-
Die
Erfindung betrifft das Gebiet des Screenings nach und der Bewertung
von Inhibitoren eukaryontischer Nukleinsäure-Methylierungsreaktionen, sowie
dabei nützliche Reporterplasmide und Methylierungsinhibitor-Standards.
-
Nukleinsäuremethylierung
und insbesondere DNA-Methylierung wird in Euykaryonten, insbesondere
in Säugerzellen und insbesondere bei Menschen, durch die
DNA-Methyltransferasen Dnmt1 (NCBI-Accession numbers: P26358, AAH92517, AAI26228,
NP_001370), Dnmt3a (NCBI-Accession numbers: AAH18214, AAH23612,
Q9Y6K1 NP_715640, NP_783329, NP_783328, NP_072046, AAH51864, AAY14761,
AAH43617, AAH32392, AAL57039, AAD33084) und Dnmt3b (NCBI-Accession
numbers: CAB53071, CAB53069, CAB53070, Q9UBC3, NP_787046, NP_787045,
NP_787044, NP_008823, ABC48951, AAL57040, AAF04015, AAD53063, AAD53062,
AAD31434, AAD31433, AAD31432) bewirkt. Diese Methyltransferasen übertragen
eine Methylgruppe von Koenzym S-Adenosyl-L-Methionin („AdoMet")
auf zu methylierende Nukleinsäu ren, insbesondere DNA („Ziel-DNA").
Bei zahlreichen Krankheiten wird eine Änderung des DNA-Methylierungsmusters
genomischer DNA gegenüber dem üblichen Methylierungsmuster
genomischer DNA beobachtet. Eine solche aberrante DNA-Methylierung
gilt als ein Auslöser oder Förderer des Entstehens
und/oder der Progression insbesondere von Tumorerkrankungen. Es
ist deshalb häufig versucht worden, DNA-Methylierungsinhibitoren
zu entwickeln, um diese als Arzneimittel zum Vorbeugen oder Behandeln
aberranter DNA-Methylierungen verwenden zu können.
-
Bekannte
DNA-Methylierungsinhibitoren wie Sinefungin beruhen auf dem Prinzip,
an die Koenzym-Bindungsstelle der jeweiligen DNA-Methyltransferase
zu binden und diese so am Binden an das Koenzym AdoMet zu hindern.
Allerdings binden diese DNA-Methylierungsinhibitoren auch an die
Koenzym-Bindungsstellen anderer Enzyme, die AdoMet als Koenzym benötigen.
Durch diese Kreuzreaktivität verursachen diese DNA-Methylierungsinhibitoren zahlreiche
Nebenwirkungen.
-
Ferner
werden Nucleotidanaloga wie Zebularin und Decitabin zum Verringern
der DNA-Methylierung verwendet. Die Nucleotidanaloga bewirken, sobald
sie in eine DNA eingebaut sind, eine kovalente Bindung der DNA-Methyltransferasen
an die DNA. Dadurch wird der zelluläre Vorrat an verfügbaren DNA-Methyltransferasen
verringert. Nachteiligerweise kommt es dabei auch zu erheblichen
DNA-Schädigungen und zu einer sehr hohen DNA-Reparaturaktivität.
-
Es
besteht deshalb ein Bedarf, weitere Nukleinsäure-Methylierungsinhibitoren
zu finden, die nach Möglichkeit die oben beschriebenen
Nachteile herkömmlicher DNA-Methylierungsinhibitoren nicht aufweisen
sollen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren
und insbesondere ein zum Screening geeignetes Verfahren zum Bestimmen
der Inhibierungswirkung eines Inhibitors auf eine eukaryontische
Nukleinsäure-Methylierungsreaktion bereitzustellen.
-
Die
Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Bestimmen der
Inhibierungswirkung eines Inhibitors auf eine eukaryontische Nukleinsäure-Methylierungsreaktion,
umfassend die Schritte:
- 1. Bereitstellen eines
Methylierungsansatzes enthaltend
(a) die für die Durchführung
der Nukleinsäure-Methylierungsreaktion benötigten
Komponenten,
(b) eine Reporternukleinsäure mit vorgewähltem Methylierungsgrad,
wobei die Reporternukleinsäure
– einen Abschnitt
für eine episomale Replikation der Reporternukleinsäure
und
– ein in Abhängigkeit vom Methylierungsgrad
der Reporternukleinsäure exprimiertes Reportergen umfasst,
und
(c) den zu untersuchenden Inhibitor;
- 2. Durchführen der Methylierungsreaktion im Methylierungsansatz;
- 3. Bestimmen der Expression des Reportergens in Anwesenheit
des zu untersuchenden Inhibitors; und
- 4. Vergleichen der in Schritt 3 bestimmten Expression des Reportergens
mit der Expression des Reportergens bei einem vorgewählten
Inhibierungsgrad zum Bestimmen der Inhibierungswirkung des zu untersuchenden
Inhibitors auf die Nukleinsäure-Methylierungsreaktion.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es auf vorteilhaft
einfache Weise, unter standardisierbaren Bedingungen die Inhibierungswirkung
eines (vermuteten) Inhibitors einer eukaryontischen Nukleinsäure-Methylierungsreaktion
zu bestimmen. Das Verfahren eignet sich besonders als Teil eines
Screening-Verfahrens zum Suchen eines Nukleinsäuremethylierungs-Inhibitors.
Besonders zweckmäßig ist es dabei, zumindest den
Schritt 3 in einem Hochdurchsatz-Ansatz durchzuführen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich aufgrund
seiner Stan dardisierbarkeit und Einfachheit besonders gut für
den Einsatz in Hochdurchsatz-Ansätzen, dazu unten mehr.
-
Wesentlich
für das erfindungsgemäße Verfahren ist
der Aufbau der dabei verwendeten Reporternukleinsäure.
Diese enthält einen Abschnitt für eine episomale
Replikation der Reporternukleinsäure. Die Reporternukleinsäure
kann deshalb in einer eukaryontischen und insbesondere einer Säuger-Zellline
vermehrt werden, ohne dazu in das Genom integrieren zu müssen.
Zweckmäßigerweise ist die Reporternukleinsäure
unabhängig von viralen trans-komplementierenden Proteinen
in der Zelllinie replizierbar. Die Reporternukleinsäure
ist dann in einer Vielzahl an Zelllinien replizierbar, ohne dass
die Zelllinien zuvor mit zur Replikation benötigten viralen Genen
für trans-komplementierende Faktoren transformiert worden
sein müssten. Insbesondere vermeidet die erfindungsgemäße
Reporternukleinsäure eine Beschränkung des erfindungsgemäßen
Verfahren auf COS7-Zellen und das SV40 Large Transforming Antigen
System. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dementsprechend
durchführbar in einer -bis auf die Reporternukleinsäure – unveränderten Zelllinie.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher besonders
geeignet, Artefakte zu umgehen, die durch die Expression trans-komplementierender
Proteine hervorgerufen werden können.
-
Besonders
bevorzugt sind solche episomal replizierbaren Reporternukleinsäuren,
die einen Kerngerüst-/Matrix-Anhaftungsbereich („nuclear scaffold/matrix
attachment region", S/MAR) umfassen. Ein solcher Bereich ist eingerichtet
zum Binden an das Chromatingerüst eines eukaryontischen
Zellkerns und vorzugsweise eines Säugetierzellen-Kerns.
Derartige Reporternukleinsäuren erlauben vorteilhafterweise
die Untersuchung der Nukleinsäure-Methylierungsinhibierung
in Säugetierzellen und vorzugsweise in menschlichen Zellen.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren, das auf diese
Reporternukleinsäuren zurückgreift, ist deshalb
besonders vorteilhaft eingerichtet, geeignete Nukleinsäure-Methylierungsinhibitoren
insbesondere zur Behandlung aberranter DNA-Methylierungsmuster in
Säugerzellen und insbesondere in menschlichen Zellen zu
finden. Das erfindungsgemäße Verfahren unterstützt daher
insbesondere die Entwicklung von Arzneimitteln zur Vorbeugung oder
Behandlung von Tumorerkrankungen.
-
Die
Reporternukleinsäure kann darüber hinaus noch
Gene für in prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zellen
wirksame Antibiotikaresistenzen umfassen. Dies ermöglicht
es, das Vorhandensein der Reporternukleinsäure in einer
pro- bzw. eukaryontischen Zelle unabhängig von der Expression
des Reportergens zu überprüfen.
-
Die
in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte
Reporternukleinsäure umfasst zudem ein in Abhängigkeit
vom Methylierungsgrad der Die in einem erfindungsgemäßen
Verfahren eingesetzte Reporternukleinsäure umfasst zudem
ein in Abhängigkeit vom Methylierungsgrad der Reporternukleinsäure
exprimiertes Reportergen, vorzugsweise ein Gen für ein
fluoreszierendes oder lumineszierendes Protein, insbesondere Green
Fluorescent Protein (GFP, EMBL Accession Nr.: gi|1277124 und gb|AAC53684.1),
verbessertes GFP (enhanced green fluorescent Protein, eEFP, EMBL
Accession Nr.: gi|1377914 und gb|U55763.1|), Red Fluorescent Protein
(RFP, EMBL Accession Nr.: gi|21464837 und gb|AF506027.1), Luciferase
(EMBL Accession Nr.: gi|2582510, gb|AAB82573.1, gi|1469268 und emb|CAA59282.1.
Die Produkte dieser Reportergene sind entweder ohne weiteres bereits
anhand ihrer Fluoreszenz nachweisbar, oder sie erzeugen ein in Säugetierzellen üblicherweise
nicht vorkommendes Lumineszenzsignal. In beiden Fällen
ist das dem Produkt des jeweiligen Reportergens zugehörige
Signal (Fluoreszenz oder Lumineszenz) charakteristisch für das
Reportergen, so dass Fehlsignale durch andere Zellbestandteile ausgeschlossen
werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht so ein weitgehend fehlerfreies Bestimmen des
Methylierungsgrades der Reporternukleinsäure.
-
Das
Reportergen steht vorzugsweise unter der Kontrolle eines vom Methylierungsgrad
der Reporternukleinsäure abhängigen Promotors,
der die Expression des Reportergens im methylierten Zustand der
Reporternukleinsäure unterdrückt und im demethylierten
Zustand ermöglicht, vorzugsweise eines Cytomegalovirus
Immediate Early-Promotors.
-
Zweckmäßigerweise
enthält eine erfindungsgemäße Reporternukleinsäure
ferner einen in Prokaryonten wirksamen Replikations-Startbereich
(„origin of replication"). Die erfindungsgemäße
Reporternukleinsäure kann daher vorteilhafterweise auch
in prokaryontischen Zellen vermehrt und mit üblichen Verfahren
geerntet und für die Transfektion eukaryontischer Zellen
aufbereitet werden.
-
Vorzugsweise
wird die Methylierungsreaktion im erfindungsgemäßen
Verfahren in einer Zelllinie durchgeführt. Dazu wird üblicherweise
die Zelllinie mit der Reporternukleinsäure transformiert
und anschließend in der Zelllinie vervielfältigt,
vorzugsweise durch episomale Replikation. Dabei wird die Reporternukleinsäure
unter der Einwirkung von Methyltransferasen der Zelllinie gegebenenfalls
methyliert. Besonders bevorzugt ist es, die Zelllinie mit einer
methylierten Reporternukleinsäure zu transformieren. Bei
der episomalen Replikation der Reporternukleinsäure werden
auch die Replikationsprodukte methyliert. Die Wirkung eines Nukleinsäure-Methylierungsinhibitors
kann dann dadurch nachgewiesern werden, dass die Replikationsprodukte
der Reporternukleinsäure nicht mehr oder nicht mehr vollständig
methyliert sind. Insbesondere bei Verwendung bevorzugter Reporternukleinsäuren,
deren Reportergen unter der Kontrolle eines im methylierten Zustand
reprimierten Promotors steht, kann die Wirkung eines Methylierungs-Inhibitors
nachgewiesen werden durch den Nachweis des Reportergen-Produktes. Dieser
Nachweis ist insbesondere bei fluoreszenten oder lumineszenten Reportergen-Produkten
sehr einfach und reproduzierbar möglich, so dass ein entsprechendes
erfindungsgemäßes Verfahren in einem Hochdurchsatz-Ansaz
durchgeführt werden kann.
-
Der
Methylierungsansatz, insbesondere die mit der Reporternukleinsäure
transformierte Zelllinie, umfasst vorzugsweise ferner eine Kontrollnukleinsäure,
die ein unabhängig vom Methylierungsgrad der Kontrollnukleinsäure
exprimierbares Kontroll-Reportergen umfasst. In einem solchen Methylierungsansatz
kann neben dem Überprüfen der Wirkung eines Nukleinsäuremethylierungs-Inhibitors
auch die Lebensfähigkeit („viability") der jeweils
zu untersuchenden Zelle der Zelllinie überprüft
werden. Auf diese Weise kann verhindert werden, dass das wegen fehlender
Lebensfähigkeit der jeweiligen Zelle auftretende Fehlen
der Expression des Reportergens irrtümlich als Zeichen
für das Vorliegen einer Nukleinsäure-Methylierung
gewertet wird. Zweckmäßigerweise werden nur solche
Zellen der Zelllinie in Schritt 4 des erfindungsgemäßen
Verfahren berücksichtigt, die das Kontroll-Reportergen
exprimieren. Dabei ist es sinnvoll, wenn das Kontroll-Reportergen
für ein vom Reportergen verschiedenes fluoreszentes oder lumineszentes
Genprodukt codiert.
-
In
einem Hochdurchsatz-Ansatz werden die mit der Reporternukleinsäure
und vorzugsweise auch mit der Kontrollnukleinsäure transformierten Zellen
der Zelllinie auf die Expression des Reportergens und vorzugsweise
auch des Kontroll-Reportergens untersucht. Dabei ist es zweckmäßig,
die transformierten Zellen der Zelllinie in einzelnen Mikrotitergefäßen
vorzulegen, darin zu vermehren und dabei mit dem zu untersuchenden
Inhibitor zu beaufschlagen. Das Beaufschlagen kann auf beliebige
Weise erfolgen, beispielsweise durch Zugeben des Inhibitors oder
durch Induzieren der Expression eines Inhibitor-Gens. Die Zellen
der Zelllinie werden nach oder unter fortgesetztem Beaufschlagen
mit dem Inhibitor vermehrt, wobei die Reporternukleinsäure
und, soweit vorhanden, die Kontrollnukleinsäure ebenfalls vermehrt
werden. Dabei wird die Reporternukleinsäure je nach Wirksamkeit
des Inhibitors methyliert, wenn der Inhibitor in der jeweils vorliegenden
Konzentration keine oder nur eine geringe Wirkung hat, oder nicht
oder weniger stark methyliert, wenn der Inhibitor in der jeweils
vorliegenden Konzentration eine die Nukleinsäuremethylierung
inhibierende Wirkung besitzt. Ferner wird die Expression des Reportergens und
ggf. des Kontroll-Reportergens bestimmt, vorzugsweise durch Bestimmen
der Fluoreszenzintensität auf der Wellenlänge
des Genproduktes des Reportergens und ggf. des Kontroll-Reportergens. Durch
Vergleichen der bestimmten Expression des Reportergens, wobei gegebenenfalls
nur solche Zellen berücksichtigt werden, die das Kontroll-Reportergen
exprimieren, mit der Expression des Reportergens bei einem vorgewählten
Inhibierungsgrad kann die Inhibierungswirkung des zu untersuchenden
Inhibitors auf die Nukleinsäure-Methylierungsreaktion auf
einfache und reproduzierbare Weise bestimmt werden.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird in Schritt 4 die Expression des Reportergens in
Anwesenheit des zu untersuchenden Inhibitors vergleichen mit einer
Expression des Reportergens in Anwesenheit einer vorgewählten
Konzentration eines Standard-Methylierungsinhibitors, der ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus 5'-Azacytidin und einem Peptid
von bis zu 17 Aminosäuren Länge, enthaltend eine
Aminosäure-Sequenz gemäß 7,
wobei „x" phosphoryliertes Serin bedeutet, und besonders
bevorzugt die Aminosäure-Sequenz EKIY(I oder M)SKI(V oder L)(V
oder I)E, wobei die Buchstaben einzelne Aminosäuren gemäß IUPAC (http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/)
bezeichnen. Dabei bedeutet „Standard-Methylierungsinhibitor",
dass dieser Nukleinsäure-Methylierungsinhibitor als Standard
für mehrere Durchgänge des erfindungsgemäßen
Verfahrens oder für mehrere zu untersuchende Inhibitoren
verwendet wird. Besonders bevorzugt ist dabei ein Standard-Methylierungsinhibitor,
bestehend aus einem bis zu 17 Aminosäuren langen Peptid
umfassend die Aminosäuresequenz EKIYI Phosphoryliertes
SKIVVE. Dieses Peptid hat sich als besonders guter Nukleinsäure-Methylierungsinhibitor
erwiesen.
-
Soweit
nichts anderes gesagt ist, ist jede Kombination von Merkmalen von
Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Verfahrens miteinander und mit Merkmalen einer Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Reporternukleinsäure
und Ausführungsformen einer hier beschriebenen Kontroll-Nukleinsäure
möglich.
-
Die
Erfindung wird nachfolgend anhand der Beispiele näher beschrieben,
ohne dass die Beispiele den Schutzbereich der Ansprüche
einschränken sollen.
-
Beispiel 1: Herstellung einer Reporternukleinsäure
-
Die
Reporternukleinsäure sollte episomal in Plasmidform in
eukaryontischen Zellen, insbesondere in humanen Zelllinien, replizierbar
sein. Als Reportergen wurde ein Gen für Green Fluorescent
Protein (enhanced green fluorescent Protein, eGFP, EMBL Accession
Nummer: s. o.) gewählt.
-
Ein
etwa 2 kb großer Kerngerüst-/Matrix-Anhaftungsbereich
(S/MAR-Bereich; Jenke et al., Proceedings of the National
Academy of Sciences USA, 101 (2004), 11322-11327) wurde
in einen peGFP-C1-Vektor (Clontech) stromabwärts vom eGFP-Gen
kloniert. Der Vektor enthält zudem ein Gen für
Neomycinphosphotransferase als in Pro- und Eukaryonten wirksames
Antibiotikaresistenzgen (Kanamycin- und Neomycinresistenz), sowie
als bakteriellen Replicationsstartbereich einen pUC-"origin of replication".
-
1 zeigt
eine Karte der Reporternukleinsäure.
-
Beispiel 2: Methylierung der Reporternukleinsäure
-
Die
Reporternukleinsäure wurde mit einer Methyltransferase
aus Spiroplasma sp. (M.Sssl, New England Biolabs) methyliert. Die
Methyltransferase methyliert alle Cytosinreste in doppelsträngigen
Cytosin-Guanin-Dinucleotiden. Die Methylierung wurde in vitro gemäß den
Vorschriften des Herstellers ausgeführt.
-
Es
wurden zur Methylierung eingesetzt: 10 µg Reporternukleinsäure,
1x Puffer (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2,
1 mM Dithiothreitol, pH 7.9 bei 25°C), 160 µM
S-adenosylmethionin (Sigma), 20 U M.Sssl (NEB, 5 µl) in
einem Gesamtvolumen von 50 µl. Der Ansatz wurde eine Stunde
lang bei 37°C inkubiert. Die Methylierung wurde gestoppt durch
20 minütiges Erwärmen auf 65°C. Die methylierte
Reporternukleinsäure wurde durch Säulenaufreinigung
aufgereinigt.
-
Die
Vollständigkeit der Methylierung der Reporternukleinsäure
wurde überprüft durch Restriktionsverdau mit HpaII
und anschließende Gelelektrophorese. Diese Restriktionsnuklease
spaltet nur unmethylierte CCGG-Nukleinsäureabschnitte.
Zur Kontrolle wurde die methylierte Reporternukleinsäure ebenfalls
mit MspI, einem methylierungsinsensitiven Isoschizomer von HpaII,
verdaut. Die Vollständigkeit der Methylierung konnte bestätigt
werden. 2 zeigt ein Elektrophoresegel
der mit HpaII verdauten Reporternukleinsäure.
-
Beispiel 3: Transfektion von HEK293-Zellen
mit der methylierten Reporternukleinsäure
-
Die
methylierte Reporternukleinsäure und ein unmodifiziertes,
für rot fluoreszierendes Protein (red fluorecent Protein,
EMBL Accession Nummer: s. o.) codierendes Plasmid (Kontroll-Nukleinsäure)
wurden mit dem Transfektionsreagens FuGene-6 (Roche) in HEK293-Zellen
transfiziert. Dazu wurden die HEK 293-Zellen zunächst in
Dulbecco's Modified Eagle-Medium (DMEM), ergänzt um 5%
fötales Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin/Streptomycin
und 2 mM Glutamin in einem feuchten Inkubator bei 5% CO2 und
37°C inkubiert. Die Zellen befanden sich in der 25.–35.
Passage. Am Tag vor der Transfektion wurden die Zellen in 6-Well-Platten
ausgesäht. DNA (Reporternukleinsäure und Kontroll-Nukleinsäure)
in einer Gesamtmenge von 1 µg pro Well wurden mit 4 µl
des Transfektionsreagens entsprechend den Herstellerempfehlungen
gemischt und nach 20 minütiger Inkubation tropfenweise
auf die Zellen gegeben.
-
Die
transfizierten Zellen wurden auf rote und grüne Fluoreszenz
mit einem Carl Zeiss LSM501 Meta-Mikroskop untersucht. Grüne
und rote Fluoreszenz wurden gegeneinander aufgetragen. Als Grenze
für eine nachgewiesene Fluoreszenz wurde jeweils der höchste
Fluoreszenzwert nicht-transfizierter Zellen verwendet.
-
Beispiel 4: Methylierung der Reporternukleinsäure führt
zu erheblicher Transkriptions-Repression des Reportergens
-
Es
wurden wie in Beispiel 3 beschrieben Hek293-Zellen mit methylierter
und nicht methylierter Reporternukleinsäure und gleichzeitig
mit Kontroll-Nukleinsäure transfiziert. 3 zeigt
die Transfektionsergebnisse.
-
Bei
Transfektion mit unmethylierter Reporternukleinsäure waren
Zellen, die sowohl rot als auch grün fluoreszierten, am
fünften Tag nach der Transfektion gleichmäßig
in der Zellkultur verteilt (3A). Die
Fluoreszenzverteilung (3C) zeigt,
dass die Fluoreszenz der Zellkultur verteilt ist auf Zellen mit grüner
Fluoreszenz (Bereich 1), roter Fluoreszenz (Bereich 2) und gleichzeitig
grüner und roter Fluoreszenz (Bereich 3). Die Anzahl (3E) der grün bzw. rot fluoreszierenden
Zellen ist dabei in etwa gleich; dies deutet auf eine etwa gleich
starke Expression der Fluoreszenz-Reportergene der Reporternukleinsäure
und der Kontroll-Nukleinsäure hin.
-
Bei
Transfektion mit methylierter Reporternukleinsäure wurden
keine grün fluoreszierenden Zellen am fünften
Tag nach der Transfektion beobachtet, lediglich rot fluoreszierende
Zellen wurden nachgewiesen (3B). Dementsprechend
zeigt die Fluoreszenzverteilung (3D)
eine klare Häufung im Bereich der nur rot fluoreszierenden
Zellen (Bereich 2). Die Anzahl der sowohl grün als auch
rot fluoreszierenden Zellen (3F) ist
im Vergleich zur Anzahl der nur rot fluoreszierenden Zellen vernachlässigbar.
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die Transfektion gelungen ist (da rote Fluoreszenz
nachgewiesen werden konnte), und dass eine Methylierung der Reporternukleinsäure
zu einem fast vollständigen Verlust der Expression des
Reportergens eGFP führt (da in diesem Fall keine grüne
Fluoreszenz nachgewiesen werden konnte).
-
Beispiel 5: Inhibierung der endogenen
DNA-Methylierung führt zum Rückgewinn der Expression
des Reportergens methylierter Reporternukleinsäuren
-
Hek293-Zellen
wurden wie in Beispiel 3 beschrieben mit methylierter Reporternukleinsäure
und unmethylierter Kontroll-Nukleinsäure transfiziert.
Am Tag der Transformation wurden die Zellen entweder mit dem demethylierenden
Reagens 5'-Azacytidin (Sigma) oder zur Kontrolle mit Puffer behandelt.
Dieser Zeitpunkt wurde als "Zeitpunkt 0 h" allen Expressionsuntersuchungen
zugrunde gelegt. Das Reagens wurde 7 Tage lang täglich
frisch in einer Endkonzentration von 2 µM zugegeben, während
im Kontrollversuch lediglich Puffer und Lösungsmittel des
Reagens zugegeben wurden. Die Versuche wurden zweimal wiederholt.
-
4 zeigt
die Entwicklung der Expression des Reportergens der Reporternukleinsäure
und demethylierenden und unter nicht-demethylierunden Kultivierungsbedingungen.
Bereits am zweiten Tag konnte ein Anstieg der grünen Fluoreszenz
und damit ein Anstieg in der Expression des Reportergens der Reporternukleinsäure
nachgewiesen werden (4C). Der Anstieg
der Reportergenexpression wurde fortdauernd bis zum 7. Tag des Versuchs
beobachtet, dann wurden die Versuche abgebrochen. Nach 7 tägiger
Kultivierung unter demethylierenden Bedingungen wurde etwa 75% der
Expression des Reportergens beobachtet, wie sie bei Verwendung nicht-methylierter
Reporternukleinsäure erreicht wird (maximal erreichbare
Expression). Unter nicht-demethylierenden Kultivierungsbedingungen
betrug die Expression des Reportergens der methylierten Reporternukleinsäure
jedoch lediglich 5% der maximal erreichbaren Expression.
-
5 zeigt
die Expression des Reportergens der Reporternukleinsäure
und der Kontroll-Nukleinsäure. HEK293-Zellen, die unter
nicht-demethylierenden Bedingungen kultiviert worden waren, zeigten
praktisch keine Expression des Reportergens eGFP (5A),
in Übereinstimmung mit den Befunden aus Beispiel 4. Dagegen
zeigten HEK293-Zellen, die unter demethylierenden Bedingungen kultiviert worden
waren, eine starke Expression des Reportergens der Reporternukleinsäure
(5B).
-
Beispiel 6: Hochdurchsatz-Ansatz zum Finden
von Nukleinsäure-Methylierungsinhibitoren
-
HEK293-Zellen
wurden wie in Beispiel 3 beschrieben mit methylierter Reporternukleinsäure
und mit nicht-methylierter Kontroll-Nukleinsäure transfiziert
und nach dem Transfizieren in 96-Well-Mikrotiterplatten verteilt.
Die Zellkulturen wurden mit einem Satire XFLUOR4(Tecan)-Fluorimeter
auf grüne und rote Fluoreszenz hin vermessen. Die Zellkulturen wurden
wie in Beispiel 5 beschrieben 5'-Azacytidin (Sigma) zum Herstellen
demethylierender Kultivierungsbedingungen behandelt. 7 zeigt
schematisch den Ablauf des Ansatzes.
-
Unter
demethylierenden Bedingungen wurde fünf Tage nach der Transfektion
eine Expression des Reportergens eGFP ermittelt, die 120 fach stärker war
als die unter nicht-demethylierenden Bedingungen erzielte. Die Expression
des Reportergens der Kontroll-Nukleinsäure war unter demethylierenden Kultivierungsbedingungen
etwa 4 Mal stärker als unter nicht-demethylierenden Bedingungen.
Dies deutet auf eine geringe unspezifische Transkriptionsaktivierung
durch 5'-Azacytidin hin. Der Anstieg der Expression des Reportergens
der Reporternukleinsäure ist jedoch hierdurch nicht erklärbar,
sondern ist das Ergebnis der Demethylierung der Reporternukleinsäure.
-
Der
Ansatz wurde wiederholt, wobei statt des demethylierenden Reagens
5'-Azacytidin ein Peptid mit der Aminosäuresequenz EKIYISKIVVE
mit phosphoryliertem Serinrest verwendet wurde. Auch hier konnte
eine nach 5 Tagen deutlich stärkere eGFP-Expression unter
demethylierenden Kultivierungsbedingungen im Vergleich zu nicht-demethylierenden
Kultivierungsbedingungen nachgewiesen werden.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/ [0017]
- - S/MAR-Bereich; Jenke et al., Proceedings of the National Academy
of Sciences USA, 101 (2004), 11322-11327 [0021]