ES2948233T3

ES2948233T3 - Administración mediante vector de virus adenoasociado de microdistrofina específica de músculo para tratar la distrofia muscular

Info

Publication number: ES2948233T3
Application number: ES18768395T
Authority: ES
Inventors: Louise Rodino-Klapac; Jerry Mendell
Original assignee: Research Institute at Nationwide Childrens Hospital
Current assignee: Research Institute at Nationwide Childrens Hospital
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2023-09-06
Anticipated expiration: 2038-03-16
Also published as: PL3596222T3; MA52112A; TW201840850A; JP2020513811A; SG11201908575SA; PT3596222T; KR20190130591A; IL269391A; CO2019011250A2; RS64299B1; MA52112B1; EA201992201A1; BR112019019248A2; AR111292A1; EP4245852A3; JP2023053254A; CY1126080T1; CN110997923A; EP3596222A1; EP3596222B1

Abstract

La invención proporciona vectores de terapia génica, tales como vectores de virus adenoasociados (AAV), que expresan un gen de microdistrofina humana miniaturizada y un método para usar estos vectores para expresar microdistrofina en músculos esqueléticos, incluidos el diafragma y el músculo cardíaco, y para proteger el músculo. fibras de lesiones, aumentar la fuerza muscular y reducir y/o prevenir la fibrosis en sujetos que padecen distrofia muscular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Administración mediante vector de virus adenoasociado de microdistrofina específica de músculo para tratar la distrofia muscular

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona vectores de virus adenoasociado (AAV) que expresan un gen de microdistrofina humana minituarizado y usos de estos vectores en métodos para expresar microdistrofina en músculos esqueléticos incluidos diafragma y músculo cardíaco y proteger las fibras musculares de la lesión, aumentar la fuerza muscular y reducir y/o prevenir la fibrosis en sujetos que padecen distrofia muscular.

ANTECEDENTES

La importancia de la masa y la fuerza musculares para las actividades diarias, tales como la locomoción y respiración, y para el metabolismo de todo el cuerpo, es inequívoca. Los déficits en la función muscular producen distrofias musculares (MD) que se caracterizan por debilidad y atrofia muscular y tienen graves impactos sobre la calidad de vida. Las MD mejor caracterizadas resultan de mutaciones en genes que codifican miembros del complejo proteico asociado a distrofina (DAPC). Estas MD resultan de la fragilidad de la membrana asociada con la pérdida de la unión entre el sarcolema y el citoesqueleto por el DAPC. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una de las enfermedades musculares más devastadoras, que afecta a 1 de cada 5000 varones recién nacidos.

La DMD está provocada por mutaciones en el gen de DMD que conducen a reducciones en el ARNm y a la ausencia de distrofina, una proteína del sarcolema de 427 kD asociada con el complejo proteico asociado a distrofina (DAPC) (Hoffman et al., Cell 51 (6):919-28, 1987). El DAPC se compone de múltiples proteínas en el sarcolema muscular que forman un vínculo estructural entre la matriz extracelular (ECM) y el citoesqueleto por medio de la distrofina, una proteína de unión a actina, y alfa-distroglicano, una proteína de unión a laminina. Estos vínculos estructurales actúan estabilizando la membrana de células musculares durante la contracción y protegiendo frente al daño inducido por la contracción. Con la pérdida de la distrofina, la fragilidad de la membrana da como resultado desgarros en el sarcolema y un flujo de entrada de calcio, desencadenando proteasas activadas por calcio y necrosis de fibras segmentarias (Straub et al., Curr Opin. Neurol. 10(2): 168-75, 1997). Este ciclo descontrolado de degeneración y regeneración muscular agota en última instancia la población de células madre musculares (Sacco et al., Cell, 2010. 143(7): págs. 1059-71; Wallace et al., Annu Rev Physiol, 2009. 71: p. 37-57), dando como resultado debilidad muscular progresiva, inflamación del endomisio y cicatrización fibrótica.

Sin la estabilización de la membrana por la distrofina o una microdistrofina, la DMD manifestará ciclos descontrolados de lesión y reparación tisular que reemplazará en última instancia las fibras musculares perdidas por tejido cicatricial fibrótico a través de la proliferación de tejido conjuntivo. La fibrosis se caracteriza por depósitos excesivos de proteínas de la matriz de ECM, incluidos colágeno y elastina. Las proteínas de la ECM se producen principalmente a partir de citocinas tales como TGFp que liberan fibroblastos activados en respuesta al estrés y la inflamación. Aunque la característica patológica primaria de la DMD es la degeneración y necrosis de miofibras, la fibrosis como consecuencia patológica tiene las mismas repercusiones. La sobreproducción de tejido fibrótico restringe la regeneración muscular y contribuye a la debilidad muscular progresiva en el paciente con DMD . En un estudio, la presencia de fibrosis en bisopsias musculares iniciales de DMD estaba altamente correlacionada con un mal resultado motor en un seguimiento de 10 años (Desguerre et al., JNeuropatholExp Neurol, 2009. 68(7): p. 762-7). Estos resultados apuntan a la fibrosis como uno de los principales contribuyentes a la disfunción muscular en DMD y resaltan la necesidad de una intervención temprana antes de la fibrosis manifiesta.

El virus adenoasociado (AAV) es un parvovirus de replicación deficiente, cuyo genoma de ADN monocatenario tiene aproximadamente 4,7 kb de longitud, incluidas repeticiones terminales invertidas (ITR) de 145 nucleótidos. Hay múltiples serotipos de AAV. Las secuencias de nucleótidos de los genomas de los serotipos de AAV se conocen. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos del genoma de AAV serotipo 2 (AAV2) se presenta en Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983) corregida por Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994). Como otros ejemplos, se proporciona el genoma completo de AAV-1 en el n.° de registro de GenBank NC_002077; se proporciona el genoma completo de AAV-3 en el n.° de registro de GenBank NC_1829; se proporciona el genoma completo de AAV-4 en el n.° de registro de GenBank NC_001829; se proporciona el genoma de Aa V-5 en el n.° de registro de GenBank AF085716; se proporciona el genoma completo de AAV-6 en el n.° de registro de GenBank NC_00 1862; se proporcionan al menos porciones de los genomas de Aa V-7 y AAV-8 en los n.os de registro de GenBank AX753246 y AX753249, respectivamente (véanse también las patentes estadounidenses n.os 7.282.199 y 7.790.449 que se refieren a AAV-8); se proporciona el genoma de AAV-9 en Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); se proporciona el genoma de AAV-10 en Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); y se proporciona el genoma de AAV-11 en Virology, 330(2): 375-383 (2004). La clonación del serotipo AAVrh.74 se describe en Rodino-Klapac., et al. Journal of translational medicine 5, 45 (2007). Dentro de las ITR, están contenidas secuencias de actuación en cis que dirigen la replicación (rep) del ADN viral, la encapsidación/empaquetamiento y la integración en el cromosoma de la célula huésped. Tres promotores de AAV (denominados p5, p19 y p40 por sus ubicaciones relativas en el mapa) dirigen la expresión de los dos marcos de lectura abiertos internos de AAV que codifican los genes rep y cap. Los dos promotores rep (p5 y p19), acoplados con el corte y empalme diferencial del único intrón de AAV (por ejemplo, en los nucleótidos de AAV22107 y 2227), dan como resultado la producción de cuatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40) a partir del gen rep. Las proteínas rep poseen múltiples propiedades enzimáticas que son responsables en última instancia de la replicación del genoma viral. El gen cap se expresa a partir del promotor p40 y codifica las tres proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3. El corte y empalme alternativo y sitios de inicio de la traducción no consenso son responsables de la producción de las tres proteínas de la cápside relacionadas. Un solo sitio de poliadenilación consenso está ubicado en la posición 95 del mapa del genoma de A^aV. El ciclo de vida y la genética de A^aV se revisan en Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

AAV posee características únicas que lo hacen atractivo como vector para suministrar ADN foráneo a células, por ejemplo, en terapia génica. La infección por AAV de células de cultivo no es citopática, y la infección natural de seres humanos y otros animales es silenciosa y asintomática. Además, AAV infecta a muchas células de mamífero, lo que permite la posibilidad de seleccionar como diana muchos tejidos diferentes in vivo. Además, AAV transduce células que se dividen lentamente y que no se dividen, y puede persistir esencialmente durante la vida útil de esas células como un episoma nuclear transcripcionalmente activo (elemento extracromosómico). El genoma proviral de AAV es infeccioso como ADN clonado en plásmidos, lo que hace viable la construcción de genomas recombinantes. Además, debido a que las señales que dirigen la replicación de AAV, la encapsidación del genoma y la integración están contenidas dentro de las ITR del genoma de AAV, parte o la totalidad de los aproximadamente 4,3 kb internos del genoma (que codifican proteínas de replicación y estructurales de la cápside, rep-cap) pueden reemplazarse por ADN foráneo tal como un casete génico que contiene un promotor, un ADN de interés y una señal de poliadenilación. Las proteínas rep y cap pueden proporcionarse en trans. Otra característica significativa de AAV es que es un virus extremadamente estable y abundante. Soporta fácilmente las condiciones usadas para inactivar adenovirus (de 56 °C a 65 °C durante varias horas), lo que hace que la conservación en frío de AAV sea menos crítica. Incluso puede liofilizarse el AAV. Finalmente, las células infectadas con AAV no son resistentes a la superinfección.

Múltiples estudios han demostrado expresión de proteínas mediada por AAV recombinante a largo plazo (> 1,5 años) en el músculo. Véanse, Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082 14087 (1996); y Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996). Véanse también, Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) y Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001). Además, debido a que el músculo está sumamente vascularizado, la transducción de AAV recombinante ha dado como resultado la aparición de productos transgénicos en la circulación sistémica tras la inyección intramuscular tal como se describe en Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) y Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921-13926 (1997). Además, Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002) demostraron que las miofibras esqueléticas poseen los factores celulares necesarios para una correcta glicosilación, plegamiento y secreción de anticuerpos, lo que indica que el músculo es capaz de una expresión estable de productos terapéuticos proteicos secretados.

La mejora funcional en pacientes que padecen DMD y otras distrofias musculares requiere restauración génica en un estadio temprano de la enfermedad. Existe la necesidad de tratamientos que aumenten la fuerza muscular y protejan frente a lesiones musculares en pacientes que padecen DMD.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a vectores de AAV que expresan el gen de microdistrofina en músculos esqueléticos incluidos diafragma y músculo cardíaco para proteger las fibras musculares de lesiones, aumentar la fuerza muscular y reducir y/o prevenir la fibrosis.

La presente invención proporciona un vector de AAVrh.74 recombinante que comprende un promotor/potenciador específico de músculo MHCK7 operativamente unido a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, en donde el vector de AAVrh.74 recombinante comprende una repetición terminal invertida (ITR) de AAV2 en 5', el promotor/potenciador específico de músculo MHCK7, un intrón de SV40, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, una señal de poliadenilación (PoliA) sintética y una ITR de AAV2 en 3'.

En el presente documento se describen terapias y enfoques para aumentar la fuerza muscular y/o aumentar la masa muscular usando vectores de terapia génica para administrar microdistrofina para abordar el defecto génico observado en la DMD. Tal como se muestra en el ejemplo 2, el tratamiento con terapia génica de microdistrofina dio como resultado una mayor fuerza muscular in vivo. Además, la administración de terapia génica de microdistrofina por vía intramuscular y de manera sistémica mostró administración de distrofina a los músculos en modelos de ratón in vivo.

La proteína microdistrofina proporciona estabilidad a la membrana muscular durante la contracción muscular, por ejemplo la microdistrofina actúa como amortiguador durante la contracción muscular.

En una realización, el vector de rAAV es un virus adenoasociado (AAV) recombinante, no replicante denominado rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina. Este genoma de vector contiene los elementos mínimos requeridos para la expresión génica, incluidas repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2, la microdistrofina, el intrón de SV40 (SD/SA) y la señal de poliadenilación (Poli A) sintética, todos bajo el control del promotor/potenciador MHCK7. Se muestra el esquema del genoma de vector y el casete de expresión. Puede emplearse el serotipo AAVrh74 para lograr una transferencia génica eficaz en el músculo esquelético y cardíaco tras la administración IV.

El término "riguroso" se usa para referirse a las condiciones que se entienden comúnmente en la técnica como rigurosas. La rigurosidad de la hibridación se determina principalmente por la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de agentes desnaturalizantes tales como formamida. Ejemplos de condiciones rigurosas para la hibridación y el lavado son cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a 65-68 °C o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 50 % a 42 °C. Véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). También pueden usarse condiciones más rigurosas (tales como temperatura más alta, fuerza iónica más baja, formamida más alta u otro agente desnaturalizante), sin embargo, la tasa de hibridación se verá afectada. En casos en donde se trata de la hibridación de desoxioligonucleótidos, las condiciones de hibridación rigurosas a modo de ejemplo adicionales incluyen lavado en 6x SSC pirofosfato de sodio al 0,05 % a 37 °C (para oligos de 14 bases), 48 °C (para oligos a 17 bases), 55 °C (para oligos a 20 bases) y 60 °C (para oligos de 23 bases).

Pueden incluirse otros agentes en los tampones de hibridación y lavado para el fin de reducir la hibridación no específica y/o de fondo. Ejemplos son albúmina sérica bovina al 0,1 %, polivinil-pirrolidona al 0,1 %, pirofosfato de sodio al 0,1 %, dodecilsulfato de sodio al 0,1 %, NaDodSO4, (SDS), ficoll, solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (u otro ADN no complementario) y sulfato de dextrano, aunque también pueden usarse otros agentes adecuados. La concentración y los tipos de estos aditivos pueden cambiarse sin afectar sustancialmente a la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Habitualmente se llevan a cabo experimentos de hibridación a pH 6,8-7,4, sin embargo, en condiciones de fuerza iónica típicas, la tasa de hibridación es casi independiente del pH. Véase Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, Inglaterra). Las condiciones de hibridación puede ajustarlas un experto en la técnica con el fin de adaptarse a estas variables y permiten que los ADN de diferente relación de secuencia formen híbridos.

El término "elemento de control específico de músculo" se refiere a una secuencia de nucleótidos que regula la expresión de una secuencia codificante que es específica para la expresión en el tejido muscular. Estos elementos de control incluyen potenciadores y promotores. En el presente documento se describen constructos que comprenden los elementos de control específicos de músculo promotor MCKH7, el promotor MCK y el potenciador MCK.

El término "operativamente unido" se refiere al posicionamiento de la secuencia de nucleótidos del elemento regulador, por ejemplo la secuencia de nucleótidos del promotor, para conferir la expresión de dicha secuencia de nucleótidos mediante dicho elemento regulador.

Los vectores de AAV recombinantes de la presente invención comprenden un promotor/potenciador específico de músculo MHCK7 operativamente unido a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. Otros elementos de control específicos de músculo incluyen un elemento de gen de actina esquelética humana, un elemento de gen de actina cardíaca, un factor de unión a potenciador específico de miocitos (MEF), creatinina quinasa muscular (MCK), MCK truncado (tMCK), cadena pesada de miosina (MHC), potenciador híbrido de cadena pesada de a-miosina-/potenciador-promotor de MCK (MHCK7), C5-12, elemento potenciador de creatina quinasa murina, elemento génico de troponina c de contracción rápida esquelética, elemento génico de troponina c cardíaca de contracción lenta, el elemento génico de troponina i de contracción lenta, factores nucleares inducibles por hipoxia, elemento inducible por esteroides o elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE).

Por ejemplo, un elemento de control específico de músculo es la secuencia de nucleótidos del promotor MHCK7 SEQ ID NO: 2 o un elemento de control específico de músculo es la secuencia de nucleótidos de MCK SEQ ID NO: 4. Además, en cualquiera de los vectores de rAAV de la invención, la secuencia de nucleótidos del elemento de control específico de músculo está operativamente unida a la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína microdistrofina. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos del promotor MHCK7 (SEQ ID NO: 2) está operativamente unida a la secuencia codificante de microdistrofina humana (SEQ ID NO: 1) tal como se expone en el constructo proporcionado en la figura 1 o la figura 10 (SEQ ID NO: 3). En otro aspecto, la invención proporciona un vector de rAAV de la invención que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un vector de rAAV de la invención que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el vector rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 y mostrada en la figura 10. Este vector de rAAV comprende el promotor MHCK7, una secuencia de intrón quimérica, la secuencia codificante del gen de microdistrofina humana, poli A, resistencia a ampicilina y la estructura principal del plásmido pGEX con origen o replicación de pBR322.

La invención proporciona un vector de AAV recombinante de la invención que comprende la secuencia de nucleótidos de microdistrofina humana de SEQ ID NO: 1 y la secuencia de nucleótidos del promotor MHCK7 de SEQ ID NO: 3. Este vector de rAAV es el serotipo de AAV AAVrh.74.

La invención también proporciona un vector de AAV recombinante de la invención que comprende la secuencia de nucleótidos del constructo pAAV.MHCK7.microdistrofina de SEQ ID NO: 3. Este vector de rAAV es el serotipo de AAV AAVrh.74.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas (o algunas veces denominadas en el presente documento simplemente "composiciones") que comprenden cualquiera de los vectores de rAAV de la invención.

En el presente documento se describen métodos de producción de una partícula de vector de rAAV que comprenden cultivar una célula que se ha transfectado con cualquier vector de rAAV de la invención y recuperar partículas de rAAV del sobrenadante de las células transfectadas. La invención también proporciona partículas virales que comprenden cualquiera de los vectores de AAV recombinantes de la invención.

La invención proporciona un vector de AAV recombinante de la invención para su uso en métodos de tratamiento de distrofia muscular que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los vectores de AAV recombinantes de la invención que expresan microdistrofina humana.

La invención proporciona un vector de AAV recombinante de la invención para su uso en métodos de tratamiento de distrofia muscular que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector de AAV recombinante de la invención que comprende la secuencia de nucleótidos de microdistrofina humana de SEQ ID NO: 1 y la secuencia de nucleótidos del promotor MHCK7 de SEQ ID NO: 2.

La invención también proporciona un vector de AAV recombinante de la invención para su uso en métodos de tratamiento de distrofia muscular que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector de AAV recombinante de la invención que comprende la secuencia de nucleótidos del constructo pAAV.MHCK7.microdistrofina de SEQ ID NO: 3.

"Fibrosis" se refiere a la deposición excesiva o no regulada de componentes de la matriz extracelular (ECM) y procesos de reparación anómalos en tejidos tras la lesión, incluidos músculo esquelético, músculo cardíaco, hígado, pulmón, riñón y páncreas. Los componentes de la ECM que se depositan incluyen fibronectina y colágeno, por ejemplo colágeno 1, colágeno 2 o colágeno 3.

La invención también proporciona un vector de AAV recombinante de la invención para su uso en métodos de reducción o prevención de la fibrosis en un sujeto que padece distrofia muscular que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquier vector de AAV recombinante de la invención.

En otra realización, la invención proporciona un vector de AAV recombinante de la invención para su uso en métodos de prevención de la fibrosis en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector de AAV recombinante de la invención. Por ejemplo, cualquiera de los vectores de rAAV de la invención puede administrarse a sujetos que padecen distrofia muscular para prevenir la fibrosis, por ejemplo el rAAV de la invención que expresa una proteína microdistrofina humana administrado antes de que se observe fibrosis en el sujeto. Además, el rAAV de la invención que expresa un gen de microdistrofina humana puede administrarse a un sujeto en riesgo de desarrollar fibrosis, tal como los que padecen o se les diagnostica distrofia muscular, por ejemplo DMD. El rAAV de la invención puede administrarse al sujeto que padece distrofia muscular con el fin de prevenir una nueva fibrosis en estos sujetos.

La invención contempla administrar cualquiera de los vectores de AAV de la invención antes de que se observe fibrosis en el sujeto. Además, el rAAV de la invención puede administrarse a un sujeto en riesgo de desarrollar fibrosis, tal como los que padecen o se les diagnostica distrofia muscular, por ejemplo DMD. El rAAV de la invención puede administrarse al sujeto que padece distrofia muscular que ya ha desarrollado fibrosis con el fin de prevenir una nueva fibrosis en estos sujetos.

También se describen en el presente documento métodos de aumento de la fuerza muscular y/o la masa muscular en un sujeto que padece distrofia muscular que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector de rAAV de la invención que expresa un gen de microdistrofina humana. Estos métodos pueden comprender además la etapa de administrar un rAAV que expresa microdistrofina.

La invención contempla el uso de cualquiera de los vectores de AAV de la invención para su administración a pacientes con diagnóstico de DMD antes de que se observe fibrosis en el sujeto o antes de que la fuerza muscular se haya reducido o antes de que la masa muscular se haya reducido.

La invención también contempla el uso de un AAV de la invención para su administración a un sujeto que padece distrofia muscular que ya ha desarrollado fibrosis, con el fin de prevenir una nueva fibrosis en estos sujetos o para reducir la fibrosis en estos pacientes. La invención también proporciona el uso de cualquiera del rAAV de la invención para su administración al paciente que padece distrofia muscular que ya tiene una fuerza muscular reducida o tiene una masa muscular reducida con el fin de proteger el músculo de una lesión adicional.

En cualquiera de los métodos, el sujeto puede padecer distrofia muscular tal como DMD o cualquier otra distrofia muscular asociada a distrofina.

En cualquiera de los métodos, el vector de rAAV o composición puede administrarse mediante inyección intramuscular o inyección intravenosa.

Además, en cualquiera de los métodos, el vector de rAAV o composición puede administrarse de manera sistémica. Por ejemplo, el vector de rAAV o composición puede administrarse por vía parenteral mediante inyección, infusión o implantación.

En otra realización, la invención proporciona una composición que comprende cualquiera de los vectores de rAAV de la invención para su uso en la reducción de la fibrosis en un sujeto que lo necesita.

Además, la invención proporciona una composición que comprende cualquiera de los vectores de AAV recombinantes de la invención para su uso en la prevención de la fibrosis en un paciente que padece distrofia muscular.

La invención proporciona composiciones que comprenden cualquiera de los vectores de AAV recombinantes de la invención para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular.

La invención proporciona composiciones que comprenden un vector de AAV recombinante de la invención que comprenden la secuencia de nucleótidos de microdistrofina humana de SEQ ID NO: 1 y la secuencia del promotor MHCK7 de SEQ ID NO: 2 para su uso en el tratamiento de distrofia muscular.

La invención proporciona una composición que comprende un vector de AAV recombinante de la invención que comprende el constructo pAAV.MHCK7.microdistrofina que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 para su uso en el tratamiento de distrofia muscular.

También se describen en el presente documento composiciones que comprenden cualquiera de los vectores de rAAV de la invención para aumentar la fuerza muscular y/o la masa muscular en un sujeto que padece distrofia muscular. En una realización adicional, la invención proporciona composiciones que comprenden cualquiera de los vectores de rAAV de la invención para su uso en el tratamiento de distrofia muscular.

Las composiciones de la invención pueden formularse para inyección intramuscular o inyección intravenosa. La composición de la invención también se formula para administración sistémica, tal como administración por vía parenteral mediante inyección, infusión o implantación.

Además, cualquiera de las composiciones puede formularse para su administración a un sujeto que padece distrofia muscular tal como DMD o cualquiera otra distrofia muscular asociada a distrofina.

En cualquiera de los usos de la invención, el medicamento puede formularse para inyección intramuscular o inyección intravenosa. Además, en cualquiera de los usos de la invención, el medicamento puede formularse para administración sistémica tal como administración parenteral mediante inyección, infusión o implantación.

Cualquiera de los medicamentos puede prepararse para su administración a un sujeto que padece distrofia muscular tal como DMD o cualquier otra distrofia muscular asociada a distrofina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 ilustra el constructo pAAV.MHCK7.microdistrofina. En este constructo, el casete de expresión de ADNc está flanqueado por secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2. Este constructo se caracteriza por una deleción de varilla en marco (R4-R23), mientras que permanecen las bisagras 1, 2 y 4 (Hi, H₂y H₄) y el dominio rico en cisteína produciendo una proteína de 138 kDa. La expresión de la proteína microdistrofina (3579 pb) está guiada por un promotor MHCK7 (795 pb). El intrón y la UTR en 5' se derivan del plásmido pCMVp (Clontech). El casete de microdistrofina tenía una secuencia Kozak de consenso inmediatamente en frente del inicio de ATG y una señal de poliA sintética de 53 pb para la terminación del ARNm. El casete de microdistrofina humana contenía los dominios (R4-R23/A71-78) tal como describieron previamente Harper et al. (Nature Medicine 8, 253-261 (2002)).

La figura 2 demuestra la expresión de proteína distrofina tras la administración intramuscular del constructo AAVrh74.MHCK7. En el músculo tibial anterior de ratones mdx se inyectaron 1 * 1011 vg (n=5 por grupo). Seis semanas después, se recogieron los músculos y se tiñeron para detectar la expresión de distrofina con un anticuerpo N-terminal para distrofina y tinción con hematoxilina y eosina.

Las figuras 3A-3C proporcionan mediciones de la fuerza del músculo esquelético y la cuantificación de la expresión de microdistrofina tras la inyección intramuscular del constructo AAVrh74.MHCK7. (A) En el músculo tibial anterior de ratones mdx se inyectaron 1 * 1011 vg (n=5) con el constructo AAVrh74.MHCK7. Seis semanas después, se recogieron los músculos tibiales anteriores y se sometieron a mediciones de la fuerza in vivo. La cohorte dosificada tuvo una producción de fuerza significativamente mayor que los controles de mdx sin tratar. Las figuras 4A-4C demuestran la transducción generalizada de fibras de músculo esquelético, de diafragma y cardíaco después de la administración sistémica del constructo AAVrh.74.MHCK7.microdis. (A) Los ratones mdx se trataron de manera sistémica a las 6 semanas de edad por medio de la vena de la cola con 6*1012 vg (2 * 10 14 vg/kg) de AAVrh.74.MHCK7.microdistrofina después de 12 semanas de tratamiento. (B) La tinción de microdistrofina demuestra la cuantificación del porcentaje de fibras musculares que expresan microdistrofina en cada tejido. (C) Muestra la fuerza específica medida en el diafragma a la dosis baja y alta (clínica planificada). No se observaron diferencias significativas a la dosis baja; sin embargo, hubo una mejora significativa a la dosis alta.

La figura 5 demuestra la expresión de proteína distrofina tras la administración sistémica del constructo AAVrh.74.MHCK7.microdistrofina. Se trataron ratones mdx (n=5) de manera sistémica comenzando a las 6 semanas de edad por medio de la vena de la cola con 6 * 1012vg de AAVrh.74.MHCK7.microdistrofina. Después de 12 semanas de tratamiento, se recogieron todos los músculos y se tiñeron para determinar la distrofina y la restauración de componentes de DAPC (se muestra beta-sarcoglicano).

Las figuras 6A-6D demuestran la toxicología/seguridad de AAVrh.74.MHCK7. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) se realizó en los siguientes tejidos musculares para analizar la toxicidad: tibial anterior (TA), gastrocnemio (GAS), cuádriceps (QD), psoas (PSO), tríceps (TRI) y diafragma (DIA) (figura 6A). No se observó toxicidad. Como indicador de eficacia, se cuantificó el número de fibras musculares con núcleos colocados centralmente (CN) (figura 6B). Los CN son indicativos de ciclos de degeneración y regeneración muscular y, por tanto, la reducción de CN demuestra el efecto del tratamiento. (Figura 6C) demuestra que el número total de fibras no cambia con el tratamiento. La cantidad de creatina quinasa se proporciona en (D) mostrando mejora a alta dosis. Se usaron pruebas de t independientes para ubicar las diferencias (p<0,05); los datos se notifican como medias ± EEM.

La figura 7 ilustra el constructo de plásmido de pAAV.MCK.microdistrofina.

La figura 8 proporciona los resultados de un ensayo de potencia de rAAVrh74.MCK. microdistrofina (humana). En el músculo tibial anterior de ratones mdx se inyectaron 3 * 109, 3 * 1010 o 1 * 1011 vg (n=3 por grupo). Cuatro semanas después, se recogieron los músculos y se tiñeron para detectar la expresión de distrofina con el anticuerpo Dys3 N-terminal. Hubo una correlación lineal entre la expresión y la dosis con muy poca expresión (sin nivel de efecto) a 3 * 109 vg y un 89 % de expresión a 1 * 1011 vg.

Las figuras 9A-9C demuestran que la microdistrofina humana mejora la generación de fuerza y la protección frente a lesiones inducidas por contracción excéntrica. (A) La inmunotinción de proteína distrofina en el extensor largo de los dedos (EDL) y TA muestra expresión en miofibras de mdx tras la inyección de rAAVrh.74-MCK-microdistrofina (humana) por medio de la arteria femoral. Se tiñó músculo infectado de manera simulada de una manera idéntica y las exposiciones son coincidentes en el tiempo. (B) rAAVrh.74-MCK-microdistrofina aumentó significativamente la fuerza específica normalizada en relación con músculos de mdx tratados de manera simulada (P<0,05 frente a mdx). (C) Se compararon músculos de mdx infectados con rAAVrh.74-MCK-Microdis (humana) con músculos EDL de mdx contralaterales infectados de manera simulada y músculos EDL WT (WT C57Bl/10) para la caída de fuerza durante contracciones excéntricas repetitivas a las 12 semanas tras la transferencia génica. El tratamiento con rAAVrh.74-MCK-microdistrofina (microdis) protegió significativamente frente a la pérdida de fuerza en comparación con músculos de mdx tratados de manera simulada (P< 0,001 frente a mdx). Los errores son EEM.

La figura 10 proporciona la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 3 rAAVrh74.MHCK7. microdistrofina).

La figura 11 proporciona la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 5) rAA Vrh74.MCK.microdistrofina.

Las figuras 12A - 12B proporciona la respuesta inmunológica a la administración sistémica de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina en el primate no humano. (A) Respuesta de ELISpot a grupos de péptidos de microdistrofina y cápside de AAV. ConA es el control positivo y DMSo es el control negativo. Había tres grupos de AAVrh74 y cuatro grupos de péptidos específicos para microdistrofina. (B) Títulos positivos por ELISA de anticuerpos neutralizantes circulantes frente a la cápside del vector. Se aisló suero de primates cada dos semanas y se analizó para determinar el título de anticuerpos. El título notificado corresponde a la última dilución a la que la razón de respuesta >2.

La figura 13A -B demuestra la administración sistémica en macacos rhesus con AAVrh74.MHCK7.microdistrofina. La tinción de inmunofluorescencia anti-FLAG en los músculos del lado izquierdo demostró una expresión de microdistrofina robusta.

La figura 14 demuestra el efecto del tratamiento sistémico con rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina sobre la expresión transgénica. La tinción de inmunofluorescencia para microdistrofina usando un anticuerpo frente a distrofina N-terminal en el corazón, el diafragma, el psoas y el tibial anterior (TA) demuestra una expresión robusta en los animales tratados con dosis media (6e12 vg; 2e14 vg/kg) y alta (1,2e13 vg; 6e14 vg/kg) 3 meses tras la inyección. Se muestran imágenes de 20x.

La figura 15 demuestra el efecto del tratamiento sistémico con rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina sobre la expresión transgénica. La tinción de inmunofluorescencia para microdistrofina usando un anticuerpo frente a distrofina N-terminal en el gastrocnemio, el cuádriceps, el tríceps y el glúteo demuestra una expresión robusta en los animales tratados con la dosis media (6e12 vg; 2e14 vg/kg) y la dosis más alta (1,2e13 vg; 6e14 vg/kg) 3 meses tras la inyección. Se muestran imágenes de 20x.

La figura 16 demuestra el efecto del tratamiento sistémico con rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina sobre la patología muscular. (A) Tinción de H&E del músculo diafragma, tibial anterior, gastrocnemio y cuádriceps de ratones C57BL/6 WT, mdx y tratados con rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina (dosis media-2e14vg/kg; dosis alta-6e14vg/kg), (B) la cuantificación del tamaño de fibra promedio demostró una normalización del tamaño de fibra en todos los tejidos. ****p<0,001, ANOVA de una vía; los datos se notifican como medias ± EEM. Se muestran imágenes de 20x.

La figura 17 demuestra el efecto del tratamiento sistémico con rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina sobre la patología muscular. (A) Tinción de H&E del músculo tríceps, glúteo y psoas de ratones C57BL/6 WT, mdx y tratados con rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina (dosis media-2e14vg/kg; dosis alta-6e14vg/kg), (B) la cuantificación del tamaño de fibra promedio demostró fibras más grandes de una manera dependiente de la dosis. ****p<0,001, ANOVA de una vía; los datos se notifican como medias ± EEM. Se muestran imágenes de 20x.

La figura 18 demuestra el efecto del tratamiento sistémico con rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina sobre la nucleación central. El aumento de la dosis ilustra las reducciones en la nucleación central en todos los músculos esqueléticos y el diafragma. Se usó ANOVA de dos vías para ubicar las diferencias (p<0,05). Los datos se notifican como medias ± EEM.

La figura 19 demuestra el efecto del tratamiento sistémico con rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina sobre la deposición de colágeno. El aumento de la dosis ilustra las reducciones en la acumulación de colágeno (%) en el diafragma. *p<0,05, ANOVA de una vía; los datos se notifican como medias ± EEM. Se muestran imágenes de 20x.

La figura 20 demuestra la corrección de los déficits de fuerza en el diafragma. Después de 3 o 6 meses de tratamiento, se recogieron tiras de músculo del diafragma para medir la fuerza específica (normalizada al área de sección transversal). El tratamiento restauró la fuerza a niveles de WT. *p<0,05. Se utilizó ANOVA de una vía para determinar las diferencias de ratones mdx-LR.

La figura 21 demuestra la corrección de los déficits de fuerza en el TA. (A) Después de 3-6 meses de tratamiento, se recogieron músculos TA (tanto izquierdo como derecho) para medir la fuerza específica (normalizada al peso de TA). El tratamiento restauró la fuerza a niveles de WT. (B) El tratamiento rescató los músculos TA de la fatiga después de un protocolo riguroso de contracciones excéntricas. *p<0,05. Se utilizó ANOVA de una vía para determinar las diferencias de ratones mdx-LR.

La figura 22 proporciona la distribución de copias de vg promedio en diversos tejidos de tres ratones mdx después de la administración IV de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina.

Figura 23. Se analizaron las químicas séricas de ratones en los que se inyectó de manera sistémica ssAAVrh74.MHCK7.microdistrofina y grupos de control de edad coincidente por un CRO independiente (Charles River Laboratories) que indican valores normales en todas las químicas analizadas. Los únicos valores anómalos fueron AST y ALT elevadas en animales tratados con vehículo MDX [MDX-LR (Ringer con lactato)] que se normalizaron con el tratamiento. Se sabe que AST y ALT están elevadas en DMD. ALT = alanina aminotransferasa, ALP/K = fosfatasa alcalina, AST = aspartato aminotransferasa, BUN = nitrógeno de urea en sangre, B/C = razón de sangre con respecto a creatinina, CREAT = creatina, GLU = glucosa, TP= proteína total, TBIL = bilirrubina total, DBIL = bilirrubina directa.

La figura 24 proporciona inmunotransferencias de tipo Western de biodistribución en músculos y órganos de ratones mdx en los que se inyectó de manera sistémica rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina.

La figura 25 proporciona el mapa del plámido auxiliar de AAV pNLREP2-Caprh74.

La figura 26 proporciona el plásmido auxiliar de Ad pHELP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención proporciona vectores de rAAV que sobreexpresan microdistrofina humana y los vectores de rAAV para su uso en métodos de reducción y prevención de la fibrosis en pacientes con distrofia muscular. Biopsias musculares tomadas a la edad más temprana de diagnóstico de DMD revelan una proliferación prominente de tejido conjuntivo. La fibrosis muscular es perjudicial de múltiples modos. Reduce el tránsito normal de nutrientes del endomisio a través de las barreras del tejido conjuntivo, reduce el flujo de sangre y priva al músculo de constituyentes nutricionales derivados del sistema vascular, y contribuye funcionalmente a la pérdida temprana de la deambulación por contracturas en las extremidades. Con el tiempo, los desafíos del tratamiento se multiplican como resultado de una marcada fibrosis en el músculo. Esto puede observarse en biopsias musculares que comparan la proliferación de tejido conjuntivo en puntos de tiempo sucesivos. El proceso sigue exacerbándose, lo que conduce a la pérdida de la deambulación y a una aceleración fuera de control, especialmente en pacientes dependientes de sillas de ruedas.

Sin un tratamiento temprano que incluya un enfoque paralelo para reducir la fibrosis, es poco probable que los beneficios de la omisión de exones, la lectura completa del codón de terminación o las terapias de reemplazo de genes puedan lograrse por completo. Incluso estrategias de moléculas pequeñas o de reemplazo de proteínas pueden fallar sin un enfoque para reducir la fibrosis muscular. El trabajo previo en ratones mdx envejecidos con fibrosis existente tratados con AAV.microdistrofina demostró que no pudo lograrse una restauración funcional completa (Liu, M., et al., Mol Ther 11,245 256 (2005)). También se sabe que la progresión de la miocardiopatía de DMD va acompañada por cicatrización y fibrosis en la pared ventricular.

Como se usa en el presente documento, el término "AAV" es una abreviatura convencional de virus adenoasociado. El virus adenoasociado es un parvovirus de ADN monocatenario que crece solo en células en las que ciertas funciones se proporcionan por un virus auxiliar coinfectante. Actualmente hay trece serotipos de AAV que se han caracterizado. Pueden encontrarse información general y revisiones de AAV en, por ejemplo, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, vol. 1, págs. 169-228, y Berns, 1990, Virology, págs. 1743-1764, Raven Press, (Nueva York). Sin embargo, se espera plenamente que estos mismos principios sean aplicables a serotipos de AAV adicionales ya que se sabe bien que los diversos serotipos están muy estrechamente relacionados, tanto estructural como funcionalmente, incluso a nivel genético. (Véanse, por ejemplo, Blacklowe, 1988, págs. 165-174 de Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; y Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). Por ejemplo, todos los serotipos de AAV aparentemente presentan propiedades de replicación muy similares mediadas por genes rep homólogos; y todos llevan tres proteínas de la cápside relacionadas, tales como las expresadas en AAV2. El grado de parentesco lo sugiere además el análisis heterodúplex que revela una hibridación cruzada extensa entre los serotipos a lo largo de la longitud del genoma; y la presencia de segmentos de autoapareamiento análogos en los extremos terminales que corresponden a "secuencias repetidas terminales invertidas" (ITR). Los patrones de infectividad similares también sugieren que las funciones de replicación en cada serotipo están bajo un control regulatorio similar.

Un "vector de AAV", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un vector que comprende uno o más polinucleótidos de interés (o transgenes) que están flanqueados por secuencias repetidas terminales (ITR) de AAV. Tales vectores de AAV pueden replicarse y empaquetarse en partículas virales infecciosas cuando están presentes en una célula huésped que se ha transfectado con un vector que codifica y expresa los productos de los genes rep y cap.

Un "virión de AAV" o "partícula viral de AAV" o "partícula de vector de AAV" se refiere a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV y un vector de AAV de polinucleótido encapsulado. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un un genoma de AAV de tipo natural, tal como un transgén que va a administrarse a una célula de mamífero), normalmente se denomina "partícula de vector de AAV" o simplemente "vector de AAV". Por lo tanto, la producción de una partícula de vector de AAV incluye necesariamente la producción de un vector AAV, ya que tal vector está contenido dentro de una partícula de vector de AAV. AAV

El vector de AAVrh.74 recombinante de la invención comprende un promotor/potenciador MHCK7 específico de músculo operativamente unido a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, en donde el vector de AAVrh.74 recombinante comprende una repetición terminal invertida (ITR) de AAV2 en 5', el promotor/potenciador específico de músculo MHCK7, un intrón de SV40, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, una señal de poliadenilación (PoliA) sintética y una ITR de AAV2 en 3'. El ADN de AAV en los genomas de rAAV puede ser de cualquier serotipo de AAV para el cual puede derivarse un virus recombinante que incluye, pero no se limita a, los serotipos de AAV AAVrh.74, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 y AAV-13. Se da a conocer la producción de rAAV pseudotipado en, por ejemplo, el documento WO 01/83692. También se contemplan otros tipos de variantes de rAAV, por ejemplo rAAV con mutaciones de la cápside. Véase, por ejemplo, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014). Como se indicó en la sección de Antecedentes anterior, las secuencias de nucleótidos de los genomas de diversos serotipos de AAV se conocen en la técnica. Para promover la expresión específica del músculo esquelético, pueden usarse AAV1, AAV6, AAV8 o AAVrh.74.

Los plásmidos de ADN de la invención comprenden genomas de rAAV de la invención. Los plásmidos de ADN se transfieren a células permisibles para la infección con un virus auxiliar de AAV (por ejemplo, adenovirus, adenovirus con deleción de E1 o herpesvirus) para el ensamblaje del genoma de rAAV en partículas virales infecciosas. Las técnicas para producir partículas de rAAV, en las que se proporcionan a una célula un genoma de AAV que va a empaquetarse, genes rep y cap, y funciones de virus auxiliares, son convencionales en la técnica. La producción de rAAV requiere que los siguientes componentes estén presentes dentro de una sola célula (denominada en el presente documento célula de empaquetamiento): un genoma de rAAV, genes rep y cap de AAV separados (es decir, no en) del genoma de rAAV y funciones de virus auxiliares. Los genes rep y cap de AAV pueden ser de cualquier serotipo de AAV para el que pueda derivarse un virus recombinante y pueden ser de un serotipo de AAV diferente al de las ITR del genoma de rAAV, incluidos, pero sin limitarse a, los serotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAVrh.74, AAV-8, AAV9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 y AAV-13. Se da a conocer la producción de rAAV pseudotipado en, por ejemplo, el documento WO 01/83692.

Un método de generación de una célula de empaquetamiento es crear una línea celular que exprese de manera estable todos los componentes necesarios para la producción de partículas de AAV. Por ejemplo, un plásmido (o múltiples plásmidos) que comprende un genoma de rAAV que carece de genes rep y cap de AAV, genes rep y cap de AAV separados del genoma de rAAV, y un marcador seleccionable, tal como un gen de resistencia a neomicina, se integran en el genoma de una célula. Los genomas de AAV se han introducido en plásmidos bacterianos mediante procedimientos como la cola de GC (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), adición de enlazadores sintéticos que contienen sitios de escisión de endonucleasas de restricción (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73) o mediante ligamiento directo de extremos romos (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). La línea celular de empaquetamiento se infecta entonces con un virus auxiliar tal como adenovirus. Las ventajas de este método es que las células son seleccionables y son adecuadas para la producción a gran escala de rAAV. Otros ejemplos de métodos adecuados emplean adenovirus o baculovirus en lugar de plásmidos para introducir genomas de rAAV y/o genes rep y cap en células de empaquetamiento.

Se revisan los principios generales de producción de rAAV en, por ejemplo, Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; y Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. y Immunol., 158:97-129). Se describen diversos enfoques en Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); y Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989); patente estadounidense n.° 5.173.414; documento WO 95/13365 y la correspondiente patente estadounidense n.° 5.658.776; documentos WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. Vaccine 13:1244-1250 (1995); Paul et al. Human Gene Therapy 4:609-615 (1993); Clark et al. Gene Therapy 3:1124-1132 (1996); patente estadounidense n.° 5.786.211; patente estadounidense n.° 5.871.982; y patente estadounidense n.° 6.258.595.

En el presente documento se describen células de empaquetamiento que producen rAAV infeccioso. Las células de empaquetamiento pueden ser células cancerosas transformadas de manera estable tales como células HeLa, células 293 y células PerC.6 (una línea 293 afín). Las células de empaquetamiento pueden ser células que no son células cancerosas transformadas, tales como células 293 de bajo número de pases (células de riñón fetal humano transformadas con E1 de adenovirus), células MRC-5 (fibroblastos fetales humanos), células WI-38 (fibroblastos fetales humanos), células Vero (células de riñón de mono) y células FRhL-2 (células de pulmón fetal de rhesus).

AAV recombinante (es decir, partículas de rAAV encapsidadas infecciosas) de la invención comprende un genoma de rAAV. En realizaciones a modo de ejemplo, los genomas de ambos rAAV carecen de ADN de rep y cap de AAV, es decir, no hay ADN de rep o cap de AAV entre las ITR de los genomas. Los ejemplos de rAAV que pueden construirse para que comprendan las moléculas de ácido nucleico de la invención se exponen en la solicitud de patente internacional n.° PCT/US2012/047999 (documento WO 2013/016352).

En una realización a modo de ejemplo, el vector de AAV recombinante de la invención se produce mediante el método de transfección triple (Xiao et al., J Virol 72, 2224-2232 (1998) usando los plásmidos de vector de AAV pAAV.MHCK7.microdistrofina, pNLRep2-Caprh74 y pHelp, pAAV contiene el casete de expresión del gen de microdistrofina flanqueado por secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2. Es esta secuencia la que se encapsida en viriones de AAVrh74. El plásmido contiene la secuencia de microdistrofina y los elementos de promotor central y potenciador MHCK7 del promotor específico de músculo para dirigir la expresión génica. El casete de expresión también contiene intrón de SV40 (SD/SA) para promover la expresión génica de alto nivel y se usa la señal de poliadenilación de hormona del crecimiento bovina para una terminación eficiente de la transcripción.

El pNLREP2-Caprh74 es un plásmido auxiliar de AAV que codifica las 4 proteínas rep de AAV2 de tipo natural y las 3 proteínas de la cápside VP de AAV de tipo natural del serotipo rh74. En la figura 25 se muestra un mapa esquemático del plásmido pNLREP2-Caprh74.

El plásmido auxiliar de adenovirus pHELP tiene 11.635 pb y se obtuvo de Applied Viromics. El plásmido contiene las regiones del genoma de adenovirus que son importantes para la replicación de AAV, concretamente ARN de E2A, E4ORF6 y VA (las funciones de E1 de adenovirus las proporcionan las células 293). Las secuencias de adenovirus presentes en este plásmido representan solo ~40 % del genoma de adenovirus, y no contienen los elementos cis críticos para la replicación tales como las repeticiones terminales de adenovirus. Por tanto, no se espera que se genere adenovirus infeccioso a partir de tal sistema de producción. En la figura 26 se muestra un mapa esquemático del plásmido pHELP.

El rAAV puede purificarse mediante métodos convencionales en la técnica tales como mediante cromatografía en columna o gradientes de cloruro de cesio. En la técnica se conocen métodos para purificar vectores de rAAV a partir de virus auxiliar e incluyen métodos dados a conocer en, por ejemplo, Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp y Clark, Methods Mol. Med., 69 427-443 (2002); patente estadounidense n.° 6.566.118 y documento w O 98/09657.

En otra realización, la invención contempla composiciones que comprenden rAAV de la presente invención. Las composiciones de la invención comprenden rAAV y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones también pueden comprender otros componentes tales como diluyentes y adyuvantes. Los portadores, diluyentes y adyuvantes aceptables no son tóxicos para los receptores y son preferiblemente inertes en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen tampones y tensioactivos tales como pluronics.

Los títulos de rAAV que van a administrarse en los métodos variarán dependiendo, por ejemplo, del rAAV particular, el modo de administración, el objetivo del tratamiento, el individuo y el/los tipo(s) de células a los que se dirigen, y pueden determinarse mediante métodos convencionales en la técnica. Los títulos de rAAV pueden oscilar entre aproximadamente 1*106, aproximadamente 1*107, aproximadamente 1*108, aproximadamente 1*109, aproximadamente 1 x io 10, aproximadamente 1 x io 11, aproximadamente 1 x io 12, aproximadamente 1*1013 y aproximadamente 1*1014 o más partículas resistentes a ADNasa (DRP) por ml. Las dosis pueden expresarse también en unidades de genomas virales (vg).

En el presente documento se describen métodos de transducción de una célula diana con rAAV, in vivo o in vitro. Los métodos in vivo comprenden la etapa de administrar una dosis eficaz, o múltiples dosis eficaces, de una composición que comprende un rAAV de la invención a un animal (incluido un ser humano) que lo necesita. Si la dosis se administra antes del desarrollo de un trastorno/enfermedad, la administración es profiláctica. Si la dosis se administra después del desarrollo de un trastorno/enfermedad, la administración es terapéutica. En realizaciones de la invención, una dosis eficaz es una dosis que alivia (elimina o reduce) al menos un síntoma asociado con el trastorno/estado patológico que está tratándose, que ralentiza o previene la progresión a un trastorno/estado patológico, que ralentiza o previene la progresión de un trastorno/estado patológico, que disminuye el grado de la enfermedad, que da como resultado la remisión (parcial o total) de la enfermedad y/o que prolonga la supervivencia. Un ejemplo de una enfermedad contemplada para la prevención o el tratamiento con los métodos de la invención es DMD.

La invención también contempla terapias de combinación. Combinación, tal como se usa en el presente documento, incluye tanto el tratamiento simultáneo como tratamientos secuenciales. Se contemplan específicamente combinaciones de métodos de la invención con tratamientos médicos convencionales (por ejemplo, corticosteroides), así como combinaciones con terapias novedosas.

La administración de una dosis eficaz de las composiciones puede realizarse por vías convencionales en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, intramuscular, parenteral, intravenosa, oral, bucal, nasal, pulmonar, intracraneal, intraósea, intraocular, rectal o vaginal. La(s) vía(s) de administración y el/los serotipo(s) de los componentes de AAV del rAAV (en particular, las ITR de AAV y la proteína de la cápside) de la invención puede(n) elegirse y/o combinarse por los expertos en la técnica teniendo en cuenta la infección y/o el estado patológico que está tratándose y las células/tejido(s) diana que van a expresar la proteína micro-distrofina.

La invención proporciona la administración local y la administración sistémica de una dosis eficaz de rAAV y composiciones de la invención. Por ejemplo, la administración sistémica es la administración en el sistema circulatorio de manera que se ve afectado todo el cuerpo. La administración sistémica incluye administración enteral tal como absorción a través del tracto gastrointestinal y administración parenteral mediante inyección, infusión o implantación.

En particular, la administración real de rAAV de la presente invención puede lograrse usando cualquier método físico que transporte el vector recombinante de rAAV al tejido diana de un animal. La administración según la invención incluye, pero no se limita a, inyección en el músculo e inyección en el torrente sanguíneo. Se ha demostrado que la simple resuspensión de un rAAV en solución salina tamponada con fosfato es suficiente para proporcionar un vehículo útil para la expresión en el tejido muscular, y no existen restricciones conocidas sobre los portadores u otros componentes que pueden coadministrarse con el rAAV (aunque las composiciones que degradan el ADN deben evitarse de la manera normal con rAAV). Las proteínas de la cápside de un rAAV pueden modificarse para que el rAAV se dirija a un tejido diana particular de interés, tal como el músculo. Véase, por ejemplo, el documento WO 02/053703. Pueden prepararse composiciones farmacéuticas como formulaciones inyectables o como formulaciones tópicas para administrarse a los músculos mediante transporte transdérmico. Se han desarrollado previamente numerosas formulaciones tanto para inyección intramuscular como para transporte transdérmico y pueden usarse en la práctica de la invención. El rAAV puede usarse con cualquier portador farmacéuticamente aceptable para facilitar la administración y el manejo.

La dosis de rAAV que se administrará en los métodos descritos en este documento variará según, por ejemplo, el rAAV particular, el modo de administración, el objetivo del tratamiento, el individuo y el/los tipo(s) de células objetivo, y puede determinarse mediante métodos convencionales en la técnica. Los títulos de cada rAAV administrado pueden oscilar entre aproximadamente 1x106, aproximadamente 1x107, aproximadamente 1x108, aproximadamente 1x109, aproximadamente 1x1010, aproximadamente 1X1011, aproximadamente 1x1012, aproximadamente 1x1013, aproximadamente 1x1014 y aproximadamente 1x1015 o más partículas resistentes a ADNasa (DRP) por ml. Las dosis pueden expresarse también en unidades de genomas virales (vg) (es decir, 1x107 vg, 1x108 vg, 1x109 vg, 1 x1010 vg, 1 x1011 vg, 1x1012 vg, 1x1013 vg, 1x1014 vg, 1x1015 respectivamente). Las dosis pueden expresarse también en unidades de genomas virales (vg) por kilogramo (kg) de peso corporal (es decir, 1x1010 vg/kg, 1x1011 vg/kg, 1x1012 vg/kg, 1x1013 vg/kg, 1x1014 vg/kg, 1x1015 vg/kg respectivamente). Se describen métodos para la titulación de AAV en Clark et al., Hum. Gene Ther., 10: 1031-1039 (1999).

Para fines de inyección intramuscular, pueden emplearse disoluciones en un adyuvante tal como aceite de sésamo o cacahuete o en propilenglicol acuoso, así como disoluciones acuosas estériles. Tales disoluciones acuosas pueden tamponarse, si se desea, y el diluyente líquido en primer lugar se vuelve isotónico con solución salina o glucosa. Las disoluciones de rAAV como ácido libre (el ADN contiene grupos fosfato ácidos) o una sal farmacológicamente aceptable pueden prepararse en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. También puede prepararse una dispersión de rAAV en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. A este respecto, los medios acuosos estériles empleados pueden obtenerse fácilmente mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica.

Los portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticos adecuados para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse mediante el uso de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se preparan disoluciones inyectables estériles incorporando rAAV en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con otros diversos componentes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el principio activo esterilizado en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado a vacío y la técnica de secado por congelación que producen un polvo del principio activo más cualquier componente adicional que se desee a partir de la disolución previamente esterilizada por filtración del mismo.

También puede realizarse la transducción con rAAV in vitro. En una realización, se extraen células musculares diana deseadas del sujeto, se transducen con rAAV y vuelven a introducirse en el sujeto. Alternativamente, pueden usarse células musculares singénicas o xenogénicas donde esas células no generarán una respuesta inmunitaria inapropiada en el sujeto.

Se conocen en la técnica métodos adecuados para la transducción y reintroducción de células transducidas en un sujeto. En una realización, las células pueden transducirse in vitro combinando rAAV con células musculares, por ejemplo, en medios apropiados, y cribando aquellas células que albergan el ADN de interés usando técnicas convencionales tales como transferencias de tipo Southern y/o PCR, o usando marcadores seleccionables. A continuación, las células transducidas pueden formularse en composiciones farmacéuticas, y la composición introducirse en el sujeto mediante diversas técnicas, tales como por inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea e intraperitoneal, o mediante inyección en el músculo liso y cardíaco, usando, por ejemplo, un catéter.

La transducción de células con rAAV de la invención da como resultado una expresión sostenida de la proteína microdistrofina. Por tanto, se proporcionan métodos para administrar/suministrar rAAV que expresan la proteína microdistrofina a un animal, preferiblemente un ser humano. Estos métodos incluyen la transducción de tejidos (incluidos, pero sin limitarse a, tejidos tales como músculos, órganos tales como hígado y cerebro, y glándulas tales como glándulas salivales) con uno o más rAAV de la presente invención. La transducción puede llevarse a cabo con casetes génicos que comprenden elementos de control específicos de tejido. Por ejemplo, en el presente documento se describen métodos de transducción de células musculares y tejidos musculares dirigida por elementos de control específicos de músculo, incluidos, pero sin limitarse a, los derivados de las familias de genes de actina y miosina, tal como la familia de genes myoD (véase Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)), el factor de unión a potenciador específico de miocitos MEF-2 (Cserjesi y Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)), elementos de control derivados del gen de actina del músculo esquelético (Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)), el gen de actina cardíaca, elementos de secuencia de creatina quinasa muscular (véase Johnson et al., Mol Cell Biol, 9:3393-3399 (1989)) y el elemento potenciador de creatina quinasa murina (mCK), elementos de control derivados del gen de troponina C de contracción rápida esquelética, el gen de troponina C cardíaca de contracción lenta y el gen de la troponina I de contracción lenta: factores nucleares inducibles por hipoxia (Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)), elementos y promotores inducibles por esteroides, incluido el elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE) (véase Mader y White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)), y otros elementos de control.

El tejido muscular es una diana atractiva para la administración de ADN in vivo, porque no es un órgano vital y es de fácil acceso. La invención contempla la expresión sostenida de microdistrofina a partir de miofibras transducidas.

Por "célula muscular" o "tejido muscular" quiere decirse una célula o grupo de células derivadas de cualquier tipo de músculo (por ejemplo, músculo esquelético y músculo liso, por ejemplo del tracto digestivo, vejiga urinaria, vasos sanguíneos o tejido cardíaco). Tales células musculares pueden estar diferenciadas o no diferenciadas, tales como mioblastos, miocitos, miotubos, cardiomiocitos y cardiomioblastos.

El término "transducción" se usa para referirse a la administración/suministro de la región codificante de la microdistrofina a una célula receptora, o bien in vivo o bien in vitro, por medio de un rAAV de replicación deficiente de la invención que da como resultado la expresión de micro-distrofina por parte de la célula receptora.

Por tanto, se proporcionan métodos para administrar una dosis eficaz (o dosis, administradas esencialmente de manera simultánea o dosis administradas a intervalos) de rAAV que codifica microdistrofina a un paciente que lo necesita.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Generación del constructo pAAV.MHCK7.microdistrofina

El plásmido pAAV.MHCK7.microdistrofina contiene un casete de expresión de ADNc de microdistrofina humana flanqueado por secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2 (véase la figura 1). El constructo de microdistrofina se caracterizó por una deleción de varilla en marco (R4-R23), mientras que permanecen las bisagras 1,2 y 4 y el dominio rico en cisteína produciendo una proteína de 138 kDa. La expresión de la proteína microdistrofina (3579 pb) estaba guiada por un promotor MHCK7 (795 pb). El plásmido se construyó a partir del plásmido pAAV.MCK.microdistrofina eliminando el promotor MCK e insertando el promotor MHCK7. Después del promotor central, está presente el exón 1 de MCK de ratón endógeno de 53 pb (no traducido) para un inicio de transcripción eficiente, seguido por las señales de corte y empalme 16S/19S tardías de SV40 (97 pb) y una UTR en 5' pequeña (61 pb). El intrón y la UTR en 5' se derivan del plásmido pCMVp (Clontech). El casete de microdistrofina tenía una secuencia Kozak de consenso inmediatamente en frente del inicio de ATG y una señal de poliA sintética de 53 pb para la terminación del ARNm. El casete de microdistrofina humana contenía los dominios (R4-R23/A71-78) tal como describieron previamente Harper et al. (Nature Medicine 8, 253-261 (2002)). Se optimizaron los codones del ADN complementario para uso en seres humanos y se sintetizó por GenScript (Piscataway, NJ) (Mol Ther 18, 109-117 (2010)). Las únicas secuencias virales incluidas en este vector fueron las repeticiones terminales invertidas de AAV2, que se requieren para tanto la replicación como el empaquetamiento de ADN viral. El casete de microdistrofina tiene una señal de poliA sintética de 53 pb pequeña para la terminación de ARNm.

Estudios previos han validado la expresión cardíaca usando el promotor MHCK7 (Salva et al. Mol Ther 15, 320-329 (2007) y AAVrh74 logrando expresión en el músculo esquelético, de diafragma y cardíaco (Sondergaard et al. Annals of clinical and Transl Neurology 2, 256-270 (2015)). La secuencia del constructo de la figura 1 se encapsidó en viriones AAVrh.74. El clon molecular del serotipo AAVrh.74 se clonó a partir de un ganglio linfático de macaco rhesus y se describe en Rodino-Klapac et al. Journal of Translational medicine 5, 45 (2007).

La tabla 1 muestra las características moleculares del plásmido pAAV.MHCK7.microdistrofina (SEQ ID NO: 3)

Ejemplo 2

Estudios de expresión intramuscular usando rAAV.MHCK7.microdistrofina

Se realizaron estudios de expresión con el constructo de microdistrofina humana (rAAVrh74.MHCK7. microdistrofina; descrito en el ejemplo 1) mediante inyección intramuscular. En el músculo tibial anterior de ratones mdx (ratones mutantes para Dmdmdx espontáneos que no expresan distrofina) se inyectaron 1 * 1011 vg del casete (n=5 por grupo). Seis semanas después, se recogieron los músculos y se tiñeron para detectar la expresión de distrofina (Dys3) con un anticuerpo N-terminal para distrofina y tinción con hematoxilina y eosina (HE). La figura 2 muestra la expresión génica difusa y la reducción en núcleos ubicados centralmente con una dosis de 1 * 1011 vg en comparación con el músculo sin tratar. Además, se observó una disminución en la nucleación central con un aumento en el promedio de fibras/marco después del tratamiento con el constructo de microdistrofina. Los niveles de expresión del constructo rAAVrh74.MHCK7. microdistrofina se cuantificaron en aproximadamente el 73 %.

Además de medir la localización y los niveles de expresión de la microdistrofina, se midió la fuerza del músculo esquelético después de la inyección intramuscular del casete. La expresión intramuscular del constructo pAAV.MHCK7.microdistrofina dio como resultado una producción de fuerza absoluta y específica significativamente mayor en comparación con los controles no tratados (figuras 3A y 3B, respectivamente).

Ejemplo 3

Administración sistémica de rAAVrh.74.MHCK7.microdistrofina a ratones mdx

A cohortes de ratones mdx se les inyectó por medio de la vena de la cola o bien 2 *1012 vg (8* 1013 vg/kg) o bien dosis alta (dosis clínica planificada) 6 *1012 vg (2*1014 vg/kg) de rAAVrh.74.MHCK7.microdistrofina a las 6 semanas de edad. Después de 12 semanas de tratamiento, se recogieron todos los músculos y se tiñeron para determinar la distrofina y la restauración de componentes de DAPC. Los ratones en los que se realizaron inyecciones sistémicas (vena de la cola) mostraron altos niveles de tinción de distrofina en todos los músculos. La figura 4A representa la transducción generalizada de fibras musculares esqueléticas, de diafragma y cardíacas después de una dosis sistémica de 6*1012 vg (2 * 1014 vg/kg). La figura 4B muestra la cuantificación del porcentaje de fibras musculares que expresan microdistrofina en cada tejido. Finalmente, se sometió a prueba la mejora funcional del diafragma (figura 4C). No se observaron diferencias significativas a la dosis baja; sin embargo, hubo una mejora significativa a la dosis alta. Es importante destacar que la figura 5 demuestra que otros componentes de la DAPC se restauraron por completo después de la administración de microdistrofina. Se muestra beta-sarcoglicano (B-SG).

La toxicología/seguridad de AAVrh.74.MHCK7.microdistrofina se evaluó mediante la administración del vector por medio de inyección intravenosa (i.v.) en la vena de la cola de ratones mdx según la tabla 2. No hubo evidencia de toxicidad en ninguno de los tejidos musculares analizados, incluidos: tibial anterior (TA), gastrocnemio (GAS), cuádriceps (QD), psoas (PSO), tríceps (TRI) y diafragma (DIA) (figura 6A y 6B). El número de núcleos colocados centralmente disminuyó con la dosis alta 6*1012 vg (2 * 1014 vg/kg). Históricamente, la nucleación central de los músculos esqueléticos en ratones mdx de la misma edad no tratados es en promedio ~80 %. Finalmente, los datos preliminares de un tamaño de muestra pequeño (n=3) demuestran un nivel disminuido de liberación de CK (U/L) en suero de ratones tratados con dosis altas (D). Se usaron pruebas de t independientes para ubicar las diferencias (p<0,05); los datos se notifican como medias ± EEM.

Tabla 2. Visión general del estudio de toxicología/seguridad de rAAVrh.74.MHCK7.microdistrofina en ratones.

Ejemplo 4

Generación del constructo pAAV.MCK.microdistrofina

Se construyó el plásmido pAAV.MCK.microdistrofina insertando el casete de expresión de MCK que dirige una secuencia de ADNc de microdistrofina humana con codones optimizados en el vector de clonación psub201 de AAV (Samulski et al., J. Virol. 61(10):3096-3101). Se incluyó un elemento regulador específico de músculo en el constructo para dirigir la expresión génica específica del músculo. Este elemento regulador comprendía el potenciador central de MCK de ratón (206 pb) fusionado con el promotor central de MCK de 351 pb (proximal). Después del promotor central, el constructo comprende el exón 1 de ^mC^kde ratón endógeno de 53 pb (no traducido) para un inicio de transcripción eficiente, seguido por las señales de corte y empalme 16S/19S tardías de SV40 (97 pb) y una 5'UTR pequeña (61 pb). El intrón y la UTR en 5' se derivaron del plásmido pCMVp (Clontech). El casete de microdistrofina tiene una secuencia Kozak de consenso inmediatamente en frente del inicio de ATG y una señal de poliA sintética de 53 pb para la terminación del ARNm. El casete de micro-distrofina humana contiene los dominios (R4-R23/A71-78) tal como se describieron previamente Harper et al. Nat. Med. 8(3):253-61, 2002

El plásmido pAAV.MCK.microdistrofina contenía el casete de expresión de ADNc de microdistrofina humana flanqueado por secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2 (véase la figura 7). Esta secuencia se encapsidó en viriones de AAVrh.74. El clon molecular del serotipo AAVrh.74 se clonó a partir de un ganglio linfático de macaco rhesus y se describe en Rodino-Klapac et al. Journal of Tran. Med. 45 (2007).

Ejemplo 5

Análisis de potencia y dosis usando rAAV.MCK.microdistrofina

Se realizaron estudios de expresión con el constructo de microdistrofina humana (rAAV.MCK.microdistrofina; descrito en el ejemplo 1) mediante inyección intramuscular. En el músculo tibial anterior (TA) de ratones mdx (ratones mutantes para Dmdmdx espontáneos que no expresan distrofina) se inyectaron 3 * 109, 3 * 1010 o 1 * 1011 vg (n=3 por grupo). Cuatro semanas más tarde, se recogieron los músculos y se tiñeron para detectar la expresión de distrofina usando un anticuerpo específico para Dys3 N-terminal y tinción con hematoxilina y eosina (HE). La figura 8 muestra una correlación lineal entre la expresión y la dosis donde hay muy poca expresión (nivel sin efecto) a 3 * 109 vg y un 89 % de expresión a 1 * 1011 vg.

Ejemplo 6

Administración vascular de rAAV.MCK.microdistrofina a ratones mdx

Usando un modelo de perfusión de extremidades aisladas (Rodino-Klapac et al., J. Trans. Med. 5(45): 1-11, 2007), se les inyectó a ratones mdx (n=10) 1 * 1011 vg de rAAVrh.74.MCK.microdistrofina por medio de la arteria femoral y se realizó el análisis de los resultados. Tres meses después de la transferencia génica, se recogieron los músculos de las extremidades inferiores y los estudios de eficacia demostraron una mejora significativa tanto en la fuerza como en la resistencia a la lesión inducida por contracción excéntrica (figura 9).

La inmunotinción de la proteína distrofina en el músculo extensor largo de los dedos (EDL) y el músculo TA muestra expresión en miofibras de mdx después del tratamiento con rAAVrh.74-MCK-microdistrofina (figura 9A). Se tiñó el músculo infectado de manera simulada de una manera idéntica y las exposiciones se igualaron en el tiempo. La figura 9B demostró que rAAVrh.74-MCK-microdistrofina aumentó significativamente la fuerza específica normalizada en relación con músculos de mdx tratados de manera simulada (P<0,05 frente a mdx). Además, los músculos de mdx infectados con rAAVrh.74-MCK-microdistrofina (humana) se compararon con músculos EDL de mdx contralaterales infectados de manera simulada (azul) y músculos EDL de tipo natural (WT C57Bl/10) para la caída de fuerza durante contracciones excéntricas repetitivas a las 12 semanas después de la transferencia génica (figura 9C). Se encontró que el tratamiento con rAAVrh.74-MCK-microdistrofina (microdis) protegió significativamente contra la pérdida de fuerza en comparación con los músculos de mdx tratados de manera simulada (P < 0,001 frente a mdx).

Ejemplo 7

Estudios con primates

Con el fin de aplicar los hallazgos preclínicos en ratones a un paradigma clínico, se administró una dosis sistémica a un primate no humano (NHP) para evaluar la seguridad y la eficacia para futuros ensayos clínicos. Se estudió el efecto de una dosis total de 2*1014 vg de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina.FLAG administrada por vía intravenosa a través de la vena cefálica en un primate no humano. Esta dosis era proporcional (basándose en el peso del animal) a la dosis sistémica administrada a ratones y correspondía a la dosis media (dosis total de 6,0*1012 vg) administrada a ratones.

Se llevaron a cabo estudios químicos e inmunológicos basales, incluido análisis de ensayo de puntos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISpot), para medir las células T frente a la cápside y la microdistrofina de AAVrh.74, así como los títulos de anticuerpos anti-AAV. Se usaron tres grupos de péptidos para la proteína de la cápside de AAVrh.74 (Genemed Synthesis, San Antonio, TX) que contenían 34-36 péptidos, cada uno de 18 aminoácidos de longitud y superpuestos por l1 residuos. Cuatro grupos de péptidos que abarcan la proteína microdistrofina.FLAG (Genemed Synthesis) cada uno de 18 aminoácidos de longitud y superpuestos por 11 residuos. La concanavalina A (ConA) (Sigma, 1 |jg/ml) sirvió como control positivo y dimetilsulfóxido (DMSO) al 0,25 % como control negativo. Estos estudios se repitieron cada dos semanas durante todo el estudio. Tres meses después del tratamiento, los animales se sacrificaron para obtener una necropsia completa del tejido. Los ensayos inmunológicos no mostraron ninguna respuesta inesperada a la cápside o al transgén por ELISpot (figura 12A) ni respuestas inesperadas de anticuerpos a la cápside de AAVrh74 por ELISA (figura 12B).

Además, los paneles completos de hemograma y análisis bioquímico de la sangre mostraron una ligera elevación de las enzimas hepáticas que se normalizaron de nuevo al nivel basal sin necesidad de intervención o tratamiento, como se muestra en la tabla 3 a continuación.

Tabla 3

No hubo otros valores químicos inesperados a lo largo de la duración del estudio. Finalmente, un análisis completo de todos los músculos esqueléticos demostró una expresión generalizada en las fibras musculares a través de la tinción de inmunofluorescencia con un anticuerpo específico de FLAG y la detección por inmunotransferencia de tipo western usando un anticuerpo monoclonal de ratón frente a la distrofina (figuras 14A, B).

Los datos conjuntos demuestran que la administración sistémica de AAVrh74.MHCK7.microdistrofina.FLAG estableció la seguridad y la eficacia con una expresión generalizada en todos los músculos esqueléticos en un primate no humano.

Ejemplo 8

Estudio preclínico para demostrar la eficacia

Se llevó a cabo un estudio preclínico para demostrar la eficacia de la administración sistémica de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina en el tratamiento de los déficits del músculo esquelético y cardíaco en ratones mdx. Para este estudio, se usó el vector AAVrh74 que contiene un transgén de microdistrofina humana con codones optimizados dirigido por un promotor específico de músculo y corazón, MHCK7, tal como se describe en el ejemplo 1.

Se usaron inyecciones sistémicas de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina por medio de la vena de la cola en ratones mdx (nulos para distrofina) para un estudio de respuesta a la dosis. Los resultados de este estudio demostraron que inyecciones sistémicas en ratones mdx fueron eficaces para normalizar los resultados histológicos y funcionales medidos en las extremidades y el diafragma de manera dependiente de la dosis. Además, no se notificó toxicidad significativa asociada con el vector después de una revisión histopatológica formal realizada por un patólogo veterinario certificado por la junta.

El vector para este estudio se produjo por el Nationwide Children's Hospital Viral Vector Core utilizando un método de transfección triple de células HEK₂93, en condiciones de grado de investigación. La caracterización del vector después de la producción incluyó la determinación del título por qPCR con un patrón superenrollado, la determinación del nivel de endotoxinas (UE/mL) y una evaluación de la esterilidad. El vector producido se analizó mediante SDS-PAGE para verificar la consistencia del patrón de bandas con el rAAV esperado. El vector se produjo usando un plásmido que contenía el constructo de microdistrofina, un promotor MHCK7 específico de músculo para dirigir la expresión, una secuencia Kozak de consenso (CCACC), un intrón quimérico de SV40, un sitio de poliadenilación sintético (53 pb) (figura 1). El casete de expresión de microdistrofina se clonó entre las ITR de AAV2 empaquetado en un vector AAVrh74 para la transducción potenciada del tejido esquelético y cardíaco.

La determinación de la potencia del artículo de prueba rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina se logró realizando inyecciones intramusculares del vector en ratones mdx. Ratones de tipo natural sirven como control positivo y la inyección de Ringer con lactato estéril en ratones mdx sirve como control negativo.

Tabla 4: Resumen del diseño del estudio de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina

6 eses t as a yeccó Se ea a o ec opsas de os ato es de co t o a os eses de edad y eses de edad

Los animales indicados en la tabla 4 recibieron dosis a la edad indicada (4-5 semanas de edad) con una inyección en la vena de la cola para la administración sistémica. Para realizar una dosificación precisa con una inyección intramuscular, los animales se anestesiaron brevemente mediante inhalación de isoflurano. Las dosis se administraron mediante inyección directa en el músculo tibial anterior de la extremidad inferior trasera. No se requirió anestesia para una dosificación precisa con administración sistémica. Las dosis se administraron por la vasculatura a través de la vena de la cola. Se tuvo cuidado de depositar con precisión toda la dosis de vector en el vaso. Después de realizar la dosificación, los animales se colocaron en una almohadilla térmica hasta que recuperaron el movimiento espontáneo y luego se devolvieron a la jaula. Las observaciones de cada animal se realizaron semanalmente durante toda la duración del estudio.

A la edad apropiada, tal como se indica en la tabla 4, los ratones recibieron una sobredosis de mezcla de ketamina/xilazina (200 mg/kg/20 mg/kg). Se recogió sangre a través de una punción cardíaca y la sangre completa se envió para un análisis de hemograma completo (CBC) y el suero se almacenó a -80 ° C hasta que Charles Rivers Laboratory analizó la química del suero. A continuación, se recogieron los tejidos y se enviaron para su análisis por parte de un histopatólogo veterinario independiente e interno.

La administración intramuscular de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina a ratones nulos para distrofina a una dosis total de 1*1011 vg dio como resultado una expresión de distrofina de ~70 % en los músculos TA inyectados. La obtención de imágenes de inmunofluorescencia del ratón al que se le dosificó el vector confirmaron la expresión del gen de la microdistrofina.

Restauración de la expresión de distrofina tras el tratamiento sistémico con rAAVrh74.MHCK7.microd¡strof¡na

La determinación de la eficacia del artículo de prueba rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina se logró realizando inyecciones sistémicas en ratones mdx (genotipo: C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J) usando aumento de la dosis a dosis baja, media y alta (dosis total de 2,0*1012 vg; dosis total de 6,0*1012; dosis total de 1,2*1013 vg) para evaluar la expresión transgénica y la eficacia del vector cuando se administró de manera sistémica en los puntos de tiempo de 3 y 6 meses tras la inyección. Se les inyectó a los ratones a las 4-5 semanas de edad y se realizó una necropsia completa a tanto 3 como 6 meses tras la inyección. Basándose en los pesos medios de los animales por grupo, estas dosis equivalen a: 8*1013 vg/kg, 2*1014 vg/kg y 6*1014 vg/kg. La inyección de un volumen igual de Ringer con lactato sirvió como control negativo. La inyección de un volumen igual de Ringer con lactato en ratones C57BL/6 sirvió como control positivo. La seguridad se determinó realizando inyecciones sistémicas en ratones WT a una dosis de dosis total de 6,0 *1012 vg (denotado como grupo de dosis media W^tTX). Se llevó a cabo una tinción de inmunofluorescencia de los músculos esqueléticos tibial anterior (TA), gastrocnemio (GAS), cuádriceps (QUAD), glúteo (GLUT), psoas, tríceps (TRI), diafragma (DlA) y corazón para determinar la restauración de la distrofina y para garantizar la eficacia del vector viral de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina.

Se extrajeron los músculos esqueléticos (TA, QUAD, GLUT, TRI), junto con el corazón y el diafragma, para su análisis. También se extrajeron órganos para estudios de toxicología y biodistribución. La expresión del transgén de microdistrofina se mantuvo alta después de 3-6 meses de tratamiento. Esto se acompañó de una histopatología muscular mejorada y una función mejorada sin efectos adversos en órganos no diana.

Reversión del fenotipo distrófico en ratones mdx tratados de manera sistémica con rAAVrh74■MHCK7■m¡crod¡strof¡na

Se llevó a cabo la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de músculos esqueléticos, diafragma y corazón para determinar la reversión y la mejora de la patología distrófica tras la inyección sistémica de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina a una dosis total de 2*1012 vg (dosis baja; n=1), dosis total de 6*1012 vg (dosis media; n=8) y dosis total de 1,2*1013 vg (dosis alta; n=8) para cada dosis con eutanasia 12 semanas tras la inyección. A las 24 semanas tras la inyección, se evaluó una segunda cohorte de animales tratados con una dosis media (dosis total de 6*1012 vg) para determinar la reversión y la mejora de la patología de distrofina (n=5).

Se usó tinción de inmunofluorescencia para la proteína microdistrofina humana para determinar la expresión transgénica de microdistrofina en los lados izquierdo y derecho de seis músculos esqueléticos (TA, GAS, QUAD, GLUT, psoas, TRI), así como el diafragma y el corazón en todos los ratones nulos para distrofina en los que se inyectó el vector de microdistrofina. Se llevó a cabo esto para determinar la restauración de la distrofina y garantizar la eficacia del vector viral de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina a una dosis total de 2*1012 vg (dosis baja; n=2), dosis total de 6*1012 vg (dosis media; n=8) y dosis total de 1,2*1013 vg (dosis alta; n=8) para cada dosis con eutanasia 12 semanas tras la inyección.

Con el fin de evaluar la eficiencia de expresión y transducción, se utilizaron para la cuantificación imágenes de las tres cohortes de dosificación y de los lados derecho e izquierdo de cada músculo. Se tomaron cuatro imágenes 20X de cada músculo y se determinó el porcentaje de fibras positivas para microdistrofina para cada imagen, lo que dio como resultado el porcentaje de transducción promedio para cada músculo. Las figuras 14 y 15 presentan imágenes representativas de ratones tratados con la dosis media (6*1012vg; 2*1014vg/kg) y la dosis alta (1,2*1013 vg; 6*1014vg/kg). Se incluyeron ratones nulos para distrofina a los que se les inyectó Ringer con lactato y de edad coincidente como control negativo y se incluyeron ratones de tipo natural a los que se les inyectó Ringer con lactato como controles positivos. El corazón demostró >75 % en todos los animales analizados.

Los músculos de los animales no tratados presentaron una miopatía generalizada que incluía infiltración grasa, nucleación central, fibrosis y áreas focales de necrosis. La tinción con H&E en la figura 16 y la figura 17 ilustra este fenotipo distrófico en ratones nulos para distrofina en comparación con ratones WT normales y la mejora de la patología muscular después del tratamiento con o bien la dosis media (6*1012 vg; 2*1014 vg/kg) o bien la dosis alta (1,2*1013 vg; 6*1014 vg/kg). La cuantificación de los parámetros histológicos mostró una reducción en la nucleación central (figura 18) y una normalización de los diámetros promedios de las fibras (figuras 16 y 17) en ratones tratados en todos los músculos de manera dependiente de la dosis. La tinción con Sirius Red demostró una reducción en la deposición de colágeno en el diafragma en las cohortes de dosis media y alta en comparación con las cohortes no tratadas (mdx LR) (figura 19).

Evaluación funcional del tratamiento sistémico con rAAVrh74■MHCK7■m¡crod¡strof¡na

Para determinar si la transferencia del gen de microdistrofina proporcionó un beneficio de fuerza funcional al músculo enfermo, se evaluaron las propiedades funcionales tanto del diafragma como del tibial anterior de ratones mdx, ratones WT y ratones a los que se les dosificó el vector a tres niveles de dosis. El aumento de la dosis incluyó dosis baja (8*1013 vg/kg), dosis media (2*1014 vg/kg) y dosis alta (6*1014 vg/kg). Se utilizó la evaluación funcional del tratamiento sistémico con rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina usando la evaluación ex vivo de la fuerza específica y la disminución de la producción de fuerza después de contracciones excéntricas en el TA 24 semanas después de la inyección en animales en los que se inyectó de manera sistémica rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina a una dosis total de 6*1012 vg (dosis media). Además, se evaluó la producción de fuerza específica en el diafragma en los mismos animales.

Como se explica resumidamente en las figuras anteriores, la histopatología presentó un entorno más normalizado con mejoras en la nucleación central, la deposición de colágeno y el tamaño de las fibras en las dosis media y alta. La administración de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina en la vena de la cola condujo a una mejora gradual en la producción de fuerza específica en el diafragma (176,9 mN/mm2 en el grupo de dosis media frente a 227,78 mN/mm2 en el grupo de dosis alta). Además, la cohorte tratada a largo plazo representa ratones 6 meses después de la inyección (dosis media 2*1014 vg/kg) y no hubo desviación en la producción de fuerza del diafragma a largo plazo (176,9 mN/mm2 frente a 194,9 mN/mm2) (figura 20).

Además, se observaron déficits funcionales en el músculo tibial anterior en ratones mdx en comparación con ratones WT. Los ratones Mdx demostraron una disminución del 50 % en la producción de fuerza en comparación con los ratones WT (171,3 mN/mm2 frente a 291,65 mN/mm2) y mayor pérdida de fuerza después de las contracciones excéntricas (32 % de pérdida en mdx; 5 % de pérdida en WT). La administración sistémica del nivel de dosis media de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina dio como resultado un 65,5 % de distrofina en el músculo tibial anterior y la restauración de la producción de fuerza específica que mejoró hasta 235,4 mN/mm2 y protegió al músculo del daño por contracción excéntrica repetida con solo un 25 % de disminución de la fuerza (figura 21). El grupo de dosis media WT representa una cohorte tratada de tipo natural para demostrar la ausencia de toxicidad y el mantenimiento de las medidas de resultado funcionales después del tratamiento con el vector.

Resumen

Después de la demostración inicial de biopotencia por inyección intramuscular, se logró una restauración comparable o mayor de microdistrofina con administración vascular mientras se transducían los músculos esqueléticos, el diafragma y el corazón. La eficacia demostró la reversión de las características distróficas de una manera dependiente de la dosis mediante la reducción de la inflamación, menos fibras degeneradas y una mejor recuperación funcional al proteger contra las contracciones excéntricas en el tibial anterior y el diafragma. Los beneficios funcionales del vector incluyen una mejora gradual hasta los niveles de tipo natural en la generación de fuerza del diafragma y el TA.

Ejemplo 9

Toxicología y biodistribución del tratamiento sistémico con rAAVrh74.MHCK7.microd¡strof¡na

Se recogieron órganos y tejidos de ratones mdx que recibieron una inyección sistémica de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina para la PCR cuantitativa en tiempo real para detectar secuencias específicas de ADN de vector. Las proteínas extraídas de todos los órganos y tejidos recogidos se procesaron en inmunotransferencia de tipo Western para detectar microdistrofina en órganos no diana.

Se administró el artículo de prueba a tres niveles de dosis: dosis baja (2 * 1012 vg; 8 * 1013 vg/kg), media (6 * 1012 vg; 8 x 1014vg/kg) y alta (1,2 * 1013 vg; 6 * 1014vg/kg) por vía intravenosa a las 4-5 semanas de edad. Para evaluar la seguridad del vector, se realizó tinción con H&E en criosecciones de tejido muscular y todos los órganos principales extraídos de las mismas cohortes de ratones descritas anteriormente. También se incluyeron órganos y músculos de ratones C57BL6 WT tratados de manera sistémica con el vector a la dosis media. También se incluyeron ratones mdx y WT tratados con Ringer con lactato para el análisis histopatológico. La toxicidad de estas secciones la revisó formalmente un patólogo veterinario externo certificado por la junta y no se detectaron efectos adversos en ninguna muestra de ninguno de los ratones; los resultados se resumen a continuación.

Los detalles del grupo y el diseño del estudio se muestran en 4 a continuación.

Tabla 5: Diseño del estudio de seguridad de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina

Revisión histopatológica de tejido transducido con vector

La inyección IV de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina no provocó ningún cambio microscópico en las miofibras de ningún músculo esquelético examinado. Además, no se observaron lesiones relacionadas con el tratamiento en ninguno de los tejidos evaluados histológicamente. Cualquier cambio observado se observó tanto en los ratones tratados como en los de control y se consideró un hallazgo incidental. En conjunto, estos datos indican que este artículo de prueba se toleró bien por los sujetos de prueba. Además, en relación con muestras de referencia de ratones mdx no tratados de edad coincidente, la administración de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina disminuyó la atrofia de miofibras en ratones mdx tratados, mostrando así que el artículo de prueba puede mejorar el grado de miopatía asociada con las deficiencias de mdx.

Además de la revisión de ratones mdx enfermos tratados de manera sistémica con el vector, se administró rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina de manera sistémica a cinco ratones C57BL/6 WT a una dosis idéntica a la dosis mínimamente eficaz (MED) establecida en los estudios anteriores en ratones mdx, dosis total de 6*1012 vg (2*1014 vg/kg). Esto permitió el estudio de la administración intravenosa del artículo de prueba en ratones WT sanos para determinar de manera más definitiva si se producen efectos adversos únicamente debido al tratamiento. En este caso, nuevamente, se extrajeron una variedad de músculos esqueléticos, incluido el diafragma, junto con el corazón y otros cinco órganos, y un patólogo veterinario independiente revisó formalmente las secciones H&E de cada tejido.

Biodistribucion del genoma del vector

La presencia de secuencias de ADN específicas del artículo de prueba se examinó mediante un ensayo de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). El análisis de biodistribución se realizó en muestras de tejido recogidas de tres animales mdx a los que se les dosificó vector por nivel de dosis. Una señal positiva era igual o superior a 100 copias de ADN monocatenario/|jg de ADN genómico detectado. Los tejidos se recogieron en la necropsia y se utilizaron conjuntos de sondas de cebadores específicos de vector específicos para secuencias del promotor MHCK7. La figura 22 y la tabla 6 a continuación representan las copias del genoma del vector detectadas en cada muestra de tejido de ratones en los que se inyectó rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina.

Tabla 6: Número de copias del genoma del vector en órganos y músculos de tres ratones mdx a los que se les dosificó el vector por nivel de dosis. Los valores se muestran en vg/^g de ADN genómico.

Se detectó el transcrito de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina en niveles variables en todos los tejidos recogidos. Como era de esperar, los niveles más altos se observaron en el músculo esquelético y el corazón. Los niveles más bajos se detectaron en las gónadas, el pulmón, el riñón y el bazo. Estos datos indican que el artículo de prueba se administró de manera eficiente en todos los tejidos investigados de ratones a los que se les dosificó el vector.

Como indican los resultados de qPCR anteriores, la administración intravenosa de rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina dio como resultado la distribución del transcrito del vector a niveles variables en la mayoría de los tejidos, apareciendo los niveles más altos en el hígado, el corazón y el músculo cuádriceps (dosis media) y el hígado, corazón y músculo gastrocnemio (dosis alta). Por lo tanto, el objetivo de esta parte del estudio fue determinar la expresión proteica del transgén de microdistrofina humana en estos tejidos para garantizar la funcionalidad del promotor MHCK7 específico de músculo. Se usó inmunotransferencia de tipo Western para detectar la expresión de microdistrofina en las muestras de tejido.

La expresión de proteínas y la biodistribución del vector también se evaluaron mediante qPCR e inmunotransferencia de tipo Western (figura 23), y estos datos indican niveles normales de vector en órganos no diana y detección mínima de proteína microdistrofina en los hígados tratados con dosis altas. Estos resultados se correlacionaron con la ausencia de toxicidad determinada por el patólogo en el hígado. Además, se analizaron las químicas séricas por un CRO independiente (Charles River Laboratories) que indican valores normales en todas las químicas analizadas. Hubo tres valores anómalos en la enzima hepática AST, 2 de los cuales se demostraron en el grupo de mdx-LR y 1 en el grupo de dosis media (figura 23). Un subconjunto de animales se sometió a análisis de creatina quinasa (CK); sin embargo, las muestras se analizaron antes y después de la evaluación fisiológica. El análisis del suero corrobora la falta de toxicidad después de la administración del artículo de prueba.

Se observó expresión de la proteína microdistrofina en cantidades variables en todas las muestras de músculo esquelético, así como en muestras de corazón (figura 24). Sin embargo, se detectó una proteína mínima en las cohortes con dosis altas en el hígado. Se cree que esto es un resultado benigno y podría ser que la presencia en el hígado se deba a la expresión en el músculo liso del hígado. Es importante destacar que no hubo efectos histopatológicos adversos indicados por el informe del patólogo independiente en el hígado.

Resumen

La revisión histopatológica concluyó que la cohorte de mdx-LR presentaba una miopatía generalizada que afectaba a los siete músculos esqueléticos evaluados, así como a la pared del ventrículo derecho del corazón. Los hallazgos principales de la revisión histopatológica incluyeron atrofia de miofibras pronunciada y generalizada (el 30-75 % del tamaño normal de miofibras), inflamaciones de células mononucleares mínimas a leves, aumento del espacio intersticial y aumento de los depósitos minerales citoplasmáticos. El diafragma presentó los cambios más marcados en la infiltración de células mononucleares y la atrofia de miofibras. El corazón presentó algunos focos pequeños de acumulación mínima de células mononucleares en el miocardio ventricular. Las cohortes en las que se dosificó el vector habían reducido sustancialmente la miopatía en todos los tejidos esqueléticos y el corazón. Las reducciones en los hallazgos histopatológicos fueron dependientes de la dosis y el grupo de dosis alta tuvo una degeneración e inflamación sustancialmente menores. No hubo efectos adversos debido al tratamiento del vector con rAAVrh74.MHCK7.microdistrofina como se documentó en la cohorte tratada con WT y las cohortes mdx en las que se dosificó el vector. Hubo hallazgos incidentales en el hígado y el pulmón de ratones mdx y WT, independientemente del tratamiento, en los que los ratones presentaron vacuolación leve del citoplasma de hepatocitos. Por tanto, el artículo de prueba era seguro, eficaz y el efecto protector dependía de la dosis.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector de AAVrh.74 recombinante que comprende un promotor/potenciador específico de músculo MHCK7 operativamente unido a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, en donde el vector de AAVrh.74 recombinante comprende una repetición terminal invertida (ITR) de AAV2 en 5', el promotor/potenciador específico de músculo MHCK7, un intrón de SV40, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, una señal de poliadenilación (PoliA) sintética y una ITR deAAV2 en 3'.

2. El vector de AAVrh.74 recombinante de la reivindicación 1, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos expuesta como nucleótidos 7-5042 de SEQ ID NO: 3.

3. Una composición que comprende el vector de AAVrh.74 recombinante de la reivindicación 1 o 2, y un portador farmacéuticamente aceptable.

4. El vector de AAVrh.74 recombinante de la reivindicación 1 o 2 o la composición de la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular en un sujeto que lo necesita.

5. El vector de AAVrh.74 recombinante de la reivindicación 1 o 2 o la composición de la reivindicación 3 para su uso en la reducción o la prevención de la fibrosis en un sujeto que padece distrofia muscular.

6. El vector de AAVrh.74 recombinante o composición para su uso según la reivindicación 4 o 5, en donde el sujeto padece distrofia muscular de Duchenne.

7. El vector de AAVrh.74 recombinante o composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde el vector de AAVrh.74 recombinante o composición se administra mediante inyección intramuscular o inyección intravenosa.

8. El vector de AAVrh.74 recombinante o composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde el vector de AAVrh.74 recombinante o composición se administra de manera sistémica.