JP2007521835A - ニコチンアミドリボシドキナーゼ組成物およびそれらの使用方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、単離されたニコチンアミドリボシドキナーゼ(Nrk)核酸配列、それらを含むベクターおよび培養細胞、およびそれらによってエンコードされたNrkポリペプチドに関する。ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグ処置に感受性がある個体または腫瘍を同定する方法、およびNrk核酸配列またはポリペプチドをニコチンアミドリボシド関連プロドラッグと組み合わせて投与することによって癌を処置する方法もまた、提供する。本発明はさらに、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを単離するための、およびニコチンアミドリボシドの天然源を同定するためのスクリーニング方法を提供する。

Description

序文
本発明は、National Cancer Institute(認可番号CA77738)の後援による研究の中で行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有するものとする。

発明の背景
ナイアシン類は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)のビタミン形状である。真核生物は、キヌレニン経路を介して、トリプトファンからのNAD+のデノボ合成をすることができ(Krehl, et al. (1945) Science 101:489-490; Schutz and Feigelson (1972) J. Biol. Chem. 247:5327-5332)、ナイアシン添加は、トリプトファンが不足した食事の母集団において生じ得るペラグラを防ぐ。ニコチン酸は、ニコチン酸モノヌクレオチド(NaMN)にホスホリボシル化され(phosphoribosylate)、そしてアデニリル化され、ニコチン酸アデニンジヌクレオチドを形成し(NaAD)、次にアミド化され、NAD+を形成する(Preiss and Handler (1958) J. Biol. Chem. 233:488-492; Preiss and Handler (1958b) J. Biol. Chem. 233:493-50)、ということが確立されている。

NAD+は当初、酸化還元酵素のための補酵素として特徴付けられた。NAD+、NADH、NADPおよびNADPHの間の変換は、総補酵素の喪失を伴わないが、NAD+はまた、未知の目的のために細胞内で転用されることが発見された(Maayan (1964) Nature 204:1169-1170)。S. cerevisiaeのSir2およびその同族体などのサーチュイン酵素は、当量のNAD+の消費によりリジン残基を脱アセチル化し、この活性が、転写サイレンサーとしてのSir2の機能に必要である(Imai, et al. (2000) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 65:297-302)。

NAD+依存性脱アセチル化反応は、遺伝子発現の交代にのみならず、リボソームDNA組換えの抑制およびカロリー制限に応答する寿命の延長にも必要である(Lin, et al. (2000) Science 289:2126-2128; Lin, et al. (2002) Nature 418:344-348)。NAD+は、Sir2により消費され、2'−および3'−O−アセチル化ADP−リボースならびにニコチンアミドおよび脱アセチル化したポリペプチドの混合物を生成する(Sauve, et al. (2001) Biochemistry 40:15456-15463)。ポリ(ADPリボース)ポリメラーゼおよびcADPリボース合成酵素を含むさらなる酵素もまた、NAD+依存性であり、ニコチンアミドおよびADPリボシル産物を生成する(Ziegler (2000) Eur. J. Biochem. 267:1550-1564; Burkle (2001) Bioessays 23:795-806)。

NAD+の非補酵素特性は、NAD+生合成への関心を新たにした。最近の4刊行物は、S. cerevisiaeにおけるすべての遺伝子産物およびNAD+への経路であると考えられるものは何かを提案し(Panozzo, et al. (2002) FEBS Lett. 517:97-102; Sandmeier, et al. (2002) Genetics 160:877-889; Bitterman, et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:45099-45107; Anderson, et al. (2003) Nature 423:181-185)、NaMNでのデノボ合成、ニコチン酸移入、およびニコチンアミド回収からNAD+へのフラックスの収れんを示している(スキーム1)。

発明の概要
デノボおよびPreiss-Handler経路の酵素を欠いている(Fleischmann, et al. (1995) Science 269:496-512)、Haemophilus influenzaなどの細菌のNAD+前駆体であることが知られていたニコチンアミドリボシド(Gingrich and Schlenk (1944) J. Bacteriol. 47:535-550; Leder and Handler (1951) J. Biol. Chem. 189:889-899; Shifrine and Biberstein (1960) Nature 187:623)は、以前は未知であるが保存された真核NAD+生合成経路におけるNAD+前駆体であることが示されている。

酵母ニコチンアミドリボシドキナーゼ、Nrk1、およびNAD+代謝において特異的機能を有するヒトNrk酵素を、ここに提供する。これらの酵素の特異性は、それらが、制癌剤などのチアゾフリンおよびベンズアミンリボシドおよびそれらの類似体を有毒なNAD+類似体に変換する第一段階を行う念願のチアゾフリンキナーゼであることを示す。さらに、定義済みの遺伝子型の酵母変異体が、ニコチンアミドリボシド源を同定するために使われ、乳が、ニコチンアミドリボシド源であることを示す。

したがって、本発明の一側面は、真核ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをエンコードしている単離された核酸である。前記単離された核酸は:
(a)配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3を含むヌクレオチド配列である;
(b)ストリンジェントな条件下で配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3を含むヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、ここで前記ヌクレオチド配列が、機能性ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをエンコードする;または
(c)(a)または(b)のヌクレオチド配列によりエンコードされたアミノ酸配列をエンコードしているが、遺伝コードの縮重または翻訳されないヌクレオチド配列の存在により、(a)または(b)のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列である。

本発明の別の側面は、真核ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをエンコードしている単離された核酸を含有する発現ベクターである。一態様において、前記発現ベクターは、薬学的に許容しうる担体を含有する組成物の一部である。別の態様において、前記組成物はさらに、プロドラッグを含有し、前記プロドラッグは、発現ニコチンアミドリボシドキナーゼによりリン酸化されたニコチンアミドリボシド関連類似体であり、それにより前記プロドラッグを活性化する。

本発明のさらなる側面は、単離された真核ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドである。一態様において、前記単離されたニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドは、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6を含むアミノ酸配列またはその機能性フラグメントと少なくとも約70%のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列である。

本発明のまたさらなる側面は、単離された真核ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをエンコードしている核酸またはそれによりエンコードされたポリペプチドを含有する培養細胞である。

本発明の別の側面は、単離された真核ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドおよび薬学的に許容しうる担体を含有する組成物である。一態様において、前記組成物はさらに、プロドラッグを含有し、前記プロドラッグは、前記プロドラッグが、ニコチンアミドリボシドキナーゼによりリン酸化されたニコチンアミドリボシド関連類似体であり、それにより前記プロドラッグを活性化する。

本発明のさらなる側面は、癌であるか癌であると疑われる患者に有効量のニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを単離された真核ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドまたは真核ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをエンコードしている単離された核酸配列を含有する発現ベクターと組み合わせてに投与することにより癌を処置する方法であり、前記ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドは、前記プロドラッグをリン酸化し、それにより前記癌の兆候または症状が減少するまたはなくなるよう、プロドラッグを活性化する第一の段階を行う。

本発明のまたさらなる側面は、ニコチンアミドリボシドの天然または合成源を同定する方法である。該方法は、機能性グルタミン依存性NAD+合成酵素を欠いている第一の細胞を天然または合成源から単離された抽出物と接触させること;機能性グルタミン依存性NAD+合成酵素およびニコチンアミドリボシドキナーゼを欠いている第二の細胞を単離された抽出物と接触させること;および、第二の細胞の増殖と比較した第一の細胞の増殖の検出をすることを含み、第一の細胞における増殖の存在および第二の細胞における増殖の不在は、単離された抽出物におけるニコチンアミドリボシドの存在を示す。一態様において、天然源は牛乳である。

本発明の別の側面は、本発明の方法により同定されたニコチンアミドリボシドおよび担体を含む栄養補助食品組成物である。

本発明のまたさらなる側面は、NAD+生合成のニコチンアミドリボシドキナーゼ経路に関連する疾患または状態を防ぐまたは処置する方法である。該方法は、疾患または状態の兆候または症状を防ぐまたは低減するよう、NAD+生合成のニコチンアミドリボシドキナーゼ経路に関連する疾患または状態を有する患者に有効量のニコチンアミドリボシド組成物を投与することを含む。一態様において、状態が発作または脂質障害である。別の態様において、ニコチンアミドリボシドをさらに、トリプトファン、ニコチン酸またはニコチンアミドを組み合わせて投与する。

本発明のさらなる側面は、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを同定するin vitroの方法である。該方法は、ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをニコチンアミドリボシド関連検査薬と接触させること、および前記検査薬が前記ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドによりリン酸化されるかどうか決定することを含み、前記検査薬のリン酸化は、前記検査薬がニコチンアミドリボシド関連プロドラッグであることを示す。この方法により同定されたニコチンアミドリボシド関連プロドラッグもまた、本発明の別の側面である。

本発明のまたさらなる側面は、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを同定する細胞に基づいた方法である。この方法は、組換えニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドを発現する第一の被検細胞をニコチンアミドリボシド関連検査薬と接触させること;機能性ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドを欠いている第二の被検細胞を同じ検査薬と接触させること;および、第一の細胞のであり第二の細胞のではない感度がニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを示す、第一のおよび第二の被検細胞の生存率を決定することを含む。この方法により同定されたニコチンアミドリボシド関連プロドラッグもまた、本発明の別の側面である。

本発明の別の側面は、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグによる処置に感受性がある個体または腫瘍を同定する方法である。この方法は、個体または腫瘍におけるニコチンアミドリボシドキナーゼの突然変異の存在、または発現のレベルを検出することを含む、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグによる処置に感受性のある個体または腫瘍を同定する方法であり、対照と比較した、前記個体または腫瘍におけるニコチンアミドリボシドキナーゼの発現の突然変異または変化の存在が、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグによる処置への感受性のレベルの変化を有する前記個体または腫瘍を示す。

発明の詳細な説明
グルタミン依存性NAD+合成酵素をエンコードしているSaccharomyces cerevisiae QNS1遺伝子は特徴付けられ、グルタミナーゼ活性部位またはNAD+合成酵素の活性部位の突然変異は、生存不能の細胞をもたらしてきた(Bieganowski, et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:33049-33055)。

qns1破壊を含有する株およびプラスミドから生じたQNS1遺伝子の所有は、スキーム1(Panozzo, et al. (2002) supra; Sandmeier, et al. (2002) supra; Bitterman, et al. (2002) supra; Anderson, et al. (2003) supra)のNAD+用の標準デノボ、移入および回収経路が、S. cerevisiaeにおけるNAD+への代謝経路の完全表記であるかどうかの決定を可能にした。

スキーム1に描かれた経路は、以下を示す:より多くのNAD+を作るためにピリジン環を回収する前にニコチンアミドをニコチン酸に脱アミド化し、したがってニコチンアミドによる添加は、経路を通してニコチンアミド含有前駆体を短絡することによりqns1突然変異体を救助しないだろう;およびQNS1が3種の経路に共通しており、したがって、qns1突然変異体を救助するNAD+前駆体がないだろう。しかしながら、ニコチンアミドは1または10mMででもqns1突然変異体を救助しない一方、ニコチンアミドリボシドは、10μMでNAD+のビタミン形状として機能することが見出された。

チアゾフリン(Cooney, et al. (1983) Adv. Enzyme Regul. 21:271-303)およびベンズアミンリボシド(Krohn, et al. (1992) J. Med. Chem. 35:511-517)などの抗癌剤は、デノボプリンヌクレオチド生合成用の律速酵素であるIMPデヒドロゲナーゼを阻害するNAD+類似体、チアゾフリンアデニンジヌクレオチドおよびベンズアミドアデニンジヌクレオチドに細胞内で代謝されることが示されている。

NMN/NaMNアデニリルトランスフェラーゼはモノヌクレオチド中間体をNAD+類似体に変換するで酵素あると考えられ、このための構造的基盤は知られているが(Zhou et al. (2002) supra)、アデノシンキナーゼ、5'ヌクレオチダーゼ(Fridland, et al. (1986) Cancer Res. 46:532-537; Saunders, et al. (1990) Cancer Res. 50:5269-5274)および特異的ニコチンアミドリボシドキナーゼ(Saunders, et al. (1990) supra)を含むいくつかの異なる酵素が、in vivoでのチアゾフリンのリン酸化に関与することが提案されてきた。推定ニコチンアミドリボシドキナーゼ(Nrk)活性が精製されたが、しかしながらアミノ酸配列情報が得られず、その結果、その機能を評価するための遺伝子検査が行われなった(Sasiak and Saunders (1996) Arch. Biochem. Biophys. 333:414-418)。

チアゾフリンをリン酸化することが提案されているヌクレオシドキナーゼ、すなわち、アデノシンキナーゼado1(Lecoq, et al. (2001) Yeast 18:335-342)、ウリジン/シチジンキナーゼurk1(Kern (1990) Nucleic Acids Res. 18:5279; Kurtz, et al. (1999) Curr. Genet. 36:130-136)、およびリボキナーゼrbk1(Thierry, et al. (1990) Yeast 6:521-534)をエンコードしている候補遺伝子の酵母同族体のためにさらに欠失したqns1破壊株を使って、ヌクレオシドキナーゼが、独自にまたは集団でニコチンアミドリボシドの利用に関与するかどうかを決定した。これらの欠失にもかかわらず、該株は、NAD+合成酵素から独立した同化経路においてニコチンアミドリボシドを利用する能力を保持した。

哺乳類の薬理学が、推定菌Nrkの同一性に有用な手掛かりを提供しなかったことから考えると、遺伝子は、Haemophilus influenzaのNrkと保存されていたかもしれないかどうかが考えられた。H. influenzaのNrkドメインはNadR遺伝子産物(NMNアデニリルトランスフェラーゼのアミノ終端)のアミノ酸225から421によってエンコードされた。

このドメインは構造的に酵母チミジル酸キナーゼと類似しているが(Singh, et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:33291-33299)、高感度配列探索により細菌Nrkが酵母の中にオーソログを持っていないことが明らかになった。H. influenza NadRのNrkドメインを伴うゲノム探索は、ニコチンアミドリボシドをNAD+前駆体として利用すると予想された細菌ゲノムの増大するリストを同定した(Kurnasov, et al. (2002) J. Bacteriol. 184:6906-6917)。したがって、菌類がNadR Nrk相同的ドメインを保有したならば、比較ゲノムはすでに酵母がニコチンアミドリボシドを回収できると予測するであろう。

S. cerevisiaeのNrkを同定するために、酵素活性のためのHPLCアッセイが確立され、および遺伝子この活性をエンコードしている遺伝子を選別するために、生化学的なゲノムアプローチとの組み合わせて使用された(Martzen, et al. (1999) Science 286:1153-1155)。90〜96のS. cerevisiaeオープンリーディングフレームの64のプールをS. cerevisiaeの中に発現するグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)と融合し、GST融合物として精製し、ニコチンアミドリボシドプラスATPをNMNプラスADPに変換する能力を求めて選別した。ほとんどのプールがいくらかのATPインプットを消費する活性を含んでいたのに対し、プール37のみがニコチンアミドリボシドを消費し、およびNMNを生成した。プール37の中で、およそ1mMのATPの半分をADPに変換し、および500μMのニコチンアミドリボシドピークはほぼ完全にNMNに変換した。プール37を生成するのに使用された94のオープンリーディングフレームの検査によりYNL129W(配列番号:1)が、501アミノ酸酵母ウリジン/シチジンキナーゼUrk1との23%同一性、および大腸菌パントテン酸キナーゼpanKのセグメントとの離れた類似性を含有する187アミノ酸セグメントエンコードを伴う、予測された240アミノ酸ポリペプチドエンコードすることが明らかになった(Yun, et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:28093-28099)(図1)。

細菌の発現ベクターの中にYNL129Wをクローン化した後、この代謝物の同族体キナーゼが真核Nrkかどうかを確かめた。精製されたYNL129Wの比活性はプール37のおよそ100倍で、プール37のすべてのNrk活性がこのオープンリーディングフレームでエンコードされたという考えと一致している。この遺伝子産物がニコチンアミドリボシドをin vivoでリン酸化するかどうか遺伝的に検査するために、qns1バックグラウンドでYNL129Wの欠失が引き起こされた。破壊株のニコチンアミドリボシド救助が全体的にこの遺伝子産物に依存していることを発見した。生化学的および遺伝子学的にYNL129Wが確証的なNrk活性をエンコードすることを示すことによって、この遺伝子はNRK1と称される。

PSI−BLAST(Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)比較を、予測されたS. cerevisiaeNrk1ポリペプチドの上で行い、および明らかなオーソログヒトタンパク質Nrk1(NP_060351;配列番号:5;図1)を見い出した。遺伝子座9q21.31にエンコードされたヒトNP_060351タンパク質は199アミノ酸のポリペプチドであり、性質不明のウリジンキナーゼ族のタンパク質であると注解した。さらに、第二のヒト遺伝子産物Nrk2(NP_733778;配列番号:6;図1)が、ヒトNrk1と57%同一であることを見い出した。Nrk2は230アミノ酸スプライシングの186アミノ酸筋肉インテグリンベータ1結合タンパク質(ITGB1BP3)と記述される形状であり、19p13.3にエンコードされている(Li, et al. (1999) J. Cell Biol. 147:1391-1398; Li, et al. (2003) Dev. Biol. 261:209-219)。

S. cerevisiae、S. pombeおよびヒトNrk同族体間のアミノ酸変換、およびS. cerevisiae Urk1ならびに大腸菌panKのフラグメントの類似性を図1に示す。真菌およびヒトNrk酵素は代謝物キナーゼスーパーファミリーの一員であり、パントテン酸キナーゼを含むが、細菌ニコチンアミドリボシドキナーゼとは無関係である。qns1 Nrk1がニコチンアミドリボシドを補充した培地の上で育てないことの頑強な相補性は、グルコース上のGAL1プロモーターから発現したときでさえ、ヒトNRK1およびヒトNRK2 cDNAによって提供された。

表1に示したように、酵母Nrk1およびヒトNrk1ならびにNrk2の精製により、ニコチンアミドリボシドおよびチアゾフリンのリン酸化への高い特異性を明らかになった。
比活性はヌクレオシド基質のリン酸化についてnmole mg−1 min−1で表される。

酵母およびヒトNrk1酵素の場合、酵素は天然基質ニコチンアミドリボシドよりもチアゾフリンを二倍好み、および両方の酵素はウリジンおよびシチジンにおいてそれらの最大比活性の7%以下を保持した。ヒトNrk2の場合、230アミノ酸の形は、ニコチンアミドリボシド、チアゾフリンおよびウリジンにおいて基本的に等しく活動的で、シチジンにおいて10%以下の対応する活性だった。逆に、186アミノ酸インテグリンベータ1結合タンパク質の形は、このin vitroアッセイの中で酸素活性を欠き、Nrkとしてin vivoでは機能的でなかった。

しかしながら、186および230アミノ酸アイソフォームは共にin vivoで酵母ニコチンアミドリボシド利用アッセイで機能する。したがって、Nrk2はウリジル酸(uridylate)の形成に寄与し得るが、これらのデータは真菌類および哺乳類がNaMNを通る周知の経路であるのに加え、NMNを通ってNAD+を合成する機能のある特異的ニコチンアミドリボシドキナーゼを所有するということを立証した。したがって、Nrk酵素活性の同定は、真菌および哺乳類NaMN/NMNアデニリルトランスフェラーゼの二重の特異性からなる。

SAGEデータに基づいて、NRK1は検査された多くの組織の中でまれなメッセージであるが、NRK2は心臓および骨格筋で高度に発現し、および網膜上皮および胎盤では低いレベルで発現した(Boon, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11287-11292)。癌細胞系統にいたっては、発現レベルはかなり変わりやすい(Boon, et al. (2002) supra)。したがって、腫瘍が、NRK1、NRK2の低い個人では、NAD+へのチアゾフリンの変換は腫瘍よりも患者心臓および筋肉でより大規模に起こり得る。NRK1および/またはNRK2の高い腫瘍では、相当量のチアゾフリンが腫瘍の中でチアゾフリンアデニンジヌクレオチドに変換され得る。

牛乳の酸ホエー製剤で識別されるニコチンアミドリボシドの天然源の選別するために、酵母qns1突然変異体を使用した。飢えたイヌの黒舌回復のために肝臓のタンパク質枯渇抽出物中のビタミン類を選別する本来の方法と違い(Elvehjem, et al. (1938) J. Biol. Chem. 123:137-149)、このアッセイはNAD+前駆体を同定することに経路特異的である。qns1の欠失のために、ニコチン酸およびニコチンアミドはこのアッセイで陽性を得ない。乳からの因子は成長のためにニコチンアミドリボシドキナーゼを必要とするので、栄養素は明らかにニコチンアミドリボシであってNMNまたはNAD+ではない。

Nrk1同族体およびニコチンアミドリボシド回収経路を取り込んだ改訂したNAD+のための代謝スキームをスキーム2に示し、二重矢印は酵母およびヒトに共通の代謝段階を示し(酵母遺伝子名と共に)、および一重矢印は段階ヒトPBEF、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ)および酵母(Pnc1、ニコチンアミダーゼ)に独特である段階を示す。

ヒトと酵母の違いは、抗黒舌因子(anti-black tongue factor)として共に同定された化合物であるニコチンアミドおよびニコチン酸の、生物の利用に関係している(Elvehjem, et al. (1938) supra)。ヒトは、プレ−B−細胞コロニー増強因子と名付けられたHaemophilus ducreyi nadV遺伝子の同族体をエンコードし、それはニコチンアミドをNMNに変換し得(Rongvaux, et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:3225-3234)、およびリンパ球活性化の間、高度に誘導される(Samal, et al. (1994) Mol. Cell Biol. 14:1431-1437)。一方で、S. cerevisiaeはnadVの同族体を欠いていて、また代わりにPreiss-Handler経路に入るために、ニコチンアミドをニコチン酸に変換するPNC1と名付けられた大腸菌pncA遺伝子の同素体を有する(Ghislain, et al. (2002) Yeast 19:215-224; Sandmeier, et al. (2002) supra)。Preiss-Handler経路は頻繁にニコチンアミドからの回収経路と認識されるが、技術的にはニコチン酸からNAD+への段階を示している(Preiss and Handler (1958) supra; Preiss and Handler (1958) supra)。

ニコチンアミダーゼを哺乳類の肝臓から精製してきたという1960年代のレポート(Petrack, et al. (1965) J. Biol. Chem. 240:1725-1730)は、真菌および動物のNAD+生合成を完全に保護されたという感覚に寄与してきたかもしれない。しかしながら、ニコチンアミダーゼについての動物遺伝子は同定されておらず、またニコチンアミドおよびニコチン酸は哺乳類の中と同じルートを通ってNAD+前駆体として利用されるという抵抗しがたい証拠はない。ニコチンアミドおよびニコチン酸の混合物としての「ナイアシン」の残留性は、NAD+を生成するために複数の経路を利用するという有用性の証明となり得、また第三の移入可能なNAD+前駆体としてニコチンアミドリボシドの添加がある状態にとって有益になり得ることを示す。

1955年に、ニコチン酸の高い投与量はコレステロール値を低減することに効果的であると最初に報告された(Altschul, et al. (1955) Arch. Biochem. Biophys. 54:558-559)。最初のレポート以後、多くの比較臨床試験は、ニコチン酸の調製が、単独でおよびHMG CoA還元酵素阻害剤との併用で、ヒトにおいて低密度リポタンパク質コレステロールの制御、高密度リポタンパク質コレステロールの増加、およびトリグリセリドおよびリポタンパク質レベルの低減に効果的であることを示した(Pasternak, et al. (1996) Ann. Intern. Med. 125:529-540)。

ニコチン酸処置は全ての重要な脂質に対して望ましい方向に効果があり、また標的母集団の死亡率を低減することを示すが(Pasternak, et al. (1996) supra)、熱および製剤の性質に大きく影響される「潮紅」と命名された赤みの副作用のためにその利用は限られている(Capuzzi, et al. (2000) Curr. Atheroscler. Rep. 2:64-71)。したがって、ニコチンアミドリボシド添加は、ヒトにおける脂質特性を向上する一つのルートとなり得る。さらに、ニコチンアミドは発作の動物モデルに保護的であり(Klaidman, et al. (2003) Pharmacology 69:150-157)、またニコチンアミドリボシド発作などの急性の状態に対して大切な補助となり得る。そのうえ、NAD+生合成酵素の調節は、チアゾフリンアデニンジヌクレオチドなどの化合物の毒性から正常な組織を保護するため、および最も賢明なチアゾフリン化学療法の利用で患者を満足させるために、チアゾフリンなどの化合物へ腫瘍を感作することに有用になり得る。

本発明の一側面は、ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをエンコードしている真核ヌクレオチド配列を含有する単離された核酸である。ここで使用されているように、単離された分子(例えば、ゲノムDNA、RNAまたはcDNAなどの単離された核酸あるいは単離されたポリペプチド)は、分離した分子または実質的に少なくともいくらか他の天然に起こる生物の成分、例えば細胞構造成分、あるいは通常分子に関連して発見される他の核酸またはポリペプチドなどがないことを意味する。単離された分子がポリペプチドであるとき、前記ポリペプチドは少なくとも約25%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%(w/w)またはさらに純粋である。

一態様において、ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをエンコードする真核ヌクレオチド配列は、配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3のヌクレオチド配列である。別の態様において、ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをエンコードしている真核ヌクレオチド配列は、配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列であるか、またはストリンジェントな条件下のその相補的ヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列は機能性ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプタイドをエンコードする。さらなる態様において、ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをエンコードする真核ヌクレオチド配列は、機能性ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列であるが、遺伝コードの縮重、または非翻訳のヌクレオチド配列が存在するために、配列番号:1、配列番号:2、または配列番号:3のヌクレオチド配列以外の異なるヌクレオチド配列を有する。

ここで使われるように、機能性ポリペプチドは少なくとも一つの通常ポリペプチドと関連する生物活性を有する。あるいは、機能性ポリペプチドは非修飾ペプチドに保有された全ての活性を保持する。生物活性を保持することによって、ポリペプチドは少なくとも約50%、60%、75%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、またはそれ以上の未変性のポリペプチドの生物活性を保持していることを意味する(および未変性のポリペプチドよりも高いレベルの活性を有することも可能である)。非機能性ポリペプチドは通常ポリペプチドと関連する検出可能な生物活性を基本的に示さないものである(例えば、多くてもたったわずかな量だけ、例えば約10%以下、またはさらに5%)。

ここで使われるように、用語ポリペプチドは、他に指示されていない限りペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。

ここで使われるように、ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドまたはNrkタンパク質は、広く解釈されることが意図され、およびニコチンアミドリボシドをリン酸化する能力のある酵素を包含する。用語ニコチンアミドリボシドキナーゼまたはNrkはまた、生物機能を保持する修飾(例えば、変異した)Nrk(すなわち、少なくとも一つの未変性Nrkタンパク質の生物活性、例えば、ニコチンアミドリボシドのリン酸化を有する)、切断された分子、あるいはスプライスされたアイソフォーム(例えば、代わりにヒトNrk2のスプライスされたアイソフォーム)を含む機能性Nrkフラグメント、および機能性Nrk融合ポリペプチド(例えば、Nrk−GSTタンパク質融合またはNrk−Hisタグを付けたタンパク質)も含む。

当技術分野で知られているどのNrkポリペプチドまたはNrkをエンコードしている核酸も、本発明に従って使用することができる。NrkポリペプチドまたはNrkをエンコードする核酸は酵母、菌(例えば、S. cerevisiae、S. pombe、Pichia種、Neurospora種など)、植物、動物(例えば、昆虫、鳥類(例えば、ニワトリ)、または哺乳類(例えば、ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ科、ネコ科、イヌ科、ウサギ目、サル、ヒトなど)由来であり得る。

代表的なS. cerevisiae Nrk1のcDNAおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号:1および配列番号:4に示す(図1)。代表的なヒトNrk1のcDNAおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号:2および配列番号:5に示す(図1)。代表的なヒトNrk2のcDNAおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号:3および配列番号:6に示す(図1)。本発明に包含される他のNrkはGENBANK受入番号M_017881、AK000566、BC001366、BC036804、およびBC026243のNrk1、およびGENBANK受入番号NM_170678のNrk2を含むが、これらに限定されるものではない。

例えば、かかる配列のハイブリダイゼーションは、ここに特に開示される配列に対して低減した厳密性、中程度の厳密性の条件下、または厳密な条件下、(例えばそれぞれ、37℃の5xデンハート液、0.5%のSDS、および1xSSPEを伴う35〜40%のホルムアミドの洗浄厳密性によって表される状態;42℃の5xデンハート液、0.5%のSDS、および1xSSPEを伴う40〜45%のホルムアミドの洗浄厳密性によって表される状態、および/または42℃の5xデンハート液、0.5%のSDSおよび1xSSPEを伴う50%のホルムアミドの洗浄厳密性によって表される状態)で行うことができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)参照。

代わりの言い方をすれば、本発明のNrkをエンコードしている単離された核酸は少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%またはそれ以上の、ここに特に開示される単離された核酸配列(または上に定義済みのそれのフラグメント)との配列類似性を有し、およびここに定義済みの機能性Nrkをエンコードする。

遺伝コードの縮重により本発明のNrkをエンコードする核酸の可変性は存在し得るということは、当業者に認められている。異なる核酸配列が同じポリペプチドをコードすることを可能にする遺伝コードの縮重は、文献において周知である(表2参照)。

さらなる核酸配列の変動は、イントロン配列および5’および3’非翻訳の配列などの、翻訳されない配列の存在(または欠如)によって導入され得る。

さらに、本発明の単離された核酸は、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%またはそれ以上のここに特に開示されるポリペプチド配列とのアミノ酸配列類似性を有するNrkポリペプチド(またはそれらのフラグメント)をエンコードする核酸を包含し、およびさらにここに定義済みの機能性Nrkをエンコードする。

当技術分野で既知のように、多種多様なプログラムを、既知の配列に対して核酸またはポリペプチドが配列同一性または類似性を有するかどうかを同定するために使うことができる。配列同一性および/または類似性は当技術分野で知られた基本技術を使って決定できる。この技術はSmith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所配列同一性アルゴリズム、Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の配列同一性アライメントアルゴリズム、Pearson & Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性の探索方法、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行(the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)、Devereux, et al. (1984) Nucl. Acid Res. 12:387-395によって説明されたベストフィット配列プログラムをデフォルト設定を用いて、または検査によることを含むが、これらに限定されるものではない。

有用なアルゴリズムの例は、PILEUPである。PILEUPは、複数の配列アライメントを進行性の対のアライメントを使った関連した配列のグループから作成する。これはアライメントを作成するのに使われたクラスタリング関係を示す系統図を作ることもできる。PILEUPはFeng & Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360の進行性アライメント方法の単精製を利用する。これはHiggins & Sharp (1989) CABIOS 5:151-153によって記述された方法に類似した方法である。

別の有用なアルゴリズムの例は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410およびKarlin, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787に記述されたBLASTアルゴリズムである。特に有用なBLASTプログラムはAltschul, et al. (1996) Methods in Enzymolog, 266:460-480; http://blast.wustl/edu/blast/README.htmlから入手されるWU-BLAST-2プログラムである。WU-BLAST-2はデフォルト値に設定することのできるいくつかの探索パラメーターを使う。このパラメーターは動的値であり、特定の配列の組成物および関心の対象となる配列を探索することに対する特定のデータベースの組成物に依存したプログラムそのものによって確立される;しかしながら、この値は感度を高めるために調節することができる。

追加の有用なアルゴリズムはAltschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402によって報告されたギャップド(gapped)BLASTである。

アミノ酸配列同一性値のパーセンテージは、適合した同一の残基数を整列させた領域のなかのより長い配列の残基の総数で割ることにより決定することができる。より長い配列は、整列させた領域の中の最も現実的な残基を有している配列である(アライメントスコアを最大化させるために導入されたギャップは無視する)。

このアライメントは、整列するための配列の中へのギャップの導入を含むことができる。さらに、特にここに開示されたポリペプチドよりも多くのまたは少ないアミノ酸を含有する配列のために、一態様において、配列同一性のパーセンテージはアミノ酸の総数に対する同一のアミノ酸の数に基づいて決定すると理解される。したがって、例えば、一態様において、特にここに開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、より短い配列中のアミノ酸の数を使って決定される。パーセント同一性計算において、相対的な重量は、挿入、欠失、置換などの配列バリエーションの様々な発現に割り当てられない。

一態様において、同一性だけが正(+1)と記録され、またギャップを含む配列バリエーション全ての形状は「0」の値が割り当てられる、そしてそれは下記の配列類似性計算のための加重スケールまたはパラメーターの必要性を除去する。パーセント配列同一性は、例えば、適合する同一残基を、整列させた領域中の最も短い配列残基の総数で割り、100をかけることで計算できる。より長い配列は、整列させた領域中で最も現実の残基を有するものである。

特にここに開示された、あるいは当技術分野で既知のアミノ酸配列を修飾するために、アミノ酸置換は当技術分野で周知のどんな特徴にも基づくことができる。そして例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどのアミノ酸側鎖置換の相対的な同一性または類似性を含む。特別な態様において、保存的な置換(すなわち、似た性質を有するアミノ酸残基による置換)が、Nrkをエンコードしているアミノ酸配列の中で行われる。

アミノ酸置換を行う際には、アミノ酸の疎水性親水性指数が考慮され得る。タンパク質に生物学的機能を相互的に与えることへの疎水性親水性アミノ酸指数の重要性は、通常当技術分野で理解されている(Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105参照)。アミノ酸の相対的な疎水性親水性の特徴が、得られるタンパク質の二次構造に寄与すると認められている。そしてそれは、タンパク質と他の分子(例えば酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原など)との相互作用を順々に定める。

それぞれのアミノ酸に、その疎水性および電荷の特徴に基づいて疎水性親水性指数が割り当てられ(Kyte and Doolittle (1982) supra)、そしてそれらは:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);トレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタミン酸塩(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパラギン酸塩(−3.5);アスパラギン(−3.5);リジン(−3.9);およびアルギニン(−4.5)である。

アミノ酸の置換は親水性に基づいて行われることも、当技術分野で理解されている。米国特許第4,554,101号は、最も大きなタンパク質の局所平均親水性は、その隣接するアミノ酸の親水性に支配されるように、タンパク質の生物性質と相関すると示している。

米国特許第4,554,101号に詳細に記述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられる:アルギニン(+3.0);リジン(±3.0);アスパラギン酸塩(+3.0±1);グルタミン酸塩(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);トレオニン(−0.4);プロリン(−0.5±1);アラニン(−0.5);ヒスチジン(−0.5);システイン(−1.0);メチオニン(−1.3);バリン(−1.5);ロイシン(−1.8);イソロイシン(−1.8);チロシン(−2.3);フェニルアラニン(−2.5);トリプトファン(−3.4)。

本発明の単離された核酸は、RNA、DNA(cDNAも含む)およびそれらのキメラを含む。単離された核酸は、さらに修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むことができる。

Nrkをエンコードする単離された核酸は適切な発現制御配列、例えば、転写/翻訳制御シグナルおよびポリアデニル化シグナルと付随することができる。

当然のことながら、様々なプロモーター/エンハンサー要素を、所望のレベルおよび組織特異的発現に依存して使用することができる。プロモーターは、構造性または誘導性(例えば、メタロチオネインプロモーターまたはホルモン誘導性プロモーター)になることができ、所望の発現パターンに依存する。プロモーターは固有または異質であり得、また天然または合成の配列でよい。異質によって、中に転写開始領域が導入された野生型宿主で見い出されないことが意図される。プロモーターは興味のある標的細胞の中で機能するように選ばれる。特別な態様において、プロモーターは、腫瘍細胞、または大規模タンパク質生成の目的でNrkをエンコードする核酸を発現させるために使われる細胞内で機能する。同様に、プロモーターはそれらの細胞および組織に特有であり得る(すなわち、有意な活性を特異的細胞または組織タイプのなかで示すのみである)。

例えば、Nrkコード配列サイトメガロウイルス(CMV)の主要最初期プロモーター、アルブミンプロモーター、伸長因子1−α(EF1−α)プロモーター、PγKプロモーター、MFGプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、またはグリセルアルデヒド−3−リン酸塩プロモーターと作動的に関連することができる。

さらに、特異的開始シグナルは通常、挿入されたタンパク質コード配列の有効な翻訳のために必要とされる。ATG導入コドンおよび隣接する配列を含むことができるこれらの翻訳制御配列は、様々な天然および合成両方の起源であり得る。

Nrkは直接だけでなく、異種ポリペプチド(すなわち分泌および/またはNrkの精製を促進する他のポリペプチドのためのシグナル配列)を伴う融合タンパク質としても発現できる。一態様において、異種ポリペプチドは異種ポリペプチドをNrkから除去するために特異的切断部位を有する。

一般に、シグナル配列はベクターの構成要素となることができ、および宿主細胞によって認識および処理される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)べきである。原核生物における生成のために、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、または熱安定エンテロトキシンIIリーダーからの原核生物のシグナル配列を使うことができる。酵母分泌のために、例えば、酵母インベルターゼ、アルファ因子、または酸性ホスターゼリーダー、Candida albicansグルコアミラーゼリーダー(EP 362,179)などを使うことができる(例えば、国際公開パンフレットWO 90/13646参照)。哺乳類細胞発現において、あるいは同種または近縁種の分泌されたポリペプチドからのシグナル配列ならびにウイルス分泌性リーダー、例えば、単純ヘルペスグリコタンパク質Dシグナルを、使うことができる。

他のNrkに融合することのできる有用な異種性のポリペプチドは、融合タンパク質の発現、または溶解度を増やすもの、あるいは親和性精製の中でリガンドとして作用することによって融合タンパク質の精製を助けるものを含む。典型的な融合発現ベクターは、ここに例証されたものならびに、pMAL(New Engl Biolabs, Beverly, Mass.)およびpRIT5(Pharmacia, Piscataway, NJ)を含む。これらは、それぞれマルトースE結合タンパク質またはタンパク質Aを標的組換えタンパク質と融合する。

Nrkをエンコードする単離された核酸を、例えば、クローン化または他の研究室操作、組換えタンパク質の生成、および遺伝子送達の目的のためにベクターに組み入れられることができる。特別な態様において、ベクターは発現ベクターである。例示的なベクターは、細菌人工染色体、コスミド、酵母人工染色体、ファージ、プラスミド、脂質ベクターおよびウイルスベクターを含む。核酸コード配列、特にNrkコード配列を、発現、発現するまたは発現することという用語によって、配列は転写され、および任意に翻訳されることを意味する。典型的に、本発明のよると、コード配列の転写および翻訳は、ポリペプチドの生成をもたらす。

本発明の方法は、広範囲の宿主細胞においてNrkをエンコードする核酸を送達する手段、および任意に発現するための手段を提供し、この宿主細胞は分裂および非分裂細胞であって、in vitroの(例えば、大規模組換えタンパク質生成のため、またはスクリーニングアッセイに使うため)またはin vivoの(例えば、組換え大規模タンパク質生成のため、疾患のために動物モデルを作るため、および治療目的のため)のもの両方を含む。本発明の態様において、核酸は過渡的に標的細胞の中に発現することができるか、あるいは該核酸は安定して標的細胞の中に組み入れることができ、例えば、細胞のゲノムの中への組込みによる、または安定して維持されたエピソーム(例えば、エプスタイン・バーウイルス由来)からの持続的な発現による。

一つの側面として、本発明の単離された核酸、ベクター、方法および医薬処方の、Nrkをエンコードする核酸を対象に投与する方法における使用を見い出した。したがってこのように、Nrkを対象中でin vivo生成することができる。この対象は、Nrk欠如であり、また対象中の異質のNrkの生成は、いくらか治療効果に影響を与えることができる。治療目的で医薬処方およびNrkをエンコードする核酸を送達する方法を、本明細書中に記載する。

あるいは、単離されたNrkをエンコードする核酸を、核酸を対象によって発現し、およびNrkを生成し、ならびにそれから精製するよう(すなわち、組換えNrkタンパク質源として)対象に投与することができる。この態様によると、Nrkは体循環内に、または簡単に収集できてNrkをさらに精製することのできる別の体液(例えば、乳、リンパ、髄液、尿)内に、分泌する。さらに別の方法として、Nrkタンパク質は鳥類の中で生成し、蓄積し、好都合に卵タンパク質から単離することができる。

同様に、Nrkをエンコードする核酸は、スクリーニングアッセイまたは大規模組換えタンパク質生成の目的のために、過渡的にまたは安定して細胞培養システムの中に発現することができる。細胞は細菌、原生生物、植物、酵母、菌類、または動物の細胞であり得る。一態様において、細胞は動物細胞(例えば、昆虫、鳥類または哺乳類)であり、および別の態様において哺乳類細胞(例えば、線維芽細胞)である。

当業者にとって、本発明の単離された核酸を標的細胞または興味の対象に送達するために、あらゆる好適なベクターを使うことができることは明らかである。送達ベクターの選択は、標的宿主の年齢および種、in vitro対in vivo送達、所望の発現のレベルおよび持続、意図する目的(例えば、治療またはドラッグスクリーニングのため)、標的細胞または器官、送達の経路、単離された核酸のサイズ、安全上の懸念などを含む当技術分野で既知の多数の要因を元に行うことができる。

好適なベクターは、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アルファウイルス;ワクシニアウイルス;アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、または単純ヘルペスウイルス)、脂質ベクター、ポリリジンベクター、プラスミドなどの核酸分子と共に使われる合成ポリアミノポリマーベクターなどを含む。

ここで使われるように、用語ウイルスベクターまたはウイルス送達ベクターは、核酸送達媒体として機能するウイルス粒子を示し、およびビリオンの中に包まれたベクターゲノムを含む。あるいは、これらの用語は、ビリオンの不在下で核酸送達媒体として使われるときは、ベクターゲノムを示すのに使うこともできる。

組換えウイルスベクターの生成および核酸送達へのウイルスベクターの使用の手順は、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989)および他の標準的なラボラトリーマニュアル(例えば、Current Protocols in Human Genetics. John Wileyand Sons, Inc.: 1997中のVector for Gene Therapy)の中に見つけることができる。

ウイルスベクターの特定な例は、核酸の送達のために以前用いられたウイルスベクターであって、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、AAV、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスベクターを含む。

本発明のある態様において、送達ベクターはアデノウイルスベクターである。ここで用いられる用語アデノウイルスは、MastadenovirusおよびAviadenovirus属を含む全てのアデノウイルスを包含することを意図している。現在までに、少なくとも47のアデノウイルスのヒト血清型が特定されている(例えば、Fields, et al., Virology, volume 2, chapter 67 (3d ed., Lippincott-Raven Publishers参照)。一態様において、アデノウイルスはヒトセログループCアデノウイルスであり、別の態様において、アデノウイルスはセログループ2(Ad2)またはセログループ5(Ad5)またはAdC68などのシミアンアデノウイルスである。

当業者は、Douglas, et al. (1996) Nature Biotechnology 14:1574および米国特許第5,922,315号、第5,770,442号および/または第5,712,136号に記述されるように、ベクターを変更または標的にすることができることを正しく評価するであろう。

アデノウイルスゲノムを、関心のある核酸をエンコードおよび発現するが、正常な溶解性ウイルスのライフサイクルの中で複製する能力に関して不活性化されるように操作することができる。。例えば、Berkner, et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld, et al. (1991) Science 252:431-434およびRosenfeld, et al. (1992) Cell 68:143-155参照。

組換えアデノウイルスは、特定の状況で非分裂細胞を感染することができないので有利になり得、上皮細胞を含む広範の細胞型を感染させることに使うことができる。さらに、ウイルス粒子は比較的安定していて、および精製および濃縮を受け入れることができ、ならびに感染力の範囲に影響するように変更することができる。さらに、導入されたアデノウイルスのDNA(およびそれに含まれた異質DNA)は、宿主細胞のゲノムに組み込まれないが、エピソームのままであり、それによって、導入されたDNAが宿主ゲノムに融合される状況で(例えば、レトロウイルスDNAと共に起こる)、挿入変異の結果として起こる潜在的な問題を回避する。さらに、異質DNAについてのアデノウイルスゲノムの運搬する能力は、他の送達ベクターに比べて大きい(Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol. 57:267)。

特別な態様において、少なくとも一つのアデノウイルスゲノム領域が機能性タンパク質をエンコードしないように、アデノウイルスゲノムはそこに欠失を含有する。例えば、アデノウイルスベクターE1遺伝子を有することができ、およびE1タンパク質(例えば、293細胞)を発現する細胞を使ってパックされる。この欠失の相補性は必要でないので、E3領域も頻繁に欠失させられる。さらに、E4、E2a、タンパク質IX、および線維タンパク質領域での欠失は、例えば、Armentano, et al. (1997) J. Virology 71:2408; Gao, et al. (1996) J. Virology 70:8934; Dedieu, et al. (1997) J. Virology 71:4626; Wang, et al. (1997) Gene Therapy 4:393; 米国特許第5,882,877号などによって記述されている。一般に、欠失はパッケージング細胞への毒性を避けるために選ばれる。宿主細胞への毒性、または他の有害な影響を避ける欠失の組み合わせが、当業者によって常に選ばれる。

典型的に、当業者は、E3遺伝子を除いては、どんな欠失も更なるウイルスを、例えばパッケージング細胞とのトランス相補性によって、繁殖(複製およびパッケージング)させるために相補である必要があることを正しく認識する。

本発明は基本的に、全てのアデノウイルスゲノム配列が失欠し、取り除かれたアデノウイルスベクターで実行することもできる(この用語が当技術分野で理解されるように、例えば、Lieber, et al. (1996) J. Virol. 70:8944-60参照)。

アデノ付随ウイルス(AAV)は、核酸送達ベクターとしても用いられている。概説については、Muzyczka, et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129参照。AAVはそれらのDNAを非分裂細胞に結合することのできる数少ないウイルスの一つで、およびヒト染色体19への安定した組込みを高頻度で示す(例えば、Flotte, et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski, et al., (1989) J Virol. 63:3822-3828; McLaughlin, et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973参照)。AAVベクターを使ってさまざまな核酸が異なる細胞型に導入される(例えば、Hermonat, et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford, et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin, et al. (1984) J. Virol. 51:611-619;およびFlotte, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790参照)。

当技術分野で知られるどの好適な方法も、本発明のNrkをエンコードする核酸を発現するAAVベクター発現を生成するのに使用することができる(具体的な方法については、例えば、米国特許第5,139,941号、第5,858,775号、第6,146,874号参照)。一つの特定方法で、ヘルパーアデノウイルスに感染したヒト細胞へのパッケージング機能をエンコードするrep/capベクターおよびAAV vDNAをエンコードするテンプレートの同時導入によって、AAV株を生成することができる(Samulski, et al. (1989) J. Virology 63:3822)。AAVrepおよび/またはcap遺伝子は代わりに、遺伝子を安定して発現するパッケージング細胞によって提供され得る(例えば、Gao, et al. (1998) Human Gene Thrapy 9:2353; Inoue, et al. (1998) J. Virol. 72:7024;米国特許第5,837,484号; 国際公開パンフレットWO 98/27207;米国特許第5,658,785号; 国際公開パンフレットWO 96/17947参照)。

本発明での利用のための別のベクターは、単純ヘルペスウイルス(HSV)である。HSVを、核酸を細胞に送達するために、長期遺伝子維持のために潜在機能のみを示すベクターを生成することで、変更することができる。HSVベクターは、核酸送達に有用である。なぜなら、それらは20キロベースまで、またはそれ以上の大きなDNAの挿入を可能にし、非常に高い力価と共に生成することができ、および中枢神経系の中に、溶菌サイクルが起こらないかぎり、長期間核酸を発現することを示してきたからである。

本発明の他の特定な態様において、関心のある送達ベクターは、レトロウイルスである。複製欠陥レトロウイルスのみを生成する特殊化した細胞株(パッケージング細胞と呼ばれる)の発達により、レトロウイルスの遺伝子治療への有用性が増加し、および欠陥レトロウイルスは、遺伝子治療目的での遺伝子移入の利用で特徴づけられる(概説については、Miller (1990) Blood 76:271参照)。複製欠陥レトロウイルスは、基本技術によるヘルパーウイルスの利用を通して、標的細胞を感染させることに使用することのできるビリオンに包むことができる。

上に説明した方法などのウイルス移入方法に加えて、非ウイルス方法も用いることができる。核酸移入の多くの非ウイルス方法は、巨大分子の取り込みおよび細胞内輸送のために、哺乳類細胞によって用いられる通常のメカニズムに頼る。特別な態様において、非ウイルス核酸送達システムは、標的細胞による核酸分子の取り込みのためのエンドサイトーシス経路に頼る。この種類の例示的な核酸送達システムは、リポソーム由来のシステム、ポリリジン接合体、および人工ウイルス外被を含む。

特別な態様において、プラスミドベクターを、本発明の実施に使用する。裸のプラスミドは、筋細胞組織への注入によって筋細胞へ導入できる。陽性細胞の数は典型的に低いが、発現は何ヶ月にもわたり得る(Wolff, et al. (1989) Science 247:247)。陽イオン性脂質は、培養下のいくつかの細胞に核酸を導入することに役立つことが明示されている(Felgner and Ringold (1989) Nature 337:387)。マウスの循環内への陽イオン性脂質プラスミドDNA複合物の注入により、肺でのDNAの発現が生じることを示している(Brigham, et al. (1989) Am. J. Med. Sci. 298:278)。プラスミドDNAの一つの長所は、非複製細胞に導入できることである。

代表的な態様において、核酸分子(例えば、プラスミド)は、表面に正電荷を帯びている脂質粒子に封入され得、任意に、標的組織の細胞表面抗原により標識を付され得る(Mizuno, et al. (1992) No Shinkei Geka 20:547; 国際公開パンフレットWO 91/06309; 日本国特許出願(Japanese patent application)1047381; および欧州特許公開EP-A-43075)。

両親媒性カチオン分子からなるリポソームは、in vitroおよびin vivoでの核酸送達に有用な非ウイルスベクターである(Crystal (1995) Science 270:404-410; Blaese, et al. (1995) Cancer Gene Ther. 2:291-297; Behr, et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:382-389; Remy, et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:647-654; およびGao, et al. (1995) Gene Therapy 2:710-722に掲載)。静電相互作用によって正電荷を持つリポソームが負電荷を持つ核酸と複合し、脂質:核酸複合体を形成すると信じられている。

この脂質:核酸複合体は、核酸移入ベクターとしていくつかの長所を有する。ウイルスベクターと違い、脂質:核酸複合体は、基本的にサイズ無制限の発現カセットを移入するために使うことができる。該複合体は、タンパク質を欠いているので、より少ない免疫原性および炎症反応を引き起こし得る。さらに、感染剤を形成するために複製または組換えができず、また組込み頻度が低い。両親媒性陽イオン性脂質がin vivoおよびin vitroの核酸送達を仲介できると、多くの刊行物が明示している(Felgner, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-17; Loeffler, et al. (1993) Methods in Enzymology 217:599-618; Felgner, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:2550-2561)。

上に示したように、Nrkポリペプチドは、様々な目的(例えば、スクリーニングアッセイ、大規模タンパク質生成、精製されたNrkの送達を基にする治療方法)のために、Nrkをエンコードする核酸を発現する培養細胞、または生物内で生成し、および任意にそこから精製することができる。

特別な態様において、Nrkをエンコードする単離された核酸を組換えタンパク質生成のために培養細胞、例えば、一次または細胞株の細胞に導入することができる。組換え細胞を、細胞または細胞培養液から集められたNrkポリペプチドを生成するのに使うことができる。同様に、組換えタンパク質を、基本的にバイオリアクターとして使われる生物(例えば、微生物、動物または植物)の中で生成し、および任意にそこから精製することができる。

一般的に、単離された核酸は(ここに記述されるように、ウイルスまたは非ウイルスの)発現ベクターに組み入れられる。様々な宿主細胞に適合する発現ベクターは、当技術分野で周知であり、また核酸の転写および翻訳のための好適な要素を含む。典型的に、発現ベクターは発現カセットを含み、それは、5’から3’への方向で、プロモーター、協同的にプロモーターと関連するNrkをエンコードするコード配列、および任意に、RNAポリメラーゼのためのストップシグナル、およびポリアデニラーゼのポリアデニル化シグナルを含む終止配列を含む。

発現ベクターは、原核細胞または真核細胞でのポリペプチドの発現のためにデザインすることができる。例えば、ポリペプチドは大腸菌、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現システム内)、酵母細胞または哺乳類細胞などの細菌細胞に発現することができる。いくつかの好適な宿主細胞は、Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CAにて議論されている。酵母S. cerevisiaeにおける発現のためのベクターの例は、pYepSecl(Baldari, et al. (1987) EMBO J. 6:229-234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943)、pJRY88(Schultz, et al. (1987) Gene 54:113-123)、およびpYES2(INVITROGEN Corporation, San Diego, CA)を含む。培養昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)の中で核酸の発現タンパク質を生成するのに利用できるバキュロウイルスベクターは、pAcシリーズ(Smith, et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165)およびpVLシリーズ(Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39)を含む。

哺乳類発現ベクターの例は、pCDM8(Seed (1987) Nature 329:840)およびpMT2PC(Kaufman, et al. (1987) EMBO J. 6:187-195)を含む。哺乳類細胞の中で使われるとき、発現ベクターの制御機能はよく、ウイルス調節要素によって提供される。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40から派生する。

ここで論じられる調節制御配列に加えて、組換え発現ベクターは、追加のヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、組換え発現ベクターは、ベクターを組み入れた宿主細胞を同定するために、選択可能なマーカー遺伝子をエンコードすることができる。

ベクターは、従来の変換または移入技術を介して原核生物または真核細胞に移入することができる。ここで使われるように、用語、変換および移入は、宿主細胞に異質核酸(例えば、DNA)を導入するための多様な当技術分野で認識された技術を示し、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、DEAEデキストラン仲介移入、リポフェクション、電気穿孔、微量注入、DNA付加リポソーム、リポフェクタミンDNA複合体、細胞超音波処理、高速微粒子銃を使った遺伝子照射、およびウイルス仲介移入を含む。宿主細胞の変換または移入の好適な方法は、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989))、および他のラボラトリーマニュアルに見られる。

細胞(特に、哺乳類細胞)の小さな領域だけがしばしば、異質DNAをそれらのゲノムに組み込む。それらの組込み体を同定するためおよび選ぶために、選択可能なマーカーをエンコードする核酸(例えば、抗生物質体制)を、関心のある核酸と共に宿主細胞に導入することができる。特別な態様において、選択可能なマーカーは、G418、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートなどの薬物への耐性を与えるものを含む。選択可能なマーカーをエンコードする核酸を、関心のある核酸を含むベクターと同じベクター上の宿主細胞に導入することができ、または別のベクターの上に導入することもできる。導入した核酸を安定して移入された細胞は、薬物の選択によって同定することができる(例えば、他の細胞は死ぬが、選択可能なマーカー遺伝子に組み込んだ細胞は生存する)。

組換えタンパク質を、タンパク質をエンコードする単離された核酸が核または色素体ゲノムに挿入された遺伝子導入植物の中に生成することができる。植物形質転換は、当業者に知られている。一般的に、Methods in Enzymology Vol. 153 (Reconbinant DNA Part D) 1987, Wu and Grossman Eds., Academic Pressおよび欧州特許出願EP 693554参照。

本発明はさらに、本発明のスクリーニング方法および大規模タンパク質生成方法での使用のために、Nrkをエンコードする単離された核酸を含有する培養または組換え細胞を提供する(例えば、Nrkはその細胞から生成および収集し、任意に、精製する)。特定な一態様において、本発明は、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを同定するためのスクリーニングアッセイでの使用のために、上述のように、Nrkをエンコードする単離された核酸を含有する培養細胞を提供する。また、治療上効果的な量のNrkをエンコードする単離された核酸を対象に投与することを含む方法によってin vivoで生成される細胞も提供する。

in vitroスクリーニングアッセイおよび治療投与のために、Nrkポリペプチドを培養細胞から精製することができる。該ポリペプチドは分泌シグナルなしで直接発現されたとき、宿主細胞溶解物からも回収できるが、典型的に分泌ポリペプチドとして培養液から回収する。ヒト起源のもの以外の組み替え細胞内でNrkが発現されたとき、Nrkは完全にヒト起源のタンパク質またはポリペプチドフリーである。しかしながら、実質的にNrkについて均一な調製物を得るために、組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからNrkを精製することが必要である。

第一段階として、微粒子状細胞破片を取り除くために、培養液または溶解液を遠心分離する。そして、その膜および可溶性タンパク質分屑を分離する。そして、Nrkを可溶性タンパク質分屑から精製することができる。そしてNrkをその後、例えば、以下の好適な精製手順により、可溶性タンパク質およびポリペプチドの混入物質から精製することができる:免疫親和性または陰イオン交換カラムでの分割;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカまたはDEAEなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィ;クロマトフォーカシング;SDS−PAGE;硫安塩析;例えば、Sephadex G-75を使ったゲルろ過;リガンド親和性クロマトグラフィ、およびIgGなどの混入物質を除くための、タンパク質Aセファロースカラムによる。

Nrkがチアゾフリンをリン酸化し、それによってそれを活性化する第一段階を行うことから、Nrkによるリン酸化および続くアデニリル化の際にIMPDHを制御する化合物を同定するのに有用な標的である。IMPDH酵素の阻害剤が非ウシウイルス性下痢ウイルス剤として機能すること(Stuyver, et al. (2002) Antivir. Chem. Chemother. 13(6):345-52);IMPDHの阻害剤がB型肝炎レプリコンコロニー形成効率を妨害すること(Zhou, et al. (2003) Virology 310(2):333-42);ならびに、活性化されたときにチアゾフリン(Cooney, et al. (1983) Adv. Enzyme Regul. 21:271-303)およびベンズアミンリボシド(Krohn, et al. (1992) J. Med. Chem. 35:511-517)がIMPデヒドロゲナーゼを制御することが示されていることから、Nrkおよび薬物スクリーニングのためのニコチンアミドリボシド経路を使うことによって、抗がんおよび抗ウイルス剤が同定されると考えられる。したがって、本発明の別の側面は、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを同定する方法を提供する。ここで使われるように、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグは、Nrkによってリン酸化されるとき、最終的に細胞死または坑ウイルス性活性をもたらすニコチンアミドリボシドのあらゆる類似体(例えば、チアゾフリンおよびベンズアミンリボシド)である。

一態様において、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグは、単離されたNrkポリペプチドを使った細胞フリーアッセイで同定される。本発明のこのスクリーニングアッセイに関連するこの段階は、Nrkポリペプチドの単離または精製;単離されたNrk、およびATP、Mg−ATP、Mn−ATP、Mg−GTPまたはMn−GTPなどの好適なリン酸塩ドナーを含有するプレートにおける、ウェルなどの作用点への少なくとも一つのニコチンアミドリボシド関連検査薬の接触または付加;前記検査薬が前記Nrkポリペプチドによってリン酸化するかどうかの決定を含み、ここで、前記検査薬のリン酸化がニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを示す該剤と共に、または後にリン酸塩ドナーを追加することができ、および、ここに例証されたようなリン酸化のために、該アッセイを好適なアッセイ条件下で行うことができる。

細胞フリーアッセイに関して、検査薬は合成することができるか、さもなければ、プラスチック製のピン、ガラス製のスライド、プラスチック製のウェルなどの固体基質に付着させることができる。さらに、単離されたNrkは、溶液中に遊離させる、固体支持体に付着させる、または細胞表面上に発現させることができる。

もしくは、マトリックスへのNrkの結合を容易にするために、Nrk融合タンパク質を提供する。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)、または後に検査薬と結合するグルタチオン被覆マイクロタイタープレートに吸着させることができ、ならびに複合体形成および上に記載されたリン酸化に貢献する条件下(例えば、塩およびpHの生理的状況)で混合物を培養する。

別の態様において、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを細胞に基づいたアッセイで同定する。本発明のこのスクリーニングアッセイに関連する段階は、Nrkポリペプチドを発現する第一の被検細胞をニコチンアミドリボシド関連検査薬に接触させること;機能性Nrkポリペプチドを欠いている第二の被検細胞を同じ検査薬に接触させること;および第一のおよび第二の被検細胞の生存率を決定することを含み、ここで第二の細胞でなく第一の細胞の感度または細胞死がニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを示す。この細胞に基づいたアッセイは、細菌、酵母、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現システムと共に)、鳥類細胞、哺乳類細胞、または植物細胞を含む、あらゆる好適な細胞を使っても行うことができる一方、特別な態様において、被検細胞は哺乳類細胞である。

さらなる態様において、前記細胞は機能的内因性Nrkを欠いている(例えば、内因性Nrkは除去または変異されているか、あるいは該細胞はNrkを発現しない)。検査薬への暴露の際、変換された細胞の生存率を、いかなる活性を欠いている第二の被検細胞とも比較できるように、前記第一の被検細胞は外因性Nrkを含有する発現ベクターと変換するか、あるいは移入する。したがって、Nrkに依存する方法で、検査薬が活性化されているかどうかを確認できる。組換えNrkを発現するように変更された細胞を、過渡的にまたは安定してNrkをエンコードする核酸と変換することができる。安定して変換された細胞を、その生物のゲノムへの安定した組み込みによって、または安定して維持するエピソームからの発現によって発生させることができる(例えば、エプスタイン・バーウイルス由来のエピソーム)。

細胞生存率を決定する好適な方法は当技術分野でしっかり確立されている。一つのかかる方法は、無傷な細胞膜または活性細胞代謝によって細胞に入り込まない非浸透性色素(例えば、ヨウ化プロピジウム、7−アミノアクチノマイシンD)を使う。損傷した原形質膜、または障害性/無細胞代謝を伴う細胞は、色素がその細胞に入り込むことを防ぐことができない。一旦細胞内に入ると、細胞を生育不能だと同定する高蛍光性の付加物を生成する細胞内構造体に色素が結合する。代わりに、非蛍光性の基質を高蛍光性の産物(例えば、フルオレッセイン二酢酸塩)に変換すること引き起こす活性細胞代謝のためのアッセイをすることによって、細胞生存率を決定する。

本発明のスクリーニング方法の被検細胞は、培養時間、光学濃度、播種密度および培地組成物が、細胞の栄養的および生理的な要求に対応している標準条件下で培養することができる。しかしながら、被検細胞の維持および増殖のための条件は、本発明のスクリーニング方法の中で候補剤をアッセイするための条件とは異なることができる。当技術分野で知られるどの技術も、最適条件を確立するために適用することができる。

本発明のスクリーニングアッセイは、例えば、96ウェルの種類のマルチウェルプレートなどの中で、複数の反応の準備および処理を迅速に行わせるどんなフォーマットでも実行することができる。剤の貯蔵液ならびにアッセイ成分を手動で調製し、および全ての続くピペットでの移行、希釈、混合、洗浄、培養、サンプル読み取り、およびデータ収集を、商業的に入手可能なロボットピペット機器、自動ワークステーション、およびアッセイの結果を検出する為の分析機器を使って行う。

上で提供された試薬に加え、様々な他の試薬を、本発明のスクリーニングアッセイに含むことができる。これらは、塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、洗剤などの試薬を含む。また他に、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのアッセイの効率を上昇する試薬も使うことができる。

スクリーニングアッセイを、動物のin vivoで行うことができる。したがって、まださらなる側面として、本発明は、当技術分野で周知の方法に従って生成することのできるNrkをエンコードする単離された核酸を含有する遺伝子導入非ヒト動物を提供する。遺伝子導入した非ヒト動物は、鳥類および非ヒト哺乳類を含むどんな種でもあり得る。本発明の側面に従って、好適な非ヒト哺乳類は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ブタおよびウシを含む。癌、ウシ下痢ウイルス感染またはC型肝炎ウイルス感染のための哺乳類モデルもまた、使うことができる。

Nrkをエンコードする核酸は、遺伝子導入した動物の細胞内に安定して組み入れられる(典型的に、ゲノムの中への安定した組込みによって、または安定して維持されたエピソームのコンストラクトによって)。全ての細胞が導入遺伝子を含む必要はなく、および動物が有用なスクリーニング手段であるために(例えば、検査薬の投与が検出可能な細胞死または坑ウイルス活性を引き上げるために)、十分な数の細胞がNrk導入遺伝子を含む、または発現する限り、動物が変更したおよび変更されていない細胞のキメラになり得る。

遺伝子導入動物を生成する方法は、当技術分野で知られている。遺伝子導入動物を作るために、鳥類または哺乳類の生殖系列にDNAコンストラクトを導入することができる。例えば、基本遺伝子導入技術によって、一つまたはいくつかのコンストラクトのコピーを胚ゲノムに組み入れることができる。

例示的な態様で、遺伝子導入非ヒト動物を、非ヒト動物の生殖系列に移入遺伝子を導入することによって生成する。様々な発生段階で、胚標的細胞に移入遺伝子を導入することができる。異なる方法を、胚標的細胞の発生段階に依存して使用する。可能ならば、使用されたどの特定の動物系統も一般的な健康、良好な胚の収率、胚内の良好な前核の視感度、および良好な生殖適応度を選択するべきである。

胚への移入遺伝子の導入は、マクロインジェクション、電気穿孔、リポフェクションまたはウイルスベクターなどの、当技術分野で知られた様々な方法のいずれかによって達成することができる。例えば、1つまたは2つ以上のコンストラクトのコピーを成長する哺乳類の細胞の中に保持することを招くために、哺乳類の受精卵の前核へのコンストラクトのマクロインジェクションによって、哺乳類へ移入遺伝子を導入することができる。遺伝子導入コンストラクトの受精卵への導入に続いて、該卵を、in vitroで様々な期間培養するか、または代理宿主の中へ再移植する、あるいは両方行うことができる。一般的な一つの方法は、卵をin vitroで種に依存して約1〜7日培養し、そして代理宿主へ再移植する。

遺伝子導入操作された胚の子孫を、組織のセグメントのコンストラクトの存在について試験する行うことができる(例えば、サザンブロット解析による)。1つまたは2つ以上の、ゲノムに安定して結合する外因性クローン化コンストラクトのコピーを有する胚を、遺伝子導入で加えられたコンストラクトを含んでいる永久遺伝子導入動物系統を確立することに使うことができる。

遺伝子導入で改造した動物を、子孫のゲノムへコンストラクトを組み入れのために、出生後にアッセイすることができる。これは、子孫からの染色体材料上にポリペプチドまたはそのセグメント用にコードするDNA配列に対応するプローブをハイブリダイズすることによって行うことができる。それらのゲノム内に少なくとも一つのコンストラクトのコピーを含んでいることが分かったこれらの子孫が成熟する。

遺伝子導入鳥類を生成する方法は、当技術分野で知られている、例えば、米国特許第5,162,215号参照。

ニコチンアミドリボシド関連検査剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む多種多様な源から得ることができる。かかる剤は、チアゾフリンおよびベンズアミンリボシドおよびそれらの類似体または誘導体だけでなく、ニコチンアミドリボシドの類似体または誘導体も含むことができる。

代わりに、単離されたNrkポリペプチドは、Nrkの結晶構造を発生するのに使うことができ、および合成ニコチンアミドリボシド類似体をデザインすることもできる。大腸菌panKの結晶構造を基に、パントテン酸キナーゼのホスホリル基移入の移行期安定で重要な役割を果たすと思われる(Yun, et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:28093-28099)。したがって、対応するNrk突然変異体、例えば、NRK2−E100Qを、Nrkおよびヌクレオチド間の安定複合体を発生させるのに使うことができると考えられる(すなわち、Nrk2−E100Q+ニコチンアミドリボシド+ATPは結晶化するのに十分安定であることができる)。

代わりに、Nrkは、ATP擬態化合物(例えば、AMP−PNHPおよびAMP−PCH2P)などの阻害剤の存在下で、安定複合体を生成することができる。代謝物キナーゼのために、二基質阻害剤はとてもうまく利用されてきた。例えば、反応dTMP+ATP−>dTDP+AMPを行うチミジル酸キナーゼは、dTpppppAによって強度に阻害され(Bone, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:16410-16413)、また結晶構造を、この阻害剤と共に得る(Lavie, et al. (1998) Biochemistry 37:3677-3686)。

最良の阻害剤は典型的に、二つの結合した基質よりも、一つまたは二つ多くののリン酸塩類を含むことが示された(すなわち、dTppppAは基質としてdTpppppAほど良くない)。アデノシンキナーゼによる結果と同じタイプに基づいて(Bone, et al. (1986) supra)、NrppppA(すなわち、二つの余分なリン酸塩類を有するNAD+類似体)は、NrpppA(すなわち、一つの余分なリン酸塩を有するNAD+類似体、または、実際にはニコチンアミドリボシド+AppNHp)よりも良い阻害剤であることが考えられる。余分なリン酸塩類を有するNAD+類似体を、多種多様のアデニリル化ジヌクレオシドポリリン酸塩類を作るように最適化された(Fraga, et al. (2003) FEBS Lett. 543:37-41)標準酵素方法(例えば、Guranowski, et al. (1990) FEBS Lett. 271:215-218参照)の利用によって生成することができる、すなわち、Nrpp(ニコチンアミドリボシド二リン酸塩)およびNrppp(ニコチンアミドリボシド三リン酸塩)のホタル発光酵素−AMPとの反応を使って発生することができる。NMN(Nrpp)の二リン酸化形は、ウリジル酸キナーゼまたはシチジル酸(cytidylate)キナーゼどちらかを用いて調製する(NMN+ATP−>Nrpp)。NMN(Nrppp)の三リン酸化形をその後、ヌクレオシド二リン酸塩キナーゼを用いて調製する(Nrpp+ATP−>Nrppp)。得られる阻害剤はそして、結晶化試験で使用し、および/またはNrk結晶に浸す。

一旦Nrkの立体構造が決定すると、有望な検査剤を、GRAM、DOCK、またはAUTODOCKなどのドッキングプログラムを使用するコンピューターモデリングの利用を通して検査することができる(Dunbrack, et al. (1997) Folding & Design 2:27-42)。この手順は、有望なリガンドの形および化学構造がどれだけ良くNrkと相互作用するかを確かめるために、Nrkに有望な剤のコンピューターフィッティングを含むことができる。コンピュータープログラムは、検査薬の引力、反発、および立体障害を予測するために用いることもできる。一般的に、適合が厳密であるほど(例えば、立体障害が低いほど、および/または引力が大きいほど)、これらの特性はより強い結合拘束と一致しているから剤がよりよい基質になる。さらに、有望な検査剤のデザインがより特有であるほど、該剤が関連する哺乳類タンパク質を妨害しない可能性が高い。これは他のタンパク質との好ましくない相互作用による潜在的な副作用を最小限にする。

本発明の別の側面は、癌であるか癌であると疑われる患者の癌を、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグと組み合わせた単離された核酸、送達ベクター、または本発明のポリペプチドを用いて処置する方法である。核酸、送達ベクター、または本発明のポリペプチドの被験者または動物への投与は、核酸、ベクター、またはポリペプチドの投与の当技術分野で周知されているどの方法でもあり得る。ここで使われる患者は、ヒト、農業上重要な動物、ペットまたは動物学上の動物などのどの哺乳類も含むことを意図する。癌であるか癌であると疑われる患者は、癌の兆候または症状を示す、または遺伝、環境または天然の理由により、癌であると疑わしい患者である。Nrkをエンコードする核酸、同じものを含有するベクター、またはNrkポリペプチドは、対象に癌の兆候または症状(例えば、腫瘍サイズ、衰弱の感覚、および痛みの認識)を減少、軽減、または排除するのに有効量で投与することができる。癌の兆候または症状の減少、軽減、排除の所望の結果を達成するのに必要とされる剤の量は、剤の医薬組成物、患者およびその患者の状態、投与の様式、防がれるまたは処置する状態または疾患のタイプ、患者の年齢および種、特定のベクター、ならびに送達する核酸に依存し、通常の方法で測定することができる。

プロドラッグおよびNrk核酸、送達ベクター、またはポリペプチドを付随して送達することができる一方、他の態様においてNrk核酸、送達ベクター、またはポリペプチドは最初に提供し、活性化されたまたは有毒な薬物を生じるように細胞をあらかじめ調整するためのプロドラッグの投与が続く。

本発明の方法に従って処置することのできる癌の種類は、膵臓癌、子宮内膜癌、肺の小細胞および非小細胞癌(扁平上皮、腺および大細胞タイプを含む)、頭および首の扁平上皮細胞癌、膀胱、卵巣、子宮頸部、胸、腎臓、CNS、および大腸癌、脊髄性およびリンパ性白血病、リンパ腫、肝腫瘍、髄液甲状腺癌腫、多発性髄液腫、黒色腫、網膜芽腫、および軟部組織および骨の肉腫を含むが、これらに限定されるものではない。

典型的に、ウイルスベクターに関して、少なくとも約10個のウイルス粒子、少なくとも約10個のウイルス粒子、少なくとも約10個のウイルス粒子、少なくとも約10個のウイルス粒子、少なくとも約1011個のウイルス粒子、少なくとも約1012個のウイルス粒子、または少なくとも約1013個のウイルス粒子が一回の処置につき患者に投与する。典型的な服用はウイルス約10〜約1015個の粒子、約10〜約1014個の粒子、約10〜約1013個の粒子、約1010〜約1015個の粒子、約1011〜約1015個の粒子、約1012〜約1014個の粒子、または約1012〜約1013個の粒子のウイルス力価である。

本発明の特別な態様において、2回以上の投与(例えば、2、3、4回、又はそれ以上の投与)を、核酸発現の治療レベルに達成するために、多様な時間間隔(例えば、一時間ごと、一日ごと、一週間ごと、一ヶ月ごと、など)にわたって用いることができる。

チアゾフリンは、最初にジチジンデアミナーゼ阻害剤を合成するためのヌクレオシド類似体である。チアゾフリンは、GTPおよびdGTP生成における律速酵素であるIMPデヒドロゲナーゼを阻害するNAD+の類似体であるTADに細胞酵素によって変換されるプロドラッグであることが示された。(Cooney, et al. (1983) supra)。急性白血病のフェーズI/フェーズII試験において、チアゾフリンは85%もの高い反応率を生じ、および促進段階または急性転化におけるCMLの処置に対して希少医薬品の資格を交付された。培養細胞の処置により、チアゾフリンがアポトーシスの誘導によって選択的に癌細胞を殺すことを示した。活性は、dGTP上で活発な複製細胞の依存性の増加、および多くの変換遺伝子型の低分子量Gタンパク質を通したシグナルへの依存症に起因すると考えられる(Jayaram, et al. (2002) Curr. Med. Chem. 9:787-792)。

癌細胞系NCI−60パネルの感度の検査、およびチアゾフリンに関する文献は、特定の胸、腎臓、CNS、大腸および非小細胞の肺由来の腫瘍は最も感受性があり、一方同じ臓器部位からの他のものは最も耐性があることを示す(Johnson, et al. (2001) Br. J. Cancer 84:1424-1431)。ここで示されたように、ニコチンアミドリボシドのNAD+前駆体としての機能は、完全にNrk1に依存していて、およびヒトNrkは、少なくともチアゾフリンリン酸化において、ニコチンアミドリボシドリン酸化においてと同じくらい高い比活性を有する。Nrk2発現が筋肉に特有であるので(Li, et al. (1999) supra)、そしてNrk1は非常に低いレベルで発現するので(Boon, et al. (2002) supra)、NMN/NaMNATが制限されない一方、Nrk遺伝子発現による腫瘍の層形成が、チアゾフリン感度を大部分予測し、および明らかにすると考えられる。

したがって、本発明のさらなる側面は、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグによる処置の影響を受けやすい個体または腫瘍を同定する方法である。一態様において、個体または腫瘍内のNrkタンパク質のレベルは、イムノアッセイにおいてNrk特異的抗体の結合により検出する。別の態様において、Nrk酵素活性のレベルを、例えば、ここに開示されたニコチンアミドリボシドリン酸化アッセイを使って決定する。別の態様において、Nrk RNA転写物のレベルを、RNAのレベルを検出するための周知のRNAに基づいたアッセイを使って決定する。検出したら、Nrkのレベルを既知の基準と比較する。Nrkのレベルの変化は、標準と比較したように、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグによる処置への感受性の変化されたレベルを示す。なおさらなる態様において、Nrk遺伝子内の突然変異または多型性を同定することができ、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグによる処置への感受性のレベルの変化をもたらす。

ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを用いた、癌および他の疾患のための最適化された処置は、高いレベルのここで提供されたNrkを自然に持った細胞、または高いレベルのNrkを発現するように組換え技術によって作られた細胞に向けられる。これらの処置の安全性、特異性および有効性は、NAD+前駆体、すなわちトリプトファン、ニコチン酸、ニコチンアミド、またはニコチンアミドリボシドのいずれかの量の補給または制限によって調整することができる。

Nrkタンパク質レベルの検出のために、Nrkを特異的に認識する抗体を発生する。これらの抗体は、多クローン性または単クローン性いずれかであり得る。さらに、かかる抗体は天然のものであるか、または部分的または全部合成的に生成することができる。Nrkに特異的に結合する、またはNrkを認識する能力を維持する全てのフラグメントまたはそれらの誘導体(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)、scFv、Fv、またはFdフラグメント)もまた、含まれる。抗体は、あらゆる免疫グロブリン類のメンバーでもあり得、ヒト類:IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEのいずれかを含む。

Nrk特異的抗体は、標準的なクローン化および細胞融合技術を利用して発生させることができる。例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York参照。もしくは、特異的にNrkを結合する抗体はファージディスプレー方法によって得られる。ファージディスプレー抗体の生成方法は、当技術分野で周知である(例えば、Huse, et al. (1989) Science 246(4935):1275-81)。

Nrk特異的抗体の選択は、結合親和性に基づいていて、様々な周知のイムノアッセイによって決定する。それらは、酵素結合免疫吸着、免疫拡散化学発光、免疫蛍光、免疫組織化学、放射免疫アッセイ、凝集、補体結合、免疫電気遊動、および免疫沈澱アッセイなどを含み、in vitro、in vivoまたはin situで行うことができる。かかる標準的な技術は当業者に周知である(例えば、"Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition、Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell et al., "Methods and Immunology", W.A. Benjamin, Inc., 1964; およびOellerich, M.(1984) J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895-904参照)。

一旦完全に特異性について特徴付けられると、ELISA、ウエスタンブロット法、または免疫組織化学などの技術によって健康なおよび疾患した組織(すなわち、腫瘍)のNrkのレベルを評価するために、抗体を診断または予測方法に使うことができる。

Nrkタンパク質レベルを検出する一般的な方法は、特異的にNrkを結合させる抗体をサンプルに接触させること、非特異的相互作用を取り除く為にサンプルを洗浄すること、ならびに抗原を検出および/または定量するために使われるいくつもの周知のイムノアッセイだけでなく、上記のイムノアッセイのいずれかを使う抗体−抗原複合体を検出することを提供する(例えば、Harlow and Lane (1988) supra参照)。かかる周知のイムノアッセイは、抗体捕獲アッセイ、抗原捕獲アッセイ、および二抗体サンドイッチアッセイを含む。

Nrkをエンコードする核酸配列の検出のために、DNAに基づいた、またはRNAに基づいた方法のいずれかを用いることができる。Nrk遺伝子座の突然変異を検出するためのDNAに基づいた方法(すなわち、フレームシフト突然変異、点突然変異、ミスセンス変異、ノンセンス変異、スプライス突然変異、誘発された、天然または承継された起源の欠失または挿入)は、DNAマイクロアレイ技術、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(突然変異体および野生型)、PCRに基づいた配列、一本鎖DNA高次構造多型性(SSCP)分析、ヘテロ二本鎖分析(HET)、PCR、または変性勾配ゲル電気遊動をふくむが、これらに限定されるものではない。突然変異は例えば、配列クロマトグラム上に二重のベースコール(dual base call)として現れることができる。潜在的突然変異は複数の独立したPCR反応により確認する。本発明の診断方法に従って同定することができる例示的な単一ヌクレオチド多型は、ヒトNrk1にはNCBI SNP Cluster ID番号rs3752955、rs1045882、rs11519およびrs3185880、ならびにヒトNrk2にはCluster ID番号rs2304190、rs4807536およびrs1055767を含むが、これらに限定されるものではない。

NrkをエンコードするRNA転写物のレベルを検出するために、基本方法に従って、核酸を個体または腫瘍の細胞から単離する(例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York)。核酸は全細胞RNAであるか、またはPoly−A+に分画することができる。RNAを相補的DNA(cDNA)に変更することは望ましいかもしれない。通常、核酸は増幅される。

様々な方法が、個体または腫瘍から単離された核酸に存在するNrk RNA転写物のレベルを評価、または定量するために使うことができる。例えば、Nrk RNA転写物のレベルを、ノーザンブロット分析(例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York参照);オリゴヌクレオチドまたはcDNAがチップまたはウェーハー上で配列に構成されている、オリゴヌクレオチドまたはcDNAフラグメントハイブリダイゼーション;リアルタイムPCR分析、またはRT−PCR分析などの周知の方法を使って評価することができる。

かかる検出方法に有用な好適なプライマー、プローブ、またはオリゴヌクレオチドは、ここで提供するNrk核酸配列から、当業者によって発生させることができる。ここで定義される用語プライマーは、テンプレート依存性プロセスにおいて新生核酸の合成をプライムすることのできる、あらゆる核酸も含むことを意図している。典型的に、プライマーはオリゴヌクレオチド、長さ10〜20の塩基対であるが、より長い配列を用いることができる。プライマーは、二重鎖または一重鎖形で提供することができる。プローブはプライマーの役を果たすことができるが、異なって定義する。プローブはおそらくプライミングすることことができる一方、標的DNAまたはRNAに結合するようにデザインされていて、また増幅プロセスに使用する必要はない。一態様において、プローブまたはプライマーは例えば、放射性種(32P、14C、35S、H、または他の標識)またはフルオロフォア(ローダミン、フルオレッセイン)で標識する。用途に依存して、プローブまたはプライマーは非放射性、すなわち非標識で使われることができ、またRNAまたはcDNA分子が標識する。

フォーマットに依存し、検出は視覚的な方法で行うことができる(例えば、ジェルの臭化エチジウム染色)。代わりに、検出は、化学発光、放射標識または蛍光性の標識を解する、あるいは電気または熱インパルスシグナルを使うシステムを介する生成物の直接な同定に関係することができる(Bellus (1994) J. Macromol. Sci. Pure Appl. Chem. A311: 1355-1376)。

Nrk内の突然変異、あるいは個体または腫瘍内に存在するNrkのレベルの検出後、前記突然変異またはレベルを既知の対照または基準と比較する。既知の対照は、分析を行う個体または腫瘍に関連する診断または予測情報を提供するために、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグによる処置への感受性がある、または感受性を欠いている個体の統計上有意な参照グループであり得る。

ここで説明されるように、牛乳のタンパク質を取り除いたホエー画分から単離したニコチンアミドリボシドは、突然変異体内でのNRK1依存性増殖を援助するのに十分だった。したがって、ここで生じた突然変異体株は、栄養補助食品として利用されるニコチンアミドリボシドのための他の天然または合成源を同定するのに有用になる。したがって、本発明の別の側面は、かかる天然または合成源を同定する方法である。

該方法の第一段階として、機能性グルタミン依存性NAD+合成酵素を欠いている第一の細胞を、天然または合成源から単離された抽出物に接触させる。一態様において、その第一の細胞は、URA3プラスミドにQNS1遺伝子を有する、qns1突然変異体である(すなわち、NAD+合成酵素を有さない)。あらゆる細胞も使うことができる一方、特別な態様において、酵母細胞を本発明のこの方法に使う。ニコチンアミドリボシドが補われている限り、qns1突然変異体株は、5−フルオロウラシル酸上で通常の増殖をする(すなわち、URA3 QNS1プラスミドが治癒する)。

該方法の第二段階として、機能性グルタミン依存性NAD+合成酵素および機能性ニコチンアミドリボシドキナーゼを欠いている第二の細胞を、前の段階の天然または合成源からの同じ単離された抽出物に接触させる。qns1およびnrk1二重突然変異体を用いて、NRK1遺伝子がニコチンアミドリボシド上での増殖に必要であることがここで明らかにされた。qns1およびnrk1はニコチンアミドリボシドを伴っていても合成的に致死である。この破壊株は、効果的な栄養として、ニコチンアミドリボシド、NMNおよびNAD+を区別することを可能にするので、本発明のこのスクリーニングアッセイで有用である。

該方法の次の段階として、第一の細胞および第二の細胞の増殖を比較する。単離された抽出物がニコチンアミドリボシドを含んでいる場合、第一の細胞は増殖し、第二の細胞は増殖しない。

ニコチンアミドリボシドの合成源は、Merck、Glaxo、Bristol Meyers Squibb、Monsanto/Searle、Eli LillyおよびPharmaciaを含むほとんどの大きな化学会社から商業的に入手可能な化学製品のあらゆるライブラリーを含むことができる。ニコチンアミドリボシドの存在の検査に使用することのできる天然源は、牛乳、血清、肉、卵、果物および穀物を含むが、これらに限定されるものではない。天然源の単離された抽出物は、標準方法を使って調製することができる。例えば、天然源を、本発明の突然変異体株で検査する前に、粉砕し、または緩衝液の中で均質化し、細胞片を取り除くために遠心分離し、および塩、炭水化物、ポリペプチド、核酸などを取り除くために分画することができる。本発明のアッセイで陽性を示すニコチンアミドリボシドのどの源もさらに分画し、HPLCおよび質量分析の標準方法によって確認することができる。

ニコチン酸は、ヒトの低密度リポタンパク質コレステロールの制御、高密度リポタンパク質コレステロールの上昇、およびトリグリセリドおよびリポタンパク質レベルの低減において効果的な剤である(例えば、Miller (2003) Mayo Clin. Proc. 78(6): 735-42参照)。ニコチン酸処置は、全ての重要な脂質に対して望ましい方向に効果があり、また標的母集団の死亡率を低減することを示すが、熱および製剤の本質に大きく影響する「潮紅」と命名された赤みの副作用のためにその利用は限られている。さらに、ミトコンドリアNAD+レベルの上昇、およびPARPの阻害を含む複数のメカニズムのため、ニコチンアミドはモデルシステムの発作の損傷を防ぐ(Klaidman, et al. (2003) Pharmacology 69(3):150-7)。NAD+前駆体のレベルの変更は、遺伝子数の調節および酵母の寿命に影響することを示している(Anderson, et al. (2003) Nature 423(6936):181-5)。

したがって、NAD+生合成の発見されたニコチンアミドリボシドキナーゼ経路を経て作用する剤(例えば、ニコチンアミドリボシド)は、プラズマ脂質プロフィルの向上、発作の予防、および健全および健康を長くすることに治療価値を有することができた。したがって、本発明の別の側面は、NAD+生合成のニコチンアミドリボシドキナーゼ経路に関連する疾患または状態を、有効量のニコチンアミドリボシド組成物を投与することによって防ぐまたは処置する方法である。食事の補足、またはニコチンアミドリボシド組成物を用いた治療的処置療法によって予防または処置することのできる、NAD+またはNAD+前駆体レベルを典型的に変えてきた疾患または状態は、脂質障害(例えば、脂質障害、高コレステロール血症)、または高脂血症、発作、および老化を含むが、これらに限定されるものではない。有効量のニコチンアミドリボシドは、予防または処置している疾患または状態の兆候または症状を予防、低減、緩和または除去するものであり、疾患または状態によって異なる。処置療法の効果を評価するために、かかる兆候または症状は、ニコチンアミドリボシドを用いた処置の前または後に、熟練した臨床医によって評価することができ、投与量は適宜調節することができる。

NAD+代謝の変更は、特定な状態に対して最適化する必要があり得るので、ニコチンアミドリボシド処置をさらに、他のNAD+前駆体、例えば、トリプトファン、ニコチン酸および/またはニコチンアミドと一緒に使用することができると考えられる。

本発明の方法に従って生成または同定されたポリペプチド、核酸、ベクター、栄養補助食品(すなわちニコチンアミドリボシド)、およびニコチンアミドリボシド関連プロドラッグは、担体と一緒に活性薬を含有する組成物に便利に使用または投与する。かかる組成物は、方法によって調製することができ、本技術で周知の担体を含有する。かかる方法および成分の一般的に認められた概論は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, editor, 20th ed. Lippingcott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000である。液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒封入材料などの担体、薬学的に許容しうる担体、または媒体は、対象化合物を一つの臓器、または体の一部から他の臓器または体の一部へ運ぶまたは輸送することに関わる。それぞれの担体は、製剤の他の成分と互換性がある、および患者に有害でないという意味において容認されなければならない。

担体として働く物質の例は、ラクトース、グルコースおよびショ糖などの糖類;コーンスターチおよびジャガイモ澱粉などの澱粉;セルロース、およびカルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースの誘導体;粉末状のトラガカントゴム;麦芽;ゼラチン;タルク;カカオバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤、;落花生油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油;プロピレングリコールなどのグリコール類;グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどの多価アルコール;オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類;寒天;水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤;アルギン酸;無ピロゲン水;等張性食塩水;リンガー溶液;エチルアルコール;pH緩衝液;ポリエステル類、ポリカーボネートおよび/またはポリ無水物;および製剤において用いられる他の無毒性の互換性を持つ物質を含む。湿潤剤、乳化剤およびラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤の他に着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、香料添加物および芳香剤、防腐剤および酸化防止剤もまた、組成物中に存在することができる。

本発明の方法に従って生成または同定された、以降化合物と称される、ポリペプチド、核酸、ベクター、栄養補助食品、およびニコチンアミドリボシド関連プロドラッグは、あらゆる経路を介しても投与することができる。これらの経路は、経口、直腸、局所、口内(例えば、舌下)、膣、非経口(例えば、皮下、骨格筋、心筋、横隔膜筋および平滑筋を含む筋肉内、皮内、静脈内、腹膜内)、局所(すなわち、皮膚および気道面を含む粘膜表面の両方)、鼻腔内、経皮、関節内、鞘内および吸入投与、門脈内送達による肝臓への投与、ならびに直接臓器注入(例えば、肝臓へ、中枢神経系への送達のために脳へ)、を含むが、これらに限定されるものではない。あらゆる与えられた場合で最も好適な経路は、処置している状態の性質および重篤度、ならびに使われている特定の化合物の性質に依存する。

注入のために、担体は典型的に無菌の無ピロゲン水、無ピロゲンのリン酸緩衝生理食塩水、精菌水、またはクレモフォール(Cremophor)(BASF, Parsippany, N.J.)などの液体である。他の投与方法のために、担体は固体または液体のいずれかであり得る。

経口治療の投与のために、化合物を、一つまたは二つ以上の担体と組み合わせ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハース、チューインガム、食べ物などの形状で使うことができる。かかる組成物および調製物は、少なくとも0.1%の活性化合物を含有するべきである。化合物および調製物の割合はもちろん多様であり得、好都合にある単位投薬形状の重量の約0.1〜約100%であり得る。かかる組成物内の活性化合物の量は、効果的な投薬量レベルが得られる量である。

錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどはまた、以下のものを含むことができる。トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの接合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤;コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸などの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤;およびショ糖、フルクトース、ラクトース、またはアスパルテームなどの甘味剤、またはペパーミント、ウィンターグリーン油またはチェリーフレーバーなどの香料。上記のリストは代表的なものに過ぎず、当業者は、他の接合剤、賦形剤、甘味剤などを想定することができる。単位投薬形状がカプセルのとき、上記の種類の物質に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含むことができる。様々な他の物質は、被覆物あるいは、さもなければ固体の単位投与形状の物理的な形を変更して存在することができる。例えば、錠剤、ピル、カプセルは、ゼラチン、ワックス、セラック、砂糖などで被覆することができる。

シロップまたはエリキシルは、活性剤、甘味剤としてショ糖またはフルクトース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、染料およびチェリーまたはオレンジフレーバーなどの香料を含むことができる。もちろん、あらゆる単位投与形状を調製するのに使われるあらゆる物質が、用いられる量では実質的に無毒性であるべきである。そのうえ、活性化合物は、徐放性調製物およびデバイスに組み込むことができ、所望の放出プロフィルを得るために浸透圧に頼っているものを含むが、それらに限定されない。

非経口投与に好適な本発明の製剤は一般的に、調製物が意図するレシピエントの血液と等浸透圧である、化合物の滅菌水性および非水溶注射溶液を含む。これらの調製物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図するレシピエントの血液と等浸透圧にする溶質をふくむことができる。水性および非水性の無菌懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含むことができる。その製剤は単位用量または複数用量の容器(例えば密封されたアンプルおよびバイアル)に存在することができ、および無菌の液体担体、例えば、生理食塩水または注入用水の追加だけを使用の直前に必要とするフリーズドライ(冷凍乾燥)状態で保存することができる。

皮膚への局所投与に好適な製剤は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ジェル、スプレー、エアゾールまたは油の形状を取ることができる。担体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール類、経皮性エンハンサー、およびこれら2つまたは3つ以上の組み合わせを含む。

経皮投与に好適な製剤は、長期間レシピエントの表皮に直接接触するままであることに適応した別個のパッチとして存在することができる。経皮投与に好適な製剤は、イオン導入によっても送達することができ(例えば、Pharmaceutical Research 3 (6):318 (1986)参照)、および典型的に任意に化合物の緩衝水溶液の形状をとる。好適な製剤はクエン酸塩またはビス/トリス緩衝液(pH6)またはエタノール/水を含み、また化合物を0.1〜0.2M含む。

代わりに、化合物は経鼻投与のために製剤することができるか、さもなければ、あらゆる好適な方法によって対象の肺に投与する。特別な態様において、化合物は、対象が吸入する化合物を含有する呼吸域粉塵のエアゾール懸濁液により投与する。呼吸域粉塵は、液体または固体であり得る。用語エアゾールは、細気管支または鼻道内まで吸入することができる、あらゆるガス媒介懸濁相を含む。特に、エアゾールは、定量吸入器または噴霧器内であるいはミスト噴霧器内で生成することができるように、液滴のガス媒介懸濁液を含む。エアゾールはまた、例えば吸入デバイスから吸入によって送達することができる、空気または他の担体ガスに懸濁した乾燥粉末組成物を含む。Ganderton & Jones、Drug Delivery to the Respiratory Tract, Ellis Horwood (1987); Gonda (1990) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier System 6:273-313; およびRaeburn, et al. (1992) J. Pharmacol. Toxicol. Methods 27:143-159参照。当業者に周知のように、化合物を含有する液体粒子のエアゾールは、圧力駆動のエアゾール噴霧器または超音波噴霧器などのあらゆる好適な方法で生成することができる。例えば、米国特許第4,501,729号参照。製薬技術分野で既知の技術によって、化合物を含有する固体粒子のエアゾールも同様に、あらゆる固体粒子状薬剤のエアゾール発生装置でを用いて生成することができる。

あるいは、全身的より局所的な方法で、例えば、持続性薬剤または除放製剤で化合物を投与することができる。

さらに、本発明はここで開示された化合物とそれらの塩のリポソーム製剤を提供する。リポソーム懸濁液を形成する技術は、当技術分野で周知である。化合物またはその塩が水溶性塩であるとき、従来のリポソーム技術を使って、同じものを脂質小胞へ組み入れることができる。かかる場合、化合物または塩の水溶性のために、化合物または塩は、リポソームの親水性の中心またはコアに実質的に取り込まれる。用いられる脂質層は、あらゆる従来の組成物でもあり得、およびコレステロールを含み得るか、またはコレステロールフリーであり得るか、いずれかである。関心のある化合物またはその塩が不水溶性であるとき、また従来のリポソーム形成技術を用いて、塩を、リポソーム構造を形成する疎水性脂質二重層に、実質的に取り込むことができる。いずれの場合にも、生成されたリポソームは、標準の超音波処理および均質化技術を使うことによって、サイズを低減することができる。

ここで開示された化合物またはその塩を含有するリポソーム製剤は、リポソーム懸濁液を再生させるために水などの担体と細胞性することができる冷凍乾燥物を生成するために、冷凍乾燥することができる。

特別な態様において、化合物を対象に有効量を投与することができ、その用語はここで定義済みのである。活性化合物の投与量は当技術分野で既知の方法で決定することができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, editor, 20th ed. Lippingcott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000参照。選択された有効投薬量レベルは、用いられる本発明の特定の化合物の活性、投与の経路、投与の時間、用いられる特定の化合物の排出または代謝率、処置の持続時間、用いられる特定の化合物と組み合わせて使われる他の薬剤、化合物および/または物質、処置する対象の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、および過去の病歴、および当技術分野で周知の要因などの多様な要因に依存する。

当技術分野における通常の技術を有する医師または獣医師は、ヒト、農業上重要な動物、ペットまたは動物学的な動物などの動物の対象の予防や処置に必要な有効量の医薬組成物を容易に決定し、処方することができる。

本発明を以下の非限定的な例によって、より詳細に記述する。

例1:S. cerevisiae株
qns1欠失およびqns1遺伝子の染色体決欠失を持った一倍体BY165−1dについてヘテロ接合性であり、QNS1およびURA3を含有するプラスミドpB175によって形質転換される、二倍体株BY165酵母は、当技術分野で既知である(Bieganowski, et al. (2003) supra)。遺伝子の欠失を、プライマーから生成するPCR生成物による直接の形質転換によって導入した(Brachmann, et al. (1998) Yeast 14:115-132)。完全培地上での24時間の増殖の後、細胞を5−フルオロオロチン酸を含有する培地で培養した(Boeke, et al. (1987) Methods Enzymol. 154:164-175)。ado1分裂(disruption)カセットを、プライマー7041(5'-CTA TTT AGA GTA AGG ATA TTT TTT CGG AAG GGT AAG AGG GAC CAA CTT CTT CTG TGC GGT ATT TCA CAC CG-3';配列番号:10)および7044(5'-ATG ACC GCA CCA TTG GTA GTA TTG GGT AAC CCA CTT TTA GAT TTC CAA GCA GAT TGT ACT GAG AGT GCA C-3';配列番号:11)およびプラスミドpRS413をテンプレートとしてを用いたPCRによって組み立てた。

酵母株BY165を、このPCR生成物で形質転換し、ヒスチジン原栄養(prototrophic)形質転換体のなかでの相同的組み換えが、プライマー7042(5'-AAG CTA GAG GGA ACA CGT AGA G-3';配列番号:12)および7043(5'-TTA TCT TGT GCA GGG TAG AAC C-3';配列番号:13)を用いたPCRで確認された。この株は、プラスミドpB175で形質転換され、および胞子形成および四分子解離を受けやすい。qns1およびado1欠失およびプラスミドを持っている一倍体株BY237を、さらなる実験のために選択した。pRS415をテンプレートとして、およびPCRプライマー7051(5'-CGA TCT TCA TCA TTT ATT TCA ATT TTA GAC GAT GAA ACA AGA GAC ACA TTA GAT TGT ACT GAG AGT GCA C-3';配列番号:14)および7052(5'-AAA ATA CTT TGA ATC AAA AAA TCT GGT CAA TGC CCA TTT GTA TTG ATG ATC TGT GCG GTA TTT CAC ACC G-3';配列番号:15)を使ったPCR増幅の生成物を用いて形質転換することによって、urk1失欠を、株BY237に導入した。

分裂は、プライマー7053(5'-ATG TCC CAT CGT ATA GCA CCT TCC-3';配列番号:16)および7054(5'-GCC TCT AAT TAT TCT CAA TCA CAA CC-3';配列番号:17)を用いたPCRによって確認され、および得られる株はBY247と称した。rbk1分裂カセットは、プライマー7063(5'-AAA CTT TCA GGG CTA ACC ACT TCG AAA CAC ATG CTG GTG GTA AGG GAT TGA GAT TGT ACT GAG AGT GCA C-3';配列番号:18)および7065(5'-GAA CAG AAA AGC ACC CCT CTC GAA CCC AAA GTC ATA ACC ACA ATT CCT CTC TGT GCG GTA TTT CAC ACC G-3';配列番号:19)およびテンプレートとしてプラスミドpRS411を用いたPCRによって確認された。分裂が、この反応の生成物を用いた形質転換によって、株BY242に導入され、およびプライマー7062(5'-GGA TAG ATT ACC TAA CGC TGG AG-3';配列番号:20)および7064(5'-TTG TAC TTC AGG GCT TTC GTG C-3';配列番号:21)を用いたPCRによって確認された。qns1、ado1、urk1およびrbk1遺伝子の欠失を持っている得られる株は、BY252と称する。

NRK1遺伝子座の分裂を持っている酵母株は、プライマー4750(5'-AAT AGC GTG CAA AAG CTA TCG AAG TGT GAG CTA GAG TAG AAC CTC AAA ATA GAT TGT ACT GAG AGT GCA C-3';配列番号:22)および4751(5'-CTA ATC CTT ACA AAG CTT TAG AAT CTC TTG GCA CAC CCA GCT TAA AGG TCT GTG CGG TAT TTC ACA CCG-3';配列番号:23)を用いたPCRによって分裂カセットに導入されたHIS3マーカーを用いた株BY165−1dの形質転換によって作られた。NRK1遺伝子座へのHIS3マーカーの正確な組込みは、プライマー4752(5'-ACC AAC TTG CAT TTT AGG CTG TTC-3';配列番号:24)および4753(5'-TAA GTT ATC TAT CGA GGT ACA CAT TC-3';配列番号:25)を用いたPCRによって確認された。

例2:ニコチンアミドリボシドおよびホエー製剤
NMN(39.9mg;Sigma, St. Louis, MO)を、1250単位の子ウシの腸のアルカリホスファターゼ(Sigma)により、1mL中100mMのNaCl、20mMのトリスpH8.0、5mMのMgClで、37℃で1時間処理した。NMNのニコチンアミドリボシドへの加水分解をHPLCによって確認し、およびフォスファターゼを、反応物を5,000Daフィルターに通して遠心分離することで除去した(Millipore, Billerica, MA)。市販の無脂肪牛乳のホエービタミン画分を、HClを用いてpHを4に調節し、55℃で10分間攪拌し、遠心分離により変性カゼインを除去し、および5,000Daフィルターを通過させることによって調製した。酵母培地では、ニコチンアミドリボシドを10μMで、およびホエービタミン画分を50容量%で使用した。

例3:酵母GST−ORFライブラリ
融合タンパク質ライブラリの調製は、90〜96タンパク質コンストラクトの64のプールそれぞれに0.5リットルの培養規模で、確立した方法に従った(Martzen, et al. (1999) supra; Phizicky, et al. (2002) Methods Enzymol.350:546-559)。10%の各プール調製物を、一晩インキュベートして、Nrk活性についてアッセイした。

例4:ニコチンアミドリボシドリン酸化アッセイ
100mMのNaCl、20mMのNaHEPES pH7.2、5mMのβ−メルカプトエタノール、1mMのATP、5mMのMgCl、および500μMのニコチンアミドリボシドまたは代わりのヌクレオシドを含有する反応物(0.2mL)を、30℃で培養し、およびEDTAを20mMに追加して、100℃で2分間加熱することで終了した。酵素および基質に依存して、50ngから6μgの酵素を含有する比活性アッセイを、初速度状態を維持するために、30℃で30分間インキュベートした。反応生成物を、KPO pH2.6の10mMから750mM勾配を用いた、強陰イオン交換カラムでのHPLCで評価した。

例5:NRK遺伝子およびcDNAクローン化および酵素精製
S. cerevisiae NRK1遺伝子を、プライマー7448(5'-CGC TGC ACA TAT GAC TTC GAA AAA AGT GAT ATT AGT TGC-3';配列番号:26)および7449(5'-CCG TCT CGA GCT AAT CCT TAC AAA GCT TTA GAA TCT CTT GG-3';配列番号:27)を用いて総酵母DNAから増幅した。増幅したDNAフラグメントを、プライマー配列に含まれたNdeIおよびXhoIのための制限部位を使う大腸菌発現のために、ベクターpSG04の中でクローン化し(Ghosh and Lowenstein (1997) Gene 176:249-255)、および得られるプラスミドは、pB446と称した。ヒトリンパ球および脾臓から作られたcDNAのサンプルはプライマー4754(5'-CCG GCC CAT GGC GCA CCA CCA TCA CCA CCA TCA TAT GAA AAC ATT TAT CAT TGG AAT CAG TGG-3';配列番号:28)および4755(5'-GCG GGG ATC CTT ATG CTG TCA CTT GCA AAC ACT TTT GC-3';配列番号:29)を使ってヒトNRK1の増幅のためのテンプレートとして使用した。

大腸菌発現のために、この反応からのPCR単位複製配列を、ベクターpMR103の制限部位NcolおよびBamHIの中でクローン化し(Munson, et al. (1994) Gene 144:59-62)、プラスミドpB449をもたらした。その後、プラスミドpB449を、プライマー7769(5'-CCG CGG ATC CAT GAA AAC ATT TAT CAT TGG AAT CAG TGG-3';配列番号:30)および7770(5'-GCC GCT CGA GTT ATG CTG TCA CTT GCA AAC ACT T-3';配列番号:31)を用いたPCRのためのテンプレートとして使用した。この増幅の生成物を、ベクターp425GAL1のBamHIおよびXhoI部位の間にクローン化し(Mumberg, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:5767-5768)、GAL1プロモーター制御下の得られるヒトNRK1遺伝子を持っているプラスミドは、pB450と称した。ヒトNRK2 cDNAを、プライマー7777(5'-GGC AGG CAT ATG AAG CTC ATC GTG GGC ATC G-3';配列番号:32)および7776(5'-GCT CGC TCG AGT CAC ATG CTG TCC TGC TGG GAC-3';配列番号:33)を用いて増幅した。この増幅されたフラグメントを、NdeIおよびXhoI酵素によって消化し、および大腸菌発現のためにプラスミドpSGA04内でクローン化した。Hisタグ付の酵素を、Ni−NTAアガロースで精製した。

ヒトNrk1(配列番号:5)、ヒトNrk2(配列番号:6)、S. cerevisiae Nrk1(配列番号:4)、S. pombe nrk1(配列番号:7)のアミノ酸配列アライメント、およびS. cerevisiaeウリジン/シチジンキナーゼUrk1(配列番号:8)および大腸菌パントテン酸キナーゼ(配列番号:9)の一部を示す図である。

Claims (25)

  1. ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをエンコードしている真核ヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
  2. 単離された核酸が、
    (a)配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3を含むヌクレオチド配列;
    (b)ストリンジェントな条件下で配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3を含むヌクレオチド配列またはその相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、ここで前記ヌクレオチド配列が、機能性ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをエンコードする;または
    (c)(a)または(b)のヌクレオチド配列によりエンコードされたアミノ酸配列をエンコードしているが、遺伝コードの縮重または翻訳されないヌクレオチド配列の存在により、(a)または(b)のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列
    を含む、請求項1に記載の核酸。
  3. 請求項1に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
  4. 請求項3に記載の発現ベクターおよび薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
  5. さらにプロドラッグを含み、ここで前記プロドラッグが、発現ニコチンアミドリボシドキナーゼによりリン酸化されたニコチンアミドリボシド関連類似体であり、それにより前記プロドラッグを活性化する、請求項4に記載の組成物。
  6. 単離された真核ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチド。
  7. ポリペプチドが、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6を含むアミノ酸配列またはその機能性フラグメントと少なくとも約70%のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の単離されたニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチド。
  8. 請求項1に記載の単離された核酸を含む培養細胞。
  9. 請求項6に記載の単離されたニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドを含む培養細胞。
  10. 請求項6に記載の単離されたニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドおよび薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
  11. さらにプロドラッグを含み、ここで前記プロドラッグが、ニコチンアミドリボシドキナーゼによりリン酸化されたニコチンアミドリボシド関連類似体であり、それにより前記プロドラッグを活性化する、請求項10に記載の組成物。
  12. 癌の兆候または症状が減少するまたはなくなるよう、癌であるか癌であると疑われる患者に有効量の請求項5に記載の組成物を投与することを含む、癌を処置する方法。
  13. 癌の兆候または症状が減少するまたはなくなるよう、癌であるか癌であると疑われる患者に有効量の請求項11に記載の組成物を投与することを含む、癌を処置する方法。
  14. ニコチンアミドリボシドの天然または合成源を同定する方法であり、
    機能性グルタミン依存性NAD+合成酵素を欠いている第一の細胞を天然または合成源から単離された抽出物と接触させること;
    機能性グルタミン依存性NAD+合成酵素およびニコチンアミドリボシドキナーゼを欠いている第二の細胞を単離された抽出物と接触させること;および
    第二の細胞の増殖と比較した第一の細胞の増殖の検出をすること、
    を含み、第一の細胞における増殖の存在および第二の細胞における増殖の不在は、単離された抽出物におけるニコチンアミドリボシドの存在を示す、前記方法。
  15. 天然源が牛乳である、請求項14に記載の方法。
  16. 請求項14に記載の方法により同定されたニコチンアミドリボシドおよび担体を含む栄養補助食品組成物。
  17. 請求項15に記載の方法により同定されたニコチンアミドリボシドおよび担体を含む栄養補助食品組成物。
  18. NAD+生合成のニコチンアミドリボシドキナーゼ経路に関連する疾患または状態を防ぐまたは処置する方法であり、疾患または状態の兆候または症状を防ぐまたは低減するよう、NAD+生合成のニコチンアミドリボシドキナーゼ経路に関連する疾患または状態を有する患者に有効量のニコチンアミドリボシド組成物を投与することを含む、前記方法。
  19. 疾患または状態が脂質障害または発作である、請求項18に記載の方法。
  20. 有効量のトリプトファン、ニコチン酸またはニコチンアミドをさらに投与することを含む、請求項18に記載の方法。
  21. ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを同定する方法であり、ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドをニコチンアミドリボシド関連検査薬と接触させること、および前記検査薬が前記ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドによりリン酸化されるかどうか決定し、それによりニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを同定することを含む、前記方法。
  22. 請求項21に記載の方法により同定された、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグ。
  23. ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを同定する方法であり、
    組換えニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドを発現する第一の被検細胞をニコチンアミドリボシド関連検査薬と接触させること;
    機能性ニコチンアミドリボシドキナーゼポリペプチドを欠いている第二の被検細胞を同じ検査薬と接触させること;および
    第一の細胞のであり第二の細胞のではない細胞死がニコチンアミドリボシド関連プロドラッグを示す、第一のおよび第二の被検細胞の生存率を決定すること、
    を含む、前記方法。
  24. 請求項23に記載の方法により同定された、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグ。
  25. 個体または腫瘍におけるニコチンアミドリボシドキナーゼの突然変異の存在、または発現のレベルを検出することを含む、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグによる処置に感受性のある個体または腫瘍を同定する方法であり、対照と比較した、前記個体または腫瘍におけるニコチンアミドリボシドキナーゼの発現の突然変異または変化の存在が、ニコチンアミドリボシド関連プロドラッグによる処置への感受性のレベルの変化を有する前記個体または腫瘍を示す、前記方法。
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