DE602004010112T2

DE602004010112T2 - In cis regulierte konditionelle Genvektoren

Info

Publication number: DE602004010112T2
Application number: DE602004010112T
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Hammerschmidt; Sibille Humme; Dagmar Pich; Aloys Schepers
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschung De
Priority date: 2004-09-14
Filing date: 2004-09-14
Publication date: 2008-09-18
Anticipated expiration: 2024-09-15
Also published as: ES2297315T3; EP1634955A1; US7803617B2; US20070184028A1; EP1799834A1; WO2006029831A1; EP1634955B1; DK1634955T3; ATE378415T1; DE602004010112D1

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf ein konditionales Genvektorsystem und eine Wirtszelle, die mit einem solchen Vektorsystem transfiziert wurde, gerichtet. Die vorliegende Erfindung ist ferner auf eine kombinierte Zubereitung, die das Vektorsystem der Erfindung und ein interferierendes Mittel umfasst, gerichtet. Des Weiteren werden eine pharmazeutische Zusammensetzung und deren Verwendung bei der Behandlung von Hämophilie, Diabetes, rheumatoider Arthritis, genetischer Immundefizienz und Graft-Versus-Host-Krankheit bereitgestellt.
Rekombinante Nukleinsäuren sind die Basis von Genvektoren, die für die Gen- und Immuntherapie von verschiedenen humanen Erkrankungen verwendet werden. Die meisten Genvektoren umfassen genetische Bestandteile von Viren oder Vielzellern, die die notwendigen cis-aktiven Elemente, wie beispielsweise Promotoren und Enhancer, zum Exprimieren von einem oder mehreren Genen von therapeutischem Interesse bereitstellen. Daneben tragen bestimmte Genvektoren, die auf Virus-Vorlagen („Virus-Blueprints") konstruiert werden, auch die essentiellen regulatorischen Signale, die am Verpacken von Nukleinsäuren in virale strukturelle Bestandteile beteiligt sind, sowie replikative Elemente für die Amplifikation der viralen Vektorgenome.
In der Empfängerzelle können die Genvektoren nur vorübergehend vorhanden sein oder für eine lange Zeit erhalten werden. Insofern gehen die genetischen Informationen durch den spontanen Abbau durch zelluläre Nukleasen schnell verloren oder werden durch Einbauen der genetischen Informationen in das Chromosom der Empfängerzelle erhalten. Da bei einer Gen- oder Immuntherapie oft eine verlängerte Wirkung der therapeutischen Gene und ihrer Produkte bevorzugt ist, werden üblicherweise Genvektoren verwendet, die den chromosomalen Einbau ihrer genetischen Informationen begünstigen. Während dieses Teils der viralen Lebenszyklen bauen sich insbesondere alle Retroviren und adeno-assoziierten Viren als Proviren ein, um einen latenten oder dauernden Zustand zu etablieren. In ähnlicher Weise können sich auch auf DNA basierende Genvektoren in das Chromosom einbauen.
Der Einbau von fremder DNA unterbricht die genetische Integrität des Wirtschromosoms. Sich einbauende Viren, virale Vektoren und auf DNA basierende Genvektoren können daher als insertionale Mutagene wirken. Die insertionale Mutagenese wurde kritisch betrachtet, da retrovirale Vektoren, die zum Heilen einer schweren Form von Immiundefizienz in Menschen verwendet wurden, zu einer onkogenen Tranformation von T-Zellen führten (Hacein-Bey-Abina et al., 2003). Dieses Problem wird mit Genvektorsystemen vermieden, die als extrachromosomale Einheiten in der transduzierten oder mit DNA transfizierten Empfängerzelle erhalten werden. Alle Genvektoren, die sich durch dieses Merkmal kennzeichnen, sind von rekombinanten DNA-Plasmiden abgeleitet, die autonome Replikons tragen (Piechaczek et al., 1999; Schaarschmidt et al., 2004; Sugden und Leight, 2001). Replikons sind genetische Einheiten, die die DNA-Replikation der DNAs von Genvektoren oft gleichzeitig mit der Replikation des Chromosoms der Wirtszelle vermitteln.
Das Plasmidreplikon des Epstein-Barr-Virus (EBV) ist der latente Ursprung der DNA-Replikation dieses humanen Herpesvirus. Plasmide, die diesen Ursprung der DNA-Replikation enthalten, replizieren ähnlich wie das Genom der Wirtszelle und werden extrachromosomal erhalten. Dieses Plasmid wurde daher als rekombinante Genvektoren ausgenutzt (Sugden und Leight, 2001). Das EBV-Plasmidreplikon, oriP genannt, unterstützt die effiziente DNA-Replikation in Zellen, die so ausgewählt sind, dass sie das virale Genprodukt EBNA1 mit mehreren Kopien erhalten, wenn es bereitgestellt wird. Rekombinante Plasmide, die oriP enthalten, werden einmal pro Zellzyklus während der S-Phase repliziert und in effizienter Weise auf die Tochterzellen verteilt. Es sind nur zwei Bestandteile, oriP in cis und EBNA1 in trans, erforderlich, die Zelle trägt das Übrige bei.
Das Replikon oriP besteht aus zwei essentiellen Elementen, der Familie von Wiederholungen (FR) und einem Doppelsymmetrieelement (DS, 1). Die Initiierung der DNA-Replikation findet an oder in der Nähe des DS statt, wo Bestandteile des zellulären Präreplikationskomplexes (Prä-RC), einschließlich ORC- und MCM-Proteine, erneuert werden (Ritzi et al., 2003; Schepers et al., 2001). Es ist wahrscheinlich, dass EBNA1, das an vier Bindungsstellen mit geringer Affinität innerhalb des DS bindet, vielleicht in Verbindung mit anderen strukturellen Merkmalen von DS, zu der Erneuerung von Prä-RC beiträgt. Das FR-Element ist eine Anordnung von 20 Bindungsmotiven mit hoher Affinität für EBNA1 und ihm wird eine Funktion bei der nukleären Retention von oriP zugeschrieben. Eine nukleare Retention von oriP-Plasmiden wird als für ein lange dauerndes Erhalten der Plasmide obligatorisch angesehen und könnte auch zur Aufteilung in jedem Zellzyklus beitragen. Bei rekombinanten Plasmiden von bis zu ungefähr 30 kbps Größe sind beide Bestandteile, DS und FR, für die oriP-Funktion essentiell. In größeren rekombinanten Plasmiden (oder in dem Zusammenhang mit dem EBV-Genom) kann DS, weil Prä-RC wahrscheinlich in anderen Bereichen als DS erneuert werden kann (Schepers et al., 2001), überflüssig werden (White et al., 2001). Diese Ergebnisse ließen vermuten, dass DS und FR funktional unterschiedliche cis-aktive Elemente sind, die sowohl in proliferierenden als auch ruhenden Zellen entsprechend der DNA-Replikation und dem Erhalten von Replikons zugeordnet werden.
EBNA1 ist ein virales Protein, das direkt mit oriP interagiert und durch eine modulare Anordnung gekennzeichnet ist. Die carboxy-terminale Hälfte umfasst die AS-Reste 459 bis 604 des Prototyp-EBNA1-Genprodukts des B95.8-Stamms von EBV (Baer et al., 1984), das eine Dimerisierungs- und DNA-Bindungsdomäne darstellt (2). Die amino-terminale Hälfte von EBNA1, insbesondere die Aminosäurereste 1 bis 89 und 322 bis 379, vermittelt die Assoziation mit den Chromosomen der Zelle (Marechal et al., 1999) und ist für das Erhalten von Plasmiden und die transkriptionale Aktivierung essentiell (Yates und Camiolo, 1988). Die restlichen Domänen sind Glycin-Alanin-Wiederholungseinheiten (AS 90 bis 327), die vermutlich an dem Proteinabbau beteiligt sind, ein nukleäres Lokalisierungssignal (AS 379 bis 386) und eine saure Aktivierungsdomäne (AS 605 bis 641) (rückblickend zusammengefasst von Kieff und Rickinson, 2001).
Die Eigenschaften einer Chromosomassoziation von EBNA1 steuerten einen Ansatz an, bei dem die amino-terminale Hälfte desselben durch zelluläre Proteine ersetzt wurde, von denen bekannt ist, dass sie mitotischen Chromosomen eine Chromatinbindung und – assoziation verleihen (Hung et al., 2001). Von mehreren Kandidaten ersetzten chimäre Genprodukte, die aus den zellulären Histon-H1- oder HMGA1a-Proteinen bestanden, die mit den Aminosäureresten 379 bis 641 von EBNA1 fusioniert worden waren, funktional das Wildtyp-(wt-)EBNA1-Allel in Bezug auf sowohl die Plasmidreplikation als auch die – erhaltung (Sears et al., 2003).
Keine der Druckschriften oder Veröffentlichungen gibt jedoch ein System für die Regulierung der Vektorerhaltung in einer Zielzelle an. Eine solche Regulierung der Vektorerhaltung könnte den Vorteil bringen, genetische Informationen auf eine Zielzelle zu übertragen, wobei die Übertragung leicht durch Zusetzen eines Mittels, das speziell dazu ausgelegt ist, den Vektor aus der Zielzelle zu entfernen, umgekehrt werden kann.
Es ist daher ein der vorliegenden Erfindung zugrunde liegendes Problem, ein konditionales Genvektorsystem bereitzustellen, das in vorteilhafter Weise zum Transfizieren von Zielzellen verwendet werden kann und in dazu in der Lage ist, auf Wunsch aus diesen entfernt zu werden. Oder anders ausgedrückt ist ein der vorliegenden Erfindung zugrunde liegendes Problem, Genvektorsysteme bereitzustellen, die durch einfache Mittel gesteuert werden können und die Empfängerzelle(n) genetisch nicht verändern. Es ist ein weiteres der vorliegenden Erfindung zugrunde liegendes Problem, ein verbessertes Vektorsystem zum Transfizieren von Wirtszellen bereitzustellen, wobei das Vektorsystem dazu in der Lage ist, die Kopienanzahl des Vektors zu erhöhen. Ein weiteres Problem ist zudem, eine verbesserte und dennoch umkehrbare Bindung von cis- und trans-aktiven Elementen für den obigen Zweck bereitzustellen.
Die Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Die Lösung der vorliegenden Erfindung ist der erste Ansatz zum Etablieren extrachromosomaler Genvektorplasmide, deren Erhalten in einer bestimmten Zielzelle in cis z. B. durch eine niedermolekulare Verbindung gesteuert werden kann.
Es wurde untersucht, dass die prokaryotischen tetR- und lacI-Gene die eukaryotische Transkription auf konditionale Weise regulieren (Gossen und Bujard, 1992; Gossen et al., 1995; Liu et al., 1989). Beide Genprodukte wurden als solche verwendet (Yao et al., 1998) oder mit eukaryotischen regulatorischen Domänen fusioniert, die entscheidende Rollen bei der transkriptinalen Aktivierung (VP16 und damit verwandte saure Transkriptionsaktivierungsdomänen) (Baron et al., 1997) oder Repression (KRAB) (Deuschle et al., 1995) spielen. Die unabhängigen Funktionen der DS- und FR-Module des oriP-Replikons, die entsprechend der DNA-Replikation und Replikonerhaltung zugeordnet werden, wurden kürzlich erkannt (Aiyar et al., 1998; Schepers et al., 2001) und legten nahe, dass EBNA1 eine Doppelrolle spielt, wenn es an DS und FR bindet. Die Struktur von EBNA1 und dem FR-Element ließ vermuten, dass FR eine Anordnung von Bindungsresten bereitstellt, an die EBNA1 spezifisch bindet und die Bindung der oriP-Plasmide an zelluläres Chromatin über so genannte AT-Hookdomänen begünstigt (Sears et al., 2003), um eine nukleäre Retention und stabile Plasmiderhaltung sicherzustellen. AT-Hookdomänen sind ein Kennzeichen von HMG-Familienmitgliedern (Harrer et al., 2004), von denen HMGA1a während des ganzen Zellzyklus an Interphase- und mitotisches Chromatin bindet. Es wurde auch erkannt, dass HMGA1 die stabile Erhaltung von oriP-wt-Plasmiden begünstigt, wenn es mit der DNA-Bindungsdomäne von EBNA1 fusioniert wurde (Hung et al., 2001).
Der kombinatorische Ansatz der vorliegenden Erfindung wird hierin unter Bezug auf einige bestimmte Beispiele, d. h. zum Fusionieren der AT-Hook enthaltenden Regionen von EBNA1 oder HMGA1a mit dem DNA-Bindungsprotein TetR, veranschaulicht. Dies offenbarte, dass (i) Hybridursprungsplasmide lange Zeit extrachromosomal erhalten werden können und (ii) bei einer Behandlung mit Doxycyclin, die die Bindung der TetR-DNA-Bindungsdomäne aufhebt, verloren gehen.
Die Erfindung zeigt ferner, dass synthetische, oriP-ähnliche Plasmidreplikons so gentechnisch verändert werden können, dass virale Faktoren oder Domänen vollkommen überflüssig werden. Die vier Bindungsstellen mit geringer Affinität innerhalb von DS (1) können durch tetO-Stellen ersetzt werden, so dass Fusionsproteine, die die TetR-DNA-Bindungsdomäne beherbergen, ebenso den prä-replikativen Komplex an dem Ursprung der DNA-Replikation erneuern können. Es wurde gezeigt, dass solche oriP-ähnlichen Plasmidreplikons wochenlang extrachromosomal erhalten werden können. Die Erfinder haben auch beweisen, dass Doxycyclin, vermutlich weil es die Plasmiderhaltung sowie die DNA-Replikation aufhebt, zu einem starken Verlust solcher Plasmide führt. Solche oriP-ähnlichen Plasmidreplikons beruhen auf Fusionsproteinen mit nur der TetR-DNA-Bindungsdomäne und erfordern für ihre DNA-Replikation kein EBNA1. Infolgedessen können Genvektorplasmide konstruiert werden, die das oriP-ähnliche Replikon, eine Expressionskassette, die für TetR:TetR:HGMA1a, kodiert, und eines oder mehrere weitere Gene von Interesse tragen (ein Beispiel in 7).
Es wurde eine durch Tetracyclin regulierte Genexpression in vivo gezeigt (Schonig et al., 2002), was anzeigt, dass Genvektoren, die in cis reguliert werden können, wahrscheinlich ebenso in vivo funktionieren. Mutanten des tetR-Gens mit einem inversen Phänotyp binden ausschließlich in der Gegenwart des Wirkstoffs an tetO-Motive (Gossen et al., 1995; Urlinger et al., 2000) und funktionieren erwartungsgemäß auch in dem vorliegenden System. Es wird angenommen, dass TetR-Fusionen mit dem inversen Phänotyp die Etablierung der oriP-ähnlichen Plasmide nur in Gegenwart von Tetracyclin oder dessen Derivaten, was eine noch stringentere Bedingung für die in cis regulierten Plasmidgenvektoren ist, erlauben wird.
Die Erfinder entwickelten eine erste Generation von Genvektorplasmiden, die in cis reguliert werden kann. Diese Genvektorplasmide tragen zwei Markergene für eine Selektion (Puromycin- oder Hygromycinresistenz) und Verfolgung des Phänotyps (GFP oder mRFP), die leicht durch Gene von therapeutischem Interesse ersetzt werden können. Solche Genvektorplasmide können in einen viralen Partikel gepackt werden, wenn notwendige Verpackungssignale bereitgestellt werden (Delecluse et al., 1999; Kreppel und Kochanek, 2004). Weitere Gene oder sogar genetische Loci von therapeutischem Interesse können hinzugefügt werden, da das Verpackungsvermögen von auf DNA basierenden Plasmidvektoren oder viralen Vektoren groß, mehr als 100 kbps, sein kann (White et al., 2002).
Die somatische Gen- und Immuntherapie benötigt Vektorsysteme, die mit einfachen Mitteln gesteuert werden können und die Empfängerzelle(n) genetisch nicht verändern. Das hierin vorgestellte, neue Genvektorsystem bietet sowohl Vorteile an als auch dass es zu der Realisierbarkeit innovativer therapeutischer Ansätze beitragen sollte. Zudem stellt das vorliegende System den Vorteil bereit, dass es zu höheren Plasmidkopienanzahlen führt, wie in 6 veranschaulicht ist.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere auf die folgenden Aspekte und Ausführungsformen gerichtet:
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein konditionales Genvektorsystem bereit, das die folgenden Elemente umfasst:
a) einen Vektor, der ein cis-aktives Element und eine oder mehrere kodierende und/oder nicht-kodierende Sequenzen trägt, und
b) einen trans-aktiven Faktor mit einer DNA-Bindungsdomäne, die dazu in der Lage ist, an eine Region des cis-aktiven Elements zu binden, und einer Domäne, die dazu in der Lage ist, das Protein in dem Kern einer Zielzelle zu halten,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Region des cis-aktiven Elements und der DNA-Bindungsdomäne des trans-aktiven Faktors, der dazu in der Lage ist, an die Region des cis-aktiven Elements zu binden, so ausgewählt sind, dass das Halten des Vektors, der das cis-aktive Element trägt, in dem Kern einer Zielzelle durch Zusetzen eines Mittels reguliert werden kann, das dazu in der Lage ist, mit der Bindung des trans-aktiven Faktors an das cis-aktive Element zu interferieren.
Der Begriff „Erhaltung/Halten", wie er hierin offenbart ist, betrifft einen wichtigen Effekt dieser Erfindung, d. h. den Effekt des Haltens eines Vektors in einer gewünschten Zielzelle solange dies gewünscht ist, zum Beispiel bei dem Versuch, ein Tier oder einen Menschen durch Gentherapie zu behandeln. „Erhaltung/Halten", wie es hierin verwendet wird, besitzt eine sehr spezielle Bedeutung, die klar von den verwandten Begriffen, die derzeit in dem Gebiet der Wissenschaft verwendet werden, unterschieden werden sollte: mit „Erhaltung/Halten" ist gemeint, dass ein Element, in dem Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein trans-aktiver Faktor, fest an den Kern einer Zielzelle, insbesondere an das Chromatin-Gerüst des Kerns, gebunden ist. „Fest verbunden", wie es hierin verwendet wird, meint, dass das entsprechende Element während aller Phasen des Zellzyklus (G1-, S-G2-Phasen des Zellzyklus) und insbesondere einschließlich der Mitose, in der Zelle gehalten wird.
Der Begriff „Erhaltung/Halten" kann daher auch als Bindungsvermögen an mitotisches Chromatin definiert werden. Es wird angegeben, dass der obige Begriff streng von anderen Eigenschaften unterschieden werden muss, die zum Beispiel durch nukleäre Lokalisierungssequenzen (NLS) gezeigt sind. Viele Proteine, zum Beispiel Transkriptionsfaktoren und strukturelle nukleäre Protein, müssen von dem Cytosol in das Innere des Kerns bewegt werden. Sie werden aufgrund ihrer nukleären Lokalisierungssequenz zu dem Kern hin gesteuert. Diese Proteine werden aktiv durch die Poren in der Kernhülle in das Innere transportiert. Diese NLS können jedoch nur als ein Transportsignal angesehen werden und stellen kein „Halten", wie sie hierin erläutert wurde, d. h. eine starke (und umkehrbare) Bindung der Proteine an die Bestandteile des Kerns der Zielzelle, bereit. Die Wirkung des Vektorsystems der vorliegenden Erfindung kann daher auch als „Plasmiderhaltung und/oder nukleare Retention" bezeichnet werden.
Die Begriffe „cis-aktives Element" und „trans-aktiver Faktor", wie sie hierin verwendet werden, haben die Bedeutung wie sie allgemein in dem Gebiet der Wissenschaft verwendet wird. Cis-aktive Elemente werden gewöhnlich als DNA-Sequenzen in der Nachbarschaft des strukturellen Abschnitts eines Gens oder anderweitig als genetische Einheit definiert, die funktional erforderlich sind. Trans-aktive Faktoren sind Faktoren, die gewöhnlich als Proteine angesehen werden und zum Beispiel zur Steuerung der Genexpression an die cis-aktiven Sequenzen binden.
Fachleute können leicht bestimmen, welche Proteindomänen dazu in der Lage sind, das Protein in dem Kern einer Zielzelle zu halten oder nicht. Dies kann zum Beispiel durch Isolieren und Identifizieren von Proteinen, die fest an Interphase- oder mitotisches Chromatin einer Zelle während des ganzen Zellzyklus binden, bestimmt werden.
Ein Beispiel für einen trans-aktiven Faktor in dem Umfang der hierin angegebenen Definitionen ist wt-EBNA1, das oben erwähnt wurde und unten erörtert wird und auch in 2A veranschaulicht ist. Darin ist das Wildtyp-EBNA1-Genprodukt des Prototyp-EBV-Stamms B95.8 mit konstruierten funktionalen Domänen und seinen Aminosäureresten gezeigt. EBNA1 besitzt daher eine DNA-Bindungsdomäne, die dazu in der Lage ist, an eine Region des cis-aktiven Elements, das in diesem Fall die FR-Sequenz von oriP ist, zu binden. Dementsprechend ist oriP hier das entsprechende cis-aktive Element. Des Weiteren zeigt EBNA1 eine Domäne, die dazu in er Lage ist, das Protein in dem Kern einer Zielzelle zu halten, was in 2A mit „Chromatinassoziation" bezeichnet ist.
Es wird jedoch explizit angegeben, dass das von EBV abgeleitete EBNA1-oriP-System nicht das Prinzip der vorliegenden Erfindung zeigt, da die Erhaltung eines Vektors, der das cis-aktive Element oriP tragt, in dem Kern einer Zielzelle nicht durch Zusetzen eines Mittels, insbesondere einer niedermolekularen Verbindung, die dazu in der Lage ist, mit der Bindung von EBNA1 an oriP zu interferieren, reguliert werden kann. Das oriP-EBNA1-System funktioniert daher nicht in dem Sinn der vorliegenden Erfindung, kann jedoch so, wie unten erläutert wird, modifiziert werden, um die hierin dargestellten Probleme zu lösen.
Der Begriff „niedermolekulare Verbindungen", wie er hierin verwendet wird, ist als eine Gruppe von Verbindungen mit einem Molekulargewicht von zwischen 50 und 2000, bevorzugt 100 bis 1000, zu verstehen.
Gemäß einer Ausführungsform ist das in der Erfindung verwendete cis-aktive Element von einem natürlich vorkommenden cis-aktiven Element abgeleitet, wobei die Region, die für das Binden des cis-aktiven Elements an den entsprechenden natürlich vorkommenden trans-aktiven Faktor bereitgestellt wird, durch eine heterologe DNA-Sequenz ersetzt wird und der trans-aktive Faktor von einem natürlich vorkommenden trans-aktiven Faktor abgeleitet ist, in dem die DNA-Bindungsdomäne, die dazu in der Lage ist, an eine Region des cis-aktiven Elements zu binden, durch eine heterologe Aminosäuresequenz ersetzt wird.
Für diese Ausführungsform kann die oben angegebene Modifizierung des oriP-EBNA1-Systems auch als Beispiel dienen. Da die Bindung zwischen oriP und EBNA1 nicht durch ein interferierendes Mittel beeinsträchtigt oder unterbrochen werden kann, werden beide Sequenzen, d. h. die DNA-Bindungsdomäne, die dazu in der Lage ist, an eine Region der FR-Region von oriP zu binden, durch eine heterologe Sequenz, zum Beispiel durch TetR, ersetzt und die FR-Region von oriP wird entsprechend durch ein tetO-Fragment ersetzt. Nach dieser Modifizierung wird sich ein Vektorsystem ergeben, dass alle Elemente aufweist, wie sie in dem ersten Aspekt der Erfindung angegeben sind, d. h. es kann in vivo und in vitro durch ein interferierendes Mittel, in diesem speziellen Fall durch Doxycyclin, reguliert werden.
Der Begriff „heterologe" Sequenz ist daher im Besonderen nicht beschränkt und umfasst den Ersatz der natürlich vorkommenden Sequenzen durch alle anderen Sequenzen, unabhängig davon, ob sie von einer verwandten oder nicht verwandten Quelle abgeleitet wurden (in dem Fall von EBV kann sie z. B. von einem anderen Virus oder, wie oben erläutert wurde, von einer prokaryotischen Quelle abgeleitet sein).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das cis-aktive Element natürlich vorkommend und ist ausgewählt aus dem Plasmidursprung der DNA-Replikation des Epstein-Barr-Virus, oriP genannt, oder von DNA-Motiven, an die trans-aktive Faktoren ortsspezifisch binden, wie beispielsweise der lacO-Operator, GAL4-Bindungsstellen, OR1/2, der tetO- Operator oder der lexA-Operator, die entsprechend in E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Phage Lambda, Transposon Tn10 und E. coli zu finden sind.
Wie oben erläutert wurde, müssen solche natürlich vorkommenden cis-aktiven Elemente modifiziert werden, um sie an die Regulierung eines interferierenden Mittels anzupassen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die DNA-Bindungsdomäne des trans-aktiven Faktors bevorzugt ausgewählt aus EBNA1, LacI-Repressor, GAL4-Protein, Cro-Protein, dem LexA-Protein oder Tet-Repressor, die entsprechend in Epstein-Barr-Virus, E. coli, Saccharomyces cerevisae, Phage Lambda, Transposon Tn10, E. coli oder Menschen zu finden sind.
Die Domäne, die dazu in der Lage ist, den trans-aktiven Faktor in dem Kern einer Zielzelle zu halten, ist ferner vorzugsweise ausgewählt aus EBNA1, Histon H1 oder HMGA1a.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Bindungsregion des cis-aktiven Elements eine oder mehrere tetO-(tet-Operator-), lacO-(lac-Operator)-Stellen oder andere Operator-Stellen, die von cis-aktiven Elementen, die nicht in der Zielzelle des Genvektors vorhanden sind, abgeleitet sind. Diese Einschränkung muss in Betracht gezogen werden, um eine spezifische Bindung an einer ungeeigneten Stelle des trans-aktiven Faktors der Erfinung in der Zielzelle (was zu einem Bindungswettbewerb mit dem Vektor, der das cis-aktive Element der Erfindung trägt, führt) zu verhindern.
Insbesondere hat sich tetO als in der vorliegenden Erfindung bevorzugt herausgestellt, da dessen Bindung an TetR in Gegenwart von Doxycyclin als interferierendem Mittel unterbrochen werden kann.
Das Vektorsystem der Erfindung umfasst daher bevorzugt eine Bindungsregion des cis-aktiven Elements, das aus zumindest 5 × tetO- bis 200 × tetO-, vorzugsweise 10 × tetO- bis 100 × tetO-, besonders bevorzugt 20 bis 40 × tetO-Stellen oder zumindest 5 × lacO- bis 200 × lacO-, vorzugsweise 10 × lacO- bis 100 × lacO-, vorzugsweise 20 bis 40 × lacO-Stellen besteht.
Die DNA-Bindungsdomäne des trans-aktiven Faktors ist bevorzugt TetR (Tet-Repressor) oder LacI (Lac-Repressor), wenn er in Verbindung mit den oben angegebenen Bindungsregionen der cis-aktiven Elemente verwendet wird.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist daher der trans-aktive Faktor von EBNA1, in dem die carboxy-terminalen Sequenzen durch TetR oder LacI ersetzt wurden, abgeleitet. Genauer gesagt, jedoch eher als bevorzugtes Beispiel statt einer Einschränkung, können die carboxy-terminalen Sequenzen als Aminosäuren 379 bis 641, besonders bevorzugt 459 bis 604, wie in 2A gezeigt ist, definiert werden. Der trans-aktive Faktor nimmt daher bevorzugt die Form EBNA1:TetR an (siehe 2B).
Noch mehr bevorzugt ist der trans-aktive Faktor in dem Vektorsystem der vorliegenden Erfindung HGMA1 oder Histon H1, die mit TetR oder LacI fusioniert sind, zum Beispiel TetR:TetR:HMGA1a.
Der Vektor, der das cis-aktive Element und eine oder mehrere kodierende und/oder nicht kodierende Sequenzen trägt und in dem vorliegenden Vektorsystem verwendet wird, ist bevorzug ein Plasmid.
Die von dem Vektor getragene, kodierende Sequenz ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Antigenen, selektierbaren und phänotypischen Markerproteinen und Genen, die einen somatischen Gendefekt in der Zielzelle (den Zielzellen) des Genvektors komplementieren. Somatische Gendefekte in diesen Genen (und Erkrankungen) und Gene, die diese komplementieren, können aus den folgenden ausgewählt sein: Hämoglobin alpha, beta, gamma, delta (Thalassämie); gewöhnlichem Gammaketten-Cytokinrezeptor (SCID); Adenosindeaminase (ADA-Immundefizienz); Brutons Tyrosinkinase (B-Zell-Immundefizienz); Gerinnungsfaktor VIII (Hämophilie A); Gerinnungsfaktor IX (Hämophilie B) und lysosomalen Speichererkrankungen (Morbus Gaucher, Mucopolysaccharidose usw.).
Der Vektor kann kodierende Sequenzen von ungefähr 120 kb tragen.
Daneben kann der Vektor ferner nicht kodierende Sequenzen, zum Beispiel Promotorsequenzen, tragen, um die Transkription der einen oder mehreren darin enthaltenen, kodierenden Sequenzen zu steuern.
Alle essentiellen Elemente des Vektorsystems der Erfindung sind bevorzugt auf einem einzigen Vektor vorhanden. Ein beispielhafter und bevorzugter Vektor dieser Art ist in 7 gezeigt. Er trägt das cis-aktive Replikon und den trans-aktiven Faktor TetR:TetR:HMGA1a, der in der Mitte der Karte angegeben ist. In vielzelligen Zellen sind zwei weitere Markergene, die für destabilisiertes GFP und Hygromycin B-Phosphotransferase kodieren, funktional, wohingegen das Gen β-Lactamase eine Ampicillinresistenz in E. coli verleiht.
Dies ist der Grund, warum die vorliegende Erfindung als „Vektorsystem" bezeichnet wird, da sie zwei essentielle Elemente, d. h. ein cis- aktives und ein trans-aktives Element, separat oder kombiniert in nur einem einzigen Vektor bereitstellen kann.
Das interferierende Mittel, wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist so ausgewählt, dass es an das bestimmte cis-aktive System, das verwendet wird, angepasst werden kann, es kann jedoch bevorzugt ausgewählt sein aus Doxycyclin, Tetracyclin, Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG), komplexierenden Metall-Ionen, vorzugsweise Zn²⁺, oder Hormonen.
Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine Wirtszelle bereit, die mit einem Vektor, wie er oben definiert wurde, transfiziert wurde. Der trans-aktive Faktor wird auch von diesem Vektor kodiert. Die Wirtszelle ist vorzugsweise eine humane oder tierische Stammzelle, bevorzugt eine hämatopoietische Stammzelle, eine T-Zelle oder eine B-Zelle.
Gemäß einem dritten Aspekt stellt die Erfindung eine kombinierte Zubereitung bereit, die: a) das Vektorsystem, wie es oben definiert ist und b) das interferierende Mittel, wie es hierin definiert ist, umfasst.
In dieser kombinierten Zubereitung sind die Bestandteile a) und b) zur aufeinander folgenden Verabreichung vorgesehen (wie weiter unten erläutert werden wird).
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die das Vektorsystem, eine Wirtszelle oder eine kombinierte Zubereitung, wie sie hierin offenbart sind, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel enthält.
Die Inhaltsstoffe der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet, wo sie mit geeigneten Trägern oder Hilfsstoffen in Dosen zum Behandeln oder Verbessern der Erkrankung vermischt werden. Eine solche Zusammensetzung kann (neben dem Inhaltsstoff und dem Träger) auch Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren, die Löslichkeit fördernde Mittel und andere Materialien, die in der Wissenschaft allgemein bekannt sind, enthalten. Der Begriff „pharmazeutisch annehmbar" meint ein nicht-toxisches Material, das die Effektivität der biologischen Aktivität des Wirkstoffs (der Wirkstoffe) nicht beeinträchtigt. Die Eigenschaften des Trägers werden von dem Verabreichungsweg abhängen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ferner andere Mittel, die entweder die Aktivität oder die Verwendung bei der Behandlung verstärken, enthalten. Solche zusätzlichen Faktoren und/oder Mittel können in der pharmazeutischen Zusammensetzung eingeschlossen werden, um eine synergistische Wirkung zu erzeugen oder Nebenwirkungen zu minimieren.
Techniken zur Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung können in „Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, letzte Ausgabe, gefunden werden. Wenn die Zusammensetzungen jeweils für medizinische Zwecke verwendet werden sollen, werden sie eine therapeutisch wirksame Dosis des entsprechenden Inhaltsstoffs enthalten. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich ferner auf die Menge der Verbindung/des Inhaltsstoffs, die dazu ausreicht, zu einer Verbesserung von Symptomen, z. B. einer Behandlung, Heilung, Vorbeugung, oder Verbesserung solcher Zustände zu führen. Die intravenöse Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung an einen Patienten wird bevorzugt.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf die Verbindung des Vektorsystems oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hämophilie, Diabetes, rheumatoider Arthritis, genetischer Immundefizienz und Graft-Versus-Host-Krankheit gerichtet.
Ein Verfahren zum Behandeln eines Patienten, einschließlich dem Schritt des Verabreichens einer therapeutisch wirksamen Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie sie hierin offenbart ist, an einen Patienten mit dem Bedarf nach einer solchen Behandlung, wird unten veranschaulicht. Ein solches Behandlungsverfahren folgt dem folgenden Protokoll:
Ein Vektor, der bevorzugt alle essentiellen und ferner nicht essentielle Elemente der Erfindung, die auf einem einzigen Vektor angeordnet wurden, umfasst, wird in eine Wirtszelle, bevorzugt eine hämatopoietische Stammzelle übertragen. Die Wirtszellen und die darin enthaltenen Vektoren werden in vitro vermehrt und anschließend an einen Patienten verabreicht, der an einer bestimmten Erkrankung leidet. In dem Patienten bindet das exprimierte trans-aktive Element über seine DNA-Bindungsdomäne an die Bindungsregion des cis-aktiven Elements auf dem Vektor, wodurch der Vektor über seine Erhaltungsdomäne an den Kern der Zielzelle in dem Patienten bindet. Die genetischen Informationen gehen daher weder schnell durch den spontanen Abbau durch zelluläre Nukleasen verloren noch werden sie durch Einbauen der genetischen Informationen in das Chromosom der Empfängerzelle erhalten. Stattdessen werden sie reversibel in dem Kern der Zielzelle erhalten.
Im Verlauf der Behandlung wird die kodierende Sequenz exprimiert, wodurch dem Patienten das therapeutisch erforderliche Produkt bereitgestellt wird. Wenn die Behandlung vollständig ist oder wenn sie unterbrochen werden soll, wird das interferierende Mittel an den Patienten verabreicht, das zu einer Unterbrechung der Bindung des trans-aktiven Elements an das cis-aktive Element führt und somit den Vektor freisetzt, der dann durch den Abbau von zellulären Nukleasen aus der Zielzelle entfernt wird.
Solange sie nicht anders definiert sind, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie allgemein von Fachleuten verstanden wird, an die sich diese Erfindung richtet. Daneben sind die Materialien, Methoden und Beispiele lediglich veranschaulichend und sollen in keinster Weise einschränken.
Die Erfindung ist ferner durch die begleitenden Figuren veranschaulicht, in denen folgendes gezeigt wird:
1: Schematischer Überblick über das oriP-Wildtyp-(wt-)Replikon und das Hybridreplikon 20xtetO. Das virale Replikon oriP ist mit den beiden Elementen „Familie von Widerholungen" und „Doppelsymmetrie" gezeigt, die entsprechend 20 und 4 EBNA1-Bindungsstellen zeigen. Jede EBNA1-Bindungsstelle ist 30 bps groß; das so genante rep*-Element ist ein Hilfselement und kann unter bestimmten Bedingungen zu der DNA-Replikation der oriP-Plasmide beitragen. Die Modifizierung des Hybridreplikons 20xtetO erzeugt eine Anordnung von zwanzig tetO-Bindungsstellen (5'-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3'), an die das TetR-Protein mit hoher Affinität bindet.
2 Konstruktion von trans-aktiven Faktoren und Zelllinien. (A) Gezeigt ist das Wildtyp-EBNA1-Genprodukt des Prototyp-EBV-Stamms B95.8 mit den funktionalen Domänen und ihren Aminosäureresten. (B) Das Fusionsgenprodukt EBNA1:TetR mit der amino-terminalen Domäne von EBNA1, die über eine künstliche Verknüpfungsdomäne [(SG₄]₅] mit der vollständigen kodierenden Region des tetR-Genoms verknüpft ist, gefolgt von einer Domäne F, einer transkriptionalen Aktivierungsdomäne, die von VP16 abgeleitet ist (Krueger et al., 2003). Im Gegensatz zu Wildtyp-EBNA1 in (A) ist ungefähr die Hälfte der Gly-Ala-Wiederholungen, wie angegeben (Δ) deletiert, ohne dass dies funktionale Konsequenzen hat. (C) Das dimere Fusionsgenprodukt TetR:TetR:HMGA1a mit zwei tetR-Genen, die über die künstliche Verknüpfungsdomäne miteinander verknüpft sind, wie in (B). (D) Western Blot-Analyse der elterlichen HEK293-Zelllinie (linke Bahn) und dessen Derivaten, die EBNA1 (mittlere Bahn) und EBNA1 plus EBNA1:TetR (rechte Bahn) exprimieren. Die Proteine wurden mit zwei monoklonalen Antikörpern, die gegen den Carboxy-Terminus von EBNA1 und TetR gerichtet sind, nachgewiesen. (E): Western Blot-Analyse der elterlichen HEK293-Zelllinie (linke Bahn) und dessen Derivaten, die TetR:HMGA1a (rechte Bahn) exprimieren. Das Protein wurde mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen TetR gerichtet ist, nachgewiesen.
3: TetR-DNA-Bindungsdomäne, die mit EBNA1 fusioniert ist, verleiht ein Halten des Plasmids. Die Testplasmide 2832 (oriP-wt) und 2835 (20xtetO) wurden separat in die HEK-Zelllinie, die sowohl EBNA1 als auch EBNA1:TetR exprimiert, transfiziert. Die Zellen wurden in Gegenwart selektiver Konzentrationen von Puromycin (125 ng/ml) mit oder ohne 2,0 μg/ml Doxycyclin (DOX) wenige Tage lang kultiviert, bis die Zellen Konfluenz erreichten. Niedermolekulare DNA wurde gemäß dem Hirt-Verfahren isoliert, mit einem Restriktionsenzym, um die Testplasmide zu linearisieren, und DpnI, um nicht replizierte Plasmide, die das dam-Methylierungsmuster, das die Plasmide während ihrer Vermehrung in E. coli erhalten hatten, behalten, zu verdauen, gespalten. Die vollständig lange, DpnI-resistente Plasmid-DNA wurde mittels Southern Blot-Analyse mit einer radioaktiven Sonde, die nur mit dem prokaryotischen Plasmidrückgrat der Testplasmide 2832 und 2835 hybridisiert, nachgewiesen. Während Doxycyclin nahezu keine Wirkung auf das oriP-wt-Plasmid 2832 zeigte, war kein Signal nachweisbar, wenn die Zellen mit dem Hybrid 20xtetO-Testplasmid 2835 transfiziert und in Medien gehalten wurden, die Doxycyclin und den selektiven Wirkstoff Puromycin enthielten. Die linke Bahn zeigt das oriP-wt-Plasmid 2832 in der HEK293-Zelllinie, das nur EBNA1 exprimiert. Das stärkere Signal gibt eine höhere Kopienanzahl dieses Plasmids an, wenn ausschließlich EBNA1 exprimiert wird.
4: Doxycyclin beeinflusst die Dauer der kurzzeitigen Erhaltung des Plasmids. In diesem Versuch wurden drei verschiedene HEK293-Zelllinien verwendet, die kein virales Protein (Kontrolle, Felder in der oberen Reihe), EBNA1 (Felder in der mittleren Reihe) und sowohl EBNA1 plus EBNA1:TetR (Felder in der untere Reihe) exprimieren. Es wurden zwei verschiedene Testplasmide untersucht, die für das rote Fluoreszenzprotein (mRFP) kodieren. Das Plasmid 3154 trägt Wildtyp-oriP, während 3155 ein Testplasmid mit dem Hybridursprung und 20 tetO-Stellen ist (Tab. 1). Die drei Zelllinien wurden mit den Testplasmiden transfiziert und nur zwei bis vier Tage lang mit Puromycin selektiert, bis die meisten der adhärenten Zellen unter UV-Licht im Mikroskop (Tag 0) hellrot erschienen. Der Selektionsdruck wurde verringert und die Zellen wurden für einen Zeitraum von 12 Tagen in normalen Zellkulturmedien mit oder ohne Doxycyclin (2,0 μg/ml) gehalten. Zu diesem Zeitpunkt schienen keine oder nur sehr wenige Zellen mRFP in elterlichen HEK293-Zellen, die mit den beiden Testplasmiden transfiziert worden waren, zu exprimieren (obere Reihe und Daten nicht gezeigt), was angibt, dass beide Testplasmide in Abwesenheit von EBNA1 und EBNA1:TetR schnell verloren gingen. In HEK293-Zellen, die EBNA1 exprimieren und mit dem oriP-wt-Testplasmid 3154 transfiziert worden waren, exprimierte nach 12 Tagen noch ein beachtlicher Anteil der Zellen mRFP in Gegenwart oder Abwesenheit von Doxycyclin (mittlere Reihe +/– DOX). HEK293-Zellen, die beide trans-Faktoren exprimieren und mit dem Hybridreplikon-Testplasmid 3155 transfiziert wurden, waren nur dann mRFP-positiv, wenn die Zellen in Abwesenheit von Doxycyclin kultiviert wurden (untere Reihe).
5: Hybridursprungsplasmide gehen in der Gegenwart von Doxycyclin stark verloren. Das oriP-wt (3230)-Plasmid und die beiden Hybridursprungsplasmide 20xtetO (3231) und 40xtetO (3293) wurden in HEK293-Zellen transfiziert, die sowohl EBNA1 als auch TetR:TetR:HMGA1a exprimieren (2E) und 19 Tage lang mit Hygromycin (80 μl/ml) selektiert. Zu diesem Zeitpunkt (Tag 0) wurde die Selektion entfernt und die Zellen wurden 12 Tage lang mit oder ohne Doxycyclin (DOX, 2,5 μg/ml) weiter kultiviert. An Tag 8 und 12 wurde niedermolekulare DNA gemäß dem Hirt-Verfahren hergestellt. Die gemäß Hirt extrahierten DNAs wurden auch aus den gleichen Zellen hergestellt, die unter kontinuierlicher Selektion mit Hygromycin gehalten wurden. Die DNAs wurden mit DpnI, um Spuren nicht replizierter Plasmid-DNAs zu verdauen, und einem Restriktionsenzym (PmlI), das nur die zelluläre DNA spaltet, gespalten und nach einer Elektrophorese auf Agarosegel mittels Southern Blot-Hybridisierung mit einer radioaktiven Sonde, die mit dem prokaryotischen Rückgrat der Genvektorplasmide hybridisiert, analysiert. Die Kontrollbahn gibt das Muster der Wanderung von 500 pg DNA des von E. coli abgeleiteten Kontrollplasmids 3230 mit den Positionen der monomeren superspiralisierten (supercoiled), kovalent geschlossenen, zirkulären (ccc), monomeren, mit offenen Kreisen (oc) und multimeren (mult.) Formen der Plasmid-DNA an. Die ccc- und oc-DNA-Formen geben das Vorhandensein extrachromosomaler Plasmide während des ganzen Versuchs an. Nach Zusetzen von Doxycyclin an Tag 8 und 12 gehen die Hybridursprungsplasmide 20xtetO und 40xtetO stark verloren, werden jedoch mit höheren Kopienanzahlen erhalten als wt-oriP mit oder ohne Hygromycinselektion in Abwesenheit von Doxycyclin.
6: Doxycyclin reguliert die Expressionsmengen von GFP, das von dem Vektor kodiert wird, herunter und bewirkt den Verlust der Plasmidkopienanzahlen in Versuchen zur Plasmidrückgewinnung. Das oriP-wt (3230)-Plasmid und die beiden Hybridursprungsplasmide 20xtetO (3231) und 40xtetO (3293) wurden in HEK293-Zellen transfiziert, die sowohl EBNA1 als auch TetR:TetR:HMGA1a exprimieren, und so, wie in 5 beschrieben ist, behandelt. An Tag 4, 8 und 12 wurden die Zellen nach Weglassen von Hygromycin aus den Zellkulturmedien mittels FACS auf die Expression von GFP, das von allen drei Plasmiden kodiert wurde, analysiert. An Tag 8 und 12 wurden die gemäß Hirt extrahierten DNAs zubereitet und, wie in 5 beschrieben ist, mit DpnI gespalten. Von jeder Probe wurden 600 ng DNA mittels Elektroporation in kompetente DH10B-E. coli-Zellen transformiert. Nach phänotypischer Expression wurden verschiedene Fraktionen der E. coli-Kulturen auf Ampicillin (100 μg/ml) enthaltenden LB-Platten ausplattiert und 20 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Die Kolonien wurden ausgezählt und die Gesamtanzahl der ampicillinresistenten Zellen in diesen Versuchen der Plasmidrückgewinnung wurde berechnet. Die Kolonienanzahlen werden für alle drei Testplasmide mit oder ohne Doxycyclin (DOX), wie angegeben ist, bereitgestellt.
7: Genkarte des Plasmids 3333. Gezeigt ist ein Genvektorplasmid 3333, das sich in elterlichen HEK293-Zellen repliziert und extrachromosomal in diesen gehalten wird. Das cis-aktive Replikon und der trans-aktive Faktor TetR:TetR:HMGA1a sind in der Mitte der Karte angegeben. In vielzelligen Zellen sind zwei weitere Markergene, die für destabilisiertes GFP und Hygromycin B-Phosphotransferase kodieren, funktional, während das Gen β-Lactamase eine Ampicillinresistenz in E. coli verleiht.
Beispiele
Die prokaryotische TetR-DNA-Bindungsdomäne, die mit EBNA1 fusioniert ist, verleiht eine Plasmiderhaltung.
Die Erfinder wollten zwei Arbeitshypothesen überprüfen: (i) Kann eine heterologe, jedoch funktional ähnliche Domäne die DNA-Bindungsdomäne von EBNA1 ersetzen? (ii) Ist es möglich, eine solche geeignete DNA-Bindungsdomäne zu identifizieren, deren Bindung konditional ist, um eine Umschaltung zum Steuern der Erhaltung von oriP-Plasmiden einzustellen? Auf diese Ziele gerichtet konstruierten die Erfinder zuerst ein synthetisches DNA-Bindungsprotein, um die Funktion von EBNA1 in Bezug auf die Erhaltung von Plasmiden nachzuahmen und ersetzten das FR-Element von oriP entsprechend.
Wie in 2A und B gezeigt ist, war die Bindungsdomäne von EBNA1 deletiert und durch den vollständigen offenen Leserahmen des prokaryotischen DNA-Bindungsproteins TetR ersetzt. Ähnlich wie EBNA1 bildet das tetR-Genprodukt Homodimere und bindet mit sehr hoher Affinität an sein verwandtes DNA-Motiv. Um die saure Transaktivierungsdomäne von EBNA1 an dessen distalem carboxy-terminalem Ende zu ersetzen, verwendeten die Erfinder eine funktional äquivalente Domäne an der gleichen Position (Domäne F in 2B) (Krueger et al., 2003). Dieses chimäre Protein wurde EBNA1:TetR genannt. Das von einem heterologen Promotor exprimierte EBNA1:tetR-Gen wurde mit herkömmlichen Verfahren stabil in die humane Zelllinie HEK293 eingebaut, die bereits ebenso Wildtyp-EBNA1 exprimiert. Wie in 2D gezeigt ist, exprimiert diese Zelllinie beide Proteine. Um eine Bindung von EBNA1:TetR an oriP zuzulassen, ersetzten die Erfinder die vollständige Anordnung von FR, die an der Plasmiderhaltung beteiligt ist, mit einer identischen Anzahl an direkten Wiederholungen, an die TetR mit hoher Affinität bindet. Dieses 2835 genannte Testplasmid (Tab. 1) trägt auch ein selektierbares Markergen für eine Puromycinresistenz und GFP als phänotypischen Marker. Das elterliche Plasmid 2832 ist mit 2835 identisch, außer dass es Wildtyp-oriP trägt.
Die Testplasmide 2832 (oriP-wt) und 2835 (20xtetO) wurden separat in die HEK-Zelllinie, die sowohl EBNA1 als auch EBNA1:TetR exprimiert, transfiziert. Die Zellen wurden einige Tage lang in Gegenwart selektiver Konzentrationen von Puromycin (125 ng/ml) mit oder ohne 2,0 μg/ml Doxycyclin (DOX) kultiviert, bis die Zellen Konfluenz erreichten. Niedermolekulare DNA wurde gemäß dem Hirt-Verfahren isoliert, mit einem Restriktionsenzym, um die Testplasmide zu linearisieren, und DpnI, um nicht replizierte Plasmide, die das dam-Methylierungsmuster, das die Plasmide während ihrer Vermehrung in E. coli erhalten hatten, behielten, zu verdauen, gespalten. Wie in 3 gezeigt ist, wurde die vollständig lange, DpnI-resistente Plasmid-DNA mittels Southern Blot-Analyse mit einer radioaktiven Sonde, die nur mit dem prokaryotischen Plasmidrückgrat der Testplasmide 2832 und 2835 hybridisiert, nachgewiesen. Während Doxycyclin nahezu keine Wirkung auf das oriPwt-Plasmid 2832 zeigte, war kein Signal nachweisbar, wenn die Zellen mit dem Hybrid-20xtetO-Testplasmid 2835 transfiziert und in Medien gehalten wurden, die Doxycyclin und den selektiven Wirkstoff Puromycin enthielten. Dieses Ergebnis ließ vermuten, dass (i) sich das Testplasmid 2835, das ein Hybridreplikon mit einem Multimer von 20 tetO-Stellen an der Position der FR-Anordnung trägt, replizieren kann und erhalten wird und (ii) Doxycyclin, das mit der DNA-Bindung von TetR interagiert, die Erhaltung dieses Plasmidvektors aufhebt.
Um die Faktoren, die zu einer stabilen Erhaltung (und Replikation) des Hybridreplikons beitragen, weiter zu analysieren, verwendeten die Erfinder drei verschiedene Zelllinien, die kein virales Protein (elterliche HEK293-Zelllinien), EBNA1 und sowohl EBNA1 plus EBNA1:TetR exprimieren. Für diese Versuchsgruppe wurden zwei verschiedene Testplasmide verwendet, die beide für das rote Fluoreszenzprotein (mRFP) kodieren (Campbell et al., 2002). Das Plasmid 3154 trägt Wildtyp-oriP, während 3155 ein Testplasmid mit dem Hybridursprung und 20 tetO-Stellen ist (Tab. 1). Die drei Zelllinien wurden mit den Testplasmiden transfiziert und nur zwei bis vier Tage lang mit Puromycin selektiert, bis die meisten der adhärenten Zellen unter UV-Licht im Mikroskop (Tag 0, 4) hellrot erschienen. Der Selektionsdruck wurde verringert und die Zellen wurden für einen Zeitraum von 12 Tagen in normalen Zellkulturmedien mit oder ohne Doxycyclin (2,0 μg/ml) gehalten. Zu diesem Zeitpunkt schienen keine oder nur sehr wenige Zellen mRFP in elterlichen HEK293-Zellen, die mit den beiden Testplasmiden transfiziert worden waren, zu exprimieren (4 obere Reihe und Daten nicht gezeigt), was angibt, dass beide Testplasmide in Abwesenheit von EBNA1 und EBNA1:TetR schnell verloren gingen. In HEK293-Zellen, die EBNA1 exprimieren und mit dem oriP-wt-Testplasmid 3154 transfiziert worden waren, exprimierte nach 12 Tagen noch ein beachtlicher Anteil der Zellen mRFP in Gegenwart oder Abwesenheit von Doxycyclin (+/– DOX, in 4 mittlere Reihe). HEK293-Zellen, die beide trans-Faktoren exprimieren und mit dem Hybridreplikon-Testplasmid 3155 transfiziert wurden, waren nur dann mRFP-positiv, wenn die Zellen in Abwesenheit von Doxycyclin kultiviert worden waren (4 untere Reihe). Dieses Ergebnis bestätigte, dass die Erhaltung des Hybridursprungsplasmids von der Funktion des EBNA1:TetR-Proteins, das in Gegenwart von Doxycyclin nicht an tetO-Motive bindet, abhängt. Infolgedessen gehen Hybrid-oriP-Replikons stark verloren, wenn Doxycyclin zu den Zellkulturmedien zugesetzt wird.
Konditionale Langzeiterhaltung von Hybrid-oriP-Plasmiden.
Es wird erwartet, dass der amino-terminale Teil in dem EBNA1:TetR-Fusionsprotein mit Chromatin assoziiert, was vermutlich für die Plasmiderhaltung essentiell ist. Da sich Wildtyp-oriP-Plasmide in Gegenwart eines anderen chimären Proteins, HMGA1a:EBNA1 (Hung et al., 2001) replizieren und stabil erhalten werden, argumentierten wir, dass ein neues chimäres Protein, das aus der kodierenden Sequenz von HMGA1a bestand und mit dem TetR-DNA-Bindungsgen fusioniert war, ebenso funktional sein könnte. Es war auch ersichtlich, dass die Plasmidkopienanzahl von sowohl Wildtyp-oriP als auch dem 20xtetO-Hybridreplikon in den Zellen erheblich geringer war, wenn EBNA1 und EBNA1:TetR co-exprimiert wurden (3), da vermutlich die so genannte Verknüpfungsregion (2), die sowohl in EBNA1 als auch in EBNA1:TetR angeordnet war, heterotypische Aggregationen und eine Beeinträchtigung der Funktion verursachte. Es schien daher plausibel, dass ein Fusionsprotein, das aus HMGA1a und TetR bestand, diese Probleme umgehen würde. Um die Wirksamkeit des Systems zu erhöhen, verwendeten die Erfinder ein dimeres Einzelketten-tetR-Gen (Krueger et al., 2003), das, im Gegensatz zu EBNA1:TetR, das nur als Homodimere bindet, als einzelnes Protein an tetO-Motive bindet.
Eine Expressionskassette mit dem HMGA1a:TetR-Gen wurde stabil in die elterliche Zelllinie HEK293 EBNA1 eingebaut (2E). Die Plasmide, die oriP (3230, Tab. 1) und zwei verschiedene Hybridreplikonplasmide mit 20 (20xtetO; 3231) oder 40 (40xtetO; 3293) Kopien des tetO-Motivs und eine destabilisierte Version von GFP (Li et al., 1998) (Tab. 1) tragen, wurden einzeln in diese Zellen transfiziert, die dann 19 Tage lang unter Hygromycinselektion (80 μg/ml) gebracht wurden. Zu diesem Zeitpunkt (Tag 0) wurde die Selektion entfernt und die Zellen wurden 12 Tage lang mit oder ohne Doxycyclin (2,5 μg/ml) weiter kultivier. An Tag 0, 4, 8 und 12 wurden die Zellen mittels FACS auf die Expression von GFP analysiert. An drei Zeitpunkten (Tag 0, 8 und 12) wurden niedermolekulare DNAs isoliert und mittels Southern Blot-Hybridisierung auf das Vorhandensein des prokaryotischen Rückgrats der Testplasmide analysiert. Die DNAs wurde auch in einem Versuch zur Plasmidrückgewinnung in E. coli elektroporiert, um die Menge an Plasmid-DNA-Molekülen mit Hilfe der Koloniebildung zu quantifizieren.

Am Tag 0 des Versuchs konnten die Plasmid-DNAs mittels Southern Blot-Hybridisierung (5) und Rückgewinnung der Plasmide in E. coli (6) nachgewiesen werden. Die Mehrzahl der Zellpools exprimierte GFP wie erwartet (6). Es war unmittelbar ersichtlich, dass beide Hyridplasmide (20xtetO und 40xtetO) mit höheren Kopienanzahlen als oriP-wt als extrachromosomale DNAs erhalten wurden (5 und 6), obwohl die Zellen keine höheren Mengen von GFP exprimierten (6). Nach Entfernen der Hygromycinselektion, nahmen die Expressionsmengen von GFP in allen Zellpools ab (6). Gleichzeitig wurden die Signalintensitäten in den Southern Blot-Autoradiogrammen schwächer, was einen spontanen Verlust der Plasmid-DNAs anzeigt, wie vorher beachtet wurde (Kirchmaier und Sugden, 1995). In starkem Gegensatz zu dem beobachteten spontanen Verlust gingen die Hybridursprungsplasmide 3231 und 3293 in Gegenwart von Doxycyclin stark verloren, wie anhand der Southern Blot-Analyse (5), den Kolonienanzahlen der aus E. coli rückgewonnenen Plasmide und den Expressionsmengen von GFP (6) offenbart wurde. Die Quantifizierung der Signalstärken in der Southern Blot-Analyse (5 und Daten nicht gezeigt) und die Kolonienanzahlen (6) geben an, dass der Plasmidverlust um einen Faktor von 50 bis 100 in Gegenwart von Doxycyclin induziert wurde. Die Verringerung der GFP-Expression schien nicht so drastisch, es konnte jedoch ein wesentlicher Verlust der GFP-Expression dokumentiert werden (6). Doxycyclin hatte eine vernachlässigbare Wirkung auf das oriP-wt-Plasmid 3230 (5 und 6). In der Gegenwart einer Hygromycinselektion wurden die beiden Hybridplasmide sowie das oriP-wt-Kontrollplasmid für die gesamte Dauer des Versuchs stabil erhalten (31 Tage, 5 und Daten nicht gezeigt). Die Kopienanzahl des oriP- wt-Plasmids war erneut niedriger als diejenigen der beiden Hybridplasmide, von denen das 40xtetO-Hybridplasmid übereinstimmend die höchste Kopienanzahl erreichte (5). Tabelle 1: Übersicht über verschiedene Genvektorplasmide

Elemente Plasmide⁺	Replikon	selektierbarer Marker	phänotypischer Marker
2832 (12,2)	oriP-wt	Puromycin	GFP
2358 (12,0)	20xtetO; DS	Puromycin	GFP
3154 (12,9)	oriP-wt	Puromycin	mRFP
3155 (12,7)	20xtetO; DS	Puromycin	mRFP
3230 (8,8)	oriP-wt	Hygromycin	GFP
3231 (8,7)	20xtetO; DS	Hygromycin	GFP
3293 (8,9)	40xtetO; DS	Hygromycin	GFP

⁺ Anzahl in Klammern gibt die Größe der Genvektorplasmide in kbps an.
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Yates, J. L. und Camiolo, S. M. (1988) Dissection of DNA replication and enhancer activation functions of Epstein-Barr virus nuclear antigen 1. Cancer Cells, 6, 197–205.

Claims

Konditionales Genvektor-System, das die folgenden Elemente umfasst: a) einen Vektor, der ein cis-aktives Element und ein oder mehrere kodierende und/oder nicht kodierende Sequenzen trägt, und b) einen trans-aktiven Faktor, der eine DNA-Bindungsdomäne aufweist, die dazu in der Lage ist, an eine Region des cis-aktiven Elementes zu binden und eine Domäne, die dazu in der Lage ist, das Protein im Kern einer Zielzelle zu halten, wobei halten bedeutet, dass es an das Chromatin-Gerüst gebunden wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Region des cis-aktiven Elementes und die DNA-Bindungsdomäne des trans-aktiven Faktors der dazu in der Lage ist, an die Region des cis-aktiven Elementes zu binden so ausgewählt ist, dass das Halten des Vektors im Kern, der das cis-aktive Element enthält, in einer Zielzelle, durch Zusetzen eines Mittels reguliert werden kann, das dazu in der Lage ist, mit der Bindung des trans-aktiven Faktors an das cis-aktive Element zu interferieren.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei das cis-aktive Element aus einem natürlich vorkommenden cis-aktiven Element gewonnen wird, wobei die Region zur Bindung des cis-aktiven Elementes an den entsprechenden natürlich vorkommenden trans-aktiven Faktor durch eine heterologe DNA-Sequenz ersetzt ist, und dass der trans-aktive Faktor von einem natürlich vorkommenden trans-aktiven Faktor abgeleitet ist, bei dem die DNA-Bindungsdomäne, die dazu in der Lage ist, an eine Region des cis-aktiven Elementes zu binden, durch eine heterologe Aminosäuresequenz ersetzt ist.
Vektorsystem nach Anspruch 2, wobei das cis-aktive Element natürlich vorkommt und aus dem Plasmid-Ursprung der DNA-Replikation des Epstein-Barr-Virus, genannt oriP, oder aus DNA-Motiven ausgewählt ist, an die trans-aktive Faktoren ortspezifisch binden, wie beispielsweise den lacO-Operator, GAL4-Bindungsstellen, OR 1/2, den tetO-Operator oder den lexA-Operator.
Vektorsystem nach Anspruch 1 bis 3, wobei die DNA-Bindungsdomäne des trans-aktiven Faktors aus EBNA1, LacI-Repressor, GAL4-Protein, Cro-Protein, dem LexA-Protein oder Tet-Repressor ausgewählt ist.
Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Domäne, die dazu in der Lage ist, den trans-aktiven Faktor im Kern einer Zielzelle zu halten, aus EBNAI, Histon H1 oder HMGA1a ausgewählt ist.
Vektorsystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindungsregion des cis-aktiven Elementes ein oder mehrere tetO (tet-Operator)-, lacO (lac-Operator)-Stellen oder andere Operator-Stellen enthält, die aus cis-aktiven Elementen abgeleitet sind, die in der Zielzelle des Genvektors nicht vorhanden sind.
Vektorsystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindungsregion des cis-aktiven Elementes aus zumindest 5 × tetO bis 200 × tetO, vorzugsweise 10 × tetO bis 100 × tetO, besonders bevorzugt 20 bis 40 × tetO-Stellen oder zumindest 5 × lacO bis 200 × lacO, vorzugsweise 10 × lacO bis 100 × lacO, vorzugsweise 20 bis 40 × lacO-Stellen besteht.
Vektorsystem nach Anspruch 6 oder 7, wobei die DNA-Bindungdomäne des trans-aktiven Faktors TetR (Tet-Repressor) oder LacI (Lac-Repressor) ist.
Vektorsystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der trans-aktive Faktor aus EBNA1 abgeleitet ist, wobei die Carboxy-terminalen Sequenzen durch TetR oder LacI ersetzt wurden.
Vektorsystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der trans-aktive Faktor HMGA1 oder Histon H1 ist, fusioniert an TetR oder LacI.
Vektorsystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Vektor ein Plasmid ist.
Vektorsystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die kodierende Sequenz, die im Vektor getragen wird, aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Antigenen, selektierbaren und phenotypischen Markerproteinen und Genen besteht, die einen somatischen Gendefekt in der Zielzelle (den Zielzellen) des Genvektors komplementieren.
Vektorsystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das interferierende Mittel aus Doxycyclin, Tetracyclin, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), komplexierenden Metall-Ionen, vorzugsweise Zn²⁺ oder Hormonen ausgewählt ist.
Vektorsystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei alle Elemente des Vektorsystems auf einem einzigen Vektor vorliegen.
Wirtszelle, die mit einem Vektor nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14 transfiziert worden ist.
Wirtszelle nach Anspruch 15, die eine humane oder tierische Stammzelle ist, vorzugsweise eine hematopoietische Stammzelle, eine T-Zelle oder eine B-Zelle, wobei humane embryonale Stammzellen und humane Keimbahnzellen ausgenommen sind.
Kombinierte Zubereitung, die folgendes umfasst: a) das Vektorsystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche; und b) das interferierende Mittel wie es in Anspruch 1 oder 13 definiert ist.
Kombinierte Zubereitung, wobei die Bestandteile a) und b) zur aufeinander folgenden Verabreichung vorgesehen sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das Vektorsystem nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14, eine Wirtszelle nach Anspruch 15 oder 16 und eine kombinierte Zubereitung nach Anspruch 17 oder 18 und einen pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel enthält.
Verwendung des Vektorsystems nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 19 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung der Hämophilie, Diabetes, rheumatoiden Arthritis, einer genetischen Immundefizienz und der Graft-Versus-Host-Krankheit.