DE69933131T2 - Zellen zur produktion von helper-abhängigen adenoviren-vektoren - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Gentherapie und insbesondere die Verwendung und die Entwicklung von Vektoren viralen Ursprungs und von Zelllinien zu deren Herstellung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung der Gentherapie ist die Entwicklung von Vektoren, welche zur Einführung von genetischem Material in Zielzellen in der Lage sind. Um effektiv zu sein, müssen diese Vektoren mehrere Merkmale besitzen: Sie müssen in der Lage sein, große oder mehrere Transgene, einschließlich Genregulationselemente, aufzunehmen, jedoch einfach manipulierbar bleiben, um deren Produktion in pharmazeutischem Maßstab zu ermöglichen. Darüber hinaus ist es essentiell, dass sie sicher und von niedriger Toxizität sind, jedoch das Vermögen zur Einführung der Transgene in effizienter und selektiver Weise in die Zielgewebe erhalten bleibt. Schließlich sollte der Vektor vorzugsweise mit einer geeigneten Retention, Expression und Regulation des Transgens in der Zielzelle kompatibel sein.
  • Derzeit scheinen die viralen Vektoren auf Adenovirus-Basis diejenigen zu sein, welche für Manipulationen am geeignetsten sind, die sie in die Lage versetzen, alle diese Anforderungen zu erfüllen. Bisher werden sie als effektivstes System zur Einführung heterologer Gene in Säugerzellen, sowohl in vivo als auch in Zellen, die in vitro kultiviert wurden, betrachtet (Hitt, M. M., et al. 1997, Advances in Pharmacol. 40, 137-206).
  • Dies beruht auf einigen interessanten Eigenschaften der Adenoviren (Ad), welche eine DNA-Virus-Familie ausmachen (diejenigen, welche den Menschen infizieren, wurden in 57 Serotypen klassifiziert), die durch ein ikosaedrales Kapsid, dem eine äußere Hülle fehlt, gekennzeichnet ist: Sie sind sehr infektiös, aber relativ harmlos, infizieren hauptsächlich Epithelzellen, können jedoch auch Zellen anderer Gewebe infizieren, unabhängig davon, ob sie in der aktiven Replikationsphase vorliegen. Aufgrund ihrer hohen Infektivität in vitro von Zelllinien humanen Ursprungs können sie leicht in großen Mengen hergestellt werden. Darüber hinaus wurde bewiesen, dass Human-DNA-Inserts mittels Ad-Infektion effizient in humane Epithelzellen transferiert werden können (Horvitz, "Adenoviridae and their replication" in Virology, Field und Knipe, Hrsg. Raven Press, NY; 1990; Seiten 1679-1740).
  • Bezüglich der molekularen Biologie des Virus hat Adenovirus, insbesondere das humane Adenovirus, ein lineares doppelsträngiges DNA-Genom von etwa 36 kB, das funktionell in zwei Bereiche, nicht-strukturell und strukturell, aufgeteilt ist. Der erste Bereich umfasst Bereiche, welche für Polypeptide codieren, die in den ersten Stadien der Infektion exprimiert werden, d.h. vor der viralen DNA-Replikation (E-Bereiche), der zweite umfasst Bereiche, welche für Polypeptide codieren, die in den nachfolgenden Stadien des viralen Zyklus exprimiert werden (L-Bereich). Nach der Infektion einer kompetenten Zelle, wenn die virale DNA den Kern erreicht, ist der erste zu transkribierende Bereich der E1a-Bereich, codierend für Proteine, die an der Transaktivierung der anderen Bereiche, sowohl E als auch L, der viralen DNA beteiligt sind. Der anschließend transkribierte E1b-Bereich codiert für Proteine, welche die RNA-Synthese, sowohl die virale als auch diejenige der Wirtszelle, regulieren und die letztere vor dem apoptotischen Effekt schützen, der ansonsten von E1a entfaltet wird. Deshalb sind die E1a/E1b-Funktionen für die virale Replikation essentiell.
  • Der E2-Bereich codiert für Proteine, die direkt an der viralen Replikation beteiligt sind, wie z.B. die virale DNA-Polymerase, das präterminale Protein und Proteine, die an die virale DNA binden. Der E3-Bereich codiert für Proteine, welche für die virale Replikation in kultivierten Zellen nicht erforderlich sind, jedoch in vivo an der Regulation der antiviralen Immunreaktion beteiligt sind. Schließlich enthält der E4-Bereich Gruppen von Genen, deren Produkte die Genexpression der Wirtszelle verringern und die Transkription der E2- und L-Bereiche des viralen Genoms erhöhen.
  • Der L-Bereich des viralen Genoms codiert im Wesentlichen für Proteine des strukturellen Typs oder Proteine, die in irgendeiner Weise an der Assemblierung der viralen Partikel beteiligt sind.
  • In den ersten 40 Jahren nach der ersten Isolierung und Charakterisierung von Ad-Viren nahmen die relevanten Modifizierungen, welche sie zu effizienten Trägern für den Transfer von genetischem Material machten, zu.
  • Insbesondere wurden die Eingriffe an dem Ad-Genom zuerst durchgeführt, um:
    • – das Vermögen des viralen Genoms zur Akzeptanz des Einbaus heterologer Gene zu erhöhen; und
    • – intrazelluläre Toxizität, welche sich aus der Expression von Adenovirus-Genen ergibt, zu eliminieren.
  • Solche Eingriffe bestehen hauptsächlich in der Bereitstellung progressiver Deletionen viraler Bereiche, deren Funktionen in trans bereitgestellt werden.
  • In Vektoren der ersten Generation (abgeleitet von den humanen Ad-Serotypen 2 und 5) beinhaltete die Deletion den E1-Bereich, welches das Virus hinsichtlich des Replikationsvermögens defizient macht, wenn die von einer solchen transkriptionalen Einheit produzierten Proteine nicht in trans bereitgestellt werden.
  • Eine Erhöhung der Größe des heterologen Gens, welches inseriert werden soll, und die Beschränkung der Vermehrung der rekombinanten Viren in Zelllinien, welche einen solchen Defekt komplementieren, da sie Gene des viralen E1-Bereichs konstitutiv exprimieren, wurde erhalten.
  • Jedoch ist die Deletion von E1 nicht per se ausreichend, um die Expression anderer Gene der E- und L-Bereiche vollständig zu eliminieren und um die Replikation viraler DNA zu verhindern. Es folgt, dass in Tieren, die mit diesen Vektoren infiziert wurden, die Anwesenheit viraler Antigene und der Beginn von Immunreaktionen, welche auf die Zerstörung der infizierten Zellen abzielen, nachgewiesen werden (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:4407-4411; 1994). Dies führt zu dem Verlust des Gens von therapeutischem Interesse und zum Beginn von Entzündungsreaktionen. Darüber hinaus kann das Bestehenbleiben eines immunologischen Gedächtnisses dieser Reaktionen die Wirksamkeit einer zweiten Verabreichung eines Adenovirus-Vektors dieses Typs stark verringern (Kozarsky et al., J. Biol. Chem. 269:1-8; 1994).
  • Somit wurden neue adenovirale Vektoren der zweiten Generation, welche verschiedene Kombinationen von Deletionen früher Gene tragen, konstruiert, um das Sicherheitsprofil von Adenovirus-Vektoren zu verbessern. Von Vektoren, die unterschiedlich E1-, E2-, E3- und/oder E4-Deletionen kombinieren, wurde demonstriert, dass sie weniger zytotoxisch in vitro und stabiler in der Mausleber als die klassischen ΔE1-Vektoren der ersten Generation sind (Gao, G-P., 1996, J. Virol. 70:8934-8943; Dedieu, J-F., 1997, J. Virol. 71:4626-4637; Gorziglia, M. I., 1996, J. Virol. 70:4173-4178; Amalfitano, A., 1998, J. Virol. 72:926-933). in vifro-Experimente demonstrierten, dass solche Deletionen die Toxizität effektiv verringerten, jedoch nicht eliminierten.
  • Darüber hinaus wurden Vektoren, die zusätzliche Deletionen trugen, welche das Vermögen des viralen Genoms zur Akzeptanz der Insertion heterologer Gene weiter erhöhten, hergestellt (Englehardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:6196-6200; 1994; Bett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8802-8806; 1994; Yeh, P., et al. 1996, J. Virol. 70:559-565). Jedoch überstieg die maximale Kapazität eines Adenovirus-Vektors der ersten Generation nicht 8 kb, wohingegen diejenigen eines ΔE1/E3/E4-Vektors 11 kb erreicht und die fremden Gene gleichermaßen in den Bereich E1 oder E3 insertiert werden können.
  • In diesem Zusammenhang wurden nach der Entdeckung, dass ein minimaler Anteil, etwa 600 bp, der viralen DNA unbedingt für die Replikation und die Verpackung rekombinanter Vektoren erforderlich ist, vollständig defiziente Adenovirus-Vektoren, die folglich vollständig von der Anwesenheit von Helferviren für die Replikation und ihre Assemblierung in virale Partikel abhängen, entwickelt.
  • Derartige helfer-abhängige Adenovirus-Vektoren (AdHD) tragen minimale Ad-Sequenzen, welche die für die Replikation und die Verpackung ausreichenden Signale enthalten. Alle anderen Faktoren, welche für die Virion-Produktion erforderlich sind, werden in trans von einem Helfervirus bereitgestellt. Das Helfergenom ist in einer solchen Weise konstruiert, dass seine Sequenzen, die Verpackungssignale enthalten, in vivo durch die Verwendung spezifischer Rekombinationssysteme, wie z.B. das cre/lox-System (WO97/32481), unschwer eliminiert werden können.
  • Dementsprechend basieren die relevanten Strategien für die Herstellung von helferabhängigen Adenovirus-Virionen (adenoHD) im Wesentlichen auf der Verwendung von drei Elementen:
    • – Zelllinien, welche transformiert sind, um sie zur Expression der Gene, welche für die Gruppe von Adenovirus-E1-Proteinen und eine Rekombinase, gewöhnlich "cre", codieren, zu befähigen;
    • – einem Helfer-Adenovirus, worin der E1-Bereich deletiert ist und worin die viralen DNA-Sequenzen, welche für dessen Verpackung im Inneren des reifen Virions erforderlich sind, von Rekombinationsstellen flankiert werden, welche als Substrate für die Rekombinase ("IoxP" im Falle von "cre") fungieren;
    • – dem adenoHD-Vektor, welcher das Transgen von Interesse trägt.
  • Obwohl diese Strategie eine bemerkenswerte Verbesserung gegenüber den bei den Vektoren der ersten Generation verwendeten Strategien darstellt, bringt sie trotzdem gewisse Probleme mit sich. Für eine Produktion im pharmazeutischen Maßstab bringt das Erfordernis der Kontrolle dreier unabhängiger Komponenten (die Zelllinie, das Helfer-Adenovirus und der transgene Vektor) Schwierigkeiten mit sich, welche schwer zu überwinden sind, und inakzeptable Produktionskosten.
  • Zunächst katalysieren die Rekombinasen vom cre-Typ sowohl die Deletion als auch die Insertion der von den IoxP-Stellen flankierten DNA-Bereiche. Die Ausschnittsreaktion ist normalerweise bis zu 20fach effizienter als die gegenteilige, jedoch kann eine vollständige Entfernung des Helfers aus der viralen Produktion niemals erzielt werden. Dies ist insbesondere in der pharmazeutischen Praxis nicht akzeptabel und eine Helfer-Kontaminierung von Präparationen zur therapeutischen Anwendung ist ein sehr schwerwiegendes Problem.
  • Eine zweite Beschränkung dieses Strategietyps beruht auf der Schwierigkeit, die quantitativen Verhältnisse zwischen Helfervirus und helfer-abhängigem Virus während des Amplifizierungsverfahrens zu optimieren. Somit erreicht die Vektor-Amplifizierung selten die Effizienz der Vektoren der ersten Generation und oft werden Ausbeuten von bis zu einer Größenordnung weniger erhalten. Wie im vorherigen Fall, ist dieses Problem dramatisch, wenn eine Produktion im industriellen Maßstab erforderlich ist und die Kosten praktisch untragbar werden.
  • Zur Lösung des Problems, welches sich aus der Kontaminierung mit Helfervirus ergibt, und zur Verringerung der Anzahl von Komponenten ist eine alternative Strategie, die im Stand der Technik bekannt ist, diejenige, Zelllinien zu manipulieren, um sie zur Expression aller Faktoren, welche für die Verpackung des defekten Virus erforderlich sind, in die Lage zu versetzen, um somit das Helfervirus zu eliminieren.
  • Im Stand der Technik gibt es mehrere Beschreibungen von Zellen, welche ein oder mehrere virale(s) Protein(e) exprimieren (siehe beispielsweise WO98/13499). Solche Zelllinien können zur Produktion von Adenovirus-Vektoren verwendet werden, denen die komplementären viralen Proteine fehlen. Jedoch ist es gemäß dieser Strategie äußerst schwierig, die exakte Koordination der Ereignisse zwischen der viralen DNA-Replikation und der Expression der Strukturproteine zu erzielen, so dass die natürliche Infektion zu der massiven Produktion von Viruspartikeln führt, welche für die lytische Phase typisch ist. Dementsprechend kann unter Adoption dieser Strategien der virale Zellzyklus nicht nachgeahmt werden. In dessen Abwesenheit kann nur eine begrenzte Ausbeutekapazität erreicht werden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist eine Helferzelllinie, welche die Produktion von helferabhängigen Adenovirus-Vektoren in der vollständigen Abwesenheit irgendeiner Art von Helfervirus ermöglicht. Solch eine Zelllinie wurde in der Tat konstruiert, damit alle essentiellen Funktionen für die Ad-Virus-Replikation in den Zellen enthalten sind, insbesondere aufgespalten in zwei genetische Einheiten, welches eine strikt regulierte Expression davon erlaubt.
  • Die erste genetische Einheit umfasst mindestens ein defektes Adenovirus-Genom, bei dem die invertierten terminalen Repeats (ITRs) in einer Kopf-zu-Schwanz-Konfiguration vorliegen und das Verpackungssignal und mindestens einer der nicht-strukturellen Bereiche inaktiviert ist.
  • Solche nicht-strukturellen Bereiche können exprimierte Bereiche oder cis-wirkende Elemente sein. Die exprimierten Bereiche können sowohl nicht-translatierte Nicht-Strukturgene sein, wie z.B. die VA-Gene, oder translatierte Nicht-Strukturgene wie die E1-, E2- und E4-Gene.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Inaktivierung durch vollständige oder, bevorzugter, durch partielle Deletion mindestens eines solchen Bereichs; das Verpackungssignal wird ebenfalls vorzugsweise durch vollständige oder partielle Deletion inaktiviert.
  • Eine solche erste genetische Einheit kann auf einer episomalen Einheit lokalisiert sein oder in das Genom der Wirtszellen integriert sein.
  • Im ersten Fall muss die episomale Einheit mindestens ein Element umfassen, welches die Replikation der episomalen Einheit selbst mit einer niedrigen Kopienzahl ermöglicht. Ein solches Element kann aus Sequenzen, welche die DNA-Replikation und deren Retention im Kern vermitteln, aufgebaut sein (Calos, M. P., 1996, Trends Genet. 12:463-466) oder aus dem Replikationsursprung des Ursprungs des Replikationssystems eines Virus, aktiviert durch mindestens einen Aktivierungsfaktor.
  • Der Replikationsursprung muss in jedem Fall auf der episomalen Einheit lokalisiert sein; der Aktivierungsfaktor kann stattdessen in die Zelle eingeführt sein oder das relevante Gen kann auf der episomalen Einheit, einschließlich der ersten genetischen Einheit, (oder in irgendeiner anderen replizierenden Einheit innerhalb der Zelle) lokalisiert sein oder kann in das Genom der Wirtszelle integriert sein. In jedem Fall soll das Gen, welches für den Akti vierungsfaktor innerhalb der Zellen der vorliegenden Erfindung codiert, exprimiert werden, um die Replikation der ersten genetischen Einheit in der episomalen Einheit zu erlauben.
  • Ein Beispiel eines Ursprungs eines Replikationssystems, der für die vorliegende Erfindung funktionell ist, ist das relevante System des Epstein-Barr-Virus (welches das bevorzugte ist), worin der Replikationsursprung das OriP-Element ist und der Aktivierungsfaktor das EBNA-1-Protein ist. Jedoch sind unterschiedliche Systeme, wie z.B. dasjenige des Rinder-Papillomavirus (BPV) (Calos, M. P. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4084), oder diejenigen aus Vektoren, welche auf einem SV40-Ursprung-T-Antigen-System basieren, ebenfalls geeignet.
  • Die Anwesenheit eines solchen Ursprungs eines Replikationssystems erlaubt der ersten genetischen Einheit die Replikation in einer geringen Kopienzahl, während die ITRs in der ersten genetischen Einheit die Replikation in einer hohen Kopienzahl in Anwesenheit der von den E2-Bereichen codierten Proteine erlaubt.
  • Falls stattdessen die erste genetische Einheit in das Genom der Wirtszellen integriert ist, müssen ITR-Sequenzen in einer Kopf-zu-Schwanz-Konfiguration an beiden Enden der ersten genetischen Einheit vorliegen. Solche ITRs erlauben in der Tat die Freisetzung und Replikation der ersten genetischen Einheit in hoher Kopienzahl in Anwesenheit der regulatorischen Proteine, welche von den oben genannten Genen der E2-Bereiche codiert werden.
  • In jedem Fall können ferner regulatorische Elemente, welche die Expression von mindestens einem der nicht-strukturellen Bereiche in der ersten genetischen Einheit steuern, in einer solchen ersten genetischen Einheit enthalten sein oder können auch in der Zelle, vorzugsweise im Zellgenom integriert, vorliegen.
  • Ein Beispiel solcher regulatorischer Elemente sind die Elemente, welche von Rittner (Rittner, K., et al. (1997), J. Virol. 71:3307-3311) beschrieben wurden.
  • Die zweite genetische Einheit umfasst eine induzierbare Transkriptionseinheit, welche die viralen nicht-strukturellen Bereiche, die in dem defekten Ad-Genom der ersten genetischen Einheit inaktiviert sind, unter der Kontrolle eines auf eine strikte Regulation ansprechenden induzierbaren Promotors umfasst. Solche Bereiche können beispielsweise E1, E2A, E2B und/oder E4 sein.
  • Ein induzierbarer Promotor in den genetischen Einheiten der vorliegenden Erfindung und insbesondere in der zweiten genetischen Einheit ist ein Promotor, der von einem Induktor induziert wird. Ein Beispiel ist der Tetracyclin-Promotor, welcher der bevorzugte ist, und Promotoren, welche durch die Anwesenheit anderer Induktoren wie Ecdyson, Rapamycin, RU486, Dexamethason oder ein Schwermetall wie Zn oder Cd reguliert werden, sind gleichermaßen geeignet.
  • Ein solcher Promotor kann funktionsfähig mit regulatorischen Elementen, wie z.B. auf Tetracyclin ansprechende Transaktivatoren und/oder Silencer (rtTA und tTS), welche beide die strenge Regulierung der Transkriptionseinheit ermöglichen, verknüpft sein.
  • Die zweite genetische Einheit kann in die Wirtszelle durch einen Vektor eingeführt werden, welcher ein Virus oder Plasmid sein kann, in das Genom der Wirtszelle integriert oder auf einer episomalen Einheit vorliegen kann; in jedem Fall muss sie während der Wachstumsphase der Zelllinie inaktiv gehalten werden, um die zytotoxische Wirkung der viralen Proteine zu vermeiden. Zu diesem Zweck können spezifische regulatorische Elemente, welche die spezifische Repression der Transkriptionseinheit ermöglichen, in der zweiten genetischen Einheit eingeschlossen sein. Ein Beispiel eines solchen Repressors ist das Tet/krab-Fusionsprotein.
  • Solche Repressor-Elemente sind in jedem Fall funktionell mit dem induzierbaren Promotor und dem regulatorischen Element, welches die Expression der oben beschriebenen Transkriptionseinheit erhöht, koordiniert.
  • In Abwesenheit des Induktors, welcher auf den relevanten induzierbaren Promotor der zweiten genetischen Einheit (Transkriptionseinheit) einwirkt, werden die darin enthaltenen nicht-strukturellen Bereiche tatsächlich nicht exprimiert, die erste genetische Einheit ist inaktiv und somit gibt es keine Produktion von viralem Protein, welches für die Zelle toxisch ist.
  • Zum Starten der Produktion des helfer-abhängigen Adenovirus-Vektors wird die Helferzelllinie mit dem helfer-abhängigen Adenovirus-Vektor infiziert, der in großen Mengen hergestellt werden soll, und in der Zwischenzeit (jedoch auch vor oder nach der Infektion mit dem defekten Adenovirus-Vektor) wird der Induktor der induzierbaren Promotoren der zweiten genetischen Einheit, die in der Zelle vorliegt, zugegeben oder deren Expression innerhalb der Zelle induziert.
  • Das Ergebnis eines solcher Aktion wird die Produktion der adenoviralen Proteine, die von den frühen Bereichen, die in der zweiten genetischen Einheit eingeschlossen sind, codiert werden, sein, was die Aktivierung der transkriptionalen Kaskade von Adenoviren, welche mit der ITR-vermittelten Replikation der ersten genetischen Einheit assoziiert ist, mit sich bringt.
  • Die Folge dieser koordinierten Reihe von Ereignissen ist die Anhäufung großer Mengen Strukturproteine des Virus, ähnlich der, welche während der natürlichen Infektion auftritt. Die viralen Proteine werden bei der Konstruktion des viralen Partikels festgehalten und führen folglich zur effizienten Produktion des helfer-abhängigen viralen Vektors.
  • In diesem Zusammenhang sollte betont werden, dass für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ein helfer-abhängiger Adenovirus-Vektor ein Adenovirus-Vektor ist, dessen Viruszyklus in Abwesenheit eines Helfers nicht vervollständigt werden kann, insbesondere ein Adenovirus-Vektor, bei dem das virale Genom vollständig oder teilweise deletiert wurde, mit Ausnahme des Verpackungssignals und der invertierten terminalen Repeats (ITRs). Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden sie hier danach und zuvor als helfer-abhängiges Adenovirus oder helfer-abhängige Adenovirus-Virionen bezeichnet.
  • Im Wesentlichen zielt diese Strategie auf die Nachbildung des Phänomens der viralen Latenz ab; in der Helferzelle wird ein virales Genom durch Suppression der Expression von Genen, welche der Adenovirus-Transkriptionskaskade zugrunde liegen, in einer latenten Phase gehalten. Zum Zeitpunkt der Infektion/Transformation mit dem defekten Adenovirus-Vektor, welcher produziert werden soll, wird die lytische Phase aktiviert durch Induktion der Expression der Proteine, welche von den frühen Genen codiert werden, die von dem Ad-Genom, das in der ersten genetischen Einheit eingeschlossen ist, deletiert und unter die strenge Transkriptionskontrolle in der zweiten genetischen Einheit gestellt wurden.
  • Das vorher latente Adenovirus-Genom, das in der ersten genetischen Einheit eingeschlossen ist, tritt deshalb in die aktive Replikation und Transkription ein, jedoch nur der helfer-abhängige Vektor, welcher produziert werden soll, wird verpackt, da nur er ein funktionelles Verpackungssignal besitzt.
  • Als Konsequenz der Tatsache, dass das System, welches Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, zwei anstelle von drei Elementen einschließt, ist die Produktion des helferabhängigen Adenovirus-Vektors stark erleichtert, welches nach einer Präparation in großem Maßstab eine Endausbeute von Titerniveaus zwischen 109 und 1012 Partikel/Milliliter erlaubt.
  • Eine solche Eigenschaft der Zelllinien der vorliegenden Erfindung ist insbesondere relevant, wenn sie in großmaßstäblichen Produktionen wie denjenigen der pharmazeutischen Industrie eingesetzt werden. Dementsprechend erlaubt die vorliegende Erfindung eine verbesserte Produktion der Vektoren, welche therapeutische Gene, geeignet zur Behandlung von menschlichen oder tiermedizinischen Erkrankungen, transferieren.
  • In jedem Fall ist anzumerken, dass die beiden genetischen Einheiten zu unterschiedlichen Zeiten in die Zelle eingeführt werden können. Dementsprechend werden Zelllinien offenbart, welche mindestens nur die erste genetische Einheit enthalten, und Zelllinien, welche mindestens nur die zweite genetische Einheit enthalten. Die zweite genetische Einheit im ersten Fall und die erste genetische Einheit im zweiten Fall können in der Tat vor oder gleichzeitig mit der Transfektion der Zelle durch den helfer-abhängigen Adenovirus-Vektor hinzugefügt werden.
  • In Verbindung mit dem oben und im folgenden offenbarten Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb die Zellen, welche zur Produktion von helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine der folgenden genetischen Einheiten einschließen:
    • – eine erste genetische Einheit, umfassend ein defektes Adenovirus-Genom, bei dem die invertierten terminalen Repeats in einer Kopf-zu-Schwanz-Konfiguration vorliegen und bei dem sowohl das Verpackungssignal als auch mindestens einer der nicht-strukturellen Bereiche inaktiviert sind;
    • – eine zweite genetische Einheit, umfassend mindestens einen induzierbaren Promotor und mindestens einen der in der ersten genetischen Einheit inaktivierten Bereiche, wobei die Bereiche unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors stehen;
    wodurch nach der Aktivierung des induzierbaren Promotors der zweiten genetischen Einheit und der Infektion der Zellen mit den helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren die erste genetische Einheit und die zweite genetische Einheit die Produktion der helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren in den Zellen in Abwesenheit von Helfervirus ermöglichen.
  • Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind die oben beschriebenen Zellen, worin die erste genetische Einheit in das Genom integriert ist und die ITRs auf beiden Enden der ersten genetischen Einheit in einer Kopf-Schwanz-Konfiguration vorliegen; die oben beschriebenen Zellen, worin die erste genetische Einheit in einer episomalen Einheit eingeschlossen ist, die ein Element umfasst, welches die Replikation der genetischen Einheit in einer geringen Kopienzahl ermöglicht. Im letzteren Fall sind spezielle Fälle Zellen, in denen das Element, welches die Replikation der episomalen Einheit ermöglicht, der Replikationsursprung des Ursprungs des Replikationssystems eines Virus ist oder davon abgeleitet ist; der Fall, in dem der relevante Aktivierungsfaktor von außerhalb der Zelle in die Zelle eingeführt wird; die Fälle, in denen das Gen, welches für den Aktivierungsfaktor codiert, sich auf der episomalen Einheit befindet oder in einer anderen transkriptionalen Einheit innerhalb der Zelle oder alternativ in das Genom der Wirtszelle integriert ist.
  • Der oben beschriebene Ursprung des Replikationssystems kann derjenige des Epstein-Barr-Virus (EBV) sein und der Ursprung des Replikationselements ist OriP und der Aktivierungsfaktor ist EBNA-1.
  • Weitere spezielle Fälle in Bezug auf jeden Fall oben sind die folgenden: der Fall, in dem das Verpackungssignal und/oder die nicht-strukturellen Bereiche der ersten genetischen Einheit vollständig oder partiell deletiert sind; der Fall, in dem die Bereiche, welche in der ersten genetischen Einheit inaktiviert sind und in der zweiten genetischen Einheit vorliegen, mindestens einen der frühen Bereiche darstellen, welche aus der Gruppe, die aus E1-, E2A-, E2B und E4-Bereichen besteht, ausgewählt sind, spezieller der Fall, in dem die Bereiche E1 und E4 sind, der Fall, in dem die Bereiche E1, E4 und E2A sind, der Fall, in dem die Bereiche E1, E4 und E2B-Polymerase sind, und der Fall, in dem die Bereiche E1, E4 und präterminales E2B-Protein (PTP) sind.
  • Weitere Fälle sind diejenigen, in denen die viralen Bereiche, welche in der ersten genetischen Einheit vorliegen, funktionsfähig mit mindestens einem regulatorischen Element verknüpft sind, welches die strenge Kontrolle ihrer Expression ermöglicht; Zellen, in denen es sich bei dem Promotor auf der zweiten genetischen Einheit speziell um den Tetracyclin-Operator, die Promotoren, welche von Steroidhormon-Rezeptoren reguliert werden, den Promotor, welcher von dem Ecdyson-Rezeptor reguliert wird, den von Rapamycin regulierten Promotor, den von RU486 regulierten Promotor und den von Metallionen regulierten Metallothionein-Promotor handelt; in diesen Fällen werden die relevanten Induktoren von Tetracyclin, Ecdyson, Rapamycin, Dexamethason RU486 bzw. einem Schwermetall wie Zn oder Cd gebildet; Zellen, in denen die viralen Bereiche in der zweiten genetischen Einheit funktionsfähig mit Elementen verknüpft sind, welche die Expression der darauf befindlichen nicht-strukturellen Bereiche steuern, und insbesondere der Fall, in dem solche Elemente auf Tetracyclin ansprechende Transaktivatoren und/oder Silencer sind; die Zellen, in denen mindestens einer der nicht-strukturellen Bereiche in der zweiten genetischen Einheit vollständig oder teilweise von einem Adenovirus-Genom, vorzugsweise Human-Adenovirus, insbesondere Adenoviren der Serotypen AD2 oder AD5, abgeleitet ist. In diesen letzteren Fällen können die unterschiedlichen Abschnitte der nicht-strukturellen Bereiche, die auf der zweiten genetischen Einheit vorliegen, von Adenoviren des gleichen Serotyps oder von Adenoviren eines unterschiedlichen Serotyps stammen.
  • Weitere Fälle von Interesse sind die Zellen, in denen das Adenovirus-Genom der ersten genetischen Einheit vollständig oder teilweise von dem Adenovirus-Genom von Säuger-Adenoviren abgeleitet ist, vorzugsweise Human-Adenoviren, bevorzugt eines Adenovirus des Serotyps AD2 und AD5. In diesen letzteren Fällen können die unterschiedlichen Abschnitte des Adenovirus-Genoms, die auf der ersten genetischen Einheit vorliegen, von Adenoviren des gleichen Serotyps oder von Adenoviren eines unterschiedlichen Serotyps stammen.
  • Die genetischen Einheiten der vorliegenden Erfindung können in mindestens einem Vektor, vorzugsweise einem Plasmid, das/der in episomaler Phase gehalten wird oder nicht, in die Zellen eingeführt werden; sowohl in dem Fall, in dem sie in das Wirtsgenom integriert werden, als auch in dem Fall, in dem sie auf einer replizierenden Einheit innerhalb der Zelle vorliegen, können solche ersten und zweiten genetischen Einheiten funktionsfähig mit genomischen Sequenzen, welche die Expression der Funktionen, die von mindestens einer der Einheiten codiert werden, in regulierter Weise sicherstellen, verknüpft sein.
  • Ferner können alle oben beschriebenen Zellen eukaryotische Zellen sein, vorzugsweise Säugerzellen, bevorzugt humane Zellen, und in diesem letzteren Fall auch vorzugsweise Zellen, welche die Adenovirus-Replikation gestatten. Insbesondere ist die Zelllinie A549 (Human-Lungenkarzinom ATCC CLL 185) für die Ableitung der Zellen der vorliegenden Erfindung geeignet.
  • Ebenfalls offenbart ist ein Verfahren zur Produktion der obengenannten Zellen, welches die vorliegenden Schritte umfasst:
    • a) Einführen der ersten genetischen Einheit wie oben beschrieben in eine Zelllinie;
    • b) Einführen der zweiten genetischen Einheit wie oben beschrieben in die Zelllinie von Schritt a).
  • Spezielle Fälle werden repräsentiert durch ein solches Verfahren, in dem die erste genetische Einheit von Schritt a) und die zweite genetische Einheit von Schritt b) in einem Plasmid- oder Virusvektor eingeführt werden. Speziell bezüglich der Plasmidvektoren, welche für die vorliegende Erfindung geeignet sind, kommen Klonierungsvektoren wie pUC, pBluescript und pLitmus in Betracht.
  • Speziell bezüglich der viralen Vektoren, welche für die vorliegende Erfindung geeignet sind, kommen retrovirale Vektoren, adeno-assoziierte virale Vektoren, Herpes simplex-Vektoren und vom Epstein-Barr-Virus abgeleitete Vektoren in Betracht.
  • Auch solche Verfahren können vorzugsweise mit einer eukaryotischen Zelllinie von Säugern durchgeführt werden, vorzugsweise mit einer humanen Zelllinie und bevorzugt mit der Zelllinie A549 (Human-Lungenkarzinom ATCC CLL 185).
  • Ebenfalls offenbart ist die Verwendung der obengenannten Zellen zur Produktion von helferabhängigen adenoviralen Vektoren oder der Zelllinie A549 (Human-Lungenkarzinom ATCC CLL 185), sowohl in vivo als auch in vitro.
  • Ebenfalls offenbart ist die Verwendung der obengenannten Zellen zur Produktion der helferabhängigen Adenovirus-Vektoren gemäß einer im Stand der Technik bekannten Technik.
  • Solche helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren sollen mindestens ein Gen enthalten, welches vorzugsweise ein Gen von therapeutischem Interesse sein kann, dessen Produkte insbesondere für die Gentherapie von Nutzen sind, speziell gerichtet gegen humane oder veterinärmedizinische Erkrankungen. Spezielle Fälle sind die folgenden, bei denen die helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren mindestens ein Gen von Interesse bei gentechnischen Verfahren oder bei Verfahren zur Herstellung transgener Tiere einschließen; der Fall, in dem die Produkte der Aktivität des Gens Peptide oder Ribozyme sind.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zusammensetzungen, welche die zuvor beschriebene Zelle und ein Vehikel oder einen Träger umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung 99 % bis 100 % frei von Helferviren ist.
  • Zusammensetzungen, welche ein Vehikel oder einen Träger und eine der oben beschriebenen Zellen umfassen, wobei die Zellen die ersten und zweiten genetischen Einheiten und den helfer-abhängigen Adenovirus-Vektor enthalten, sind ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ein solches Vehikel oder ein solcher Träger kann Wasser, Glycerin, Ethanol, Salzlösung oder dgl. oder Kombinationen davon sein.
  • Besonders relevante Fälle sind diejenigen, in denen das Vehikel oder der Träger in allen diesen Zusammensetzungen mit dem aktiven Wirkungsprinzip, welches der oben genannte helfer-abhängige Adenovirus-Vektor und eine der oben beschriebenen Zellen darstellen, pharmazeutisch annehmbar und kompatibel ist. Pharmazeutisch annehmbare Träger sind die im Stand der Technik wohlbekannten, d.h. sterile wässrige Lösungen, welche das aktive Wirkungsprinzip enthalten können oder ferner Puffer, wie z.B. Natriumphosphat bei einem physiologischen pH-Wert und/oder eine physiologische Salzlösung, wie z.B. phosphatgepufferte Salzlösung, einschließen können. Darüber hinaus können andere Exzipienten, wie z.B. ein Benetzungsmittel oder Emulgator, lösungsförderndes Mittel, pH-Pufferungsmittel, Stabilisatoren und Färbemittel oder dgl. oder irgendein anderes im Stand der Technik bekanntes Additiv, in solchen Zusammensetzungen eingeschlossen sein.
  • In diesem Zusammenhang beziehen sich pharmazeutisch annehmbare oder kompatible Träger oder Vehikel auf die Materialien, welche im Stand der Technik dafür bekannt sind, zur Verabreichung an oder auf ein Individuum, beispielsweise einen Säuger, insbesondere einen Menschen, ohne Hervorrufung einer unerwünschten physiologischen Wirkung geeignet zu sein. Beispiele solcher Wirkungen sind Übelkeit, Magenverstimmung, Schwindel und dgl.
  • Die Herstellung solcher Zusammensetzungen, welche pharmazeutische oder pharmakologische Zusammensetzungen sein können, in denen die aktiven Wirkungsprinzipien gelöst oder dispergiert sind, ist im Stand der Technik wohlbekannt. Im Allgemeinen werden solche Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung hergestellt oder in jedem Fall als injizierbare Zusammensetzungen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspension. In jedem Fall können feste Formen, geeignet für Lösungen oder Suspension in Flüssigkeit vor der Verwendung, hergestellt werden. Präparationen, die für andere gewünschte Verabreichungswege gemäß im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren geeignet sind, wie z.B. die orale Route, dermale Pflaster, Zäpfchen oder auch eine emulgierte Präparation, sind in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
  • Spezielle Fälle stellen die Zusammensetzungen dar, welche den helfer-abhängigen Adenovirus-Vektor oder mindestens eine der Zellen der vorliegenden Erfindung, die helfer-abhängige Adenovirus-Vektoren einschließen, enthalten, umfassend mindestens ein Gen, das für Moleküle von therapeutischem Interesse codiert, Moleküle, welche auch Peptide oder Ribozyme sein können, insbesondere von Nutzen in der Gentherapie, spezieller gegen menschliche Erkrankungen gerichtet.
  • Ebenfalls offenbart ist die Verwendung der Zellen der vorliegenden Erfindung als Medikament und insbesondere zur Herstellung der obengenannten Zusammensetzungen, insbesondere für pharmazeutische oder pharmakologische Zusammensetzungen, welche für die Gentherapie geeignet sind.
  • Ebenfalls offenbart ist das Verfahren zur Herstellung mindestens einer der oben beschriebenen Zusammensetzungen, welche pharmazeutische Zusammensetzungen oder Materialzusammensetzungen sein können.
  • Ebenfalls offenbart sind Kits, umfassend mindestens eine der oben beschriebenen Zusammensetzungen zur Produktion der helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung in vitro, in vivo oder ex vivo. Von speziellem Interesse ist der Kit, welcher umfasst:
    • – eine Zusammensetzung, umfassend mindestens eine oder oben beschriebenen Zellen, einschließlich einer ersten genetischen Einheit, einer zweiten genetischen Einheit und eines helfer-abhängigen Adenovirus-Vektors;
    • – eine Zusammensetzung, umfassend einen Induktor, welcher zur Aktivierung des induzierbaren Promotors in der zweiten genetischen Einheit in der Lage ist.
  • Von besonderem Interesse ist auch der Fall, in dem der Kit einschließt:
    • – eine Zusammensetzung, umfassend mindestens eine der oben beschriebenen Zellen, einschließlich einer ersten genetischen Einheit und einer zweiten genetischen Einheit;
    • – eine Zusammensetzung, umfassend mindestens einen helfer-abhängigen Adenovirus-Vektor, einschließlich eines heterologen Gens, insbesondere von therapeutischem Interesse; und gegebenenfalls
    • – eine Zusammensetzung, umfassend einen Induktor, welcher zur Aktivierung des induzierbaren Promotors in der zweiten genetischen Einheit in der Lage ist.
  • Die hier offenbarten Kits können ein Kit für die therapeutische Verwendung (Produktion in vivo oder ex vivo des helfer-abhängigen Adenovirus-Vektors, der mindestens ein Gen von therapeutischem Interesse, insbesondere in der Gentherapie, umfasst) und ein Kit zur Produktion in vitro eines helfer-abhängigen Adenovirus-Vektors, der mindestens ein Gen, vorzugsweise von therapeutischem Interesse, enthält, sein.
  • Die Erfindung wird mit Hilfe der als Anhang beigefügten Figuren näher beschrieben werden.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt in den vier Feldern die schematischen Karten von Vektoren, welche zur Ableitung der Helferzelllinien der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind:
    • A) Karte des AD5-Shuttle-Vektors (erste genetische Einheit): Ad5ΔΨΔE1/E4 repräsentiert das Genom eines humanen Adenovirus, vollständig mit Ausnahme der Deletion der E1-, E4-Bereiche und desjenigen, der das Verpackungssignal einschließt (Ψ); AdITRs repräsentieren die Ad5-ITR-Gensequenzen in Kopf-Schwanz-Konfiguration; Hygror repräsentiert das Hygromycinresistenzgen; Ampr das Ampicillinresistenzgen; EBNA-1 den viralen Transaktivator des Epstein-Barr-Virus (EBV) und OriP repräsentiert den Ursprung der latenten Replikation des EBV-Virus.
    • B) Karte des E1/E4-Vektors (zweite genetische Einheit): wobei E1 und E4 DNA-Sequenzen repräsentieren, die den E1- und E4-Adenovirus-Bereichen entsprechen, MSC I und II Sequenzen sind, welche Mehrfachklonierungsstellen einschließen; PminCMV die minimalen Promotoren des Cytomegalovirus (CMV) sind, TRE (Tetracyclin-Response-Element) sieben wiederholte Sequenzen des Operators des E. coli-Tetracyclinresistenzgens repräsentiert; β-Globin-polyA die Polyadenylierungsstelle des β-Globins ist; ColE1ori der Replikationsursprung von E. coli ist; SV40-polyA die SV40-Virus-Polyadenylierungsstelle ist.
    • C) Karte des pTet-On/Off-Vektors (regulatorisches Element): wobei Pcmv und Psv40 die Promotoren von CMV bzw. SV40 sind, (r)tTa den steuerbaren Transaktivator von Tetracyclin (oder den invertierten, d.h., denjenigen, der nur von einem Tetracyclin aktiviert wird) anzeigt. Dieser Transaktivator besteht wiederum aus dem Gen, welches für den Tetracyclin-Repressor (oder dessen Mutante rtetR der entgegengesetzten Funktion) in Fusion mit der VP16AD-Domäne des Herpes-simplex-Virus codiert. Neor repräsentiert das Neomycinresistenzgen.
    • D) Karte des pTet-KRAB-Vektors (regulatorisches Element): im wesentlichen ähnlich dem pTet-On/Off-Vektor, wobei die für die VP16AD-Domäne des Herpes-simplex-Virus codierenden Sequenzen durch diejenigen der KRAB-Domäne des humanen Kox-Gens ersetzt sind.
  • 2 zeigt die schematischen Karten von Vektoren, welche zur Ableitung der Helferzelllinien der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind:
    • A) Karte des AD/EBV-Shuttle-Vektors pSA-1 (erste genetische Einheit): Ad5 repräsentiert das Genom eines humanen Adenovirus, vollständig mit Ausnahme der Deletion der E1-, E4-Bereiche und desjenigen, der das Verpackungssignal einschließt (Ψ); AdITRs repräsentieren die Ad5-ITR-Gensequenzen in Kopf-Schwanz-Konfiguration: Hygror repräsentiert das Hygromycinresistenzgen; Ampr repräsentiert das Ampicillinresistenzgen; OriP repräsentiert den Ursprung der latenten Replikation des EBV-Virus; Tet-Eptamer repräsentiert ein Eptamer von Tetracyclin-Repressor-DNA-Bindungsstellen. Die DNA-Sequenzen, welche deletiert wurden, um eine unterschiedliche ΔE2-Version dieses Vektors zu erzeugen, sind ebenfalls angegeben: DBP-Deletion repräsentiert die Deletion der gesamten codierenden Sequenz des DNA-bindenden Proteins; Polymerase-Deletion repräsentiert die Deletion von 608 bp innerhalb des Aminoterminus des Polymerasegens; pTP-Deletion repräsentiert die Deletion von zwei DNA-Segmenten innerhalb des Hauptexons des Gens des präterminalen Proteins.
    • B) Karte des AD/EBV-Shuttle-Vektors pSA-2 (erste genetische Einheit), das einzige Element, welches pSA-2 von pSA-1 unterscheidet, ist die Insertion des EBNA-1-Gens neben dem OriP-Replikationsursprung.
    • C) Karte von pIREStTS/rtTApuro (regulatorisches Element): wobei CMV-IE den "immediateearly"-Promotor des Human-Cytomegalovirus repräsentiert; rtTA DNA-Sequenzen repräsentiert, die dem reversen Tetracyclin-Transaktivator entsprechen; IRES die Sequenz ist, welche die interne Ribosomeneintrittsstelle einschließt; tTS-Kid die Sequenz repräsentiert, welche der Fusion zwischen dem tet-Repressor und einer Silencer-Domäne von Kid-1 entspricht; Kid-1-S-Domäne die Silencer-Domäne von Kid-1 ist; SV40-PuroR-polyA die Puromycinresistenzgen-Expressionskassette repräsentiert; Amp das Ampicillinresistenzgen ist.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Offenbart ist die Konstruktion und Verwendung der ersten genetischen Einheit wie in der Zusammenfassung der Erfindung beschrieben für die Ableitung der Helferzellen der vorliegenden Erfindung.
  • Die erste genetische Einheit kann als Plasmidvektor durch Anwendung der rekombinanten DNA-Standardtechniken konstruiert werden. Eine Modifizierung (Insertionen, Deletionen, Mutation) der ersten genetischen Einheit kann nach dem von A. F. Stuart und Mitarbeitern (Zhang et al., Nat. Genet. 1998; 20:123-126) beschriebenen Verfahren erhalten werden.
  • Die erste genetische Einheit, wenn sie in das Genom der Wirtszelle integriert ist, umfasst typischerweise:
    • i) ein Adenovirus-Genom, vollständig mit Ausnahme der Deletion von mindestens einem der nicht-strukturellen Bereiche, welche für den Ablauf der Adenovirus-Transkriptionskaskade essentiell sind, und desjenigen, der das Verpackungssignal einschließt;
    • ii) zwei Sequenzen von invertierten terminalen Repeats von Ad (ITRs) in einer Kopf-zu-Schwanz-Konfiguration, welche das Adenovirus-Genom flankieren; und im Allgemeinen ist auch
    • iii) ein Selektionsmarker, wie z.B. ein G418-Resistenzgen, Hygromycin B-Resistenzgen, Puromycinresistenzgen, Bleomycinresistenzgen, vorhanden, der zur Selektion einer Zelllinie, welche die Einheit stabil aufrechterhält, verwendet werden kann.
  • Zelllinien, welche die erste genetische Einheit in das Wirtschromosom integriert enthalten, können durch Transformation der Zelle mit der Vektor-DNA unter Anwendung von Standard-DNA-Transfektionsverfahren und Kultivierung der transformierten Zellen in einem selektiven Medium (+ G418 oder Hygromycin B oder Bleomycin oder Puromycin) nach den im Stand der Technik bekannten einschlägigen Techniken erhalten werden.
  • Die Transkription und Replikation eines Adenovirus-Vektors, der in das Wirtschromosom zwischen zwei ITR-Verbindungsstellen in einer Kopf-zu-Schwanz-Konfiguration inseriert ist, kann auch aktiviert werden durch Bereitstellung von deletierten viralen Faktoren und/oder der viralen Funktionen, die in dem Adenovirus-Genom inaktiviert wurden, in trans unter Einsatz von DNA-Transfektion oder Infektion mit viralen Vektoren oder direkter Einführung aktiver viraler Polypeptide.
  • In dem Fall, in dem die erste genetische Einheit stattdessen auf einer episomalen Einheit gehalten wird, wurde der für die Einführung der ersten genetischen Einheit verwendete Vektor als ein "Shuttle-Vektor" bezeichnet, wobei ein solcher Shuttle-Vektor ein Vektor (Plasmid oder Virus) in einer episomalen Form ist und so konstruiert wurde, dass er die im Punkt i) oben angegebenen Elemente einschließt, im allgemeinen die im Punkt iii) oben angegebenen Elemente, und ferner umfasst:
    • iv) den Ursprung der latenten Replikation eines Virus und insbesondere des Epstein-Barr-Virus (EBV);
    • v) die invertierten terminalen Repeats (ITRs) von Ad-Gensequenzen in einer Kopf-Schwanz-Konfiguration.
  • Der Vektor in diesem Fall wurde aufgrund der charakterisierenden Anwesenheit der EBV-Elemente als "Ad/EBV-Shuttle-Vektor" bezeichnet. In der Tat ist auch das für das Protein EBNA-1 codierende Gen eingeschlossen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform eines solchen Vektors sind in dem Adenovirus-Genom des Punkts i) die E1- und E4-Gene deletiert und die Grundaktivität des E2-Promotors ist durch Insertion einer Tet-Silencer-Bindungsstelle in das virale Chromosom stromaufwärts des E2-Promotors verringert. In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform eines solchen Vektors sind in dem Adenovirus-Genom die E1- und E4-Gene und E2A-Gene deletiert. In einer dritten bevorzugten Ausführungsform eines solchen Vektors sind in dem Adenovirus-Genom die E1- und E4-Gene und E2B-Gene deletiert.
  • Ein wesentliches Charakteristikum eines solchen "Shuttle-Vektors" ist das Replikationsvermögen, welches eine hohe Kopienzahl pro Zelle reproduziert, sobald die Transkription der Ad-Gene aktiviert wurde. Dies wird ermöglicht durch die Anwesenheit der invertierten terminalen Repeats (ITRs) von Adenovirus in einer Kopf-Schwanz-Konfiguration in dem Konstrukt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform eines solchen Vektors ist das Ad-Genom dasjenige des Serotyps Ad5, in einer zweiten bevorzugten Ausführungsform umfasst ein solcher Vektor das Genom des Serotyps Ad2. Kombinationen mit anderen Serotyp-Genomen oder irgendeinem anderen Mitglied der Adenoviridae-Familie sind möglich und könnten in einigen Anwendungen bevorzugt sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform eines solchen Vektors sind die ITRs diejenigen des Serotyps Ad5. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eines solchen Vektors sind die ITRs diejenigen des Serotyps Ad2. Kombinationen mit ITRs anderer Serotypen oder irgendeines anderen Mitglieds der Adenoviridae-Familie sind möglich und könnten in einigen Ausführungsformen bevorzugt sein.
  • Eukaryotische Zellen können mit der ersten genetischen Einheit nach Transfektionsprotokollen wie dem Calciumphosphat-Verfahren oder Lipofektion oder unter Anwendung von DNA-Mikroinjektion transformiert werden. Zellen, welche die erste genetische Einheit enthalten, können unter Ausnutzung der Anwesenheit eines Selektionsmarkers auf dem Episom durch Zugabe des entsprechenden Antibiotikums zu dem Kulturmedium selektioniert werden. Permissive Zellen, welche die erste genetische Einheit in episomaler Form enthalten, können in Anwesenheit der viralen Funktionen, welche in dem defekten Ad-Genom, welches in der ersten genetischen Einheit vorliegt, deletiert oder inaktiviert wurden, die Vermehrung eines Adenovirus fördern.
  • Eine wie oben beschrieben erhaltene Zelllinie kann für die Insertion der zweiten genetischen Einheit, in welcher die in der ersten genetischen Einheit inaktivierten Adenovirus-Funktionen unter einer strengen transkriptionalen Kontrolle stehen, verwendet werden.
  • Die zweite genetische Einheit kann nach Standardverfahren rekombinanter DNA-Techniken, wie z.B. direkte Klonierung von DNA-Fragmenten, erhalten durch DNA-Verdauung mit Restriktionsenzymen, in Vektoren, PCR oder durch homologe Rekombinationstechnik in E. coli oder eukaryotischen Zellen erhalten werden.
  • Die zur Einführung der zweiten genetischen Einheit verwendeten relevanten Vektoren enthalten dementsprechend als charakterisierende Elemente:
    • I) die Nicht-Strukturbereiche, die in dem Adenovirus-Genom der ersten genetischen Einheit inaktiviert wurden, integriert in das Genom der Wirtszelle oder in einem "Shuttle-Vektor" vorliegend;
    • II) einen induzierbaren Promotor, der streng regulierbar sein kann; und gegebenenfalls
    • III) zwei Dimere von Isolatorsequenzen, welche die Transkriptionseinheit flankieren;
    • IV) regulatorische Elemente, wie z.B. Tetracyclin-Response-Elemente.
  • Ein wesentliches Charakteristikum eines solchen Vektors ist das Vermögen, während des Wachstumsschritts der Zelllinie strikt inaktiv gehalten zu werden, um die zytotoxische Wirkung der viralen Proteine zu vermeiden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform eines solchen Vektors sind die Ad-Bereiche diejenigen des Serotyps Ad5, in einer zweiten bevorzugten Ausführungsform eines solchen Vektors sind die Ad-Bereiche diejenigen des Serotyps Ad2. Kombinationen mit Ad-Bereichen anderer Serotypen oder irgendeines anderen Mitglieds der Adenoviridae-Familie sind möglich und könnten in einigen Anwendungen bevorzugt sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform eines solchen Vektors besteht der induzierbare Promotor aus einem Element, welches auf Tetracyclin anspricht. Die Regulation der Expression basiert in diesem Fall auf der Verwendung der beiden regulatorischen Elemente tetracyclin-gesteuerter reverser Transaktivator (rtTA) (Gossen, D., et al. (1995), Science 268:1766-1769) und hybrider transkriptionaler Repressor Tet-KRAB (Deuschle, U., et al. (1995), Mol. Cell. Biol. 15:1907-1914), modifiziert, um die Bildung eines rtTA/Tet-KRAB-Dimers zu verhindern (Freundlieb, S., et al., J. Gene Med. 1999; 1:1-13).
  • Vorzugsweise wird die Verwendung eines Vektors, der ein einziges Tetracyclin-Response-Element in Form bidirektionaler Expression enthält, bereitgestellt, so dass die Grundaktivität durch den TetR-KRAB-Repressor strikt reprimiert wird. In Abwesenheit von Doxycyclin bindet der TetR-KRAB-Repressor stark an das Tetracyclin-Response-Element und stellt eine drastische Verringerung der Grundpromotoraktivität sicher. In Anwesenheit von Doxycyclin wird die Transkription durch Ablösung des Tet-KRAB-Repressors und die Bindung des rtTA-Aktivators an den Promotor aktiviert.
  • Alternativ kann das System auf einem reversen Silencer basieren, erhalten durch Fusionierung der KRAB-Domäne, welche für die transkriptionale Repression verantwortlich ist, und der DNA-Bindungsdomäne von rtTA in Kombination mit dem direkten Transaktivator tTA. In dieser zweiten Version des Regulationssystems findet die transkriptionale Repression durch Kultivierung der Zellen in Abwesenheit von Tetracyclin statt.
  • Andere Regulationssysteme sind im Stand der Technik beschrieben, wie z.B. diejenigen, welche auf der Verwendung anderer Liganden als Tetracyclin basieren, wie z.B. RU486 (Wang, K. E., et al. (1994), PNAS, 91:8180-8184), Ecdyson (No, D., et al. (1996), PNAS 93:3346-3351), Rapamycin (Spencer, D. M., et al. (1993), Science 262:1019-1024), und deren Verwendung kann unschwer an die vorliegende Erfindung angepasst werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann jeder beliebige Genexpressionsregulator verwendet werden, so lange er eine ausreichende Regulation gewährleistet und durch die Verwendung von Faktoren, welche in der pharmakologischen Praxis akzeptabel sind, induzierbar ist.
  • Die Anwesenheit von zwei DNA-Isolator-Dimeren verbessert die Stabilität der zweiten genetischen Einheit, was deren Induzierbarkeit erlaubt. Diese DNA-Elemente können vom Hühner-β-Globin-Locus abgeleitet sein und schützen bekanntermaßen eine transkriptionale Einheit vor konstitutiver Inaktivierung aufgrund von DNA-Methylierung und negativen oder positiven Einflüssen, welche auf der Insertionsstelle in dem Wirtschromosom beruhen.
  • Ferner können die Zellen der vorliegenden Erfindung eine zweite genetische Einheit in einer stabilen Form enthalten, wobei die Nicht-Strukturbereiche, die in dem Ad-Genom der ersten genetischen Einheit, welche in dem "Shuttle-Vektor" vorliegt, deletiert oder in irgendeiner Weise inaktiviert sind, funktionsfähig mit Sequenzen, vorzugsweise genomischen Sequenzen, die induzierbar deren Expression regulieren, verknüpft sind.
  • Die zweite genetische Einheit kann in einem oder mehreren Vektor(en) enthalten sein und durch Transfektionstechniken, Mikroinjektion etc., in die Zellen inseriert werden.
  • Eine Selektionsmarker, wie z.B. ein G418-Resistenzgen, Hygromycin B-Resistenzgen, Puromycinresistenzgen, Bleomycinresistenzgen, liegt im allgemeinen in beiden Einheiten vor und kann zur Selektion von Zelllinien, welche stabil eine oder beide der Einheiten aufrecht erhalten, verwendet werden, wobei in diesem letzteren Fall entweder von einer Zelle ausgegangen wird, die eine der Einheiten enthält, oder von Zellen, die keine der Einheiten enthalten, in jedem Fall entsprechend wohlbekannten Techniken auf diesem Gebiet.
  • Die nach Transformation mit der zweiten genetischen Einheit erhaltenen Zellen sind charakterisiert durch das Vermögen zur Expression der darin enthaltenen Nicht-Strukturbereiche in einer streng kontrollierten Weise. Im Fall der Regulation von Nicht-Strukturbereichen unter Verwendung des Tet-Systems führt die Zugabe von Tetracyclin zu dem Kulturmedium zu einer Derepression des Tet-Promotors, vermittelt durch die tetracyclin-induzierte Dissoziation von tTS von der TetR-DNA-Bindungsstelle, gefolgt von einer vollständigen transkriptionalen Aktivierung aufgrund von rtTA-Bindung.
  • Insbesondere umfasst diese Zelllinie in einer stabilen Form einen oder mehrere Vektor(en), umfassend die für E1 und E4 oder E1, E2 und E4 codierenden Gene, welche die Ad-Bereiche, die von dem "Ad/EBV-Shuttle-Vektor" eines humanen Ad-Virus wie oben beschrieben deletiert wurden, komplementieren können. Speziell sind die viralen Gene die des Ad5-Serotyps und das Expressionsregulationssystem basiert auf der Verwendung von sowohl dem tetracyclin-gesteuerten reversen Transaktivator (rtTA) als auch dem hybriden transkriptionalen Tet-KRAB-Repressor wie oben offenbart. Jedoch können genetische Sequenzen, die von irgendeinem anderen Mitglied der Adenoviridae-Familie abgeleitet sind, verwendet werden. In ihren bevorzugten Ausführungsformen ist diese Zelllinie vorzugsweise die Zelllinie A549 (Human-Lungenkarzinom, ATCC CLL 185) wie im Stand der Technik beschrieben, jedoch werden andere Zelllinien, welche die Adenovirus-Replikation erlauben, in der vorliegenden Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen.
  • In irgendeinem der oben beschriebenen Fälle wird die Ableitung der Helferzelllinie mit einer eukaryotischen Zelllinie, vorzugsweise einer Säugerzelllinie, vorzugsweise humanen Ursprungs, welche die erste genetische Einheit in einer stabilen episomalen Form als Vektor einschließt (bezeichnet als "Shuttle-Plasmid"), wie oben offenbart durchgeführt.
  • In ihren bevorzugten Ausführungsformen ist diese Zelllinie vorzugsweise die Zelllinie A549 (Human-Lungenkarzinom, ATCC CLL 185) wie im Stand der Technik beschrieben, aber andere Zelllinien humanen Ursprungs oder auch nicht sind vom Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, so lange sie die Adenovirus-Replikation erlauben.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wurden die so erhaltenen Helferzelllinien in einem Verfahren zur Produktion von adenovirus-abgeleiteten und helferabhängigen Vektoren eingesetzt, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:
    • a') Kultivierung der vorgenannten Helferzelllinie unter Bedingungen, welche dazu geeignet sind, die Expression von Genen, welche von den im Inneren der Zelle enthaltenen Adenovirus-Bereichen codiert werden, zu verringern, wobei die Bedingungen die im Stand der Technik für jeden hier beschriebenen Promotor bekannten Bedingungen sind, wie z.B. die in den Beispielen beschriebenen Bedingungen. Wenn das Tet-System für die transkriptionale Kontrolle verwendet wird, wird die Zelllinie in Abwesenheit von Tetracyclin kultiviert werden;
    • b') Insertion in die Helferzelllinie der genomischen DNA für ein helfer-abhängiges Adenovirus durch Vektor-DNA-Transfektion oder Infektion der Zelle wie beschrieben (Parks, R. J., L. Chen, M. Anton, U. Sankar, M. A. Rudnicki und F. L. Graham (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13656-13570).
    • c') Induktion der Expression der Gene, welche von den im Inneren der Zelle enthaltenen Adenovirus-Bereichen codiert werden. Im Falle der tet-kontrollierten Transkription durch Zugabe von Doxycyclin zu dem Kulturmedium.
  • Eine großmaßstäbliche Produktion eines vollständig deletierten HD-Adenovirus-Vektors wird erzielt durch reihenmäßiges Passagieren des Vektors wie bereits für Vektoren der ersten Generation beschrieben (Hitt, M. M., et al. 1995, Meth. Mol. Genet. 7, 13-30).
  • Speziell wird dieses Verfahren angewandt für die Produktion von helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren, welche für die Expression von Polypeptiden von therapeutischem Interesse codierende Gene enthalten, vorzugsweise zur Verwendung in der Gentherapie, bevorzugt zur Verwendung in der humanen Gentherapie.
  • Bisher wurde eine allgemeine Beschreibung der vorliegenden Erfindung gegeben. Eine detailliertere Beschreibung einiger spezifischer Ausführungsformen davon wird hier im folgenden mit Hilfe der folgenden Beispiele gegeben, welche ein besseres Verständnis ihrer Ziele, charakteristischen Eigenschaften, Vorteile und Ausführungsformen geben sollen.
  • Beispiel 1: Konstruktion eines E1- und E4-Expressionsvektors
  • Alle Plasmide können unter Anwendung von rekombinanten DNA-Standardtechniken konstruiert werden.
  • Der E1-Bereich des Adenovirus 5 kann mittels PCR unter Verwendung der viralen genomischen DNA als Substrat erhalten werden und kann in das Plasmid pBI (Baron, U., et al. (1995), Nucleic Acids Res., 23 (17) 3605-3606), welches einen bidirektionalen Promotor enthält, der aus einem einzigen Tetracyclin-Response-Element (TRE), flankiert von zwei minimalen Cytomegalovirus (CMV)-Promotoren (Clontech), besteht, zwischen den Restriktionsstellen NotI und SalI inseriert werden, was das Plasmid pBI.E1 ergibt. Dann kann pBI.E1 durch Insertion der DNA, welche für den mittels PCR erhaltenen Adenovirus-E4-Bereich codiert, zwischen den Restriktionsstellen MluI und NheI modifiziert werden, um somit das Konstrukt pBI.E1/E4 zu erhalten.
  • Beispiel 2: Konstruktion eines E1/E4-Expressionsvektors
  • Alle Plasmide können unter Anwendung der rekombinanten DNA-Standardtechniken konstruiert werden.
  • Die E4-ORF6-Gen-DNA wurde mittels PCR amplifiziert unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-TTATACGCGTGCCACCATGACTACGTCCG-3' und 5'-TTATGCTAGCGCGAAGGAGAAGTCCACG-3' und pFG140, enthaltend virale genomische Ad5-DNA, als Substrat. Amplifizierte DNA wurde in das Plasmid pBI (Clontech) (Baron, U., et al. (1995), Nucleic Acids Res., 23 (17) 3605-3606), das einen bidirektionalen Promotor, bestehend aus einem einzigen Tetracyclin-Response-Element (TRE), flankiert von zwei minimalen Cytomegalovirus (CMV)-Promotoren, enthält, zwischen den Restriktionsstellen MluI und NheI inseriert, welches das Plasmid pBI.E4 ergibt. pBI.E4 wurde durch Insertion der DNA, welche für den unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-ATGCGCGGGCGCTGAGTTCCTCAAGAGG-3' und 5'-ATGCGTCGACCAGTACCTCAATCTGTATCTTC-3' mittels PCR erhaltenen Adenovirus-E1-Bereich codiert, zwischen den Restriktionsstellen NotI und SalI hergestellt, wobei schließlich das Konstrukt pBI.E1/E4 erhalten wurde (1).
  • Expressionsvektoren für E2a- und E2b-Gene wurden unter Befolgung derselben Strategie konstruiert, wobei das Plasmid pFG140 dazu verwendet wurde, um DNA-Bindungsproteingen-DNA zu amplifizieren, und pVACpoI und pVACpTP als Matrizen für die Amplifizierung der cDNA von Polymerase und präterminalem Protein (pTp). DBP-DNA wurde in pTRE (Clontech) zwischen den Restriktionsstellen EcoRI und XbaI kloniert. Ad-Polymerase und pTP wurden in denselben Vektor kloniert oder in Kombination in das pBI mit dem bidirektionalen Promotor unter der transkriptionalen Kontrolle des Tet-Operators.
  • Beispiel 3: Konstruktion eines Vektors, der tetracyclin-gesteuerte Transkriptionsregulatoren exprimiert
  • Das Tet-Steuerungssystem erlaubt die Regulation von Genaktivitäten über ein breites Größenspektrum in Säugerzellen. Ein transkriptionaler Silencer (tTS) wurde kürzlich durch Fusion der DNA-Bindungsdomäne des Tetracyclin-Repressors mit der Silencer-Domäne von Kid-1 entwickelt (Freundlieb, S., et al., J. Gene Med. 1999; 1:1-13). tTS und rtTA wurden in einem einzigen Expressionsvektor wie folgt kombiniert. Ein EcoRI-ClaI-DNA-Fragment, enthaltend den Tet-Silencer, wurde aus dem Plasmid pUHS6-1 isoliert und stromabwärts der IRES-Sequenz in den Vektor pIRES-Neo (Clontech) unter Ersatz des Neo-Gens inseriert. Der neue Vektor pIRES-tTS wurde mit der Insertion des rtTA-Gens in die nur einmal vorkommende EcoRV-Restriktionsstelle stromabwärts des Human-Cytomegalovirus-IE-Promotors modifiziert, welches pIREStTS/rtTA ergab. Zur Einführung eines Selektionsmarkers zur Isolierung von Zellklonen, welche stabil Tet-Proteine exprimierten, wurde eine aus dem Vektor pPUR (Clontech) erhaltene Puromycinresistenz-Expressionskassette in die XhoI-Stelle von pIREStTS/rtTA inseriert, welches pIREStTS/rtTApuro ergab (2).
  • Beispiel 4: Konstruktion des Shuttle-Plasmids
  • Ein 32462-bp-DNA-Fragment, enthaltend das gesamte Adenovirus 5-Genom, bei dem der E1-Bereich und das Verpackungssignal deletiert sind, kann durch Spalten des Plasmids pBHG10 (Bett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8802-8806; 1994) mit den Restriktionsenzymen XbaI und ClaI erhalten werden. Das resultierende Fragment kann in den Vektor pCEP4 (Invitrogen), welcher den Replikationsursprung von EBV Ori P und das Gen für den viralen Transaktivator EBNA-1 enthält, zwischen den Restriktionsstellen SspBI und BamHI inseriert werden, um somit das Plasmid pSC zu erhalten. Dann kann der E4-Bereich des Adenovirus-Genoms deletiert werden, wobei das DNA-Fragment, das zwischen den Nukleotiden 32810 und 35620 enthalten ist, eliminiert wird, und somit das Plasmid pSCΔE4 erzeugt werden. Anschließend können pSCΔE4-Modifikationen eingeführt werden, um die Vektoreigenschaften zu optimieren. Beispielsweise kann die erneute Insertion von Sequenzen aus dem AdS-Wt-E3-Bereich, welche im Kontext von pBHG10 deletiert wurden, in das virale Genom die Expressionsniveaus des für die Virusfaser codierenden Gens erhöhen. Darüber hinaus kann ein DNA-Fragment, das Mehrfachbindungsstellen des Tetracyclin-Repressors einschließt (tet-O), stromaufwärts der Transkriptionsstarts des E2-Bereiches inseriert werden, um die restliche Expression des Adenovirus-Genoms weiter abzuschwächen, wie von Rittner et al. (Rittner, K., et al. (1997), J. Virol. 71:3307-3311) beschrieben. In dieser Version des Shuttle-Plasmids pSCΔE4 ist dessen Expression weiter durch Tet-KRAB abgeschwächt, welches an den E2-Bereich in Abwesenheit von Tetracyclin bindet.
  • Beispiel 5: Konstruktion des Shuttle-Plasmids
  • A: Subklonierung und Modifizierung des E4-Bereichs von Ad5
  • Ein DNA-Fragment, enthaltend den gesamten Adenovirus 5-E4-Bereich, wurde erhalten durch Spalten des Plasmids pBHG10 (Bett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8802-8806; 1994) mit den Restriktionsenzymen SpeI und ClaI. Das isolierte Fragment wurde in den Vektor pBluescript (Stratagene) zwischen den Restriktionsstellen SpeI und ClaI ligiert, welches das Plasmid pBSE4 ergab. Dann wurde pBSE4 durch Insertion eines Eptamers von DNA-Bindungsstellen für den Tet-Repressor in die nur einmal vorkommende PacI-Restriktionsstelle modifiziert, welches pBSE4-ept ergab. Die Tet-Eptamer-DNA wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-CTGATTAATTAAATAGGCGTATCACGAGGCC-3' und 5'-CTGACGATCGCGTACACGCCTACTC-3' und des Plasmids pUHD10.3 als DNA-Matrize amplifiziert. Die Tet-Bindungsstelle wurde in die PacI-Restriktionsstelle von pBSE4 gerade stromaufwärts des E2-Promotors kloniert. Das Endziel war die Verringerung der Hintergrundexpression des E2-Promotors unter Nutzung des Silencer-Effekts des tetracyclin-kontrollierten transkriptionalen Silencers wie beschrieben von Rittner (Rittner, K., et al. (1997), J. Virol. 71:3307-3311). Der in PBSE4-ept vorliegende Ad5-E4-Bereich wurde dann eliminiert durch Verdauung mit den Restriktionsenzymen MfeI und ClaI, die Vektor-DNA wurde gelgereinigt und mit einer Tk-Hygromycin B-Resistenz-Expressionskassetten-DNA, erhalten mittels PCR mit den Oligonukleotiden 5'-AGTGCACAATTGATTTAAATAATCCGCGCGGTGG-3' und 5'-TGCAATCGATCAACGCGGGCATCC-3' unter Verwendung von pCEP-4-Plasmid-DNA als Matrize, ligiert, welches pBSΔE4 ergab. Die Adenovirus-ITRs in Kopf-zu-Schwanz-Konfiguration wurden dann mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-TCGAATCGATACGCGAACCTACGC-3' und 5'-TCGACGTGTCGACTTCGAAGCGCACACCAAAAACGTC-3' und pFG140 (Microbix)-Plasmid-DNA als Matrize amplifiziert. Die Ad-ITRs wurden in die nur einmal vorkommende NruI-Stelle von pBSΔE4 kloniert, welches pBSΔE4J ergab.
  • B: Insertion von EBV-OriP in pLBG40
  • Ein DNA-Fragment, enthaltend EBV-OriP, wurde aus dem Vektor pCEP4 durch MfeI-Verdauung isoliert und in pLitmus 28 (N. E. Biolabs), verdaut mit dem Restriktionsenzym EcoRI, subkloniert. Das resultierende Plasmid plit-OriP wurde dann mit XbaI verdaut, um ein 2476-bp-DNA-Fragment, enthaltend den EBV-OriP freizusetzen, welches in die nur einmal vorkommende XbaI-Stelle des Plasmids pLBG40 (Recchia, A., et al. 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96:2615-2620) kloniert wurde, welches pLBG-OriP ergab.
  • C: Construktion von Ad/EBV-Shuttle-Plasmiden
  • Ein Shuttle-Plasmid pSA-1 (2), welches eine Kopie des Ad5-Genoms trägt, bei der E1, E3, E4 und das Verpackungssignal deletiert sind, wurde konstruiert durch Ersatz des DNA-Fragments von pLBG-OriP zwischen den Restriktionsstellen SfuI und PacI durch das PacI-ClaI-DNA-Fragment, welches aus pBSΔE4J erhalten wurde.
  • pSA-1 wurde weiter modifiziert durch Insertion des EBNA-1-Gens wie folgt. pREP10 (Invitrogen), ein Plasmid, das beide Elemente des latenten EBV-Replikationsursprungs enthält, EBNA-1 und OriP, wurde mit XbaI und NheI verdaut, um ein 429-bp-DNA-Fragment zu isolieren, welches SV40-polyA enthielt. Plasmid-DNA wurde vollständig aufgefüllt, gelgereinigt und ligiert, um pREP11 zu erzeugen. pREP11 wurde dann mit EcoRI und XhoI verdaut, um ein DNA-Fragment freizusetzen, welches sowohl das EBNA-1-Gen als auch den OriP enthielt. Dieses DNA-Fragment wurde in pLitmus28, verdaut mit EcoRI und XhoI, subkloniert, um pREP12 zu erhalten. pREP12 wurde mit EcoRI und MluI verdaut, gelgereinigt und mit dem 3627-bp-EcoRI-MluI-DNA-Fragment ligiert, welches aus pCEP4 isoliert worden war, um pREP13 zu erzeugen. pREP13 wurde mit XbaI und NheI verdaut, um ein DNA-Fragment mit XbaI-kompatiblen Enden freizusetzen, welches EBNA-1 und OriP enthält. Schließlich wurde dieses Fragment in pSA-1, verdaut mit XbaI, kloniert, um pSA-2 zu erzeugen.
  • Beispiel 6: Ad/EBV-Shuttle-Plasmid-Modifizierungen
  • Die Ad/EBV-Shuttle-Plasmide (pSA-1 und pSA-2) wurden weiter modifiziert durch Deletion einer DNA-Sequenz, welche dem DNA-Bindungsprotein (DBP)-Gen (Nukleotide 22443-24032 der Ad5-Sequenz) entsprach. Die Deletion wurde durch homologe Rekombination in E. coli nach dem von A. F. Stuart und Mitarbeitern beschriebenen Verfahren (Zhang et al., Nat. Genet. 1998; 20:123-128) erhalten. Ein DNA-Fragment, enthaltend das Tn5-Kanamycinresistenzgen (neo), flankiert von DNA-Sequenzen, wurde mittels PCR mit den Oligonukleotiden 5'-GCGGTTAGGCTGTCCTTCTTCTCGACTGACTCCATGATCTTTTTCTGCCTATAGGAGAAG GAATCCCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCG-3' und 5'-AAATGCTTTTATTTGTACACTCTCGGGTGATTATTTACCCCCACCCTTGCCGTCTGCGCC GTTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCG-3', bestehend aus etwa 60 bp an Homologie zu dem DBP-Gen, und an den 3'-Enden PCR-Primern zur Amplifizierung des neo-Gens unter Verwendung von pGKfrt als Matrize erhalten. Lineare DNA, enthaltend das neo-Gen, wurde in Rekombinationsexperimenten eingesetzt, um das DBP-Gen aus Ad/EBV-Shuttle-Plasmiden zu deletieren. Dasselbe Verfahren wurde zur Konstruktion von Ad/EBV-Shuttle-Plasmiden angewandt, welche kein Ad-Polymerasegen und präterminales Protein exprimieren. Die Sequenz der zur Deletion des Polymerasegens verwendeten Oligonukleotide war 5'-ACGGCCTGGTAGGCGCAGCATCCCTTTTCTACGGGTAGCGCGTATGCCTGCGCGGCCT TCCGGTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCG-3' und 5'-AGACCTATACTTGGATGGGGGCCTTTGGGAAGCAGCTCGTGCCCTTCATGCTGGTCAT GTCCCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCG-3'. Zwei Paare von Oligonukleotiden wurden zur Deletion der beiden Bereiche innerhalb des Hauptexons von pTP verwendet: 5'-CCGCCTCCCGGTGCGCCGTCGTCGCCGCCGTGTCCCCCCTCCCCCACCGTCCCGGCG GATTTGTCCTACTCAGGAGAGCG-3' und 5'-GATCTCCGCGTCCGGCTCGCTCCACGGTGGCGGCGAGGTCGTTGGAAATGCGTCTGC AAACCCTATGCTACTCCGTCG-3', 5'-TCGACAGAAGCACCATGTCCTTGGGTCCGGCCTGCTGAATGCGCAGGCGGTCTGCAAA CCCTATGCTACTCCGTCG-3' und 5'-TCGCCCCCGGAGCCCCGGCCACCCTACGCTGGCCCCTCTACCGCCAGCCGCTCCCGG CGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCG-3'.
  • Das gleiche Verfahren kann auf andere Bereiche von genomischer Adenovirus-DNA angewandt werden, die für die Erzielung einer Verringerung zytotoxischer Wirkungen, welche durch Expression viraler Gene in der infizierten Zelle hervorgerufen werden, von Bedeutung sind.
  • Beispiel 7: Beurteilung von E1/E4-Expression
  • Zur Ermittlung der Regulation der E1-Genexpression in Zellen, die Tet-Proteine produzieren, wurden HeLa-Zellen auf 6-Mulden-Platten ausgesät und mit pBI.E1/E4 in Kombination mit pIREStTS/rtTApuro transfiziert. Das Experiment erfolgte in doppelter Ausführung mit und ohne Doxycyclin. 48 h nach der Transfektion wurden HeLa-Zellen geerntet und Zelllysate mittels Westernblots unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der gegen E1-Proteine gerichtet war, analysiert. 293-Zellen, welche konstitutiv den E1-Bereich exprimieren, wurden als positive Kontrolle verwendet.
  • Eine Leck-Expression von E1-Proteinen war in Zellen nachweisbar, die nur mit pBI.E1/E4 transfiziert worden waren. Erwartungsgemäß wurde in Anwesenheit von Tet-Regulationsfaktoren eine starke Expression von E1-Proteinen, induziert durch Doxycyclin, beobachtet, während in Abwesenheit des Wirkstoffs die Expression nicht nachweisbar war. Dieses Ergebnis demonstriert, dass die Expression von Tet-Silencer die Genaktivität aktiv reprimiert und somit die Hintergrundexpression eliminiert. Eine gleichzeitige Expression von tTS und rtTA beeinflusste die Geninduktion über rtTA in Gegenwart von Doxycyclin nicht. Dieses Ergebnis wurde durch ein zweites Experiment bestätigt, in dem HeLa-Zellen mit einem ΔE1-Ad-Vektor, der β-Galactosidase exprimierte, infiziert und dann mit pBI.E1/E4 und pIREStTS/rtTApuro transfiziert wurden. 48 h nach der Transfektion wurden HeLa-Zellen geerntet und ein Lysat wurde durch Aufbrechen der Zellen mittels Einfrieren und Auftauen erhalten. Monoschichten von A549-Zellen wurden mit einem Aliquot des Zelllysats inkubiert und nach 24 h wurde die β-Gal-Aktivität wie beschrieben (Parks, R. J., et al. 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8802-8806) nachgewiesen. Nachdem HeLa-Zellen nicht vollständig permissiv für die Replikation von Vektoren der ersten Generation sind, wurden keine viralen Abkömmlinge in den Zellen nachgewiesen, die nur infiziert waren, während der ΔE1-Vektor in Zellen, die mit beiden Vektoren (pBI.E1/E4 und pIREStTS/rtTApuro) transfiziert worden waren, in Anwesenheit von Doxycyclin vollständig komplementiert wurde, wie demonstriert durch den Nachweis von IacZ-transduzierenden Partikeln im Zelllysat. Ein niedriger β-Galactosidase-Transduktionstiterwurde nach Transfektion mit pBI.E1/E4 als Ergebnis von Tet-Promotor-Grundaktivität nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurden keine transduzierenden Partikel in Zellen nachgewiesen, die in Abwesenheit von Doxycyclin nach Cotransfektion von pBI.E1/E4 und pIREStTS/rtTApuro und Infektion mit Ad-ΔE1-βgal aufrecht erhalten wurden. Dieses Ergebnis bestätigt, dass eine Modulation der E1-Genexpression durch Kombination von Tet-Silencer- und rtTA-Aktivität erhalten werden kann. Darüber hinaus reprimiert die tTS-Expression die E1-Produktion unterhalb des erforderlichen Niveaus, um eine virale Replikation des ΔE1-Ad-Vektors nachzuweisen.
  • Beispiel 8: Komplementierungsfunktion von Ad/EBV-Shuttle-Plasmiden
  • Zum Testen der Ad-Helferfunktion von Ad/EBV-Plasmiden wurden die Plasmide in A549EBNA- und 293EBNA-Zelllinien in Kombination mit dem helfer-abhängigen Ad-Plasmid C4E1E4gfp kotransfiziert. Dieser Vektor enthält E1- und E4-Adenovirus-Bereiche sowie eine Expressionskassette für Grünes Fluoreszenzprotein (GFP). Wenn beide Plasmide in die gleiche Zelle eingeführt wurden, aktivierte die Expression der E1- und E4-Gene das Ad/EBV-Plasmid, welches die Replikation beider Vektoren, jedoch nur die Verpackung von C4E1/E4gfp-DNA erlaubt. Zwei parallele Experimente wurden unter Verwendung beider Zelllinien durchgeführt. 72 h nach der Transfektion wurde episomale DNA aus einer Gewebekulturschale nach dem Hirt-Verfahren extrahiert. Transfizierte Zellen wurden von der zweiten Schale geerntet und mittels Einfrieren und Auftauen aufgebrochen, um ein rohes Zelllysat zu erhalten.
  • Episomale DNA wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und DpnI verdaut und mittels Southernblots analysiert. Filter wurden mit einer Hygromycin-B-DNA-Sonde hybridisiert, welche für das Ad/EBV-Plasmid spezifisch war, und dann, nach Ablösung, mit einer zweiten DNA-Sonde, abgeleitet von C4E1E4gfp, welche beide Plasmide erkennt, rehybridisiert. Parallel dazu wurde eine Monoschicht von 293-Zellen mit Aliquots an Zelllysat inkubiert, um die Produktion von gfp transduzierenden Partikeln zu ermitteln. Die Ergebnisse demonstrierten, dass sich Ad/EBV-Plasmide in zirkulärer Form sowie in linearer Form replizieren, wenn sowohl Ad (E1/E4) als auch viraler EBV (EBNA-1)-Transaktivator exprimiert werden. Darüber hinaus führte die Aktivierung des Ad-Transkriptionsprogramms zu C4E1E4gfp-DNA-Replikation und Verpackung in reife Virionen, wie demonstriert durch die Beobachtung von fluoreszentem GFP exprimierenden Zellen in der 293-Monoschicht, die mit dem Zelllysat inkubiert wurde.
  • Beispiel 9: Konstruktion einer Zelllinie, die Regulationsproteine exprimiert
  • A549-Zellen (Human-Lungenkarzinom, ATCC CLL 185), welche sowohl den tetracyclinkontrollierten reversen Transaktivator (Gossen, D., et al. (1995), Science 268:1766-1769) als auch den hybriden transkriptionalen tet-KRAB-Repressor (Deuschle, U., et al. (1995), Mol.
  • Cell. Biol. 15:1907-1914) exprimieren, können durch Cotransfektion der beiden Plasmide pTet-On (Clontech) und pTetKRAB erhalten werden. Anschließend können die durch Selektion mit dem Antibiotikum G-418 erhaltenen Zellklone getestet werden, um durch Verwendung irgendeines Vektors, in dem ein Reportergen unter der Kontrolle des Tet-Operators inseriert ist, die Expression beider transregulierender Proteine zu ermitteln.
  • Ein Adenovirus-Vektor der ersten Generation wurde konstruiert, indem in die PacI-Stelle des Plasmids pLBG40 eine Expressionskassette, welche das unter die Kontrolle des Tet-Operators gestellte Luciferasegen enthielt, inseriert wurde, wodurch das Plasmid pLBGluc erhalten wurde.
  • Dieses Plasmid umfasst das gesamte Adenovirus-Genom, bei dem die E1- und E3-Bereiche deletiert sind, und ist deshalb infektiös, falls es mittels Transfektion in 293-Zellen inseriert wird. Das Virus (AdLBGluc), das in den Plaques, die etwa 10 Tage nach der Transfektion in 293-Zellen, die in Monoschicht kultiviert wurden, erschienen, enthalten ist, wurde expandiert, titriert und einem Assay hinsichtlich Luciferase-Enzym-Expression unterworfen.
  • Etwa 104-Zellen eines jeden Klons, erhalten durch Resistenz gegenüber G418, können in 24-Mulden-Platten ausgesät und mit AdLBGluc-Virus bei einer MOI von 20 infiziert werden. Dieselbe Anzahl an Zellen wurde als Duplikat auf eine zweite Platte ausgesät und in Gegenwart von Doxycyclin vor der Infektion kultiviert. 48 h nach der Infektion wurden die Zellen geerntet und lysiert. Die Expressionsniveaus des Luciferasegens wurden unter Verwendung des natürlichen Substrats Luciferin ermittelt. Die Klone, in denen das beste Verhältnis zwischen der Aktivierung der Luciferaseexpression in Gegenwart von Doxycyclin und dem Grundniveau in Abwesenheit von Ligand beobachtet wurde, wurden ausgewählt und expandiert. Ein Klon, welcher gemäß diesem Verfahren hergestellt worden war, wurde expandiert, um weiter charakteristische Eigenschaften von Wachstum, Stabilität und Expressionsniveaus der Regulationsproteine zu definieren. Deshalb wurden geeignete Banken eingefrorener Zellen präpariert, um die Aufrechterhaltung einer Zelllinie sicherzustellen, welche die Regulationsproteine der Transkription rtTA und Tet-KRAB exprimiert.
  • Beispiel 10: Konstruktion der E1/E4-induzierbaren Zelllinie
  • Das Plasmid pBI.E1/E4 (siehe Beispiel 1) kann in die Zellen des zuvor selektionierten Klons zusammen mit einem Plasmid, welches Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Puromycin exprimiert, transfiziert werden. Die Zellen sind selektierbar durch Wachstum auf einem Medium, welches das Antibiotikum enthält, und werden hinsichtlich ihrer Expression von frühen Adenovirus-Proteinen unter der Kontrolle von Tetracyclin einem Assay unterworfen. Für diesen Zweck kann ein Adenovirus-Vektor der zweiten Generation, bei dem sowohl der E1- als auch der E4-Bereich deletiert ist, konstruiert werden wie in der Literatur beschrieben (Brough, D. E., et al. (1996), J. Virol. 70:6497-6501). Die durch Insertion der transkriptionalen Einheit E1/E4 in die Zelle erhaltenen Zellklone können auf Basis ihres Vermögens, den helfer-abhängigen defekten Adenovirus zu komplementieren und somit dessen Replikation zu erlauben, selektioniert werden. Puromycin-resistente Klone können in 24-Mulden-Platten als Duplikat ausgesät werden. Anschließend können die Zellen mit dem ΔE1/E4-Virus infiziert und dann mit und ohne Zugabe von Doxycyclin zum Kulturmedium kultiviert werden. In Anwesenheit von Doxycyclin kann die E1- und E4-Transkriptions-aktivierung Zellen hinsichtlich viraler Replikation permissiv machen und somit den damit verbundenen zytopatischen Effekt belegen. Die Klone, in welchen der AdΔE1/E4-Vektor ausschließlich in Gegenwart von Doxycyclin replizieren kann, können expandiert und zur Feststellung einer dauerhaften Produktion des defekten Virus weiter charakterisiert werden.
  • Beispiel 11: Konstruktion einer EBNA-1-exprimierenden A549-Zelllinie
  • Eine A549-Zelllinie, welche ein EBNA-1-Gen exprimiert, wurde durch stabile Transfektion des Vektors pEB (Ramage, A. D., et al., 1997, Gene 197:83-89) erzeugt. pEB wurde durch MluI-Verdauung linearisiert und in A549 unter Verwendung des Reagenzes Fugene 6 (Boehringer) transfiziert. 72 h nach der Transfektion wurden A549-Zellen in einem Verhältnis 1:20 in selektivem Medium, enthaltend 600 μg/ml G418, aufgeteilt. 10 resistente Klone wurden expandiert und hinsichtlich episomaler Replikation des Plasmids pCEP-EBNAde1, enthaltend den EBV-Ori-P und eine Hygromycin-Resistenzgen-Expressionskassette, getestet.
  • Beispiel 12: Konstruktion der Helferzelllinie
  • Das Shuttle-Plasmid pSCΔE4 kann durch Transfektionstechniken in die Zelllinie, welche die E1/E4-induzierbare transkriptionale Einheit einschließt, inseriert werden. Die resistenten Zellklone, welche durch Kultivierung der transfizierten Zellen in Gegenwart des Antibiotikums Hygromycin B erhalten wurden, können expandiert und weiter hinsichtlich ihres Vermögens zur induzierbaren Expression der Adenovirus-Gene und zur Aufrechterhaltung der Propagation eines helfer-abhängigen Ad-Vektors charakterisiert werden. Zunächst kann die induzierbare Expression des Adenovirus-Genoms überwacht werden, wobei der vermittelte zytopathische Effekt durch Kultivierung der Zellen in Gegenwart von Tetracyclin ermittelt wird. Die Produktion der Adenovirus-Strukturproteine kann quantitativ mittels Westernblots und Immunpräzipitationstechniken mit spezifischen Antikörpern, wie bereits in der Literatur beschrieben, bestimmt werden. Die Kapazität der Zellklone, welche das Episom pSCΔE4 einschließen, eine Replikation von helfer-abhängigen Vektoren zu erlauben, kann unter Verwendung verschiedener Vektoren, welche die Reportergene, die für das Grüne Fluoreszenzprotein (GFP) oder für die β-Galactosidase oder irgendein anderes Gen mit einer leicht nachweisbaren Aktivität codieren, untersucht werden. Die Zellen können mit einer unterschiedlichen MOI des helfer-abhängigen Virus infiziert werden, dann geerntet, wenn der zytopathische Effekt ersichtlich ist, nach tetracyclin-induzierter Expression des Adenovirus-Genoms. Die Virusausbeute kann unter Verwendung des zellulären Lysats, wie von Parks in PNAS 1996 beschrieben, bestimmt werden. Die Ermittlung des Verhältnisses zwischen der Anzahl der gebildeten transduzierenden viralen Partikel, welche die verpackenden Zelllinien infizieren, und derjenigen, welche in dem verwendeten viralen Impfgut vorliegen, kann eine Abschätzung der Virusproduktionseffizienz in den verschiedenen erhaltenen Klonen ermöglichen.
  • Beispiel 13: Konstruktion von Zelllinien, die Ad/EBV-Shuttle-Vektor enthalten
  • A. A549-EBNA-Klone, die Ad/EBV-Shuttle-Vektor enthalten
  • Ad/EBV-Shuttle-Plasmid wurde in die A549-EBNA-Zelllinie unter Einsatz des Transfektionsreagenzes Fugene-6 (Boehringer) oder des Calciumphosphat-Verfahrens eingeführt. Ad/EBV-Plasmid wurde alleine oder in Kombination mit pIREStTS/rtTApuro oder pUHS6-1 transfiziert. Die Cotransfektion des Ad/EBV-Shuttle-Vektors mit Plasmiden, welche den Tet-Silencer exprimieren, sollte das Auftreten von Ad-Gen-Leck-Expression durch Repression des E2-Promotors weiter reduzieren. A549-EBNA-Zellen wurden in selektives Medium, das 400 μg/ml an G-418 und 200 μg/ml an Hygromycin-B enthielt, 48-72 h nach der Transfektion eingebracht. Isolierte hygromycin-B-resistente Klone wurden in 24-Mulden-Platten überführt und expandiert.
  • Zum Testen von A549-Ad/EBV-Klonen hinsichtlich des Vermögens zur Komplementierung und Propagierung eines helfer-abhängigen Ad-Vektors wurde ein neues Plasmid C4E1E4gfp konstruiert. Dieses helfer-abhängige Plasmid enthält E1- und E4-Adenovirusbereiche sowie eine Expressionskassette für Grünes Fluoreszenzprotein. Der HDC4E1E4gfp-Vektor wurde freigesetzt und amplifiziert unter Verwendung von 293CRE4-Zellen wie beschrieben (Parks, R. J., et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:13565-13570). Eine gereinigte Präparation von HDC4E1E4gfp wurde zur Infektion von A549-Ad/EBV-Klonen bei einer niedriger Multiplizität der Infektion verwendet.
  • Klone, die nach Ad/EBV-Cotransfektion mit pIREStTS/rtTApuro oder pUHS6-1 isoliert worden waren, wurden in doppelter Ausführung mit oder ohne 1 μg/ml Doxycyclin getestet. Die Expression von E1- und E4-Genen erlaubte die Aktivierung des Ad-Transkriptionsprogrammes nur in Klonen, die eine intakte Kopie des Ad/EBV-Shuttle-Plasmids enthielten. Das Ergebnis war die Induktion eines zytopathischen Effekts (cpe) und HD-Vektor-Propagation.
  • B. Konstruktion verschiedener Zelllinien, die den Ad/EBV-Shuttle-Vektor II enthielten
  • pSA-2 inkorporiert eine EBNA-1-Expressionskassette und ist somit in der Lage, in irgendeiner Zelllinie, die hinsichtlich episomaler Aufrechterhaltung permissiv ist, vermittelt durch einen latenten EBV-Replikationsursprung zu replizieren. Er wurde dann zur Identifizierung neuer, von A549EBNA verschiedenen Zelllinien mit verbesserten biologischen Eigenschaften eingesetzt. Eine Anzahl unterschiedlicher Zelllinien wurde transfiziert und hygromycin-B-resistente Klone wurden isoliert und untersucht wie bereits für die Klone, die aus A549EBNA-Zellen erhalten worden waren, beschrieben.
  • Beispiel 14: Isolierung eines Zellklons, der E1- und E4-Proteine in einer durch tet regulierten Weise exprimiert
  • A549EBNA-Zellen, welche sowohl den tetracyclin-kontrollierten reversen Transaktivator (Gossen, D., et al. (1995), Science 268:1766-1769) als auch den transkriptionalen tTS-Silencer (Deuschle, U., et al. (1995), Mol. Cell. Biol. 15:1907-1914; Freundlieb, S., et al., J. Gene Med. 1999; 1:1-13) exprimieren, wurden durch Transfektion von pIREStTS/rtTApuro erhalten. Anschließend wurden die durch Selektion mit dem Antibiotikum Puromycin erhaltenen Zellklone getestet, um die Expression der beiden transregulierenden Proteine durch Verwendung irgendeines Vektors, in dem ein Reportergen unter der Kontrolle des Tet-Operators eingebaut ist, zu ermitteln.
  • Ein Adenovirus-Vektor der ersten Generation wurde konstruiert durch Insertion einer Expressionskassette, die das Luciferasegen unter die Kontrolle des Tet-Operators gestellt enthält, welche durch PvuII-Verdauung von pABS-Tetluc erhalten worden war, in die XbaI-Stelle des Plasmids pLBG40, wodurch das Plasmid pLBGTetluc erhalten wurde.
  • Dieses Plasmid umfasst das gesamte Adenovirus-Genom, bei dem die E1- und E3-Bereiche deletiert sind, und ist deshalb infektiös bei Transfektion in 293-Zellen. Isolierte Plaques waren 10 Tage nach 293-Transfektion sichtbar. Drei Plaques wurden gepickt und durch HindIII-Verdauung nach dem von Graham, F. L., und Mitarbeitern, 1995, Methods in Molecular Genetics 7:13-20, beschriebenen Verfahren analysiert. Alle drei Plaques zeigten das korrekte Restriktionsmuster. Ein virales Isolat wurde expandiert, titriert und hinsichtlich Luciferaseenzym-Expression einem Assay unterworfen.
  • Etwa 104 Zellen eines jeden Klons, erhalten durch Resistenz gegenüber Puromycin, wurden als Duplikat in 24-Mulden-Platten ausgesät und mit dem AdLBGluc-Virus in einer MOI von 20 infiziert. Eine Platte wurde in Gegenwart von Doxycyclin vor der Infektion kultiviert. Die Zellen wurden 48 h nach der Infektion geerntet und lysiert. Die Expressionsniveaus des Luciferasegens wurden unter Verwendung des natürlichen Substrats Luciferin ermittelt. Die Klone, in denen das beste Verhältnis zwischen der Aktivierung der Luciferase-Expression in Gegenwart von Doxycyclin und dem Grundniveau in Abwesenheit von Ligand beobachtet wird, wurden ausgewählt und expandiert. Ein Klon, der gemäß dieser Prozedur hergestellt worden war, wurde expandiert, um weiter charakteristische Eigenschaften von Wachstum, Stabilität und Expressionsniveaus der Regulationsproteine zu definieren. Deshalb wurden geeignete Banken eingefrorener Zellen präpariert, um die Aufrechterhaltung einer Zelllinie, welche die Regulationsproteine der Transkription rtTA und Tet-KRAB exprimiert, sicherzustellen.
  • Beispiel 15: Konstruktion der E1/E4-induzierbaren Zelllinie
  • Das Plasmid pBI.E1/E4 (siehe Beispiel 1) wurde in die A549EBNA-Zellen zusammen mit pIREStTS/rtTApuro transfiziert. Die Zellen wurden durch Wachstum auf einem Medium, welches das Antibiotikum enthielt, selektioniert und hinsichtlich ihrer Expression früher Adenovirus-Proteine unter der Kontrolle von Tetracyclin einem Assay unterworfen. Für diesen Zweck wurde ein Adenovirus-Vektor der zweiten Generation, bei dem sowohl die E1- als auch die E4-Bereiche deletiert waren (Krougliak, V., et al. 1995, Hum. Gene Ther. 6:1575-1586) von F. L. Graham erhalten und zum Screenen hinsichtlich positiver Klone verwendet. Die Zellklone, welche durch Insertion der transkriptionalen Einheit E1/E4 in die Zelle erhalten worden waren, wurden auf der Basis ihrer Kapazität zur Komplementierung des helfer-abhängigen defekten Adenovirus-Vektors und somit zur Ermöglichung seiner Replikation selektioniert. Puromycin-resistente Klone wurden in 24-Mulden-Platten als Duplikat ausgesät. Dann wurden die Zellen mit dem ΔE1/E4-Virus infiziert und dann mit oder ohne Zugabe von Doxycyclin zu dem Kulturmedium kultiviert. In Gegenwart von Doxycyclin kann die E1- und E4-Transkriptionsaktivierung Zellen hinsichtlich viraler Replikation permissiv machen und somit den vermittelten zytopathischen Effekt belegen. Virale Titer wurden mittels PCR unter Verwendung des TaqMam-Verfahrens ermittelt. Die Klone, in denen der AdΔE1/E4-Vektor ausschließlich in Gegenwart von Doxycyclin replizieren kann, wurden expandiert und weiter charakterisiert, wobei eine dauerhafte Produktion des defekten Virus ermittelt wurde. Dieselbe Prozedur wurde befolgt, um A549EBNA-Klone zu erhalten, welche E2-Gene unter Tetracyclin-Kontrolle exprimierten. Die erhaltenen Klone wurden gescreent unter Verwendung von Ad-Vektoren, bei denen die entsprechenden E2-Gene deletiert waren.
  • Beispiel 16: Konstruktion der Helferzelllinie und HD-Propagation
  • Das Shuttle-Plasmid pSA-1 wurde durch Standard-Transfektionstechniken in die Zelllinie inseriert, welche die E1/E4-induzierbare transkriptionale Einheit und Tet-Proteine einschloss. Mehrere resistente Klone wurden erhalten durch Aufteilen der Zellen 48 h nach der Transfektion und Kultivierung in einem selektiven Medium, das auch Hygromycin B in einer Konzentration von 200 μg/ml enthielt. Resistente Klone wurden expandiert und hinsichtlich ihres Vermögens zur induzierbaren Expression der Adenovirus-Gene und zur Aufrechterhaltung der Propagation eines helfer-abhängigen Ad-Vektors weiter charakterisiert. Zunächst wurde die induzierbare Expression des Adenovirus-Genoms überprüft, wobei der vermittelte zytopathische Effekt durch Kultivierung der Zellen in Anwesenheit von Tetracyclin ermittelt wurde. Die Induktion der Adenovirus-Strukturproteinproduktion wurde quantitativ bestimmt durch Westernblots und Immunpräzipitationstechniken mit spezifischen Antikörpern. Die Kapazität der Zellklone, welche das Episom pSA-1 einschlossen, zur Ermöglichung der Replikation von helfer-abhängigen Vektoren wurde unter Verwendung verschiedener Vektoren untersucht, welche die Reportergene, codierend für das Grüne Fluoreszenzprotein (GFP) oder für die β-Galactosidase oder irgendein anderes Gen mit einer leicht nachweisbaren Aktivität, enthielten. Die Zellen wurden mit einer unterschiedlichen MOI des helferabhängigen Virus infiziert, dann geerntet, wenn der zytopathische Effekt ersichtlich war, nach tetracyclin-induzierter Expression des Adenovirus-Genoms. Die Virusausbeute wurde durch Verwendung des Zelllysats zur Infektion einer 293-Zellmonoschicht bestimmt. Die Ermittlung des Verhältnisses zwischen der Anzahl gebildeter transduzierender viraler Partikel, welche die verpackenden Zelllinien infizierten, und derjenigen, die im viralen Impfgut vorlagen, wurde zur Beurteilung der Virusproduktionseffizienz in den verschiedenen erhaltenen Klonen verwendet.
  • Dieselbe Prozedur wurde befolgt, um verpackende Zelllinien mit den modifizierten Versionen des Ad/EBV-Shuttle-Plasmids unter Kombination verschiedener Deletionen früher Gene, einschließlich E2-Gene, zu erhalten.
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Claims (25)

  1. Zellen zur Produktion von helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren, welche mindestens die folgenden genetischen Einheiten umfassen: – eine erste genetische Einheit, umfassend ein defektes Adenovirus-Genom, bei dem die invertierten terminalen Repeats in einer Kopf-zu-Schwanz-Konfiguration vorliegen, das Verpackungssignal inaktiviert ist und mindestens einer der nicht-strukturellen Bereiche inaktiviert ist; – eine zweite genetische Einheit, umfassend mindestens einen induzierbaren Promotor und mindestens einen der in der ersten genetischen Einheit inaktivierten Bereiche, wobei die Bereiche unter Kontrolle des induzierbaren Promotors stehen; – wodurch nach der Aktivierung des induzierbaren Promotors der zweiten genetischen Einheit und der Infektion der Zellen mit den helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren die erste genetische Einheit und die zweite genetische Einheit die Produktion der helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren in den Zellen in Abwesenheit von Helfervirus ermöglichen.
  2. Zellen nach Anspruch 1, wobei die erste genetische Einheit in der Genom der Zellen integriert ist und an beiden Enden invertierte terminale Repeats in einer Kopf-zu-Schwanz-Konfiguration aufweist.
  3. Zellen nach Anspruch 1, wobei die erste genetische Einheit in einer episomalen Einheit eingeschlossen ist, die ein Element umfasst, welches die Replikation der episomalen Einheit in einer geringen Kopienzahl ermöglicht.
  4. Zellen nach Anspruch 3, wobei das Element, welches die Replikation der episomalen Einheit erlaubt, der Replikationsursprung eines Virus ist.
  5. Zellen nach Anspruch 4, wobei in der episomalen Einheit ferner das Gen, welches für einen Aktivierungsfaktor des Replikationsursprungs codiert, eingeschlossen ist.
  6. Zellen nach Anspruch 4, wobei das Gen, welches für einen Aktivierungsfaktor des Replikationsursprungs codiert, in das Genom integriert ist.
  7. Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Virus das Epstein-Barr-Virus ist, der Replikationsursprung OriP ist und der Aktivierungsfaktor EBNA-1 ist.
  8. Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Verpackungssignal des defekten Adenovirus-Genoms der ersten genetischen Einheit durch vollständige oder teilweise Deletion inaktiviert ist.
  9. Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die nicht-strukturellen Bereiche des defekten Adenovirus-Genoms der ersten genetischen Einheit durch vollständige oder teilweise Deletion inaktiviert sind.
  10. Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die inaktivierten Bereiche der ersten genetischen Einheit aus der Gruppe, die aus E1, E2A, E2B und E4 besteht, ausgewählt sind.
  11. Zellen nach Anspruch 10, wobei die Bereiche E1 und E4 sind.
  12. Zellen nach Anspruch 10, wobei die Bereiche E1, E4 und E2A sind.
  13. Zellen nach Anspruch 10, wobei die Bereiche E1, E4 und E2B-Polymerase sind.
  14. Zellen nach Anspruch 10, wobei die Bereiche E1, E4 und präterminales E2B-Protein (PTP) sind.
  15. Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die viralen Bereiche der ersten genetischen Einheit funktionsfähig mit mindestens mit einem regulatorischen Element verknüpft sind, welches die strenge Kontrolle der Expression dieser Bereiche ermöglicht.
  16. Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Promotor auf der zweiten genetischen Einheit der Tetracyclin-Operator ist.
  17. Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die viralen Bereiche in der zweiten genetischen Einheit funktionsfähig mit Elementen verknüpft sind, welche die Expression dieser Bereiche regulieren.
  18. Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das defekte Adenovirus-Genom der ersten Einheit vollständig oder teilweise aus dem Genom eines humanen Adenovirus besteht.
  19. Zellen nach Anspruch 18, wobei das defekte Adenovirus-Genom der ersten genetischen Einheit vollständig oder teilweise aus dem Genom von mindestens einem der humanen Adenoviren Ad2 und Ad5 besteht.
  20. Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die viralen Bereiche der zweiten genetischen Einheit vollständig oder teilweise aus viralen Bereichen eines humanen Adenovirus bestehen.
  21. Zellen nach Anspruch 20, wobei die viralen Bereiche der zweiten genetischen Einheit vollständig oder teilweise aus viralen Bereichen von mindestens einem der humanen Adenoviren Ad2 und Ad5 bestehen.
  22. Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Zellen Säugerzellen sind.
  23. Zellen nach Anspruch 22, wobei die Säugerzellen humane Zellen sind.
  24. Zusammensetzung, umfassend die Zelle nach Anspruch 1 und ein Vehikel oder einen Träger, wobei die Zusammensetzung frei von Helferviren ist.
  25. Verfahren zur Produktion von helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren, umfassend: (a) Kultivierung von Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 23; (b) Einführung von genomischer DNA der helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren in die Zellen; und (c) Aktivierung des mindestens einen induzierbaren Promotors der zweiten genetischen Einheit.
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