-
Fachgebiet
-
Diese
Erfindung betrifft die Gentherapie und genauer gesagt stabile Zelllinien,
die zum Verpacken von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus-Typ
2-(AAV)-Vektoren ohne Erzeugung von Wildtyp-AAV nützlich sind.
-
Hintergrund
-
AAV-Vektoren
zählen
zu einer kleinen Zahl von rekombinanten Virus-Vektorsystemen, die
sich als in vivo-Gentransfervehikel als nützlich erwiesen haben (im Überblick
wiedergegeben bei Carter, 1992 Current Opinion in Biotechnology,
3: 533–539;
Muzcyzka, 1992, Curr. Top, Mikrobiol. Immunol. 158: 97–129) und
daher potenziell von großer
Bedeutung für
die Humangentherapie sind; AAV-Vektoren sind zu einer stabilen DNA-Integration und -Expression
in hoher Häufigkeit
in einer Vielzahl von Zellen fähig,
einschließlich
Bronchial- und Nasalepithelzellen einer zystischen Fibrose (CF)(Flotte
et al., 1992a, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7: 349–356; Egan
et al., 1992, Nature, 358: 581–584;
Flotte et al., 1993a, J. Biol. Chem. 268: 3781–3790; Flotte et al., 1993b,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, in Druck), humaner Knochenmark-abstammender
Erythroleukämiezellen (Walsh
et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7257–7261) und
verschiedener weiterer Zellen. AAV erfordern nicht unbedingt eine
aktive Zellteilung für
die stabile Expression, was ein eindeutiger Vorteil gegenüber Retroviren
wäre, insbesondere
in einem Gewebe wie dem humanen Luftwegsepithel, wo die meisten
Zellen abschließend
differenziert und sich nicht mehr teilend sind.
-
Bei
AAV handelt es sich um einen defekten Parvovirus, der lediglich
in Zellen wächst,
in denen bestimmte Funktionen durch ein koinfizierendes Helfer-Virus übernommen
werden. Allgemeine Überblicke über AAV
sind zu finden bei Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Bd. I,
S. 169–228,
Berns, 1990, Virology, S. 1743–1764,
Raven Press, New York). Beispiele für koinfizierende Viren, die
Helferfunktionen für
AAV-Wachstum und -Replikation übernehmen,
sind Adenoviren, Herpesviren und in einigen Fällen Pockenviren wie Vaccinia.
Die Beschaffenheit der Helferfunktion ist nicht bekannt, doch scheint
irgendeine indirekte Wirkung des Helfervirus zu sein, die die Zelle
empfänglich
für die
AAV-Replikation macht. Dieses Konzept wird durch die Beobachtung
gestützt,
dass in bestimmten Fällen
die AAV-Replikation bei einem niedrigen Grad von Effizienz in Abwesenheit
der Helfervirus-Coinfektion erfolgen kann, wenn die Zellen mit Agenzien
behandelt werden, die entweder genotoxisch sind oder den Zellzyklus
unterbrechen.
-
AAV
zeigt einen sehr breiten Wirtsbereich ohne erkennbare Spezies- noch
Gewebespezifität
und wird in nahezu jeder Zelllinie von humanem, Affen- oder Nager-Ursprung
replizieren, vorausgesetzt, ein entsprechender Helfer ist vorhanden.
AAV ist allgegenwärtig
und wurde aus einer breiten Vielfalt von Tierspezies isoliert, einschließlich der
meisten Säuger-
und mehrerer Vogel-Spezies.
-
AAV
ist nicht als Verursacher irgendeiner Krankheit identifiziert worden.
AAV ist kein transformierender oder onkogener Virus. Die AAV-Integration
in Chromosomen von humanen Zelllinien bewirkt keine signifikante Veränderung
bei den Wachstumseigenschaften oder morphologischen Charakteristika
der Zellen. Diese Eigenschaften des AAV empfehlen es auch als einen
potenziell nützlichen
Humangentherapie-Vektor, da die meisten der anderen für diese
Anmeldung vorgeschlagenen viralen Systeme, wie etwa Retroviren,
Adenoviren, Herpesviren oder Pockenviren, krankheitserregende Viren
sind.
-
Das
AAV-Genom besitzt eine Kopie des 145 Nukleotide langen ITR (inverted
terminal repeat) an jedem Ende und eine einzelne Sequenzregion von
etwa 4470 Nukleotiden Länge
(Srivastava et al., 1993, J. Virol., 45: 555–564), die zwei hauptsächliche
offene Leseraster für
die rep- und cap-Gene enthält
(Hermonat et al., J. Virol., 51: 329–339; Tratschin et al., 1984a,
J. Virol., 51: 611–619).
Die einzelne Region enthält
drei Transkriptions-Promotoren p5, p19 und p40 (Laughlin
et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76: 5567–5571),
die zum Exprimieren der rep- und cap-Gene dienen. Die ITR-Sequenzen
sind in cis erforderlich und reichen aus, um einen funktionellen
Replikationsursprung (ori) bereitzustellen, und reichen ebenfalls
aus, um die Signale zu liefern, die für die Integration in das Zellgenom
als auch für
eine effiziente Exzision und Sicherstellung aus Wirtszell-Chromosomen
oder aus rekombinanten Plasmiden erforderlich sind. Außerdem ist
gezeigt worden, dass das ITR direkt als ein Transkriptionspromotor
in einem AAV-Vektor fungieren kann (Flotte et al., 1993, vide supra).
-
Die
rep- und cap-Gene sind in trans erforderlich, um Funktionen für die Replikation
bzw. Encapsidierung des viralen Genoms zu erfüllen. Das rep-Gen wird von
zwei Promotoren, p5 und p19,
exprimiert. Die Transkription von p5 ergibt
eine ungespleißte
4,2 kb-mRNA, welche ein Protein, Rep78, codiert, und eine gespleißte 3,9
kb-mRNA, welche ein Protein, Rep68, codiert. Die Transkription von
p19 ergibt eine ungespleißte mRNA, welche
Rep52 codiert, und eine gespleißtee
3,3 kb-mRNA, welche Rep40 codiert. So umfassen die vier Rep-Proteine
alte eine gemeinsame interne Regionsequenz, doch weichen bezüglich ihrer
Amino- und Carboxyl-terminalen Regionen ab. Lediglich Rep78 und
Rp68 sind für
die AAV-Duplex-DNA-Replikation erforderlich, doch scheinen Rep52
und Rep40 für
einzelsträngige
Progeny-DNA-Anhäufung
erforderlich zu sein. Mutationen in Rep78 und Rep68 sind phänotypisch
Rep-, wohingegen Mutationen, die lediglich Rep52 und Rep40 betreffen,
Rep+, doch Ssd– sind.
Rep68 und Rep78 binden spezifisch an die Haarnadel-Konformation
des AAV-ITR und besitzen mehrere Enzymaktivitäten, die zum Auflösen der
Replikation an den AAV-Termini
erforderlich sind. Rep52 und Rep40 weisen keine dieser Eigenschaften
auf.
-
Die
Rep-Proteine, primär
Rep78 und Rep68, zeigen verschiedene pleiotrope regulatorische Aktivitäten, einschließlich der
positiven und negativen Regulation der AAV-Gene und Expression einiger
heterologer Promotoren, als auch inhibitorische Wirkungen auf das
Zellwachstum (Tratschin et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 2884–2894; Labow
et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7: 1320–1325; Khleif et al., Virology,
181: 738–741).
Der AAV-p5-Promotor wird durch Rep78 oder Rep68
negativ autoreguliert (Tratschin et al., 1986, Mol. Cell. Biol.
6: 2884–2894).
-
Die
allgemeinen Prinzipien der AAV-Vektorkonstruktion wurden definiert,
wie kürzlich
im Überblick
angegeben (Carter, 1992, Current Opinion in Biotechnology, 3: 533–539; Muzyczka,
1992, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97–129). AAV-Vektoren werden in
AAV-rekombinanten Plasmiden durch Ersetzen von Teilen der AAV-Codierungssequenz
durch Fremd-DNA zur Erzeugung eines Vektorplasmids konstruiert.
Im Vektorplasmid müssen
die terminalen (ITR) Abschnitte der AAV-Sequenz intakt verbleiben, da diese
Regionen in cis für
verschiedene Funktionen erforderlich sind, einschließlich der
Exzision aus dem Plasmid nach der Transfektion, der Replikation
des Vektorgenoms und der Integration und Sicherstellung aus dem Wirtszellgenom.
Der Vektor kann in einem AAV-Partikel verpackt werden, um ein AAV-transduzierendes
Virus durch Transfizieren des Vektorplasmids in Zellen zu erzeugen,
die durch ein geeignetes Helfervirus, z. B. ein Adenovirus oder
Herpesvirus, infiziert sind. Um eine Replikation und Encapsidierung
des Vektorgenoms in AAV-Partikel zu erzielen, muss das Vektorplasmid
für jegliche
in trans erforderlichen AAV-Funktionen, nämlich rep und cap, die bei
der Konstruktion des Vektorplasmids deletiert wurden, komplementiert
werden.
-
Wie
erörtert,
weisen AAV-Vektoren einen potenziellen Nutzen für die Behandlung von Humankrankheiten
mittels Gentherapie auf. Einer der einschränkenden Faktoren für die AAV-Gentherapie
war bisher die relative Ineffizienz der Vektor-Verpackungssysteme,
die eingesetzt wurden. Aufgrund des Fehlens von Zelllinien, die
die AAV-transkomplementierenden-Funktionen exprimieren, wie rep
und cap, wurde das Verpacken von AAV-Vektoren in Adenovirus-infizierten
Zellen durch Kotransfektion eines Verpackungsplasmids und eines Vektorplasmids
erreicht. Die Wirksamkeit dieses Vorgangs mag aber durch die Effizienz
der Transfektion jedes der Plasmidkonstrukte und durch den Grad
der Expression von Rep-Proteinen aus den bis heute beschriebenen
Verpackungsplasmiden begrenzt sein. Jedes dieser Probleme scheint
zu den biologischen Aktivitäten
der AAV-Rep-Proteine in Bezug zu stehen. Außerdem, und wie oben angemerkt,
weisen alle der oben beschriebenen Verpackungssysteme die Fähigkeit
zum Erzeugen von Wildtyp-AAV durch Rekombination auf.
-
Das
Fehlen von Zelllinien, die das funktionelle Rep stabil exprimieren,
spiegelt offensichtlich eine zytotoxische oder zytostatische Funktion
des Rep wider, wie durch die Inhibierung durch Rep der neo-resistenten Koloniebildung
gezeigt (Labow et al., 1987; Trempe et al., 1991). Dies scheint
auch mit der Neigung von Rep in Bezug zu stehen, den immortalisierten
Phänotyp
in kultivierten Zellen umzukehren, was die Produktion von Zelllinien,
die funktionelles Rep stabil exprimieren, extrem schwierig gemacht
hat. Mehrere Versuche, Zelllinien zu erzeugen, die Rep exprimieren,
wurden unternommen.
-
Mendelson
et al., (1988, Virology, 166: 154–165) berichteten vom Erhalt
eines sehr geringen Expressionsgrades bestimmter AAV-Rep-Proteine
nach stabiler Transfektion von HeLa- oder 293-Zellen mit Plasmiden,
die ein AAV-rep-Gen enthalten, doch war die Menge für die Vektorerzeugung
ungenügend.
Winocour et al., (1992, Virolo 190: 316–329) berichteten von der Erzielung
der Expression von AAV-Rep52 nach stabiler Transfektion von Chinesischen
Hamsterembryo-(OD4)-Zellen und verwendeten die transfizierten Zellen,
um die Wirkung der stabilen Integration des AAV-rep-Gens auf zelluläre Prozesse
in Zusammenhang mit der DNA-Reparatur und Genamplifikation zu untersuchen.
Vincent et al., (1990, Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, S. 353–359)
versuchten, Zelllinien zu erzeugen, die die AAV-rep- und cap-Gene,
exprimiert von den normalen AAV-Promotoren, enthalten, doch waren
diese Versuche nicht erfolgreich, da entweder die Vektoren mit einem
100-fachen Überschuss
an Wildtyp-AAV-Partikeln
kontaminiert waren oder da die Vektoren bei lediglich sehr geringen
Titern von weniger als 4 × 103 erzeugt wurden. Bei einem alternativen
Ansatz konstruierten Lebkowski et al., (US-Patent Nr. 5.173.414,
veröffentlicht
am 22. Dezember 1992) Zelllinien, die AAV-Vektoren in einem episomalen
Plasmid enthielten. Diese Zelllinien konnten dann mit Adenovirus
infiziert und mit den trans-komplementierenden AAV-Funktionen rep
und cap transfiziert werden, um Präparate des AAV-Vektors zu erzeugen.
Es wird behauptet, dass dies den Erhalt hoher Titer an AAV-Ausgangsvektoren
ermöglicht.
In den gezeigten Beispielen besteht allerdings die einzige Information
bezüglich
des Titers darin, dass eine humane Zelllinie, K562, bei Leistungen
von lediglich 1% oder weniger transduziert werden konnte, was keine
hohe Titerproduktion irgendeines AAV-Vektors anzeigt. In diesem
System wird der Vektor als ein Episomal (unintegriertes Konstrukt)
getragen, und es wird behauptet, dass integrierte Kopien des Vektors
nicht bevorzugt sind.
-
Der
von Lebowski et al, 1992, beschriebene Ansatz zum Verpacken von
AAVE-Vektoren weist mehrere unerwünschte Aspekte auf. Zunächst ist
es nicht erwünscht,
den Vektor als ein unintegriertes, episomales Plasmid in hoher Kopienzahl
in einer Zelllinie zu behalten, da die Kopienzahl pro Zelle nicht
rigoros kontrollbar ist, und die Wahrscheinlichkeit, dass episomale
DNA eine Neuanordnung vollzieht, was zur Produktion defekter Vektoren
führt,
viel höher
ist. Zweitens muss bei diesem System nach wie vor der Vektor durch
Infizieren der Zelllinie mit Adenovirus und Einführen eines Plasmids, das die
AAV-rep- und cap-Gene enthält,
verpackt werden. Das von Lebowksi et al., 1992, verwendete Plasmid
war ebenfalls pBaI, welches, wie oben angemerkt, eine überlappende
Homologie mit den Vektor-ITR-Sequenzen aufweist und zur Erzeugung
von Wildtyp-AAV führt.
Drittens wird beim von Lebowski et al. 1988, 1992, verwendeten pBaI-Verpackungsplasmid
das rep-Gen abseits seines homologen p5-Promotors
exprimiert und ist daher negativ autoreguliert und deshalb die rep-Expression
wahrscheinlich begrenzt.
-
Das
Problem der suboptimalen Mengen der rep-Expression nach der Plasmid-Transfektion
kann in Bezug zu einer anderen biologischen Aktivität dieser
Proteine stehen. Es gibt Beweise (Tratschin, et al., 1986, Mol.
Cell. Biol. 6: 2884–2894),
dass AAV-Rep-Proteine
ihre eigene Expression vom AAV-p5-Promotor,
der in allen bisher beschriebenen Verpackungskonstrukten, wie pAAV/Ad,
verwendet wurde, herunterregulieren (Samulski et al., 1989) oder
pBaI (Lebowski et al., 1988, 1992).
-
Die
vorliegende Erfindung stellt stabile Zelllinien bereit, die relativ
hohe Mengen an Rep78 einbringen können und zum Verpacken von
AAV-Vektoren ohne Erzeugung von Wildtyp-AAV nützlich sind.
-
Beschreibung der Erfindung
-
Ein
Aspekt der Erfindung ist eine stabile Säugerzelllinie, die ein Adeno-assoziiertes
Virus-(AAV)-rep-Gen in funktionsfähiger Bindung an einen induzierbaren
heterologen Promotor besitzt, welche Zelllinie zum Erzeugen eines
funktionellen Rep-Proteins fähig
ist.
-
Ein
anderer Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zum Verpacken
eines rekombinanten AAV-Vektors ohne Erzeugung von Wildtyp-AAV,
welches das Kultivieren einer Zelllinie der Erfindung unter Bedingungen
umfasst, welche die Expression der rep- und cap-Gene erlauben, wobei
die Zelllinie mit einem Helfer-Virus infiziert ist und der rekombinante
AAV-Vektor in die Zelllinie eingeführt wurde, welchem AAV-Vektor eine überlappende
Homologie mit AAV-Sequenzen in der Zelle fehlt und der entweder
ein funktionelles AAV-Capsid-Gen aufweist oder mit einem zweiten
Vektor mit einem funktionellen AAV-Capsid-Gen komplementiert ist,
wodurch der rekombinante AAV-Vektor
verpackt wird.
-
Noch
ein anderer Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zum
Erzeugen einer stabilen Zelllinie der Erfindung, welches umfasst:
- (a) Auswählen
einer Zelle, die das Rep-Protein aus den Zellen einer Säuger-Zelllinie,
die mit AAV infizierbar ist, stabil produziert, wobei die Zelllinie
mit einem AAV-Vektor transfiziert wurde, bei dem das AAV-rep-Gen funktionsfähig an einen
induzierbaren heterologen Promotor gebunden ist und wobei die transfizierten
Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, die die Expression des
Gens erlauben; und
- (b) Züchten
der Zelle zur Erzeugung der Zelllinie.
-
Ebenfalls
wird durch die Erfindung ein Verfahren zum Infizieren einer Zelllinie
mit einem rekombinanten AAV-Partikel bereitgestellt, welches Verfahren
umfasst:
- (a) Infizieren einer Zelllinie gemäß der Erfindung,
wobei die Zelllinie mit einem Helfer-Virus infiziert ist, mit dem rekombinanten
AAV-Partikel, welcher Partikel einen Vektor enthält, der entweder ein funktionelles AAV-Capsid-Gen
aufweist oder mit einem zweiten Vektor mit einem funktionellen AAV-Capsid-Gen
komplementiert ist; und
- (b) Kultivieren der infizierten Zellen unter Bedingungen, welche
die Expression der AAV-rep- und -Capsid-Gene erlauben.
-
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
-
1 zeigt
eine Darstellung des pMtrep-Plasmids.
-
2 zeigt
eine Halbtonreproduktion der Western-Blot-Analyse der Rep-Proteine
aus verschiedenen Neomycin-resistenten Klonen, wie kultiviert in
Abwesenheit (–)
oder Gegenwart (+) einer Schwermetall-Induktion, oder von 293-Zellen,
transfiziert mit pAW2 von pMtrep. Bahn E. coli enthält Rep-Protein
aus einem prokaryontischen Expressionsvektor.
-
3 zeigt
eine Halbtonreproduktion eines AAV-terminal repeat-Bindungsassays
unter Verwendung von Rep78, wie von Neo6-Zellen produziert. Die
DNA-bindende Reaktion enthielt keinen Extrakt (Bahn frei) oder 1 μl eines Kernextrakts
von pCDM8-, (Bahn pCDM8) oder pCDMrep- (Bahn pCDMrep) transfizierten 293-Zellen,
oder von induzierten (+) oder nicht-induzierten (–) Neo5-
oder Neo6-Zellen.
-
4 zeigt
eine Halbtonreproduktion der Southern-Hybridisationsanalyse eines
Verpackungsassays für
ein rep-Gen-mutiertes AAV-Genom in Gegenwart (+) oder Abwesenheit
(–) von
Induktion.
-
5 zeigt
eine Halbtonphotographie von Platten des koloniebildenden Wirksamkeits-(CFE)-Assays.
-
6 zeigt
einen Graphen, der die Ergebnisse des MTT-Wachstumsassays darstellt.
Die Zellwachstums-Kurven in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) einer
Schwermetall-Induktion
wurden aus vier Experimenten hergeleitet. Die Ergebnisse sind als
optische Dichten (O. D.) gegenüber
Zeit nach Ausplattierung (Tage) ausgedrückt.
-
Ausführungsformen der Erfindung
-
Bei
der Ausführung
der vorliegenden Erfindung werden, sofern nicht anders angegeben,
herkömmliche
Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, der rekombinanten
DNA und Immunologie angewendet, die alle innerhalb der Kenntnisse
eines Fachmanns des Gebiets liegen. Diese Techniken sind in der
Literatur umfassend erklärt.
Siehe z. B. Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Zweite Auflage (1989), Oligonucleotide Synthesis
(M. J. Gait, Hrg., 1984), Animal Cell Culture (R. I. Freshney, Hrg., 1987),
die Reihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer
Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller und M. P. Calos Hrg. 1987),
Handbook of Experimental Immunooogy, (D. M. Weir und C. C. Blackwell,
Hrg.), Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, R.
Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Siedman, J. A. Smith und
K. Struhl, Hrg., 1987) und Current Protocols in Immunology (J. E.
Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach und W.
Strober, Hrg., 1991). Alle hierin, sowohl supra als auch infra, erwähnten Patente,
Patentanmeldungen und Veröffentlichungen
sind hierin als Verweise aufgenommen.
-
Die
Zelllinien der Erfindung können
von jeglicher Säuger-Mutterzelllinie
abgeleitet sein, die für
eine AAV-Infektion anfällig
ist. Wie zuvor angegeben, weist AAV einen sehr breiten Wirtsbereich
auf und ist aus einer Vielzahl von Säuger-Zelltypen isoliert worden,
einschließlich
Affen-, Menschen- und Nagerzellen. Für die Gentherapie werden humane
Zelllinien, in denen geeignete Helferfunktionen exprimiert werden
können,
verwendet. Beispiele solcher humaner Zelllinien, von denen die Zelllinien
der Erfindung abgeleitet sein können, sind
293, HeLa, A549, KB, Detroit und WI38. 293-Zellen sind besonders
bevorzugt.
-
Die
Zelllinien der Erfindung werden durch Transfizieren der Mutterzelllinie
mit einem Plasmid, das das AAV-rep-Gen in funktionsfähiger Bindung
an einen heterologen Promotor oder einen AAV-Rep78-unempfindlichen
Promotor enthält,
Kultivieren der transfizierten Zellen in einem ausgewählten Medium,
Kultivieren der überlebenden
Zellen unter Bedingungen, die die Expression des AAV-rep-Gens fördern, Auswählen der
Zellen, die Rep78 produzieren, und Kultivieren der Rep78-produzierenden
Zellen erzeugt.
-
Das
Plasmid, das das rep-Gen enthält,
welches zum Transfizieren der Mutterzellen verwendet wird, sollte
zum stabilen Integrieren in die Zelle fähig sein und nicht durch Infektion
der transfizierten Zellen mit einem Helfervirus befreit werden.
Es enthält
das AAV-rep-Gen in funktionsfähiger
Bindung an einen heterologen Transkriptions-Promotor. Der Promotor kann homolog
sein, muss aber Rep78-unempfindlich sein zumindest in dem Ausmaß, dass
er durch das exprimierte Rep78-Protein nicht vollständig herunterreguliert
wird. Annehmbare Promotoren können
durch die rep-Gen-Expression
etwas, doch nicht stark herunterreguliert werden. Der Promotor kann
ein induzierbarer Promotor oder ein konstitutiver Promotor sein.
Beispiele der induzierbaren Promotoren umfassen die folgenden: Schwermetallionen-induzierbare
Promotoren, wie etwa der Metallothionein-Promotor; Steroidhormon-induzierbare
Promotoren, wie etwa der MMTV-Promotor, oder der Wachstumshormon-Promotor;
Promotoren, die durch das Helfer-Virus induzierbar wären, wie
etwa der Adenovirus-Early-Gen-Promotor,
der durch Adenovirus-EIA-Protein induzierbar ist, oder der Adenovirus-Major-Late-Promotor;
Herpesvirus-Promotor, der durch Herpesvirus-Proteine wie VP16 oder ICP4 induzierbar
ist; Vaccinia- oder Pockenvirus-induzierbare Promotoren oder Promotoren,
die durch eine Pockenvirus-RNA-Polymerase induzierbar sind; bakterieller
Promotor, wie etwa der des T7-Phagen, welcher durch eine Pockenvirus-RNA-Polymerase
induzierbar wäre;
oder ein bakterieller Promotor, wie etwa der von T7-RNA-Polymerase. Der
Promotor ist vorzugsweise ein muriner Metallothionein-I-Genpromotor.
Bevorzugter besteht der Promotor aus einem Fragment des murinen
Metallothionein-I-Gens von etwa –650 by von der Transkriptionsstartstelle des
Gens bis 69 by stromabwärts
der Stelle. Starke konstitutive Promotoren, die für die Verwendung
als dem heterologen Promotor für
die rep-Expression geeignet sind, umfassen den Adenovirus-Major-Late-Promotor, den
Zytomegalovirus-Immediate-Early-Promotor
des β-Actin-Promotors
oder des β-Globin-Promotors.
Durch RNA-Polymerase
III aktivierte Promotoren könnten
ebenfalls verwendet werden.
-
In
den infra gezeigten Beispielen wurden die Mutterzellen mit einem
neo-Gen-enthaltenden
Vektor kotransfiziert und die anfängliche Auswahl durch Kultivieren
in einem Geneticin-haltigen Medium vorgenommen. Es ist natürlich offensichtlich,
dass andere selektive Marker verwendet werden können. Nach der anfänglichen Selektion
werden überlebende
Zellen isoliert, unter Bedingungen kultiviert, die die Expression
des rep-Gens zulassen (z. B. im Falle von induzierbaren Promotoren,
einschließlich
eines Induktionsmittels im Kulturmedium), abgeerntet und auf die
Rep78-Produktion untersucht. Western-Blotting und andere geeignete
Assays können
angewendet werden. Rep78-produzierende Klone werden expandiert,
um die Zelllinien der Erfindung zu erzeugen (der Begriff "Zelllinie" soll die Nachkommenschaft
(Subklone) einer ursprünglichen
Linie umfassen). Die Stabilität
wird durch die Fähigkeit
zum Erzeugen von Rep78 über
zumindest etwa 12 Monate und mehr als etwa 50 Passagen bestätigt. Die
Menge der Rep78-Proteinproduktion durch die Zellen reicht aus, um die
Verwendung der Zellen zum Verpacken von rekombinanten AAV-Vektoren
zu erlauben. Im Anschluss an das Verfahren der Erfindung wurden
verpackte Vektoren im Überstand
bei Titern im Bereich von 2,8 × 107 bis 1,4 × 108 viralen
Partikeln pro Milliliter gemessen. Diese Überstandstiter lassen sich
sehr wohl mit dem Stand der Technik vergleichen, obwohl im Stand
der Technik allgemein die Mengen nach Konzentrationsverfahren berichtet
wurden.
-
Die
Verpackungszelllinien der Erfindung werden zum Verpacken von rekombinanten
AAV-Vektoren wie folgt verwendet.
-
Der
rekombinante AAV-Vektor setzt sich aus den AAV-ITR-Regionen und
einem Transkriptionspromotor in funktionsfähiger Bindung an ein Ziel-Polynukleotid
zusammen. Der Transkriptionspromotor, der an das Zielpolynukleotid
gebunden ist, ermöglicht
die Bildung von Transkripten und enthält beispielsweise Nicht-AAV-Promotoren
als auch AAV-Promotoren wie p5, p19, p40 und AAV-ITR-Promotoren.
Die Transkriptions- und/oder
Translationsprodukte des Ziel-Polynukleotids sind von Nutzen, insbesondere
in der Gentherapie. Daher enthalten die Ziel-Polynukleotide für die Gentherapie
zu liefernde Gene, z. B. solche, die für Subeinheitenketten von Hämoglobin,
Enzymen, Proteinen, z. B. dem Zystische-Fibrose-Transmembran-Conductance-Regulator
(CFTR), und ähnliches
codieren. Ziel-Polynukleotide können
auch Polynukleotide sein, die, wenn transkribiert, eine Aktivität als Antisense-Moleküle, als
Decoys, die an Transkriptions- oder Translationsfaktoren binden,
als Ribozyme und ähnliches
aufweisen. Ziel-Polynukleotide
umfassen auch Gene, die Immunantwort-Modulatoren wie Zytokine und
Haupthistokompatibilitätsgene
codieren. Eine andere Klasse von Polynukleotiden, die für die Gentherapie
verwendet werden kann, sind Gene, die die Empfängerzelle empfänglich für spezifische
Wirkstoffe machen, wie etwa das Herpesvirus-Thymidinkinase-Gen und
die Methotrexat-resistenten, mutanen Dihyrofolatreduktase-Gene.
Ein anderes Ziel-Polynukleotid ist die Wildtyp-p53-Tumorsuppressor-cDNA
für die
Ersatztherapie des fehlenden oder beschädigten p53-Gens, welches mit
Lungen-, Brust- und anderen Arten von Krebs verbunden ist.
-
Die
Zellen werden mit einem Helfer-Virus wie Adenovirus oder Herpesvirus
infiziert und dann mit dem Vektor transfiziert. Andere Methoden
zur Einführung
des Vektors, z. B. die Elektroporation, können angewendet werden. Die
komplementierende AAV-Capsid-Funktion
wird durch Kotransfizieren der Zellen mit einem Vektor bereitgestellt,
der zum Exprimieren des AAV-cap-Gens fähig ist. Der komplementierende
Vektor kann das cap-Gen von entweder einem homologen AAV-Promotor,
wie etwa dem p40-Promotor, oder einem heterologen
Promotor exprimieren. Alternativ kann das AAV-cap-Gen in den Primärvektor
aufgenommen werden, wodurch das Erfordernis eines komplementierenden
Vektors wegfällt.
Um die Entwicklung von Wildtyp-AAV zu verhindern, darf der transfizierende
AAV-Vektor keine überlappende
Homologie mit AAV-Sequenzen, die bereits in den mit dem Helfervirus
infizierten Zellen vorhanden sind, aufweisen.
-
Nach
der Transfektion werden die Zellen unter Bedingungen kultiviert,
welche die Expression der rep- und cap-Gene und die Replikation
von AAV zulassen. Ist das rep-Gen
funktionsfähig
an einen induzierbaren Promotor gebunden, so wird ein geeignetes
Induktionsmittel in das Medium aufgenommen. Die Zellen werden typischerweise
2–5 Tage
lang gezüchtet,
dann Lysate präpariert
und die rekombinanten AAV-Vektorpartikel mittels im Fachgebiet bekannter
Techniken gereinigt.
-
Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter. Sie sollen
die Erfindung in keinster Weise einschränken.
-
Die
unten beschriebene neo6-Zelllinie wurde am 9. November 1993 bei
der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr.,
Rockville, Maryland 20852, hinterlegt und ihr die Zugriffsnummer
CRL 11484 zugeteilt. Die Hinterlegung wurde unter dem Wortlaut des
Budapest Treaty vorgenommen. Bei Genehmigung und Erteilung dieser
Anmeldung als einem Patent der Vereinigten Staaten von Amerika wird
jegliche Einschränkung
bezüglich
der Verfügbarkeit
der Hinterlegung unwiderruflich aufgehoben; der Zugang zu den bezeichneten
Hinterlegungen wird während
der Schwebe der oben genannten Anmeldung einer Person offen stehen,
die vom unter 37 CFR § 1.14
und 35 USC § 1.22
ernannten Bevollmächtigen
dazu ermächtigt
wurde. Darüber
hinaus wird die bezeichnete Hinterlegung aufrechterhalten für einen
Zeitraum von dreißig
(30) Jahren vom Datum der Hinterlegung an, oder von fünf (5) Jahren
nach dem letzten Ersuchen um Hinterlegung; oder für die durchsetzbare
Dauer des US-Patents,
was immer länger
ist. Die oben erwähnten
hinterlegten Materialien sollen lediglich der Zweckmäßigkeit
dienen und sind zur Ausführung
der vorliegenden Erfindung unter Berücksichtigung der hierin wiedergegebenen
Beschreibungen nicht erforderlich; darüber hinaus sind diese Materialien
hierin durch Verweis mitaufgenommen.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
-
Herstellung der Plasmide
-
Für die Plasmidkonstruktion,
das Wachstum und die Reinigung wurden standardmäßige Verfahrensweisen befolgt
(Ausubel et al., (Hrg.) 1987. Current Protocols in Molecular Biology.
Greene Publishing Associates, Brooklyn, N.Y.). Adenovirus-Typ 2
wurde bei einer Multiplizität
der Infektion (MOI) von 5 verwendet. Plasmid pMtrep (1)
enthält
das Wildtyp-rep-Gen von Desoxyribonukleotid 263 bis 2233 des AAV- Genoms in funktionsfähiger Bindung
an ein 1,9 kbp DNA-Fragment vom Mäuse-Metallothionein-I-Gen, das einen Schwermetall-induzierbaren
Transkriptionspromotor enthält
(Hamer und Walling. 1982. J. Mol. Appl. Genet. 1: 273–288.; Yang
et al. 1992. J. Virol. 66: 6058–6069).
Plasmid pCDMrep enthält
dieselbe rep-Gensequenz, inseriert in den pCDM8-Vektor (Invitrogen
Corp.)(Yang und Trempe. 1993. J. Virol. 67: 4442–4447).
-
Plasmid
pΔMtrep
wurde konstruiert, indem ein teilweiser KpnI-Verdau von pMtrep vorgenommen
und ein 2725 bp-Fragment isoliert wurde, das den Mäuse-Metallothionein-I-Promotor von der
KpnI-Stelle bei –650 by
von der Transkriptionsstartstelle bis 69 bp stromabwärts der
Startstelle, etwa 18 bp der pGEM3Z-Polylinkersequenz (von der HindIII
bis zur XhoI-Stelle), die AAV-rep-Gensequenzen, die im AvaI-Restriktionsendonuklease-Fragment
von 263–2233
im AAV-Genom enthalten sind, und etwa 21 bp der pGEM3Z-Polylinkersequenz
(von der XhoI- bis zur KpnI-Stelle) enthielt. Das 2725 bp KpnI-Fragment
wurde in die KpnI-Stelle des Plasmids pAW1 zur Schaffung von pΔMtrep inseriert.
Plasmid pAW1 wurde durch Inserieren eines 336 bp KpnI bis SnaBI-Fragments geschaffen,
das das AAV-Polyadenylierungssignal von pAV2 enthielt, in die EcoRI
bis KpnI-Stelle von pGEM3Z, nachdem die EcoRI-Stelle zu einem stumpfen
Ende mit dem Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I verwandelt
worden war. So enthält
pΔMtrep
69 bp der Leadersequenz der Mäuse-Metallothionein-mRNA
und die unmittelbar stromaufwärts
gelegenen regulatorischen Elemente, die eine Schwermetall-Induktion
ermöglichen,
doch fehlen pΔMtrep
die stromaufwärts
gelegenen Enhancer-Elemente des Promotors.
-
Plasmid
pJDT279 enthält
das vollständige
AAV2-Genom, doch mit einer Frameshift-Mutation im rep-Gen an der SstI-Stelle
bei Nukleotid 814 (Tratschin et al. 1984. J. Virol. 51: 611–619). Plasmid
pSV2neo wurde zuvor beschrieben (Southern und Berg. 1982. J. Mol.
Appl. Genet. 1: 327–341).
-
Beispiel 2
-
Herstellung der induzierbaren
Zelllinien, die die Rep-Proteine exprimieren
-
Humane
293-Zellen (Graham et al. 1977. J. Gen. Virol. 36: 59–72) wurden
in Eagle's Minimum
Essential Medium (MEM), ergänzt
mit Antikörpern
und 10% fötalem
Rinder serum, gezüchtet.
Alle DNA-Transfektionen wurden an Kulturen, die 50–70% konfluent
waren, unter Anwendung der Calciumphosphat-Methode einen Tag nach
Ausplattieren der Zellen auf Kulturschalen vorgenommen (Ausubel
et al. (Hrg.) 1987. Current Protocols in Molecular Biology. Greene
Publishing Associates, Brooklyn, N.Y.).
-
Die
durch das AAV-rep-Gen vermittelte Inhibierung der Zellvermehrung
hat die Entwicklung von Zelllinien verhindert, die signifikante
Mengen an Rep-Proteinen exprimieren. Um diese antiproliferativen
Wirkungen zu umgehen, wurde das rep-Gen funktionsfähig an den
induzierbaren Mäuse-Metallothionein-I-(Mt)-Transkriptionspromotor
gebunden (Yang et al. 1992. J. Virol. 66: 6058–6069). Das bei der Konstruktion
von pΔMtrep verwendete
Mt-Promotor-Fragment enthält
64 bp des ersten Exons des Metallothionein-Gens bis –650 im
Promotor. Dieser Promotor weist eine reduzierte Grundmengen-Expression
auf, doch behält
seine Schwermetall-Induzierbarkeit bei (KARIN). PΔMtrep und
PSV2neo wurden auf 293-Zellen kotransfiziert, und Geneticin wurde
zur Auswahl jener Zellen verwendet, die das neo-Gen angenommen und
exprimiert hatten. Geneticin-resistente Klone wurden für die Produktion
von Rep-Proteinen
auf die Induktion hin gescreent. 2 × 105 humane
293-Zellen in 35-mm-Schalen
wurden mit 2 μg
von pSV2neo und 6 μg
von pΔMtrep
kotransfiziert. Induzierbare Zelllinien wurde in MEM-Medium gezüchtet, das
10% dialysiertes FBS und 1 mg/ml (600 μg/ml aktive Komponente) an Geneticin
(Sigma Chem. Co.) enthielt. Alle Zellen wurden als Monoschichtkultur
bei 37°C
in einer 5,0% CO2-Atmosphäre gehalten.
Zwei Tage später
wurden die Zellen trypsiniert, verdünnt und auf 100-mm-Schalen ausplattiert,
um ein Heranwachsen von Einzelzellklonen zu ermöglichen. Selektives Medium, das
0,6 mg/ml der aktiven Komponente Geneticin (Sigma Chemical Corp.)
in MEM enthielt, wurde 48 Stunden später auf die Zellen aufgebracht.
-
Die
Kulturen wurden in selektivem Medium 10 bis 14 Tage lang gezüchtet, woraufhin
die überlebenden Kolonien
isoliert, kultiviert und auf die Rep-Proteinexpression untersucht
wurden. Um die Rep-Proteinexpression zu induzieren, wurde das Zellkulturmedium
auf 2 μm
CdSO4 und 100 μm ZnCl2 16–24 Stunden
vor Abernten der Kulturen und Analysieren auf die Rep-Protein-Expression
eingestellt. Die Western-Blot-Analyse zum Nachweis der Rep-Expression
wurde unter Verwendung von Rep-spezifischem Antiserum vorgenommen (Trempe
et al. 1987. Virology 161: 18–28),
wie unten beschrieben. Bei einem Klon, Neo6, wurde festgestellt, dass
er signifikante Mengen an Rep78 exprimiert, wie mittels Western-Blot-Assays
unter Verwendung von Anti-Rep-Antiserum
bestimmt (2). Ein anderer Geneticin-resistenter
Klon, neo5, exprimierte keinerlei nachweisbares Rep-Protein auf
die Induktion hin. Die indirekte Immunofluoreszenz von Neo6-Zellen
ergab, dass zwischen 30–70%
der Zellen für
die Rep-Proteinexpression
positiv waren (Yang und Trempe, unveröffentlichte Daten).
-
Bei
einem Versuch, einen höheren
Prozentsatz an Rep-positiven Zellen zu erhalten, wurden Neo6-Zellen
durch Ausverdünnen
(limiting dilution) subkloniert. Das Subklonieren von Neo6 erzeugte
die Klone Neo34, Neo36, Neo39 und Neo40, die alle signifikante Mengen
an Rep78 auf die Induktion hin erzeugen (2). Obschon
Klon Neo34 auf diesem Western-Blot nicht gezeigt ist, erzeugte er
Rep78 bei einer Menge vergleichbar der von Neo6 (Yang und Trempe,
ibid.). Der Anteil der Zellen unter den Subklonen, der Rep-Proteine
exprimierte, war dem der parentalen Neo6-Zellen vergleichbar (etwa
60%), wie durch Immunofluoreszenz beurteilt, und die Anfärbung war
ebenfalls auf den Kern beschränkt
(Yang und Trempe, ibid.).
-
Proteinextraktion
und -analyse. 3 × 105 Geneticin-resistente Zellen in 35-mm-Schalen
wurden für
die Expression von Rep-Proteinen induziert. Rep-Proteine aus den
Zelllinien oder transfizierten Zellen wurden aus den Kernen in 200
mM NaCl in STM-NP-Puffer wie früher
beschrieben (Yang, ibid.) extrahiert. Die Proteinextrakte wurden
durch Natriumdodecylsulfat 12,5% Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) abgetrennt und mittels Western-Immunoblotting wie früher beschrieben
analysiert (Yang et al. 1992. J. Virol. 66: 6058–6069) oder wurden in Gel-Mobility-Shift-Assays
verwendet.
-
Gel-Mobility-Shift-Assay.
Rep78 vermittelt die AAV-DNA-Replikation durch Binden an die AAV-terminal repeat-Sequenzen,
die in einer Haarnadel-Konformation vorliegen, wobei dieses Charakteristikum
in vitro emuliert werden kann (Asktorab und Srivastave. 1989. J.
Virol. 63: 3034–3039;
Im und Muzyczka. 1989. J. Virol. 63: 3095–3104). Die folgenden Haarnadel-Bindungsassays
wurden vorgenommen, um zu bestimmen, dass Rep78 aus Neo6-Zellen
funktional ist. 5000 cpm radiomarkierte AAV-Haarnadeln wurden in
jeder Reaktion verwendet. 3 zeigt
einen AAV-Haarnadel-Bindungsassay mit Kernextrakten von Neo5-, Neo6-
und Wildtyp-rep-Gen-Plasmid-transfizierten Zellen.
-
Rep78-Protein,
erzeugt aus induzierten Neo6-Zellen, band wirksam an die radiomarkierte
Haarnadel; wohingegen keine Immobilitätsverschiebung mit Kernextrakten
von nicht-induzierten Neo6-Zellen beobachtet wurde. Dies stimmt
mit der Western-Blotting-Analyse
von Neo6-Zellen überein,
bei der kein Rep78 in Abwesenheit der Induktion nachgewiesen wurde
(2). Die verschobene Bande kann durch Zugabe einer Überschussmenge
an unmarkierter AAV-Haarnadel korrigiert werden oder durch Antikörper gegen
die Rep-Proteine supershifted werden (Yang und Trempe, unveröffentlichte
Daten).
-
Als
einer positiven Kontrolle für
diese Mobility-Shift-Assays wurden Kernextrakte aus pCDMrep-transfizierten
293-Zellen präpariert,
die bekanntermaßen
Rep78 enthalten, das wirksam an die AAV-terminal repeat-Sequenzen
bindet (Yang und Trempe. 1993. J. Virol. 67: 4442–4447).
Kernextrakte aus Plasmid pCDM8-transfizierten 293-Zellen oder Kontrollklon
Neo5 verschoben die Haarnadelstruktur nicht. Die Bindung des Rep78-Proteins
an radiomarkierte AAV-Haarnadel-DNA wurde wie früher beschrieben vorgenonmen (Yang
und Trempe, ibid.). Aus diesen Zelllinien erzeugtes Rep78 weist ähnliche
Mobilitäten
nach der Bindung wie Rep78 aus mit pMtrep transfizierten humanen
293-Zellen auf, und die gebundenen Proteine erscheinen als ein Dublett,
wie von anderen beobachtet (Im und Muzyczka. 1992. J. Virol. 66:
1119–1128).
-
Die
in diesen Zellen exprimierte vorherrschende Form des Rep-Proteins
ist Rep78. Dies kann an der Abwesenheit der Helfervirus-Infektion
liegen, welche ein effizientes AAV-mRNA-Splicing ermöglicht,
was wiederum die Rep68-Synthese beschränken würde (Trempe und Carter. 1988.
J. Virol. 62: 3356–3363).
Das Fehlen der Rep52-Expression
kann auch an der Abwesenheit der Andenovirus-Infektion liegen, von
welcher gezeigt wurde, dass sie die p19-Expression
erhöht
(Tratschin et al. 1984. Mol. Cell. Biol. 4: 2072–2081), oder dem Fehlen der
AAV-terminal repeat-Sequenzen, die ebenfalls eine stimulatorische
Wirkung auf die p19-Expression aufweisen
(Beaton et al. 1989. J. Virol. 63: 4450–4454).
-
AAV-DNA-Replikation
und Verpackungs-Assays. Zur Bestimmung der AAV-DNA-Replikation wurden 2 μg pJDT279
in die angegebenen Zelllinien in Gegenwart einer Adenovirus-Typ
2-Koinfektion (MOI = 5) transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurde
die Hirt-Überstands-DNA
präpariert
(Hirt. 1967. J. Mol. Biol. 26: 365–369). Die DNA wurde dann mit
DpnI verdaut, mittels Agarose-Gelelektrophorose aufgetrennt, auf
Nitrocellulose-Filterpapier übertragen,
an eine radiomarkierte AAV-cap-Gensonde hybridisiert und durch Autoradiographie
unter Anwendung standardmäßiger Techniken
prozessiert (Ausubel et al. (Hrg.) 1987. Current Protocols in Molecular
Biology. Greene Publishing Associates, Brooklyn, N.Y.). Die Hybridisationssonde
bestand in einem HincII-Restriktionsendonuklease-Fragment von pJDT279,
das die Sequenzen von 2397 bis 3981 des AAV-Genoms enthielt.
-
Beispiel 3
-
Verpacken von rekombinanten
AAV-Vektoren
-
Die
derzeitigen Methoden zur Erzeugung infektiöser, mutierter AAV-Partikel
wenden Kotransfektionen eines AAV-Vektorplasmids an, das die viralen
Replikationsursprünge
enthält,
und eines Plasmids, das die rep- und cap-Gene von AAV enthält. Eine
Beschränkung
dieser Methode besteht darin, dass in dem Fall, dass irgendwelche
homologen Sequenzen zwischen den kotransfizierten Plasmiden geteilt
werden, eine beträchtliche
Rekombination auftreten wird, die zur Erzeugung von Wildtyp-AAV
führt.
Daher muss Vorsicht walten, um überlappende
Homologien zwischen den beiden transfizierten Plasmiden zu vermeiden.
-
pYT45
enthält
die AAV-terminal repeat-Sequenzen, das bakterielle cat-Gen, gelenkt
durch den AAV-p5-Transkriptionspromotor, und das AAV-Polyadenylierungssignal
(Khlief et al. 1991. Virology 181: 738–741). Zum Verpackung von pYT45
in ein infektiöses
Virion wurde p1097cap verwendet, um die cap-Gensequenzen bereitzustellen,
welche Capsid-Proteine zum Zusammenbau des AAV-Virions liefern.
p1097cap erzeugt keines der Rep-Proteine aufgrund des Fehlens des
p5-Transkriptionspromotors und eines 12 bp XhoI-Oligonukleotid-Linkers,
der bei Nukleotid 1097 der AAV-rep-Gensequenzen inseriert ist. p1097cap
enthält
AAV-Sequenzen von Nukleotid 263 bis 4493, inseriert in das pGEM3Z-Plasmid
(Promega Corp.).
-
Zum
Verpackung der pYT45-Sequenzen wurden 10 μg von p1097cap und 5 μg von pYT45
auf 5 × 105 Zellen jeder Zelllinie kotransfiziert,
die mit Adenovirus infiziert und mit Cadmium- und Zinksalzen induziert
worden war. Zwei Tage nach der Transfektion wurde das verpackte
pYT45, vYT45, wie oben beschrieben abgeerntet und zum Infizieren
neuer Kulturen (5 × 105 Zellen) derselben Zelllinien, von denen
sie abgeleitet waren, verwendet, nachdem die Kulturen mit Schwermetall
induziert und mit Adenovirus infiziert worden waren. Zwei Tage nach
der Infektion wurden die Kulturen abgeerntet, die Extrakte präpariert
und die Hälfte
des Extrakts von 5 × 105 Zellen für Cat-Enzymassays verwendet
(Ausubel et al. (Hrg.) 1987. Current Protocols in Molecular Biology.
Greene Publishing Associates, Brooklyn, N.Y.). Der Prozentsatz der
Acetylierung von Chloramphenicol wurde mittels Szintillationszählung der
Dünnschichtchromatographie-Platten
bestimmt.
-
Um
rep-Gen-mutierte AAVs zu verpacken, wurden 10 μg pJDT279 in 5 × 105 Adenovirus-infizierte Rep-produzierende
Zellen transfiziert, die mit Schwermetallen induziert worden waren.
Zwei Tage später
wurden die Kulturen durch Abschaben der Zellen in Phosphat-gepufferte
Kochsalzlösung
(PBS), die 5 mM MgCl2 enthielt, geerntet,
tiefgefroren und dreimal aufgetaut, bei 60°C für 30 Minuten zum Inaktivieren
des Adenovirus erhitzt und dann 30 Minuten lang bei 37°C mit 100
Einheiten/ml pankreatischer DNasel (Sigma Chemical Corp.) behandelt.
Der Extrakt wurde bei 10.000 × g
für 20
Minuten bei 4°C
zentrifugiert und der Überstand
für anschließende Infektionen
verwendet. Die Extrakte wurden zum Infizieren neuer Kulturen (5 × 105 Zellen) derselben Zelllinien, von denen
sie abstammten, verwendet, nachdem die Kulturen mit Cadmium- und
Zinksalzen wie oben beschrieben induziert und mit Adenovirus infiziert
worden waren. Zwei Tage später
wurden die Kulturen abgeerntet, Hirt-DNA-Präparate hergestellt und mittels
Agarose-Gelelektrophorese und Southern-Hybridisationen mit derselben
radiomarkierten cap-Gensonde analysiert, die für die DNA-Replikationsassays
verwendet wurde.
-
Um
zu bestimmen, ob die Rep-induzierbaren Zelllinien zur Erzeugung
einer infektiösen
Nachkommenschaft fähig
waren, die eine Rep-Genmutation trugen, wurde das Plasmid pJDT279
auf die Schwermetall-induzierten Zelllinien transfiziert, die mit
Adenovirus infiziert worden waren. Zwei Tage später wurden die Kulturen abgeerntet,
und die Rohzellextrakte wurden wie oben beschrieben präpariert.
Die Extrakte wurden dann zum Infizieren neuer Kulturen verwendet,
die mit Schwermetall induziert und mit Adenovirus infiziert worden waren.
Zwei Tage später
wurden die Kulturen abgeerntet, Hirt- DNA-Präparate hergestellt und mittels
Agarose-Gelelektrophorese und Southern-Hybridisationen mit einer radiomarkierten
cap-Gensonde analysiert. In 4 enthält die pMtrep-Bahn
die DNA aus 293-Zellen, die mit vJDT279 infiziert worden waren,
welches durch Kotransfektion von pMtrep und pJDT279 auf Adenovirus-infizierte
293-Zellen erzeugt worden war. Die pJDT279-Bahn enthält einen
BgIII-Teilverdau des Plasmids, das linearisiertes Plasmid und DNA
von Monomer-Länge
erzeugt. Die Lokalisationen der Dimer (D)- und Monomer (M)-replikativen
Form und einzelsträngigen
(SS) DNAs sind angegeben. Aus 4 ist erkennbar,
dass alle Rep-produzierenden Zelllinien die Zusammenfügung des
infektiösen
AAV, das ein mutiertes rep-Gen enthielt, steuerten. (Monomer-DNA
der replikativen Form (RF) konnte in der Neo40-Bahn auf längeres Belichten
des Autoradiogramms hin beobachtet werden.)
-
Es
wurde kein infektiöser
Virus in Abwesenheit von Induktion amplifiziert, was darauf hinwies,
dass es keine nachweisbare Produktion von Wildtyp-Virus während der
anfänglichen
Transfektion gab. Wie erwartet, ergaben Neo5-Zellen keinen infektiösen Virus
weder unter induzierten noch nicht-induzierten Bedingungen. Als
einer Kontrolle für
diese Experimente wurde pMtrep mit pJDT279 auf Adenovirus-infizierten
293-Zellen kotransfiziert und der Virus-Nachkomme abgeerntet. Nach
anschließender
Infektion der Adenovirus-infizierten 293-Zellen war erkennbar, dass
ein Wildtyp-AAV aus der anfänglichen
Kotransfektion von pJDT279 und pMtrep entstanden war. Eine signifikante
Menge an RF-DNA wurde beobachtet, welche indikativ für die Rekombination
zwischen den gemeinsamen rep-Gensequenzen von pMtrep und pJDT279
ist. Diese Experimente zeigen, dass die Rep-produzierenden Zelllinien
ein verbessertes Verfahren zur Erzeugung von infektiösem rep-Gen-mutiertem
Virus bieten, ohne dabei ein Wildtyp-AAV durch Rekombination zu erhalten.
-
MTT-Wachstumsassay
-
Ein
Vergleich der Wachstumsraten unter induzierten und nicht-induzierten
Bedingungen für
neo5-, neo6- und neo40-Zellen wurde unter Anwendung von MTT-Wachstumsinhibitions-Assays
vorgenommen.
-
1 × 103 Neo5, Neo6 oder Neo40-Zellen wurde in einen
Napf einer 24-Well-Schale ausgesät.
Vierundzwanzig Stunden nach der Ausplattierung wurde das Medium
auf der Hälfte
der Kulturen gegen Cadmium- und Zinksalz-haltiges Medium ausgetauscht.
2, 4, 8 und 12 Tage nach der Ausplattierung wurde das Medium durch serumfreies,
phenolrotfreies MEM, das 0,05 mg/ml MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazoliumbromid;
Sigma Chemical Co.) enthielt, ersetzt. Die Kulturen wurden dann
für weitere
4 Stunden bei 37°C
in einer befeuchteten 5,0% CO2-Atmosphäre inkubiert.
Das Medium wurde dann durch Ansaugen entfernt und die Kulturen mit
200 μl eines
Stopplösung
(0,04 N HCl in Isopropanol) behandelt. Die Platten wurden eine Stunde
lang zum Lösen
der Formazankristalle kräftig
geschüttelt.
Die Extinktion (bei 595 nm) der Stopplösung wurde bestimmt. MTT-Ausgangslösungen wurden
präpariert,
indem zunächst
MTT in PBS, pH 7,5, bei einer Konzentration von 5 mg/ml aufgelöst wurde.
Die Lösung
wurde mit 0,45 μm-Spritzenfiltern
filtriert, um jegliche ungelöste
Kristalle zu entfernen.
-
Auf
die Induktion der rep-Genexpression hin wuchsen sowohl neo6- als
auch neo40-Zellen
viel schneller als die nicht-induzierten Kulturen (6).
Im Gegensatz dazu waren die Kontroll-neo5-Zellen nicht durch eine
Schwermetall-Induktion inhibiert. Zwischen dem achten und dem zwölften Tag
schienen sowohl die neo6- als auch neo40-Zellen ihr Wachstum wieder
aufzunehmen. Dies mag an dem Verlust der Rep-Proteinexpression oder zellulären Akklimatisation
an das Vorhandensein der Rep-Proteine
liegen. Eine immunofluoreszierende Anfärbung unter Verwendung von
Anti-Rep-Antikörpern der
induzierten Kulturen bis zu vierzehn Tagen nach Induktion zeigte
auf, dass 50–60%
der Zellen nach wie vor Rep-Protein enthielten (Yang und Trempe, unveröffentlichte
Daten). Dieser Prozentsatz ist ähnlich
dem von neo6- oder neo40-Zellen
nach einer zweitägigen
Induktion.
-
Beispiel 4
-
Produktion stabiler Zelllinien
-
Die
Neo6- und Neo40-Zelllinien wurden für mehr als zehn Monate und
mehr als 50 Generationen kultiviert. Die Fähigkeit dieser Zellen, auf
Induktion hin die Rep-Proteine zu erzeugen, hat über diesen Zeitraum nicht abgenommen.
Beide Zelllinien haben ihre Induzierbarkeit beibehalten, und es
liegt keine Veränderung
in der Population von Zellen vor, die auf eine Schwermetall-Induktion
reaktionsfähig
sind, wie durch die Rep-Proteinproduktion
gemessen (Yang und Trempe, unveröffentlichte
Daten). Eine kritische Periode in der Entwicklung der Zelllinien
wurde von Passage 10 bis 15 beobachtet, während welcher Zeit die Zellen
der induzierbaren Zelllinien nicht trypsiniert und bei geringer
Dichte (mehr als 1 bis 3 Verdünnungen)
wieder ausplattiert werden konnten. Nach dieser Krisenperiode konnten
die Klone als etablierte Zelllinien erhalten werden, mit Ausnahme des
Subklons Neo34, der nicht über
20 Passagen hinaus kultiviert werden konnte. Klon Neo34 exprimierte nachweisbare
Mengen des Rep-Proteins
und verhielt sich in funktionellen Assays ähnlich zu anderen Klonen (Yang
und Trempe, unveröffentlichte
Daten).
-
Koloniebildender Wirksamkeits-(CFE)-Assay
-
Das
Vorhandensein von AAV-DNA-Sequenzen führt zu veränderten Wachstumseigenschaften
der infizierten Zellen und bringt in einigen Fällen das Zellwachstum zum Einhalten.
Zur Bestimmung der Wirkungen des Rep-Proteins auf die Zelllinien
wurden die Wachstumsraten und die koloniebildende Wirksamkeit der neo5-,
neo6- und neo40-Zelllinien
bestimmt. Die Verdopplungszeiten der Rep-induzierbaren Zellen (wie
mittels Trypanblau-Ausschluss gemessen) zeigte, dass sie sich langsamer
multiplizierten als neo5-Zellen bei Verdopplungszeiten von etwa
35 Stunden für
neo5, 43 Stunden für
neo6 und 50 Stunden für
neo40 (Yang und Trempe, unveröffentlichte
Daten).
-
1 × 103 Neo5-, Neo6- und Neo40-Zellen wurden auf
6 cm-Schalen im Triplikat dünn
ausplattiert, um ihre Klonierleistung in Gegenwart und Abwesenheit
von Rep-Proteinexpression zu testen. Zwei der drei Kulturen in jedem
Satz enthielten Cadmium- und Zinksalze im Medium, wohingegen die
Dritte normales Medium enthielt. Nach einer 14-tägigen
Inkubation wurde die nicht-induzierte Kultur und eine induzierte
Kultur aus jedem Satz in 18% Formaldehyd in PBS fixiert und mit
Kristallviolett wie zuvor beschrieben angefärbt (Yang et al. 1992. J. Virol.
66: 6058–6069).
Das Schwermetallhaltige Medium auf der dritten Kultur in jedem Satz
wurde durch normales Medium ersetzt, wobei jene Kulturen für weitere
14 Tage inkubiert wurde. Diese 28-Tage-Kulturen wurden dann fixiert und angefärbt und
die Anzahl der Foci ermittelt. Es wurden Foci von größer als
2 mm gezählt.
-
Die
Schwermetall-Induktion (begleitet durch Rep-Synthese) zeigte eine
mäßige inhibitorische
Wirkung auf die CFE der Neo5-Zellen (5). Zwei
Wochen nach Inkubation wurden die induzierten (B, D, G) und nicht-induzierten
(A, C, F) Platten angefärbt.
Die verbliebenen Platten (E, H) wurden in normalem Medium für weitere
zwei Wochen rekultiviert und dann angefärbt. Das Wachstum der Rep78-exprimierenden
Zellen war in Gegenwart von Induktion jedoch enorm vermindert. Sowohl
für neo6-
als auch neo40-Zellen ergab sich eine Reduktion von größer 90%
des CFE in Gegenwart von Rep78 vor. Wurde Rep78 exprimiert, so bildeten
sehr wenige Kolonien von neo6 und neo40 Foci, die ohne Vergrößerung sichtbar
waren.
-
Die
mikroskopische Untersuchung der Platten vor der Anfärbung zeigte
auf, dass jene Zellen, die nicht in Clustern wuchsen, morphologisch
normal waren (Yang und Trempe, unveröffentlichte Daten). Ein Teil
der großen
Foci von induzierten neo6-Zellen wurde rekultiviert (mit Induktion)
und durch indirekte Immunofluoreszenz unter Verwendung eines Rep-spezifischen
Antikörpers
untersucht, um zu bestimmen, ob sie die Fähigkeit zum Exprimieren von
Rep-Protein beibehielten. Alle der getesteten Klone zeigten ähnliche
Grade der Immunofluoreszenz wie neo6-Zellen, die zwei Tage lang
induziert worden waren (Yang und Trempe, unveröffentlichte Daten).
-
Flusszytometrische Analyse
-
Das
AAV-Rep78-Protein hemmt die SV40-DNA-Replikation in 293- und COS-1-Zellen
und die zelluläre DNA-Synthese
in NIH3T3-Zellen (Yang et al., Manuskript übergeben an J. Virol.). Die
Inhibierung kann aufgrund direkter Interferenz der zellulären DNA-Replikation oder
Hemmung des Zellzyklus-Verlaufs durch das Rep-Protein erfolgen.
Um diese beiden Möglichkeiten
zu untersuchen, wurde eine Flusszytometrie an den induzierbaren
Zelllinien wie folgt vorgenommen. 2 × 106 Zellen
von Neo6, Neo40 und Kontroll-neo5-Zellen wurden in 15-cm-Schalen
in Gegenwart oder Abwesenheit von Schwermetallen ausplattiert. Nach
72-stündiger
Inkubation wurden die Zellen mit PBS gespült und in Flüssigstickstoff
in Citratpuffer (250 mM Sucrose und 40 mM Natriumcitrat), der 5%
DMSO enthielt, bei einer Konzentration von 5 × 106 Zellen/ml
gelagert. Die Propidiumiodid-Anfärbung
wurde wie beschrieben vorgenommen (Vindelov et al. 1983. Cytometry
3: 323–327).
Die Flusszytometrie wurde auf einem Colter-Flusszytometer vorgenommen.
Die Population der Zellen in verschiedenen Stadien des Zellzyklus
wurde mit einem Polynomial-Fit zweiter Ordnung unter Verwendung
der Multicycle-Software berechnet, wie beschrieben von Peter S.
Rabinovitch (Phoenix Flow System).
-
In
Tabelle 1 sind die Ergebnisse zusammengefasst. Schwermetalle zeigen
keine Wirkungen auf den Verlauf des Zellzyklus bei neo5-Zellen,
wie durch ähnliche
Prozentsätze
der Zellen in den G1-, G2- und S-Phasen des Zellzyklus gezeigt (Tabelle
1). Klon neo40 zeigte jedoch einen signifikanten Anstieg in der
Zahl der Zellen in der S-Phase, wenn das Rep-Protein induziert war.
Neo6-Zellen zeigen ebenfalls einen mäßigen Anstieg der Zellen in
der S-Phase auf Induktion hin. Ohne Induktion wiesen die neo5-Zellen weniger Zellen
in der S-Phase auf als die neo40- oder neo6-Zellen. Diese Wirkung
kann an den geringen Mengen an Rep-Protein liegen, die im nicht-induzierten
Zustand undetektierbar bleiben. Ist dem so, so können geringe Mengen an Rep-Protein, wie von
nicht-induziertem Metallothionein-Promotor exprimiert, eine inhibitorische
Wirkung ausüben.
An keinem Punkt der S-Phase wurde ein scharfer Peak beobachtet.
Stattdessen verteilte sich der Anstieg auf den gesamten Prozess
der DNA-Synthese,
was zeigte, dass Rep78 keinen Zyklusblock einführt, sondern eher die Entwicklung
der Zelle durch die DNA-Synthesephase verlangsamt. Diese Ergebnisse
legen nahe, dass die antiproliferativen Wirkungen der Rep-Proteine
möglicherweise
von der Inhibierung oder Verlangsamung der DNA-Synthese anstelle
der Einführung
eines Zellzyklus-Blocks in den G1-, G2- oder M-Phasen herstammen.
-
TABELLE
1. Zellzyklus-Verteilung von induzierten und nicht-induzierten Klonen.
A
