JP2021527418A - ジストログリカノパチーおよびラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス生成物および方法 - Google Patents

Abstract

ジストログリカノパチーおよびラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための生成物および方法が提供される。この方法では、ヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢＥＧＦ）のヘパリン結合ドメインなどのリンカードメインを含むタンパク質が患者に送達される。ジストログリカノパチーおよびラミニン欠損筋ジストロフィーなどのＣＭＤの治療のための方法および生成物が本明細書で提供される。生成物には、治療用タンパク質および開示される治療用タンパク質をコードするｒＡＡＶが含まれる。

Description

本出願は、２０１８年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／６８６，５２２号の優先権を主張し、この仮特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、本開示の別個の部分として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、ファイル名：５３１４７Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：１２５，４３９バイト、作成：２０１９年６月１８日として認識されるコンピュータ可読形態の配列表を含む。

ジストログリカノパチーおよびラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための生成物および方法が提供される。この方法では、ヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢＥＧＦ）のヘパリン結合ドメインなどのリンカードメインを含むタンパク質が患者に送達される。このリンカータンパク質は、導入遺伝子を筋肉細胞の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対して標的化するのに役立つ。

筋ジストロフィー（ＭＤ）は遺伝性疾患のグループである。このグループは、動作を制御する骨格筋の進行性の衰弱および変性を特徴とする。ＭＤのいくつかの形態は乳児期または小児期に発症するが、他の形態は中年以降まで現れない場合がある。障害は、筋力低下の分布および程度（ＭＤのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす）、発病年齢、進行速度、ならびに遺伝形式の点で異なる。

先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）は、筋肉の構造成分の喪失が新生児の筋緊張低下および進行性の骨格筋の衰弱をもたらすＭＤのグループを表す。これらの障害は、脳および眼の発達障害、認知障害、発作、ならびに呼吸器および心臓の異常を含む重大な筋肉外合併症に関連していることが多く、学際的なチームによる定期的な医学的管理が必要である。ＣＭＤの推定発生率は、世界中で２１，５００人の出生に１人である。これらの障害の重大さにもかかわらず、現在、承認された効果的な療法はない。ジストログリカノパチーおよびメロシン欠損ＣＭＤ１Ａ型（ＭＤＣ１Ａ）は、ＣＭＤの最も一般的な形態のうちの２つである［Ｓｆｒａｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ．，２７（９）：７９３−８０３（２０１７）］。

ジストログリカノパチーは、α−ジストログリカンのグリコシル化に必要な１８以上の遺伝子のうちのいずれかにおける変異によって引き起こされる。適切なグリコシル化により、α−ジストログリカンが細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の要素に結合することができる。次に、α−ジストログリカンは、膜貫通タンパク質であるβ−ジストログリカンに結合することにより、筋鞘に固定される。感受性遺伝子の数により、ジストログリカノパチーのための単一の遺伝子置換療法の開発は不可能である。ジストログリカノパチーの例には以下が含まれる。ウォーカー・ワールブルグ症候群（ＷＷＳ）は、Ｂ３ＧＬＮＴ２、Ｂ４ＧＡＴ１、ＤＡＧ１、ＦＫＲＰ、ＦＫＴＮ、ＧＭＰＰＢ、ＩＳＰＤ、またはＬＡＲＧＥにおける遺伝子変異を伴う。筋眼脳病（ＭＥＢ）は、Ｂ３ＧＬＮＴ２、Ｂ４ＧＡＴ１、ＤＡＧ１、ＦＫＲＰ、ＦＫＴＮ、ＧＭＰＰＢ、ＩＳＰＤ、またはＬＡＲＧＥにおける遺伝子変異を伴う。福山型ＣＭＤは、ＦＫＴＮ遺伝子における変異を伴う。認知障害を伴う先天性筋ジストロフィーのグループは、ＦＫＲＰ、ＬＡＲＧＥ、ＰＯＭＴ１、ＰＯＭＴ２、またはＰＯＭＧＮＴ１における変異に起因する。認知障害のないＣＭＤのグループは、ＦＫＲＰまたはＦＫＴＮの遺伝子変異の結果である。肢帯型筋ジストロフィーＬＧＭＤ２Ｉ、２Ｋ、２Ｍ、２Ｎ、および２Ｏは、ＦＫＲＰ、ＦＫＴＮ、ＰＯＭＧＮＴ１、ＰＯＭＴ１、またはＰＯＭＴ２における遺伝子変異を伴うグリコシル化異常に関連する。肢帯型筋ジストロフィーＬＧＭＤ２Ｔおよび２Ｕは、それぞれＧＭＰＰＢおよびＩＳＰＤにおける遺伝子変異の結果である。ジストログリカノパチーにおける他の変異遺伝子には、ＤＯＬＫ、ＤＰＭ１、ＤＰＭ２、ＤＰＭ３、ＧＴＤＣ２／ＡＧ０６１、ＴＭＥＭ５、およびＳＫ１９６が含まれる。

ＭＤＣ１Ａは、筋鞘でグリコシル化されたα−ジストログリカンに結合する重要なＥＣＭタンパク質であるラミニン−α２をコードするＬＡＭＡ２遺伝子における変異によって引き起こされる。完全なＬＡＭＡ２遺伝子の長さは、９，０００塩基対を超える。

Ｒｅｉｎｈａｒｄおよび同僚による研究［Ｒｅｉｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．，９（３９６），（２０１７）］は、ラミニン−α４およびミニアグリンからの融合ドメインの生殖系列発現を伴い、ＭＤＣ１ＡのｄｙＷ／ｄｙＷマウスモデルにおける疾患症状を不完全に寛解させた。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が既知である。例えば、ＡＡＶ−１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ−２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４（１９８３）に提供されており、ＡＡＶ−３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ−４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ−５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ−６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも部分は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供されており、ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７−７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５−３８３（２００４）に提供されており、ＡＡＶ−１２ゲノムの部分は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ８１３６４７に提供されており、ＡＡＶ−１３ゲノムの部分は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＵ２８５５６２に提供されている。ＡＡＶｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，４３４，９２８号に提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）が生成される。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）においてレビューされる。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド内のクローニングされたＤＮＡとして挿入される。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムカプシド形成を指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、内部約４．３ｋｂのゲノム（複製および構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ−ｃａｐ）の一部またはすべてが、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃〜６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
ジストログリカノパチーおよびＭＤＣ１ＡなどのＣＭＤの治療に対する当該技術分野の必要性は依然として残っている。

Ｓｆｒａｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ．，２７（９）：７９３−８０３（２０１７） Ｒｅｉｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．，９（３９６），（２０１７） Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５−５６４（１９８３）

ジストログリカノパチーおよびラミニン欠損筋ジストロフィーなどのＣＭＤの治療のための方法および生成物が本明細書で提供される。生成物には、治療用タンパク質および開示される治療用タンパク質をコードするｒＡＡＶが含まれる。

ａ）ヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢＥＧＦ）のヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトラミニンアルファ２（ＬＡＭＡ２）遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｃ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｄ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｅ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメイン、または
ｆ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメインを含むタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドが提供される。

一実施形態では、提供されるポリヌクレオチドはタンパク質をコードし、タンパク質の第１のドメインは、配列番号１３または配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされ、タンパク質の第２の第２のドメインは、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる。

例えば、提供されるポリヌクレオチドは、配列番号１３および配列番号１５のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１３および配列番号１６のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１４および配列番号１５のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１４および配列番号１６のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１３および配列番号１７のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１４および配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、次のうちの１つ：ｉ）図３に示されるヌクレオチド配列、ｉｉ）図３に示されるヌクレオチド１４〜３２３５を含むヌクレオチド配列、ｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、またはｉｖ）配列番号１９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

別の実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、次のうちの１つ：ｉ）図４に示されるヌクレオチド配列、ｉｉ）図４に示されるヌクレオチド１４〜３３６１を含むヌクレオチド配列、ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列、またはｉｖ）配列番号２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

さらなる実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、次のうちの１つ：ｉ）図５に示されるヌクレオチド配列、ｉｉ）図５に示されるヌクレオチド１４〜１９３０を含むヌクレオチド配列、ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列、またはｉｖ）配列番号２１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

別の実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、次のうちの１つ：ｉ）図６に示されるヌクレオチド配列、ｉｉ）図６に示されるヌクレオチド１４〜２０５６を含むヌクレオチド配列、ｉｉｉ）配列番号７のヌクレオチド配列、またはｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、次のうちの１つ：ｉ）図７に示されるヌクレオチド配列、ｉｉ）図７に示されるヌクレオチド１４〜１３６０を含むヌクレオチド配列、ｉｉｉ）配列番号９のヌクレオチド配列、またはｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

別の実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、次のうちの１つ：ｉ）図８に示されるヌクレオチド配列、ｉｉ）図８に示されるヌクレオチド１４〜１４８６を含むヌクレオチド配列、ｉｉｉ）配列番号１１のヌクレオチド配列、またはｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

提供されるポリヌクレオチドのいずれかによってコードされる治療用タンパク質も提供される。例えば、提供されるタンパク質は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４のアミノ酸配列を含む。

加えて、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む組換え宿主細胞を提供する。例示的な実施形態では、宿主細胞、ポリヌクレオチドは、転写制御因子に作動可能に連結されており、これらの宿主細胞は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれかを発現する。例えば、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒトＨＥＫ２９３細胞である。

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）がさらに提供され、ｒＡＡＶのゲノムは、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む。例えば、ｒＡＡＶが提供され、ｒＡＡＶのゲノムは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、または配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含む。例示的な実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ＣＭＶプロモーター（配列番号１８）、ＭＣＫ、ＮＨＣＫ、ＬＡＭＡ２、またはｔＭＣＫなどの筋肉特異的転写制御因子をさらに含む。本明細書に記載のｒＡＡＶのいずれも、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ６カプシドを含む。

ｒＡＡＶも提供され、ｒＡＡＶのゲノムは、配列番号２のヌクレオチド３５９０〜８２１５、配列番号４のヌクレオチド３５９０〜８３４１、配列番号６のヌクレオチド３６０９〜６９２９、配列番号８のヌクレオチド３５９０〜７０３６、配列番号１０のヌクレオチド３５９０〜６３４０、配列番号１２のヌクレオチド３５９０〜６０４９、図１３に示されるヌクレオチド配列、または図１４に示されるヌクレオチド配列を含む。

本明細書に記載のｒＡＡＶのいずれかを含むｒＡＡＶ粒子も提供される。本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか、本明細書に開示されるｒＡＡＶのいずれか、本明細書に開示されるｒＡＡＶ粒子のいずれか、または本明細書に開示されるタンパク質のいずれかを含む組成物を提供する。

ラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための方法が提供され、これには、治療を必要とする患者にｒＡＡＶを投与することが含まれ、ｒＡＡＶのゲノムは、
ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｃ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、または
ｄ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、を含むタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含む。

例えば、ラミニン欠損筋ジストロフィーを治療する方法は、治療を必要とする患者に、次のいずれか：第２のドメインとしてＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）またはＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）を含むタンパク質をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか、第２のドメインとしてＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）またはＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ粒子のいずれかを投与することを含む。

ラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための方法がさらに提供され、これには、治療を必要とする患者に、
ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｃ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、または
ｄ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、を含むタンパク質を投与することが含まれる。

例えば、ラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための方法は、治療を必要とする患者にタンパク質を投与することを含み、タンパク質は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２２のアミノ酸配列を含む。

ｒＡＡＶを含むラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための組成物も提供され、ｒＡＡＶのゲノムは、
ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｃ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、または
ｄ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、を含むタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含む。

例えば、ラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための組成物は、次のいずれか：第２のドメインとしてＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）またはＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）を含むタンパク質をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか、第２のドメインとしてＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）またはＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む。

タンパク質を含むラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための組成物がさらに提供され、タンパク質は、
ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｃ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、または
ｄ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメインを含む。

例えば、ラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための組成物は、タンパク質を含み、タンパク質は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２２のアミノ酸配列を含む。

本開示はまた、ラミニン欠損筋ジストロフィーの治療を必要とする患者における、治療を行うための薬剤の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供し、ｒＡＡＶのゲノムは、
ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｃ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、または
ｄ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、を含むタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含む。

例えば、本開示はまた、次のいずれか：ラミニン欠損筋ジストロフィーの治療を必要とする患者における、治療を行うための薬剤の調製のための、第２のドメインとしてＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）またはＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）を含むタンパク質をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか、第２のドメインとしてＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）またはＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ粒子のいずれかの使用を提供する。

本開示は、さらにラミニン欠損筋ジストロフィーの治療を必要とする患者における、治療を行うための薬剤の調製のためのタンパク質の使用を提供し、タンパク質は、
ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
ｃ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、または
ｄ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメインを含む。

例えば、本開示はまた、ラミニン欠損筋ジストロフィーの治療を必要とする患者における、治療を行うための薬剤の調製のためのタンパク質の使用を提供し、タンパク質は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２２のアミノ酸配列を含む。

ジストログリカノパチーを治療するための方法も提供され、これには、治療を必要とする患者にｒＡＡＶを投与することが含まれ、ｒＡＡＶのゲノムは、
ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメイン、または
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメイン、を含むタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含む。

例えば、ジストログリカノパチーを治療する方法は、治療を必要とする患者に、次のいずれか：第２のドメインとしてＤＡＧ１アルファを含むタンパク質をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか、第２のドメインとしてＤＡＧ１アルファを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ粒子のいずれかを投与することを含む。

ジストログリカノパチーを治療するための方法がまたさらに提供され、これには、治療を必要とする患者に、
ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメイン、または
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメイン、を含むタンパク質を投与することが含まれる。

例えば、治療を必要とする患者にタンパク質を投与することを含む、ジストログリカノパチーを治療するための方法であって、タンパク質は、配列番号２３または配列番号２４のアミノ酸配列を含む。

ｒＡＡＶを含むジストログリカノパチーを治療するための組成物も提供され、ｒＡＡＶのゲノムは、
ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメイン、または
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメイン、を含むタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含む。

例えば、本開示は、次のいずれか：第２のドメインとしてＤＡＧ１アルファを含むタンパク質をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか、または第２のドメインとしてＤＡＧ１アルファを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶもしくはｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む、ジストログリカノパチーを治療するための組成物を提供する。

タンパク質を含むジストログリカノパチーを治療するための組成物がまたさらに提供され、タンパク質は、
ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメイン、または
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメインを含む。

例えば、ジストログリカノパチーを治療するための組成物は、タンパク質を含み、タンパク質は、配列番号２３または配列番号２４のアミノ酸配列を含む。

ジストログリカノパチーの治療を必要とする患者における、治療を行うための薬剤の調製のためのｒＡＡＶの使用も提供され、ｒＡＡＶのゲノムは、
ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメイン、または
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメイン、を含むタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを含む。

例えば、本開示は、次のいずれか：ジストログリカノパチーの治療を必要とする患者における、治療を行うための薬剤の調製のための、第２のドメインとしてＤＡＧ１アルファを含むタンパク質をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか、または第２のドメインとしてＤＡＧ１アルファを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶもしくはｒＡＡＶ粒子のいずれかの使用を提供する。

ジストログリカノパチーの治療を必要とする患者における、治療を行うための薬剤の調製のためのタンパク質の使用がまたさらに提供され、タンパク質は、
ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメイン、または
ｂ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメインを含む。

例えば、本開示は、ジストログリカノパチーの治療を必要とする患者における、治療を行うための薬剤の調製のためのタンパク質の使用を提供し、タンパク質は、配列番号配列番号２３または配列番号２４のアミノ酸配列を含む。

提供されるラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための方法、使用、または組成物において、ラミニン欠損筋ジストロフィーは、例えば、ＭＤＣ１Ａであり得る。

ジストログリカノパチーを治療するための方法、使用、または組成物のいずれにおいても、ジストログリカノパチーは、例えば、ウォーカー・ワールブルグ症候群、筋眼脳病、福山型先天性筋ジストロフィー、ＭＤＣ１Ｃ、ＭＤＣ１Ｄ、ＬＧＭＤ２Ｉ、ＬＧＭＤ２Ｋ、ＬＧＭＤ２Ｍ、ＬＧＭＤ２Ｎ、ＬＧＭＤ２Ｏ、ＬＧＭＤ２Ｐ、ＬＧＭＤ２Ｔ、またはＬＧＭＤ２Ｕである。

提供されるタンパク質の例を表１に示す。

特許または出願ファイルには、カラーで作成された図面が少なくとも１つ含まれている。カラー図面およびカラー写真を含むこの特許または特許出願の出版物のコピーは、要請および必要な料金の支払いに応じて、官庁により提供される。

［図１Ａ］ジストロフィン関連糖タンパク質（ＤＡＧ）複合体を示す。［図１Ｂ］αジストログリカンがジストログリカノパチーにおいて異常にグリコシル化される（その正常なラミニン結合機能が失われる）だけでなく、αジストログリカンタンパク質が罹患筋肉において低減することを示す。［図１Ｃ］本明細書に記載の治療用タンパク質が、αジストログリカンが正常な量で存在するβジストログリカンに結合することによって筋膜に連結し、ＥＣＭのヘパリン硫酸プロテオグリカンへのＨＢＥＧＦの結合を介して、その適切なＥＣＭ結合グリカンがなくてもＥＣＭに連結することを可能にすることを示す。これにより、αジストログリカンのＥＣＭおよび筋膜への失われた連結が再構成される。これらの治療用タンパク質を提供する本明細書に記載の方法の使用は、１８以上の遺伝子型のジストログリカノパチーすべての治療に適応され、本方法は、各ジストログリカノパチーが異なる遺伝子療法の開発を必要とする遺伝子置換戦略の強力な代替法となる。 同上。 ［図２Ａ］ＭＤＣ１Ａが、体内の各筋肉細胞を取り囲む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質であるラミニンα２をコードするＬＡＭＡ２遺伝子の機能喪失変異によって引き起こされることを示す。ＬＡＭＡ２は、ＥＣＭへの筋肉細胞接着および筋膜の安定性に必要である。［図２Ｂ］本明細書に記載の治療用タンパク質は、ＬＡＭＡ２ Ｇ１−Ｇ５ドメインが通常存在するＥＣＭにＬＡＭＡ２ Ｇ１−Ｇ５ドメインを固定することができるため、ＬＡＭＡ２ Ｇ１−Ｇ５ドメインは天然ラミニンα２と同様に機能することができることを示す。したがって、これらの治療用タンパク質を提供する本明細書に記載の方法の使用は、ＭＤＣ１Ａに適応される。 同上。 治療用タンパク質ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ドメインで終了）−ＬＡＭＡ２ Ｇ１−Ｇ５をコードするポリヌクレオチド配列を示す。治療用タンパク質は、本発明のヌクレオチドによってコードされ、配列番号１にも対応するヌクレオチド１４〜３２３５を含む。 同上。 同上。 同上。 治療用タンパク質ＨＢ−ＥＧＦ（完全な可溶型）−ＬＡＭＡ２ Ｇ１−Ｇ５をコードするポリヌクレオチド配列を示す。治療用タンパク質は、本発明のヌクレオチドによってコードされ、配列番号３にも対応するヌクレオチド１４〜３３６１を含む。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 治療用タンパク質ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ドメインで終了）−ＬＡＭＡ２ Ｇ３−Ｇ５をコードするポリヌクレオチド配列を示す。治療用タンパク質は、本発明のヌクレオチドによってコードされ、配列番号５にも対応するヌクレオチド１４〜１９３０を含む。 同上。 同上。 治療用タンパク質ＨＢ−ＥＧＦ（完全な可溶型）−ＬＡＭＡ２ Ｇ３−Ｇ５をコードするポリヌクレオチド配列を示す。治療用タンパク質は、本発明のヌクレオチドによってコードされ、配列番号７にも対応するヌクレオチド１４〜２０５６を含む。 同上。 治療用タンパク質ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ドメインで終了）−ＤＡＧ１（天然のプロセシングされたアルファＤＧ遺伝子）をコードするポリヌクレオチド配列を示す。治療用タンパク質は、本発明のヌクレオチドによってコードされ、配列番号９にも対応するヌクレオチド１４〜１３６０を含む。 同上。 治療用タンパク質ＨＢ−ＥＧＦ（完全な可溶型）−ＤＡＧ１（天然のプロセシングされたアルファＤＧ遺伝子）をコードするポリヌクレオチド配列を示す。治療用タンパク質は、本発明のヌクレオチドによってコードされ、配列番号１１にも対応するヌクレオチド１４〜１４８６を含む。 同上。 同上。 同上。 組換え哺乳類宿主細胞による、本明細書に記載の治療用タンパク質の発現を示す。 同上。 ｓＨＢ−ＥＧＦが筋肉から分泌され得、細胞外マトリックスに付着することを示す。 ｓＨＢ−ＥＧＦが治療用代理筋ジストロフィー遺伝子の発現を誘導することを示す。全長ＨＢＥＧＦは、治療用遺伝子発現を誘導しない。 ｓＨＢ−ＥＧＦが骨格筋においてＡｋｔチロシンキナーゼカスケードを誘導し、筋肉の成長および再生を刺激することができることを示す。 治療用タンパク質ＨＢ−ＥＧＦ（完全な可溶型）−ＬＡＭＡ２ Ｇ１−Ｇ５をコードする例示的なｒＡＡＶゲノムを示す。 同上。 同上。 同上。 治療用タンパク質ＨＢ−ＥＧＦ（完全な可溶型）−ＤＡＧ１（天然のプロセシングされたアルファＤＧ遺伝子）をコードする例示的なｒＡＡＶゲノムを示す。 同上。 同上。 野生型マウスにおいて、ＨＢＥＧＦ、ＨＢＥＧＦ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）、ＨＢＥＧＦ．ＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）、またはＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）を含有するｒＡＡＶ９．ＣＭＶベクターの筋肉内注射後のＨＢ−ＥＧＦおよびＬＧ５（図では４Ｈ８−２と表される）の免疫組織化学的染色を提供する。偽注射されたマウス（緩衝液のみ）は、陰性対照として示される。４Ｈ８−２は、切片の筋肉細胞を示す抗ラミニン抗体である。 ｒＡＡＶ９．ＨＢＥＧＦ−ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）、ＨＢ−ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）、またはＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）をＩＭ注射した筋肉のＨＢ−ＥＧＦおよびラミニン球状ドメイン（ＬＧ５）の免疫組織化学的染色を提供する。下の下部のパネルは、二次抗体のみの染色を示す。 ｒＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＨＢ．ＬＡＭＡ（Ｇ１−Ｇ５）がｄｙ／ｄｙマウスの筋力低下を防止したことを示すグラフである。マウスに、ＨＢＥＧＦ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）、またはＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）を含有する１×１０^１２ｖｇのｒＡＡＶ９．ＣＭＶベクターをＩＶ注射した。マウスを、注射の２ヶ月および３ヶ月後に、偽注射されたｄｙ／ｄｙ疾患対照および野生型正常対照と比較した。混合（５０：５０）雌：雄の性別をすべてのグループで使用した。エラーは、グループあたりｎ＝１２匹（野生型および偽ｄｙ／ｄｙ）、６匹（ｓＨＢ−ＥＧＦ．ＬＡＭＡ２Ｇ１−Ｇ５およびＨＢ．ＬＡＭＡ２Ｇ１−Ｇ５）または５匹（ＨＢ．ＬＡＭＡ２Ｇ３−Ｇ５）の動物のＳＥＭであり、データ点あたり５つの測定を平均化した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ Ｐ１でのＩＶ注射後の４ヶ月齢のｄｙ／ｄｙ筋肉（三頭筋）におけるＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）の発現を示すために、ＨＢ−ＥＧＦおよびＬＧ５の免疫組織化学的染色を提供する。偽注射されたか、または１×１０^１２ｖｇのｒＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＨＢ−ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）を注射されたかのいずれかの４ヶ月齢の野生型およびｄｙ／ｄｙマウスの三頭筋からの筋肉切片を、トランスジェニックタンパク質を認識するためにＨＢＥＧＦ（緑色）、およびすべての筋肉細胞を認識するためにコラーゲンＩＶ（Ｃｏｌ（ＩＶ）、赤色）に特異的な抗体で染色した。核を染色するためにＤＡＰＩが青色で追加されている。統合した三色画像を示す。 ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＢ．ＬＡＭＡ１（Ｇ１−Ｇ５）のプラスミド配列（配列番号２）を提供し、ｒＡＡＶゲノムはヌクレオチド３５９０〜８２１５に対応する。 同上。 同上。 同上。 ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＢＥＧＦ ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）のプラスミド配列（配列番号４）を提供し、ｒＡＡＶゲノムはヌクレオチド３５９０〜８３４１に対応する。 同上。 同上。 同上。 ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＢ ＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）のプラスミド配列（配列番号６）を提供し、ｒＡＡＶゲノムはヌクレオチド３６９０９〜６９２９に対応する。 同上。 同上。 同上。 ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＢＥＧＦ．ＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）のプラスミド配列（配列番号８）を提供し、ｒＡＡＶゲノムはヌクレオチド３５９０〜７０３６に対応する。 同上。 同上。 ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＢ．ＤＡＧ１（アルファ）のプラスミド配列（配列番号１０）を提供し、ｒＡＡＶゲノムはヌクレオチドに対応し、ｒＡＡＶゲノムはヌクレオチド３５９０〜６３４０に対応する。 同上。 同上。 ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＢ．ＤＡＧ１（アルファ）のプラスミド配列（配列番号１３）を提供し、ｒＡＡＶゲノムはヌクレオチド３５９０〜６０４９に対応する。 同上。 同上。

本明細書では、ジストログリカノパチー（ウォーカー・ワールブルグ症候群、筋眼脳病、福山型先天性筋ジストロフィー、ＭＤＣ１Ｃ、ＭＤＣ１Ｄ、ＬＧＭＤ２Ｉ、ＬＧＭＤ２Ｋ、ＬＧＭＤ２Ｍ、ＬＧＭＤ２Ｎ、ＬＧＭＤ２Ｏ、ＬＧＭＤ２Ｐ、ＬＧＭＤ２Ｔ、およびＬＧＭＤ２Ｕを含むが、これらに限定されない）およびラミニン欠損筋ジストロフィー（ＭＤＣ１Ａを含むが、これに限定されない）の治療のための方法および生成物が提供され、これらはＨＢＥＧＦのリジンに富むヘパリン結合ドメインを利用する。ヘパリン硫酸プロテオグリカンは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に豊富であり、ここに示されるように、筋肉でのＨＢＥＧＦの過剰発現は、筋肉ＥＣＭでのＨＢＥＧＦの局在化につながる。本明細書に記載の方法では、ジストログリカノパチーおよびラミニン欠損筋ジストロフィーにおける膜固定欠損は、治療用タンパク質の「リンカー」ドメインとしてＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを使用して治療される。

ここで、「ＨＢＥＧＦ」という用語は、生物活性ＥＧＦドメインまでのＨＢＥＧＦ配列全体を指すが、膜貫通ドメインを欠いており、そのため、ＨＢＥＧＦ分泌が可能となる（図４）。ＨＢＥＧＦフラグメントは、分泌経路への侵入を可能にするシグナルペプチド、タンパク質の折り畳みおよび安定化を可能にするプレプロペプチド、細胞外マトリックスとの相互作用の増加を可能にするヘパリン結合ドメイン、およびＨＢＥＧＦシグナル伝達を可能にする生物活性ＥＧＦドメインの、ＨＢＥＧＦ遺伝子からの４つのドメインを含有する。本明細書に開示されるタンパク質において、次に、次に、これらのドメインのコード配列は、ラミニンアルファ２またはジストログリカンコード配列に連結される。第２の「ＨＢ」フラグメントも使用される（図３）。ＨＢフラグメントは、ＨＢＥＧＦに見られる４つのドメインのうち、シグナルペプチド、プレプロペプチド、およびヘパリン結合ドメインの３つのみを含有する（したがって、ＨＢは生物活性ＥＧＦドメインを欠いている）。ラミニンアルファ２またはジストログリカンタンパク質フラグメントに連結されると、ＨＢドメインはＥＣＭとの関連を増大させることができるが、ＥＧＦまたはＨＢＥＧＦシグナル伝達は増大させない。

ＨＢＥＧＦまたはＨＢリンカードメインは、タンパク質を細胞の細胞外マトリックスに対して標的化し、このタンパク質を筋肉細胞などの細胞の細胞外ドメインに固定するように作用する。治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、患者に送達される（例えば、治療用タンパク質をコードする組換えＡＡＶによる送達）か、または治療用タンパク質が患者に送達される。

例えば、ジストログリカノパチーのすべてに関して、ＨＢＥＧＦヘパリン結合ドメインのコード配列が、α−ジストログリカンのコード配列に融合され、治療用タンパク質ＨＢＥＧＦ−ＤＡＧ１（α）をコードするポリヌクレオチドが作製される。α−ジストログリカンの低グリコシル化（ｈｙｐｏｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に加えて、α−ジストログリカンタンパク質レベルが、ジストログリカノパチーにおいて低下する。本明細書に記載の方法において、ＨＢＥＧＦ−ＤＡＧ１（α）のＨＢＥＧＦドメインは、ＥＣＭヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合し、一方、α−ジストログリカンドメインは、β−ジストログリカンに結合し、ジストログリカノパチーにおける低グリコシル化にもかかわらず、筋鞘をＥＣＭに連結する。このようなＨＢＥＧＦ−ＤＡＧ１（α）治療用タンパク質の４つの例は、
ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ドメインで終了）−ＬＡＭＡ２ Ｇ１−Ｇ５（図３のポリヌクレオチドによってコードされる）、
ＨＢ−ＥＧＦ（完全な可溶型）−ＬＡＭＡ２ Ｇ１−Ｇ５（図４のポリヌクレオチドによってコードされる）、
ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ドメインで終了）−ＬＡＭＡ２ Ｇ３−Ｇ５（図５のポリヌクレオチドによってコードされる）、および
ＨＢ−ＥＧＦ（完全な可溶型）−ＬＡＭＡ２ Ｇ３−Ｇ５（図６のポリヌクレオチドによってコードされる）である。

本明細書における「完全な可溶型」という用語は、治療用タンパク質が、ＨＢＥＧＦヘパリン結合ドメインおよびＥＧＦ様ドメインを含むが、ＨＢＥＧＦの膜貫通部分を含まないことを示す。ＨＢＥＧＦのＨＢＥＧＦヘパリン結合ドメインとＥＧＦ様ドメインとの組み合わせは、ＨＢＥＧＦの切断された活性の可溶性アイソフォームに対応する。この用語は、本明細書において「ＨＢＥＧＦ」と呼ばれる。

本明細書における「ヘパリン結合ドメインで終了」という用語は、治療用タンパク質がＨＢＥＧＦヘパリン結合ドメインのみを含み、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインまたは膜貫通部分を含まないことを示す。この用語は、本明細書において「ＨＢ」と略される。

例えば、ＭＤＣ１Ａなどのラミニン欠損筋ジストロフィーに関して、ＨＢＥＧＦヘパリン結合ドメインのコード配列が、ラミニン−α２の球状（Ｇ）ドメイン１−５のコード配列に融合され、治療用タンパク質ＨＢＥＧＦ−ＬＡＭＡ２（Ｇ１−５）をコードするポリヌクレオチドが作製される。ラミニン−α２Ｇドメインは、筋鞘でグリコシル化されたα−ジストログリカンと、インテグリンにも結合し、ＬＡＭＡ２遺伝子の一部によってコードされる。本明細書に記載の方法において、ＨＢＥＧＦ−ＬＡＭＡ２（Ｇ１−５）のＨＢＥＧＦドメインは、ＥＣＭヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合し、Ｇドメインは、α−ジストログリカンに結合し、全長のラミニン−α２がＭＤＣ１Ａに存在しないにもかかわらず、筋鞘をＥＣＭに連結する。このようなＨＢＥＧＦ−ＬＡＭＡ２（Ｇ１−５）治療用タンパク質の２つの例は、
ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ドメインで終了）−ＤＡＧ１（天然のプロセシングされたアルファＤＧ遺伝子）（図７のポリヌクレオチドによってコードされる）および
ＨＢ−ＥＧＦ（完全な可溶型）−ＤＡＧ１（天然のプロセシングされたアルファＤＧ遺伝子）（図８のポリヌクレオチドによってコードされる）である。

さらに、ジストログリカノパチーおよびラミニン欠損筋ジストロフィー（ＭＤＣ１Ａなど）の両方が筋肉再生の低下に関連しており、治療用タンパク質がＨＢＥＧＦヘパリン結合ドメインおよびＨＢＥＧＦ ＥＧＦ様ドメインを含む本明細書に記載の方法の実施形態では、患者はまた、Ｐａｘ７、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、Ｍｙｈ３を含む遺伝子の発現が変化し、筋形成および筋肉再生の増加をもたらす治療用タンパク質のＨＢＥＧＦ ＥＧＦ様ドメインの栄養シグナル伝達から利益を得る。

したがって、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。実施形態は、図３、４、５、６、７、または８に示されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。他の実施形態は、図３、４、５、６、７、または８に示されるポリヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態は、図３、４、５、６、７、または８に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。

一実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、次のうちの１つ：ｉ）図３に示されるヌクレオチド配列、ｉｉ）図３に示されるヌクレオチド１４〜３２３５を含むヌクレオチド配列、ｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、またはｉｖ）配列番号１９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

別の実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、次のうちの１つ：ｉ）図４に示されるヌクレオチド配列、ｉｉ）図４に示されるヌクレオチド１４〜３３６１を含むヌクレオチド配列、ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列、またはｉｖ）配列番号２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

さらなる実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、次のうちの１つ：ｉ）図５に示されるヌクレオチド配列、ｉｉ）図５に示されるヌクレオチド１４〜１９３０を含むヌクレオチド配列、ｉｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列、またはｉｖ）配列番号２１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

別の実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、次のうちの１つ：ｉ）図６に示されるヌクレオチド配列、ｉｉ）図６に示されるヌクレオチド１４〜２０５６を含むヌクレオチド配列、ｉｉｉ）配列番号７のヌクレオチド配列、またはｉｖ）配列番号２２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、次のうちの１つ：ｉ）図７に示されるヌクレオチド配列、ｉｉ）図７に示されるヌクレオチド１４〜１３６０を含むヌクレオチド配列、ｉｉｉ）配列番号９のヌクレオチド配列、またはｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

別の実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、次のうちの１つ：ｉ）図８に示されるヌクレオチド配列、ｉｉ）図８に示されるヌクレオチド１４〜１４８６を含むヌクレオチド配列、ｉｉｉ）配列番号１１のヌクレオチド配列、またはｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

提供される他のポリヌクレオチドには、限定されないが、治療用タンパク質の結合活性を保持する治療用ポリペプチドのアミノ酸変異体をコードするポリヌクレオチドが含まれ、このポリヌクレオチドは、図３、４、５、６、７、または８に示されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または提供されるポリヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を有する。

治療用タンパク質の結合活性を保持する治療用ポリペプチドのアミノ酸変異体をコードするポリヌクレオチドも本明細書で提供され、このポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、図３、４、５、６、７、または８に示されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列もしくはそれらの補体、または提供されるポリヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド配列にハイブリダイズする。「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５〜６８℃の０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウムまたは０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。

「結合活性を保持する」は、本明細書において、ポリヌクレオチドによってコードされる治療用タンパク質のアミノ酸変異体が、図３、４、５、または６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる治療用タンパク質とヘパリン硫酸塩プロテオグリカンおよびβ−ジストログリカンへの結合について、または図７もしくは８に示されるヌクレオチド配列によってコードされる治療用タンパク質とヘパリン硫酸プロテオグリカンおよびα−ジストログリカンへの結合について、または配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、もしくは配列番号２４のアミノ酸配列を含む治療用タンパク質とヘパリン硫酸プロテオグリカンおよびα−ジストログリカンへの結合について競合することを意味することが企図される。

本明細書に記載のポリヌクレオチドの１つ以上を含む組換え発現ベクターも提供される。本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶゲノムも提供される。

本明細書に記載の発現ベクターまたは組換えＡＡＶゲノムにおいて、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、転写制御因子（プロモーター、エンハンサー、および／またはイントロンを含むが、これらに限定されない）、特に目的の標的細胞において機能的な転写制御因子に作動可能に連結される。例えば、哺乳類宿主細胞で使用するのに好適なプロモーターは周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが含まれるが、これらに限定されない。他の好適な哺乳類プロモーターには、異種哺乳類プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。また、例えば、ＡＡＶの送達方法は、アクチンおよびミオシン遺伝子ファミリー、例えばｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１−７６６（１９９１）を参照されたい］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ−２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１１：４８５４−４８６２（１９９１）］、ヒト骨格アクチン遺伝子［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７：４０８９−４０９９（１９８７）］、筋クレアチンキナーゼ配列因子［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，９：３３９３−３３９９（１９８９）を参照されたい］、およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）因子に由来する制御因子、骨格速収縮トロポニンＣ遺伝子、遅収縮心筋トロポニンＣ遺伝子、および遅収縮トロポニンＩ遺伝子に由来する制御因子：低酸素誘導性核内因子［Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８８：５６８０−５６８４（１９９１）］、グルココルチコイド応答因子（ＧＲＥ）を含むステロイド誘導性因子およびプロモーター［Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３−５６０７（１９９３）］、ｔＭＣＫプロモーター［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５：１４８９−１４９９（２００８）を参照されたい］、ハイブリッドα−ミオシン重鎖エンハンサー−／ＭＣＫエンハンサー−プロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター［Ｓａｌｖａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１５：３２０−３２９（２００７）、ＣＫ６プロモーター［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、上記を参照されたい］、ならびに他の制御因子を含むが、これらに限定されない筋肉特異的転写制御因子を使用する形質導入筋肉または肝細胞を含み得る。したがって、筋肉特異的転写制御因子の一例は、ｔＭＣＫプロモーターである。肝臓特異的プロモーターの例は、ＬＳＰである［Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｖｅｒｍａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，３９０６−３９１０（１９９９）］。別のプロモーターの例として、組換え宿主細胞における治療用タンパク質の産生に関して、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどの構成的プロモーターであり得る。別の例は、ＬＡＭＡ２である。

本明細書に記載の治療用タンパク質の発現のために、本明細書に記載される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写または発現カセットの形態の発現系および構築物、ならびにこのような発現系または構築物を含む宿主細胞が提供され、また提供される。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、タンパク質コード情報を宿主細胞に導入するために使用するのに好適な任意の分子または実体（例えば、ポリヌクレオチド、プラスミド、バクテリオファージ、またはウイルス）を意味する。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳類ベクター、および発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。組換え発現ベクターなどの発現ベクターは、宿主細胞の形質転換に有用である。

組換え発現ベクターなどの発現ベクターが導入された宿主細胞が提供される。宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞））であり得る。発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞に導入することができる。哺乳類細胞の安定したトランスフェクションのために、選択可能なマーカーをコードする遺伝子（例えば、抗生物質に対する耐性のために）は、一般に、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与するものが含まれる。導入されたポリヌクレオチドで安定にトランスフェクトされた細胞は、他の方法の中でもとりわけ、薬物選択によって同定することができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入するための方法は、当該技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチド（複数可）のカプセル化、核酸と正に帯電した脂質との混合、およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが含まれるが、これらに限定されない。

選択される方法は、部分的には使用される宿主細胞の種類の関数である。これらの方法および他の好適な方法は当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１に記載されている。

宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、タンパク質を合成し、その後、タンパク質は、培養培地から（宿主細胞がタンパク質を培地に分泌する場合）、またはそれを産生する宿主細胞から直接（溶解しない場合）収集され得る。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化など）、および生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さなどの様々な要因に依存する。一例として、ＬＡＲＧＥを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＬＡＲＧＥ細胞）［Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｙ Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｌｐｈａ Ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎ− ａｎｄ Ｏ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ＬＡＲＧＥ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰＬｏＳ Ｃｕｒｒ．（２０１３ Ｊａｎｕａｒｙ ２）］は、本明細書に記載のグリコシル化治療用タンパク質の産生に使用することが企図される。

発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当該技術分野で周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−ＬＡＲＧＥ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、および当該技術分野で標準的な他の細胞株を含むがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株を含むが、これらに限定されない。

本明細書で提供されるｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠く。本明細書で提供される組換えＡＡＶゲノムは、上記に記載される治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型 ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、およびＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。他の種類のｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００−１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景技術の部分に記載されたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を使用することができる。

ｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡプラスミドが提供される。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子へのアセンブリのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルスを含むが、これらに限定されない）の感染に許容される細胞に導入される。パッケージングされるべきＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ＩＴＲならびにｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型 ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３、およびＡＡＶ ｒｈ．７４を含むがこれらに限定されないｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からであり得る。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要なすべての成分を安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１−４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。

ｒＡＡＶ産生の一般的な原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−１５３９（１９９２）；ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９（１９９２）にレビューされる。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、ｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９）；、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２４４−１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４：６０９−６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４−１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、米国特許第６，２５８，５９５号、およびＭｃＣａｒｔｙ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６（１０）：１６４８−１６５６（２００８）に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。

したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ−３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ−２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

本明細書において、複製欠損、感染性、カプシド形成ウイルス粒子（ｒＡＡＶ）である組換えＡＡＶは、ｒＡＡＶゲノムを含む。ｒＡＡＶは、本明細書に記載の治療用タンパク質をコードする。ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠いており、すなわち、ｒＡＡＶゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐまたはｃａｐ ＤＮＡが存在しない。

ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１−１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７−４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含む。

別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のｒＡＡＶまたは治療用タンパク質を含む組成物を企図する。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体にｒＡＡＶまたは治療用タンパク質を含む。組成物はまた、希釈剤およびアジュバントなどの他の成分を含んでもよい。許容される担体、希釈剤、およびアジュバントは、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量および濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）、プルロニック（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

本明細書に記載の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、個体、および標的化される細胞型（複数可）に応じて異なり、当該技術分野における標準的な方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬあたり約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３〜約１×１０^１４以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、当該技術分野において理解されるウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。

インビボまたはインビトロで、標的細胞にｒＡＡＶを形質導入する方法が、本発明によって企図される。インビボ方法は、有効用量または複数回有効用量の、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする動物（ヒト患者を含む）に投与するステップを含む。

本明細書に記載の治療用タンパク質の投薬量および投与頻度は、投与経路、投与される特定の治療用タンパク質、および患者のサイズおよび全身状態などの要因によって異なり得る。適切な投薬量は、関連技術分野で既知の手順によって、例えば、用量漸増研究を伴い得る臨床試験において決定することができる。これらの要因を考慮して、本明細書に記載の治療用タンパク質の典型的な用量は、約０．１ｐｇ／ｋｇ〜最大約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。さらに、用量は、０．１ｐｇ／ｋｇ〜最大約３０ｍｇ／ｋｇ、１ｐｇ／ｋｇ〜最大約３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｐｇ／ｋｇ〜最大約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、または約０．３ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。

したがって、本明細書に記載の治療用タンパク質で患者を治療する方法も提供される。本方法は、有効用量または複数回有効用量の、本明細書に記載の治療用タンパク質を含む組成物を、それを必要とする動物（ヒト患者を含む）に投与するステップを含む。

用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。「有効用量」は、治療される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除または低減）する用量、障害／疾患状態への進行を遅らせるかもしくは防止する用量、障害／疾患状態の進行を遅らせるかもしくは防止する用量、疾患の程度を縮小する用量、疾患の寛解（部分的または完全）をもたらす用量、および／または生存を延長させる用量である。本明細書に記載の方法は、治療された患者において、歩行時間、四肢握力の改善、筋肉病理の減少、および神経病理の減少のうちの１つ以上をもたらす。本明細書に記載の方法によって達成される他のエンドポイントは、治療された患者における筋線維サイズの増加、小さな酸化線維数の減少、筋萎縮の矯正、筋力の増加、および筋肉再生の増加のうちの１つ以上である。ジストログリカノパチーおよびラミニン欠損筋ジストロフィーは、本発明の方法による予防または治療のために企図される。

併用療法も本発明により企図される。本明細書で使用される併用療法は、同時治療または連続治療の両方を含む。新規療法との組み合わせであるため、本明細書に記載の方法と標準的な薬物治療との組み合わせが特に企図される。

有効用量のｒＡＡＶまたは治療用タンパク質の組成物の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、髄腔内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣内を含むが、これらに限定されない当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）および血清型（複数可）は、治療される感染症および／または疾患状態、ならびに治療用タンパク質を発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者によって選択および／または適合され得る。

特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することにより達成され得る。本発明による投与としては、筋肉内への注入、血流への注入、および／または肝臓への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水または乳酸リンゲル液中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体または他の成分に対する既知の制限はない（しかし、ＤＮＡを分解する組成物はｒＡＡＶとの通常の方法で避けられるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織を標的とするように修飾されてもよい。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射と経皮輸送の両方のための多数の製剤がこれまでに開発されており、本発明の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。

筋肉内注射の目的のために、ゴマ油もしくはピーナッツ油などのアジュバント中、または水性プロピレングリコール、ならびに滅菌水溶液中のｒＡＡＶまたは治療用タンパク質の溶液を用いることができる。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水またはグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。通常の保存状態および使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用られる滅菌水性媒体はすべて、当業者に周知の標準的な技術により容易に入手可能である。

全身性（例えば、静脈内）注射使用に好適なｒＡＡＶまたは治療用タンパク質の医薬品形態としては、滅菌水溶液または分散剤、および滅菌注射溶液または分散剤の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。すべての場合において、形態は滅菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。

滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と、その以前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分との粉末をもたらす、真空乾燥およびフリーズドライ技術である。

ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行うこともできる。一実施形態では、所望の標的筋肉細胞を対象から取り出し、ｒＡＡＶで形質導入し、対象に再導入する。代替的に、同系または異種の筋肉細胞は、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に使用され得る。

対象への形質導入および形質導入細胞の再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地でｒＡＡＶを筋肉細胞と組み合わせ、サザンブロットおよび／またはＰＣＲなどの従来の技術を使用して、または選択可能なマーカーを使用して目的のＤＮＡを持つ細胞をスクリーニングすることにより、インビトロで形質導入することができる。次いで、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内注射による、または例えばカテーテルを使用して平滑筋および心筋への注射によるなど、様々な技術により対象に導入することができる。

本発明のｒＡＡＶでの細胞の形質導入は、本明細書に記載の治療用タンパク質の持続発現をもたらす。したがって、本発明は、本明細書に記載の治療用タンパク質を発現するｒＡＡＶを患者、好ましくはヒトに投与する方法を提供する。これらの方法は、本発明の１つ以上のｒＡＡＶを組織（筋肉などの組織、肝臓や脳などの臓器、唾液腺などの腺を含むが、これらに限定されない）に形質導入することを含む。

筋肉組織は生命維持に必須な臓器ではなく、アクセスしやすいため、インビボＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本発明は、形質導入された筋肉細胞からの本明細書に記載の治療用タンパク質の持続発現を企図する。

「筋肉細胞」または「筋肉組織」とは、任意の種類の筋肉［例えば、骨格筋および平滑筋（例えば、消化管、膀胱、血管、または心臓組織）］に由来する細胞または細胞群を意味する。そのような筋肉細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、および心筋芽細胞など、分化または未分化であり得る。

「形質導入」という用語は、レシピエント細胞による治療用タンパク質の発現をもたらす、本発明のｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロのいずれかでの、レシピエント細胞への治療用タンパク質の投与／送達を指すように使用される。

したがって、有効用量（または本質的に同時に投与される用量もしくは間隔を置いて与えられる用量）の、本明細書に記載の治療用タンパク質をコードするｒＡＡＶを、それを必要とする患者に投与する方法が本明細書で提供される。

有効用量（または本質的に同時に投与される用量もしくは間隔を置いて与えられる用量）の、本明細書に記載の治療用タンパク質を、それを必要とする患者に投与する方法も本明細書で提供される。

本発明の態様および実施形態は、以下の実施例によって示される。実施例１は、本開示の治療用タンパク質をコードする構築物を記載する。実施例２は、培養宿主細胞における治療用タンパク質の組換え発現を記載する。実施例３は、ヘパリン結合ドメインが野生型マウスの筋肉に対してＬＡＭＡ２（ｇ１−Ｇ５０）を標的化することを実証する実験を記載する。実施例４は、ＭＤＣ１Ａのｄｙ^Ｗ／ｄｙ^Ｗマウスモデルにおける症状および病理の低減においてＡＡＶ媒介ＨＢＥＧＦ−ＬＡＭＡ２（Ｇ１−５）発現の有効性を実証するための実験を記載する。実施例５は、ジストログリカノパチーのマウスモデルにおける症状および病理の低減においてＡＡＶ媒介ＨＢＥＧＦ−ＤＡＧ１（α）発現の有効性を実証するための実験を記載する。実施例６は、本明細書に記載の治療用タンパク質におけるリンカードメインとして、および本明細書に記載の様々な方法における栄養素としてその適用に有用であると本明細書で企図されるｓＨＢＥＧＦ（のドメイン）の特性を記載する。

実施例１
治療用タンパク質をコードする構築物
ＨＢＥＧＦ ＥＧＦドメインを含む治療用タンパク質をコードする６つの例示的なＤＮＡ構築物を以下のように生成した：
ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ドメインで終了）−ＬＡＭＡ２ Ｇ１−Ｇ５（図３のポリヌクレオチドによってコードされる）、
ＨＢ−ＥＧＦ（完全な可溶型）−ＬＡＭＡ２ Ｇ１−Ｇ５（図４のポリヌクレオチドによってコードされる）、
ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ドメインで終了）−ＬＡＭＡ２ Ｇ３−Ｇ５（図５のポリヌクレオチドによってコードされる）、
ＨＢ−ＥＧＦ（完全な可溶型）−ＬＡＭＡ２ Ｇ３−Ｇ５（図６のポリヌクレオチドによってコードされる）、
ＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合ドメインで終了）−ＤＡＧ１（天然のプロセシングされたアルファＤＧ遺伝子）（図７のポリヌクレオチドによってコードされる）、および
ＨＢ−ＥＧＦ（完全な可溶型）−ＤＡＧ１（天然のプロセシングされたアルファＤＧ遺伝子）（図８のポリヌクレオチドによってコードされる）である。

構築物は、ＣＨＯ細胞中のプラスミドから発現された。ＣＨＯ細胞は、構築物の１つを含むプラスミドでトランスフェクトされるか、偽トランスフェクト（−）された。

トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、ＨＢ−ＥＧＦ、ジストログリカン、またはラミニン−α２ Ｇ５ドメインに対する抗体で染色した。結果を図９Ａに示す。また、トランスフェクションの４８時間後に各プレートから培養培地を収集し、細胞溶解を行った。ヘパリン−アガロースプルダウンを、細胞溶解物および培養培地の両方で行い、全細胞溶解物とともにウエスタンブロットにロードした。結果を図９Ｂに示す。

実施例２
培養宿主細胞における治療用タンパク質の組換え発現
実施例１の構築物を、プラスミドにサブクローニングして、治療用タンパク質をコードするＡＡＶ９ベクターも生成した。

サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写制御下にある実施例１の治療遺伝子のうちの１つを保有するＡＡＶベクターを生成した。

ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２型ベクターゲノムを複数のＡＡＶカプシド血清型にパッケージングすることができる修正されたクロスパッケージングアプローチによって生成された［Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７６（２）：７９１−８０１（２００２）］。生成は、ＨＥＫ２９３細胞を使用した標準的な３プラスミドＤＮＡ／ＣａＰＯ４沈殿法を使用して達成された。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持された。生成プラスミドは、（ｉ）治療用タンパク質をコードするプラスミド、（ｉｉ）ｃａｐ血清型９分離体をコードするｒｅｐ２−ｃａｐＸ修飾ＡＡＶヘルパープラスミド、ならびに（ｉｉｉ）アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ６、およびＶＡ Ｉ／ＩＩ ＲＮＡ遺伝子を発現するアデノウイルス５型ヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ）であった。定量的ＰＣＲベースの滴定法を使用して、Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｔａｑｍａｎ検出器システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用してカプシド形成されたベクターゲノム（ｖｇ）力価を決定した。［Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（６）：１０３１−１０３９（１９９９）］。最終的な力価（ｖｇｍｌ^−１）は、Ｐｒｉｓｍ ７５００リアルタイム検出器システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を利用した特定のプライマーおよびプローブを使用して定量的逆転写酵素ＰＣＲによって決定された。分割したウイルスは、使用するまで−８０℃で保存された。

表２に示されるｒＡＡＶは、本明細書に記載の実験で使用された。

実施例３
ヘパリン結合ドメインはＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）を野生型マウスの筋肉に対して標的化する
野生型マウスは、ＨＢＥＧＦ、ＨＢＥＧＦ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）、ＨＢＥＧＦ．ＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）、またはＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）（表２を参照）を含有する５ｘ１０^１１ｖｇ ｐｆ ｒＡＡＶ９．ＣＭＶベクターを腓腹筋に筋肉内注射された。細胞を、ヒトＨＢ−ＥＧＦまたはＬＡＭＡ２の組換えＧ５ドメインに特異的な抗体で染色した。偽注射されたマウス（緩衝液のみ）は、陰性対照として示される。４Ｈ８−２は、切片の筋肉細胞を示す抗ラミニン抗体である。

図１５に示すように、ＨＢＥＧＦの過剰発現に関して以前に示したが、ＨＢＥＧＦおよびＨＢＥＧＦ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）は、筋肉成長を低減し、かつ／または軽度の筋萎縮を誘導したが、ｒＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）のＩＭ注射は、細胞外マトリックスにおけるＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）タンパク質の分泌および局在化につながる。加えて、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）を発現する筋肉は、正常な野生型筋肉よりも大きいように思われた。ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）は、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）よりも低い全体的なタンパク質染色を示した。ＨＢＥＧＦのＨＢドメインのＥＣＭ標的化機能により、ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）タンパク質の筋肉細胞外マトリックスへの分泌および標的化が可能となる。対照的に、ＨＢドメインのないＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）の発現は、タンパク質生成が非常に低く、ＥＣＭの局在化は検出されなかった。したがって、完全なＨＢ−ＥＧＦドメインではなく、ＨＢドメインのみを含む構築物は、ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）を筋肉のＥＣＭに対して標的化する目的を果たし、この構築物はＨＢＥＧＦからＥＧＦドメインが削除されているため、ＥＧＦシグナル伝達の悪影響なく良好に目的を果たす。

ＨＢ構築物にまだ存在するＨＢＥＧＦのプレプロペプチド部分は、ＨＢＥＧＦからのシグナルペプチドのみを含有するＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）のみと比較して、ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）のタンパク質折り畳みおよび／または発現も改善し得る。最後に、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）は、適切に局在化されると、正常な筋肉においても筋肉の成長を改善し得る。

図１６は、ヒトＨＢＥＧＦタンパク質に対する抗体、およびヒトＬＡＭＡ２のＧ５ドメインに対する抗体を使用して、ＨＢＥＧＦ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）、およびＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）の染色を示す。このデータにより、ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）のみの発現は筋肉でのタンパク質生成を非常に低下させる一方で、ＨＢドメインを含めるとＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）の発現が改善されることが確認され、これは、抗ラミニン抗体およびＨＢＥＧＦ抗体で視覚化された。

実施例４
ＭＤＣ１Ａのｄｙ^Ｗ／ｄｙ^Ｗマウスモデルにおける症状および病理の低減におけるＡＡＶ９媒介ＨＢＥＧＦ−ＬＡＭＡ２（Ｇ１−５）発現の有効性
ｄｙ^Ｗ／ｄｙ^Ｗマウス［Ｎｏｎａｋａ，Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ．，４８（１）：８−１７（１９９８）］は、Ｌａｍａ２に機能喪失変異を有し、ＭＤＣ１Ａの病因と同様にラミニン−α２生成の障害を引き起こす。Ｄｙ^Ｗ／ｄｙ^Ｗマウスは、野生型マウスと比較して、サイズ、握力、および寿命が減少している。マウスは、３ヶ月齢までに筋萎縮、ジストロフィー筋病理、および重度の歩行障害を示す。そのため、これらのマウスは、ＭＤＣ１Ａ療法をテストするための適切で堅牢なモデルである。

実施例２で提供されるＬＡＭＡ２発現ｒＡＡＶゲノムの治療効果を実証するために、生後１日目に、８匹のｄｙ^Ｗ／ｄｙ^Ｗの仔に、低用量の１０^１１ウイルスゲノム（ｖｇ）または高用量の１０^１２ｖｇのいずれかの、ｒＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＨＢＥＧＦ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）またはｒＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）またはｒＡＡＶ．ＣＭＶ．ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）を顔面静脈から静脈内注射した。対照ｄｙ^Ｗ／ｄｙ^Ｗの仔のＡＡＶ緩衝液の偽注射も行った。

注射後２ヶ月および３ヶ月に、前肢の筋肉の握力を分析した（図１７）。４ヶ月齢で、マウスを安楽死させ、四肢の筋肉を解剖し、組換えタンパク質の発現について分析した。図１７に示されるように、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）およびＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）の両方が、ｄｙ／ｄｙマウスの握力の低下を防ぎ、偽治療したｄｙ／ｄｙマウスからの有意な変化を示し、強度値を同じ年齢の未処置の野生型マウスで見られる範囲内に導いた。したがって、ＨＢ−ＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）およびＨＢ−ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）の両方が、ＭＤＣ１Ａのｄｙ／ｄｙモデルで治療効果を示す。この実験では、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ３−Ｇ５）は、偽処置されたｄｙ／ｄｙマウスと比較して、２ヶ月で有意に達しなかったが、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）は有意に達した。

処置したｄｙ／ｄｙマウスの中心核を有する筋線維の割合、筋線維の直径および面積、ならびに筋線維の直径の変動を比較することにより、筋肉病理を予防する際の導入遺伝子発現の役割も分析した。三頭筋の筋肉を使用して、導入遺伝子を発現する筋線維の筋肉病理を、非発現筋線維における同じ病理測定と比較した。この実験は、ＨＢ．ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）の発現が筋肉サイズを増加させることを実証した。このような変化を示す染色の例を図１８に示す。すべての筋肉にわたって定量化したとき、平均横断筋肉領域は、発現筋繊維の２３２８ｍｍ^２対非発現筋繊維の１０８２ｍｍ^２（ｎ＝４つの筋肉、各々筋肉あたり４００の筋繊維を分析）であり、これは、処置を伴う筋肉のサイズにおいて２倍の平均増加であった。筋線維直径指数（直径ＳＤ／平均×１０００）の分散は、非発現筋肉の６２０から発現筋肉の４３１（２５０以下は正常と見なされる）に減少し、筋肉変性および再生のサイクルの指標である中心核を有する筋線維の割合は、非発現筋線維の２８％から発現筋線維の１４％に減少した（各々ｎ＝２）。

病理がゼロに低減されることはないが、ＡＡＶが最大遺伝子発現を達成するのに３〜４週間かかるため、これらの動物では、治療用導入遺伝子の発現が起こる前にある程度の病理が発生することを覚えておくことが重要である。このようなすべての実験において、筋肉変換の平均レベルは２６±１％であった（ｎ＝４の三頭筋を分析、各々４００の繊維）。これらの病理学的測定から取得したものは、ＨＢ−ＬＡＭＡ２（Ｇ１−Ｇ５）が、少なくとも部分的に、ｄｙ／ｄｙ筋肉の筋肉損傷を防ぐだけでなく、野生型に戻る、そしておそらくそれを超えて筋肉の成長を増加させるように思えることである。

実施例５
ジストログリカノパチーのマウスモデルにおける症状および病理の低減におけるＡＡＶ媒介ＨＢＥＧＦ−ＤＡＧ１（α）発現の有効性
ジストログリカン、またはＦｋｔｎ遺伝子によってコードされる、α−ジストログリカン−グリコシル化酵素であるフクチンを欠くマウスは、胚致死性であり、ジストログリカノパチー療法の研究には使用することができない。Ｆｋｔｎ欠失が骨格筋に限定されるＭｙｆ５Ｃｒｅ−Ｆｋｔｎ^ｌｏｘＰマウス［Ｋａｎａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．，２２（１５）：３００３−３０１５（２０１３）］を使用して、有効性を実証する。Ｍｙｆ５Ｃｒｅ−Ｆｋｔｎ^ｌｏｘＰマウスは、野生型マウスと比較して、体重、握力、および寿命が減少している。マウスはまた、ジストロフィー筋の病理を示す。

Ｍｙｆ５Ｃｒｅ−Ｆｋｔｎ^ｌｏｘＰマウスモデルにおけるｒＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＨＢＥＧＦ−ＤＡＧ１（α）の治療効果を実証するために、実施例３に記載されるのと同じ注射プロトコルおよび評価を行う。

ジストログリカノパチーの別のマウスモデルであるＬａｒｇｅ−ｖｌｓマウス変異体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０：１６０−１７２，２００５）．何匹かのＬａｒｇｅ ｖｌｓマウスに、Ｐ１で顔面静脈から１×１０^１２ｖｇ ｒＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＨＢ−ＤＡＧ１ＩＶをＩＭ注射した。これらのマウスの握力テストは、潜在的な改善を示唆する。２ヶ月でグループごとに分析された４〜７匹の動物のうち、前肢の握力は野生型の４．７±．２ｇ／ｇから未処置のＬａｒｇｅ ｖｌｓマウスの３．８±０．１ｇ／ｇに低下し（ｐ＝０．０００５）、一方、ｐＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＨＢ−ＤＡＧ１（α）処置のＬａｒｇｅ ｖｌｓマウス（Ｐ１で１×１０^１２ｖｇをＩＶ）は、握力が４．４±．３ｇ／ｇに改善したことを示した（偽治療のＬａｒｇｅ ｖｌｓに対してｐ＝０．０６）。このデータは有意性に非常に近く、追加の測定で有意差が達成される可能性がある。

実施例６
リンカータンパク質としてのｓＨＢＥＧＦおよび栄養素
本明細書に記載の様々な例示的な治療用タンパク質において可溶性ＨＢＥＧＦ（ｓＨＢＥＧＦ）のヘパリン結合ドメインおよびＥＧＦ様ドメインを使用することは、患者に二重の利益を提供する。両方のドメインを含めると、ＬＡＭＡ２（Ｇ１−５）またはＤＡＧ１（α）とともにヘパリン結合ドメインを含めることで筋肉膜の安定性が増大され、ＥＧＦ様ドメインを含めるとさらに筋肉再生の刺激が得られる。図１０、１１、および１２は、ｓＨＢＥＧＦが筋肉におけるＡｋｔキナーゼ経路を活性化し、筋肉再生マーカーの発現を増加させることを示す。筋肉における活性化されたＡｋｔキナーゼの発現は、ミオスタチン阻害剤で見られるものと同様に、著しい筋肉の成長を刺激することが以前に示されている。したがって、本明細書に記載の様々な治療用タンパク質におけるＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインの存在は、本明細書に記載の疾患の治療にさらなる治療効果を追加する。

５週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの左側の腓腹筋に、筋肉の中点近くで、０．３ｍＬのインスリン注射器を使用して、５０μＬの滅菌ＰＢＳの量で、５×１０^１０ベクターゲノムのｒ（ｄｓ）ＡＡＶ９．ＣＭＶ．ＨＢ−ＥＧＦまたはｒ（ｄｓ）ＡＡＶ９．ＣＭＶ．ｓＨＢ−ＥＧＦを注射した。マウスの反対側（右側）の筋肉に、同量の滅菌ＰＢＳを偽注射した。注射の４週間または１２週間後に、マウスを屠殺し、解剖した。腓腹筋を、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に埋め込み、液体窒素で冷却されたイソペンタンで急速冷凍した。

ｓＨＢ−ＥＧＦの発現は、ｓＨＢ−ＥＧＦを認識する抗体を使用して視覚化し、Ｇａｌｇｔ２タンパク質またはＣＴグリカンに対する抗体のいずれかで共染色した。ｓＨＢ−ＥＧＦは、ｒ（ｄｓ）ＡＡＶ９．ＣＭＶ．ｓＨＢ−ＥＧＦの注射の４週間後に分析された筋肉の骨格筋線維の筋鞘膜に沿って発現した。図９は、ｓＨＢ−ＥＧＦが筋肉から分泌され得、細胞外マトリックスに付着することを示し、リンカータンパク質としてのその使用を支持する。

図１０は、ｓＨＢ−ＥＧＦが治療用代理筋ジストロフィー遺伝子の発現を誘導することを示す。

図１１は、ｓＨＢ−ＥＧＦが骨格筋においてＡｋｔチロシンキナーゼカスケードを誘導し、筋肉の成長および再生を刺激することができることを示す。

本発明は特定の実施形態に関して記載されてきたが、当業者には変形および修正が発生するであろうことを理解する。したがって、特許請求の範囲に見られるそのような制限のみが、本発明に課せられるべきである。

本出願で参照されるすべての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (50)

1. ａ）ヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢＥＧＦ）のヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトラミニンアルファ２（ＬＡＭＡ２）遺伝子のＧ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
   ｂ）ＨＢＥＧＦの前記ヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、および前記ヒトＬＡＭＡ２遺伝子の前記Ｇ１−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、
   ｃ）ＨＢＥＧＦの前記ヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、および前記ヒトＬＡＭＡ２遺伝子のＧ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、または
   ｄ）ＨＢＥＧＦの前記ヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦの前記ＥＧＦ様ドメインと、を含む第１のドメイン、および前記ヒトＬＡＭＡ２遺伝子の前記Ｇ３−Ｇ５ドメインを含む第２のドメイン、を含むタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
2. 前記タンパク質の前記第１のドメインが、配列番号１３または配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 前記タンパク質の前記第２のドメインが、配列番号１５または配列番号１６のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
4. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３および配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
5. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３および配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
6. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１４および配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
7. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１４および配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
8. ｉ）図３に示されるヌクレオチド１４〜３２３５、ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、またはｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１（ａ）に記載のポリヌクレオチド。
9. ｉ）図４に示されるヌクレオチド１４〜３３６１、ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列、またはｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１（ｂ）に記載のポリヌクレオチド。
10. ｉ）図５に示されるヌクレオチド１４〜１９３０、ｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列、またはｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１（ｃ）に記載のポリヌクレオチド。
11. ｉ）図６に示されるヌクレオチド１４〜２０５６、配列番号７のヌクレオチド配列、またはｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１（ｄ）に記載のポリヌクレオチド。
12. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶのゲノムが、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
13. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶのゲノムが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７のポリヌクレオチド配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
14. 前記ｒＡＡＶのゲノムが、筋肉特異的転写制御因子をさらに含む、請求項１２または１３に記載のｒＡＡＶ。
15. 前記筋肉特異的転写制御因子が、ＣＭＶプロモーターである、請求項１４に記載のｒＡＡＶ。
16. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶのゲノムが、配列番号２のヌクレオチド３５９０〜８２１５、配列番号４のヌクレオチド３５９０〜８３４１、配列番号６のヌクレオチド３６０９〜６９２９、配列番号８のヌクレオチド３５９０〜７０３６、または図１３に記載のヌクレオチド配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
17. ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ６カプシドを含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
18. 請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを含む、ｒＡＡＶ粒子。
19. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞。
20. チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
21. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、タンパク質。
22. 配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２２のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
23. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１８に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項２１もしくは２２に記載のタンパク質を含む、組成物。
24. ラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための方法であって、前記治療を必要とする患者に、請求項１〜１１のいずれか一項のポリヌクレオチド、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１８に記載のｒＡＡＶ粒子、請求項２１もしくは２２に記載のタンパク質、または請求項２３に記載の組成物を投与することを含む、方法。
25. ラミニン欠損筋ジストロフィーの治療を必要とする患者において前記治療を行う際に使用するための組成物であって、前記組成物が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１８に記載のｒＡＡＶ粒子、請求項２１もしくは２２に記載のタンパク質、または請求項２３に記載の組成物を含む、組成物。
26. ラミニン欠損筋ジストロフィーの治療のための薬剤の調製のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１８に記載のｒＡＡＶ粒子、請求項２１もしくは２２に記載のタンパク質、または請求項２３に記載の組成物の使用。
27. 前記ラミニン欠損筋ジストロフィーが、ＭＤＣ１Ａである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
28. ａ）ＨＢＥＧＦのヘパリン結合ドメインを含む第１のドメイン、およびヒトジストログリカン遺伝子のプロセシングされた天然アルファ鎖（ＤＡＧ１アルファ）を含む第２のドメイン、または
    ｂ）ＨＢＥＧＦの前記ヘパリン結合ドメインと、ＨＢＥＧＦのＥＧＦ様ドメインと、を含む、第１のドメイン、およびＤＡＧ１アルファを含む第２のドメイン、を含むタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
29. 前記タンパク質の前記第１のドメインが、配列番号１３または配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
30. 前記タンパク質の前記第２のドメインが、配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項２８または２９に記載のポリヌクレオチド。
31. 前記ポリペプチドが、配列番号１３および配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
32. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１４および配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
33. ｉ）図７に示されるヌクレオチド１４〜１３６０、ｉｉ）配列番号９のヌクレオチド配列、またはｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２８（ａ）に記載のポリヌクレオチド。
34. ｉ）図８に示されるヌクレオチド１４〜１４８６、ｉｉ）配列番号１１のヌクレオチド配列、またはｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２８（ｂ）に記載のポリヌクレオチド。
35. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶのゲノムが、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
36. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶのゲノムが、配列番号配列番号９または配列番号１１のポリヌクレオチド配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
37. 前記ｒＡＡＶのゲノムが、筋肉特異的転写制御因子をさらに含む、請求項３５または３６に記載のｒＡＡＶ。
38. 前記筋肉特異的転写制御因子が、ＣＭＶプロモーターである、請求項３７に記載のｒＡＡＶ。
39. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶのゲノムが、配列番号１０のヌクレオチド３５９０〜６３４０、配列番号１２のヌクレオチド３５９０〜６０４９、または図１４に記載のヌクレオチド配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
40. ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ６カプシドを含む、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
41. 請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを含む、ｒＡＡＶ粒子。
42. 請求項２８〜３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞。
43. チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
44. 請求項２８〜３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、タンパク質。
45. 配列番号２３または配列番号２５のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
46. 請求項２８〜３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項４１に記載のｒＡＡＶ粒子、または請求項４４もしくは４５に記載のタンパク質を含む、組成物。
47. ジストログリカノパチーを治療するための方法であって、前記治療を必要とする患者に、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項４１に記載のｒＡＡＶ粒子、請求項４４もしくは４５に記載のタンパク質、または請求項４６に記載の組成物を投与することを含む、方法。
48. ジストログリカノパチーの治療を必要とする患者において、前記治療を行う際に使用するための組成物であって、前記組成物が、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項４１に記載のｒＡＡＶ粒子、請求項４４もしくは４５に記載のタンパク質、または請求項４６に記載の組成物を含む、組成物。
49. ジストログリカノパチーの治療のための薬剤の調製のための、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項４１に記載のｒＡＡＶ粒子、請求項４４もしくは４５に記載のタンパク質、または請求項４６に記載の組成物の使用。
50. 前記ジストログリカノパチーが、ウォーカー・ワールブルグ症候群、筋眼脳病、福山型先天性筋ジストロフィー、ＭＤＣ１Ｃ、ＭＤＣ１Ｄ、ＬＧＭＤ２Ｉ、ＬＧＭＤ２Ｋ、ＬＧＭＤ２Ｍ、ＬＧＭＤ２Ｎ、ＬＧＭＤ２Ｏ、ＬＧＭＤ２Ｐ、ＬＧＭＤ２Ｔ、またはＬＧＭＤ２Ｕである、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。

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