JP2023552531A - 接着細胞のための懸濁モードシードトレイン開発 - Google Patents

Abstract

本開示は、接着細胞のシードトレイン増殖のための方法を対象とし、方法は、Ｎ－２槽内の血清添加成長培地で細胞を培養することと、血清添加培地から細胞を除去することと、工程からの細胞をＮ－１槽内の無血清成長培地に接種することと、懸濁条件下で、Ｎ－１槽内で細胞を培養することと、バイオリアクター内の成長培地に懸濁培養細胞を接種することと、を含む。いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合していない。いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合している。いくつかの態様では、シードトレイン増殖方法によって産生された接着細胞は、ウイルスベクターを産生するために使用される。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年１２月１０日に出願された米国仮出願第６３／１２３，６０２号の利益を主張する。上記の出願の教示全体は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

遺伝子療法及びＤＮＡワクチン接種用途のための組換えウイルスベクターの使用の進歩により、遺伝物質の輸送のためのアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターなどの臨床グレードのウイルスベクターの大規模製造に対する必要性が生じている。

組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳動物接着細胞は、多くの場合、大量生産用バイオリアクターで培養されて、目的の治療用タンパク質を産生する。シードトレインプロセスを使用して、大量生産用バイオリアクターに接種するのに十分な数のそのような哺乳動物細胞を生成する。従来のシードトレインプロセスは、凍結保存された細胞バンクバイアルの解凍から始まり、漸進的により大きい培養槽内での複数の培養工程（例えば、５つ以上）が続く。従来のシードトレインプロセスは、各工程中に複数の手動操作を必要とすることを含むいくつかの不利点を有し、これは、プロセス全体を汚染及び操作者のエラーに対して脆弱にする。特に、各継代中の接着細胞に対する細胞解離プロトコルは、多くの場合、汚染をもたらし、このプロセスをスケールアップ産生に適さないものにする。これらの接着シードトレインプロセスはまた、持続可能かつ実用的な様式で望ましい生成物収率を達成するために必要な高細胞数を培養することを可能にしない。

これらの問題を克服しようとして、懸濁に適合した細胞株が開発されている。しかしながら、懸濁に適合した細胞株の開発には時間がかかる。懸濁に適合した細胞はまた、親接着細胞株とは異なるトランスクリプトームを有する。したがって、細胞、例えば、ウイルス産生のための細胞のスケールアップ産生を可能にする新しい懸濁システムが必要である。

本開示のいくつかの態様は、細胞増殖方法を対象とし、方法は、（ａ）Ｎ－２容器内の血清を含む第１の培地で細胞を培養することと、（ｂ）第１の培地から細胞を除去することと、（ｃ）工程（ｂ）からの細胞を、Ｎ－１容器内の、血清を含まないか又は第１の培地よりも低い濃度の血清を含む第２の培地に接種することと、（ｄ）懸濁条件下で、Ｎ－１容器内で細胞を培養することと、（ｅ）バイオリアクター内の第３の培地に工程（ｄ）からの細胞を接種することと、を含む。一実施形態では、第２の培地は、無血清培地である。別の実施形態では、第２の培地は、第１の培地中の血清濃度よりも低い濃度の血清を含む。いくつかの態様では、細胞は、接着細胞である。いくつかの態様では、Ｎ－１容器及びＮ－２容器は、同じである。いくつかの態様では、Ｎ－１容器及びＮ－２容器は、異なる。いくつかの態様では、Ｎ－１容器は、振盪フラスコ又はウェーブバッグを含む。いくつかの態様では、細胞は、工程（ｅ）の前に、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、又は少なくとも６回継代される。いくつかの態様では、第３の培地は、第２の培地中の血清濃度よりも高い血清濃度を含む。

いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＣＯＳ細胞、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの態様では、接着細胞は、ヒトである。いくつかの態様では、接着細胞は、動物細胞、昆虫細胞、又は幼虫である。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ－２９３細胞である。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨＥＫ－２９３である。

いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合していない。いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合している。いくつかの態様では、懸濁条件下で細胞を培養することは、細胞の接着依存性を変化させない。いくつかの態様では、方法は、細胞を変化させて新しい細胞株を作製しない。いくつかの態様では、方法は、細胞を遺伝子的に変化させない。

いくつかの態様では、方法は、Ｎ－３容器内の第１の培地で細胞を培養することを更に含むことができる。いくつかの態様では、方法は、Ｎ－４容器内の第１の培地で細胞を培養することを更に含むことができる。いくつかの態様では、方法は、Ｎ－５容器内の第１の培地で細胞を培養することを更に含むことができる。

いくつかの態様では、バイオリアクターは、接着バイオリアクターである。いくつかの態様では、バイオリアクターは、撹拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動層型バイオリアクター、充填層型バイオリアクター、光バイオリアクターバイオリアクター、及び固定層型バイオリアクターからなる群から選択される。いくつかの態様では、バイオリアクターは、固定層型バイオリアクターである。

いくつかの態様では、バイオリアクター内の第３の培地は、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子を含む。いくつかの態様では、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子は、血清、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外マトリックスのプロテオグリカン又は非プロテオグリカン多糖類、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、バイオリアクター内の第３の培地は、ＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを含む。

いくつかの態様では、細胞は、約２４～１２０時間、懸濁条件下で培養される。いくつかの態様では、細胞は、約４８～７２時間、懸濁条件下で培養される。いくつかの態様では、Ｎ－１容器は、振盪フラスコである。いくつかの態様では、Ｎ－１容器は、ウェーブバッグである。

いくつかの態様では、方法は、細胞を、バイオリアクター内の第１のポリヌクレオチド配列と接触させることを更に含むことができる。いくつかの態様では、第１のポリヌクレオチド配列は、プラスミドである。いくつかの態様では、プラスミドは、ＡＡＶ、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される組換えウイルス粒子のカプシドタンパク質をコードする。

いくつかの態様では、ウイルス粒子は、ＡＡＶである。いくつかの態様では、方法は、細胞を、導入遺伝子をコードする第２のポリヌクレオチドと接触させることを更に含むことができる。いくつかの態様では、方法は、細胞を、ヘルパー遺伝子をコードする第３のポリヌクレオチドと含有することを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、末端逆位配列、少なくとも１つのＡＡＶ複製タンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶ構造カプシドタンパク質をコードする核酸、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。

いくつかの態様では、方法は、バイオリアクター内で細胞を培養することを更に含むことができる。

いくつかの態様では、培養は、バッチ培養を含む。いくつかの態様では、培養は、流加培養を含む。いくつかの態様では、培養は、灌流培養を含む。

いくつかの態様では、細胞は、組換えウイルス粒子を産生する条件下で培養される。

本開示のいくつかの態様は、細胞増殖方法を対象とし、方法は、（ａ）Ｎ－３容器内の血清を含む第１の培地で細胞を培養することと、（ｂ）第１の培地から細胞を除去することと、（ｃ）工程（ｂ）からの細胞を、Ｎ－２容器内の、血清を含まないか又は第１の培地よりも低い濃度の血清を含む第２の培地に接種することと、（ｄ）懸濁条件下で、Ｎ－２容器内で細胞を培養することと、（ｅ）ステップ（ｄ）からの細胞をＮ－１容器内の第２の培地に接種することと、（ｆ）懸濁条件下で、Ｎ－１容器内で細胞を培養することと、（ｇ）バイオリアクター内の第３の培地に工程（ｄ）からの細胞を接種することと、を含む。

いくつかの態様では、細胞は、接着細胞である。いくつかの態様では、Ｎ－１、Ｎ－２、及びＮ－３容器は、同じである。いくつかの態様では、Ｎ－１、Ｎ－２、及びＮ－３容器は、異なる。いくつかの態様では、細胞は、工程（ｇ）の前に、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、又は少なくとも６回継代される。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＣＯＳ細胞、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの態様では、接着細胞は、ヒトである。いくつかの態様では、接着細胞は、動物細胞、昆虫細胞、又は幼虫である。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ－２９３細胞である。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨＥＫ－２９３である。

いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合していない。いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合している。いくつかの態様では、懸濁条件下で細胞を培養することは、細胞の接着依存性を変化させない。いくつかの態様では、方法は、細胞を変化させて新しい細胞株を作製しない。いくつかの態様では、方法は、細胞を遺伝子的に変化させない。

いくつかの態様では、方法は、Ｎ－４槽内の第１の培地で細胞を培養することを更に含むことができる。いくつかの態様では、方法は、Ｎ－５容器内の第１の培地で細胞を培養することを更に含むことができる。

いくつかの態様では、バイオリアクターは、接着バイオリアクターである。いくつかの態様では、バイオリアクターは、撹拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動層型バイオリアクター、充填層型バイオリアクター、光バイオリアクターバイオリアクター、及び固定層型バイオリアクターからなる群から選択される。いくつかの態様では、バイオリアクターは、固定層型バイオリアクターである。

いくつかの態様では、バイオリアクター内の第３の培地は、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子を含む。いくつかの態様では、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子は、血清、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外マトリックスのプロテオグリカン又は非プロテオグリカン多糖類、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、バイオリアクター内の第３の培地は、ＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを含む。

いくつかの態様では、細胞は、約２４～１２０時間、懸濁条件下で培養される。いくつかの態様では、細胞は、約４８～７２時間、懸濁条件下で培養される。いくつかの態様では、Ｎ２容器及びＮ－１容器は、振盪フラスコである。いくつかの態様では、Ｎ２容器及びＮ－１容器は、ウェーブバッグである。

いくつかの態様では、方法は、細胞を、バイオリアクター内の第１のポリヌクレオチド配列と接触させることを更に含むことができる。いくつかの態様では、第１のポリヌクレオチド配列は、プラスミドである。いくつかの態様では、プラスミドは、ＡＡＶ、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される組換えウイルス粒子のカプシドタンパク質をコードする。

いくつかの態様では、ウイルス粒子は、ＡＡＶである。いくつかの態様では、方法は、細胞を、導入遺伝子をコードする第２のポリヌクレオチド配列と接触させることを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列は、末端逆位配列、少なくとも１つのＡＡＶ複製タンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶ構造カプシドタンパク質をコードする核酸、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。

いくつかの態様では、方法は、バイオリアクター内で細胞を培養することを更に含むことができる。

いくつかの態様では、培養は、バッチ培養を含む。いくつかの態様では、培養は、流加培養を含む。いくつかの態様では、培養は、灌流培養を含む。

いくつかの態様では、細胞は、組換えウイルス粒子を産生する条件下で培養される。

本開示のいくつかの態様は、接着細胞の細胞増殖方法を対象とし、方法は、（ａ）血清を含む第１の培地中で、接着条件下で接着細胞を培養することと、（ｂ）第１の培地から接着細胞を除去することと、（ｃ）血清を含まないか又は第１の培地よりも低い濃度の血清を含む第２の培地中に接着細胞を懸濁することと、（ｄ）懸濁条件下で、工程ｃからの接着細胞を培養することと、（ｅ）バイオリアクター内の第３の培地に工程（ｄ）からの接着細胞を接種することと、を含む。

いくつかの態様では、方法は、接着条件下で少なくとも１回、工程（ａ）の接着細胞を継代することを更に含むことができる。いくつかの態様では、方法は、懸濁条件下で少なくとも１回、工程（ｄ）の接着細胞を継代することを更に含むことができる。いくつかの態様では、方法は、懸濁条件下で少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、又は少なくとも５回、工程（ｄ）の接着細胞を継代することを更に含むことができる。

いくつかの態様では、バイオリアクターは、接着バイオリアクターである。いくつかの態様では、バイオリアクターは、撹拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動層型バイオリアクター、充填層型バイオリアクター、光バイオリアクターバイオリアクター、及び固定層型バイオリアクターからなる群から選択される。いくつかの態様では、バイオリアクターは、固定層型バイオリアクターである。

いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合していない。いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合している。いくつかの態様では、懸濁条件下で細胞を培養することは、細胞の接着依存性を変化させない。いくつかの態様では、方法は、細胞を変化させて新しい細胞株を作製しない。いくつかの態様では、方法は、細胞を遺伝子的に変化させない。

いくつかの態様では、バイオリアクター内の第３の培地は、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子を含む。いくつかの態様では、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子は、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外マトリックスのプロテオグリカン又は非プロテオグリカン多糖類、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、バイオリアクター内の第３の培地は、ＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを含む。

いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁条件下で２回以下継代される。いくつかの態様では、細胞は、懸濁条件下で３回以下、４回以下、又は５回以下継代される。いくつかの態様では、細胞は、約２４～１２０時間、懸濁条件下で培養される。いくつかの態様では、接着細胞は、４８～７２時間、懸濁条件下で成長する。

いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＣＯＳ細胞、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの態様では、接着細胞は、ヒトである。いくつかの態様では、接着細胞は、動物細胞、昆虫細胞、又は幼虫である。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ－２９３細胞である。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨＥＫ－２９３細胞である。

いくつかの態様では、方法は、接着細胞を、第１のポリヌクレオチド配列と接触させることを更に含むことができる。いくつかの態様では、第１のポリヌクレオチド配列は、プラスミドである。いくつかの態様では、プラスミドは、ＡＡＶ、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される組換えウイルス粒子のカプシドタンパク質をコードする。

いくつかの態様では、ウイルス粒子は、ＡＡＶである。いくつかの態様では、方法は、接着細胞を、導入遺伝子をコードする第２のポリヌクレオチド配列と接触させることを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列は、末端逆位配列、少なくとも１つのＡＡＶ複製タンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶ構造カプシドタンパク質をコードする核酸、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。

いくつかの態様では、方法は、バイオリアクター内で細胞を培養することを更に含むことができる。

いくつかの態様では、培養は、バッチ培養を含む。いくつかの態様では、培養は、流加培養を含む。いくつかの態様では、培養は、灌流培養を含む。

いくつかの態様では、細胞は、組換えウイルス粒子を産生する条件下で培養される。

本開示のいくつかの態様は、接着細胞の細胞増殖方法を対象とし、方法は、（ａ）血清を含む第１の培地中で、接着条件下で細胞を培養することと、（ｂ）第１の培地から細胞を除去することと、（ｃ）血清を含まないか又は第１の培地よりも低い濃度の血清を含む第２の培地中に細胞を懸濁することと、（ｄ）懸濁条件下で細胞を培養することと、（ｅ）バイオリアクター内の第３の培地に工程（ｄ）からの細胞を接種することと、（ｆ）ウイルス粒子をコードするポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることと、（ｇ）ウイルス粒子が産生される条件下で、培地に内で細胞を培養することと、を含む。一実施形態では、第２の培地は、無血清培地である。

いくつかの態様では、方法は、工程（ｇ）で産生されたウイルス粒子を単離することを更に含むことができる。

いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、プラスミドである。いくつかの態様では、ウイルス粒子は、ＡＡＶ、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される。いくつかの態様では、ウイルス粒子は、ＡＡＶである。

いくつかの態様では、バイオリアクターは、接着バイオリアクターである。いくつかの態様では、バイオリアクターは、撹拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動層型バイオリアクター、充填層型バイオリアクター、光バイオリアクターバイオリアクター、及び固定層型バイオリアクターからなる群から選択される。いくつかの態様では、バイオリアクターは、固定層型バイオリアクターである。

いくつかの態様では、バイオリアクター内の第３の培地は、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子を含む。いくつかの態様では、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子は、血清、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外マトリックスのプロテオグリカン又は非プロテオグリカン多糖類、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、バイオリアクター内の第３の培地は、ＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを含む。

いくつかの態様では、細胞は、接着細胞である。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＣＯＳ細胞、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。いくつかの態様では、接着細胞は、ヒトである。いくつかの態様では、接着細胞は、動物細胞、昆虫細胞、又は幼虫である。

いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ－２９３細胞である。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨＥＫ－２９３である。

いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合していない。いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合している。いくつかの態様では、懸濁条件下で細胞を培養することは、細胞の接着依存性を変化させない。いくつかの態様では、方法は、細胞を変化させて新しい細胞株を作製しない。

いくつかの態様では、方法は、接着条件下で少なくとも１回、工程（ａ）の細胞を継代することを更に含むことができる。いくつかの態様では、方法は、懸濁条件下で少なくとも１回、工程（ｄ）の細胞を継代することを更に含むことができる。いくつかの態様では、細胞は、懸濁条件下で２回以下継代される。いくつかの態様では、細胞は、懸濁条件下で２回以下、３回以下、４回以下、又は５回以下継代される。いくつかの態様では、細胞は、約２４～１２０時間、懸濁条件下で成長する。いくつかの態様では、細胞は、４８～７２時間、懸濁条件下で成長する。

いくつかの態様では、バイオリアクター内で細胞を培養することは、バッチ培養を含む。いくつかの態様では、バイオリアクター内で細胞を培養することは、流加培養を含む。いくつかの態様では、バイオリアクター内で細胞を培養することは、灌流培養を含む。

本明細書に記載されるハイブリッドシードトレイン増殖方法の視覚的表現である。 本明細書に開示されるハイブリッドシードトレイン増殖方法を使用して、ＡＡＶ粒子を産生する視覚的表現である。 本明細書に開示されるハイブリッドシードトレイン増殖方法に従って培養されたＨＥＫ２９３細胞の生存率を示すグラフである。 接着条件下でのみ培養されたＨＥＫ２９３細胞の生存率を示すグラフである。 本明細書に開示されるハイブリッドシードトレイン増殖方法に従って培養されたＨＥＫ２９３細胞の生細胞密度を示すグラフである。 接着条件下でのみ培養されたＨＥＫ２９３細胞の生細胞密度を示すグラフである。

定義
他に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示の属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合では、定義を含む本出願が支配する。文脈により他に要求されない限り、単数形は複数形を含むものとし、複数形は単数形を含むものとする。

本開示全体を通して、用語「ａ」又は「ａｎ」実体は、その実体の１つ以上を指し、例えば、ポリヌクレオチドは、１つ以上のポリヌクレオチドを表すと理解される。そのようなものとして、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書中で互換的に使用することができる。

更に、「及び／又は」は、本明細書中で使用される場合、他を伴う又は伴わない、２つの特定された特色又は成分の各々の特定の開示として理解される。このように、語句において使用される用語「及び／又は」、例えば本明細書中の「Ａ及び／又はＢ」などは、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、語句において使用される用語「及び／又は」、例えば「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などは、以下の態様の各々を包含することが意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。

用語「約」は、およそ、大まかに、前後、又はその領域内を意味するために本明細書中で使用される。用語「約」が数値範囲と併せて使用される場合、それによって、示される数値の上下の境界を拡張させることによりその範囲が変更される。一般的に、用語「約」は、１０パーセントの上又は下の変動（より高い又はより低い）により、記載値を上回って及び下回って数値を変更するために、本明細書中で使用される。

数値又は一連の数値の前の用語「少なくとも」は、文脈から明らかであるように、用語「少なくとも」に隣接する数値、及び論理的に含まれ得る全ての後続の数値又は整数を含むと理解される。例えば、核酸分子中のヌクレオチドの数は、整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチドが示される特性を有することを意味する。少なくともが一連の数値又は範囲の前に存在する場合、「少なくとも」は、その一連又は範囲内の数値の各々を修正することができることが理解される。「少なくとも」はまた、有効数字の数値を考慮することなく、整数に限定されない（例えば、「少なくとも５％」は５．０％、５．１％、５．１８％を含む）。

ヌクレオチド配列は、別段の明確な指示がない限り、左から右へと５’から３’方向にのみ、一本鎖によって本明細書に提示される。ヌクレオチド及びアミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、又は（アミノ酸については）１文字コード若しくは３文字コードのいずれかによって（両方が３７ ＣＦＲ §１．８２２及び確立された使用法に従う）、表される。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、ホスホジエステル結合によって接続されたヌクレオチドの配列を意味する。ポリヌクレオチドは、５’から３’方向の方向に、本明細書に提示される。本開示のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子又はリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得る。ヌクレオチド塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）、及びウラシル（Ｕ）の１文字コードによって、本明細書に示される。

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチド及びタンパク質の両方を包含する。

用語「コード配列」又は配列「コード」は、例えば、インスリン又はグルコキナーゼなどの特定のタンパク質を「コード」するＤＮＡ又はＲＮＡ領域（転写領域）を意味するために本明細書で使用される。コード配列は、プロモーターなどの適切な調節領域の制御下に置かれた場合、インビトロ又はインビボで、ポリペプチドに転写（ＤＮＡ）及び翻訳（ＲＮＡ）される。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、原核生物又は真核生物由来のｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物由来のゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置することができる。

遺伝子は、例えば、ポリアデニル化部位又はシグナル配列を含む、プロモーター、５’リーダー配列、イントロン、コード配列、及び３’－非翻訳配列など、いくつかの作動可能に連結された断片を含むことができる。本明細書で使用される場合、「遺伝子の発現」は、遺伝子がＲＮＡに転写され、かつ／又は活性タンパク質に翻訳されるプロセスを指す。

用語「プロモーター」は、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置する１つ以上の遺伝子（又はコード配列）の転写を制御するように機能し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、及び任意の他のＤＮＡ配列（転写因子結合部位、抑制因子及び活性化因子タンパク質結合部位、並びにプロモーターからの転写量を調節するために直接的又は間接的に作用することが当業者に知られているヌクレオチドの任意の他の配列が挙げられるが、これらに限定されない）の存在によって構造的に特定されている、核酸配列又は断片を意味するために本明細書で使用される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的条件及び発生条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理学的条件又は発生条件に応じて調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の型の分化細胞／組織において優先的に活性である。

本明細書で使用される場合、用語「エンハンサー」は、隣接する遺伝子の転写を刺激又は阻害するシス作用エレメントである。転写を阻害するエンハンサーは、「サイレンサー」とも称される。エンハンサーは、いずれの配向においても、コード配列から、及び転写領域の下流の位置から、最大数キロ塩基対（ｋｂ）の距離にわたって機能することができる（例えば、コード配列に関連付けられ得る）。

用語「作動可能に連結された」、「作動可能に挿入された」、「作動可能に位置付けられた」、「制御下」、又は「転写制御下」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始及び遺伝子の発現を制御するために、核酸と関連した正しい位置及び配向にあることを意味する。用語「作動可能に連結された」は、ＤＮＡ配列及び調節配列が、適切な分子（例えば、転写活性化因子タンパク質）が調節配列に結合されたときに、遺伝子発現を可能にするような方法で接続されることを意味する。用語「作動可能に挿入された」は、細胞に導入される目的のＤＮＡが、導入されたＤＮＡの転写及び翻訳を誘導する（すなわち、例えば、目的のＤＮＡによってコードされたポリペプチドの産生を促進する）ＤＮＡ配列に隣接して位置付けられることを意味する。

用語「導入遺伝子」は、細胞に導入される遺伝子又は核酸分子を意味するために本明細書で使用される。導入遺伝子の例は、治療用ポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、遺伝子が存在する可能性があるが、場合によっては、通常は細胞内で発現されないか、又は不十分なレベルで発現される。この文脈において、「不十分な」とは、当該遺伝子が通常は細胞内で発現されるが、状態及び／又は疾患が依然として発症し得ることを意味する。ある特定の態様では、導入遺伝子は、遺伝子の発現の増加又は過剰発現を可能にする。導入遺伝子は、細胞に天然の配列を含むことができるか、細胞に天然に存在しない配列を含むことができるか、又はそれは、両方の組み合わせを含むことができる。ある特定の態様では、導入遺伝子は、遺伝子の発現のための適切な調節配列に作動可能に連結され得る配列を含むことができる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、宿主細胞のゲノムに組み込まれない。

「ウイルスゲノム」又は「ベクターゲノム」又は「ウイルスベクター」は、目的の分子、例えば、タンパク質、ペプチド、及びポリヌクレオチド、又はそれらの複数をコードする、又はそれらを含む、１つ以上のポリヌクレオチド領域を含む配列を指す。ウイルスベクターは、遺伝物質を細胞内に送達するために使用される。ウイルスベクターは、特定の用途のために改変され得る。いくつかの態様では、送達ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターを含む。

本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルスベクター」又は「ＡＡＶベクター」は、アデノ随伴ベクターの成分を含むか、又はそれに由来し、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞を感染させるのに好適である任意のベクターを指す。ＡＡＶベクターという用語は、典型的には、ペイロードを含むＡＡＶ型ウイルス粒子又はビリオンを示す。ＡＡＶベクターは、血清型（すなわち、偽型ＡＡＶ）の組み合わせを含む様々な血清型から、又は様々なゲノム（例えば、一本鎖若しくは自己相補的）に由来し得る。加えて、ＡＡＶベクターは、複製欠損及び／又は標的であり得る。本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）としては、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ及び３Ｂ型）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ．７４、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１（２００４））、及びＭｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ． （Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５（２００４））によって開示されるそれらのＡＡＶ血清型及び分岐群、並びに任意の他のＡＡＶが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ． ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。いくつかの態様では、「ＡＡＶベクター」は、既知のＡＡＶベクターの誘導体を含む。いくつかの態様では、「ＡＡＶベクター」は、改変又は人工ＡＡＶベクターを含む。用語「ＡＡＶゲノム」及び「ＡＡＶベクター」は、互換的に使用され得る。

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つのペイロード領域（例えば、インスリン及び／又はＧｃｋをコードするポリヌクレオチド）、並びに少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）領域を有するＡＡＶベクターを含む、ＡＡＶウイルスである。いくつかの態様では、用語「本開示のＡＡＶベクター」又は「本明細書に開示されるＡＡＶベクター」は、例えば、ＡＡＶ粒子に封入された、インスリン、ＧｃＫ、又はそれらの組み合わせをコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド又は核酸を含むＡＡＶベクターを指す。

ウイルスによる細胞の「遺伝子導入」は、ウイルス粒子から細胞への核酸の移動があることを意味する。いくつかの態様では、遺伝子導入は、インスリン及び／又はグルコキナーゼをコードする核酸の、ウイルスベクターによるレシピエント宿主細胞への送達を指す。例えば、本開示のｒＡＡＶベクターによる標的細胞の遺伝子導入は、そのベクター中に含有されるｒＡＡＶゲノム（例えば、本開示のポリヌクレオチドを含む）の遺伝子導入細胞への移動をもたらす。

細胞の「トランスフェクション」は、細胞を遺伝子改変する目的で遺伝物質が細胞に導入されることを意味する。トランスフェクションは、当技術分野で既知の様々な手段、例えば、遺伝子導入又はエレクトロポレーションによって達成され得る。

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、インビトロ又はインビボのいずれかで、宿主細胞内に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えプラスミド又はウイルスを意味する。

「組換え」とは、一般的に自然界に見られるものとは異なることを意味する。

ベクター又はウイルスカプシドに関する「血清型」は、カプシドタンパク質配列及びカプシド構造に基づく異なる免疫学的プロファイルによって定義される。

「ＡＡＶ Ｃａｐ」は、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３及びその類似体を意味する。

「ＡＡＶ Ｒｅｐ」は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及びその類似体を意味する。

他の要素が隣接する配列に関する「隣接する」とは、配列に対して上流及び／又は下流、すなわち、５’及び／又は３’の１つ以上の隣接要素の存在を示す。用語「隣接する」は、配列が必ずしも連続していることを示すことを意図していない。例えば、導入遺伝子をコードする核酸と隣接要素との間に介在する配列があってもよい。２つの他の要素（例えば、ＩＴＲ）が「隣接する」配列（例えば、導入遺伝子）は、一方の要素が配列に対して５’に位置し、他方が配列に対して３’に位置することを示すが、それらの間に介在する配列があってもよい。

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子療法」は、核酸配列（例えば、本明細書に定義される治療用分子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸）を、個体の細胞及び／又は組織に挿入して、疾患又は状態を治療することである。遺伝子療法はまた、本質的に阻害性である導入遺伝子、すなわち、望ましくない又は異常な（例えば病原性の）遺伝子又はタンパク質などの内因性遺伝子又はタンパク質の発現、活性、又は機能を阻害する、減少させる、又は低減する導入遺伝子の挿入を含む。そのような導入遺伝子は、外因性であってもよい。外因性分子又は配列は、処置される細胞、組織、及び／又は個体において通常は発生しない分子又は配列であることが理解される。後天性疾患及び先天性疾患の両方が、遺伝子療法に適し得る。

本明細書で使用される場合、用語「培地（ｍｅｄｉａ）」、「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、「細胞培養培地」、「培養培地」、「組織培養培地（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」、「組織培養培地（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）」、「成長培地」は、成長する培養真核細胞に栄養分を与える栄養素を含有する溶液を指す。典型的には、これらの溶液は、最小限の成長及び／又は生存のために細胞によって必要とされる必須及び非必須のアミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、及び微量元素を提供する。溶液はまた、ホルモン及び成長因子を含む、最小速度を超えて成長及び／又は生存を強化する成分を含有することができる。溶液は、細胞生存及び増殖に最適なｐＨ及び塩濃度に配合される。培地はまた、タンパク質、加水分解物、又は未知の組成の成分を含有しない無血清培地である、「限定培地」又は「既知組成培地」であり得る。限定培地は、動物由来の成分を含まず、全ての成分は、既知の化学構造を有する。当業者であれば、限定培地が、組換え糖タンパク質又はタンパク質、例えば限定されないが、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、及び他のシグナル伝達分子を含むことができることを理解する。

本明細書で使用される場合、用語「基本培地配合物」又は「基本培地」は、補充、又はある特定の成分の選択的な除去のいずれかによって改変されていない細胞を培養するために使用される、任意の細胞培養培地を指す。

本明細書で使用される場合、用語「培養」、「細胞培養」、及び「真核細胞培養」は、細胞集団の生存及び／又は増殖に適した条件下の培地中で維持される又は成長する、表面付着した又は懸濁液中のいずれかの真核細胞集団を指す。当業者に明らかになるように、本明細書で使用されるこれらの用語は、哺乳動物細胞集団及び集団が懸濁される培地を含む組み合わせを指すことができる。

本明細書で使用される場合、用語「バッチ培養」は、培地並びに細胞自体を含む、細胞の培養で最終的に使用される全ての成分が培養プロセスの開始時に提供される、細胞を培養する方法を指す。バッチ培養は典型的には、ある時点で停止され、培地中の細胞及び／又は成分が採取され、任意選択的に精製される。

本明細書で使用される場合、用語「流加培養」は、培養プロセスの開始後のある時点で、追加の成分が培養物に提供される、細胞を培養する方法を指す。流加培養は、基本培地を使用して開始され得る。培養プロセスの開始後のある時点で、追加の成分が培養物に提供される培養培地は、フィード培地である。提供される成分は典型的には、培養プロセス中に枯渇した細胞のための栄養補助剤を含む。流加培養は典型的には、ある時点で停止され、培地中の細胞及び／又は成分が採取され、任意選択的に精製される。

本明細書で使用される場合、用語「灌流培養」は、培養プロセスの開始後に、追加の成分が培養に連続的又は半連続的に提供される、細胞を培養する方法を指す。提供される成分は典型的には、培養プロセス中に枯渇した細胞のための栄養補助剤を含む。培地中の細胞及び／又は成分の一部分は典型的には、連続的又は半連続的に採取され、任意選択的に精製される。

細胞培養の「成長期」は、細胞が概して急速に分裂する指数関数的な細胞成長（対数期）の期間を指す。この期間、細胞は一定期間、通常は１～４日間、及び細胞成長が最大化されるような条件下で培養される。宿主細胞の成長サイクルの決定は、過度の実験をすることなく想定される特定の宿主細胞について決定され得る。「期間、及び細胞増殖が最大化されるような条件下」などは、特定の細胞株について、細胞成長及び分裂に対して最適であると判断される培養条件を指す。いくつかの実施形態では、成長期中、細胞は、特定の細胞株に対して最適な成長が達成されるように、加湿された制御雰囲気で、概して約２５℃～４０℃において、必要な添加剤を含有する栄養培地中で培養される。実施形態では、細胞は、約１～７日間、例えば、２～６日間、例えば、６日間の期間にわたって成長期で維持される。特定の細胞の成長期の長さは、過度の実験をすることなく決定され得る。例えば、成長期の長さは、培養物が成長条件下で維持された場合、特定の細胞が可能な限り最大の生細胞密度の約２０％～８０％の範囲内の生細胞密度まで繁殖することを可能にするのに十分な期間である。いくつかの実施形態では、「最大成長速度」は、細胞が新鮮な培養培地中にある間に、特定の細胞株／クローンのその指数関数的成長期の間に測定された成長速度を指す（例えば、栄養分が十分であり、培養の任意の成分からの成長の有意な阻害がない培養中に測定される）。

本明細書で使用される場合、用語「細胞生存率」は、所与の一連の培養条件又は実験変動下で生存する培養物中の細胞の能力を指す。本明細書で使用されるこの用語はまた、その時点において培養物中で生存している細胞及び死滅した細胞の総数に関連して、特定の時間において生存している細胞の割合を指す。

本明細書で使用される場合、用語「細胞密度」は、所与の体積の培地中に存在する細胞の数を指す。

用語「細胞誘導体」又は「誘導体細胞株」は、元の細胞株に由来する、元の細胞株から発生した、元の細胞株から生じる、又は元の細胞株から起こる、元の細胞株とはある点で異なる細胞又は細胞株を指し、例えば、誘導体細胞株は、元の細胞株に対して１つ以上の遺伝子改変を有し得る。用語「誘導体細胞株」は、細胞株を生成するための任意の特定の方法又は工程を暗示するものではない。いくつかの態様では、複数の誘導体細胞株が、単一の元の細胞株によって生じ得る。誘導体細胞株、例えば、ＨＥＫ－２９３細胞に由来するＨＥＫ－２９３誘導体細胞株が、本明細書に記載される方法における使用のために企図される。

本明細書で使用される場合、用語「バイオリアクター」又は「培養槽」は、哺乳動物細胞培養の成長に使用される任意の槽を指す。バイオリアクターは、哺乳動物細胞の培養に有用である限り、任意のサイズであり得る。

本明細書で使用される場合、用語「バイオリアクター実行」は、細胞培養サイクル中の遅滞期、対数相、又はプラトー相の成長期間のうちの１つ以上を含むことができる。

本明細書で使用される場合、用語「Ｎ－ｌ培養槽」、「Ｎ－ｌシードトレイン培養槽」、「Ｎ－ｌ槽」、「Ｎ１－培養」、又は「Ｎ１容器」は、Ｎ培養槽（生産培養槽）の直前にあり、Ｎ（生産）培養槽への後続の接種のために高い生細胞密度まで細胞培養物を成長させるために使用される培養槽を指す。Ｎ－ｌ培養槽で成長する細胞培養物は、Ｎ－ｌ培養槽の前に細胞をＮ－６、Ｎ－５、Ｎ－４、Ｎ－３、及びＮ－２槽などのいくつかの槽で培養した後に得られ得る。本明細書で使用される場合、用語「Ｎ培養槽」、「生産培養槽」、「Ｎ槽」、「Ｎバイオリアクター」、又は「生産バイオリアクター」は、Ｎ－ｌバイオリアクター後のバイオリアクター内の細胞培養を指す。Ｎ培養は、ＡＡＶの産生で使用される。

本明細書で使用される場合、用語「播種すること」又は「接種すること」は、細胞培養物をバイオリアクター又は別の槽に提供するプロセスを指す。一実施形態では、細胞は、別のバイオリアクター又は槽で以前に増殖されている。別の実施形態では、細胞は凍結され、バイオリアクター又は槽に提供する直前に解凍されている。この用語は、単一の細胞を含む任意の数の細胞を指す。

接着細胞のハイブリッドシードトレイン増殖
本開示のいくつかの態様は、細胞増殖方法に関し、方法は、（ａ）Ｎ－２容器内の血清を含む第１の培地で細胞を培養することと、（ｂ）第１の培地から細胞を除去することと、（ｃ）工程（ｂ）からの細胞を、Ｎ－１容器内の、血清を含まないか又は第１の培地よりも低い濃度の血清を含む第２の培地に接種することと、（ｄ）懸濁条件下で、Ｎ－１容器内で細胞を培養することと、（ｅ）バイオリアクター内の第３の培地に工程（ｄ）からの細胞を接種することと、を含む。一実施形態では、第２の培地は、無血清培地である。別の実施形態では、第２の培地は、第１の培地中の血清濃度よりも低い濃度の血清を含む。別の実施形態では、第３の培地は、第２の培地中の血清濃度よりも高い濃度の血清を含む。

本開示のいくつかの態様は、シードトレイン増殖方法に関し、方法は、（ａ）Ｎ－３容器内の血清を含む第１の培地で細胞を培養することと、（ｂ）第１の培地から細胞を除去することと、（ｃ）工程（ｂ）からの細胞を、Ｎ－２容器内の、血清を含まないか又は第１の培地よりも低い濃度の血清を含む第２の培地に接種することと、（ｄ）懸濁条件下で、Ｎ－２容器内で細胞を培養することと、（ｅ）工程（ｄ）からの細胞をＮ－１槽内の第２の培地に接種することと、（ｆ）バイオリアクター内の第３の培地に工程（ｄ）からの細胞を接種することと、を含む。一実施形態では、第２の培地は、無血清培地である。別の実施形態では、第２の培地は、第１の培地中の血清濃度よりも低い濃度の血清を含む。別の実施形態では、第３の培地は、第２の培地中の血清濃度よりも高い濃度の血清を含む。

本開示のいくつかの態様は、接着細胞の細胞増殖方法に関し、方法は、（ａ）血清を含む第１の培地中で、接着条件下で接着細胞を培養することと、（ｂ）第１の培地から接着細胞を除去することと、（ｃ）血清を含まないか又は第１の培地よりも低い濃度の血清を含む第２の培地中に接着細胞を懸濁することと、（ｄ）懸濁条件下で接着細胞を培養することと、（ｅ）バイオリアクター内の第３の培地に工程（ｄ）からの接着細胞を接種することと、を含む。いくつかの態様では、方法は、接着条件下で少なくとも１回、工程（ａ）の接着細胞を継代することを更に含むことができる。いくつかの態様では、方法は、懸濁条件下で少なくとも１回、工程（ｄ）の接着細胞を継代することを更に含むことを更に含むことができる。一実施形態では、第２の培地は、無血清培地である。別の実施形態では、第２の培地は、Ｎ－１容器内の第１の培地よりも低い濃度の血清を含む。別の実施形態では、第３の培地は、第２の培地中の血清濃度よりも高い濃度の血清を含む。

第１の培地、第２の培地、及び第３の培地は、培養される特定の細胞に適した任意の培地であり得る。いくつかの態様では、培地は、例えば、無機塩、炭水化物（例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、又はフルクトースなどの糖類）、アミノ酸、ビタミン（例えば、Ｂ群ビタミン（例えば、Ｂ１２）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リボフラビン、チアミン、及びビオチン）、脂肪酸及び脂質（例えば、コレステロール及びステロイド）、タンパク質及びペプチド（例えば、アルブミン、トランスフェリン、フィブロネクチン、及びフェチュイン）、血清（例えば、アルブミン、成長因子、及び成長阻害剤を含む組成物、例えば、ウシ胎児血清、ウシ新生児仔血清、及びウマ血清）、微量元素（例えば、亜鉛、銅、セレン、及びトリカルボン酸中間体）、加水分解物（植物又は動物源由来の加水分解タンパク質）、並びにそれらの組み合わせを含む。成長培地は、５×濃縮ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯフィード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＢＤ Ｒｅｃｈａｒｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｃｅｌｌｖｅｎｔｏ Ｆｅｅｄ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｅｘ－ｃｅｌｌ ＣＨＯＺＮ Ｆｅｅｄ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＨＯ Ｆｅｅｄ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＳｈｅｆｆＣＨＯ（Ｋｅｒｒｙ）、Ｚａｐ－ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｉａ）、ＡｃｔｉＣＨＯ（ＰＡＡ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（［ＤＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地であり得る。いくつかの態様では、第１の培地、第２の培地、及び第３の培地は、本明細書に記載されるように限定培地であり得る。いくつかの態様では、限定培地は、ＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを含むことができる。

いくつかの態様では、血清を含まないか、又は第１の血清よりも少ない濃度の血清を含む第２の無血清成長培地は、細胞の固定を支持する細胞外マトリックスのカルシウムイオン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、又はプロテオグリカン若しくは非プロテオグリカン多糖類を実質的に含まない（微量レベル以下を含む）。一実施形態では、第２の培地は、無血清培地である。別の実施形態では、第２の培地は、第１の培地中の血清濃度よりも低い濃度の血清を含む。

いくつかの態様では、成長培地は、約６．５～約７．５、約６．５～約７．４、約６．５～約７．３、約６．５～約７．２、約６．５～約７．１、約６．５～約７．０、約６．５～約６．９、約６．５～約６．８、約６．５～約６．７、約６．６～約７．５、約６．６～約７．４、約６．６～約７．３、約６．６～約７．２、約６．６～約７．１、約６．６～約７．０、約６．６～約６．９、約６．６～約６．８、約６．７～約７．５、約６．７～約７．４、約６．７～約７．３、約６．７～約７．２、約６．７～約７．１、約６．７～約７．０、約６．７～約６．９、約６．８～約７．５、約６．８～約７．４、約６．８～約７．３、約６．８～約７．２、約６．８～約７．１、約６．８～約７．０、約６．９～約７．５、約６．９～約７．４、約６．９～約７．３、約６．９～約７．２、約６．９～約７．１、約７．０～約７．５、約７．０～約７．４、約７．０～約７．３、約７．０～約７．２、約７．１～約７．５、約７．１～約７．４、約７．１～約７．３、約７．２～約７．５、約７．２～約７．４、又は約７．３～約７．５．のｐＨを有することができる。

いくつかの態様では、細胞は、約３２℃～約３９℃、約３２℃～約３７℃、約３２℃～約３７．５℃、約３４℃～約３７℃、約３５℃～約３７℃、約３５．５℃～約３７．５℃、約３６℃～約３７℃、又は３６．５℃約の温度で培養され得る。いくつかの態様では、細胞は、培養期間の開始から終了まで約３７℃の温度で培養され得る。いくつかの態様では、温度は培養期間中、例えば、１時間毎又は１日毎に変更され得るか、又はわずかに変動し得る。いくつかの態様では、温度は、培養期間の開始の約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１４日、若しくは１５日後、又は培養期間内の任意の時点で、変更又はシフト（例えば、増加又は減少）され得る。いくつかの態様では、温度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０℃上方にシフトされ得る。いくつかの態様では、温度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０℃下方にシフトされ得る。

いくつかの態様では、細胞培養は、約１％～約１５％ ＣＯ_２を含有する雰囲気を使用して実施され得る。いくつかの態様では、細胞は、約１４％ ＣＯ_２、１２％ ＣＯ_２、１０％ ＣＯ_２、８％ ＣＯ_２、６％ ＣＯ_２、５％ ＣＯ_２、４％ ＣＯ_２、３％ ＣＯ_２、２％ ＣＯ_２、又は約１％ ＣＯ_２を含有する雰囲気を使用して培養され得る。

いくつかの態様では、細胞培養は、細胞培養物中に約３％～約５５％、約３％～約５０％、約３％～約４５％、約３％～約４０％、約３％～約３５％、約３％～約３０％、約３％～約２５％、約３％～約２０％、約３％～約１５％、約５％～約５５％、約５％～約５０％、約５％～約４５％、約５％～約４０％、約５％～約３５％、約５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、約５％～約１０％、約１０％～約５５％、約１０％～約５０％、約１０％～約４５％、約１０％～約４０％、約１０％～約３５％、約１０％～約３０％、約１０％～約２５％、約１０％～約２０％、約１５％～約５５％、約１５％～約５０％、約１５％～約４５％、約１５％～約４０％、約１５％～約３５％、約１５％～約３０％、約１５％～約２５％、約１５％～約２０％、約２０％～約５５％、約２０％～約５０％、約２０％～約４５％、約２０％～約４０％、約２０％～約３５％、約２０％～約３０％、約２０％～約２５％、約２５％～約５５％、約２５％～約５０％、約２５％～約４５％、約２５％～約４０％、約２５％～約３５％、約２５％～約３０％、約３０％～約５５％、約３０％～約５０％、約３０％～約４５％、約３０％～約４０％、約３０％～約３５％、約３５％～約５５％、約３５％～約５０％、約３５％～約４５％、約３５％～約４０％、約４０％～約５５％、約４０％～約５０％、約４０％～約４５％、約４５％～約５５％、約４５％～約５０％、又は約５０％～約５５％の溶解酸素（ｄＯ２）を維持することによって実施され得る。

いくつかの態様では、細胞培養のｐＨは、アルカリ塩基溶液などの塩基溶液の添加によって、特定のｐＨ値で維持され得る。細胞培養のｐＨは、約６．５～約７．５、約６．５～約７．４、約６．５～約７．３、約６．５～約７．２、約６．５～約７．１、約６．５～約７．０、約６．５～約６．９、約６．５～約６．８、約６．５～約６．７、約６．６～約７．５、約６．６～約７．４、約６．６～約７．３、約６．６～約７．２、約６．６～約７．１、約６．６～約７．０、約６．６～約６．９、約６．６～約６．８、約６．７～約７．５、約６．７～約７．４、約６．７～約７．３、約６．７～約７．２、約６．７～約７．１、約６．７～約７．０、約６．７～約６．９、約６．８～約７．５、約６．８～約７．４、約６．８～約７．３、約６．８～約７．２、約６．８～約７．１、約６．８～約７．０、約６．９～約７．５、約６．９～約７．４、約６．９～約７．３、約６．９～約７．２、約６．９～約７．１、約７．０～約７．５、約７．０～約７．４、約７．０～約７．３、約７．０～約７．２、約７．１～約７．５、約７．１～約７．４、約７．１～約７．３、約７．２～約７．５、約７．２～約７．４、又は約７．３～約７．５のｐＨで維持され得る。

いくつかの態様では、懸濁条件下での細胞培養は、例えば、Ｔ－フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、又は振盪フラスコ、又はそれらの組み合わせを使用して、安定した又は混合／振盪された懸濁細胞増殖に適した任意のタイプの細胞培養フラスコで行われ得る。いくつかの態様では、Ｎ－１容器は、振盪フラスコである。いくつかの態様では、Ｎ－１容器は、ウェーブバッグである。

いくつかの態様では、懸濁条件は、何らかの形態の撹拌を含むことができる。いくつかの態様では、撹拌は、回転撹拌であり得る。いくつかの態様では、撹拌は、約２５ＲＰＭ～約５００ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約４８０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約４６０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約４４０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約４２０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約４００ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約３８０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約３６０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約３４０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約３２０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約３００ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約２８０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約２６０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約２４０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約２２０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約２００ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約１８０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約１６０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約１４０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約１２０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約１００ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約８０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約６０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約４０ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約３５ＲＰＭ、約２５ＲＰＭ～約３０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約５００ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約４８０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約４６０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約４４０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約４２０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約４００ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約３８０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約３６０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約３４０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約３２０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約３００ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約２８０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約２６０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約２４０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約２２０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約２００ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約１８０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約１６０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約１４０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約１２０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約１００ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約８０ＲＰＭ、約５０ＲＰＭ～約６０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約５００ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約４８０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約４６０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約４４０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約４２０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約４００ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約３８０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約３６０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約３４０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約３２０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約３００ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約２８０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約２６０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約２４０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約２２０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約２００ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約１８０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約１６０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約１４０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約１２０ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約１００ＲＰＭ、約７５ＲＰＭ～約８０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約５００ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約４８０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約４６０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約４４０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約４２０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約４００ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約３８０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約３６０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約３４０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約３２０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約３００ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約２８０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約２６０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約２４０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約２２０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約２００ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約１８０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約１６０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約１４０ＲＰＭ、約１００ＲＰＭ～約１２０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約５００ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約４８０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約４６０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約４４０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約４２０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約４００ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約３８０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約３６０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約３４０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約３２０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約３００ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約２８０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約２６０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約２４０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約２２０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約２００ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約１８０ＲＰＭ、約１５０ＲＰＭ～約１６０ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約５００ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～４８０ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約４６０ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約４４０ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約４２０ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約４００ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約３８０ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約３６０ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約３４０ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約３２０ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約３００ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約２８０ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約２６０ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約２４０ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ～約２２０ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約５００ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約４８０ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約４６０ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約４４０ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約４２０ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約４００ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約３８０ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約３６０ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約３４０ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約３２０ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約３００ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約２８０ＲＰＭ、約２４０ＲＰＭ～約２６０ＲＰＭ、約２６０ＲＰＭ～約５００ＲＰＭ、約２６０ＲＰＭ～約４８０ＲＰＭ、約２６０ＲＰＭ～約４６０ＲＰＭ、約２６０ＲＰＭ～約４４０ＲＰＭ、約２６０ＲＰＭ～約４２０ＲＰＭ、約２６０ＲＰＭ～約４００ＲＰＭ、約２６０ＲＰＭ～約３８０ＲＰＭ、約２６０ＲＰＭ～約３６０ＲＰＭ、約２６０ＲＰＭ～約３４０ＲＰＭ、約２６０ＲＰＭ～約３２０ＲＰＭ、約２６０ＲＰＭ～約３００ＲＰＭ、約２６０ＲＰＭ～約２８０ＲＰＭ、約２８０ＲＰＭ～約５００ＲＰＭ、約２８０ＲＰＭ～約４８０ＲＰＭ、約２８０ＲＰＭ～約４６０ＲＰＭ、約２８０ＲＰＭ～約４４０ＲＰＭ、約２８０ＲＰＭ～約４２０ＲＰＭ、約２８０ＲＰＭ～約４００ＲＰＭ、約２８０ＲＰＭ～約３８０ＲＰＭ、約２８０ＲＰＭ～約３６０ＲＰＭ、約２８０ＲＰＭ～約３４０ＲＰＭ、約２８０ＲＰＭ～約３２０ＲＰＭ、約２８０ＲＰＭ～約２８０ＲＰＭ、約３００ＲＰＭ～約５００ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ～約４８０ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ～約４６０ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ～約４４０ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ～約４２０ＲＰＭ、約３８０ＲＰＭ～約４００ＲＰＭ、約４００ＲＰＭ～約５００ＲＰＭ、約４００ＲＰＭ～約４８０ＲＰＭ、約４００ＲＰＭ～約４６０ＲＰＭ、約４００ＲＰＭ～約４４０ＲＰＭ、又は約４００ＲＰＭ～約４２０ＲＰＭの回転数で起こり得る。撹拌は、連続的又は周期的に実施され得る。

いくつかの態様では、細胞は、懸濁条件下で２回以下継代される。いくつかの態様では、細胞は、懸濁条件下で３回以下継代される。いくつかの態様では、細胞は、懸濁条件下で４回以下継代される。いくつかの態様では、細胞は、懸濁条件下で５回以下継代される。

いくつかの態様では、細胞は、Ｎ－１容器への継代の前に少なくとも約２４時間、懸濁培養で培養される。したがって、一例として、細胞が懸濁条件下で５回継代される場合、細胞は、Ｎ－４容器への継代前にＮ－５容器内で少なくとも約２４時間培養され、細胞は、Ｎ－３容器への継代前にＮ－４容器内で少なくとも約２４時間培養され、細胞は、Ｎ－２容器への継代前にＮ－３容器内で少なくとも約２４時間培養され、細胞は、Ｎ－１容器への継代前にＮ－２容器内で少なくとも約２４時間培養される。

いくつかの態様では、細胞は、約２４～約１２０時間、懸濁培養で培養される。いくつかの態様では、細胞は、約２４～約９６時間、懸濁培養で培養される。いくつかの態様では、細胞は、約３６～約８４時間、懸濁培養で培養される。いくつかの態様では、細胞は、約４８～約７２時間、懸濁培養で培養される。いくつかの態様では、細胞は、約５４～約６６時間、懸濁培養で培養される。いくつかの態様では、細胞は、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約５４時間、約６０時間、約６６時間、約７２時間、約７８時間、約８４時間、約９０時間、又は約９６時間、懸濁培養で培養される。

本開示のいくつかの態様では、細胞は、接着細胞である。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＣＯＳ細胞、及びそれらの誘導体である。いくつかの態様では、接着細胞は、ヒトである。いくつかの態様では、接着細胞は、動物細胞、昆虫細胞、又は幼虫である。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨｅＬａ又はＨＥＫ－２９３細胞である。いくつかの態様では、接着細胞は、ＨＥＫ－２９３細胞である。

いくつかの態様では、好適な接着細胞は、ＣＲＬ １５７３（ＡＴＣＣ）、２９３－Ｆ（ＧＩＢＣＯ）、ＨＥＫ ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）、２９３ Ｈ、２９３ ＭＳＲ、Ｅｘｐｉ２９３、Ｆｌｐ－Ｉｎ（商標）－２９３、２９３ Ｍｅｔ（－）、及びＴ－ＲＥｘ（商標）２９３が挙げられるが、これらに限定されない、様々な市販のＨＥＫ－２９３細胞株誘導体を含む。ＨＥＫ－２９３細胞株を、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を含む４ｋｂｐのアデノウイルス５（Ａｄ５）ゲノム断片の組み込みによって不死化し、その発現は、アポトーシスを阻害し、転写及び細胞周期制御経路を妨害することによって、ＨＥＫ２９３細胞の連続培養を可能にする。（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａｌｍ，Ｍ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ １０，１８９９６（２０２０））を参照されたい）． ある特定のＨＥＫ－２９３細胞株誘導体を、遺伝子改変によって確立した。１つの非限定的な例は、ＨＥＫ２９３Ｔ誘導体である。ＨＥＫ２９３Ｔゲノムは、ＳＶ４０ラージＴ抗原を含有し、これは、ＳＶ４０プロモーターを含有するプラスミドベクター内の組換えタンパク質の産生を可能にする。１つの非限定的な例は、ＨＥＫ２９３ＭＳＲ誘導体である。ＨＥＫ２９３ＭＳＲ細胞株は、ヒトマクロファージスカベンジャー受容体を発現するように遺伝子改変され、標準的な組織培養皿に強く接着する。本開示のいくつかの態様では、好適な接着細胞は、市販の遺伝子改変ＨＥＫ－２９３細胞株誘導体のいずれかである。

いくつかの態様では、接着細胞は、懸濁に適合していない。いくつかの態様では、懸濁条件下で細胞を培養することは、細胞の接着依存性を変化させない。いくつかの態様では、方法は、細胞を変化させて新しい細胞株を作製しない。いくつかの態様では、方法は、細胞を遺伝子的に変化させない。本明細書に開示される方法は、細胞のゲノムプロファイル又はトランスクリプトームプロファイルを変化させない。本明細書に開示される方法は、細胞の表現型を変化させない。

いくつかの態様では、細胞は、Ｎ－１容器に接種する前に、血清添加成長培地中で、接着条件下で複数回継代される。いくつかの態様では、細胞は、Ｎ－１容器に接種する前に、血清添加成長培地中で、接着条件下で、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、又は少なくとも６回継代される。いくつかの態様では、細胞は、Ｎ－１容器に接種する前に、Ｎ－２、Ｎ－３、Ｎ－４、Ｎ－５、Ｎ－６、Ｎ－７、Ｎ－８、Ｎ－９、又はＮ－１０容器内で培養される。いくつかの態様では、細胞は、Ｎ－３及びＮ－２容器内で培養される。いくつかの態様では、細胞は、Ｎ－４、Ｎ－３、及びＮ－２容器内で培養される。いくつかの態様では、細胞は、Ｎ－６、Ｎ－５、Ｎ－４、Ｎ－３、及びＮ－２容器内で培養される。いくつかの態様では、細胞は、Ｎ－６、Ｎ－５、Ｎ－４、Ｎ－３、Ｎ－２、及びＮ－１容器内で培養される。いくつかの態様では、Ｎ－６、Ｎ－５、Ｎ－４、Ｎ－３、Ｎ－２、及びＮ－１容器は、同じである。いくつかの態様では、Ｎ－６、Ｎ－５、Ｎ－４、Ｎ－３、Ｎ－２、及びＮ－１容器は、異なる。

Ｎ－１容器は、折り畳み式バッグ又は可撓性容器、非折り畳み式又は剛性容器、及び液体貯蔵を伴う任意の他の構成など、バイオリアクターの接種前に細胞株を維持するために、当技術分野で既知の任意のタイプのＮ－１容器又は細胞培養容器若しくは槽を含むことができる。いくつかの態様では、Ｎ－１容器は、振盪フラスコであり得る。いくつかの態様では、Ｎ－１容器は、ウェーブバッグであり得る。

いくつかの態様では、バイオリアクターは、接着バイオリアクターである。いくつかの態様では、バイオリアクターは、増殖細胞が接着することが意図されている少なくとも１つの、より好ましくは複数の担体を含み、これは、バイオリアクター内で浮遊又は固定のいずれかであってもよい。好ましくは、当該担体は、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ＤＥＡＥ－デキストラン、コラーゲン、ガラス、アルギン酸塩、又はアクリルアミドを使用して作製され得る。いくつかの態様では、バイオリアクターは、ビーズ型マイクロキャリア（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｉｎｃ．ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｒｐ．から市販されているＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）ブランドのビーズ）、又はマトリックス型担体（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｏｒｐ．から市販されているＦｉｂｒａ－Ｃｅｌｌ（商標）ブランドのディスク）を含有するバイオリアクターであり得る。いくつかの態様では、バイオリアクターは、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ナノ又はｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）５００バイオリアクター（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）及びＰａｌｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆａｌｌ Ｒｉｖｅｒ，Ｍａｓｓ）から市販されている）で使用されるものなどのポリエステル繊維担体を使用する。

いくつかの態様では、バイオリアクターは、バイオプロセスのための任意の市販のバイオリアクターであり得る。いくつかの態様では、バイオリアクターは、連続撹拌タンクバイオリアクターであり得る。いくつかの態様では、バイオリアクターは、バブルカラムバイオリアクターであり得る。いくつかの態様では、バイオリアクターは、エアリフトバイオリアクターであり得る。いくつかの態様では、バイオリアクターは、流動層型バイオリアクターであり得る。いくつかの態様では、バイオリアクターは、充填層型ベッドバイオリアクターであり得る。いくつかの態様では、バイオリアクターは、光バイオリアクターであり得る。いくつかの態様では、バイオリアクターは、固定層型バイオリアクターであり得る。一態様では、バイオリアクターは、ウイルスベクターを製造するためのＩＣＥＬＬＩＳ固定層型バイオリアクター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）であり得る。

いくつかの態様では、バイオリアクター内の第３の培地は、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子を含む。いくつかの態様では、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子は、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外マトリックスのプロテオグリカン又は非プロテオグリカン多糖類、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子は、バイオリアクターへの懸濁細胞の接種の直前、その最中、又はその直後に第３の培地に添加され得る。

いくつかの態様では、成長培地は、ＤＭＥＭ及び約１０重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約２重量％～約２０重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約３重量％～約１９重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約４重量％～約１８重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約５重量％～約１７重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約６重量％～約１６重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約７重量％～約１５重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約８重量％～約１４重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約９重量％～約１３重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約１０重量％～約１２重量％のＦＢＳを含む。いくつかの態様では、成長培地は、約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、又は約２０重量％のＦＢＳを含む。

いくつかの態様では、工程（ｄ）からの懸濁増殖細胞は、バイオリアクターに直接接種され得る。いくつかの態様では、バイオリアクターに接種される細胞の量は、バイオリアクターのサイズに基づいて変動する。いくつかの態様では、４ｍ^２のバイオリアクター（例えば、ｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ナノバイオリアクター）が使用される。いくつかの態様では、４ｍ^２のバイオリアクターは、約１×１０^８～１×１０^９細胞を接種される。いくつかの態様では、４ｍ^２バイオリアクターは、約３×１０^８～７×１０^８細胞を接種される。４ｍ^２バイオリアクターは、約４×１０^８～６×１０^８細胞を接種される。４ｍ^２バイオリアクターは、約５×１０^８細胞を接種される。いくつかの態様では、同等の細胞密度が、他のサイズのバイオリアクターに使用される。

いくつかの態様では、本開示の方法は、バイオリアクター内で細胞を培養することを更に含むことができる。いくつかの態様では、細胞培養は、バッチ培養を含む。いくつかの態様では、細胞培養は、流加培養を含む。いくつかの態様では、細胞培養は、灌流培養を含む。

流加培養は、細胞培養物から成長培地を実質的に又は大幅に除去することのない、初期細胞培養物へのフィード培養培地の漸増的（周期的）添加又は連続添加を含む。流加培養中の細胞培養物は、バイオリアクター（例えば、１０，０００Ｌの生産バイオリアクターなどの生産バイオリアクター）内に配置され得る。いくつかの態様では、フィード培養培地は、成長培地と同じであり得る。フィード培養培地は、液体形態又は乾燥粉末のいずれかであり得る。いくつかの態様では、フィード培養培地は、成長培地の濃縮形態であり、かつ／又は乾燥粉末として添加される。いくつかの態様では、第１の液体フィード培養培地及び異なる第２の液体フィード培養培地の両方が、成長培地に添加（例えば、連続的に添加）され得る。いくつかの態様では、培養物への第１の液体フィード培養培地の添加及び第２の液体フィード培養培地の添加は、ほぼ同時に開始され得る。いくつかの態様では、培養期間全体にわたって培養物に添加される第１の液体フィード培養培地及び第２の液体フィード培養培地の総体積は、ほぼ同じであり得る。

フィード培養培地が連続的に添加される場合、フィード培養培地の添加速度は、培養期間にわたって一定に維持され得るか、又は増加（例えば、安定して増加）し得る。フィード培養培地の連続添加は、培養期間中の特定の時点で（例えば、細胞が目標生細胞密度、例えば、約１×１０^６細胞／ｍＬ、約１．１×１０^６細胞／ｍＬ、約１．２×１０^６細胞／ｍＬ、約１．３×１０^６細胞／ｍＬ、約１．４×１０^６細胞／ｍＬ、約１．５×１０^６細胞／ｍＬ、約１．６×１０^６細胞／ｍＬ、約１．７×１０^６細胞／ｍＬ、約１．８×１０^６細胞／ｍＬ、約１．９×１０^６細胞／ｍＬ、又は約２．０×１０^６細胞／ｍＬの生細胞密度に達したときに）開始され得る。いくつかの態様では、フィード培養培地の連続添加は、培養期間の２日目、３日目、４日目、又は５日目に開始され得る。

いくつかの態様では、フィード培養培地の漸増的（周期的）添加は、細胞が目標生細胞密度（例えば、約１×１０^６細胞／ｍＬ、約１．１×１０^６細胞／ｍＬ、約１．２×１０^６細胞／ｍＬ、約１．３×１０^６細胞／ｍＬ、約１．４×１０^６細胞／ｍＬ、約１．５×１０^６細胞／ｍＬ、約１．６×１０^６細胞／ｍＬ、約１．７×１０^６細胞／ｍＬ、約１．８×１０^６細胞／ｍＬ、約１．９×１０^６、又は約２．０×１０^６細胞／ｍＬ）に達したときに開始することができる。いくつかの態様では、漸増的フィード培養培地添加は、規則的な間隔で（例えば、毎日、隔日、若しくは３日毎に）起こり得るか、又は細胞が特定の目標細胞密度（例えば、培養期間にわたって増加する目標細胞密度）に達したときに起こり得る。いくつかの態様では、添加されるフィード培養培地の量は、フィード培養培地の第１の漸増的添加と後続のフィード培養培地の添加との間で漸進的に増加することができる。いくつかの態様では、培養期間の任意の２４時間にわたって初期細胞培養物に添加される液体培養フィード培養培地の体積は、培養物を含有するバイオリアクターの初期体積のある割合、又は初期培養物の体積のある割合であり得る。

いくつかの態様では、液体フィード培養培地の添加（連続的又は周期的）は、培養期間の開始後６時間～７日、約６時間～約６日、約６時間～約５日、約６時間～約４日、約６時間～約３日、約６時間～約２日、約６時間～約１日、約１２時間～約７日、約１２時間～約６日、約１２時間～約５日、約１２時間～約４日、約１２時間～約３日、約１２時間～約２日、約１日～約７日、約１日～約６日、約１日～約５日、約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約７日、約２日～約６日、約２日～約５日、約２日～約４日、約２日～約３日、約３日～約７日、約３日～約６日、約３日～約５日、約３日～約４日、約４日～約７日、約４日～約６日、約４日～約５日、約５日～約７日、又は約５日～約６日である時点で起こり得る。

いくつかの態様では、任意の２４時間にわたって初期細胞培養物に（連続的又は周期に）添加される液体フィード培養培地の体積は、バイオリアクターの容量の０．０１×～約０．３×であり得る。割合は、バイオリアクターの容量の約０．０１×～約０．２８×、約０．０１×～約０．２６×、約０．０１×～約０．２４×、約０．０１×～約０．２２×、約０．０１×～約０．２０×、約０．０１×～約０．１８×、約０．０１×～約０．１６×、約０．０１×～約０．１４×、約０．０１×～約０．１２×、約０．０１×～約０．１０×、約０．０１×～約０．０８×、約０．０１×～約０．０６×、約０．０１×～約０．０４×、約０．０２×～約０．３×、約０．０２×～約０．２８×、約０．０２×～約０．２６×、約０．０２×～約０．２４×、約０．０２×～約０．２２×、約０．０２×～約０．２０×、約０．０２×～約０．１８×、約０．０２×～約０．１６×、約０．０２×～約０．１４×、約０．０２×～約０．１２×、約０．０２×～約０．１０×、約０．０２×～約０．０８×、約０．０２×～約０．０６×、約０．０２×～約０．０５×、約０．０２×～約０．０４×、約０．０２×～約０．０３×、約０．０２５×～約０．３×、約０．０２５×～約０．２８×、約０．０２５×～約０．２６×、約０．０２５×～約０．２４×、約０．０２５×～約０．２２×、約０．０２５×～約０．２０×、約０．０２５×～約０．１８×、約０．０２５×～約０．１６×、約０．０２５×～約０．１４×、約０．０２５×～約０．１２×、約０．０２５×～約０．１０×、約０．０２５×～約０．０８×、約０．０２５×～約０．０６×、約０．０２５×～約０．０４×、約０．０５×～約０．３×、約０．０５×～約０．２８×、約０．０５×～約０．２６×、約０．０５×～約０．２４×、約０．０５×～約０．２２×、約０．０５×～約０．２０×、約０．０５×～約０．１８×、約０．０５×～約０．１６×、約０．０５×～約０．１４×、約０．０５×～約０．１２×、約０．０５×～約０．１０×、約０．１×～約０．３×、約０．１×～約０．２８×、約０．１×～約０．２６×、約０．１×～約０．２４×、約０．１×～約０．２２×、約０．１×～約０．２０×、約０．１×～約０．１８×、約０．１×～約０．１６、約０．１×～約０．１４×、約０．１×、約０．１５×～約０．３×、約０．１５×～約０．２×、約０．２×～約０．３×、又は約０．２５×～約０．３×であり得る。

いくつかの態様では、培養期間中の任意の２４時間にわたって初期細胞培養物に（連続的又は周期的に）添加される液体フィード培養培地の体積は、初期細胞培養物の体積の約０．０２×～約１．０×、約０．０２×～約０．９×、約０．０２×～約０．８×、約０．０２×～約０．７×、約０．０２×～約０．６×、約０．０２×～約０．５×、約０．０２×～約０．４×、約０．０２×～約０．３×、約０．０２×～約０．２×、約０．０２×～約０．１×、約０．０２×～約０．０８×、約０．０２×～約０．０６×、約０．０２×～約０．０５×、約０．０２×～約０．０４×、約０．０２×～約０．０３×、約０．０５×～約１．０×、約０．０５×～約０．８×、約０．０５×～約０．７×、約０．０５×～約０．６×、約０．０５×～約０．５×、約０．０５×～約０．４×、約０．０５×～約０．３×、約０．０５×～約０．２×、約０．０５×～約０．１×、約０．１×～約１．０×、約０．１×～約０．９×、約０．１×～約０．８×、約０．１×～約０．７×、約０．１×～約０．６×、約０．１×～約０．５×、約０．１×～約０．４×、約０．１×～約０．３×、約０．１×～約０．２×、約０．２×～約１．０×、約０．２×～約０．９×、約０．２×～約０．８×、約０．２×～約０．７×、約０．２×～約０．６×、約０．２×～約０．５×、又は約０．２×～約０．４×であり得る。

いくつかの態様では、培養期間全体にわたって（連続的又は周期的に）添加されるフィード培養培地の総量は、初期培養物の体積の約１％～約４０％（例えば、約１％～約３５％、約１％～約３０％、約１％～約２５％、約１％～約２０％、約１％～約１５％、約１％～約１０％、約１％～約５％、約１％～約４％、約２％～約４０％、約２％～約３５％、約２％～約３０％、約２％～約２５％、約２％～約２０％、約２％～約１５％、約２％～約１０％、約２％～約５％、約３％～約４０％、約３％～約３５％、約３％～約３０％、約３％～約２５％、約３％～約２０％、約３％～約１５％、約３％～約１０％、約３％～約５％、約４％～約４０％、約４％～約３５％、約４％～約３０％、約４％～約２５％、約４％～約２０％、約４％～約１５％、約４％～約１０％、約４％～約８％、約５％～約４０％、約５％～約３５％、約５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、約５％～約１０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３５％、約１０％～約３０％、約１０％～約２５％、約１０％～約２０％、約１０％～約１５％、約１５％～約４０％、約１５％～約３５％、約１５％～約３０％、約１５％～約２５％、約１５％～約２０％、約２０％～約４０％、約２０％～約３５％、約２０％～約３０％、約２０％～約２５％、約２５％～約４０％、約２５％～約３５％、約２５％～約３０％、約３０％～約４０％、約３０％～約３５％、又は約３５％～約４０％）であり得る。

いくつかの態様では、２つの異なるフィード培養培地が、流加培養中に（連続的又は漸増的に）添加される。いくつかの態様では、添加される第１のフィード培養培地及び第２のフィード培養培地の量又は体積は、実質的に同じであり得るか、又は異なり得る。いくつかの態様では、第１のフィード培養培地は、液体の形態であり得、第２のフィード培養培地は、固体の形態であり得る。いくつかの態様では、第１のフィード培養培地及び第２のフィード培地は、液体フィード培養培地であり得る。

灌流培養は、バイオリアクターから成長培地の第１の体積を除去することと、第２の成長培養培地の第２の体積を生産バイオリアクターに添加することと、を含み、第１の体積及び第２の体積は、ほぼ等しい。細胞は、細胞保持デバイスによって、又は沈降コーンにおける細胞沈降などの技術を介して、バイオリアクター内に保持される。いくつかの態様では、成長培地の除去及び添加は、同時若しくは逐次的に、又はそれら２つのなんらかの組み合わせで実施され得る。いくつかの態様では、除去及び添加は、バイオリアクターの容量の０．１％～８００％、１％～７００％、１％～６００％、１％～５００％、１％～４００％、１％～３５０％、１％～３００％、１％～２５０％、１％～１００％、１００％～２００％、５％～１５０％、１０％～５０％、１５％～４０％、８％～８０％、又は４％～３０％の体積を除去及び交換する速度などで、連続的に実施され得る。

いくつかの態様では、除去される第１の成長培地の第１の体積及び添加される第２の成長培地の第２の体積は、各２４時間の期間にわたってほぼ同じに保持され得る。いくつかの態様では、第１の成長培地の第１の体積が除去される速度（体積／時間単位）、及び第２の成長培地の第２の体積が添加される速度（体積／時間単位）は変動し得、特定の細胞培養システムの条件に依存する。いくつかの態様では、第１の成長培地の第１の体積が除去される速度（体積／時間単位）、及び第２の成長培地の第２の体積が添加される速度（体積／時間単位）は、ほぼ同じであり得るか、又は異なり得る。

いくつかの態様では、除去及び添加される体積は、各２４時間の期間にわたって徐々に増加することによって変化することができる。いくつかの態様では、各２４時間の期間にわたって除去される第１の成長培地の体積及び添加される第２の成長培地の体積は、培養期間にわたって増加することができる。いくつかの態様では、体積は、２４時間の期間にわたってバイオリアクターの容量の０．５％～約２０％である体積、増加することができる。いくつかの態様では、体積は、２４時間の期間にわたって、バイオリアクターの容量又は第１の液体培養培地体積の約２５％～約１５０％である体積まで、培養期間にわたって増加することができる。

いくつかの態様では、培養期間の最初の４８～９６時間後、各２４時間の期間にわたって、除去される第１の成長培地の第１の体積及び添加される第２の成長培地の第２の体積は、第１の成長培地の体積の約１０％～約９５％、約１０％～約２０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％、約５０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、約８５％～約９５％、約６０％～約８０％、又は約７０％である。

いくつかの態様では、第１の成長培地及び第２の成長培地は、同じタイプの培地であり得る。いくつかの態様では、第１の成長培地及び第２の成長培地は、異なり得る。いくつかの態様では、第２の液体培養培地は、１つ以上の培地成分に関してより濃縮されてもよい。

いくつかの態様では、第１の成長培地の第１の体積は、任意の自動システムを使用することによって除去され得る。いくつかの態様では、交互接線流濾過が使用されてもよい。いくつかの態様では、第１の成長培地の第１の体積は、細胞を除外する分子量カットオフを有する滅菌膜を通した、第１の成長培地の第１の体積の浸出又は重力流によって除去され得る。いくつかの態様では、第１の成長培地の第１の体積は、少なくとも１分、少なくとも２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４０分、５０分、又は１時間の期間、撹拌速度を停止するか又は大幅に減少させ、生産バイオリアクターの頂部から、成長培地の第１の体積を除去又は吸引することによって除去され得る。

いくつかの態様では、第２の液体培養培地の第２の体積は、ポンプによって第１の液体培養培地に添加され得る。いくつかの態様では、第２の液体培養培地は、第１の液体培地に、第２の液体培養培地の第２の体積を第１の液体培養培地上に直接分注若しくは注入することになどよって手動で、又は自動化された様式で添加され得る。

いくつかの態様では、方法は、細胞を第１のポリヌクレオチド配列と接触させることを更に含む。いくつかの態様では、方法は、細胞をポリヌクレオチド配列でトランスフェクトすることを更に含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列は、プラスミドである。いくつかの態様では、プラスミドは、ＡＡＶ、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される組換えウイルス粒子のカプシドタンパク質をコードする。いくつかの態様では、細胞は、バイオリアクターに接種される前にトランスフェクトされる。いくつかの態様では、細胞は、バイオリアクターに接種された後にトランスフェクトされる。いくつかの態様では、細胞は、第２のポリヌクレオチドと接触するか、又はそれでトランスフェクトされ、導入遺伝子をコードする核酸を含む。いくつかの態様では、細胞は、ヘルパー遺伝子をコードする第３のポリヌクレオチドと接触するか、又はそれでトランスフェクトされる。一実施形態では、ヘルパー遺伝子は、アデノウイルスヘルプ遺伝子である。一実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、末端逆位配列、少なくとも１つのＡＡＶ複製タンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸、又は少なくとも１つのＡＡＶ構造カプシドタンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上を含む。

いくつかの態様では、細胞は、ウイルスベクターを産生する条件下で培養される。いくつかの態様では、方法は、産生されたウイルスベクターを単離することを更に含む。

いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターである。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。これらのベクターは、滑膜細胞及び肝臓細胞を含む多数の分裂及び非分裂細胞型に感染する。細胞侵入後のアデノウイル及びＡＡＶベクターのエピソーム性質は、これらのベクターを治療用途に適したものにする。上記に示されるような（Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２５７３－２６０４、Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，２００５，Ｖｉｒｏｌ Ｊ．２（１）：４３）。ＡＡＶベクターは、導入遺伝子発現の非常に安定した長期発現をもたらす可能性がある（イヌにおいて最長９年間（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００９ Ｊａｎ．２２；１１３（４）：７９７－８０６）、及びヒトにおいて最長２年間（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１ Ｄｅｃ．２２；３６５（２５）：２３５７－６５、Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｍａｒｃｈ；１８（３）：６４３－５０．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｄｅｃ．１．））。いくつかの態様では、アデノウイルスベクターは、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００、上記参照）によってレビューされるように、宿主応答を低減するように改変される。ＡＡＶベクターを使用した遺伝子療法のための方法は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ． Ｍａｒｃｈ ９（印刷前の電子出版）、Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．６（５）：４８２－９０、及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｅｙｅ １８（１１）：１０４９－５５、Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２０１１ Ｄｅｃ．２２；３６５（２５）：２３５７－６５、Ａｐｐａｒａｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００５ Ａｐｒｉｌ；１６（４）：４２６－３４によって記載されている。

いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列は、末端逆位配列、少なくとも１つのＡＡＶ複製タンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶ構造カプシドタンパク質をコードする核酸、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。いくつかの態様では、第２のポリヌクレオチドは、導入遺伝子をコードする核酸を含む。いくつかの態様では、第３のポリヌクレオチドは、ヘルパー遺伝子をコードする。

いくつかの態様では、細胞は、組換えウイルス粒子を産生する条件下で培養される。いくつかの態様では、方法は、産生された組換えウイルス粒子を単離することを更に含む。

いくつかの態様では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの態様では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベースの発現構築物である。レンチウイルスベクターは、分裂及び非分裂細胞のゲノムに感染し、それに安定して組み込まれる能力を有する（Ａｍａｄｏ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，１９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：６７４－６）。レンチウイルスベースの発現構築物の構築及び使用のための方法は、米国特許 第６，１６５，７８２号、同第６，２０７，４５５号、同第６，２１８，１８１号、同第６，２７７，６３３号、及び同第６，３２３，０３１号、並びにＦｅｄｅｒｉｃｏ（１９９９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １０：４４８－５３）及びＶｉｇｎａ ｅｔ ａｌ．（２０００，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２０００；２：３０８－１６）に記載されている。

いくつかの態様では、ウイルスベクターは、ヘルペスウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、又はワクシニアウイルスベクターである。

いくつかの態様では、ウイルスベクターは、適切な調節配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含む。用語「調節配列」は、タンパク質の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））において記載されている。いくつかの態様では、調節配列は、プロモーター配列を含むことができる。いくつかの態様では、プロモーター配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモーター、ウイルス長末端反復プロモーター（ＬＴＲ）、例えば、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ラウス肉腫ウイルス、又はＨＴＬＶ－１、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター由来のものであり得る。いくつかの態様では、プロモーターは、筋肉、心臓、ＣＮＳ、及び肝臓を含むがこれらに限定されない、組織特異的プロモーターである。

いくつかの態様では、ウイルスベクターは、更なるポリペプチドをコードする更なるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、更なるポリペプチドは、ウイルスベクターを含有する細胞の特定、選択、及び／又はスクリーニングを可能にする（選択可能な）マーカーポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、マーカーポリペプチドは、蛍光タンパク質ＧＦＰ、及び選択可能なマーカー遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地での選択用）、細菌ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢでの選択用）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８での選択用）、及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（メトトレキサートでの選択用）、ＣＤ２０、低親和性神経成長因子遺伝子であり得る。これらのマーカー遺伝子を取得するためのソース及びそれらの使用方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋで提供されている。

ウイルスベクターの産生
本開示のいくつかの態様は、ウイルスベクターを産生する方法に関し、方法は、本明細書に開示されるシードトレイン増殖方法のうちのいずれか１つに従って細胞を増殖することと、バイオリアクター内の増殖培地に細胞を接種することと、細胞を、ウイルス粒子をコードするポリヌクレオチド配列でトランスフェクトすることと、ウイルス粒子が産生される条件下で、バイオリアクター内で細胞を培養することと、を含む。いくつかの態様では、培地は、限定培地又は馴化培地であり得る。本明細書で使用される場合、用語「限定培地（ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）」又は「限定培地（ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉａ）」又はその等価物は、生化学的に定義された構成要素のみからなる生化学的に定義された製剤を指す。いくつかの実施形態では、限定培地は、既知の化学組成を有する構成要素のみを含む。他の実施形態では、限定培地は、既知の供給源に由来する構成要素を含む。例えば、限定培地は、既知の組織又は細胞から分泌された因子及び他の組成物も含むことができるが、限定培地は、そのような細胞の培養物からの馴化培地を含まない。したがって、示される場合、「限定培地」は、培養培地を形成するために添加される特定の化合物を含むことができる。限定培地組成物は、当技術分野、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２７５５で既知であり、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａによってＳｔｅｍＰｒｏ～ｈＥＳＣ ＳＦＭとして市販されており、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、語句「馴化培地」は、基本培地と比較して変化している培地を指す。例えば、培地の馴化は、栄養素及び／又は成長因子などの分子を、基本培地に見られる元のレベルに添加させるか、又はそれから枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、培地は、ある特定の型の細胞が、ある特定の期間、ある特定の条件下で、培地中で成長すること又は維持されることを可能にするによって馴化される。

外因性核酸を宿主細胞中に導入する方法は、当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞により変動する。技術は、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、ポリエチレンイミン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス又はファージ感染、リポソーム中のポリヌクレオチドの封入、及び核中へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含むが、これらに限定しない。トランスフェクションは、一過性又は安定のいずれかであり得る。

いくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列は、プラスミドである。いくつかの態様では、プラスミドは、ＡＡＶ、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるウイルス粒子をコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列は、ウイルスベクターである。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、ウイルス粒子をコードする。いくつかの態様では、ウイルス粒子は、ＡＡＶ、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される方法によって産生される組換えウイルス又はウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、組換えウイルス又はウイルスベクターは、ＡＡＶ、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、又はワクシニアウイルスのものである。

いくつかの態様では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。いくつかの態様では、ＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）を含むことができる。本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書に開示されるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質のタンパク質シェル中でカプシド形成されたＡＡＶゲノムの一部を含む組換えベクターを指す。いくつかの態様では、ＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２などに由来する末端逆位配列（ＩＴＲ）を含むことができる。

典型的には、ベクターゲノムは、ベクターゲノムをｒＡＡＶカプシドに効率的にパッケージングすることを可能にするために、隣接した５’及び３’ＩＴＲ配列の使用を必要とする。いくつかの態様では、ｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムは、少なくとも、ＡＡＶ血清型のうちの１つの末端逆位配列領域（ＩＴＲ）のヌクレオチド配列、又は実質的に同一のヌクレオチド配列、及び好適な調節因子（例えば、プロモーター）の制御下で導入遺伝子をコードする核酸配列を含み、調節因子及び改変核酸配列は、２つのＩＴＲの間に挿入される。

いくつかのＡＡＶ血清型及び対応するＩＴＲの完全なゲノムが配列決定されている（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２，ｐ１３０９－１３１９）。それらは、クローニングされ得るか、又は当技術分野で既知の化学合成によって、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒｓ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）によって供給されるオリゴヌクレオチド合成装置によって、又は標準的な分子生物学技術によって作成され得る。ＩＴＲは、ＡＡＶウイルスゲノムからクローニングされ得るか、又はＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターから切除され得る。ＩＴＲヌクレオチド配列は、標準的な分子生物学技術を使用して、１つ以上の治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列のいずれかの末端でライゲーションされ得るか、又はＩＴＲ間の野生型ＡＡＶ配列が、所望のヌクレオチド配列で置き換えられ得る。

いくつかの態様では、パッケージングされたウイルスベクターのウイルスカプシド成分は、パルボウイルスカプシド、例えば、ＡＡＶ Ｃａｐ及び／又はキメラカプシドであり得る。好適なパルボウイルスのウイルスカプシド成分の例は、自律性パルボウイルス又はディペンドウイルスなどのパルボウイルス科由来のカプシド成分である。例えば、ウイルスカプシドは、ＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶＲＨ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶＲＨ１０、ＡＡＶ１１、若しくはＡＡＶ１２カプシド。当業者であれば、同じ又は類似の機能を果たす、まだ特定されていない他のバリアントがある可能性があることを知っているであろう）であってもよいか、又は２つ以上のＡＡＶカプシド由来の成分を含んでもよい。ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全補体は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３を含む。ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、完全補体未満のＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を含み得るか、又はＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全補体が提供され得る。

いくつかの態様では、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質のうちの１つ以上は、２つ以上のウイルス、好ましくは２つ以上のＡＡＶ由来のアミノ酸配列ＡＡＶ Ｃａｐを含むキメラタンパク質であり得る。例えば、キメラウイルスカプシドは、ＡＡＶ１ Ｃａｐタンパク質又はサブユニット、及び少なくとも１つのＡＡＶ２ Ｃａｐ又はサブユニットを含むことができる。いくつかの態様では、ｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）又はｃａｐ（カプシド）遺伝子などのウイルスタンパク質をコードするいかなるヌクレオチド配列も含まない。いくつかの態様では、ｒＡＡＶゲノムは、マーカー又はレポーター遺伝子、例えば、抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）、又は当技術分野で既知の化学的、酵素的、若しくは他の方法で検出可能及び／若しくは選択可能な生成物（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈなど）をコードする遺伝子などを更に含むことができる。

いくつかの態様では、当該ｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を更に含むことができる。

いくつかの態様では、好適な３’非翻訳配列もまた、導入遺伝子をコードする改変核酸配列に作動可能に連結され得る。好適な３’非翻訳領域は、ヌクレオチド配列に天然に関連した領域であり得るか、又は例えば、ウシ成長ホルモン３’非翻訳領域（例えば、ｂＧＨポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びエンハンサー配列）などの異なる遺伝子に由来し得る。

別段の示唆がない限り、当業者に既知の方法が、組換えパルボウイルス及びＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物、パルボウイルスＲｅｐ及び／又はＣａｐ配列を発現するパッケージングベクター、並びに一過性かつ安定的に処理されたパッケージング細胞の構築に使用され得る。そのような技術は、当業者に既知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｌ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。

いくつかの態様では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。レンチウイルスは、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節機能又は構造機能を有する他の遺伝子を含有する複雑なレトロウイルスである。より高い複雑さにより、レンチウイルスは、潜伏感染の過程にあるように、そのライフサイクルを調整することができる。

典型的なレンチウイルスは、ＡＩＤＳの病因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。インビボでは、ＨＩＶは、リンパ球及びマクロファージなど、滅多に分裂しない最終分化細胞に感染することができる。インビトロでは、ＨＩＶは、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）の初代培養物、並びにアフィディコリン又はγ線照射の処理によって細胞周期が停止されたＨｅＬａ－Ｃｄ４又はＴリンパ球細胞に感染することができる。

細胞の感染は、標的細胞の核膜孔を通したＨＩＶ組み込み前複合体の能動的な核輸入に依存する。これは、複合体中の複数の部分的に重複している分子決定因子の、標的細胞の核輸入機構との相互作用によって起こる。特定された決定因子は、ｇａｇマトリックス（ＭＡ）タンパク質中の機能的核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核親和性ビリオン関連タンパク質、ｖｐｒ、及びｇａｇ ＭＡタンパク質中のＣ末端ホスホチロシン残基を含む。

レンチウイルスゲノム及びプロウイルスＤＮＡは、レトロウイルスに見られる３つの遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖを有し、これらには、２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列が隣接している。ｇａｇ遺伝子は、内部構造（マトリックス、カプシド、及びヌクレオカプシド）タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼ及びインテグラーゼをコードし、ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’及び３’のＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写及びポリアデニル化を促進する役割を果たす。ＬＴＲは、ウイルス複製に必要な他の全てのシス作用配列を含有する。レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、及びｖｐｘ（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、及び／又はＳＩＶ中）を含む追加の遺伝子を有する。

ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）、及び粒子へのウイルスＲＮＡの効率的なカプシド形成（Ｐｓｉ部位）に必要な配列が、５’ＬＴＲに隣接している。カプシド形成（又は感染ビリオンへのレトロウイルスＲＮＡのパッケージング）に必要な配列が、ウイルスゲノムから失われている場合、シス欠損は、ゲノムＲＮＡのカプシド形成を妨げる。しかしながら、得られた変異体は、全てのビリオンタンパク質の合成を誘導することができるままである。

いくつかの態様では、組換えレンチウイルスは、好適な宿主細胞を、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ、並びにｒｅｖ及びｔａｔを担持する２つ以上のベクターでトランスフェクトすることによって、非分裂細胞に感染することができる。いくつかの例では、機能的ｔａｔ遺伝子を欠くベクターが望ましい。したがって、例えば、第１のベクターは、ウイルスｇａｇ及びウイルスｐｏｌをコードする核酸を提供することができ、別のベクターは、パッケージング細胞を産生するために、ウイルスｅｎｖをコードする核酸を提供することができる。輸送ベクターとして特定される異種遺伝子を提供するベクターをパッケージング細胞に導入すると、プロデューサー細胞がもたらされ、これは、目的の外来遺伝子を担持する感染性ウイルス粒子を放出する。

目的のベクターのｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子も、当技術分野で既知である。したがって、関連する遺伝子は、選択されたベクターにクローニングされ、次いで、目的の標的細胞を形質転換するために使用される。

ベクター及び外来遺伝子の上述の構成によると、第２のベクターは、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子をコードする核酸を提供することができる。ｅｎｖ遺伝子は、レトロウイルスを含む任意のウイルスに由来し得る。ｅｎｖは、好ましくは、ヒト及び他の種の細胞の遺伝子導入を可能にする両種指向性エンベロープタンパク質である。

特定の細胞型の受容体を標的化するために、エンベロープタンパク質を抗体又は特定のリガンドと連結することによって、組換えウイルスを標的化することが望ましくあり得る。例えば、特定の標的細胞上の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と共に、目的の配列（調節領域を含む）をウイルスベクターに挿入することによって、ベクターは、この時点で標的特異的になる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖脂質又はタンパク質を挿入することによって標的特異的にされ得る。標的化は多くの場合、抗体の抗原結合部分、又は一本鎖抗体などの組換え抗体型分子を使用して、レトロウイルスベクターを標的化することによって達成される。当業者であれば、過度の実験なしに、特定の標的へのレトロウイルスベクターの送達を達成するための特定の方法を知るか、又はそれを容易に確認することができる。

レトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ又はＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ又はＨＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ又はＭＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ又はＧＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びラス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）タンパク質Ｇ（ＶＳＶ Ｇ）、肝炎ウイルス及びインフルエンザのものなどの他のｅｎｖ遺伝子も使用され得る。

ウイルスｅｎｖ核酸配列を提供するベクターは、調節配列、例えば、プロモーター又はエンハンサーと作動可能に関連付けられる。調節配列は、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスプロモーター－エンハンサー要素、ヒトサイトメガロウイルスエンハンサー、又はワクシニアＰ７．５プロモーターを含む、任意の真核細胞プロモーター又はエンハンサーであってもよい。場合によっては、モロニーマウス白血病ウイルスプロモーター－エンハンサー要素など、プロモーター－エンハンサー要素は、ＬＴＲ配列内に、又はそれに隣接して位置する。

いくつかの態様では、当該レンチウイルスベクター中に存在するレンチウイルスゲノムは、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を更に含む。いくつかの態様では、プロモーター配列は、筋細胞及び／又は筋組織で発現を付与するプロモーターである。そのようなプロモーターの例としては、本明細書に開示されるＣＭＶ及びＲＳＶプロモーターが挙げられる。

いくつかの態様では、好適な３’非翻訳配列もまた、導入遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に連結され得る。好適な３’非翻訳領域は、ヌクレオチド配列に天然に関連した領域であり得るか、又は例えば、ウシ成長ホルモン３’非翻訳領域（例えば、ｂＧＨポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びエンハンサー配列）などの異なる遺伝子に由来し得る。

いくつかの態様では、追加のヌクレオチド配列は、シグナル配列、核局在化シグナル、発現エンハンサーなどをコードするヌクレオチド配列など、導入遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に連結され得る。

別段の示唆がない限り、当業者に既知の方法が、レンチウイルス構築物、ベクター、及び一過性かつ安定的に処理されたるパッケージング細胞の構築に使用され得る。そのような技術は、当業者に既知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ． （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｌ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。

いくつかの態様では、方法は、産生されたウイルス粒子を単離することを更に含む。ウイルスベクターは、細胞内で複製し、それによって増幅され、ウイルス粒子を産生する。ウイルス感染は、トランスフェクトされた細胞の溶解をもたらす。したがって、ＡＡＶなどのウイルスベクターの溶解特性は、ウイルス粒子の産生及び単離の２つの異なる様式を可能にする。第１の様式は、細胞溶解前にウイルス粒子を採取し、外部因子を利用して細胞を溶解することである。第２の様式は、産生されたウイルスによるほぼ完全な細胞溶解の後に、上清からウイルス粒子を採取することである。

能動的な細胞溶解に使用され得る方法は、当業者に既知である。いくつかの態様では、細胞は、凍結融解、固体剪断、高張及び／又は低張溶解、液体剪断、超音波処理、高圧押出し、洗浄剤溶解、上記の組み合わせなどによって溶解され得る。

いくつかの態様では、細胞は、少なくとも１つの洗浄剤を使用して溶解され得る。いくつかの態様では、洗浄剤は、アニオン、カチオン、双性イオン、及び非イオン洗浄剤を含むことができる。いくつかの態様では、洗浄剤の濃度は、約０．１％～５％（ｗ／ｗ）であり得る。いくつかの態様では、洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００であり得る。

いくつかの態様では、ヌクレアーゼが、トランスフェクトされた細胞から汚染核酸、すなわち、天然核酸を除去するために利用され得る。いくつかの態様では、ヌクレアーゼは、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＬＭＯＺＹＭＥ（登録商標）、又は当技術分野で一般的に使用される任意の他のＤＮａｓｅ及び／若しくはＲＮａｓｅであり得る。

トランスフェクトされた細胞からウイルスベクターを採取又は単離するための方法は、ＷＯ ２００５／０８０５５６に広く開示されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの態様では、ウイルスベクターの採取又は単離の時間は、トランスフェクションの約２４～１２０時間後、約３６～１０８時間、トランスフェクションの約４８～約９６時間後、トランスフェクションの約６０～約８４時間後である。いくつかの態様では、ベクターの採取又は単離の時間は、トランスフェクションの約７２時間後である。

いくつかの態様では、単離されたウイルス粒子は、更に精製され得る。いくつかの態様では、ウイルス粒子の精製は、浄化、限外濾過、透析濾過、又はクロマトグラフィーによる分離を含む、いくつかの工程で実施され得る。そのような方法は、ＷＯ ２００５／０８０５５６に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、浄化は、細胞溶解物から細胞残屑及び他の不純物を除去する濾過工程によって行われてもよい。いくつかの態様では、限外濾過を使用してウイルス溶液を濃縮する。いくつかの態様では、透析濾過、バッファー交換、又は限外濾過を使用して、塩、糖類などを除去及び交換することができる。当業者は、各精製工程についての最適な条件を見つける方法を知っている。

いくつかの態様では、精製が、密度勾配遠心分離によって達成され得る。いくつかの態様では、精製は、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を用いる。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせによって精製され得る。

発明の概要及び要約のセクションではなく、発明を実施するための形態のセクションが、特許請求の範囲を解釈するために使用されることを意図していることが理解されるべきである。発明の概要及び要約のセクションは、本発明者によって企図される本発明の１つ以上であるが全てではない例示的な実施形態を記載し得、したがって、本発明及び添付の特許請求の範囲をいかなる方法でも制限することを意図するものではない。

ＨＥＫ２９３細胞を接着条件で４回継代した。最後から２番目の増殖培養に入る前に、細胞を採取し、遠心分離して血清を洗い流し（３００ｇで５分間）、０．５＋Ｅ６細胞／ｍＬの播種密度で、懸濁振盪フラスコ内の無血清成長培地（ＥＸＰＩ２９３）中に再懸濁した。次いで、細胞を４８～７２時間にわたって成長させ、数を増殖させた。次いで、バイオリアクター接種に必要であった生細胞の数に応じて、懸濁細胞を収集し、振盪フラスコ又はＷＡＶＥバッグに接種した。７２時間の終わりに、細胞計数装置を使用して生細胞の濃度を決定した。次いで、好ましい総生細胞を含有する必要な体積を、ＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを含有する接着バイオリアクターに添加した。最終ＦＢＳ濃度が１０％に維持されるような無血清懸濁培養体積の添加を考慮するように、追加のＦＢＳを適切に添加した。

図３に示されるように、シードトレインシステム及び接着システムの両方における細胞生存率は類似していた。生細胞密度（ＶＣＤ）に関して、ハイブリッドシードトレインシステムでは、第６継代後のＶＣＤは、第１継代後のＶＣＤよりも高く（図４Ａ）、これは、接着システムに匹敵する（図４Ｂ）。その一方で、懸濁細胞又は懸濁に適合した細胞を有するシードトレインシステムは、従来の接着システムよりも便利な継代を可能にした。また、懸濁細胞培養を用いたシードトレインシステムにおける細胞継代は、トリプシンの使用を回避し、汚染を最小限に抑え、したがって、治療用ウイルスベクターのスケールアップ産生又は製造を可能にする。

本発明は、指定された機能の実装及びそれらの関係を示す機能構築ブロックを用いて、上に記載されている。これらの機能構築ブロックの境界は、説明の便宜上、本明細書で任意に定義されている。指定された機能及びそれらの関係が適切に実施される限り、代替的な境界が定義され得る。

特定の実施形態の前述の記載は、他者が、当技術分野の技能内の知識を適用することによって、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、過度の実験を行うことなく、様々な用途のために、そのような特定の実施形態を容易に変更及び／又は適応することができるほど完全に、本発明の一般的な性質を明らかにする。したがって、そのような適応及び変更は、本明細書中に提示する教示及びガイダンスに基づいて、開示する実施形態の同等物の意味及び範囲内であることが意図される。本明細書中の語句又は用語は、本明細書の用語又は語句が、教示及びガイダンスに照らして当業者により解釈されるように、限定ではなく、説明の目的のためであることを理解すべきである。

本発明の幅及び範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれによっても制限されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの等価物に従ってのみ定義されるべきである。

Claims (140)

1. 細胞増殖の方法であって、
   （ａ）Ｎ－２容器内の血清を含む第１の成長培地で細胞を培養することと、
   （ｂ）前記第１の培地から前記細胞を除去することと、
   （ｃ）工程（ｂ）からの前記細胞を、Ｎ－１容器内の、血清を含まないか又は前記第１の培地よりも低い濃度の血清を含む第２の培地に接種することと、
   （ｄ）懸濁条件下で、前記Ｎ－１容器内で前記細胞を培養することと、
   （ｅ）工程（ｄ）からの前記細胞にバイオリアクター内の第３の培地を接種することと、を含む、方法。
2. 前記細胞が、接着細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｎ－１容器及び前記Ｎ－２容器が、同じである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記Ｎ－１容器及び前記Ｎ－２容器が、異なる、請求項１又は２に記載の方法。
5. 前記Ｎ－１容器が、振盪フラスコ又はウェーブバッグを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記細胞が、工程（ｅ）の前に、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、又は少なくとも６回継代される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記第３の培地が、前記第２の培地中の前記血清濃度よりも高い血清濃度を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記接着細胞が、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＣＯＳ細胞、及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記接着細胞が、ヒト細胞、動物細胞、昆虫細胞、又は幼虫である、請求項２～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記接着細胞が、ＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ－２９３細胞である、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記接着細胞が、ＨＥＫ－２９３細胞である、請求項２～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記接着細胞が、懸濁に適合していない、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記接着細胞が、懸濁に適合している、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。
14. 懸濁条件下で前記細胞を培養することが、前記細胞の接着依存性を変化させない、請求項２～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記方法が、前記細胞を遺伝子的に変化させない、請求項２～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. Ｎ－３容器内の前記第１の培地で細胞を培養することを更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. Ｎ－４容器内の前記第１の培地で細胞を培養することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
18. Ｎ－５容器内の前記第１の培地で細胞を培養することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記バイオリアクターが、接着バイオリアクターである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記バイオリアクターが、撹拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動層型バイオリアクター、充填層型バイオリアクター、光バイオリアクターバイオリアクター、及び固定層型バイオリアクターからなる群から選択される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記バイオリアクターが、固定層型バイオリアクターである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記バイオリアクター内の前記第３の培地が、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 細胞接着を促進する前記少なくとも１つの因子が、血清、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外マトリックスのプロテオグリカン又は非プロテオグリカン多糖類、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記バイオリアクター内の前記第３の培地が、ＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記細胞が、約２４～１２０時間、懸濁条件下で培養される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記細胞が、約４８～７２時間、懸濁条件下で培養される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記Ｎ－１容器が、振盪フラスコ又はウェーブバッグである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記細胞を、前記バイオリアクター内の第１のポリヌクレオチド配列と接触させることを更に含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記ポリヌクレオチド配列が、プラスミドである、請求項２８に記載の方法。
30. 前記プラスミドが、ＡＡＶ、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される組換えウイルス粒子のカプシドタンパク質をコードする、請求項２９に記載の方法。
31. 前記ウイルス粒子が、ＡＡＶである、請求項３０に記載の方法。
32. 前記細胞を、導入遺伝子をコードする第２のポリヌクレオチドと接触させることを更に含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記細胞を、ヘルパー遺伝子をコードする第３のポリヌクレオチドと接触させることを更に含む、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記バイオリアクター内で前記細胞を培養することを更に含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 培養が、バッチ培養を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 培養が、流加培養を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 培養が、灌流培養を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記細胞が、前記組換えウイルス粒子を産生する条件下で培養される、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 細胞増殖の方法であって、
    （ａ）Ｎ－３容器内の第１の培地で細胞を培養することと、
    （ｂ）前記第１の培地から前記細胞を除去することと、
    （ｃ）工程（ｂ）からの前記細胞を、Ｎ－２容器内の、血清を含まないか又は前記第１の培地よりも低い濃度の血清を含む第２の培地に接種することと、
    （ｄ）前記Ｎ－２容器内の前記細胞を前記第２の培地中で培養することと、
    （ｅ）工程（ｄ）からの前記細胞をＮ－１容器内の前記第２の培地に接種することと、
    （ｆ）懸濁条件下で、前記Ｎ－１容器内で前記細胞を培養することと、
    （ｇ）バイオリアクター内の第３の培地に工程（ｆ）からの前記細胞を接種することと、を含む、方法。
40. 前記細胞が、接着細胞である、請求項３９に記載の方法。
41. 前記Ｎ－１、前記Ｎ－２、及び前記Ｎ－３容器が、同じである、請求項３９又は４０に記載の方法。
42. 前記Ｎ－１、前記Ｎ－２、及び前記Ｎ－３容器が、異なる、請求項３９又は４０に記載の方法。
43. 前記細胞が、工程（ｇ）の前に、前記第２の培地中で少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、又は少なくとも６回継代される、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記接着細胞が、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＣＯＳ細胞、及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記接着細胞が、ヒト細胞、動物細胞、昆虫細胞、又は幼虫である、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記接着細胞が、ＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ－２９３細胞である、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記接着細胞が、ＨＥＫ－２９３細胞である、請求項４６に記載の方法。
48. 前記接着細胞が、懸濁に適合していない、請求項４０～４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記接着細胞が、懸濁に適合している、請求項４０～４７のいずれか一項に記載の方法。
50. 懸濁条件下で前記細胞を培養することが、前記細胞の接着依存性を変化させない、請求項４０～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記方法が、前記細胞を遺伝子的に変化させない、請求項４０～５０のいずれか一項に記載の方法。
52. Ｎ－４容器内の前記第１の培地で細胞を培養することを更に含む、請求項３９～５１のいずれか一項に記載の方法。
53. Ｎ－５容器内の前記第１の培地で細胞を培養することを更に含む、請求項５２に記載の方法。
54. 前記バイオリアクターが、接着バイオリアクターである、請求項３９～５３のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記バイオリアクターが、撹拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動層型バイオリアクター、充填層型バイオリアクター、光バイオリアクターバイオリアクター、及び固定層型バイオリアクターからなる群から選択される、請求項３９～５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記バイオリアクターが、固定層型バイオリアクターである、請求項５５に記載の方法。
57. 前記バイオリアクター内の前記第３の培地が、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子を含む、請求項３９～５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 細胞接着を促進する前記少なくとも１つの因子が、血清、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外マトリックスのプロテオグリカン又は非プロテオグリカン多糖類、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
59. 前記バイオリアクター内の前記第３の培地が、ＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを含む、請求項５８に記載の方法。
60. 前記細胞が、約２４～１２０時間、懸濁条件下で培養される、請求項３９～５９のいずれか一項に記載の方法。
61. 前記細胞が、約４８～７２時間、懸濁条件下で培養される、請求項３９～６０のいずれか一項に記載の方法。
62. 前記Ｎ－２容器及び前記Ｎ－１容器が、振盪フラスコ又はウェーブバッグである、請求項３９～６１のいずれか一項に記載の方法。
63. 前記細胞を、前記バイオリアクター内の第１のポリヌクレオチド配列と接触させることを更に含む、請求項３９～６２のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記ポリヌクレオチド配列が、プラスミドである、請求項６３に記載の方法。
65. 前記プラスミドが、ＡＡＶ、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される組換えウイルス粒子のカプシドタンパク質をコードする、請求項６４に記載の方法。
66. 前記ウイルス粒子が、ＡＡＶである、請求項６５に記載の方法。
67. 前記細胞を、導入遺伝子をコードする第２のポリヌクレオチドと接触させることを更に含む、請求項６３～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記第１のポリヌクレオチドが、末端逆位配列、少なくとも１つのＡＡＶ複製タンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸、又は少なくとも１つのＡＡＶ構造カプシドタンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上を含む、請求項６３～６７のいずれか一項に記載の方法。
69. 前記バイオリアクター内で前記細胞を培養することを更に含む、請求項３９～６８のいずれか一項に記載の方法。
70. 培養が、バッチ培養を含む、請求項３９～６９のいずれか一項に記載の方法。
71. 培養が、流加培養を含む、請求項３９～６９のいずれか一項に記載の方法。
72. 培養が、灌流培養を含む、請求項３９～６９のいずれか一項に記載の方法。
73. 前記細胞が、組換えウイルス粒子を産生する条件下で培養される、請求項６３～７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 接着細胞のシードトレイン増殖の方法であって、
    （ａ）血清を含む第１の培地中で、接着条件下で前記接着細胞を培養することと、
    （ｂ）前記第１の培地から前記接着細胞を除去することと、
    （ｃ）前記接着細胞を、血清を含まないか又は前記第１の培地よりも低い濃度の血清を含む第２の培地中に懸濁することと、
    （ｄ）懸濁条件下で、工程（ｃ）からの前記接着細胞を培養することと、
    （ｅ）バイオリアクター内の第３の培地に工程（ｄ）からの前記接着細胞を接種することと、を含む、方法。
75. 接着条件下で少なくとも１回、工程（ａ）の前記接着細胞を継代することを更に含む、請求項７４に記載の方法。
76. 懸濁条件下で少なくとも１回、工程（ｄ）の前記接着細胞を継代することを更に含む、請求項７４又は７５に記載の方法。
77. 懸濁条件下で少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、又は少なくとも５回、工程（ｄ）の前記接着細胞を継代することを更に含む、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の方法。
78. 前記バイオリアクターが、接着バイオリアクターである、請求項７４～７７のいずれか一項に記載の方法。
79. 前記バイオリアクターが、撹拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動層型バイオリアクター、充填層型バイオリアクター、光バイオリアクターバイオリアクター、及び固定層型バイオリアクターからなる群から選択される、請求項７４～７８のいずれか一項に記載の方法。
80. 前記バイオリアクターが、固定層型バイオリアクターである、請求項７９に記載の方法。
81. 前記接着細胞が、懸濁に適合していない、請求項７４～８０のいずれか一項に記載の方法。
82. 前記接着細胞が、懸濁に適合している、請求項７４～８０のいずれか一項に記載の方法。
83. 懸濁条件下で前記細胞を培養することが、前記細胞の接着依存性を変化させない、請求項７４～８２のいずれか一項に記載の方法。
84. 前記方法が、前記細胞を遺伝子的に変化させない、請求項７４～８３のいずれか一項に記載の方法。
85. 前記バイオリアクター内の前記第３の培地が、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子を含む、請求項７４～８４のいずれか一項に記載の方法。
86. 細胞接着を促進する前記少なくとも１つの因子が、血清、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外マトリックスのプロテオグリカン又は非プロテオグリカン多糖類、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
87. 前記バイオリアクター内の前記第３の培地が、ＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを含む、請求項８６に記載の方法。
88. 前記細胞が、懸濁条件下で２回以下継代される、請求項７４～８７のいずれか一項に記載の方法。
89. 前記細胞が、懸濁条件下で３回以下、４回以下、又は５回以下継代される、請求項７４～８８のいずれか一項に記載の方法。
90. 前記細胞が、約２４～１２０時間、懸濁条件下で培養される、請求項７４～８９のいずれか一項に記載の方法。
91. 前記接着細胞が、４８～７２時間、懸濁条件下で成長する、請求項７４～９０のいずれか一項に記載の方法。
92. 前記接着細胞が、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、及びＣＯＳ細胞、又はそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項７４～９１のいずれか一項に記載の方法。
93. 前記接着細胞が、ヒト細胞、動物細胞、昆虫細胞、又は幼虫である、請求項７４～９２のいずれか一項に記載の方法。
94. 前記接着細胞が、ＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ－２９３細胞である、請求項７４～９３のいずれか一項に記載の方法。
95. 前記接着細胞が、ＨＥＫ－２９３細胞である、請求項９４に記載の方法。
96. 前記接着細胞を、第１のポリヌクレオチド配列と接触させることを更に含む、請求項７４～９０のいずれか一項に記載の方法。
97. 前記ポリヌクレオチド配列が、プラスミドである、請求項９６に記載の方法。
98. 前記プラスミドが、ＡＡＶ、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される組換えウイルス粒子のカプシドタンパク質をコードする、請求項９７に記載の方法。
99. 前記ウイルス粒子が、ＡＡＶである、請求項９８に記載の方法。
100. 前記細胞を、導入遺伝子をコードする第２のポリヌクレオチドと接触させることを更に含む、請求項９６～９９のいずれか一項に記載の方法。
101. 前記第１のポリヌクレオチドが、末端逆位配列、少なくとも１つのＡＡＶ複製タンパク質をコードする核酸、少なくとも１つのＡＡＶパッケージングタンパク質をコードする核酸、又は少なくとも１つのＡＡＶ構造カプシドタンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上を含む、請求項９６～１００のいずれか一項に記載の方法。
102. 前記バイオリアクター内で前記細胞を培養することを更に含む、請求項７４～１０１のいずれか一項に記載の方法。
103. 培養が、バッチ培養を含む、請求項７４～１０２のいずれか一項に記載の方法。
104. 培養が、流加培養を含む、請求項７４～１０２のいずれか一項に記載の方法。
105. 培養が、灌流培養を含む、請求項７４～１０２のいずれか一項に記載の方法。
106. 前記細胞が、組換えウイルス粒子を産生する条件下で培養される、請求項９６～１０５のいずれか一項に記載の方法。
107. ウイルスベクターを産生する方法であって、
     （ａ）第１の培地中で、接着条件下で細胞を培養することと、
     （ｂ）前記第１の培地から前記細胞を除去することと、
     （ｃ）前記細胞を、血清を含まないか又は前記第１の培地よりも低い濃度の血清を含む第２の培地中に懸濁することと、
     （ｄ）懸濁条件下で、工程ｃからの前記細胞を培養することと、
     （ｅ）バイオリアクター内の第３の培地に工程（ｄ）からの前記細胞を接種することと、
     （ｆ）ウイルス粒子をコードするポリヌクレオチド配列で前記細胞をトランスフェクトすることと、
     （ｇ）前記ウイルス粒子が産生される条件下で、前記バイオリアクター内で前記細胞を培養することと、を含む、方法。
108. 工程（ｇ）で産生された前記ウイルス粒子を単離することを更に含む、請求項１０７に記載の方法。
109. 前記ポリヌクレオチドが、プラスミドである、請求項１０７又は１０８に記載の方法。
110. 前記ウイルス粒子が、ＡＡＶ、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される、請求項１０７～１０９のいずれか一項に記載の方法。
111. 前記ウイルス粒子が、ＡＡＶベクターである、請求項１１０に記載の方法。
112. 前記バイオリアクターが、接着バイオリアクターである、請求項１０７～１１１のいずれか一項に記載の方法。
113. 前記バイオリアクターが、撹拌タンクバイオリアクター、バブルカラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動層型バイオリアクター、充填層型バイオリアクター、光バイオリアクターバイオリアクター、及び固定層型バイオリアクターからなる群から選択される、請求項１０７～１１２のいずれか一項に記載の方法。
114. 前記バイオリアクターが、固定層型バイオリアクターである、請求項１１３に記載の方法。
115. 前記バイオリアクター内の前記第３の培地が、細胞接着を促進する少なくとも１つの因子を含む、請求項１０７～１１４のいずれか一項に記載の方法。
116. 細胞接着を促進する前記少なくとも１つの因子が、血清、ＦＢＳ、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、カルシウムイオン、細胞外マトリックスのプロテオグリカン又は非プロテオグリカン多糖類、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
117. 前記バイオリアクター内の前記第３の培地が、ＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを含む、請求項１１６に記載の方法。
118. 前記細胞が、接着細胞である、請求項１０７～１１７ｅのいずれか一項に記載の方法。
119. 前記接着細胞が、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＣＯＳ細胞、及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１１８に記載の方法。
120. 前記接着細胞が、ヒト細胞、動物細胞、昆虫細胞、又は幼虫である、請求項９２又は９３に記載の方法。
121. 前記接着細胞が、ＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ－２９３細胞である、請求項１１８～１２０のいずれか一項に記載の方法。
122. 前記接着細胞が、ＨＥＫ－２９３細胞である、請求項１２１に記載の方法。
123. 前記接着細胞が、懸濁に適合していない、請求項１１８～１２２のいずれか一項に記載の方法。
124. 前記接着細胞が、懸濁に適合している、請求項１１８～１２２のいずれか一項に記載の方法。
125. 懸濁条件下で前記細胞を培養することが、前記細胞の接着依存性を変化させない、請求項１０７～１２４のいずれか一項に記載の方法。
126. 前記方法が、前記細胞を遺伝子的に変化させない、請求項１０７～１２５のいずれか一項に記載の方法。
127. 接着条件下で少なくとも１回、工程（ａ）の前記細胞を継代することを更に含む、請求項１０７～１２６のいずれか一項に記載の方法。
128. 懸濁条件下で少なくとも１回、工程（ｄ）の前記細胞を継代することを更に含む、請求項１０７～１２７のいずれか一項に記載の方法。
129. 前記細胞が、懸濁条件下で２回以下継代される、請求項１０７～１２８のいずれか一項に記載の方法。
130. 前記細胞が、懸濁条件下で２回以下、３回以下、４回以下、又は５回以下継代される、請求項１０７～１２９のいずれか一項に記載の方法。
131. 前記細胞が、約２４～１２０時間、懸濁条件下で成長する、請求項１０７～１３０のいずれか一項に記載の方法。
132. 前記細胞が、約４８～７２時間、懸濁条件下で成長する、請求項１０７～１３１のいずれか一項に記載の方法。
133. 前記バイオリアクター内で前記細胞を培養することが、バッチ培養を含む、請求項１０７～１３２のいずれか一項に記載の方法。
134. 前記バイオリアクター内で前記細胞を培養することが、流加培養を含む、請求項１０７～１３２のいずれか一項に記載の方法。
135. 前記バイオリアクター内で前記細胞を培養することが、灌流培養を含む、請求項１０７～１３２のいずれか一項に記載の方法。
136. 前記第２の培地が、無血清培地である、請求項１、３９、７４、及び１０７のいずれか一項に記載の方法。
137. 前記第２の培地が、Ｎ－１容器内の前記第１の培地中の血清濃度よりも低い濃度の前記血清を含む、請求項１、３９、７４、及び１０７のいずれか一項に記載の方法。
138. 前記第３の培地が、前記第２の培地中の前記血清濃度よりも高い血清濃度を含む、請求項１、３９、７４、及び１０７のいずれか一項に記載の方法。
139. 請求項１～１３８のいずれか一項に記載の方法によって産生される、組換えウイルス。
140. 前記組換えウイルスは、ＡＡＶ、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、又はワクシニアウイルスのものである。