CN104603272B - 能够产生腺伴随病毒载体的细胞 - Google Patents

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Abstract

按照本发明，可以使用人工导入了能够表达miRNA的核酸的细胞，产生与常规载体的滴度相比滴度较高的AAV载体。使用所述细胞产生的AAV载体和含有所述病毒载体作为活性成分的组合物作为在基因疗法的研究或临床实践中的基因转移方法是非常有用的。

Description

能够产生腺伴随病毒载体的细胞
技术领域
本发明涉及在基因疗法的研究或临床领域中特别用于将基因转移进入人体中的能够产生具有高滴度的腺伴随病毒载体的细胞。
发明背景
目前，为了治疗癌症或感染以及治疗先天性遗传疾病，进行了使用病毒载体的基因疗法的许多尝试。在许多情况下，作为病毒载体，按惯例使用反转录病毒载体或腺病毒载体。
腺伴随病毒(AAV)是线性单链DNA病毒，可感染大范围物种(包括人)的细胞。AAV还感染其中分化终止的不发生细胞分裂的细胞，包括血细胞、肌肉细胞、神经细胞等。另外，因为AAV对人类不是致病性的，所以具有低的不良反应的风险，并且AAV的病毒颗粒是稳定的。出于这些原因，近来开发用于基因转移的AAV载体在继续进行之中。
为了产生用于基因转移的AAV载体，正如其它病毒载体一样，在形成病毒颗粒所需要的存在于野生型AAV基因组的元件中，将需要以顺式提供的元件和可以反式提供的元件分别导入用于病毒产生的细胞中和使它们在细胞中表达，因此防止在被AAV载体感染的宿主中野生型AAV的产生和AAV载体的自我复制(专利文献1)。
用于产生AAV载体的已确立的常规方法包括：1)将其中保留置于野生型AAV基因组各端的ITR并剔除rep和cap基因的AAV载体质粒导入，2)导入用于表达rep和cap基因的质粒以便以反式提供Rep和Cap蛋白，并且，因为AAV需要提供来自所谓辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒)的补充元件用于形成感染性病毒颗粒，所以3)用腺病毒感染(专利文献2)。
然而，通过上述方法获得的AAV载体从理论上说被腺病毒污染。腺病毒污染物必须排除或灭活，这是造成AAV载体滴度降低的原因。另外，对将被腺病毒污染的AAV载体给予人可能引起副作用(例如腺病毒感染或炎症)存有担忧。因此，开发了一种用于产生AAV载体的方法，其包括：用以替代上述步骤3)的步骤3')导入在腺病毒来源的元件中只表达形成AAV病毒颗粒所必需的元件的辅助质粒(无辅助病毒系统(Helper-free system)) (专利文献3)。按照所述方法产生的AAV载体不被腺病毒污染，因此是极安全的。
另一方面，对于预期用于基因疗法的研究或临床领域的AAV载体的产生，必须获得具有高滴度的病毒载体溶液。为此，根据来源于人的HeLa细胞或A549细胞产生恒定表达rep和cap基因的细胞系，并进行了控制这些基因的表达水平的尝试。然而，由此获得的AAV载体没有足够的滴度。因此，需要用于产生具有较高滴度的AAV载体的方法。
引用文献列表
专利文献
专利文献1：USP6093570
专利文献2：WO97/06272
专利文献3：WO97/17458。
发明概述
本发明要解决的问题
本发明的目的是提供在没有复杂操作的情况下获得具有高滴度的AAV载体溶液的细胞和包括使用所述细胞产生AAV载体的方法和试剂盒。
解决问题的技术方案
如上所述，对于预期用于基因疗法的研究或临床领域的AAV载体的产生，需要能够产生具有较高滴度的AAV载体的方法。本发明人潜心研究并最终发现，在产生AAV载体时，通过使用表达人工导入的miRNA (例如hsa-miR-196a1、hsa-miR-324或hsa-miR-342)的细胞，获得具有高于通过常规方法获得的载体的滴度的AAV载体。因此，完成了本发明。
本发明概述如下。本发明涉及：
[1] 一种能够产生AAV载体的细胞，其中表达人工导入的miRNA，
[2] [1]的细胞，其中人工导入的miRNA是选自hsa-miR-196a1、hsa-miR-324和hsa-miR-342的至少一种，
[3] 一种产生AAV载体的细胞，其是导入了待包封入病毒中的核酸的[1]或[2]的细胞，
[4] 一种用于产生AAV载体的方法，所述方法包括培养[3]的细胞的步骤，
[5] 一种用于产生AAV载体的试剂盒，其包含用于提供miRNA的核酸和用于提供形成AVV载体的病毒颗粒所必需的元件的核酸，
[6] 一种通过[4]的方法可获得的AAV载体，
[7] 一种通过在产生AAV载体的细胞中表达miRNA来选择可引起产生AAV载体的细胞产生AAV载体的能力提高的miRNA的方法，所述方法包括制备表达miRNA的AAV载体的混合物的步骤和选择在细胞中大量产生的AAV载体的步骤，和
[8] [7]的方法，所述方法包括下列(a)-(e)的步骤：
(a) 获得表达miRNA的AAV载体的混合物的步骤；
(b) 用表达miRNA的AAV载体的混合物感染细胞的步骤；
(c) 培养通过步骤(b)获得的细胞以获得由细胞产生的AAV载体混合物的步骤；
(d) 使用通过步骤(c)获得的AAV载体混合物重复步骤(b)和(c)一次或多次的步骤；和
(e) 获得编码在通过步骤(d)获得的AAV载体混合物中的miRNA的核酸的步骤。
发明效果
按照本发明，提供能够产生AAV载体的细胞。通过使用所述细胞，可在没有复杂操作的情况下产生具有高于通过常规方法获得的载体的滴度的AAV载体。另外，提供包括使用所述细胞产生AAV载体的方法和试剂盒。
具体实施方式
能够产生本发明的AAV载体的细胞(下文亦称为本发明的细胞)是表达产生AAV载体所必需的元件和人工导入的miRNA的细胞。本发明的产生AAV载体的细胞是导入了待包封入病毒颗粒中的核酸的本发明细胞。
为了产生本发明的细胞，待用作材料的细胞不受特别限制。细胞的实例包括哺乳动物(例如人、猴和啮齿动物)的细胞，其优选的实例包括293细胞(ATCC CRL-1573)、293T细胞(ATCC CRL-11268)、293F细胞、293FT细胞(全部都由Life Technologies生产)、G3T-hi细胞(WO06/035829)和用于AAV载体产生的市购可得的细胞系，例如AAV293细胞(由Stratagene Corp.生产)，其具有高的转化效率并恒定表达腺病毒E1基因。此外，可以使用经修饰以瞬时或恒定表达AAV载体产生所必需的一些蛋白质的细胞。
产生AAV载体所必需的元件的实例包括：(A) AAV来源的Rep和Cap蛋白，和(B)腺病毒来源的元件，例如E1a、E1b、E2、E4、VA RNA基因。用于向本发明细胞提供形成AVV载体的病毒颗粒所必需的元件的核酸的实例包括：(a)编码Rep蛋白的核酸、编码Cap蛋白的核酸，和(b)编码腺病毒来源的元件的核酸。这些核酸的形式不受限制。可将作为能够为所用细胞提供各种元件的一个或多个核酸构建体的这些核酸插入质粒或病毒载体中，然后可将核酸构建体导入细胞中。例如，使用市购可得的pAAV-RC1质粒和pHelper质粒(由Cell Biolabs,Inc.生产)。编码Cap蛋白的核酸在不同于编码的Cap蛋白的可读框中编码形成AAV颗粒所必需的装配激活蛋白(assembly-activating protein，AAP) (Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 2010, 第107卷, 第10220-10225页)。除非另有说明，否则本文所用的“编码Cap蛋白的核酸”意指除Cap蛋白以外还编码AAP的核酸。当破坏AAP功能的这类突变(自发或人为地)发生在编码Cap蛋白的核酸中时，可将编码AAP的核酸进一步导入本发明的细胞中。因为编码E1a和E1b蛋白的核酸被插入上述293细胞等的基因组中并恒定表达，因此不需要将该核酸导入细胞中。必要时，可根据所用的细胞，导入编码E1a和E1b蛋白的核酸。
用于导入核酸构建体的方法的实例包括瞬时导入方法和恒定导入方法。瞬时导入方法不受特别限制，可采用已知的瞬时导入方法，包括磷酸钙方法、脂转染方法、DEAE葡聚糖方法、聚乙烯亚胺方法和电穿孔方法。此外，可使用市购可得的试剂，例如TransIT (注册商标)-293 Reagent、TransIT (注册商标)-2020 (由Mirus Bio LLC生产)、Lipofectamine2000 Reagent (由Life Technologies生产)、Lipofectamine 2000CD Reagent (由LifeTechnologies生产)、FuGene (注册商标) Transfection Reagent (由Promega KK.生产)等。
将核酸恒定导入细胞的方法不受特别限制，可采用已知的恒定导入方法，包括：包括使用反转录病毒载体的方法和包括以与用于质粒的瞬时导入方法相同的方式将核酸导入细胞中并选择其中核酸整合到染色体的细胞的方法。对于包括使用反转录病毒载体的方法，可使用市购可得的试剂，例如反转录病毒构建系统(Retrovirus ConstructiveSystem) (由Takara Bio Inc.生产)。
本发明中miRNA的优选实例是通过在产生AAV载体的细胞中表达miRNA可引起产生AAV载体的细胞产生AAV载体的能力提高的miRNA。
本领域技术人员采用本文公开的选择方法(下文亦称本发明的选择方法)，可容易地选择通过在产生AAV载体的细胞中表达miRNA可引起产生AAV载体的细胞产生AAV载体的能力提高的miRNA。本发明的选择方法包括如下步骤：制备各自在细胞中表达不同的miRNA(例如人miRNA)的AAV载体的文库(混合物)，然后从文库中选出在细胞中以高水平产生的AAV载体。
产生AAV载体文库的方法的实例包括：制备其中将编码miRNA文库的核酸与待包封入病毒颗粒中的核酸连接的核酸构建体，然后将已知方法应用于核酸构建体以获得携带miRNA文库的AAV载体。对于核酸构建体的制备，可使用例如pAAV-MCS表达载体(由CellBiolabs, Inc.生产)，其是市购可得的AAV载体质粒。然后，将适于制备产生AAV载体的细胞(例如AAV293细胞)用携带miRNA文库的AAV载体感染。然后，将编码产生AAV载体所必需的元件的核酸构建体瞬时导入细胞中。培养细胞以获得从细胞中产生的AAV载体的混合物。使用由此获得的AAV载体，不止一次地重复上述步骤(感染、培养和载体获取)的循环。通过重复该循环，在AAV载体混合物中将携带用于表达引起AAV载体产生增加的miRNA的核酸的AAV载体浓缩。至于由此获得的AAV载体混合物中的AAV载体，测定AAV载体中所携带的miRNA的核苷酸序列。鉴定出因上述循环的重复而变得更频繁获得的miRNA，其被视为引起AAV载体产生增加的miRNA。由此选择的miRNA可优选地作为本发明细胞中的miRNA。miRNA的实例包括hsa-miR-196a1、hsa-miR-324和hsa-miR-342。
构成hsa-miR-196a1、hsa-miR-324和hsa-miR-342的RNA的核苷酸序列是已知的，并且编码它们的DNA序列分别以NCBI GENE ID：406972、442898和442909登记。另外，携带上述序列的miRNA表达质粒载体可市购获自Takara Bio Inc.等。
通过人工导入表达上述miRNA的核酸来制备本发明的细胞。人工导入的方法不受特别限制。例如，表达miRNA的核酸以核酸构建体(例如质粒等)的形式瞬时或恒定导入。核酸构建体的携带形式不受限制。核酸构建体可以只携带表达miRNA的核酸，或表达miRNA的核酸可由携带提供AAV载体产生所必需的元件的核酸或待包封入病毒颗粒中的核酸的相同核酸构建体携带。
将待包封入病毒颗粒中的核酸导入能够产生本发明的AAV载体的细胞中以制备本发明的产生AAV载体的细胞。由此制备的产生AAV载体的细胞也是本发明的一个方面。待包封入病毒颗粒中的核酸由来源于AAV的ITR序列和需要由AAV载体携带的核酸组成。需要由AAV载体携带的核酸的实例包括任何外源基因，例如编码多肽(酶、生长因子、细胞因子、受体、结构蛋白质等)的核酸、反义RNA、核酶、诱杀剂、诱导RNA干扰的RNA等。对于外源基因表达的控制，可将合适的启动子、增强子、终止子和其它转录调节元件插入核酸中。待包封入病毒颗粒中的核酸可以质粒的形式导入细胞中。可通过使用例如市购可得的pAAV-MCS表达载体(由Cell Biolabs, Inc.生产)等来构建质粒。
通过培养产生AAV载体的细胞进行本发明的AAV载体的生产，所述细胞通过包括将待包封入病毒颗粒中的核酸瞬时或恒定导入本发明细胞的步骤的方法获得。瞬时或恒定导入核酸的方法不受特别限制，例如，可以使用已知的上述瞬时导入方法或恒定导入方法作为核酸构建体的导入方法。
优选地，当表达miRNA的核酸以携带表达miRNA的核酸(单独或连同编码Rep蛋白和/或Cap蛋白的核酸一起)的表达质粒的形式瞬时导入时，本发明发挥更有效的作用。
在本发明的AAV载体的生产中，产生AAV载体的细胞的培养可在已知培养条件下进行。培养条件的实例包括但不限于在30-37℃的温度、95%的湿度和5-10%的CO2浓度下培养。细胞培养可在上述范围以外的温度、湿度和CO2浓度下进行，只要实现所需细胞生长和AAV载体的产生即可。
用于培养的培养基不受特别限制，只要它允许本发明的产生AAV载体的细胞的培养并实现AAV载体的产生即可。培养基的实例包括已知的培养基和无血清培养基，例如DMEM、IMDM、Ham's F12和RPMI-1640，其可市购获自Lonza、Life Technologies、Sigma-Aldrich Co. LLC等。培养基可含胎牛血清(FBS)、人血清来源的白蛋白等。
培养时间不受特别限制。例如，培养持续12-72小时，优选48-72小时。AAV载体溶液可获自培养上清液，或将所收集的细胞在合适的缓冲溶液中再悬浮后匀浆而获得的细胞匀浆物的离心上清液。在本发明中，由此获得的培养上清液或离心上清液原样保存，或在用过滤器过滤或通过获得AAV载体溶液的已知方法浓缩或纯化后通过合适的方法(例如冷冻)保存，直到用于所需目的。
通过使用本发明的产生AAV载体的细胞产生的AAV载体不受特别限制。AAV载体的实例包括来源于已有AAV血清型的重组AAV载体或新获自天然的野生型AAV。当产生本发明的细胞时，可通过选择合适的材料(例如编码Rep蛋白的核酸或编码Cap蛋白的核酸)产生基于需要使用的AAV血清型的重组AAV载体。例如，还产生这样的AAV载体，其中编码Rep蛋白的核酸从待包封入病毒颗粒中的核酸中剔除，以防止包封入病毒颗粒中的DNA插入靶细胞的基因组并增加外源基因的插入区。
如本文所用，AAV载体产生的程度以AAV载体的滴度表示。AAV载体的滴度是一定量的样品中的a)获自正常形成的AAV载体颗粒的基因组数目(基因组滴度)，或b) 根据实验测定的AAV载体对细胞的感染能力(感染性滴度)。需要时，载明AAV载体产生的程度。
用于测定基因组滴度的方法的实例包括这样的方法，其包括将含AAV载体的样品用核酸酶和然后蛋白酶处理以降解样品中的核酸杂质，然后通过PCR检测样品中的病毒基因组的拷贝数。
用于测定感染性滴度的方法的实例包括这样的方法，其包括将合适的靶细胞用系列稀释的含AAV载体的样品的溶液感染，检测转基因的表达和细胞形式的改变(细胞病)，并测定导入细胞中的原病毒的拷贝数。
按照本发明，还提供含有使用本发明的产生AAV载体的细胞获得的AAV载体作为有效成分的药物组合物。可按照用于基因疗法的AAV载体制剂的生产技术，适当地制备药物组合物。例如，可通过已知方法浓缩并纯化通过本发明的生产方法获得的AAV载体，然后配制成药物组合物。药物组合物可离体用于来自患者的细胞，或直接给予患者。
因此，本发明还提供治疗方法，所述方法包括给予含有通过使用本发明的产生AAV载体的细胞而获得的AAV载体作为有效成分的药物组合物。此外，本发明提供通过使用本发明的产生AAV载体的细胞而获得的AAV载体在制备药物中的用途。本发明还提供用于治疗的通过使用本发明的产生AAV载体的细胞而获得的AAV载体。
通过将待用于产生本发明的细胞的用于表达miRNA的核酸与用于提供形成AVV载体的病毒颗粒所必需的元件的核酸(编码Rep蛋白的核酸、编码Cap蛋白的核酸、编码腺病毒来源的蛋白的核酸)组合，来制备用于生产产生AAV载体的细胞的试剂盒。所有上述核酸可被组合或它们可适当组合以制备用于在细胞内提供所需RNA或蛋白质的核酸构建体。试剂盒可含有核酸构建体。试剂盒还可含有用于制备待包封入病毒颗粒中的核酸的载体或合适的细胞。
实施例
在下文中，通过实施例更具体地解释本发明，本发明不限于所述实施例。
实施例1：pAAV-AsRed2-miRNA文库质粒的构建
通过PCR获得从CMV启动子到聚腺苷酸信号的pAsRed2-C1载体(由ClontechLaboratories，Inc.生产)的约1.6 kb片段。同时，使用含有NotI的识别位点的扩增引物以将NotI识别位点加入PCR产物的各端。将该片段用NotI (由Takara Bio Inc.生产)处理，然后用作插入片段。另一方面，将pAAV-MCS载体(由Cell Biolabs, Inc.生产)用NotI处理，得到约2.9 kb片段。该片段用作载体片段。使用DNA连接试剂盒<Mighty Mix> (由Takara BioInc.生产)将所述载体片段和插入片段连接，得到重组质粒。用重组质粒转化大肠杆菌(E.coli) HST08优质感受态细胞(由Takara Bio Inc.生产，下文亦称大肠杆菌(Escherichiacoli))，以得到转化体。从转化体中提取质粒DNA，选择按从上游到下游的顺序插入有CMV启动子、AsRed2编码区、多克隆位点(MCS)和聚腺苷酸信号的质粒。该质粒亦称为pAAV-AsRed2载体。
将pAAV-AsRed2载体用BglII (由Takara Bio Inc.生产)和HindIII (由TakaraBio Inc.生产)处理。另一方面，将克隆至pBApo-CMV DNA的人miRNA文库(由Takara BioInc.生产)用BamHI (由Takara Bio Inc.生产)和HindIII处理，得到miRNA编码区的片段。使用DNA连接试剂盒(由Takara Bio Inc.生产)，将miRNA编码区片段与pAAV-AsRed2载体连接，条件是使用In-Fusion (注册商标) Advantage PCR克隆试剂盒(由ClontechLaboratories，Inc.生产)通过直接克隆，将含有BamHI或HindIII的内部识别位点的miRNA与pAAV-AsRed2载体连接。由此获得的重组质粒在以下实验中用作pAAV-AsRed2-miRNA文库质粒。
实施例2：AAV-miRNA文库载体的产生
(1) AAV293细胞的接种
将AAV293细胞(由Stratagene Corp.生产)以2.5 x 105个细胞/mL悬浮于含有10%FBS (由Thermo Scientific生产)和2 mM L-谷氨酸钠的DMEM (由Sigma-Aldrich Co. LLC生产)中。将4毫升悬液加入60 mm细胞培养皿(由IWAKI生产)中，在5% CO2和37℃下的培养箱(下文亦称37℃下的CO2培养箱)中培养过夜。
(2) 将质粒导入AAV293细胞中
通过磷酸钙方法，使用通过实施例1获得的pAAV-AsRed2-miRNA文库质粒、pHelper质粒和pAAV-RC1质粒(二者均由Cell Biolabs, Inc.生产) (各4 μg)转染实施例2-(1)的AAV293细胞。6小时后，完全除去培养基。加入含有2% FBS和2 mM L-谷氨酸钠的4毫升DMEM，将细胞在37℃下的CO2培养箱中再培养48小时。
(3) AAV-miRNA文库载体的收集
从通过实施例2-(2)培养的AAV293细胞中除去培养基，加入1 mL PBS (由NacalaiTesque生产)。通过吸取将AAV293细胞收集在1.5 mL管中，在4℃和700 x g下离心5分钟。除去上清液。将AAV293细胞重新悬浮于0.1 mL PBS中，然后，进行3次由以下组成的一系列处理：在乙醇/干冰中冷冻2分钟，在37℃水浴中融化2分钟，并通过涡旋混合器搅拌1分钟。然后，收集含有AAV-miRNA文库载体的细胞匀浆物。将细胞匀浆物在4℃和10,000 x g下离心10分钟。然后，收集上清液作为AAV-miRNA文库载体溶液。
实施例3：AAV载体的基因组滴度测定
(1) DNA酶处理
向2 μL AAV-miRNA文库载体溶液中加入2 μL 10 x DNaseI缓冲液、15.2 μL注射用水(由Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.生产)和0.8 μL DNaseI (由Takara Bio Inc.生产)，以制备反应溶液。使反应溶液与TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (注册商标)Standard (由Takara Bio Inc.生产)一起在37℃下温育1小时，以降解游离的基因组和质粒。之后，将反应溶液在99℃下加热10分钟以使DNaseI灭活，然后保存在4℃或-20℃下直到实施例3-(2)。
(2) 蛋白水解酶K处理
向由实施例3-(1)获得的20 μL反应溶液中加入15 μL注射用水、4 μL 10 X蛋白水解酶K缓冲液[0.1M Tris-HCl (pH 7.8)、0.1M EDTA、5% SDS]和1 μL蛋白水解酶K (由Takara Bio Inc.生产)。将反应溶液与TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (注册商标)Standard (由Takara Bio Inc.生产)一起在55℃下温育1小时以释放AAV载体的基因组。之后，将反应溶液在95℃下加热10分钟以使蛋白水解酶K失活。将由此制备的溶液保存在4℃或-20℃下作为AAV-miRNA文库载体基因组溶液直到进行实时PCR。
(3) 实时PCR
将实施例3-(2)中制备的AAV载体基因组溶液用注射用水稀释50倍。使用2 μL稀释液作为模板、序列表SEQ ID NO: 1 (正向引物1)和SEQ ID NO:2 (反向引物1)所示引物和SYBR (注册商标) Premix ExTaqII (Perfect Real Time) (由Takara Bio Inc.生产)，进行实时PCR。按照试剂盒所附用法说明制备反应溶液。作为标准品，使用通过用EcoRI处理pAAV-AsRed2而得到的线性DNA溶液替代AAV载体基因组溶液。在建议的仪器条件下，使用Thermal Cycler Dice (注册商标) Real Time System Single (由Takara Bio Inc.生产)进行实时PCR。然后按照仪器所附用法说明，测定AAV载体基因组的量。基因组滴度表示为每个产生AAV载体的细胞的AAV载体基因组的数目(病毒基因组/细胞，下文亦称VG/细胞)。
实施例4：AAV-miRNA文库的筛选
(1) AAV293细胞的接种
将AAV293细胞以2.5 x 105个细胞/mL悬浮于含有10% FBS和2 mM L-谷氨酸钠的DMEM中。将4毫升悬液加入60 mm细胞培养皿中，并在37℃下的CO2培养箱中培养过夜。
(2) 用AAV-miRNA文库载体感染AAV293细胞
在从实施例4-(1)中培养的AAV293细胞中完全除去培养基后，将实施例2中制备的AAV-miRNA文库载体溶液用含有2% FBS的DMEM稀释，将2 mL稀释液加入细胞中，使得感染复数(moi)为约850，就基因组滴度而言。将细胞在37℃下的CO2培养箱中培养2小时。然后，加入2 mL含有2% FBS的DMEM，并将细胞在37℃下的CO2培养箱中培养过夜。
(3) 将pAAV-RC1质粒和pHelper质粒转染到AAV293细胞中
通过磷酸钙方法，将实施例4-(2)中培养的AAV293细胞用各4 μg的pAAV-RC1质粒和pHelper质粒转染。6小时后，完全除去培养基。加入4毫升含有2% FBS和2 mM L-谷氨酸钠的DMEM，并将细胞在37℃下的CO2培养箱中再培养48小时。
(4) 再次收集AAV-miRNA文库载体
从在实施例4-(3)中培养的AAV293细胞中除去培养基，加入1 mL PBS。通过吸取将AAV293细胞收集在1.5 mL管中，在4℃和700 x g下离心5分钟。除去上清液。将AAV293细胞重新悬浮于0.1 mL PBS中，然后进行3次由以下组成的一系列处理：在乙醇/干冰中冷冻2分钟，在37℃水浴中融化2分钟，并通过涡旋混合器搅拌1分钟。然后，收集含有AAV-miRNA文库载体的细胞匀浆物。将细胞匀浆物在4℃和10,000 x g下离心10分钟。然后，收集上清液作为AAV-miRNA文库载体溶液。
(5) AAV-miRNA文库载体的浓缩
将实施例4-(1)至(4)的步骤重复共8次，以浓缩AAV-miRNA文库载体。在每轮中，在感染时间内的病毒的量(moi)和在收集时间内的病毒的量见表1，就基因组滴度而言。
[表1]
从表可见，在第5轮以后，AAV-miRNA病毒易复制。因此发现，浓缩了引起AAV载体产生增加的miRNA。
实施例5：选择引起AAV载体产生增加的miRNA
(1) AAV-miRNA载体基因组的制备
使用2 μL在实施例4的每轮中收集的AAV-miRNA文库载体溶液，以与实施例3-(1)和(2)相同的方式获得AAV-miRNA文库载体基因组溶液。
(2) miRNA的克隆
使用由实施例5-(1)获得的AAV-miRNA文库载体基因组溶液作为模板、序列表SEQID NO: 3 (正向引物2)和SEQ ID NO:4 (反向引物2)所示引物和PrimeSTAR (注册商标)GXL DNA聚合酶(由Takara Bio Inc.生产)，通过PCR扩增miRNA编码区附近的区域。通过重复98℃ 10秒钟、55℃ 15秒钟和68℃ 30秒钟的30个循环，然后重复相同条件一次，来进行反应。使用In-Fusion (注册商标) Advantage PCR克隆试剂盒，将由此得到的片段与用HincII (由Takara Bio Inc.生产)和BAP (由Takara Bio Inc.生产)处理的pUC118 (由Takara Bio Inc.生产)连接。
(3) miRNA核苷酸序列的测定
用由实施例5-(2)获得的重组质粒转化大肠杆菌，接种在含有氨苄西林的LB平板中，然后在37℃下培养过夜，以得到许多菌落。选择一些菌落，将各菌落在含有氨苄西林的LB液体培养基中培养过夜。然后，使用Miniprep DNA纯化试剂盒(由Takara Bio Inc.生产)，从菌落中提取质粒。对由此获得的菌落测序，并鉴定质粒中编码的miRNA的名称。结果见表2。
[表2]
如上表所示，多次鉴定出hsa-miR-196a1、324、342等。因此发现，通过重复实验轮次，获得了引起AAV载体产生增加的miRNA。
实施例6：所获得的miRNA的评价
(1) miRNA表达质粒的制备
从克隆至pBApo-CMV DNA中的人miRNA文库中，选择插入有hsa-miR-196a1、hsa-miR-324和hsa-miR-342的质粒。将大肠杆菌用各质粒转化以制备大量的质粒。对于质粒的制备，使用Nucleobond Xtra Midi EF (由Macherey-Nagel GmbH & Co., KG生产)。由此获得的质粒分别称为pBapo-miR196a1、pBapo-miR324和pBapo-miR342。
(2) AAV载体的产生
将AAV293细胞用实施例6-(1)中获得的质粒连同pAAV-AsRed2-C1载体、pAAV-RC1质粒和pHelper质粒一起进行转染。作为对照，转染pBApo-CMV而不是实施例6-(1)中获得的质粒。从转染到AAV载体的收集的每个操作以与实施例2-(1)-(3)相同的方式进行。
(3) AAV载体的基因组滴度的测定
以与实施例3相同的方式测定由此获得的AAV载体的基因组滴度。结果见表3。
[表3]
如上表所示，当使用pBApo-miR324、pBApo-miR196a1或pBApo-miR342时，获得与对照相比具有高基因组滴度的AAV载体。特别是当使用pBApo-miR324时，获得基因组滴度为对照的几倍高的AAV载体。
实施例7：pRC-miR342质粒的评价
(1) pRC-miR342质粒的制备
使用pBApo-miR342作为模板和序列表SEQ ID NO: 5 (正向引物3)和SEQ ID NO:6(反向引物3)所示引物，通过PCR扩增从CMV启动子至miR342编码区的区域。使用In-Fusion(注册商标) Advantage PCR克隆试剂盒，将由此得到的片段与已用SnaBI (由Takara BioInc.生产)处理的pAAV-RC1质粒连接。测定由此获得的重组质粒的核苷酸序列以证实CMV-miR342片段的插入。然后，制备质粒。由此获得的质粒称为pRC-miR342。
(2) pRC-miR342的评价
将AAV293细胞用实施例7-(1)中获得的pRC-miR342连同pAAV-AsRed2载体和pHelper质粒一起进行转染。作为对照，pAAV-RC1质粒而不是pRC-miR342被转染。由此获得的产生AAV载体的细胞称为293-RC-miR342细胞和293-RC细胞。从转染至AAV载体收集的每个操作以与实施例2-(1)-(3)相同的方式进行。
(3) AAV载体的基因组滴度的测定
按与实施例3相同的方式测定由实施例7-(2)获得的各产生AAV载体的细胞的AAV载体的基因组滴度。结果见表4。
[表4]
如上表所示，使用pRC-miR342制备的产生AAV载体的细胞产生基因组滴度比对照的高60%的AAV载体。
实施例8：所获得的AAV载体的评价
(1) 靶细胞的接种
以4 x 104个细胞/mL将AAV293细胞悬浮于含有10% FBS和2 mM L-谷氨酸钠的DMEM中。将1毫升悬液加入用于细胞培养的24孔板中(由Corning Incorporated生产)，并在37℃下的CO2培养箱中培养过夜。
(2) 用病毒感染
从在实施例8-(1)中培养的AAV293细胞中除去培养基后，将500 μL含有10% FBS和2 mM L-谷氨酸钠的DMEM加入细胞中，然后添加1 μL由实施例7-(2)获得的AAV载体溶液。在37℃下的CO2培养箱中培养细胞6小时后，除去培养基，加入500 μL含有10% FBS和2 mM L-谷氨酸钠的DMEM，接着培养过夜。
(3) 流式细胞仪分析和感染性滴度的计算
从在实施例8-(2)中培养的AAV293细胞中除去培养基，加入500 μL PBS。在用胰蛋白酶处理后，加入500 μL培养基，并通过吸取将AAV293细胞收集在1.5 mL管中。将由此获得的细胞悬液提供给流式细胞仪(Cytomics FC500，由Beckman Coulter，Inc.生产)，以测量AsRed2阳性细胞比率。根据所得值，计算感染性滴度，并表示为1 mL AAV载体溶液中感染性AAV载体的数目(感染性病毒颗粒/mL，下文亦称ivp/mL)。结果见表5。
[表5]
如上表所示，使用pRC-miR342产生的AAV载体不仅具有高基因组滴度，而且还有高感染性滴度。因此发现，将pRC-miR342导入产生AAV载体的细胞中引起细胞产生具有正常感染能力的AAV载体的能力提高。
实施例9：pRC6-miR342和pRC9-miR342质粒的评价
(1) pRC-miRNA质粒的制备
在将pAAV-RC1用SmiI和SnaBI处理，并人工合成AAV 9型Cap基因的相应部位后，将其与构建体pRC9连接。将在实施例7-(1)中扩增的从CMV启动子到miR342编码区的片段以与实施例7-(1)相同的方式与用SnaBI处理的pRC9连接，以得到pRC9-miR342。换句话说，pRC9-miR342是含有AAV 9型的Cap基因和CMV-miR342片段的辅助质粒。分别使用pBApo-miR342作为模板和序列表SEQ ID NO: 7 (正向引物4)和SEQ ID NO:8 (反向引物4)所示引物，通过PCR扩增从CMV启动子到miR342编码区的区域。使用In-Fusion (注册商标) Advantage PCR克隆试剂盒，将由此得到的片段与已用SmaI (由Takara Bio Inc.生产)处理的pRep-CapAAV6质粒(由Applied Viromics，LLC生产)连接，以得到pRC6-miR342。换句话说，pRC6-miR342是含有AAV 6型的Cap基因和CMV-miR342片段的辅助质粒。
(2) pRC-miRNA的评价
将AAV293细胞用实施例9-(1)中获得的质粒或对照质粒连同pAAV-AsRed2和pHelper质粒一起转染。按与实施例2-(1)至(3)相同的方式进行从转染到AAV载体收集的每个操作。
(3) AAV载体的基因组滴度的测定
按与实施例3相同的方式测定所产生的AAV载体的基因组滴度。结果见表6。
[表6]
如表6所示，当使用插入有miR342的pRC时，不论pRC来源于AAV 6型还是来源于AAV9型，都获得与对照相比具有高基因组滴度的AAV载体。
工业实用性
通过使用本发明的细胞，可产生与常规方法相比具有较高滴度的AAV载体。使用本发明的细胞产生的AAV载体和包含AAV载体作为有效成分的组合物作为用于基因疗法的研究或临床领域的基因导入方法是非常有用的。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1：正向引物1
SEQ ID NO:2：反向引物1
SEQ ID NO:3：正向引物2
SEQ ID NO:4：反向引物2
SEQ ID NO:5：正向引物3
SEQ ID NO:6：反向引物3
SEQ ID NO:7：正向引物4
SEQ ID NO:8：反向引物4。

Claims (5)

1.一种产生AAV载体的细胞，其中表达人工导入的miRNA，其中所述人工导入的miRNA是选自hsa-miR-196a1、hsa-miR-324和hsa-miR-342的至少一种，以及其中所述细胞还包含用于提供形成AAV载体的病毒颗粒所必需的元件的核酸。
2.一种产生AAV载体的细胞，其是导入了待包封入病毒中的核酸的权利要求1的细胞。
3.一种用于产生AAV载体的方法，所述方法包括培养权利要求2的细胞的步骤。
4.一种用于产生AAV载体的试剂盒，其包含表达选自hsa-miR-324、hsa-miR-196a1和hsa-miR-342的至少一种miRNA的核酸和用于提供形成AAV载体的病毒颗粒所必需的元件的核酸。
5.一种通过在产生AAV载体的细胞中表达miRNA来选择可引起产生AAV载体的细胞产生AAV载体的能力提高的miRNA的方法，所述方法包括下列步骤(a)-(e)：
(a) 获得表达miRNA的AAV载体的混合物的步骤；
(b) 用表达miRNA的AAV载体的混合物感染细胞并将编码形成AAV载体的病毒颗粒所必需的元件的核酸构建体引入所述细胞的步骤；
(c) 培养通过步骤(b)获得的细胞以获得由细胞产生的AAV载体混合物的步骤；
(d) 使用通过步骤(c)获得的AAV载体混合物重复步骤(b)和(c)一次或多次，从而使具有核酸的AAV载体在所述AAV载体混合物中浓缩的步骤，所述核酸用于表达引起AAV载体产生提高的miRNA；和
(e) 获得编码在通过步骤(d)获得的AAV载体混合物中的miRNA的核酸的步骤。
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