JP2020523006A - 増強された改変ウイルスカプシドタンパク質 - Google Patents

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Abstract

改変カプシドタンパク質、単離されたポリヌクレオチド、改変カプシドタンパク質の調製方法、組換えウイルス粒子、改変ウイルス粒子の生成のための組換え発現システム、ならびに遺伝子編集および調節の方法が、本明細書で提供される。改変ウイルスカプシドタンパク質であって、前記ウイルスカプシドタンパク質の内部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質またはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含む、改変ウイルスカプシドタンパク質。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年６月５日に出願した米国特許仮出願第６２／５１５，４６８号、および２０１７年９月２２日に出願した米国特許仮出願第６２／５６２，０５８号の優先権を米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて主張するものであり、前記仮出願各々についての内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
背景
生細胞のゲノムに特異的な、安全な、かつ標的化された変化を最小限のオフターゲット効果でもたらす、効率的で信頼性のある方法の開発は、生物医学研究者の長年の目標である。最近、細菌ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質−９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）に基づく新たなツールが、遺伝子編集および調節を効率的に行うその可能性のため、大きな反響を呼んでいる。
Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲシステムによる遺伝子修復を媒介するために標的組織および細胞に効率的に送達されなければならない大きい酵素であり、現行のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子修正プロトコールには多数の欠点がある。Ｃａｓ９の長期発現は、宿主免疫応答を惹起しうる。追加のガイドＲＮＡは、パッケージング制約のため、通常は別のベクターによって送達しなければならない。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに伴うもう１つの制約は、ｇＲＮＡ標的以外の配列に対するＣａｓ９のニッキングのため、標的部位以外の代替ゲノム領域の遺伝子改変リスクを増大させることである。これらの「オフターゲット」部位は、正常な細胞機能にとって非常に重要であり、一部の領域の破壊が、異常な細胞増殖を招くこともある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの最適な実施形態は、「オフターゲット」遺伝子再構成の機会を低下させるために一過的にしか発現されないＣａｓ９タンパク質を有することである。したがって、ＡＡＶでのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集方法の使用には、大きな安全性の懸念がある。
本開示は、先行技術の制限に対処し、関連する利点も提供する。
概要
本開示は、改変カプシドタンパク質、単離されたポリヌクレオチド、改変カプシドタンパク質の調製方法、組換えウイルス粒子、改変ウイルス粒子の生成のための組換え発現システム、および遺伝子編集の方法、ならびに産物およびそれらを産生させるためのプロセスに関する。
一部の態様では、本開示は、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質に関する。他の態様では、本開示は、ウイルスカプシドタンパク質の外部表面にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質に関する。一態様では、カプシドおよび／またはＣａｓ９タンパク質は、標識される。同じもしくは異なるウイルスカプシドを有するかまたはウイルスカプシドの内部、外部もしくは両方に結合されているＣａｓ９タンパク質を有する複数の改変カプシドタンパク質を含む組成物も、本明細書で提供される。一態様では、カプシドおよび／またはＣａｓ９タンパク質は、標識される。
ウイルスカプシドタンパク質の表面にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドも、本明細書で開示される。一部の態様では、表面は、ウイルスカプシドタンパク質の外部表面である。一態様では、ポリヌクレオチドは、標識される。他の態様では、表面は、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面である。一態様では、ポリヌクレオチドは、標識される。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物は、モジュール式のインテインベースの集合によってウイルスカプシドタンパク質にコンジュゲートされている。同じもしくは異なるウイルスカプシドをコードするかまたはウイルスカプシドの内部、外部もしくは両方に結合されているＣａｓ９タンパク質をコードする複数のポリヌクレオチドを含む組成物も、本明細書で提供される。
ウイルスカプシドタンパク質の内部表面にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質を調製する方法が、本明細書で提供される。ウイルスカプシドタンパク質の外部表面にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質を調製する方法も、本明細書で提供される。一態様では、方法は、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物をウイルスカプシドタンパク質とカップリングさせることを含む。あるいは、方法は、ウイルス粒子の調製のためのヘルパー機能を提供するシステムにおいて、Ｃａｓ９またはその等価物と１つもしくは複数のウイルスカプシドタンパク質とをコードする組換え融合ポリヌクレオチドを発現させることを含む。一態様では、ウイルス粒子は、システムから単離される。さらなる態様では、標識がシステムの成分に付加される。
改変ウイルスカプシドタンパク質を調製する方法であって、（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物とスプリットインテインのＮ末端断片とを含む融合タンパク質を、（ｉｉ）ウイルスカプシドタンパク質とスプリットインテインのＣ末端断片とを含む融合タンパク質と、モジュール式のインテインベースの集合に適する条件下でカップリングさせることを含む、そのようなことからなる、またはそのようなことから本質的になる方法も、本明細書で提供される。別の態様では、改変ウイルスカプシドタンパク質を調製する方法であって、（ｉ）Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物とスプリットインテインのＣ末端断片とを含む融合タンパク質を、（ｉｉ）ウイルスカプシドタンパク質とスプリットインテインのＮ末端断片とを含む融合タンパク質と、モジュール式のインテインベースの集合に適する条件下でカップリングさせることを含む、そのようなことからなる、またはそのようなことから本質的になる、方法が、本明細書で提供される。一部の態様では、モジュール式のインテインベースの集合は、Ｎ末端スプリットインテイン断片およびＣ末端スプリットインテイン断片の少なくとも一方が高速インテインに由来する、高速インテインシステムを含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一部の態様では、スプリットインテイン断片は、安定性、効率、ライゲーション速度、および／または機能を向上させるように改変される。一部の態様では、モジュール式のインテインベースの集合は、Ｎ末端スプリットインテイン断片およびＣ末端スプリットインテイン断片の少なくとも一方が高速インテインに由来する、高速インテインシステムを含む、それからなる、またはそれから本質的になる。特定の態様では、モジュール式のインテインベースの集合は、Ｎ末端スプリットインテイン断片およびＣ末端スプリットインテイン断片の少なくとも一方がＣｆａインテインに由来する、コンセンサス高速（Ｃｆａ）インテインシステムを含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一態様では、改変カプシドタンパク質の１つまたは複数の成分は、標識される。
ウイルスカプシドタンパク質の表面にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変カプシドタンパク質と、そのカプシド内にカプシド内封入されている（encapsidated）１つもしくは複数のポリヌクレオチドとを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる組換えウイルス粒子が、本明細書で開示される。一部の態様では、表面は、ウイルスカプシドタンパク質の外部表面である。他の態様では、表面は、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面である。特定の態様では、組換えウイルス粒子は、ウイルス粒子１個あたり（および／もしくは改変ウイルスカプシド１個あたり）５つもしくはそれより多くの改変カプシドタンパク質を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか。他の態様では、組換えウイルス粒子は、ウイルス粒子１個あたり（および／もしくは改変ウイルスカプシド１個あたり）１つ〜５つの間の改変カプシドタンパク質を含むか、または代替的にこれらから本質的になる。一態様では、改変カプシドタンパク質の１つまたは複数の成分は、標識される。
ウイルス粒子カプシド表面にＣａｓ９またはその等価物を発現する改変ウイルス粒子の生成のための組換え発現システムであって、（ａ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドであって、この融合タンパク質がＣａｓ９またはその等価物とウイルスカプシドタンパク質とを含む、プラスミドと、（ｂ）ヘルパープラスミドとを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる組換え発現システムが、本明細書でさらに提供される。別の態様では、ウイルス粒子カプシド表面にＣａｓ９またはその等価物を発現する改変ウイルス粒子の生成のための組換え発現システムであって、（ａ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドであって、この融合タンパク質がＣａｓ９もしくはその等価物とスプリットインテインのＮ末端断片とを含む、プラスミドと、（ｂ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドであって、この融合タンパク質が改変ウイルスカプシドタンパク質とスプリットインテインのＣ末端断片とを含む、プラスミドと、（ｃ）ヘルパープラスミドとを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる、システムが、本明細書で開示される。一部の態様では、表面は、ウイルスカプシドタンパク質の外部表面である。他の態様では、表面は、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面である。一態様では、システムの１つまたは複数の成分は、標識される。
遺伝子編集または遺伝子調節の方法であって、方法が、細胞または組織を組換えウイルス粒子と接触させることを含み、このウイルス粒子が、必要に応じて標識されていてもよい、ウイルスカプシドタンパク質の表面にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変カプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれからなるか、またはなおさらにそれからなる、方法も、本明細書で開示される。一部の態様では、表面は、ウイルスカプシドタンパク質の外部表面である。他の態様では、表面は、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面である。一部の態様では、組換えウイルス粒子は、必要に応じて標識されていてもよい、改変ウイルスカプシド内にカプシド内封入されている１つまたは複数のポリヌクレオチドをさらに含む。他の態様では、方法は、細胞または組織を、必要に応じて標識されていてもよい１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む第２のウイルス粒子と接触させることをさらに含む。別の態様では、方法は、必要に応じて標識されていてもよい１つまたは複数のポリヌクレオチドと細胞または組織を接触させることをさらに含む。接触させることは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏでありうる。
本開示は、担体を含み、かつ改変タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、プラスミド、宿主細胞または発現システムのうちの１つまたは複数、および前記改変タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、プラスミド、宿主細胞または発現システムのうちの１つまたは複数についての、互いに同じ形態であってもよくまたは異なる形態であってもよい複数を含む組成物も提供する。改変タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、プラスミド、宿主細胞または発現システムのうちの１つまたは複数、および前記改変タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、プラスミド、宿主細胞または発現システムのうちの１つまたは複数についての、互いに同じかまたは異なる形態であってもよい複数を含み、かつ使用指示書も含むキットをさらに提供する。
それを必要とする対象における遺伝子編集または遺伝子調節の方法であって、方法が、組換えウイルス粒子の有効量を対象に投与することを含み、または代替的にそのようなことから本質的になり、またはなおさらにそのようなことからなり；前記組換えウイルス粒子が、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変カプシドタンパク質と、カプシド内にカプシド内封入されている１つまたは複数のポリヌクレオチドとを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる、方法が、本明細書でさらに開示される。一態様では、ウイルス粒子またはその成分は、標識される。
図１は、ＡＡＶのＶＰ１およびＶＰ３をコードする第１の例示的構築物と、外部Ｃａｓ９発現のためのＶＰ２−Ｃａｓ９融合タンパク質をコードする第２の例示的構築物である、２つの例示的構築物を表す。
図２は、ＡＡＶのＶＰ１およびＶＰ３をコードする第１の例示的構築物と、外部Ｃａｓ９発現のためのＶＰ２−Ｃａｓ９融合タンパク質をコードする第２の例示的構築物と、ウイルスのパッケージングに必要な遺伝子を含むヘルパープラスミドをコードする第３の例示的構築物と、ウイルスを検出するためのレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）をコードする第４の例示的構築物である、４つの例示的構築物を表す。 図２は、ＡＡＶのＶＰ１およびＶＰ３をコードする第１の例示的構築物と、外部Ｃａｓ９発現のためのＶＰ２−Ｃａｓ９融合タンパク質をコードする第２の例示的構築物と、ウイルスのパッケージングに必要な遺伝子を含むヘルパープラスミドをコードする第３の例示的構築物と、ウイルスを検出するためのレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）をコードする第４の例示的構築物である、４つの例示的構築物を表す。
図３は、Ｃａｓ９−ＶＰ２ウイルス調製物の粗細胞溶解物からのＳＹＰＲＯ染色ゲルを表す。このゲルの目的は、大きい１９３ｋＤａ Ｃａｓ９−ＶＰ２融合タンパク質が見えるかどうかを判定することであった。このゲルは、ゲル中のＶＰ１およびＶＰ３タンパク質の存在量を示す。
図４は、様々なプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのウェスタンブロットを表す。第１のレーン（ラダーレーンの後）のプラスミドは、正常ＡＡＶタンパク質（それぞれおおよそ８７、７２および６２ｋＤａである、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を発現するＡＡＶ対照２プラスミドである。レーン２のプラスミドは、おおよそ１２７ｋＤａのＣａｓ９対照タンパク質を発現するＣａｓ９対照プラスミドである。レーン３のプラスミドは、ＶＰ１およびＶＰ３タンパク質のみを発現するＶＰ１−３対照２プラスミドである。レーン４のプラスミドは、正常ＶＰ２タンパク質のみを発現するＶＰ２−対照２プラスミドである。レーン５のプラスミドは、おおよそ１９３ｋＤａのサイズのＣａｓ９−ＶＰ２融合タンパク質のみを発現するＶＰ２−Ｃａｓ９プラスミドである。レーン６のプラスミドは、Ｃａｓ９−ＶＰ２融合タンパク質およびアデノウイルスヘルパータンパク質のみを発現する、ＶＰ２−ｃａｓ９ヘルププラスミドである。レーン７のプラスミドは、Ｃａｓ９−ＶＰ２融合タンパク質ならびにＶＰ１およびＶＰ３タンパク質を発現する、Ｃａｓ９ウイルスである。トランスフェクションの７２時間後に、プロテアーゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ緩衝液中の細胞溶解物を収集した。各溶解物の試料を４〜１２％勾配ゲルで泳動させ、ＯＬＬＡＳタグ付きＣａｓ９タンパク質の検出のために抗ＯＬＬＡＳ抗体を用いて探索した。レーン２は、陽性対照Ｃａｓ９タンパク質の検出を隠した試料に関するタンパク質ローディングアーチファクトを示す。レーン５〜７は、大きいＣａｓ９−ＶＰ２融合タンパク質の予想通りの発現を明確に示す。
図５は、ｒｈ７４−ＡＶＢ対照およびＣａｓ９ウイルスの粗ウイルス調製物のウェスタンブロットを表す。各溶解物の試料を４〜１２％勾配ゲルで泳動させ、ＯＬＬＡＳタグ付きＣａｓ９タンパク質の検出のために抗ＯＬＬＡＳ抗体を用いて探索した。レーン２は、予想より低い分子量のタンパク質を示す。このより低い分子量バンドは、精製中のＣａｓ９−ＶＰ２融合タンパク質のプロテアーゼ分解の結果である可能性があり、または粗溶解物試料からのウェスタンブロットにも見られる、存在量が多いＶＰ３タンパク質と抗ＯＬＬＡＳ抗体の非特異的結合である可能性もある。
図６は、下記に列挙する様々なプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのウェスタンブロットを表す。ラダーの後の第１のレーンにおけるプラスミドは、正常ＡＡＶタンパク質（それぞれおおよそ８７、７２および６２ｋＤａである、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を発現するＡＡＶ対照２プラスミドである。レーン２のプラスミドは、おおよそ１２７ｋＤａのＣａｓ９対照タンパク質を発現するＣａｓ９対照プラスミドである。レーン３のプラスミドは、ＶＰ１およびＶＰ３タンパク質のみを発現するＶＰ１−３対照２プラスミドである。レーン４のプラスミドは、正常ＶＰ２タンパク質のみを発現するＶＰ２−対照２プラスミドである。レーン５のプラスミドは、おおよそ１９３ｋＤａのサイズのＣａｓ９−ＶＰ２融合タンパク質のみを発現するＶＰ２−Ｃａｓ９プラスミドである。レーン６のプラスミドは、Ｃａｓ９−ＶＰ２融合タンパク質およびアデノウイルスヘルパータンパク質のみを発現する、ＶＰ２−ｃａｓ９ヘルププラスミドである。レーン７のプラスミドは、Ｃａｓ９−ＶＰ２融合タンパク質ならびにＶＰ１およびＶＰ３タンパク質を発現する、Ｃａｓ９ウイルスである。トランスフェクションの７２時間後に、プロテアーゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ緩衝液中の細胞溶解物を収集した。各溶解物の試料を４〜１２％勾配ゲルで泳動させ、ＡＡＶタンパク質の検出のために抗ＡＡＶ抗体を用いて探索した。レーン２は、試料に関するタンパク質ローディングアーチファクトを示す。レーン３は、最も存在量が多いＶＰ３タンパク質の予想通りの発現を示す。陽性対照試料（レーン１）におけるウイルスタンパク質およびレーン４〜７におけるウイルスタンパク質は、この画像で検出するのに十分な存在量がなかった。
図７は、抗ＡＡＶ抗体（Ｂ１）を用いて探索したｒｈ７４−ＡＶＢ対照およびＣａｓ９ウイルスの粗ウイルス調製物のウェスタンブロットを表す。各溶解物の試料を４〜１２％勾配ゲルで泳動させ、ＡＡＶタンパク質の検出のために抗ＡＡＶ抗体を用いて探索した。レーン１は、対照ＡＡＶｒｈ７４ウイルスの精製調製物からの適正なサイズのウイルスタンパク質を示す。レーン２は、より低い分子量のタンパク質を示す。このより低い分子量バンドは、泳動に影響を与えた粗ウイルス調製物中の残留塩またはタンパク質による影響を受ける、最も存在量が多いＶＰ３タンパク質である可能性が高い。
図８は、プールおよび濃縮前の、精製後のクロマトグラフィー画分のアリコートを示す。試料は、アクリルアミドゲルで泳動され、ＳＹＰＲＯ染色で可視化される。ウイルス画分が薄すぎてＣａｓ９−ＶＰ２融合タンパク質（１９３ｋＤａ）を可視化することができず、ＶＰ１（８７ｋＤａ）およびＶＰ３（６２ｋＤａ）タンパク質のみが見える。
図９は、Ｕ６プロモーターの制御下のガイドＲＮＡをコードする例示的構築物を表す。構築物は、ｐＡＶ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ−ｕＤｙｓである。
図１０は、粗ウイルス調製物のウェスタンブロットを表す。ＶＰ０２５は、標準的プロトコールによって精製したウイルスのより大きい調製物である。ＳＡＬ Ｃａｓ９は、細胞を７２時間後に溶解し、次いで、細胞内から培地への放出前にウイルスを精製するために標準的プロトコールにより精製した、より小さいウイルス調製物であった。ＯＬＬＡＳタグは、産生または精製中にプロテアーゼ切断により形成される可能性が高いより低い分子量のタンパク質の存在を示す、特異的ＯＬＬＡＳタグ配列を含有する検出専用タンパク質である。少量の完全長Ｃａｓ９−ＶＰ２タンパク質が、かすかに見える。Ｃａｓ９融合タンパク質は、１９３ｋＤａであり、単独でのＣａｓ９は、１２７ｋＤａである。
図１１は、粗ウイルス調製物のウェスタンブロットを表す。ＶＰ０２５は、標準的プロトコールによって精製したウイルスのより大きい調製物である。ＳＡＬ Ｃａｓ９は、細胞を７２時間後に溶解し、次いで、細胞内から培地への放出前にウイルスを精製するために標準的プロトコールにより精製した、より小さいウイルス調製物であった。Ｂ１抗体は、ＡＡＶ特異的カプシドタンパク質を検出する。ＡＡＶｒｈ７４対照ウイルスレーンは、３つすべてのウイルスカプシドタンパク質の存在を示すが、ＶＰ０２５およびＳＡＬ Ｃａｓ９レーンは、単独のＶＰ３およびＶＰ１の存在のみを、６０〜８０ｋＤａの間のより低い分子量の多少の分解タンパク質とともに示す。
図１２Ａ〜１２Ｂは、ＡＡＶ８の結晶構造を表す。図１２Ａは、１２個のカプシド単量体（様々な色調の灰色）の内部側面図を表示する。５つの挿入部位が、各単量体上に白色矢印で特定されている。図１２Ｂは、カプシド単量体（様々な色調の灰色）の上面図を表示する。５つの挿入部位が、各単量体上に白色矢印で特定されている。
この図１３Ａ〜１３Ｂは、ｓａＣａｓ９およびＶＰ２の例示的スプリットインテイン融合体を表す。図１３Ａは、ｓａＣａｓ９−Ｃｆａインテインタンパク質マップを表す。シグナルペプチド（ＳＰ）、ｓａＣａｓ９、ＣｆａＮインテインが示されている。図１３Ｂは、ＶＰ２−Ｃｆａインテインタンパク質マップを表す。ＣｆａＣおよびＶＰ２が示されている。
図１４は、Ｃａｓ９タンパク質と粒子の外部表面のインテイン媒介ライゲーションの流れ図を表す。
図１５Ａ〜１５Ｂは、Ｃａｓ９−ＶＰ２切断産物を表す。図１５Ａ：列挙されている様々なプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の溶解物を４〜１２％勾配ゲルで泳動させ、抗ＡＡＶ抗体（Ｂ１）を用いて探索した。図１５Ｂ：列挙されている様々なプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の溶解物を４〜１２％勾配ゲルで泳動させ、ＯＬＬＡＳタグ付きＣａｓ９タンパク質の検出のために抗ＯＬＬＡＳ抗体を用いて探索した。
図１６Ａ〜１６Ｂは、タンパク質およびウェスタンゲルを表す。図１６Ａ：精製ウイルスのＳｙｐｒｏ染色タンパク質ゲル。ＡＡＶｒｈ７４は、対照ウイルスである；ＶＰ２−ＣｆａＣ、ＶＰ２とのインテインリンカー融合体；ＶＰ２−２２８、２２８位でＶＰ２の内部に向いている領域と融合されたＯＬＬＡＳリンカー。図１６Ｂ：抗ＡＡＶ抗体を用いて探索したウェスタン（レーン２〜４）、および抗ＯＬＬＡＳタグ抗体を用いて探索したウェスタン（レーン６〜８）。
図１７Ａ〜１７Ｂは、構築物の模式図である。図１７Ａは、ＧｅｏＣａｓ９−ＣｆａＮの模式図である。図１７Ｂは、ＣｆａＣ−ＶＰ２構築物の模式図である。スプリットインテインのトランススプライシングが、ＧｅｏＣａｓ９−ＶＰ２の集合を可能にする。
図１８は、インテインスプライシングおよびタンパク質ライゲーションの図である。スプリットインテインのトランススプライシングが、インテイン断片の集合後に起こる。
詳細な説明
本開示による実施形態は、本明細書の下文にてより詳細に説明されることになる。しかし、本開示の態様を異なる形態で実施することができるので、本明細書に示す実施形態に限定されるとみなすべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が行き届いた、完全なものになるように、また本発明の範囲を当業者に十分に知らせるために、提供される。本明細書での説明に使用される専門用語は、特定の実施形態の説明を目的にしたものに過ぎず、限定となるように意図されたものではない。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。一般に使用される辞書で定義されているものなどの用語は、本願および関連技術の文脈でのそれらの意味と一致する意味を有すると解釈すべきであり、理想化された意味にも、過度に形式的な意味にも、本明細書で明示的にそのように定義されない限り、解釈すべきでないことは、さらに理解されるであろう。下記で明確に定義されない限り、そのような用語をそれらの一般的な意味に従って解釈すべきである。
本明細書での説明に使用される専門用語は、特定の実施形態の説明を目的にしたものに過ぎず、本発明の限定となるように意図されたものではない。本明細書において言及するすべての公表文献、特許出願、特許および他の参考文献は、それら全体が参照により組み入れられる。
別段の指示がない限り、本技術の実施は、当技術分野の技能の範囲内である組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の手法を利用することになる。
文脈による別段の指示がない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴を任意の組合せで使用することができることが、特に意図されている。さらに、本開示は、一部の実施形態では、本明細書に示す任意の特徴または特徴の組合せが除外または割愛される場合があることも、企図している。例を挙げて説明すると、本明細書により、複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと述べられている場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか、またはこれらの組合せが、単独でまたは任意の組合せで割愛および放棄される場合あることが、特に意図されている。
別段の明確な指示がない限り、すべての明記される実施形態、特徴および用語は、述べられている実施形態、特徴または用語とそれらの生物学的等価物の両方を含むように意図されている。
範囲を含む、すべての数字表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、適宜、１．０もしくは０．１ずつ、または代替的に＋／−１５％、もしくは代替的に１０％、もしくは代替的に５％、もしくは代替的に２％の変動で、（＋）または（−）に変化する近似値である。必ずしも明確に述べられていなかったとしても、すべての数字表示に用語「約」が先行することを理解されたい。必ずしも明確に述べられていなかったとしても、本明細書に記載される試薬が単に例示的なものであること、およびそのような試薬の等価物が当技術分野において公知であることも、理解されたい。
本開示を通して、様々な公表文献、特許および公開特許明細書が、識別引用情報により、またはアラビア数字により言及される。アラビア数字により識別される公表文献についての詳細な引用情報は、本特許請求の範囲の直前にある。これらの公表文献、特許および公開特許明細書の開示は、本発明が関係する技術分野の現状をより十分に説明するために、本明細書によってそれら全体が参照により本開示に組み入れられている。
定義
別段の指示がない限り、本技術の実施は、当技術分野の技能の範囲内である有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の手法を利用することになる。例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版（１９８９年）；Current Protocols In Molecular Biology（F. M. Ausubelら編（１９８７年））；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson、B.D. HamesおよびG.R. Taylor編（１９９５年））、HarlowおよびLane編（１９８８年）Antibodies, a Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney編（１９８７年））を参照されたい。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈による別段の明白な指示がない限り、複数形も含むように意図されている。
本明細書で使用される場合、用語「含む（comprising）」は、組成物および方法が述べられている要素を含む（include）が、他のものを除外しないことを意味するように意図されている。本明細書で使用される場合、から本質的になる（および文法上の異表記）という移行句は、述べられている物質またはステップと、述べられている実施形態の基本的および新規の特徴に実質的な影響を与えないものとを包含すると解釈されたい。したがって、本明細書で使用される場合の用語「から本質的になる」を、「含む」と同意義のものと解釈すべきでない。「からなる」は、本明細書で開示される組成物を投与するための他の成分の微量元素および実質的な方法ステップ以外のものを除外することを意味するものとする。これらの移行語の各々によって定義される態様は、本開示の範囲内である。
用語「約」は、量または濃度およびこれらに類するものなどの測定可能な値に言及する際に本明細書で使用される場合、明記されている量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を包含するように意図されている。
用語「許容される」、「有効な」、または「十分な」は、本明細書で開示される任意の成分、範囲、剤形などの選択を記述するために使用される際、前記成分、範囲、剤形などが、開示される目的に適していることを意図するものである。
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、付随する列挙されている用語の１つまたは複数についての任意のおよびすべての可能な組合せ、ならびに代替選択的に（「または」で）解釈される際には組合せの欠如も指し、包含する。
本明細書で使用される場合の用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、この名称を伴い、ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に属する、ウイルスのクラスのメンバーを指す。このウイルスの複数の血清型が遺伝子送達に適していることは公知であり、すべての公知の血清型が様々な組織型からの細胞に感染しうる。少なくとも１１の連番のＡＡＶ血清型が当技術分野において公知である。本明細書で開示される方法において有用な非限定的な例示的血清型としては、１１の血清型のいずれか、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、または変異血清型、例えばＡＡＶ−ＤＪが挙げられる。ＡＡＶ粒子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３という３つの主要ウイルスタンパク質を含む。
用語「Ｃａｓ９」は、この名称で呼ばれるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９の非限定的な例は、本明細書で提供され、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｇ３ＥＣＲ１（ＣＡＳ９＿ＳＴＲＴＲ）で提供されるＣａｓ９、または本明細書に記載されるタンパク質配列、例えば配列番号３、によりコードされるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、ならびにタンパク質配列の配列番号４０によりコードされるヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９、これらの各々のオルソログおよび生物学的等価物である。オルソログとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（「ｓｐＣａｓ９」）、例えば、配列番号１８；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａからのＣａｓ９；ならびにＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２を含む、様々な細菌種からのＣｐｆ１（配列番号１９）（これはＣａｓ９に類似の切断機能を果たす）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合の用語「細胞」は、必要に応じて対照または市販の供給元から得られる、真核細胞または原核細胞のどちらかを指すことができる。一部の実施形態では、細胞は、単離された細胞である。
「真核細胞」は、モネラ界を除く生命界のすべてを含む。膜結合核によってそれらを容易に区別することができる。動物、植物、真菌および原生生物は、真核生物、または細胞が細胞内膜および細胞骨格により複雑な構造に組織化されている生物である。最も特徴的な膜結合構造が核である。特に記述がない限り、用語「宿主」は、例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む、真核生物宿主を含む。真核細胞または宿主の非限定的な例としては、サル、ウシ、ブタ、ネズミ科動物、ラット、トリ、爬虫類およびヒト、例えば、ＨＥＫ２９３細胞および２９３Ｔ細胞が挙げられる。
「原核細胞」は、核または一切の他の膜結合細胞小器官を通常は欠いており、細菌および古細菌という２つの分野に分けられる。染色体ＤＮＡに加えて、これらの細胞は、エピソーム（on episome）と呼ばれる環状ループ内にも遺伝情報を含有することができる。細菌細胞は、非常に小さく、大体、動物のミトコンドリアのサイズ（直径約１〜２μｍおよび長さ１０μｍ）である。原核細胞は、桿形、球形およびらせん形という３つの主要形状を特徴とする。真核生物のような精緻な複製過程を経るのではなく、細菌細胞は、二分裂により分裂する。例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細菌、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、クラスター化して規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返しの経路に依存する配列特異的遺伝子操作手法を指す。ＣＲＩＳＰＲは、遺伝子編集および／または遺伝子調節を行うために使用することができ、タンパク質を特定の遺伝子位置に単に標的化するために使用することもできる。遺伝子編集は、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がそのポリヌクレオチド配列への欠失、挿入または塩基置換の導入によって変更されるタイプの遺伝子操作を指す。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路または相同組換え経路を利用して編集を行う。遺伝子調節は、タンパク質またはＲＮＡなどの特定の遺伝子産物の産生を増加させることまたは減少させることを指す。
本明細書で使用される場合の用語「ｇＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」は、特定の遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ手法を利用する修正の標的とするために使用される、ガイドＲＮＡ配列を指す。標的特異性のためのｇＲＮＡおよびドナー治療用ポリヌクレオチドを設計する手法は、当技術分野で周知である。例えば、Doench, J.ら、Nature biotechnology ２０１４年；３２巻（１２号）：１２６２〜７頁、Mohr, S.ら、（２０１６年）FEBS Journal ２８３巻：３２３２〜３８頁、およびGraham, D.ら、Genome Biol.２０１５年；１６巻：２６０頁。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む融合ポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むポリヌクレオチドを含むか、または代替的にこれらから本質的なるか、またはなおさらにこれらからなる。一部の態様では、ｇＲＮＡは、合成のものである（Kelley, M.ら（２０１６年）J of Biotechnology ２３３巻（２０１６年）７４〜８３頁）。本明細書で使用される場合、ｇＲＮＡの生物学的等価物は、Ｃａｓ９またはその等価物を細胞のゲノムの特定の領域などの特定のヌクレオチド配列に誘導することができる、ポリヌクレオチドまたは標的化分子を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、生物学的等価物は、スペーサー配列を含む。
本明細書で使用される場合の用語「修復鋳型」は、標的配列内の修復が望まれる配列を含むポリヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、修復機構は、相同組換え修復である。一部の実施形態では、修復鋳型は、所望の編集はもちろん、標的の直ぐ上流および下流に追加の相同配列（左および右相同アームと呼ばれる）も含む。一部の実施形態では各相同アームの長さは、導入される変化のサイズに依存し、挿入物が大きいほど長い相同アームが必要とされる。一部の実施形態では、修復鋳型は、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、または二本鎖ＤＮＡプラスミドである。修復鋳型を設計する方法は、当技術分野において公知である（例えば、参照により本明細書に組み入れられるPaquet, D.ら、Nature.２０１６年５月５日；５３３巻（７６０１号）：１２５〜９頁を参照されたい）。一部の実施形態では、修復鋳型は、修復鋳型がＣａｓ９切断の適する標的にならないようにするために、ゲノムＤＮＡ内に存在するＰＡＭ配列を含まない。
核酸配列に適用される場合の用語「コードする」は、そのネイティブ状態で、または当業者に周知の方法により操作されたときに、転写および／または翻訳されてポリペプチドおよび／またはその断片のためのｍＲＮＡを産生することができる場合、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の補体であり、コード配列をそれから推定することができる。
用語「等価物」または「生物学的等価物」は、特定の分子、生体物質または細胞物質を指す場合、同義で使用され、ほとんど相同性を有さないが所望の構造または機能性をなお維持するものを意図している。等価のポリペプチドの非限定的な例としては、それに対してもしくはポリペプチド配列に対して少なくとも６０％、もしくは代替的に少なくとも６５％、もしくは代替的に少なくとも７０％、もしくは代替的に少なくとも７５％、もしくは代替的に少なくとも８０％、もしくは代替的に少なくとも８５％、もしくは代替的に少なくとも９０％、もしくは代替的に少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド、またはそのようなポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドもしくはその補体によりコードされているポリペプチドが挙げられる。高ストリンジェンシー条件は、本明細書に記載され、参照により本明細書に組み入れられる。あるいは、その等価物は、参照ポリヌクレオチド、例えば野生型ポリヌクレオチド、に対して、少なくとも７０％、もしくは代替的に少なくとも７５％、もしくは代替的に８０％、もしくは代替的に少なくとも８５％、もしくは代替的に少なくとも９０％、もしくは代替的に少なくとも９５％の同一性、もしくは代替的に少なくとも９７％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはその補体によりコードされているポリペプチドである。
等価のポリペプチドの非限定的な例としては、参照ポリヌクレオチドと少なくとも６０％、もしくは代替的に少なくとも６５％、もしくは代替的に少なくとも７０％、もしくは代替的に少なくとも７５％、もしくは代替的に少なくとも８０％、もしくは代替的に少なくとも８５％、もしくは代替的に少なくとも９０％、もしくは代替的に少なくとも９５％、もしくは代替的に少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。等価物は、参照ポリヌクレオチドと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその補体も意図している。
本明細書で使用される場合、用語「機能性（の）」は、特定の明記される効果を遂行することを意図して、任意の分子、生体物質または細胞物質を改変するために使用されうる。
別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）は、アラインメントしたときに、２配列を比較して塩基（またはアミノ酸）のパーセンテージが、それと同じものであることを意味する。アラインメント、および相同性または配列同一性パーセントは、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubelら編、１９８７年）補遺３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載されているものを使用して、決定することができる。ある特定の実施形態では、デフォルトパラメーターがアラインメントに使用される。非限定的な例示的アラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、例示的プログラムとしては、次のデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰが挙げられる：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示＝５０配列；ソート順＝ハイスコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレスで見出すことができる：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。配列同一性、および同一性パーセントは、それらをｃｌｕｓｔａｌＷ（ウェブアドレス：ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可能、最終アクセス２０１７年１月１３日）に組み込むことによって決定することができる。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２ペプチド間または２核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較を目的としてアラインメントされうる各配列内の位置を比較することにより決定することができる。比較配列内の位置が、同じ塩基またはアミノ酸により占有されている場合には、それらの分子は、その位置で相同である。配列間の相同度は、それらの配列により共有される一致または相同位置の数の関数である。「無関係」または「非相同」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、または代替的に２５％未満の同一性を共有する。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２核酸分子を指す場合もある。
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化されている複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合により起こることもあり、フーグスティーン結合により起こることもあり、または任意の他の配列特異的様式で起こることもある。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖を含むこともあり、多鎖複合体を形成する３本もしくはそれより多くの鎖を含むこともあり、自己ハイブリダイズする単一の鎖を含むこともあり、またはこれらの任意の組合せを含むこともある。ハイブリダイゼーション反応は、より大規模なプロセスのステップ、例えば、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断を構成することもある。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ〜約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中等度ハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、約０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、１ステップ、２ステップまたはそれより多くの洗浄ステップを伴う、５分〜２４時間であり、洗浄インキュベーション時間は、約１、２または１５分である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である。他の緩衝系を使用するＳＳＣの等価物を利用することができることは理解される。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
「インテイン」は、自体を切り出して残存部分（「エクステイン」）をペプチド結合で連結することができる、タンパク質またはポリペプチドのセグメントである。一部の実施形態では、インテイン切り出し／スプライシング過程は、前駆タンパク質のインテイン部分の最初の残基（セリン、トレオニンまたはシステイン）の側鎖が、直ぐ上流の残基（すなわち、Ｎ−エクステインの最後の残基）のペプチド結合を求核攻撃すると、Ｎ−ＯまたはＮ−Ｓシフトに伴って開始して、直鎖状エステルまたはチオエステル中間体を形成する。一部の実施形態では、Ｃ−エクステインの最初の残基の側鎖が、新たに形成されたエステルまたはチオエステルを攻撃するとトランスエステル化が起こって、インテインのＮ末端を遊離される。一部の実施形態では、これは、分岐中間体を形成し、そのＮ−エクステインおよびＣ−エクステインが攻撃される。一部の実施形態では、インテインの最後の残基は、アスパラギンであり、この側鎖のアミド窒素原子は、インテインとＣ−エクステイン間のペプチド結合を切断して離し、その結果、末端環状イミドを有する遊離インテインセグメントが生じる。最後に、一部の実施形態では、Ｃ−エクステインの遊離アミノ基が、Ｎ−エクステインとＣ−エクステインを互いに連結しているエステルまたはチオエステルを攻撃する。したがって、一部の実施形態では、Ｏ−ＮまたはＳ−Ｎシフトにより、ペプチド結合および機能性のライゲーションされたタンパク質が生成される。
本明細書で使用される場合、「インテインシステム」は、介在インテインタンパク質ドメインが、自体を宿主タンパク質から痕跡を残さないように切り出し、その結果、隣接ポリペプチド配列（エクステインと呼ばれる）が正常ペプチド結合によって互いにライゲーションされる、インテインベースのタンパク質スプライシング機構を含む、システムを指す。本明細書で使用される場合、「モジュール式のインテインベースのライゲーション」、「モジュール式のインテインベースの集合」、および「スプリットインテイン」は、インテインが、Ｎ末端断片とＣ末端断片である２つの断片に分割され、各断片が、エクステイン、例えば、Ｃａｓ９またはウイルスカプシドタンパク質に融合される、インテインシステムを指すために、同義で使用される。適切な条件下で、スプリットインテイン−エクステイン融合体は、共発現されるかまたは互いに混合され、インテインライゲーション反応が触媒され、その結果、２個のエクステインの融合、およびスプリットインテイン断片の切り出しが生じる。
本明細書で使用される場合、「高速インテイン」システムは、高速の速度のタンパク質トランススプライシングが可能なインテインシステムである（参照により本明細書に組み入れられるNeel, S.ら、Journal of the American Chemical Society（２０１２年）、１３４巻（２８号）、１１３３８〜１１３４１頁）。例えば、高速の速度は、３０℃で約ｔ１／２＜５秒、３０℃で約ｔ１／２＜１０秒、３０℃で約ｔ１／２＜２０秒、３０℃で約ｔ１／２＜５０秒、３０℃で約ｔ１／２＜１００秒、３０℃で約ｔ１／２＜２００秒、３０℃で約ｔ１／２＜３００秒、３０℃で約ｔ１／２＜４００秒、３０℃で約ｔ１／２＜５００秒、３０℃で約ｔ１／２＜６００秒、３０℃で約ｔ１／２＜７００秒、３０℃で約ｔ１／２＜８００秒、３０℃で約ｔ１／２＜９００秒、３０℃で約ｔ１／２＜１０００秒の速度である。特定の実施形態では、高速の速度は、３０℃で約ｔ１／２＜４００秒である。高速インテインシステムは、コンセンサス高速インテインシステム、および１つまたは複数の促進剤残基を含むシステムを含むが、これらに限定されない。促進剤残基の非限定的な例としては、配列番号６０のＫ７０、Ｍ７５およびＭ８１が挙げられる（Stevens, A.ら、J. Am. Chem. Soc.、２０１６年、１３８巻（７号）、２１６２〜２１６５頁）。例示的高速インテインとしては、コンセンサス高速インテイン（Ｃｆａ）（配列番号６０）、Ｎｐｕ、Ａｖａ、およびＭｃｈｔが挙げられるが、これらに限定されない。インテインの例示的Ｎ末端断片は、ＣｆａＮ（配列番号６０のアミノ酸残基１〜１０１）である。インテインの例示的Ｃ末端断片は、ＣｆａＣ（配列番号６０のアミノ酸残基１０２〜１３６）である。一実施形態では、光ケージされたシステインアミノ酸残基で高速インテインをさらに改変して、その結果、光活性化可能であるインテインライゲーション反応を生じさせることができる（Ren, W.ら、J Am Chem Soc.２０１５年２月１８日；１３７巻（６号）：２１５５〜８頁）。
用語「コンセンサス高速」および「コンセンサス高速集合」（Ｃｆａ）は、Stevensら、J Am Chem Soc.２０１６年２月２４日；１３８巻（７号）：２１６２〜２１６５頁（参照により本明細書に組み入れられる）のコンセンサス設計アプローチを利用する高速インテインタンパク質集合システムを指す。このアプローチは、他のスプリットタンパク質集合システムと比較して増強された安定性および活性を有する頑強なシステムをもたらす。バッチ突然変異誘発を使用して、Ｓｔｅｖｅｎｓらは、ＤｎａＥファミリーのＮｐｕ（高速）スプリットインテインとＳｓｐ（低速）スプリットインテイン間のスプライシング速度の差の詳細な分析を行い、最も影響力の強い残基が、活性部位に直接隣接するタンパク質の第２の殻上に存することを見いだした。次いで、これらの残基を使用して、高速であると予想される７３の天然に存在するＤｎａＥインテインのアラインメントを生成した。このアラインメントからのコンセンサス配列は、迅速なタンパク質スプライシングも、かつてない熱およびカオトロピック安定性も、明示する。例えば、Ｃｆａインテインは、８０℃以下の温度で、かつ刺激の強い化学物質の存在下で、迅速なライゲーションを触媒することができる。さらに、抗体重鎖を含む様々なタンパク質に融合されたとき、ＣｆａのＮ末端断片は、他のＮ−インテイン融合体と比べて発現レベル上昇を示す。Ｃｆａは、培養培地中のコトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの２つの分泌タンパク質をライゲーションするためにも使用されている。よりネイティブな細菌発現システム、例えばＣｆａシステムにおいてＣａｓ９タンパク質を産生させることにより、プロテアーゼ分解リスクを低下させつつ大量の精製タンパク質を生成することができる。
本明細書で使用される場合の用語「単離された」は、他の物質が実質的にない、分子または生体物質または細胞物質を指す。
本明細書で使用される場合、用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのどちらかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために同義で使用される。したがって、この用語は、一本鎖、二鎖もしくは多鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に改変された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合の用語「プロモーター」は、遺伝子などの、コード配列の発現を調節する任意の配列を指す。プロモーターは、例えば、構成的であってもよく、誘導性であってもよく、抑止性であってもよく、または組織特異的であってもよい。「プロモーター」は、転写の開始および速度を制御するポリヌクレオチド配列の領域である、制御配列である。プロモーターは、調節タンパク質および分子が結合しうる遺伝要素、例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子を含有しうる。非限定的な例示的プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター（例えば、配列番号４１、配列番号７の番号１４０〜７７４が付与された塩基対、またはそれらの各々の等価物）およびＵ６プロモーター（例えば、配列番号４２、配列番号８の番号４４０４〜４３９５が付与された塩基対、またはそれらの各々の等価物）が挙げられる。ある特定の標的特異性を有する、さらなる非限定的な例示的プロモーターは、本明細書において下記で提供され、これらに限定されないが、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０（例えば、配列番号７の番号３４３４〜３７０２が付与された塩基対）、ＰＧＫ１（ヒトまたはマウス）、Ｐ５（例えば、配列番号５の番号１０７４９〜１０８２８が付与された塩基対）、Ｕｂｃ、ヒトベータアクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、ＵＡＳ、Ａｃ５、ポリヘドリン、ＣａＭＫＩＩａ、Ｇａｌ１、１０、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｈ１、Ｕ６、およびアルファ１アンチトリプシンを含む。系統的に誘導されたプロモーターを、遍在的発現に使用してもよく、または組織特異的発現に使用してもよい。さらに、ウイルス由来プロモーターであって、これらの一部が上で述べられているプロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＨＩＶ、アデノウイルス、およびＡＡＶプロモーターは、本明細書で開示される方法において有用でありうる。
用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、アミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣物の２つまたはそれより多くのサブユニットの化合物を指すために、同義で、およびそれらの最も広い意味で使用される。サブユニットは、ペプチド結合により連結されうる。別の態様では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどにより連結されうる。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質配列またはペプチド配列を構成しうるアミノ酸の最大数に課される制限がない。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤ光学異性体とＬ光学異性体両方、アミノ酸類似体およびペプチド模倣物を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」は、ポリペプチド、タンパク質またはペプチドの２つまたはそれより多くの機能性ドメインまたはドメイン断片を結合する部分構造を指す。キメラ融合タンパク質の文脈でのリンカーは、２つまたはそれより多くの明確に異なるタンパク質に由来する２つまたはそれより多くのポリペプチドを結合するように機能する。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸から構成される（すなわち、「ペプチドリンカー」である）。一部の実施形態では、リンカーは、成分ポリペプチド、タンパク質またはペプチドの協調的ドメイン間相互作用を維持するようにおよび／または生物学的活性を防止するように機能する。リンカーの非限定的な例は、本明細書で提供され、またChen, X.ら、Adv Drug Deliv Rev.２０１３年１０月１５日；６５巻（１０号）：１３５７〜１３６９頁（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。一部の実施形態では、リンカーは、ポリヌクレオチドによりコードされている。
本明細書で使用される場合、用語「組換え発現システム」は、組換えにより形成されるある特定の遺伝物質の発現の遺伝子構築物（単数または複数）を指す。
「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞に運ぶことができる任意の分子と定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、ミセル；天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；ならびに当技術分野において典型的に使用される細菌、またはウイルス、例えばバキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターおよび他の組換えビヒクルであり、これらは、様々な真核生物および原核生物宿主における発現について記載されており、ならびに単純なタンパク質発現のみならず遺伝子治療にも使用されうる。
本明細書で開示されるポリヌクレオチドを、遺伝子送達ビヒクルを使用して細胞または組織に送達することができる。本明細書で使用される場合の「遺伝子送達」、「遺伝子移入」、「形質導入すること」およびこれらに類するものは、導入に使用される方法に関係なく宿主細胞への外因性ポリヌクレオチド（「導入遺伝子」と呼ばれることもある）の導入を指す用語である。そのような方法は、様々な周知の手法、例えば、ベクター媒介遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または様々な他のタンパク質ベースのもしくは脂質ベースの遺伝子送達複合体による）、ならびに「裸の」ポリヌクレオチドの送達を助長する手法（例えば、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入に使用される様々な他の手法）を含む。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において、安定的に維持されることもあり、または一過的に維持されることもある。安定的維持には、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞に適合する複製起点を含有すること、あるいは宿主細胞のレプリコン、例えば染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）または核もしくはミトコンドリア染色体に組み込まれること、どちらかが、通常は必要である。それ自体が当技術分野において公知あり、本明細書に記載される、哺乳動物細胞への遺伝子の移入を媒介することができる多数のベクターが公知である。
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは無関係に複製することができる、染色体ＤＮＡとは別の染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合、プラスミドは、環状または二本鎖状である。プラスミドは、微生物の集団内の遺伝子水平伝播機構をもたらし、通常は、所与の環境の状況下で選択優位性をもたらす。プラスミドは、競合的な環境的ニッチに天然に存在する抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子を有することができ、または代替的に、産生されるタンパク質が、同様の状況下で毒素として作用することができる。
遺伝子工学で使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と呼ばれる。多くのプラスミドが、そのような使用のために市販されている。複製されることになる遺伝子は、細胞を特定の抗生物質に対して耐性にさせる遺伝子と、多重クローニング部位（ＭＣＳ、またはポリリンカー）とを含有する、プラスミドのコピーに挿入され、前記多重クローニング部位は、この位置へのＤＮＡ断片の容易な挿入を可能にするいくつかの一般に使用される制限部位を含有する、短い領域である。プラスミドのもう１つの主要な使用は、大量のタンパク質を作製するための使用である。この場合、研究者は、目的の遺伝子を内部に持つプラスミドを含有する細菌を増殖させる。細菌がその抗生物質耐性を付与するためのタンパク質を産生するのと全く同じように、挿入された遺伝子からの大量のタンパク質の産生を誘導することもできる。
「酵母人工染色体」または「ＹＡＣ」は、大きいＤＮＡ断片（１００ｋｂより大きく、かつ３０００ｋｂ以下）をクローニングするために使用されるベクターを指す。これは、人工的に構築された染色体であり、酵母細胞内での複製および保存に必要なテロメア、セントロメアおよび複製起点配列を含有する。初期環状プラスミドを使用して構築されると、それらは、制限酵素を使用することにより直線化され、そしてその後、ＤＮＡリガーゼが、付着末端の使用によりその直鎖状分子内に目的の配列または遺伝子を付加させることができる。酵母発現ベクター、例えば、ＹＡＣ、ＹＩｐ（酵母組込型プラスミド）およびＹＥｐ（酵母エピソームプラスミド）は、酵母自体が真核細胞であるので翻訳後修飾を有する真核生物タンパク質産物を得ることができるので極めて有用であるが、ＹＡＣは、ＢＡＣより不安定であり、キメラ効果を生じさせることが判明している。
「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで宿主細胞に送達されることになるポリヌクレオチドを含む、組換えにより産生されたウイルスまたはウイルス粒子と定義される。
ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターおよびこれらに類するものが挙げられる。感染性タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ベースのベクターは、タンパク質を製造するために使用することができ、タバコ葉においてグリフィスシンを発現することが報告されている（O'Keefeら（２００９年）Proc. Nat. Acad. Sci. USA １０６巻（１５号）：６０９９〜６１０４頁）。アルファウイルスベクター、例えば、セムリキ森林ウイルスベースのベクターおよびシンドビスウイルスベースのベクターも、遺伝子療法および免疫療法における使用のために開発されている。SchlesingerおよびDubensky（１９９９年）Curr. Opin. Biotechnol.５巻：４３４〜４３９頁、およびYingら（１９９９年）Nat. Med.５巻（７号）：８２３〜８２７頁を参照されたい。遺伝子移入がレトロウイルスベクターにより媒介される態様では、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノムまたはその一部と治療用遺伝子とを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子移入における使用のためベクターの現代的方法に関するさらなる詳細は、例えば、Kottermanら（２０１５年）Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook Annual Review of Biomedical Engineering 17において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス媒介遺伝子移入」または「レトロウイルス形質導入」は、同じ意味を有するものであり、細胞に侵入してそのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むウイルスによって遺伝子または核酸配列が宿主細胞に安定的に移入される過程を指す。ウイルスは、その通常の感染機構によって宿主細胞に侵入することができ、またはウイルスを異なる宿主細胞表面受容体もしくはリガンドと結合して細胞に侵入するように、改変することができる。本明細書で使用される場合、レトロウイルスベクターは、ウイルスおよびウイルス様侵入機構によって細胞に外因性核酸を導入することができるウイルス粒子を指す。
レトロウイルスは、それらの遺伝情報をＲＮＡの形態で有するが、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡは、ＤＮＡ形態に逆転写され、これが感染細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＤＮＡ形態は、プロウイルスと呼ばれる。
遺伝子移入が、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのＤＮＡウイルスベクターにより媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその一部と導入遺伝子とを含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、５０を超える血清型を含む、比較的よく特徴付けられている均一なウイルス群である。Ａｄは、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。組換えＡｄ由来ベクター、特に、野生型ウイルスの組換えまたは生成の可能性を低下させるものも、構築されている。そのようなベクターは、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）、およびＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｇｅｎｅ（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）などの供給元から市販されている。野生型ＡＡＶは、宿主細胞のゲノムに組み込む、高い感染性および特異性を有する。WoldおよびToth（２０１３年）Curr. Gene. Ther.１３巻（６号）：４２１〜４３３頁、HermonatおよびMuzyczka（１９８４年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８１巻：６４６６〜６４７０頁、およびLebkowskiら（１９８８年）Mol. Cell. Biol.８巻：３９８８〜３９９６頁を参照されたい。
プロモーターとポリヌクレオチドが作動可能に連結されうるクローニング部位を両方とも含有するベクターは、当技術分野において周知である。そのようなベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することができ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）などの供給元から市販されている。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去して、付加して、または変化させて、転写レベルまたは翻訳レベルのどちらかで発現に干渉しうる余分な、潜在的に不適切な、代替翻訳開始コドンまたは他の配列を除去することが、必要でありうる。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンの直ぐ５’に挿入して、発現を増強することができる。
遺伝子送達ビヒクルは、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセルおよび標的ウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体も含む。標的化抗体またはその断片も含むリポソームを、本明細書で開示される方法において使用することができる。ポリヌクレオチドの細胞または細胞集団への送達に加えて、本明細書に記載されるタンパク質の細胞または細胞集団への直接導入をタンパク質トランスフェクションの非限定的な手法により行うことができ、あるいは本明細書で開示されるタンパク質の発現を増強することおよび／または活性を促進することができる培養条件は、他の非限定的手法である。
本明細書で使用される場合、用語「シグナルペプチド」または「シグナルポリペプチド」は、新たに合成された分泌または膜ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端に通常は存在するアミノ酸配列を意図している。それは、ポリペプチドを特定の細胞内位置に、例えば、細胞膜を横断して、細胞膜内に、または核内に、方向付けるように作用する。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、局在化後に除去される。シグナルペプチドの例は、当技術分野において周知である。非限定的な例は、米国特許第８，８５３，３８１、５，９５８，７３６号および同第８，７９５，９６５号に記載されているものである。
本明細書で使用される場合、用語「ウイルスカプシド」または「カプシド」は、ウイルス粒子のタンパク質性の殻またはコートを指す。カプシドは、ウイルスゲノムをカプシド内封入、保護、輸送および宿主細胞に放出する機能を果たす。カプシドは、一般に、タンパク質（「カプシドタンパク質」）のオリゴマー構造サブユニットから構成される。本明細書で使用される場合、用語「カプシド内封入される／された」は、ウイルスカプシドの中に密閉される／されたことを意味する。
本明細書で使用される場合、ウイルスまたはプラスミドに関しての用語「ヘルパー」は、本明細書で開示される改変ＡＡＶなどの、ウイルス粒子または組換えウイルス粒子の複製およびパッケージングに必要な追加の成分を提供するために使用されるウイルスまたはプラスミドを指す。ヘルパーウイルスによりコードされる成分は、ビリオン集合、カプシド内封入、ゲノム複製および／またはパッケージングに必要とされる任意の遺伝子を含みうる。例えば、ヘルパーウイルスは、ウイルスゲノムの複製に必要な酵素をコードすることができる。ＡＡＶ構築物との使用に適しているヘルパーウイルスおよびプラスミドの非限定的な例としては、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）、またはヘルペスウイルス（ウイルス）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、ウイルスカプシドタンパク質に関しての用語「外部」は、集合したウイルスカプシドにおける外部に向いているカプシドタンパク質の表面、ドメイン、領域または末端部を指す。当業者には公知であるように、「ウイルスカプシドタンパク質」は、ウイルスのタンパク質殻である。「改変」カプシドタンパク質は、野生型配列から変更されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。ウイルスカプシドタンパク質に関しての用語「内部」は、集合したウイルスカプシドにおける内部に向いているカプシドタンパク質の表面、ドメイン、領域または末端部（アミノ末端部もしくはカルボキシ末端）を指す。集合したウイルスカプシドに関して使用される場合、用語「内部」は、ウイルスカプシド内のカプシド内封入空間、およびその密閉空間に露出しているカプシドの内向きの表面を指す。内部空間は、ウイルスカプシドタンパク質によりカプシド内封入されており、核酸、例えばウイルスゲノム、ウイルスタンパク質、宿主またはパッケージング細胞のタンパク質、ならびに複製、ビリオン集合、カプシド内封入および／またはパッケージング中にパッケージングまたはカプシド内封入される任意の他の成分または因子を含みうる。
本明細書で使用される場合、用語「コンジュゲートされる／された」は、ウイルスカプシドタンパク質をＣａｓ９タンパク質またはその等価物に結合、カップリング、融合および／または連結する任意の方法を指す。コンジュゲーションの非限定的な例としては、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物およびウイルスカプシドタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物とウイルスカプシドタンパク質の両方の遺伝子を構成する単一のポリヌクレオチドによりコードされている、組換え融合タンパク質；Ｃａｓ９−インテインタンパク質およびウイルスカプシド−インテインタンパク質のモジュール式のインテインベースの集合；Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物とウイルスカプシドタンパク質の間の化学結合の形成を引き起こす翻訳後修飾；ならびに１つまたは複数のリンカーを介してのＣａｓ９タンパク質またはその等価物とウイルスカプシドタンパク質の連結が挙げられる。一部の実施形態では、コンジュゲーションは、ウイルスカプシドタンパク質とその等価物の間の一時的なまたは一過性の会合状態でありうる。例えば、Ｃａｓ９またはその等価物を、ウイルスカプシドタンパク質に、オキシム結合などの、感染のより後のステップでまたは特定の細胞微小環境内でｐＨの変化またはイオン勾配に感受性のポリマーによって、一過的に連結することができる（例えば、Jinら、Biomacromolecules、２０１１年、１２巻（１０号）、３４６０〜３４６８頁、およびYoshidaら、Expert Opin Drug Deliv.２０１３年１１月、１０巻（１１号）：１４９７〜１５１３頁を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、用語「標識」は、「標識された」組成物を生成するために検出すべき組成物に直接または間接的にコンジュゲートされる、直接または間接的に検出可能な化合物または組成物、例えば、ポリヌクレオチドまたはタンパク質、例えば抗体を意図している。この用語は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびこれに類するものなどの、挿入された配列の発現時にシグナルを提供する、したがって、検出可能になる、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされる配列も含む。標識は、それ自体が検出可能（例えば、放射性標識または蛍光標識）であることもあり、または酵素標識の場合には、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒することもある。標識は、小規模検出に適していることもあり、またはハイスループットスクリーニングにより適していることもある。しかるが故に、適する標識は、これらに限定されないが、放射性同位体、蛍光色素、化学発光性化合物、色素、およびタンパク質（酵素を含む）を含む。標識を簡単に検出することができ、またはそれを定量することができる。簡単に検出される応答は、単にその存在が確認される応答を一般に含み、その一方で、定量される応答は、強度、分極および／または他の特性などの定量可能な（例えば、数値で報告可能な）値を有する応答を一般に含む。発光または蛍光アッセイにおいて、検出可能な応答は、結合に実際に関与するアッセイ成分と会合している発光団もしくは発蛍光団を使用して直接生成されることもあり、または別の（例えば、レポーターもしくは指示薬）成分と会合している発光団もしくは発蛍光団を使用して間接的に生成されることもある。
シグナルを生成する発光標識の例としては、生物発光および化学発光が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な発光応答は、一般に、発光シグナルの変化または発生を含む。アッセイ成分の発光標識に適する方法および発光団は、当技術分野において公知であり、例えば、Haugland、Richard P.（１９９６年）Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals（第６版）に記載されている。発光プローブの例としては、エクオリンおよびルシフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
適する蛍光標識の例としては、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Malacite green）、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）およびテキサスレッドが挙げられるが、これらに限定されない。他の適する光学色素は、Haugland、Richard P.（１９９６年）Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals（第６版）に記載されている。
別の態様では、蛍光標識は、細胞または組織の中または表面に存在する細胞成分、例えば細胞表面マーカー、への共有結合を助長するために官能化される。適する官能基は、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステルおよびハロゲン化スルホニル基を含むが、これらに限定されず、これらのすべてが、第二の分子に蛍光標識を結合させるために使用されうる。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、薬剤、マーカー、または第二の標識剤のいずれかへの結合部位に依存することになる。
蛍光標識の結合は、細胞成分もしくは化合物に直接に、であることもあり、または代替的に、リンカーを介して、による場合もある。中間体に蛍光標識を間接的に連結させる際の使用に適する結合対は、抗原／抗体、例えば、ローダミン／抗ローダミン、ビオチン／アビジン、およびビオチン／ストレプトアビジン（strepavidin）を含むが、これらに限定されない。
句「固体支持体」は、非水性表面、例えば、「培養プレート」、「遺伝子チップ」、または「マイクロアレイ」を指す。そのような遺伝子チップまたはマイクロアレイは、当業者に公知の多数の手法により、診断および治療目的で使用することができる。１つの手法では、オリゴヌクレオチドは。米国特許第６，０２５，１３６号および同第６，０１８，０４１号に概要が示されているものなどの、ハイブリダイゼーションアプローチにより、ＤＮＡ配列を判定するための遺伝子チップ上に結合され、配列される。本開示のポリヌクレオチドを探索用に改変することができ、そしてまた、その改変されたポリヌクレオチドを遺伝子配列の検出に使用することができる。そのような手法は、例えば、米国特許第５，９６８，７４０号および同第５，８５８，６５９号に記載されている。Ｋａｙｅｍらの米国特許第５，９５２，１７２号により、およびKelleyら（１９９９年）Nucleic Acids Res.２７巻：４８３０〜４８３７頁により記載されたものなどの、核酸配列の電気化学的検出用の電極表面にプローブを結合または付着させることもできる。
「組成物」は、活性ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体と、別の不活性化合物もしくは組成物（例えば、検出可能な標識）または別の活性化合物もしくは組成物（例えば、遺伝子送達ビヒクル）との組合せを意味するように意図されている。
「医薬組成物」は、活性ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体と、組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断または治療使用に適するものにする、固体支持体などの、不活性または活性の担体との組合せを含むように意図されている。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な医薬担体のいずれか、例えば、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、およびエマルジョン、例えば油／水型または水／油型エマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤を包含する。組成物は、安定剤および保存剤も含むことができる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、Martin（１９７５年）Remington's Pharm. Sci.、第１５版（Mack Publ. Co.、Easton）を参照されたい。
診断または処置の「対象」は、細胞、または動物、例えば、哺乳動物もしくはヒトである。対象は、特定の種に限定されず、診断または処置に付される非ヒト動物を含み、感染しやすいものまたは動物モデル、例えば、サル、ネズミ科動物、例えばラット、マウス、チンチラ、イヌ、例えば犬、ウサギ科動物、例えばウサギ、畜産動物、競技用動物およびペットである。ヒト患者もこの用語に含まれる。
用語「組織」は、生存もしくは罹患生物の組織、あるいは生存もしくは罹患生物に由来するまたはそれを模倣して設計された任意の組織を指すために、本明細書では使用される。組織は、健常あることもあり、罹患していることもあり、および／または遺伝子突然変異を有することもある。生体組織は、生物の身体の器官または一部または領域を構成する、任意の単一組織（例えば、相互接続していることもある細胞の集まり）または組織群を含みうる。組織は、均一な細胞物質を含むこともあり、または例えば肺組織、骨格組織および／もしくは筋肉組織を含みうる、胸部を含む身体の領域において見いだされるものなどの複合構造であることもある。例示的組織としては、これらに限定されないが、肝臓、肺、甲状腺、皮膚、膵臓、血管、膀胱、腎臓、脳、胆管、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓および腸に由来するものが、これらの任意の組合せを含めて、挙げられる。
本明細書で使用される場合、対象における疾患を「処置すること」、または対象における疾患の「処置」は、（１）疾患の素因を有するもしくは疾患の症状をまだ示していない対象において症状もしくは疾患が発生するのを防止すること；または（２）疾患を抑制すること、もしくはその発症を阻止すること；または（３）疾患もしくは疾患の症状を改善することもしくはその退行を生じさせることを指す。当技術分野において理解されているように、「処置」は、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本技術の目的では、有益なまたは所望の結果は、１つまたは複数の症状の改善または軽減；状態（疾患を含む）の程度の低下；状態（疾患を含む）の現状安定化（すなわち、悪化しないこと）；状態（疾患を含む）、進行、の遅延または緩徐化；状態（疾患を含む）、現状、の改善または緩和；および寛解（部分的または完全を問わず）を、検出可能または検出不能を問わず、１つまたは複数含みうるが、これらに限定されない。
多数のエフェクター要素が本明細書で開示される。これらのエフェクター要素の性質および機能は、当技術分野において一般に理解されており、多数のこれらのエフェクター要素が市販されている。関連する場合、それらの非限定的な例示的配列が本明細書で開示され、それらのさらなる説明が、本明細書において下記で提供される。
本開示を実施する方法
本開示の方法および組成物は、公知組成物および方法に勝るいくつかの利点を提供する。例えば、本記事の方法および組成物は、次のうちの１つまたは複数を提供する：（１）機能性Ｃａｓ９またはその等価物の標的細胞への効率的かつ標的化された送達、（２）単一ベクターの使用によるパッケージングおよび送達に対するサイズ制約の低減、（３）Ｃａｓ９活性の継続期間を制限すること、それによって経時的に生じるオフターゲット遺伝子編集を低減させること、（４）Ｃａｓ９およびその等価物の発現期間ならびに免疫系への曝露および（形質導入細胞を標的とし、形質導入細胞数を経時的に低減させうる）その応答を制限すること、（５）ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集の長期安定性プロファイルを向上させる、および（６）および多くのこれまでは処置が困難な疾患に対する処置戦略を可能にする。
改変ウイルスカプシドおよび調製方法
ウイルスカプシドタンパク質の内部表面、内部に向いているドメインまたは内部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質が、本明細書で開示される。一部の態様では、コンジュゲーションは、融合タンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質もしくはその等価物がウイルスカプシドタンパク質の内部表面と融合されている、Ｃａｓ９タンパク質もしくはその等価物とウイルスカプシドタンパク質の融合体を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。ウイルスカプシドタンパク質の外部表面、外部に向いているドメインまたは外部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質も、本明細書で開示される。一部の態様では、コンジュゲーションは、融合タンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物がウイルスカプシドタンパク質の外部表面と融合されている、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物とウイルスカプシドタンパク質の融合体を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。
一態様では、Ｃａｓ９またはその等価物は、ＶＰ２タンパク質の内部表面と融合されている。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物は、配列番号５９のアミノ酸２２８、３５０、４１９、６８４または６８９位でＶＰ２タンパク質に融合または挿入されている。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物は、配列番号３９のアミノ酸９０、２１３、２８２、５４７または５５２位でＶＰ２タンパク質に融合または挿入されている。Ｃａｓ９とＶＰ２の融合体の非限定的な例としては、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４９が挙げられる。他の態様では、コンジュゲーションは、ウイルスカプシドタンパク質とＣａｓ９またはその等価物の間に結合、例えば、共有結合、水素結合、もしくはイオン結合を生じさせる翻訳後修飾を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一部の態様では、コンジュゲーションは、集合したウイルス粒子の内部表面をＣａｓ９またはその等価物でコーティングすることを含むか、または代替的にそれから本質的になるから、またはなおさらにそれからなる。
別の態様では、Ｃａｓ９またはその等価物は、ＶＰ２タンパク質の外部表面と融合される。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物は、ＶＰ２タンパク質のアミノ酸末端部でＶＰ２タンパク質に融合または挿入されている。Ｃａｓ９とＶＰ２の融合体の非限定的な例としては、配列番号３６、配列番号２の番号５０３７〜１０５６５が付与されたヌクレオチド塩基対、配列番号５の番号５５３２〜１０５７４が付与された塩基対、およびそれらの各々の等価物が挙げられる。他の態様では、コンジュゲーションは、ウイルスカプシドタンパク質とＣａｓ９またはその等価物の間に結合、例えば、共有結合、水素結合、もしくはイオン結合を生じさせる翻訳後修飾を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一部の態様では、コンジュゲーションは、集合したウイルス粒子の内部表面をＣａｓ９またはその等価物でコーティングすることを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。
さらなる態様では、本明細書に記載の改変ウイルスカプシドは、検出の容易さのために検出可能な標識にカップリングされる。そのような標識の非限定的な例は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載される。一態様では、検出可能な標識は、天然に存在する検出可能な化合物、例えば、蛍光ポリヌクレオチドでもアミノ酸でもない。
一態様では、コンジュゲーションは、Ｃａｓ９またはその等価物をウイルスカプシドタンパク質の内部または外部表面に１つまたは複数のリンカーを介して結合させることを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一部の態様では、リンカーは、可動性または剛性である。一部の態様では、リンカーは、細胞感染後に起こるｐＨ変化中にカプシドからＣａｓ９タンパク質を効率的に放出することを可能にする、自己切断タンパク質スペーサーである。一態様では、精製タンパク質部分構造を精製ウイルス調製物と結合するためにビオチンリガーゼが使用される。タンパク質とカプシドタンパク質のコンジュゲーションのさらなる例は、Stachlerら（２００８年）Site-specific modification of AAV vector particles with biophysical probes and targeting ligands using biotin ligase. Mol. Ther.１６巻：１４６７〜１４７３頁、doi:10.1038/mt.2008.129、およびWeiら（２０１２年）Conjugation of paclitaxel on adeno-associated virus (AAV) nanoparticles for co-delivery of genes and drugs. Eur. J. Pharm. Sci.４６巻：１６７〜１７２頁、doi:10.1016/j.ejps.2012.02.022に記載されている。
一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物は、ウイルスカプシドタンパク質にビオチンリンカーを介してコンジュゲートされる。一部の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ酵素ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）は、ビオチンを１５−アミノ酸ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）に、配列特異的にライゲーションする。一部の実施形態では、補因子としてのビオチンのケトンアイソスター（ketone isotere）の使用により、ペプチドをＢＡＰ改変ＡＡＶカプシドにライゲーションすることができる。一部の実施形態では、ケトンは、ＡＡＶに非存在であり、したがって、ＢＡＰ改変ＡＡＶ粒子にケトンペプチドタグを付け、次いで、ヒドラジド官能化またはヒドロキシルアミン官能化分子に特異的にコンジュゲートすることができる。
一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物のウイルスカプシドタンパク質へのコンジュゲーションを、ｐＨの変化またはイオン勾配への曝露によって反転または変化させることができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物は、ｐＨ感受性ポリマー、またはｐＨ感受性官能基を含むリンカーを介して、ウイルスカプシドタンパク質にコンジュゲートされる。ｐＨ感受性ポリマーの例としては、アミノアルキルメタクリレートコポリマー；ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−メチルメタクリレート）；親水性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）と疎水性オキシム連結ポリカプロラクトン（ｏｘｉｍｅ−ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）（ＯＰＣＬ）とからなるトリブロックコポリマー（ＰＥＧ−ＯＰＣＬ−ＰＥＧ）；およびフタル酸ヒドロキシプロピル−メチルセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。例示的ｐＨ感受性官能基としては、ヒドラジン、アセタール、オルトエステルおよびビニルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物は、イオン感受性樹脂を介してウイルスカプシドタンパク質にコンジュゲートされる。例示的なイオン感受性樹脂としては、ポリ（エチルアクリレート−メチルメタクリレート−トリメチルアンモニオエチルメタクリレートクロリド）コポリマー、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、およびYoshidaら、Expert Opin Drug Deliv.２０１３年１１月；１０巻（１１号）：１４９７〜１５１３頁に記載されているようなイオン交換樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ウイルスカプシド内の、形質導入細胞内の、または形質導入細胞内の微小環境内の、ｐＨまたはイオン勾配は、コンジュゲーションからのＣａｓ９またはその等価物の放出を誘発する。
一部の態様では、改変カプシドタンパク質は、ウイルスカプシド集合および／または形成に対する一切の立体障害を最小にするために、Ｃａｓ９もしくはその等価物とウイルスカプシドタンパク質の間にスペーサー領域をさらに含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。Ｃａｓ９を、カプシドタンパク質の末端部にではなく、カプシドタンパク質内にカップリング、挿入または結合させれば、複数のスペーサー領域を含めることができ、したがって、より大きな可動性または空間が可能になる。１つまたは複数のスペーサー領域が、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物の一方または両方の末端に隣接することもある。一態様では、スペーサー領域は、ペプチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一部の態様では、ペプチドは、１〜１００アミノ酸の間の長さ、１〜５０アミノ酸の間の長さ、１〜３０アミノ酸の間の長さ、１〜２０アミノ酸の間の長さ、１〜１０アミノ酸の間の長さ、１〜５アミノ酸の間の長さ、５〜１０アミノ酸の間の長さ、５〜１５アミノ酸の間の長さ、または２０〜４０アミノ酸の間の長さである。本明細書で使用される場合、「スペーサー」は、「リンカー」を含むペプチド配列を含む。一態様では、スペーサー領域は、配列番号９またはその等価物を含むポリヌクレオチドによってコードされる。別の態様では、リンカーは、ヌクレオチド配列ｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｃａｇｃ（配列番号５３）によってコードされ、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５１）を有する、Ｇ４Ｓである。Ｇ４Ｓの等価物は、１５−ｍｅｒ（Ｇ４Ｓ）３（配列番号５３）、１８−ｍｅｒ ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５４）（Andris-Widhopfら、２０１１年）および２０−ｍｅｒ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号５５）（Schaeferら、２０１０年）を含むがこれらに限定されない、様々な長さの多量体を含む。さらに別の態様では、Ｇ４Ｓリンカー中のＧの数を、連続する３つのＧ（配列番号５６）に減少させることができる。改変カプシドにおける使用に適しているさらなる可動性リンカーの非限定的な例としては、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号３１）およびＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号３２）が挙げられ、これらは、生物活性ｓｃＦｖの構築に利用されている（Bird, R. E.ら、Science ２４２巻、４２３〜４２６頁（１９８８年））。改変カプシドにおける使用に適している他のリンカーのさらなる例としては、グリシン残基からなる（Ｇｌｙ）８（配列番号３３）；ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号３４）；Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）の配列を有する実験的剛性リンカー（配列番号３５）；およびαヘリックス構造を有し、セグメント内でＧｌｕ−−Ｌｙｓ＋塩架橋により安定化されている、リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。リンカーのさらなる生成方法、および上記リンカーについての説明は、例えば、Sabourin, M.ら（２００７年）Yeast ２４巻：３９〜４５頁、doi:10.1002/yea.1431；Waldo, G.S.ら（１９９９年）Nat Biotechnol.１７巻：６９１〜６９５頁、doi:10.1038/10904（１９９９年）；Araiら（２００１年）Protein Eng.１４巻：５２９〜５３２頁、およびAraiら（２００４年）Proteins ５７巻：８２９〜８３８頁において見出される。
一部の態様では、コンジュゲーションは、Ｃａｓ９またはその等価物をウイルスカプシドタンパク質の内部または外部表面にインテイン媒介ライゲーションによって結合またはカップリングさせることを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。インテイン切り出しは、介在インテインタンパク質ドメインが、自体を宿主タンパク質から痕跡を残さないように切り出し、その結果、隣接ポリペプチド配列（エクステインと呼ばれる）が正常ペプチド結合によって互いにライゲーションされる、タンパク質スプライシング機構である。モジュール式のインテインベースのライゲーションまたは集合方法において、この過程は、Ｎ末端断片およびＣ末端断片である２つの断片にインテインを分割し、各断片を、エクステイン、例えばＣａｓ９またはウイルスカプシドタンパク質、と融合させることによって、活用される。適切な条件下で、スプリットインテイン−エクステイン融合体は、共発現されるかまたは互いに混合され、インテインライゲーション反応が触媒され、その結果、エクステイン２個の融合体が得られ、スプリットインテイン断片が切り出される。一部の実施形態では、インテインは、高速の速度のタンパク質トランススプライシング（例えば、３０℃で約ｔ１／２＜４００秒）が可能である、高速インテインである（Neel, S.ら、Journal of the American Chemical Society（２０１２年）、１３４巻（２８号）、１１３３８〜１１３４１頁）。一部の実施形態では、高速インテインは、１つまたは複数の促進剤残基（配列番号６０のＫ７０、Ｍ７５およびＭ８１）を含有する（Stevens, A.ら、J. Am. Chem. Soc.、２０１６年、１３８巻（７号）、２１６２〜２１６５頁）。例示的高速インテインとしては、コンセンサス高速インテイン（Ｃｆａ）（配列番号６０）、Ｎｐｕ、Ａｖａ、およびＭｃｈｔが挙げられるが、これらに限定されない。インテインの例示的Ｎ末端断片は、ＣｆａＮ（配列番号６０のアミノ酸残基１〜１０１）である。インテインの例示的Ｃ末端断片は、ＣｆａＣ（配列番号６０のアミノ酸残基１０２〜１３６）である。一実施形態では、光ケージされたシステインアミノ酸残基で高速インテインをさらに改変して、その結果、光活性化可能であるインテインライゲーション反応を生じさせることができる（Ren, W.ら、J Am Chem Soc.２０１５年２月１８日；１３７巻（６号）：２１５５〜８頁）。
旧来のインテインライゲーション反応は、使用可能な効率で機能するためにｐＨおよびイオン塩強度の最適な条件で行われる必要がある。これらの条件は、真核細胞内では見られない。旧来のインテインとは対照的に、Ｃｆａおよび高速インテインなどの改変インテインについてのライゲーション反応を、トランスフェクト細胞内で触媒することができ、その後の単離、および最適化された緩衝系への精製の必要がない。改変および高速インテインは、広範な温度、ｐＨ、および緩衝剤のもとで機能することができる。重要なこととして、ウイルスカプシドタンパク質にライゲーションされた内部Ｃａｓ９またはその等価物を産生するには、ウイルスが完全に形成される前にタンパク質ライゲーションを生じさせるためにスプリットインテインライゲーション反応をトランスフェクト細胞内で行わなければならない。他の旧来のインテイン形態は、トランスフェクト細胞の環境内で非機能性であり、融合産物を産生しないであろう。
Ｃｆａを含む、改変および高速インテインの効率的インテインライゲーション反応を触媒するための例示的な適切な条件としては、（ｉ）適するスプライシング緩衝液（例えば、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ；２ｍＭ ＴＣＥＰを用いてｐＨ７．２）中、３０〜３７℃での等体積のＮ末端インテイン融合タンパク質とＣ末端インテイン融合タンパク質のコインキュベーション；（ｉｉ）タンパク質発現に適する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３）におけるＮ末端インテイン融合タンパク質とＣ末端インテイン融合タンパク質の共発現；および（ｉｉｉ）ウイルス集合およびパッケージングに適する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３）におけるＮ末端インテイン融合タンパク質とＣ末端インテイン融合タンパク質の共発現が挙げられるが、これらに限定されない。トランススプライシングをＨＰＬＣによりモニターすることができる。一部の態様では、Ｃａｓ９−インテインおよび／またはウイルスカプシドタンパク質−インテインは、細菌において産生される。一部の態様では、Ｃａｓ９−インテインおよび／またはウイルスカプシドタンパク質−インテインは、真核細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）において産生される。
一態様では、ウイルスカプシドタンパク質は、アデノウイルス（Ａｄ）カプシドタンパク質、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質、またはレンチウイルスカプシドもしくはエンベロープタンパク質の群から選択される。Ａｄカプシドタンパク質の非限定的な例としては、ヘキソン（タンパク質ＩＩ）、ペントン塩基（タンパク質ＩＩＩ）および線維（タンパク質ＩＶ）ならびにタンパク質ＩＩＩａ、ＶＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸまたはそれらの各々の等価物が挙げられる。これらの配列は、当技術分野において公知であり、例えば、Athappilly FKら、J Mol Biol １９９４年；２４２巻：４３０〜４５５頁に記載されている。ＡＡＶウイルスタンパク質の非限定的な例としては、ＶＰ１（配列番号３７）、ＶＰ２（配列番号３９）、およびＶＰ３（配列番号３８）、またはそれらの各々の等価物が挙げられる。レンチウイルスカプシドおよびエンベロープタンパク質の非限定的な例としては、Ｐ２４カプシドタンパク質ＣＡ、およびＰ９カプシドタンパク質ＮＣ、ＶＳＶＧ、ならびにそれらの各々の等価物が挙げられる。一態様では、改変ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ ＶＰ２、またはその等価物を含む。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（配列番号３、配列番号５０）またはその等価物である。他の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列ＮＧＧ（配列番号２０）を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳＰ）ＳｐＣａｓ９（配列番号１８）；ＰＡＭ配列ＮＧＧ（配列番号２１）（還元ＮＡＧ結合）を有するＳｐＣａｓ９ Ｄ１１３５Ｅ変異体；ＰＡＭ配列ＮＧＣＧ（配列番号２２）を有するＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲ変異体；ＰＡＭ配列ＮＧＡＧ（配列番号２３）を有するＳｐＣａｓ９ ＥＱＲ変異体；ＰＡＭ配列ＮＧＡＮ（配列番号２４）もしくはＮＧＮＧ（配列番号２５）を有するＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ変異体；ＰＡＭ配列ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２６）もしくはＮＮＧＲＲ（Ｎ）（ここでの（Ｎ）は、任意選択である）（配列番号２７）を有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）ＳａＣａｓ９；ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号２８）を有するＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＭ）Ｃａｓ９；ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号２９）を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＳＴ）Ｃａｓ９；ＰＡＭ配列ＮＡＡＡＡＣ（配列番号３０）を有するＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＴＤ）Ｃａｓ９；または別の細菌種、例えば、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、もしくはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａからのＣａｓタンパク質である。Ｃａｓ９の等価物としては、上に挙げたＣａｓ酵素に由来するＣａｓ９ならびに／またはタンパク質の機能、標的化特異性、サイズ（例えば、切断型突然変異）、局在化に影響を与える改変、および／もしくはオフターゲット効果を低下させる改変を有するＣａｓ９、例えば、酵素的に不活性であるがＤＮＡに結合でき、しかしＤＮＡを切断できない、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９、配列番号４０）；２つのヌクレアーゼドメインの一方（ＲｕｖＣまたはＨＮＨのどちらか）が不活性化され、その結果、酵素が標的ＤＮＡの１本の鎖のみを切断することができるようにされている、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ）；非特異的エンドヌクレアーゼＦｏｋＩに融合されているヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９−Ｆｏｋｌ）；新規ＮＧＧ（配列番号２０）ＰＡＭ配列を認識するｓｐＣａｓ９ ＶＱＲ、ＥＱＲおよびＶＲＥＲ変異体；ならびにＤＮＡ（配列番号１０）を切断したときにＰＡＭ配列から５ヌクレオチド５’オーバーハング１８塩基対を遊離する非Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼＣｐｆ１が挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、単一成分のプログラム可能なＲＮＡ誘導型ＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲエフェクターであるＣ２Ｃ２である（Abudayyeh, O.ら（２０１６年）Science ３５３巻：６２９９頁）。別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号３もしくは配列番号５０、もしくはそれらの各々の等価物を含むか、またはそれからなる。一部の態様では、Ｃａｓ９を、プロテアーゼ分解または切断に対して耐性になるように改変することができる。プロテアーゼ耐性タンパク質を設計する方法は、Fruchart-Gaillard, C.ら（２０１２年）PLoS One 7:e39166；Hu, W.ら Enzyme Microb Technol ９７巻、８２〜８９頁（２０１７年）；Kukenshoner, T.ら（２０１４年）J Struct Biol １８６巻：３３５〜３４８頁（２０１４年）；Li, Y.ら（２０１３年）J Biotechnol.１６３巻：４０１〜４０７頁；およびWerner, H.M.ら（２０１６年）Chembiochem １７巻：７１２〜７１８頁に記載されているように、当技術分野において公知である。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９またはその等価物は、耐熱性ヒトＣａｓ９である。耐熱性Ｃａｓ９の非限定的な例は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＧｅｏＣａｓ９である。耐熱性Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９より高温（ＳｐＣａｓ９の４５℃に対して７０℃）で活性であり、ヒト血清中での安定性が増大している（ＳｐＣａｓ９に許容される血清中約０％と比較して、血清中最大３０％まで許容される）。ＧｅｏＣａｓ９は、ＣＲＡＡ（ここで、Ｒ＝ＡまたはＧ）のＰＡＭ配列、および２２ｎｔのスペーサー長を有する。ＧｅｏＣａｓ９は、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ（ｐＥＴ−ＭＢＰ−ＮＬＳ−Ｇｅｏ＿ｓｔ；Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ ８７７０３）から入手可能である。
一部の実施形態では、Ｃａｓ９またはその等価物は、ＲＮＡを標的にすることおよび／または編集することができる。例えば、一部の実施形態では、Ｃａｓ９またはその等価物は、Ｃａｓ１３、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ１３（ｄＣａｓ１３）、Ｃ２ｃ２、Ｃａｓ１３ａ、またはＣａｓ９である。例えば、Gootenbergら、Science.２０１７年１１月２４日；３５８巻（６３６６号）：１０１９〜１０２７頁；Abudayyehら Nature.２０１７年１０月１２日；５５０巻（７６７５号）：２８０〜２８４頁；およびStruttら、eLife.２０１８年；７巻：ｅ３２７２４頁（各々が参照により本明細書に組み入れられている）を参照されたい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９またはその等価物は、標的配列中のＰＡＭ配列の存在を必要としない。
一部の実施形態では、その改変ウイルスカプシドタンパク質は、１つまたは複数のシグナルペプチドをさらに含みうる。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、Ｃａｓ９またはその等価物にコンジュゲートされている。特定の実施形態では、１つまたは複数のシグナルペプチドは、Ｃａｓ９またはその等価物のＮ末端に融合されている。別の実施形態では、１つまたは複数のシグナルペプチドは、Ｃａｓ９またはその等価物のＣ末端に融合されている。一部の実施形態では、１つまたは複数のシグナルペプチドは、Ｃａｓ９またはその等価物のＮ末端とＣ末端の両方にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、シグナルは、Ｃａｓ９またはその等価物内に挿入されている。特定の実施形態では、シグナルは、核への改変ウイルスカプシドタンパク質の局在化を助けるための核局在化シグナルである。核局在化シグナルを有する例示的なＣａｓ９は、米国特許第８，７９５，９６５号において見出される。
一部の態様では、本開示は、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面、内部に向いているドメインまたは内部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質をコードする、１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチドを提供する。他の態様では、本開示は、ウイルスカプシドタンパク質の外部表面、外部に向いているドメインまたは外部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質をコードする、１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチドを提供する。一態様では、ポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９タンパク質もしくはその等価物をコードするポリヌクレオチドと、ウイルスカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる、融合タンパク質をコードする。さらなる態様では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９またはその等価物とウイルスカプシドタンパク質の間にまたはそれらに隣接してスペーサー領域および／またはリンカーをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む。一態様では、ポリヌクレオチドによりコードされるＣａｓ９は、ｓａＣａｓ９であり、ポリヌクレオチドによりコードされるウイルスカプシドタンパク質は、ＶＰ２である。別の態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号３または配列番号５０を含むまたはそれからなる、Ｃａｓ９タンパク質をコードする。他の態様では、２つまたはそれより多くの明確に異なるポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物およびカプシドタンパク質をコードする。一部の態様では、Ｃａｓ９および／またはウイルスカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。
さらなる態様では、ポリヌクレオチドは、複製および／または発現に必要な調節配列、例えば、プロモーターおよび必要に応じてエンハンサーに、作動可能にカップリングされている。それらの非限定的な例は、本明細書で開示され、例えば、Ｕ６プロモーターである。
さらなる態様では、ポリヌクレオチドは、遺伝子発現ビヒクル、ベクター、例えばウイルスベクターまたはプラスミド、内に含有されている。非限定的な例は、当技術分野で公知であり、本明細書に簡潔に記載される。当業者には明らかであるように、ポリヌクレオチドは、遺伝子発現ビヒクル内に、ポリヌクレオチドの発現に適切な配向で含有されている。
さらなる態様では、ポリヌクレオチドは、検出可能な標識に結合されている。標識の非限定的な例は、本明細書に記載される。
さらなる態様では、２つまたはそれより多くの明確に異なるポリヌクレオチドが、同じかまたは異なるプラスミド上にある。さらに別の態様では、２つの明確に異なるポリヌクレオチドの一方は、１つまたは複数のスペーサー領域および／またはリンカーをさらに含む。一態様では、リンカーは、Ｃａｓ９またはその等価物のアミノ末端部とカルボキシ末端部の両方に隣接する。他の態様では、単一のリンカーが、Ｃａｓ９またはその等価物のアミノまたはカルボキシ末端部のどちらかに隣接する。
加えて、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面、内部に向いているドメインまたは内部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質をコードする、１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターまたは宿主細胞が本明細書で提供される。ウイルスカプシドタンパク質の外部表面、外部に向いているドメインまたは外部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質をコードする、１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターまたは宿主細胞も本明細書で提供される。一部の態様では、ベクターまたは宿主細胞は、ウイルス粒子の産生および集合に必要な追加のプラスミド、および／または遺伝子編集のための成分のコードするプラスミドをさらに含む。ベクターまたは宿主細胞の非限定的な例としては、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはそれらの各々の等価物、市販のウイルスパッケージング細胞、例えば、２９３ＡＡＶ細胞（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）またはＰｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞（ＡＴＴＣ）が挙げられる。一部の態様では、ベクターまたは宿主細胞は、ウイルス複製、パッケージング、集合および／またはカプシド内封入に必要な遺伝子をコードするヘルパープラスミドをさらに含む。
本開示の一部の態様は、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面、内部に向いているドメインまたは内部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるぁか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質を調製する方法であって、Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物をウイルスカプシドタンパク質にカップリングすることを含むか、または代替的にそのようなことから本質的になるか、またはなおさらにそのようなことからなる方法に関する。一部の態様では、カップリングは、ウイルスカプシドタンパク質とＣａｓ９もしくはその等価物の間に結合、例えば、共有結合、水素結合、もしくはイオン結合を生じさせる翻訳後修飾を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一部の態様では、カップリングは、集合したウイルス粒子の内部表面をＣａｓ９もしくはその等価物でコーティングすることを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一態様では、カップリングは、Ｃａｓ９もしくはその等価物をウイルスカプシドタンパク質の内部または外部表面に１つもしくは複数のリンカーを介して結合させることを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一部の態様では、リンカーは、同じかまたは異なる。さらなる態様では、リンカーは、可動性または剛性である。一態様では、１つまたは複数のリンカーは、Ｃａｓ９またはその等価物のアミノ末端部とカルボキシ末端部の両方に隣接する。他の態様では、リンカーは、Ｃａｓ９またはその等価物のアミノまたはカルボキシ末端部のどちらかに隣接する。一部の態様では、Ｃａｓ９もしくはその等価物および／またはリンカーは、（配列番号５９の）アミノ酸２２８、３５０、４１９、６８４または６８９位でＶＰ２タンパク質にカップリングされる。一部の態様では、Ｃａｓ９もしくはその等価物および／またはリンカーは、配列番号３９のアミノ酸９０、２１３、２８２、５４７または５５２位でＶＰ２タンパク質にカップリングされる。ＶＰ２にカップリングされたＣａｓ９の非限定的な例としては、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４９、ならびにそれらの各々の等価物が挙げられる。
本開示の一部の態様は、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面、内部に向いているドメインまたは内部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質を調製する方法であって、改変ウイルスカプシドタンパク質をコードする１つもしくは複数の単離されたポリペプチドを発現させることを含むか、または代替的にそのようなことから本質的になるか、またはなおさらにそのようなことからなる方法を提供する。本開示の他の態様は、ウイルスカプシドタンパク質の外部表面、外部に向いているドメインまたは外部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質を調製する方法であって、改変ウイルスカプシドタンパク質をコードする１つもしくは複数の単離されたポリペプチドを発現させることを含むか、または代替的にそのようなことから本質的になるか、またはなおさらにそのようなことからなる方法を提供する。一態様では、単離されたポリペプチドは、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８または配列番号４９をコードする。
一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質もしくその等価物、ウイルスカプシドタンパク質、またはＣａｓ９にコンジュゲートされている改変ウイルスカプシドタンパク質は、Ｃａｓ９のプロテアーゼ分解を低減させるようにさらに改変される。一部の態様では、Ｃａｓ９配列内のプロテアーゼ切断部位は、切断を防止するように突然変異される。一部の態様では、１つまたは複数のウイルスカプシドタンパク質は、その内因性切断活性の一部またはすべてを消去するように突然変異される。一部の態様では、改変ウイルスカプシドタンパク質は、１つまたは複数のプロテアーゼ阻害剤の存在下で産生される。
内部または外部カプシド表面にＣａｓ９を発現する改変ウイルス粒子
改変カプシドを含むかまたは代替的に改変カプシドから本質的になる組換えまたは改変ウイルス粒子であって、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面、内部に向いているドメインまたは内部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質を、改変カプシドが含む、組換えまたは改変ウイルス粒子も、本明細書で提供される。改変カプシドを含むかまたは代替的に改変カプシドから本質的になる組換えまたは改変ウイルス粒子であって、ウイルスカプシドタンパク質の外部表面、外部に向いているドメインまたは外部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質を、改変カプシドが含む、組換えまたは改変ウイルス粒子も、本明細書で提供される。一部の態様では、改変ウイルス粒子は、カプシド内にカプシド内封入されている１つまたは複数のポリヌクレオチドをさらに含む。一部の態様では、ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一態様では、ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、治療法ポリヌクレオチドを含むか、または代替的にそれから本質的になる、またはなおさらにそれからなる。本明細書で使用される場合、用語「治療用ポリヌクレオチド」は、標的細胞ゲノムの遺伝子改変のためのものでありうる置換ポリヌクレオチドを意図している。あるいは、治療用ポリヌクレオチドは、治療用ポリペプチドをコードする。
一部の態様では、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む融合ポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むポリヌクレオチドを含むか、または代替的にこれらから本質的なるか、またはなおさらにこれらからなる。一態様では、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８またはその等価物を含むまたはそれからなる。一部の態様では、ｇＲＮＡは、遺伝子編集および／または遺伝子調節を必要とする、ＤＮＡの領域に特異的である。さらなる態様では、ｇＲＮＡは、検出可能な標識をさらに含む。
一部の態様では、治療用ポリヌクレオチドをさらに含む組換えウイルス粒子。治療用ポリヌクレオチドは、編集を必要とするＤＮＡ配列を標的とするために使用することができる、編集を必要とするＤＮＡ配列のための修復鋳型を提供するために使用することができる、または編集を必要とするＤＮＡ配列の置換物を提供するために使用することができる、任意のポリペプチドである。さらなる態様では、治療用ポリペプチドは、編集を必要とする遺伝子の野生型配列を含む。さらなる態様では、治療用ポリヌクレオチドは、検出可能な標識をさらに含む。
ウイルス粒子の内部または外部カプシド表面にＣａｓ９またはその等価物を発現する改変ウイルス粒子の生成のための組換え発現システムであって、（ａ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドであって、融合タンパク質がＣａｓ９またはその等価物およびウイルスカプシドタンパク質を含む、プラスミドと、（ｂ）ヘルパープラスミドとを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる組換え発現システムが、本明細書で開示される。一部の態様では、ウイルスカプシドは、アデノウイルス（Ａｄ）カプシドタンパク質、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質、またはレンチウイルスの群から選択される。Ａｄカプシドタンパク質の非限定的な例としては、ヘキソン（タンパク質ＩＩ）、ペントン塩基（タンパク質ＩＩＩ）および線維（タンパク質ＩＶ）ならびにタンパク質ＩＩＩａ、ＶＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸまたはそれらの各々の等価物が挙げられる。ＡＡＶウイルスタンパク質の非限定的な例としては、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、またはそれらの各々の等価物が挙げられる。ＶＰ１の非限定的な例としては、配列番号３７、配列番号１の番号５０３７〜７２５３が付与されたＤＮＡ塩基対、配列番号４の番号５０３７〜７２５３が付与された塩基対、およびそれらの各々の等価物が挙げられる。ＶＰ２の非限定的な例としては、配列番号３９、配列番号５の番号８７８６〜１０５７４が付与された塩基対、およびそれらの各々の等価物が挙げられる。ＶＰ３の非限定的な例としては、配列番号３８、配列番号１の番号５６４６〜７２５３が付与された塩基対、配列番号１の番号５６４６〜７２５３が付与された塩基対、およびそれらの各々の等価物が挙げられる。レンチウイルスカプシドタンパク質の非限定的な例としては、Ｐ２４カプシドタンパク質ＣＡ、Ｐ９カプシドタンパク質ＮＣ、レンチウイルスエンベロープタンパク質ＶＳＶＧ、およびそれらの各々の等価物が挙げられる。一部の態様では、改変カプシドタンパク質は、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のうちの１つもしくは複数、またはそれらの各々の等価物を含む。一態様では、改変ウイルスカプシドタンパク質は、ＶＰ２、またはその等価物を含む。Ａｄカプシドタンパク質の非限定的な例としては、ヘキソン（タンパク質ＩＩ）、ペントン塩基（タンパク質ＩＩＩ）および線維（タンパク質ＩＶ）ならびにタンパク質ＩＩＩａ、ＶＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸまたはそれらの各々の等価物が挙げられる。ＡＡＶウイルスタンパク質の非限定的な例としては、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、またはそれらの各々の等価物が挙げられる。レンチウイルスカプシドタンパク質の非限定的な例としては、Ｐ２４カプシドタンパク質ＣＡ、およびＰ９カプシドタンパク質ＮＣ、ならびにそれらの各々の等価物が挙げられる。
一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９またはその等価物である。他の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列ＮＧＧ（配列番号２０）を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳＰ）ＳｐＣａｓ９；ＰＡＭ配列ＮＧＧ（配列番号２１）（還元ＮＡＧ結合）を有するＳｐＣａｓ９ Ｄ１１３５Ｅ変異体；ＰＡＭ配列ＮＧＣＧ（配列番号２２）を有するＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲ変異体；ＰＡＭ配列ＮＧＡＧ（配列番号２３）を有するＳｐＣａｓ９ ＥＱＲ変異体；ＰＡＭ配列ＮＧＡＮ（配列番号２４）もしくはＮＧＮＧ（配列番号２５）を有するＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ変異体；ＰＡＭ配列ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２６）もしくはＮＮＧＲＲ（Ｎ）（配列番号２７）を有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）ＳａＣａｓ９；ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号２８）を有するＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＭ）Ｃａｓ９；ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号２９）を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＳＴ）Ｃａｓ９；ＰＡＭ配列ＮＡＡＡＡＣ（配列番号３０）を有するＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＴＤ）Ｃａｓ９；または別の細菌種、例えば、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、もしくはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａからのＣａｓタンパク質である。上記配列において、Ｎは、任意のヌクレオチドを表す。Ｃａｓ９の等価物としては、タンパク質の機能、標的化特異性、サイズ、局在化に影響を与える改変、および／またはオフターゲット効果を低下させる改変を有するＣａｓ９、例えば、酵素的に不活性であるがＤＮＡに結合でき、しかしＤＮＡを切断できない、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）；２つのヌクレアーゼドメインの一方（ＲｕｖＣまたはＨＮＨのどちらか）が不活性化され、その結果、酵素が標的ＤＮＡの１本の鎖のみを切断することができるようにされている、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ｎ）；非特異的エンドヌクレアーゼＦｏｋＩに融合されているヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９−Ｆｏｋｌ）；新規ＮＧＧ（配列番号２０）ＰＡＭ配列を認識するｓｐＣａｓ９ ＶＱＲ、ＥＱＲおよびＶＲＥＲ変異体；ならびにＤＮＡを切断したときにＰＡＭ配列から５ヌクレオチド５’オーバーハング１８塩基対を遊離する非Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼＣｐｆ１が挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、単一成分のプログラム可能なＲＮＡ誘導型ＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲエフェクターである、Ｃ２Ｃ２である（Abudayyeh, O.ら（２０１６年）Science ３５３巻：６２９９頁）。別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号３もしくは配列番号５０、またはそれらの各々の等価物を含むか、またはそれからなる。一部の態様では、Ｃａｓ９は、プロテアーゼ分解または切断に対して耐性になるように改変される。プロテアーゼ耐性タンパク質を設計する方法は、Fruchart-Gaillard, C.ら（２０１２年）PLoS One ７巻：ｅ３９１６６頁；Hu, W.ら、Enzyme Microb Technol ９７巻、８２〜８９頁（２０１７年）；Kukenshoner, T.ら（２０１４年）J Struct Biol １８６巻：３３５〜３４８頁；Li, Y.ら（２０１３年）J Biotechnol.１６３巻：４０１〜４０７頁；およびWerner, H.M.ら（２０１６年）Chembiochem １７巻：７１２〜７１８頁に記載されているように、当技術分野において公知である。
一部の態様では、組換え発現システムは、Ｃａｓ９およびＶＰ２を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる、融合タンパク質を含む。さらなる態様では、組換え発現システムは、融合タンパク質配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９もしくはそれらの各々の等価物をコードするＤＮＡ配列を含むかまたはそのようなＤＮＡ配列からなるプラスミドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一部の態様では、組換え発現システムは、配列番号１、配列番号４、配列番号５７、もしくはそれらの各々の等価物の群から選択されるＤＮＡ配列を含むかまたはそのようなＤＮＡ配列からなるヘルパープラスミドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。さらなる態様では、ヘルパープラスミドは、配列番号６またはその等価物を含むか、またはそれからなる。一部の態様では、組換え発現システムは、ＶＰ２をコードするＤＮＡ配列、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ配列、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９をコードするＤＮＡ配列またはそれらの各々の等価物の群から選択される、ＤＮＡ配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一部の態様では、組換え発現システムは、ＶＰ１をコードするＤＮＡ配列、ＶＰ３をコードするＤＮＡ配列、もしくはＶＰ１とＶＰ３の両方をコードするＤＮＡ配列、またはそれらの各々の等価物の群から選択されるＤＮＡ配列を含む、ヘルパープラスミドを含む。
改変ウイルス、例えばＡＡＶは、ウイルスパッケージングシステム、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはバキュロウイルスパッケージングシステムを使用してパッケージングすることができる。一部の実施形態では、パッケージングは、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドおよび細胞株を使用することにより果たされる。ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドは、細胞への遺伝物質の送達を助長する要素および配列を含有する。別の態様では、ヘルパープラスミド、またはヘルパープラスミドを含むポリヌクレオチドは、パッケージング細胞株のゲノムに安定的に組み込まれており、したがって、パッケージング細胞株にヘルパープラスミドをさらにトランスフェクトする必要がない。
ヘルパープラスミドは、例えば、複製能力のないウイルス、例えばＡＡＶ、をパッケージングするために必要とされる、および複製能力のあるＡＡＶを産生することなく高力価で複製能力のないＡＡＶをパッケージングすることができるビリオンタンパク質を産生するために必要とされる、すべてのビリオンタンパク質をトランスでコードする、複製能力のないウイルスゲノムに由来する少なくとも１つのウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含みうる。ウイルスＤＮＡ配列は、このウイルスのウイルス５’ＬＴＲのネイティブエンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域を欠いており、かつヘルパーゲノムのパッケージングに関与するプサイ機能配列と３’ＬＴＲの両方を欠いているが、外来ポリアデニル化部位、例えばＳＶ４０ポリアデニル化部位と、ウイルスの産生が望まれる細胞型において効率的転写を指示する外来エンハンサーおよび／またはプロモーターとをコードする。ウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）などの、白血病ウイルスである。外来エンハンサーおよびプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）最初期（ＩＥ）エンハンサーおよびプロモーター；モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（Ｕ３領域）；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域；またはネイティブモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターに結合されたＨＣＭＶ ＩＥエンハンサーでありうる。ヘルパープラスミドは、プラスミドベースの発現ベクターによりコードされている２つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列からなることもあり、例えば、この場合、第１のヘルパー配列は、同種指向性ＭＭＬＶまたはＧＡＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有し、第２のヘルパー配列は、ｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する。宿主域を決定するＥｎｖ遺伝子は、異種指向性、両種指向性、同種指向性、多種指向性（ミンクフォーカス形成）もしくは１０Ａ１マウス白血病ウイルスｅｎｖタンパク質をコードする遺伝子、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖタンパク質をコードする遺伝子、ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖ（ｇｐ１６０）タンパク質をコードする遺伝子、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）Ｇタンパク質をコードする遺伝子、ヒトＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ）Ｉ型およびＩＩ型ｅｎｖ遺伝子産物、前述のｅｎｖ遺伝子のうちの１つもしくは複数についての組合せに由来するキメラエンベロープ遺伝子、または前述のｅｎｖ遺伝子産物の細胞質および膜貫通領域と所望の標的細胞上の特定の表面分子に対するモノクローナル抗体とをコードするキメラエンベロープ遺伝子に由来しうる。
パッケージング過程で、ヘルパープラスミド、およびＡＡＶウイルスタンパク質をコードするプラスミドは、高力価組換えレトロウイルスを含有する上清を生成するために、ウイルスを産生することができる哺乳動物細胞、例えば、ヒト胚性腎細胞、例えば２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）、の第１の集団に、一過的にコトランスフェクトされる。本開示の別の方法では、この一過的にトランスフェクトされた第１の細胞集団は、その後、標的細胞に外来遺伝子を高効率で形質導入するために哺乳動物標的細胞、例えばヒトリンパ球、とともに共培養される。
別の態様では、ヘルパープラスミドは、ウイルスを産生することができる哺乳動物細胞、例えば、ヒト胚性腎細胞、例えば２９３細胞、の第１の集団において安定的に発現される。プラスミドは、細胞のエピソームに維持されているプラスミドに導入される。高力価改変ＡＡＶ含有上清が生成され、改変ＡＡＶは、本明細書において下記で開示される処置方法で使用するためにこの高力価上清から精製されることもあり、またはこの高力価上清中に維持されることもある。
さらなる態様では、組換え発現システムは、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。他の態様では、組換え発現システムは、治療用ポリヌクレオチドをさらに含む。
その内部または外部カプシド表面にＣａｓ９またはその等価物を発現する改変ＡＡＶを産生する方法であって、（ａ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドであって、融合タンパク質がＣａｓ９またはその等価物およびウイルスカプシドタンパク質を含む、プラスミドと（ｂ）ヘルパープラスミドとから本質的になるかまたはなおさらにこれらからなる組換え発現システムを１つまたは複数の細胞にトランスフェクトすることを含む方法も、本明細書で開示される。一部の態様では、方法は、ＶＰ１＋ＶＰ３および、別のリーディングフレーム内に、ＶＰ２−Ｃａｓ９融合タンパク質をコードする（encode for）プラスミドがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３または同様の細胞を含む。加えて、ｇＲＮＡ配列および、必要に応じて、さらなる治療用ポリヌクレオチドを含有する標的化ベクター。別の態様では、方法は、効率的ＡＡＶ産生を可能にするために、アデノウイルス（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６およびＶＡ ＲＮＡ）またはヘルペスウイルス（同じく、数ある他のウイルスの中でも特に）に見られるウイルスヘルパー機能を提供するさらなるヘルパープラスミドの、ＨＥＫまたは同様の細胞への、トランフェクションをさらに含む。ＡＡＶおよびヘルパー遺伝子を、別々のプラスミドとして提供することができ、または必要に応じて複数もしくは単一のプラスミドに組み合わせることができる。別の実施形態では、遺伝子を細胞に安定的に導入して安定したパッキング細胞株を生成することができる。あるいは、大量の必要な遺伝子の増幅、および付着または浮遊増殖細胞への送達のために、バキュロウイルスまたはヘルペスウイルスのようなウイルスベクターを使用して細胞に遺伝子を導入することができる。
その内部または外部カプシド表面にＣａｓ９またはその等価物を発現する、改変ＡＡＶ粒子であって、（ａ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドであって、融合タンパク質がＣａｓ９またはその等価物およびウイルスカプシドタンパク質を含む、プラスミドと（ｂ）ヘルパープラスミドとから本質的になるかまたはなおさらにこれらからなる組換え発現システムを１つまたは複数の細胞にトランスフェクトする方法によって産生される改変ＡＡＶ粒子が、本明細書で開示される。一部の態様では、ＡＡＶ粒子は、ＶＰ２の内部にコンジュゲートされているＣａｓ９またはその等価物を含む。他の態様では、ＡＡＶ粒子は、ＶＰ１またはＶＰ３にコンジュゲートされているＣａｓ９またはその等価物を含む。
本開示は、その内部または外部カプシド表面にＣａｓ９を発現する改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ならびに前記改変ＡＡＶを製造および使用する方法に関する。そのようなものの非限定的な例はもちろん、そのようなものの生物学的等価物の非限定的な例も、本開示で開示される。適する生物学的等価物の非限定的な例としては、様々な要素に対して少なくとも７０％、または代替的に７５％、または代替的に少なくとも８０％、または代替的に少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％の配列同一性を有する、ポリヌクレオチドが挙げられる。
本開示の態様は、Ｃａｓ９に融合されたＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の群から選択されるＡＡＶウイルスタンパク質を含む、Ｃａｓ９をその内部カプシド表面で発現する改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に関する。一部の実施形態では、ＡＡＶウイルスタンパク質は、ＶＰ２である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。さらなる実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号３もしくは配列番号５０で提供されるアミノ酸配列またはそれらの各々の等価物を含む。一部の実施形態では、改変ＡＡＶは、１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、および／またはカプシド内封入する。
本開示のさらなる態様は、そのような改変ＡＡＶの生成のための組換え発現システムに関する。一部の実施形態では、組換え発現システムは、複数のプラスミドを含み、前記多数は、ＡＡＶウイルスタンパク質のすべて、つまりＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。一部の実施形態では、各ウイルスタンパク質は、異なるプラスミドにコードされる。一部の実施形態では、１つまたは複数のウイルスタンパク質は、同じプラスミドにコードされる。一部の実施形態では、少なくとも１つのウイルスタンパク質は、Ｃａｓ９との融合タンパク質としてコードされる。
したがって、本明細書で開示される実施形態は、その内部または外部カプシド表面にＣａｓ９を発現する改変ＡＡＶの生成のための組換え発現システムであって、（ａ）Ｃａｓ９とＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の群から選択されるＡＡＶウイルスタンパク質とを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドと、（ｂ）プラスミド（ａ）の融合タンパク質に含まれていないＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の群から選択される任意のＡＡＶウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドとを含む、組換え発現システムに関する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＶＰ２を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。さらなる実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号３または配列番号５０で提供されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、プラスミド（ａ）は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９またはそれらの各々の等価物をコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、プラスミド（ｂ）は、配列番号１、配列番号４および配列番号５７の群から選択されるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、組換え発現システムは、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドをさらに含む。一部実施形態では、ヘルパープラスミドは、配列番号６で提供されるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、組換え発現は、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドをさらに含む。
本開示の一部の態様は、本明細書で開示される組換え発現システムを使用して改変ＡＡＶを産生する方法に関する。態様は、本明細書で開示される組換え発現システムを１つまたは複数の細胞にトランスフェクトすることにより、その内部または外部プラスミド表面にＣａｓ９を発現する改変ＡＡＶを産生する方法に関する。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
組成物
本開示は、担体と、開示される単離されたポリヌクレオチド、ウイルスベクター、パッケージングシステムおよび組換えウイルスのいずれか１つまたは複数とを含む組成物も提供し、担体も本明細書に記載される。一部の実施形態では、担体は、不活性化合物もしくは組成物（例えば、検出可能な薬剤もしくは標識）または活性化合物もしくは組成物、例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントまたはこれらに類するものを含む。担体は、単独でまたは組合せで１〜９９．９９重量または容量％を構成する、個々にまたは組合せで存在しうる、医薬品賦形剤および添加剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質および炭水化物（例えば、単糖類、二、三、四およびオリゴ糖類；誘導体化された糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖およびこれらに類するもの、ならびに多糖類または糖ポリマーを含む、糖）も含む。例示的タンパク質賦形剤としては、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインおよびこれらに類するものが挙げられる。緩衝能力の点でも機能しうる代表的なアミノ酸／抗体成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム、およびこれらに類するものを含む。炭水化物賦形剤も、本開示の範囲内で意図されており、それらの例としては、単糖類、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースおよびこれらに類するもの；二糖類、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースおよびこれらに類するもの；多糖類、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンおよびこれらに類するもの；ならびにアルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトールが挙げられるが、これらに限定されない。
担体という用語は、緩衝剤またはｐＨ調整剤をさらに含み、通常は、緩衝剤は、有機酸または塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤としては、有機酸塩、例えば、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸もしくはフタル酸の塩；Ｔｒｉｓ、トロメタミン塩酸塩、またはリン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる担体としては、高分子賦形剤／添加剤、例えば、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、シクロデキストリン、例えば、２−ヒドロキシプロピル−．ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ．−シクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、着香剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、ポリソルベート、例えば「ＴＷＥＥＮ ２０」および「ＴＷＥＥＮ ８０」）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、およびキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）が挙げられる。
一部の実施形態では、担体は、薬学的に許容される担体である。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な医薬担体のいずれか、例えば、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、およびエマルジョン、例えば油／水型または水／油型エマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤を包含する。組成物は、安定剤および保存剤および上述の担体のいずれかも含むことができるが、但し、それらがｉｎ ｖｉｖｏでの使用に許容されることをさらなる条件とする。担体、安定剤およびアジュバントの例については、Martin REMINGTON'S PHARM. SCI.、第１５版（Mack Publ. Co., Easton（１９７５年）およびWilliams & Williams、（１９９５年）を、ならびに「PHYSICIAN'S DESK REFERENCE」、第５２版、Medical Economics、Montvale、N.J.（１９９８年）におけるものを、参照されたい。
本開示は、包装材と、必要に応じて水性希釈剤中の、処方された緩衝剤および／または保存薬を伴う少なくとも１つの薬剤または組成物の溶液を含む少なくとも１つのバイアルとを含む製造物品であって、前記包装材が、そのような溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間またはそれより長時間にわたって保持することができることを示すラベルを含む、製造物品も提供する。本開示は、包装材と、少なくとも１つの薬剤または組成物を含む第１のバイアルと、処方された緩衝剤または保存剤の水性希釈剤を含む第２のバイアルとを含む製造物品であって、前記包装材が、治療薬を水性希釈剤で復元して、２４時間またはそれより長時間にわたって保持することができる溶液を形成するように患者に指示するラベルを含む、製造物品をさらに含む。
本開示の製剤は、少なくとも１つの薬剤または組成物と、水性希釈剤中のフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン、（メチル、エチル、プロピル、ブチルおよびこれらに類するもの）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールからなる群から選択される保存剤またはこれらの混合物とを混合することを含む方法により調製することができる。抗体と水性希釈剤中の保存剤とを混合することは、従来の溶解および混合手順を使用して行う。例えば、緩衝溶液中の測定された量の少なくとも１つの抗体を、緩衝溶液中の所望の保存剤と、所望の濃度の抗体および保存剤を得るのに十分な量で、合わせる。この方法の変形形態は、当業者には承知されているであろう。例えば、成分が添加される順序、さらなる添加剤が使用されるかどうか、製剤が調製される温度およびｐＨは、すべて、使用される濃度および投与手段に合わせて最適化することができる因子である。
組成物および製剤を、患者に、透明溶液として提供することができ、または復元される薬剤もしくは組成物のバイアルと、水性希釈剤が入っている第２のバイアルを含む、デュアルバイアルとして、提供することができる。単一の溶液バイアルまたは復元を必要とするデュアルバイアルのどちらかを複数回再使用することができ、そのようなバイアルは、患者の単一または複数の処置サイクルに十分なものでありうるため、現在利用可能な処置レジメンより適便な処置レジメンを提供する。これらの単一バイアルシステムを含む認知されているデバイスとしては、溶液を送達するためのペン型注射器デバイス、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．；ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｅｎｓｏｎ．ｃｏｍで入手可能）、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（Ｂｕｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍで入手可能）；Ｂｉｏｊｅｃｔ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、Ｏｒｅｇｏｎ（ｂｉｏｊｅｃｔ．ｃｏｍで入手可能）；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ；ｗｅｓｔｏｎ−ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍで入手可能）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ Ｃｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．；ｍｅｄｉｊｅｃｔ．ｃｏｍで入手可能）により製造または開発されたような、ＢＤ Ｐｅｎ、ＢＤ Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒｅ、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（登録商標）、ＮｏｖｏＰｅｎ（登録商標）、Ｂ−Ｄ（登録商標）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（登録商標）、およびＯｐｔｉＰｅｎ（登録商標）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎ（登録商標）、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｈｕｍａｔｒｏ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｅｃｏ−Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｏｆｅｒｏｎ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、ｉｊｅｃｔ（登録商標）、Ｊ−ｔｉｐ Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｎｔｒａｊｅｃｔ（登録商標）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ（登録商標）が挙げられる。
送達の方法は、動脈内、筋肉内および静脈内を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、処置を必要とする領域に本開示の医薬組成物および／または細胞を局所的に投与することが望ましいことがあり、これは、例えば、限定としてではなく、外科手術中の局所注入により、注射により、またはカテーテルによって果たすことができる。一部の実施形態では、組成物または細胞は、静脈内注射により投与される。さらなる実施形態では、組成物または細胞は、筋肉内注射により投与される。組成物を単回注射でまたは複数回注射で投与することができる。さらに、それらを、罹患肢の虚血領域に直接注射することもできる。
細胞を含有する溶液は、適する希釈剤、例えば、水、エタノール、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、様々な油、および／またはこれらの混合物、ならびに当業者に公知の他のもので調製することができる。
製剤中の微生物の増殖の防止または阻害は、１つまたは複数の抗菌剤、例えば、クロロブタノール、アスコルビン酸、パラベン、チメロサール（thermerosal）、またはこれらに類するものの添加によって果たすことができる。等張性を変化させる薬剤、例えば、糖または塩を含めることが好ましいこともある。
改変ＡＡＶカプシドおよび粒子
本開示は、特定の実施形態、例えば、その内部または外部カプシド表面にＣａｓ９を発現する改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ならびに改変ＡＡＶを製造するおよび改変ＡＡＶを使用する方法も提供する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、細胞に遺伝子カーゴを効率的に送達するように操作されている複製欠損ウイルスである。それらは、それらのベクター形態では元のウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）のみを有する、非包膜ウイルスである。構造および酵素ＡＡＶタンパク質は、さらなるプラスミドによって「トランスで」供給され、遺伝子送達用の操作されたウイルス粒子を生成するために細胞に一緒にトランスフェクトされる。ＡＡＶは、それらの安全性および効率のため、遺伝子療法に、より具体的にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムで広範に利用されている。ＡＡＶは、様々な細胞に効率的に感染し、感染過程でカプシドは核と結合し、核に侵入し、そこにベクターゲノムが送達される。
ＡＡＶ構造粒子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３で構成される６０個のタンパク質分子から構成される。各粒子は、秩序化されて正二十面体構造になる、おおよそ５個のＶＰ１タンパク質、５個のＶＰ２タンパク質および５０個のＶＰ３タンパク質を含有する。ＡＡＶ２粒子は、カプシド構造内の様々な部位へのペプチドおよびタンパク質の挿入を支持することができることが証明されている。特有のペプチドをカプシドに導入することができることにより、通常は感染させるのが困難でありうる細胞および組織へのウイルスの結合および感染を可能にする、指向性が変化したＡＡＶ粒子が開発されている。加えて、大きなペプチドおよびさらには機能性タンパク質が、様々な成功レベルでＡＡＶ２ベクターのカプシドに導入されている。機能性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、３０ｋＤ ＭＷ）含有ＡＡＶカプシドが生成され、細胞感染を追跡するために使用される感染性ウイルスを産生した。
遺伝子送達用のＡＡＶベクターに伴う制約の１つは、粒子に効率的にパッケージングされうる遺伝子挿入物のサイズ制限である。例えば、野生型ＡＡＶ２ゲノムのサイズは、一本鎖ＤＮＡの４６７９塩基である。Ｃａｓ９の新規のより小さい変異体の１つ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、ＳａＣａｓ９、１３０ｋＤ ＭＷ）であってもそのパッケージングにはコード領域だけでもおおよそ３２５５ｂｐが必要である。構築物に遍在性または組織特異的プロモーターを加えると、さらに５００〜８００ｂｐが加算されうる。ポリＡ付加配列およびＩＴＲについてのさらに５００ｂｐを含めると、ベクターは、ＡＡＶ粒子のパッケージング容量の限界に近い。機能性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子修正を達成するには、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）と標的配列も含めなければならない。このＲＮＡを発現させるには、さらに、最小ｐｏｌＩＩＩプロモーターおよび終結配列が必要である。一部の実施形態では、これらの要素は、互いに組み合わせて効率的にパッケージングされるＡＡＶベクターにするには、大き過ぎる。したがって、一部の実施形態では、Ｃａｓ９構築物およびガイドＲＮＡ発現カセットを別々のベクターにパッケージングすることを選択することができるが、それらが機能性であるためには、両方のウイルスが同じ標的細胞に感染しなければならない。
直接送達ではなく、本出願人は、その内部カプシド表面でＣａｓ９に発現する改変ＡＡＶを産生するためのプラスミドを生成した。細胞に対するＡＡＶの通常の感染過程で、粒子表面は、核局在化配列を含有し、これらの配列がウイルスの核への輸送を方向付ける。核膜孔複合体に結合すると、粒子は、核に侵入し、ベクターゲノムを脱コートする。ＡＡＶカプシドタンパク質は、核内で非常に安定しており、感染後、何週間にもわたってＡＡＶカプシドタンパク質を見いだすことができる。ウイルス粒子の内部カプシド表面にＣａｓ９酵素を発現するようにＡＡＶベクターを操作することにより、粒子内のＣａｓ９ポリヌクレオチドコード領域をパッケージングする必要がなくなり、単一のベクター粒子内のＣａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡ発現カセットの両方の送達が可能になる。一部の態様では、Ｃａｓ９またはその等価物は、配列番号５９のアミノ酸２２８、３５０、４１９、６８４または６８９位でＶＰ２タンパク質に結合される。一部の態様では、Ｃａｓ９またはその等価物は、配列番号３９のアミノ酸９０、２１３、２８２、５４７または５５２位でＶＰ２タンパク質に結合される。
本開示の態様は、その内部または外部表面にＣａｓ９を発現する改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、Ｃａｓ９に融合されたＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の群から選択されるＡＡＶウイルスタンパク質を含むＡＡＶに関する。一部の実施形態では、ＡＡＶウイルスタンパク質は、ＶＰ２である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。さらなる実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号３、配列番号５０またはそれらの各々の等価物で提供されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、改変ＡＡＶは、１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、および／またはカプシド内封入する。特定の遺伝子、必要に応じて、疾患、障害または状態に関連する遺伝子、を標的とするために標的特異性のためのｇＲＮＡを生成することができることは、当業者には理解される。したがって、Ｃａｓ９との組合せで、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの標的特異性を助長する。
本開示のさらなる態様は、そのような改変ＡＡＶの生成のための組換え発現システムに関する。一部の実施形態では、組換え発現システムは、複数のプラスミドを含み、前記多数は、ＡＡＶウイルスタンパク質のすべて、つまりＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。一部の実施形態では、各ウイルスタンパク質は、異なるプラスミドにコードされる。一部の実施形態では、１つまたは複数のウイルスタンパク質は、同じプラスミドにコードされる。一部の実施形態では、少なくとも１つのウイルスタンパク質は、Ｃａｓ９との融合タンパク質としてコードされる。
したがって、本明細書で開示される実施形態は、その内部または外部カプシド表面にＣａｓ９を発現する改変ＡＡＶの生成のための組換え発現システムであって、（ａ）Ｃａｓ９とＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の群から選択されるＡＡＶウイルスタンパク質とを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドと、（ｂ）プラスミド（ａ）の融合タンパク質に含まれていないＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の群から選択される任意のＡＡＶウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドとを含む、組換え発現システムに関する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＶＰ２を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。さらなる実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号３、配列番号５０またはそれらの各々の等価物で提供されるアミノ酸配列を含む。Ｃａｓ９がウイルスカプシドタンパク質の内部表面にコンジュゲートされている実施形態では、プラスミド（ａ）は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９またはそれらの各々の等価物をコードするＤＮＡ配列を含む。Ｃａｓ９がウイルスカプシドタンパク質の外部表面にコンジュゲートされている一部の実施形態では、プラスミド（ａ）は、配列番号２または配列番号５をコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、プラスミド（ｂ）は、配列番号１、配列番号４または配列番号５７の群から選択されるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、組換え発現システムは、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドをさらに含む。一部の実施形態では、ヘルパープラスミドは、配列番号６で提供されるＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、組換え発現は、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドをさらに含む。
一部の態様は、本明細書で開示される組換え発現システムを使用して改変ＡＡＶを産生する方法に関する。態様は、本明細書で開示される組換え発現システムを１つまたは複数の細胞にトランスフェクトすることにより、その内部または外部カプシド表面にＣａｓ９を発現する改変ＡＡＶを産生する方法に関する。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
なおさらなる態様は、疾患、障害または状態を有する対象を処置する方法であって、本明細書で開示される改変ＡＡＶを対象に投与することを含む方法に関する。一部の実施形態では、疾患、障害または状態は、血友病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、アルファ１アンチトリプシン、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、脊髄性筋萎縮症、嚢胞性線維症、ＨＩＶ、サラセミア、コロイデレミア、パーキンソン病、レーベル先天黒内障、黄斑変性、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ欠損症、１色覚、クリグラー・ナジャー症候群、ポンペ病、Ｘ染色体連鎖性網膜分離症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、バッテン病、網膜変性、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、ムコ多糖症（Ｉ〜ＩＸ）、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の群から選択される。一部の実施形態では、血友病は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子欠損症の１つまたは複数を特徴とする。一部の実施形態では、筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィーおよび眼咽頭筋型筋ジストロフィーから選択される。
改変ウイルス粒子を投与する方法
ウイルスカプシドタンパク質の内部表面、内部に向いているドメインまたは内部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質を有する非ヒトトランスジェニック動物が、本明細書で開示される。改変カプシドを含むか、または代替的にそれから本質的になる、改変または組換えウイルス粒子を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面、内部に向いているドメインまたは内部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質と、カプシド内にカプシド内封入されている１つもしくは複数のポリヌクレオチドとを、改変カプシドが含む、非ヒトトランスジェニック動物も、本明細書で提供される。
遺伝子編集の方法であって、方法が、改変カプシドを含むかまたは代替的に改変カプシドから本質的になる組換えウイルス粒子と、細胞を接触させることを含み、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面、内部に向いているドメインまたは内部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質と、カプシド内にカプシド内封入されている１つもしくは複数のポリヌクレオチドとを、改変カプシドが含む、方法が、本明細書で開示される。一部の態様では、接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。他の態様では、接触は、ｉｎ ｖｉｖｏである。一部の態様では、接触は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏである。一部の態様では、ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一態様では、ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、治療用ポリペプチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。
それを必要とする対象における遺伝子編集の方法であって、方法が、改変カプシドを含むかまたは代替的に改変カプシドから本質的になる有効量組換えウイルス粒子を対象に投与することを含み、ウイルスカプシドタンパク質の内部表面、内部に向いているドメインまたは内部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質と、カプシド内にカプシド内封入されている１つもしくは複数のポリヌクレオチドとを、改変カプシドが含む、方法が、本明細書でさらに開示される。一部の態様では、ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一部の態様では、ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、治療用ポリペプチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。
ウイルスカプシドタンパク質の外部表面、外部に向いているドメインまたは外部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質を有する非ヒトトランスジェニック動物が、本明細書で提供される。改変カプシドを含むまたは代替的に改変カプシドから本質的になる改変または組換えウイルス粒子を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、ウイルスカプシドタンパク質の外部表面、外部に向いているドメインまたは外部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質と、カプシド内にカプシド内封入されている１つもしくは複数のポリヌクレオチドとを、改変カプシドが含む、非ヒトトランスジェニック動物も、本明細書で提供される。
遺伝子編集の方法であって、方法が、改変カプシドを含むかまたは代替的に改変カプシドから本質的になるか組換えウイルス粒子と、細胞を接触させることを含み、ウイルスカプシドタンパク質の外部表面、外部に向いているドメインまたは外部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質と、カプシド内にカプシド内封入されている１つもしくは複数のポリヌクレオチドとを、改変カプシドが含む、方法が、本明細書で開示される。一部の態様では、接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。他の態様では、接触は、ｉｎ ｖｉｖｏである。一部の態様では、接触は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏである。一部の態様では、ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一態様では、ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、治療用ポリペプチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って編集または接触された、１つもしくは複数の単離された細胞または単離された細胞の拡張集団は、それを必要とする対象に投与される。一部の実施形態では、細胞は、対象にとって自己である。他の実施形態では、細胞は、対象にとって同種異系である。一部の実施形態では、細胞または細胞集団の有効量が対象に投与される。ある特定の実施形態では、約１〜１，０００，０００，０００個の細胞が、本明細書に記載される方法で対象に投与される。あるいは、約１〜９００，０００，０００個の細胞、約１〜８００，０００，０００個の細胞、約１〜７００，０００，０００個の細胞、約１〜６００，０００，０００個の細胞、約１〜５００，０００，０００個の細胞、約１〜４００，０００，０００個の細胞、約１〜３００，０００，０００個の細胞、約１〜２００，０００，０００個の細胞、約１〜１００，０００，０００個の細胞、約１０〜９００，０００，０００個の細胞、約１０〜８００，０００，０００個の細胞、約１０〜７００，０００，０００個の細胞、約１０〜６００，０００，０００個の細胞、約１０〜５００，０００，０００個の細胞、約１０〜４００，０００，０００個の細胞、約１０〜３００，０００，０００個の細胞、約１０〜２００，０００，０００個の細胞、約１０〜１００，０００，０００個の細胞、３０〜９００，０００，０００個の細胞、約３０〜８００，０００，０００個の細胞、約３０〜７００，０００，０００個の細胞、約３０〜６００，０００，０００個の細胞、約３０〜５００，０００，０００個の細胞、約３０〜４００，０００，０００個の細胞、約３０〜３００，０００，０００個の細胞、約３０〜２００，０００，０００個の細胞、約３０〜１００，０００，０００個の細胞、約５０〜９００，０００，０００個の細胞、約５０〜８００，０００，０００個の細胞、約５０〜７００，０００，０００個の細胞、約５０〜６００，０００，０００個の細胞、約５０〜５００，０００，０００個の細胞、約５０〜４００，０００，０００個の細胞、約５０〜３００，０００，０００個の細胞、約５０〜２００，０００，０００個の細胞、約５０〜１５０，０００，０００個の細胞、約５０〜１００，０００，０００個の細胞、１００〜９００，０００，０００個の細胞、約１００〜８００，０００，０００個の細胞、約１００〜７００，０００，０００個の細胞、約１００〜６００，０００，０００個の細胞、約１００〜５００，０００，０００個の細胞、約１００〜４００，０００，０００個の細胞、約１００〜３００，０００，０００個の細胞、または約１００〜２００，０００，０００個の細胞が、本明細書に記載される方法で対象に投与される。
それを必要とする対象における遺伝子編集の方法であって、方法が、改変カプシドを含むかまたは代替的に改変カプシドから本質的になる有効量組換えウイルス粒子を対象に投与することを含み、ウイルスカプシドタンパク質の外部表面、外部に向いているドメインまたは外部に向いている末端部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質もしくはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる改変ウイルスカプシドタンパク質と、カプシド内にカプシド内封入されている１つもしくは複数のポリヌクレオチドとを、改変カプシドが含む、方法が、本明細書でさらに開示される。一部の態様では、ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一態様では、ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、治療用ポリペプチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。
一部の態様では、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む融合ポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むポリヌクレオチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはなおさらにそれからなる。一態様では、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８またはその等価物を含むか、またはそれからなる。一部の態様では、ｇＲＮＡは、それを必要とする対象における遺伝子編集を必要とするＤＮＡの領域に特異的である。
一部の態様では、治療用ポリヌクレオチドをさらに含む組換えウイルス粒子。治療用ポリヌクレオチドは、編集を必要とするＤＮＡ配列を標的とするために使用することができる、編集を必要とするＤＮＡ配列のための修復鋳型を提供するために使用することができる、または編集を必要とするＤＮＡ配列の置換物を提供するために使用することができる、任意のポリペプチドである。さらなる態様では、治療用ポリペプチドは、それを必要とする対象における編集を必要とする遺伝子の野生型配列を含む。
なおさらなる態様は、疾患、障害または状態を有する対象を処置する方法であって、本明細書で開示される改変ＡＡＶを対象に投与することを含む方法に関する。一部の態様では、疾患、障害または状態は、血友病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、アルファ１アンチトリプシン、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、脊髄性筋萎縮症、嚢胞性線維症、ＨＩＶ、サラセミア、コロイデレミア、パーキンソン病、レーベル先天黒内障、黄斑変性、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ欠損症、１色覚、クリグラー・ナジャー症候群、ポンペ病、Ｘ染色体連鎖性網膜分離症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、バッテン病、網膜変性、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、ムコ多糖症（Ｉ〜ＩＸ）、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の群から選択される。一態様では、血友病は、第ＶＩＩＩ因子欠損症または第ＩＸ因子欠損症のうちの１つまたは複数を特徴とする。一部の態様では、筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィーおよび眼咽頭筋型筋ジストロフィーから選択される。
一部の態様では、ガイドＲＮＡおよび／または治療用ポリヌクレオチドは、血友病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、アルファ１アンチトリプシン、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、脊髄性筋萎縮症、嚢胞性線維症、ＨＩＶ、サラセミア、コロイデレミア、パーキンソン病、レーベル先天黒内障、黄斑変性、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ欠損症、１色覚、クリグラー・ナジャー症候群、ポンペ病、Ｘ染色体連鎖性網膜分離症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、バッテン病、網膜変性、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、ムコ多糖症（Ｉ〜ＩＸ）、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の群から選択される疾患、障害または状態を処置するために、設計および／または選択される。一態様では、血友病は、第ＶＩＩＩ因子欠損症または第ＩＸ因子欠損症のうちの１つまたは複数を特徴とする。一部の態様では、筋ジストロフィーは、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィーおよび眼咽頭筋型筋ジストロフィーから選択される。
一部の態様では、ガイドＲＮＡおよび／または治療用ポリヌクレオチドは、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８、ＮＭ＿０００１３２、ＮＭ＿０１９８６３）、第ＩＸ因子（Ｆ９、ＮＭ＿０００１３３、ＮＭ＿００１３１３９１３）、ジストロフィン（ＤＭＤ、ＮＭ＿０００１０９、ＮＭ＿００４００６、ＮＭ＿００４００７、ＮＭ＿００４００９、ＮＭ＿００４０１０）、ジスフェリン（ＤＹＳＦ、ＮＭ＿００１１３０４５５、ＮＭ＿００１１３０９７６、ＮＭ＿００１１３０９７７、ＮＭ＿００１１３０９７８、ＮＭ＿００１１３０９７９）、エメリン（ＥＭＤ、ＮＭ＿０００１１７）、ラミンＡ／Ｃ（ＬＭＮＡ、ＮＭ＿００１２５７３７４、ＮＭ＿００１２８２６２４、ＮＭ＿００１２８２６２５、ＮＭ＿００１２８２６２６、ＮＭ＿００５５７２）、ダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４、ＮＭ＿００１２０５２１８、ＮＭ＿００１２７８０５６、ＮＭ＿００１２９３７９８、ＮＭ＿００１３０６０６８）、ミオトニンプロテインキナーゼ（ＭＤＰＫ、ＮＭ＿００１０８１５６０、ＮＭ＿００１０８１５６２、ＮＭ＿００１０８１５６３、ＮＭ＿００１２８８７６４、ＮＭ＿００１２８８７６５）、細胞核酸結合タンパク質（ＣＮＢＰ、ＮＭ＿００３４１８、ＮＭ＿００１１２７１９２、ＮＭ＿００１１２７１９３、ＮＭ＿００１１２７１９４、ＮＭ＿００１１２７１９５）、ポリアデニル化−結合タンパク質−２（ＰＡＢＰ−２、ＮＭ＿００４６４３）、アルファ１アンチトリプシン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１、ＮＭ＿０００４５４）、アルシン（ＡＬＳ２、ＮＭ＿００１１３５７４５、ＮＭ＿０２０９１９）、ヘリカーゼセナタキシン（ＳＥＴＸ、ＮＭ＿０１５０４６）、スパタクシン（ＳＰＧ１１、ＮＭ＿００１１６０２２７、ＮＭ＿０２５１３７）、ＲＮＡ結合タンパク質ＦＵＳ／ＴＬＳ（ＦＵＳ、ＮＭ＿００１０１０８５０、ＮＭ＿００１１７０６３４、ＮＭ＿００１１７０９３７、ＮＭ＿００４９６０）、小胞結合膜タンパク質結合タンパク質Ｂ／Ｃ（ＶＡＰＢ、ＮＭ＿００１１９５６７７、ＮＭ＿００４７３８）、アンジオゲニン（ＡＮＧ、ＮＭ＿００１１４５、ＮＭ＿００１０９７５７７）、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＡＲＤＢＰ、ＮＭ＿００７３７５）、ポリホスホイノシチドホスファターゼ（ＦＩＧ４、ＮＭ＿０１４８４５）、オプチニューリン（ＯＰＴＮ、ＮＭ＿００１００８２１１、ＮＭ＿００１００８２１２、ＮＭ＿００１００８２１３、ＮＭ＿０２１９８０）、アタキシン−２（ＡＴＸＮ２、ＮＰ＿００１２９７０５０、ＮＰ＿００１２９７０５２、ＮＰ＿００２９６４）、バロシン含有タンパク質（ＶＣＰ、ＮＭ＿００７１２６）、ユビキリン−２（ＵＢＱＬＮ２、ＮＭ＿０１３４４４）、シグマ１受容体（ＳＩＧＭＡＲ１、ＮＭ＿００１２８２２０５、ＮＭ＿００１２８２２０６、ＮＭ＿００１２８２２０７、ＮＭ＿００１２８２２０８、ＮＭ＿００１２８２２０９）、荷電多小胞体タンパク質２ｂ（ＣＨＭＰ２Ｂ、ＮＭ＿００１２４４６４４、ＮＭ＿０１４０４３）、プロフィリン−１（ＰＦＮ１、ＮＭ＿００５０２２）、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ−４（ＥＲＢＢ４、ＮＭ＿００１０４２５９９、ＮＭ＿００５２３５）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ａ１（ＨＮＲＮＰＡ１、ＮＭ＿００２１３６、ＮＭ＿０３１１５７）、マトリン−３（ＭＡＴＲ３、ＮＭ＿１９９１８９、ＮＭ＿００１１９４９５４、ＮＭ＿００１１９４９５５、ＮＭ＿００１１９４９５６、ＮＭ＿００１２８２２７８）、チューブリンアルファ４Ａ鎖（ＴＵＢＡ４Ａ、ＮＭ＿００１２７８５５２、ＮＭ＿００６０００）、９番染色体オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ｏｒｆ７２、ＮＭ＿１４５００５、ＮＭ＿００１２５６０５４、ＮＭ＿０１８３２５）、ＣＨＣＤ１０、ＳＱＳＴＭ１（ＮＭ＿００１１４２２９８）、ＴＢＫ１、アポリポタンパク質Ｅ（ＮＭ＿００１３０２６９１、ＮＭ＿００００４１、ＮＭ＿００１３０２６８８、ＮＭ＿００１３０２６８９、ＮＭ＿００１３０２６９０）、ＳＭＮ１（ＮＭ＿０００３４４）、ＳＭＮ２（ＮＭ＿０１７４１１、ＮＭ＿０２２８７５、ＮＭ＿０２２８７６、ＮＭ＿０２２８７７）、ＣＴＦＲ（ＮＭ＿０００４９２）、ベータブロビンＨＢＢ ＰＤＢ、ＣＨＭ、アルファシヌクレイン（ＳＮＣＡ、ＮＭ＿０００３４５）、パーキン（ＰＲＫＮ、ＮＭ＿００４５６２）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２もしくはダルダリン、ＮＭ＿１９８５７８）、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１、ＮＭ＿０３２４０９）、ＤＪ−１（ＮＭ＿００１１２３３７７）、酸性マルターゼ（ＮＭ＿０００１５２）、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ１（ＮＭ＿０００４６３）、ＰＰＴ−１（ＮＭ＿０００３１０）、またはＡＴＰ１３Ａ２（ＮＭ＿００１１４１９７３）の群から選択される遺伝子を標的化または修復するために、設計および／または選択される。
本開示のさらなる態様は、本明細書で開示される実施形態で説明される、担体と改変ウイルスとを含む組成物に関する。
本明細書に記載されるように、本開示の医薬組成物は、本明細書に記載されるようなその内部または外部カプシド表面にＣａｓ９を発現する改変ウイルス粒子を、１つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含みうる。そのような組成物は、緩衝剤、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水およびこれらに類するもの；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含みうる。本開示の組成物を経口、静脈内、局所、腸内および／または非経口投与用に製剤化することができる。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、静脈内投与用に製剤化される。
ｇＲＮＡを、標的特異性のために、特定の遺伝子、必要に応じて、疾患、障害または状態に関連する遺伝子、を標的とするように生成することができることは、当業者には理解される。したがって、Ｃａｓ９との組合せで、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの標的特異性を助長する。上で論じたようなさらなる態様、例えばプロモーターの選択、例えば、特定の器官または組織における発現を助長するポリヌクレオチドをコードするガイドＲＮＡのためのプロモーターの選択は、標的特異性を達成するさらなる機構をもたらしうる。したがって、特定の疾患、障害または状態に適するｇＲＮＡの選択が、本明細書において企図される。
改変ＡＡＶまたは組成物の投与を、１用量として、または処置の過程を通して連続的もしくは間欠的に投与することができる。投与は、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、くも膜下腔内、脳室下、硬膜外、脳内、脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、眼内、腹腔内、子宮内、皮内、皮下、経皮、経粘膜、および吸入を含むがこれらに限定されない、いずれの適する投与方法によってもよい。
投与の最も有効な手段および投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、および処置される対象によって変わることになる。主治医により選択される用量レベルおよびパターンを用いて、単回または複数回投与を行うことができる。投薬量が投与経路による影響を受けうることに留意される。適切な投薬量製剤、および薬剤の投与方法は、当技術分野で公知である。そのような適する投薬量の非限定的な例は、１投与あたり最低１Ｅ＋９ベクターゲノム〜最大１Ｅ＋１７ベクターゲノムでありうる。
本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、対象範囲に投与されるアデノウイルス粒子の数は、約１０９〜約１０１７の範囲である。特定の実施形態では、約１０１０〜約１０１２個、約１０１１〜約１０１３個、約１０１１〜約１０１２個、約１０１１〜約１０１４個、約５×１０１１〜約５×１０１２、または約１０１２〜約１０１３個のアデノウイルス粒子が、対象に投与される。
さらなる態様では、本開示の改変ウイルス粒子および組成物を、他の処置、例えば、特定の疾患、障害または状態に適する認可されている処置、と組み合わせて投与することができる。非限定的な例としては、改変ウイルス粒子と１つまたは複数のステロイドとの組合せでの筋ジストロフィーの処置が挙げられる。
本開示の改変ウイルス粒子または組成物のこの投与を行って、実験およびスクリーニングアッセイのための所望の疾患、障害または状態の動物モデルを生成することができる。
次のうちの１つまたは複数が検出されたとき、処置および／または修復成功と判定される：処置された対象の疾患、障害または状態の症状の１つまたは複数についての軽減または改善；対象の疾患、障害または状態の程度の低下；疾患、障害または状態の現状の安定化（すなわち、悪化しないこと）；疾患、障害または状態の進行の遅延または緩徐化；および疾患、障害または状態の改善または緩和。一部の実施形態では、処置の成功は、対象から単離された１つまたは複数の細胞、組織または器官において修復された標的ポリヌクレオチドの存在を検出することにより判定される。一部の実施形態では、処置の成功は、対象から単離された１つまたは複数の細胞、組織または器官において修復されたポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドの存在を検出することにより判定される。
一部の実施形態では、うまく処置された細胞、組織、器官または対象における修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、未修復の標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する比は、約１．５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１０００：１、約１０，０００：１、約１００，０００：１、または約１，０００，０００：１である。修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量または比は、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＰＣＲ、シークエンシング、質量分析、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査、免疫蛍光検査、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、次世代シークエンシング、免疫ブロットおよびＥＬＩＳＡを含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の方法により決定することができる。
キット
一部の実施形態では、前記本明細書に記載される薬剤を集めて、治療、診断または研究応用でのそれらの使用を助長するための医薬キットまたは診断キットまたは研究キットにすることができる。一部の実施形態では、本開示のキットは、次のうちの１つまたは複数を含む：本明細書に記載の、改変ウイルスカプシドタンパク質、単離されたポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、組換えウイルス粒子、組換え発現システム、改変ＡＡＶ、改変細胞、単離された組織、組成物、または医薬組成物。
一部の実施形態では、キットは、使用指示書をさらに含む。具体的には、そのようなキットは、本明細書に記載される１つまたは複数の薬剤を、これらの薬剤の所期の応用および適正な使用を説明する指示書とともに含みうる。一例として、一実施形態では、キットは、そのキットの１つもしくは複数の成分の混合、ならびに／または試料の単離および混合、ならびに対象への適用についての指示書を含みうる。ある特定の実施形態では、キット内の薬剤は、特定の応用におよび薬剤の投与方法に適する医薬製剤および投薬量でのものである。研究目的のキットは、様々な実験を実行するために適切な濃度または量の成分を含有しうる。
本明細書に記載される方法の使用を助長するようにキットを設計することができ、キットは、多くの形態をとることができる。キットの組成物の各々を、適用可能な場合、液体形態で（例えば、溶液で）または固体形態（例えば乾燥粉末）で備えることができる。特定の場合、組成物の一部は、例えば、そのキットに備えられていることもあり、備えられていないこともある、適する溶媒または他の種（例えば、水もしくは細胞培養培地）の添加によって（例えば、活性形態に）構成可能または別様に加工可能でありうる。一部の実施形態では、保存溶液（例えば、凍結保存溶液）中の組成物を備えることができる。保存溶液の非限定的な例としては、ＤＭＳＯ、パラホルムアルデヒド、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）が挙げられる。一部の実施形態では、保存溶液は、メタロプロテアーゼ阻害剤の量を含有する。
本明細書で使用される場合、「指示（書）」は、指示および／または推奨の要素を規定することができ、通常は、本請求項記載の方法または組成物についての書面での指示を包装の上に、または包装に付随する形で含む。指示書は、指示がキットに関連しうることを使用者が明確に理解するようにあらゆる様式で、例えば、オーディオビジュアル（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、および／またはウェブベースの通信などで、提供される、あらゆる口頭または電子的指示も含むことができる。一部の実施形態では、書面での指示は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を監督する政府機関によって命じられた形式であり、動物への投与のための製造、使用または販売についての前記機関による承認を示すこともある。
一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数の容器に入っている、本明細書に記載される要素のいずれか１つまたは複数を含有する。したがって、一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される薬剤を収容する容器を含むことがある。薬剤は、液体、ゲルまたは固体（例えば粉末）の形態でありうる。薬剤は、無菌調製され、注射器に包装され、凍結状態で出荷されることもある。あるいは、薬剤は、保存用のバイアルまたは他の容器に収容されることもある。第２の容器が、滅菌調製された他の薬剤を有することもある。あるいは、キットは、予混され、注射器、バイアル、チューブまたは他の容器に入れて出荷される、活性薬剤を含むこともある。キットは、注射器、局所適用デバイス、またはＩＶ針チュービングおよびバッグなどの、対象に薬剤を投与するために必要な要素の１つもしくは複数またはすべてを有することができる。
本明細書に記載の治療剤を、治療のための患者を同定および選択するための適切な診断手法と、組み合わせることができる。例えば、筋ジストロフィー遺伝子の突然変異を同定するための遺伝子検査を施すことができる。そのようにして、突然変異を保有する患者を治療に適すると同定することができる。
以下の実施例は、非限定的であり、本開示を実施する際の様々な場合に使用することができる手順の説明に役立つ。加えて、本明細書で開示するすべての参考文献は、それら全体が参照により組み入れられる。
理論により拘束されないが、本明細書で開示する方法および組成物の使用は、正常なウイルス指向性を維持しつつ、Ｃａｓ９またはその等価物をＡＡＶ粒子の安定した要素として一過的に送達することを可能にすると予想される。理論により拘束されないが、Ｃａｓ９またはその等価物の内部配置は、立体障害、プロテアーゼ分解ならびに免疫認識および／または応答のリスクを低下させることになると、さらに予想される。加えて、開示する方法および組成物は、カプシド内封入されるポリヌクレオチドのサイズ制約が改善された、機能性Ｃａｓ９またはその等価物の効率的な標的化された送達を可能にする。
（実施例１）
Ｃａｓ９が外部表面に発現されるＡＡＶ粒子の生成
本出願人は、図１に提供するスキームに従って２つのプラスミドを構築した。これらのプラスミドの配列を、ＶＰ１（配列番号３７）およびＶＰ３（配列番号３８）のタンパク質をコードする配列番号１として、ならびにＣａｓ９−ＶＰ２融合体（配列番号３６）のタンパク質をコードする配列番号２または配列番号５として、提供する。本出願人は、図２および９に提供するスキームに従ってさらなるプラスミドを構築した。これらのプラスミドの配列を、ＶＰ１およびＶＰ３をコードする配列番号４、Ｖｐ２−Ｃａｓ９融合体をコードする配列番号２、ＯＬＬＡＳエピトープタグを有するＶｐ２−Ｃａｓ９融合体をコードする配列番号５、ヘルパープラスミドをコードする配列番号６、レポーター（ルシフェラーゼ）をコードする配列番号７、およびｇＲＮＡをコードする配列番号８として提供する。ＶＰ１配列の非限定的な例としては、配列番号３７、配列番号１の番号５０３７〜７２５３が付与されたＤＮＡ塩基対、配列番号４の番号５０３７〜７２５３が付与された塩基対、およびそれらの各々の等価物が挙げられる。ＶＰ２配列の非限定的な例としては、配列番号３９、配列番号５の番号８７８６〜１０５７４が付与された塩基対、およびそれらの各々の等価物が挙げられる。ＶＰ３配列の非限定的な例としては、配列番号３８、配列番号１の番号５６４６〜７２５３が付与された塩基対、配列番号１の番号５６４６〜７２５３が付与された塩基対、およびそれらの各々の等価物が挙げられる。Ｃａｓ９−ＶＰ２融合配列の非限定的な例としては、配列番号３６、配列番号５の番号５５３２〜１０７４が付与された塩基対、配列番号２の番号５５３２〜１０５６５が付与された塩基対、およびそれらの各々の等価物が挙げられる。
ＨＥＫ２９３細胞に、ＶＰ１＋ＶＰ３および、別のプラスミドに、Ｃａｓ９−ＶＰ２融合タンパク質（例えば、配列番号１および配列番号２）をコードする（encode for）プラスミドを、トランスフェクトする。加えて、ガイドＲＮＡ配列と、必要に応じて、ＤＮＡ修復鋳型または遺伝子改変に必要な他のＤＮＡ配列をコードするさらなる治療用ポリペプチドとを含有する標的化ベクターも、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトまたはコトランスフェクトする（例えば、配列番号８）。効率的ＡＡＶ産生を可能にするために、アデノウイルス（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６およびＶＡ ＲＮＡ）またはヘルペスウイルス（同じく、数ある他のウイルスの中でも特に）に見られるウイルスヘルパー機能を提供するさらなるプラスミドを、トランスフェクトまたはコトランスフェクトすることができる。あるいは、ＡＡＶおよびヘルパー遺伝子を、別々のプラスミドとして提供することができ、または必要に応じて複数もしくは単一のプラスミドに組み合わせることができる。あるいは、遺伝子を細胞に安定的に導入して安定したパッキング細胞株を生成することができる。あるいは、大量の必要な遺伝子の増幅、および付着または浮遊増殖細胞への送達のために、バキュロウイルスまたはヘルペスウイルスのようなウイルスベクターを使用して細胞に遺伝子を導入することもできる。
トランスフェクションのために、浮遊適応ＨＥＫ２９３細胞を無血清２９３Ｅｘｐｉ培地で細胞５Ｅ＋６個／ｍＬの濃度まで増殖させる。標準的なトランスフェクション方法を使用してポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、上記のプラスミド（例えば、ｐＡＡＶｒｈ７４−Ｃａｓ９−ＶＰ２、ｐＡＡＶｒｈ７４−ＶＰ１−３、ｐＨＥＬＰおよびｓｃＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌｕｃ２Ｐｖ２プラスミド）を細胞にトランスフェクトする。簡単に説明すると、プラスミドＤＮＡを、別途、Ｏｐｔｉ−ｍｅｍ培地と混合し、ＰＥＩを、別途、Ｏｐｔｉ−ｍｅｍと混合する。希釈されたＤＮＡおよびＰＥＩ混合物を合わせ、短時間、ボルテックスし、複合体形成のために室温で１０分間、放置する。その後、トランスフェクション混合物を細胞に添加し、細胞を加湿インキュベーターにおいて１３５ｒｐｍおよび３７度で振盪フラスコ内でインキュベートする。トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３細胞を培養して、ウイルス粒子を含有する上清を生成する。トランスフェクションの４日後、０．４５マイクロメートルフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）での深層濾過を使用して培地からウイルスを回収し、１００ｋＤ ＭＷＣＯ回転濃縮器（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して濃縮し、イオジキサノール勾配（１５〜５７％）超遠心分離（６８，０００ｒｐｍ、１８度、１時間）およびカラムクロマトグラフィー（ＧＥ）により精製する。
意図したタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ３、およびＣａｓ９−ＶＰ２融合体）の発現を同定するために、ウェスタンブロットを行う。ｒＡＡＶ画分および最終試料中のウイルス粒子の定性分析、および純度の決定のためにも、ウェスタンブロットを行う。簡単に説明すると、ＢＯＬＴ ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル法を行う。先ず、ウイルス上清の試料を、１．５ｍＬ ｅｐｐチューブ中で、１μｌのＢｏｌｔ ＤＴＴ還元剤、２．５μｌのＢｏｌｔ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ ４×ローディングダイ、および６．５μｌの試料を各チューブに添加し、ピペットで吸い上げ、吐き出して混合することにより、調製する。次に、９５℃に設定したヒートブロックに１０分間、チューブを入れることにより、試料を変性させる。Ｍｉｎｉ Ｇｅｌ Ｔａｎｋ電気泳動システムを、タンクにカセットを配置することにより組立て、電極が反対側にあることを確認する。コームとテープを１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで取り除く。２０ｍＬのＢｌｏｔ ＭＯＰＳ ＳＤＳ ２０×ランニングバッファーを３８０ｍＬのｄＨ２Ｏに添加することにより、１×ＭＯＰＳ ＳＤＳランニングバッファー。試料を１０分間加熱した後、チューブを氷上で１分間冷却し、そしてその後、遠心分離して一切の凝縮を取り除く。１０μｌの変性試料を各ウェルに添加する。１０μｌの標準ラダー、例えば１×Ｍａｒｋ １２標準、をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの最後のウェルに添加する。ゲルを１６５ボルト、５００ｍＡ（一定）で４５分間泳動させる。１００ｍＬの７．５％酢酸および１０μｌのＳＹＰＲＯオレンジをゲル染色ボックスに添加することにより染色溶液を調製し、６０ｒｐｍに設定したロッカーを用いて室温で１時間、ゲルを染色する。ゲルを振盪したら、７．５％酢酸を交換し、７５ｍＬの新たな７．５％酢酸で５〜１０分間、ゲルを染色して、残留物をゲルから洗い流す。イメージングシステムを使用して、ゲルの画像を取り込む。組換えウイルスシステムの適切な発現は、発現されるウイルスタンパク質の予測サイズに対応するバンドを検出することにより示される。例えば、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、それぞれ、おおよそ８７、７２および６２ｋＤａである。ｓａＣａｓ９は、おおよそ１２７ｋＤａである。ＶＰ２−Ｃａｓ９融合タンパク質は、おおよそ１９３ｋＤａのサイズである。
（実施例２）
筋ジストロフィーの修正のための実験的システム
この実施例では、プラスミドを使用して、１）ＡＡＶ構造および酵素タンパク質をコードする遺伝子、２）アデノウイルスヘルパータンパク質およびＲＮＡをコードする遺伝子、および３）ＡＡＶ粒子にパッケージングされるベクターゲノムを、供給する。１９番染色体に安定的に組み込まれたアデノウイルス５のヌクレオチド１〜４３４４を有し、Ａｄタンパク質Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する、ＨＥＫ２９３細胞に、これら３つのプラスミドを通常どおりトランスフェクトする。次いで、トランスフェクションの数日後にウイルスを細胞から収集し、超遠心分離、クロマトグラフィーまたは類似の方法の組合せにより精製する。通常は、３つすべてのウイルスカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３（それぞれ、おおよそ８７、７２および６２ｋＤａである、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）は、単一の遺伝子から産生され、コード領域の有意な重複を有する。大きなタンパク質挿入が必要ＶＰ１タンパク質の産生を妨げるのを防止するために、本出願人らは、遺伝子を２つの別々のプラスミド上に分離した。第１のプラスミドは、正常ＶＰ１およびＶＰ３タンパク質をコードし、その一方で、ＡＣＧを開始コドンとして通常は使用するＶＰ２を、ＧＣＧに改変した。通常の開始コドンの３’側の追加の代替開始コドンも、切断型ＶＰ２産物の産生を防止するように改変した。第２のプラスミドは、ＶＰ１およびＶＰ３の開始コドンをＡＴＧからＣＴＧに突然変異させ、ＶＰ２の開始コドンをＡＣＧからＡＴＧに変化させた。制限部位もＶＰ２と同じリーティングフレーム内のＳａＣａｓ９に付加した。リンカー領域として役立つＯＬＬＡＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＯｍｐＦリンカーとマウスランゲリンの融合配列）エピトープタグ、および感受性検出ペプチド配列とともに、遺伝子を、ＶＰ２発現プラスミドにサブクローニングした。この実施例には、以前に示された筋細胞指向性に基づいて筋特異的遺伝子編集の血清型としてＡＡＶｒｈ７４を選択したが、ＡＡＶ９は、適する代替物である。
カプシド発現プラスミドのＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション後、ウイルスを精製し、ウェスタンブロットで泳動させ（図１５）、抗ＡＡＶ抗体Ｂ１（図１５Ａ）または抗ＯＬＬＡＳ抗体（図１５Ｂ）のどちらかで探索した。図１５Ａは、両方のレーンに予想どおり大量に存在するＶＰ３バンドと、ＶＰ２が過剰発現されたときに見られることが多いかすかなＶＰ１バンド（図１５Ａ、ＡＡＶ対照レーンを参照されたい）とを示す。ＶＰ２のより高い予想分子量（１９２ｋＤａ）バンドは、Ｂ１抗体で探索したときには見られない（図１５Ａ）が、予想サイズのかすかなバンドが、より感受性の高い抗ＯＬＬＡＳ抗体で見られる（図１５Ｂ）。理論により拘束されないが、より低い分子量の産物は、ＶＰ２融合タンパク質の切断の結果であるように見える。精製ＡＡＶｒｈ７４−Ｃａｓ９ウイルスに感染したＨＥＫ２９３細胞は、対照ＡＡＶｒｈ７４ウイルスと比べて（両方のウイルスについて細胞１個あたり粒子２０，０００個のＭＯＩ）、ＧＦＰ発現に基づいて同等のまたは大きい感染性と、２〜３倍高いルシフェラーゼ発現を示した。
ＧｅｏＣａｓ９配列を含有するＡＡＶ９ ＶＰ２融合タンパク質、ならびに別のＡＡＶ９ ＶＰ１／３発現プラスミドおよび＿＿＿により、ジストロフィン遺伝子編集のためのｓｇＲＮＡ発現（Ｃａｓ９遺伝子のない）カセットを含有するＧＦＰレポーターベクターのパッケージングが生じる。ジストロフィン遺伝子の突然変異の修正は、マウスとブタの両方におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの複数の疾患モデルが存在するので、本発明者らの最初の試験システムにする。
粗溶解物をプロテアーゼ阻害剤で収集し、ウェスタンゲルで泳動させて、ウイルスカプシドタンパク質およびＯＬＬＡＳタグ付きＧｅｏＣａｓ９タンパク質を検出する。完全長ＶＰ２−ＧｅｏＣａｓ９タンパク質は、ウェスタンブロットによりおおよそ１９５ｋＤａバンドであるはずである。粗ウイルス溶解物をイオジキサノール勾配により精製し、ウェスタンブロットによりアッセイして、完全長ＶＰ２融合タンパク質が精製粒子に組み込まれたかどうかを判定する。ウイルスをパッケージングされたゲノムについて力価測定し、感染性アッセイを行って相対感染力価を決定する。ＡＡＶ９−ＧｅｏＣａｓ９を形質導入した細胞における遺伝子編集効率は、ＰＣＲおよびＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）アッセイを使用して行う。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を行って、編集事象を判定することもできる。次いで、ＳａＣａｓ９遺伝子およびｓｇＲＮＡをパッケージングしたＡＡＶｒｈ７４を使用して、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集についてＡＡＶ９−ＧｅｏＣａｓ９を試験する。修正の標的となる突然変異が既知のヒト筋芽細胞の細胞株の大パネル。加えて、未成熟終止コドンの形成およびジストロフィン発現の崩壊をもたらす、２３番エクソンの点突然変異を有するｍｄｘマウスを使用する。ホモ接合性雌およびヘテロ接合性雄は、同様の筋肉病態を示し、それらを最初の遺伝子編集研究に使用することにする（１群あたりｎ＝１０（１群当たり雄５匹および雌５匹））。加えて、ＥＧＦＰ遺伝子が安定的に組み込まれたヒト細胞株のパネルを使用して、ＥＧＦＰのアミノ酸６５〜６７の間の活性部位を編集し、発現をノックアウトすることができる。遺伝子編集効率は、フローサイトメトリーを使用してＧＦＰ蛍光の消失により定量する。同様に、トランスジェニックＥＧＦＰマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）１Ｏｓｂ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）におけるＥＧＦＰ遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集の標的とする。研究を通して同数の雄および雌動物を使用して、雌雄両方（１群当たりｎ＝１０（１群当たり雄５匹および雌５匹））における編集効率を判定する。
一部の実施形態では、精製中に観察された部分切断産物は、プロテアーゼ阻害剤の最適化、ならびに産生および精製中のプロテアーゼ活性を防止するまたは最小にする条件を必要とする。加えて、ＡＡＶ９カプシドは、ＡＡＶ２ベクターにおいて見られるものに類似した内因性プロテアーゼ活性を有することがあり、完全長ＧｅｏＣａｓ９発現を可能にするために活性部位の突然変異を必要としうる。本出願人らは、外部プロテアーゼ活性を破壊するためにカプシドタンパク質の点突然変異を計画した。ＶＰ２融合体（ＡＡＶ９−Ｅ５６４）およびＶＰ１〜３カプシドにおける相同残基を、アラニンまたはグルタミンのどちらかに突然変異させて、Ｃａｓ９安定性に対するそれらの効果を試験する。切断産物が検出された場合、タンパク質のシークエンシングおよび分析を使用して、切断産物の配列末端を決定する。切断配列の同定により、切断事象をなくすためのＶＰ２融合タンパク質におけるアミノ酸置換の設計が可能になる。
（実施例３）
ＶＰ２−Ｃａｓ９ｉの設計
ＡＡＶは、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞への遺伝子の非常に効率的な送達ビヒクルであることが証明されている。積極的に調査されていない１つの研究領域は、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞へのタンパク質の送達ビヒクルとしてのＡＡＶの使用である。立体障害およびプロテアーゼ分解のリスクを低下させるために、本出願人は、ＡＡＶウイルスゲノム内へのｓａＣａｓ９遺伝子のパッケージングまたはＡＡＶの表面におけるｓａＣａｓ９タンパク質の提示の代替案である、粒子の内部表面にｓａＣａｓ９タンパク質を提示するＡＡＶ粒子を開発した。粒子の内部にＣａｓ９タンパク質を密閉することにより、酵素を循環免疫認識および潜在的プロテアーゼ分解から防護する。この代替案は、表面に露出しているＣａｓ９によって起こりうる、細胞を標的化するための通常のＡＡＶ−受容体結合に及ぼすＣａｓ９タンパク質の影響も防止する。ＶＰ２の内部表面に位置する５つの別個のアミノ酸位置を試験して、これらの位置に挿入しても安定した粒子の形成が可能であるかどうかを判定する。安定した挿入部位を同定したら、Ｃａｓ９配列を挿入し、得られた改変ウイルス粒子を試験して、粒子安定性、感染性および機能的なＣａｓ９活性を特徴付ける。この方法により、Ｃａｓ９酵素を免疫監視および分解から防護しながら同時に遺伝子修正のためのＣＲＩＳＰＲ標的配列を送達する効率的タンパク質送達システムが得られる。ＡＡＶ防護Ｃａｓ９含有粒子は、機能性Ｃａｓ９タンパク質を細胞に送達することができる。本明細書に記載するアプローチによって、大きいタンパク質挿入のためのＡＡＶ内部の位置についてのより深い理解が得られる。そのような知識によって、初めて、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞へのタンパク質カーゴの効率的で保護された送達方法が得られる。
内部ＶＰ２−Ｃａｓ９ｉ融合タンパク質および粒子安定性の特徴付け。最適なＶＰ２挿入部位およびリンカー配列を同定したら、完全ウイルス粒子を産生し、安定性およびパッケージング効率について試験する。レポーターベクターとともにＶＰ２およびＶＰ１＋ＶＰ３発現プラスミドを使用するＶＰ２のＣａｓ９挿入ならびに安定したウイルス形成についての試験に関するウイルスの試験バッチを産生し、ｑＰＣＲ力価測定およびウェスタンブロットによりアッセイする。理論により拘束されないが、Ｃａｓ９タンパク質を内部にパッケージングするための空間要求は、ベクターゲノムのパッケージング能力に悪影響を及ぼすことがある。Ｃａｓ９タンパク質が内部に位置するウイルス粒子（ＡＡＶ−Ｃａｓ９ｉ）を産生して、様々なサイズのＩＴＲを有するベクターゲノムを試験して、ＡＡＶ−Ｃａｓ９ｉ粒子により効率的にパッケージングされうるベクターゲノムのサイズを決定する。
ペプチドリンカーの挿入を許容するＶＰ２カプシドの内部領域の同定。ＡＡＶの多くの血清型についての結晶構造は、４オングストローム未満の分解能に至るまで同定されている。結晶構造に加えて、多くの研究者が、ウイルスの生体機能に関与するカプシド内の肝要な残基の位置についての理解を深めるのに役立つ、アミノ酸の非常に多くの突然変異を行ってきた。ＡＡＶ粒子内へのペプチドおよびタンパク質の挿入が可能である、肝要な内部に位置する残基に関して報告した者はまだいない。挿入を許容して安定した粒子を産生する部位を同定することにより、本明細書で開示する研究は、カプシド改変およびタンパク質送達に関する新たな研究領域を切り開く。
ＶＰ２タンパク質の内部表面で同定された５つの別個の部位に、突然変異および挿入を導入する。これら５つの部位は、結晶構造が２．６オングストロームまで分解されているＡＡＶ８のものとのＡＡＶｒｈ７４の密接な相同性に基づいて選択した。部位の選択は、それらの内部表面露出に基づいて行ったばかりでなく、電荷によりそれらの部位と相互作用している可能性がある、またはＤＮＡの構造的完全性およびパッケージングに重要である２倍、３倍および５倍対称軸に関与する可能性がある、周囲二次構造の影響を最小にすることにも基づいて行った。可動性リンカー配列をＶＰ２の５つの部位にクローニングして、大きいタンパク質挿入の導入をシミュレートすることができる。５つの同定された部位の位置にＶＰタンパク質（配列番号５９）の始点に基づいて番号を付与し、それらの位置は、２２８、３５０、４１９、６８４および６８９である。ＶＰ２（配列番号３９）におけるこれらの位置に相当する位置は、９０、２１３、２８２、５４７および５５２位である。５つの部位の位置を図１２の構造に示す。ペプチド挿入が可能である部位を同定したら、Ｃａｓ９配列を活性試験のためにＶＰ２プラスミドに挿入する。ＶＰ２に連結させたときにＣａｓ９の機能活性を可能にするペプチドリンカーを同定するために、部位特的切断反応を媒介する単独でのＣａｓ９−ＶＰ２タンパク質の能力を、ウイルスを産生する前に、特徴付ける。試験ガイドＲＮＡベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトすることにより、ＶＰ２−Ｃａｓ９ｉプラスミドを、部位特異的切断反応を媒介するそれらの能力について試験する。これらの結果により、切断反応の発生を可能にするためのＣａｓ９タンパク質とＶＰ２タンパク質間の最適なリンカー配列を決定することができる。より長い、または可動性、または自己切断性リンカーを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最適なＣａｓ９活性について試験することができる。
ＨＥＫ２９３細胞およびＤＭＤ患者細胞におけるＡＡＶ−Ｃａｓ９ｉ感染性および部位特異的切断活性。ＡＡＶ−Ｃａｓ９ｉ粒子の有用性を示すために、細胞における感染性および切断活性を試験する。Ｃａｓ９タンパク質は、感染後にウイルス粒子の制約から逃れることができなければならず、核内のＤＮＡおよびＲＮＡ結合が可能であるような位置にあらねばならない。特定の実施形態では、ウイルスカプシド内には、１つのウイルスと切断／編集反応を行うためにガイドＲＮＡおよび任意選択の治療用ポリペプチドを送達するベクターをパッケージングするのに十分な余地（すなわち、空間）がある。機能性ガイドＲＮＡの送達および配列の標的化に必要なパッケージング容量は、ＩＴＲ間のおよそ５００塩基対である。
ＩＴＲ間への５００ｂｐ挿入物で開始して、小さいＩＴＲベクター構築物をパッケージングし、パッケージングが起こったかどうかをｑＰＣＲ力価測定により判定する。ベクターのサイズを徐々に増大させて、パッケージング容量の上限を決定する。パッケージングの上限が分かったら、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験感染用の標的化ベクターをパッケージングする。感染性を確証したら、５０および５４番エクソンを標的とするジストロフィン特異的ｓｇＲＮＡ配列を含有するＡＡＶ−Ｃａｓ９ｉウイルスを産生して、ジストロフィンの遺伝子編集のｓａＣａｓ９機能活性について試験する。ＰＣＲならびにＤＭＤ患者生検試料の不死化筋芽細胞からのＳｕｒｖｅｙｏｒ／Ｃｅｌｌ酵素アッセイにより、遺伝子標的化効率を試験し、インデル形成およびジストロフィン発現を測定する。
ＡＡＶ−Ｃａｓ９ｉウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏでの効率的タンパク質送達のための新規方法を提供する。加えて、ペプチドおよびタンパク質挿入が可能であるカプシド内の挿入部位の同定によって、重要な情報を得ることができる。挿入部位の評価、続いてのＶＰ２−Ｃａｓ９構築物のリンカー最適化、続いてのＣａｓ９活性アッセイという、段階的アプローチにより、安定したベクターの線形順序での設計が可能になる。Ｃａｓ９タンパク質およびベクターＤＮＡの空間要求を予測することは困難である。理論により拘束されないが、機能活性のために粒子１個あたり１つだけのＣａｓ９タンパク質をパッケージングする必要がある。したがって、ウイルス粒子１個あたり（またはウイルスカプシド１個あたり）５つまたはそれより多くのＣａｓ９−ＶＰ２タンパク質ではなく、改変ウイルス粒子が、ウイルス粒子１個あたり（またはウイルスカプシド１個あたり）１〜５つのＣａｓ９−ＶＰ２タンパク質を含むように、ウイルス産生中のＣａｓ９−ＶＰ２およびＶＰ１−３プラスミドのプラスミド比を変更することができる。プラスミド比の変更は、指向性が変化したモザイクウイルス粒子を生成するために以前に使用されたことがある。プラスミド比を変化させることにより、粒子１個あたりのＣａｓ９タンパク質が５つより少ないＡＡＶ−Ｃａｓ９ｉウイルスを生成する。パッケージング容量制限が、最小ガイドＲＮＡと任意選択の治療用ポリヌクレオチドとを含有するベクターゲノムの有効なパッケージングを妨げる場合には、２ウイルスシステムを使用して、（１）Ｃａｓ９タンパク質を有するウイルス、および（２）ガイドＲＮＡと任意選択の治療用ポリヌクレオチドとを有するウイルスを送達する。この２ウイルスシステムは、単一標的細胞への同時感染を必要とするが、Ｃａｓ９活性の継続期間を形質導入細胞の生存期間ではなく数週間に制限することにより、安全性を増大させる。
（実施例４）
内部Ｃａｓ９ ＡＡＶ融合タンパク質産生および精製のプロテアーゼ耐性方法
改変Ｃａｓ９（例えば、ｓａＣａｓ９）は、細菌由来の酵素であって、真核細胞系では、細胞内のプラスミドまたはベクターＤＮＡから通常は発現され、翻訳後に迅速に前記細胞の核に送り返される酵素である。本明細書で開示される改変ウイルス粒子では、内部ＶＰ２−Ｃａｓ９（ＶＰ２−Ｃａｓ９ｉ）タンパク質は、完全形成ウイルス粒子の一部になり、培養培地に放出され、その培地から回収され、精製される。改変ウイルス粒子は、産生中に、ならびに産生中に使用される細胞および培地からの精製中に、プロテアーゼに遭遇すると予想される。加えて、２つの異なるプロテアーゼ活性が、ＡＡＶのカプシドの一部として同定された（Wuら、２０００年；Salganikら、２０１２年）。一方のプロテアーゼ活性は、低ｐＨ（＜５．５）の間のカプシドの自己分解性のタンパク質分解を含む。他方のプロテアーゼ活性は、ｐＨ依存性でなく、外部基質を分解することが示された。
プロテアーゼ分解部位を同定するために、ＳＹＰＲＯ染色ゲルから切り出した低分子量融合タンパク質産物を用いてプロテオーム解析を行う。タンパク質シークエンシング情報は、切断事象が、公知プロテアーゼによって引き起こされるのか、または内因性カプシドプロテアーゼ活性によって引き起こされる可能性があるのかについての判定を知らせる。配列は、切断事象をなくすようにＶＰ２−Ｃａｓ９ｉタンパク質のアミノ酸置換の設計するためにも利用する。様々なアミノ酸置換を、１）ＶＰ２−Ｃａｓ９ｉ切断を低減させること、２）安定したウイルス粒子形成を可能にすること、および３）Ｃａｓ９機能活性を維持することについて、試験する。ＶＰ２−Ｃａｓ９ｉ構築物は、単一のプラスミド内にあり、これにより、アミノ酸配列を変化させるためのおよび試験トランスフェクションを行うための迅速な部位特異的突然変異誘発が可能になる。アミノ酸修飾を、無血清浮遊増殖ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションで試験し、その後、細胞溶解を行い、Ｃａｓ９特異的一次抗体またはＡＡＶ特異的一次抗体のどちらかを使用してウェスタンブロットを行って、完全長ＶＰ２−Ｃａｓ９ｉタンパク質を検出する。細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するプロテアーゼ耐性改変融合タンパク質の能力を、ルシフェラーゼ増強黄色蛍光融合タンパク質（ｌｕｃ−ＥＹＦＰ）を発現するレポーター構築物のパッケージング、および遺伝子発現の測定によって、試験する。ＤＥＮＮドメイン含有４Ｃ（ＤＥＮＮＤ４Ｃ）特異的ｓｇＲＮＡ配列を含有するＶＰ２−Ｃａｓ９ｉウイルスを産生することにより改変融合タンパク質のさらなる機能試験を行って、ＤＥＮＮＤ４Ｃの遺伝子編集のｓａＣａｓ９機能活性について試験する（Chariら、２０１７年）。Ｉｌｌｕｍｉｎａバーコードおよびシークエンシングアダプターを付加するＰＣＲ、続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用するシークエンシング、そして公開ｓｇＲＮＡおよびプライマー配列を使用するインデル形成の測定により、遺伝子標的化効率を試験する。
Ｃａｓ９−ＶＰ２の産生およびプロテアーゼ阻害剤での精製
切断産物の原因となる可能性があるプロテアーゼを同定および予測するために、プロテアーゼ配列データベースでＶＰ２−Ｃａｓ９ｉタンパク質配列のクエリーを実行する。これらのプロテアーゼの活性を阻止するために、トランスフェクションおよびウイルス精製を様々なプロテアーゼ阻害剤の存在下で行う。阻害剤の有効性をウェスタンブロットによりアッセイして、より少ない分解産物（ＶＰ２−Ｃａｓ９ｉの予測サイズと比較して低い分子量によって同定可能）がこの方法によって産生されるかどうかを判定する。ＶＸ−７６５は、ＩＣＥ／カスパーゼ−１サブファミリーに属するカスパーゼの強力かつ選択的な阻害剤であり、現在、臨床試験中である（Wannamakerら、２００７年；Tanouryら、２００８年）。ＶＸ−７６５（ならびに他の汎プロテアーゼ阻害剤）の付加を用いる試験トランスフェクションを行って、プロテアーゼ阻害剤が、精製後に見られる分子量のより低い産物の形成を低減させるかどうかを確かめる。ＶＰ２−Ｃａｓ９ｉ発現プラスミドをプロテアーゼ阻害剤の存在下でＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に細胞溶解物を単離し、Ｃａｓ９またはＡＡＶ特異的抗体を用いてウェスタンブロットを実行して、産生されたＶＰ２−Ｃａｓ９ｉタンパク質のサイズを決定する。
精製プロセスにおける後続のステップも、ｐＨおよび界面活性剤の変化などの、ｓａＣａｓ９産物の分解を招くことがある。精製プロセスの各ステップで試料を採取して、いずれかのさらなるプロセスがＶＰ２−Ｃａｓ９ｉカプシドの分解に寄与するかどうかを判定する。様々なイオン交換および親和性カラム、イオジキサノールおよびＣｓＣｌ勾配を含む、多種多様な精製手順を使用することができ、精製プロセスを、完全長ＶＰ２−Ｃａｓ９ｉ産物の効率的精製に対してあまり過酷でなく、より適しているものに改めるために、タンジェンシャルフロー濾過を使用することができる。次いで、プロテアーゼ分解についての改良低減法により産生されたＶＰ２−Ｃａｓ９ｉウイルスを機能について試験する。細胞に感染するウイルスの能力を、ルシフェラーゼ増強黄色蛍光融合タンパク質（ｌｕｃ−ＥＹＦＰ）を発現するレポーター構築物のパッケージング、および遺伝子発現の測定によって、試験する。感染性を確証したら、本明細書に記載のとおりＤＥＮＮＤ４Ｃ ｓｇＲＮＡおよびＭｉＳｅｑを使用してＣａｓ９活性を試験する。
内因性ＡＡＶカプシドプロテアーゼ活性に必要なアミノ酸を改変する
２つの異なるプロテアーゼ活性が、ＡＡＶ２のカプシドにおいて同定された（Wuら、２００年；Salganikら、２０１２年）。プロテアーゼ活性の一方は、ｐＨ依存性であることが判明し、ｐＨ５．５およびそれ未満でのみ活性であった。プロテアーゼ活性は、カプシドタンパク質の自己切断をもたらし、エンドソームにおいて遭遇する通常の感染過程に関与しうる。他方のプロテアーゼ活性は、ｐＨ依存性でなく、外部基質に対して活性であった。ＡＡＶ２の５６３位におけるグルタミン酸の突然変異は、外部プロテアーゼ活性を特異的に破壊することが示されている。理論により拘束されないが、この外部プロテアーゼ活性が、ウイルス産生中に見られるＣａｓ９分解のもとでありうる。
本出願人は、外部プロテアーゼ活性を破壊するためにカプシドタンパク質の点突然変異を計画した。ＶＰ２−Ｃａｓ９ｉ融合タンパク質およびＶＰ１−３カプシドタンパク質における相同残基もアラニンまたはグルタミンのどちらかに突然変異させて、Ｃａｓ９安定性に対するそれらの効果を試験する。突然変異させたら、改変された発現プラスミドをプロテアーゼ阻害剤の存在または非存在下でＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの４８時間後に細胞溶解物を単離し、Ｃａｓ９またはＡＡＶ特異的抗体を用いてウェスタンブロットを実行して、産生された融合タンパク質のサイズを決定する。次に、細胞に感染するこれらの改変粒子の能力を、ルシフェラーゼ増強黄色蛍光融合タンパク質（ｌｕｃ−ＥＹＦＰ）を発現するレポーター構築物のパッケージング、および遺伝子発現の測定によって、試験する。感染性を確証したら、上記のとおりＤＥＮＮＤ４Ｃ ｓｇＲＮＡおよびＭｉＳｅｑを使用してＣａｓ９活性を試験する。
（実施例４）
スプリットインテインタンパク質スプライシングによる内部Ｃａｓ９ ＡＡＶのモジュール式集合
タンパク質トランススプライシング（ＰＴＳ）は、インテイン−エクステインタンパク質自己スプライシング反応によって２つのタンパク質を互いに連結するために使用される新規技術である（Borraら、２０１７年；Stevensら、２０１６年；Truongら、２０１５年、図１８）。インテインは、自体を前駆タンパク質から切り出して周囲配列を互いにライゲーションする、介在配列である（Kaneら、１９９０年；Hirataら、１９９０年；Perler ２００２年）。ＰＴＳは、大きいＶＰ２−Ｃａｓ９ｉ融合タンパク質を産生するための代替アプローチである。ＰＴＳ設計は、２つのタンパク質が別々に産生され、別の反応で互いに結合される、モジュール式集合システムである。産生および精製条件を、別々の反応でタンパク質ごとに最適化することができる。次いで、精製タンパク質を混合し、集合反応を行う。本実施例の目的は、Ｃａｓ９−インテインおよびＡＡＶ−インテインタンパク質を産生し、混合し、精製タンパク質を集合させてＡＡＶ−Ｃａｓ９ｉ粒子にし、感染性およびＣａｓ９活性を判定することである。
先ず、Ｃａｓ９−インテイン（例えば、ｓａＣａｓ９−インテイン）およびＡＡＶ ＶＰ２−インテイン粒子を別々の反応で産生する。次に、両方の成分を互いに混合し、産物の純度、安定性および感染性について測定する。得られた産物の純度および感染性は、迅速なライゲーションならびに機能性ＡＡＶおよびＣａｓ９活性を助長するために必要とされうる、代替スプライスジャンクション配列および／またはペプチドリンカー付加の選択を導く。本実施例の理論的根拠は、ＡＡＶ−Ｃａｓ９ｉのモジュール式集合を開発すること、ならびに産物が不安定になる可能性を低下させる一方で迅速な改変および最適化のためのプラットフォームをもたらすことである。これらの方法は、遺伝子編集および／または遺伝子調節を目的として機能性ｓａＣａｓ９タンパク質を細胞に送達するＡＡＶ粒子のモジュール式作出のためのツールを、初めて、提供する。モジュール式集合アプローチにより、代替Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１もしくはジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質の迅速な試験、またはさらには、効率的送達のためのＡＡＶの内部に提示されるリガンドの標的化も、可能にする。図１６に示すデータは、ＡＡＶｒｈ７４血清型ウイルスのＶＰ２タンパク質に融合させたＣｆａＣ−インテインの組込みおよびウイルス産生の成功を実証する。対照ＡＡＶｒｈ７４ウイルスにおける７２ｋＤａから７７ｋＤａへのＶＰ２のサイズ増大も示す。
細菌細胞において産生されたスプリットインテイン−Ｃａｓ９の純度および安定性を検査する
インテインは、ＲＮＡ６８におけるイントロンと同様にタンパク質スプライシング反応を触媒する、天然に存在する介在配列である。インテインは、あらゆる種類の生き物に見られ、真核生物には１１３種が存在することが公知である（ＩｎＢａｓｅ）（Perler ２００２年）。前駆タンパク質から２つのインテインが自己触媒切断し、周囲のエクステイン断片をネイティブペプチド結合でライゲーションする（Vila-Perelloら、２０１０年）。トランススプライシングスプリットインテインは、天然由来の形態または人工的に作出された形態であり、これらのインテインは、２つの別々のタンパク質の一部であり、２つの別々のタンパク質を１つにライゲーションする結果となる、結合、スプライシングおよびライゲーション反応を指示する。Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ ＤｎａＥから同定されたインテインは、著しく迅速なスプライシングおよびライゲーション反応速度を示した（Cheriyanら、２０１３年）。加えて、変異インテインが介在ペプチド配列を残さない、痕跡を残さないスプライシング反応を達成することができる。２つのタンパク質の結合を、ほぼあらゆる配列で果たすことができ、この結合は、ライゲーション速度による影響しか受けない。安定性および活性が増強されたスプリットインテインを構築するための最近の努力の結果、コンセンサス高速ＤｎａＥインテイン配列（Ｃｆａ）と称する並外れた特性を有するインテインが得られた（Stevensら、２０１６年）。Ｃｆａインテインは、８０℃以下の温度で、刺激の強い化学物質中で、迅速なライゲーションを触媒することができる。Ｃｆａは、培養培地中のコトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの２つの分泌タンパク質をライゲーションするためにも使用されている。より多くのネイティブ細菌発現システムにおいてＣａｓ９タンパク質を産生させることにより、プロテアーゼ分解リスクを低下させつつ大量の精製タンパク質を生成することができる。
精製のための、および精製されたタンパク質の細菌からのまたは酵母培養物からの単離のための、６×Ｈｉｓタグとともに、ＣｆａＮインテインを、Ｃａｓ９（例えば、ｓａＣａｓ９）のカルボキシ末端および／またはアミノ末端にクローニングする。一部の実施形態では、ＣｆａＮインテインをＣａｓ９のカルボキシ末端にクローニングする。ＣｆａＣインテインを、ＶＰ２のアミノ末端、または集合したカプシド内での内部発現に適するＶＰ２の挿入部位（例えば、２２８、３５０、４１９、６８４および６８９位）のどちらかにクローニングし、その改変ＶＰ２をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、精製ＶＰ２−インテインタンパク質を産生させる。精製ｓａＣａｓ９−インテインおよびＶＰ２−インテインタンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で配合し、ライゲーション反応で試験する。精製Ｃａｓ９−インテインとＶＰ２−インテインを混合し、ＰＢＳ中での経時的なライゲーション反応速度をウェスタンブロットによりモニターする。Ｃａｓ９−インテインのＶＰ２−インテインへの安定したライゲーションのための反応条件を決定したら、ＶＰ１−３、Ａｄ−ＨＥＬＰおよびＡＡＶベクタープラスミドのＨＥＫ２９３細胞へのコトランスフェクション、そしてウイルス粒子の精製により、ＶＰ２−インテイン含有ＡＡＶ粒子を産生する。ＡＡＶ−インテイン粒子をＰＢＳ中でＣａｓ９−インテインと混合して、エクステインライゲーションを可能にする。精製Ｃａｓ９−ＡＡＶ粒子をＣａｓ９とＶＰ２タンパク質のライゲーションについてウェスタンブロットにより分析して、ライゲーション効率、ならびにＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質と比較したＣａｓ９の相対存在量を判定する。ｓａＣａｓ９およびＶＰ２タンパク質は、効率的ライゲーションが起こった場合、１：１比で見いだされるはずである。より低い比が見いだされた場合には、時間および温度の反応条件を調整して、ライゲーション比を向上させることができる。ＶＰ２のアミノ末端は、Ｃａｓ９タンパク質への効率的なインテインベースのライゲーションに利用しやすいだろう。
ＡＡＶの様々な血清型の結晶構造に基づいて、ＶＰ２のアミノ末端は、完全ウイルス粒子の外部領域にあるか、その外部領域と密接に会合していると、予想される。加えて、ＧＦＰ−ＶＰ２含有ＡＡＶを顕微鏡で検査したとき、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞感染中に蛍光装飾粒子が見えた。加えて、Ｃｆａインテイン領域を含むようにＶＰ１またはＶＰ２中の表面露出アミノ酸の代替部位を突然変異させて、ＶＰ２のアミノ末端ではない、Ｃａｓ９とのライゲーション反応の標的部位を得ることができる。
ＨＥＫ２９３において産生されたスプリットインテイン−ｓａＣａｓ９の純度および安定性を検査する
インテインライゲーション反応を利用するスプリットＣａｓ９タンパク質の試験に成功し、スプリットＣａｓ９タンパク質は、２つの別々のＡＡＶベクターによる細胞へのこれらの成分の送達後に機能活性を生じさせた（Truongら、２０１５年）。加えて、Ｓｔｅｖｅｎｓらは、モノクローナル重鎖抗体−インテインおよび分泌ペプチド−インテインのスプリットインテイン成分を共発現させ、３７℃で４日間の発現後の培地中の成分の効率的ライゲーションを示した（Stevensら、２０１６年）。ＨＥＫ２９３細胞は、効率的プラスミドトランスフェクションが比較的容易であること、ならびにＡＡＶ産生に必要とされるアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質を内因性発現することから、ＡＡＶベクターを産生するために、通常、使用される。スプリットインテイン媒介ライゲーションによるｓａＣａｓ９−ＡＡＶ粒子の単純な代替産生方法は、ｓａＣａｓ９−インテインプラスミドをＡＡＶ−インテイン成分プラスミドとともにＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトし、培地から直接ＡＡＶ−Ｃａｓ９ｉを精製する方法である。ＨＥＫ２９３細胞へのコトランスフェクションは、ＡＡＶ−Ｃａｓ９ｉ粒子を産生するための別々の産生、ライゲーションおよび精製ステップをなくす。加えて、ＨＥＫ２９３へのコトランスフェクションは、発現および機能の最適化のための様々なリンカー、ならびに代替Ｃａｓ９タンパク質の、迅速な試験を可能にする。翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、細菌の場合、真核生物とは非常に異なる（Delleyら、２０１７年；Brownら、２０１７年；Bastosら、２０１７年）。ＨＥＫ２９３細胞において産生されたｓａＣａｓ９−インテインは、真核生物ＰＴＭを保持するため外来と認識される可能性が低い。
ＣｆａＮインテインをＣａｓ９のカルボキシおよび／またはアミノ末端にクローニングし、標準的な真核生物発現プラスミドにライゲーションする。ＣｆａＣインテインを、集合したカプシド内での内部発現に適切なＶＰ２の挿入部位（例えば、２２８、３５０、４１９、６８４および６８９位）にさらにクローニングする。これらのプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトし、完全長ＶＰ２−Ｃａｓ９ｉタンパク質を産生するためのライゲーションの効率を判定する。ＨＥＫ２９３細胞におけるＣａｓ９−インテインのＶＰ２−インテインへの安定したライゲーションのための反応条件を決定したら、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションへのＶＰ１−３、Ａｄ−ＨＥＬＰおよびＡＡＶベクタープラスミドの組み入れ、そしてウイルス粒子の精製により、改変粒子を産生する。標準的なイオジキサノール段階勾配精製を利用してウイルス精製を行って、完全ウイルス粒子を夾雑細胞およびアデノウイルスヘルパータンパク質から単離し、その後、ＰＢＳおよびポロクサマーの処方緩衝液に透析する。処方緩衝液への０．００１％ポロクサマーの添加は、表面へのウイルスの吸着を低下させるのに役立つ。
２つのタンパク質を互いに結合するためのインテイン媒介タンパク質トラススプライシング技術は、細胞への送達のためにＡＡＶの内部に向いている表面にｓａＣａｓ９を連結させる効率的方法をもたらす。２つのタンパク質成分を上記の最も望ましいかつ効率的な方法によって別々に産生することができる。細菌におけるＣａｓ９−インテインタンパク質の発現は、ＡＡＶ−インテインカプシドに迅速にライゲーションすることができる大量の純粋なタンパク質の単純な産生方法をもたらす。ＨＥＫ２９３細胞におけるｓａＣａｓ９−インテインタンパク質の発現により、ＰＴＭの潜在的問題は克服される。タンパク質のＨＥＫ２９３細胞産生のもう１つの利点は、ｓａＣａｓ９−インテインタンパク質を別の反応で産生し、産生および精製に最適な条件下で単独で精製し、次いで、後のライゲーション反応で精製ＡＡＶ−インテイン粒子と混合して最終内部Ｃａｓ９ ＡＡＶ産物を得ることができることである。タンパク質ライゲーションのためのスプリットインテインシステムの有用性は、代替Ｃａｓ９酵素または他のタンパク質を効率的に産生することができ、ｉｎ ｖｉｖｏでＡＡＶベクターにより送達することができ、それによって無数の分子の迅速な開発および試験が可能になることである。これに関連して、Ｃａｓ９とＡＡＶ間のあらゆるスプライシング問題の克服に役立つように、様々なリンカーを精製し、試験することができる。これらの改変によりＡＡＶの感染性が低下した場合、より長いタンパク質リンカーを使用して、Ｃａｓ９を可動性立体構造または安定した立体構造のどちらかに配置しなおすことができる。Ｃａｓ９活性が、細胞感染後に影響を受ける場合には、自己切断タンパク質スペーサーを使用することができ、それによって、細胞感染後に起こるｐＨ変化中にカプシドからＣａｓ９タンパク質を効率的に放出することができる。
（実施例５）
内部Ｃａｓ９を発現するＡＡＶでの筋ジストロフィーの処置
デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、男性新生児５０００名のうちのおおよそ１名に発症する遺伝性Ｘ染色体連鎖劣性遺伝子異常である。この遺伝子は、２．２メガ塩基対（ＭＢ）の長さであり、７９のエクソンを含有する。ＤＭＤ遺伝子の切断型は、遺伝子置換戦略として試験されてきたが、この短縮型は、完全な機能性を提供しない。各々の個体において特異的である無数の遺伝子突然変異を正確に修正する方法を開発することにより、完全機能性ジストロフィン遺伝子をこれらの患者に回復させることができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、標的化配列の単純な置換による特異的遺伝子修正の提供を可能にする。開示するＡＡＶ送達システムは、単回静脈内投与であらゆる主要筋を効率的に標的化するために使用され、このシステムは、ＤＭＤを処置するための確固たる治療戦略をもたらす。
マウスモデルｍｄｘを使用して、本明細書に開示する改変ウイルス粒子および方法での筋ジストロフィーの処置の有効性を実証する。ｍｄｘマウスは、ＤＭＤ遺伝子のフレーム破壊突然変異を有し、これが、筋肉の筋線維を損なわせ、結果的に筋肉を衰えさせることになる。可能性のある遺伝子修復のための１つの戦略は、ＤＭＤ遺伝子からの少なくとも１つのエクソンの除去、したがって、短縮型ｍＲＮＡの産生であり、この短縮型ｍＲＮＡは、まだインフレームであり、少なくともある程度機能性であるジストロフィンタンパク質を産生する。マウスにおけるＤＭＤ遺伝子を直接編集するために、改変ＡＡＶウイルス粒子を用いる遺伝子療法アプローチを使用して、Ｃａｓ９−ウイルスカプシド融合タンパク質の送達と同時に、マウスＤＭＤ遺伝子の２３番エクソンを切り出すようにＣａｓ９を方向付けることができる１つまたは複数のガイドＲＮＡを送達する。骨格筋を標的とするために最終的にはＡＡＶを使用するため、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９などの、骨格筋指向性を有するＡＡＶを使用すべきである。
改変Ｃａｓ９ ＡＡＶ粒子は、上記のように調製する。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に４つのプラスミドをコトランスフェクトする。第１のプラスミドは、ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１およびＶＰ３をコードし、ＶＰ２が欠失している（例えば、配列番号１、配列番号２、または配列番号４）。第２のプラスミドは、ＶＰ２−ｓａＣａｓ９ｉ融合タンパク質（例えば、配列番号４５〜４９）をコードする。第３のプラスミドは、ウイルス集合ヘルパー遺伝子（例えば、配列番号６）をコードする。第４のプラスミドは、Ｕ６プロモーターまたは目的の組織における発現のための別の適切なプロモーターの制御下でＤＭＤ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（配列番号８）をコードする。あるいは、必要ウイルス集合遺伝子、例えば、第１および／または第３のプラスミドにコードされている遺伝子が安定的に導入される細胞株を、これらの遺伝子をコードするプラスミドとのコトランスフェクションの代わりに、使用することができる。
マウスＤｍｄ遺伝子の２３番エクソンを標的とするガイドＲＮＡ配列を設計する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Tabebordbar, M.ら（２０１６年）Science ３５１巻（６２７１号）：４０７〜４１１頁を参照されたい。Ｄｍｄ ２３番エクソンのｓａＣａｓ９切断に適切な例示的ガイドＲＮＡ標的配列を、配列番号１０〜１７として開示する。配列番号１０〜１７は、２３番エクソンに隣接するゲノム配列を標的とし、その結果、２３番エクソンが切り出される。これらの配列を、足場ガイドＲＮＡプラスミドである第４のプラスミドにクローニングして、集合した改変ウイルス粒子にパッケージングする。Ｄｍｄ遺伝子を標的としない対照ガイドＲＮＡも調製する。
コトランスフェクション後、集合した改変ウイルス粒子を収集し、ＶＰ２−ｓａＣａｓ９タンパク質発現、ならびにＶＰ１およびＶＰ３の発現を、実施例１で説明したようにウェスタンブロットによって試験する。パッケージングされたウイルスもウイルス力価についてアッセイし、ウイルス力価は、約１０８ＧＣ／ｍＬ〜１０１７ＧＣ／ｍＬの範囲であるはずであり、最適には約１０１３ＧＣ／ｍＬの力価である。ウイルス力価をウェスタンブロットによりまたはｑＰＣＲによるウイルスゲノムコピー数によりアッセイし、コピー数標準試料と比較することができる。融合タンパク質発現および十分なウイルス力価の確認後、ｍｄｘマウスから収集した細胞に改変ウイルス粒子をｅｘ ｖｉｖｏで投与して、２３番エクソンの効率的切り出しを確認する。ｍｄｘマウスから収集した細胞（例えば、筋細胞、筋幹細胞、肝臓細胞、線維芽細胞、脂肪幹細胞、または使用するＡＡＶ血清型と適合する任意の他の細胞）は、ゲノムＤｍｄ突然変異を有する。改変ウイルス粒子を形質導入した後、欠失領域を挟むプライマーを使用してＰＣＲにより効率的２３番エクソン切り出しについてそれらの粒子をアッセイすることができる。ＣＲＩＳＰＲシステムの効率的動作は、２３番エクソンを挟むプライマーのＰＣＲ産物と、２３番エクソン内のプライマーのＰＣＲ産物と、一方のプライマーが２３番エクソンの欠失領域外にあり、他方が欠失領域内にある場合の産物との相対レベルの比較によって測定することができる。効率的切り出しは、２３番エクソンを挟むプライマーが最も大量に存在する産物を産生する場合に実証される。効率的ＣＲＩＳＰＲ活性のさらなる確認を、修復されたジストロフィンタンパク質産物についてのウェスタンブロットによって、確実にすることができる。
ＣＲＩＳＰＲシステムの効率的切り出しの確認後、改変ウイルス粒子を、ｍｄｘマウスからの筋幹または前駆細胞、例えば衛星細胞に、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与することができる。２３番エクソンを切り出したら、ＣＲＩＳＰＲ改変細胞を筋肉内注射によってマウスに移植して戻す。改変ＡＡＶで処置した細胞を用いる細胞療法の有効性を、筋肉形態の改善、多量体ジストロフィン−糖タンパク質複合体および神経型一酸化窒素合成酵素の筋線維鞘局在化の減少、ならびにジストロフィン発現の検出によって測定する。
あるいは、改変ウイルス粒子を、局所組織注射、例えば、筋肉内注射、腹腔内注射、全身注射によって、または尾静脈注射により、筋組織にｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。改変ｓａＣａｓ９ ＡＡＶを用いるウイルス遺伝子療法の有効性を、筋肉形態の改善、多量体ジストロフィン−糖タンパク質複合体および神経型一酸化窒素合成酵素の筋線維鞘局在化の減少、ならびにジストロフィン発現の検出によって測定する。
ヒトにおける筋ジストロフィーを処置するために、筋ジストロフィーの原因となる以下の遺伝子のうちの１つまたは複数を標的とするガイドＲＮＡを設計する：ジストロフィン（ＤＭＤ、ＮＭ＿０００１０９、ＮＭ＿００４００６、ＮＭ＿００４００７、ＮＭ＿００４００９、ＮＭ＿００４０１０）、ジスフェリン（ＤＹＳＦ、ＮＭ＿００１１３０４５５、ＮＭ＿００１１３０９７６、ＮＭ＿００１１３０９７７、ＮＭ＿００１１３０９７８、ＮＭ＿００１１３０９７９）、エメリン（ＥＭＤ、ＮＭ＿０００１１７）、ラミンＡ／Ｃ（ＬＭＮＡ、ＮＭ＿００１２５７３７４、ＮＭ＿００１２８２６２４、ＮＭ＿００１２８２６２５、ＮＭ＿００１２８２６２６、ＮＭ＿００５５７２）、ダブルホメオボックス４（ＤＵＸ４、ＮＭ＿００１２０５２１８、ＮＭ＿００１２７８０５６、ＮＭ＿００１２９３７９８、ＮＭ＿００１３０６０６８）、ミオトニン−プロテインキナーゼ（ＭＤＰＫ、ＮＭ＿００１０８１５６０、ＮＭ＿００１０８１５６２、ＮＭ＿００１０８１５６３、ＮＭ＿００１２８８７６４、ＮＭ＿００１２８８７６５）、細胞核酸結合タンパク質（ＣＮＢＰ、ＮＭ＿００３４１８、ＮＭ＿００１１２７１９２、ＮＭ＿００１１２７１９３、ＮＭ＿００１１２７１９４、ＮＭ＿００１１２７１９５）、ポリアデニル化−結合タンパク質−２（ＰＡＢＰ−２、ＮＭ＿００４６４３）。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によってエクソンを切り出すようにＣａｓ９に指示し、これに起因して、機能性タンパク質産物を産生するインフレーム切断型産物が生じるように、ガイドＲＮＡを設計する。あるいは、相同組換え修復によって遺伝子を修復するように、ガイドＲＮＡを設計することができる。この方法は、切断領域の修復の鋳型として使用されうる野生型ＤＮＡ配列または置換配列をコードする治療量ＤＮＡを使用する。
内部Ｃａｓ９を有する改変ウイルス粒子であって、ガイドＲＮＡと必要に応じて治療用鋳型ＤＮＡとを含むポリヌクレオチドを封入する改変ウイルス粒子を、上記のように調製する。ウイルスタンパク質発現および力価を、上記のようにウェスタンブロットおよびＰＣＲによりアッセイする。修復されたＤＮＡ断片を検出するＰＣＲプライマーを設計することにより、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集効率をアッセイする。ウイルス粒子を筋組織に筋肉内注射または全身送達によって投与する。修復された遺伝子産物の発現を、処置した筋肉組織のＰＣＲ、組織学的染色またはウェスタンブロットにより、検出することができる。
次のうちの１つまたは複数が検出されたとき、処置および／または修復成功と判定する：筋ジストロフィーの症状の１つまたは複数についての軽減または改善；筋ジストロフィーの現状の安定化（すなわち、悪化しないこと）；筋ジストロフィーの進行の遅延または緩徐化；および筋ジストロフィーの改善または緩和。一部の実施形態では、処置の成功は、対象から単離した１つまたは複数の細胞、組織または器官において修復された標的ポリヌクレオチドの存在を検出することにより判定する。一部の実施形態では、処置の成功は、対象から単離した１つまたは複数の細胞、組織または器官において修復された標的ポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドの存在を検出することにより判定する。一部の実施形態では、修復されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、処置した対象の筋組織において検出される。
（実施例６）
血友病の処置
血友病を処置するために、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子修復を第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８、ＮＭ＿０００１３２、ＮＭ＿０１９８６３）または第ＩＸ因子（Ｆ９、ＮＭ＿０００１３３、ＮＭ＿００１３１３９１３）に方向付けるように、ガイドＲＮＡを設計する。あるいは、治療用ポリヌクレオチドを、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８、ＮＭ＿０００１３２、ＮＭ＿０１９８６３）または第ＩＸ因子（Ｆ９、ＮＭ＿０００１３３、ＮＭ＿００１３１３９１３）の修復のための鋳型になるように調製する。内部Ｃａｓ９を有する改変ウイルス粒子であって、ガイドＲＮＡと治療用鋳型ＤＮＡとを含むポリヌクレオチドを封入する改変ウイルス粒子を、上記のように調製する。ウイルスタンパク質発現および力価を、上記のようにウェスタンブロットおよびＰＣＲによりアッセイする。修復されたＤＮＡ断片を検出するＰＣＲプライマーを設計することにより、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集効率を判定する。一態様では、改変ウイルス粒子を幹細胞、肝細胞前駆細胞、または肝細胞に投与して、第ＶＩＩＩまたはＩＸ因子遺伝子を修正する。あるいは、改変ウイルス粒子を、直接肝臓への注射により、または全身送達により、血友病を有する対象に直接投与する。血友病を有する処置した細胞または対象において、機能性第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子タンパク質を検出することにより、遺伝子修復成功を検出する。一部の実施形態では、処置した対象における凝血機能改善を検出することにより、処置成功を判定する。
均等物
別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
本明細書において例証して説明する本発明は、本明細書で具体的に開示しない、何らかの要素（単数または複数）、制限（単数または複数）の非存在下で適切に実施されることもある。したがって、例えば、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」などは、広く、制限なく読むものとする。加えて、本明細書で用いる用語および表現は、説明用語として使用しており、限定用語として使用しておらず、そのような用語および表現の使用には、示す特徴、記載する特徴またはそれらの一部の、いかなる均等物も除外する意図はなく、様々な修飾形態が請求項記載の本発明の範囲内で可能であると認識している。
したがって、本開示を好ましい実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示したが、本明細書で開示する、そのような実施形態および特徴において実現される本発明の修飾形態、改良形態および変形形態を当業者は用いることができること、ならびにそのような修飾形態、改良形態および変形形態が本発明の範囲内であると考えられることを理解されたい。本明細書で提供する物質、方法および実施例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的であり、本発明の範囲に対する制限として意図したものではない。
本発明を本明細書で広く、一般的に説明した。この一般的開示の範囲内に入る、より狭い種および亜属分類の各々も、本発明の一部を構成する。これは、削除される物質が本明細書に具体的に記載されているか否かを問わず、属から任意の対象物を除去するという条件または否定的限定を伴う、本発明の一般的説明を含む。
本明細書で言及するすべての公表文献、特許出願、特許および他の参考文献は、各々が個々に参照により組み入れられたと場合と同程度に、すべての式および図を含めて、それら全体が参照により明確に組み入れられる。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優先するものとする。
他の実施形態は、後続の特許請求の範囲に示す。
参考文献
以下の論文は、本明細書の上文における開示の中で参照したものであり、これら全体が参照により組み入れられる。
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配列表
本明細書で論じる非限定的な例示的ベクターおよびそれらの配列の説明を本明細書において下記に提供する：
ｐＮＬ−Ｒｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−ＡＶＢ−ＶＰ１−３
遺伝子座 ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４− １０５３８ｂｐ ＤＮＡ 環状 ＳＹＮ ２０１６年３月２３日
定義 ノックアウトＰＶ２発現、５４４８ Ａ−Ｇ
アクセッション ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−
生物名 不明
参照 １（塩基１〜１０５３８）
コメント ＳＥＣＩＤ／ファイル作成者Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ
コメント ＳＥＣＮＯＴＥＳ｜ＧｅｎＢａｎｋ １０５３８ｂｐ ＤＮＡ 環状 ２０１５年３月２０日
配列の特徴 存在位置／小項目
misc_feature ８４．．８１５
／註記＝「Ｒｅｐ７８ ５’」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐ７８」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐ７８ ５’」
misc_feature ７５６．．８１５
／註記＝「Ｒｅｐ５２ ５’」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐ５２」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐ５２ ５’」
misc_feature ８１６．．３８８６
／註記＝「ヒトコラーゲンイントロン」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｈ Ｃｏｌｌ Ｉｎｔ」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「ヒトコラーゲンイントロン」
misc_feature ３８８７．．５０１７
／註記＝「Ｒｅｐ５２ ３’」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐ５２」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐ５２ ３’」
misc_feature ３８８７．．５０１７
／註記＝「Ｒｅｐ７８ ３’」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐ７８」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐ７８ ３’」
misc_feature ４７４１．．４７４２
／註記＝「スプライスドナー」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ＳＤ」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「スプライスドナー」
misc_feature ４７４１．．５０６１
／註記＝「Ｒｅｐイントロン」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐ ｉｎｔ」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐイントロン」
misc_feature ５０３３．．５０３４
／註記＝「スプライスアクセプター」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ＳＡ」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「スプライスアクセプター」
ＣＤＳ ５０３７．．７２５３
／遺伝子＝「ＶＰ１」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ＶＰ１」
misc_feature ５０６０．．５０６１
／註記＝「スプライスアクセプター」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ＳＡ」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「スプライスアクセプター」
misc_feature ５０６２．．５０８６
／註記＝「ＲＥＰ６８／４０ ３’末端 ＡＡＶ２ ｗｔは、ＲＬＡＲＧＨＳＬ（配列番号４３）であり、ｒｈ．７４カプシドを伴い、それはＲＬＡＲＧＱＰＬ ！（配列番号４４）」である
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ＲＥＰ６８／４０」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「ＲＥＰ６８／４０ ３’末端 ＡＡＶ２ ｗｔは、ＲＬＡＲＧＨＳＬ（配列番号４３）であり、ｒｈ．７４カプシドを伴い、それは、ＲＬＡＲＧＱＰＬ ！（配列番号４４）」である
ＣＤＳ ５６４６．．７２５３
／遺伝子＝「ＶＰ３」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
misc_feature 補体（７２５４．．７４１１）
／註記＝「３’ＵＴＲ」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「３」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「３’ＵＴＲ」
misc_feature ７４２８．．７５０７
／註記＝「ｐ５プロモーター」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ｐ５」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「ｐ５プロモーター」
ＣＤＳ 補体（８８９３．．９７５３）
／遺伝子＝「ａｍｐ」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ａｍｐ」
起源 （配列番号１）
ｐＮＬ−Ｒｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−ＡＶＢ−ＶＰ１−３
遺伝子座 ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４− １３８５０ｂｐ ＤＮＡ 環状 ＳＹＮ ２０１６年３月２３日
定義 ｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ−−Ｎ６９６〜４０１１産物（ＮｈｅＩ．．６〜ＮｓｉＩ．．３３３１が切断されたもの）の、ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−ＡＶＢ−ＶＰ２−ＮＮ（ＮｓｉＩ．．５４６４〜ＮｈｅＩ．．５４５１が切断されたもの）へのライゲーション
アクセッション ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−
生物名 不明
参照 １（塩基１〜１３８５０）
コメント ＳＥＣＮＯＴＥＳ｜ベクター分子：ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−ＡＶＢ−ＶＰ２−ＮＮ（ＮｓｉＩ．．５４６４〜ＮｈｅＩ．．５４５１が切断されたもの）
断片末端：ＮｓｉＩおよびＮｈｅＩ
断片サイズ：１０５２５
挿入分子：ｐＸ６０１−ＡＡＶ−ＣＭＶ−−Ｎ６９６〜４０１１産物（ＮｈｅＩ．．６〜ＮｓｉＩ．．３３３１が切断されたもの）
断片末端：ＮｈｅＩおよびＮｓｉＩ
断片サイズ：３３２５
配列の特徴 存在位置／小項目
misc_feature ８４．．８１５
／註記＝「Ｒｅｐ６８ ５’」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐ６８」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐ６８ ５’」
misc_feature ８４．．８１５
／註記＝「Ｒｅｐ７８ ５’」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐ７８」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐ７８ ５’」
misc_feature ７５６．．８１５
／註記＝「Ｒｅｐ４０ ５’」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐ４０」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐ４０ ５’」
misc_feature ７５６．．８１５
／註記＝「Ｒｅｐ５２ ５’」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐ５２」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐ５２ ５’」
misc_feature ８１６．．３８８６
／註記＝「ヒトコラーゲンイントロン」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｈ Ｃｏｌｌイントロン」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「ヒトコラーゲンイントロン」
misc_feature ３８８７．．５０１７
／註記＝「Ｒｅｐ５２ ３’」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐ５２」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐ５２ ３’」
misc_feature ３８８７．．５０１７
／註記＝「Ｒｅｐ７８ ３’」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐ７８」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐ７８ ３’」
misc_feature ４７４１．．４７４２
／註記＝「スプライスドナー」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ＳＤ」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「スプライスドナー」
misc_feature ４７４１．．５０６１
／註記＝「Ｒｅｐイントロン」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐイントロン」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐイントロン」
misc_feature ５０３３．．５０３４
／註記＝「スプライスアクセプター」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ＳＡ」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「スプライスアクセプター」
ＣＤＳ ５０３７．．１０５６５
／遺伝子＝「ＶＰ２−Ｃａｓ９」
／産物＝「融合タンパク質」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ＶＰ２−Ｃａｓ９」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「融合タンパク質」
misc_feature ５０６０．．５０６１
／註記＝「スプライスアクセプター」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ＳＡ」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「スプライスアクセプター」
misc_feature ５０６２．．５０８６
／註記＝「ＲＥＰ６８／４０ ３’末端 ＡＡＶ２ ｗｔは、ＲＬＡＲＧＨＳＬ（配列番号４３）であり、ｒｈ．７４カプシドを伴い、それはＲＬＡＲＧＱＰＬ ！（配列番号４４）」である
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ＲＥＰ６８」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「ＲＥＰ６８／４０ ３’末端 ＡＡＶ２ ｗｔは、ＲＬＡＲＧＨＳＬ（配列番号４３）であり、ｒｈ．７４カプシドを伴い、それは、ＲＬＡＲＧＱＰＬ ！（配列番号４４）」である
misc_feature ５０８４．．５０８６
／註記＝「Ｒｅｐ ６８／４０ 終止」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「Ｒｅｐ」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「Ｒｅｐ ６８／４０ 終止」
ＣＤＳ ５４５７．．８７７２
／遺伝子＝「ｓａＣａｓ９」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ｓａＣａｓ９」
misc_feature ８７３０．．８７７１
／遺伝子＝「ＯＬＬＡＳ」
／産物＝「エピトープタグ」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
misc_feature 補体（１０５６６．．１０７２３）
／註記＝「３’ＵＴＲ」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「３」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「３’ＵＴＲ」
misc_feature １０７４０．．１０８１９
／註記＝「ｐ５プロモーター」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「領域」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ｐ５」
／ＳＥＣＤｅｓｃｒ＝「ｐ５プロモーター」
ＣＤＳ 補体（１２２０５．．１３０６５）
／遺伝子＝「ａｍｐ」
／ＳＥＣＤｒａｗＡｓ＝「遺伝子」
／ＳＥＣＳｔｙｌｅＩｄ＝１
／ＳＥＣＮａｍｅ＝「ａｍｐ」
起源 （配列番号２）
Ｓｔａｐｈ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９）
（配列番号３）
ｐＡＡＶｒｈ７４−ＶＰ１−３
遺伝子座 ｐＡＡＶｒｈ７４−ＶＰ１−３ １０５３８ｂｐ ＤＮＡ 環状 ＳＹＮ ２０１６年９月１９日
定義 ノックアウトＶＰ２発現、５４４８ Ａ−Ｇ
アクセッション ｐＡＡＶｒｈ７４−ＶＰ１−３
参照 １（塩基１〜１０５３８）
配列の特徴 存在位置／小項目
misc_feature ８４．．８１５
／註記＝「Ｒｅｐ７８ ５’」
misc_feature ７５６．．８１５
／註記＝「Ｒｅｐ５２ ５’」
misc_feature ８１６．．３８８６
／註記＝「ヒトコラーゲンイントロン」
misc_feature ３８８７．．５０１７
／註記＝「Ｒｅｐ５２ ３’」
misc_feature ３８８７．．５０１７
／註記＝「Ｒｅｐ７８ ３’」
misc_feature ４５３４．．４６８６
／遺伝子＝「ｐ４０」
misc_feature ４７４１．．４７４２
／註記＝「スプライスドナー」
misc_feature ４７４１．．５０６１
／註記＝「Ｒｅｐイントロン」
misc_feature ５０３３．．５０３４
／註記＝「スプライスアクセプター」
ＣＤＳ ５０３７．．７２５３
／遺伝子＝「ＶＰ１」
misc_feature ５０６０．．５０６１
／註記＝「スプライスアクセプター」
ＣＤＳ ５６４６．．７２５３
／遺伝子＝「ＶＰ３」
misc_feature 補体（７２５４．．７４１１）
／註記＝「３’ＵＴＲ」
misc_feature ７４２８．．７５０７
／註記＝「ｐ５プロモーター」
ＣＤＳ 補体（８８９３．．９７５３）
／遺伝子＝「ａｍｐ」
起源 （配列番号４）
ｐＡＡＶｒｈ７４−Ｃａｓ９−ＶＰ２
遺伝子座 ｐＡＡＶｒｈ７４−Ｃａｓ９−ＶＰ １３８５９ｂｐ ＤＮＡ 環状 ＳＹＮ ２０１７年３月９日
参照 １（塩基１〜１３８５９）
配列の特徴 存在位置／小項目
misc_feature ８４．．８１５
／註記＝「Ｒｅｐ６８ ５’」
misc_feature ８４．．８１５
／註記＝「Ｒｅｐ７８ ５’」
misc_feature ７５６．．８１５
／註記＝「Ｒｅｐ４０ ５’」
misc_feature ７５６．．８１５
／註記＝「Ｒｅｐ５２ ５’」
misc_feature ８１６．．３８８６
／註記＝「ヒトコラーゲンイントロン」
misc_feature ３８８７．．５０１７
／註記＝「Ｒｅｐ５２ ３’」
misc_feature ３８８７．．５０１７
／註記＝「Ｒｅｐ７８ ３’」
misc_feature ４５３４．．４６８６
／遺伝子＝「ｐ４０ ｐｒｏ」
misc_feature ４７４１．．４７４２
／註記＝「スプライスドナー」
misc_feature ４７４１．．５０６１
／註記＝「Ｒｅｐイントロン」
misc_feature ５０３３．．５０３４
／註記＝「スプライスアクセプター」
misc_feature ５０６０．．５０６１
／註記＝「スプライスアクセプター」
misc_feature ５０８４．．５０８６
／註記＝「Ｒｅｐ ６８／４０ 終止」
ＣＤＳ ５５３２．．８７８１
／遺伝子＝「’ｓａＣａｓ９」
misc_feature ８７３９．．８７８０
／産物＝「ＯＬＬＡＳタグエピトープタグ」
ＣＤＳ ８７８６．．１０５７４
／遺伝子＝「ｒｈ７４ ｃａｐ」
／コドン＿開始＝３
／翻訳＝「ＤＲ」
misc_feature 補体（１０５７５．．１０７３２）
／註記＝「３’ＵＴＲ」
misc_feature １０７４９．．１０８２８
／註記＝「ｐ５プロモーター」
ＣＤＳ 補体（１２２１４．．１３０７４）
／遺伝子＝「ａｍｐ」
起源 （配列番号５）
ｐＨＥＬＰ
遺伝子座 ｐＨＥＬＰ １１６３５ｂｐ ＤＮＡ 環状 ＳＹＮ ２０１６年７月１９日
参照 １（塩基１〜１１６３５）
配列の特徴 存在位置／小項目
misc_feature 補体（２５８．．１８４１）
／註記＝「Ａｄ５ Ｅ２Ａ ＤＢＰ」
misc_feature ８３９．．９０３
／註記＝「Ｅ２Ａプライマー／プローブ領域」
misc_feature ５６４７．．８２６７
／註記＝「Ａｄ５ Ｅ４ 遺伝子」
misc_feature 補体（８５４６．．８６６２）
／註記＝「５２Ｋ 部分的」
misc_feature ８６６１．．９１２１
／註記＝「ＶＡ ＲＮＡ領域」
ＣＤＳ 補体（１０１８２．．１１０４２）
／遺伝子＝「ａｍｐ」
起源 （配列番号６）
ｓｃＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌｕｃ２Ｐｖ２
遺伝子座 ｓｃＡＡＶ−ＣＭＶ−ｌｕｃ２Ｐｖ ５９６８ｂｐ ＤＮＡ 環状 ＳＹＮ ２０１４年１２月８日
参照 １（塩基１〜５９６８）
配列の特徴 存在位置／小項目
misc_feature １．．１０６
／遺伝子＝「ｍＩＴＲ」
misc_feature １４０．．７７４
／遺伝子＝「ＣＭＶｐｒｏ」
ＣＤＳ ８０６．．２５８１
／遺伝子＝「ｌｕｃ２Ｐ」
misc_feature ２６６８．．２７７１
／註記＝「３’ＩＴＲ」
misc_feature ３３１９．．３３６０
／註記＝「細菌性プロモーター」
misc_feature ３４３４．．３７０２
／註記＝「ＳＶ４０プロモーター」
misc_feature ３７８５．．４５７９
／註記＝「Ｎｅｏ／Ｋａｎ」
misc_feature ４５８１．．４８３３
／註記＝「ＨＳＶ ｔｋ ポリＡ」
misc_feature ５３２５．．５９１２
／註記＝「ｐＭＢ１ ｏｒｉ」
起源 （配列番号７）
ｐＡＡＶ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ−ｕＤ
遺伝子座 ｐＡＡＶ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ−ｕＤ ７１４１ｂｐ ＤＮＡ 環状 ＳＹＮ ２０１７年３月２３日
定義 ｐＡＡＶ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ−ｕＤｙｓ 環化型
配列の特徴 存在位置／小項目
misc_feature １．．１３０
／遺伝子＝「ＩＴＲ」
misc_feature １６２．．３７４２
／註記＝「ｈｕＵＤｙｓ」
misc_feature ３８０８．．４０３９
／遺伝子＝「ｂＧＨ ｐＡ」
misc_feature 補体（４０４６．．４１２６）
／遺伝子＝「ｓｇＲＮＡ足場」
misc_feature 補体（４１４７．．４３９５）
／遺伝子＝「ｈＵ６」
misc_feature ４４０４．．４５４４
／遺伝子＝「ＩＴＲ」
ＣＤＳ ５４６１．．６３２１
／遺伝子＝「Ａｍｐ」
misc_feature ６４６９．．７１３６
／遺伝子＝「ｐＵＣ」
起源 （配列番号８）
スペーサー （配列番号９）
Ｄｍｄ ｇＲＮＡ １（配列番号１０）
ＡＴＡＴＡＡＴＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＣＡＴ
Ｄｍｄ ｇＲＮＡ ２（配列番号１１）
ＴＡＡＴＡＴＧＣＣＣＴＧＴＡＡＴＡＴＡＡ
Ｄｍｄ ｇＲＮＡ ３（配列番号１２）
ＴＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＴＣＴＴＴＧ
Ｄｍｄ ｇＲＮＡ ４（配列番号１３）
ＧＣＡＡＴＴＡＡＴＴＧＧＡＡＡＡＴＧＴＧ
Ｄｍｄ ｇＲＮＡ ５（配列番号１４）
ＣＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＧＧＴＡＡＡＡＴＣＡ
Ｄｍｄ ｇＲＮＡ ６（配列番号１５）
ＣＡＧＴＡＡＴＧＴＧＴＣＡＴＡＣＣＴＴＣ
Ｄｍｄ ｇＲＮＡ ７（配列番号１６）
ＣＡＧＧＧＣＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴＴＡＧＡ
Ｄｍｄ ｇＲＮＡ ８（配列番号１７）
ＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＣＴＡＴＴＴＣＡ
ｓｐＣａｓ９（配列番号１８）
＞ｓｐ｜Ｑ９９ＺＷ２｜ＣＡＳ９＿ＳＴＲＰ１ ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ Ｃａｓ９／Ｃｓｎ１ ＯＳ＝Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ 血清型 Ｍ１ ＧＮ＝ｃａｓ９ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１
Ｃｐｆ１（配列番号１９）
ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ Ｃｐｆ１ ＯＳ＝Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｕ１１２株）ＧＮ＝ｃｐｆ１ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１
ＳｐＣａｓ９ ＰＡＭ（配列番号２０）
ＮＧＧ
ＳｐＣａｓ９ Ｄ１１３５Ｅ変異体ＰＡＭ（配列番号２１）
ＮＧＧ
ＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲ変異体ＰＡＭ（配列番号２２）
ＮＧＣＧ
ＳｐＣａｓ９ ＥＱＲ変異体ＰＡＭ（配列番号２３）
ＮＧＡＧ
ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ変異体ＰＡＭ１（配列番号２４）
ＮＧＡＮ
ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ変異体ＰＡＭ１（配列番号２５）
ＮＧＮＧ
ＳａＣａｓ９ ＰＡＭ１（配列番号２６）
ＮＮＧＲＲＴ
ＳａＣａｓ９ ＰＡＭ２（配列番号２７）
ＮＮＧＲＲ（Ｎ）
ＮＭＣａｓ９ ＰＡＭ（配列番号２８）
ＮＮＮＮＧＡＴＴ
ＳＴＣａｓ９ ＰＡＭ（配列番号２９）
ＮＮＡＧＡＡＷ
ＴＤ Ｃａｓ９ ＰＡＭ（配列番号３０）
ＮＡＡＡＡＣ
リンカー１ （配列番号３１）
ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ
リンカー２（配列番号３２）
ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ
リンカー３（配列番号３３）
ＧＧＧＧＧＧＧＧ
リンカー４（配列番号３４）
ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ
リンカー５（配列番号３５）
Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）
外部カプシド発現のためのｓａＣａｓ９−ＶＰ２融合ペプチド（配列番号３６）
（ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−ＡＶＢ−ＶＰ２ＮＮ−ＶＰ３ｋｎｏｃｋ−Ｃａｓ９ｕｐｄａｔｅ ｂｐ５５３２で開始）
ＶＰ１タンパク質（配列番号３７）
ＶＰ１の翻訳（ｐＡＡＶｒｈ７４−ＶＰ１−３ ｂｐ５０３７で開始）
ＶＰ３タンパク質（配列番号３８）
ＶＰ３の翻訳（ｐＡＡＶｒｈ７４−ＶＰ１−３ ｂｐ５６４６で開始）
ＶＰ２タンパク質（配列番号３９）
ＶＰ２の翻訳（ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−ＡＶＢ−ＶＰ２ ｂｐ５４４８で開始）
ｄＳａＣａｓ９タンパク質（配列番号４０）
ｄＳａＣａｓ９の翻訳（ｐＸ６０３−ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＮＬＳ−ｄＳａＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＨＡ−ｂＧＨｐＡ ｂｐ７００で開始）
ＣＭＶプロモーター（配列番号４１）
Ｕ６ プロモーター（配列番号４２）
２２８Ｃａｓ９ＶＰ２ 融合タンパク質（配列番号４５）
ＶＰ２の翻訳（ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−ＡＶＢ−ＶＰ２−ＮＮ−ＶＰ３ ｋｎｏｃｋＳｐｅ ｂｐ５４４８で開始）
３５０Ｃａｓ９ＶＰ２融合タンパク質（配列番号４６）
ＶＰ２の翻訳（ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−ＡＶＢ−ＶＰ２−ＮＮ−ＶＰ３ ｋｎｏｃｋＳｐｅ ｂｐ５４４８で開始）
４１９Ｃａｓ９ＶＰ２融合タンパク質（配列番号４７）
ＶＰ２の翻訳（ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−ＡＶＢ−ＶＰ２−ＮＮ−ＶＰ３ ｋｎｏｃｋＳｐｅ ｂｐ５４４８で開始）
６８４Ｃａｓ９ＶＰ２融合タンパク質（配列番号４８）
ＶＰ２の翻訳（ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−ＡＶＢ−ＶＰ２−ＮＮ−ＶＰ３ ｋｎｏｃｋＳｐｅ ｂｐ５４４８で開始）
６８９Ｃａｓ９ＶＰ２融合タンパク質（配列番号４９）
ＶＰ２の翻訳（ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−ＡＶＢ−ＶＰ２−ＮＮ−ＶＰ３ ｋｎｏｃｋＳｐｅ ｂｐ５４４８で開始）
ｓａＣａｓ９バージョン２（配列番号５０）
ｓａＣａｓ９の翻訳（ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４−ＡＶＢ−ＶＰ２ＮＮ−ＶＰ３ｋｎｏｃｋ−Ｃａｓ９ｕｐｄａｔｅ ｂｐ５５３２で開始）
Ｇ４Ｓリンカーペプチド（配列番号５１）
ＧＧＧＧＳ
Ｇ４Ｓリンカーポリヌクレオチド（配列番号５２）
ｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇｃａｇｃ
１５−ｍｅｒ Ｇ４Ｓリンカー（配列番号５３）
（ＧＧＧＧＳ）３
１８−ｍｅｒ Ｇ４Ｓリンカー（配列番号５４）
ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ
２０−ｍｅｒ Ｇ４Ｓリンカー（配列番号５５）
（ＧＧＧＧＳ）４
Ｇ３Ｓリンカー（配列番号５６）
ＧＧＧＳ
ｐＡＡＶｒｈ７４−ＶＰ１−３ ＶＰ２発現ノックアウト、５４４８ Ａ−Ｇ（配列番号５７）
完全ＶＰ遺伝子（配列番号５８）
＞ＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１カプシド遺伝子 ｒｈ７４ ｃａｐ
完全ＶＰタンパク質 （配列番号５９）
＞ｒｈ７４ ｃａｐのＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１タンパク質翻訳
＞ＶＰ２の代替開始部位＝ａａ１３７
＞挿入部位１＝ａａ２２８
＞挿入部位２＝ａａ３５０
＞挿入部位３＝ａａ４１９
＞挿入部位４＝ａａ６８４
＞挿入部位５＝ａａ６８９
Ｃｆａスプリットインテイン（配列番号６０）
＞ＣｆａＮ＝ａａ１〜１０１
＞ＣｆａＣ＝ａａ１０２〜１３６
＞アクセプターリシン残基＝ａａ７０（下線）
＞アクセプターｍｅｔ残基１＝ａａ７５（下線）
＞アクセプターｍｅｔ残基２＝ａａ８１（下線）

Claims (90)

  1. 改変ウイルスカプシドタンパク質であって、前記ウイルスカプシドタンパク質の内部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質またはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含む、改変ウイルスカプシドタンパク質。
  2. １つまたは複数のリンカーをさらに含む、請求項１に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  3. 前記１つまたは複数のリンカーが、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号５１、またはそれらの各々の等価物を含む、請求項２に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  4. 前記Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物が、モジュール式のインテインベースの集合によって前記ウイルスカプシドタンパク質の内部にコンジュゲートされている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  5. 前記モジュール式のインテインベースの集合が、高速インテインベースの集合である、請求項４に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  6. 前記モジュール式のインテインベースの集合が、コンセンサス高速（Ｃｆａ）ベースの集合である、請求項４に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  7. 前記ウイルスカプシドタンパク質が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質である、前記請求項のいずれか一項に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  8. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のうちの１つもしくは複数、またはそれらの各々の等価物を含む、請求項７に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  9. 前記ＡＡＶウイルスタンパク質が、ＶＰ２またはその等価物を含む、請求項８に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  10. 前記Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物が、配列番号５９のアミノ酸２２８、３５０、４１９、６８４または６８９位でＶＰ２にコンジュゲートされている、請求項９に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  11. 前記Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物が、１つまたは複数のリンカーを介して、配列番号５９のアミノ酸２２８、３５０、４１９、６８４または６８９位でＶＰ２にコンジュゲートされている、請求項１０に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  12. 前記Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、もしくはＧｅｏＣａｓ９を含むか、またはそれに由来する、前記請求項のいずれか一項に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  13. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９またはその等価物またはその誘導体である、請求項１２に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  14. 前記改変カプシドタンパク質が、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８もしくは配列番号４９、またはそれらの各々の等価物を含む、請求項９に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  15. 改変ウイルスカプシドタンパク質であって、モジュール式のインテインベースの集合によって前記ウイルスカプシドタンパク質の外部にコンジュゲートされたＣａｓ９タンパク質またはその等価物を有するウイルスカプシドタンパク質を含む、改変ウイルスカプシドタンパク質。
  16. １つまたは複数のリンカーをさらに含む、請求項１５に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  17. 前記１つまたは複数のリンカーが、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号５１、またはそれらの各々の等価物を含む、請求項１６に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  18. 前記１つまたは複数のリンカーが、配列番号３１を含む、請求項１６に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  19. 前記モジュール式のインテインベースの集合が、高速インテインベースの集合である、請求項１８に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  20. 前記モジュール式のインテインベースの集合が、コンセンサス高速（Ｃｆａ）ベースの集合である、請求項１８に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  21. 前記ウイルスカプシドタンパク質が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  22. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のうちの１つもしくは複数、またはそれらの各々の等価物を含む、請求項２１に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  23. 前記ＡＡＶウイルスタンパク質が、ＶＰ２またはその等価物を含む、請求項２２に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  24. 前記Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物が、ＶＰ２のＮ末端にコンジュゲートされている、請求項２３に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  25. 前記Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、もしくはＧｅｏＣａｓ９を含むか、またはそれに由来する、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  26. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９またはその等価物またはその誘導体である、請求項２５に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  27. 前記改変カプシドタンパク質が、配列番号３６またはその等価物を含む、請求項２６に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質。
  28. 請求項１〜２７のいずれかに記載の改変ウイルスカプシドタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  29. 請求項２８の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターまたは宿主細胞。
  30. 請求項４または１８に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質を調製する方法であって、（ｉ）前記Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物とスプリットインテインのＮ末端断片とを含む融合タンパク質を、（ｉｉ）前記ウイルスカプシドタンパク質とスプリットインテインのＣ末端断片とを含む融合タンパク質と、モジュール式のインテインベースの集合に適する条件下でカップリングさせることを含む方法。
  31. スプリットインテインの前記Ｎ末端断片およびスプリットインテインの前記Ｃ末端断片の少なくとも一方が、高速インテインに由来する、請求項３０に記載の方法。
  32. スプリットインテインの前記Ｎ末端断片およびスプリットインテインの前記Ｃ末端断片のうちの少なくとも一方が、Ｃｆａインテインに由来する、請求項３０に記載の方法。
  33. 改変ウイルスカプシドタンパク質を調製する方法であって、請求項２８に記載のポリヌクレオチドを発現させることを含む方法。
  34. 改変カプシドを含む組換えウイルス粒子であって、前記改変カプシドが、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質を含む、組換えウイルス粒子。
  35. 前記改変カプシドが、組換えウイルス粒子１個あたり１つ〜５つの間の改変ウイルスカプシドタンパク質を含む、請求項３４に記載の組換えウイルス粒子。
  36. 前記改変カプシド内にキャプシド内封入されているポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３４または３５に記載の組換えウイルス粒子。
  37. 前記ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の組換えウイルス粒子。
  38. 前記１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチドが、
    ａ．ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む融合ポリヌクレオチド、または
    ｂ．ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むポリヌクレオチド
    を含む、請求項３７に記載の組換えウイルス粒子。
  39. 治療用ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の組換えウイルス粒子。
  40. 前記治療用ポリヌクレオチドが、修復鋳型を含む、請求項３９に記載の組換えウイルス粒子。
  41. Ｃａｓ９またはその等価物をウイルスカプシドの内部に発現する改変ウイルス粒子の生成のための組換え発現システムであって、
    （ａ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドであって、前記融合タンパク質が前記Ｃａｓ９またはその等価物とウイルスカプシドタンパク質とを含む、プラスミドと、
    （ｂ）ヘルパープラスミドと
    を含む、組換え発現システム。
  42. Ｃａｓ９またはその等価物をウイルスカプシドの内部に発現する改変ウイルス粒子の生成のための組換え発現システムであって、
    （ａ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドであって、前記融合タンパク質が前記Ｃａｓ９またはその等価物とスプリットインテインのＮ末端断片とを含む、プラスミドと、
    （ｂ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドであって、前記融合タンパク質がウイルスカプシドタンパク質とスプリットインテインのＣ末端断片とを含む、プラスミドと、
    （ｃ）ヘルパープラスミドと
    を含む、組換え発現システム。
  43. プラスミド（ａ）およびプラスミド（ｂ）が、同じかまたは異なるプラスミドである、請求項４２に記載の組換え発現システム。
  44. スプリットインテインの前記Ｎ末端断片およびスプリットインテインの前記Ｃ末端断片の少なくとも一方が、高速インテインに由来する、請求項４２または４３に記載の組換え発現システム。
  45. スプリットインテインの前記Ｎ末端断片およびスプリットインテインの前記Ｃ末端断片の少なくとも一方が、Ｃｆａインテインに由来する、請求項４２または４３に記載の組換え発現システム。
  46. 前記ウイルスカプシドタンパク質が、ＡＡＶカプシドタンパク質である、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の組換え発現システム。
  47. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のうちの１つもしくは複数、またはそれらの各々の等価物を含む、請求項４６に記載の組換え発現システム。
  48. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＶＰ２またはその等価物を含む、請求項４７に記載の組換え発現システム。
  49. 前記Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物が、配列番号５９のアミノ酸２２８、３５０、４１９、６８４または６８９位でＶＰ２に融合されている、請求項４８に記載の組換え発現システム。
  50. 前記Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物が、１つまたは複数のリンカーを介して、配列番号５９のアミノ酸２２８、３５０、４１９、６８４または６８９位でＶＰ２に融合されている、請求項４９に記載の組換え発現システム。
  51. Ｃａｓ９またはその等価物をウイルスカプシドの外部に発現する改変ウイルス粒子の生成のための組換え発現システムであって、
    （ａ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドであって、前記融合タンパク質が前記Ｃａｓ９またはその等価物とウイルスカプシドタンパク質とを含む、プラスミドと、
    （ｂ）ヘルパープラスミドと
    を含む、組換え発現システム。
  52. Ｃａｓ９またはその等価物をウイルスカプシドの外部に発現する改変ウイルス粒子の生成のための組換え発現システムであって、
    （ａ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドであって、前記融合タンパク質が前記Ｃａｓ９またはその等価物とスプリットインテインのＮ末端断片とを含む、プラスミドと、
    （ｂ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドであって、前記融合タンパク質がウイルスカプシドタンパク質とスプリットインテインのＣ末端断片とを含む、プラスミドと、
    （ｃ）ヘルパープラスミドと
    を含む、組換え発現システム。
  53. プラスミド（ａ）およびプラスミド（ｂ）が、同じかまたは異なるプラスミドである、請求項５２に記載の組換え発現システム。
  54. スプリットインテインの前記Ｎ末端断片およびスプリットインテインの前記Ｃ末端断片の少なくとも一方が、高速インテインに由来する、請求項５２または５３に記載の組換え発現システム。
  55. スプリットインテインの前記Ｎ末端断片およびスプリットインテインの前記Ｃ末端断片の少なくとも一方が、Ｃｆａインテインに由来する、請求項５２または５３に記載の組換え発現システム。
  56. 前記ウイルスカプシドタンパク質が、ＡＡＶカプシドタンパク質である、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の組換え発現システム。
  57. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のうちの１つもしくは複数、またはそれらの各々の等価物を含む、請求項５６に記載の組換え発現システム。
  58. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＶＰ２またはその等価物を含む、請求項５７に記載の組換え発現システム。
  59. 前記Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物が、ＶＰ２のＮ末端にコンジュゲートされている、請求項５１〜５８のいずれか一項に記載の組換え発現システム。
  60. プラスミド（ａ）が、リンカーをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４１〜５９のいずれか一項に記載の組換え発現システム。
  61. プラスミド（ｂ）が、リンカーをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４２または５２に記載の組換え発現システム。
  62. 前記リンカーが、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号５１、またはそれらの各々の等価物を含む、請求項６０または６１に記載の組換え発現システム。
  63. 前記Ｃａｓ９タンパク質またはその等価物が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、請求項４１〜６２のいずれか一項に記載の組換え発現システム。
  64. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９またはその等価物である、請求項６３に記載の組換え発現システム。
  65. 前記融合タンパク質が、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８もしくは配列番号４９、またはそれらの各々の等価物を含む、請求項４１に記載の組換え発現システム。
  66. 前記融合タンパク質が、配列番号３６またはその等価物を含む、請求項５１に記載の組換え発現システム。
  67. プラスミド（ａ）が、ＶＰ２をコードするポリヌクレオチド、Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド、およびリンカーをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチド、またはそれらの各々の等価物を含む、請求項４１または５１に記載の組換え発現システム。
  68. 前記ヘルパープラスミドが、ＶＰ１をコードするＤＮＡ配列、ＶＰ３をコードするＤＮＡ配列、もしくはＶＰ１とＶＰ３の両方をコードするＤＮＡ配列、またはそれらの各々の等価物の群から選択されるＤＮＡ配列を含む、請求項４１〜６７のいずれか一項に記載の組換え発現システム。
  69. 前記ヘルパープラスミドが、配列番号５７またはその等価物を含む、請求項６８に記載の組換え発現システム。
  70. １つまたは複数のｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４１〜６９のいずれか一項に記載の組換え発現システム。
  71. 治療用ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４１〜７０のいずれか一項に記載の組換え発現システム。
  72. Ｃａｓ９をウイルスカプシドの内部に発現する改変ＡＡＶを産生する方法であって、請求項４１〜５０または６５のいずれか一項に記載の組換え発現システムを１つまたは複数の細胞にトランスフェクトすることを含む方法。
  73. Ｃａｓ９をウイルスカプシドの外部に発現する改変ＡＡＶを産生する方法であって、請求項５１〜５９または６６のいずれか一項に記載の組換え発現システムを１つまたは複数の細胞にトランスフェクトすることを含む方法。
  74. 請求項７２または７３に記載の方法に従って産生される改変ＡＡＶ。
  75. 請求項１〜２７のいずれか一項に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質を含む、単離された組織。
  76. 請求項１〜２７のいずれか一項に記載の改変ウイルスカプシドタンパク質を有する非ヒトトランスジェニック動物。
  77. 遺伝子編集または遺伝子調節の方法であって、細胞を、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の組換えウイルス粒子と接触させることを含む方法。
  78. 遺伝子編集または遺伝子調節の方法であって、細胞を、請求項３４または３５に記載の組換えウイルス粒子、およびポリヌクレオチドを含む第２のウイルス粒子と接触させることを含む方法。
  79. 前記ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチドが、
    ａ．ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む融合ポリヌクレオチド、または
    ｂ．ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むポリヌクレオチド
    を含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 治療用ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記治療用ポリヌクレオチドが、修復鋳型を含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記接触させることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏにおいてである、請求項７７〜８２のいずれかに記載の方法。
  84. それを必要とする対象における遺伝子編集または遺伝子調節の方法であって、請求項３４または３５に記載の組換えウイルス粒子の有効量を前記対象に投与することを含む方法。
  85. それを必要とする対象における遺伝子編集または遺伝子調節の方法であって、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の組換えウイルス粒子の有効量を前記対象に投与することを含む方法。
  86. それを必要とする対象における遺伝子編集または遺伝子調節の方法であって、請求項３９または４０に記載の組換えウイルス粒子の有効量を前記対象に投与することを含む方法。
  87. 前記ポリヌクレオチドが、血友病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、アルファ１アンチトリプシン、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、脊髄性筋萎縮症、嚢胞性線維症、ＨＩＶ、サラセミア、コロイデレミア、パーキンソン病、レーベル先天黒内障、黄斑変性、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ欠損症、１色覚、クリグラー・ナジャー症候群、ポンペ病、Ｘ染色体連鎖性網膜分離症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、バッテン病、網膜変性、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、ムコ多糖症（Ｉ〜ＩＸ）、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の群から選択される疾患、障害または状態を処置するために選択される、請求項８５に記載の方法。
  88. 前記治療用ポリヌクレオチドが、血友病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、アルファ１アンチトリプシン、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、脊髄性筋萎縮症、嚢胞性線維症、ＨＩＶ、サラセミア、コロイデレミア、パーキンソン病、レーベル先天黒内障、黄斑変性、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ欠損症、１色覚、クリグラー・ナジャー症候群、ポンペ病、Ｘ染色体連鎖性網膜分離症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、バッテン病、網膜変性、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、ムコ多糖症（Ｉ〜ＩＸ）、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の群から選択される疾患、障害または状態を処置するために選択される、請求項８６に記載の方法。
  89. 前記血友病が、第ＶＩＩＩ因子欠損症または第ＩＸ因子欠損症の１つまたは複数を特徴とする、請求項８７または８８に記載の方法。
  90. 前記筋ジストロフィーが、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィーおよび眼咽頭筋型筋ジストロフィーから選択される、請求項８７または８８に記載の方法。
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