JP7338970B2

JP7338970B2 - Ｇａｌｇｔ２遺伝子治療のための方法および物質

Info

Publication number: JP7338970B2
Application number: JP2018513504A
Authority: JP
Inventors: ポールテイラーマーティン，
Original assignee: リサーチインスティチュートアットネイションワイドチルドレンズホスピタル
Priority date: 2015-09-17
Filing date: 2016-09-16
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2036-09-16
Also published as: EP3350331A1; JP2018527365A; AU2023200499A1; MX2018003234A; CO2018003960A2; CN108136049A; JP2022010079A; BR112018005177A2; SA518391113B1; US10980897B2; HK1257519A1; US20180250423A1; IL258005A; US20210220484A1; CA2998636A1; AU2016323575A1; EA201890543A1; AU2016323575B2; WO2017049031A1; KR20180084747A

Description

合衆国政府の権益に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所による表彰（Ｕ５４ＮＳ０５５９５９およびＲ０１ＡＲ０４９７２２）を受け、政府の助成によりなされた。政府は、本発明の一定の権利を有する。

配列表の参照
本出願は、開示の別部分として、コンピュータ可読の配列表（ファイル名：４９８８５ＰＣＴ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；１４，４６７ｂｙｔｅｓ－ＡＳＣＩＩｔｅｘｔｆｉｌｅ；２０１６年９月１５日作成）を含んでおり、この全体が本明細書に参照として組み込まれる。

本開示は、ＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）送達に関する。該開示は、ｒＡＡＶおよび神経筋障害へのＧＡＬＧＴ２遺伝子治療にｒＡＡＶを用いる方法を提供する。神経筋障害の例としては、それらに限定されるものではないが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー１Ａ、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄがある。

筋ジストロフィー（ＭＤ）は、遺伝子病群に入る。該群は、動きを制御する骨格筋の進行性脆弱化および変性によって特徴づけられる。ＭＤのいくつかの型は、幼児期または児童期に発症するが、一方で他の型は、中年期またはその後になるまで出現しないこともある。障害は、筋力低下の分布や範囲（ＭＤのいくつかの型は、心筋にも影響する）、発症年齢、進行の速さ、および遺伝様式の点で異なっている。

ＭＤのタイプの一つはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。これは、新生男児５０００人に１人に影響を及ぼす、もっとも一般的で深刻な児童期の筋ジストロフィーの形である。Ｘ－染色体の劣性遺伝に従う遺伝的性質である。ＤＭＤは、骨格筋や心筋また同様に消化管や網膜におけるジストロフィンタンパク質（４２７ＫＤａ）の非存在につながるＤＭＤ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ジストロフィンは、筋細胞膜を奇形な収縮から保護するばかりでなく、筋細胞膜に近接している多くの情報伝達タンパク質をつなぎとめている。ＤＭＤの臨床症状は、通常、典型的には診断検査へとつながる異常歩行と運動機能低下を伴い、３歳から５歳までの間に初めに気付かれる。ＤＭＤは、絶え間なく進行し、１２歳までには歩行運動を失う。歴史的に、患者は、２０歳代後半に呼吸器系合併症により死亡していたが、支持療法の改善により、特に夜間の換気補助の賢明なる使用により、１０年ほど余命が伸びている。寿命の延びは、遅延された心筋症の合併症を伴った全面的な心機能低下を明らかにすることになった。このことが、更なる臨床的挑戦とこれまでには存在しなかった認知と医学的介入の必要性をもたらした。ＤＭＤは非進行認知機能障害も伴う。ＤＭＤに対する何百もの臨床的試みにも拘らず、依然としてコルチコステロイドによる処置が、一貫して有効性を示す唯一の処置のままとなっている。ＤＭＤに対する現行標準治療は、かなりの副作用を伴って歩行運動を数年間延長することができるものではあるが、プレドニゾンまたはデフラザコルトの使用を含んでおり、また生存に与える何らかの効果についての証拠は限定的である。

ＭＤの別の型は、先天型筋ジストロフィー１Ａ（ＭＣＤ１Ａ）である。ＭＣＤ１Ａは、緊張低下、筋力低下、および筋消耗によって特徴づけられ、生誕時または幼児期に発症する神経筋障害群に属する。ＭＣＤ１Ａは、地域差はあるが、先天性筋ジストロフィーの３０～４０％にあたる。罹患率は１／３００００と見積もられる。病理は、生誕時または生涯の初めの数か月に、手足および体幹の緊張低下および筋力低下を伴って現れる。呼吸器および採食障害も起こり得る。運動技能発が遅れまた限定される（手助けによって立ち、座りのみが可能である）。乳幼児は、早期の脊椎硬直、脊椎側弯症、および呼吸不全を示す。典型的な伸びた筋障害性顔貌となる顔症状があり、眼の眼筋麻痺がその後現われ得る。対象者の１／３以下ではあるが、てんかん発作が起こる可能性がある。知的発達は正常である。ＭＣＤ１Ａはラミニンα－２鎖をコードするＬＡＭＡ２遺伝子の突然変異によって引き起こされる。遺伝は、常染色体劣性である。現行の治療は、対処療法である。これは、理学療法士、作業療法士、および言語士を含む集学的取組から成り、各対象者の能力を最適化させるのを目的とする。発作や他の神経学的合併症は、特別な治療を要する。ＭＤＣ１Ａの予後については、感染した児童の多くは青年期に達することがないほど非常に厳しい。現在、予後は、慎重な集学的（特に、整形外科および呼吸器）制御によってのみ改善することができる。

更にもう一つのＭＤの型は、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）である。ＬＧＭＤは、まれな状態であり、発症する年齢や、筋力低下を起こす場所、心臓および呼吸器のかかわり、進行率や劇症率に関して異なる人々に、異なって現れる。ＬＧＭＤは、児童期、思春期、青年期、またはその後に始まる。両性とも等しく患う。ＬＧＭＤは、時の経過ともに上脚部および上腕部近くの筋肉の脆弱化を時に引き起こし、肩および下肢帯の脆弱化を引き起こす。脚部の脆弱化はしばしば、腕のそれより早く現われる。顔面筋は通常影響を受けない。状態の進行につれ、歩行の問題が起こり車いすを常時使用することが必要となる。肩と腕の筋肉が関連することにより、腕を頭より上にあげることや物体を持ち上げることなどが困難になる。ＬＧＭＤのいくつかの型において、心臓や呼吸筋が、関わることがある。

少なくとも、１９のＬＧＭＤの形があり、各形は、関連する遺伝子欠陥により分類される。

ＬＧＭＤ用の特定テストが、現在、国立委託グループ（ＮＣＧ）による国民診断計画を通じて受けることができる。

ＧＡＬＧＴ２遺伝子（他に、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２として知られている）は、β１－４－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（βＧａｌＮＡｃ）グルコシルトランスフェラーゼ（糖転移酵素）をコードする。３つの異なる筋ジストロフィーモデル、すなわち、ＤＭＤ、ＬＧＭＤ２Ｄ、とＭＤＣ１Ａにおいて、ＧＡＬＧＴ２過剰発現が研究されてきた（Ｘｕら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１７５：２３５－２４７（２００９）；Ｘｕら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１７１：１８１－１９９（２００７）；Ｘｕら，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．，１７：２０９－２２０（２００７）；Ｍａｒｔｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２９６：Ｃ４７６－４８８（２００９）；およびＮｇｕｙｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：５６１６－５６２１（２００２））。骨格筋におけるＧＡＬＧＴ２過剰発現は、ＣＴ炭酸水素塩抗原（Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２－３［ＧａｌＮＡｃβα１－４］Ｇａｌβα１－４ＧｌｃＮＡｃβ－）を作るために、β１－４－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）炭酸水素塩によるα－ジストログリカンのグリコシル化を誘発すると報告されてきた。ＧＡＬＧＴ２グルコシルトランスフェラーゼとそれによって作られたＣＴ炭酸水素塩は、ヒト成人、非人類霊長類、齧歯動物および、その他、これまで研究されてきた全ての哺乳類の骨格筋における神経筋と筋腱接合部に限られない（Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．，３２：９１５－９２９（２００３））。骨格筋におけるＧＡＬＧＴ２の過剰発現は、ジストロフィン代替物（例えば、ウトロフィンやプレクチン１）およびラミニンα２代替物（ラミニンα５やアグリン）などを含んでおり、種々の型の筋ジストロフィーにおいて失われているタンパク質の相同分子種または相同物である、常にはシナプスタンパク質のスキャフォールドの異所性過剰発現を刺激することによって、シナプス外膜の異所性グリコシル化を刺激すると報告されている（Ｘｕら，２００９，前述；Ｘｕら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．２００７，前述；Ｘｕら，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．２００７，前述；Ｎｇｕｙｅｎら，前述；Ｃｈｉｃｏｉｎｅら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ，２２：７１３－７２４．（２０１４）。グループとして、ＧＡＬＧＴ２によるそのような代替物の誘導は、筋細胞膜の完全性を強化し、ジストロフィン―欠損筋と同様に野生型筋肉において筋損傷を防止すると報告されている（Ｍａｒｔｉｎら，前述）。骨格筋におけるＧＡＬＧＴ２過剰発現は筋の損傷を防止し、筋疾患を抑制すると報告されている。このことは、ＤＭＤ用のｍｄｘマウスモデルにおいて真実であり（Ｘｕら，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．２００７，前述；Ｍａｒｔｉｎら（２００９），前述；Ｎｇｕｙｅｎら，前述）、そこでは、繊維の半数のみが変換されたにすぎないにもかかわらず、ミクロ－ジストロフィン遺伝子導入の改善と等しい改善が述べられている（Ｍａｒｔｉｎら（２００９），前述）。とりわけ、ＧＡＬＧＴ２遺伝子導入が、先天型筋ジストロフィー１Ａ用のｄｙ^Ｗモデルにおいて（Ｘｕら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．２００７，前述）、また肢帯型筋ジストロフィータイプ２Ｄ用のＳｇｃａ－マウスモデルにおいて（Ｘｕら，２００９，前述）予防できることが報告されている。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製不全のパルボウイルスであり、それの一本鎖ＤＮＡゲノムは、末端逆位配列（ＩＴＲｓ）の１４５のヌクレオチドを含む約４．７ｋｂの長さを有している。数多くのＡＡＶ血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列はすでに知られている。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－２の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１４０１とＳｒｉｖａｓｔａｖａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）に提供されており、ＡＡＶ－３の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿１８２９に、ＡＡＶ－４の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１８２９に、ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０８５７１６に、ＡＡＶ－６の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１８６２に、ＡＡＶ－７とＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部はそれぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ７５３２４６とＡＸ７５３２４９に、ＡＡＶ－９ゲノムはＧａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に、そしてＡＡＶ－１１ゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶＩＴＲ内には、ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージングと、宿主細胞への染色体組み込みを指示するシス作用配列が含まれている。３つのＡＡＶプロモーター（相対的位置関係によりｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられている）は、ｒｅｐとｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を促す。一つのＡＡＶイントロン（２１０７と２２２７ヌクレオチドに於ける）の弁別スプライシングと組み合わされることにより、該２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５とｐ１９）はｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の製造をみちびく。Ｒｅｐタンパク質は、究極的にウイルスゲノムの複製の責任を負うなど多くの酵素的性質を有している。Ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非―コンセンサス転写開始部位は、３つのカプシドタンパク質の製造の責任を負っている。一つのコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムの９５番に位置する。Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）にＡＡＶのライフサイクルと遺伝的特徴の再調査が述べられている。

ＡＡＶは、例えば遺伝子治療において、外来ＤＮＡを送達するためのベクターとして有望であるなどの特異な特徴を有している。培地での細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性的であり、ヒトやその他の動物の自然感染は、無変化で無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳類の細胞に感染し、生体内の多くの異なる組織を標的にすることを可能にさせる。更に、ＡＡＶはゆっくり分裂細胞や非分裂細胞の形質を導入し、転写活性のある核エピソーム（染色体外因子）として、これらの細胞の寿命を基本的に維持することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換え体ゲノムの構築を可能にするプラスミドの中でクローン化されたＤＮＡとして、感染力がある。更に、ＡＡＶ複写、ゲノムカプシド形成と統合を指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれていることによって、ほぼ４．３ｋｂの内部ゲノム（複製と構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）のいくつかまたは全てを外来性ＤＮＡに置き換えることができる。該ｒｅｐとｃａｐタンパク質はトランス型として提供される。もう一つの重要なＡＡＶの性質は、極端に安定で活発なウイルスであることである。その性質は、アデノウイルスを不活性化させるのに採用される条件（５６℃から６５℃に数時間）に容易に耐えることができ、それによって、ＡＶＶの低温保存をより容易にすることができる。ＡＡＶは、凍結乾燥さえすることができる。最後に、ＡＡＶに感染した細胞は、重感染への耐性はない。

ｒｈ．７４と名付けられたＡＡＶは種々のタンパク質を高度化するＤＮＡを送達するために用いられてきた。デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対して、細胞毒性のあるＴ細胞ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（転移酵素）のｒｈ．７４発現についてＸｕら，ＮｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒＤｉｓｏｒｄｅｒｓ，１７：２０９－２２０（２００７）およびＭａｒｔｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２９６：４７６－４８８（２００９）に述べられている。血管を通しての肢灌流によるＡＡＶｒｈ．７４の送達の後に、ＡＡＶｒｈ．７４のミクロジストロフィンＦＬＡＧタンパク質タグ融合のＡＡＶｒｈ．７４発現について、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１８（１）：１０９－１１７（２０１０）に述べられている。

筋ジストロフィーは、確とした治療法のない、個人、家庭、社会に重大な衝撃を与える一群の疾患である。コストは莫大である。個人は、生活感情的な緊張や自尊心を失わせることにつながる人生の質の低下に苦しむ。肢の機能の喪失による重度の肢体不自由者にとって、日々の生活活動は困難なものである。家族関係は、財政損失および困難な対人関係に苦しむ。罹患した患者の兄弟たちは、疎外されていると感じ、特に筋ジストロフィーが一方の親の責任であるならば、夫婦間の争いはしばしば離婚に至る。治癒を求める負担は、多くの場合、生涯にわたる高度に集中した努力となり、それは人生のあらゆる側面を損ない、また苦難となる。家族の他には、社会が、特別教育、特別輸送および繰り返される呼吸道感染や心臓病の合併症を治療するための再入院において、筋ジストロフィー人口の肢体不自由者を居住させる為の追加の施設が必要なため経済的な重荷を担うことになる。経済的負担の責任は、州および連邦政府の庁が分担しているが、これは、更に納税者の責任へとつながっている。
このように、これら限られるものではないが、ＤＭＤ、ＭＤＣ１Ａ、およびＬＧＭＤ２Ｄなどの筋ジストロフィーを含む神経筋障害に対する治療法が、当該分野に於いて強く必要とされている。

Ｘｕら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１７５：２３５－２４７（２００９）Ｘｕら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１７１：１８１－１９９（２００７）Ｘｕら，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．，１７：２０９－２２０（２００７）Ｍａｒｔｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２９６：Ｃ４７６－４８８（２００９）Ｎｇｕｙｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：５６１６－５６２１（２００２）

ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２などの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を
投与された対象者における神経筋障害を治療する方法であって、投与の経路が筋肉内経
経路でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約３×１０^１１ｖｇ／注入から５×１０^１２ｖｇ／注入である、投与の経路が筋肉内経路でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約３×１０^１１ｖｇ／注入である、投与の経路が筋肉内経路でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約１×１０^１２ｖｇ／注入である、投与の経路が筋肉内経路でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約５×１０^１２ｖｇ／注入である、投与の経路が動脈内肢灌流でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ／肢から４．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ／肢である、投与の経路が動脈内肢灌流でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ／肢である、投与の経路が動脈内肢灌流でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約１．２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ／肢である、投与の経路が動脈内肢灌流でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約２．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ／肢である、投与の経路が動脈内肢灌流でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約４．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ／肢である、投与の経路が全身的静脈内投与でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇから約６×１０^１５ｖｇ／ｋｇである、投与の経路が全身的静脈内投与でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約４×１０^１４ｖｇ／ｋｇから約６×１０^１５ｖｇ／ｋｇである、投与の経路が全身的静脈内投与でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約４×１０^１４ｖｇ／ｋｇである、投与の経路が全身的静脈内投与でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約８×１０^１４ｖｇ／ｋｇである、投与の経路が全身的静脈内投与でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約２×１０^１５ｖｇ／ｋｇである、または投与の経路が全身的静脈内投与でありかつ投与されたｒＡＡＶの用量が約６×１０^１５ｖｇ／ｋｇである方法を本明細書において提供する。

その治療法が考えられている神経筋障害の例としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー（ＭＤＣ）１Ａ，１Ｂ，１Ｃと１Ｄ、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ、２Ｎ、２Ｏと２Ｑ、ベスレムミオパチー、ウーリッヒ先天型筋ジストロフィー、筋・眼・脳病、福山型先天性筋ジストロフィー、ウォーカー・ワールブルク症候群、筋硬直性ジストロフィー、筋無力症症候群、先天型筋無力症、封入体ミオパチー、封入体筋炎、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、皮膚筋炎、中心核ミオパチー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、三好型ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、ネマリンミオパチー、埜中ミオパチー、重症筋無力症、および多発性筋炎がある。このように、筋ジストロフィーのその他の例には神経筋障害が考えられる。

例えば、絶対筋力、偏心的筋肉の収縮の間の力減少、血清ＣＫ濃度、血清心筋トロポニン濃度；血清ＭＭＰ９濃度；握力；肢トルク；肢可動性または柔軟性；歩行運動；６分間歩行テスト；膝関節屈筋または伸筋の強度；最大随意筋等尺性収縮；ノーススター歩行能力評価、肢Ｔ２強調ＭＲＩ画像による筋肉量、脂肪減少または浮腫測定、筋収縮、肢関節角度、心機能（心拍数、心拍出量、左室内径短縮率、１回拍出量）、呼吸機能（呼吸数、血中酸素濃度、酸素補給の必要性を含む）、筋肉壊死、筋肉再生、筋消耗、筋肉炎症、筋肉石灰化、筋肉中央核形成、筋肉サイズまたは筋線維サイズ、寿命、および／またはジストロフィンまたはラミニンα２タンパク質代用物発現（ウトロフィン（ｕｔｒｏｐｈｉｎ）、プレクチン１（ｐｌｅｃｔｉｎ１）、ラミニンα５（ｌａｍｉｎｉｎａｌｐｈａ５）、アグリン（ａｇｒｉｎ））に於いて、該方法は、ヒト対象者において改善をもたらす。

更に、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２などＧＡＬＧＴ２ポリペプチドをコードするｒＡＡＶを本明細書において提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
その治療を必要とするヒト対象者における神経筋障害を治療する方法であって、前記方法は、ヒト対象者に、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２を投与するステップを含み、
前記投与経路が筋肉内経路で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約３×１０ ^１１ｖｇ／注入～約５×１０ ^１２ｖｇ／注入であり、
前記投与経路が筋肉内経路で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約３×１０ ^１１ｖｇ／注入であり、
前記投与経路が筋肉内経路で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約１×１０ ^１２ｖｇ／注入であり、
前記投与経路が筋肉内経路で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約５×１０ ^１２ｖｇ／注入であり、
前記投与経路が動脈内肢灌流で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約６×１０ ^１２ｖｇ／ｋｇ／肢～約４．８×１０ ^１３ｖｇ／ｋｇ／肢であり、
前記投与経路が動脈内肢灌流で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約６×１０ ^１２ｖｇ／ｋｇ／肢であり、
前記投与経路が動脈内肢灌流で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約１．２×１０ ^１３ｖｇ／ｋｇ／肢であり、
前記投与経路が動脈内肢灌流で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約２．４×１０ ^１３ｖｇ／ｋｇ／肢であり、
該投与経路が動脈内肢灌流で、投与されるｒ前記ＡＡＶの用量が約４．８×１０ ^１３ｖｇ／ｋｇ／肢であり、
前記投与経路が全身性静脈投与で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約２×１０ ^１４ｖｇ／ｋｇ～約６×１０ ^１５ｖｇ／ｋｇであり、
前記投与経路が全身性静脈投与で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約４×１０ ^１４ｖｇ／ｋｇ～約６×１０ ^１５ｖｇ／ｋｇであり、
前記投与経路が全身性静脈投与で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約４×１０ ^１４ｖｇ／ｋｇであり、
前記投与経路が全身性静脈投与で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約８×１０ ^１４ｖｇ／ｋｇであり、
前記投与経路が全身性静脈投与で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約２×１０ ^１５ｖｇ／ｋｇであり、または
前記投与経路が全身性静脈投与で、投与される前記ｒＡＡＶの用量が約６×１０ ^１５ｖｇ／ｋｇである、方法。
（項目２）
前記神経筋障害が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー（ＭＤＣ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ、２Ｎ、２Ｏおよび２Ｑ、ベスレムミオパチー、ウーリッヒ先天型筋ジストロフィー、筋・眼・脳病、福山型先天性筋ジストロフィー、ウォーカー・ワールブルク症候群、筋硬直性ジストロフィー、筋無力症症候群、先天型筋無力症、封入体ミオパチー、封入体筋炎、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、皮膚筋炎、中心核ミオパチー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、三好型ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、ネマリンミオパチー、埜中ミオパチー、重症筋無力症、および多発性筋炎である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記神経筋障害が筋ジストロフィーである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記筋ジストロフィーが先天型筋ジストロフィー１Ａである、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記筋ジストロフィーが肢帯型筋ジストロフィー２Ｄである、項目３に記載の方法。
（項目７）
前記ヒト対象者において、それによって、絶対筋力、偏心的筋肉の収縮の間の力減少、血清ＣＫ濃度、血清心筋トロポニン濃度、血清ＭＭＰ９濃度、握力、肢トルク、肢可動性または柔軟性、歩行運動、６分間歩行テスト、膝関節屈筋または伸筋の強度、最大随意筋等尺性収縮、ノーススター歩行能力評価、肢Ｔ２強調ＭＲＩ画像による筋肉量、脂肪減少または浮腫測定、筋収縮、肢関節角度、心機能（心拍数、心拍出量、左室内径短縮率、１回拍出量）、呼吸機能（呼吸数、血中酸素濃度、酸素補給の必要性を含む）、筋肉壊死、筋肉再生、筋消耗、筋肉炎症、筋肉石灰化、筋肉中央核形成、筋肉サイズまたは筋線維サイズ、寿命、およびジストロフィンまたはラミンα２タンパク質代用物発現（ウトロフィン（ｕｔｒｏｐｈｉｎ）、プレクチン１（ｐｌｅｃｔｉｎ１）、ラミンα５（ｌａｍｉｎｉｎａｌｐｈａ５）、アグリン（ａｇｒｉｎ））における改善がある、項目１に記載の方法。
（項目８）
配列番号：２に表わされているＧＡＬＧＴ２遺伝子カセットを含む前記ｒＡＡＶ．ｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２。

本開示は、神経筋障害を治療するための方法と製品を提供する。該方法は、ＡＡＶを遺伝子送達ベクターとしてＡＡＶを用いて、対象者の筋細胞にＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドを送達することを含んでいる。対象者は、それに限られるものではないが、犬、猫、人などの哺乳類である。幾つかの実施形態において、対象者は、ヒト患者である。幾つかの実施形態において、対象者は、小児科のヒト患者である。

一つの態様において、ＧＡＬＧＴ２をコードする組換え体ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を、対象者に投与することを含む神経筋障害の治療のための方法が提供される。

本明細書において神経筋障害と考えられているものは、限定はされないが、筋ジストロフィー（ＭＤ）である。本明細書において神経筋障害と考えられているものは、ＭＤ以外の神経筋障害も含んでいる。このように、幾つかの実施形態において、本明細書で神経筋障害と考えられているものは、限定はされないが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー（ＭＤＣ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ、２Ｎ、２Ｏおよび２Ｑ、ベスレムミオパチー、ウーリッヒ先天型筋ジストロフィー、筋・眼・脳病、福山型先天性筋ジストロフィー、ウォーカー・ワールブルク症候群、筋硬直性ジストロフィー、筋無力症症候群、先天型筋無力症、封入体ミオパチー、封入体筋炎、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、皮膚筋炎、中心核ミオパチー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、三好型ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、ネマリンミオパチー、埜中ミオパチー、重症筋無力症、および多発性筋炎がある。幾つかの実施形態において、ＭＤはＤＭＤである。幾つかの実施形態において、ＭＤはＭＤＣ１Ａである。幾つかの実施形態において、ＭＤはＬＧＭＤ２Ｄである。

本明細書に記載された該方法のいずれかの実施形態において、対象者は、少なくとも１歳（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０歳）またはそれ以上である。本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、男性（雄）である。本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、女性（雌）である。本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、治療時点で独歩患者である。本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、治療が始まった時点で非―独歩患者である。本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、然変異を明確化できる臨床的に許容された技術を持って、ＤＭＤ遺伝子の突然変異が確認された者である。ＤＭＤ表現型を発症させるジストロフィー遺伝子における突然変異は、対象者においてそれらの突然変異を特定する方法として、当該分野ではよく知られている。参照、例えば、ＴｈｅＬｅｉｄｅｎＤｕｃｈｅｎｎｅｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙｍｕｔａｔｉｏｎｄａｔａｂａｓｅ，ＬｅｉｄｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，およびＡａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓら，Ｈｕｍ．Ｍｕｔ．，３０：２９３－２９９（２００９）。

本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、短指伸筋（ＥＤＢ）の核磁気共鳴画像において、形質導入または遺伝子導入を可能とするほど十分な筋肉量を保持している。本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、治療開始に先立ち、例えば、少なくとも４（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１または１２）週間、安定した用量の副腎皮質ステロイド療法（例えば、デフラザコルト、プレドニゾンまたはそれらのジェネリック薬）を受けている。ある実施形態において、対象者は、バックグラウンドステロイド治療中（例えば、断続的または慢性／継続的バックグラウンドステロイド治療）である。当業者は、そのような対象者はステロイド（または、コルチコステロイド）の使用が続けられる対象者で、本明細書に記載された遺伝子治療など、他の治療がその成功後に投与されることを理解するであろう。

本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、活性なウイルス感染をしていない者である。本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、機能の脆弱化または喪失のない状態でＤＭＤ突然変異を持っていない。本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、労作時呼吸困難、足浮腫、横たわった時の呼吸困難、肺基底部のラッセル音などの心筋症の症状を示していない。本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、心エコー図による心駆出率が約４０％以下である。本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、ＨＩＶ感染（対象者は、おそらく免疫不全状態である）またはＡ、ＢまたはＣ型肝炎（対象者は、おそらくアミノ基転移酵素の上昇がある）の治療の際に血清学的にその証拠がある者ではない。

本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、自己免疫疾患と診断されていない、それを患っていない、または現在その治療をしていない者である。本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、頑固な白血球減少症または白血球増加症ではなく（白血球数、３．５Ｋ／μＬ以上または２０．０Ｋ／μＬ以下）または絶対好中球数が１．５Ｋ／μＬより高くない。

本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、病気（例えば、ウイルス感染または自己免疫疾患）を併発していないか、または開業医の所見において不要な遺伝子導入のリスクを伴うような慢性的医薬治療を必要としない者である。

本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、ＥＬＩＳＡ免疫測定法で１：４００以上のｒＡＡＶｒｈ７４結合抗体力価を持たない者である。本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、対象者は、ＥＬＩＳＡ免疫測定法で１：５０以下のｒＡＡＶｒｈ７４結合抗体力価を持たない。

本明細書に記載された方法のいずれかの実施形態において、例えば、対象者の生物学的試料をＥＬＩＳＡ免疫測定法で決定するとき、抗－Ｓｄａ抗体の検出可能な循環を持たない者である（Ｂｌｏｏｄｇｒｏｕｐｓ：Ｐ，Ｉ，Ｓｄａ，ａｎｄＰｒ．ＡＡＢＢ（１９９１））。Ｓｄａグリカンは、ＧＡＬＧＴ２によって作られるヒト血液型群構造である。該Ｓｄａ血液型群抗体は、マウスの［ＧａｌＮＡｃｂ１，４［Ｎｅｕ５Ａｃａ２，３］Ｇａｌｂ１，４ＧｌｃＮＡｃ－］におけるＧＡＬＧＴ２によって作られるＣＴグリカンと同一である。該開示は、特定の理論や作用機構のいずれにも縛られることを望むものではないが、ＣＴグリカンの存在または量はＧＡＬＧＴ２を発現する細胞中で高められると予想され、対象者人口の０．２％と推測されるが、Ｓｄａ抗体を持つ対象者はｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２による治療後に、抗体関連型組織拒絶反応のリスクがあるものと、本発明者は考えている。

本明細書に記載された方法において用いられる、適した生物学的試料は、例えば、生体液のいずれかである。生物学的試料は、たとえば、対象者（例えば、ヒトなど哺乳類）から得られる試験片である。生物学的試料は、筋生検からのものであってよい。生物学的試料は、また尿、全血、その分画（例えば、血漿、血清）、唾液、精液、痰、脳脊髄液、粘液など生体液であってよい。生物学的試料は、望むならば、更に特定の興味の対象である被検物質（例えば、タンパク質）を含む分画に分画化されてもよい。例えば、全血試料は、血清または特定の型のタンパク質を含む分画に分画化されてよい。望むなら、生物学的は、二つの異なる流体の組み合わせなど、対象者からの異なる生物学的試料の組み合わせでもよい。

本発明に適した生物学的試料は、対象者から採られた新鮮なまたは凍結された試料か、または診断、治療および／または既往歴を伴った保存試料でもよい。生物学的試料は、例えば、癌または感染病（例えば、ウイルス感染）を発症している者、発症していると疑われる者、発症リスクのある者など、対象者から得るものであってよい。生物学的試料を得るために適した方法であれば、いずれの方法も採用できるが、典型的な方法は、例えば、解放筋生検、放血、スワッブ（例えば、口内スワッブ）、洗浄、または穿刺吸引細胞診手順である。生物学的試料は、また骨髄または脾臓からも得られる。

幾つかの実施形態において、タンパク質抽出物は、生物学的試料から調製してもよい。幾つかの実施形態において、タンパク質抽出物は、総タンパク質質分を含んでいる。タンパク質抽出方法は、当該分野でよく知られている。例えば、Ｒｏｅ“ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ”，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（２００１）を参照されたい。数多くの異なる多様なキットが、体液や組織からタンパク質を抽出するために用いることができ、また、例えば、ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）、ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、やＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などから商業的に入手可能である。

生物学的試料中で細胞の活性や完全性を保持する試料を得るためおよび／保存するための方法は、当業者によく知られている。例えば、生物学的試料は、更に一つ以上の添加剤、例えば適当な緩衝液および／またはプロテアーゼ阻害剤など阻害剤などと触れさせられるが、添加剤は、タンパク質構造を保持またはその変化（例えば、浸透圧またはｐＨの変化）を最小化する意味合いがある。このような阻害剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）などのキレート剤、フッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）、アプロチニンおよびロイペプチンなどプロテアーゼ阻害剤を含んでいる。全細胞を保存または他の取り扱い方に適した緩衝液と状態は、例えば、ＰｏｌｌａｒｄおよびＷａｌｋｅｒ，“ＢａｓｉｃＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｖｏｌｕｍｅ７５ｏｆＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（１９９７）、Ｍａｓｔｅｒｓ，“Ａｎｉｍａｌｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ：ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｖｏｌｕｍｅ２３２ｏｆＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈＳｅｒｉｅｓ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（２０００）、およびＪｏｎｅｓ“Ｈｕｍａｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，” Ｖｏｌｕｍｅ２ｏｆＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（１９９６）に述べられている。

本明細書に記載された神経筋障害の治療の方法は、ＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドによる筋細胞（例えば、骨格筋、平滑筋、または心筋細胞）の形質導入の結果をもたらす。本開示のｒＡＡＶを含む組成物の、対象者への有効量または有効反復投与量は、現に治療している神経筋障害と関連する筋肉の病理を防止するか、進行を遅らせるか、または改善する（除くまたは減らす）だけの用量である。筋肉の病理への効果は、１つ以上のこの分野での測定基準、例えば、絶対筋力、偏心的筋肉の収縮の間の力減少、血清ＣＫ濃度、血清心筋トロポニン濃度、血清ＭＭＰ９濃度、握力、肢トルク、肢可動性または柔軟性、歩行運動、６分間歩行テスト、膝関節屈筋または伸筋の強度、最大随意筋等尺性収縮、ノーススター歩行能力評価、肢Ｔ２強調ＭＲＩ画像による筋肉量、脂肪減少または浮腫測定、筋収縮、肢関節角度、心機能（心拍数、心拍出量、左室内径短縮率、１回拍出量）、呼吸機能（呼吸数、血中酸素濃度、酸素補給の必要性を含む）、筋肉壊死、筋肉再生、筋消耗、筋肉炎症、筋肉石灰化、筋肉中央核形成、筋肉サイズまたは筋線維サイズ、寿命、およびジストロフィンまたはラミニンα２タンパク質代用物発現（ウトロフィン（ｕｔｒｏｐｈｉｎ）、プレクチン１（ｐｌｅｃｔｉｎ１）、ラミニンα５（ｌａｍｉｎｉｎａｌｐｈａ５）、アグリン（ａｇｒｉｎ））などによって測定される。例えば、Ｆｏｒｂｅｓら，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２６９（１）：１９８－２０７（２０１３）；Ｇｏｖｏｎｉら，ＣｅｌｌＭｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．，７０（２３）：４５８５－４６０２（２０１３）；ならびにＣｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎおよびＭａｒｔｉｎ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，４７９：２９１－３２２（２０１０）を参照されたい。神経筋障害の発現に先立って用量を投与された場合、投与は予防のためである。神経筋障害の発現の後、用量を投与された場合、投与は治療のためである。本明細書に記載された方法による対象者の治療は、それ故、神経筋障害を防止するため、その進展を遅らせるかまたは防止するため、その範囲を縮小させるため、寛解（部分的または全体的）の結果をもたらすためおよび／または寿命を延ばすために考えられている。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載された方法のいずれかは、ＧＡＬＧＴ２導入遺伝子で形質導入された細胞中のＧＡＬＧＴ２の発現レベルを検出または測定することを更に含んでいる。ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定する方法（例えば、ウェスタンブロッティングなどの免疫測定法）は、当分野でよく知られている。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載された方法のいずれかは、ＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドで形質導入された細胞上に発現されたＣＴ抗原の量を検出または測定することを更に含んでいる（Ｃｈｉｃｏｉｎｅら、前述）。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載された方法のいずれかは、ＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドで形質導入された細胞上に発現されたウトロフィンの量を検出または測定することを更に含んでいる（Ｃｈｉｃｏｉｎｅら、前述）。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載された方法のいずれかは、中心核を有する繊維の数、この繊維はＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドで形質導入されたものであるが、を検出または測定することを更に含んでいる。

それ故、上述の方法で考慮されるｒＡＡＶの投与の経路は、限定はされないが、腹腔内（ＩＰ）、筋肉内（ＩＭ）および血管内（例えば、動脈内肢灌流（ＩＬＰ）や静脈内（ＩＶ））経路を含む。

本明細書に記載された方法により投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与の方法、治療の到達点、個人、目的の細胞の種類に依っておりさまざまであり、当該分野の基準に従った方法により決定され得る。一つ以上の用量、例えば、一つ、二つ、三つ、またはそれ以上の用量が投与される。用量中のｒＡＡＶの力価は、約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４から約１×１０^１５またはそれ以上の耐ＤＮＡ分解酵素粒子（ＤＲＰ）／ｍＬである。服用量はウイルスゲノム（ｖｇ）の単位でも表すことができる（すなわち、それぞれ１×１０^７ｖｇ、１×１０^８ｖｇ、１×１０^９ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１１ｖｇ、１×１０^１２ｖｇ、１×１０^１３ｖｇ、１×１０^１４、１×１０^１５である）。ＡＡＶの力価測定法はＣｌａｒｋら，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９（１９９９）に述べられている。

ＩＭ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約３×１０^１１から約５×１０^１２ｖｇ／注入である。（本明細書におけるすべての範囲は、その範囲内の各値と、個々の範囲の上限下限の値を表すことを意図している。）ＩＭ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約３×１０^１１ｖｇ／注入である。ＩＭ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１×１０^１２ｖｇ／注入である。ＩＭ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約５×１０^１２ｖｇ／注入である。

ＩＬＰ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約６×１０^１２から少なくとも約４．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。（本明細書におけるすべての範囲は、その範囲内の各値と、個々の範囲の上限下限の値を表すことを意図している。）ＩＬＰ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約６×１０^１２ｖｇ／ｋｇ／肢である。ＩＬＰ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ／肢である。ＩＬＰ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約２．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ／肢である。ＩＬＰ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約４．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ／肢である。

全身的ＩＶ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約２×１０^１４から少なくとも約６×１０^１５ｖｇ／ｋｇである。全身的ＩＶ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約４×１０^１４から少なくとも約６×１０^１５ｖｇ／ｋｇである。（本明細書におけるすべての範囲は、その範囲内の各値と、個々の範囲の上限下限の値を表すことを意図している。）全身的ＩＶ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約４×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。全身的ＩＶ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約８×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。全身的ＩＶ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約２×１０^１５ｖｇ／ｋｇである。全身的ＩＶ経路を投与経路とする上述の方法のいくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約６×１０^１５ｖｇ／ｋｇである。

本明細書において治療を考慮される対象者はヒト患者である。本明細書においてＩＭ送達による治療を考慮される対象者はヒト患者である。その様な患者としては、例えば、（ｉ）９歳以上の患者、（ｉｉ）男性患者、（ｉｉｉ）独歩患者または非―独歩患者、（ｉｖ）然変異を明確化できる臨床的に許容された技術を持って、ＤＭＤ遺伝子の突然変異が確認された患者（ｖ）短指伸筋（ＥＤＢ）の核磁気共鳴画像において、形質導入または遺伝子導入を可能とするほど十分な筋肉量を保持している患者、（ｖｉ）あらゆる人種の患者、（ｖｉｉ）全ての研究手順に協力できる能力を持つ患者、（ｖｉｉｉ）適切であるか、性的に成熟および／または活動的である場合、信頼できる避妊法を実行する意思のある患者、および／または（ｉｘ）遺伝子導入に先立ち少なくとも１２週間、副腎皮質ステロイド療法（例えば、デフラザコルト，プレドニゾン、またはそれらのジェネリック薬）の安定した用量を服用している患者が含まれる。適さない患者としては、例えば、（ｉ）臨床的知見に基づいて活性ウイルスに感染している患者、（ｉｉ）機能の脆弱化または喪失のないＤＭＤ突然変異を有する患者、（ｉｉｉ）労作時呼吸困難、足浮腫、横たわった時の呼吸困難、肺基底部のラッセル音などの心筋症の症状を示す患者、（ｉｖ）心エコー図による心駆出率が約４０％以下である患者、（ｖ）ＨＩＶ感染またはＡ、ＢまたはＣ型肝炎の血清学的証拠がある者、（ｖｉ）自己免疫疾患と診断されているまたはこれまでに診断されたことがある（または現在治療中である）患者、（ｖｉｉ）頑固な白血球減少または白血球増加（白血球数、３．５Ｋ／μＬ以上または２０．０Ｋ／μＬ以下）または１．５Ｋ／μＬ未満の絶対好中球数を持つ患者、（ｖｉｉｉ）病気を併発しているか、または開業医の所見において不要な遺伝子導入のリスクを伴うような慢性的医薬治療を必要とする患者、（ｉｘ）ＥＬＩＳＡ免疫測定法で１：４００以上のｒＡＡＶｒｈ７４結合抗体力価を持つ患者、または、（ｘ）抗－Ｓｄａ抗体の循環を示す患者である。例示的治療プロトコルにおいて、ＤＭＤ患者は、各々の患者の一つの短指伸筋（ＥＤＢ）にベクターｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２と各々の患者の他の一つのＥＤＢに生理食塩水のみの両側注射を受ける。対象者は、１×１０^１２ｖｇ（総用量）のベクター用量をうける。

上述および下述の方法における細胞形質導入の効率は、少なくとも約、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％である。ＩＶ肢灌流による送達を含む幾つかの実施形態において、形質導入効率は、ｒＡＡＶを送達された組成物の量を増加させること、ｒＡＡＶの送達前に事前洗浄を行うこと、および／またはｒＡＡＶの留まる時間を増やすことで、増加させることができる。

他の態様において、ｒＡＡＶゲノムが提供される。投与されたｒＡＡＶのゲノムは、転写制御配列の制御のもとＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドを含んでいる。該ｒＡＡＶゲノムはＡＡＶｒｅｐとｃａｐＤＮＡを欠いている。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶＤＮＡはその中で組換え体ウイルスが派生することができるＡＡＶ血清型のいずれか、限定ではないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１とＡＡＶｒｈ．７４を含むＡＡＶ血清型に由来する。これらのＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、上記の背景技術に記載されているように当該分野ではよく知られている。幾つかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶＤＮＡはＡＡＶｒｈ．７４に由来する。ＡＡＶｒｈ．７４ゲノムのポリヌクレオチド配列は、配列番号：１に提示されており、ここで、２１０－２１４７はＲｅｐ７８遺伝子オープンリーディングフレームであり、８８２－２０８はＲｅｐ５２オープンリーディングフレームであり、２０７９－２０８１はＲｅｐ７８ストップ、２１４５－２１４７はＲｅｐ７８ストップ、１７９７－１８００はスプライス供与部位、２０９４－２０９７はスプライス受容部位、２１２１－２１２４はスプライス受容部位、１７４－１８１はｐ５プロモーター＋１プレディクティド、１４５－１５１はｐ５ＴＡＴＡｂｏｘ、７５８－７６１はｐ１９プロモーター＋１プレディクティド、７３２－７３８はｐ１９ＴＡＴＡｂｏｘ、１７１１－１７１６はｐ４０ＴＡＴＡｂｏｘ、２０９８－４３１４はＶＰ１Ｃａｐ遺伝子オープンリーディングフレーム、２５０９－２５１１はＶＰ２スタート、２７０７－２７０９はＶＰ３スタートおよび４３２８－４３３３はｐｏｌｙＡシグナルである。

幾つかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムの転写制御配列は、筋－特異制御エレメントであり、限られるものではないが、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーなどのアクチンおよびミオシン遺伝子ファミリー（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照のこと）、筋細胞－特異エンハンサーバインディング因子ＭＥＦ－２（ＣｓｅｒｊｅｓｉおよびＯｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：４８５４－４８６２（１９９１））、ヒト骨格アクチン遺伝子から派生した制御エレメント（Ｍｕｓｃａｔら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：４０８９－４０９９（１９８７））、心アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター（Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３３９３－３３９９（１９８９））およびＭＣＫエンハンサー、ＭＨＣＫ７プロモーター（ミオシン重鎖を組み込んだＭＣＫプロモーターの改修版）（Ｓａｌｖａら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１５：３２０－３２９（２００７）］）、デスミンプロモーター、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子や遅心筋トロポニンＣ遺伝子や遅筋トロポニンＩ遺伝子から派生した制御エレメント、低酸素誘導因子（Ｓｅｍｅｎｚａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１））、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を含むステロイド誘導エレメントおよびプロモーター（ＭａｄｅｒおよびＷｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照のこと）、および他の制御エレメントを含んでいる。幾つかの実施形態において、転写制御エレメントはＭＣＫプロモーターを含んでいる。幾つかの実施形態において、転写制御エレメントははＭＨＣＫ７プロモーターを含んでいる。

幾つかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノム中のＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ５１７７７１に提示されているＧＡＬＧＴ２ｃＤＮＡである（配列番号：２のヌクレオチド１００２－２５２２として提示）。幾つかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノム中のＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ５１７７７１に提示されているＧＡＬＧＴ２ｃＤＮＡであるかまたは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のＧＡＬＧＴ２ｃＤＮＡと配列同一性を持つ変異ポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、該変異ポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ５１７７７１に提示されているＧＡＬＧＴ２ｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドと同じＧＡＬＧＴ２ポリペプチドをコードする。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ５１７７７１に提示されているＧＡＬＧＴ２ｃＤＮＡによってコードされるＧＡＬＧＴ２ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号：３に提示されている。幾つかの実施形態において、該変異ＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ５１７７７１に提示されているＧＡＬＧＴ２ｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３）と較べると少なくとも一つのアミノ酸配列が変更されている変異ＧＡＬＧＴ２ポリペプチドをコードする。アミノ酸配列の変更は、たとえば、一つ以上のアミノ酸の置換、削除、または挿入、好ましくは保存的置換、である。該変異ＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドは、ポリペプチドのグルコシルトランスフェラーゼ活性が保たれていれば、アミノ酸置換、削除、および挿入のいずれの組み合わせでもよい。一つの態様において、変異ＧＡＬＧＴ２ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ５１７７７１に提示されているＧＡＬＧＴ２ｃＤＮＡにコードされとアミノ酸配列（配列番号：３）と少なくとも６０％、７０％、８０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を持つように多くのアミノ酸変更がある。

幾つかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、ＭＣＫ．ＡＬＧＴ２ゲノムであり、そのＧＡＬＧＴ２遺伝子カセットの配列は配列番号：２に提示されており、以下に示される通りである。

更に他の態様において、配列番号：２に表わされているヌクレオチド配列を含む単離された核酸が提供される。幾つかの実施形態において、該単離された核酸は、配列番号：２に表わされているヌクレオチド配列から成る。

更に提供されるのは、５’から３’への順で、（ｉ）初めのＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ），（ｉｉ）筋クレアチンキナーゼプロモーター配列，（ｉｉｉ）ヒトＧＡＬＧＴ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および（ｉｖ）第二のＡＡＶ２ＩＴＲ配列を含む単離された核酸であり、ここで該ヒトＧＡＬＧＴ２ポリペプチドは、配列番号：３と少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列、配列番号：３と１００％の同一性アミノ酸配列、または配列番号：２のヌクレオチド１００２－２５２２によってコードされているものである。

上記核酸を含む組換えＡＡＶは、配列番号：２と少なくとも９０％の同一性のアミノ酸配列のヌクレオチド配列を含んでいるｒＡＡＶと同様と考えられる。

開示されたｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡプラスミドが提供される。該ＤＮＡプラスミドは、本明細書で考えられるｒＡＡＶゲノムを含んでいる。該ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に集合させるため、ヘルパーウイルスのＡＡＶ（例えば、アデノウイルス、Ｅ１－欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）への感染が容認できる細胞へ転移される。ＡＡＶ粒子を製造する技術、この技術に於いてパッケージされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐとｃａｐ遺伝子、およびヘルパーウイルスの機能が細胞に提供されるのであるが、は当該分野で標準化されている。ｒＡＡＶの製造は、次の成分が単一の細胞（本明細書では、パッケージング細胞と記されている）に存在することを必要とする、すなわちｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムと離れた（すなわち、その中に無い）ＡＡＶｒｅｐとｃａｐ遺伝子、およびヘルパーウイルス機能である。ＡＡＶｒｅｐとｃａｐ遺伝子は、そのために組換え体ウイルスが派生するＡＡＶ血清型のいずれかから得られ、また限られるものではないが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１とＡＡＶｒｈ７４を含くむ、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲと異なるＡＡＶ血清型から得られる。疑似タイプのｒＡＡＶの製造は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。例えば、カプシド変異のあるｒＡＡＶなどの他のタイプのｒＡＡＶ変種もまた考慮される。例えば、Ｍａｒｓｉｃら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照のこと。

パッケージング細胞を製造する方法は、ＡＡＶ粒子製造に必要なすべての成分を安定的に発現する細胞株を創り出すことである。例えば、ＡＡＶｒｅｐとｃａｐ遺伝子を欠損するｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶｒｅｐとｃａｐ遺伝子、耐ネオマイシン遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または多くのプラスミド）が細胞のゲノムに統合される。ＡＡＶゲノムはＧＣテーリングなどの手順（Ｓａｍｕｌｓｋｉら，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限酵素切断部位を含む人工リンカーを加えること（Ｌａｕｇｈｌｉｎら，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３９）、または直接、平滑末端ライゲーション（ＳｅｎａｐａｔｈｙおよびＣａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）によって細菌プラスミドに導入されてきた。パッケージング細胞株は、次に、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させられる。この方法の優位点は、細胞が選択可能であることとｒＡＡＶの大量生産に適していることである。他の適した方法の例では、プラスミドよりむしろアデノウイルスまたはバキュロウイルスをｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐとｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するのに採用している。自己相補性ゲノムを持つｒＡＡＶを製造する方法も該分野ではよく知られている。

ｒＡＡＶ製造の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９やＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９に論じられている。種々の取り組みが、Ｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら，１９８８Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．５，１７３，４１４、ＷＯ９５／１３３６５（Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．５，６５８．７７６）、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ１３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌら（１９９３）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋら（１９９６）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：１１２４－１１３２、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ．Ｎｏ．５，７８６，２１１、Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．５，８７１，９８２、とＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ．Ｎｏ．６，２５８，５９５に記載されている。上記の文献は、ｒＡＡＶ製造に関するセクションが特に強調されるが、その全てが参照として本明細書に組み込まれる。

更なる態様において、本開示は、このように、感染性ｒＡＡＶを製造するパケージング細胞を提供する。ある実施形態において、パッケージング細胞はＨｅＬａ細胞２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同族２９３株）などの安定的に形質転換された癌細胞である。他の実施形態において、パッケージング細胞は、低通過２９３細胞（Ｅ１アデノウイルスで形質転換されたヒト胎児由来腎臓細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児繊維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児繊維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）などの、形質転換された癌細胞ではない細胞である。

ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィーや塩化セシウム密度勾配法などの当該分野で標準化された方法で精製される。ヘルパーウイルスからのＡＡＶベクターの精製方法は、当該分野でよく知られており、例えば、Ｃｌａｒｋら，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）；ＳｃｈｅｎｐｐやＣｌａｒｋ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｍｅｄ．，６９４２７－４４３（２００２）、Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．６，５６６，１１８、およびＷＯ９８／０９６５７に開示されている方法が含まれる。

このように、他の態様において、本開示は、ＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶを考慮している。幾つかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４カプシドとＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、ｒＡＡＶのゲノムはＡＡＶｒｅｐとｃａｐＤＮＡを欠損している。本方法の実施形態において、ｒＡＡＶはｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２である。幾つかの実施形態において、ｒＡＡＶは自己相補性ゲノムである。

他の態様において、本開示は、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む組成物を考慮している。本開示の組成物は、薬学的に許容されるキャリアー中にｒＡＡＶを含んでいる。該組成物は、希釈剤などの他の成分も含んでいる。その様なキャリアーや成分は、需要者にとって毒性がなく、好ましくは、採用された用量や濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸、または他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノースまたはデキストリンなどの単糖類、二糖類および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの造塩対イオン、および／またはツイーン、プルロニックスまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性表面活性剤などが含まれる。幾つかの実施形態において、ｒＡＡＶはトリス、塩化マグネシウム、塩化ナトリウムとプルロニックＦ６８中で製剤化される。幾つかの実施形態において、ｒＡＡＶは２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭの塩化マグネシウムおよび０．００１％のプルロニックＦ６８を含む２００ｍＭの塩化ナトリウム中で製剤化される。

本明細書において、併用療法も考慮される。本明細書で用いられている併用とは、同時治療または順を追った治療を含んでいる。標準化されている医療的治療（例えば、コルチコステロイドおよび／または免疫抑制剤）との本開示の方法の併用は、新規な治療との併用として、特別に考慮される。種々の実施形態において、対象者は、本明細書で考慮される方法によって治療を受ける前、その間、またはその後（これらの３つの可能性のうち二つ以上の組み合わせのいずれの順番でもよい）、コルチコステロイドで治療を受ける。

無菌の注入可能な溶液が、上に列挙された種々のその他の成分とともに適当な溶媒に必要な量のｒＡＡＶを取り込むことによって調整され、必要ならば、ろ過殺菌される。一般的に、分散液は殺菌された活性成分を、基本の分散媒と上に列挙されたうちの必要な他の成分を含んでいる無菌の媒体に取り込むことによって調整される。無菌の注入可能な溶液の調整のための無菌粉末である場合、好ましい調整方法は、殺菌濾過された溶液から活性成分と必要なあらゆる添加成分の粉末を収集することができる真空乾燥および冷凍乾燥の技術である。

本発明の態様と実施形態は以下の実施例により説明する。

実施例１
ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２の名付けられた非先天的ｒＡＡＶが製造された。該ｒＡＡＶベクターは、筋クレアチンキナーゼプロモーター（ＭＣＫ；筋特異プロモーター）の制御下で完全なヒトＧＡＬＧＴ２ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ５１７７７１）を含んでいる。ＭＣＫプロモーター／エンハンサー配列が筋特異遺伝子発現を促進するために用いられ、これは、３５１ｂｐＭＣＫ核プロモーター（基部（プロキマル））に融合されたマウスＭＣＫ核エンハンサー（２０６ｂｐ）から成る。該核プロモーターの後に、５３ｂｐ内生性マウスＭＣＫエクソン１（非翻訳）が十分な転写阻害のために存在し、次にＳＶ４０遅延１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（９７ｂｐ）と小さな５’ＵＴＲ（非翻訳領域、６１ｂｐ）が続いている。イントロンと５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来である。ＧＡＬＧＴ２カセットは、ｍＲＮＡの終結のためのＡＴＧ開始と小さな５３ｂｐ合成ポリＡシグナルの直前にコンセンサスコザック配列を有する。ヒトＧＡＬＧＴ２カセットは、すでにＭａｒｔｉｎら（２００９）、上記に述べられている。含まれているウイルス性配列は、ＡＡＶ２の末端逆位配列（ＩＴＲ）のみであり、これはウイルスＤＮＡ複製とパッケージングの両方のため必要とされる。ｐＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２プラスミドは、ＡＡＶ２末端逆位配列が側に配置されているヒトＧＡＬＧＴ２ｃＤＮＡ発現カセットを含んでいる。該遺伝子カセットは、ＭＣＫプロモーター、遺伝子発現を最善化するためのコザック配列をもつキメライントロン、配列をコードするヒトＧＡＬＧＴ２とポリＡシグナルを含んでいる。遺伝子カセットの配列は、側に配置されているＡＡＶＩＴＲとともに配列番号：２に表わされている。

ＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターは、ＨＥＫ２９３細胞中で、アデノウイルスフリーの３重プラスミドＤＮＡ形質導入（リン酸カルシウム沈殿）方法において改良されたクロスパッケジングの手法で作られた（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：７９１－８０１（２００２））。ベクターは、すでに述べられている方法（Ｗａｎｇら，Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，１０：１５２８－１５３４（２００３））と同様な仕方で、ＡＡＶヘルパープラスミドｒｅｐ２－ｃａｐｒｈ．７４とアデノウイルスヘルパープラスミドでＧＡＬＧＴ２ポリヌクレオチドを含むプラスミドを同時形質導入することによって製造した。プラスミドｒｅｐ２－ｃａｐｒｈ．７４は野生型ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子とｒｈ．７４ｃａｐ遺伝子をコードし、アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ）は、高力価ｒＡＡＶ製造に要求されるアデノウイルス型５Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、とＶＡＩ／ＩＩＲＮＡ遺伝子を発現する。

ベクターは、すでに述べられているように（Ｃｌａｒｋら，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ，１０：１０３１－１０３９（１９９９））、清澄な２９３細胞溶解物から、逐次イオジキサノール勾配浄化と直線的な塩化ナトリウム塩勾配を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより浄化された。ベクターゲノム（ｖｇ）力価は、すでに述べられているように（Ｃｌａｒｋら，前述）、ＭＣＫ特異プライマー／プローブセットで、プリズム７５００Ｔａｑｍａｎ検出器システム（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定された。ベクターストック力価は１×１０^１２ｖｇ／ｍＬから４０×１０^１２ｖｇ／ｍＬであった。

ベクターは、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭの塩化マグネシウムおよび０．００１％のプルロニックＦ６８を含む２００ｍＭの塩化ナトリウム中で製剤化される。該ベクターは、臨床的投与の前に解凍される凍結液として供給される。

実施例２
ＤＭＤによる対象者へのＩＭ送達
ヒト患者が、本明細書においてＩＭ送達によって治療を受けると考えられる対象者である。例示的治療プロトコルにおいて、ＤＭＤ患者は、各々の患者の一つの短指伸筋（ＥＤＢ）にベクターｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２と各々の患者の他の一つのＥＤＢに生理食塩水のみの両側注射を受ける。第一コホートの対象者は、３×１０^１１ｖｇ（総用量）のベクター用量をうける。第二コホートの対象者は、より高い１×１０^１２ｖｇ（総用量）のベクター用量をうける。

臨床セッティングへの輸送の直前に、ベクターの適当な希釈液が調製される。注入のための希釈は、通常生理食塩水と１：１である。ベクターは、投与まで氷の（凍結されない）上で保たれ、調製から８時間以内に対象者に投与される。ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２の取り扱いは、バイオセーフティレベル１ベクターの遵守基準に従う。参照、ｗｗｗ４．ｏｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｂａ／ＲＡＣ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ＿０２／ＡＰＰＥＮＤＩＸ＿Ｇ．ｈｔｍ＃＿Ｔｏｃ７２４６５６１。

対象者は、臨床テストによる筋力低下がみられるものである。ＤＭＤの遺伝子的診断は、妥当な病歴の現場において、ＤＭＤと一致するＤＭＤ遺伝子突然変異に基づいて確立されている。本研究では、対象者はすべてＤＭＤの症状を示す年齢層内（すなわち、ステロイド治療なしの１２歳以下、または、長期にわたるステロイド治療の現場にいる１５歳以下）の歩行運動を失った非―独歩患者である。対象者は、治療に先立ち、安定した用量の副腎皮質ステロイド療法（プレドニゾンかデフラザコルトのいずれか、または、これらのジェネリック薬）を１２週間受ける。

ベクターまたは対照が対象者の一つの足の短指伸筋（ＥＤＢ）に直接筋肉内注射により送達され、もう一つの足は、生理食塩水のみを受ける。１２歳未満の協力者には、意識下鎮静法が用いられる。１２歳以上の患者は、遺伝子導入に先立ち少なくとも１時間、意識下鎮静法を受けるかまたは鎮静作用（ロラゼパムのような）を受ける。加えて、遺伝子導入部位の皮膚は、クリーム基剤（ＥＭＬＡクリーム）またはセルロースディスク（ＥＭＬＡパッチ）に組み込まれたリドカイン／プリロカイン共融混合物によって前処理が行われる。キシロカインクリームなど、同等のクリーム基剤の麻酔が採用される。無菌状態下で手順が執り行われる。注入部位は、ヨウ素を含まない手術用スワップで続けて３回塗布することで清浄にし、使い捨て無菌のドレープで覆う。通常の臨床用ドップラー超音波が導入を受ける者の周りの無菌のシースと共に用いられ注入現場の無菌状態を保つ。ＥＤＢへのｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２または偽薬のベクター注入のために、同期ＥＭＧ記録ができる使い捨てミオジェクト針（ＭｙｏＪｅｃｔＮｅｅｄｌｅｓ）と流動体注入が、筋肉注射の精度を高めるために用いられる。筋肉の解剖学的中心線が皮膚上で同定され、２～６の別々のベクター注入が筋肉に注入される。注入は、筋肉表面から０．５ｃｍの深さである。ベクターの総用量は、１．５ｍｌ中に３×１０^１１ｖｇの低用量投与群と１．５ｍｌ中に１×１０^１２ｖｇの高用量投与群である。超音波で測られたベクター送達の中央部と末端部の範囲は、遺伝子導入後の筋生検時の参考のために消えないレントゲンマーカーを付ける。

対象者のバイタルサインの綿密なモニタリングがつづいて行われる。注入後、併用薬物治療が観察され記録される。遺伝子導入後、（もし、副作用が観察されなければ）、対象者は、２日後退院できる。

対象者は、外来通院する。筋生検が４５日と９０日目に行われる。遺伝子導入後４５日と７５日、および９、１２、１８および２４か月目の免疫検査は、ｒＡＡＶｒｈ７４への抗体の結合とＧＡＬＧＴ２への抗体の結合試験とカプシド抗原に対するＴ細胞応答を検出するためＥＬＩＳｐｏｔ試験を含んでいる。対象者は、１年目と２年目の終わりに、身体検査、体力検査と免疫検査を受ける。

実施例３
予後有効度測定
ＥＤＢ筋から筋生検がおこなわれる。試料は、全てのｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２の注入を受けた者に対する追跡分析における盲検を保つため符号がつけられた。

予後有効度の測定は、抗－ＣＴエピトープ抗体で示されるＧＡＬＧＴ２発現、ウェスタンブロットで定量され密度検査で評価されるＧＡＬＧＴ２タンパク質発現、筋肉からのＧＡＬＧＴ導入遺伝子のｑＰＣＲによって測定され、遺伝子シングルコピー制御に正常化されるベクターゲノムとして表現される形質導入、ｔ－テストによって筋肉間で較べられる中心核を含む繊維の数、およびジストロフィン発現（Ｎ－末端、Ｃ－末端、および桿状部分に対する抗体による）ウトロフィン発現およびＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＭＡＣ３８７を含む白血球マーカーを含んでいる。筋肉は身体的外見のため調べられる。ｒＡＡＶｒｈ７４カプシドとＧＡＬＧＴタンパク質の両方に対するＰＢＭＣＥＬＩＳｐｏｔｓとともにｒＡＡＶｒｈ４７に対する抗体が、２年に及ぶ研究の間の異なる時々に評価される。遺伝子発現の筋肉分析も、盲検を壊すことなく行われる。

導入遺伝子発現が、一人の対象者の両ＥＤＢ筋の間で、また４５日と９０日の対象者の生体組織検査の間で盲検的に比べられた。Ａベクター特異プライマープローブセットが、内在性のＧＡＬＧＴ２から導入遺伝子発現ＧＡＬＧＴ２タンパク質を区別する独自の５’非翻訳領域を増強するのに用いられる。筋肉組織の直接免疫蛍光法（ＩＦ）およびウェスタンブロット（ＷＢ）研究を用いて筋肉の定量化が行われる。ＣＤ４＋とＣＤ８＋単核細胞が免疫染色法により定量され、ｍｍ^２面積あたりの細胞の数として報告される。ＭＨＣＩとＭＨＣＩＩ抗原発現が筋肉部位で査定される。繊維サイズ度数分布や中心核形成の定量分析を含む、筋肉形態測定も実施される。分析は、ウイルスＤＮＡのＰＣＲ分析も含んでいる。

免疫反応は、ＧＡＬＧＴ２とＡＡＶカプシドへのＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔによって査定される。標準偏差２未満のＩＦＮ－γのウイルスまたは導入遺伝子への上昇は、有意であると考えられる。免疫反応の追加測定は、ＡＡＶの抗体結合分析である。

考えられるものとしては、絶対筋力、偏心的筋肉の収縮の間の力減少、血清ＣＫ濃度、血清心筋トロポニン濃度、血清ＭＭＰ９濃度、握力、肢トルク、肢可動性または柔軟性、歩行運動、６分間歩行テスト、膝関節屈筋または伸筋の強度、最大随意筋等尺性収縮、ノーススター歩行能力評価、肢Ｔ２強調ＭＲＩ画像による筋肉量、脂肪減少または浮腫測定、筋収縮、肢関節角度、心機能（心拍数、心拍出量、％左室内径短縮率、１回拍出量）、呼吸機能（呼吸数、血中酸素濃度、酸素補給の必要性を含む）、筋肉壊死、筋肉再生、筋消耗、筋肉炎症、筋肉石灰化、筋肉中央核形成、筋肉サイズまたは筋線維サイズ、寿命、またはジストロフィンまたはラミニンα２タンパク質代用物発現（ウトロフィン（ｕｔｒｏｐｈｉｎ）、プレクチン１（ｐｌｅｃｔｉｎ１）、ラミニンα５（ｌａｍｉｎｉｎａｌｐｈａ５）、アグリン（ａｇｒｉｎ））の一つ以上の改善の測定がある。例えばＦｏｒｂｅｓら，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２６９（１）：１９８－２０７（２０１３）、Ｇｏｖｏｎｉら，ＣｅｌｌＭｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．，７０（２３）：４５８５－４６０２（２０１３）、ならびにＣｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎおよびＭａｒｔｉｎ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，４７９：２９１－３２２（２０１０）．

各測定において、遺伝子導入の前と後の試験の間の違いに基づく統計的分析が対応ｔ検定を採用して、優位を示す０．０５以上のｐ値をもって、分析される。

実施例４
分離式患肢灌流による血管送達
分離式患肢灌流（ＩＬＰ）と名付けられる血管送達経路も、ヒト患者の治療のために考慮される。大腿動脈を通じてＩＬＰ送達により、複数の脚筋が目標になり得る。該方法は、形質導入の効率を上昇しウイルスが大循環へ逃れることを防止しすることにより、肢の大循環からの隔離を許すものである（Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１８：１０９－１１７（２０１０））。例示的治験実施計画が以下に述べられている。

ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２が、上述の実施例１と２で調製される。

対象者は、治療に先立ち、安定した用量の副腎皮質ステロイド療法（プレドニゾンかデフラザコルトのいずれか、または、これらのジェネリック薬）を１２週間受ける。プレドニゾン治療も遺伝子導入後続けられる。鎮痛剤で安定化され麻酔された対象者は、外科床に付けられる。基部および末端止血帯が、ニホンザルの膝の上とすね筋の下にゆるく位置づけられる。出血を制御しカテーテル導入を補助するため、小さな切込みを大腿三角につけ、大腿動脈が見分けられ、解放切開され、基部と末端の結索糸でゆるく結ばれる。大腿動脈は、大腿に事前に設置されたワイアーのところまで水洗されたシースを通すことでセルディンガー方法によって３．０Ｆｒ導入シースでカニューレ処置された。シースは数センチだけ前に進められ３．０の編み絹糸で安定化された。

大腿動脈と静脈へのシースの設置に続いて、１００～２００ｕ／ｋｇの未分画ヘパリンを投与し、３～５分間循環させる。次に、チョイスＰＴ冠状ガイドワイアが、始めに右大腿静脈および動脈に挿入され、続いて最終的に左大腿静脈および動脈に挿入される。４ｍｍ径のバルーンカテーテル（ＴｙｓｈａｋＭｉｎｉＢａｌｌｏｏｎｃａｔｈｅｒｔｅｒ）が３．３－フレンチシース（３．３－Ｆｒｅｎｃｈｓｈｅａｔｈ）を通して、右大腿動脈を通して大腿－腸骨動脈接合部に通される。８ｍｍ径で２ｃｍ長さのバルーンカテーテル（８－ｍｍｄｉａｍｅｔｅｒｘ２ｃｍｌｏｎｇＴｙｓｈａｋＭｉｎｉＢａｌｌｏｏｎｃａｔｈｅｔｅｒ）が４－フレンチシース（４－Ｆｒｅｎｃｈｓｈｅａｔｈ）を通して、右大腿－腸骨動脈接合部の適切な位置に通される。希釈された対照の少量手動注入が、左大腿動脈と右大腿静脈両方の適切な閉塞を確認するため行われる。必要ならば、シースとバルーンはより大きなものと取り換えることができる。例えば、右大腿静脈における４－フレンチシースは６－フレンチシースに替えることができ、１２ｍｍ径で２ｃｍ長さのバルーンカテーテル（１２ｍｍｘ２ｃｍｌｏｎｇＴｙｓｈａｋＩＩＢａｌｌｏｏｎｃａｔｈｅｔｅｒ）がチョイスＰＴ冠状ガイドワイアを超え適当な位置にまで通される。大腿静脈中の位置と完全な閉塞を確認するため、少量手動注入がシースのサイドアームを通して行われる。

右脚を隔離して、右大腿動脈と大腿静脈両バルーンを膨らませた後、２ｍＬ／ｋｇのヘパリンを添加された乳酸リンゲル液を事前に染渡らせる。１分後に、乳酸リンゲル液の洗い流しを２ｍＬ／ｋｇで完了させる。次に、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２ベクターが、２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ／肢～４．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ／肢の間の用量で、８ｍＬ／ｋｇＬＲの量で、１分～１分３０秒にわたって注入される。（左右の肢灌流が行われるので、患者への総用量は４×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～９．６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）である。ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２が送達された後、留める時間を１０分間置き、次に右の大腿深動脈シースを用いて、１分以上２ｍＬ／ｋｇのヘパリンを添加された乳酸リンゲルを染渡らせる。次にバルーンをすぼませ、カテーテルと導入ワイアーが取り除かれる。

次に、同様の手順で左脚が目的とされる。左の大腿動脈が、３．３フレンチシース（３．３－Ｆｒｅｎｃｈｓｈｅａｔｈｓ）で保たれる。チョイスＰＴ冠状ガイドワイアを超えている左大腿動脈における４ｍｍ径のバルーンカテーテル（４－ｍｍｄｉａｍｅｔｅｒＴｙｓｈａｋＭｉｎｉＢａｌｌｏｏｎｃａｔｈｅｒｔｅｒ）と、同様に３気圧まで膨らませられた、左大腿静脈における５－フレンチシースを通る１２ｍｍ径で２ｃｍ長さのバルーンカテーテル（１２ｍｍｘ２ｃｍｌｏｎｇＴｙｓｈａｋＩＩＢａｌｌｏｏｎｃａｔｈｅｔｅｒ）を用いて、適切な血管閉塞が示される。１分以上の２ｍＬ／ｋｇのヘパリンを添加された乳酸リンゲルの注入が繰り返され、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２を２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ／肢～４．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ／肢の間の用量で、１０分の滞留時間をもって１分１５秒の間注入される。最後に、２ｍＬ／ｋｇのヘパリンを添加された乳酸リンゲルが左大腿深動脈シースを通して注入され、次に、圧迫止血処置をしながら、ＨｅｍＣｏｎパッチを用いて、シースが４つの全ての部位から取り除かれる。

ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２の他の必要とする筋肉群へ他の動脈を経て送達するために本処置手順の変形を採用することもできる。例えば、横隔膜、肋間および／または肋骨下動脈を通して横隔膜筋を供給する送達、または冠状動脈を通して心筋を供給する送達が考えられる。各手順のために、同じような用量を用いてもよく、複数の手順を一人の患者、または一人の入院患者に実施してもよい。

服用の完了時、止血帯とカテーテルが取り除かれ、出血を制御するため、傷に直接圧迫が１０分間加えられる。傷は、連続する表皮下の４．０Ｖｉｃｒｙｌ縫合糸によって閉じられる。圧力包帯が該部位にあてられ、対象者が麻酔から覚めるまで保たれる。

ＩＬＰベクター送達の医療手順に従って、ＩＭ－治療を受けた対象者に対し、上述の対象者の追跡調査と予後有効度の測定／分析が実施される。

実施例５
全身性血管送達
ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２ベクターの考えられる他の送達の方法は、全身性血管送達である。有効性を検査するための模範的用量の段階的増大についての研究は、以下のように実行される

用量範囲の決定
日齢１日目の１．４×１０^１５ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２の（尾静脈をへて）ＩＶ注入は、野生型マウスにおいて、前脛骨筋、腓腹筋、四頭筋、三頭筋を含む９０％以上の全ての肢の骨格筋の形質導入を引き起こし、同用量は、野生型マウスにおいて全ての心筋細胞の５０％以上およびｍｄｘモデルマウス心臓において７０％以上の心筋細胞の形質導入をもたらす。モック処置済ｍｄｘ対照動物との比較で、処置後３か月のｍｄｘマウスのあらゆる心臓機能の分析は、この用量のベクターでｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２処置の結果として、心拍数を刺激するβーアゴニストであるドブタミンによる刺激がある場合またはない場合いずれでも、明らかに心拍出量がほぼ２倍になることが示された。このように、病気と関連する心臓の病理が発症する前にベクターが与えられるとき、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２処置の結果として、ジストロフィン―不足の心臓から血流に８０％の増量がある。５×１０^１５ｖｇ／ｋｇが、静脈注射を用いて、全身隅々に心臓および骨格筋細胞の全てを形質導入するための最大治療用量と考えられる。このように、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇから５×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量範囲が、第四相臨床試験におけるすべての患者のｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２治療にとって最少有効量と最適有効量をカバーするものと考えられる。

プロトコル
実施例１と２に述べられたように、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２が調製される。

対象者は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２投与の１日前に、予防的経腸プレドニゾロン（糖質コルチコイド）（約１ｍｇ／ｋｇ／日）が始められる。プレドニゾロン治療は、遺伝子導入後も続けられる。

ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２注入に先立つ遺伝子導入日（０日）、バイタルデータ収集とともに、医的検査が行われる。

もし対象者が、ＰＩ判定で不適切に水分補給されているように見える場合、１０～２０ｍＬ／ｋｇの通常生理食塩水の大量摂取を、入院中と遺伝子導入の間行ってよい。対象者は、遺伝子導入の８時間前まで通常の食事をしてよく、その後は、固形食は摂らず、清澄な液体は遺伝子導入の２時間前まで許され、その後、完全に絶食となる。対象者は、麻酔前の基準にまで戻った後、通常の経口摂取を再開する。遺伝子導入は、資格を有する麻酔医の指示のもと、鎮静を緩やかなものにする光の下で、無菌状態で行われる。鎮静作用は様々でよいが、対象者は、静脈内経由でのプロポフォールの導入に先立ち亜硝酸の吸引を用いで鎮静化され、セボフルランの吸引またはプロポフォールの滴下によってその状態に保たれる。研究責任者（および麻酔医との相談によって）安全なベクターの送達のために鎮静が必要ではないと決定された対象者においては、鎮静化は見送ってよい。

治験の対象者は皆、末梢肢静脈を経てｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ＧＡＬＧＴ２の静脈注入を受ける。考えられる用量の範囲は、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０^１５ｖｇ／ｋｇである。

一例として、各用量のベクターは、希釈されずに与えられ、５０ｍＬかそれ以下に分けられ、ベクトン・ディッキンソンの６０ｍＬ容量のポリプロピレン注射器に満たされ、ＮＣＨ治験薬局により調製される。ベクター塩類溶液は約４００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌである。注入は、ＰｈａｒｍＧｕａｒｄＩｎｆｕｓｉｏｎＭａｎａｇｅｍｅｎｔＳｏｆｔｗａｒｅＳｕｉｔｅを備えるＳｍｉｔｈｓＭｅｄｉｃａｌＭｅｄｆｕｓｉｏｎ４０００ＳｙｒｉｎｇｅＩｎｆｕｓｉｏｎＰｕｍｐによって行われ、ＳｍｉｔｈｓＭｅｄｉｃａｌＭＸ５６３注入管によって送達される。注入速度は、いずれの対象者に対しても２ｍＬ／ｋｇ／分は超えない。注入は、約１０分から２０分にわたり行われる。ベクターは、注入の終わりに、通常生理食塩水を使い注入管から洗い流される。必要ならば、ベクターの用量は分けることができ、違った方法で投与することができると考えられる。

対象者は、注入の間、心拍数、呼吸数、血中酸素濃度や時々の血圧測定など、副作用を注意深く観察される。心拍数、呼吸数、血中酸素濃度、体温および血圧は、注入の前と直後、注入の間５分ごとに測られ、注入後１５分ごとに繰り返される。

対象者は、遺伝子導入に続いて集中治療床に残り、遺伝子導入後４８時間は病因に留まる。遺伝子導入後、バイタルサインが１時間ごとに４時間、続いて４時間ごとに退院まで記録される。研究責任者の心配がなければ、注入後観察の初めの２４時間の後、集中治療から転床が行われる。

ベクター送達のプロトコルに続き、上述のＩＭ治療を受けた対象者についてと同じように、対象者の追跡調査と予後有効度分析が行われる。

特定の実施形態の観点から、本発明を述べたが、当業者であれば変形や修正が可能であることは理解されるであろう。従って、特許範囲に述べられている制限のみが本発明を制限するものである。

該特許出願に引用されている全ての文献は、特に触れられている内容とともにその全体が参照として本明細書に組み込まれる。また、本特許出願は、２０１５年９月１７日出願された米国仮出願第６２／２２０１０７、２０１５年９月２０日に出願された米国仮出願第６２／２２１０６８、と２０１６年２月に出願された６２／３０１２６０の権利を主張するものであり、これら全体が本明細書に参照として組み込まれる。

Claims

配列番号：２のヌクレオチド５３－２７６２からなる核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）。
感染性である、請求項１に記載の核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）。
血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１またはＡＡＶｒｈ．７４である、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
前記ｒＡＡＶのゲノムにおけるＡＡＶＤＮＡが、ＡＡＶｒｈ．７４由来である、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、および薬学的に許容されるキャリアーを含む組成物。
神経筋障害を罹患したまたはそのリスクのある対象者において神経筋障害を治療または防止するように製剤化されている、請求項５に記載の組成物。
前記神経筋障害が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー（ＭＤＣ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ、２Ｎ、２Ｏおよび２Ｑ、ベスレムミオパチー、ウーリッヒ先天型筋ジストロフィー、筋・眼・脳病、福山型先天性筋ジストロフィー、ウォーカー・ワールブルク症候群、筋硬直性ジストロフィー、筋無力症症候群、先天型筋無力症、封入体ミオパチー、封入体筋炎、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、皮膚筋炎、中心核ミオパチー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、三好型ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、ネマリンミオパチー、埜中ミオパチー、重症筋無力症、または多発性筋炎である、請求項６に記載の組成物。
ｉ）筋肉内（ＩＭ）投与、分離式患肢注入もしくは分離式患肢灌流（ＩＬＰ）投与、または静脈内（ＩＶ）投与のために製剤化されている、
ｉｉ）ＩＭ投与のために製剤化されている、
ｉｉｉ）ＩＭ投与のために製剤化されており、かつ約３×１０^１１～少なくとも約５×１０^１２ｖｇ／注射の前記ｒＡＡＶの用量を含む、
ｉｖ）注入もしくはＩＬＰ投与のために製剤化されている、
ｖ）注入もしくはＩＬＰ投与のために製剤化されており、かつ約２×１０^１２～少なくとも約４．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ／肢の前記ｒＡＡＶの用量、または約４×１０^１２～少なくとも約９．６×１０^１３の総用量を含む、
ｖｉ）ＩＶ投与のために製剤化されている、
ｖｉｉ）ＩＶ投与のために製剤化されており、かつ約２×１０^１４～少なくとも約６×１０^１５ｖｇ／ｋｇの前記ｒＡＡＶの用量を含む、あるいは
ｖｉｉｉ）約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇの前記ｒＡＡＶの用量を含む、
請求項５～７のいずれか一項に記載の組成物。