BR112020026853A2 - produtos de vírus adeno-associados recombinantes e métodos para tratar a distrofia muscular de cinturas tipo 2a - Google Patents

Abstract

“produtos de vírus adeno-associados recombinantes e métodos para tratar a distrofia muscular de cinturas tipo 2ª”. são fornecidos produtos e métodos para o tratamento da distrofia muscular de cinturas tipo 2a. nos métodos, os vírus adeno-associados recombinantes liberam o dna que codifica uma proteína com atividade da calpaína 3.

Description

“PRODUTOS DE VÍRUS ADENO-ASSOCIADOS RECOMBINANTES E MÉTODOS PARA TRATAR A DISTROFIA MUSCULAR DE CINTURAS TIPO 2ª”

[001] Este pedido reivindica prioridade sobre o Pedido de Patente Provisório US Nº 62/691,934, depositado em 29 de junho de 2018 e o Pedido de Patente Provisório US Nº 62/865,081, depositado em 21 de junho de 2019, ambos os quais são incorporados neste documento por referência em sua totalidade. Campo da Invenção

[002] São fornecidos neste documento produtos e métodos para tratar a distrofia muscular de cinturas tipo 2A. Nos métodos, os vírus adeno-associados recombinantes distribuem DNA que codifica uma proteína com atividade de calpaína3 (CAPN3). Incorporação por Referência da Listagem de Sequências

[003] Este pedido contém, como uma parte separada da divulgação, uma Listagem de Sequências em formato legível por computador (nome do arquivo: 52684P2_SeqListing.txt; 23.755 bytes – arquivo de texto ASCII criado em 26 de junho de 2019) que é incorporada por referência neste documento em sua totalidade.

Fundamentos da Invenção

[004] As distrofias musculares (MDs) são um grupo de doenças genéticas. O grupo é caracterizado por fraqueza progressiva e degeneração dos músculos esqueléticos que controlam o movimento. Algumas formas de MD se desenvolvem na infância, enquanto outras podem não aparecer até a meia-idade ou mais tarde. Os distúrbios diferem em termos de distribuição e extensão da fraqueza muscular (algumas formas de MD também afetam o músculo cardíaco), a idade de início, a taxa de progressão e o padrão de herança.

[005] Um grupo de MDs é o grupo de MDs do tipo cintura (LGMD). As LGMDs são doenças raras e se apresentam de forma diferente em pessoas diferentes com relação à idade de início, áreas de fraqueza muscular, envolvimento cardíaco e respiratório, frequência de progressão e gravidade. As LGMDs podem começar na infância, adolescência, idade adulta jovem ou mesmo mais tarde. Ambos os sexos são igualmente afetados. As LGMDs causam fraqueza no ombro e na cintura pélvica, com músculos próximos na parte superior das pernas e braços, às vezes também enfraquecendo com o tempo. A fraqueza das pernas geralmente aparece antes da fraqueza dos braços. Os músculos faciais geralmente não são afetados. À medida que a condição progride, as pessoas podem ter problemas para caminhar e podem precisar usar uma cadeira de rodas ao longo do tempo. O envolvimento dos músculos do ombro e do braço pode levar à dificuldade de levantar os braços sobre a cabeça e levantar objetos. Em alguns tipos de LGMD, o coração e os músculos respiratórios podem estar envolvidos.

[006] Há pelo menos dezenove formas de LGMD e as formas são classificadas por seus defeitos genéticos associados. Tipo Padrão de Hereditariedade Gene ou Cromossomo LGMD1A Autossômico dominante Gene da miotilina LGMD1B Autossômico dominante Gene da lamina A/C LGMD1C Autossômico dominante Gene da ceveolina LGMD1D Autossomo dominante Cromossomo 7 LGMD1E Autossômico dominante Gene da desmina LGMD1F Autossômico dominante Cromossomo 7 LGMD1G Autossômico dominante Cromossomo 4 LGMD2A Autossômico recessivo Gene da calpaína-3 LGMD2B Autossômico recessivo Gene da disferlina LGMD2C Autossômica recessiva Gene do gama- sarcoglicano LGMD2D Autossômico recessivo Gene do alfa- sarcoglicano LGMD2E Autossômico recessivo Gene do beta- sarcoglicano LGMD2F Autossômico recessivo Gene do delta-

sarcoglicano LGMD2G Autossômico recessivo Gene da teletonina LGMD2H Autossômico recessivo TRIM32 LGMD2I Autossômico recessivo Gene do FKRP LGMD2J Autossômico recessivo Gene da titina LGMD2K Autossômico recessivo Gene do POMT1 LGMD2L Autossômico recessivo Gene da fukutina

[007] Testes especializados para LGMD estão agora disponíveis através de um esquema nacional para diagnóstico, o National Commissioning Group (NCG).

[008] As mutações no gene da calpaína3 (CAPN3) levam a uma das distrofias musculares de cinturas mais comuns em todo o mundo, LGMD2A. No momento, não há tratamento para essa doença hereditária. Estudos anteriores demonstraram o potencial de transferência do gene da CAPN3 para corrigir os sinais patológicos em camundongos com deficiência de CAPN3. No entanto, a expressão de CAPN3 impulsionada pelo promotor de desmina resultou em cardiotoxicidade [Bartoli et al., Mol. Ther., 13: 250-259 (2006)]. Em estudos de acompanhamento, a expressão muscular esquelética do gene foi estudada [Roudaut et al., Circulation, 128: 1094- 1104 (2013)].

[009] O vírus adeno-associado (AAV) é um parvovírus deficiente em replicação, cujo genoma de DNA de fita única tem cerca de 4,7 kb de comprimento, incluindo duas repetições terminais invertidas (ITRs) de 145 nucleotídeos. Há vários sorotipos de AAV. As sequências nucleotídicas dos genomas dos sorotipos de AAV são conhecidas. Por exemplo, o genoma completo de AAV-1 é fornecido no Nº de Adesão do GenBank NC_002077; o genoma completo do AAV-2 é fornecido no Nº de Adesão do GenBank NC_001401 e Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 {1983); o genoma completo do AAV-3 é. fornecido no Nº de Adesão do GenBank NC_1829; o genoma completo do AAV-4 é fornecido no Nº de Adesão do GenBank NC_001829; o genoma do AAV-5 é fornecido no Nº de Adesão do GenBank AF085716; o genoma completo do AAV-6 é fornecido no Nº de Adesão do GenBank NC_00 1862; pelo menos porções dos genomas AAV-7 e AAV-8 são fornecidas nos Nº de Adesão do GenBank AX753246 e AX753249, respectivamente; o genoma AAV-9 é fornecido em Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); o genoma AAV-10 é fornecido em Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); e o genoma do AAV-11 é fornecido em Virology, 330(2): 375-383 (2004). A sequência do genoma de AAV rh.74 é fornecida em vide Patente US 9,434,928, incorporada neste documento por referência. As sequências de ação cis que direcionam a replicação viral do DNA (rep), a encapsulação/empacotamento e a integração cromossômica da célula hospedeira estão contidas nas ITRs do AAV. Três promotores de AAV (chamados p5, p19 e p40 por causa de suas localizações relativas no mapa) conduzem a expressão dos dois quadros de leitura aberta interna de AAV que codifica genes rep e cap. Os dois promotores rep (p5 e p19), acoplados com o splicing diferencial do único íntron de AAV (nos nucleotídeos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40) do gene rep. As proteínas rep possuem múltiplas propriedades enzimáticas que são, em última instância, responsáveis pela replicação do genoma viral. O gene cap é expresso a partir do promotor p40 e codifica as três proteínas de capsídeo VP1, VP2 e VP3. Sítios alternativos de splicing e de início translacionais não consensuais são responsáveis pela produção das três proteínas de capsídeo relacionadas. Um único sítio de poliadenilação consensual está localizado na posição 95 do mapa do genoma do AAV. O ciclo de vida e a genética do AAV são analisados em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

[010] O AAV possui características únicas que o tornam atraente como um vetor para a distribuição de DNA estranho para as células, por exemplo, na terapia genética. A infecção por AAV de células em cultura não é citopática e a infecção natural de humanos e outros animais é silenciosa e assintomática. Além disso, o AAV infecta muitas células de mamíferos, permitindo a possibilidade de visar muitos tecidos diferentes in vivo. Além disso, o AAV transduz lentamente células que se dividem e não dividem, e pode persistir essencialmente durante a vida dessas células como um epissomo nuclear transcricionalmente ativo (elemento extracromossômico). O genoma pró-viral AAV é inserido como DNA clonado em plasmídeos, o que torna a construção de genomas recombinantes viável. Além disso, como os sinais direcionando a replicação do AAV e a encapsulação do genoma estão contidos dentro das ITRs do genoma do AAV, alguns ou todos os aproximadamente 4,3 kb internos do genoma (que codificam a replicação e proteínas do capsídeo estrutural, rep-cap) podem ser substituídos por DNA estranho. Para gerar vetores AAV, as proteínas rep e cap podem ser fornecidas em trans. Outra característica significativa do AAV é que ele é um vírus extremamente estável e saudável. Ele resiste facilmente às condições usadas para inativar o adenovírus (56° a 65 °C por várias horas), tornando a preservação do frio do AAV menos crítica. O AAV pode até ser liofilizado. Por fim, as células infectadas por AAV não são resistentes à superinfecção.

[011] Ainda há uma necessidade na técnica de tratamentos para LGMD2A.

Sumário

[012] São fornecidos neste documento métodos e produtos para distribuição de DNA que codificam uma proteína com atividade de calpaína3 (CAPN3). Tais métodos e produtos podem ser usados para tratar várias doenças, por exemplo, LGMD2A.

[013] Vírus adeno-associados recombinantes (rAAVs) são fornecidos que codificam uma proteína com atividade de calpaína3 (CAPN3). Os vírus adeno- associados recombinantes compreendem um polinucleotídeo que compreende uma sequência nucleotídica que codifica a proteína com atividade de CAPN3. A sequência nucleotídica que codifica a proteína com atividade de CAPN3, por exemplo, é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2 ou compreende a sequência da SEQ ID NO: 2.

[014] Por exemplo, o rAAV fornecido compreende um polinucleotídeo que compreende uma primeira repetição terminal invertida de AAV (ITR), um promotor, uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína com atividade de calpaína3 (CAPN3) e uma segunda ITR de AAV. A sequência nucleotídica que codifica a proteína com atividade de CAPN3, por exemplo, é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2, ou pelo menos 91% idêntica à SEQ ID NO: 2, pelo menos 92% idêntica à SEQ ID NO: 2, pelo menos 93% idêntica à SEQ ID NO: 2, pelo menos 94% idêntica à SEQ ID NO: 2, pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 2, pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 2, pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 2, ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 2. O rAAV compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína com atividade de CAPN3 que compreende a sequência da SEQ ID NO: 2.

[015] Além disso, o rAAV fornecido compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína com atividade de CAPN3 que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 7, pelo menos 91% idêntica à SEQ ID NO: 7, pelo menos 92% idêntica à SEQ ID NO: 7, pelo menos 93% idêntica à SEQ ID NO: 7, pelo menos 94% idêntica à SEQ ID NO: 7, pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 7, pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 7, pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 7, pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 7, ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 7. O rAAV compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína com atividade de CAPN3 que compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.

[016] O rAAV fornecido compreende uma sequência polinucleotídica que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 1, pelo menos 91% idêntica à SEQ ID NO: 1, pelo menos 92% idêntica à SEQ ID NO: 1, pelo menos 93% idêntica à SEQ ID NO: 1, pelo menos 94% idêntica à SEQ ID NO: 1, pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 1, pelo menos 96% idêntica à SEQ ID NO: 1, pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 1, pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 1, ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO:

1. O rAAV compreende uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1.

[017] A sequência nucleotídica, em uma modalidade, está sob o controle de transcrição de um promotor específico do músculo. Por exemplo, o promotor específico do músculo compreende um ou mais dentre um elemento do gene da actina esquelética humana, um elemento do gene da actina cardíaca, um promotor de desmina, um promotor de alfa-actina esquelética (ASKA), um promotor de troponina I (TNNI2), um elemento de ligação mef do fator de ligação ao potenciador específico de miócitos, um promotor de creatina quinase muscular (MCK), um promotor de MCK truncado (tMCK), um promotor de cadeia pesada de miosina (MHC), um promotor híbrido de potenciador de cadeia pesada de a-miosina/potenciador de MCK (MHCK7), um promotor de C5-12, um elemento potenciador de creatina quinase murina, um elemento do gene da troponina c de contração rápida esquelética, um elemento do gene da troponina c cardíaca de contração lenta, um elemento do gene da troponina i de contração lenta, elemento de resposta ao fator nuclear induzível por hipóxia (HIF) (HRE), um elemento induzível por esteroides, e um elemento de resposta de glicocorticoide (gre). Em uma modalidade, o promotor específico do músculo é um promotor de tMCK, que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 3.

[018] Por exemplo, o rAAV compreende um polinucleotídeo que compreende, em uma modalidade, uma primeira repetição terminal invertida de AAV (ITR), um promotor de tMCK, a sequência nucleotídica que codifica a proteína com atividade de calpaína3 e uma segunda repetição terminal invertida de AAV (ITR). A ITR de AAV (por exemplo, o primeiro e/ou segundo ITRs de AAV) é, por exemplo, uma repetição terminal invertida de AAV2. As proteínas do capsídeo do rAAV compreendem, por exemplo, uma proteína do capsídeo AAV rh.74 ou uma proteína do capsídeo AAV9.

[019] O rAAV fornecido compreende um ou mais dentre AAV-1, AAV-2, AAV- 3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh.74 e proteínas do capsídeo de AAV rh.10.

[020] Em outra modalidade, são fornecidas composições compreendendo qualquer um dos rAAV divulgados. Por exemplo, as composições são formuladas para injeção intramuscular ou injeção intravenosa.

[021] Também são fornecidos métodos de tratamento da distrofia muscular de cinturas tipo 2A em um sujeito compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer rAAV divulgado ou qualquer composição compreendendo um rAAV divulgado. Em qualquer um dos métodos fornecidos, o rAAV é administrado por injeção intramuscular ou injeção intravenosa.

[022] Por exemplo, nestes métodos, o tratamento resulta em um ou mais dentre: (a) aumento do diâmetro da fibra muscular, (b) diminuição do número de fibras musculares lobuladas pequenas, (c) diminuição do número de fibras com núcleos internos, (d) diminuição do conteúdo do tecido conjuntivo tipo endomísio, (e) correção da atrofia muscular e (f) aumento da geração de força muscular. A fibra muscular afetada pelo tratamento compreende uma ou mais fibras musculares oxidativas de contração lenta (DTA), fibra muscular oxidativa de contração rápida (FTA) e fibra glicolítica de contração rápida (FTG).

[023] Além disso, em qualquer um dos métodos fornecidos, o tratamento resulta em um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% de redução do número total de fibras musculares em até mm2 por 4 semanas após a administração; (b) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% de aumento do diâmetro de fibra musculares em até 4 semanas após a administração; (c) pelo menos 5%, 10%, até 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 42% de redução do número de fibras musculares STO por mm2 em até 4 semanas após a administração; (d) pelo menos 5%, 10%, até 15%, 20% ou 25% de aumento do diâmetro de fibras musculares STO em até 4 semanas após a administração; (e) pelo menos 5%, 10%, 15% ou 20% de redução do número de fibras musculares FTO por mm2 em até 4 semanas após a administração; (f) pelo menos 5%, 10%, 15%, ou 20% de aumento do diâmetro de fibra musculares FTO em até 4 semanas após a administração; (g) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% ou 35% de redução do número de fibras musculares FTG por mm2 em até 4 semanas após a administração; e (h) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% de aumento no diâmetro de fibras musculares FTG em até 4 semanas após a administração.

[024] Em qualquer um dos métodos fornecidos, o músculo cardíaco do sujeito exibe mínima ou baixa expressão de proteína de calpaína 3 a partir de qualquer um dos rAAV fornecidos, ou uma composição compreendendo qualquer um dos rAAV fornecidos. A fibra muscular afetada pelo tratamento com a composição compreende uma ou mais fibras musculares oxidativas de contração lenta (STO), fibra muscular oxidativa de contração rápida (FTO) e fibra glicolítica de contração rápida (FTG).

[025] São fornecidas composições para tratar a distrofia muscular de cinturas tipo 2A compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos rAAV divulgados ou uma composição compreendendo qualquer um dos rAAV divulgados. Estes compostos para tratamento de distrofia muscular de cinturas tipo 2A são formulados para administração por injeção intramuscular ou injeção intravenosa. Além disso, o tratamento com qualquer uma das composições divulgadas de distrofia muscular de cinturas tipo 2A resulta em um ou mais dentre: (a) um diâmetro aumentado de fibra muscular, (b) um número reduzido de fibras musculares lobuladas pequenas, (c) um número reduzido de fibras com núcleos internos, (d) um teor reduzido de tecido conjuntivo tipo endomísio, (e) correção da atrofia muscular e (f) uma geração aumentada de força muscular. A fibra muscular afetada pelo tratamento com a composição compreende uma ou mais fibras musculares oxidativas de contração lenta (STO), fibra muscular oxidativa de contração rápida (FTO) e fibra glicolítica de contração rápida (FTG).

[026] Além disso, o tratamento com qualquer uma das composições divulgadas para tratamento de distrofia muscular de cinturas tipo 2A resulta em um ou mais dentre: (a) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% de redução do número total de fibras musculares por mm2 em até 4 semanas após a administração; (b) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% de aumento do diâmetro de fibras musculares em até 4 semanas após a administração; (c) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 42% de redução do número de fibras musculares STO por mm2 em até 4 semanas após a administração; (d) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% de aumento do diâmetro de fibras musculares STO em até 4 semanas após a administração; (e) pelo menos 5%, 10%, 15% ou 20% de redução do número de fibras musculares FTO por mm2 em até 4 semanas após a administração; (f) pelo menos 5%, 10%, 15% ou 20% de aumento do diâmetro de fibras musculares FTO em até 4 semanas após a administração; (g) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% ou 35% de redução do número de fibras musculares FTG por mm2 em até 4 semanas após a administração; e (h) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% de aumento no diâmetro de fibras musculares de FTG em até 4 semanas após a administração.

[027] Além disso, o tratamento com qualquer uma das composições fornecidas para o tratamento da distrofia muscular de cinturas tipo 2A resulta no músculo cardíaco do sujeito exibindo mínima ou baixa expressão de proteína de calpaína 3 a partir de qualquer um dos rAAV fornecidos, ou uma composição compreendendo qualquer um dos rAAV fornecidos. O músculo cardíaco, após a administração com o rAAV, não exibe nenhum efeito tóxico ou tem pouco efeito tóxico, p. ex., inflamação, necrose e/ou regeneração.

[028] A divulgação também fornece o uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos rAAV divulgados ou uma composição compreendendo qualquer um dos rAAV divulgados para a preparação de um medicamento para o tratamento da distrofia muscular de cinturas tipo 2A. Por exemplo, o medicamento é formulado para administração por injeção intramuscular ou injeção intravenosa.

[029] Em qualquer um dos usos, o tratamento com o medicamento resulta em um ou mais dentre: (a) aumento do diâmetro da fibra muscular, (b) diminuição do número de fibras musculares lobuladas pequenas, (c) diminuição do número de fibras com núcleos internos, (d) diminuição do teor de tecido conjuntivo tipo endomísio, (e) correção da atrofia muscular e (f) aumento da geração de força muscular. A fibra muscular afetada pelo tratamento com o medicamento é uma ou mais das fibras musculares oxidativas de contração lenta (TOS), fibra muscular oxidativa de contração rápida (TOF) e fibra glicolítica de contração rápida (FTG).

[030] Além disso, em qualquer um dos usos de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer rAAV divulgado ou uma composição fornecida, o tratamento com o medicamento resulta em um ou mais dos seguintes: (a) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% de redução do número total de fibras musculares por mm2 em até 4 semanas após a administração; (b) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% de aumento do diâmetro de fibras musculares em até 4 semanas após a administração; (c) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 42% de redução do número de fibras musculares STO por mm2 em até 4 semanas após a administração; (d) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% de aumento do diâmetro de fibras musculares STO em até 4 semanas após a administração; (e) pelo menos 5%, 10%, 15% ou 20% de redução do número de fibras musculares FTO por mm2 em até 4 semanas após a administração; (f) pelo menos 5%, 10%, 15%, ou 20% de aumento do diâmetro de fibras musculares FTO em até 4 semanas após a administração; (g) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% ou 35% de redução do número de fibras musculares FTG por mm2 em até 4 semanas após a administração; e (h) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% de aumento no diâmetro de fibras musculares FTG em até 4 semanas após a administração.

[031] Em qualquer um dos usos de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos rAAV divulgados ou de uma composição fornecida, após o tratamento com o medicamento, o músculo cardíaco do sujeito não exibe nenhuma, mínima ou baixa expressão de proteína de calpaína 3 a partir dos AAV divulgados ou da composição fornecida. Breve Descrição das Figuras

[032] As Figuras 1A-1F mostram que a terapia genética restaurou a regeneração comprometida no músculo CAPN3-KO. O diagrama esquemático do rAAV AAV9.CAPN3 de fita simples é mostrado na Figura 1A. Entre as ITRs (repetições terminais invertidas) de fita simples 5' e 3', o promotor de creatina quinase muscular (MCK) (563 bp) conduz a expressão da estrutura de leitura aberta CAPN3 (2466 bp). Também marcado é o sítio de poliadenilação (Poli A, 53 bp). Os músculos tibial anterior (TA) de camundongos CAPN3-KO foram injetados pela primeira vez com CTX e 2 semanas depois com 1x1011 vg de AAV.CAPN3 no TA esquerdo (Figura 1B) ou PBS no TA direito (Figura 1C). Quatro semanas após a injeção de rAAV, o diâmetro muscular aumentou e as fibras lobuladas foram menos comuns em comparação com o músculo CAPN3-KO não tratado. Na Figura 1D, fibras lobuladas com um padrão de organela subsarcolemal, a distribuição de mitocôndrias (setas) sugerem fusão parcial de miotubos no músculo CAPN3-KO não tratado em ampliação mais alta. Barra de escala= 20 μm para B-D. Na Figura 1E, os histogramas de distribuição do tamanho de fibras musculares (média ± área de EPM/mm2; derivados de 3 camundongos em cada grupo) do músculo TA tratado e não tratado de camundongos CAPN3-KO mostram uma mudança para fibras de diâmetro maior com o tratamento e um aumento na subpopulação de diâmetro pequeno presente no grupo não tratado. Na Figura 1F, os histogramas de distribuição de tamanho de fibras oxidativas de contração lenta (STO) mostram um número maior de fibras pequenas (por exemplo, diâmetros de fibra iguais ou inferiores a 30 μm) no músculo CAPN3-KO não tratado em comparação com o músculo CAPN3-KO tratado.

[033] A Figura 2 mostra um diagrama esquemático do rAAV desta divulgação, chamado de "AAVrh.74.tMCK.CAPN3".

[034] As Figuras 3A-3B fornecem dados de Western Blot (painel A) e RT-PCR (painel B) após administração de AAVrh.74.tMCK.CAPN3 via injeção intramuscular (1E11 vg) e injeção sistêmica (3E12 vg e 6E12 vg). Esses dados foram comparados com lisado muscular humano normal (carga de proteína de gel de 60% total em comparação com lisados de camundongo) e camundongos CAPN3-KO não tratados.

[035] A Figura 4 fornece imagens representativas de seções de tecido coradas com SDH dos músculos TA CAPN3 KO (gene AAV.hCAPN3 injetado e não tratado) e do tipo selvagem (WT). O tamanho médio da fibra de fibras oxidativas de contração lenta (STO, escuro), oxidativas de contração rápida (FTO, intermediário) e glicolíticas de contração rápida (FTG, claro) pareceu normalizado em direção aos valores de WT no músculo TA de camundongos tratados com AAVrh.74.tMCK.CAPN3. Os tamanhos dos tipos de fibra com e sem tratamento são ilustrados na Tabela 4.

[036] A Figura 5 fornece os níveis relativos de expressão da proteína CAPN3 nos músculos WT (Z18-14) e TA da coorte de dose baixa (3E12 vg, Z18-13, Z18-15, Z18-16, Z18-17, Z18-18) e gastrocnêmio (gastroc), coração, quadríceps, tibial anterior (TA) e tríceps da coorte de dose alta (6E12 vg, Z18-20, Z18-21, Z18-23, Z18-24, Z18- 22) são mostrados (UT: não-tratados).

[037] A Figura 6 fornece cópias do vetor AAVrh74.tMCK.hCAPN3/μg de DNA genômico na coorte de dose alta sistêmica do genoma do vetor 6E12 nos seguintes músculos: quadríceps (quadríceps), coração, tibial anterior (TA), tríceps gastrocnêmio (gastroc) e fígado.

[038] A Figura 7 fornece os diâmetros médios das fibras oxidativas de contração lenta (STO, escuro), oxidativas de contração rápida (FTO, intermediário) e fibras glicolíticas de contração rápida (FTG, claro) do músculo TA esquerdo após a administração sistêmica de AAVrh.74.tMCK.CAPN3 em 3E12 e 6E12 vg. Dados de camundongos CAPN3KO e WT não tratados foram incluídos.

[039] A Figura 8 fornece os dados para o teste de corrida até a exaustão. A Figura 8A fornece dados para a coorte de dose baixa, que recebeu 3E12 vg de AAVrh.74.tMCK.CAPN3 e a coorte de dose alta, que recebeu 6E12 vg de AAVrh.74.tMCK.CAPN3 4 semanas após a administração sistêmica. Camundongos KO de CAPN3 tratados tiveram melhor desempenho no teste de corrida até a exaustão em comparação com as contrapartes não tratadas. A Figura 8B fornece dados para a coorte de dose alta, na qual os camundongos foram testados 20-24 semanas após a administração sistêmica de 6E12 vg de AAVrh.74.tMCK.CAPN3 (n=5) e contrapartes não tratadas (n-16)

[040] A Figura 9 fornece seções congeladas frescas com coloração de hematoxilina e eosina (H&E) dos ventrículos esquerdos de amostras cardíacas representativas de camundongos KO CAPN3 em 4 semanas após a injeção sistêmica do vetor AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3 em doses de 3E12 vg e 6E12 vg com controles não tratados correspondentes.

[041] A Figura 10 fornece a análise Western blot dos tecidos cardíacos da coorte de dose alta (que recebeu 6E12 vg de AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3. Esta análise mostrou nenhuma ou mínima proteína de calpaína 3 detectável no coração do animal tratado. Os números de identificação do animal Z18-19 e 22 representam os lisados dos camundongos KO CAPN3 não tratados. Descrição Detalhada

[042] Os AAVs recombinantes (rAAVs) fornecidos neste documento compreendem um polinucleotídeo que compreende uma primeira repetição terminal invertida de AAV (ITR), um promotor, uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína com atividade de calpaína 3 (CAPN3) e uma segunda ITR de AAV. Em uma modalidade, o nucleotídeo codifica CAPN3. As modalidades incluem, mas não estão limitadas a, um rAAV compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica

CAPN3 ou uma proteína com atividade de CAPN3, em que a sequência nucleotídica é pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, ou 89% idêntica à sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 2. As modalidades adicionais incluem, mas também não estão limitadas a, rAAV compreendendo uma sequência nucleotídica pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntica à sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 2 e codifica um polipeptídeo com uma atividade proteolítica CAPN3. A atividade proteolítica de CAPN3 é entendida na técnica como a atividade de proteolisar substratos potenciais, tais como fodrina e HSP60, e/ou a atividade de autoclivagem autoliticamente. Assim, conforme usado neste documento, o termo "uma proteína com atividade de calpaína 3 (CAPN3)" refere-se a uma proteína com atividade proteolítica de CAPN3, que inclui, mas não está limitada à atividade de substratos proteolizantes, tais como fodrina e HSP60, e/ou à atividade de autoclivagem autoliticamente. A proteína com atividade de CAPN3 pode ter a atividade total ou parcial de uma proteína de calpaína 3 de comprimento total. Em uma modalidade, a proteína com atividade de CAPN3 tem pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% de atividade de uma proteína CAPN3 de comprimento total. Em outra modalidade, a proteína com atividade de CAPN3 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 7.

[043] Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica que codifica a proteína com atividade de CAPN3 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, a proteína com atividade de CAPN3 compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 7. Em outra modalidade, a proteína com atividade de CAPN3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em outra modalidade, o polinucleotídeo do rAAV compreende uma sequência que é pelo menos

90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o polinucleotídeo compreende uma sequência pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o polinucleotídeo compreende a sequência da SEQ ID NO: 1.

[044] Em outro aspecto, é descrito neste documento um AAV recombinante que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína com atividade de CAPN3 e/ou que compreende uma sequência nucleotídica que hibridiza sob condições rigorosas para a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2, ou o complemento da mesma. O termo "rigoroso" é usado para se referir a condições que são comumente compreendidas na técnica como rigorosas. A rigorosidade de hibridização é determinada principalmente pela temperatura, força iônica e concentração de agentes desnaturantes, tais como a formamida. Exemplos de condições rigorosas para hibridização e lavagem são 0,015 M de cloreto de sódio, 0,0015 M de citrato de sódio a 65-68 oC ou 0,015 M de cloreto de sódio, 0,0015 M de citrato de sódio e 50% de formamida a 42 oC. Vide Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edição, Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, NY 1989).

[045] Em genomas recombinantes descritos neste documento, o polinucleotídeo CAPN3 está operacionalmente ligado a elementos de controle transcricional (incluindo, mas não limitado a, promotores, potenciadores e/ou íntrons), especificamente elementos de controle transcricional funcionais em células alvo de interesse. Por exemplo, várias modalidades fornecem métodos de transduzir células musculares usando elementos de controle transcricionais específicos do músculo, incluindo, mas não se limitando a, aqueles derivados das famílias dos genes da actina e miosina, como da família do gene myoD [Vide Weintraub et al., Science, 251: 761- 766 (1991)], o fator de ligação ao potenciador específico de miócitos MEF-2 [Cserjesi e Olson, Mol Cell Biol, 11: 4854-4862 (1991)], elementos de controle derivados do gene da actina esquelética humana [Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], elementos da sequência de creatina quinase muscular [Vide Johnson et al., Mol Cell Biol, 9: 3393-3399 (1989)] e o elemento potenciador de creatina quinase murina (mCK), elementos de controle derivados do gene da troponina C de contração rápida esquelética, o gene da troponina C cardíaca de contração lenta e o gene da troponina I de contração lenta: fatores nucleares induzíveis por hipóxia [Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)], elementos indutíveis por esteroides e promotores, incluindo o elemento de resposta glicocorticoide (GRE) [vide Mader e White, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 90: 5603-5607 (1993)], o promotor de tMCK [vide Wang et al., Gene Therapy, 15: 1489-1499 (2008)], o promotor de CK6 [vide Wang et al., supra] e outros elementos de controle.

Em uma modalidade, a sequência nucleotídica que codifica uma proteína com atividade de calpaína 3 (CAPN3) está operacionalmente ligada a um promotor específico do músculo.

Em uma modalidade, o promotor específico do músculo compreende um ou mais dentre um elemento do gene da actina esquelética humana, um elemento do gene da actina cardíaca, um promotor de desmina, um promotor de alfa-actina esquelética (ASKA), um promotor de troponina I (TNNI2), um elemento de ligação mef do fator de ligação ao potenciador específico de miócitos, um promotor de creatina quinase muscular (MCK), um promotor de MCK truncado (tMCK), um promotor de cadeia pesada de miosina (MHC), um promotor híbrido de potenciador de cadeia pesada de a-miosina/potenciador de MCK (MHCK7), um promotor de C5-12, um elemento potenciador de creatina quinase murina, um elemento do gene da troponina c de contração rápida esquelética, um elemento do gene da troponina c cardíaca de contração lenta, um elemento do gene da troponina i de contração lenta, elemento de resposta ao fator nuclear induzível por hipóxia (HIF) (HRE), um elemento induzível por esteroides, e um elemento de resposta de glicocorticoide (gre). Em outra modalidade, o promotor específico de músculo é um promotor MCK, um promotor tMCK ou um promotor MHCK7. Em algumas modalidades, o promotor específico de músculo é tMCK que compreende uma sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 3.

[046] Estudos anteriores mostraram que a expressão de CAPN3 impulsionada pelo promotor de desmina resultou em cardiotoxicidade. Em estudos de acompanhamento, a expressão seletiva do músculo esquelético do gene eliminou os defeitos cardíacos. Os genomas de AAV divulgados neste documento compreendem um promotor específico de músculo, tMCK para restringir a expressão de CAPN3 ao músculo esquelético e não mostraram toxicidade cardíaca após a administração sistêmica do vírus em 6E12 vg (duas vezes a dose inicial alta proposta) 4 semanas após a injeção gênica.

[047] Os genomas de rAAV descritos neste documento não possuem DNA cap e rep de AAV. Os genomas de rAAV fornecidos compreendem um polinucleotídeo CAPN3, conforme descrito acima, e um ou mais ITRs de AAV flanqueando o polinucleotídeo. O DNA de AAV nos genomas de rAAV pode ser de qualquer sorotipo de AAV para o qual um vírus recombinante pode ser derivado, incluindo, mas não se limitando a, sorotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh.74 e AAV rh.10. Outros tipos de variantes de rAAV, por exemplo, rAAV com mutações do capsídeo, também são contemplados. Vide, por exemplo, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900- 1909 (2014). Conforme observado na seção Fundamentos acima, as sequências nucleotídicas dos genomas de vários sorotipos de AAV são conhecidas na técnica. Para promover a expressão específica do músculo esquelético, AAV1, AAV5, AAV6, AAV8 ou AAV9 podem ser usados.

[048] Os plasmídeos de DNA fornecidos compreendem genomas de rAAV. Os plasmídeos de DNA são transferidos para células permitidas para infecção com um vírus auxiliar de AAV (incluindo, mas não limitado a, adenovírus, adenovírus com exclusão de E1 ou herpesvírus) para a montagem do genoma de rAAV em partículas virais infecciosas. Técnicas para produzir partículas de rAAV, nas quais um genoma de AAV a ser empacotado, genes rep e cap e funções de vírus auxiliares são fornecidos a uma célula são padrão na técnica. A produção de rAAV requer que os seguintes componentes estejam presentes dentro de uma única célula (denotada neste documento como uma célula de empacotamento): um genoma de rAAV, genes rep e cap de AAV separados (ou seja, fora) do genoma de rAAV e funções de vírus auxiliares. As ITRs de AAV e genes rep e cap podem ser de qualquer sorotipo de AAV para o qual o vírus recombinante pode ser derivado e pode ser de um sorotipo de AAV diferente do que as ITRs do genoma de rAAV, incluindo, mas não se limitando a, sorotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV- 9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh. 10 e AAV rh.74. A produção de rAAV pseudotipado é divulgada, por exemplo, em WO 01/83692, que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade. Assim, em uma modalidade, o rAAV compreende um ou mais dentre as proteínas de capsídeo AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV- 4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh.74 ou AAV rh.10. Em outra modalidade, o rAAV compreende uma proteína do capsídeo de AAV rh.74 ou uma proteína do capsídeo de AAV9.

[049] Um método de geração de uma célula de embalagem é criar uma linhagem celular que expressa estavelmente todos os componentes necessários para a produção de partículas de AAV. Por exemplo, um plasmídeo (ou múltiplos plasmídeos) compreendendo um genoma de rAAV sem genes rep e cap de AAV, genes rep e cap de AAV separados do genoma de rAAV e um marcador selecionável, tal como um gene de resistência à neomicina, são integrados no genoma de uma célula. Os genomas de AAV foram introduzidos em plasmídeos bacterianos por procedimentos tais como a adição de cauda de GC [Samulski et al., Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081 (1982)], adição de ligantes sintéticos contendo sítios de clivagem de endonuclease de restrição [Laughlin et al., Gene, 23:65-73 (1983)] ou por ligação direta de extremidade cega [Senapathy & Carter, J. Biol. Chem., 259:4661- 4666 (1984)]. A linhagem celular de empacotamento é então infectada com um vírus auxiliar, como o adenovírus. As vantagens deste método são que as células são selecionáveis e são adequadas para produção em larga escala de rAAV. Outros exemplos de métodos adequados empregam adenovírus ou baculovírus em vez de plasmídeos para introduzir genomas de rAAV e/ou genes rep e cap em células de empacotamento.

[050] Os princípios gerais da produção de rAAV são analisados, por exemplo, em Carter, Current Opinions in Biotechnology, 1533-1539 (1992); e Muzyczka, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129 (1992). Várias abordagens são descritas em Ratschin et al., Mol. Cell. Biol., 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol., 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988); Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989); Patente US Nº 5,173,414; WO 95/13365 e a Patente US correspondente Nº 5,658,776 ; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. , Vaccine, 13:1244-1250 (1995); Paul et al., Human Gene Therapy, 4:609-615 (1993); Clark et al., Gene Therapy 3:1124- 1132 (1996); Patente US Nº 5,786,211; Patente US Nº 5,871,982; Patente US Nº 6,258,595; e McCarty, Mol. Ther., 16(10): 1648-1656 (2008). Os documentos anteriores são incorporados por referência em sua totalidade neste documento, com ênfase particular nas seções dos documentos relacionados à produção de rAAV.

[051] Assim, são fornecidas células de embalagem que produzem rAAV infeccioso. Em uma modalidade, as células de empacotamento podem ser células cancerígenas estavelmente transformadas, tais como células HeLa e células PerC.6 (uma linhagem 293 cognata). Em outra modalidade, as células de empacotamento são células que não são células cancerígenas transformadas, tais como células 293 de baixa passagem (células renais fetais humanas transformadas com E1 de adenovírus), células MRC-5 (fibroblastos fetais humanos), células WI-38 (fibroblastos fetais humanos), células Vero (células renais de macacos) e células FRhL-2 (células pulmonares fetais de macaco Rhesus).

[052] O AAV recombinante fornecido neste documento é, portanto, partículas virais infecciosas, encapsuladas e deficientes em replicação que compreendem um genoma recombinante. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, um rAAV incluindo um genoma compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 que codifica CAPN3, um rAAV incluindo um genoma consistindo essencialmente na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1 que codifica CAPN3 e um rAAV (chamado “AAVrh.74.tMCK.CAPN3”) incluindo um genoma consistindo na sequência definida na SEQ ID NO: 1 que codifica CAPN3. Os genomas do rAAV não possuem DNA rep e cap de AAV, ou seja, não há DNA rep ou cap de AAV entre as ITRs do genoma de rAAV.

[053] A sequência da sequência AAVrh.74.tMCK.CAPN3 é estabelecida na SEQ ID NO: 1, na qual uma ITR de AAV2 abrange os nucleotídeos 1-128, o promotor de tMCK abrange os nucleotídeos 165-884, um íntron quimérico abrange os nucleotídeos 937-1069, uma Sequência Kozak abrange os nucleotídeos 1101-1106, o polinucleotídeo CAPN3 abrange os nucleotídeos 1107-3572, um sinal poli A abrange os nucleotídeos 3581-3780, e uma segunda ITR de AAV2 abrange os nucleotídeos 3850-3977.

[054] O rAAV pode ser purificado por métodos conhecidos na técnica, tais como por cromatografia de coluna ou gradientes de cloreto de césio. Métodos para purificar vetores rAAV do vírus auxiliar são conhecidos na técnica e incluem métodos divulgados, por exemplo, Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp e Clark, Methods Mol. Med., 69: 427-443 (2002); Patente US Nº 6,566,118;

e WO 98/09657.

[055] Em outra modalidade, as composições compreendendo rAAV descritas neste documento são fornecidas. As composições fornecidas compreendem rAAV em um carreador farmaceuticamente aceitável. As composições também podem compreender outros ingredientes, tais como diluentes e adjuvantes. Carreadores aceitáveis, diluentes e adjuvantes não são tóxicos para os receptores e são, preferencialmente, inertes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões como fosfato, citrato, ou outros ácidos orgânicos; antioxidantes como ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular; proteínas, como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, uma asparagina, arginina ou lisina; de monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos, incluindo glicose, uma manose, ou dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; álcoois de açúcar como manitol ou sorbitol; contra-íons salina como sódio; e/ou surfactantes não iônicos como Tween, Plurônicos ou polietilenoglicol (PEG).

[056] Os títulos de rAAV a serem administrados nos métodos descritos neste documento podem variar dependendo, por exemplo, do rAAV específico, do modo de administração, do objetivo de tratamento, do indivíduo e do(s) tipo(s) de célula que está(ão) sendo visado(s) e podem ser determinados por métodos padrão na técnica. Os títulos de rAAV podem variar de cerca de 1x1010, cerca de 1x1011, cerca de 1x1012, cerca de 1x1013, a cerca de 1x1014, ou mais partículas resistentes à DNase (DRPs) por ml. As dosagens também podem ser expressas em unidades de genomas virais (vg). Doses divulgadas exemplares incluem 1E11 vg, 3E12 vg e 6E12 vg.

[057] São contemplados neste documento métodos de transdução de uma célula alvo, tal como uma célula muscular com rAAV, in vivo ou in vitro. Os métodos in vivo compreendem a etapa de administrar uma dose eficaz ou múltiplas doses eficazes de uma composição que compreende um rAAV fornecido neste documento ao sujeito (por exemplo, um animal incluindo, entre outros, um paciente humano) em necessidade.

Se a dose for administrada antes do desenvolvimento de um distúrbio/doença, a administração é profilática.

Se a dose for administrada após o desenvolvimento de um distúrbio/doença, a administração é terapêutica.

Uma dose eficaz é uma dose que alivia (elimina ou reduz) pelo menos um sintoma associado ao estado do distúrbio/doença que está sendo tratado, que retarda ou impede a progressão para um estado do distúrbio/doença, que retarda ou impede a progressão de um estado do distúrbio/doença, que diminui a extensão da doença, que resulta em remissão (parcial ou total) da doença e/ou que prolonga a sobrevida.

Em comparação com o sujeito antes do tratamento, os métodos deste documento resultam em um ou mais dentre: u aumento do diâmetro da fibra muscular, uma diminuição do número de fibras musculares lobuladas pequenas, uma diminuição do número de fibras com núcleos internos, uma diminuição do teor de tecido conjuntivo tipo endomísio, correção da atrofia muscular e um aumento da geração de força muscular.

Em uma modalidade, a fibra muscular compreende uma ou mais fibras musculares oxidativas de contração lenta (STO), fibra muscular oxidativa de contração rápida (FTO) e fibra glicolítica de contração rápida (FTG). Em uma modalidade, o tratamento resulta em um ou mais dos seguintes (a) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40% de redução do número total de fibras musculares em até mm2 por 4 semanas após a administração; (b) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% de aumento do diâmetro de fibra musculares em até 4 semanas após a administração; (c) pelo menos 5%, 10%, até 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 42% de redução do número de fibras musculares STO por mm2 em até 4 semanas após a administração; (d) pelo menos 5%, 10%, até 15%, 20% ou 25% de aumento do diâmetro de fibras musculares STO em até 4 semanas após a administração; (e) pelo menos 5%, 10%, 15% ou 20% de redução do número de fibras musculares FTO por mm2 em até 4 semanas após a administração; (f) pelo menos 5%, 10%, 15%, ou 20% de aumento do diâmetro de fibra musculares FTO em até 4 semanas após a administração; (g) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% ou 35% de redução do número de fibras musculares FTG por mm2 em até 4 semanas após a administração; e (h) pelo menos 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% de aumento no diâmetro de fibras musculares FTG em até 4 semanas após a administração. O método desta divulgação, em uma modalidade, acarreta em nenhuma ou em uma quantidade mínima ou baixa de proteína calpaína 3 expressa a partir do rAAV no músculo cardíaco do sujeito administrado com o rAAV.

[058] Ensaios para examinar esses resultados são entendidos na técnica e/ou são descritos nos exemplos deste documento. Contempla-se uso dos métodos descritos neste documento para prevenir ou tratar distúrbios/doenças (por exemplo, distrofias musculares) causados por defeitos na atividade da CAPN3 ou defeitos na expressão da CAPN3. LGMD2A é um exemplo de uma doença contemplada para prevenção ou tratamento de acordo com os métodos.

[059] Terapias combinadas também são contempladas. A combinação, conforme usada neste documento, inclui tratamento simultâneo ou tratamentos sequenciais. As combinações dos métodos descritos neste documento com tratamentos médicos padrão (por exemplo, corticosteroides) são especificamente contempladas, assim como combinações com novas terapias.

[060] A administração de uma dose eficaz das composições pode ser por vias padrão na técnica incluindo, entre outras, intramuscular, parenteral, intravenosa, intratecal, oral, bucal, nasal, pulmonar, intracraniana, intraóssea, intraocular, retal ou vaginal. As vias de administração e sorotipos dos componentes de AAV do rAAV (em particular, as ITRs de AAV e proteína do capsídeo) podem ser escolhidos e/ou combinados pelos versados na técnica, levando em conta o estado da infecção e/ou doença que está sendo tratada e as células/tecidos alvo que devem expressar a CAPN3. Em uma modalidade, o rAAV é administrado por injeção intramuscular, injeção intravenosa, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea, administração epicutânea, injeção intravaginal, administração intradérmica ou administração nasal. Em outra modalidade, o rAAV é administrado por injeção intramuscular ou injeção intravenosa.

[061] Em particular, a administração real de rAAV descrita neste documento pode ser realizada usando qualquer método físico que transportará o vetor recombinante de rAAV para o tecido alvo de um animal. A administração inclui, entre outros, injeção no músculo, na corrente sanguínea e/ou diretamente no fígado. Demonstrou-se que a ressuspensão simples de um rAAV em solução salina tamponada com fosfato é suficiente para fornecer um veículo útil para a expressão do tecido muscular e que não há restrições conhecidas sobre os carreadores ou outros componentes que possam ser coadministrados com o rAAV. As proteínas do capsídeo de um rAAV podem ser modificadas de modo que o rAAV seja direcionado a um tecido alvo específico de interesse, tal como músculo. Consulte, por exemplo, WO 02/053703, cuja divulgação é incorporada por referência a este documento. As composições farmacêuticas podem ser preparadas como formulações injetáveis ou como formulações tópicas a serem distribuídas aos músculos por transporte transdérmico. Várias formulações para injeção intramuscular e transporte transdérmico foram desenvolvidas anteriormente e podem ser usadas na prática dos métodos. O rAAV pode ser usado com qualquer carreador farmaceuticamente aceitável para facilitar a administração e manuseio.

[062] Para injeção intramuscular, soluções em um adjuvante como óleo de gergelim ou amendoim ou óleo de amendoim em propilenoglicol aquoso podem ser empregadas, bem como soluções aquosas estéreis. Tais soluções aquosas podem ser tamponadas, se desejado, e o diluente líquido primeiro rendeu primeiro isotônico com solução salina ou glicose. Soluções de rAAV como um ácido livre (DNA contém grupos de fosfato ácido) ou um sal farmacologicamente aceitável podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um surfactante, tal como hidroxipropilcelulose. Uma dispersão de rAAV também pode ser preparada em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e misturas destes e em óleos. Em condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para impedir o crescimento de micro-organismos. Nesta conexão, os meios aquosos estéreis empregados são facilmente obtidos por técnicas padrão bem conhecidas pelos versados na técnica.

[063] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável sistêmico (por exemplo, intravenoso) incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que exista facilidade de seringabilidade. Deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra as ações contaminantes de micro- organismos como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido e similares), misturas adequadas destes e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de uma dispersão e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de micro- organismos pode ser realizada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[064] As soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporação do rAAV na quantidade necessária no solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguida por esterilização do filtro. Em geral,

as dispersões são preparadas pela incorporação do ingrediente ativo esterilizado em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre aqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação, em algumas modalidades, compreendem secagem a vácuo e/ou a técnica de liofilização, em que cada um destes pode produzir um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir da solução anteriormente filtrada e estéril deste.

[065] A transdução com rAAV também pode ser realizada in vitro. Em uma modalidade, as células musculares alvo desejadas são removidas do sujeito, transduzidas com rAAV e reintroduzidas no sujeito. Alternativamente, células musculares singênicas ou xenogênicas podem ser usadas se essas células não gerarem uma resposta imune inadequada no sujeito.

[066] Métodos adequados para a transdução e reintrodução de células transduzidas em um sujeito são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, as células podem ser transduzidas in vitro pela combinação de rAAV com células musculares, por exemplo, em meio apropriado, e triagem para aquelas células que contêm o DNA de interesse usando técnicas convencionais, tais como Southern blots e/ou PCR ou pelo uso de marcadores selecionáveis. As células transduzidas podem, então, ser formuladas em composições farmacêuticas e a composição introduzida no sujeito por várias técnicas, tais como por injeção intramuscular, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal ou por injeção no músculo liso e cardíaco, usando, por exemplo, um cateter.

[067] A transdução de células com rAAV por métodos descritos neste documento resulta na expressão sustentada de CAPN3 ou uma proteína com atividade de CAPN3. Portanto, são fornecidos métodos para administrar rAAV que expressa CAPN3 ou uma proteína com atividade de CAPN3 a um sujeito, preferencialmente um ser humano. O objeto desta divulgação inclui, entre outros,

humano, um cão, um gato, um cavalo, uma vaca, um porco, uma ovelha, uma cabra, uma galinha, um roedor (por exemplo, ratos e camundongos) e um primata. Esses métodos incluem a transdução de tecidos (incluindo, entre outros, tecidos como músculo, órgãos como fígado e cérebro e glândulas como glândulas salivares) com um ou mais rAAV descritos neste documento.

[068] O tecido muscular é um alvo atraente para a distribuição de DNA in vivo, porque não é um órgão vital e é fácil de acessar. Os métodos contidos neste documento fornecem expressão sustentada de CAPN3 de células musculares transduzidas.

[069] Por "célula muscular", "fibra muscular" ou "tecido muscular" entende-se uma célula ou grupo de células derivadas de músculos de qualquer tipo [por exemplo, músculo esquelético e músculo liso (por exemplo, do trato digestivo, bexiga urinária, vasos sanguíneos ou tecido cardíaco)]. Essas células musculares podem ser diferenciadas ou indiferenciadas, como mioblastos, miócitos, miotubos, cardiomiócitos e cardiomioblastos.

[070] O termo "transdução" é usado para se referir à administração/distribuição de CAPN3 a uma célula receptora in vivo ou in vitro, através de um rAAV descrito resultando na expressão de CAPN3 pela célula receptora.

[071] Assim, são fornecidos métodos de administração de uma dose eficaz (ou doses, administradas essencialmente de forma simultânea ou doses administradas em intervalos) de rAAV que codificam CAPN3 a um sujeito em necessidade.

[072] Conforme observado acima, os métodos descritos neste documento resultam no sujeito, em comparação com o sujeito antes do tratamento, os métodos deste documento resultam em um ou mais dentre: um aumento do diâmetro da fibra muscular, uma diminuição do número de fibras musculares oxidativas de contração lenta (STO) lobuladas pequenas, uma diminuição do número de fibras com núcleos internos, uma diminuição do teor de tecido conjuntivo tipo endomísio, correção da atrofia muscular e um aumento da geração de força muscular. Exemplos

[073] Os aspectos e modalidades são ilustrados pelos exemplos a seguir. O Exemplo 1 descreve a produção de AAV9.MCK.CAPN3. O Exemplo 2 descreve a administração intramuscular de AAV9.MCK.CAPN3. O Exemplo 3 descreve a produção de AAVrh.74.tMCK.CAPN3. O Exemplo 4 descreve a administração intramuscular de AAVrh.74.tMCK.CAPN3. O Exemplo 5 descreve a administração intravenosa de AAVrh.74.tMCK.CAPN3. O Exemplo 6 descreve estudos de desfecho. O Exemplo 7 descreve estudos de toxicologia e biodistribuição. O Exemplo 8 descreve o teste de biopotência in vivo após injeção intramuscular. O Exemplo 9 descreve o teste de biopotência in vivo após injeção sistêmica. O Exemplo 10 descreve a avaliação da distribuição sistêmica do gene AAVrh.74.tMCK.CAPN3. O Exemplo 11 descreve a avaliação da toxicidade cardíaca após a injeção sistêmica do vetor AAVrh.74.tMCK.CAPN3. O Exemplo 12 descreve a análise fisiológica in vivo. Exemplo 1 Produção de AAV9.MCK.CAPN3

[074] Foi produzido um vetor AAV (chamado AAV.CAPN3) portando o gene CAPN3 sob o promotor MCK específico do músculo (Figura 1A). Um DNA incluindo o quadro de leitura aberto de CAPN3 de camundongo (NM_007601.3) entre dois sítios de restrição Not1 foi sintetizado pela Eurofin Genomics, EUA, e depois foi subclonado em um vetor AAV.MCK de fita simples (creatina quinase muscular) previamente descrito em Rodino-Klapacet al., Journal of Translational Medicine, 5:45-55 (2007)]. Os vetores rAAV foram produzidos por uma abordagem de empacotamento cruzado modificado por meio da qual o genoma do vetor de tipo 2 de AAV pode ser empacotado em múltiplos sorotipos de capsídeo de AAV. [Rabinowitz et al., J Virol. 76 (2):791-801 (2002)]. A produção foi realizada usando um método de precipitação de DNA/CaPO4 de três plasmídeos padrão usando células HEK293. Células 293 foram mantidas em DMEM suplementado com soro bovino fetal (FBS) 10% e penicilina e estreptomicina. Os plasmídeos de produção foram: (i) pAAV.MCK.microdys, (ii) plasmídeos helper de AAV modificados por rep2-capX codificando sorotipos cap 1, 6 ou um isolado similar a 8 e (iii) um plasmídeo helper tipo 5 de adenovírus (pAdhelper) expressando genes de RNA de adenovírus E2A, E4 ORF6 e VA I/II. Para possibilitar comparações entre sorotipos, um método de titulação baseado em PCR quantitativa foi usado para determinar um título de genoma de vetor encapsulado (vg) utilizando um sistema detector Prism 7500 Taqman (PE Applied Biosystems). [Clark et al., Hum Gene Ther. 10 (6): 1031-1039 (1999)] O primer e a sonda fluorescente direcionaram o promotor MCK e foram os seguintes: primer forward de MCK, 5-CCCGAGGCCTGGTTAATT-3 (SEQ ID NO: 4); primer reverse de MCK, 5-GCTCAGGCAGGCAGGTGTTG-3 (SEQ ID NO: 5); e sonda de MCK, 5-FAM- CCAGACATGTGGGCTGCTCCC-TAMRA-3 (SEQ ID NO: 6).O título final (vgml−1) foi determinado por PCR de transcriptase reversa quantitativa usando os primers e sondas específicos para o promotor MCK utilizando um sistema detector em tempo real Prism 7500 (PE Applied Biosystems, Grand Island, NY, EUA). Os vírus em alíquotas foram mantidos a −80°C até o uso. Exemplo 2 Administração intramuscular de AAV9.MCK.CAPN3

[075] Para demonstrar se CAPN3 WT pode restaurar o processo de regeneração comprometido em camundongos submetidos a nocaute para CAPN3 (CAPN3-KO), os músculos de camundongos CAPN3-KO (n=4) [Kramerova et al., Hum Mol Genet 13(13):1373-1388 (2004)]] sob anestesia foram primeiramente injetados com 30 μl de CTX e, 2 semanas depois, foram transduzidos para expressar CAPN3 de tipo selvagem usando AAV9.MCK.CAPN3 em 1x1011 vg em volume de 20 μl via injeção intramuscular. Os músculos TA de outra coorte de CAPN3-KO (n=4), servidos como controles, receberam o mesmo volume de PBS 2 semanas após a injeção de CTX.

[076] Os camundongos foram sacrificados 6 semanas após a injeção de CTX e os músculos TA foram removidos e processados para seccionamento de criostato. Seções transversais com espessura de doze μm foram primeiramente coradas com H&E para avaliação histopatológica de rotina; medições de diâmetro específico do tipo de fibra muscular foram obtidas a partir de seções transversais coradas com SDH de TA de 3 camundongos em cada grupo. Três imagens aleatórias de TA (por seção por animal) foram fotografadas em ampliação X20 e as medições de diâmetro da fibra e histogramas específicos do tipo de fibra foram gerados.

[077] A histoquímica da enzima succinato desidrogenase (SDH) foi usada para avaliar a diferenciação do tipo de fibra metabólica [oxidativa de contração lenta (STO), oxidativa de contração rápida (FTO) e glicolítica de contração rápida (FTG)]. As medições de diâmetro específico do tipo de fibra muscular foram obtidas usando cortes transversais corados com SDH de 12 μm de espessura em 4 e 12 semanas após a injeção final de cardiotoxina. Três imagens, cada uma representando três zonas distintas do músculo gastrocnêmio (uma zona profunda predominantemente composta de STO, zona intermediária mostrando uma aparência quadriculada de STO e FTO ou FTG e a zona superficial predominantemente composta de fibras FTG) ao longo do eixo da linha média (por seção por animal) foram fotografadas na ampliação X20 usando um microscópio Olympus BX41 e câmera SPOT (Olympus BX61, Japão). Essa abordagem foi escolhida para capturar as alterações no estado oxidativo das fibras em cada zona em resposta a alterações metabólicas durante a regeneração. Os diâmetros das fibras escuras (STO), intermediárias (FTO) e claras (FTG) foram determinados pela medição da distância mais curta ao longo da fibra muscular usando o software Zeiss Axiovision LE4 (v.4.8). Os histogramas de diâmetro da fibra foram gerados separadamente para STO; FTG e FTO foram combinados para representar a população total de fibras de contração rápida (FTG/O), derivada de 3 animais e expressa como número por mm2 da área do endomísio (média ± SEM). O diâmetro médio da fibra foi derivado da combinação de todos os 3 tipos de fibra. Uma média de 900–1700 fibras foi medida por grupo. Foram usados músculos TA para avaliação da fibrose (vide abaixo)

[078] Quatro semanas após a injeção de AAV9.MCK.CAPN3, foi observado um aumento significativo no diâmetro muscular com uma diminuição aparente dos núcleos internos e um número muito menor de fibras pequenas com padrão lobulado (Figura 1B). O músculo CAPN3-KO não tratado tinha 31,6% mais fibras por área em mm2, principalmente composta por fibras STO pequenas e lobuladas indicando que o tratamento melhorou a fusão de miotubos, diminuindo, portanto, o número de fibras pequenas individuais por área de unitária (Figura 1, C e D; Tabela 1). Tabela 1 – Tamanho da fibra muscular anterior tibial Não tratados Não Tratado com Tratado com Número por mm2 tratados AAV.CAPN3 AAV.CAPN3 Diâmetro Número por mm2 Diâmetro STO 355 32,72 ± 0,4 233 39,81 ± 0,6* FTG/O 116 44,26 ± 0,9 99 50,40 ± 1,2* Todas 471 35,55 ± 0,4 322 43,08 ± 0,6* as fibras *p < 0,0001 em comparação com o mesmo parâmetro de tipo selvagem

[079] Os histogramas de distribuição do tamanho da fibra do músculo TA tratado mostraram uma mudança para fibras de diâmetro maior com tratamento e o número excessivo de fibras pequenas no músculo controle CAPN3-KO não tratado são do tipo de fibra histoquímica STO (Figuras 1E e 1F). Em conjunto, esses achados mostram que a substituição de CAPN3 via terapia gênica no músculo CAPN3-KO resgatou a regeneração defeituosa, evidenciada pela normalização do tamanho da fibra e uma diminuição no número de populações de fibras STO. Exemplo 3 Produção de AAVrh.74.tMCK.CAPN3

[080] Foi produzido um vetor AAV (chamado AAVrh74.tMCK.CAPN3) portando o gene CAPN3 sob um promotor MCK específico do músculo truncado (promotor tMCK). Um DNA incluindo o quadro de leitura aberto do CAPN3 de camundongo (NM_007601.3) entre dois sítios de restrição Not1 foi sintetizado pela Eurofin Genomics, EUA, e, então, inserido em um plasmídeo de produção de AAV. Um mapa do plasmídeo é mostrado na Figura 2.

[081] Os vetores rAAV foram então produzidos pela abordagem descrita no Exemplo 1.

Exemplo 4 Administração intravenosa de AAVrh.74.tMCK.CAPN3

[082] Camundongos CAPN3-KO, 6 meses de idade, receberam AAVrh.74.tMCK.CAPN3 em doses baixas (3x1012 vg) e altas (6x1012 vg) por injeção na veia da cauda. Os camundongos foram sacrificados 20 semanas após a injeção gênica para estudos de desfecho. Os camundongos CAPN3-KO tratados com veículo com idade correspondente serviram como controles. Tabela 2 - Coortes de tratamento Idade no Dose do Duraçã Idade Nº total de Coorte Tratame início tratamento o do no camundon s nto do (AAVrh.74.tMCK.C tratame Desfec gos tratame APN3) nto ho nto

CAPN 40 3-KO 24 3e12 vg em 300 μl 20 44 Dose AAV.CA 8 semana de solução salina, semana seman baixa PN3 s i.v. s as Tratame 24 20 nto com 44 8 semana semana solução seman s s salina as 24 6e12 vg em 300 μl 20 44 Dose AAV.CA 8 semana de solução salina, semana seman Alta PN3 s i.v. s as Tratame 8 24 20 44 nto com semana semana seman solução s s as salina Control Tratame es de 24 20 44 nto com tipo 8 semana semana seman solução selvag s s as salina em

[083] Estudos de desfecho realizados conforme descrito no Exemplo 7 abaixo incluem fisiologia muscular (geração de força de TA ou ensaio de contratilidade muscular in vivo e proteção contra contrações excêntricas), histopatologia muscular, detecção de hCAPN3 usando qPCR e análise por Western blot. Exemplo 5 Administração intramuscular de AAVrh.74.tMCK.CAPN3

[084] As respostas regenerativas são medidas em músculos de CAPN3-KO jovens e idosos à necrose sincronizada induzida por cardiotoxina (CTX) após a introdução de CAPN3 no músculo regenerador via tratamento com rAAV.

[085] Em coortes de camundongos jovens (com 2 meses de idade) e idosos (com 6 meses de idade), a CTX é injetada em ambos os músculos TA para induzir necrose sincronizada 2 semanas antes da injeção de rAAV no músculo TA esquerdo. AAVrh.74.tMCK.CAPN3 a 1x1011 vg em volume de 20 μl é administrado por injeção intramuscular. Estudos de desfecho são realizados 8 semanas após a transferência gênica (na dose de 1x1011 vg com eficácia estabelecida em nossos estudos anteriores) para avaliar a correção do defeito de regeneração comparando histologia quantitativa e achados fisiológicos de TA esquerdo ao TA direito não tratado.

Tabela 3 – Coortes de tratamento músculo Idad TA e no Dose de Nº total bilateral- início Duraç Idade tratamento Coort Tratament de inj CTX; da ão do no (AAVrh.74.tMC es o camund idade/via terap tratam Desf K.CAPN3) TA ongos de ia ento echo esquerdo distribuiçã gênic o/dose a

CAP CTX+AAV. N3- 16 CAPN3

KO 6 8 8 16 Jove 1e11 vg em 30 8 semanas/ sema sema sema m μl PBS, i.m. i.m./30 μl nas nas nas 22 24 8 32 1e11 vg em 30 Idoso 8 semanas/ sema sema sema μl PBS, i.m. i.m./30 μl nas nas nas Tipo Apenas selva 18

CTX gem 6 8 8 16 Jove 8 semanas/ sema 30 μl PBS sema sema m i.m./30 μl nas nas nas 22 24 8 32 Idoso 8 semanas/ sema 30 μl PBS sema sema i.m./30 μl nas nas nas

[086] Oito semanas após a injeção de rAAV, os estudos de desfecho realizados conforme descrito no Exemplo 6 abaixo incluem fisiologia muscular (geração de força de TA e proteção contra contrações excêntricas), histopatologia muscular quantitativa, detecção de hCAPN3 usando qPCR e análise de western blot. Exemplo 6 Estudos de Desfecho Geração de força de TA e proteção contra contrações excêntricas

[087] Um protocolo para avaliar efeitos funcionais no músculo TA é realizado nos músculos extraídos de camundongos [Wein et al., Nature Medicine, 20(9):992- 1000 (2014)]. Os camundongos são anestesiados usando mistura de cetamina/xilazina. Usando um endoscópio de dissecção, a pele do membro posterior é removida para expor o músculo TA e a patela. O tendão TA distal é dissecado e um nó quadrado duplo é amarrado em torno do tendão com sutura 4-0 o mais próximo possível do músculo e o tendão é cortado. O músculo exposto é constantemente umedecido com solução salina. Os camundongos são então transferidos para uma plataforma controlada termicamente e mantidos a 37 graus. O joelho é fixado à plataforma com uma agulha através do tendão da patela, a sutura distal do tendão TA até o braço nivelado do transdutor de força (Aurora Scientific, Aurora, ON, Canadá) e o pé é preso com fita. As contrações do músculo TA são provocadas pelo estímulo do nervo ciático através de eletrodos de platina bipolares. Assim que o músculo foi estabilizado, o comprimento ideal foi determinado pelo alongamento incremental do músculo até que a força de contração máxima fosse alcançada. Após um período de repouso de 3 minutos, o TA é estimulado a 50, 100, 150 e 200 Hz, permitindo um período de repouso de 1 minuto entre cada estímulo para determinar a força tetânica máxima. O comprimento muscular é medido. Após um repouso de 5 minutos, a suscetibilidade do músculo TA à lesão induzida por contração é avaliada. Após 500 ms de estímulo, o músculo é alongado em 10% do comprimento ideal. Isso inclui estimular o músculo a 150 Hz por 700 ms. Após o estímulo, o músculo retorna ao comprimento ideal. O ciclo é repetido a cada minuto por um total de 10 ciclos. A força específica é calculada dividindo-se a força tetânica máxima pela área transversal do músculo TA. Após as contrações excêntricas, os camundongos são sacrificados e o músculo TA é dissecado, pesado e congelado para análise. A análise dos dados é realizada em caráter cego, mas não randômico. Ensaio de contratibilidade muscular in vivo

[088] Este ensaio mede o torque agregado produzido pelos músculos plantares ou dorsiflexores do membro inferior e é realizado usando aparelho de fisiologia muscular (Aurora Scientific, ON, Canadá). O animal é anestesiado com isoflurano. Depois que o animal for anestesiado, os pelos das costas e do membro posterior serão removidos, conforme necessário, com tosquiadores. Se a remoção de pelos com tosquiador for insuficiente, uma fina camada de creme para remoção de pelos (Nair) é aplicada e o local é completamente limpo com água morna para não causar desconforto. O membro posterior a ser medido é fixado à placa de suporte com fita adesiva. O membro é mantido rígido em uma braçadeira contundente. O componente tibial ou peroneal do nervo ciático será estimulado com dois eletrodos monopolares descartáveis e estéreis de calibre 28 inseridos pela pele, por via subcutânea, perto do nervo. A temperatura do camundongo será mantida pela almofada de aquecimento termorregulada condutora (ajustada a 37 oC) ou fonte de calor radiante e monitorada pela sonda de temperatura. Histopatologia

[089] Para análise histológica, todos os músculos e órgãos são incorporados em goma de tragacanto 7% e congelados instantaneamente em isopentano resfriado por nitrogênio líquido. Seções congeladas (12 μm) são coletadas para análise imuno- histoquímica e western blot. Análise por Western blot para detecção de CAPN3 humana

[090] A quantificação da proteína CAPN3 em tecidos musculares de camundongos é avaliada usando um método de Western blot. A enzima CAPN3 é resolvida por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS- PAGE) e migra como uma banda de 94 kDa com um produto autolítico a aproximadamente 60 kDa usando o anticorpo de grau clínico da Novocastra reconhecendo o terminal N, NCL-CALP-12A2. Além disso, o anticorpo NCL-CALP- 2C4 reconhece esse mesmo peso molecular de CAPN3 (94kD) e um fragmento adicional (30kD) no músculo esquelético; ambos os anticorpos são adequados para detecção de proteína. Uma medida semiquantitativa dos níveis de expressão da proteína CAPN3 dentro das amostras de camundongo submetido a nocaute para calpaína após a distribuição de vetor rAAV terapêutico é realizada e comparada com os controles não tratados.

Histologia muscular quantitativa

[091] Seções transversais de músculos TA e quad do tratado com AAVrh.74.tMCK.CAPN3 versus controle não injetado, são coradas com hematoxilina e eosina e fotografadas usando o software Zeiss Axiovision L4 (4 imagens aleatórias 20× por seção por animal). Os diâmetros do tamanho da fibra são comparados entre tratados e controles. Análise Estatística

[092] Teste t de Student ou múltiplos testes de comparação por ANOVA unidirecional são realizados quando aplicável. Exemplo 7 Estudos de Toxicologia/Biodistribuição

[093] Estudos de toxicologia/biodistribuição são realizados usando a dose eficaz estabelecida e uma dose mais alta logarítmica. Os estudos de toxicologia são realizados pela distribuição sistêmica (veia caudal) de rAAV para camundongos CAPN3-KO de 6-8 semanas de idade, incluindo comparação com camundongos C57Bl6 normais. Foram incluídas coortes de 6-10 camundongos e as necropsias completas são realizadas usando métodos similares a GLP.

[094] O soro coletado das amostras de sangue é usado para Químicas Clínicas: Alanina aminotransferase, Alcalina Fosfatase, Aspartato aminotransferase, Bilirrubina (Total e Direta), nitrogênio ureico no sangue, Creatinina, Creatina Quinase, glicose e Proteína Total.

[095] Uma necropsia completa é realizada com um exame minucioso e sistemático e dissecção das vísceras e carcaças do animal. Os tecidos/órgãos coletados incluem gônadas, cérebro, baço, rins, jejuno, cólon, pâncreas, coração, pulmão, estômago, fígado, linfonodos inguinais, gastrocnêmio da medula espinhal e quadríceps. Os tecidos/órgãos para estudos histopatológicos são coletados e fixados em formalina tamponada neutra a 10% (NBF 10%), com exceção de todos os espécimes de músculo esquelético que são montados em blocos com OCT e congelados instantaneamente em metil-butano líquido refrigerado por nitrogênio para criosseções. Exemplo 8 Teste de Biopotência In Vivo Após Injeção Intramuscular

[096] O teste de biopotência in vivo foi realizado após injeção intramuscular (IM) de AAVrh.74.tMCK.CAPN3 (1E11 vg) no músculo tibial anterior (TA) em camundongos CAPN3 KO (n=3) conforme descrito acima no Exemplo 5.

[097] Após 4 semanas da administração, a distribuição gênica foi analisada por análise por PCR quantitativa de transcrição reversa (RT-qPCR) e análise por western blot. Para a análise Western blot, as amostras correspondentes a 50 μg de extratos de proteína de músculo inteiro foram separadas em acrilamida 3-8%, gel SDS Tris-Acetato e transferidas para uma membrana PVDF. A imunodetecção foi realizada com um anticorpo monoclonal elevado em relação ao peptídeo sintético contendo AAs 1-19 da sequência de Calpaína 3 humana (Leica) e anticorpo de actina específico do músculo (Leica) como um controle de carga. A Fig. 3A demonstra a presença da proteína calpaína 3 de 94kD no músculo TA após injeção intramuscular. A análise de RT-qPCR demonstrou níveis de expressão relativa do gene da Calpaína 3 humana 4 semanas após a transferência gênica retornar aos níveis normalizados em comparação com camundongos WT (ver Fig. 3B). O GAPDH de camundongo foi usado como um gene de referência e C57BL/6 WT foi usado para calibrar os dados de RT-qPCR.

[098] Além disso, a análise histopatológica quantitativa foi realizada após a administração intramuscular. Conforme mostrado, o diâmetro da fibra do músculo TA dos camundongos CAPN3 KO tratados foi comparado ao do músculo controle não tratado (TA injetado com lactato de ringer). O tamanho médio da fibra de fibras oxidativas de contração lenta (STO, escuras), oxidativas de contração rápida (FTO,

intermediárias) e glicolíticas de contração rápida (FTG, claras) pareceu normalizado em relação aos valores de WT no músculo TA injetado com AAV.hCAPN3. A quantificação do tamanho do tipo de fibra é fornecida na Tabela 4 e ilustra um aumento com o tratamento. Tabela 4 WT (z18-14) Tratado (z18-11) Não Tratado (z18-22 L) número diâmetro número diâmetro número diâmetro (μm) (μm) (μm) STO 246 28,06±0,27 142 28,89±0,32 240 25,57±0,2 7 FTO 63 36,65±0,53 86 36,71±0,58 110 32,19±0,4 8 FTG 82 42,55±0,53 86 43,68±0,66 128 35,49±0,5 0 Todas 391 32,45±0,38 314 35,08±0,45 478 29,75±0,3 as 0 fibras

[099] Em resumo, o teste de biopotência in vivo após a injeção IM do vetor (1E11 vg) no músculo tibial anterior (TA) em camundongos CAPN3 KO (n=2) demonstrou que 4 semanas após a distribuição gênica 1) RT-qPCR e análises de western blot mostraram expressões de transcritos de CAPN3 e proteína calpaína 3 de comprimento total de 94 kDa e 2) análise histológica mostrou um aumento no diâmetro da fibra muscular de TA em comparação com o músculo controle (TA injetado com lactato de Ringer). Exemplo 9 Teste de Biopotência In Vivo Após Injeção Sistêmica

[0100] O teste de biopotência in vivo foi realizado após a injeção sistêmica de AAVrh.74.tMCK.CAPN3 (3E12 vg ou 6E12 vg) via veia caudal de camundongos CAPN3-KO. A coorte de CAPN3KO de dose baixa (n=5; camundongos foram representados como Z18-13, Z18-15, Z18-16, Z18-17, Z18-18) recebeu 3E12 vg em 300 μl de lactato de Ringer. Após 4 semanas da injeção gênica, os camundongos foram avaliados quanto à fadiga da corrida pelo teste de corrida até exaustão realizado em uma esteira e, em seguida, foram sacrificados para coleta de tecido. Foram removidos os músculos dos membros superiores e inferiores (TA, gastrocnêmio (GAS), quadríceps, tríceps), coração, fígado, baço, pulmão, ovários e testículos, e as amostras de tecido foram congeladas em isopentano e resfriadas em nitrogênio líquido.

[0101] A expressão de CAPN3 por RT-qPCR foi avaliada nos músculos TA. Para a dose baixa de 3E12 vg, os níveis de expressão de mRNA de CAPN3 foram baixos, conforme observado por valores elevados de CT, >27. A análise por Western Blot mostrou bandas de proteína correspondentes indetectáveis. Embora dados de baixa expressão tenham sido observados neste tecido para a dose baixa, os benefícios funcionais e histológicos foram demonstrados com a administração sistêmica de 3E12 vg.

[0102] Posteriormente, uma dose mais alta (6E12 vg) foi administrada sistemicamente para examinar se a expressão da proteína poderia ser detectada em uma dose de mais alta de distribuição do vetor. Os camundongos CAPN3-KO da coorte de dose alta (camundongos representados como Z18-20, Z18-21, Z18-23 e Z18- 24) receberam 6E12 vg do vetor AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3 (duas vezes a dose usada na coorte de dose baixa via injeção sistêmica na veia caudal) e foram sacrificados 4 semanas após a injeção. A RT-qPCR mostrou níveis variáveis de expressão de CAPN3 no quadríceps, tríceps, GAS, TA e músculo cardíaco.

[0103] Para determinar a expressão relativa do mRNA de CAPN3, amostras de tecido muscular foram coletadas de camundongos CAPN3 KO tratados com vetor tMCK.hCAPN3 na dose de 3E12 vg (coorte de dose baixa 1) e 6E12 vg (coorte de dose alta 2). O RNA total foi isolado de ambas as coortes e qPCR de CAPN3 vs. GAPDH de camundongo foi testada juntamente com as amostras anteriores da coorte que recebeu o vetor via injeção IM (1E11 vg; ver acima no Exemplo 8).

[0104] A expressão relativa de CAPN3 foi determinada pelo método abaixo:

CT = CTCAPN3 – CTmGAPDH ΔΔCT = ΔCT – ΔCTCalibrador* Expressão Relativa de CAPN3 = 2- ΔΔCT

[0105] A expressão relativa de CAPN3 em cada tecido e o valor de CT original foram mostrados na Tabela 5 abaixo e na Figura 5. A Tabela 5 fornece dados para distribuição IM (Nº de camundongo Z18-11 e Z18-12) e para distribuição sistêmica Tabela 5: RT-PCR de CAPTN3: Dose de Valor de CT Tratamen Camundon to Tecido Genótipo ΔCT ΔΔCT 2(-ΔΔCT) go nº (DRAPs CAPN3 mGAPDH por Camundo ngos) Z18-14* TA WT 0 22,437 22,456 15,234 15,274 7,193 0,000 1,0003 Z18-19 TA 0 35,259 32,705 15,159 15,176 18,814 11,621 0,0003 Z18-11 TA 24,338 24,217 15,800 15,835 8,460 1,267 0,4155 1E11 Z18-12 TA 21,030 21,104 14,906 15,058 6,085 -1,108 2,1548 Z18-13 TA 32,376 32,430 15,236 15,203 17,183 9,990 0,0010 Z18-15 TA 27,407 27,443 14,510 14,520 12,910 5,717 0,0190 Z18-16 TA 3E12 28,609 28,333 15,229 15,259 13,227 6,034 0,0153 Z18-17 TA 28,675 28,670 14,997 15,005 13,671 6,478 0,0112 Z18-18 TA 27,869 28,128 14,522 14,544 13,466 6,273 0,0129 Gastroc 22,271 22,439 15,939 15,974 6,398 -0,795 1,7347 Coração 21,996 22,051 15,267 15,315 6,732 -0,461 1,3762 Quadrícep Z18-20 21,008 21,202 15,203 15,407 5,800 -1,393 2,6262 s TA 23,806 24,173 16,169 16,385 7,713 0,520 0,6975 CAPN3 Tríceps 24,083 24,361 15,978 16,097 8,185 0,992 0,5027

KO Gastroc 25,330 25,221 15,461 15,462 9,814 2,621 0,1625 Coração 25,024 24,819 15,032 15,097 9,857 2,664 0,1577 Quadrícep Z18-21 26,278 26,108 15,285 15,370 10,866 3,673 0,0784 s 6E12 TA 26,649 26,697 15,017 15,010 11,659 4,466 0,0452 Tríceps 27,040 27,134 15,321 15,343 11,755 4,562 0,0423 Gastroc 24,150 24,144 16,225 16,117 7,976 0,783 0,5812 Coração 22,799 22,495 14,593 14,502 8,099 0,906 0,5335 Quadrícep Z18-23 24,248 24,076 16,511 16,504 7,655 0,462 0,7262 s TA 25,554 25,338 16,124 16,054 9,357 2,164 0,2231 Tríceps 24,396 24,383 15,363 15,277 9,070 1,877 0,2723 Z18-24 Gastroc 24,444 24,165 18,083 18,036 6,245 -0,948 1,9297

Coração 22,769 22,425 15,100 15,077 7,508 0,315 0,8037 Quadrícep 22,754 22,521 15,637 15,672 6,983 -0,210 1,1568 s TA 23,491 23,555 15,979 15,974 7,547 0,354 0,7826 Tríceps 24,554 24,403 16,370 16,329 8,128 0,935 0,5229 Gastroc 31,878 31,962 15,433 15,527 16,440 9,247 0,0016 Coração 31,407 32,964 16,006 15,972 16,197 9,004 0,0019 Quadrícep Z18-22 0 32,332 33,464 16,528 16,468 16,400 9,207 0,0017 s TA 35,584 33,917 16,451 16,372 18,339 11,146 0,0004 Tríceps 33,615 32,786 15,742 15,628 17,516 10,323 0,0008 Tecido Músculo 23,547 23,539 37,743 38,262 humano pAAV.tMC K. 1pg/uL 16,328 16,413 UD 38,302 hCAPN3 * Calibrador

[0106] Em geral, a expressão de mRNA de CAPN3 no músculo de CAPN3 KO após a distribuição sistêmica apresentou variabilidade específica para tecido e animal e menor expressão relativa em comparação com a distribuição IM em 1E11 vg (< 1% de distribuição IM); isso foi especialmente verdadeiro para a coorte de dose baixa de 3E12. Por conseguinte, a proteína de 94 kDa de comprimento total estava abaixo do limite de detecção por Western blot. No entanto, a expressão gênica robusta e quantidades proeminentes da proteína Calpaína 3 de comprimento total foram apresentadas após a injeção sistêmica de 6E12 vg de dosagem sistêmica na coorte de dose alta. Exemplo 10

[0107] Avaliação da Distribuição Gênica Sistêmica de AAVrh74.tMCK.hCAPN3

[0108] A eficiência da transferência gênica foi avaliada por qPCR, calculando cópias do genoma do vetor dentro de amostras de tecido de camundongo CAPN3 KO após a distribuição sistêmica de AAVrh74.tMCK.hCAPN3 em 6E12 vg. Foi determinada a carga do genoma do vetor dos músculos esqueléticos das extremidades inferior e superior (quad, TA, gastroc, tríceps), coração e fígado. O DNA genômico foi isolado das amostras de tecido congelado. O ensaio de qPCR foi realizado em um ABI 7500 (Applied Biosystems) usando o seguinte conjunto de primers: “5’-CGGAGAGCAACTGCATAAG-3’ (Forward; SEQ ID NO: 8); “5'-GGCTGATGATGGCTGAATAG-3' (Reverse; SEQ ID NO: 9). O par de primer amplifica exclusivamente um produto da região 5' de ORF de hCAPN3 e região a jusante exclusiva do vetor de expressão, incluindo porções de um elemento intrônico. Os resultados finais são relatados como número médio de cópias do vetor AAVrh74 por micrograma de DNA genômico.

[0109] Conforme mostrado na Figura 6, o maior número de cópias do genoma do vetor estava presente no fígado após a distribuição sistêmica do vetor. A distribuição do genoma do vetor foi variável entre os grupos musculares. Em geral, os valores foram maiores no quadríceps e no tecido cardíaco em comparação com outros músculos. Foi também observada variabilidade experimental; como no caso com o camundongo nº Z18-21, que mostrou números de cópias relativamente menores em todos os grupos musculares em comparação com outros 3 camundongos.

[0110] Foi observada melhora nas características funcionais e histológicas nos camundongos CAPN3 KO tratados por via sistêmica com 3E12 vg, no entanto, apenas níveis baixos de expressão muscular de Calpaína 3 foram detectados em isolados de RNA totais por RT-qPCR e a proteína de 94kDa de comprimento total foi indetectável por Western blot para o tecido muscular específico (ver Fig. 3A). No entanto, a expressão gênica robusta e quantidades proeminentes da proteína Calpaína 3 de comprimento total foram apresentadas após a dosagem sistêmica de 6E12 vg (ver Fig. 3B). Os dados demonstram que a expressão do gene da Calpaína 3 voltou para os níveis normalizados em comparação com camundongos WT 4 semanas após a transferência gênica das partículas de AAVrh74.tMCK.hCAPN3. O GAPDH de camundongo foi usado como um gene de referência e C57BL/6 WT para calibrar os dados de RT-qPCR. Histopatologia

[0111] Conforme discutido acima, foi observada uma tendência de eficácia 4 semanas após a injeção. Foi observado um aumento significativo no tamanho da fibra no músculo TA de camundongos CAPN3 KO após a distribuição sistêmica de AAVrh.74.tMCK.hCAPN3 em 4 semanas após a injeção em ambas as coortes (3E12 e 6E12). Conforme mostrado na Figura 7, o diâmetro total da fibra aumentou significativamente em ambas as coortes tratadas em comparação com as contrapartes de KO não tratadas (p<0,00001). O tratamento resultou na normalização do tamanho da fibra e não houve diferença relacionada à dose entre as coortes de tratamento (p=0,78058). A Tabela 6 fornece os tamanhos das fibras musculares em camundongos de tipo selvagem e CAPN3 KO após a terapia gênica sistêmica com AAV.hCAPN3 em 3E12 e 6E12 vg. Tabela 6 WT (n=3) 6 E12 CAPN3 (n=3) 3E12 CAPN3 (n=4) KO (n=4) number número diameter diâmetro (μm) number diâmetro (m) número diameter (m) número (μm) number diameter diâmetro (μm) (m) number diameter (m) número diâmetro (μm) STO 532 30.0 ± 0.6 441 31.7 ± 0.8 464 30.7 ± 1.2 858 27.2 ± 0.8 FTO 278 40.7 ± 1.1 345 38.8 ± 1.1 447 40.8 ± 1.4 364 35.4 ± 1.1 FTG 275 46.1 ± 1.3 226 45.8 ± 1.4 403 44.1 ± 1.6 455 39.7 ± 1.2 Todas as Allfibras fiber 1085 38.9 ± 1.8 1012 38.8 ± 2.0 1314 38.5 ± 2.4 1677 34.1 ± 1.8

[0112] Não houve evidência histopatológica de toxicidade cardíaca após a injeção sistêmica do vetor AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3 em 4 semanas em qualquer coorte. Houve quantidades variáveis de vírus encontradas no tecido cardíaco, no entanto, não foram detectadas bandas de proteína no tecido cardíaco por Western blot em nenhuma coorte. Estudo de Funcionalidade: Teste de Corrida até a Exaustão

[0113] Os camundongos foram acostumados com uma corrida de 15 minutos na esteira (Colombus Instruments) uma vez ao dia a 10 m/min por 3 dias antes da aquisição de dados para o Teste de Corrida até a Exaustão. O protocolo usado exigia ter camundongos em uma esteira com inclinação de 15 graus. A esteira foi ligada a uma velocidade de 1 m/min e a velocidade foi aumentada em 1 m a cada minuto até que o camundongo ficasse exausto. A exaustão foi determinada quando o camundongo sentou na almofada de descanso por pelo menos 15 segundos. O tempo, velocidade e distância até a exaustão foram registrados.

[0114] A Figura 8A fornece dados para o teste de corrida até a exaustão para a coorte de dose baixa, que recebeu 3E12 vg de AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3 e a coorte de dose alta 2, que recebeu 6E12 vg de AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3 conforme avaliado 4 semanas após a administração sistêmica. Camundongos CAPN3 KO tratados em ambas as coortes tiveram melhor desempenho no Teste de Corrida até a Exaustão em comparação com as contrapartes não tratadas. Não houve diferença aparente relacionada à dose no desempenho do teste de Corrida até a Exaustão nem diferença estatística no diâmetro da fibra muscular entre as coortes de dose baixa e de dose alta.

[0115] Os camundongos da coorte de dose alta 2 (n=16) foram analisados ainda 20-24 semanas após a administração de 6E12 vg de AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3. Conforme mostrado na Figura 8B, os camundongos CAPN3 KO tratados continuaram tendo melhor desempenho no Teste de Corrida até a Exaustão em comparação com as contrapartes não tratadas (p<0,00001). Exemplo 11

[0116] Avaliação de toxicidade cardíaca após injeção sistêmica do vetor AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3

[0117] Depois de os camundongos das coortes terem sido sacrificados 4 semanas após a injeção, amostras de soro e órgãos foram coletadas. A coorte de CAPN3KO de dose baixa 1 (n=5) recebeu 3E12 vg em 300 μl de lactato de Ringer do vetor AAVrh.74.tMCK.hCAPN3 via injeção na veia caudal. Os camundongos CAPN3- KO da coorte de dose alta de 2 receberam 6E12 vg do vetor AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3 via veia caudal e ambas as coortes foram sacrificadas 4 semanas após a injeção. Foram examinadas duas seções através do ápice do coração, regiões superficiais e profundas dos ventrículos. Nenhuma inflamação, necrose ou regeneração foi encontrada nas seções de tecido indicando que não foram observados efeitos tóxicos no músculo cardíaco proveniente da distribuição sistêmica do vetor AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3 em duas doses diferentes 4 semanas após a injeção. Os camundongos nº Z18-19 e o Z18-22 (injetados com lactato de Ringer/não tratados) serviram como animais KO de controle. A Figura 9 fornece seções congeladas frescas com coloração de H&E do coração. Não foi observada necrose, regeneração ou inflamação das fibras musculares. Embora houvesse quantidades variáveis de vírus presentes no tecido cardíaco, não foram detectadas bandas por Western blot em nenhuma coorte. A Figura 10 fornece a análise de Western blot que mostra que a proteína Calpaína 3 de comprimento total está abaixo do limite de detecção nos tecidos cardíacos após a transdução. Exemplo 12 Análise Fisiológica In Vivo

[0118] A avaliação fisiológica é realizada após administração IM ou sistêmica do vetor AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3. Durante as avaliações fisiológicas in vivo in vivo, os camundongos são anestesiados com isoflurano inalado. Assim que o animal estiver anestesiado, os pelos das costas e do membro posterior são removidos conforme necessário com tosquiadores. Se a remoção de pelos com tosquiadores for insuficiente, aplica-se uma fina camada de creme para remoção de pelos. Durante as medições de força fisiológica in vivo, o torque do membro posterior é medido com uma placa de apoio de força não invasiva conectada à ao motor de detecção de força (Aurora Scientific, Canadá) após estímulos supramáximos do nervo ciático. O membro posterior a ser medido é fixado à placa de suporte com fita adesiva. O membro é mantido rígido em uma braçadeira contundente. O componente tibial ou peroneal do nervo ciático é estimulado com dois eletrodos monopolares descartáveis estéreis de calibre 28 inseridos por via subcutânea perto do nervo. A temperatura do camundongo é mantida pela placa de aquecimento termorregulada condutora (ajustada a 37 oC) ou fonte de calor radiante e monitorada pela sonda de temperatura infravermelho.

[0119] Embora a presente divulgação forneça modalidades específicas, entende-se que variações e modificações ocorrerão àqueles versados na técnica. Por conseguinte, somente tais limitações como aparecem nas reivindicações devem ser colocadas na invenção.

[0120] Todos os documentos referidos neste pedido são incorporados por referência em sua totalidade.

Claims (36)

REIVINDICAÇÕES

1. Vírus adeno-associado recombinante (rAAV) CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que compreende uma primeira repetição terminal invertida (ITR) de AAV, um promotor, uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína com atividade de calpaína 3 (CAPN3) e uma segunda ITR de AAV.

2. rAAV, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência nucleotídica que codifica a proteína com atividade de CAPN3 é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 2.

3. rAAV, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência nucleotídica que codifica a proteína com atividade de CAPN3 é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2.

4. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência nucleotídica que codifica a proteína com atividade de CAPN3 compreende a sequência da SEQ ID NO: 2.

5. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína com atividade de CAPN3 compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 7.

6. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína com atividade de CAPN3 compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 7.

7. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína com atividade de CAPN3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.

8. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1.

9. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 1.

10. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, CARACTERIZADO pelo fato de que polinucleotídeo compreende a sequência da SEQ ID NO: 1.

11. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, CARACTERIZADO pelo promotor que é um promotor específico de músculo.

12. rAAV, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor específico de músculo compreende um ou mais dentre um elemento do gene da actina esquelética humana, um elemento do gene da actina cardíaca, um promotor de desmina, um promotor de alfa-actina esquelética (ASKA), um promotor de troponina I (TNNI2), um elemento de ligação mef do fator de ligação ao potenciador específico de miócitos, um promotor de creatina quinase muscular (MCK), um promotor de MCK truncada (tMCK), um promotor de cadeia pesada de miosina (MHC), um promotor híbrido de potenciador de cadeia pesada de a-miosina/potenciador- promotor de MCK (MHCK7), um promotor de C5-12, um elemento potenciador de creatina quinase murina, um elemento do gene da troponina c de contração rápida esquelética, um elemento do gene da troponina c cardíaca de contração lenta, um elemento do gene da troponina i de contração lenta, elemento de resposta ao fator nuclear induzível por hipóxia (HIF) (HRE), um elemento induzível por esteroides, e um elemento de resposta de glicocorticoide (gre).

13. rAAV, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor específico de músculo é um promotor de MCK, um promotor de tMCK ou um promotor de MHCK7.

14. rAAV, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor específico de músculo é um promotor de MCK truncada compreendendo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 3.

15. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira e a segunda repetição terminal invertida de AAV são repetições terminais invertidas de AAV2.

16. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV compreende uma ou mais dentre proteínas do capsídeo de AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV- 8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh.74 e AAV rh.10.

17. rAAV, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o rAAV compreende uma proteína do capsídeo de rh.74 ou uma proteína do capsídeo de AAV9.

18. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17.

19. Método de tratamento da distrofia muscular de cinturas tipo 2A em um sujeito, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar, ao sujeito, uma quantidade terapeuticamente eficaz do rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, ou a composição de acordo com a reivindicação 18.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento resulta em um ou mais dentre: (a) um diâmetro aumentado da fibra muscular, (b) um número reduzido de fibras musculares lobuladas pequenas, (c) um número reduzido de fibras com núcleos internos, (d) um teor reduzido de tecido conjuntivo tipo endomísio,

(e) correção da atrofia muscular, e (f) uma maior geração de força muscular.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a fibra muscular compreende uma ou mais dentre fibra muscular oxidativas de contração lenta (STO), fibra muscular oxidativa de contração rápida (FTO) e fibra muscular glicolítica de contração rápida (FTG).

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-21, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento resulta em um ou mais dentre: (a) pelo menos uma redução de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, ou 35%, ou 40% do número total de fibras musculares por mm2 em 4 semanas após a administração; (b) pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% de diâmetro da fibra muscular em 4 semanas após a administração; (c) pelo menos uma redução de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, ou 42% do número de fibras musculares STO por mm2 em 4 semanas após a administração; (d) pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% do diâmetro de fibras musculares STO em 4 semanas após a administração; (e) pelo menos uma redução de 5%, 10%, 15%, ou 20% do número de fibras musculares FTO por mm2 em 4 semanas após a administração; (f) pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, ou 20% de aumento do diâmetro de fibras musculares FTO em 4 semanas após a administração; (g) pelo menos uma redução de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, ou 35% do número de fibras musculares FTG por mm2 em 4 semanas após a administração; e (h) pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% do diâmetro de fibras musculares FTG em 4 semanas após a administração.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-22,

CARACTERIZADO pelo fato de que a administração é por injeção intramuscular ou injeção intravenosa.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-23, CARACTERIZADO pelo fato de que o músculo cardíaco do sujeito mostra a proteína calpaína 3 expressa a partir do rAAV em um valor mínimo ou baixo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, ou composição, de acordo com a reivindicação

18.

25. Composição para tratamento da distrofia muscular de cinturas tipo 2A, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, ou composição, de acordo com a reivindicação 18.

26. Composição, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADA pelo fato de que o tratamento com a composição resulta em um ou mais dentre: (a) um diâmetro aumentado da fibra muscular, (b) um número reduzido de fibras musculares lobuladas pequenas, (c) um número reduzido de fibras com núcleos internos, (d) um teor reduzido de tecido conjuntivo tipo endomísio, (e) correção da atrofia muscular, e (f) uma maior geração de força muscular.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADA pelo fato de que a fibra muscular compreende uma ou mais dentre fibra muscular oxidativas de contração lenta (STO), fibra muscular oxidativa de contração rápida (FTO) e fibra muscular glicolítica de contração rápida (FTG).

28. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25-27, CARACTERIZADA pelo fato de que o tratamento com a composição resulta em um ou mais dentre: (a) pelo menos uma redução de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, ou 35%, ou

40% do número total de fibras musculares por mm2 em 4 semanas após a administração; (b) pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% de diâmetro da fibra muscular em 4 semanas após a administração; (c) pelo menos uma redução de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, ou 42% do número de fibras musculares STO por mm2 em 4 semanas após a administração; (d) pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% do diâmetro de fibras musculares STO em 4 semanas após a administração; (e) pelo menos uma redução de 5%, 10%, 15%, ou 20% do número de fibras musculares FTO por mm2 em 4 semanas após a administração; (f) pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, ou 20% de aumento do diâmetro de fibras musculares FTO em 4 semanas após a administração; (g) pelo menos uma redução de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, ou 35% do número de fibras musculares FTG por mm2 em 4 semanas após a administração; e (h) pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% do diâmetro de fibras musculares FTG em 4 semanas após a administração.

29. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25-28, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é formulada para administração por injeção intramuscular ou injeção intravenosa.

30. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25-28, CARACTERIZADA pelo fato de que, após o tratamento com a composição, o músculo cardíaco do sujeito mostra a proteína calpaína 3 expressa a partir do rAAV em um valor mínimo ou baixo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, ou composição, de acordo com a reivindicação 18.

31. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz do rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, ou composição, de acordo com a reivindicação

18, CARACTERIZADO pelo fato de que se aplica na preparação de um medicamento para o tratamento da distrofia muscular de cinturas tipo 2A.

32. Uso, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento com o medicamento resulta em um ou mais dentre: (a) um diâmetro aumentado da fibra muscular, (b) um número reduzido de fibras musculares lobuladas pequenas, (c) um número reduzido de fibras com núcleos internos, (d) um teor reduzido de tecido conjuntivo tipo endomísio, (e) correção da atrofia muscular, e (f) uma maior geração de força muscular.

33. Uso, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a fibra muscular compreende uma ou mais dentre fibra muscular oxidativas de contração lenta (STO), fibra muscular oxidativa de contração rápida (FTO) e fibra muscular glicolítica de contração rápida (FTG).

34. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31-33, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento com o medicamento resulta em um ou mais dentre: (a) pelo menos uma redução de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, ou 35%, ou 40% do número total de fibras musculares por mm2 em 4 semanas após a administração; (b) pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% de diâmetro da fibra muscular em 4 semanas após a administração; (c) pelo menos uma redução de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, ou 42% do número de fibras musculares STO por mm2 em 4 semanas após a administração; (d) pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% do diâmetro de fibras musculares STO em 4 semanas após a administração;

(e) pelo menos uma redução de 5%, 10%, 15%, ou 20% do número de fibras musculares FTO por mm2 em 4 semanas após a administração; (f) pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, ou 20% de aumento do diâmetro de fibras musculares FTO em 4 semanas após a administração; (g) pelo menos uma redução de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, ou 35% do número de fibras musculares FTG por mm2 em 4 semanas após a administração; e (h) pelo menos um aumento de 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% do diâmetro de fibras musculares FTG em 4 semanas após a administração.

35. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31-34, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para administração por injeção intramuscular ou injeção intravenosa.

36. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31-35, CARACTERIZADO pelo fato de que, após o tratamento com o medicamento, o músculo cardíaco do sujeito mostra a proteína calpaína 3 expressa a partir do rAAV em um valor mínimo ou baixo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, ou a composição, de acordo com a reivindicação 18.

Figura 1

Promotor de MCK

Petição 870200162128, de 28/12/2020, pág. 65/77 Poli A 1/11

Tratados Tratados Não tratados Não tratados

Número de fibras/ mm2 Número de fibras/ mm2

Diâmetro da fibra Diâmetro da fibra (µm) (µm)

Figura 2

Criado com [ilegível]

ss pAAV tMCK hCapn3 sI2 7629 bp poli A

Figura 3 Não tratados 1E11vg_IM 3E12 vg Gastroc hCPN3 Quad

TA Tratamento: Calpaína 3 Actina muscular Expressão de mRNA da CALPAÍNA 3 de CAPN3 Normalizada Variação da Expressão WT normal CPN3KO de não tratados 1E11 vg_IM 3E12 vg_Sistêmica 6E12 vg_Sistêmica Não

TA Quad tratados 1E11vg_IM Gastroc Normal 3E12vg tratados Não injetados com AAV.hCAP3 Figura 4

Tríceps

TA Não tratados Quadríceps Coração Gastroc Tríceps

TA Quadríceps Coração Gastroc Tríceps

TA Quadríceps Coração Expressão Relativa de

AMOSTRA DE TECIDO DE CAMUNDONGO Gastroc Tríceps Figura 5

TA CAPN3 Quadríceps Coração Gastroc Tríceps

TA Quadríceps Coração Gastroc

EXPRESSÃO RELATIVA NORMALIZADA

Figura 6 Cópias do Vetor AAVrh74.tMCK.hCAPN3/µg DNA genômico na Coorte Sistêmica com Genoma do Vetor 6e12 Petição 870200162128, de 28/12/2020, pág. 70/77 6/11 Cópias do vetor/µg DNA genômico

TA

TA

TA

TA

TA Quad Quad Quad Quad Quad Fígado Fígado Fígado Fígado Fígado Tríceps Tríceps Tríceps Tríceps Tríceps Gastroc Gastroc Gastroc Gastroc Gastroc Coração Coração Coração Coração Coração KO não tratados Amostra de Tecido de Camundongo *Valor de cópias do genoma do vetor no fígado muito maior que o valor máx no eixo-Y. Não mostrado devido à grande quantidade.

Tratamento com CAPN3 sistêmica em TA Figura 7

Tipo selvagem (n=3)

Diâmetro da fibra (um)

A melhor de duas corridas Figura 8A

Distância até a exaustão (m)

Figura 8B

Petição 870200162128, de 28/12/2020, pág. 73/77 A melhor de duas corridas, camundongos CAPN3 KO de 20- 24 semanas 9/11

Metros Não tratados

Figura 9

Z18-22 não tratados Z18-19 não tratados

Figura 10

Avaliação da expressão da proteína Calpaína 3 cardíaca

Petição 870200162128, de 28/12/2020, pág. 75/77 após administração sistêmica do gene de AAVrh.74tMCK.CAPN3

Coorte de 6x1012 vg

Tratamento : 11/11

Calpaína 3

Actina muscular

A proteína Calpaína 3 completa está abaixo do limite de detecção.

Camundongos CPN3KO sistemicamente dosados com 6x1012 vg de AAVrh.74tMCK.CAPN3 não mostraram expressão da proteína Calpaína 3 detectável no músculo cardíaco.

Controle positivo, lisado do músculo quadríceps humano (hCPN3).