CN110914413A

CN110914413A - 产生腺相关病毒的哺乳动物细胞

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Publication number: CN110914413A
Application number: CN201880025541.6A
Authority: CN
Inventors: M·福瑞; R·J·杨; A·塞思
Original assignee: Lonza AG
Current assignee: Lonza AG
Priority date: 2017-02-17
Filing date: 2018-02-17
Publication date: 2020-03-24
Also published as: EP3583205A1; WO2018150271A1; JP2023081927A; IL268525A; CA3053304A1; US20200002682A1; KR20190129857A; US11781116B2; JP2020507331A

Abstract

一种哺乳动物细胞，其包含，至少四个不同的重组靶位点(RTS)、含E1A、E1B或其组合的腺病毒(Ad)基因，和与Ad基因操作性连接的启动子，其中，所述RTS、Ad基因和所述启动子是染色体整合型的；采用所述细胞来产生重组腺相关病毒(rAAV)生产宿主细胞的方法；和采用所述AAV生产宿主细胞来生产、包装和纯化rAAV的方法。

Description

产生腺相关病毒的哺乳动物细胞

发明领域

本公开涉及一种哺乳动物细胞，其包含至少四个不同的重组靶位点(RTS)，含E1A、E1B或其组合的腺病毒(Ad)基因，和与该Ad基因操作性连接的启动子，其中所述RTS、Ad基因和启动子是染色体整合型的。本公开还涉及使用所述细胞产生重组腺相关病毒(rAAV)生产细胞的方法，以及在无活辅助病毒的情况下使用rAAV生产细胞生产、包装和纯化rAAV的方法。

背景技术

在临床开发中正积极地使用重组腺相关病毒(rAAV)，以获得基因治疗产品的长期高效递送。用于生产rAAV的基于杆状病毒的平台通常需要原材料，这些原材料具有可变性，并且生成耗时很长。可扩展性(scalibility)差可能会限制HEK293中的三重转染和瞬时表达。现有的基于可扩展HeLa细胞的生产细胞系方法需要野生型(wt)腺病毒5(Ad5)作为辅助病毒，而出于安全方面的考虑，最终产品中辅助病毒的清除至关重要。当构建产生rAAV的细胞系时，感兴趣的基因和辅助性辅助基因可瞬时表达或整合到宿主染色体中。用于修饰细胞基因组的常规DNA转导途径可能会发生不可预测的变化，并且不易互换以适应病毒血清型的不同要求。

治疗性重组腺相关病毒(AAV)构建体具有复制缺陷，且需要wt腺病毒(Ad)的共感染来进行复制和随后的感染。治疗性重组腺相关病毒(rAAV)载体的产生通常需要向宿主提供三种不同的成分：(i)提供复制和包装元件的腺相关病毒基因Rep/Cap，(ii)用于病毒包装的Ad基因组的辅助病毒功能，和(iii)位于3'和5'AAV反向末端重复序列(ITR)之间的感兴趣的基因(GOI)。认为进行高效基因表达、DNA复制和包装所需的Ad基因包括E1A、E1B、E2A、E4和VA RNA。认为E1A是在Ad感染期间产生的最早的基因产物(Shenk,T.等,《领域病毒学(Fields Virology)》,第3版,2211-2148(1996))。据信E1A可通过上调从AAV Rep基因启动子p5和p19的转录以及激活E1B、E2A和E4的早期腺病毒启动子来启动病毒复制。由于AAV编码的蛋白质(Rep和Cap)不具有此功能，从而也认为E1A可用于驱动宿主细胞进入细胞周期的S期以进行病毒DNA复制。E1A的不利作用是它使p53稳定，导致凋亡(Low等,Genes&Dev.7:535-545(1993))。E1A的泄漏性表达(leaky expression)可开启Ad基因和AAV Rep基因。据报道后者具有细胞生长抑制作用和细胞毒性，从而难以从组成型表达E1A的细胞中获得稳定的细胞系。经调控的E1A基因表达对于无辅助病毒的AAV包装细胞系的成功至关重要。

已经尝试了将这些元件聚集在一起以产生rAAV的不同方法和不同的细胞系。这些不同的细胞系包括HEK293和HeLa细胞系。不同的方法还包括杆状病毒系统的使用。但是，每种细胞系和方法都有其缺点，均不是用作可扩展、强大的rAAV生产方法的理想平台。

一种rAAV生产方法包括HEK293细胞，其通过利用物理剪切的Ad5 DNA转染初级胚胎肾细胞而产生(Graham F.L.等,J.Gen.Virol.36:59-74(1977))。据报道，基因组分析表明，HEK293细胞携带腺病毒基因组左端(碱基1-4344)的整合片段，其中包含E1区和其它侧接序列(Louis N.等,Virology 233:423-9(1997))。一些三重转染方法使用贴壁HEK293细胞，用于采用含剩余必需元件的质粒进行转染。尽管在rAAV生产中使用HEK293是可能的，但基于贴壁细胞的方法无法扩展以满足用于各种适应症的越来越多的载体需求，并且依赖瞬时转染而不是稳定的生产细胞系。

第二个rAAV生产方法的特征是生成和选择同时包含AAV基因Rep/Cap和GOI的稳定转染的HeLa细胞克隆。这些细胞系随后可被wt Ad5感染，以触发rAAV颗粒的包装。尽管该方法是可扩展的，但是这些克隆的产生可能是一个漫长而费力的过程，并且从该方法的最终产物中去除wt Ad5病毒会使该方法增加多个步骤。

第三种rAAV生产方法依赖于重组杆状病毒来引入AAV基因(Rep/Cap)，并在SF9昆虫细胞中直接发挥所需的辅助病毒功能用于生产rAAV。尽管该方法在悬浮培养中可扩展，但它需要生成噬菌斑纯化的重组杆状病毒构建体，从而造成更长的产品开发时间。

需要一种新颖、高效的rAAV生产平台来产生高质量载体用于临床前和临床研究，所述平台通过提供一种产生用于任何所需AAV血清型的稳定生产细胞系(producer cellline)的快速方法来解决上述缺陷，其还在无需添加活辅助病毒的情况下提供可扩展的高产量。

I型干扰素(IFN)是最早发现的细胞因子，且因其“干扰”病毒复制的强大能力而得名。许多病毒产物可阻断IFN相关信号，例如抑制蛋白激酶(PKR)的流感NS1蛋白和牛痘病毒E3L蛋白，以及牛痘病毒编码的可溶性IFN-α/β受体诱饵。

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Puck,J.Exp.Med.,108:259-268(1958))是一种成熟表征的细胞系，其因生产力高，稳健性质和工业安全记录和往绩记录而通常用于从哺乳动物细胞中商业生产重组蛋白(Birch和Racher,Adv.Drug Delivery Rev.,58:671-685(2006))。但是，CHO细胞在之前尚未用于生产rAAV。

本文引用各种公开文献，其公开内容通过引用其全部内容纳入本文。

发明概述

在一些实施方式中，本公开提供了哺乳动物细胞，其包含(i)至少四个不同的重组靶位点(RTS)，(ii)含E1A、E1B或其组合的腺病毒(Ad)基因，和(iii)与Ad基因操作性连接的启动子，其中所述RTS、Ad基因和启动子是染色体整合型的。在一些实施方式中，细胞是小鼠细胞，人细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，CHO-K1细胞，CHO-DXB11细胞，CHO-DG44细胞，CHOK1SV^TM细胞(隆萨公司(Lonza)，英国斯劳)(包括所有变体)，CHOK1SV GS-KO^TM(谷氨酰胺合成酶敲除型)细胞(隆萨公司(Lonza)，英国斯劳)(包括所有变体)，HEK293细胞(包括贴壁和悬浮适应的变体)，HeLa细胞或HT1080细胞。在一些实施例中，所述细胞包含四个RTS。在一些实施方式中，所述细胞包含六个RTS。在一些实施方式中，至少一个RTS选自SEQ ID NO:1-30。在一些实施方式中，至少一个RTS、Ad基因和启动子整合在单个染色体基因座上。在一些实施方式中，染色体基因座是X染色体上MID1的第一内含子、NL2、NL1、Fer1L4、ROSA26、HGPRT、DHFR、COSMC、LDHa、MGAT1、GRIK1，或增强的表达和稳定性区(EESYR，参见例如，美国专利号7,771,997)。在一些实施方式中，细胞包含位点特异性重组酶基因。在一些实施方式中，位点特异性重组酶基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，所述细胞包含第二Ad基因，其中，所述第二Ad基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，第二Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合。在一些实施方式中，第二Ad基因来自Ad5。在一些实施方式中，第二Ad基因位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞还包含腺相关病毒(AAV)基因，其中所述AAV基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，AAV基因包含Rep、Cap或其组合。在一些实施方式中，AAV基因来自2型腺相关病毒。在一些实施方式中，AAV基因位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞还包含AAV载体盒，其中所述AAV载体盒是染色体整合型的。在一些实施方式中，AAV载体盒包含报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。在一些实施方式中，AAV载体盒位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞基本上不含辅助病毒。

在一些实施方式中，本公开提供了哺乳动物细胞，其包含(i)至少四个不同的重组靶位点(RTS)，(ii)Ad基因E2A、E4、VA、MIR342或其组合，和(iii)与Ad基因操作性连接的启动子，其中RTS、Ad基因和启动子是染色体整合型的。在一些实施方式中，所述细胞是小鼠细胞，人细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，CHO-K1细胞，CHO-DXB11细胞，CHO-DG44细胞，CHOK1SV^TM细胞(包括所有变体)，CHOK1SV GS-KO^TM(谷氨酰胺合成酶敲除型)细胞(包括所有变体)，HEK293细胞(包括贴壁和悬浮适应型变体)，HeLa细胞或HT1080细胞。在一些实施例中，所述细胞包含四个RTS。在一些实施方式中，所述细胞包含六个RTS。在一些实施方式中，至少一个RTS选自SEQ ID NO:1-30。在一些实施方式中，RTS、Ad基因和启动子整合在单个染色体基因座处。在一些实施方式中，染色体基因座是X染色体上MID1的第一内含子，NL2，NL1，Fer1L4，ROSA26，HGPRT，DHFR，COSMC，LDHa，MGAT1，GRIK1，或增强的表达和稳定性区(EESYR)。在一些实施方式中，所述细胞包含位点特异性重组酶基因。在一些实施方式中，位点特异性重组酶基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，所述细胞还包含第二Ad基因，其中，所述第二Ad基因是染色体整合的。在一些实施方式中，第二Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合。在一些实施方式中，第二Ad基因来自Ad5。在一些实施方式中，第二Ad基因位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞还包含腺相关病毒(AAV)基因，其中所述AAV基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，AAV基因包含Rep、Cap或其组合。在一些实施方式中，AAV基因来自2型腺相关病毒。在一些实施方式中，AAV基因位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞还包含AAV载体盒，其中所述AAV载体盒是染色体整合型的。在一些实施方式中，AAV载体盒包含报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。在一些实施方式中，AAV载体盒位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞基本上不含辅助病毒。

在一些实施方式中，本公开提供了哺乳动物细胞，其包含(i)至少四个不同的重组靶位点(RTS)，和(ii)包含Rep、Cap或其组合的腺相关病毒(AAV)基因，其中RTS和AAV基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，AAV基因来自2型腺相关病毒。在一些实施方式中，所述细胞是小鼠细胞，人细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，CHO-K1细胞，CHO-DXB11细胞，CHO-DG44细胞，CHOK1SV^TM细胞(包括所有变体)，CHOK1SV GS-KO^TM细胞(包括所有变体)，HEK293细胞(包括贴壁和悬浮适应型变体)，HeLa细胞或HT1080细胞。在一些实施方式中，所述细胞包含四个RTS。在一些实施方式中，所述细胞包含六个RTS。在一些实施方式中，至少一个RTS选自SEQ ID NO:1-30。在一些实施方式中，RTS和AAV基因整合在单个染色体基因座处。在一些实施方式中，染色体基因座是X染色体上MID1的第一内含子，NL2，NL1，Fer1L4，ROSA26，HGPRT，DHFR，COSMC，LDHa，MGAT1，GRIK1，或增强的表达和稳定性区(EESYR)。在一些实施方式中，所述细胞包含位点特异性重组酶基因。在一些实施方式中，位点特异性重组酶基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，所述细胞还包含Ad基因和与Ad基因操作性连接的启动子，由此Ad基因和启动子是染色体整合型的。在一些实施方式中，所述Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合。在一些实施方式中，Ad基因来自Ad5。在一些实施方式中，AAV基因位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞还包含AAV载体盒，其中所述AAV载体盒是染色体整合型的。在一些实施方式中，AAV载体盒包含报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。在一些实施方式中，AAV载体盒位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞基本上不含辅助病毒。

在一些实施方式中，本公开提供了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包含：六个不同的重组靶位点(RTS)，其中至少一个RTS选自SEQ ID NO:1-30，包含E1A和E1B的腺病毒(Ad)基因，与该Ad基因操作性连接的启动子，其中RTS、Ad基因和该启动子是染色体整合型的，含E2A、E4、VA、和MIR342的第二Ad基因，其中第二Ad基因是染色体整合型的且位于两个RTS之间，含Rep和Cap的腺相关病毒(AAV)基因，其中该AAV基因是染色体整合型的且位于两个RTS之间，和含报告基因、选择基因或治疗上感兴趣的基因的AAV载体盒，其中所述AAV载体盒是染色体整合型的且位于两个RTS之间。

在一些实施方式中，本公开提供了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包含含有E1A和E1B的腺病毒(Ad)基因和操作性连接至所述Ad基因的启动子，含E2A、E4、VA和MIR342的第二Ad基因，含Rep和Cap的腺相关病毒(AAV)基因，以及含报告基因、选择基因、治疗上感兴趣的基因或其组合的AAV载体盒。

在一些实施方式中，本公开提供了一种用于产生重组腺相关病毒(rAAV)生产细胞的方法，其包括：提供这样的细胞，其包含至少四个不同的重组靶位点(RTS)，含E1A、E1B或其组合的腺病毒(Ad)基因，以及与该Ad基因操作性连接的启动子，其中RTS、Ad基因和启动子是染色体整合型的，用载体转染如此提供的细胞，所述载体包含编码腺相关病毒(AAV)基因的可交换盒(exchangeable cassette)，第二Ad基因，AAV载体盒或其组合，将可交换盒整合到染色体中，和，选择具有整合到染色体中的可交换盒的rAAV生产细胞。在一些实施方式中，用两种载体进行转染，第一载体包含含有第二Ad基因和AAV基因的可交换盒，第二载体包含含有AAV载体盒的可交换盒。在一些实施方式中，用两种载体进行转染，第一载体包含含有第二Ad基因的可交换盒，第二载体包含含有AAV基因的可交换盒。在一些实施方式中，用三种载体进行转染，第一载体包含含有第二Ad基因的可交换盒，第二载体包含含有AAV基因的可交换盒，第三载体包含含有AAV载体盒的可交换盒。在一些实施方式中，每个可交换盒还包括两个RTS，与细胞的两个RTS匹配。在一些实施方式中，第二Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合。在一些实施方式中，AAV基因包含Rep、Cap或其组合。在一些实施方式中，AAV载体盒包含报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。

在一些实施方式中，本公开提供了一种产生重组腺相关病毒(rAAV)的方法，该方法包括：(i)用rAAV感染宿主细胞，(ii)产生包装有AAV载体盒的rAAV，和(iii)纯化包装的rAAV，其中所述宿主细胞包含：至少四个不同的重组靶位点(RTS)，含E1A、E1B或其组合的腺病毒(Ad)基因，与所述Ad基因操作性连接的启动子，其中所述RTS、Ad基因和启动子是染色体整合型的第二Ad基因，其含E1A、E1B，E2A、E4、VA、MIR342或其组合，含Rep、Cap或其组合的腺相关病毒(AAV)基因，以及AAV载体盒，其含报告基因、选择基因、治疗上感兴趣的基因或其组合。在一些实施方式中，rAAV的生产和包装不需要活的野生型辅助病毒。在一些实施方式中，rAAV的产生不需要E1A的表达。在一些实施方式中，纯化后获得至少1.0×10⁹vg/mL的活性AAV。

附图说明

图1显示在HEK293和CHOK1SV GS-KO^TM细胞中重组腺相关病毒(rAAV)的产生。在HEK293细胞中，完成了质粒三重转染(pAAV-GFP(AAV-400，细胞生物实验室公司(CellBiolabs))、pRC2-mi342(6234，克隆泰克公司(Clontech))和pHelper(6234，克隆泰克公司(Clontech)))。在CHOK1SV GS-KO^TM中完成了采用辅助病毒共感染(wt Ad5)的双重转染(pAAV-GFP(AAV-400，细胞生物实验室公司(Cell Biolabs))和pRC2-mi342(6234，克隆泰克公司(Clontech)))。图1A显示实验设计的示意图。图1B显示在转染的CHOK1SV GS-KO^TM细胞(左)和用来自转染的CHOK1SV GS-KO^TM细胞的裂解物感染的HEK293细胞(右)中检测绿色荧光蛋白(GFP)信号。图1C显示通过病毒基因组DNA的qPCR分析对rAAV效价CHOK1SV GS-KO^TM和HEK293(对照)细胞的定量。

图2显示pMF30载体图。带有GS选择标志物的TET诱导型载体中的E1A。

图3显示pMF23载体图。带有PAC选择标志物的组成型载体中的E1B。

图4显示pXC17.4_17Ad5PerProKZ载体图。E1A和E1B由单个启动子表达(保留位于E1A和E1B编码序列之间的病毒启动子区域(核苷酸498-3635)和两个基因之间的病毒调节区)，如Qiao等所述(Qiao等,J.Virol.76:1904-13(2002))。注释匹配Qiao等,J.Virol.76:1904-13(2002)中描述的坐标。

图5显示表达wt Ad5 E1A和E1B的CHOK1SV GS-KO^TM库的构建，以使得在没有辅助病毒的情况下能够在这些细胞中产生rAAV。图5A显示实验设计的示意图。图5B显示HEK293F，HEK293L，CHOK1SV GS-KO^TM和CHOK1SVGS-KO^TM拟和CHOK1SV GS-KO^TM(E1A_E1B)库中E1A的基因组PCR产物的琼脂糖凝胶分析。图5C显示HEK293F，HEK293L，CHOK1SV GS-KO^TM宿主以及CHOK1SV GS-KO^TM拟和CHOK1SV GS-KO^TME1A_E1B库中E1B的基因组PCR产物的琼脂糖凝胶分析。图5D显示HEK293F，HEK293L，CHOK1SV GS-KO^TM宿主以及CHOK1SV GS-KO^TM拟和CHOK1SVGS-KO^TME1A_E1B库(其用多四环素处理)中E1A的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶分析。图5E显示HEK293F，HEK293L，CHOK1SV GS-KO^TM以及CHOK1SV GS-KO^TM拟和CHOK1SV GS-KO^TME1A_E1B库(其用多四环素处理)中E1B的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶分析。分图F显示CHOK1SV GS-KO^TM拟和CHOK1SV GS-KO^TME1A_E1B库中E1A和β-肌动蛋白的蛋白裂解物的Western印迹分析。

图6显示pRC2-miRNA342(6234，克隆泰克公司(Clontech))(图6A)，pHelper(6234，克隆泰克公司(Clontech))(图6B)和pAAV-GFP(AAV-400，细胞生物实验室公司(CellBiolabs))(图6C)的载体图。

图7显示CHEK1SV GS-KO^TM和HEK293位点特异性整合细胞系中的三个可独立寻址的位点特异性整合位点(SSIS)的示意图。图7A显示包含单功能或双功能报告/标志物基因的着陆坪(landing pad)1的排布。报告基因在SV40E启动子的控制下并且具有SV40多聚A序列。不相容的Frt位点位于SV40启动子和hpt-eGFP基因(Frt-A)之间和SV40多聚A序列(Frt-B)的5'，用于重组酶介导的盒交换(RMCE)。图7B和图7C显示后续着陆坪的排布，其包含不相容的Frt位点(C，D，E和F)和不同的报告子以允许荷载序列(payload sequence)的独立靶向。在这种情况下，Frt位点A-F可以是表2中描述的任何位点。

图8显示用于制备CHOK1SV GS-KO^TM-AAV生产细胞的方法的系统示意图。采用SSIS来引入腺病毒(Ad)基因(辅助基因)，AAV基因(Rep/Cap)和AAV载体盒(例如ITR-GOI-ITR)，并且在CHOK1SV GS-KO^TM中，其它Ad基因(E1A/E1B)伴随诱导型启动子一起引入别处。在这种情况下，Frt位点A-F可以是表2中描述的任何位点。图8A显示单位点CHEK1SV GS-KO^TM和HEK293宿主的排布。Ad辅助基因在SSIS处整合，且GOI/Rep/Cap基因从质粒瞬时表达。图8B显示双位点CHOK1SV GS-KO^TM和HEK293宿主的排布。Ad辅助基因和Rep/Cap基因整合在两个独立的SSIS上，GOI从质粒瞬时表达。图8C显示三位点CHEK1SV GS-KO^TM和HEK293宿主的排布。辅助基因、Rep/Cap和GOI基因整合在三个独立的SSIS中。在一些情况下，E1A和E1B基因也整合到SSIS中以增强表达。

图9显示利用GOI和Rep/Cap基因在不同位点的位点特异性整合在CHOK1SV GS-KO^TM位点特异性整合(SSI)宿主中产生rAAV的示意图。为了产生rAAV，用wt Ad5感染CHOK1SVGS-KO^TMSSI宿主，以提供rAAV复制所需的辅助基因功能。

图10显示GOI载体的示意图和Rep/Cap基因的四种设计，用于位点特异性整合在CHOK1SV GS-KO^TM宿主中。所有载体均侧接两个Frt位点，以允许SSI进入CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主细胞。图10A示意性地显示载体pLMC31的结构(编码rAAV载体，其具有在AAV盒的任一端侧接ITR的eGFP报告基因)。该载体中的选择标志物是新霉素磷酸转移酶I基因，并且安排了Frt位点以靶向NL1。图10B示意性地显示载体pLMC32(编码AAV2 Rep/Cap基因)的结构。该载体包括Rep的min p5启动子(白方块)5'，其包含两个增强子元件以减少Rep表达和抑制rAAV产生，和Cap的3'的完整p5启动子(黑色和白色正方形)以增强Cap表达。图10C示意性地显示载体pLMC33(编码AAV2 Rep/Cap基因)的结构。该载体包括Rep的5'的min p5启动子(白色正方形)和p5mut启动子(黑色和灰色方块)，其TATA框突变为GGGGGGG以降低Cap的3'的启动子活性。图10D示意性显示载体pLMC34的结构，该载体还编码AAV2 Rep/Cap基因。该载体包括Rep的5'的野生型p5启动子(黑色和白色方块)和Cap的3'的突变p5启动子(黑色和灰色方块)。图10E示意性显示载体pLMC35(也编码AAV2 Rep/Cap基因)的结构。此载体在Rep的5'和Cap的3'包含突变的p5启动子(黑色和灰色方块)。pLMC32到pLMC35的选择标志物是GS cDNA，并且安排了Frt位点用于靶向Fer1L4。

图11通过Western印迹分析显示HE1293和CHOK1SV GS-KO^TM细胞中E1A、Rep和Cap的蛋白质表达。HEK293细胞用pHelper(6234，基因泰克公司(Clontech))，GOI(pLMC31)和一个Rep-Cap载体(pLMC32-35)转染，或用pHelper(6234，基因泰克公司(Clontech))，pRC2-mi342(6234，基因泰克公司(Clontech))和pAAV-GFP(AAV-400，细胞生物实验室公司(CellBiolabs))三重转染。CHOK1SV GS-KO^TM细胞用wt Ad5感染并用GOI(pLMC31)和一个Rep-Cap载体(pLMC32-35)转染，或用wt Ad5感染并用pRC2-mi342(6234，基因泰克公司(Clontech))和pAAV-GFP(AAV-400，细胞生物实验室公司(Cell Biolabs))转染。转染后三天，通过Western印迹分析蛋白质裂解物。图11A显示三种E1A同种型的水平：E1A 289R，E1A 243R和E1A 171R(Radko等(2015)PLoS One.10:e0140124)。使用1:1000稀释的小鼠抗E1A抗体(阿柏堪穆公司(Abcam)，ab33183)检测E1A蛋白水平。E1A、Rep和Cap蛋白同种型的分子量显示在括号中。用不同载体转染的HEK293或CHOK1SV GS-KO^TM细胞中E1A蛋白水平没有变化，但HEK293和CHOK1SV GS-KO^TM细胞之间每种E1A同种型的蛋白质水平均不同。图11B显示Rep78和Rep52蛋白的水平。使用以1:1000稀释的小鼠抗Rep抗体(ARP，03-61069)检测Rep蛋白水平。括号中显示分子量。用不同载体转染的HEK293或CHOK1SV GS-KO^TM细胞中Rep52蛋白水平没有变化，但用pLMC34和pLMC35转染的细胞中Rep78蛋白水平更高。图11C显示使用1:1000稀释的小鼠抗Cap抗体(ARP，03-61058)的三种Cap同种型的水平：VP1、VP2和VP3。括号中显示分子量。用不同载体转染的HEK293细胞中VP3蛋白水平没有变化，在HEK293细胞中未检测到VP1和VP2。在CHOK1SV GS-KO^TM细胞中未检测到VP1，VP2和VP3。图11D显示使用1:1000稀释的小鼠抗β-肌动蛋白抗体(TFS，MA5-1573)进行的β-肌动蛋白加载对照。

图12显示HEK293和CHOK1SV GS-KO^TM细胞产生的rAAV的感染性。HEK293细胞用Rep/Cap、GOI和pHelper(6234，克隆泰克公司(Clontech))三重转染。CHOK1SV GS-KO^TM细胞用Rep/Cap和GOI转染，并用wt Ad5感染。转染后三天，使用等体积的粗制rAAV收获物感染HEK293细胞。转导后两天，获得绿色荧光和明场图像。GOI包装的rAAV产生绿色荧光。显示的比例尺表示50μm。三重转染的HEK293细胞(pHelper(6234，克隆泰克公司(Clontech))，pRC2-mi342(6234，克隆泰克公司(Clontech))，pAAV-GFP(AAV-400，细胞生物实验室公司(Cell Biolabs)))产生的rAAV的感染性高于转染的rAAVCHOK1SV GS-KO^TM细胞(第三组)产生的rAAV。值得注意的是，转染了pLMC32-35的HEK293细胞产生的rAAV的感染力高于转染了pRC2-mi342(6234，克隆泰克公司(Clontech))的HEK293细胞(上图)。

图13显示具有GOI的SSI和四种Rep-Cap构型之一的CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主衍生库的构建。库分两个阶段生成。在第1阶段的第1部分中，将CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主用FLP重组酶载体(pMF4)和一个Rep-Cap载体(pLMC32-35)转染，然后在无谷氨酰胺的培养基中进行选择。在第1阶段的第2部分中，将CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主用FLP重组酶载体(pMF4)，一个Rep-Cap载体(pLMC32-35)和GOI载体(pLMC31)转染，然后在含遗传霉素(500μg/mL或750μg/mL)的无谷氨酰胺的培养基中进行选择。这些成为了“A”库。在第2阶段，用FLP重组酶(pMF4)和GOI载体(pLMC31)转染“A”库4-7，然后在含有遗传霉素(400μg/mL)的培养基中进行选择。这些成为了“B”库。

图14显示用于检测定靶(on-target)SSI和剩余(未替换的)着陆坪的引物位置的示意图。设计引物组P5用于检测位于Fer1L4基因中的着陆坪中的特异性Rep/Cap整合。预期产物大小为1524bp。引物组P6设计用于检测残余的着陆坪。预期产物大小为487bp。引物组P7设计用于检测特异性GOI整合到位于NL1基因座中的着陆坪中的情况。预期产物大小为1446bp。引物组P8设计用于检测残余的NL1着陆坪。预期产物大小为809bp。

图15显示用于Rep/Cap整合到Fer1L4着陆坪中的基因组DNA PCR产物的琼脂糖凝胶分析。从“A”库，“B”库，CHOK1SV GS-KO^TM和CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主中收获基因组DNA，然后使用引物组5或6通过PCR进行扩增。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离。图15A显示使用引物组P5对特异性Rep/Cap整合到位于Fer1L4基因中的着陆坪中的基因组DNA PCR产物的琼脂糖凝胶分析。预期产物大小为1524bp。结果显示位于“A”库4、5、6、7、9、11、17、18、19、21以及所有分析的“B”库中的Fer1L4基因中的着陆坪中的特异性Rep/Cap整合。如同预期，在CHOK1SV GS-KO^TM和CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主中未检测到特异性的Rep/Cap整合。图15B显示使用引物组P6对Fer1L4基因中的残余着陆坪的基因组DNA PCR产物的琼脂糖凝胶分析。预期产物大小为487bp。结果显示一些残余的着陆坪，和位于所有“A”库(除了18)和所有“B”库中Fer1L4基因中的着陆坪中的不完全Rep/Cap整合。“A”库19中的PCR产物较小，表明部分序列丢失。如同预期，Fer1L4着陆坪在CHOK1SV GS-KO^TM细胞中扩增，但在CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主中未检测到。

图16显示用于GOI整合到NL1着陆坪中的基因组DNA PCR产物的琼脂糖凝胶分析。从“A”库，“B”库，CHOK1SV GS-KO^TM和CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主中收获基因组DNA，然后使用引物组7或8通过PCR进行扩增。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离。图16A显示使用引物组P7对特异性GOI整合到NL1着陆坪中的基因组DNA PCR产物的琼脂糖凝胶分析。预期产物大小为1446bp。结果显示所有“B”库中(但非“A”库中)的NL1基因座中的着陆坪中的特异性GOI整合。如同预期，在CHOK1SV GS-KO^TM和CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主中未检测到特异性GOI整合。图16B显示使用引物组P8对残余NL1着陆坪的基因组DNA产物的琼脂糖凝胶分析。预期产物大小为809bp。结果显示一些残余的着陆坪，和位于所有“A”库(除了11)和所有“B”库中NL1基因中的着陆坪中的不完全GOI整合。根据结果，NL1着陆坪在“A”库11中不完整，但GOI尚未整合到着陆坪中。如同预期，NL1着陆坪在CHOK1SV GS-KO^TM细胞中扩增，但在CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主中未检测到。

图17通过Western印迹分析显示wt Ad5感染的CHOK1SV GS-KO^TM细胞中E1A、Rep和Cap的蛋白质表达。“A”库和“B”库被wt Ad5感染三天，然后收获以进行E1A、Rep、Cap和β-肌动蛋白表达分析。图17A显示三种E1A同种型的水平：E1A 289R，E1A 243R和E1A 171R。使用1:1000稀释的小鼠抗E1A抗体(阿柏堪穆公司(Abcam)，ab33183)检测E1A蛋白水平。E1A、Rep和Cap蛋白同种型的分子量显示在括号中。所有库中所有三种E1A亚型的水平均相同，并且略高于CHOK1SV GS-KO^TM细胞。图17B显示Rep78和Rep52蛋白的水平。使用以1:1000稀释的小鼠抗Rep抗体(ARP，03-61069)检测Rep蛋白水平。括号中显示分子量。Rep78未检到。在“A”库13和“B”库6、7、8和10中检测到Rep52，用*表示。图11C显示使用1:1000稀释的小鼠抗Cap抗体(ARP，03-61058)的三种Cap同种型的水平：VP1、VP2和VP3。括号中显示分子量。未检测到VP1，Vp2和VP3。图17D显示使用1:1000稀释的小鼠抗β-肌动蛋白抗体(TFS，MA5-1573)进行的β-肌动蛋白加载对照。

图18显示用于检测AAV2 Rep和Cap mRNA的引物位置的示意图。引物组P1用于Rep78和Rep68。引物组P2用于Rep78，Rep68，Rep52和Rep40。引物组P3用于Rep78和Rep52。引物组P4用于总Rep和Cap。*表示用于生产VP3的替代ACG密码子。AAV2基因组结构适应自Samulski和Muzyczka.,Annu.Rev.Virol.1:427-451(2014)。

图19显示对来自转染的HEK293和CHOK1SV GS-KO^TM细胞的Rep-Cap基因和Ad5辅助基因的mRNA表达分析。用pRC2-mi342(6234，克隆泰克公司(Clontech))，pAAV-GFP(AAV-400，细胞生物实验室公司(Cell Biolabs))载体(黑条)对HEK293细胞进行三重转染。CHOK1SV GS-KO^TM细胞用pRC2-mi342和pAAV-GFP转染，并用wt Ad5(白色柱)感染。对照包括用pRC2-mi342转染的HEK293或CHOK1SV GS-KO^TM细胞(左侧柱)。制备了用于Rep/Cap和Ad辅助基因的RT-qPCR分析的cDNA。将表达数据用β-肌动蛋白进行内部标准化，然后与HEK293对照样品进行比较。引物序列包括在图21中。图19A显示Rep78和Rep68的mRNA水平。三重转染后，分别在HEK293和CHOK1SVGS-KO^TM细胞中观察到约6倍和约5倍诱导。图19B显示Rep78，Rep68，Rep52和Rep40mRNA水平。三重转染后，分别在HEK293和CHOK1SV GS-KO^TM细胞中观察到约11倍和约5倍诱导。图19C显示Rep78和Rep52mRNA水平。三重转染后，分别在HEK293和CHOK1SV GS-KO^TM细胞中观察到约17倍和约4倍诱导。图19D显示总Rep和Cap mRNA水平。三重转染后，分别在HEK293和CHOK1SV GS-KO^TM细胞中观察到约20倍和约7倍诱导。图19E显示E1AmRNA水平。三重转染后在HEK293中观察到约1倍的诱导。在对照CHOK1SV GS-KO^TM细胞中未检测到E1A mRNA，但在转染和wt Ad5感染后检测到E1A mRNA。图19F显示E1B-19K mRNA水平。三重转染后在HEK293中观察到约1倍的诱导。在对照CHOK1SV GS-KO^TM细胞中未检测到E1AmRNA，但在转染和wt Ad5感染后检测到E1B-19K mRNA。图19G显示E1B-55K mRNA水平。三重转染后在HEK293中观察到约1倍的诱导。在对照CHOK1SV GS-KO^TM细胞中未检测到E1A mRNA，但在转染和wt Ad5感染后检测到E1B-55K mRNA。图19H显示E2A mRNA水平。E2A mRNA在对照样品中未检到，并在三重转染后存在。图19I显示E4 mRNA水平。E4 mRNA在对照样品中未检到，并在三重转染后存在。图19J显示VAI mRNA水平。VAI mRNA在对照样品中未检到，并在三重转染后存在。图19K显示VAII mRNA水平。VAII mRNA在对照样品中未检到，并且在三次转染后存在。与HEK293细胞相比，在CHOK1SV GS-KO^TM中，除E4外，所有观察到的mRNA水平均较低(图19A-K)。这些数据表明，与HEK293细胞相比，CHOK1SV GS-KO^TM细胞中Rep-Cap mRNA的诱导和表达较低。

图20显示来自三重转染的HEK293和CHOK1SV GS-KO^TM细胞的rAAV的效价。HEK293细胞用pHelper(6234，克隆泰克公司(Clontech))和一种pLMC32-35或pRC-mi342(6234，克隆泰克公司(Clontech))和pLMC31或pAAV-GFP(AAV-400，细胞生物实验室公司(CellBiolabs))载体转染。CHOK1SV GS-KO^TM细胞用wt Ad5和一种pLMC32-35或pRC-mi342(6234，克隆泰克公司(Clontech))和pLMC31或pAAV-GFP(AAV-400，细胞生物实验室公司(CellBiolabs))载体感染。转染三天后，提取DNA以进行AAV表达的TaqMan-qPCR分析。CHOK1SVGS-KO^TM细胞产生的AAV效价低于HEK293细胞的情况，并且使用pHelper(6234，克隆泰克公司(Clontech))、pLMC31和pLMC32-35三重转染的HEK293细胞产生的效价显著高于采用Clontech载体(pHelper(6234,克隆泰克公司(Clontech))，pRC2-mi342(6234,克隆泰克公司(Clontech))和pAAV-GFP(AAV-400,细胞生物实验室公司(Cell Biolabs)))三重转染的HEK293细胞的情况。

图21显示用于TaqMan-qPCR和基因组DNA PCR分析的引物序列。

发明详述

术语“一种”或“一个”当与“包含”在权利要求和/或说明书中联用时，可表示“一个/种”，但也与“一个/种或多个/种”，“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的意思一致。

在整篇申请中，术语“约”用于表示包含用于测定数值的装置/方法的误差的固有差异或存在于研究对象中的差异的值。通常，该术语视情况而定表示包括大约或少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％可变性。

在权利要求中使用术语“或”表示“和/或”，除非特别指出仅指替代方式，或替代方式互相排除，但公开内容支持仅指替代方式和“和/或”的定义。

如本说明书和权利要求中所使用的，术语“包含”(和任何形式的包含，例如“含有”和“含”)，“具有”(以及任何形式的具有，例如“有”和“拥有”)，“包括”(以及任何形式的包括，例如“囊括”和“括入”)或“含有”(以及任何形式的含有，例如“含入”和“包含”)都是纳入性或开放性的，并不排除额外的未提到的元素或方法步骤。考虑本说明书中所讨论的任何实施方式可以用任何本发明的方法、系统、宿主细胞、表达载体和/或组合物实现。此外，本发明的组合物、系统、细胞和/或载体可用于实现本文所述的任何方法。

术语“例如”及其相应缩写“如”(无论是否用斜体)的使用意味着所引用的特定术语是本公开的代表性示例和实施方式，并不旨在限于所引用或援引的特定示例，除非另有明确说明。

本公开提供了哺乳动物细胞，其包含(i)至少四个不同的重组靶位点(RTS)，(ii)含E1A、E1B或其组合的腺病毒(Ad)基因，和(iii)与Ad基因操作性连接的启动子，其中所述RTS、Ad基因和启动子是染色体整合型的。

“核酸”、“核酸分子”或“寡核苷酸”表示包含共价连接的核苷酸的聚合化合物。术语“核酸”包括多核糖核酸(RNA)和多脱氧核糖核酸(DNA)，它们都可以是单链或双链的。DNA包括但不限于互补DNA(cDNA)、基因组DNA、质粒或载体DNA和合成DNA。RNA包括但不限于mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、微小RNA、miRNA或MIRNA。

提及核酸分子、肽、多肽或蛋白质时，术语“重组”用于表示自然界中不存在的一种新的遗传物质组合或由其产生。重组分子可以通过重组技术领域内可用的任何熟知的技术产生，包括但不限于，聚合酶链反应(PCR)，基因切割(例如，使用限制性内切核酸酶)和核酸分子、肽或蛋白质的固态合成。在一些实施方式中，“重组体”指不知其在自然界中存在的病毒载体或病毒，例如，在病毒载体或病毒中具有一种或多种突变、核酸插入，或异源性基因的病毒载体或病毒。在一些实施方式中，“重组体”指不知其在自然界中存在的细胞或宿主细胞，例如，在细胞或宿主细胞中具有一种或多种突变、核酸插入，或异源性基因的细胞或宿主细胞。

“分离的”多肽、蛋白质、肽或核酸是已经从其自然环境中移出的分子。还应当该理解的是，“分离的”多肽、蛋白质、肽或核酸可以与赋形剂如稀释剂或佐剂一起配制，并且仍认为其是分离的。

在核酸序列或氨基酸序列的情况中，术语“序列相同性”或“％相同性”是指当序列在指定的比较窗口对齐时，比较的序列中相同的残基的百分比。比较窗口可以是至少10个残基至超过1000个残基的区段，其中序列可以被对齐并比较。用于确定序列相同性的对齐方法为本领域所熟知，可以使用公众可得的数据库诸如BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.)进行。

在一些实施方式中，多肽或核酸分子分别与参照多肽或核酸分子(或参照多肽或核酸分子的片段)具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的序列相同性。在本公开的某些实施方式中，多肽或核酸分子分别与参照多肽或核酸分子(或参照多肽或核酸分子的片段)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％或100％的序列相同性。在一些实施方式中，多肽或核酸分子分别与参照多肽或核酸分子具有约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％的序列相同性。

本文所用“启动子”，“启动子序列”或“启动子区域”指能够结合RNA聚合酶并涉及启动下游编码或非编码序列的转录的DNA调控区域/序列。在本公开的一些示例中，启动子序列包括转录起始位点并向上游延伸以包括以高于背景可检测到的水平启动转录所需的最少数量的碱基或元件。在一些实施方式中，启动子序列包含转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域。真核启动子通常但并不总是包含“TATA”盒和“CAT”盒。各种启动子，包括诱导型启动子，可以用于驱动基因表达，例如，在本公开的宿主细胞或载体中。在一些实施方式中，启动子不是渗漏(leaky)启动子，即启动子并不组成性表达本文所述基因产物中的任何一种。

本文所用术语“哺乳动物细胞”包括来自哺乳动物纲任何成员的细胞，例如，人细胞，小鼠细胞，大鼠细胞，猴细胞，仓鼠细胞等等。在一些实施方式中，细胞是小鼠细胞，人细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，CHO-K1细胞，CHO-DXB11细胞，CHO-DG44细胞，CHOK1SV^TM细胞，包括各种变体(例如，CHOK1SV^TM

隆萨公司(Lonza)，英国斯劳)，CHOK1SVGS-KO^TM(

Lonza，英国斯劳)细胞，包括各种变体，HEK293细胞，包括粘附和悬浮适应型变体，HeLa细胞，或HT1080细胞。

本文所用术语“染色体整合型”或“染色体整合”指将核酸序列稳定的纳入宿主细胞，例如，哺乳动物细胞的染色体中，即，核酸序列被染色体整合到宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)的基因组DNA(gDNA)中。在一些实施方式中，染色体整合型核酸序列是稳定的。在一些实施方式中，染色体整合型核酸序列不位于质粒或载体上。在一些实施方式中，染色体整合型核酸序列没有被剪切。在一些实施方式中，染色体整合通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR-结合(Cas)蛋白基因编辑系统(CRISPR/CAS)介导。

本文所用术语“重组靶位点特异性整合”或“位点特异性整合”可互换使用，并且可用于向宿主细胞染色体引入一个或多个基因。参见例如，Bode等，Biol.Chem.381:801-813(2000),Kolb,Cloning and Stem Cells 4:381-392(2002)和Coates等,Trends inBiotech.23:407-419(2005)，其各自通过引用纳入。在一些实施方式中，“重组靶位点特异性整合”或“位点特异性整合”指核酸序列在靶位点处整合到染色体中。在一些实施方式中，位点特异性整合通过位点特异性重组进行。在一些实施方式中，“位点特异性重组”指通过在其靶位点或序列的同源对进行重组的特异性酶重排两种DNA伴侣分子。与同源性重组不同，位点特异性重组和位点特异性整合需要极少的伴侣DNA分子之间的DNA同源性，是RecA独立的，并且在任何阶段均不涉及DNA复制。在一些实施方式中，位点特异性重组使用位点特异性重组酶系统，以实现宿主细胞，例如，哺乳动物细胞中核酸的位点特异性整合。重组酶系统通常包括三种元件：两种特异性DNA序列(重组靶位点)和特异性酶(重组酶)。重组酶催化特异性重组靶位点之间的重组反应。

可以使用本领域技术人员已知的其它手段来插入一个或多个所需的核酸序列(例如基因)。在一些实施方式中，使用同源重组将一个或多个核酸序列(例如，基因)插入染色体。同源重组是指遗传重组，其中核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分子之间交换。在一些实施方式中，针对缺失/插入靶向的区域(例如基因)通过同源重组被缺失/插入。例如，使用包含进入序列的DNA构建体，该进入序列具有选择标志物，其在各侧侧接具有与针对缺失/插入靶向的区域同源的序列。DNA构建体可以与宿主染色体的同源序列比对，并且在两次交换事件中，针对以下靶向区域：(i)从宿主染色体上切除的缺失或(ii)添加到染色体中的插入。在一些实施方式中，不使用同源重组来将以下插入重组靶位点：腺病毒(Ad)基因，例如E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合，和/或与Ad基因操作性连接的启动子。

重组酶(recombinase enzyme)或重组酶(recombinase)是在位点特异性重组中催化重组的特异性酶。在本公开的一些实施方式中，用于位点特异性重组的重组酶源自非哺乳动物系统。在一些实施方式中，重组酶源自细菌、噬菌体或酵母。

在一些实施方式中，编码重组酶的核酸序列被整合到宿主细胞中，例如，哺乳动物细胞。在一些实施方式中，编码重组酶的核酸序列通过分子生物学已知的其它方法递送到宿主细胞。在一些实施方式中，可以直接递送重组酶多肽序列至细胞。在一些实施方式中，重组酶是Cre重组酶，Dre重组酶，KD重组酶，B2B3重组酶，Hin重组酶，Tre重组酶，λ整合酶，HK022整合酶，HP1整合酶，γδ解离酶/转化酶，ParA解离酶/转化酶，Tn3解离酶/转化酶，Gin解离酶/转化酶，

整合酶，BxB1整合酶，R4整合酶或其它功能重组酶。参见例如，Thorpe和Smith,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 95:5505-5510(1998)；Kuhstoss和Rao,J.Mol.Biol.222:897-890(1991)；美国专利号5,190,871；Ow和Ausubel,J.Bacteriol.155:704-713(1983)；Matsuura等,J.Bacteriol.178:3374-3376(1996)；Sato等,J.Bacteriol.172:1092-1098(1990)；Stragier等,Science 243:507-512(1989)；Carrasco等,Genes Dev.8:74-83(1994)；Bannam等,Mol.Microbiol.16:535-551(1995)；Crelin和Rood,J.Bacteriol.179:5148-5156(1997)。

在一些实施方式中，本文所述的重组酶是FLP重组酶。FLP重组酶是一种催化位点特异性重组反应的蛋白质，该反应关于在DNA复制过程中扩增酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)2μm质粒的拷贝数。在一些实施方式中，本公开的FLP重组酶衍生自酿酒酵母属的物种。在一些实施方式中，FLP重组酶源自酿酒酵母。在一些实施方式中，FLP重组酶衍生自酿酒酵母的菌株。在一些实施方式中，FLP重组酶是热稳定的、突变的FLP重组酶。在一些实施方式中，FLP重组酶是FLP1或FLPe。在一些实施方式中，编码FLP重组酶的核酸序列包含人优化的密码子。

在一些实施方式中，重组酶是Cre重组酶。Cre(造成重组)是Int家族重组酶的一员(Argos等(1986)EMBO J.5:433)并且已经证明其不但在细菌中还在真核细胞中进行lox位点(X交叉(X-ing over)的基因座)的高效重组(Sauer(1987)Mol.Cell.Biol.7:2087；Sauer和Henderson(1988)Proc.Natl Acad.Sci.85:5166)。在一些实施方式中，本文所述并使用的Cre重组酶源自细菌噬菌体。在一些实施方式中，Cre重组酶源自P1细菌噬菌体。

如本文所指，术语“重组靶位点”，“RTS”和“位点特异性重组酶靶位点”是指短的(例如少于60个碱基对)核酸位点或被位点特异性重组酶识别的序列，其在位点特异性重组事件中成为交叉区域。首字母缩写“RTS”可以指单个重组靶位点或多个重组靶位点。在一些实施方式中，RTS小于约60个碱基对，小于约55个碱基对，小于约50个碱基对，小于约45个碱基对，小于约40个碱基对，小于约35个碱基对或小于约30个碱基对。在一些实施方式中，RTS是约30-约60个碱基对，约30-约55个碱基对，约32-约52个碱基对，约34-约44个碱基对，约32个碱基对，约34个碱基对或约52个碱基对。RTS的示例包括但不限于lox位点、rox位点、Frt位点、att位点和dif位点。在一些实施方式中，RTS是具有与表1、2、3或4中的任何序列所示的序列基本相同的序列的核酸。

在一些实施方式中，RTS是选自表1的lox位点。本文所用术语“lox位点”指Cre重组酶可以催化位点特异性重组的核苷酸序列。本领域已知各种不同的lox位点。不同lox位点的序列在这方面是相似的，它们都包含相同的13个碱基对的反向重复，其侧接在其中发生重组的8个碱基对的不对称核心区。其为负责位点方向性和不同lox位点之间变化的不对称核心区。这些的说明性(非限制性)示例包括天然存在的loxP(存在于P1基因组中的序列)，loxB，loxL和loxR(这些存在于大肠杆菌染色体中)以及几个突变或变体lox位点，例如loxP511，loxΔ86，loxΔ117，loxC2，loxP2，loxP3，loxP23，loxC2，loxP2和loxP3。在一些实施方式中，RTS是选自loxΔ86，loxΔ117，loxC2，loxP2，loxP3和loxP23的lox位点。在一些实施方式中，lox RTS是与表1中的序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列相同性的核酸。

表1：

在一些实施方式中，RTS是选自表2的Frt位点。本文所用术语“Frt位点”指这样的核苷酸序列，在该核苷酸序列处，酵母2μm质粒的FLP基因的产物，FLP重组酶，可催化位点特异性重组。本领域已知各种不同的Frt位点。各种Frt位点的序列在这方面是相似的，它们都包含相同的13个碱基对的反向重复，其侧接在其中发生重组的8个碱基对的不对称核心区。这是负责位点方向性和不同Frt位点之间变化的不对称核心区。这些的说明性(非限制性)示例包括天然存在的Frt，以及几种突变或变体Frt位点，例如Frt1、Frt2。在一些实施方式中，RTS是选自Frt(F)，Frt F1(F1)，Frt F2(F2)，Frt F3(F3)，Frt F4(F4)或Frt F5(F5)的Frt位点。在一些实施例中，RTS是选自Frt F6(F6)，Frt F7(F7)，Frt F14(F14)，Frt F15(F15)或Ff61的Frt位点。在一些实施方式中，RTS是选自F2151，Fw2，F2161和F2262的Frt位点。在一些实施方式中，Frt重组靶位点是与表2中序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列相同性的核酸。

表2.

在一些实施方式中，RTS是选自表3的rox位点。本文所用术语“rox位点”指这样的核苷酸序列，在该核苷酸序列处，Dre重组酶可催化位点特异性重组。本领域已知各种不同的rox位点。它们的示例性(非限制性)实例包括roxR和roxF。在一些实施方式中，rox重组靶位点是与表3中序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的核酸。

表3

名称	标识符	序列
			roxF	SEQ ID NO.:22	TAACTTTAAATAATGCCAATTATTTAAAGTTA
roxR	SEQ ID NO.:23	TAACTTTAAATAATTGGCATTATTTAAAGTTA

在一些实施方式中，RTS是选自表4的att位点。本文所用术语“att位点”指这样的核苷酸序列，在该核苷酸序列处，λ整合酶或

整合酶可催化位点特异性重组。本领域已知各种不同的aat位点。这些的示例性(非限制性)实例包括attP、attB、proB、trpC、galT、thrA和rrnB。在一些实施方式中，att重组靶位点是与表4中序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的核酸。

表4.

本文所述术语“不同的重组靶位点”指不相同或异种特异性(hetero-specific)的重组靶位点。例如，存在多种变体Frt位点，但是重组通常仅可在两种相同的Frt位点之间发生。在一些实施方式中，不同的重组靶位点指来自相同重组系统的不相同的重组靶位点(例如，LoxP和LoxR)。在一些实施方式中，不同的重组靶位点指来自不同重组系统的不相同的重组靶位点(例如，LoxP和Frt)。在一些实施方式中，不同的重组靶位点指来自相同重组系统的重组靶位点和来自不同重组系统的重组靶位点的组合(例如，LoxP、LoxR、Frt和Frt1)。

可以使用RTS的各种组合。在一些实施方式中，所述细胞包含四个RTS。在一些实施方式中，所述细胞包含六个RTS。在一些实施方式中，至少一个RTS选自SEQ ID No:1-30。在一些实施方式中，至少一个RTS选自SEQ ID No:1-6。在一些实施方式中，至少一个RTS选自SEQ ID No:28-30。在一些实施方式中，至少一个RTS选自SEQ ID No:7-21。在一些实施方式中，至少一个RTS选自SEQ ID No:22-23。在一些实施方式中，至少一个RTS选自SEQ ID No:24-27。在一些实施方式中，至少一个RTS选自SEQ ID No:28-30。在一些实施方式中，包含至少四个不同RTS的细胞包括以下RTS：LoxP_511、Frt_F5、Frt和LoxP。在一些实施方式中，包含至少四个不同RTS的细胞包括以下RTS：Frt_F14和Frt_F15。在一些实施方式中，包含至少四个不同RTS的细胞包括以下RTS：LoxP_511、Frt_F5、Frt、LoxP、Frt_F14和Frt_F15。在一些实施方式中，包含至少四个不同RTS的细胞可包括以下RTS：Frt_1、Frt_2、Frt_3、Frt_4。在一些实施方式中，包含至少四个不同RTS的细胞包括以下RTS：Frt_m5,Frt_wt、Frt_m14、Frt_m15、Frt_m7和Frt_m6。

本文所用术语“着陆坪(landing pad)”指包含染色体整合到宿主细胞中的第一重组靶位点的核酸序列。在一些实施方式中，着陆坪包含染色体整合于宿主细胞中的两个或更多个重组靶位点。在一些实施例中，细胞包括1、2、3、4、5、6、7或8个着陆坪。在一些实施方式中，着陆坪在多达1、2、3、4、5、6、7或8个不同的染色体基因座处整合。

如本文所指，术语“腺病毒”是指具有包含腺病毒科双链DNA的二十面体核衣壳的非包膜病毒。已从人类分离出50多种腺病毒亚型，并从其它哺乳动物和鸟类分离出许多其它亚型。鸟类。参见例如Ishibashi等,"动物腺病毒(Adenoviruses of animals)",刊于《腺病毒(The Adenoviruses)》,Ginsberg编,普莱南出版公司(Plenum Press),纽约州纽约,第497-562页(1984)；Strauss,"人类中的腺病毒感染(Adenovirus infections inhumans)",刊于《腺病毒(The Adenoviruses)》,Ginsberg编,普莱南出版公司,纽约州纽约,第451-596页(1984)。这些亚型属于腺病毒科(Adenoviridae)，目前分为两个属，即马斯特腺病毒(Mastadenovirus)和禽腺病毒(Aviadenoviru)。所有腺病毒在形态和结构上均相似。然而，在人类中，腺病毒显示出不同的免疫学特性，因此被分为多种血清型。腺病毒的两种人血清型，即Ad2和Ad5，已得到深入研究，并提供了有关腺病毒的一般信息中的大多数。

“基因”是指编码多肽的核苷酸集合，并且包括cDNA和基因组DNA核酸分子。“基因”也指可以作为编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)调节序列的核酸片段。在一些实施方式中，基因以多个拷贝整合。在一些实施方式中，基因以预定的拷贝数整合。

如本文所指，术语“腺病毒基因”或“AV基因”是指包含衍生自一种或多种腺病毒亚型或血清型的一种或多种核酸序列的基因。在一些实施方式中，Ad基因是有助于腺相关病毒复制和包装的基因。在一些实施方式中，Ad基因是E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合或任何其它Ad基因。在一些实施方式中，本公开提供了一种细胞，其中一个或多个Ad基因染色体整合到该细胞中。在一些实施方式中，本公开提供了一种细胞，其中E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342中的一个或多个染色体整合到该细胞中。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A和E1B。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A、E1B和E2A。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A、E1B、E2A和E4。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4和VA。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A和E2A。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A、E2A和E4。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A，E2A、E4和VA。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A、E2A、E4、VA和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A和E4。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A、E4和VA。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A、E4、VA和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A和VA。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A、VA和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E1A和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E1B。在一些实施方式中，Ad基因包含E1B和E2A。在一些实施方式中，Ad基因包含E1B、E2A和E4。在一些实施方式中，Ad基因包含E1B、E2A、E4和VA。在一些实施方式中，Ad基因包含E1B、E2A、E4、VA和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E1B和E4。在一些实施方式中，Ad基因包含E1B、E4和VA。在一些实施方式中，Ad基因包含E1B、E4、VA和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E1B和VA。在一些实施方式中，Ad基因包含E1B、VA和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E1B和MR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E2A。在一些实施方式中，Ad基因包含E2A和E4。在一些实施方式中，Ad基因包含E2A、E4和VA。在一些实施方式中，Ad基因包含E2A、E4、VA和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E2A和VA。在一些实施方式中，Ad基因包含E2A、VA和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E2A和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E4。在一些实施方式中，Ad基因包含E4和VA。在一些实施方式中，Ad基因包含E4、VA和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含E4和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含VA。在一些实施方式中，Ad基因包含VA和MIR342。在一些实施方式中，Ad基因包含MIR342。在一些实施方式中，发明人发现当Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA和MIR342时(其中Ad基因是染色体整合型的)，观察到更一致的Ad基因表达。在一些实施方式中，Ad基因包含选自E1A、E1B、E2A、E4、VA和MIR342的一个或多个。

本文所述术语“调节元件”指控制核酸序列表达的一些方面的遗传元件。如本文所用，“启动子”是促进操作性连接的编码区的转录起始的调节元件。在一些实施方式中，启动子是Ad启动子。如本文所用，术语“AV启动子”是指衍生自腺病毒系统的这种调节元件。在一些实施方式中，启动子是AAV启动子。如本文所用，术语“AAV启动子”是指源自腺相关病毒系统的这种调节元件。在一些实施方式中，本公开内容提供了一种细胞，其中一个或多个AAV启动子通过染色体整合到该细胞中。如本文所用，术语“非AV启动子”是指衍生自非腺病毒系统的这种调节元件。在一些实施方式中，非AV启动子衍生自原核系统。在一些实施方式中，非AV启动子衍生自真核系统。在一些实施方式中，本公开内容提供了一种细胞，其中一个或多个启动子染色体整合到该细胞中。在一些实施方式中，本公开内容提供了一种细胞，其中一种或多种非AV启动子染色体整合到该细胞中。在一些实施方式中，本公开提供了一种细胞，其中一个或多个Ad启动子染色体整合到该细胞中。在一些实施方式中，启动子是非AAV启动子。如本文所用，术语“非AAV启动子”是指衍生自非腺相关病毒系统的这种调控元件。在一些实施方式中，非AAV启动子衍生自原核系统。在一些实施方式中，非AAV启动子衍生自真核系统。在一些实施方式中，本公开内容提供了一种细胞，其中一种或多种非AAV启动子染色体整合到该细胞中。

如本文所指，术语“操作性组合”，“以操作性顺序”和“操作性连接”是指核酸序列的连接，其方式产生能够指导给定基因转录和/或所需蛋白质分子合成的核酸分子。该术语还表示以一定方式连接从而产生功能性蛋白质的氨基酸序列的连接。在一些实施方式中，Ad基因与启动子操作性连接，其中该Ad基因染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，Ad基因与非Ad启动子操作性连接，其中Ad基因染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，所述Ad基因与Ad启动子操作性连接，其中所述Ad基因染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，AAV基因操作性连接至启动子，其中所述AAV基因染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，AAV基因与非AAV启动子操作性连接，其中AAV基因染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，AAV基因与AAV启动子操作性连接，其中AAV基因染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，GOI操作性连接至启动子，其中GOI染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，GOI基因操作性连接至非GOI启动子，其中GOI染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，重组酶基因与启动子操作性连接，其中所述重组酶基因染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，重组酶基因操作性连接至启动子，其中重组酶基因未整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，重组酶基因操作性连接至启动子，其中所述重组酶基因不染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，重组酶基因与启动子操作性连接，其中重组酶基因不染色体整合到宿主细胞基因组中。

在一些实施方式中，调节元件操作性地将基因表达与外源提供的配体的存在联系起来。在一些实施方式中，Ad基因操作性连接至启动子，其中所述启动子操作性将基因表达与外源提供的配体的存在联系起来，并且其中所述Ad基因染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，AAV基因操作性连接至启动子，其中所述启动子操作性将基因表达与外源提供的配体的存在联系起来，并且其中所述AAV基因染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，GOI操作性连接至启动子，其中所述启动子操作性将基因表达与外源提供的配体的存在联系起来，并且其中所述GOI染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，重组酶基因操作性连接至启动子，其中该启动子操作性将基因表达与外源提供的配体的存在联系起来，并且其中该重组酶基因染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，重组酶基因与启动子操作性连接，其中该启动子操作性将基因表达与外源提供的配体的存在联系起来，并且其中重组酶基因不染色体整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，E1A表达与启动子操作性连接，其中该启动子操作性将基因表达与rAAV的产生联系起来。在一些实施方式中，E1A表达与启动子操作性连接，其中该启动子操作性将基因表达与外源提供的配体的存在联系起来，并且其中基因表达操作性将外源提供的配体的存在与rAAV的产生联系起来。

在一些实施方式中，至少一个RTS、Ad基因和启动子整合在单个染色体基因座上。在一些实施方式中，第一Ad基因E1A和E1B以及包含E2A、E4、VA和MIR342的第二Ad基因在两个不同的基因座上。在一些实施方式中，第一Ad基因E1A和E1B以及包含E2A、E4、VA和MIR342的第二Ad基因在同一基因座上。在一些实施方式中，第一Ad基因E1A和E1B以及包含E2A、E4、VA和MIR342的第二Ad基因是同一基因座，而腺相关病毒(AAV)基因在不同基因座上。在一些实施方式中，第一Ad基因E1A和E1B以及包含E2A、E4、VA和MIR342的第二Ad基因是同一基因座，而腺相关病毒(AAV)基因和AAV载体盒在不同基因座上。

如本文所指，术语“染色体基因座”是指核酸在细胞染色体上的确定位置，其可以包含至少一个基因。在一些实施方式中，染色体基因座是约500个碱基对至约100,000个碱基对，约5,000个碱基对至约75,000个碱基对，约5,000个碱基对至约60,000个碱基对，约20,000个碱基对至约50,000个碱基对，约30,000个碱基对至约50,000个碱基对或约45,000个碱基对至约49,000个碱基对。在一些实施方式中，染色体基因座向限定的核酸序列的5’或3’端延伸多达约100个碱基对，约250个碱基对，约500个碱基对，约750个碱基对或约1000个碱基对。在一些实施方式中，染色体基因座包含内源性核酸序列。在一些实施方式中，染色体基因座包含已经使用分子生物学领域技术人员已知方法整合进入染色体的外源性核苷酸序列。在一些实施方式中，染色体基因座在宿主细胞的基因组中包含核苷酸序列，该核苷酸序列提供了由整合在染色体基因座中的基因编码的蛋白质的强而稳定的产生。在一些实施方式中，染色体基因座包含宿主细胞基因组中的核苷酸序列，其提供了强而稳定的病毒基因表达。在一些实施方式中，染色体基因座包含宿主细胞基因组中的核苷酸序列，其提供高效的位点特异性重组。在一些实施方式中，染色体基因座包含Fer1L4(参见例如美国专利申请号14/409,283)，ROSA26，HGPRT，DHFR，COSMC，LDHA或MGAT1。在一些实施方式中，染色体基因座包含NL1或NL2。在一些实施方式中，染色体基因座是X染色体上MID1的第一内含子。在一些实施方式中，染色体基因座是增强的表达和稳定性区域(Regeneron，Tarrytown，NY EESYR，参见例如，美国专利号7,771,997)。在一些实施方式中，了染色体基因座中的至少一部分核酸缺失。

在一些实施方式中，染色体基因座包含表A所述的NL1基因座，NL2基因座，NL3基因座，NL4基因座，NL5基因座或NL6基因座。在一些实施方式中，本公开涉及哺乳动物细胞，其包含至少两个不同的重组靶位点(RTS)，其中至少一个RTS、Ad基因和启动子整合在NL1基因座，NL2基因座，NL3基因座，NL4基因座，NL5基因座或NL6基因座中。在一些实施方式中，第一Ad基因E1A和E1B以及包含E2A、E4、VA和MIR342的第二Ad基因在两个不同的基因座上，其中一个在NL1基因座，NL2基因座，NL3基因座，NL4基因座，NL5基因座或NL6基因座中。在一些实施方式中，第一Ad基因E1A和E1B以及包含E2A、E4、VA和MIR342的第二Ad基因在NL1基因座，NL2基因座，NL3基因座，NL4基因座，NL5基因座或NL6基因座内。在一些实施方式中，第一Ad基因E1A和E1B以及包含E2A、E4、VA和MIR342的第二Ad基因在NL1基因座，NL2基因座，NL3基因座，NL4基因座，NL5基因座或NL6基因座内。在一些实施方式中，第一Ad基因E1A和E1B以及包含E2A、E4、VA和MIR342的第二Ad基因在NL1基因座，NL2基因座，NL3基因座，NL4基因座，NL5基因座或NL6基因座内。在一些实施方式中，本公开涉及哺乳动物细胞，其包含至少三个不同的重组靶位点(RTS)，其中至少一个RTS、Ad基因和启动子整合在NL1基因座，NL2基因座，NL3基因座，NL4基因座，NL5基因座或NL6基因座中。在一些实施方式中，本公开涉及哺乳动物细胞，其包含至少四个不同的重组靶位点(RTS)，其中至少一个RTS、Ad基因和启动子整合在NL1基因座，NL2基因座，NL3基因座，NL4基因座，NL5基因座或NL6基因座中。在一些实施方式中，本公开涉及哺乳动物细胞，其包含至少五个不同的重组靶位点(RTS)，其中至少一个RTS、Ad基因和启动子整合在NL1基因座，NL2基因座，NL3基因座，NL4基因座，NL5基因座或NL6基因座中。在一些实施方式中，本公开涉及哺乳动物细胞，其包含至少六个不同的重组靶位点(RTS)，其中至少一个RTS、Ad基因和启动子整合在NL1基因座，NL2基因座，NL3基因座，NL4基因座，NL5基因座或NL6基因座中。

表A.

本领域技术人员将认识到，术语“整合在NL1基因座内”或“整合在NL2基因座内”将包括整合到基因座的任何部分，并且不仅限于所指示的基因组坐标。本领域技术人员将意识到术语整合于“NL1基因座内”或“整合于NL2基因座内”将还包括对应的生物体中对应的基因座。因此，在一些实施方式中，术语“整合于NL1基因座内”或“整合于NL2基因座内”将包括整合于指定基因组坐标约50,000bp内，约40,000bp内，约30,000bp内，20,000bp内或10,000bp内。

在一些实施方式中，所述细胞包含位点特异性重组酶基因。在一些实施方式中，位点特异性重组酶基因是染色体整合型的。

本文所述术语“位于两个RTS之间”指位于两个RTS之间的基因，即，一个RTS位于基因的5’而不同的RTS位于基因的3’。在某些实施方式中，所述RTS紧邻它们之间的基因。在某些实施方式中，所述RTS位于与处于它们之间的基因限定的距离。在一些实施方式中，RTS是定向序列。在一些实施方式中，位于它们之间的基因的5’和3’RTS是直接定向的(即，它们朝向相同的方向)。在一些实施方式中，位于它们之间的基因的5’和3’RTS是反向定向的(即，它们朝向相反的方向)。

在一些实施方式中，所述细胞还包含腺相关病毒(AAV)基因，其中所述AAV基因是染色体整合型的。AAV基因包含来自任何AAV血清型的任何基因。在一些实施方式中，AAV基因是Rep、Rep78、Rep68、Rep52、Rep40、Cap、VP1、VP2、VP3或其组合。在一些实施方式中，AAV基因来自2型腺相关病毒。在一些实施方式中，AAV基因来自腺相关病毒Anc80。在一些实施方式中，AAV基因包含ANC80Rep和Cap基因。在一些实施方式中，AAV基因位于两个RTS之间。

如本文所指，术语“腺相关病毒(AAV)”是指包含细小病毒(Parvoviridae)科和依赖细小病毒(Dependoparvovirus)属的单链DNA的小型、复制缺陷型无包膜病毒。到目前为止，已经鉴定出超过10种腺相关病毒血清型，其中AAV2血清型是表征最成熟的。AAV血清型的其它(非限制性)示例是ANC80，AAV1，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10和AAV11。除了这些血清型，还开发了AAV假型(pseudotype)。AAV假型包含第一血清型的衣壳和第二血清型的基因组(例如，假型AAV2/5将对应于具有血清型AAV2的基因组和AAV5的衣壳的AAV)。

如本文所用，术语“重组AAV”或“rAAV”定义为感染性、复制缺陷型病毒，包含衣壳化(即，被蛋白质外壳包围的)异源基因的AAV蛋白壳，其继而在5'和3'侧接AAV ITR。

如本文所用，术语复制能力型腺病毒(RCA)是指不希望的活性腺病毒颗粒的污染物，所述活性腺病毒颗粒有时在重组腺病毒载体与生产细胞基因组中存在的重组腺病毒基因之间的同源重组产生的rAAV生产期间产生。

如本文所指，术语“腺相关病毒基因”是指包含衍生自一种或多种腺相关病毒血清型的一种或多种核酸序列的基因。在一些实施方式中，AAV基因包含有助于AAV复制和包装的基因。

如本文所指，术语“Rep”基因是指AAV基因组的本领域公认的区域，其编码病毒的复制蛋白，所述病毒的复制蛋白是复制病毒基因组或其功能同源物(例如人疱疹病毒6(HHV-6)rep基因，也已知其介导AAV-2DNA复制)共同需要的。因此，rep编码区至少包含编码AAV Rep78和Rep68(Rep的长形式)，Rep52和Rep40(Rep的短形式)的基因或其功能同源物。对于AAV rep编码区的进一步描述。如本文所用，rep编码区可以源自任何病毒血清型，例如上述的AAV血清型。该区域不必包括所有野生型基因，但是可以改变(例如，通过核苷酸的插入，缺失或取代)，只要存在的rep基因当在合适的靶细胞中表达时提供足够的整合功能即可。参见例如Muzyczka,N.,Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129(1992)；和Kotin,R.M.,Human Gene Therapy 5:793-801(1994)。

如本文所指，术语“Cap”基因是指AAV基因组的本领域公认的区域，其编码病毒的衣壳蛋白。这些衣壳蛋白的说明性(非限制性)示例是AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。在本公开中使用的Cap基因可以来自任何AAV血清型或AAV血清型的组合。

在一些实施方式中，所述细胞包含第二Ad基因，其中，所述第二Ad基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，第二Ad基因是E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合。在一些实施方式中，第二Ad基因来自Ad5。在一些实施方式中，第二Ad基因位于两个RTS之间。

在一些实施方式中，所述细胞还包含AAV载体盒，其中所述AAV载体盒是染色体整合型的。在一些实施方式中，AAV载体盒位于两个RTS之间。

“载体”或“表达载体”是复制子，例如质粒，噬菌体，病毒或粘粒，可以在其上附着另一个DNA片段以在细胞中引起附着的DNA片段的复制和/或表达。“载体”包括附加型(例如质粒)和非附加型载体。在本公开内容的一些实施方式中，载体是附加型载体，其在多个细胞世代之后(例如通过不对称分配)从细胞群中去除/丢失。术语“载体”包括用于将核酸分子体外、体内或离体引入细胞中的病毒和非病毒手段。术语载体可以包括合成载体。载体可以通过熟知的方法引入所需的宿主细胞，包括但不限于，转染、转导、细胞融合和脂质转染。载体可以包含各种调节元件，包括启动子。

本文所用“转染”表示导入外源性核酸分子(包括载体)到细胞中。“转染的”细胞在细胞内包含外源性核酸分子，而“转化的”细胞是其中细胞内的外源性核酸分子诱导细胞中的表型改变的细胞。转染的核酸分子可以被整合到宿主细胞的基因组DNA中和/或可在染色体外由该细胞临时性维持或维持较长时间。表达外源性核酸分子或片段的宿主细胞或生物体被称为“重组”、“转化”或“转基因”生物体。许多转染技术在本领域是公知的。参见例如，Graham等,Virology,52:456(1973)；Sambrook等,《分子克隆，实验室手册》(MolecularCloning,A Laboratory Manual),纽约州冷泉港实验室(1989)；Davis等,《分子生物学基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology),Elsevier(1986)；和Chu等,Gene 13:197(1981)。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分(例如AAV载体盒，AAV辅助构建体和其它核酸分子)引入合适的宿主细胞中。

本文所用术语“可交换盒(exchangeable cassette)”或“盒”是包含基因和重组位点的一类移动遗传元件。在一些实施方式中，可交换盒包含至少两个RTS。在一些实施方式中，可交换盒包含报告基因或选择基因。在一些实施方式中，盒通过重组酶介导的盒交换(RMCE)来交换。

如本文所指，术语“AAV载体盒”是指衍生自腺相关病毒血清型载体的盒。AAV载体盒可具有一个或多个AAV野生型基因，其缺失全部或部分Rep和/或Cap基因，但保留功能性侧接性反向末端重复(ITR)序列。

如本文所指，术语“功能性侧接性反向末端重复序列”或“功能性侧接性ITR”序列是指145个碱基对ITR，前125个碱基对能够形成Y或T形双链结构，其位于AAV载体盒中感兴趣基因(GOI)的5'和3'端。ITR序列代表AAV基因组的复制、拯救、包装和整合所需的最小序列。

如本文所指，术语“辅助性基因(ancillary gene)”，“辅助基因(helper gene)”和“辅助性辅助基因(ancillary helper gene)”可互换使用，以指辅助rAAV的复制或包装的第一基因。在一些实施方式中，辅助基因包括病毒基因。在一些实施方式中，辅助基因包含Ad基因。在一些实施方式中，辅助基因包括AAV基因。在一些实施方式中，辅助基因包括AAV基因rep、cap或其组合。在一些实施方式中，辅助基因包括原核基因。在一些实施方式中，辅助基因包括真核基因。在一些实施方式中，辅助基因包含编码RNA的基因。在一些实施方式中，辅助基因包含干扰素(IFN)拮抗剂。在一些实施方式中，辅助基因编码蛋白质，其为蛋白质激酶R(PKR)抑制剂。在一些实施方式中，辅助基因包含编码流感NS1蛋白的基因。在一些实施方式中，辅助基因包含编码牛痘病毒E3L蛋白的基因，参见例如，de Vries等,GeneTher.15:545-52,(2008)。在一些实施方式中，辅助基因编码病毒编码的可溶性IFN-α/β受体诱饵，其抵消了感染细胞中的IFN应答。在一些实施方式中，辅助基因编码NS1、E3L或相似的蛋白质。在一些实施方式中，辅助基因编码NS1、E3L或具有同源序列或基序的蛋白质。

本文所用术语“感兴趣的基因”或“GOI”用于描述异源性基因。本文所用术语“异源性基因”或“HG”当其涉及核酸序列如编码序列或对照序列时，表示通常不接合在一起和/或通常不与特定细胞相关联的核酸序列，例如，基因。在一些实施方式中，异源性基因是这样的构建体，其中编码序列自身天然不存在(例如，具有不同于天然基因中的密码子的合成序列)。等位变异或天然发生的突变事件不产生异源性DNA，如本文所用。

在一些实施方式中，感兴趣的基因包含报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。

本文所述“报告基因”是这样的基因，其表达使细胞具有可被容易地鉴定和测量的表型。在一些实施方式中，报告基因包含荧光蛋白基因。在一些实施方式中，报告基因包含选择基因。

本文所用术语“选择基因”指使用编码酶活性的基因，其赋予在缺乏原本将是必需营养素的培养基中生长的能力；此外，选择基因赋予其中选择基因表达的细胞对抗生素或药物的抗性。选择基因可以用于赋予宿主细胞特定表型。当宿主细胞必须表达选择基因以在选择性培养基中生长时，可称该基因为阳性选择基因。选择基因还可以用于针对包含特定基因的宿主细胞进行选择；将以此方式使用的选择基因称为负选择基因。

本文所用术语“治疗上感兴趣的基因(gene of therapeutic interest)”指任何功能相关的核苷酸序列。因此，本公开内容的治疗上感兴趣的基因可以包含任何期望的基因，其编码靶细胞基因组中有缺陷或缺失的蛋白质或编码具有期望的生物学或治疗作用的非天然蛋白质(例如，抗病毒功能)，或者该序列可对应于具有反义或核酶功能的分子。合适的治疗上感兴趣的基因的代表性(非限制性)示例包括用于治疗以下病症的那些：炎性疾病，自身免疫，慢性和感染性疾病，包括例如AIDS，癌症，神经系统疾病，心血管疾病，高胆固醇血症等疾病；各种血液疾病，包括各种贫血，地中海贫血和血友病；遗传缺陷，例如囊性纤维化，高雪氏病(Gaucher's Disease)，腺苷脱氨酶(ADA)缺乏，肺气肿等。可用于癌症和病毒性疾病的反义疗法(antisense therapy)的几种反义寡核苷酸(例如与mRNA翻译起始位点(AUG密码子)周围序列互补的短寡核苷酸)已经在本领域中进行了描述，并且也是合适的治疗上感兴趣的基因的示例。

在一些实施方式中，所述细胞基本上不含辅助病毒。如本文所提到的“辅助病毒”是经添加以实现腺相关病毒的复制和包装的任何非AAV病毒。辅助病毒的代表性(非限制性)示例是腺病毒和疱疹病毒。在一些实施方式中，术语基本上不含辅助病毒是指每个细胞具有少于100个，少于10个或少于1个辅助病毒的细胞。在一些实施方式中，术语基本上不含辅助病毒是指其中使用本领域技术人员已知的检测方法检得不存在辅助病毒的细胞或不存在辅助病毒的细胞群。在一些实施方式中，所述细胞中没有野生型辅助病毒。在一些实施方式中，术语野生型病毒是指可以独立于任何其它病毒在细胞中复制的任何完全非AAV病毒。

在一些实施方式中，本公开提供了哺乳动物细胞，其包含(i)至少四个不同的重组靶位点(RTS)，(ii)腺病毒(Ad)基因E2A、E4、VA、MIR342或其组合，和(iii)与Ad基因操作性连接的启动子，其中RTS、Ad基因和启动子是染色体整合型的。在一些实施方式中，所述细胞是小鼠细胞，人细胞，CHO细胞，CHO-K1细胞，CHO-DXB11细胞，CHO-DG44细胞，CHOK1SV^TM细胞(包括所有变体)(例如CHOK1SV^TM

)，CHOK1SV GS-KO^TM细胞(包括所有变体)(例如，XCEED^TM)，HEK293细胞(包括贴壁和悬浮适应型变体)，HeLa细胞或HT1080细胞。

在一些实施例中，所述细胞包含四个RTS。在一些实施方式中，所述细胞包含六个RTS。在一些实施方式中，至少一个RTS选自SEQ ID No:1-30。在一些实施方式中，RTS、Ad基因和启动子整合在单个染色体基因座处。在一些实施方式中，染色体基因座是X染色体上MID1的第一内含子，NL6，NL5，NL4，NL3，NL2，NL1，Fer1L4，ROSA26，HGPRT，DHFR，COSMC，LDHa，MGAT1，GRIK1，或增强的表达和稳定性区(EESYR)。在一些实施方式中，所述细胞包含位点特异性重组酶基因。在一些实施方式中，位点特异性重组酶基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，所述细胞还包含第二Ad基因，其中，所述第二Ad基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，第二Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合。在一些实施方式中，第二Ad基因来自Ad5。在一些实施方式中，第二Ad基因位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞还包含腺相关病毒(AAV)基因，其中所述AAV基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，AAV基因包含Rep、Cap或其组合。在一些实施方式中，AAV基因来自2型腺相关病毒。在一些实施方式中，AAV基因位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞还包含AAV载体盒，其中所述AAV载体盒是染色体整合型的。在一些实施方式中，AAV载体盒是报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。在一些实施方式中，AAV载体盒位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞基本上不含辅助病毒。

在一些实施方式中，本公开提供了哺乳动物细胞，其包含(i)至少四个不同的重组靶位点(RTS)；和(ii)包含Rep、Cap或其组合的腺相关病毒(AAV)基因，其中RTS和AAV基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，所述细胞是小鼠细胞，人细胞，CHO细胞，CHO-K1细胞，CHO-DXB11细胞，CHO-DG44细胞，CHOK1SV^TM细胞(包括所有变体)(例如CHOK1SV^TM

)，CHOK1SV GS-KO^TM细胞(包括所有变体)，HEK293细胞(包括贴壁和悬浮适应型变体)，HeLa细胞或HT1080细胞。在一些实施方式中，细胞包含四个RTS。在一些实施方式中，细胞包含六种RTS。在一些实施方式中，至少一个RTS选自SEQ ID No:1-30。在一些实施方式中，RTS和AAV基因整合在单个染色体基因座处。在一些实施方式中，染色体基因座是X染色体上MID1的第一内含子，NL2，NL1，Fer1L4，ROSA26，HGPRT，DHFR，COSMC，LDHa，MGAT1，GRIK1，或增强的表达和稳定性区(EESYR)。在一些实施方式中，所述细胞包含位点特异性重组酶基因。在一些实施方式中，位点特异性重组酶基因是染色体整合型的。在一些实施方式中，所述细胞还包含Ad基因和与Ad基因操作性连接的启动子，由此Ad基因和启动子是染色体整合型的。在一些实施方式中，所述Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合。在一些实施方式中，Ad基因来自Ad5。在一些实施方式中，AAV基因位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞还包含AAV载体盒。在一些实施方式中，AAV载体盒包含报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。在一些实施方式中，感兴趣的基因位于两个RTS之间。在一些实施方式中，所述细胞基本上不含辅助病毒。在一些实施方式中，所述细胞完全不含辅助病毒。

在一些实施方式中，本公开提供了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包含：六个不同的重组靶位点(RTS)，其中至少一个RTS选自SEQ ID NO:1-30，包含E1A和E1B的腺病毒(Ad)基因，与该Ad基因操作性连接的启动子，其中RTS、Ad基因和该启动子是染色体整合型的，含E2A、E4、VA和MIR342的第二Ad基因，其中第二Ad基因是位于两个RTS之间；含Rep和Cap的腺相关病毒(AAV)基因，其中该AAV基因位于两个RTS之间；和含报告基因、选择基因或治疗上感兴趣的基因的AAV载体盒，其中所述AAV载体盒位于两个RTS之间。

在一些实施方式中，本公开提供了一种用于产生重组腺相关病毒(rAAV)生产细胞的方法，其包括：提供这样的细胞，其包含至少四个不同的重组靶位点(RTS)，含E1A、E1B或其组合的腺病毒(Ad)基因，以及与该Ad基因操作性连接的启动子，其中RTS、Ad基因和启动子是染色体整合型的，用载体转染如此提供的细胞，所述载体包含编码腺相关病毒(AAV)基因的可交换盒(exchangeable cassette)，第二Ad基因，AAV载体盒或其组合，将可交换盒整合到染色体中，和，选择具有整合到染色体中的可交换盒的rAAV生产细胞。在一些实施方式中，用两种载体进行转染，第一载体包含含有第二Ad基因和AAV基因的可交换盒，第二载体包含含有AAV载体盒的可交换盒。在一些实施方式中，用两种载体进行转染，第一载体包含含有第二Ad基因的可交换盒，第二载体包含含有AAV基因的可交换盒。在一些实施方式中，用三种载体进行转染，第一载体包含含有第二Ad基因的可交换盒，第二载体包含含有AAV基因的可交换盒，第三载体包含含有AAV载体盒的可交换盒。在一些实施例中，每个可交换盒还包括两个RTS，与细胞的两个RTS匹配。在一些实施方式中，发明人发现SSI的使用消除了从那些转染的细胞克隆细胞的需求，因为细胞在其遗传组成上是均匀(homogenous)的。

术语“匹配”就两条RTS序列而言指具有被重组酶结合并且影响两条序列之间位点特异性重组的能力的两条序列。在一些实施方式中，匹配细胞的RTS的可交换盒的RTS指具有与细胞的RTS基本相同的序列的盒的RTS。在一些实施方式中，可交换盒包含与在细胞中染色体整合的RTS之一或两种基本上相同的序列。

在一些实施方式中，术语整合指将可交换盒整合进入(例如，插入)染色体中。在一些实施方式中，整合通过位点特异性重组酶介导。

在一些实施方式中，术语“选择”指鉴定包含染色体整合的标志物的细胞。在一些实施方式中，选择是通过使用本领域技术人员已知道方法检测标志物的存在。在一些实施方式中，选择是通过使用本领域技术人员已知方法检测标志物的缺失。

在一些实施方式中，第二Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合。在一些实施方式中，AAV基因是Rep、Cap或其组合。在一些实施方式中，AAV载体盒包含报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。

在一些实施方式中，本公开提供了一种产生重组腺相关病毒(rAAV)的方法，该方法包括：(i)用AAV感染宿主细胞，(ii)产生包装有AAV载体盒的rAAV，和(iii)纯化包装的rAAV，其中所述宿主细胞包含：至少四个不同的重组靶位点(RTS)，含E1A、E1B或其组合的腺病毒(Ad)基因，与所述Ad基因操作性连接的启动子，其中所述RTS、Ad基因和启动子是染色体整合型的第二Ad基因，其含E1A、E1B，E2A、E4、VA、MIR342或其组合，含Rep、Cap或其组合的腺相关病毒(AAV)基因，以及AAV载体盒，其含报告基因、选择基因、治疗上感兴趣的基因或其组合。在一些实施方式中，rAAV的生产和包装不需要活的野生型辅助病毒。在一些实施方式中，rAAV的产生不需要E1A的表达。在一些实施方式中，纯化后获得至少1.0×10⁹vg/mL的活性rAAV。在本公开的一些实施方式中，产生的rAAV基本不含复制能力型腺病毒(RCA)。例如，在本公开的一些实施方式中，RCA低于纯化前的检测极限。病毒颗粒的定量方法是本领域技术人员已知的，并且可包括定量聚合酶链反应(qPCR)分析，感染滴定分析，终点稀释测定和病毒噬斑测定。在一些实施方式中，发明人发现使用SSI制备rAAV生产细胞可确保生产细胞库在其遗传组成上是均匀(homogenous)的。在一些实施方式中，发明人发现使用SSI制备rAAV生产细胞可确保生产细胞库在其效率上是均匀(homogenous)的。在一些实施方式中，发明人发现使用SSI制备rAAV生产细胞可确保生产细胞的库在第一辅助基因与第二辅助基因的比例上是均匀的。在一些实施方式中，发明人发现使用SSI制备rAAV生产细胞可确保生产细胞的库在辅助基因与治疗上感兴趣的基因的比率上是均匀的。在一些实施方式中，发明人发现使用SSI制备rAAV生产细胞可以确保更一致的rAAV产品质量。

本文所用“氨基酸”指包含羧基(-COOH)和氨基(-NH₂)基团的化合物。“氨基酸”指天然的和非天然的(即，合成的)氨基酸。天然氨基酸包括(以其三字母和单字母缩写)：丙氨酸(Ala；A)；精氨酸(Arg；R)；天冬酰胺(Asn；N)；天冬氨酸(Asp；D)；半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酰胺(Gln；Q)；谷氨酸(Glu；E)；甘氨酸(Gly；G)；组氨酸(His；H)；异亮氨酸(Ile；I)；亮氨酸(Leu；L)；赖氨酸(Lys；K)；蛋氨酸(Met；M)；苯丙氨酸(Phe；F)；脯氨酸(Pro；P)；丝氨酸(Ser；S)；苏氨酸(Thr；T)；色氨酸(Trp；W)；酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，并且指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码的或非编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸，和具有修饰的肽主链的多肽。

可以使用本文所述的任何合适的装置，设备和方法来培养包括原核和/或真核细胞系的所需细胞系。此外，在实施方式中，所述装置、设备和方法适合于培养悬浮细胞或锚定依赖性(贴壁)细胞，并且适合于配置用于生产药物和生物药物产品(例如多肽产品，核酸产品(例如DNA或RNA)，或哺乳动物或微生物细胞和/或病毒，例如用于细胞和/或病毒和微生物群疗法的那些)。

在一些实施方式中，细胞表达或产生产物，例如重组治疗或诊断性产物。如下更加详细的描述，细胞产生的产物的实例包括但不限于抗体分子(例如，单克隆抗体，双特异性抗体)，抗体模拟物(特异性结合抗原的多肽分子，但是与抗体诸如DARP素、亲和体、阿迪连接素(adnectin)或IgNAR结构上不相关的抗原)，融合蛋白(例如，Fc融合蛋白，嵌合细胞因子)，或其它重组蛋白(例如，糖基化蛋白，酶，激素)，病毒治疗(例如，基因疗法和病毒免疫疗法的病毒载体，抗癌溶瘤细胞)，细胞治疗(例如，多能干细胞，间充质干细胞和成体干细胞)，疫苗或脂质包封的颗粒(例如，外来体，病毒样颗粒)，RNA(例如，siRNA)或DNA(例如，质粒DNA)，抗生素或氨基酸。在实施方式中，装置、设备和方法可以用于产生生物仿制药。

如本文所述，在实施方式中，装置、设备和方法允许产生真核细胞，例如，哺乳动物细胞或低等真核细胞，例如酵母细胞或丝状真菌细胞，或原核细胞，如革兰氏阳性或革兰氏阴性细胞和/或真核或原核细胞的产物，例如，蛋白质，肽，抗生素，氨基酸，核酸(如DNA或RNA)，由真核细胞以大规模方式合成。在一些实施方式中，还公开了微生物治疗中应用的微生物生物体及其孢子的用途。除非在本文中另外说明，装置、设备和方法可以包括任何体积或生产能力，包括但不限于，实验室规模，中试规模和全面生产规模能力。

此外，除非在本文中另外说明，装置、设备和方法可以包括任何合适的反应器，包括但不限于，搅拌槽，空运，纤维，微纤维，中空纤维，陶瓷基质，流化床，固定床和/或喷射床生物反应器。本文所用的“反应器”可包括发酵罐或发酵单元，或任何其它反应容器，并且术语“反应器”与“发酵罐”可以互换使用。术语发酵罐或发酵指微生物或哺乳动物培养。例如，在一些方面中，示例性的生物反应器单元可以进行下述内容的一种或多种或所有：营养物和/或碳源的进料，注入合适的气体(例如氧气)，发酵或细胞培养基的入口和出口流动，气相和液相的分离，维持温度，维持氧气和CO₂水平，维持pH水平，搅拌(例如，混合)和/或清洁/消毒。示例性反应器单元，如发酵单元，在单元内可以包含多个反应器，例如，单元在各单元中可以具有1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100或更多个生物反应器，和/或设备可以包含在设备内具有单个或多个反应器的多个单元。在各种实施方式中，生物反应器可以适用于批次，半批次、分批补料、灌注和/或连续发酵过程。可采用任何合适的反应器。在实施方式中，生物反应器可以具有约100mL至约50,000L的体积。非限制性的实例包括100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升的体积。此外，合适的反应器可以是多次使用，单次使用，一次性或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成，包括金属合金，如不锈钢(例如，316L或任何其它合适的不锈钢)和铬镍铁合金，塑料和/或玻璃。

在实施方式中并且除非本文另外说明，本文所述的装置、设备和方法还可以包括并未另外提及的任何合适的单元操作和/或器材，如用于分离、纯化和/或分离这些产物的操作和/或器材。可以使用任何合适的设备和环境，如传统的粘贴建立设备，模块化，流动和临时设备，或任何其它合适的结构，设备和/或布置。例如，在一些实施方式中，可使用模块化的清洁室。此外，并且除非另外说明，本文所述的装置、系统和方法可以封装于单一位置或设备和/或在其中进行，或者，可以封装于分开的或多个位置和/或设备中和/或在其中进行。

作为非限制实例且不构成任何限制，美国专利公开号2013/0280797；2012/0077429；2011/0280797；2009/0305626；和美国专利号8,298,054；7,629,167；和5,656,491描述了可能合适的示例性设备、装置和/或系统，其通过引用其全文纳入本文。

在实施方式中，细胞是真核细胞，例如，哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是例如人或啮齿动物或牛细胞系或细胞株。这类细胞、细胞系或细胞株的示例是，例如，小鼠骨髓瘤(NSO)细胞系，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，HT1080，H9，HepG2，MCF7，MDBK Jurkat，NIH3T3，PC12，BHK(幼崽仓鼠肾细胞)，VERO，SP2/0，YB2/0，Y0，C127，L细胞，COS，例如COS1和COS7，QC1-3，HEK293，VERO，PER.C6，HeLa，EB1，EB2，EB3，溶瘤或杂交瘤细胞系。优选地，哺乳动物细胞是CHO细胞系。在一实施方式中，细胞是CHO细胞。在一个实施方式中，该细胞是CHO-K1细胞，CHOK1SV^TM细胞，DG44 CHO细胞，DUXB11 CHO细胞，CHOS，CHO GS敲除细胞，CHOFUT8 GS敲除细胞，CHOZN或CHO衍生的细胞。CHO GS敲除细胞(例如GSKO细胞)是例如CHOK1SV GS-KO(隆萨公司的

表达系统的一部分，隆萨公司(Lonza)，英国斯劳)。CHO FUT8敲除细胞是例如CHOK1SV^TM

(隆萨公司(Lonza)，英国斯劳)。真核细胞可能还是鸟细胞、细胞系或细胞株，例如，

细胞，EB14、EB24、EB26、EB66或EBvl3。

在一些实施方式中，真核细胞是干细胞。例如，干细胞可以是多潜能干细胞，包括胚胎干细胞(ESC)，成体干细胞，诱导型多能干细胞(iPSC)，组织特异性干细胞(例如，造血干细胞)和间充质干细胞(MSC)。

在一实施方式中，细胞是本文所述任何细胞的分化形式。在一实施方式中，细胞是源自培养中的任何原代细胞的细胞。在一些实施方式中，细胞不源自干细胞。例如，在一些实施方式中，将细胞用于从个体患者或已建立的细胞库中提取和分离的免疫疗法(例如，淋巴细胞)中。在一些实施方式中，细胞可以包括遗传操纵的细胞(即，CAR-T等)。

在实施方式中，细胞是肝细胞，如人肝细胞、动物肝细胞或非薄壁组织细胞。例如，细胞可以是可铺板(plateable)的代谢合格的人肝细胞，可铺板的诱导合格的人肝细胞，可铺板的Qualyst Transporter Certified^TM人肝细胞，悬浮合格的人肝细胞(包括10供体和20供体汇集的肝细胞)，人肝枯氏细胞(Kupffer cell)，人肝星状细胞，狗肝细胞(包括单一和汇集的比格尔(Beagle)肝细胞)，小鼠肝细胞(包括CD-1和C57BI/6肝细胞)，大鼠肝细胞(包括Sprague-Dawley、Wistar Han和Wistar肝细胞)，猴肝细胞(包括食蟹猴(Cynomolgus)或恒河猴(Rhesus monkey)肝细胞)，猫肝细胞(包括短毛家猫肝细胞)和兔肝细胞(包括新西兰白兔肝细胞)。示例性的肝细胞可商购自三角研究实验室有限公司(TriangleResearch Labs,LLC)，美国北卡罗纳州Davis Drive研究三角科技园6，27709。

在一实施方式中，真核细胞是低等真核细胞，例如，酵母细胞(例如，毕赤酵母(Pichia)属(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)，克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)，和安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta))，孔玛氏酵母(Komagataella)属(例如，巴斯德孔玛氏酵母(Komagataellapastoris)，假巴斯德孔玛氏酵母(Komagataella pseudopastoris)或菲氏孔玛氏酵母(Komagataella phaffii))，酵母(Saccharomyces)属(例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))，克氏酵母(Saccharomyces kluyveri)，葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)，克鲁维酵母(Kluyveromyces)属(例如，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis))，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus))，假丝酵母(Candida)属(例如，产朊假丝酵母(Candida utilis)，卡卡假丝酵母(Candida cacaoi)，博伊丁假丝酵母(Candida boidinii))，地丝菌(Geotrichum)属(例如，发酵地丝菌(Geotrichumfermentans))，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。优选的是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)种。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株的示例是X33、GS115、KM71、KM71H；和CBS7435。

在一个实施方式中，真核细胞是真菌细胞(例如，曲霉属(Aspergillus)(例如，黑曲霉(A.niger)、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲霉(A.orzyae)、构巢曲霉(A.nidula))、枝顶孢属(Acremonium)(例如嗜热支顶孢(A.thermophilum))、毛壳菌属(Chaetomium)(例如嗜热毛壳菌(C.thermophilum))、金孢子菌属(Chrysosporium)(例如嗜热金孢子菌(C.thermophile))、虫草属(Cordyceps)(例如蛹虫草(C.militaris))、棒囊壳属(Corynascus)、栉霉属(Ctenomyces)、镰刀菌属(Fusarium)(例如尖孢镰刀菌(F.oxysporum))、小丛壳属(Glomerella)(例如禾生小丛壳菌(G.graminicola))、肉座菌属(Hypocrea)(例如红褐肉座菌(H.jecorina))、巨座壳属(Magnaporthe)(例如奥载巨座壳菌(M.orzyae))、毁丝霉属(Myceliophthora)(例如嗜热毁丝霉(M.thermophile))、丛赤壳属(Nectria)(例如红球丛赤壳菌(N.heamatococca))、脉孢菌属(Neurospora)(例如粗糙脉孢霉(N.crassa))、青霉属(Penicillium)、孢子丝菌属(Sporotrichum)(例如嗜热孢子丝菌(S.thermophile))、梭孢壳属(Thielavia)(例如疣革菌(T.terrestris)、异梭孢壳霉(T.heterothallica))、木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉(T.reesei))或轮枝孢属(Verticillium)(例如大丽轮枝菌(V.dahlia)))。

在一实施方式中，真核细胞是昆虫细胞(例如，Sf9，Mimic^TMSf9，Sf21，High Five^TM(BT1-TN-5B1-4)，或BT1-Ea88细胞)，藻类细胞(例如，双眉藻属(Amphora)，硅藻属(Bacillariophyceae)，杜氏藻属(Dunaliella)，小球藻属(Chlorella)，衣藻属(Chlamydomonas)，蓝绿藻属(Cyanophyta)(蓝藻细菌)，微拟球藻属(Nannochloropsis)，螺旋藻属(Spirulina)或棕鞭藻属(Ochromonas))或植物细胞(例如，来自单子叶植物(例如，玉米、水稻、小麦或狗尾草(Setaria))，或来自双子叶植物(例如，木薯，土豆，大豆，番茄，烟草，紫花苜蓿，小立碗藓(Physcomitrella patens)或拟南芥(Arabidopsis))。

在一实施方式中，细胞是细菌或原核细胞。在一些实施方式中，原核细胞是革兰氏阳性细胞，如芽孢杆菌(Bacillus)、链球菌(Streptomyces Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)或乳酸菌(Lactobacillus)。可以使用的芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，纳豆芽孢杆菌(B.natto)或巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。在实施方式中，细胞是枯草芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌3NA和枯草芽孢杆菌168。芽孢杆菌可获自例如，枯草芽孢杆菌遗传储存中心(Bacillus Genetic Stock Center)，生物科学556，484西第12大道，哥伦布市，俄亥俄州43210-1214。

在一个实施方式中，原核细胞是革兰氏阴性细胞，例如沙门氏菌(Salmonellaspp.)或大肠杆菌(Escherichia coli)，例如TG1，TG2，W3110，DH1，DHB4，DH5a，HMS 174，HMS174(DE3)，NM533，C600，HB101，JM109，MC4100，XL1-Blue和Origami，以及衍生自大肠杆菌B菌株，例如BL-21或BL21(DE3)，所有这些都是市售可得的。合适的宿主细胞是市售可得的，例如购自诸如DSMZ(德国微生物和细胞培养有限公司(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen and Zellkulturen GmbH)，德国不伦瑞克)的培养物保藏中心或美国典型培养物保藏中心(ATCC)。在一些实施方式中，所述细胞包括用作治疗剂的其它微生物群。它们包括存在于人类微生物组中的属于厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrumicrobia)、放线菌门(Actinobacteria)、梭菌门(Fusobacteria)和蓝菌门(Cyanobacteria)的微生物群。微生物群可包括需氧，严格厌氧或兼性厌氧，包括细胞或孢子。治疗性微生物群也可以包括在其修饰形式中利用的遗传操纵生物体和载体。其它微生物组相关治疗性生物体可以包括：古细菌、真菌和病毒。参见例如，人类微生物群项目联盟(The Human Microbiome ProjectConsortium).Nature 486,207–214(2012年6月14日)；Weinstock,Nature,489(7415):250–256(2012)；Lloyd-Price,Genome Medicine 8:51(2016)。

在一些实施方式中，培养的细胞被用于产生蛋白质，例如，抗体，例如单克隆抗体，和/或重组蛋白，用于治疗性用途。在实施方式中，培养的细胞产生肽、氨基酸、脂肪酸或其它有用的生化中间体或代谢物。例如，在实施方式中，可以产生具有约4000道尔顿至大于约140,000道尔顿分子量的分子。在实施方式中，这些分子可以具有一系列的复杂性并且可以包括翻译后修饰，包括糖基化。

在实施方式中，蛋白质是，例如，BOTOX，肉毒杆菌，肉毒毒素制剂(Neurobloc)，丽舒妥(Dysport)(或其它肉毒菌神经毒素血清型)，阿糖苷酶α(alglucosidase alpha)，达托霉素，YH-16，绒毛膜促性腺激素α，非格司亭(filgrastim)，西曲瑞克(cetrorelix)，白细胞介素-2，阿地白介素(aldesleukin)，替西白介素(teceleulin)，地尼白介素(denileukindiftitox)，干扰素α-n3(注射)，干扰素α-nl，DL-8234，干扰素，桑托里(Suntory)(γ-1a)，干扰素γ，胸腺素α1，他索纳明(tasonermin)，DigiFab，ViperaTAb，EchiTAb，CroFab，奈西立肽(nesiritide)，阿巴西普(abatacept)，阿来塞普(alefacept)，利比(Rebif)，阿法艾托特明(eptoterminalfa)，特立帕肽(骨质疏松症)，降钙素可注射(骨病)，降钙素(鼻腔注射，骨质疏松症)，依那西普(etanercept)，血红蛋白谷氨酸250(牛)，多确克津α(drotrecoginalpha)，胶原酶，卡培立肽(carperitide)，重组人表皮生长因子(局部凝胶，伤口愈合)，DWP401，达贝泊汀α(darbepoetin alpha)，促红细胞生成素Ω(epoetin omega)，促红细胞生成素(epoetin)β，促红细胞生成素α，地西卢定(desirudin)，重组水蛭素(lepirudin)，比伐卢定(bivalirudin)，诺纳革α(nonacog alpha)，霉诺耐(Mononine)，依他凝血素(eptacog alpha)(激活)，重组因子VIII+VWF，重组体(Recombinate)，重组因子VIII，因子VIII(重组)，阿法美特(Alphnmate)，奥特革α(octocog alpha)，因子VIII，帕利夫明(palifermin)，英迪激酶(Indikinase)，替奈普酶(tenecteplase)，阿替普酶(alteplase)，派替普酶(pamiteplase)，瑞替普酶(reteplase)，那替普酶(nateplase)，孟替普酶(monteplase)，促卵泡素α(follitropin alpha)，rFSH，hpFSH，米卡芬净(micafungin)，培非格司亭(pegfilgrastim)，来格司亭(lenograstim)，那托芬净(nartograstim)，舍莫瑞林(sermorelin)，胰高血糖素，艾塞那肽(exenatide)，普兰林肽(pramlintide)，阿糖脑苷酶(iniglucerase)，加硫酶(galsulfase)，乐克托品(Leucotropin)，莫革斯汀(molgramostirn)，醋酸曲普瑞林(triptorelin acetate)，组氨瑞林(Histrelin)(皮下植入Hydron)，地洛瑞林(deslorelin)，组氨瑞林(histrelin)，那法瑞林(nafarelin)，亮丙瑞林缓释储库(ATRIGEL)，亮丙瑞林植入物(DUROS)，戈舍瑞林(goserelin)，欧托品(Eutropin)，KP-102计划，生长激素，美卡舍明(mecasermin)(生长失败)，恩法韦肽(enlfavirtide)，ORG-33408，甘精胰岛素，谷氨酸胰岛素，胰岛素(吸入)，赖脯胰岛素，德特尼胰岛素(insulin deternir)，胰岛素(口腔，RapidMist)，美卡舍明林菲培(mecaserminrinfabate)，阿那白滞素，西莫白介素(celmoleukin)，99mTc-阿普西肽注射液，麦乐贝齐(myelopid)，倍泰龙(Betaseron)，醋酸格拉替雷(glatiramer acetate)，格旁(Gepon)，沙格司亭(sargramostim)，奥普瑞白介素(oprelvekin)，人白细胞衍生的α干扰素，倍尔来福(Bilive)，胰岛素(重组)，重组人胰岛素，门冬胰岛素(insulin aspart)，美卡色宁(mecasenin)，罗扰素-A(Roferon-A)，干扰素-α2，阿尔法扰素(Alfaferone)，复合α干扰素-1，干扰素α，阿温耐克斯(Avonex)重组人黄体生成素，阿法链道酶(dornase alpha)，曲弗明(trafermin)，齐考诺肽(ziconotide)，他替瑞林(taltirelin)，阿法地博特明(diboterminalfa)，阿托西班(atosiban)，贝卡普勒明(becaplermin)，依替巴肽(becaplermin)，扎马拉(Zemaira)，CTC-111，夏伐克(Shanvac)-B，HPV疫苗(四价)，奥曲肽，兰瑞肽，安克斯丁(ancestirn)，阿加西酶β(agalsidase beta)，阿加糖酶α，拉罗尼酶(laronidase)，醋肽铜(prezatide copper acetate)(局部凝胶)，拉布立酶(rasburicase)，兰尼单抗(ranibizumab)，阿提姆尼(Actimmune)，PEG-内含子，确可宁(Tricomin)，重组屋尘螨过敏脱敏注射液，重组人甲状旁腺激素(PTH)1-84(sc，骨质疏松症)，红细胞生成素δ(epoetin delta)，转基因抗凝血酶III，格兰迪托品(Granditropin)，透明质酸酶(Vitrase)，重组胰岛素，干扰素-α(口服含片)，GEM-21S，伐普肽(vapreotide)，艾度硫酸酯酶(idursulfase)，奥纳帕确特(omnapatrilat)，重组血清白蛋白，赛妥珠单抗佩革(certolizumab pegol)，羧肽酶(glucarpidase)，人重组C1酯酶抑制剂(血管神经性水肿)，拉诺普酶(lanoteplase)，重组人生长激素，恩夫韦肽(enfuvirtide)(无针注射，Biojector 2000)，VGV-1，干扰素(α)，卢辛坦特(lucinactant)，艾帕它迪(aviptadil)(吸入，肺病)，艾替班特(icatibant)，艾卡拉肽(ecallantide)，欧米甘安(omiganan)，奥革比(Aurograb)，醋酸培西加南(pexiganan acetate)，ADI-PEG-20，LDI-200，加瑞克(degarelix)，白介假单胞菌外毒素(cintredelinbesudotox)，Favld，MDX-1379，ISAtx-247，利拉鲁肽(liraglutide)，特立帕肽(teriparatide)(骨质疏松症)，组织因子通路抑制剂(tifacogin)，AA4500，T4N5脂质体乳液，卡妥索单抗(catumaxomab)，DWP413，ART-123，魁萨琳(Chrysalin)，去氨普酶，安地普酶(amediplase)，绒促卵泡素α(corifollitropinalpha)，TH-9507，替度鲁肽(teduglutide)，戴麦德(Diamyd)，DWP-412，生长激素(持续释放注射)，重组G-CSF，胰岛素(吸入，空气)，胰岛素(吸入，技术领域)，胰岛素(吸入，AERx)，RGN-303，DIAPEP277，干扰素β(丙型肝炎病毒感染(HCV))，干扰素α-n3(口服)，贝拉西普(belatacept)，透皮胰岛素贴片，AMG-531，MBP-8298，西雷西普(Xerecept)，奥培巴康(opebacan)，AIDSVAX，GV-1001，LymphoScan，瑞皮核糖核酸酶(ranpirnase)，利普散(Lipoxysan)，鲁丝普利肽(lusupultide)，MP52(β-三磷酸盐载体，骨再生)，黑色素瘤疫苗，西普勒塞尔-T(sipuleucel-T)，CTP-37，英色革(Insegia)，维特斯朋(vitespen)，人凝血酶(冷冻，手术出血)，凝血酶，TransMID，蛇毒纤溶酶(alfimeprase)，普瑞凯希(Puricase)，特利加压素(静脉注射，肝肾综合征)，EUR-1008M，重组FGF-I(可注射，血管疾病)，BDM-E，罗替盖普肽(rotigaptide)，ETC-216，P-113，MBI-594AN，耐力霉素(duramycin)(吸入，囊性纤维化)，SCV-07，OPI-45，内皮抑素(Endostatin)，血管抑素(Angiostatin)，ABT-510，包曼比瑞克(Bowman Birk)抑制剂浓缩液，XMP-629，99mTc-Hynic-膜联蛋白V，卡海拉利肽F(kahalalide F)，CTCE-9908，替维瑞克(teverelix)(延释)，奥扎瑞克(ozarelix)，罗咪酯肽(rornidepsin)，BAY-504798，白介素4，PRX-321，佩斯坎(Pepscan)，依波介素(iboctadekin)，rh乳铁蛋白(rhlactoferrin)，TRU-015，IL-21，ATN-161，西仑吉肽(cilengitide)，阿布富伦(Albuferon)，比费西克斯(Biphasix)，IRX-2，Ω干扰素，PCK-3145，CAP-232，帕瑞肽，huN901-DMI，卵巢癌免疫治疗疫苗，SB-249553，Oncovax-CL，OncoVax-P，BLP-25，CerVax-16，多表位肽黑色素瘤疫苗(MART-1，GP100，酪氨酸酶)，奈米非肽(nemifitide)，rAAT(吸入)，rAAT(皮肤科)，CGRP(吸入，哮喘)，培那西普(pegsunercept)，胸腺素β4，普厉肽平辛(plitidepsin)，GTP-200，雷莫拉宁(ramoplanin)，GRASPA，OBI-1，AC-100，鲑鱼降钙素(口服，埃利根(eligen))，降钙素(口服，骨质疏松症)，艾沙瑞林(examorelin)，卡莫瑞林(capromorelin)，Cardeva，韦拉繁明(velafermin)，131I-TM-601，KK-220，T-10，乌拉立肽(ularitide)，地来司他(depelestat)，海明肽(hematide)，克瑞沙林(Chrysalin)(局部)，rNAPc2，重组因子V111(聚乙二醇化脂质体)，bFGF，聚乙二醇化的重组葡萄球菌激酶变体，V-10153，超声波降解尿激酶原(SonoLysisProlyse)，NeuroVax，CZEN-002，胰岛细胞新生疗法，rGLP-1，BIM-51077，LY-548806，艾塞那肽(控释，Medisorb)，AVE-0010，GA-GCB，阿伏瑞林(avorelin)，ACM-9604，乙酸利那洛肽(linaclotid eacetate)，CETI-1，赫莫斯盘(Hemospan)，VAL(可注射)，速效胰岛素(注射用，Viadel)，鼻内胰岛素，胰岛素(吸入)，胰岛素(口服，埃利根)，重组甲硫氨酰人瘦素，皮创克纳(pitrakinra)皮下注射，湿疹)，皮创克纳(吸入干粉，哮喘)，多白介素(Multikine)，RG-1068，MM-093，NBI-6024，AT-001，PI-0824，ORG-39141，Cpn10(自身免疫性疾病/炎症)，塔拉特弗利(talactoferrin)(局部)，rEV-131(眼科)，rEV-131(呼吸系统疾病)，口服重组人胰岛素(糖尿病)，RPI-78M，奥普瑞白介素(oprelvekin)(口服)，CYT-99007 CTLA4-Ig，DTY-001，伐拉司特(valategrast)，干扰素α-n3(局部)，IRX-3，RDP-58，塔弗隆(Tauferon)，胆盐刺激脂肪酶，美瑞帕酶(Merispase)，丙氨酸磷酸酶，EP-2104R，美拉诺坦-II，布美诺肽(bremelanotide)，ATL-104，重组人微纤溶酶，AX-200，SEMAX，ACV-1，Xen-2174，CJC-1008，强啡肽A.，SI-6603，LAB GHRH，AER-002，BGC-728，疟疾疫苗(病毒体，PeviPRO)，ALTU-135，细小病毒B19疫苗，流感疫苗(重组神经氨酸酶)，疟疾/HBV疫苗，炭疽疫苗，VACC-5Q，VACC-4X，HIV疫苗(口服)，HPV疫苗，Tat类毒素，YSPSL，CHS-13340，PTH(1-34)脂质体乳膏(Novasome)，奥斯塔柏林-C(Ostabolin-C)，PTH类似物(局部用药，银屑病)，MBRI-93.02，MTB72F疫苗(结核病)，MVA-Ag85A疫苗(结核病)，FARA04，BA-210，重组瘟疫FIV疫苗，AG-702，OxSODrol，rBetV1，Der-p1/Der-p2/Der-p7过敏原靶向疫苗(尘螨过敏)，PR1肽抗原(白血病)，突变ras疫苗，HPV-16E7脂肽疫苗，迷路(labyrinthin)疫苗(腺癌)，CML疫苗，WT1-肽疫苗(癌症)，IDD-5，CDX-110，朋曲斯(Pentrys)，诺雷林(Norelin)，CytoFab，P-9808，VT-111，伊克卡品肽(icrocaptide)，替柏明(telbermin)(皮肤病学，糖尿病足溃疡)，芦平曲韦(rupintrivir)，瑞替克鲁(reticulose)，rGRF，HA，α-半乳糖苷酶A.，ACE-011，ALTU-140，CGX-1160，血管紧张素治疗性疫苗，d-4F，ETC-642，APP-018，rhMBL，SCV-07(口头，结核)，DRF-7295，ABT-828，ErbB2特异性免疫毒素(抗癌)，DT3SSIL-3，TST-10088，PRO-1762，Combotox，胆囊收缩素-B/胃泌素受体结合肽，111In-hEGF，AE-37，曲妥珠单抗(trasnizumab)-DM1，拮抗剂G，IL-12(重组)，PM-02734，IMP-321，rhIGF-BP3，BLX-883，CUV-1647(局部)，基于L-19的放射免疫治疗药(癌症)，Re-188-P-2045，AMG-386，DC/1540/KLH疫苗(癌症)，VX-001，AVE-9633，AC-9301，NY-ESO-1疫苗(多肽)，NA17.A2肽，黑色素瘤疫苗(脉冲抗原治疗)，前列腺癌疫苗，CBP-501，重组人乳铁蛋白(干眼症)，FX-06，AP-214，WAP-8294A(可注射)，ACP-HIP，SUN-11031，肽YY[3-36](肥胖，鼻内)，FGLL，阿塞西普(atacicept)，BR3-Fc，BN-003，BA-058，人甲状旁腺激素1-34(鼻腔，骨质疏松症)，F-18-CCR1，AT-1100(乳糜泻/糖尿病)，JPD-003，PTH(7-34)脂质体乳膏(Novasome)，耐力霉素(眼科，干眼)，CAB-2，CTCE-0214，GlycoPEG化促红细胞生成素，EPO-Fc，CNTO-528，AMG-114，JR-013，因子XIII，氨基康定(aminocandin)，PN-951，716155，SUN-E7001，TH-0318，BAY-73-7977，替维瑞克(teverelix)(速释)，EP-51216，hGH(控释，生物圈)，OGP-I，西夫韦肽(sifuvirtide)，TV4710，ALG-889，ORG-41259，rhCC10，F-991，胸腺五肽(肺病)，r(m)CRP，肝选择性胰岛素，苏靶林(subalin)，L19-IL-2融合蛋白，弹力素(elafin)，NMK-150，ALTU-139，EN-122004，生成素，血小板生成素受体激动剂(血小板减少症)，AL-108，AL-208，神经生长因子拮抗剂(疼痛)，SLV-317，CGX-1007，INNO-105，口服特立帕肽(艾力更(eligen))，GEM-OS1，AC-162352，PRX-302，LFn-p24融合疫苗(Therapore)，EP-1043，肺炎球菌儿科疫苗，疟疾疫苗，脑膜炎奈瑟氏菌B组疫苗，新生儿B组链球菌疫苗，炭疽疫苗，HCV疫苗(gpE1+gpE2+MF-59)，中耳炎治疗，HCV疫苗(核心抗原+ISCOMATRIX)，hPTH(1-34)(透皮，ViaDerm)，768974，SYN-101，PGN-0052，阿维库明(Aviscumnine)，BIM-23190，结核疫苗，多表位酪氨酸酶肽，癌症疫苗，恩卡斯替母(Enkastim)，APC-8024，GI-5005，ACC-001，TTS-CD3，血管靶向TNF(实体瘤)，去氨加压素(口腔控释)，奥那西普，和TP-9201。

在一些实施方式中，多肽是阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRA)，英利昔单抗(infliximab)(REMICADE^TM)，利妥昔单抗(rituximab)(RITUXAN^TM/MABTHERA^TM)依那西普(etanercept)(ENBREL^TM)，贝伐单抗(bevacizumab)(AVASTIN^TM)，曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTIN^TM)，派革利革斯丁(pegrilgrastim)(NEULASTA^TM)，或任何其它合适的多肽，包括生物类似物和生物改良剂。

其它合适的多肽在如下表6中以及US2016/0097074的表1中列出。本领域技术人员可以理解的是，本发明的公开内容还包括如本文所述的产物和/或偶联物的组合[(即多重蛋白质，修饰的蛋白质(与PEG、毒素、其它活性成分偶联)]。

表6

在实施方式中，多肽是如表7所示的激素、血液凝固/凝结因子、细胞因子/生长因子、抗体分子、融合蛋白、蛋白疫苗或肽。

表7.示例性产物

在实施方式中，蛋白质是多特异性蛋白，例如，双特异性抗体，如表8所示。

为了实现该系统对治疗性蛋白质的益处，可测试包含多个RTS位点的CHOK1SV SSI的治疗性蛋白质的表达，如表10所示。实验可以分为三个阶段；阶段1：测试多位点SSI的应用以增加qP；阶段2：测试多位点SSI在两个SSIS之间表达三基因双特异性mAb的能力；阶段3：在一个位点表达辅助基因，以协助在另一个位点编码的DtE蛋白的表达。

阶段1：包含单个RTS位点的某些细胞系的局限性是必需转录单元的单拷贝不足以产生供于临床生产的合适效价。因此，我们可评估使用多个RTS来增加mAb基因整合拷贝数的选择。在这种方法中，mAb基因可以同时靶向着陆坪A和B。库的均质性可通过FACS分选和蛋白A HPLC分析上清液来确定。

阶段2：对于大多数下一代抗体(例如四价双特异性抗体)，多个重链或轻链的组装是一个经常出现的问题。为了获得具有极少不需要的副产物的最佳产品质量，选择在稳定且可重复的情况下表达多达4种抗体链的合适CHO克隆是有益的。因此，通常需要在克隆选择期间利用ELISA、RP-HPLC或CD-SDS进行大量的产物分析。然而，在包含多个RTS的细胞系中，编码多链蛋白的基因在两个位点上通过个体启动子在空间上分开。这确保了单个链的拷贝数和相对表达早在转染子库中就是一致的，并且能够通过编码转录单元的启动子强度或拷贝数操作实现各个多肽链的可用性的经验微调。这样做的好处是产品质量更加一致，减少了由SSI生成的库和细胞系产生的错误折叠的多链重组蛋白的比例，显著地回避了早期评估的需要。测试分子：色古土珠单抗阿木纳白细胞素(cergutumab amunaleukin)。

阶段3：会导致CHOK1SV GS-KO^TM细胞系分泌能力的扩大的内源性蛋白质的表达是提高产品效价的可靠方法。可以从PCT申请WO2015018703A1中识别出候选物，并且可以在包含多个不同的重组靶位点(RTS)的细胞系上评估表9和10中的候选物。产物效价可以通过蛋白A HPLC测量，抗体组装可以通过SDS-PAGE和IEF评估。测试分子：利妥昔单抗，cB72.3，英夫利昔单抗和依那西普。

表9.

表10.

实施例

实施例1：采用腺病毒5病毒共感染的CHOK1SV GS-KO^TM中的瞬时AAV生产

为了确定CHOK1SV GS-KO^TM(隆萨公司(Lonza)，英国斯劳)细胞在生物学上能否产生和组装rAAV载体蛋白，将CHOK1SV GS-KO^TM细胞用两种质粒转染，所述两种质粒分别为：pRC2-mi342(6234，克隆泰克公司(Clontech))和pAAV-GFP(AAV-400，细胞生物实验室公司(Cell Biolabs))对照载体(目录号：AAV-400细胞生物实验室公司(Cell Biolabs)，美国圣迭戈)(图6)，在wt Ad5病毒(目录号：

VR-1516^TM，美国典型培养物保藏中心，美国马纳萨斯)存在下进行。在自然条件下，CHOK1SV GS-KO^TM细胞由于缺乏病毒受体而不接受腺病毒，但是在阳离子转染试剂(Lipofectamine或PEI)存在下，带负电荷的腺病毒5能够进入CHOK1SV GS-KO^TM细胞，从而提供所有辅助元件。此概念用于设计该评估实验，其中CHOK1SVGS-KO^TM细胞提供了所有元件(通过转染提供Rep-Cap和GOI，通过感染提供Ad5元件)。细胞在转染/感染后72小时收获，并通过4次冷冻/融化循环进行裂解，然后进行苯甲酸酯酶处理以消化任何质粒DNA。裂解物通过qPCR测试AAV滴度，以及测试HEK293对转基因(绿色荧光蛋白-GFP)表达的转导效率。作为该实验的对照，使用了贴壁HEK293细胞，并分析来自HEK293三重转染(pHelper(6234，克隆泰克公司(Clontech))，pRC2-mi342(6234，克隆泰克公司(Clontech))，pAAV-GFP(AAV-400，细胞生物实验室公司(Cell Biolabs))的细胞裂解物(图6)，以及用pRC2-mi342(6234，克隆泰克公司(Clontech))，pAAV-GFP转染，且用wt Ad5感染的CHOK1SV GS-KO^TM细胞。实验概述和该实验的结果如图1所示。转染后，在CHOK1SV GS-KO^TM细胞中检测到绿色荧光，表明转染成功(图1B，左图)。转染后，来自CHOK1SV GS-KO^TM细胞中的裂解物被用于转导HEK293细胞，并且在HEK293细胞中检测到绿色荧光，尽管其水平较低(图1B，右图)，表明AAV的产量较低。qPCR数据显示AAV效价为6.8E+09vg/mL(图1C)。阳性对照HEK293进行了三次转染，产生了如预期更高的AAV效价1.8e+12，而阴性对照HEK293 GFP转染中无AAV产生。总而言之，这是第一个已知的实验，表明CHOK1SV GS-KO^TM细胞能够在提供AAV包装所需的所有已知基因组元件时产生AAV。

实施例2：在无病毒共感染情况下，CHOK1SV GS-KO^TM中的瞬时rAAV生产

为了确定在不存在wt Ad5病毒的情况下，CHOK1SV GS-KO^TM细胞能否产生rAAV，采用与Howe等(2005)相似的方法，对细胞进行了工程改造以表达Ad5E1A和E1B。产生了如下质粒构建体，其在在TET-on启动子控制下表达E1A(pMF30，图2)，在组成型人CMV启动子控制下表达E1B(pMF23，图3)，和Ad5 E1A-E1B开放阅读框(pXC17.4_17AV5PerProKZ，图4)。通过用pMF30转染并选择能够在补充了50μM L-MSX的无谷氨酰胺的培养基中存活的细胞来建立CHOK1SV GS-KO^TM衍生库(图5A)。然后用pMF23转染CHOK1SV GS-KO^TME1A，并选择能够在补充了50μM L-MSX和10μg/mL嘌呤霉素的无谷氨酰胺培养基中存活的细胞(图5A)。在所有基因组DNA PCR中，水对照均受到污染，但很明显E1A PCR产物在HEK293F和HEK293L细胞以及pXC17.4_17AV5PerProKZ中得到了扩增(图1B)。CHOK1SV GS-KO^TM拟(拟)和CHOK1SV GS-KO^TME1A E1B(E1A E1B)库用多四环素(2μg/ml)处理以活化TET启动子并经E1A转录0(未处理)、2、3、4和7天，然后使用E1A(图1D)和E1B(图1E)的引物分离出mRNA，用于逆转录PCR。结果显示，用多四环素处理的CHOK1SV GS-KO^TME1A E1B库和HEK293L细胞中E1A 243R和E1A171R的水平较高。多四环素处理后，E1B mRNA产物的量没有变化，但在HEK293L细胞中明显更高。在多四环素处理7天的CHOK1SV GS-KO^TME1A E1B库(E1A E1B)中检测到E1A蛋白，而在CHOK1SV GS-KO^TM拟(拟)蛋白裂解物中则未检测到E1A蛋白(图5F)。然后测试该库CHOK1SVGS-KO^TME1A_E1B在有和没有多四环素(2μg/ml)存在的情况下产生rAAV的能力。为了确保E1A和E1B蛋白的高表达，还在CHOK1SV GS-KO^TM细胞中瞬时转染了E1A-E1B质粒(pXC17.4_17AV5PerProKZ，图4)。这些数据显示，可在CHO中实现E1A蛋白表达，而无需进行wt Ad感染。E1B整合和表达的确认更具挑战性。

实施例3：在无病毒共感染的情况下，CHOK1SV GS-KO^TM和HEK293中的永久rAAV产生。

将适合后续RMCE的着陆坪整合到CHOK1SV GS-KO^TM和HEK293基因组中，作为从重组CHOK1SV^TM细胞系中鉴定出的基因座(Fer1L4、NL1、2、3、4、5和6(例如，参见WO2013190032A1和EP2711428A1))。这些着陆坪内的元件排布示意图在图7A，B和C中示出。Frt位点在SV40E启动子和选择标志物之间的定位使其可在随后的RMCE中被使用。使用不相容的Frt位点(A，B，C，D，E和F)和不同的报告/选择标志物可确保位点可独立寻址。图8显示在1个(图8A)，2个(图8B)和3个(图8C)位点CHO-和HEK293-源性的SSI细胞系中，RMCE后AAV，Ad5和GOI基因的各种排列。

为了生成HEK293 SSI宿主，使用加州大学圣克鲁兹分校(University ofCalifornia Santa Cruz(UCSC))人基因组数据库的独立副本针对人基因组(版本：2006年3月(NCBI36/hg18))进行BLAT搜索CHOK1SV衍生的载体整合位点和着陆坪位置。这在CHOK1SV序列的至少25个碱基对中鉴定了95％(和更高)相似性的序列。在IGV查看器(博德研究所(Broad institute)版本2.4)中显示相似性区域。使用内部Crispr-Cas9设计工具设计Crispr-Cas9 gRNA。在表A中总结CHOK1SV和HEK293基因座。

实施例4：辅助基因表达以增强CHOK1SV GS-KO^TM中的rAAV生产

哺乳动物的先天免疫系统通过识别病毒签名来感知病毒感染并活化有效的抗病毒应答(例如RIG-1 IFNα应答)。越来越多的证据表明，RNA沉默或RNA干扰(RNAi)在哺乳动物细胞中起着抗病毒作用。哺乳动物病毒编码IFN拮抗剂，例如流感NS1蛋白和牛痘病毒E3L蛋白，参见例如de Vries等,Gene Ther.,15:545-52(2008)，其抑制PKR，且牛痘病毒编码的可溶性IFN-α/β受体诱饵抵消了感染细胞中的IFN反应。可研究IFN拮抗剂的共表达作为克服实施例2和3中观察到的不良Ad5和AAV基因表达的可能方法。

实施例5：使用位点特定整合的CHEK1SV GS-KO^TM中的rAAV生产

第1节：双着陆坪CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主的构建

通过在CHOK1SV GS-KO^TM宿主的基因组中插入两个着陆坪来创建CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主(图9)。着陆坪A位于Fer1L4基因中(参见表10)，且包含SV40早期启动子(SV40E)，潮霉素磷酸转移酶-eGFP融合基因(Hpt-eGFP)和SV40多腺苷酸化序列(pA)。Hpt-eGFP基因和SV40 pA侧接不相容的Frt位点(分别为Frt_5和Frt_wt)，以促进重组基因进入CHOK1SV GS-KO^TM基因组的RMCE。着陆坪B位于NL1基因座中(见表A)，且包含SV40早期启动子(SV40E)，嘌呤霉素N-乙酰转移酶-DsRed融合基因(PAC-DsRed)和SV40多腺苷酸化序列(pA)。PAC-DsRed基因和SV40 pA侧接不相容的Frt位点(分别为Frt14和Frt15)。在两个着陆坪中，在SV40E启动子和选择标志物之间定位Frt位点使其能够在随后数轮RMCE中被使用。设计用于在CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主中RMCE的靶向载体包含一个阳性选择标志物(例如GS)，该标志物紧邻与目标着陆坪相容的Frt位点的3'排列(图9)。载体的其余部分包含GOI的转录单元，其后是与着陆坪中第二Frt位点相容的Frt位点。靶向载体DNA(图10)与表达Flp重组酶的载体共转染。转染的细胞经24小时孵育，然后施加选择压力(例如，从培养基去除谷氨酰胺)。成功的RMCE的特征是Hpt-eGFP或PAC-DsRed基因的缺失和被阳性选择标志物基因的取代。细胞在荧光显微镜下或用流式细胞术分析显示为暗色。通过FACS可以轻松去除阳性选择中回收的未交换细胞。

第2节：与CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主相容的Rep-Cap和GOI表达载体的构建

为了生成表达Rep-Cap和GOI基因的CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主衍生库(图9)，设计了五个载体(pLMC31-35，图10A至E)。pLMC31(图10A)是用于在CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主中建立GOI(eGFP)产生型细胞系的靶标载体。eGFP的转录由hCMV主要中间早期基因1(hCMV)的启动子驱动，并使用β-球蛋白聚腺苷酸化(pA)序列。整个转录盒侧接反向末端重复序列(ITR)，这是病毒复制和封装所必需的唯一顺式作用元件。新霉素磷酸转移酶I(nptI)基因紧邻Frt14的3'端排列，并由位于NL1基因座着陆坪中的SV40E启动子驱动成功的RMCE转录。pLMC32至35(图10B至E)是靶向载体，其包含具有AAV p5启动子的不同构象的Rep-Cap表达盒，用于在CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主中建立AAV Rep-Cap生产型细胞系(图10B至E)。由野生型p5启动子驱动的正常Rep78表达显示抑制AAV产生。不同构象的目的是减少Rep78表达，同时保持Cap表达以最大化AAV产生。谷氨酰胺合成酶(GS)cDNA紧邻Frt5的3'端排列，成功的RMCE转录由位于Fer1L4基因座的着陆坪中的SV40E启动子驱动。pLMC32(图10B)包含最小的p5(白色正方形)，其中两个增强子元件已移除。完整的p5(黑白方块)位于Cap基因的3'端，以增强Cap的表达。pLMC33(图10C)也具有最小的p5启动子(白色正方形)(类似于pLMC32)，但Cap基因3'处的p5mut启动子(黑色和灰色正方形)包含突变的(GGGGGGG)TATA框。在pLMC34(图10D)中，含有Rep的5'的p5启动子(黑色和白色正方形)，和p5mut启动子(黑色和灰色正方形)，伴有突变为GGGGGGG的TATA框，位于Cap的3'端。pLMC35(图10E)在两个p5启动子(黑色和灰色正方形)中都具有TATA突变。pLMC32-35使用GS cDNA选择标志物。

第3节：通过四种Rep-Cap构型的三重转染，在CHOK1SV GS-KO^TM和HEK293细胞中产生rAAV

GOI(pLMC31)和Rep-Cap(pLMC32至35)表达载体支持在用wt Ad5病毒共感染的CHOK1SV GS-KO^TM中或用pHelper(6234，克隆泰克公司(Clontech))载体共转染的HEOK293中支持rAAV生产的能力。Western印迹分析由E1A蛋白表达证实CHOK1SV GS-KO^TM细胞的wt Ad5转导(图11A)，并揭示了HEK293细胞中采用pLMC31-35载体的高水平Rep和Cap蛋白表达，低水平Rep蛋白表达和未检到Cap蛋白(CHOK1SV GS-KO^TM细胞中)(图11B和11C)。TaqMan-qPCR分析显示，在HEK293细胞中，与来自克隆泰克公司的原始质粒(5#，pRC2-mi342(6234，克隆泰克公司(Clontech))和pAAV-GFP)相比，采用这些pLMC32-35载体的AAV效价提高了3-5倍，而CHOK1SV GS-KO^TM细胞中产量较低(图20)。感染性测定证实了qPCR效价，显示HEK293样品高水平的病毒转导和CHOK1SV GS-KO^TM样品低水平的感染(图12)。总之，这些数据验证了pLMC32-35载体在HEK293和CHO细胞中产生AAV的功能性，表明它们能够在CHO细胞中稳定表达后产生rAAV。

第4节：通过位点特异性整合(SSI)生成具有Rep-Cap和GOI稳定表达的CHO细胞。

为了确定具有GOI和Rep/Cap稳定整合的CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主是否可以支持rAAV的生产，将GOI(pLMC31)和各Rep-Cap载体(pLMC32-35)与FLP重组酶表达型载体(pMF4)转染进入CHOK1SV GS-KO^TMSSI宿主。通过同时或顺序整合Rep-Cap和GOI生成了两组库(图13)。使用经设计以与Rep-Cap，Fer1L着陆坪，GOI或NL1着陆坪退火的引物进行PCR分析(图14)，显示Rep/Cap成功整合到大多数库中位于Fer1L4基因中的着陆坪中(图15A))。除了这些库中的两个(“A”库18和19)外，全部检测到残余的Fer1L4着陆坪的PCR产物，表明这些库中的完全SSI(图15B)。但是，GOI仅整合到了由顺序靶向产生的库(‘B’库)的NL1基因座库中的着陆坪中(图16A)，并且在所有库中都检测到了残余的着陆坪(图16B)。Western印迹分析鉴定了具有Rep的稳定表达的五个库，而未检测到Cap蛋白的表达(图17)。为了证实CHOK1SVGS-KO^TM细胞中Rep-Cap的表达，使用用于检测Rep和Cap的不同同种型的引物，通过TaqMan-qPCR分析法分析了这些基因的mRNA表达(图18和图21)。用Rep-Cap2，GOI和pHelper(6234，克隆泰克公司(Clontech))载体转染CHOK1SV GS-KO^TM细胞诱导Rep mRNA水平升高约5倍(图19A-C)，而Rep和Cap mRNA水平升高约7倍(与GOI(pLMC31)和Rep-Cap(pLMC32-35)载体相比)(图19A-C)。仅当用Rep-Cap2，GOI和pHelper(6234，克隆泰克公司(Clontech))转染CHOK1SV GS-KO^TM细胞时，才能检测到E1A、E1B、E2A、E4和VA I mRNA水平，而当用GOI(pLMC31)和Rep-Cap(pLMC32-35)转染时检测不到(图19E-J)。在CHOK1SV GS-KO^TM细胞中未检测到VA II mRNA水平(图19K)。与HEK293细胞相比，在CHOK1SV GS-KO^TM中，除E4外，所有观察到的mRNA水平均较低(图19A-K)。这些数据表明，与HEK293细胞相比，CHOK1SV GS-KO^TM细胞中Rep-Cap mRNA的诱导和表达较低。总之，CHOK1SV GS-KO^TM细胞可表达Ad5辅助基因和Rep-Cap，但是这些基因的表达水平需要进一步优化。

Claims

1.一种哺乳动物细胞，其包含(i)至少四个不同的重组靶位点(RTS)，(ii)含E1A、E1B或其组合的腺病毒(Ad)基因，和(iii)与Ad基因操作性连接的启动子，其中所述RTS、Ad基因和启动子是染色体整合型的。

2.如权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞是小鼠细胞，人细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，CHO-K1细胞，CHO-DXB11细胞，CHO-DG44细胞，包括所有变体的CHOK1SV^TM细胞，包括所有变体的CHOK1SV GS-KO^TM(谷氨酰胺合成酶敲除型)细胞，包括贴壁和悬浮适应型变体的HEK293细胞，HeLa细胞或HT1080细胞。

3.如权利要求1-2中任一项所述的细胞，其中，所述细胞包含四个RTS。

4.如权利要求1-2中任一项所述的细胞，其中，所述细胞包含六个RTS。

5.如权利要求1-4中任一项所述的细胞，其中，至少一个RTS选自下组：SEQ ID NO.:1-30。

6.如权利要求1-5中任一项所述的细胞，其中，至少一个RTS、所述Ad基因和所述启动子整合在单一染色体基因座处。

7.如权利要求6所述的细胞，其中，所述染色体基因座是X染色体上MID1的第一内含子，NL2，NL1，Fer1L4，ROSA26，HGPRT，DHFR，COSMC，LDHa，MGAT1，GRIK1，或增强的表达和稳定性区。

8.如权利要求1-7中任一项所述的细胞，其还包含位点特异性重组酶基因。

9.如权利要求8所述的细胞，其中，所述位点特异性重组酶基因是染色体整合型的。

10.如权利要求1-9中任一项所述的细胞，其还包含第二Ad基因，其中所述第二Ad基因是染色体整合型的。

11.如权利要求10所述的细胞，其中，所述第二Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合。

12.如权利要求11所述的细胞，其中，所述第二Ad基因来自腺病毒5型。

13.如权利要求10-12中任一项所述的细胞，其中，所述第二Ad基因位于两个RTS之间。

14.如权利要求1-13中任一项所述的细胞，其还包含腺相关病毒(AAV)基因，其中，所述AAV基因是染色体整合型的。

15.如权利要求14所述的细胞，其中，所述AAV基因包含Rep、Cap或其组合。

16.如权利要求16所述的细胞，其中，所述AAV基因来自腺相关病毒2型。

17.如权利要求14-16中任一项所述的细胞，其中，所述AAV基因位于两个RTS之间。

18.如权利要求1-17中任一项所述的细胞，其还包含AAV载体盒，其中所述AAV载体盒是染色体整合型的。

19.如权利要求18所述的细胞，其中，所述AAV载体盒包含报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。

20.如权利要求18-19中任一项所述的细胞，其中，所述AAV载体盒位于两个RTS之间。

21.如权利要求1-20中任一项所述的细胞，其中，所述细胞基本上不含辅助病毒。

22.一种哺乳动物细胞，其包含(i)至少四个不同的重组靶位点(RTS)，(ii)腺病毒(Ad)基因E2A、E4、VA、MIR342或其组合，和(iii)与Ad基因操作性连接的启动子，其中所述RTS、Ad基因和启动子是染色体整合型的。

23.如权利要求22所述的细胞，其中，所述细胞是小鼠细胞，人细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，CHO-K1细胞，CHO-DXB11细胞，CHO-DG44细胞，包括所有变体的CHOK1SV^TM细胞，包括所有变体的CHOK1SV GS-KO^TM(谷氨酰胺合成酶敲除型)细胞，包括贴壁和悬浮适应型变体的HEK293细胞，HeLa细胞或HT1080细胞。

24.如权利要求22-23中任一项所述的细胞，其中，所述细胞包含四个RTS。

25.如权利要求22-23中任一项所述的细胞，其中，所述细胞包含六个RTS。

26.如权利要求22-25中任一项所述的细胞，其中，至少一个RTS选自下组：SEQ ID NO.:1-30。

27.如权利要求22-26中任一项所述的细胞，其中，所述RTS、所述Ad基因和所述启动子整合在单一染色体基因座处。

28.如权利要求27所述的细胞，其中，所述染色体基因座是X染色体上MID1的第一内含子，NL2，NL1，Fer1L4，ROSA26，HGPRT，DHFR，COSMC，LDHa，MGAT1，GRIK1，或增强的表达和稳定性区。

29.如权利要求22-27中任一项所述的细胞，其还包含位点特异性重组酶基因。

30.如权利要求29所述的细胞，其中，所述位点特异性重组酶基因是染色体整合型的。

31.如权利要求22-30中任一项所述的细胞，其还包含第二Ad基因，其中所述第二Ad基因是染色体整合型的。

32.如权利要求31所述的细胞，其中，所述第二Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合。

33.如权利要求32所述的细胞，其中，所述第二Ad基因来自腺病毒5型。

34.如权利要求31-33中任一项所述的细胞，其中，所述第二Ad基因位于两个RTS之间。

35.如权利要求22-34中任一项所述的细胞，其还包含腺相关病毒(AAV)基因，其中，所述AAV基因是染色体整合型的。

36.如权利要求35所述的细胞，其中，所述AAV基因包含Rep、Cap或其组合。

37.如权利要求36所述的细胞，其中，所述AAV基因来自腺相关病毒2型。

38.如权利要求35-37中任一项所述的细胞，其中，所述AAV基因位于两个RTS之间。

39.如权利要求22-38中任一项所述的细胞，其还包含AAV载体盒，其中所述AAV载体盒是染色体整合型的。

40.如权利要求39所述的细胞，其中，所述AAV载体盒包含报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。

41.如权利要求39-40中任一项所述的细胞，其中，所述AAV载体盒位于两个RTS之间。

42.如权利要求20-41中任一项所述的细胞，其中，所述细胞基本上不含辅助病毒。

43.一种哺乳动物细胞，其包含(i)至少四个不同的重组靶位点(RTS)；和(ii)包含Rep、Cap或其组合的腺相关病毒(AAV)基因，其中RTS和AAV基因是染色体整合型的。

44.如权利要求43所述的细胞，其中，所述AAV基因来自腺相关病毒2型。

45.如权利要求43-44中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是小鼠细胞，人细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，CHO-K1细胞，CHO-DXB11细胞，CHO-DG44细胞，包括所有变体的CHOK1SV^TM细胞，包括所有变体的CHOK1SV GS-KO^TM(谷氨酰胺合成酶敲除型)细胞，包括贴壁和悬浮适应型变体的HEK293细胞，HeLa细胞或HT1080细胞。

46.如权利要求43-45中任一项所述的细胞，其中，所述细胞包含四个RTS。

47.如权利要求43-45中任一项所述的细胞，其中，所述细胞包含六个RTS。

48.如权利要求43-47中任一项所述的细胞，其中，至少一个RTS选自下组：SEQ ID NO.:1-30。

49.如权利要求43-48中任一项所述的细胞，其中，所述RTS和所述Ad基因整合在单一染色体基因座处。

50.如权利要求49所述的细胞，其中，所述染色体基因座是X染色体上MID1的第一内含子，NL2，NL1，Fer1L4，ROSA26，HGPRT，DHFR，COSMC，LDHa，MGAT1，GRIK1，或增强的表达和稳定性区。

51.如权利要求43-50中任一项所述的细胞，其还包含位点特异性重组酶基因。

52.如权利要求51所述的细胞，其中，所述位点特异性重组酶基因是染色体整合型的。

53.如权利要求43-52中任一项所述的细胞，其还包含Ad基因和操作性连接至Ad基因的启动子，由此所述Ad基因和所述启动子是染色体整合型的。

54.如权利要求53所述的细胞，其中，所述Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合。

55.如权利要求54所述的细胞，其中，所述Ad基因来自腺病毒5型。

56.如权利要求43-55中任一项所述的细胞，其中，所述AAV基因位于两个RTS之间。

57.如权利要求43-56中任一项所述的细胞，其还包含AAV载体盒。

58.如权利要求57所述的细胞，其中，所述AAV载体盒包含报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。

59.如权利要求57-58中任一项所述的细胞，其中，所述感兴趣的基因位于两个RTS之间。

60.如权利要求43-59中任一项所述的细胞，其中，所述细胞基本上不含辅助病毒。

61.一种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包含：

a.六个不同重组靶位点(RTS)；

b.腺病毒(Ad)基因，其含有E1A和E1B；

c.启动子，其操作性连接至Ad基因，其中所述RTS、所述Ad基因和所述启动子是染色体整合型的；

d.第二Ad基因，其包含E2A、E4、VA和MIR342，其中所述第二Ad基因位于两个RTS之间；

e.腺相关病毒(AAV)基因，其包含Rep和Cap，其中所述AAV基因位于两个RTS之间；和

f.AAV载体盒，其包含报告基因、选择基因或治疗上感兴趣的基因，其中所述AAV载体盒位于两个RTS之间。

62.一种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包含含有E1A和E1B的腺病毒(Ad)基因和操作性连接至所述Ad基因的启动子，含E2A、E4、VA和MIR342的第二Ad基因，含Rep和Cap的腺相关病毒(AAV)基因，以及含报告基因、选择基因、治疗上感兴趣的基因或其组合的AAV载体盒。

63.一种产生重组腺相关病毒(rAAV)生产细胞的方法，其包括：

a.提供细胞，该细胞包含至少四个不同的重组靶位点(RTS)，含E1A、E1B或其组合的腺病毒(Ad)基因，和与该Ad基因操作性连接的启动子，其中所述RTS、Ad基因和启动子是染色体整合型的；

b.用载体转染(a)中提供的细胞，所述载体包含可交换盒，其编码腺相关病毒(AAV)基因、第二Ad基因、AAV载体盒，或其组合；

c.将可交换盒整合到染色体中；和

d.选择具有整合到染色体中的可交换盒的rAAV生产细胞。

64.如权利要求63所述的方法，其中，(b)的转染采用两种载体，第一载体包含含有第二Ad基因和AAV基因的可交换盒，第二载体包含含有AAV载体盒的可交换盒。

65.如权利要求63所述的方法，其中，(b)的转染采用两种载体，第一载体包含含有第二Ad基因的可交换盒，第二载体包含含有AAV基因的可交换盒。

66.如权利要求63所述的方法，其中，(b)的转染采用三种载体，第一载体包含含有第二Ad基因的可交换盒，第二载体包含含有AAV基因的可交换盒，第三载体包含含有AAV载体盒的可交换盒。

67.如权利要求63-66中任一项所述的方法，其中，各可交换盒还包含两个RTS，其与细胞的两个RTS相匹配。

68.如权利要求63-67中任一项所述的方法，其中，所述第二Ad基因包含E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合。

69.如权利要求63-69中任一项所述的方法，其中，所述AAV基因包含Rep、Cap或其组合。

70.如权利要求63-69中任一项所述的细胞，其中，所述AAV载体盒包含报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。

71.一种产生重组腺相关病毒(rAAV)的方法，其包括：(i)用rAAV感染宿主细胞，(ii)产生包装有AAV载体盒的rAAV，和(iii)纯化包装的rAAV，其中所述宿主细胞包含：

a.至少四个不同的重组靶位点(RTS)；

b.腺病毒(Ad)基因，其包含E1A、E1B或其组合；

d.第二Ad基因，其包含E1A、E1B、E2A、E4、VA、MIR342或其组合；

e.腺相关病毒(AAV)基因，其包含Rep、Cap或其组合；和

f.AAV载体盒，其包含报告基因，选择基因，治疗上感兴趣的基因或其组合。

72.如权利要求71所述的方法，其中，rAAV生产和包装不需要活的野生型辅助病毒。

73.如权利要求71-72中任一项所述的方法，其中，rAAV生产不需要E1A的表达。

74.如权利要求71-73中任一项所述的方法，其中，纯化后获得最小1.0 x 10⁹vg/mL活性rAAV。