WO1993004179A1 - Plasmid und in-vitro-test zur detektion von tumorpromotoren unter verwendung dieses plasmids - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein DNA Konstrukt und ein Verfahren zur Detektion von Tumorpromotoren unter Verwendung dieses DNA Konstrukts. Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfach durchführbares quantitatives Nachweisverfahren für Tumorpromotoren zur Verfügung zu stellen. Gelöst wird diese Aufgabe durch ein DNA Konstrukt, welches mindestens ein Reportergen und eine Kontrollregion für die Aktivierung eines besonders stark induzierten Gens des Epstein-Barr-Virus (EBV) enthält, sowie durch Einwirken der zu untersuchenden Substanz auf EBV-haltige Zellen, welche das DNA Konstrukt enthalten, worauf die entstandene Menge an Reportergenprodukt quantitativ bestimmt wird.
Description
Plasmid und In-vitro-Test zur Detektion von Q?umor- promotoren unter Verwendung dieses Plas ids
Die Erfindung betrifft ein DNA Konstrukt und ein Verfahren zur Detektion von Tumorpromotoren unter Verwendung dieses DNA Konstrukts.
Tumorpromotoren sind Substanzen, die in Kombination mit für sich nicht tumorigenen Dosen von Solitärkarzi nogenen die Entwicklung von Tumoren bzw. Karzinomen induzieren. Solitärkarzinogene sind Substanzen, die (im Tierversuch) für sich allein appliziert, dosisabhängig Tumoren hervorrufen. Die alleinige Einwirkung von Tumorpromotoren dagegen erzeugt im Sinne ihrer Definition keinen Krebs, sie fördert aber in erheblichem Maße in solchen Organen, die durch exogene Einwirkung eines Solitärkarzinogens initiiert sind, die Tumorentstehung. Zur Identifikation von Solitärkarzinogenen stehen bereits einfache und rasch durchführbare Testsysteme zur Verfügung. Die Substanzklasse der Tumorpromotoren konnte jedoch bisher nur über Tierversuche, z. B. an der Mäusehaut oder dem Darm der Ratte, identifiziert werden.
Ein von zur-Hausen, H ., Bornkamm, G. W., Schmidt, R., und Hecker, E. : Tumor initiators and promoters in the induction of Epstein-Barr virus. in: Proceedings of the National Academic Science (U.S.A.) Band 76, Seite 782 - 785 (1979) beschriebener Ansatz eines Suchtests für Tumorpromotoren sieht vor, die Epstein-Barr Virus (EBV) induzierende Eigenschaft von Substanzen mittels Immunfluoreszenzdarstellung, EBV ko¬ dierter Antigene (sog. frühe Antigene) zu ermitteln. Diese Technik setzt jedoch virologisch und serologisch geschultes Personal voraus. Darüber hinaus ist dieses Verfahren zeitaufwendig und auf Grund der subjektiven Bewertung von immunofluoreszenzgefärbten Zellen nicht exakt standardisierbar.
Der endgültige Beweis für die tumorpromovierende Eigenschaft einer Substanz kann nur durch die Auslösung von Tumoren im in-vivo-Tier-Experiment z. B. an der Mäusehaut erbracht werden. Solche in-vivo-Experimente eignen sich jedoch nicht als Suchtest für die Testung einer Vielzahl von Substanzen.
Aufgabe der Erfindung ist es nun, ein DNA Konstrukt und ein einfach durchführbares quantitatives Verfahren der e. g. Art zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird durch die Patentansprüche 1 und 8 gelöst. Die übrigen Ansprüche beschreiben vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.
Die Erfindung wird im folgenden anhand zweier Beispiele und der Figuren 1 bis 5 näher erläutert.
Die Fig. 1 zeigt schematisch den Aufbau des DNA Konstrukts, während die Figuren 2 und 3 Schemata zweier DNA Konstrukte mit Schnittstellen und deren genaue Positionen angeben. Die Figur 4 zeigt eine Southern-blot Analyse von verschiedenen pHEBO-DR- CAT Transfektanten (A4, D2, D4) und die Figur 5 einen CAT-assay von den pHEBO- DR-CAT transfizierten Raji Sublimen D4, A4 und D2.
Die Basen-Sequenz und eine Kartierung dieser beiden DNA Konstrukte findet sich in den Tabellen 1 und 2.
Die Erfindung basiert auf der Beobachtung, daß verschiedene Klassen von Tumorpromotoren, wie z. B. Diterpenester, Indolalkaloide oder Polyacetate, Teleocidin, t-__ιsfoπrιing growth factor ß (TGFß) in Epstein-Barr Virus (EBV) haltigen lymphatischen Zellen einen lyrischen oder abortiven Viruszyklus induzieren. Im EBV Genom gibt es eine große Anzahl von Genen, die im Zustand der Latenz nicht experimentiert sind und erst bei Induktion eines lyrischen oder abortiven Zyklus induziert werden. Die für diese Aktivierung verantwortliche Kontrollregion des besonders stark induzierten DR-Gens (DL oder andere sind möglich) wurde vor den kodierenden Bereich eines sogenannten Reportergens mit den Methoden der Molekularbiologie kloniert. Der hierfür verwandte Vektor (pHEBO) trägt den episomalen Repliaktionsursprung von EBV und zwei Resi¬ stenzgene, von denen das eine die Selektion transifzierter eukaryonter Zellen mit Hygromyzin, und das Andere die Selektion in Prokaryonten erlaubt. Dieser Vektor ist be¬ schrieben von Sugden, B., Marsh, K., and Yates, J. A. vector that replicates as a plasmid and can be efficiently selected in'B-lymphoblasts transformed by Epstein virus. in: Molecular and Cellular Biology, Band 5, Seite 410 - 413 (1985). Das so entstandene Konstrukt (siehe auch Fig. 1) wurde stabil in eine EBV haltige Zellinie (Raji) eingeschleust.
Raji-Zellen wurden gewählt, da aufgrund von Deletionen im Raji-EBV-Genom kein infektiöses Virus gebildet werden kann und weil die sogenannte Spontaninduktionsrate in
diesen Zellen sehr gering ist. Als Zielzellen für die stabile Transfektion mit dem oben beschriebenen Plasmid kommen alle EBV positiven Zellinien in Betracht, die sich durch chemische Induktoren induzieren lassen (z.B. die Zellinie P3HR1 oder Akata). Das Translationsprodukt des Reportergens kann auf relativ einfache Weise über eine Enzymreaktion in Extrakten von diesen Zellen quantitativ nachgewiesen werden. Die Menge an nachweisbarem Reportergenprodukt korreliert quantitativ mit dem Akti¬ vierungszustand des EBV-Genoms.
Wegen der guten Korrelation zwischen tumorpromovierender und EBV-induzierender Aktivität kann dieses System als einfach und schnell durchführbarer Suchtest zur Identifikation von Tumorpromotoren eingesetzt werden.
Es wurden die Reportergene (REP) Chl orampenicolacetyltransferase (CAT) und die Glühwürmchen-Luziferase (LUC) getestet.
Weitere verwendbare Reportergene sind: die ß-Galaktosidase, das ß-Globin-Gen, Hepatitis B kodierte Antigene o. ä.
Das hier beschriebene Testsystem unterscheidet sich von den bisher bekannten vor allem durch eine vereinfachte Durchführbarkeit und eine entscheidende Verbesserung der quantitativen Auswertung der Ergebnisse. Bisher floß in jedes Meßergebnis die subjektive Bewertung von immunfluoreszenzgefarbten Zellen ein. Insbesondere beinhaltet die Angabe, ein bestimmter Prozentsatz von Zellen zeige eine positive Immunfluoreszenz für frühe EBV-Antigene, eine subjektive Festsetzung eines Schwellenwertes. Darüber hinaus läßt sich auf diese Weise die absolute Proteinmenge an frühen Antigenen, die in der einzelnen Zelle entstanden sind, nicht bestimmen. Dies erschwerte in der Vergangenheit eine Standardisierung erheblich.
Die Menge an entstandenem Reportergenprodukt läßt sich dagegen exakt und reproduzierbar in einer vorgebenen Anzahl von Zellen bestimmen. Ein weiterer Vorteil dieses Systems ist durch den klonalen Ursprung der stabil transfizierten Raji-DR-REP- Linie gegeben. Es ist bekannt, daß im Rahmen der langen in-vitro-Kultivation der Raji- Zellinie Subpopulationen mit unterschiedlichem biologischen Verhalten entstanden sind. Darüber hinaus zeichnet sich dieser Test durch eine höhere Sensitivität und eine verbesserte Dosis-Wirkungsbeziehung aus.
Die Figur 1 zeigt als Diagramm die Konstruktion der DNA-Klone (DNA Konstrukte) DR- REP und pHEBO-DR-REP.
REP steht für Reportergen.
Die oberste Zeile der Zeichnung stellt das Genom des EBV in linearer Form dar (terminale repetitionen, TR; interne Repetionen, IR; duplizierte Region links und rechts, DL und DR; lange und kurze einheitliche Region, UL und U$). In der nächsten Zeile ist das Bglll- Restriktionsfragment (Bgffl-K) (Polack et al. A complete set of overlapping cosmid clones of M-ABA virus derived from nasopharyngeal carcinoma and its similarity to other Epstein-Barr virus isolates. in: Gene, Band 27, Seite 279-288, 1984), das das DR-Gen trägt, vergrößert dargestellt. Der Pfeil in der nächsten Zeile entspricht der von dieser Region kodierten 2,8 kb großen Boten-RNS.
Im folgenden wird die Konstruktion von pHEBO-DR-CAT mit Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) als Reportergen beschrieben. Der Promotorbereich des DR-Gens wurde als HindHI-Ndel-Fragment (nach der Umwandlung der 31 vom DR-Promotor befindlichen Bgll-Schnittstelle in eine HindUI-Schnittstelle) aus pMBgiπ-K vor das Reportergen CAT in die Schnittstellen HindHI/Ndel des Vektors pSV2CAT kloniert (der SV40-Promotor in ρSV2CAT wurde dadurch deletiert).
Aus dem Klon DR-CAT wurde der DR-Promotor-CAT-Anteil als Xbal-BamHI-Fragment in die Schnittstellen BarnHI und Xbal des Vektors pucl8(R/X) eingesetzt (Labor- bezeichnung: G3-28). pucl8(R/X) ist entstanden durch die Umwandlung der Ecorl-
Schnittstelle in eine Xhol-Schnittstelle im Vektor pucl8. Aus G3-28 wurde DR-CAT als Sphl-Xhol-Fragment mobilisiert und in die Sphl/Sall-Schnittstelle des Vektors pHEBO ein loniert (pHEBO-DR-CAT).
Der Promotor des DR-Gens ist als schwarze Box gekennzeichnet. Die Initiationsstelle der Polymerase II ist durch einen nach links gerichteten kurzen Pfeil dargestellt. Der SV40- Anteil 3' vom offenen Leserahmen des CAT-Gens ist schräg schraffiert. ori-P steht für den "origin of plasmid replication" von EBV, HYG für das Hygromycin-Resistenzgen und AMP für das Resistenzgen gegen Ampizillin.
Die Figur 4 zeigt eine Southern-blot- Analyse von verschiedenen pHEBO-DR-CAT- Transfektanten (A4, D2, D4).
Jeweils ca. 10 μg zelluläre DNA der Sublinien A4, D2 und D4 wurden entweder ungespalten (U), mit BgUI (B) oder Hindlll (H) gespalten auf ein 0,6%iges Agarosegel aufgetragen. Als Kontrolle diente das ungespaltene (U) bzw. Hindlll (H) gespaltene Plasmid pHEBO-CR-CAT von dem das ein- (lx), fünf (5x) und zehnfache (lOx) eines Genomäquivalents aufgetragen wurde. Nach dem Gellauf wurde die nach der Größe
aufgetrennte DNA auf NitiozeUulosefilter übertragen und mit -^P-markierter DNA von pHEBO-DR-CAT hybridisiert. Der Klon pHEBO-DR-CAT enthält Sequenzen, die sowohl mit dem oriP als auch den Regionen DL und DR von EBV hybridisieren.
In den mit Hindlll geschnittenen zellulären DNAs (A4, D2, D4) erscheinen 5 Banden im Autoradiogramm: die HindHI-Fragmente A, B und D2 vom endogenen Raji-EBV-Genom, und zwei Fragmente von 8 und 2,5 kb Größe entsprechend der transfizierten DNA (mit x gekennzeichnet; siehe rechter Rand). Im BgUI- Verdau stellen sich die Bglll-Fragmente A, C und K des endogene Raji-EBV-Genoms dar. Da BgUI im Klon pHEBO-DR-CAT nicht schneidet, ergibt sich für die transifzierten DNA (gekennzeichnet mit x am linken Rand des Autoradiogramms) das identische Bandenmuster wie beim ungespalten aufgetragenen Plasmid (pHEBO-DR-C AT: U) .
Das Ergebnis dieser Southern-blot-Analyse läßt den Schluß zu, daß das transfizierte Plasmid in allen drei Sublinien in episomalem Zustand und ca. 50 bis 100 Kopien enthalten ist.
Eine vereinfachte Restriktionsenzymkarte des EBV-Genoms ist unter dem Autoradiogramm abgebildet.
Figur 5 zeigt einen CAT-assay von den pHEBO-DR-CAT transfizierten Raji-Sublinien D4, A4 und D2.
Ungefähr 20 bis 30 x 10" Zellen wurden für 48 Stunden mit dem Tumorpromotor TPA (20 ng/ml Sigma) und 5-Iodo-2'-desoxyurid_n (50 μg/ml Sigma) als Verstärker behandelt. Nur in den induzierten Zellen (T+I) ist das CAT-Enzym entstanden wie das Auftreten von acetylierten Formen (markiert mit 2,3,4 am rechten Rand) des 14C-mar_άerten
Chlorampemcols im Enzymassay zeigt. In unbehandelten Zellen (U) kann keine CAT- Aktivität nachgewiesen werden.
Der Nachweis der tumorpromovierenden Eigenschaften von Verbindungen (Nachweis von Tumorpromotoren) erfolgt für die beiden Varianten nach folgenden Schemata.
a) Mit pHEBO-DR-CAT transfizierten Raii-Zellen.
1) Züchtung von mindestens 1 bis 5 x 10" transfizierter Zellen pro experimentellem Ansatz.
Zellkulturbedingungen :
Zellkulturmedium: RPMI 1640 (Gibco) mit: etwa 10 % foetalem Kälberserum, 300 μg/ml Hygromycin (Calbiochem), 100 U/ml Penizillin, 280 μg/ml L-Glutamin, etwa 37° C, 5 - 6 % CO2-
2) Inkubation dieser Zellen mit einer entsprechenden Menge zu testender Substanz für 48 Stunden (= Standardansatz; <20 h bis zu mehreren Tage sind ebenfalls möglich) bei 37 ° C und 6 % CO2. 3) Gewinnung der Zellen durch Zentrifugation
4) Resuspension der Zellen in 100 μl 0.25M Tris-HCl (pH 7.8)
5) Aufschluß der Zellen zur Gewinnung des gebildeten Enzyms mittels Ultraschallbehandlung oder drei Zyklen Frieren/Tauen (3 Minuten im Cθ2/Äthanol-Bad/3 Minuten Tauen bei 30° C) 6) Klären des Zell-Lysats durch Zentrifugation
7) Bestimmung der Proteinkonzentration
8) Inkubation von z. B.
20 μl Lysat (Menge richtet sich nach der Proteinmenge) 100 μl 0.25M Tris-HCl (pH 7.8)
1 μCi C-Chloramphenicol 20 μl 4mM Acetyl-Coenzym-A
9) Inkubation bei 37° C für 1 Stunde (durch längere Inkubation kann die Sensitivität etwas erhöht werden) 10) Abbruch der Enzym-Reaktion durch Zugabe von 2 ml kaltem Äthylacetat
11) Intensive Durchmischung des Reaktionsansatzes zur Extraktion des Chlorampenikols und der entstandenen Derivate
12) Zentrifugation zur Phasentrennung
13) Entnahme der organischen Phase 14) Eindampfen der organischen Phase aus 13) durch Anlegen eines Vakuums bei gleichzeitiger Rotation
15) Resuspension der zurückgebliebenen festen Phasen aus 14) in 30 μl Äthylacetat
16) Dünnschichtchromatografie mit Chloroform-Äthanol (95:5) als Laufmittel zur Auftrennung der verschiedenen acetylierten Formen des
Chloramphenikols auf Kieselgel-Platten (Polygram Sil G, Macherey-Nagel).
17) Autoradiografie der Dünnschichtchromatografie-Platten oder Auswertung mit Hilfe eines Radioaktivitäts-Scanners.
b) Mit pHEBO-DR-LUC transfizierten Raii-Zellen.
1) Züchtung von mindestens 0,1 bis 1,0 x 104 transfizierter Zellen pro experimentellem Ansatz.
Zellkulturbedingungen:
Zellkulturmedium: RPMI 1640 (Gibco) mit: 10 % foetalem Kälberserum, 300 μg/ml Hygromycin (Calbiochem), 100 U/ml Penizillin, 280 μg/ml L- Glutamin, 37° C, 5 - 6 % CO2- 2) Inkubation dieser Zellen mit einer entsprechenden Menge zu testender
Substanz für 48 Stunden (= Standardansatz; <20 h bis zu mehreren Tage sind ebenfalls möglich) bei 37 ° C und 6 % CO2.
3) Gewinnung der Zellen durch Zentrifugation
4) Resuspension der Zellen in Lysepuffer (100 mM Kaliumphosphat pH 7.8, 1 mM DTT)
5) Aufschluß der Zellen zur Gewinnung des gebildeten Enzyms mittels Ultraschallbehandlung oder drei Zyklen Frieren/Tauen (3 Minuten im Cθ2/Äthanol-Bad/3 Minuten Tauen bei 30° C)
6) Klärung des Zell-Lysats durch Zentrifugation 7) Bestimmung der Proteinkonzentration
8) Inkubation von z. B. 20 μl Lysat (Menge richtet sich nach der
Proteinmenge) 100 μl Testpuffer (25 raM Glycylglycine, pH 7.8, 5 mM
ATP, 15 mM MgSθ4) Injektion von 100 μl Luciferinlösung (1 mM Luciferin in 0,5 M Tris-HCl (pH 7.8))
9) sofortige Messung des emittierten Lichts in einem Luminometer (z. B. Lumat von Berthold).
Die Menge der nachgewiesenen Enzyme ist ein Maß für die EBV induzierende Eigenschaft der untersuchten Substanzen und läßt somit einen Rückschluß zu auf die mögliche tumor¬ promovierende Eigenschaft dieser Substanz.
Die besonderen Vorteile des Verfahrens b) gegenüber a) bestehen in der wesentlich geringeren Zellmenge, einer um ein vielfaches höheren Sensitivität, einer wesentlich vereinfachten Quantifizierbarkeit (die Menge an entstandenem Enzym kann im Luziferase- Test über mehrere Log-Stufen ohne zusätzliche Verdünnungsreihen quantitativ erfaßt werden), einem deutlich geringeren Arbeitsaufwand und der Vermeidung von radioaktivem Abfall.
Tabelle 1: PHEBO-DR-CAT
Merkmale:
Protoko1lbuchbezeic nung: DRCATPHEBO
Klonierung:
DR-CAT als XhoI-SpHI 3, 6kb Fragment in Sall-SpHI von pHEBO einkloniert.
Basen total: 10580
Restriktionsenzym- Schnittstellen: Position:
Hindlll 29 BamHI 375 SphI 562 Sall 574 Hindlll 2539 EcoRI 2789 BamHI 4171 EcoRI 7895 EcoRI 8292 EcoRI 10578
Regionen: Position:
DR 575-2539
CAT 2539-3325
SV40 3325-4171
EBV-oriP 4603-6783
Hygromycin-
Resistenzgen 8383-6783
Ampicillin-
Resistenzgen 10333-9483
Sequenz
TTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATT GCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACC GTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGA TATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGA TGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTC
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CCCGTCCCTAACCCACGGGGCCCGTGGCTATGGCGGGCTTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGA GCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGTTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTAT TGGCCCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCG TTTATGAACAAACGACCCAACACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCG CGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCGATCCC CTCGGACGAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGT CCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGA CGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTC TGATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGCCGCGGCGATCCTGCAAG CTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCC AGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATG ACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAG GTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGG ACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCG CATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCC GCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATGGCCTCCGCGACCGGCTGCAGAA CAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATG CAATAGGTCAGGCTCTCGCTGAATTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGC CGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCC GCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAG AGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGC GGTGAGTTCAGGCTTTTTCATATCTCATTGCCCCCGGGGGATCTGCGGCACGCTGTTGACGC TGTTAAGCGGGTCGCTGCAGGGTCGCTCGGTGTTCGAGGCCACACGCGTCACCTTAATATGC GAAGTGGACCTGGGACCGCGCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAA GACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGG ACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAGGGCGGCACCTCGCTAACG GATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACC AACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTC GGGCAGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTT CCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGT CCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGT TGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGT CAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCT CGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGG GAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGC
TCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAA CTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTA ACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAAC TACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGG AAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTG TTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCT ACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATC AAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTA TATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCG ATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACG GGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTC CAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACT TTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGT TAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTG GTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTG TGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGT GTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGAT GCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCG AGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGT GCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGAT CCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGC GTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACG GAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATT GTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGC ACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTA TAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAA
Tabelle 2: PHEBO-DR-LUC Merkmale: Protokollbuchnummer: RF202-15
Klonierung: DR-LUC als BamHI+Bglll 4,54 kb Fragment in BamHI von pHEBO einkloniert.
Basen total: - 11616
Restriktions- Enzym-Schnittstellen:
Ba HI/Bglll (Sau3A) Hindlll
EcoRI
BamHI
EcoRI
EcoRI EcoRI
Hindlll
Regionen: Positionen
DR (von EBV) 1-1963 Luciferase (LUC) 1972-3689 Teil von SV40 3701-4546 EBV-oriP (von EBV) 4979-7159 Hygromycin- Resistenzgen 9044-7159 Ampicillin- Resistenzgen (AMP) (von pBR322) 10994-10144
Sequenz:
GATCTCTAGAACTGGATACTCGTGGGGGGTAAAGAAGGTGAATAAAAATTACAAACATTCTC TGCCCAGCCTTCAGACTATCAAACCTAGATAATCATTCTATAAATAACCCAGGGCTTGCATC ACAATTTAAAGGGAAGTTAAGATGGGGGATTACCTTCTAAGAGGAAATGACAAGCCACAGAC ATCCCCACATATAGCCGGGTGTCCACTGTCTAATGTCAGTAATTTAATTCCATAGTGAAAAT AGCACCCCCAACTCAATTTGGAATCCAGAAACTATATTGCACACCAACACCCCCTCCTCTGC ACATGAGCAAGACAAGACATCTATGTTTATCTCTAAATGTGCCATGGAACCCGGTTGCCCAT GCAGTGGTGTCAGACAGGAAAATGGTTAATTAACCACATCTTAAATTGCCACCTTAGGCAAA TTGAAAATAGGCAGGCTGAAGAATTGCACAATACCCTAAACAGGTAAGAGGAATTAGTGACA TTTTATGAATTTTTTTACAAACTTTCACACTCAAGAATAGAAACCCAATACCAACAGGTGTG CAGGTGTGCATGACAAATCTTGGGGGTCTCAGAACCCAGGACCAGACTTTGAAGTCTCAGGT
ATAGGTCCTGGCTGAGATTCTATTAATAAAACAAGAGAGAAAGAAGGCGGGCGCCCATTAGA ATCTGCTCGGCTGCCAGTAAGTTGCCAGCAAACAGGAACACAAACAAACCAAGGGTGTTGGC CCCTACAGGCTCCCAAGGCGGGGGTTGGGCACAGGGCCAAGCTCTGCCACCACAGGAGGCAA GTAGACATGCAGGAACACATGGCCCTGGCTAGGAAAGGGAGGAAATAGAGGCCACAGCCAAA GTTAGGCTGCCGCCCCACCTGTGTACCCAGGGTGAGAGACCTTGGGAGGTCGTCAGCTTAAC CAGCGCCGCCCTCACCCCATTGCCAACTTCCGGCTCACACAAAACCACTCCCAAAAATTGAA GACTGGCCAAAATCCAGCTTCCGTCCCCGGGACGTGGTGCTTCCTAAAGGCGGGGCTCATGG ATTAGCAGGGGCTTAGTGTGTCATGGTGAGGCAGGCAAGGCGAGCAACGGGGGCTTAGTGGC TCAAAGTGATGCATCCCAAAGGCAGCCACCACGCTGGAGGGACATTGTCCACGGGACAAGGC ACAGGCCAGGTCATGACCCAGGAAGTGGCGAGCATCGGTCAGCTGACCAAATGTGCAAAGGT GACAAGTCAGTAAGGCACGCGGGGGGCCACGTCACCCCGGGGTGCTGGGGTGGGGGATGGGC TCAGGCAACCGTAAGGGAGGGGGGGGTAGGGGGGGGAGGGATTACACTATAGGGTTCCCTTC CTCTAGGTTCTATATACCTATAGGTATATACCCAGCTGCAATACCCTATTCCACCACTAGGT TAATAACCTATAGGTTATTCTACCATTAAAACGGAAGGAGGAAGGGTGGCGCACCTTAAGGT AGGGTAGGGGGGTACCCCAGTAGGAACCTAGCTGAATCCTACCTAGCTCCACCCACCTGGTA TATAGGGGCGGAGCTTAGGATACCTCCAGGATAATGGAACCCTATGGAGACCTACCTCTAGG CTCCACCCACTAGGTATATCGGGGCGGAGCCCACTCCTCCCCCTCCTGGTTCAACCCTATGG AGGGGACCCTCCTGAGGCTCCGCCTACCCCAAATCTCGCGGGCCTCTAGCCCCTCCTCCTCT CGTTATCCCAATAGAATGACCTCCAGGTACCACCCACCTGGTTACACACCTTAATGTAACCC AACGGGCTAAAATCACACACCTGAATTAACCAATGAGAAGCCCCCCACACCTGAGCAAACCT TAAGGTATTGCACAGAAACCCCAAAAAGAGGATAAAAGAAGGCGAGCTGGCCCGGCTCGCCA GCGTCGTCCAGACGCTCGGGGGGTGCACACCTCCCAGCCGCAAGCTTGGCATTCCGGTACTG TTGGTAAAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCTCTAGAG GATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAAC AATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGAACATCACGTACGCGGAATACTTCGAAATGT
CCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTA TGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGC AGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGAACATTTCGC AGCCTACCGTAGTGTTTGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAA TTACCAATAATCCAGAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTC
GATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTACCAG AGTCCTTTGATCGTGACAAAACAATTGCACTGATAATGAATTCCTCTGGATCTACTGGGTTA CCTAAGGGTGTGGCCCTTCCGCATAGAACTGCCTGCGTCAGATTCTCGCATGCCAGAGATCC TATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACG GTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTAT
AGATTTGAAGAAGAGCTGTTTTTACGATCCCTTCAGGATTACAAAATTCAAAGTGCGTTGCT AGTACCAACCCTATTTTCATTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTA ATTTACACGAAATTGCTTCTGGGGGCGCACCTCTTTCGAAAGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCA AAACGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTAT TCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTG AAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAGAGAGGCGAATTA TGTGTCAGAGGACCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTT GATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACT TCTTCATAGTTGACCGCTTGAAGTCTTTAATTAAATACAAAGGATATCAGGTGGCCCCCGCT GAATTGGAATCGATATTGTTACAACACCCCAACATCTTCGACGCGGGCGTGGCAGGTCTTCC CGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGA CGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGA GGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAAT CAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGTCCAAATTGTAAAATGTAACTGTAT TCAGCGATGACGAAATTCTTAGCTATTGTAATGACTCTAGAGGATCTTTGTGAAGGAACCTT ACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAAT ATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGAT TCCAACCTATGGAACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTTAATGAGGAAAACCTGT TTTGCTCAGAAGAAATGCCATCTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACT CCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGCTAAGTTT TTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGAACTCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAAGG AAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAATTATGGAAAAATATTCTGTAACCTTTATAAGTAGG CATAACAGTTATAATCATAACATACTGTTTTTTCTTACTCCACACAGGCATAGAGTGTCTGC TATTAATAACTATGCTCAAAAATTGTGTACCTTTAGCTTTTTAATTTGTAAAGGGGTTAATA AGGAATATTTGATGTATAGTGCCTTGACTAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGA GGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATG CAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATC ACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCAT CAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCG CCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGC CACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGG ACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCA ACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACTACGCGAT CATGGCGACCACACCCGTCTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTC CGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACT
CGTAGGACAGGTGCCCTGGCCGGGGTCCCGCGGAAACTCGGCCGTGGTGACAGGAAAAGGAC AAGCAGCGAAAATTCACGCCCCCTTGGGAGGTGGCGGCATATGCAAAGGATAGCACTCCCAC TCTACTACTGGGTATCATATGCTGACTGTATATGCATGAGGATAGCATATGCTACCCGGATA CAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATA GATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGA TTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATT AGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTA GTATATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCTAATCTCTATTAGGATAGC ATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCAT ATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATAT ACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGC TACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCA TGGCAACATTAGCCCACCGTGCTCTCAGCGACCTCGTGAATATGAGGACCAACAACCCTGTG CTTGGCGCTCAGGCGCAAGTGTGTGTAATTTGTCCTCCAGATCGCAGCAATCGCGCCCCTAT CTTGGCCCGCCCACCTACTTATGCAGGTATTCCCCGGGGTGCCATTAGTGGTTTTGTGGGCA AGTGGTTTGACCGCAGTGGTTAGCGGGGTTACAATCAGCCAAGTTATTACACCCTTATTTTA CAGTCCAAAACCGCAGGGCGGCGTGTGGGGGCTGACGCGTGCCCCCACTCCACAATTTCAAA AAAAAGAGTGGCCACTTGTCTTTGTTTATGGGCCCCATTGGCGTGGAGCCCCGTTTAATTTT CGGGGGTGTTAGAGACAACCAGTGGAGTCCGCTGCTGTCGGCGTCCACTCTCTTTCCCCTTG TTACAAATAGAGTGTAACAACATGGTTCACCTGTCTTGGTCCCTGCCTGGGACACATCTTAA
TAACCCCAGTATCATATTGCACTAGGATTATGTGTTGCCCATAGCCATAAATTCGTGTGAGA TGGACATCCAGTCTTTACGGCTTGTCCCCACCCCATGGATTTCTATTGTTAAAGATATTCAG AATGTTTCATTCCTACACTAGTATTTATTGCCCAAGGGGTTTGTGAGGGTTATATTGGTGTC ATAGCACAATGCCACCACTGAACCCCCCGTCCAAATTTTATTCTGGGGGCGTCACCTGAAAC CTTGTTTTCGAGCACCTCACATACACCTTACTGTTCACAACTCAGCAGTTATTCTATTAGCT AAACGAAGGAGAATGAAGAAGCAGGCGAAGATTCAGGAGAGTTCACTGCCCGCTCCTTGATC TTCAGCCACTGCCCTTGTGACTAAAATGGTTCACTACCCTCGTGGAATCCTGACCCCATGTA AATAAAACCGTGACAGCTCATGGGGTGGGAGATATCGCTGTTCCTTAGGACCCTTTTACTAA CCCTAATTCGATAGCATATGCTTCCCGTTGGGTAACATATGCTATTGAATTAGGGTTAGTCT GGATAGTATATACTACTACCCGGGAAGCATATGCTACCCGTTTAGGGTTAACAAGGGGGCCT
TATAAACACTATTGCTAATGCCCTCTTGAGGGTCCGCTTATCGGTAGCTACACAGGCCCCTC TGATTGACGTTGGTGTAGCCTCCCGTAGTCTTCCTGGGCCCCTGGGAGGTACATGTCCCCCA GCATTGGTGTAAGAGCTTCAGCCAAGAGTTACACATAAAGGCAATGTTGTGTTGCAGTCCAC AGACTGCAAAGTCTGCTCCAGGATGAAAGCCACTCAGTGTTGGCAAATGTGCACATCCATTT ATAAGGATGTCAACTACAGTCAGAGAACCCCTTTGTGTTTGGTCCCCCCCCGTGTCACATGT
GGAACAGGGCCCAGTTGGCAAGTTGTACCAACCAACTGAAGGGATTACATGCACTGCCCCGT GACCAATACAAAACAAAAGCGCTCCTCGTACCAGCGAAGAAGGGGCAGAGATGCCGTAGTCA GGTTTAGTTCGTCCGGCGGCGCCAGAAATCCGCGCGGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTT GGCAGCCACAGACGCCCGGTGTTCGTGTCGCGCCAGTACATGCGGTCCATGCCCAGGCCATC CAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTCCAGTCGTGGACCTGACCCCACGCAACGCCCAAAA GAATAACCCCCACGAACCATAAACCATTCCCCATGGGGGACCCCGTCCCTAACCCACGGGGC CCGTGGCTATGGCGGGCTTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAAC TTGGGGGTTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGCCCCAATGGGGTCTCGGT GGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAAC ACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTC TCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCGATCCCCTCGGACGAGTGCTGGGGCGT CGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCG GGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCT GCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCA ATGCGGAGCATATACGCCCGGAGCCGCGGCGATCCTGCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAA GTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGACCT CGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTG TCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTC CTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCA TCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTA GTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGC CGCAGCGATCGCATCCATGGCCTCCGCGACCGGCTGCAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAG GCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTG AATTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAAC ATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTC
CTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGGTCGGAGACG CTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCAT ATCTCATTGCCCCCGGGGGATCTGCGGCACGCTGTTGACGCTGTTAAGCGGGTCGCTGCAGG GTCGCTCGGTGTTCGAGGCCACACGCGTCACCTTAATATGCGAAGTGGACCTGGGACCGCGC CGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGT
CATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGC AACGGGCCACGGGGATGAAGCAGGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTG GAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCC ATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGGCCGACGCGCTGGGC TACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGC
TTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACC ATCAGGGCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGC TCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACA GGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGAC CCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAAT GCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCAC GAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCC GGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGT ATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTÄGAAGGACA GTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTG ATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGC GCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGG AACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGAT CCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTG ACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCC ATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCC CAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACC AGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCT ATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGT TGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCG GTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCC TTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGC AGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGT ACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCA ACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTC
TTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTC GTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACA GGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACT CTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATAT TTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCA
CCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAG GCCCTTTCGTCTTCAAGAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGT AGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCT CATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTAC TGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTG
CTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCG CTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCA TGGCGACCACACCCGTCCTGTG
Claims
1. DNA Konstrukt bestehend aus mindestens folgenden Teilen: a) einer Kontrollregion für die Aktivierung eines besonders stark induzierten Gens des Epstein-Barr- Virus (EBV) b) einer» Reportergen (REP).
2. DNA Konstrukt nach Anspruch 1 , bestehend aus mindestens folgenden weiteren Teilen: c) einem Resistenzgen Rl für die Selektion transfizierter eukaryonter Zellen, d) einem Resistenzgen R2 für die Selektion in procaryonten Zellen.
3. DNA Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das stark induzierte Gen das DR-Gen ist.
4. DNA Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen Chloramphericolacetyltransferase (CAT) ist.
5. DNA Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen Glühwürmchenluziferase (LUC) ist.
6. DNA Konstrukt nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Rl ein Hygromyzin-Resistenzgen ist.
7. DNA Konstrukt nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß R2 ein Ampicillin-Resistenzgen ist.
8. In-vitro-Test zur Detektion von Tumorpromotoren gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) EBV-haltige Zellen, welche ein DNA Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 enthalten werden mit der zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht, b) dann wird die Mischung ca. 1-3 Tage bei 37° C in Cθ2-Atmosphäre gehalten, c) schließlich wird die Menge vom entstandenen Reportergenprodukt bestimmt.
9. In-vitro-Test nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als EBV-haltige Zellen Raji-Zellen verwendet werden.
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Cited By (2)
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| DE4306547A1 (de) * | 1993-03-03 | 1994-09-08 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | DNA Konstrukt und In-vitro-Test zur Detektion von Proteinkinase C Inhibitoren unter Verwendung dieses DNA Konstrukts |
| EP0826775A1 (de) * | 1996-09-02 | 1998-03-04 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Vektorsysteme zur konditionalen Genexpression |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5741657A (en) * | 1995-03-20 | 1998-04-21 | The Regents Of The University Of California | Fluorogenic substrates for β-lactamase and methods of use |
| US5928888A (en) * | 1996-09-26 | 1999-07-27 | Aurora Biosciences Corporation | Methods and compositions for sensitive and rapid, functional identification of genomic polynucleotides and secondary screening capabilities |
| US5955604A (en) * | 1996-10-15 | 1999-09-21 | The Regents Of The University Of California | Substrates for β-lactamase and uses thereof |
| US6031094A (en) * | 1998-07-23 | 2000-02-29 | The Regents Of The University Of California | Beta-lactam substrates and uses thereof |
-
1991
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- 1991-08-16 US US08/196,259 patent/US5639596A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4306547A1 (de) * | 1993-03-03 | 1994-09-08 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | DNA Konstrukt und In-vitro-Test zur Detektion von Proteinkinase C Inhibitoren unter Verwendung dieses DNA Konstrukts |
| WO1994020630A1 (de) * | 1993-03-03 | 1994-09-15 | GSF - Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Dna konstrukt und in-vitro-test zur detektion von proteinkinase c inhibitoren unter verwendung dieses dna konstrukts |
| EP0826775A1 (de) * | 1996-09-02 | 1998-03-04 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Vektorsysteme zur konditionalen Genexpression |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5639596A (en) | 1997-06-17 |
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