ES2978666T3

ES2978666T3 - Suministro de alfa-sarcoglicano por vector de virus adenoasociado y tratamiento de la distrofia muscular

Info

Publication number: ES2978666T3
Application number: ES20765424T
Authority: ES
Inventors: Louise Rodino-Klapac; Danielle Griffin; Jerry Mendell
Original assignee: Res Institute At Nationwidechildrens Hospital
Current assignee: Res Institute At Nationwidechildrens Hospital
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2024-09-17
Anticipated expiration: 2040-08-21
Also published as: CN114945583A; JP7532503B2; US12258573B2; PT4017871T; EP4488287A2; IL323311A; JP2022544627A; LT4017871T; WO2021035120A1; EP4017871A1; SMT202400152T1; EP4488287A3; CN120400170A; EP4374880A3; EP4374880A2; IL290734A; FI4017871T3; RS65421B1; DK4017871T5; BR112022003142A2

Abstract

En el presente documento se describen métodos para tratar la distrofia muscular en un sujeto, que comprenden la administración de un vector AAV recombinante AAVrh74.tMCK.hSCGA mediante una vía de administración sistémica y en una dosis de aproximadamente 1,0 x 1012 vg/kg a aproximadamente 5,0 x 1015 vg/kg. Además, se describen métodos para expresar el gen alfa-sarcoglicano en una célula o en un sujeto que lo necesite, disminuir el nivel de CK sérica y aumentar las fibras positivas para alfa-sarcoglicano en el tejido muscular de un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Suministro de alfa-sarcoglicano por vector de virus adenoasociado y tratamiento de la distrofia muscular

CAMPO DE LA INVENCIÓN

En el presente documento se describen vectores de terapia tales como vectores AAV que expresan alfa-sarcoglicano y un método para usar estos vectores para tratar distrofias musculares de cinturas tales como LGMD2D.

ANTECEDENTES

Las distrofias musculares (MD, por sus siglas en inglés) son un grupo de enfermedades genéticas. El grupo se caracteriza por una debilidad progresiva y degeneración de los músculos esqueléticos que controlan el movimiento. Algunas formas de MD se desarrollan en la infancia o la niñez, mientras que otras pueden no aparecer hasta la mediana edad o más tarde. Los trastornos difieren en términos de la distribución y extensión de la debilidad muscular (algunas formas de MD también afectan el músculo cardíaco), la edad de aparición, la tasa de progresión y el patrón de herencia.

Un grupo de MD son las distrofias musculares de cinturas (LGMD, por sus siglas en inglés). Las LGMD son afecciones raras y se presentan de manera diferente en diferentes personas con respecto a la edad de aparición, las áreas de debilidad muscular, la afectación cardíaca y respiratoria, la tasa de progresión y la gravedad. Las LGMD pueden comenzar en la niñez, la adolescencia, la edad adulta temprana o incluso más tarde. Ambos sexos se ven afectados por igual. Las LGMD causan debilidad en los hombros y la cintura pélvica, y los músculos cercanos en la parte superior de las piernas y los brazos a veces también se debilitan con el tiempo. La debilidad de las piernas suele aparecer antes que la de los brazos. Los músculos faciales no suelen verse afectados. A medida que la afección progresa, las personas pueden tener problemas para caminar y es posible que con el tiempo necesiten usar una silla de ruedas. La afectación de los músculos de los hombros y los brazos puede provocar dificultad para levantar los brazos por encima de la cabeza y levantar objetos. En algunos tipos de LGMD, los músculos cardíacos y respiratorios pueden estar involucrados.

Actualmente se encuentran disponibles pruebas especializadas para LGMD a través de un esquema nacional de diagnóstico, el National Commissioning Group (NCG).

El subtipo LGMD 2D (LGMD2D), a menudo denominado a-sarcoglicanopatía, es un trastorno autosómico recesivo causado por mutaciones en el gen alfa-sarcoglicano (SGCA; a-sarcoglicano), que conduce a una pérdida completa o reducida de proteína funcional con pérdida de otras Componentes estructurales del complejo proteico asociado a la distrofina. En particular, la pérdida de la proteína alfa-sarcoglicano conduce a una distrofia muscular progresiva con deterioro de la función muscular, que comienza entre los 3 y los 8 años de edad. Los síntomas incluyen: retraso en la deambulación, debilidad en los músculos proximales causada por el reemplazo de grasa y fibrosis, elevación de la creatina quinasa, escoliosis y contracturas articulares. Esta enfermedad debilitante conduce a menudo a la dependencia de la silla de ruedas y a la muerte por insuficiencia respiratoria. Por tanto, sigue existiendo una necesidad de tratamientos para LGMD2D.

El documento WO 2013/078316 se refiere al suministro por rAAV de un gen alfa-sarcoglicano en el tratamiento de distrofias musculares de cinturas. Mendell et al., 2019, Human Gene Therapy, 30(7): 794-801 se relaciona con el suministro de genes para la distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2D mediante infusión aislada de una extremidad. Mendell et al., 2012, Neuroscience Letters, 527(2): 90-99 se relaciona con la terapia génica para la distrofia muscular. Mendell et al., 2010, Annals of Neurology, 68(5): 629-638 se relaciona con la expresión del gen alfa-sarcoglicano después de la transferencia genética en la distrofia muscular de cinturas de extremidades, tipo 2D.

BREVE DESCRIPCIÓN

En un aspecto, la invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular en un sujeto que la necesita, donde composición comprende un virus adenoasociado recombinante (rAAV, por sus siglas en inglés) AAVrh74.tMCK.hSCGA a una dosis de 5*1013 vg/kg a 2*1014 vg/kg basada en un ADN superenrollado o plásmido como patrón de cuantificación, y donde la composición está formulada para una vía de administración sistémica, y además donde el rAAV comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con SEQ ID NO: 4 y dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína que conserva la actividad del alfa-sarcoglicano. También se proporciona una composición para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular en un sujeto que la necesita, donde la composición comprende un virus adeno-asociado recombinante (rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA a una dosis de 1,0 * 1013 vg/kg a 8,0 * 1013 vg/kg basada en un ADN linealizado o plásmido como patrón de cuantificación y donde la composición está formulada para una vía de administración sistémica, y además donde el rAAV comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 4 y dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína que conserva la actividad del alfasarcoglicano. También se proporciona una composición para disminuir el nivel de CK en suero en un sujeto que lo necesita, comprendiendo la composición la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

En el presente documento se describen métodos para tratar la distrofia muscular en un sujeto que lo necesita, que comprenden la etapa de administrar un virus adenoasociado recombinante (rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA, donde el rAAv se administra usando una ruta de administración sistémica y a una dosis de aproximadamente 1,0 x 1012 vg/kg a aproximadamente 5,0 x 1015 vg/kg basado en un ADN superenrollado o un plásmido como patrón de cuantificación. La divulgación se refiere a un rAAV que expresa el gen alfa-sarcoglicano. También se describen en el presente documento métodos para suministrar alfa-sarcoglicano al músculo para reducir y/o prevenir la fibrosis; y/o para aumentar la fuerza muscular, y/o para tratar una a-sarcoglicanopatía en un sujeto que padece distrofia muscular.

En el presente documento se describe un AAV recombinante (rAAV) que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína alfa-sarcoglicano. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica comprende una secuencia de al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, u 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % idéntica a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 y codifica una proteína que retiene la actividad alfa-sarcoglicano. En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1. En otra realización, el polinucleótido codifica una proteína que es al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, u 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % idéntica a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 2. En otra realización, el polinucleótido codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, el rAAV comprende una secuencia de nucleótidos que comprende un promotor tMCK. Por ejemplo, el promotor tMCK comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en s Eq ID NO: 3. Además, el rAAV comprende una secuencia repetida terminal invertida 5' de SEQ ID NO: 5 y/o una secuencia repetida terminal invertida 3' de SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, el rAAV comprende una secuencia poli A de SEQ ID NO: 7.

En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 99,5 % idéntica a la SEQ ID NO: 4. En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4.

En el presente documento se describen métodos para tratar la distrofia muscular en un sujeto que lo necesita, que comprenden la etapa de administrar cualquiera de los rAAV descritos en el presente documento, donde el rAAV se administra por vía sistémica. En particular, en cualquiera de los métodos descritos, el rAAV es AAVrh74.tMCK.hSCGA, donde el rAAV se administra usando una vía de administración sistémica.

En cualquiera de los métodos aquí descritos, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1,0 x 1012 vg/kg a aproximadamente 5,0 x 1015 vg/kg basándose en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación. Por ejemplo, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1,0 x 1012 vg/kg a aproximadamente 2,0 x 1015 vg/kg, aproximadamente 5 x 1012 vg/kg a aproximadamente 1,0 x 1015 vg/kg, aproximadamente 1,0 x 1013 vg/kg a aproximadamente 5,0 x 1014 vg/kg, aproximadamente 2,0 x 1013 vg/kg a aproximadamente 3,0 x 1014 vg/kg, or aproximadamente 5x1013 vg/kg a aproximadamente 2x1014 vg/kg, o el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 5x1013 vg/kg, aproximadamente 6x1013 vg/kg, aproximadamente 7x1013 vg/kg, aproximadamente 8x1013 vg/kg, aproximadamente 9x1013 vg/kg, aproximadamente 1x1014 vg/kg, aproximadamente 2x1014 vg/kg, aproximadamente 3x1014 vg/kg, aproximadamente 4x1014 vg/kg or aproximadamente 5x1014 vg/kg basándose en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación.

En cualquiera de los métodos aquí descritos, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1,85 x 1013 vg/kg o 7,41 x 1013 vg/kg basándose en un ADN o plásmido linealizado como patrón de cuantificación. Por ejemplo, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1,0 x1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,5 x1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,6 x1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,8 x1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,2 x1013vg/kg a aproximadamente 7,5 x 1013 vg/kg, de aproximadamente 1,9 x 1013vg/kg a aproximadamente 7,5 x 1013 vg/kg, de aproximadamente 1,4 x 1013vg/kg a aproximadamente 7,4 x 1013 vg/kg 5 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,9 x1013vg/kg a aproximadamente 7,5 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,4 x1013vg/kg a aproximadamente 7,4 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,9 x1013vg/kg a aproximadamente 7,5 x1013 vg/kg, o de aproximadamente 1,8 x1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x1013 vg/kg basándose en un ADN o plásmido linealizado como patrón de cuantificación.

Además, en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la vía sistémica de administración es una vía intravenosa. Por ejemplo, el rAAV se administra mediante inyección, infusión o implantación. El rAAV puede administrarse por vía intravenosa a través de una vena periférica de la extremidad.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la distrofia muscular es distrofia muscular de cinturas de extremidades. Por ejemplo, la distrofia muscular es la distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2D (LGMD2D).

Los métodos de tratamiento de la distrofia muscular descritos en el presente documento pueden comprender la administración del rAAV a un sujeto que padece distrofia muscular de cinturas de extremidades, y el rAAV se administra mediante infusión intravenosa a una dosis de aproximadamente 5x1013 vg/kg a aproximadamente 2x1014 vg/kg basada en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación, y donde el rAAV comprende la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4.

Se describen métodos para tratar la distrofia muscular en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método la etapa de administrar un rAAV al sujeto donde el sujeto sufre distrofia muscular de cinturas de extremidades, y el rAAV se administra mediante infusión intravenosa a una dosis de aproximadamente 5*1013 vg/kg hasta aproximadamente 2*1014 vg/kg basado en un ADN superenrollado o plásmido como patrón de cuantificación, y donde el rAAV comprende la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4. Por ejemplo, en estos métodos, el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano en una célula del sujeto aumenta después de la administración del rAAV en comparación con el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano antes de la administración del rAAV.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano en una célula del sujeto aumenta después de la administración del rAAV en comparación con el nivel de expresión del gen alfasarcoglicano antes de la administración del rAAV; y/o donde el nivel de CK en suero en el sujeto disminuye después de la administración del rAAV en comparación con el nivel de CK en suero antes de la administración del rAAV; y/o donde aumentan la actividad locomotora y la generación de fuerza específica; donde se reduce la fibrosis; donde aumenta la resistencia a la lesión inducida por la contracción en el músculo tibial anterior; y/o donde el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano en el tejido muscular del sujeto aumenta después de la administración del rAAV en comparación con el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano antes de la administración del rAAV; o donde la fibrosis se reduce en el sujeto después de la administración del rAAV en comparación con antes de la administración del rAAV; y/o donde la fibrosis se reduce en el sujeto después de la administración del rAAV en comparación con antes de la administración del rAAV; y/o donde la fuerza específica, el tamaño del diámetro de la fibra y/o la contracción excéntrica en el músculo del sujeto aumentan después de la administración del rAAV en comparación con antes de la administración del rAAV.

En algunas realizaciones, la expresión del gen alfa-sarcoglicano se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano mediante inmunotransferencia tipo Western, y/o inmunohistoquímica.

También se describen métodos para expresar el gen alfa-sarcoglicano en una célula que comprende administrar a un sujeto cualquiera de los rAAV divulgados. Por ejemplo, se describe un método para expresar el gen alfa-sarcoglicano en una célula que comprende administrar a un sujeto la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4. Además, en cualquiera de los métodos, la expresión del gen alfa-sarcoglicano en la célula del sujeto se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano en una transferencia Western en biopsias musculares. Alternativamente, en cualquiera de los métodos, la expresión del gen alfa-sarcoglicano en la célula se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano mediante inmunohistoquímica en biopsias musculares. En otras realizaciones, la expresión del gen del alfa-sarcoglicano se mide en el sujeto detectando el número de genomas del vector por microgramo de ADN genómico.

También se describen métodos para disminuir el nivel de CK en suero en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto cualquiera de los rAAV divulgados. Por ejemplo, se describen métodos para disminuir el nivel de CK en suero en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4.

También se describen métodos para aumentar las fibras positivas al alfa-sarcoglicano en un tejido muscular de un sujeto que comprenden administrar al sujeto cualquiera de los rAAV divulgados. Por ejemplo, se describe un método para aumentar las fibras positivas alfa-sarcoglicano en un tejido muscular de un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4.

También se describen métodos para aumentar la expresión de alfa-sarcoglicano en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto cualquiera de los rAAV divulgados. Por ejemplo, se describen métodos para aumentar la expresión de alfa-sarcoglicano en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4. Además, en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la expresión del gen alfa-sarcoglicano en la célula del sujeto se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano en una transferencia Western en biopsias musculares. Alternativamente, en cualquiera de los métodos, la expresión del gen alfa-sarcoglicano en la célula se detecta midiendo el nivel de proteína alfasarcoglicano mediante inmunohistoquímica en biopsias musculares. En otras realizaciones, la expresión del gen del alfasarcoglicano se mide en el sujeto detectando el número de genomas del vector por microgramo de ADN genómico.

La divulgación proporciona composiciones para tratar la distrofia muscular en un sujeto que lo necesita, donde la composición comprende cualquiera de los rAAV divulgados en el presente documento, donde la composición se formula para administración por vía sistémica. En particular, en cualquiera de las composiciones, el rAAV es AAVrh74.tMCK.hSCGA.

Cualquiera de las composiciones divulgadas comprende rAAV a una dosis de aproximadamente 1,0 x 1012 vg/kg a aproximadamente 5,0 x 1015 vg/kg basada en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación. Por ejemplo, el rAAV está en una dosis de aproximadamente 1,0 x1012 vg/kg a aproximadamente 2,0 x1015 vg/kg, de aproximadamente 5 x1012 vg/kg a aproximadamente 1,0 x1015 vg/kg, de aproximadamente 1,0 x1013 vg/kg a aproximadamente 5,0 *1014 vg/kg, de aproximadamente 2,0 *1013 vg/kg a aproximadamente 3,0 x 1014 vg/kg, o de aproximadamente 5x1013 vg/kg a aproximadamente 2x1014 vg/kg o el rAAV está a una dosis de aproximadamente 5x1013 vg/kg, aproximadamente 6 x1013 vg/kg, aproximadamente 7x1013 vg/kg, aproximadamente 8x1013 vg/kg, aproximadamente 9x1013 vg/kg, aproximadamente 1x1014 vg/kg, aproximadamente 2x1014 vg/kg, aproximadamente 3x1014 vg/kg, aproximadamente 4x1014 vg/kg o aproximadamente 5x1014 vg/kg basándose en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación.

En otra realización, en cualquiera de las composiciones divulgadas, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1,85 x 1013 vg/kg o aproximadamente 7,41 x 1013 vg/kg basada en un ADN o plásmido linealizado como patrón de cuantificación. Por ejemplo, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1,0 x1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,5 x1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,6 x1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,8 x1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,2 x1013vg/kg a aproximadamente 7,5 x 1013 vg/kg, de aproximadamente 1,9 x 1013vg/kg a aproximadamente 7,5 x 1013 vg/kg, de aproximadamente 1,4 x 1013vg/kg a aproximadamente 7,4 x 1013 vg/kg 5 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,9 x1013vg/kg a aproximadamente 7,5 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,4 x1013vg/kg a aproximadamente 7,4 x1013 vg/kg, de aproximadamente 1,9 x1013vg/kg a aproximadamente 7,5 x1013 vg/kg, o de aproximadamente 1,8 x1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x1013 vg/kg basándose en un ADN o plásmido linealizado como patrón de cuantificación.

Además, cualquiera de las composiciones divulgadas se formula para administración por vía intravenosa, tales como composiciones formuladas para administración por inyección, infusión o implantación. En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas se formulan para administración por vía intravenosa a través de una vena periférica de una extremidad.

Cualquiera de las composiciones descritas es para el tratamiento de la distrofia muscular de cinturas de extremidades, tal como la distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2D (LGMD2D).

En una realización ejemplar, la divulgación proporciona composiciones para tratar a un sujeto que padece distrofia muscular de cinturas de extremidades, donde la composición comprende una dosis de rAAV de aproximadamente 5x1013 vg/kg a aproximadamente 2x1014 basada en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación, y donde la composición está formulada para administración por infusión intravenosa, y donde el rAAV comprende la secuencia nucleotídica de la construcción scAAVrh74.tMCK.hsGcA de SEQ ID NO: 4.

Además, la divulgación proporciona composiciones para tratar la distrofia muscular de cinturas de extremidades en un sujeto que las necesite, en las que la composición comprende una dosis de rAAV de aproximadamente 5x1013 vg/kg a aproximadamente 2x1014 vg/kg basada en un ADN superenrollado o plásmido como patrón de cuantificación, y la composición está formulada para administración por infusión intravenosa y en las que el rAAV comprende la secuencia nucleotídica de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4. Por ejemplo, la administración de la composición aumenta el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano en una célula del sujeto en comparación con el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano antes de la administración de la composición.

Además, la administración de cualquiera de las composiciones descritas aumenta el nivel de expresión del gen alfasarcoglicano en una célula del sujeto en comparación con el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano antes de la administración de la composición; y/o donde la administración de la composición descrita disminuyó el nivel de CK en suero en el sujeto en comparación con el nivel de CK en suero antes de la administración de la composición; y/o donde aumentan la actividad locomotora y la generación de fuerza específica; donde se reduce la fibrosis; donde aumenta la resistencia a la lesión inducida por la contracción en el músculo tibial anterior; y/o donde la administración de la composición aumenta el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano en el tejido muscular del sujeto en comparación con el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano antes de la administración de la composición; y/o donde la administración de la composición redujo la fibrosis en el sujeto en comparación con antes de la administración del rAAV; y/o donde la composición redujo la fibrosis en comparación con antes de la administración de la composición; o donde la administración de la composición aumentó la fuerza específica, el tamaño del diámetro de la fibra y/o la contracción excéntrica en el músculo del sujeto en comparación con antes de la administración de la composición. En algunas realizaciones, la expresión del gen alfa-sarcoglicano se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano mediante inmunotransferencia tipo Western, y/o inmunohistoquímica.

En otro aspecto, la divulgación proporciona composiciones para expresar el gen alfa-sarcoglicano en una célula, donde la composición comprende cualquiera de los rAAV divulgados. Por ejemplo, la divulgación proporciona composiciones para expresar el gen alfa-sarcoglicano en una célula que comprende la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4. Además, en cualquiera de las composiciones, la expresión del gen alfasarcoglicano en la célula del sujeto se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano en una transferencia Western en biopsias musculares. Alternativamente, en cualquiera de los métodos, la expresión del gen alfa-sarcoglicano en la célula se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano mediante inmunohistoquímica en biopsias musculares. En otras realizaciones, la expresión del gen del alfa-sarcoglicano se mide en el sujeto detectando el número de genomas del vector por microgramo de ADN genómico.

La divulgación proporciona composiciones para disminuir el nivel de CK en suero en un sujeto que lo necesita, comprendiendo la composición la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición para aumentar las fibras positivas al alfa-sarcoglicano en un tejido muscular de un sujeto, donde la composición comprende cualquiera de los rAAV divulgados. Por ejemplo, la divulgación proporciona composiciones para aumentar las fibras positivas al alfa-sarcoglicano en un tejido muscular de un sujeto, donde la composición comprende la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4.

La divulgación también proporciona una composición para aumentar la expresión de alfa-sarcoglicano en un sujeto que lo necesita, donde la composición comprende cualquiera de los rAAV divulgados. Por ejemplo, la divulgación proporciona composiciones para aumentar la expresión de alfa-sarcoglicano en un sujeto que lo necesita, donde la composición comprende la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4. Además, después de la administración de cualquiera de las composiciones descritas, la expresión del gen alfa-sarcoglicano en la célula del sujeto se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano en una transferencia Western en biopsias musculares. Alternativamente, después de la administración de cualquiera de las composiciones descritas, la expresión del gen alfasarcoglicano en la célula se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano mediante inmunohistoquímica en biopsias musculares. En otras realizaciones, después de la administración de cualquiera de las composiciones divulgadas, la expresión del gen alfa-sarcoglicano se mide en el sujeto detectando el número de genoma del vector por microgramo de ADN genómico.

También se describe el uso de cualquiera de los rAAV descritos para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la distrofia muscular en un sujeto que lo necesita, donde el medicamento se formula para administración por vía sistémica. Se describe el uso de AAVrh74.tMCK.hSCGA para la preparación de un medicamento para tratar la distrofia muscular, donde el medicamento se formula para la administración mediante una vía de administración sistémica.

En cualquiera de los usos descritos, el medicamento comprende rAAV a una dosis de aproximadamente 1,0 x 1012 vg/kg a aproximadamente 5,0 x 1015 vg/kg basada en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación. Por ejemplo, el rAAV está en una dosis de aproximadamente 1,0 x1012 vg/kg a aproximadamente 2,0 x1015 vg/kg, de aproximadamente 5 x1012 vg/kg a aproximadamente 1,0 x1015 vg/kg, de aproximadamente 1,0 x1013 vg/kg a aproximadamente 5,0 x1014 vg/kg, de aproximadamente 2,0 x1013 vg/kg a aproximadamente 3,0 x 1014 vg/kg, o de aproximadamente 5x1013 vg/kg a aproximadamente 2x1014 vg/kg o el rAAV está a una dosis de aproximadamente 5x1013 vg/kg, aproximadamente 6 x1013 vg/kg, aproximadamente 7x1013 vg/kg, aproximadamente 8x1013 vg/kg, aproximadamente 9x1013 vg/kg, aproximadamente 1x1014 vg/kg, aproximadamente 2x1014 vg/kg, aproximadamente 3x1014 vg/kg, aproximadamente 4x1014 vg/kg o aproximadamente 5x1014 vg/kg basándose en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación.

En cualquiera de los usos descritos, el medicamento comprende rAAV a una dosis de aproximadamente 1,85 x 1013 vg/kg o 7,41 x 1013 vg/kg basada en un ADN o plásmido linealizado como patrón de cuantificación. Por ejemplo, el medicamento comprende rAAV a una dosis de aproximadamente 1,0 1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x 1013 vg/kg, aproximadamente 1,5 x 1013vg/kg a aproximadamente 8,0 1013 vg/kg, aproximadamente 1,6 x 1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x 1013 vg/kg, aproximadamente 1,8 1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x 1013 vg/kg, aproximadamente 1,2 x 1013vg/kg a aproximadamente 7,5 1013 vg/kg, aproximadamente 1,9 x 1013vg/kg a aproximadamente 7,5 x 1013 vg/kg, aproximadamente 1,4 1013vg/kg a aproximadamente 7,4 x 1013 vg/kg, aproximadamente 1,9 1013 vg/kg a aproximadamente 7,5 1013 vg/kg, o aproximadamente 1,8 x 1013vg/kg a aproximadamente 8,0 x 1013 vg/kg basada en un ADN o plásmido linealizado como patrón de cuantificación.

Además, en cualquiera de los usos descritos, el medicamento está formulado para administración por vía intravenosa. Por ejemplo, en cualquiera de los usos descritos, el medicamento se formula para administración mediante inyección, infusión o implantación. En algunas realizaciones, el medicamento está formulado para administración por vía intravenosa a través de una vena periférica de una extremidad.

En cualquiera de los usos descritos, el medicamento es para el tratamiento de la distrofia muscular de cinturas de extremidades, tal como la distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2D (LGMD2D).

Se describe el uso de un rAAV para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la distrofia muscular de cinturas de extremidades, donde el medicamento está formulado para la administración por infusión intravenosa y el rAAV está en una dosis de aproximadamente 5x1013 vg/kg a aproximadamente 2x1014 vg/kg basado en un ADN superenrollado o plásmido como el patrón de cuantificación, y donde el rAAV comprende la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4. Por ejemplo, la administración del medicamento a un sujeto que lo necesita da como resultado un aumento en la expresión del gen alfa-sarcoglicano en una célula del sujeto en comparación con el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano antes de la administración del rAAV.

En cualquiera de los usos descritos, la administración del medicamento a un sujeto que lo necesita da como resultado un aumento en el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano en una célula del sujeto en comparación con el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano antes de la administración del medicamento. medicamento; y/o la administración del medicamento a un sujeto da como resultado una disminución del nivel de CK en suero en el sujeto en comparación con el nivel de CK en suero antes de la administración del medicamento; y/o donde aumentan la actividad locomotora y la generación de fuerza específica; donde se reduce la fibrosis; donde aumenta la resistencia a la lesión inducida por la contracción en el músculo tibial anterior; y/o la administración del medicamento al sujeto da como resultado un aumento en el número de fibras positivas alfa-sarcoglicano en el tejido muscular del sujeto en comparación con el número de fibras positivas alfa-sarcoglicano antes de la administración del medicamento, y /o la administración del medicamento al sujeto que lo necesita da como resultado una fibrosis reducida en el sujeto en comparación con antes de la administración del medicamento; y/o la administración del medicamento da como resultado un aumento en la fuerza específica, el tamaño del diámetro de la fibra y/o la contracción excéntrica en el músculo del sujeto en comparación con antes de la administración del medicamento. En algunas realizaciones, la expresión del gen alfa-sarcoglicano se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano mediante inmunotransferencia tipo Western, y/o inmunohistoquímica.

También se describe el uso de cualquiera de los rAAV divulgados para la preparación de un medicamento para expresar el gen alfa-sarcoglicano en una célula en un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, se describe el uso de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA para la preparación de un medicamento para expresar el gen alfa-sarcoglicano en una célula en un sujeto que lo necesita, donde la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. : 4. Además, en cualquiera de los usos, la expresión del gen alfa-sarcoglicano en la célula del sujeto se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano en una transferencia Western en biopsias musculares. Alternativamente, en cualquiera de los usos, la expresión del gen alfa-sarcoglicano en la célula se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano mediante inmunohistoquímica en biopsias musculares. En otras realizaciones, la expresión del gen del alfa-sarcoglicano se mide en el sujeto detectando el número de genomas del vector por microgramo de ADN genómico.

En el presente documento se describe el uso de cualquiera de los rAAV divulgados para la preparación de un medicamento para disminuir el nivel de CK en suero en un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, se describe el uso de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA para la preparación de un medicamento para disminuir el nivel de CK en suero en un sujeto que lo necesita, donde la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

En el presente documento se describe el uso de cualquiera de los rAAV divulgados para la preparación de un medicamento para aumentar las fibras positivas alfa-sarcoglicano en un tejido muscular de un sujeto. Por ejemplo, se describe el uso de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA para la preparación de un medicamento para aumentar las fibras positivas al alfa-sarcoglicano en un tejido muscular de un sujeto, donde la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

En el presente documento se describe el uso de cualquiera de los rAAV divulgados para la preparación de un medicamento para aumentar la expresión de alfa-sarcoglicano en un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, se describe el uso de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA para la preparación de un medicamento para aumentar la expresión de alfasarcoglicano en un sujeto que lo necesita, donde la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. : 4. Además, en cualquiera de los usos descritos, la expresión del gen alfa-sarcoglicano en la célula del sujeto se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano en una transferencia Western en biopsias musculares. Alternativamente, en cualquiera de los usos descritos, la expresión del gen alfa-sarcoglicano en la célula se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano mediante inmunohistoquímica en biopsias musculares. En otras realizaciones, la expresión del gen del alfa-sarcoglicano se mide en el sujeto detectando el número de genomas del vector por microgramo de ADN genómico.

En cualquiera de los métodos, composiciones o usos divulgados, el sujeto es un sujeto humano que tiene de 4 a 15 años de edad, o un sujeto humano que tiene de 25 a 55 años de edad o un sujeto humano que tiene más de 50 años de edad.

En cualquiera de los métodos, composiciones o usos divulgados, el sujeto es un sujeto pediátrico, un sujeto adolescente o un sujeto adulto joven. Alternativamente, el sujeto es un adulto de mediana edad o un anciano.

Por ejemplo, en cualquiera de los métodos, composiciones o usos divulgados, el sujeto es un sujeto humano que tiene entre 4 y 15 años de edad, tiene una mutación alfa-sarcoglicano (SGCA, por sus siglas en inglés) confirmada en ambos alelos, fue negativo para anticuerpos AAVrh74 y/ o tenía >40% o una prueba de caminata normal de 100 metros.

También se describen métodos para generar un rAAV administrado en un método de cualquiera de los métodos, composiciones o usos divulgados, comprendiendo el método transferir un plásmido vector de AAV a una célula huésped, donde el plásmido vector de AAV comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a SEQ ID NO: 8. Por ejemplo, el plásmido vector AAV comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el plásmido vector comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO. : 1, 4 u 8, o el plásmido vector comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 4 u 8.

En cualquiera de los métodos descritos para generar un rAAV, el método comprende además transferir un plásmido empaquetador y/o un virus auxiliar a la célula huésped. Además, en cualquiera de los métodos descritos para generar un rAAV, una célula empaquetadora comprende un gen cap de AAV integrado de manera estable y/o comprende una célula empaquetadora que comprende un gen rep de AAV integrado de manera estable.

También se describen células huésped que comprenden un plásmido vector de AAV que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica. a SEQ ID NO: 1, 4 u 8. Por ejemplo, la célula huésped comprende un plásmido vector AAV que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 4 u 8.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO

Figura 1muestra el casete del gen scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

Figura 2muestra la expresión transgénica en un estudio de aumento de dosis después del tratamiento sistémico con scAAVrh74.tMCK.hSGCA. (A) Tinción de inmunofluorescencia alfa-sarcoglicano de múltiples músculos de ratones tratados sistémicamente (intravenosos) con 1x1012 vg, 3*1012 vg y 6*1012 vg (o 5x 1013 vg/kg, 1*1014 vg/kg y 2*1014 vg/kg, respectivamente, basado en un ratón de 20 g) (n=6 por grupo). Las fibras musculares que expresaban el alfasarcoglicano 12 semanas después del tratamiento oscilaron entre el 70% y el 93% en comparación con los controles no tratados. (B) transferencias Western de músculos de los ratonessgca-/-tratados confirman la expresión de la proteína hSGCA. Abreviaturas: TA, tibial anterior; GAS, gastrocnemio; QD, cuádriceps; TRI, tríceps; GLUT, glúteo; PSO, psoas mayor; DIA, diafragma; TRH, corazón; WT, tipo silvestre.

Figura 3muestra una mejora en la morfología muscular por scAAVrh74.tMCK.hSGCA independientemente de la dosis en ratonessgca-/-.(A) Imágenes de hematoxilina y eosina de varios músculos de ratonessgca-/-tratados con 1x1012 vg, 3*1012 vg y 6*1012 vg (o 5x 1013 vg/kg, 1*1014 vg/kg y 2*1014 vg/kg, respectivamente, basado en un ratón de 20 g) de scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Imágenes representativas de 20x muestran una reducción drástica de los núcleos centralizados y una normalización general del tamaño de las fibras independientemente de la dosis de tratamiento. (B) Cuantificación que confirma la normalización del diámetro de las miofibras de varios músculos en los grupos tratados en comparación con ratones tratados con vehículo y controles de tipo silvestre (n = 6 por grupo). (C) Cuantificación de núcleos ubicados centralmente en músculos de ratones tratados en comparación con ratones no tratados y controles de tipo silvestre (n = 6 por grupo). Abreviaturas: TA, tibial anterior; GAS, gastrocnemio; QD, cuádriceps; GLUT, glúteo; PSO, psoas mayor; TRI, tríceps; DIA, diafragma; WT, tipo silvestre.

Figura 4muestra fibrosis de reducción en ratonessgca-/-tratados con scAAVrh74.tMCK.hSGCA. (A) La tinción con rojo Picrosirius muestra una fibrosis reducida en ratones tratados con scAAVrh74.tMCK.hSGCA indicada por una disminución en la deposición de colágeno en comparación con ratonessgca-/-tratados con vehículo en varios músculos Se muestran imágenes representativas de 20x. (B) La cuantificación de los niveles de colágeno en varios músculos confirma la reducción de los niveles de colágeno en los tres grupos tratados en comparación con ratones no tratados y controles de tipo silvestre (n = 6 por grupo). Abreviaturas: PSO, psoas mayor; DIA, diafragma; TRI, tríceps; GLUT, glúteo.

Figura 5muestra beneficios funcionales para el músculo esquelético después del tratamiento con scAAVrh74.tMCK.hSGCA. (A) Después de 3 meses de tratamiento, se extrajeron los músculos tibial anterior (TA) (tanto izquierdo como derecho) para medir la fuerza específica y la resistencia al daño inducido por la contracción (normalizado al peso de TA). La cuantificación de la fuerza específica y la contracción excéntrica aumentó en todos los grupos tratados (con una diferencia mínima entre dosis) en comparación con los controles no tratados (n = 6 por grupo). (B) Se recolectaron tiras de músculo del diafragma para medir la fuerza específica. Después de 12 semanas de tratamiento, la fuerza aumentó significativamente en los ratones tratados en comparación con ratonessgca-/-no tratados. (C) Después de 12 semanas de tratamiento, se observó una mejora en la deambulación y la actividad vertical mediante análisis de campo abierto en ratones tratados en comparación con controlessgca-/-no tratados (n=6 por grupo). (D) Los niveles de creatina quinasa en suero disminuyeron en todos los grupos de tratamiento en comparación con controlessgca-/-no tratados. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido del análisis post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. *=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001,***=p<0,0001 en comparación con ratonessgca-/-tratados con vehículo, a menos que se indique lo contrario. Abreviaturas: Ta , tibial anterior; DIA, diafragma; WT, tipo silvestre.

Figura 6no muestra evidencia de toxicidad a través de la química sanguínea después del tratamiento con scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Se analizó la toxicidad de las enzimas hepáticas (ALT, AST y ALP/K) y los niveles de glucosa en sangre (GLU) (n = 6 por grupo). Todos los valores químicos de los ratones tratados estaban dentro de los límites normales/saludables de los ratones como lo indican las líneas de puntos.

Figura 7Amuestra el análisis de biodistribución del histograma de distribución de suministro de scAAVrh74.tMCK.hSGCA sistémico de copias vg medias de transcripción por microgramo de ADN agregado a la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en varios tejidos de ratonessgca-/-después de la administración intravenosa de scAAVrh74.tMCK.hSGCA a 3*1012 vg y 6*1012 vg (o 1*1014 vg/kg y 2*1014 vg/kg, respectivamente, basado en un ratón de 20 g).Figura 7Bmuestra transferencias Western de la expresión de la proteína alfa-sarcoglicano en el hígado de ratones WT ysgca-/-tratados con cualquiera de los vehículos(sgca-/-LR (ringer de lactato)) o scAArh74.tMCK.hSGCA a 1,0 x 1012 vg (transferencia Western izquierda) o 6 * 1012 vg (transferencia Western derecha). Cada carril representa un ratón independiente (M1: Ratón 1; M2: Ratón 2; M3: Ratón 3). El panel inferior representa la vinculina que se utilizó como control de carga. Abreviaturas: DIA, diafragma; TA, tibial anterior; TRI, tríceps

Figura 8muestra la expresión de scAAVrh74.tMCK.hSGCA en el músculo esquelético de ratonessgca^ de doce meses mediante tinción por inmunofluorescencia (Fig. 8A) y transferencia Western (Fig. 8B). El gráfico de la Figura 8C proporciona el porcentaje de fibras musculares positivas en los ratones sgca_/_scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Abreviaturas: TA, tibial anterior; GAS, gastrocnemio; QD, cuádriceps; GLUT, glúteo; TRI, tríceps; PSOAS, psoas mayor, diafragma; WT, tipo silvestre, LRS, solución de ringer lactatos

Figura 9muestra los resultados histológicos de la administración de scAAVrh74.tMCK.hSGCA en ratonessgca-/-de doce meses. La Figura 9a muestra una patología muscular mejorada. La Figura 9b muestra una reducción en la nucleación central y un aumento en el tamaño promedio de las fibras en los músculos gastrocnemio (GAS) y tríceps (TRI). La Figura 9c muestra una reducción en los niveles de fibrosis en comparación con los controles no tratados. Abreviaturas: TA, tibial anterior; GAS, gastrocnemio; QD, cuádriceps; GLUT, glúteo; PSO, psoas mayor, TRI, tríceps; diafragma; WT, tipo silvestre.

Figura 10muestra una mejora funcional en un ratón envejecido después de administrar scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente divulgación se basa en el descubrimiento de que la administración de un rAAV que comprende un polinucleótido que expresa alfa-sarcoglicano da como resultado una reducción o una reversión completa de la fibrosis muscular en un modelo animal de distrofia muscular de cinturas de extremidades. Como se demuestra en el presente documento en los Ejemplos, la administración del rAAV descrito en el presente documento dio como resultado la reversión de las características distróficas que incluyen niveles reducidos de CK, aumento de la fuerza muscular, mejor deambulación y actividad vertical, y otras funciones motoras.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de virología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de los conocimientos de la técnica. Estas técnicas se explican detalladamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Clonación molecular: Manual de laboratorio (edición actual); Clonación de ADN: Un enfoque práctico, vol. I y II (D. Glover, ed.); Síntesis de oligonucleótidos (N. Gait, ed., edición actual); Hibridación de ácidos nucleicos (B. Hames & S. Higgins, eds., edición actual); Transcripción y traducción (B. Hames & S. Higgins, eds., edición actual); Manual del CRC sobre parvovirus, vol. I y II (P Tijssen, ed.); Virología fundamental, segunda edición, vol. I y II (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds.); Cultivo de células animales de Freshney, manual de técnicas básicas (Wiley-Liss, tercera edición); y Ausubel et al. (1991) Protocolos actuales en biología molecular (Wiley Interscience, Nueva York).

Definiciones

Tal como se utilizan en este documento, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "el cultivo" incluye la referencia a uno o más cultivos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. La referencia a "un AAV recombinante" incluye una mezcla de dos o más viriones de rAAV y similares. Todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta invención, a menos que se indique claramente lo contrario.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere únicamente a alternativas, o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere únicamente a alternativas y "y /o."

A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye el error estadístico experimental (desviación estándar del error) para el dispositivo o método que se emplea para determinar el valor.

El término "vector" o "vector de expresión" pretende ser cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc., que es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control adecuados. y que puede transferir secuencias genéticas entre células. En una realización, el vector es un vector viral. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de secuencias de control, genes estructurales (por ejemplo, genes de interés) y secuencias de ácidos nucleicos que cumplen también otras funciones.

Como se usa en el presente documento, el término "AAV" es una abreviatura convencional de virus adenoasociado. El virus adenoasociado es un parvovirus de ADN monocatenario que crece solo en células en las que ciertas funciones se proporcionan por un virus auxiliar coinfectante. Actualmente hay trece serotipos de AAV que se han caracterizado. Pueden encontrarse información general y revisiones de AAV en, por ejemplo, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, vol. 1, págs. 169-228, y Berns, 1990, Virology, págs. 1743-1764, Raven Press, (Nueva York). Sin embargo, se espera plenamente que estos mismos principios sean aplicables a serotipos de AAV adicionales ya que se sabe bien que los diversos serotipos están muy estrechamente relacionados, tanto estructural como funcionalmente, incluso a nivel genético. (Véanse, por ejemplo, Blacklowe, 1988, págs. 165-174 de Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; y Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). Por ejemplo, todos los serotipos de AAV aparentemente presentan propiedades de replicación muy similares mediadas por genes rep homólogos; y todos llevan tres proteínas de la cápside relacionadas, tales como las expresadas en AAV2. El grado de parentesco lo sugiere además el análisis heterodúplex que revela una hibridación cruzada extensa entre los serotipos a lo largo de la longitud del genoma; y la presencia de segmentos de autoapareamiento análogos en los extremos terminales que corresponden a "secuencias repetidas terminales invertidas" (ITR). Los patrones de infectividad similares también sugieren que las funciones de replicación en cada serotipo están bajo un control regulatorio similar.

El término "vector de AAV" se refiere a un vector que comprende uno o más polinucleótidos de interés (o transgenes) que están flanqueados por secuencias repetidas terminales (ITR, por sus siglas en inglés) de AAV. Tales vectores de a Av pueden replicarse y empaquetarse en partículas virales infecciosas cuando están presentes en una célula huésped que se ha transfectado con un vector que codifica y expresa los productos de los genes rep y cap. En una realización, el vector de AAV es un vector derivado de un serotipo de virus adenoasociado, que incluye, entre otros, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh10 y AAV rh74. Los vectores de AAV pueden tener uno o más de los genes de AAV de tipo silvestre eliminados total o parcialmente, preferiblemente los genes rep y/o cap, pero conservan secuencias ITR flanqueantes funcionales. Las secuencias ITR funcionales son necesarias para el rescate, replicación y empaquetamiento del virión AAV. Por lo tanto, un vector de AAV se define en el presente documento para incluir al menos aquellas secuencias requeridas en cis para la replicación y empaquetamiento (por ejemplo, ITR funcionales) del virus. Las ITR no necesitan ser secuencias de nucleótidos de tipo silvestre y pueden alterarse, por ejemplo, mediante la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos, siempre que las secuencias proporcionen rescate, replicación y empaquetado funcionales.

El término "funciones auxiliares de AAV" se refiere a secuencias codificantes derivadas de AAV que pueden expresarse para proporcionar productos génicos de AAV que, a su vez, funcionan en trans para la replicación productiva de AAV. Por lo tanto, las funciones auxiliares de AAV comprenden los principales marcos de lectura abiertos (ORF, por sus siglas en inglés), repeticiones y límites de AAV. Se ha demostrado que los productos de expresión Rep poseen muchas funciones, que incluyen, entre otras: reconocimiento, unión y mella del origen de replicación del ADN del AAV; actividad de ADN helicasa; y modulación de la transcripción de promotores AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión Cap proporcionan las funciones de embalaje necesarias. Las funciones auxiliares de AAV se utilizan en el presente documento para complementar funciones de AAV en trans que faltan en los vectores de AAV.

Por "virus recombinante" se entiende un virus que ha sido alterado genéticamente, por ejemplo, mediante la adición o inserción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga en la partícula viral.

Por "virión de AAV", "partícula viral de AAV" o "partícula de vector de AAV" se refiere a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV y un vector de AAV polinucleotídico encapsidado. El virión de<a>A<v>, en una realización, comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un genoma de AAV de tipo silvestre, tal como un transgén que se suministrará a una célula de mamífero). La producción de partículas virales de AAV, en alguna realización, incluye la producción de un vector de AAV, ya que dicho vector está contenido dentro de una partícula de vector de AAV. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un genoma de AAV de tipo silvestre, tal como un transgén que se suministrará a una célula de mamífero), normalmente se denomina "vector de rAAV" o simplemente "partícula de rAAV". Por lo tanto, la producción de una partícula de vector de AAV incluye necesariamente la producción de rAAV, ya que dicho genoma de rAAV está contenido dentro de una partícula de vector de rAAV.

Por ejemplo, una partícula de virus AAV de tipo silvestre (wt, por sus siglas en inglés) que comprende un genoma de ácido nucleico de AAV monocatenario lineal asociado con una cubierta proteica de la cápside de AAV. El virión de AAV puede ser un AAV monocatenario (ss, por sus siglas en inglés) o un AAV autocomplementario (SC, por sus siglas en inglés). En una realización, se pueden empaquetar moléculas de ácido nucleico de AAV monocatenario de cualquier sentido complementario, por ejemplo, cadenas "sentido" o "antisentido", en un virión de AAV y ambas cadenas son igualmente infecciosas.

El término "AAV recombinante" o "rAAV" se define en el presente documento como un virus infeccioso con replicación defectuosa compuesto por una cubierta de proteína de AAV, que encapsida una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés que está flanqueada en ambos lados por ITR de AAV. Un rAAV, en una realización, se produce en una célula huésped adecuada que tiene un vector de AAV, funciones auxiliares de AAV y funciones accesorias introducidas en el mismo. De esta manera, la célula huésped es capaz de codificar polipéptidos de AAV que se requieren para empaquetar el vector de AAV (que contiene una secuencia de nucleótidos recombinante de interés) en partículas de virión recombinantes infecciosas para el posterior suministro de genes.

El término "transfección" se refiere a la absorción de ADN extraño por una célula, y una célula ha sido "transfectada" cuando se ha introducido ADN exógeno dentro de la membrana celular. Generalmente se conocen en la técnica varias técnicas de transfección. Véase, por ejemplo, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, un manual de laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis et al. (1986) Métodos básicos en biología molecular, Elsevier y Chu et al. (1981) Gen 13:197. Tales técnicas pueden usarse para introducir uno o más restos de ADN exógenos, tales como un vector de integración de nucleótidos y otras moléculas de ácido nucleico, en células huésped adecuadas.

El término "transducción" denota el suministro de una molécula de ADN a una célula receptora in vivo o in vitro, a través de un vector viral de replicación defectuosa, tal como a través de un virión AAV recombinante.

El término "célula huésped" se refiere, por ejemplo, a microorganismos, células de levadura o insectos. células y células de mamíferos, que pueden usarse, o han sido, utilizadas como receptores de una construcción auxiliar de AAV, un plásmido de vector de AAV, un vector de función accesoria u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Por lo tanto, una "célula huésped" como se usa en el presente documento generalmente se refiere a una célula que ha sido transfectada con una secuencia de ADN exógena. Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN genómico o total al progenitor original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada.

El término "heterólogo", en lo que se refiere a secuencias de ácidos nucleicos tales como secuencias codificantes y secuencias de control, denota secuencias que normalmente no están unidas entre sí y/o normalmente no están asociadas con una célula particular. Por tanto, una región "heteróloga" de una construcción de ácido nucleico o un vector es un segmento de ácido nucleico dentro o unido a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra asociado con la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga de una construcción de ácido nucleico podría incluir una secuencia codificante flanqueada por secuencias que no se encuentran asociadas con la secuencia codificante en la naturaleza. Otro ejemplo de una secuencia codificante heteróloga es una construcción donde la secuencia codificante en sí no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo). De manera similar, una célula transformada con una construcción que normalmente no está presente en la célula se consideraría heteróloga para los fines de esta invención. La variación alélica o los eventos mutacionales que ocurren naturalmente no dan lugar a ADN heterólogo, como se usa en el presente documento.

Una "secuencia codificante" o una secuencia que "codifica" una proteína particular es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia codificante puede incluir, entre otras, ADNc de ARNm procariótico o eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN procariótico o eucariótico e incluso secuencias de ADN sintético. Normalmente, una secuencia de terminación de la transcripción estará situada en 3' con respecto a la secuencia codificante.

Una secuencia de "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ADN o ARN. Los ácidos nucleicos incluyen análogos de bases de ADN y ARN que incluyen, entre otros, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometilo. -2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina , 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, uracilo Éster metílico del ácido 5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ácido éster metílico-uracilo-5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

El término "secuencias de control" de ADN se refiere colectivamente a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores aguas arriba, orígenes de replicación, sitios internos de entrada a ribosomas ("IRES", por sus siglas en inglés), potenciadores y similares, que colectivamente proporcionan la replicación. , transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula receptora. No es necesario que todas estas secuencias de control estén siempre presentes siempre que la secuencia codificante seleccionada sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una célula huésped apropiada.

El término "promotor" se usa en el presente documento en su sentido habitual para referirse a una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, donde la secuencia reguladora deriva de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una cadena (dirección 3') secuencia de codificación. Los promotores de la transcripción pueden incluir "promotores inducibles" (donde la expresión de una secuencia de polinucleótidos unida operativamente al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), "promotores reprimibles" (donde la expresión de una secuencia de polinucleótidos unida operativamente al promotor el promotor es inducido por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.) y "promotores constitutivos". En una realización, el promotor es un promotor específico de músculo, que incluye, entre otros, un elemento genético de actina esquelética humana, un elemento genético de actina cardíaca, un promotor de desmina, un promotor de alfa-actina esquelética (ASKA, por sus siglas en inglés), un promotor de troponina. I (TNNI2, por sus siglas en inglés), un factor de unión potenciador específico de miocitos, elemento de unión mef, un promotor de creatina quinasa muscular (MCK, por sus siglas en inglés), un promotor de MCK truncado (tMCK, por sus siglas en inglés), un promotor de cadena pesada de miosina (MHC, por sus siglas en inglés), una cadena pesada híbrida de a-miosina promotor potenciador/promotor potenciador-promotor MCK (MHCK7, por sus siglas en inglés), un promotor C5-12, un elemento potenciador de la creatina quinasa murina, un elemento del gen esquelético de la troponina c de contracción rápida, un elemento del gen de la troponina c cardíaca de contracción lenta, una troponina de contracción lenta i elemento genético, elemento de respuesta al factor nuclear inducible por hipoxia (HIF, por sus siglas en inglés) (HRE, por sus siglas en inglés), un elemento inducible por esteroides y un elemento de respuesta a glucocorticoides (gre, por sus siglas en inglés). En otra realización, el promotor es un promotor MCK, un promotor tMCK o un promotor MHCK7.

El término "unido operativamente" se refiere a una disposición de elementos donde los componentes así descritos están configurados para realizar su función habitual. Por tanto, las secuencias de control unidas operativamente a una secuencia codificante son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificante. No es necesario que las secuencias de control sean contiguas a la secuencia codificante, siempre que funcionen para dirigir la expresión de la misma. Así, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias intermedias no traducidas pero transcritas entre una secuencia promotora y la secuencia codificante y la secuencia promotora todavía puede considerarse "unida operativamente" a la secuencia codificante.

Un promotor "dirige la transcripción" de una secuencia codificante en una célula cuando la ARN polimerasa se une a la secuencia promotora y transcribe la secuencia codificante en ARNm, que luego se traduce en el polipéptido codificado por la secuencia codificante.

"Casete de expresión" o "construcción de expresión" se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de la(s) secuencia(s) o gen(es) de interés. El casete de expresión incluye elementos de control, como se describió anteriormente, tales como un promotor que está unido operativamente (para dirigir la transcripción de) la(s) secuencia(s) o gen(es) de interés, y a menudo incluye también una secuencia de poliadenilación. En determinadas realizaciones de la invención, el casete de expresión descrito en el presente documento puede estar contenido dentro de una construcción de plásmido. Además de los componentes del casete de expresión, la construcción plasmídica también puede incluir uno o más marcadores seleccionables, una señal que permite que la construcción plasmídica exista como ADN monocatenario, al menos un sitio de clonación múltiple y un origen de replicación de "mamífero" (por ejemplo, un origen de replicación de SV40 o adenovirus).

Por "aislado" cuando se hace referencia a una secuencia de nucleótidos, se entiende que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas tales como otras secuencias de nucleótidos, material de cromatina, etc. Por tanto, una "molécula de ácido nucleico aislada que codifica una secuencia de nucleótidos particular" polipéptido" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido en cuestión; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o restos adicionales que no afectan perjudicialmente a las características básicas de la composición.

Con el fin de describir la posición relativa de las secuencias de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico particular a lo largo de la presente solicitud, tal como cuando una secuencia de nucleótidos particular se describe como situada "aguas arriba", "aguas abajo", "3" o "5" con respecto a otra secuencia, debe entenderse que es la posición de las secuencias en la cadena "sentido" o "codificante" de una molécula de ADN a la que se hace referencia como es convencional en la técnica.

Los términos "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" o "porcentaje idéntico" en el contexto de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se refieren a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede abarcar toda la longitud del genoma, la longitud completa de una secuencia codificante de gen o un fragmento de al menos aproximadamente 500 a 5000 nucleótidos. Sin embargo, también se puede desear la identidad entre fragmentos más pequeños, por ejemplo, de al menos unos nueve nucleótidos, normalmente de al menos unos 20 a 24 nucleótidos, de al menos unos 28 a 32 nucleótidos, de al menos unos 36 nucleótidos o más. El porcentaje de identidad de las secuencias se puede determinar mediante técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la homología se puede determinar mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas polipeptídicas alineando la información de secuencia y usando programas informáticos fácilmente disponibles tales como a LiGN, ClustalW2 y BLAST. En una realización, cuando se usa BLAST como herramienta de alineación, los siguientes parámetros predeterminados: código genético = estándar; filtro=ninguno; hebra=ambos; corte=60; esperar=10; Matriz=BLOSUM62; Descripciones=50 secuencias; ordenar por=PUNTUACIÓN ALTA; Bases de datos = no redundante, GenBank EMBL DDBJ PDB GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR

El término "sujeto" se refiere a cualquier miembro del reino animal, que incluye, sin limitación, humanos y primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja como ganado vacuno, ovino, porcino, caprino y equino; mamíferos domésticos como perros y gatos; animales de laboratorio, incluidos roedores tales como ratones, ratas y cobayas, y similares. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano con edades comprendidas desde el nacimiento hasta los 2 años, de 1 a 10 años, o de 4 a 15 años, o de 10 a 19 años, o de 20 a 40 años de edad, o de 15 a 29 años o de 25 a 55 años, o de 40 a 60 años, o más de 50 años o más de 60 años o más de 65 años o más de 70 años. Por ejemplo, el sujeto es un niño humano (de 2 a 12 años), un adolescente humano (de 10 a 19 años). En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano adulto (18 años o más). En particular, el sujeto es un humano adulto joven (de 15 a 29 años de edad), un humano adulto de mediana edad (de 25 a 55 años de edad) o un humano adulto mayor (de más de 50 años de edad) o un sujeto humano de edad avanzada (de más de 65 años de edad) o un sujeto humano geriátrico (mayor de 70 años).

Por "efecto terapéutico" se entiende cualquier beneficio terapéutico conferido por el tratamiento descrito en el presente documento. Por ejemplo, tal efecto puede ser la expresión sostenida, en un tejido diana apropiado, de una proteína o una enzima que es deficiente o está ausente en la distrofia muscular de interés. Además, un efecto terapéutico puede ser cualquier reducción o eliminación de una o más manifestaciones clínicas o subclínicas de la enfermedad o trastorno de interés. Por ejemplo, una reducción en el nivel de CK, se reduce la fibrosis; un aumento de la resistencia a la lesión inducida por la contracción en el músculo tibial anterior; y/el aumento de la fuerza específica en el músculo y la función motora mejorada proporcionan un beneficio terapéutico al sujeto tratado con LGMD-2D.

Un vector de AAV recombinante descrito en el presente documento comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica alfa-sarcoglicano que es al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o una proteína conserva la actividad a-sarcoglicana. En otra realización, el alfa-sarcoglicano comprende una secuencia polipeptídica expuesta en SEQ ID NO: 2.

En el presente documento se describe un vector de AAV recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica alfa-sarcoglicano funcional que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones estrictas con la secuencia de ácido nucleico al menos en un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a SEQ ID NO: 1, o un complemento del mismo. En otra realización, el rAAV comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 4. En otra realización, el rAAV comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4.

El término "riguroso" se usa para referirse a las condiciones que se entienden comúnmente en la técnica como rigurosas. La rigurosidad de la hibridación se determina principalmente por la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de agentes desnaturalizantes tales como formamida. Ejemplos de condiciones estrictas para la hibridación y el lavado son cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a 65-68 °C o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 50 % a 42 °C. Véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y 1989). También pueden usarse condiciones más rigurosas (tales como temperatura más alta, fuerza iónica más baja, formamida más alta u otro agente desnaturalizante), sin embargo, la tasa de hibridación se verá afectada. En casos en donde se trata de la hibridación de desoxioligonucleótidos, las condiciones de hibridación rigurosas a modo de ejemplo adicionales incluyen lavado en 6x SSC pirofosfato de sodio al 0,05 % a 37 °C (para oligos de 14 bases), 48 °C (para oligos a 17 bases), 55 °C (para oligos a 20 bases) y 60 °C (para oligos de 23 bases).

Cuando en el presente documento se utilizan rangos para propiedades físicas, como peso molecular, concentración o dosificación, se pretende incluir todas las combinaciones y subcombinaciones de rangos y realizaciones específicas de los mismos. El término "aproximadamente" cuando se refiere a un número o rango numérico significa que el número o rango numérico al que se hace referencia es una aproximación dentro de la variabilidad experimental (o dentro del error estadístico experimental), y por lo tanto el número o rango numérico puede variar de, por ejemplo , entre el 1% y el 15% del número o rango numérico indicado.

Pueden incluirse otros agentes en los tampones de hibridación y lavado para el fin de reducir la hibridación no específica y/o de fondo. Algunos ejemplos son 0,1% de albúmina de suero bovino, 0,1% de polivinilpirrolidona, 0,1% de pirofosfato sódico, 0,1% de dodecilsulfato sódico, NaDodSO4, (SDS), ficoll, solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (u otro ADN no complementario) y sulfato de dextrano, aunque también pueden utilizarse otros agentes adecuados. La concentración y los tipos de estos aditivos pueden cambiarse sin afectar sustancialmente a la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Habitualmente se llevan a cabo experimentos de hibridación a pH 6,8-7,4, sin embargo, en condiciones de fuerza iónica típicas, la tasa de hibridación es casi independiente del pH. Véase Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, Inglaterra). Las condiciones de hibridación puede ajustarlas un experto en la técnica con el fin de adaptarse a estas variables y permiten que los ADN de diferente relación de secuencia formen híbridos.

La distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2D (LGMD2D) es una distrofia muscular progresiva que se manifiesta con debilidad muscular, anomalías respiratorias y, en casos raros, miocardiopatía. LGMD2D es causada por mutaciones en el gen alfa-sarcoglicano que resultan en la pérdida de proteínas y la pérdida concomitante del sarcoglicano y el complejo de glicoproteína asociado a distrofina. El ratón Sgca-null (sgca'/_) recapitula el fenotipo clínico de pacientes con LGMD2D, incluidas características distróficas como necrosis y fibrosis muscular, creatina quinasa (CK) sérica elevada y reducción en la generación de fuerza muscular absoluta y actividad locomotora. Por lo tanto, los ratones sgca_/' proporcionan un modelo relevante para probar la seguridad y eficacia del reemplazo genético. Por la presente, esta divulgación proporciona un vector AAVrh74 autocomplementario que contiene un transgén SGCA humano de longitud completa (hSGCA) con codones optimizados impulsado por un promotor específico del músculo, la creatina quinasa muscular truncada (tMCK). Se probó la eficacia y seguridad de scAAVrh74.tMCK.hSGCA en ratonessgca■/_ utilizando un diseño de aumento de dosis para evaluar una única inyección sistémica de 1 * 101Z, 3 * 1012 y 6 * 1012 vg en comparación con el tratamiento con vehículo y con ratones de tipo silvestre. En el tratamiento de ratones sgca_/' con scAAVrh74.tMCK.hSGCA dio como resultado una expresión proteica robusta de a-SG en la membrana del sarcolema en el músculo esquelético en todas las dosis probadas. Además, scAAVrh74.tMCK.hSGCA fue eficaz para mejorar la histopatología del músculo de la extremidad y el diafragma de ratones sgca-/-, como lo indican las reducciones en la fibrosis y la nucleación central y la normalización del tamaño de las miofibras. Estos cambios moleculares fueron concomitantes con aumentos significativos en la generación de fuerza específica en el diafragma y el músculo tibial anterior, protección contra la pérdida de fuerza excéntrica y reducción de la CK sérica. La actividad locomotora mejoró en todas las dosis de ratones sgca-/- tratados con el vector en comparación con los tratados con vehículo. Por último, se detectó una falta de toxicidad asociada a vectores en un panel de química del suero y mediante necropsia macroscópica. En conjunto, el estudio brinda respaldo para el suministro sistémico de scAAVrh74.tMCK.hSGCA en un entorno clínico para el tratamiento de LGMD2D.

Los vectores de AAV recombinantes descritos en el presente documento pueden estar unidos operativamente a un elemento de control específico de músculo. Por ejemplo, el promotor específico de músculo comprende uno o más de un elemento genético de actina esquelética humana, un elemento genético de actina cardíaca, un promotor de desmina, un promotor de alfa-actina esquelética (ASKA), un promotor de troponina I (TNNI2), un promotor de miocitos. -elemento de unión al factor de unión potenciador específico mef, un promotor de creatina quinasa muscular (MCK), un promotor de MCK truncado (tMCK), un promotor de cadena pesada de miosina (MHC), un potenciador-promotor híbrido de cadena pesada de a-miosina-/potenciador-promotor de MCK ( MHCK7), un promotor C5-12, un elemento potenciador de la creatina quinasa murina, un elemento del gen esquelético de la troponina c de contracción rápida, un elemento del gen de la troponina c cardíaca de contracción lenta, un elemento del gen de la troponina i de contracción lenta, un elemento nuclear inducible por hipoxia factor de respuesta (HIF) (HRE), un elemento inducible por esteroides y un elemento de respuesta a glucocorticoides (gre).

En una realización, el promotor específico de músculo es un promotor tMCK, que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 3. Un rAAV ejemplar descrito en el presente documento es AAVrh74.tMCK.hSCGA que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos que codifica un AAVrh74.tMCK.hSCGA comprende una secuencia de al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %. %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o al menos 99 % idéntico a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4, o a una secuencia de nucleótidos que es al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o al menos 99 % idéntico a SEQ ID NO: 1.

En otra realización, la secuencia polinucleotídica que codifica un AAVrh74.tMCK.hSCGA comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia polipeptídica al menos en un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos 99% idéntico al nucleótido secuencia establecida en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la secuencia polinucleotídica codifica una proteína que conserva la actividad alfa-sarcoglicano.

En una realización, el rAAV comprende una secuencia repetida terminal invertida 5' de SEQ ID NO: 5. En otra realización, el rAAV comprende una secuencia de repetición terminal invertida 3' de SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, el rAAV comprende una secuencia poli A de SEQ ID NO: 7.

El VAA puede ser cualquier serotipo, por ejemplo VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA-10, VAA-11, VAA-12, VAA-13, VAA rh.10, VAA rh.74, o variantes y derivados de los mismos. En la presente invención el rAAV es del serotipo AAVrh.74. Se da a conocer la producción de rAAV pseudotipado en, por ejemplo, el documento WO 2001/083692. También se contemplan otros tipos de variantes de rAAV, por ejemplo rAAV con mutaciones de la cápside. Véase, por ejemplo, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014).

También se contemplan composiciones que comprenden cualquiera de los vectores rAAV descritos en el presente documento.

Se describen métodos de tratamiento de la distrofia muscular en un sujeto humano que lo necesite, que comprenden el paso de administrar un virus adeno-asociado recombinante (rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA, donde el rAAV se administra utilizando una dosis de aproximadamente 1,0 * 1012 vg/kg a aproximadamente 5,0 * 1015 vg/kg. Por ejemplo, en cualquiera de los métodos descritos, la dosis del rAAV administrada está entre aproximadamente 1,0 x 1012 vg/kg a aproximadamente 2.0 * 1015 vg/kg, aproximadamente 5 * 1012 vg/kg a aproximadamente 1,0 * 1015 vg/kg, aproximadamente 1,0 * 1013 vg/kg a aproximadamente 5,0 * 1014 vg/kg, aproximadamente 5*1013 vg/kg a aproximadamente 2*1014 vg/kg, o aproximadamente 2,0 * 1013 vg/kg a aproximadamente 3,0 * 1014 vg/kg. En otra realización, la dosis es aproximadamente 5.0 x 1013 vg/kg, 1,0 * 1014 vg/kg, o 2,0 * 1014 vg/kg. En una realización, el rAAV se administra por vía sistémica, que comprende una vía intravenosa. En otra realización, el rAAV se administra por vía intravenosa a una dosis de aproximadamente 5,0 x 1013. vg/kg, 1,0 * 1014 vg/kg, o 2,0 * 1014 vg/kg. En una realización, la distrofia muscular es una distrofia muscular de cinturas.

Además, la dosis del rAAV administrada es de aproximadamente 1,5 * 1013. vg a aproximadamente 3,5 * 1016 vg, o 3 * 1013 vg a 1 * 1016 vg, o aproximadamente 1,5 * 1013 vg a aproximadamente 2 * 1015 vg, o aproximadamente 1,5 * 1013 vg a aproximadamente 1 * 1015 vg. Además, en cualquiera de los métodos, la dosis de rAAV se administra a una concentración de aproximadamente 10 ml/kg. En una realización, la distrofia muscular es una distrofia muscular de cinturas. En una realización, la distrofia muscular es distrofia muscular de cinturas de extremidades, tipo 2D. Las dosis en esta divulgación, expresadas en vg o vg/kg, se basan en un método de calificación de titulación mediante PCR cuantitativa (qPCR). El método de titulación basado en qPCR es conocido en la técnica.

Se describen métodos para tratar la distrofia muscular en un sujeto que lo necesita, que comprenden la etapa de administrar un virus adenoasociado recombinante (rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA, donde el rAAV se administra usando una ruta de administración sistémica y en una dosis de aproximadamente 1,0 x 1012 vg/kg a aproximadamente 2,0 x 1015 vg/kg; donde el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano en una célula del sujeto aumenta después de la administración del rAAV en comparación con el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano antes de la administración del rAAV; donde el nivel de CK en suero en el sujeto disminuye después de la administración del rAAV en comparación con el nivel de CK en suero antes de la administración del rAAV; y/o donde aumentan la actividad locomotora y la generación de fuerza específica; donde se reduce la fibrosis; donde aumenta la resistencia a la lesión inducida por la contracción en el músculo tibial anterior; y/donde el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano en el tejido muscular del sujeto aumenta después de la administración del rAAV en comparación con el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano antes de la administración del rAAV; donde el tamaño del diámetro de la fibra en el tejido muscular del sujeto aumenta después de la administración del rAAV en comparación con el número del diámetro de la fibra antes de la administración del rAAV; o donde la nucleación central en el tejido muscular del sujeto se reduce después de la administración del rAAV en comparación con la nucleación central antes de la administración del rAAV. Los tejidos musculares incluyen, entre otros, tríceps, tibial anterior, sóleo, gastrocnemio, bíceps, trapecio, glúteo, psoas mayor, deltoides, cuádriceps y diafragma. En una realización, los tejidos musculares comprenden tibial anterior, gastrocnemio, glúteo, psoas mayor y tríceps. La expresión de alfa-sarcoglicano se determina mediante métodos conocidos por una persona con conocimientos habituales en la técnica. En una realización, la expresión se determina mediante transferencia Western, inmunoquímica en biopsias musculares y/o detectando el número de genoma del vector por microgramo de ADN genómico.

Se describe un método para tratar la distrofia muscular en un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar un virus adenoasociado recombinante (rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA, donde se demuestra que la función motora mejora en dicho sujeto humano en comparación con la función motora de dicho sujeto humano antes de la administración del rAAV.

Se describen métodos para aumentar el alfa-sarcoglicano en un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4.

En cualquiera de los métodos, usos y composiciones para el tratamiento de la distrofia muscular proporcionados, el sujeto tiene entre 4 y 15 años de edad, tiene una mutación alfa-sarcoglicano (SGCA) confirmada en ambos alelos, es negativo para los anticuerpos AAVrh74 y/o tiene >40% o prueba normal de caminata de 100 metros. En cualquiera de los métodos, usos y composiciones para el tratamiento de la distrofia muscular proporcionados, el sujeto es un sujeto pediátrico. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto pediátrico, tal como un sujeto con edades comprendidas entre 1 y 21 años. En algunas realizaciones, el sujeto tiene de 1 a 10 años de edad, o de 2 a 12 años de edad, de 4 a 15 años de edad, o de 10 a 19 años de edad. El sujeto, en una realización, es un sujeto adolescente, tal como un sujeto con edades comprendidas entre 12 y 21 años. Además, el sujeto, en una realización, es un sujeto adulto joven tal como un sujeto con edades comprendidas entre 15 y 29 años o entre 18 y 39 años. En alguna realización, el sujeto es un adulto de mediana edad o un sujeto de edad avanzada, de modo que el adulto de mediana edad puede tener una edad de entre 25 y 55 años, el sujeto adulto mayor puede tener una edad de más de 50 años, y el sujeto anciano puede tener edades superiores a 65 años. En algunas realizaciones, el rAAV se administra mediante inyección, infusión o implantación. Por ejemplo, el rAAV se administra mediante infusión durante aproximadamente 1 a 2 horas. Además, el rAAV se administra por vía intravenosa a través de una vena periférica de la extremidad.

Se describen métodos para tratar la distrofia muscular en un sujeto humano que lo necesita, que comprenden la etapa de administrar un virus adenoasociado recombinante (rAAV) scAAVrh74.tMCK.hSGCA, donde el rAAV se administra usando una ruta de administración sistémica y a una dosis de aproximadamente 1,0 x 1012 vg/kg a aproximadamente 5,0 x 1014 vg/kg y el rAAV comprende una secuencia de nucleótidos al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %. , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a SEQ ID NO: 1. En otra realización, el rAAV comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1. En una realización, el rAAV codifica una proteína que comprende una secuencia polipeptídica que es al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a SEQ ID NO: 2. En otra realización, el rAAV comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una secuencia polipeptídica expuesta en SEQ ID NO: 2. Además, cualquiera de los rAAV divulgados comprende un promotor tal como la secuencia del promotor tMCK de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el rAAV es del serotipo AAVrh.74. Además, el rAAV comprende la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 3. En una realización, el rAAV comprende una secuencia repetida terminal invertida 5' de SEQ ID NO: 5. En otra realización, el rAAV comprende una secuencia de repetición terminal invertida 3' de SEQ ID NO: 6. En otra realización, el rAAV comprende una secuencia poli A de SEQ ID NO: 7.

La dosis de AAV se puede determinar mediante múltiples métodos, que incluyen, entre otros, LISA, evaluación de la actividad de la transcriptasa inversa, FACS, ensayos de transducción, transferencia Northern (por ejemplo, Northern semicuantitativa), análisis de transferencia puntual o PCR (por ejemplo, qPCR). Es bien sabido que las dosis de AAV se pueden determinar midiendo los genomas del vector de AAV con PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). Estos métodos de qPCR superan la inconsistencia o los resultados arbitrarios de los ensayos de transducción convencionales. En una realización de la determinación de dosis por PCR, se utiliza ADN plasmídico como estándar de calibración. Las formas de los plásmidos pueden afectar los resultados de dosificación de los métodos qPCR. En una realización, el ADN circular o superenrollado o los plásmidos se utilizan como patrón de cuantificación. En otra realización, el ADN linealizado o los plásmidos se utilizan como patrón de cuantificación.

El término "ADN superenrollado" o "plásmido superenrollado" se refiere a un ADN o plásmido que no comprende ningún extremo libre. El término "ADN linealizado" o plásmido linealizado" se refiere a un ADN o plásmido que comprende un extremo 5' libre y un extremo 3' libre, que no están unidos entre sí. En una realización, se obtiene un ADN o plásmido linealizado mediante una digestión de restricción de un ADN circular (por ejemplo, ADN plasmídico) o mediante una digestión de restricción de un ADNb. En otra realización, la digestión de restricción se realiza usando enzimas que generan al menos un extremo romo.

Los métodos para tratar la distrofia muscular en un sujeto humano que lo necesite pueden comprender la etapa de administrar un virus adenoasociado recombinante (rAAV) scAAVrh74. tMCK7.hSGCA, donde el rAAV se administra usando una vía de administración sistémica y a una dosis de aproximadamente 1,0 x 1012 vg/kg a aproximadamente 5,0 x 1014 vg/kg, donde el sujeto humano sufre distrofia muscular de cinturas de extremidades. En una realización, el rAAV se administra por infusión intravenosa durante aproximadamente 1 a 2 horas a una dosis de aproximadamente 5,0 x 1013 vg/kg, 1,0 x 1014 vg/kg, o 2,0 x 1014 vg/kg basándose en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación, y donde el rAAV comprende la secuencia de nucleótidos del constructo scAAVrh74. tMCK7.hSGCA de SEQ ID NO: 3. En otra realización, la dosis es de aproximadamente 1,85 x 1013 vg/kg o 7,41 x 1013 vg/kg basándose en un ADN o plásmido linealizado como patrón de cuantificación.

Se describe un método para aumentar la expresión de sarcoglicano en tejido muscular de un sujeto que comprende administrar al sujeto una construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 90 % idéntica, al menos 95 % idéntica o 99 % idéntica a las SEQ ID NO: 1, y/o 4.

Se describe un método para mejorar la función muscular de un sujeto que comprende administrar al sujeto una construcción que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 90 % idéntica, al menos 95 % idéntica o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, y/o 4.

En algunos aspectos, el sujeto padece una mutación genética en un gen que codifica una proteína sarcoglicana o una distrofia muscular. En algunos aspectos, el sujeto padece una mutación genética en un gen que codifica la proteína alfasarcoglicano.

En cualquiera de los métodos descritos, el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano en una célula del sujeto aumenta después de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK 7.hSGCA en comparación con el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano antes de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

Además, en cualquiera de los métodos descritos, la expresión del gen alfa-sarcoglicano en la célula se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano en una transferencia Western o inmunohistoquímica en músculo biopsiado antes y después de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

En cualquiera de los métodos descritos, el nivel de proteína alfa-sarcoglicano aumenta después de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Por ejemplo, el nivel de proteína alfa-sarcoglicano aumenta en al menos un 33 % como se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano en una transferencia Western en músculo biopsiado antes y después de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA, o el nivel de proteína alfa-sarcoglicano se mide mediante inmunohistoquímica en biopsias musculares y/o detectando el número de genoma de vector por microgramo de ADN genómico antes y después de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el nivel de CK en suero en el sujeto disminuye después de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA en comparación con el nivel de Ck en suero antes de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano en el tejido muscular del sujeto aumenta después de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA en comparación con el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano antes de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Por ejemplo, el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano mediante transferencia Western o inmunohistoquímica en biopsias musculares antes y después de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Por ejemplo, el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano en el tejido muscular del sujeto aumenta después de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el nivel de alfa-sarcoglicano en el sujeto aumenta después de la administración del rAAV en comparación con el nivel de alfa-sarcoglicano antes de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA. El nivel de alfa-sarcoglicano se detecta midiendo el nivel de proteína alfasarcoglicano mediante inmunohistoquímica o transferencia Western en biopsias musculares antes y después de la administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA.

También se describen métodos que expresan el gen alfa-sarcoglicano en una célula de un paciente que comprenden administrar al paciente la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4. En cualquiera de los métodos descritos para expresar el gen alfa-sarcoglicano en una célula de un paciente, la expresión del gen alfa-sarcoglicano en la célula del paciente se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano en una transferencia Western o inmunohistoquímica en biopsias musculares antes y después. administración de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA. En una realización, el gen alfa-sarcoglicano se mide en el paciente detectando más de una copia del genoma del vector rAAV por núcleo. En otra realización, la expresión del gen alfa-sarcoglicano se mide en el sujeto detectando el número de genoma del vector por microgramo de ADN genómico.

Métodos para disminuir los niveles de CK en suero en un paciente que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4 también se describen.

Métodos para aumentar las fibras positivas alfa-sarcoglicano en el tejido muscular de un paciente que comprenden administrar al sujeto la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de s Eq ID NO: 4 se describen. En cualquiera de estos métodos, el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano se detecta midiendo el nivel de proteína alfa-sarcoglicano mediante transferencia Western o inmunohistoquímica en biopsias musculares antes y después de la administración del rAAV.

También se describen métodos para aumentar la expresión de alfa-sarcoglicano en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar al sujeto la secuencia de nucleótidos de la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4. En cualquiera de estos métodos, el nivel de alfa-sarcoglicano se detecta midiendo el nivel de proteína alfasarcoglicano mediante transferencia Western o inmunohistoquímica en biopsias musculares antes y después de la administración del rAAV.

También se describen métodos para producir una partícula de vector de AAV recombinante que comprende cultivar una célula huésped que se transfiere con cualquier vector de AAV recombinante descrito en el presente documento y recuperar partículas de AAV recombinantes del sobrenadante de las células transfectadas. También se contemplan partículas virales que comprenden cualquiera de los vectores de AAV recombinantes descritos en el presente documento. En una realización, el método para generar el rAAV comprende transferir un plásmido vector de AAV a una célula huésped. En otra realización, la partícula del vector de AAV recombinante y/o el plásmido del vector de AAV comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 81 %, aproximadamente 82 %, aproximadamente 83 %. %, aproximadamente 84 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 86 %, aproximadamente 87 %, aproximadamente 88 %, o aproximadamente 89 %, más típicamente aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, o aproximadamente 99 % o más idéntico a SEQ ID NO: 8. Se describe una célula huésped que comprende un plásmido vector de AAV que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8. En alguna realización, el plásmido del vector AAV se expresa de forma estable en la célula hospedera. La célula hospedera que alberga de forma estable el plásmido del vector AAV puede utilizarse para generar rAAV. En una realización, el plásmido del vector AAV es un pAAV.tMCK.hSGCA. Plásmido KAN (SEQ ID NO: 8).

También se describen métodos para reducir la fibrosis en un sujeto mamífero que lo necesita. A este respecto, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector de AAV descrito en el presente documento (o una composición que comprende un vector de AAV descrito en el presente documento) al sujeto mamífero. En algunas realizaciones, el sujeto mamífero sufre de distrofia muscular. En una realización, la distrofia muscular es LGMD2D. En algunas realizaciones, la administración de un vector de AAV descrito en el presente documento (o una composición que comprende un vector de AAV descrito en el presente documento) reduce la fibrosis en el tejido muscular del sujeto. En una realización, el tejido muscular comprende psoas mayor, diafragma, tríceps y/o glúteo.

El término "distrofia muscular", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un trastorno donde la fuerza y el volumen muscular disminuyen gradualmente. Los ejemplos no limitantes de enfermedades de distrofia muscular pueden incluir distrofia muscular de Becker, distrofia muscular tibial, distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular facioescapulohumeral, sarcoglicanopatías, distrofia muscular congénita tal como distrofia muscular congénita debida a deficiencia parcial de LAMA2, merosina- distrofia muscular congénita deficiente, distrofia muscular congénita tipo 1D, distrofia muscular congénita de Fukuyama, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 1A, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2A, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2B, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2C, extremidad- distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2D, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2E, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2F, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2G, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2H, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2I, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2I, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2J, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2K, distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo IC, distrofia muscular de columna rígida con epidermólisis ampollosa simple, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular congénita de Ullrich y distrofia muscular escleroatónica de Ullrich distrofia. En algunas realizaciones, el sujeto sufre distrofia muscular de cinturas de extremidades. En algunas realizaciones, el sujeto padece distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2D (LGMD2D).

El término "fibrosis", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la deposición excesiva o no regulada de componentes de la matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) y procesos de reparación anormales en tejidos tras una lesión, incluidos el músculo esquelético, el músculo cardíaco, el hígado, los pulmones, los riñones y el páncreas. Los componentes de la ECM que se depositan incluyen colágeno, por ejemplo, colágeno 1, colágeno 2 o colágeno 3 y fibronectina.

En el presente documento se describe un método para aumentar las fibras positivas alfa-sarcoglicano en un tejido muscular, el tamaño del diámetro de la fibra, la contracción excéntrica en el músculo, la fuerza muscular y/o la expresión de alfa-sarcoglicano en un sujeto mamífero que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector AAV descrito en el presente documento (o composición que comprende un vector de AAV descrito en el presente documento) al sujeto mamífero. También se describe en el presente documento un método para reducir la fibrosis, la nucleación central, el nivel de CK y/o la deposición de colágeno en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector de AAV descrito en el presente documento (o una composición que comprende un vector de AAV descrito en el presente documento) a un sujeto.

El sujeto puede sufrir distrofia muscular tal como distrofia muscular de cinturas de extremidades o cualquier otra distrofia muscular asociada a distrofina. En una realización, la distrofia muscular es LGMD-2D.

También se describe un método para tratar la distrofia muscular en un sujeto mamífero que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector de AAV descrito en el presente documento (o una composición que comprende un vector de AAV descrito en el presente documento) al sujeto mamífero. En algunas realizaciones, la distrofia muscular es distrofia muscular de cinturas de extremidades.

El rAAV puede administrarse mediante inyección intramuscular o inyección intravenosa. Además, el rAAV puede administrarse sistémicamente, tal como administración parental mediante inyección, infusión o implantación.

Las composiciones de la invención están formuladas para inyección intramuscular o inyección intravenosa. Además, las composiciones de la invención se formulan para administración sistémica, tal como administración parental mediante inyección, infusión o implantación.

Además, cualquiera de las composiciones formuladas para administración a un sujeto que padece distrofia muscular (tal como distrofia muscular de cinturas de extremidades o cualquier otra distrofia muscular asociada a distrofina). En algunas realizaciones, la composición puede comprender además un segundo vector de AAV recombinante que expresó alfasarcoglicano o un segundo vector de AAV recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4.

En cualquiera de los usos descritos en el presente documento, el medicamento está formulado para inyección intramuscular o inyección intravenosa. Además, en cualquiera de los usos descritos en el presente documento, el medicamento se formula para administración sistémica, tal como administración parental mediante inyección, infusión o implantación. Además, cualquiera de los medicamentos puede prepararse para su administración a un sujeto que padece distrofia muscular (tal como distrofia muscular de cinturas de extremidades o cualquier otra distrofia muscular asociada a distrofina). En algunas realizaciones, el medicamento puede comprender además un segundo vector de AAV recombinante que expresó alfa-sarcoglicano o un segundo vector de a Av recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4.

AAV

Los genomas de AAV recombinantes descritos en el presente documento comprenden la molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento y una o más ITR de AAV que flanquean una molécula de ácido nucleico. El ADN de AAV en los genomas de rAAV puede ser de cualquier serotipo de AAV para el cual se pueda derivar un virus recombinante, incluidos, entre otros, los serotipos de AAV, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 y AAV rh.74. Se da a conocer la producción de rAAV pseudotipado en, por ejemplo, el documento WO 01/83692. También se contemplan otros tipos de variantes de rAAV, por ejemplo, rAAV con mutaciones de la cápside.

Los plásmidos de ADN descritos en el presente documento comprenden genomas de rAAV. Los plásmidos de ADN se transfieren a células permisibles para la infección con un virus auxiliar de AAV (por ejemplo, adenovirus, adenovirus con deleción de E1 o herpesvirus) para el ensamblaje del genoma de rAAV en partículas virales infecciosas. Las técnicas para producir partículas de rAAV, en las que se proporcionan a una célula un genoma de AAV que va a empaquetarse, genes rep y cap, y funciones de virus auxiliares, son convencionales en la técnica. La producción de rAAV requiere que los siguientes componentes estén presentes dentro de una sola célula (denominada en el presente documento célula de empaquetamiento): un genoma de rAAV, genes rep y cap de AAV separados (es decir, no en) del genoma de rAAV y funciones de virus auxiliares. Los genes rep y cap de AAV pueden ser de cualquier serotipo de AAV para el cual se puede derivar virus recombinante y pueden ser de un serotipo de AAV diferente de las ITR del genoma de rAAV, incluidos, entre otros, los serotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh10 y AAV rh.74. Se da a conocer la producción de rAAV pseudotipado en, por ejemplo, el documento WO 2001/083692.

Un método de generación de una célula de empaquetamiento es crear una línea celular que exprese de manera estable todos los componentes necesarios para la producción de partículas de AAV. Por ejemplo, un plásmido (o múltiples plásmidos) que comprende un genoma de rAAV que carece de genes rep y cap de AAV, genes rep y cap de AAV separados del genoma de rAAV, y un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a neomicina, se integran en el genoma de una célula. Los genomas de AAV se han introducido en plásmidos bacterianos mediante procedimientos como la cola de GC (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), adición de enlazadores sintéticos que contienen sitios de escisión de endonucleasas de restricción (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73) o mediante ligamiento directo de extremos romos (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). La línea celular de empaquetamiento se infecta entonces con un virus auxiliar tal como adenovirus. Las ventajas de este método es que las células son seleccionables y son adecuadas para la producción a gran escala de rAAV. Otros ejemplos de métodos adecuados emplean adenovirus o baculovirus en lugar de plásmidos para introducir genomas de rAAV y/o genes rep y cap en células de empaquetamiento.

Se revisan los principios generales de producción de rAAV en, por ejemplo, Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; y Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. y Immunol., 158:97-129). Se describen diversos enfoques en Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); y Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); Patente U.S. No. 5,173,414; WO 95/13365 y la correspondiente patente U.S. No. 5.658.776 ; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; U.S. Patent. Núm. 5.786.211; patente estadounidense Núm.

5.871.982; y patente estadounidense Núm. 6.258.595.

Se describen células empaquetadoras que producen rAAV infeccioso. En una realización, las células empaquetadoras pueden ser células cancerosas transformadas de manera estable, tales como células HeLa, células 293 y células PerC.6 (una línea 293 afín). En otra realización, las células empaquetadoras son células que no son células cancerosas transformadas, tales como células 293 de bajo paso (células de riñón fetal humano transformadas con E1 de adenovirus), células MRC-5 (fibroblastos fetales humanos), células WI-38 (fibroblastos fetales humanos). fibroblastos), células Vero (células de riñón de mono) y células FRhL-2 (células de pulmón fetal rhesus).

Los AAV recombinantes (es decir, partículas de rAAV encapsidadas infecciosas) comprenden un genoma de rAAV. Las realizaciones incluyen, entre otras, el rAAV denominado pAAV.tMCK.hSCGA que comprende la secuencia de polinucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 3.

El rAAV puede purificarse mediante métodos convencionales en la técnica tales como mediante cromatografía en columna o gradientes de cloruro de cesio. En la técnica se conocen métodos para purificar vectores de rAAV a partir de virus auxiliar e incluyen métodos dados a conocer en, por ejemplo, Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp y Clark, Methods Mol. Med., 69 427-443 (2002); patente estadounidense Núm. 6.566.118 y documento w O 98/09657.

En otra realización, la invención contempla composiciones que comprenden rAAV descrito en el presente documento. Las composiciones descritas en el presente documento comprenden rAAV en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones también pueden comprender otros componentes tales como diluyentes y adyuvantes. Los vehículos, diluyentes y adyuvantes aceptables no son tóxicos para los receptores y son preferiblemente inertes en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; antioxidantes como el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluidos glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, pluronics o polietilenglicol (PEG).

Los títulos de rAAV que se administrarán en los métodos descritos en el presente documento variarán dependiendo, por ejemplo, del rAAV particular, el modo de administración, el objetivo del tratamiento, el individuo y los tipos de células a los que se dirige, y pueden determinarse mediante métodos. norma en el art. Los títulos de rAAV pueden oscilar entre aproximadamente 1* 106, aproximadamente 1 * 107, aproximadamente 1 * 108, aproximadamente 1 * 109, aproximadamente 1 x1010, aproximadamente 1X1011, aproximadamente 1 * 1012, aproximadamente 1 * 1013 y aproximadamente 1 * 1014 o más partículas resistentes a ADNasa (DRP) por ml. Las dosis también se pueden expresar en unidades de genomas virales (vg) medidas por qPCR.

Métodos de transducción de una célula diana con rAAV,in vivo o in vitro,están contemplados. Los métodosin vivocomprenden la etapa de administrar una dosis eficaz, o múltiples dosis eficaces, de una composición que comprende un rAAV descrito en el presente documento a un animal (incluido un ser humano) que lo necesite. Si la dosis se administra antes del desarrollo de un trastorno/enfermedad, la administración es profiláctica. Si la dosis se administra después del desarrollo de un trastorno/enfermedad, la administración es terapéutica. En realizaciones de la invención, una dosis eficaz es una dosis que alivia (elimina o reduce) al menos un síntoma asociado con el trastorno/estado patológico que está tratándose, que ralentiza o previene la progresión a un trastorno/estado patológico, que ralentiza o previene la progresión de un trastorno/estado patológico, que disminuye el grado de la enfermedad, que da como resultado la remisión (parcial o total) de la enfermedad y/o que prolonga la supervivencia. Un ejemplo de una enfermedad contemplada para la prevención o el tratamiento con los métodos descritos en el presente documento es la distrofia muscular, tal como la distrofia muscular de cinturas de extremidades. Por tanto, se describe un método para transducir una célula diana con un rAAV scAAVrh74.tMCK.hSGCA, que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

Se describe un método para generar el rAAV scAAVrh74.tMCK.hSGCA que comprende transferir un plásmido vector de AAV a una célula huésped. Los métodos para transferir un ADN a una célula huésped son bien conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, transfección, infección, transformación, electroporación y transducción. En una realización, el plásmido vector comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, o aproximadamente 89%, más típicamente aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, o aproximadamente 99% o más idéntica a SEQ ID NO: 8. En otra realización, el plásmido vector comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 8. En otra realización, el plásmido vector comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8. Se describe una célula huésped que comprende un plásmido vector AAV que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8. En alguna realización, el plásmido del vector AAV se expresa de forma estable en la célula hospedera. La célula hospedera que alberga de forma estable el plásmido del vector AAV puede utilizarse para generar rAAV. En una realización, el plásmido del vector AAV es un pAAV.tMCK.hSGCA. Plásmido KAN.

En una realización, el plásmido vector comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, o aproximadamente 89%, más típicamente aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, o aproximadamente 99% o más idéntica a SEQ ID NO: 1, 4 u 8.

En una realización, el plásmido vector comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, 4 u 8. En una realización, el plásmido vector comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 4 u 8. El método para generar rAAV, en una realización, comprende además transferir un plásmido empaquetador y/o un virus auxiliar a la célula huésped. En el plásmido empaquetador, en algunas realizaciones, comprende un gen rep y/o cap de AAV que está unido operativamente a un promotor. El promotor, en una realización, es un promotor de transcripción de AAV. En una realización, la célula huésped es una célula empaquetadora. En una realización, la célula empaquetadora comprende un gen cap de AAV integrado de forma estable. En otra realización, la célula empaquetadora comprende un gen rep de AAV integrado de forma estable.

Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a una célula que puede usarse para expresar una secuencia de ADN exógena. Los ejemplos no limitantes de una célula huésped comprenden un microorganismo, una célula de levadura, una célula de insecto y/o una célula de mamífero. La célula huésped puede usarse como receptor para una construcción auxiliar de AAV, un plásmido empaquetador, un plásmido de vector de AAV, un vector de función accesoria u otro ADN. El término como se usa aquí abarca la progenie de la célula original después de expresar la secuencia de ADN exógeno en la célula huésped original. Ejemplos no limitantes de células huésped para la producción de AAV incluyen células de insecto Sf9 y células HEK 293T. El plásmido vector AAV se puede introducir en las células huésped, por ejemplo, Sf9 o 293T, mediante infección (virus o baculovirus), transfección transitoria usando reactivos (por ejemplo, liposomales, fosfato cálcico) o medios físicos (por ejemplo, electroporación) u otros medios. conocer en el arte. En otra realización, las líneas celulares huésped se integran de manera estable con los plásmidos rAAV en sus genomas. Estas líneas celulares estables pueden establecerse incorporando un marcador de selección en el plásmido vector.

La célula huésped puede ser una célula empaquetadora para la producción de partículas virales de AAV. Por lo tanto, se describe una célula huésped que comprende un plásmido vector de AAV que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 8. El plásmido vector AAV puede comprender una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8. La célula huésped puede comprender una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 4 u 8.

La invención también contempla terapias de combinación. La combinación tal como se utiliza en el presente documento incluye tanto tratamientos simultáneos como tratamientos secuenciales. Las combinaciones de métodos descritos en el presente documento con tratamientos médicos estándar(por ejemplo,esteroides, corticosteroides y/o glucocorticoides que incluyen, entre otros, uno o más de prednisona, prednisolona; y deflazacort) se contemplan específicamente, al igual que las combinaciones con terapias novedosas. A este respecto, las combinaciones incluyen administrar a un sujeto uno o más esteroides, corticosteroides y/o glucocorticoides que incluyen, entre otros, uno o más de prednisona, prednisolona; y deflazacort antes de administrar un rAAV de los métodos inventivos al sujeto, simultáneamente con la administración del rAAV al sujeto, o después de administrar el rAAV al sujeto.

En realizaciones relacionadas de una terapia combinada contemplada por la invención, el glucocorticoide incluye, entre otros, beclometasona, betametasona, budesonida, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona o triamcinolona.

Se reconoce que puede producirse una respuesta de células T específica de antígeno en un sujeto al que se le administra el vector rAAV. Esta es una respuesta esperada entre 2 y 4 semanas después de la transferencia genética. Una posible consecuencia de tales respuestas de células T específicas de antígeno es la eliminación de las células transducidas y la pérdida de la expresión del transgén. Para amortiguar la respuesta inmune del huésped a la terapia basada en rAAV, antes de la terapia, por ejemplo, veinticuatro horas antes del procedimiento de terapia, los sujetos pueden comenzar con aproximadamente 1 mg/kg/día de prednisona profiláctica o un glucocorticoide comparable por vía oral con un máximo. dosis de 60 mg/día. Si fuera necesario, también se permitiría la administración intravenosa de un glucocorticoide comparable a una dosis aproximada de 1 mg/kg/día. El tratamiento continuará durante aproximadamente un mes. Se puede implementar un protocolo de reducción gradual de prednisona o glucocorticoides comparables en función de la respuesta inmune de los sujetos individuales a la transferencia genética, evaluada mediante el ensayo ELISpot y también mediante la monitorización de la función hepática con GGT.

Una cantidad terapéuticamente eficaz del vector rAAV es una dosis de rAAV comprendida entre aproximadamente 1,0 * 1012 vg/kg a aproximadamente 2,0 * 1015 vg/kg, aproximadamente 5 * 1012 vg/kg a aproximadamente 1,0 * 1015 vg/kg, aproximadamente 1,0 * 1013 vg/kg a aproximadamente 5,0 * 1014 vg/kg, aproximadamente 5* 1013 vg/kg a aproximadamente 2*1014 vg/kg, o aproximadamente 2,0 * 1013 vg/kg a aproximadamente 3,0 * 1014 vg/kg. En otra realización, la dosis es aproximadamente 5,0 x 1013 vg/kg, aproximadamente 1,0 * 1014 vg/kg, o aproximadamente 2,0 * 1014 vg/kg. En otra realización, la dosis es 5,0 * 1013 vg/kg, 1,0 * 1014 vg/kg, o 2,0 * 1014 vg/kg.

Las dosis pueden expresarse también en unidades de genomas virales (vg). Los títulos de rAAV pueden determinarse mediante el patrón de cuantificación de plásmido o ADN superenrollado o el patrón de cuantificación de plásmido o ADN linealizado. El título o la dosis de los vectores AAV pueden variar según las formas físicas del plásmido o del ADN como patrón de cuantificación. Por ejemplo, el valor del título o la dosis puede variar según un método de titulación de qPCR estándar superenrollado o un método de titulación de qPCR estándar lineal. En una realización, la dosis en esta divulgación se basa en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación. En otra realización, la dosificación en esta divulgación se basa en un ADN o plásmido linealizado como patrón de cuantificación. Por lo tanto, la cantidad terapéuticamente eficaz del vector rAAV puede ser una dosis de rAAV comprendida entre aproximadamente 1,0 * 1012 vg/kg a aproximadamente 2,0 * 1015 vg/kg, aproximadamente 5 * 1012 vg/kg a aproximadamente 1,0 * 1015 vg/kg, aproximadamente 1,0 * 1013 vg/kg a aproximadamente 5,0 * 1014 vg/kg, aproximadamente 5* 1013 vg/kg a aproximadamente 2*1014 vg/kg, o aproximadamente 2,0 * 1013 vg/kg a aproximadamente 3,0 * 1014 vg/kg basándose en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación. En otra realización, la dosis es aproximadamente 5,0 x 1013 vg/kg, aproximadamente 1,0 * 1014 vg/kg, o aproximadamente 2,0 * 1014 vg/kg basado en un ADN superenrollado o un plásmido como patrón de cuantificación. En otra realización, la dosis es 5,0 * 1013 vg/kg, 1,0 * 1014 vg/kg, o 2,0 * 1014 vg/kg basado en un ADN superenrollado o un plásmido como patrón de cuantificación.

En otra realización, la cantidad terapéuticamente eficaz del vector rAAV es una dosis de rAAV que oscila entre aproximadamente 1,0 x 1013 vg/kg a aproximadamente 8,0 * 1013 vg/kg, aproximadamente 1,5 * 1013vg/kg a aproximadamente 8,0 * 1013 vg/kg, aproximadamente 1,6 * 1013vg/kg a aproximadamente 8,0 * 1013 vg/kg. aproximadamente 1,8 * 1013vg/kg a aproximadamente 8,0 * 1013 vg/kg, aproximadamente 1,2 * 1013vg/kg a aproximadamente 7,5 * 1013 vg/kg, aproximadamente 1,9 * 1013vg/kg a aproximadamente 7,5 * 1013 vg/kg, aproximadamente 1,4 * 1013vg/kg a aproximadamente 7,4 * 1013 vg/kg, aproximadamente 1,9 * 1013vg/kg a aproximadamente 7,5 * 1013 vg/kg, o aproximadamente 1,8 * 1013vg/kg a aproximadamente 8,0 * 1013 vg/kg basado en un ADN linealizado o un plásmido como patrón de cuantificación. Por ejemplo, la cantidad terapéuticamente eficaz del vector rAAV es una dosis de aproximadamente 1,85 * 1013 vg/kg o 7,41 * 1013 vg/kg basada en un ADN o plásmido linealizado como patrón de cuantificación.

En una realización, la dosis de 5,0 x 1013 vg/kg basado en un ADN superenrollado o un plásmido como patrón de cuantificación es equivalente a la dosis de 1,85 * 1013 vg/kg basado en un ADN linealizado o un plásmido como patrón de cuantificación. En otra realización, la dosis de 2,0 x 1014 vg/kg basado en un ADN o plásmido superenrollado equivale a 7,41 * 1013 vg/kg basado en un ADN linealizado o un plásmido como patrón de cuantificación. Por lo tanto, en otra realización, aproximadamente 1,85 * 1013 vg/kg o 7,41 * 1013 vg/kg basado en un ADN linealizado o un plásmido como patrón de cuantificación.

La administración de una dosis eficaz de las composiciones puede realizarse por vías convencionales en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, intramuscular, parenteral, intravenosa, oral, bucal, nasal, pulmonar, intracraneal, intraósea, intraocular, rectal o vaginal. Los expertos en la técnica pueden elegir y/o combinar las rutas de administración y los serotipos de los componentes de AAV del rAAV (en particular, las ITR de AAV y la proteína de la cápside) descritos en el presente documento teniendo en cuenta la infección y/o o estado de enfermedad que se está tratando y las células/tejido(s) diana que van a expresar el a-sarcoglicano.

La invención proporciona la administración local y la administración sistémica de una dosis eficaz de rAAV y composiciones de la invención. Por ejemplo, la administración sistémica es la administración en el sistema circulatorio de manera que se ve afectado todo el cuerpo. La administración sistémica incluye administración enteral tal como absorción a través del tracto gastrointestinal y administración parental mediante inyección, infusión o implantación.

En particular, la administración real de rAAV descrita en el presente documento se puede lograr utilizando cualquier método físico que transporte el vector recombinante de rAAV al tejido diana de un animal. La administración según la invención incluye, pero no se limita a, inyección en el músculo, el torrente sanguíneo y/o directamente en el hígado. Se ha demostrado que simplemente resuspender un rAAV en solución salina tamponada con fosfato es suficiente para proporcionar un vehículo útil para la expresión del tejido muscular, y no se conocen restricciones sobre los vehículos u otros componentes que pueden coadministrarse con el rAAV (aunque las composiciones que degradan El ADN debe evitarse de la forma habitual con rAAV). Las proteínas de la cápsida de un rAAV pueden modificarse de modo que el rAAV se dirija a un tejido diana particular de interés, tal como el músculo. Véase, por ejemplo, el documento WO 02/053703.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar como formulaciones inyectables o como formulaciones tópicas para suministrarse a los músculos mediante transporte transdérmico. Se han desarrollado previamente numerosas formulaciones tanto para inyección intramuscular como para transporte transdérmico y pueden usarse en la práctica de la invención. El rAAV se puede utilizar con cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable para facilitar la administración y manipulación. Así, en otro aspecto, la solicitud se dirige a una formulación que comprende un rAAV que comprende una cápside derivada de AAVrh74, un agente tampón, un agente de fuerza iónica y un tensioactivo. En una realización, el rAAV se encuentra en una concentración de aproximadamente 1,0 x 1012 vg/kg a aproximadamente 5,0 x 1014 vg/kg. En otra realización, el rAAV está a una concentración de aproximadamente 5,0 x 1012 vg/kg a aproximadamente 1,0 x 1014 vg/kg. En otra realización, el rAAV se encuentra en una concentración de aproximadamente 5x1013 vg/kg, aproximadamente 1x1014 vg/kg, y/o aproximadamente 2x1014 vg/kg. En una realización, la dosis se basa en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación. En una realización, el rAAV es un vector scAAVrh74 tMCK.hSGCA. En una realización, el agente tampón comprende uno o más de tris, tricina, bis-tricina, HEPES, MOPS, TES, TAPS, PIPES y CAPS. En otra realización, el agente tampón comprende tris con pH 8,0 a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 40 mM. En una realización, el agente tampón comprende tris con pH 8,0 a aproximadamente 20 mM. En una realización, el agente de fuerza iónica comprende uno o más de cloruro de potasio (KCI), acetato de potasio, sulfato de potasio, sulfato de amonio, cloruro de amonio (NH4Cl), acetato de amonio, cloruro de magnesio (MgCh), acetato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de manganeso (MnCh), acetato de manganeso, sulfato de manganeso, cloruro de sodio (NaCl), acetato de sodio, cloruro de litio (LiCI) y acetato de litio. En una realización, el agente de fuerza iónica comprende MgCh a una concentración de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 4 mM. En otra realización, el agente de fuerza iónica comprende NaCl en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 500 mM. En otra realización, el agente de fuerza iónica comprende MgCh a una concentración de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 4 mM y NaCl a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 500 mM. En otra realización, el agente de fuerza iónica comprende MgCh a una concentración de aproximadamente 1 mM y NaCl a una concentración de aproximadamente 200 mM. En una realización, el tensioactivo comprende uno o más de un sulfonato, un sulfato, un fosfonato, un fosfato, un poloxámero y un tensioactivo catiónico. En una realización, el poloxámero comprende uno o más de poloxámero 124, poloxámero 181, poloxámero 184, poloxámero 188, poloxámero 237, poloxámero 331, poloxámero 338 y poloxámero 407. En una realización, el tensioactivo comprende el poloxámero en una concentración de aproximadamente 0,00001 % a aproximadamente 1 %. En otra realización, el tensioactivo comprende Poloxámero 188 en una concentración de aproximadamente 0,001%. Para fines de inyección intramuscular, se pueden emplear soluciones en un adyuvante tal como aceite de sésamo o de maní o en propilenglicol acuoso, así como soluciones acuosas estériles. Tales soluciones acuosas pueden tamponarse, si se desea, y hacer primero que el diluyente líquido sea isotónico con solución salina o glucosa. Se pueden preparar soluciones de rAAV como ácido libre (el ADN contiene grupos fosfato ácidos) o una sal farmacológicamente aceptable en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. También se puede preparar una dispersión de rAAV en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos. En este sentido, todos los medios acuosos estériles empleados se pueden obtener fácilmente mediante técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que sea fácil de inyectar. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir mediante el uso de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando rAAV en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el ingrediente activo esterilizado en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y la técnica de liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de la solución del mismo previamente filtrada de forma estéril.

La transducción con rAAV también puede realizarsein vitro.En una realización, las células musculares diana deseadas se eliminan del sujeto, se transducen con rAAV y se reintroducen en el sujeto. Alternativamente, se pueden usar células musculares singénicas o xenogénicas cuando esas células no generen una respuesta inmune inapropiada en el sujeto.

En la técnica se conocen métodos adecuados para la transducción y reintroducción de células transducidas en un sujeto. En una realización, las células pueden transducirsein vitromediante la combinación de rAAV con células musculares, por ejemplo, en medios apropiados, y el cribado de aquellas células que albergan el ADN de interés mediante técnicas convencionales como transferencia Southern y/o PCR, o mediante el uso de marcadores seleccionables. Las células transducidas pueden entonces formularse en composiciones farmacéuticas y la composición introducirse en el sujeto mediante diversas técnicas, tales como inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea e intraperitoneal, o mediante inyección en el músculo liso y cardíaco, usando, por ejemplo, un catéter.

La transducción de células con rAAV descrita en el presente documento da como resultado la expresión sostenida de asarcoglicano. Se describen métodos de administración/suministro de rAAV que expresan alfa-sarcoglicano a un sujeto mamífero, preferiblemente un ser humano. Estos métodos incluyen la transducción de tejidos (incluidos, entre otros, tejidos como músculos, órganos como hígado y cerebro, y glándulas como glándulas salivales) con uno o más rAAV descritos en el presente documento. La transducción se puede llevar a cabo con casetes de genes que comprenden elementos de control específicos de tejido. Por ejemplo, se describen métodos de transducción de células musculares y tejidos musculares dirigidos por elementos de control específicos del músculo, incluidos, entre otros, los derivados de las familias de genes de actina y miosina, tales como de la familia de genes myoD [Ver Weintraub et al., Science, 251: 761 766 (1991)], el factor de unión potenciador específico de miocitos MEF-2 [Cserjesi y Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)], elementos de control derivados del gen de actina esquelética humana [Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], el gen de actina cardíaca, elementos de la secuencia de creatina quinasa muscular [véase Johnson et al., Mol Cell Biol, 9:3393-3399 (1989)] y el elemento potenciador de creatina quinasa murina (mCK), control elementos derivados del gen esquelético de la troponina C de contracción rápida, el gen de la troponina C cardíaca de contracción lenta y el gen de la troponina I de contracción lenta: factores nucleares inducibles por hipoxia (Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)), elementos y promotores inducibles por esteroides, incluido el elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE) (véase Mader y White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)), y otros elementos de control.

El tejido muscular es un objetivo atractivo para el suministroin vivode ADN, porque no es un órgano vital y es de fácil acceso. La invención contempla la expresión sostenida de miARN a partir de miofibras transducidas.

Por "célula muscular" o "tejido muscular" se entiende una célula o grupo de células derivadas de músculo de cualquier tipo (por ejemplo, músculo esquelético y músculo liso, por ejemplo, del tracto digestivo, vejiga urinaria, vasos sanguíneos o tejido cardíaco). Dichas células musculares pueden estar diferenciadas o indiferenciadas, tales como mioblastos, miocitos, miotubos, cardiomiocitos y cardiomioblastos.

El término "transducción" se utiliza para referirse a la administración/suministro de un polinucleótido de interés (por ejemplo, una secuencia polinucleotídica que codifica a-sarcoglicano) a una célula receptora, ya seain vivooin vitro,a través de un rAAV de replicación deficiente descrito que resulta en la expresión de alfa-sarcoglicano por la célula receptora.

Por lo tanto, también se describen en el presente documento métodos para administrar una dosis eficaz (o dosis, administradas esencialmente simultáneamente o dosis administradas a intervalos) de rAAV que codifica alfa-sarcoglicano a un sujeto mamífero que lo necesita.

En caso de conflicto, prevalecerá la presente solicitud, incluidas las definiciones contenidas en el presente documento. Los rangos numéricos descritos incluyen cada valor entero dentro de cada rango e incluyen los números enteros más bajo y más alto indicados. La invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

EJEMPLOS

Los estudios preclínicos que utilizan AAVrh74.tMCK.hSCGA se describen en la publicación de patente internacional No. WO 2013/078316 y las patentes estadounidenses No.9.434.928 y 10.105.453.

Ejemplo 1

Materiales y métodos

Modelos animales

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Instituto de Investigación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Nationwide Children's Hospital. Los ratones nocaut (sgca-/-) fueron criados y mantenidos como animales homocigotos en condiciones estandarizadas en el Animal Resources Core del Instituto de Investigación del Nationwide Children's Hospital. Los ratones se mantuvieron con Teklad Global Rodent Diet (3,8 % de fibra, 18,8 % de proteína, 5 % de alimento graso) con un ciclo de oscuridad:luz de 12:12 horas. Todos los animales se alojaron en jaulas estándar para ratones con comida y agua ad libitum.

Genotipado

Se utilizó el genotipo de ADN para identificar ratones sgca-/-. El ADN de los recortes de la cola se aisló y se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando ADN polimerasa OneTaq (New England Biolabs, Ipswich, MA). Se utilizó una serie de cebadores en el análisis de PCR para determinar el estado de nocaut de a-SG. Se utilizaron los siguientes cebadores y condiciones: Intrón1 (CAGGGCTGGGAGCTGGGTTCTG; SEQ ID NO: 9); cebador-intrón mutante 3 (CCCAGGGCCTTGATGCCT; SEQ ID NO: 10); y NEOTR (GCTATCAGGACATAGCGTTGGCTA; SEQ ID NO: 11). Las reacciones se llevaron a cabo sobre ADN genómico durante 30 ciclos en las siguientes condiciones: 94°C, 5 min; 94°C, 1 min; 64°C, 1 min; 72°C, 2,5 min; y 72°C, 7 min.

Construcción del gen a-SG

El casete transgén scAAVrh74.tMCK.hSGCA se preparó utilizando un plásmido de ADN vector de virus adenoasociado (AAV) pAAV.tMCK.aSG-neo, insertando el casete de expresión de tMCK que impulsa una secuencia de ADNca-SG humano con codones optimizados(ADNc humano, número de acceso a Genbank U08895) en el esqueleto del vector autocomplementario pHpa7. Las únicas secuencias virales incluidas en este vector son las repeticiones terminales invertidas de AAV2, que son necesarias tanto para la replicación del ADN viral como para el empaquetado del genoma del vector rAAV. Una de las repeticiones terminales invertidas (ITR) tiene una eliminación específica del sitio de resolución terminal (TRS) para restringir la replicación de este ITR, lo que facilita la generación de la forma replicativa dimérica para el empaquetado de vectores autocomplementarios. Se ha demostrado que el virus AAVrh74 en ratones, primates no humanos (NHP, por sus siglas en inglés) y humanos es seguro y altamente eficiente en la transducción de músculo a través de la barrera vascular.

Producción de vectores

El AAV recombinante, (sc)rAAVrh74.tMCK.hSGCA, se obtuvo mediante transfección triple. Se utilizó un método de titulación basado en qPCR para determinar un título de vg encapsulado utilizando un sistema detector Prism 7500 Fast Taqman (PE Applied Biosystems). La construcción comprende un intrón quimérico para promover la expresión de alto nivel. El intrón quimérico está compuesto por el sitio donante 5' del primer intrón del gen de la p-globina humana y el punto de ramificación y el sitio aceptor de empalme 3' del intrón que se encuentra entre el líder y el cuerpo de una región variable de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina. . El rAAV también comprende una señal de poliadenilación sintética de SV40 que se utiliza para la terminación eficaz de la transcripción. A continuación, en la Figura 1, se muestra un esquema del casete de expresión. El vector se produjo utilizando el gen humano alfa-sacroglicano (a-SG) flanqueado por secuencias ITR de AAV2 y encapsidado en viriones AAVrh74. La construcción contiene el promotor/potenciador temprano inmediato de tMCK (No. de acceso de GenBank M21390) y utiliza el intrón de p-globina para una expresión de alto nivel.

Suministro de genes

El suministro sistémico en ratones se logró mediante la inyección de un vector en la vena de la cola de ratones sgca-/-. A los ratones se les inyectó una dosis total 1x1012 vg, 3*1012 vg, o 6*1012 vg (ratones que oscilan entre 13 y 20 g; 5*1013 vg/kg, 1*1014 vg/kg y 2*1014 vg/kg (las dosis basadas en un ADN superenrollado o un plásmido como patrón de cuantificación-respectivamente, basadas en un ratón de 20 g) de scAAVrh74.tMCK.hSGCA diluido en solución de Ringer lactato en un volumen de 200-250 pl usando una jeringa de insulina de calibre ultrafino de 30. Todos los ratones tratados fueron inyectados a las 4-5 semanas de edad y sacrificados 12 semanas después de la inyección. En otra realización, la dosis es de aproximadamente 1,85 x 1013 vg/kg o 7,41 x 1013 vg/kg basándose en un ADN o plásmido linealizado como patrón de cuantificación.

Medición de creatina quinasa sérica

Los niveles de creatina quinasa se midieron en los sueros de ratones C57BL/6 de tipo silvestre (n = 6), ratones sgca-/-tratados con vehículo (solución de Ringers lactato) (n = 6), y ratones sgca-/- tratados con scAAVrh74.tMCK.hSGCA (n = 6 por dosis) utilizando el ensayo Creatine Kinase SL y el protocolo correspondiente del fabricante (Sekisui Diagnostics; Charlottetown, PE, Canadá) (catálogo n.° 326-10). Brevemente, se mezclaron 25 gl de suero con 1 ml de los reactivos de trabajo y se agregaron a una cubeta. Se configuró un ensayo cinético en el espectrofotómetro para medir la absorbancia a 340 nm cada 30 segundos durante 180 segundos. Los niveles de creatina quinasa se calcularon utilizando las lecturas de absorbancia y la ecuación que se enumera a continuación:

U/L= [AAbs./min) * 1.025 * 1000] / [1 * 6.22 * 0.025] = (AAbs./min) * 6592.

Contracción tetánica del diafragma para evaluación funcional.

Se sacrificaron los ratones y se diseccionó el diafragma (DIA) con las uniones de las costillas y el tendón central intactos, y se colocó en tampón K-H. Se aisló una sección de DIA de 2-4 mm de ancho. Las tiras DlA se ataron firmemente con seda quirúrgica trenzada (6/0; Surgical Specialties, Reading, PA) en el tendón central y se suturaron a través de una porción de costilla fijada al extremo distal de la tira. Cada músculo se transfirió a un baño de agua lleno de solución de K-H oxigenada que se mantuvo a 37°C. Los músculos se alinearon horizontalmente y se ataron directamente entre un pasador fijo y un transductor de fuerza-servomotor de modo dual (305C; Aurora Scientific, Aurora, Ontario, Canadá). Se colocaron dos electrodos de placa de platino en el baño de órganos para flanquear la longitud del músculo. El músculo se estiró hasta alcanzar la longitud óptima para medir las contracciones y luego se dejó descansar durante 10 minutos antes de iniciar el protocolo tetánico. Una vez que el músculo se estabilizó, se ajustó a una longitud óptima de 1 g y se sometió a un calentamiento, que consistió en tres contracciones de 1 Hz cada 30 segundos seguidas de tres contracciones de 150 Hz cada minuto. Después de un período de descanso de 3 minutos, el DlA se estimuló a 20, 50, 80, 120, 150, 180 Hz, permitiendo un período de descanso de 2 minutos entre cada estímulo, cada uno con una duración de 250 ms para determinar la fuerza tetánica máxima. Se midieron la longitud y el peso del músculo. La fuerza se normalizó según el peso y la longitud del músculo.

Contracción tetánica del tibial anterior (TA) para evaluación funcional

El procedimiento de evaluación de TA siguió el protocolo enumerado en Hakim et al., Methods Mol Biol; 709:75-89 (2011). Los ratones se anestesiaron a través de la cavidad intraperitoneal utilizando una mezcla de ketamina/xilazina (100 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente). Bajo un microscopio de disección, se eliminó la piel de las extremidades posteriores para exponer el músculo TA y la rótula. Se ató un cuadrado doble alrededor del tendón rotuliano con una sutura 4-0. Luego se diseccionó el tendón distal del TA y se ató un nudo cuadrado doble alrededor del tendón con sutura 4-0 lo más cerca posible del músculo y luego se cortó el tendón. El músculo expuesto se humedeció constantemente con solución salina. Luego se transfirieron los ratones a una plataforma térmica controlada y se mantuvieron a 37°C. La rodilla se aseguró al pasador de metal con la sutura del tendón rotuliano y la sutura del tendón TA distal al brazo nivelador del transductor de fuerza (Aurora Scientific, Aurora, Canadá). Se colocó un electrodo cerca del nervio ciático para estimularlo. Una vez que el músculo se estabilizó, la tensión en reposo se ajustó a una longitud (longitud óptima) donde las contracciones eran máximas. Después de un período de descanso de 3 minutos, el TA fue estimulado a 50, 100, 150 y 200 Hz, permitiendo un descanso de 1 minuto entre cada estímulo. Después de un descanso de 5 minutos, los músculos fueron sometidos a una serie de 10 contracciones isométricas, ocurriendo a intervalos de 1 minuto con un procedimiento de estiramiento y alargamiento del 10%. Después de las contracciones excéntricas, se sacrificó a los ratones y se diseccionó y congeló el músculo TA para histología.

Inmunofluorescencia

Criosecciones (de 12 gm de espesor) de los músculos TA, gastrocnemio (GAS), cuádriceps (QD), psoas mayor (PSOAS), glúteo (GLUT), tríceps (TRI), DlA y corazón (HRT) se sometieron a tinción por inmunofluorescencia para el transgén hSGCA. Las secciones se incubaron con un anticuerpo primario monoclonal de conejo a-SG (Abcam; Cambridge, Reino Unido; número de catálogo ab189254) a una dilución de 1:100. Se tomaron cuatro imágenes aleatorias de 20x que cubren los cuatro cuadrantes diferentes de la sección muscular utilizando una cámara AxioCam MRC5 de Zeiss (Alemania). El porcentaje de fibras positivas para la tinción con a-SG en comparación con los controles se determinó para cada imagen y se promedió para cada músculo. La expresión positiva de la fibra a-SG se definió como tener al menos un 30% de la tinción de la fibra más brillante que los controles sgca-/- tratados con vehículo.

Análisis de transferencia Western

Para cada transferencia Western se utilizaron muestras de ratones C57BL/6 de tipo silvestre, ratones sgca-/- tratados con vehículo y ratones sgca-/- dosificados con vector. Se utilizaron una dilución 1:10.000 de un anticuerpo monoclonal de conejo a-SG (Abeam, número de catálogo ab189254) y una dilución 1:5.000 de un anticuerpo monoclonal de ratón aactinina (Sigma-Aldrich, número de catálogo A7811) para las transferencias de hSGCA. También se utilizó una dilución 1:1.000 de un anticuerpo monoclonal de vinculina de ratón de conejo (Invitrogen, n° de catálogo 70062). Se utilizaron anticuerpos secundarios de peroxidasa de rábano picante antiratón (Millipore, Núm. de catálogo AP308P) y anti-conejo (Life Technologies, Núm. de catálogo 656120) para mejorar la inmunodetección por quimioluminiscencia. La cuantificación por transferencia Western se realizó mediante densitometría utilizando ImageQuantTL 1D 8.1.0 (GE Healthcare Life Sciences).

Análisis morfométrico

La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) se realizó en criosecciones de músculo de 12 pm de espesor de ratones C57BL/6 de tipo silvestre de 16 a 17 semanas de edad (n = 6), ratones sgca-/- tratados con vehículo (n = 6 ), y ratones sgca-/- tratados con scAAVrh74.tMCK.hSGCA de 16-17 semanas de edad (n=6 por dosis) para su análisis. Se determinó el porcentaje de miofibras con núcleo central en los músculos TA, GAS, QD, GLUT, PSOAS y TRI. Además, se midieron los diámetros de las fibras musculares en los músculos TA, GAS, QD, TRI y PSOAS. Se tomaron cuatro imágenes aleatorias de 20x por músculo por animal con una cámara Zeiss AxioCam MRC5. Las fibras con núcleo central se cuantificaron utilizando el software de imágenes de los Institutos Nacionales de Salud y los diámetros de las fibras se midieron utilizando el software Zeiss Axiovision LE4.

Análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de biodistribución.

Se realizó una PCR cuantitativa Taqman para cuantificar el número de copias del genoma del vector presentes en el músculo contralateral objetivo y no objetivo, así como en órganos no objetivo como se describió anteriormente. Se usó un conjunto de sondas cebadoras específicas de vector para amplificar una secuencia de la región intrónica directamente aguas abajo del promotor tMCK que es única y está ubicada dentro del casete del transgén scAAVrh.74.tMCK.hSGCA. En este estudio se utilizaron los siguientes cebadores y sondas: Cebador directo del intrón tMCK 5'-ACC CGA GAT GCC TGG TTA TAA TT-3'; Cebador inverso del intrón tMCK 5'-TCC ATG GTG TAC AGA GCC TAA GAC-3'; y la sonda intrón tMCK 5'-FAM-CTG CTG CCT GAG CCT GAG CGG TTA C-IABkFQ-3' (Integrated DNA Technologies). El número de copias se informó como genomas vectoriales por microgramo de ADN genómico.

Tinción roja de Picrosirius y cuantificación de colágeno.

Se realizó tinción con rojo Picrosirius para determinar los niveles de depósito de colágeno en el tejido muscular. La tinción se realizó en criosecciones de 12 pm de músculos C57BL/6 de 16-17 semanas de edad de tipo silvestre (n=6), sgca-/-tratados con vehículo (n=6) y sgca-/- tratados con scAAVrh74.tMCK.hSGCA de 16-17 semanas de edad (n=6 por dosis) GLUT, PSOAS, TRI y DIA. Se tomaron cuatro imágenes de 20x por músculo por ratón y se determinó la cantidad de deposición de colágeno con el programa de software de imágenes. Se calculó el porcentaje medio de colágeno para cada músculo para todos los grupos.

Monitoreo láser de la actividad de jaulas en campo abierto.

Se utilizó una cámara de actividad de campo abierto para determinar la actividad general de los ratones experimentales. Se sometieron a análisis ratones de 16-17 semanas de edad de los grupos de control C57BL/6 de tipo silvestre (n=6) y sgca_/' (n=6) no tratados, junto con ratones sgca_/' tratados con scAAVrh74.tMCK.hSGCA de 16-17 semanas de edad (n=6 por dosis). Todos los ratones fueron evaluados a la misma hora del día, temprano en la mañana, cerca del final del ciclo nocturno, cuando los ratones están más activos. Todos los ratones fueron evaluados en una habitación aislada, bajo luz tenue y con el mismo manipulador cada vez. Además, para reducir la ansiedad y mantener al mínimo las variables de comportamiento que podrían afectar la actividad normal de los ratones y, en consecuencia, los resultados del ensayo, probamos ratones que no estaban alojados individualmente. La actividad del ratón se controló utilizando el sistema de actividad Photobeam (San Diego Instruments, San Diego, CA). Este sistema utiliza una rejilla de haces de luz infrarroja invisibles que atraviesan la cámara del animal de adelante hacia atrás y de izquierda a derecha para monitorear la posición y el movimiento del ratón dentro de un plano x-y-z. La actividad se registró durante ciclos de 1 hora a intervalos de 5 minutos. Los ratones se aclimataron a la sala de pruebas de actividad durante una sesión inicial de 1 hora varios días antes de comenzar la adquisición de datos. Los ratones fueron probados en cámaras individuales en grupos de cuatro. El equipo de prueba se limpió entre cada uso para reducir las variables de comportamiento reaccionarias del ratón que podrían alterar los resultados. Los datos se convirtieron a una hoja de cálculo de Microsoft Excel y todos los cálculos se realizaron dentro del programa Excel. Se sumaron las roturas de haz individuales para el movimiento en los planos x e y para cada ratón para representar la deambulación total, y las roturas de haz en el plano z se sumaron para obtener actividad vertical dentro del intervalo de tiempo de 1 hora.

Estudios de seguridad

Hematología

Se recuperó sangre completa de una punción cardíaca para realizar análisis químicos sanguíneos. La sangre se recogió en un tubo separador de suero y se centrifugó durante 10 minutos a 15.000 rpm. El suero se recogió, se congeló y se envió a Charles River Laboratories para realizar pruebas químicas. En el análisis hematológico se priorizaron las enzimas hepáticas y la química de la glucosa.

Histopatología

En la necropsia, los músculos estaban frescos congelados en metilbutano líquido enfriado con nitrógeno; todos los demás órganos se extrajeron y se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina. Después del procesamiento, los tejidos se tiñeron con H&E y los portaobjetos y todos los tejidos se enviaron a GEMPath, Inc, para su revisión formal por parte de un patólogo veterinario.

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como la media ± SEM (barras de error) y se analizaron mediante un ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples entre grupos evaluados mediante la prueba de análisis post-hoc de Tukey utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA) a menos que se especifique lo contrario.

Ejemplo 2

Eficiencia del suministro sistémico de scAAVrh74.tMCK.hSGCA

Se inició un pequeño estudio piloto para observar la eficacia del suministro de genes mediante inyección intravenosa en la vena lateral de la cola de ratonessgca-/-a una dosis de 1*1012 vg dosis total (5*1013 vg/kg basado en un ratón de 20 g, n=4). El análisis de inmunofluorescencia se realizó en músculos recolectados 4 semanas después de la transferencia genética. La cantidad de expresión del transgén hSGCA en siete músculos esqueléticos de extremidades diferentes: TA, GAS, GLUT, QD, PSOAS y TRI y DIA. Los ratones con deficiencia de a-SG mostraron una ausencia completa de la proteína cuando se analizaron mediante inmunofluorescencia (Fig.2A;imágenes representativas de TA, GAS, TRI y DIA). La dosis terapéutica de dosis total de 1*1012 vg dio como resultado una transducción de vector media de 54 ± 23,81 % en todos los músculos esqueléticos, incluido el DIA, 4 semanas después del suministro del gen.

Estudio de aumento de dosis de scAAVrh74.tMCK.hSGCA suministrado sistémicamente a ratones sgca-/-

Para determinar la dosis más segura y eficaz, se estudió el suministro de tres dosis distintas de vector en un estudio de escalado de dosis, donde la vena lateral de la cola de ratones sgca^ de 4 semanas de edad se trató con una dosis total de 1*1012 vg (5*1013 vg/kg), una dosis total de 3*1012 vg (1*1014 vg/kg) o una dosis total de 6*1012 vg (2*1014 vg/kg) de scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Los ratones fueron sacrificados 12 semanas después del suministro del gen para evaluar la expresión del transgén hSGCA en los músculos TA, GAS, QD, Gl Ut, PSOAS, TRI, DIA y HRT mediante inmunofluorescencia. Expresión media de hSGCA en ratones tratados con la dosis más baja de 1x1012 vg dosis total (5*1013 vg/kg) fue de 70,07± 3,71 % de expresión general en los músculos esqueléticos, incluido el DIA. La expresión media de hSGCA en ratones tratados con la dosis intermedia de 3x1012 vg dosis total (1*1014 vg/kg) fue de 85,35 ± 2,36 % en todos los músculos esqueléticos. La expresión media de hSGCA en ratones tratados con la dosis más alta de 6x1012 vg dosis total (2*1014 vg/kg) fue 93,86±2,02% en todos los músculos esqueléticos. Para mayor claridad, las dosis se calcularon basándose en un ADN superenrollado o un plásmido como patrón de cuantificación. La expresión de hSGCA en el músculo HRT se mantuvo en un 75% independientemente de la dosis. Las imágenes representativas de los tejidos se muestran en laFig. 2A.La sólida expresión de hSGCA muestra la eficacia del suministro de genes en las tres dosis. El suministro del gen se dirigió a múltiples músculos de las extremidades anteriores y traseras, mostrando una expresión excepcional de a-SG en los ratones con las tres dosis. Lo más importante es que el músculo vital del diafragma también mostró la expresión del gen a-SG después del suministro. Las transferencias Western se muestran en laFig.2Bconfirmar la expresión de proteínas en todos los músculos de las tres cohortes de dosificación de los ratones tratados. El músculo cardíaco de ratones también mostró expresión de a-SG después del tratamiento.

Las características histopatológicas tanto de humanos como de ratones desprovistos de proteína a-SG incluyen nucleación central, irregularidades en la distribución del tamaño de las fibras, necrosis y fibrosis. Se utilizó tinción H&E para visualizar la morfología muscular, incluido el tamaño de las fibras y la nucleación central (Fig. 3). Como se muestra en laFig. 3Ay3B, se observó una normalización de la distribución del tamaño de las fibras, similar a la observada en los controles de tipo silvestre, en el TA, QD y TRI de los ratones sgca^ tratados con scAAVrh74.tMCK.hSGCA en comparación con los controles sgca^ tratados con vehículo. El tamaño del diámetro promedio de las fibras aumentó significativamente en todas las dosis en los músculos TA, QD y TRI en comparación con ratones controlsgca-l-tratado con vehículo-(Tabla 1).

TABLA 1

Diámetro de fibra (pm)

Sin tratar Dosis

*=p<0,05, ****=p<0,0. Abreviatura: TA, tibial anterior, AD: cuádriceps; y TRI, tríceps. Dosis

más baja: 1,0*1012 vg; dosis intermedia: 3,0*1012 vg; dosis más alta: 6,0* 1012 vg.

En ratonessgca-/-tratados con scAAVrh74.tMCK.hSGCA, también se observó una reducción en la nucleación central. Los músculos esqueléticos de ratonessgca--tratados con vehículo tenían 68,72 ± 3,01% de fibras con núcleos ubicados centralmente. Después del tratamiento con scAAVrh74.tMCK.hSGCA, el valor general de la nucleación central en todos los tejidos musculares se redujo con la dosis más baja de scAAVrh74.tMCK.hSGCA, lo que resultó en que el 55,60 ± 3,25 % de las fibras del músculo esquelético mostraran núcleos ubicados centralmente( Tabla 2).

TABLA 2

Los ratones tratados con la dosis intermedia tenían un 61,85±4,00% de fibras musculares con núcleos centralizados, mientras que la nucleación de las fibras musculares tratadas con la dosis más alta se redujo a un 37,93±12,46% (Fig.

3C).

La fibrosis, donde el tejido es superado por colágeno, a menudo ocurre en los músculos de los pacientes con LGMD, lo que lleva a la formación de tejido cicatricial. La fibrosis se evaluó mediante tinción de rojo picrosirius para detectar el contenido de colágeno I y III, como marcador de fibrosis. Como se muestra en laFig. 4,Se observó una fuerte reducción en la tinción roja en ratones sgca-/-después del tratamiento con scAAVrh74.tMCK.hSGCA. La cuantificación reveló una reducción significativa en el contenido de colágeno en todos los músculos en scAAVrh74.tMCK.hSGCA tratado consgca-/-ratones en comparación con ratones de controlsgca-1-tratados con vehículo(Fig. 4B).En conjunto, estos datos demuestran el suministro sistémico exitosa del transgén hSGCA como lo indica la expresión robusta en los tejidos musculares y la mejora en las características histopatológicas asociadas con la falta de proteína a-SG en ratonessgca-/-.

Ejemplo 3

scAAVrh74.tMCK.hSGCA rAAV mejoró la función del diafragma y del músculo tibial anterior y aumenta la capacidad locomotora

Como la debilidad y la pérdida de función de los músculos proximales son síntomas importantes de LGMD2D y la insuficiencia respiratoria es la principal causa de muerte en LGMD2D, mejorar la funcionalidad y la fuerza de TA y DIA es imperativo para aumentar la duración y la calidad de vida en sujetos con LGMD2D. Se utilizaron tiras de los músculos DIA y T<a>completos para confirmar la correlación entre la expresión de hSGCA y la fuerza muscular. Como se muestra en las Figuras 5A y 5B, se identificó un déficit en la fuerza específica y la resistencia a la lesión inducida por la contracción en el TA y la fuerza específica en los músculos DIA de ratonessgca-/-no tratados en comparación con ratones de tipo silvestre.

Los músculos TA de ratonessgca-/-exhibieron un déficit funcional significativo del 44 % en la reducción de la producción de fuerza específica en comparación con los ratones de tipo silvestre (161,6 ± 8,20 mN/mm2 frente a 291,7 ± 6,17 mN/mm2, respectivamente; p<0,0001), así como una mayor pérdida de fuerza de la que se produce tras un riguroso protocolo de contracción excéntrica (44,0±6,0% de pérdida en ratonessgca-1-;pérdida del 18,0 ± 1,0 % en ratones de tipo silvestre; p<0,0001)(Figura 5A).Doce semanas después del suministro en la vena de la cola, el solicitante observó una mejora espectacular tras el tratamiento con dosis bajas, intermedias y altas de scAAVrh74.tMCK.hSGCA en la producción de fuerza específica, que aumentó a 218±11,94 mN/mm2, 227±11,7 mN/mm2, and 255±11,7 mN/mm2, respectivamente. La resistencia a las lesiones después de un protocolo de contracción excéntrica también mejoró en comparación con ratonessgca-/-tratados con vehículo, donde los ratones tratados con dosis baja, intermedia y alta solo perdieron 22,0 ± 4,0 %, 22,0 ± 3,0 % y 12,0 ± 1,0 %, respectivamente (p<0,0001 en comparación con ratonessgca--tratados con vehículo)(Fig.

5A).

En el DIA de ratonessgca--tratados con vehículo, la fuerza específica generada mostró una reducción del 41 % en la fuerza en comparación con los ratones de tipo silvestre (131,5 ± 12,07 mN/mm2 frente a 223,8 ± 15,85 mN/mm2). Se observó una mejora en la fuerza después del tratamiento con scAAVrh74.tMCK.hSGCA en las tres dosis, donde la fuerza específica de DIA en ratones con dosis bajas aumentó a 179,2 ± 21,03 mN/mm2 , en ratones con dosis intermedia aumentó a 201,2 ± 22,94 mN/mm2 y en ratones con dosis altas aumentó a 261,46 ± 9,73 mN/mm2 (Figura 65B). Estos datos muestran que los músculos TA y DIA en los ratonessgca- 'tienen un déficit de fuerza y se agotan más rápido que los ratones de tipo silvestre. Sin embargo, después del suministro de scAAVrh74.tMCK.hSGCA, se logró la recuperación funcional.

Los síntomas adicionales de LGMD2D incluyen intolerancia al ejercicio y reducción de la actividad y la deambulación, posiblemente debido a daño muscular, lo que provoca dolor y fatiga muscular. Para evaluar el nivel de actividad física, los ratonessgca- 'y C57BL/6 de tipo silvestre se sometieron a un protocolo de actividad en campo abierto similar al utilizado en informes anteriores. Se controlaron las actividades de los ratones relacionadas con la deambulación para determinar si la falta de a-SG en el ratónsgca--conduce a una disminución de la deambulación en comparación con los ratones de tipo silvestre. Los gráficos enFig. 5Crepresentan una reducción en la deambulación y la crianza vertical en el modelo de ratónsgca--en comparación con controles de tipo silvestre. Las roturas medias del haz ambulatorio horizontal registradas en los ratonessgca-1-fue de 2000 ± 159 roturas del haz/h, una disminución del 77,5% en la deambulación en comparación con 8911 ± 1193 roturas del haz/h en los controles de tipo silvestre. Las roturas verticales medias del haz de cría registradas en los ratonessgca-1-fue de 24,75 ± 11,47 roturas de haz/h, una disminución del 97 % en la crianza vertical en comparación con 803,3 ± 55,03 roturas de haz/h en ratones de tipo silvestre. Después del tratamiento con scAAVrh74.tMCK.hSGCA, la deambulación y las actividades de crianza vertical de los ratones aumentaron 12 semanas después del suministro del gen. La ambulación horizontal media aumentó a 3595±55,03 interrupciones del haz/hora en ratones tratados con dosis total de 1x1012 vg, 5238±861,9 interrupciones del haz/hora en ratones tratados con dosis total de 3*1012 vg, y 6487±467,9 interrupciones del haz/hora en ratones tratados con dosis total de 6*1012. La actividad media de crianza vertical aumentó a 377±146,1 interrupciones del haz/hora en ratones tratados con dosis total de 1x1012 vg, 321±126,1 interrupciones del haz/hora en ratones tratados con dosis total de 3*1012 vg, y 448,8±53,43 interrupciones del haz/hora en ratones tratados con dosis total de 6*1012 vg (Fig. 5C). Las actividades físicas de los ratones tratados mostraron una mejora del 44% al 69% en la ambulación y del 92% al 94% en la crianza vertical en comparación con ratonessgca-/-tratados con vehículo. Además, los niveles de creatina quinasa sérica se redujeron significativamente en todos los grupos tratados en comparación con los ratones no tratados(Fig. 5D).En conjunto, estos datos muestran que el suministro de a-SG restablece la actividad física y protege contra la degradación del músculo en ratonessgca-1-.

Análisis de seguridad y biodistribución de scAAVrh74.TMCK.hSGCA

Como medida de seguridad, se realizaron estudios de química sanguínea y hematología en ratones sgca-/- y silvestres tratados con el vector. Todos los valores estaban dentro de los rangos de referencia normales para ratones(Fig. 6).

Además, las secciones de tejido de todos los músculos y órganos teñidos con H&E de ratones sgca-/- y silvestres con dosis de scAAVrh74.tMCK.hSGCA se enviaron a un patólogo veterinario para su revisión formal. No se observaron efectos adversos en ninguna muestra de ninguno de los ratones sgca-/- y silvestres tratados con scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Además de la eficacia, estos datos demostraron que el suministro sistémico de las tres dosis de scAAVrh74.tMCK.hSGCA fue bien tolerada, segura y no tóxica para ratonessgca-1-y de tipo silvestre.

Para probar la posible toxicidad o problemas de seguridad derivados del suministro de scAAVrh74.tMCK.hSGCA, se realizó una PCR cuantitativa de biodistribución del vector para cuantificar la presencia del genoma del vector(Fig. 7A).

Se utilizaron conjuntos de sondas cebadoras tMCK.hSGCA específicas del vector para detectar genomas del vector en todos los músculos y órganos analizados de los ratones sgca-/- dosificados con scAAVrh74.tMCK/hSGCA. Como era de esperar, los genomas de los vectores estaban presentes en los tejidos analizados, con el mayor número de copias en el hígado, seguido de los músculos. Transferencias Western de proteína alfa-sarcoglicano en el hígado de ratones WT y sgca-/- tratados con cualquiera de los vehículos(sgca-1-LR) o scAArh74.tMCK.hSGCA se muestran en laFig. 7B.

Para mejorar la eficacia de la expresión de a-SG, en una realización, la secuencia de ADNc de hSGCA se empaqueta en un vector autocomplementario. Los vectores AAV autocomplementarios contienen un genoma repetido invertido que promueve la formación de ADNbc, lo que permite que se produzca la replicación y la transcripción sin la necesidad de múltiples genomas vectoriales para promover estos procesos. Como tal, el uso de vectores autocomplementarios elimina el paso limitante de la velocidad para permitir una expresión más rápida del transgén. El solicitante ha demostrado que el suministro intravascular de scAAVrh74.tMCK.hSGCA en pacientes con LGMD2D se asoció con una mayor expresión de a-SG 180 días después de la transferencia genética en dosis de 1 x 1012 y 3 x 1012.

El suministro intravenoso de scAAVrh74.tMCK.hSGCA proporciona a los músculos mayor fuerza y resistencia contra el daño inducido por la contracción en los músculos tibial anterior y diafragma en las tres cohortes tratadas con vector en comparación con los controles tratados con vehículo. Además, el tratamiento con scAAVrh74.tMCK.hSGCA dio como resultado una reducción significativa de CK. Además, después del tratamiento con scAAVrh74.tMCK.hSGCA, los ratones pudieron deambular y levantarse sobre las extremidades traseras con más frecuencia que los ratones tratados con vehículo.

La histopatología prominente, que incluye núcleos ubicados centralmente, amplia variabilidad en el tamaño de las fibras, inflamación, necrosis y fibrosis, se observa típicamente a través de biopsias musculares de pacientes con LGMD2D. Después del suministro de hSGCA, los ratones tuvieron una reducción en el CN, una distribución más uniforme del tamaño de las miofibras. y una reducción en el contenido de colágeno, con músculos que tienen una apariencia general más saludable en comparación con los ratones tratados con vehículo. La reducción total de la histopatología y el tejido cicatricial se asoció concomitantemente con una mejora en la función normal general y la fisiología de los músculos en ratones tratados con vectores.

Finalmente, los estudios de seguridad realizados mediante PCR cuantitativa, análisis de química sérica e histopatología no revisaron signos de toxicidad. El promotor tMCK se detectó sólo en los tejidos diana (todos los músculos) y estuvo ausente en otros órganos (no musculares), excepto el hígado. La detección de tMCK en el hígado no es infrecuente ni preocupante, ya que es un órgano de eliminación. La revisión histopatológica de todos los tejidos (incluido el hígado) realizada por un patólogo veterinario certificado concluyó que el suministro sistémico de scAAVrh74.tMCK.hSGCA no solo fue segura en todos los tejidos, sino que también el suministro de genes redujo drásticamente la cantidad de patología distrófica encontrada en los músculos esqueléticos de ratones sgca-/- tratados con vehículo. Las pruebas químicas realizadas en muestras de sangre de ratones tratados con vectores también respaldan la falta de toxicidad.

El estudio de aumento de dosis, como en esta divulgación, proporciona datos preclínicos que respaldan que la dosis más baja probada sistémicamente aquí,es decir1 x 1012 total total (5 x 1013 vg/kg), es suficiente para reducir los signos y síntomas asociados con la pérdida de proteína a-SG. Con la dosis más baja probada, se observó una mejora funcional en todos los músculos, como lo demuestra el aumento de la fuerza y el comportamiento locomotor (deambulación y crianza) en ratones tratados con vector. Los estudios de seguridad no muestran signos de toxicidad, incluso con la dosis más alta suministrada de 6 x 1012 total total (2 x 1014 g/kg).

Ejemplo 4

Pacientes mayores y durabilidad.

El reemplazo del gen mediado por rAAVrh74.tMCK.hSGCA ha mostrado resultados positivos en el tratamiento de LGMD-2D y otras enfermedades asociadas. Este estudio fue diseñado para probar la capacidad de rAAVrh74.tMCK.hSGCA para tratar músculos más viejos y más gravemente afectados, y para determinar la durabilidad a largo plazo del vector viral AAV.

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la aprobación del Instituto de Investigación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Nationwide Children's Hospital. Los ratones se mantuvieron en condiciones estandarizadas en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 horas, con comida y agua proporcionadas ad libitum. En primer lugar, se administró sistémicamente rAAVrh74.tMCK.hSGCA mediante inyección en la vena de la cola a ratonessgca-/-de 12 meses de edad (n = 5) que presentaban histopatología muscular grave con tres dosis (1,0 x 1012, 3,0x1012 y 6,0x1012 vg. Los controles incluyeron ratones sgca-/- (n=5) inyectados con solución de Ringers lactato (LRS) y ratones BL6 de tipo silvestre (n=4) inyectados con LRS. En el criterio de valoración de 6 meses después del tratamiento, se evaluó el músculo de los ratones tratados para determinar la expresión de la proteína SCGA, el rescate histológico y la mejora funcional. Las tres dosis mostraron una sólida expresión proteica de a-SG en el sarcolema, una histopatología mejorada, un aumento de la actividad locomotora y la generación de fuerza específica, protección contra la pérdida de fuerza excéntrica y una reducción de la CK sérica en comparación con los controles. No se detectó toxicidad vectorial. En ratones de edad avanzada, el tratamiento dio como resultado una expresión proteica generalizada y de alto nivel en los músculos analizados, una reducción de la fibrosis y una mayor resistencia a las lesiones inducidas por la contracción en el músculo tibial anterior.

En particular, la administración IV de rAAVrh74.tMCK.hSGCA a ratones sgca-/- de 12 meses de edad dio lugar a una expresión proteica generalizada de alto nivel en los músculos de las extremidades inferiores, superiores y proximales del torso, incluidos el diafragma y el corazón (Fig. 8).

Mejora general en la patología muscular (Fig 9a) y se observó una reducción en la nucleación central después de la administración de scAAVrh74.tMCK.hSGCA. Además, el tamaño promedio de las fibras aumentó a niveles similares a los niveles de las fibras WT en los músculos gastrocnemio (GAS) y tríceps (TRI) (Fig. 9b) después de la administración.

El nivel de depósito de colágeno se cuantificó como medida de fibrosis. La administración de scAAVrh74.tMCK.hSGCA dio como resultado una reducción en el nivel de fibrosis en comparación con los controles no tratados (Fig. 9c). La mejora funcional después de la administración de scAAVrh74.tMCK.hSGCA se evidenció por una mejor producción de fuerza (fuerza específica) en el músculo tibial anterior (TA) y el diafragma (DIA) y una mayor resistencia a la lesión inducida por la contracción en el músculo TA (Fig. 10).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para usarse en el tratamiento de la distrofia muscular en un sujeto que la necesita, donde la composición comprende un virus adeno-asociado recombinante (rAAV) AAVrh74.tMCK. hSCGA a una dosis de 5*1013 vg/kg a 2*1014 vg/kg basada en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación, y donde la composición está formulada para una vía de administración sistémica, y además donde el rAAV comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con SEQ ID NO: 4 y dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína que conserva la actividad del alfa-sarcoglicano.

2. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 1, donde el rAAV está a una dosis de 5*1013 vg/kg, 1x1014 vg/kg, o 2*1014 vg/kg basada en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación.

3. Una composición para usarse en el tratamiento de la distrofia muscular en un sujeto que la necesita, donde la composición comprende un virus adeno-asociado recombinante (rAAV) AAVrh74.tMCK.hSCGA a una dosis de 1,0 x 1013 vg/kg a 8,0 x 1013 vg/kg basado en un ADN o plásmido linealizado como patrón de cuantificación y donde la composición está formulada para una vía de administración sistémica, y además donde el rAAV comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 4 y dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína que conserva la actividad del alfa-sarcoglicano.

4. La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 3, donde la composición comprende AAVrh74.tMCK.hSCGA en una dosis de 1,85 x 1013 vg/kg o 7,41 x 1013 vg/kg basado en un ADN linealizado o un plásmido como patrón de cuantificación.

5. La composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

6. La composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano en una célula del sujeto aumenta después de la administración de la composición en comparación con el nivel de expresión del gen alfa-sarcoglicano antes de la administración de la composición; o donde el nivel de CK en suero en el sujeto disminuye después de la administración de la composición en comparación con el nivel de CK en suero antes de la administración de la composición; o donde el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano en el tejido muscular del sujeto aumenta después de la administración de la composición en comparación con el número de fibras positivas para alfa-sarcoglicano antes de la administración de la composición.

7. La composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la vía sistémica de administración es una vía intravenosa.

8. La composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la composición está formulada para administración mediante inyección, infusión o implantación.

9. La composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la composición está formulada para administración mediante infusión.

10. La composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la composición está formulada para administración por vía intravenosa a través de una vena periférica de una extremidad.

11. La composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la distrofia muscular es distrofia muscular de cinturas de extremidades.

12. La composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la distrofia muscular es distrofia muscular de cinturas de extremidades tipo 2D (LGMD2D).

13. La composición para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el sujeto padece distrofia muscular de cinturas de extremidades, y la composición está formulada para su administración por infusión intravenosa a una dosis de 5x1013 vg/kg a 2x1014 vg/kg basada en un ADN o plásmido superenrollado como patrón de cuantificación, y donde el rAAV comprende la secuencia nucleotídica del constructo scAAVrh74.tMCK.hSGCA de SEQ ID NO: 4.

14. Una composición para usarse para disminuir el nivel de CK en suero en un sujeto que lo necesita, comprendiendo la composición la construcción scAAVrh74.tMCK.hSGCA que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.