと理解される。また、本発明によ
るベクターと組合わせたまたは結合したトランスフェク
ションベクターを包含するトランスフェクション系、お
よびトランスフェクションあるいは形質転換を促進しま
たは行うことができる細胞中への浸透も包含される。助
剤は、特に、ＰＭＳＦのような一般的なプロテアーゼ阻
害剤、およびＥＤＴＡのようなヌクレアーゼ阻害剤を意
味するものとしても理解される。
【００４５】好ましいトランスフェクションベクター
は、例えばウイルスまたは非ウイルスベクターである。
トランスフェクションのため、他の非ウイルス性のトラ
ンスフェクション促進物質、例えば脂質、ポリマー、ペ
プチドまたはポルフィリン由来のものであり、ベクター
と組合わせたものを用いることもできる。
【００４６】遺伝子治療ベクターは、本発明によるベク
ターをリポソーム（中性またはカチオン性）と複合体形
成することによって得ることができる。従って、ベクタ
ーは本質的にリポソームに包含され、従って、トランス
フェクション効率が極めて高く（例えば、ＷＯ９５／２
７０７０号明細書を参照）、ＤＮＡアーゼから本質的に
保護されている。いわゆるＨＶＪリポソーム（ヴィロソ
ーム）の形態のセンダイウイルスを用いる核酸−リポソ
ーム複合体によるトランスフェクションは、この手段に
より、トランスフェクション速度を更に一層増加させる
ことができるので、特に好ましい。
【００４７】リポフェクションの際に、カチオン性脂質
から、リポソーム懸濁液の超音波処理によって小さな単
一層小胞を作成する。ベクターを、リポソームの表面に
イオン結合し、精確に例えば正の真電荷が残りかつベク
ター１００％がリポソームによって複合体形成されるよ
うな比率とする。Felgner et al.によって用いられる脂
質混合物ＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピ
ル−３−トリメチルアンモニウムブロミド）およびＤＯ
ＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）の
他に(Felgner , P.L. et al. (1987) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 84,7413-7414)、一方において、多数の新
規な脂質処方物を合成し、様々な細胞のトランスフェク
ションに対するそれらの効率について試験した。新規な
脂質処方物の例は、ＤＯＴＡＰまたはＤＯＧＳである。
ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコ
レステロールからのＤＮＡ−リポソーム複合体の調製の
一例と、センダイウイルスによる細胞壁のトランスフェ
クションにおけるそれらの良好な使用は、ＷＯ９５／２
７０７０号明細書に記載されている。
【００４８】ベクター−リポソーム複合体が、核酸結合
タンパク質、例えば染色体タンパク質、好ましくはＨＭ
Ｇタンパク質（高速移動群タンパク質）、特にＨＭＧ１
またはＨＭＧ２、またはヌクレオソームヒストン、例え
ばＨ２Ａ、Ｈ２ＢまたはＨ３またはＨ４を含むことが、
この手段によってベクターに組み込まれた遺伝子の発現
を増加することができるので特に有利である。染色体タ
ンパク質を、例えばコウシ胸腺またはラット肝臓から一
般に知られている方法によって単離することができ、ま
たは遺伝子光学によって調製することができる。ヒトＨ
ＭＧ１を、例えばヒトｃＤＮＡ配列を用いて当業者に知
られている方法によって特に容易に組換えによって調製
することができる(Wenn, L. et al. (1989) Nucleic Ac
ids Research 17(3), 1197-1214)。
【００４９】膜透過を増加させるヒスチジン含有ポリペ
プチドも、同様に用いることができる。所望なエフェク
ターを有する本発明によるベクター、組織特異的ペプチ
ドとＤＮＡ形成部分、例えば正に帯電したドメインとか
ら作成される融合タンパク質、および膜透過を増加させ
るペプチドを含んでなるいわゆるポリフェクション(pol
yfection)溶液を用いるのが好ましい。更に、例えば活
性化した脂質成分に導入したＣ−末端システインによる
ベクターのリポソームへのカップリングも知られてい
る。
【００５０】本発明のもう一つの課題は、少なくとも１
個のスカフォールド／マトリックス付着領域と少なくと
も１個のウイルス性または真核性ＯＲＩとを有する少な
くとも１個のエピソーム的に複製するベクター、および
／またはこれらのベクターを含有する１個以上の細胞
と、適当であれば、適当な添加剤および／または助剤を
含んでなる医薬または診断薬である（上記を参照された
い）。
【００５１】本発明のもう一つの態様は、例えばトラン
スフェクション系の形態での組成物であって、１個以上
のベクターおよび／またはこれらのベクターを含んでな
る細胞と、例えば細胞のトランスフェクションのための
他の物質とを含んでなる組成物にも関する。上記のポリ
フェクション溶液が、ここでは特に好ましい。
【００５２】下記の図および実施例は、本発明を更に詳
細に、発明を制限することなく説明しようとするもので
ある。
【００５３】図１は、典型的態様としてベクター上に存
在する略記した領域を有するベクターを示す。
【００５４】この特に好ましい態様では、下記の配列要
素が見出だされている：真核生物での増殖のためのＳＶ
４０ ＯＲＩ（１３５塩基対）、E. coliおよび真核生
物（カナマイシンまたはゲネチシンに耐性を伝達）での
選択のためのカナマイシン耐性遺伝子（１３９９塩基
対）、E. coliでの増殖のためのｐＵＣ−プラスミドＯ
ＲＩ（６４３塩基対）、および真核生物での増殖のため
のマトリックス付着領域（ヒトインターフェロンβ遺伝
子の５′領域から；１９８４塩基対）。
【００５５】特にＳＶ４０ ＯＲＩを有するマトリック
ス付着領域の強力によるこれらの要素と、例えばエフェ
クター要素と相互作用すると、トランスフェクションを
カナマイシン耐性遺伝子によってチェックすることがで
き、かつｐＵＣ−ＯＲＩを介して原核生物で増殖し、従
って適量で調製することができるエピソーム的に複製す
るベクターが生じる。
【００５６】図２は、例１および２に準じて用いられ、
Clontech社によって供給されかつ実施例および好ましい
製造法で用いられたｐＧＦＰ−Ｃ１ベクターを示す。
【００５７】図３は、本発明でｐＥＰＩ−１と呼ばれる
本発明によるベクターの特定の態様を示し、これを用い
て、幾つかの実施例を行った。
【００５８】例１によれば、Ｓ／ＭＡＲを、本発明にお
いて、図２に記載のベクターに組込み、本発明によるベ
クターが生じるようにした。これは、（Ｓ／）ＭＡＲ、
図４に記載のインターフェロンβ遺伝子の５′領域由来
のプラスミドｐＴＺ−Ｅ２０の２．０ｋｂのＥｃｏＲＩ
／ＢｇｌＩＩ断片、ＳＶ４０ ＯＲＩ、ｐＵＣ ＯＲ
Ｉ、結合したＨＳＶ ＴＫポリＡとプロモーターｐ
ａｍｐを有する耐性遺伝子Ｋａｎ／Ｎｅｏ、「エンハン
サー」ｐＣＭＶ、「ＳＶ４０初期プロモーター」ｐＳ４
０、およびＧＦＰ／グリーン蛍光タンパク質を含む。例
１〜５の結果も、適当なベクターを用いて得られた。
【００５９】図４は、プラスミドｐＴＺ−Ｅ２０を示
す。
【００６０】
【実施例】例１ 好ましいエピソーム的に複製するベクターの調製 ヒトインターフェロンβ遺伝子の５′領域からのＳ／Ｍ
ＡＲ断片を、プラスミドＰＴＺ−Ｅ２０（Bode, J. et
al., 上記引用）から２．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ｂｇｌ
ＩＩ断片として単離し、ポリリンカーＰＧＦＰ−Ｃ１に
挿入した（図２を参照されたい）。この方法によって、
ｐＥＰＩ−１と呼ばれる本発明によるベクターを得た。
もう一つの実験では、ＳＶ４０「ラージＴ抗原」をコー
ドする遺伝子を別のウイルス／プラスミドベクターから
切出し、Ｓ／ＭＡＲによって置換し、このようにして本
発明によるベクターも得た。
【００６１】例２ 真核および原核細胞のトランスフェクションおよび選択 チャイニーズ・ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞を、１
０％ＦＣＳ、アンホテリシンＢ２．５μｌ／ｍｌおよび
ゲンタマイシン５０μｌ／ｍｌを含むハムＦ１２培地で
培養した。３×１０６個のＣＨＯ細胞を電気穿孔し、例
１に準じて調製したベクターｐＥＰＩ−１（図３）、ま
たはｐＧＦＰ−Ｃ１（図２）５μｇと共にインキュベー
ションした。電気穿孔から１日後に、トランスフェクシ
ョンした細胞をＧ４１８ ５００μｇ／ｍｌによって選
択したとコロイド、トランスフェクションした細胞はそ
れ抗生物質耐性により生き残った。２週間後、安定なク
ローンを単離して、Ｇ４１８ ２５０μｇ／ｍｌと共に
培養した。同様な手続きを、E. coli細胞で用いた。
【００６２】例３ 再トランスフェクション 例２に準じてトランスフェクションしたＣＨＯ細胞から
得たＨＩＲＴ抽出物(Hirt, B. (1967) J. Mol. Biol.,
26, 365-369)を用いて、例２の手続きに準じて新たなＣ
ＨＯ細胞をトランスフェクションした。
【００６３】例４ 例１〜３に準じた細胞の検討の結果 ＤＮＡの単離、制限酵素による消化、標識したｐＥＰＩ
−１プローブを用いるブロッティングおよびハイブリダ
イゼーション実験の後、ベクターのランダム組込みは、
例２および精確にクローンのいずれにも起こらないこと
が明らかとなった。本発明によるベクター、この場合に
はｐＥＰＩ−１は、染色体ＤＮＡとハイブリダイゼーシ
ョンを全く示さなかったが、例２および例３に記載の細
胞から得たＨＩＲＴ抽出物は、本発明によるベクターと
同一の制限パターンを有する単離ＤＮＡを示した。単離
したエピソームＤＮＡのＣＨＯ細胞での形質転換によ
り、ベクターを検出することが可能であり（例３を参照
されたい）、E. coli細胞出も同様であった。これは、
別の型のＡＴが高い配列を有する高度に増幅されたベク
ターでは、頭と尾の組込みが起こるという従来の技術で
知られている結果と矛盾している(Wegner et al. (198
9) Nucleic Acids Research 17, 9909-9932)。しかしな
がら、相当するＯＲＩのみまたはＳ／ＭＡＲのみを有す
るベクターは、宿主のゲノムにランダムに組込まれる
（Klehr et al. (1992) Biochemistry, 31, 3222-322
9、およびSchubeler et al. (1996) Biochemistry, 35,
11160-11169）。従って、ＯＲＩのみを有するベクター
の組込みは起こらないので、ＣＨＯ細胞はＴ抗原を発現
しないことも付随的に明らかになった。更に、サザンブ
ロット分析の結果も、本発明によるベクターが効率的か
つ安定に染色体外で複製し、従ってそれらはエピソーム
ベクターであり、約２０コピーのベクターがそれぞれの
クローンに存在することを示していた。
【００６４】例５ 安定性および発現の検討 ネオマイシン耐性遺伝子のプラスミド安定性および発現
を検討するため、例２に記載のトランスフェクションし
たＣＨＯ細胞を、Ｇ４１８を添加せず、従って抗生物質
による選択圧力がないことを除き、例２に記載の培地で
２か月以上（少なくとも１００世代）培養した。
【００６５】全培養期間中の様々な時間に、培養したＧ
４１８細胞の幾らかを培地に加えたところ、ごく僅かな
数だけがそれぞれの場合に死滅した。サザンブロット分
析によって、任意の時間にエピソームベクターを別個に
検出することも可能であった。
【００６６】しかしながら、これから、一方では、ベク
ターは少なくとも１００世代に亙り選択なしでもＣＨＯ
細胞中で安定であり、他方、カナマイシン耐性、従って
エフェクターの形態でのベクターに挿入された核酸配列
はそれぞれの世代に発現されると、結論することができ
る。
【００６７】例６ ヒト細胞におけるベクターの増殖 ＨａＣａｔ細胞（ヒト皮膚ケラチノサイト）を、１０％
ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（ダルベッコの改良イーグル培
地）で培養した。ＨａＣａｔ細胞を、（例２に記載した
のと同一方法および同一条件下で）例１に準じて調製し
たベクターｐＥＰＩ−１でトランスフェクションし、選
択した。選択の開始から４週間後に、安定なクローンを
単離し、Ｇ４１８ ２５０μｇ／ｍｌと共に培養した。
【００６８】例７ 例６に記載の細胞の検討の結果 例６に記載の６個のクローンのＤＮＡを単離した。例４
に記載したサザンブロット分析を行い、更に行った実験
で、全ベクターをＰＣＲによって増幅した。反対向きの
２個のプライマーをＮｅｏ遺伝子から選択したところ
（ｎｅｏ−ｆｗｄおよびｎｅｏ−ｕｐ）、環状分子だけ
が増幅された。いずれの実験も、本発明によるベクター
は効率的および安定に染色体外で複製され、従ってそれ
らはエピソームベクターであり、約２０コピーのベクタ
ーがそれぞれのクローンに含まれることを示していた。
ネオマイシン−カセットは、効率的に発現した。
【００６９】これらの結果は、本発明によるベクターは
増殖させることができ、ヒト細胞でもエピソーム的に発
現することを示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】典型的態様としてベクター上に存在する略記し
た領域を有するベクターを示す。
【図２】ｐＧＦＰ−Ｃ１ベクターを示す。
【図３】ｐＥＰＩ−１と呼ばれる、本発明によるベクタ
ーの特定の態様を示す。
【図４】プラスミドｐＴＺ−Ｅ２０を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 5/00 Ｂ (72)発明者 ユルゲン、ボーデ ドイツ連邦共和国ブラウンシュベイグ、マ ッシェーローダ、ベーク、１ (72)発明者 クリスティアーン、フェツァー ドイツ連邦共和国ミュンヘン、フレミング シュトラーセ、47 (72)発明者 ハンス‐ヨアヒム、リップス ドイツ連邦共和国ビッテン、シュトックマ ー、シュトラーセ、10 (72)発明者 クリストフ、ピーヒャツェック ドイツ連邦共和国ミュンスター、ダルムシ ュテッター、シュトラーセ、54

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも１個のスカフォールド／マトリ
    ックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）を含み、少なくとも１個
    のウイルスまたは真核性の複製起源（ＯＲＩ）を含むこ
    とを特徴とする、エピソーム的に複製するベクター。
  2. 【請求項２】ベクターが発現ベクターである、請求項１
    に記載のベクター。
  3. 【請求項３】トランスに作用する複製因子をコードする
    核酸を含まない、請求項１または２に記載のベクター。
  4. 【請求項４】複製因子をコードする核酸を含まない、請
    求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
  5. 【請求項５】複製因子がウイルス起源のものである、請
    求項３または４に記載のベクター。
  6. 【請求項６】ウイルスタンパク質をコードする核酸を含
    まない、請求項１〜５のいずれか一項に記載のベクタ
    ー。
  7. 【請求項７】ＯＲＩを真核生物での増殖に用いる、請求
    項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
  8. 【請求項８】ＯＲＩがＥＢＶ ＯＲＩ、ＢＰＶ ＯＲＩ
    またはＳＶ４０ ＯＲＩのようなウイルスＯＲＩからな
    る群から選択される、請求項７に記載のベクター。
  9. 【請求項９】ＯＲＩを原核生物での増殖に用いる、請求
    項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
  10. 【請求項１０】ＯＲＩがｐＵＣ ＯＲＩである、請求項
    ９に記載のベクター。
  11. 【請求項１１】真核生物での増殖および原核生物での増
    殖のための１個以上のＯＲＩ、好ましくは真核生物での
    増殖のための少なくとも１個のＯＲＩと原核生物での増
    殖のための少なくとも１個のＯＲＩを含む、請求項１〜
    １０のいずれか一項に記載のベクター。
  12. 【請求項１２】Ｓ／ＭＡＲが哺乳動物に由来し、好まし
    くはヒト起源のものである、請求項１〜１１のいずれか
    一項に記載のベクター。
  13. 【請求項１３】Ｓ／ＭＡＲが、インターフェロンβ遺伝
    子の５′領域に由来し、特に図４に記載のプラスミドｐ
    ＴＺ−Ｅ２０の２．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断
    片である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のベク
    ター。
  14. 【請求項１４】抗生物質耐性を媒介する１個以上の遺伝
    子をも含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のベ
    クター。
  15. 【請求項１５】上記の１個以上の遺伝子が、カナマイシ
    ン、ゲネチシン、ゲンタマイシン、アンピシリン、テト
    ラサイクリン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシ
    ン、ナリジクス酸、リファンピシン、クロラムフェニコ
    ール、および／またはゼオシンから選択された抗生物質
    に対する耐性を媒介する、請求項１４に記載のベクタ
    ー。
  16. 【請求項１６】１個以上のプロモーターまたはアクチベ
    ーター配列および／または１個以上のエフェクターを含
    む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のベクター。
  17. 【請求項１７】プロモーターまたはアクチベーターが、
    構成的、細胞周期特異的、組織特異的、代謝調節され
    た、および／または誘導的プロモーターまたはアクチベ
    ーターから選択される、請求項１６に記載のベクター。
  18. 【請求項１８】エフェクターが、タンパク質、ペプチ
    ド、リボザイム、またはアンチセンスＲＮＡから選択さ
    れるある種の物質をコードするか、またはアンチセンス
    ＤＮＡである、請求項１６に記載のベクター。
  19. 【請求項１９】１種類以上のアミノ酸をコードする１種
    類以上の核酸を含み、好ましくは一酸化窒素シンター
    ゼ、インシュリン、エリトロポエチン、血液凝固因子、
    インターフェロン、サイトカイン、ホルモン、または成
    長因子をコードする核酸から選択される、請求項１〜１
    ８のいずれか一項に記載のベクター。
  20. 【請求項２０】請求項１〜１９のいずれか一項に記載の
    ベクターを含んでなる細胞。
  21. 【請求項２１】細胞が真核または原核細胞、特に細菌、
    酵母、昆虫、両生類、魚類または哺乳類の細胞である、
    請求項２０に記載の細胞。
  22. 【請求項２２】細胞がヒト起源の非不死化細胞である、
    請求項２１に記載の細胞。
  23. 【請求項２３】１種類以上のＳ／ＭＡＲを少なくとも１
    個のＯＲＩと組み合わせることを含んでなる、請求項１
    〜１９のいずれか一項に記載のベクターの製造法。
  24. 【請求項２４】ベクター中の複製因子をコードする核酸
    の１種類以上を少なくとも１個のＳ／ＭＡＲで置換する
    ことを含んでなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記
    載のベクターの製造法。
  25. 【請求項２５】少なくとも１種類のＯＲＩおよび／また
    は抗生物質耐性を媒介する遺伝子をベクターに挿入す
    る、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】少なくとも１種類のエフェクターであっ
    て、好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードする
    エフェクターをベクターに挿入する、請求項２３〜２５
    のいずれか一項に記載の方法。
  27. 【請求項２７】請求項１〜１９のいずれか一項に記載の
    ベクター、または請求項２０〜２２のいずれか一項に記
    載の細胞の、遺伝子治療における使用。
  28. 【請求項２８】１個以上の遺伝子のイン・ビトロでの発
    現のための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のベ
    クター、または請求項２０〜２２のいずれか一項に記載
    の細胞の使用。
  29. 【請求項２９】細胞のトランスフェクションのための請
    求項１〜１９のいずれか一項に記載のベクターの使用。
  30. 【請求項３０】請求項１〜１９のいずれか一項に記載の
    少なくとも１個のベクターおよび／または請求項２０〜
    ２２のいずれか一項に記載の細胞、および少なくとも１
    個の適当な添加剤を含んでなる、組成物。
  31. 【請求項３１】組成物が、ベクターに結合したまたはと
    組み合わされたトランスフェクション系を含む、請求項
    ３０に記載の組成物。
  32. 【請求項３２】トランスフェクション系がウイルスまた
    は非ウイルスベクターである、請求項３１に記載の組成
    物。
  33. 【請求項３３】トランスフェクション系が、脂質、ポリ
    マー、ペプチド、またはポルフィリンから選択される、
    請求項３２に記載の組成物。
  34. 【請求項３４】少なくとも１個のＳ／ＭＡＲと少なくと
    も１個のウイルス性または真核性ＯＲＩとを有する少な
    くとも１個のエピソーム的に複製するベクター、および
    ／またはこのまたはこれらのベクターを含んでなる１個
    以上の細胞と、適当であれば、適当な添加剤および／ま
    たは助剤を含んでなる、医薬。
  35. 【請求項３５】少なくとも１個のＳ／ＭＡＲと少なくと
    も１個のウイルス性または真核性ＯＲＩとを有する少な
    くとも１個のエピソーム的に複製するベクター、および
    ／またはこのまたはこれらのベクターを含んでなる１個
    以上の細胞と、適当であれば、適当な添加剤および／ま
    たは助剤を含んでなる、診断薬。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010501170A (ja) * 2006-08-23 2010-01-21 セレキス エスアー 転写を増大させるためのマトリックス付着領域（ｍａｒ）およびその使用
WO2010110340A1 (ja) * 2009-03-27 2010-09-30 国立大学法人広島大学 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を増幅し高発現させる方法、および当該方法を実施するために用いられるキット
US8685645B2 (en) 2010-03-31 2014-04-01 Kabushiki Kaisha Toshiba Screening method and vector, vector library, and assay kit used therefor

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100529281B1 (ko) * 2000-12-15 2005-11-17 주식회사 팬젠 인터페론 베타 ｍａｒ 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터
JP4307079B2 (ja) * 2001-01-26 2009-08-05 セレキス エスアー マトリックス付着領域およびその使用方法
DE10109780A1 (de) * 2001-02-28 2002-09-05 Cardion Ag Episomale Vektoren enthaltend Matrix-Anheftungsregionen zur zellspezifischen Genexpression
WO2004018506A2 (en) * 2002-08-22 2004-03-04 Cytos Biotechnology Ag Inducible alphaviral/orip based gene expression system
US6933136B2 (en) 2002-09-20 2005-08-23 Novo Nordisk A/S Method for making recombinant proteins
WO2004027072A2 (en) * 2002-09-20 2004-04-01 Novo Nordisk A/S Method for making recombinant proteins
EP1644508A1 (en) * 2003-07-11 2006-04-12 Cytos Biotechnology AG Gene expression system
RU2375450C2 (ru) 2003-10-24 2009-12-10 Селексис С.А. Днк, повышающая продуцирование белка, и ее применение
JP2009511010A (ja) * 2005-10-05 2009-03-19 ユニヴァーシタ デグリ ストゥディ ディ ミラノ−ビコッカ エピソーマルベクターを動物細胞へ伝達するための方法
AU2007352618B2 (en) 2007-05-02 2013-07-18 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. DNA plasmids having improved expression and stability
DE102007022274A1 (de) * 2007-05-09 2008-11-20 Jacobs University Bremen Ggmbh Verfahren und Reagenzien zur Untersuchung von Nukleinsäure-Methylierungsreaktionen
BR112013025099B1 (pt) * 2011-03-30 2021-08-10 Pangen Biotech Inc. Vetor de expressão para células animais
CN102229958B (zh) * 2011-05-18 2015-11-04 新乡医学院 一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用
JP5863338B2 (ja) 2011-08-25 2016-02-16 株式会社東芝 プラスミド型ベクター、遺伝子プロモーター活性の検出方法、及びアッセイキット
WO2013134015A2 (en) * 2012-03-05 2013-09-12 Wake Forest University Health Sciences Non-viral episomal suicide construct
US10927384B2 (en) 2014-04-09 2021-02-23 Dna Twopointo Inc. DNA vectors, transposons and transposases for eukaryotic genome modification
HUE056009T2 (hu) 2015-10-08 2022-01-28 Dna Twopointo Inc DNS vektorok, transzpozonok és transzpozázok eukarióta genom módosítására
DK3456821T4 (da) * 2017-09-19 2024-04-15 Deutsches Krebsforsch Ikke-integrerende dna-vektorer til genetisk modifikation af celler
WO2019057774A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 Deutsches Krebsforschungszentrum NON-INTEGRATING DNA VECTORS FOR THE GENETIC MODIFICATION OF CELLS
EP3942035A1 (en) 2019-03-18 2022-01-26 Deutsches Krebsforschungszentrum Expression constructs for the genetic modification of cells
CN116209767A (zh) 2020-07-22 2023-06-02 德国癌症研究中心 5’s/mar应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7353494A (en) * 1993-11-12 1995-05-29 Case Western Reserve University Episomal expression vector for human gene therapy
US5888774A (en) * 1994-12-19 1999-03-30 Cangene Corporation Recombinant DNA molecules and expression vectors for erythropoietin
WO1997046687A1 (en) * 1996-06-06 1997-12-11 Novartis Ag Vectors comprising sar elements
US6030956A (en) * 1996-10-24 2000-02-29 Boulikas; Teni Combination gene therapy for human cancers
AU734189B2 (en) * 1996-12-16 2001-06-07 Mcgill University Human and mammalian DNA replication origin consensus sequences
US6245974B1 (en) * 1997-08-06 2001-06-12 North Carolina State University Matrix attachment regions

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010501170A (ja) * 2006-08-23 2010-01-21 セレキス エスアー 転写を増大させるためのマトリックス付着領域（ｍａｒ）およびその使用
WO2010110340A1 (ja) * 2009-03-27 2010-09-30 国立大学法人広島大学 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を増幅し高発現させる方法、および当該方法を実施するために用いられるキット
JP5688771B2 (ja) * 2009-03-27 2015-03-25 国立大学法人広島大学 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を増幅し高発現させる方法、および当該方法を実施するために用いられるキット
US8685645B2 (en) 2010-03-31 2014-04-01 Kabushiki Kaisha Toshiba Screening method and vector, vector library, and assay kit used therefor

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