CN115916987A - 填充床生物反应器中的慢病毒载体制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过多质粒瞬时DNA转染，在填充床生物反应器中制造LVV载体的方法的开发。更具体地，本发明公开并要求保护如下的方法，其中将以灌注模式或分批模式实施的步骤组合以获得有效的方法。此外，本发明确定了成功地用于填充床生物反应器中的瞬时转染步骤中，以用于制造慢病毒载体的总DNA的有效范围。

Description

填充床生物反应器中的慢病毒载体制造方法
发明领域
本发明涉及通过在填充床生物反应器系统中进行包装细胞的多质粒DNA瞬时转染，大规模制造慢病毒载体的领域。
发明背景
慢病毒载体或慢病毒(LVV)是在基因疗法应用中广泛应用的基因递送载体。已知LVV提供许多优势，包括下列的能力i) 转导分裂和非分裂的细胞，ii) 永久地整合到宿主细胞基因组中，由此在宿主细胞和任何后代中提供稳定的基因表达(Naldini等人，2006)。此外，由于其低免疫原性和毒性，以及与致癌-逆转录病毒载体相比的低的插入诱变和肿瘤发生的比率，LVV被认为更安全。可以用衍生自其它病毒的包膜蛋白使LVV假型化，从而赋予广泛的向性或对于特定靶细胞的特异性(Chronin等人，2005)。出于所有这些原因，LVV大量用于不同的基因疗法应用，诸如，例如几种遗传疾病的治疗，包括异染性脑白质营养不良(Biffi等2013)，Wiskott-Adrich综合征(Aiuti等人，2013)，地中海贫血(Cavazzana-Calvo等人，2010)或X-连锁的肾上腺脑白质营养不良(Cartier等人，2009)。所有这些临床应用都具有如下的最终目标，即通过将目的基因递送至待输注到患者的CD34+造血干细胞中。LVV用作基因递送载体的临床应用的进一步实例是使用基因工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体的T细胞的过继细胞疗法。嵌合抗原受体(CAR)是重组受体，其识别在靶细胞上表达的特定蛋白或抗原。一旦在T淋巴细胞(随后称之为CAR-T细胞)或免疫系统的其它细胞中表达，CAR能够使特定免疫反应重新定向为针对表达其所结合的抗原的所有细胞。CAR的最广泛探索的临床应用是癌症免疫疗法，其包括输注携带靶向肿瘤抗原的CAR的免疫系统细胞，诸如T细胞和NK细胞。此类细胞能够针对表达CAR所靶向的抗原的细胞产生强烈的抗肿瘤反应(Sadelain等人，Cancer Discovery. 2013. 3(4):388-98)。
现在几种CAR-T细胞候选物正在临床开发中，并且不同的成功案例正在出现。美国食品药品管理局(FDA)近期批准了首个CAR-T疗法替沙仑赛(tisagenlecleucel) (Kymriah®)，其指示用于治疗年龄高至25岁的患者，所述患者患有难治的或在第二次或之后的复发中的B细胞前体急性淋巴细胞白血病(ALL)。
对LVV应用的日益增长的关注，产生了对大体积载体的强烈需求，以用于临床前、毒理学和临床研究，以及最终用于制造批准上市的药物产品。
最广泛使用的用于制造LVV的方法需要使用T-烧瓶或多塔盘系统(诸如细胞工厂)，对单层培养中的包装细胞(诸如293细胞系及其衍生物293 T、293 E或293Vec)的多质粒瞬时转染。已经公开了不同方法，其使用包括磷酸钙在内的不同转染试剂(Segura等人，2007)。
本发明关注开发用于大规模制造LVV的方法，所述方法包括在填充床生物反应器中进行的细胞的瞬时多质粒转染。本发明人发现了实施制造过程的条件，其特征在于LVV的高生产率和质量，以及在小和大规模的再现性，并且考虑到该过程的总持续时间和最关键材料的消耗，有效的成本降低。
现有技术公开了LVV制造方法，其基于在填充床生物反应器中进行的包装细胞的瞬时转染，但没有指出根据本发明的必要技术特征或方法的性能。
例如，在Valkama等人， Optimization of lentiviral vector purification for  scale-up in fix bed bioreactor Gene Therapy (2018) 25, 39-46中；该作者公开了用于制造LVV的方法，其通过在填充床生物反应器系统iCellis Nano中293T细胞的瞬时转染进行。该作者报道了在具有4 m2表面积的高压缩iCellis Nano中6次运行和在具有2.67 m2表面积的低压缩iCellis Nano中4次运行的性能。报道了用于转染的DNA量是该方法的产率的关键参数之一。该作者推荐使用总量在300至400 ng/cm2的范围内的DNA，以PEI为转染试剂，并且DNA:PEI的比率等于1:1。清楚地指出，使用100ng/cm2的DNA将转染效率降低至只有5%。除4或6小时的转染外，通过将新鲜培养基灌注到生物反应器中而进行整个运行，即在细胞培养期间，在转染之后，和收获时。在转染后24小时开始收获灌注中的重组LVV颗粒，并且在后续的48小时持续进行(即：转染和收获步骤需要总共4天)。据报道，在从转染起24至72小时之间的收获窗口的定义来自从转染起6小时LVV生产率低的观察结果。以固定的恒定速率或以可变速率进行灌注，在某些运行中，通过转染后灌注1或2天进行培养基的完全更换。
WO 2018/007873公开了与Valkama等人，2018中所述实质上相似的方法，包括在转染中300 ng/cm2至400 ng/cm2的优化的DNA量，以及通过使用100 ng/cm2的DNA将转染效率降低至只有5%的观察结果。WO 2018/007873也公开了为了实现转染混合物(即：通过组合DNA和PEI获得的混合物)中的最佳DNA浓度，需要大体积的转染混合物，其将需要生物反应器中的培养基的完全更换。该发明人声称在大规模下，培养基的完全更换(即：排出存在于生物反应器中几乎全部量的细胞培养基)不是实际的方法步骤，因为它耗时，并且由于在排出期间搅拌关闭，以及处于上部载架的细胞没有培养基的事实，可能影响细胞生存力。为了克服这样的限制，通过再循环将转染混合物添加至生物反应器。
在Mc Carron等人， Transient Lentiviral Vector Production Using a Packed  Bed Bioreactor System (2019) Human Gene Therapy 30 (3) 93-101中，该作者公开了在具有18m2表面积和3L工作容量(即：仍要操作有限量的培养基以排空和填充生物反应器的，其不需要长的时间)的一次性填充床生物反应器Bio-BLU (Eppendorf)中制造LVV的方法。LVV制造通过使用4,79mg的总DNA和PEI转染试剂(DNA:PEI比率为1:3)，对293T细胞的瞬时转染进行。生产的整个运行以分批模式进行(包括细胞培养、细胞转染和收获)。在转染后，从系统中除去细胞培养基，并将3L新鲜培养基添加至生物反应器。通过在转染后48和72小时收集培养基，进行含有重组LVV颗粒的细胞培养基的收获(即：转染和收获步骤需要总共4天)。在转染后24、48和72小时进行的取样显示，在该方法中，在转染后72小时获得最高生产率。该作者建议也在转染后的72小时之后评估生产率。
在Leinonen等人， Preclinical Proof of Concept, Analytical Development  and Commercial Scale production of lentiviral vector in adherent cells (2019)Molecular Therapy 15, 63-71中，该作者公开了通过在具有2.67 m2的表面积的iCellisNano生物反应器中，或以更大规模，使用具有100m2或333m2表面的iCellis500生物反应器，瞬时转染293T细胞，而制造LVV的方法。使用300ng/cm2或200ng/m2的DNA量和PEI转染试剂进行转染。将转染混合物添加至生物反应器并且在不存在灌注的情况下孵育6小时。为了在除转染外的所有工艺阶段向细胞提供新鲜培养基，所有运行使用灌注或再循环模式进行。在细胞培养期间，转染6小时后和收集LVV期间应用灌注(或再循环)。在转染后24小时开始收集LVV，直至转染后72小时。在开始收集LVV前，即转染后24小时，通过使用在转染后灌注相同的培养基的灌注进行培养基的完全更换，直至培养基完全更换。报道该步骤降低生产率，但连同在生产阶段期间已经添加至生物反应器中的核酸内切酶，其导致在含有LVV的最终批量产物中的DNA污染物方面，对最终产物的纯度具有积极影响。当大规模应用时，在具有333m2表面积的填充床生物反应器中，该方法产生甚至高于预期的良好物理滴度，但是感染性病毒的滴度低于预期。具体而言，应用于具有333 m2表面积的生物反应器中的方法所获得的总病毒转染单位(TU)看起来与在具有100 m2 (3.3倍更小的床尺寸)表面积的生物反应器中使用基于转染的方法所获得的总病毒转染单位(TU)相似，具有更高的总DNA量并且没有转染后的培养基更换。此外，该作者报道了在运行结束进行单次核酸内切酶处理不足以提供DNA清除。由于该原因，该作者在该方法中引入了在生物反应器中生产阶段期间的第一核酸内切酶处理和在收获后的第二处理，以减少DNA污染物。
需要开发可再现的制造方法，其允许获得高数量和高质量的LVV，以满足用于生产基因修饰的细胞疗法产品的这类基因递送载体的日益增长的需求。本发明解决了这种需求。
发明内容
本发明涉及开发通过多质粒DNA瞬时转染，在填充床生物反应器中制造LVV载体的方法。具体而言，本发明人关注用于实施所述方法的那些参数和技术条件，其导致在最终产品的量和功能性方面，产生改进的生产率(物理滴度、感染性病毒滴度和感染性)、最终产品质量(低的DNA和宿主细胞蛋白污染物)和关键试剂的较低的消耗(诸如在转染中使用的DNA)。此外，本发明人发现通过应用所要求保护的方法，可以使进行转染和LVV收集所需的周期缩短至共计三天，在现有技术中公开的方法中披露的所述周期为4天。具体而言，虽然现有技术公开了完全以分批模式或灌注模式操作的方法，但本发明公开并要求保护如下的方法，其中应用和组合两种技术模式以获得有效的方法。
根据本发明，提供了通过多质粒DNA瞬时转染，在填充床生物反应器中制造慢病毒载体的方法，其包括以下步骤：
(i) 接种细胞，
(ii) 培养所述细胞以扩增至少一天，
(iii) 通过向所述生物反应器中添加转染混合物转染所述细胞，所述转染混合物含有通过混合多质粒DNA和PEI获得的DNA转染颗粒，并且在不存在新鲜培养基的灌注或再循环的情况下，将所述细胞与所述DNA转染颗粒一起孵育，
(iv) 通过从所述生物反应器排出含有DNA转染颗粒的细胞培养基并且向细胞培养物添加新鲜培养基，以分批模式更换所述培养基，
(v) 在iv点下添加新鲜培养基后，立刻通过以灌注模式从所述生物反应器收获细胞培养基，开始重组慢病毒载体的收集。
此外，根据本发明的进一步方面，本发明人确定了在填充床生物反应器中进行的LVV制造方法中，将用于多质粒瞬时转染的总DNA的理想范围。与现有技术中公开的在转染中使用更大量的总DNA的方法中的观察结果相比，使用此类范围的DNA允许获得具有良好质量的LVV和相当的或甚至更高的生产率，以及随后成本的显著降低。
因此，根据本发明，提供了用于在填充床生物反应器中制造慢病毒载体的方法，其包括使用多质粒DNA和PEI转染试剂对细胞进行瞬时转染，所述多质粒DNA的总量在45 ng/cm2至185 ng/cm2填充床表面积。
实施方案
根据本发明，在第一方面提供了通过多质粒DNA瞬时转染，在填充床生物反应器中制造慢病毒载体的方法，其包括以下步骤：
(i) 接种细胞，
(ii) 培养所述细胞以扩增至少一天，
(iii) 通过向所述生物反应器中添加转染混合物转染所述细胞，所述转染混合物含有通过混合多质粒DNA和PEI获得的DNA转染颗粒，并且在不存在新鲜培养基的灌注或再循环的情况下，将所述细胞与所述DNA转染颗粒一起孵育，
(iv) 通过从所述生物反应器排出含有DNA转染颗粒的细胞培养基并且向细胞培养物添加新鲜培养基，以分批模式更换所述培养基，
(v) 在iv点下添加新鲜培养基后，立刻通过以灌注模式从所述生物反应器收获细胞培养基，开始重组慢病毒载体的收集。
在一个实施方案中，转染(iii)，转染后培养基更换(iv)和以灌注收获(v)的步骤在三天内进行。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在步骤ii和步骤iii之间的培养基的完全更换。
在进一步的实施方案中，在步骤ii，以灌注模式培养细胞用于扩增。优选地，通过以至少0.1 ml/cm2填充床表面积的总量，向所述生物反应器中提供新鲜培养基直到扩增阶段结束，进行灌注模式的培养。
在优选的实施方案中，在步骤ii，以再循环模式培养细胞用于扩增。更优选地，使用总量为至少0.1 ml/cm2填充床表面积的新鲜培养基作为储库，进行再循环模式的培养。
在本发明方法的优选设置中，在步骤iii，将细胞与所述DNA转染颗粒一起孵育长达18小时的时段，更优选地6至18小时之间的时段，在更优选的实施方案中，8小时的时段。
优选地，在一个实施方案中，在步骤iii，使用总量在45 ng/cm2至185 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA转染细胞。
在另一个实施方案中，在步骤iii，使用总量在45 ng/cm2至150 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA转染细胞。
在进一步的实施方案中，在步骤iii，使用总量在45 ng/cm2至100 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA转染细胞。
在更优选的实施方案中，在步骤iii，使用对应于1:1的DNA量与PEI量的比率制备转染混合物。
在本发明的优选设置中，在步骤v，通过应用持续至少39小时的灌注进行重组慢病毒载体的收集。
在本发明的另一设置中，在步骤v，通过应用持续48小时的灌注进行重组慢病毒载体的收集。
在一个实施方案中，通过应用使用在步骤v所用的相同培养基的灌注，进行步骤v的重组慢病毒载体的收集。
在另一个实施方案中，通过应用使用细胞培养基的灌注，进行步骤v的重组慢病毒载体的收集，所述细胞培养基包含在2.5%至10% FBS的量的胎牛血清(FBS)。
在进一步实施方案中，通过应用使用无FBS的细胞培养基的灌注，进行步骤v的重组慢病毒载体的收集。
在本发明的另一方面，提供了用于在填充床生物反应器中制造慢病毒载体的方法，其包括使用总量在45 ng/cm2至185 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA，和PEI转染试剂，对细胞进行瞬时转染。
优选地，本发明提供了通过多质粒DNA瞬时转染，在填充床生物反应器中制造慢病毒载体的方法，其包括以下步骤：
a) 接种细胞，
b) 培养所述细胞以扩增至少一天，
c) 使用总量在45 ng/cm2至185 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA，和PEI转染试剂，转染所述细胞，
d) 收获含有重组慢病毒载体的细胞培养上清液。
在另一个实施方案中，使用总量在45 ng/cm2至150 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA进行转染。
在进一步的实施方案中，使用总量在45 ng/cm2至100 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA进行转染。
在更优选的实施方案中，使用对应于1:1的DNA量与PEI量的比率进行转染。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括在步骤b的扩增培养和步骤c的转染之间的培养基的完全更换。
在进一步的实施方案中，在上述步骤b，以灌注模式培养细胞用于扩增。优选地，通过以至少0.1 ml/cm2填充床表面积的总量，向所述生物反应器中提供新鲜培养基直到扩增阶段结束，进行灌注模式的培养。
在优选的实施方案中，在上述步骤b，以再循环模式培养细胞用于扩增。更优选地，使用总量为至少0.1 ml/cm2填充床表面积的新鲜培养基作为储库，进行再循环模式的培养。
在本发明方法的优选设置中，在上述步骤c，将细胞转染长达18小时的时段，更优选地6至18小时之间的时段。在最优选的设置中，细胞转染持续8小时。
在一个的实施方案中，所述方法进一步包括在步骤c的转染和在上述步骤d的收获之间的培养基更换，此类培养基更换可以以灌注或分批模式进行，更优选地以分批模式进行。
在另一个的实施方案中，上述步骤d的收获以分批模式或灌注模式进行。
在本发明的一种设置中，提供了一种方法，其中通过在从转染后更换培养基起24和48小时，从所述生物反应器收集细胞培养基，以分批模式进行上述步骤d的收获。
在本发明的另一设置中，提供了一种方法，其中以灌注模式进行上述步骤d的收获，其在转染后更换培养基之后实施至少39小时。
在另一设置中，提供了一种方法，其中以灌注模式进行上述步骤d的收获，其在转染后更换培养基之后实施至少48小时。
在本发明的更优选设置中，提供了一种方法，其中以灌注模式进行在步骤d的收获，并且从转染(步骤c)至收获(步骤d)的步骤在三天内进行。
发明详述
现将通过非限制性的示例性实施方案的方式描述本发明的各种优选特点和实施方案。
本发明提供了通过多质粒DNA瞬时转染，在填充床生物反应器中制造慢病毒载体(LVV)的方法。本发明的方法特别关注于大量、良好质量、大规模和使用自动化装置的LVV生产。本发明人发现了最佳条件，从而以高再现性实现具有高物理病毒滴度和感染性病毒滴度和最佳杂质概况的LVV批量生产。
根据本发明，提供了通过多质粒DNA瞬时转染，在填充床生物反应器中制造慢病毒载体的方法，其包括以下步骤：
(i) 接种细胞，
(ii) 培养所述细胞以扩增至少一天，
(iii) 通过向所述生物反应器中添加转染混合物转染所述细胞，所述转染混合物含有通过混合多质粒DNA和PEI获得的DNA转染颗粒，并且在不存在新鲜培养基的灌注或再循环的情况下，将所述细胞与所述DNA转染颗粒一起孵育，
(iv) 通过从所述生物反应器排出含有DNA转染颗粒的细胞培养基并且向细胞培养物添加新鲜培养基，以分批模式更换所述培养基，
(vi) 在iv点下添加新鲜培养基后，立刻通过以灌注模式从所述生物反应器收获细胞培养基，开始重组慢病毒载体的收集。
慢病毒载体(LVV)
本发明涉及慢病毒载体的制造。LVV是源自慢病毒的基因递送载体。慢病毒的详细列表可见于Coffin等人(“Retroviruses”1997 Cold Spring Harbour Laboratory PressEds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763)中。简而言之，慢病毒可被分为灵长类和非灵长类组。灵长类慢病毒的实例包括但不限于：人类免疫缺陷病毒(HIV)，人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体，和猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒组包括原型“慢病毒”维斯纳/梅迪病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)，马传染性贫血病毒(EIAV)和更近期描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
在优选的实施方案中，所述慢病毒载体源自HIV慢病毒，更优选地，所述慢病毒载体源自HIV-1慢病毒。
将在本发明的方法中使用的示例性慢病毒载体至少包括慢病毒基因组的以下部分：a) 5' 长末端重复(LTR)；b) 包装序列 psi；c) Rev响应元件(RRE)；d) 与目的基因可操作连接的启动子；e) 3' 长末端重复(LTR)。在优选的实施方案中，5' LTR的U3区域被替换为选自以下的异源启动子：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40 (SV40)；因此使慢病毒转录独立于 tat。在进一步优选的实施方案中，3'LTR序列含有U3区域的缺失(即，所述载体是自失活载体或SIN载体)。所述慢病毒载体可进一步包含慢病毒中央多聚嘌呤区(lentiviral central polypurine tract, cPPT)和土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)。
填充床生物反应器
根据本发明的方法利用了填充床生物反应器用于生产LVV。填充床生物反应器是由容器组成的装置，所述容器包含或装有或填充用作细胞固定化支持物的载架材料(carrier material)。载架由有机或无机材料构成，细胞被包封在载架上，因此允许细胞粘附生长至非常高的密度。以适当量的O2和所需的pH条件调理的细胞培养基循环通过固定床，以提供养分和O2并以允许细胞生长。不同的填充床生物反应器实质上能够以两种可能的设置工作：1) 所述培养基从调理容器循环至所述固定床，并回到调理容器(例如：CellCube system Corning)；或2) 所述固定床整合至生物反应器中，并且以在这个生物反应器内调理的培养基通过这个床循环(例如：iCellis Pall Corporation)。在优选的实施方案中，根据本发明的方法可以在iCELLis®一次性固定床生物反应器系统中进行，如实施例中所示。iCELLis生物反应器系统是用于在受控环境中粘附细胞生长的、自动的一次性固定床生物反应器。所述生物反应器以两种格式获得，即iCELLis Nano和iCellis 500，iCELLis Nano用于开发研究，具有用于细胞生长的不同的可能表面积(从0.53 m2至4m2的培养面积的单元)；iCellis 500用于大规模生产，具有从66至500 m2的培养面积单元。细胞在固定床内含有的聚酯宏载架中生长，而细胞培养基从下至上流经所述固定床。在顶部，培养基像薄膜一样从外壁流下，在此处吸收O2返回储库。如本文所使用的术语“培养面积”或“表面积”是指在其上附着和培养细胞的生物反应器的填充床的总表面。
多质粒瞬时转染
根据本发明，通过细胞的多质粒DNA瞬时转染在填充床生物反应器中生产LVV，即在本发明的方法中携带两种不同基因的至少两种表达质粒瞬时共转染至细胞系(所谓的包装细胞系)中。根据本发明的优选方面，至少使用如下共转染细胞：携带慢病毒Gag/Pol基因的包装质粒，携带编码目的包膜蛋白的基因的质粒，和携带如上文公开的必需慢病毒基因组元件和目的基因的转化质粒。在另一优选的实施方案中，可进一步在第四个分离质粒上反式表达慢病毒调节蛋白Rev。在本发明的进一步方面中，可进一步在第五个分离质粒上表达慢病毒蛋白tat。合适的 env基因的实例包括，但不限于，VSV-G env、MLV 4070 env、RD114env、RD114-TR、RD114pro、杆状病毒5 GP64 env、GALV或源自麻疹病毒的包膜蛋白。
在优选的实施方案中，在本发明的方法中，使用由四个质粒构成的第三代LVV病毒载体系统进行多质粒DNA转染，即：一个携带慢病毒gag/pol基因的质粒，一个携带慢病毒rev基因的质粒，一个携带编码包膜蛋白的基因的质粒，优选编码VSV-G包膜蛋白的基因，和一个携带转化载体的质粒，所述转化载体包括所需的慢病毒基因组部分和外源目的基因。
在生物反应器中接种细胞
根据本发明的制造方法包含接种细胞，即将所述细胞引入生物反应器中。
可以向生物反应器接种在1000个细胞/cm2至10000个细胞/cm2生物反应器培养面积的量的细胞。在另一个实施方案中，可以培养2000个细胞/cm2至8000个细胞/cm2的量的细胞，优选4000个细胞/cm2至6000个细胞/cm2，在更优选的实施方案中，以5000个细胞/cm2向生物反应器接种。为了获得合适的量，可在解冻后，先在所述生物反应器外的细胞培养中扩增细胞。在一个实施方案中，解冻细胞，通过粘附细胞培养扩增至合适的量，并且之后从支持物脱离，并以合适的量接种在生物反应器中。
现有技术公开了由于在生物反应器中细胞培养期间使用促进细胞粘附的因子，将适应悬浮的细胞系用于填充床生物反应器的可能性(WO 2016/048556)。因此，在另一个实施方案中，根据本发明，解冻适应悬浮的细胞系，并通过进行悬浮细胞培养扩增至合适的量，并且随后接种在存在促进细胞粘附的因子的生物反应器中。
在本发明中可以使用已知充当用于制造病毒载体的包装细胞系的所有细胞系。在一个实施方案中，将在本发明中使用的包装细胞系选自HEK293、HEK293 T、HEK 293E、HEK293FT、293 Vec、TE671、HT1080或HeLa细胞系。在优选的实施方案中，所述包装细胞系是HEK293 T。
细胞扩增
根据本发明的方法，在接种后，在所述生物反应器中培养所述细胞以扩增至少一天。
技术人员在这个步骤可以使用本领域已知的和适合于使用的填充床生物反应器的任何细胞培养操作条件，用于向细胞提供含有营养物的细胞培养基。例如，iCELLis®一次性固定床生物反应器系统允许以三种不同模式操作细胞培养：1)“分批模式”，据该模式，使用恒定体积的细胞培养基在生物反应器中培养细胞，持续所系的时间段，直到培养基消耗(即，细胞生长所需的营养物耗竭并且细胞代谢物累积)，并且在达到培养基消耗后，有必要将耗竭的培养基从生物反应器中完全排出，并填充新鲜培养基，2)“灌注模式”，据该模式，在细胞培养期间，以恒定流速向生物反应器中添加新鲜培养基，并且以相同的流速取出待废弃或收获的耗竭培养基，同时维持所述生物反应器中细胞培养基的总体积恒定，并允许向细胞培养物持续供应营养物和持续除去细胞代谢物；3)“再循环模式”，据该模式，在所述生物反应器中以恒定量的细胞培养基培养所述细胞，所述生物反应器与作为培养基储库的外部容器相连，以恒定的流速从所述外部容器向所述生物反应器中添加额外的培养基(如灌注模式)，并且以相同的流速取出以带回所述储库。再循环模式的培养允许提高用于细胞培养的培养基总体积。上述的每种操作模式或其组合可用于本发明的方法中，以培养细胞用于扩增。
在一个实施方案中，提供了根据本发明的方法，其中通过分批模式操作生物反应器，培养所述细胞至少1天用于扩增。更优选地，当以分批模式进行细胞培养用于扩增时，在扩增阶段结束时且在转导之前，通过从所述生物反应器排出全部体积的耗竭细胞培养基，随后填充新鲜培养基，进行培养基的完全更换。或者，可以通过以固定速率提供对应于生物反应器中存在的细胞培养基的体积两倍的量的新鲜培养基，以灌注模式进行培养后的培养基更换。在另一个实施方案中，当以分批模式进行细胞培养用于扩增时，在扩增阶段结束时且在转导之前，可以通过以固定速率提供总量对应于生物反应器中存在的细胞培养基体积的新鲜培养基，以灌注模式进行培养后的培养基更换。
在另一个实施方案中，提供了根据本发明的方法，其中通过灌注模式操作生物反应器，培养所述细胞至少1天用于扩增。在本发明方法的优选设置中，通过提供总量至少0.1ml/cm2填充床表面积的新鲜培养基直到扩增阶段结束，进行灌注模式的细胞培养。
在优选的实施方案中，提供了根据本发明的方法，其中通过再循环模式操作生物反应器，培养所述细胞至少1天用于扩增。在本发明方法的优选设置中，使用总量至少0.1ml/cm2填充床的额外新鲜培养基作为储库，进行再循环模式的细胞培养。
细胞扩增阶段的目的是在转染日实现最佳细胞浓度。在一个实施方案中，扩增细胞以获得0.9 x 105个细胞/cm2至2 x 105个细胞/cm2生物反应器表面积的浓度。在填充床生物反应器系统中的细胞计数并不总是实际的和可能的，因此，在接种后可以通过测量合适的代谢参数来监测细胞扩增，诸如乳酸积累或葡萄糖消耗。在优选的实施方案中，培养所述细胞用于扩增，直至在生物反应器中获得的0.7 g/l至1g/l的乳酸积累。
在进一步优选的实施方案中，在第0天，在生物反应器中接种细胞，并且随后培养至第4天，或最优选地至第3天。
在一个实施方案中，在第0天，在生物反应器中接种细胞，并且随后通过分批模式操作细胞培养物进行培养。在优选的实施方案中，在第0天，在生物反应器中接种细胞，并且随后以分批模式培养至第4天，或最优选地至第3天。优选地，在分批模式扩增培养结束时，在转导前更换耗竭的细胞培养基。在一个实施方案中，通过排空生物反应器并添加新鲜培养基，更换耗竭的细胞培养基。在另一个实施方案中，通过以固定速率提供对应于生物反应器中存在的细胞培养基的至少相同体积的量的新鲜培养基，以灌注模式更换耗竭的细胞培养基。
在另一个实施方案中，在第0天，在生物反应器中接种细胞，并且随后以灌注模式培养至第4天，或更优选地至第3天。可在细胞接种至少四小时后激活灌注。
在优选的实施方案中，在第0天，在生物反应器中接种细胞，并且随后以再循环模式培养至第4天，或更优选地至第3天。可在细胞接种至少四小时后激活灌注。
本领域已知的许多基础培养基可适用于本发明的方法。培养基包括但不限于，EMEM (Eagle最低基础培养基)，BEM (基础Eagle培养基)、DMEM (Dulbecco氏改良的Eagle培养基)、Glasgow最低基础培养基、M199基础培养基、HAMs F-10、HAMs F-12、Iscove'sDMEM、RPMI、Leibovitz L15、MCDB、RPMI-1640、IMDM、X-Vivo10™、X-Vivo15™和X-Vivo20™。优选地，所述细胞培养基补充有其它已知的促进细胞扩增的因子，诸如谷氨酰胺或glutamax、胎牛血清(FBS)或本领域技术人员可容易确定的替代物。
转染步骤
在本发明的方法中，使用两个或多个质粒转染(即：多质粒DNA转染)适用于慢病毒载体生产的细胞。
本领域已知的各种技术可用于向细胞引入核酸分子。此类技术包括使用化合物的化学-协助转染，诸如磷酸钙、阳离子脂质、阳离子聚合物、脂质体-介导的转染。然而，根据本发明优选的方面，使用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂进行多质粒DNA瞬时转染。
根据本发明的制造方法包括转染步骤，通过向所述生物反应器添加转染混合物开始转染。
如本文所使用的术语“转染混合物”是指含有DNA转染颗粒的溶液，其在DNA与转染剂的混合后形成。
优选地，转染混合物的制备包括以下步骤：
a) 制备含有DNA的溶液(溶液a)，
b) 制备含有PEI的溶液(溶液b)，
c) 混合两种溶液a和b，并且进一步将其孵育以获得含有DNA转染颗粒的转染混合物。
在优选的实施方案中，使用总量在45 ng/cm2至185 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA进行转染。
在另一个实施方案中，使用总量在45 ng/cm2至150 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA进行转染。
在进一步实施方案中，使用总量在45 ng/cm2至100 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA进行转染。
技术人员可使用在本领域已知的转染方案公开的任何不同比率的DNA:PEI，包括制造商推荐的条件。在本发明的方法中，根据优选的实施方案，使用DNA量与PEI之间等于1:1的比率进行转染。
根据本发明的方法，通过向生物反应器添加含有DNA转染颗粒的转染混合物进行转染，并且在不存在新鲜培养基的灌注或再循环的情况下，在所述生物反应器中孵育所述细胞和DNA转染颗粒。
在一个实施方案中，向所述生物反应器的细胞培养基中添加所述转染混合物，必要时，随后取出与转染混合物体积成比例或相等的体积的细胞培养基。
在本发明的方法中，在转染期间，在不存在新鲜培养基的灌注或再循环的情况下，孵育所述细胞和DNA转染颗粒，从而维持在所述生物反应器中的DNA转染颗粒的数量恒定。
持续应用搅拌以允许提供O2和循环DNA颗粒。
如实施例中所示，与DNA转染颗粒的孵育时间可对最终载体制备物的生产率和质量具有影响。实施例2.3和2.4显示，与DNA转染颗粒孵育21小时后获得的LVV感染性降低。因此，根据本发明优选的方面，在转染期间，将所述细胞与DNA转染颗粒孵育长达18小时的时段。此外，如实施例1.3中所示，通过将与DNA转染颗粒的孵育时间减少至6小时，可以观察到生产率降低。在这样的条件下，生产率仍然是可接受的，但预计进一步减少孵育时间，效率甚至更低。因此，在优选的实施方案中，将所述细胞与DNA转染颗粒孵育6至18小时的时段，更优选地，8小时的时段。
转染中的最佳DNA总量
如以上所解释的，在本发明的方法中，使用编码生产所述载体所必需的所需成分的两个或多个质粒转染细胞(多质粒DNA转染)。本领域已知不同的方案，其公开了用于转染的每个质粒的不同比率。取决于所使用的质粒系统(例如：所使用的包装质粒的数量、转化载体质粒的特点和长度)，技术人员可优化LVV生产所需的不同质粒之间的最佳比例。一旦确定，例如在烧瓶或孔中，此类比例必须适用于生物反应器系统中使用的DNA总量。
本发明人确定了将用于本发明方法中的总多质粒DNA的理想范围，以确保所述方法的高生产率和再现性。
在一个实施方案中，使用DNA总量在45 ng/cm2至185 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA进行转染。
本发明人惊讶地发现，可使用低于现有技术公开的量的范围的DNA，获得具有相当的或甚至更高的生产率的批量生产。
现有技术(Valkama等人，2018和Leinonen等人，2019)公开了在转染中使用200ng/cm2或300 ng/cm2或400 ng/cm2 的量的总DNA和作为转染试剂的PEI (DNA:PEI的比率等于1:1)。此外，Valkama等人，2018和WO 2018/007873明确声称，通过在转染中使用100 ng/cm2的量的DNA，转染效率降低至5%。本发明的实施例1.2显示了通过使用不同的DNA总量(即363 ng/cm2、181 ng/cm2和91 ng/cm2)进行多质粒DNA瞬时转染，在填充床生物反应器中实施LVV病毒载体生产的制造方法获得的结果。表4清楚地显示，与363 ng/cm2的总DNA获得的运行相比，在转染中使用181 ng/cm2和91 ng/cm2的量的总DNA获得的批量生产具有更高的生产率(更高的物理滴度)。如实施例2.3和在相关的表23所示，通过在具有1.06 m2的表面积的iCellis nano应用所述方法也观察到此类令人惊讶的效果，其中发现相对于用181ng/cm2的总DNA感染细胞，使用91 ng/cm2的总DNA获得的批量生产具有相当的生产率。如实施例3所示，在大规模中获得了一致的数据。与在现有技术中的报道相反，通过减少在低于200 ng/cm2表面积的转染中使用的总DNA的量，有可能实现相当的甚至更高的生产率。使用甚至低于PEI制造商推荐的用于单质粒转染的DNA量(至少100 ng/cm2表面积)，观察到所述结果。考虑到在本发明的方法中，必需在细胞中共转染不同的质粒以获得生产LVV，这是是尤其重要的。
Mc Carron等人，2019公开了在填充床生物反应器中的制造方法，其中使用了5种质粒慢病毒载体系统。在这样的情况下，使用26.5 ng/cm2的总DNA和PEI转染试剂(DNA:PEI比率为1:3，即：使用PEI的量比在实施例中使用的高三倍)进行共转染。描述获得的批量生产具有1X107 vp/cm2的低产量，对应于1 ng/cm2的测量的p24，即：滴度比通过根据本发明使用的DNA范围观察到的滴度低达大约70多倍。
因此，根据本发明，提供了用于在填充床生物反应器中制造慢病毒载体的方法，其包括使用总量在45 ng/cm2至185 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA，和PEI转染试剂，对细胞进行瞬时转染。
在本发明更优选的方面，提供了通过多质粒瞬时DNA转染，在填充床生物反应器中制造慢病毒载体的方法，其包括以下步骤：
(a) 接种细胞，
(b) 培养所述细胞以扩增至少一天，
(c) 使用总量在45 ng/cm2至185 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA，和所述PEI转染试剂转染所述细胞，
(d) 收获含有重组慢病毒载体的细胞培养上清液。
在另一个实施方案中，使用总量在45 ng/cm2至150 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA进行转染。
在进一步实施方案中，使用总量在45 ng/cm2至100 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA进行转染。
在优选的实施方案中，使用比率等于1:1的DNA:PEI进行转染。
在优选的实施方案中，多质粒DNA由以下构成：一个携带慢病毒gag/pol基因的质粒，一个携带慢病毒rev基因的质粒，一个携带编码包膜蛋白的基因的质粒，优选编码VSV-G包膜蛋白的基因，和一个携带转化载体的质粒，所述转化载体包括上文公开的所需的慢病毒基因组部分，以及基因(外源目的基因)。
转染后的培养基更换
如以上所公开的，有必要监测和测量转染时间，即：时间段，其中孵育所述细胞与转染颗粒，以及在孵育时间期间在所述生物反应器中维持转染DNA颗粒的量。根据本发明的制造方法包括在转染结束更换培养基(即转染后)。此类步骤有效用于在孵育时间结束取出所述DNA转染颗粒，其可对所述方法的生产率和质量产生负面影响，所述质量是指在所述大批量生产中存在的污染物方面。以灌注模式通过提供固定速率的、充足的量的新鲜培养基在填充床生物反应器中进行培养基更换。例如，有可能在转染期间提供固定速率的一定量的新鲜培养基，其对应于相同的或者两倍的在所述生物反应器中使用的培养基的总体积。或者，可以分批模式进行转染后更换培养基，即通过从所述生物反应器排出含有DNA转染颗粒的细胞培养基，并向所述细胞添加新鲜培养基。由于取出所述DNA转染颗粒，转染后更换培养基的步骤允许停止转染，因此允许控制转染的时间，即：时间段，其中孵育所述细胞与转染颗粒，如以上所解释的，所述转染颗粒也可影响所述批量生产的感染性病毒滴度。
在优选设置中，本发明的方法包括通过从所述生物反应器排出含有DNA转染颗粒的细胞培养基，并向所述细胞添加新鲜培养基。在一个实施方案中，从所述生物反应器取出高达98%的含有DNA转染颗粒的细胞培养基。或者，从所述生物反应器取出高达约95%，或高达约90%，或高达约85%，或高达约80%，或高达约75%，或高达约70%的含有DNA转染颗粒的细胞培养基。
现有技术公开了以灌注模式进行转染后培养基的完全更换。Valkama等人，2018公开了一种方法，其中在转染后的4或6小时将灌注应用于填充床生物反应器，并且之后在转染后收集LVV期间通过灌注进行一或两天以灌注模式完全更换培养基。Leinonen等人，2019公开了在通过灌注开始收集LVV颗粒前，在转染后24小时，通过应用在转染后灌注进行更换培养基，直至培养基完全更换。Mc Carron等人，2019公开了以分批模式在转染后更换培养基，随后以分批模式收集LVV。
现有技术未公开以分批模式在转染后更换培养基与以灌注模式收集LVV的结合。
如实施例所示，令人惊讶地发现以实现转染后更换培养基的灌注的应用不利于所述批量生产的生产率(物理病毒滴度和感染性病毒滴度)。具体而言，实施例1.5和相关的表13示出根据本发明方法生产的LVV (从所述生物反应器排出细胞培养液，并向所述细胞添加新鲜培养基，随后以灌注模式收获)相较于以下列方法获得的那些具有更高的物理滴度和更高的感染性病毒滴度，所述下列方法如现有技术中所公开的，通过应用灌注进行在转染后更换培养基，直至培养基完全更换。此外，如表14所报告的，以分批模式在转染后更换培养基对在没有核酸内切酶处理的最终池中的污染物(质粒DNA、总DNA和HCP)的减少是有效的。
这样的技术效果不但令它本身惊讶，而且它完全是出乎意料的，大规模完全排干生物反应器和后续的填充需要具体的时间(大约50分钟)，其中细胞维持在没有培养基中。出于逻辑考虑和现有技术工作也有的观点，认为此类技术限制对生产造成问题。例如，WO2018/007873声称：“以大规模完全交换培养基不是实际的方法步骤，因为它要求时间，并且由于在排出期间，搅拌关闭，以及在上载体的细胞没有培养基的事实，可能影响细胞生存力”。
相反，本应用的数据示出通过以大规模分批完全取出细胞培养基未对生产率和感染性病毒滴度造成潜在的不利的迹象。在实施例1.5，为了模拟大规模排空/填充的时间，进行的制造运行之一包括和以分批模式在转染后更换培养基期间，在排出细胞培养基后的50'的保持时间。通过包括所述50'的保持时间的运行获得的结果，证实了相对于包括以灌注模式在转染后更换培养基的生产运行，生产率和感染性病毒滴度增加。
此外，实施例3示出通过根据本发明进行大规模制造方法而获得的结果。为了评估所述方法在大规模中的效果，在小规模中的运行(iCellisNano)与在iCellis500中的运行平行，并且直接比较数据，所述数据是指在物理滴度和感染性病毒滴度方面。在大规模中获得的生产率(如物理病毒滴度和感染性病毒滴度)和最终产物的质量(在污染物的存在方面)与平行进行的小规模运行所获得的那些一致甚至更好(如实施例3.2所示，例如物理的感染性病毒滴度和感染率以及存在的污染物)。
收集LVV重组颗粒
收获操作程序和收集LVV重组颗粒时间段的识别是开发有效的制造方法的最重要的目标之一。根据本发明的方法，如以上所公开的，在以分批进行的转染后培养基更换之后立刻以灌注模式通过开始收集含有重组LVV的细胞培养基进行重组LVV的收集。现有技术公开了使用填充床生物反应器的生产LVV的方法，其中以分批(诸如Mc Carron等人，2019)进行所有步骤，或其中以灌注(诸如在Valkama等人，2018或Leinonen等人，2019中)进行所有步骤。根据本发明的方法，本发明人发现转染后，将分批进行的步骤与灌注进行的步骤组合成功实现了有效的和可再现的制造方法。
在Mc Carron等人，2019中，在以分批进行的转染后培养基更换之后，以分批收集重组LVV颗粒。在所述生物反应器中的细胞培养基在转染后48小时或在转染后72取出，用于收集LVV，以允许在所述细胞培养基中重组LVV颗粒的最大积累。在转染后72小时观察到生产率增加，并且本作者建议进一步评估在转染后72小时之后进一步评估生产率。用于转染和随后收获的所需的总时间是4天。
在Valkama等人，2018或Leinonen等人，2019中，从转染后24小时以灌注进行收集，在两篇文章中，有清楚的迹象表明转染后6小时，LVV的产量非常低。此外，在Leinonen等人，2019中，该作者声明转染后培养基更换(以灌注进行)造成生产率降低，出于这样的原因在所述培养基中添加具体的添加物用于收获。
根据本发明的方法，以分批在转染后培养基更换，随后通过以灌注收获立刻开始收集LVV的性能允许避免在现有技术中观察到的生产率的降低。
在一个实施方案中，根据本发明的方法，在转染后培养基更换进行以灌注收获48小时。
在优选的实施方案中，根据本发明的方法，在转染后培养基更换之后进行以灌注收获至少39小时。
在更优选的实施方案中，根据本发明提供了方法，其中转染，转染后培养基更换和以灌注收获的步骤具有三天的总持续时间。
具体而言，实施例2.4示出根据本发明制造方法的优化版本获得的结果。该实施例比较了通过在3天内进行转染和随后的收获(8小时的转染，随后以分批更换培养基，以及39小时的以灌注收获)获得的结果和通过在4天内进行转染和随后的收获(21小时的转染，随后以分批更换培养基，以及48小时的以灌注收获)获得的那些。如表27所示，当转染后培养基更换和最终收获预计在一天内，感染性病毒滴度和感染性更高，即：当在3天内进行转染和随后的收获。此外，进行在总共三天内的转染和收获所获得的批量收获物具有较少的污染物，在不存在核酸内切酶处理的情况下，总DNA不可测或低于分析方法的限度。
本发明的主要优势
本发明涉及在填充床生物反应器中制造LVV的方法，其中最终批量生产表征为在物理滴度、感染性病毒滴度和感染率方面的高生产率和少量的污染物。具体而言，本发明人选择操作条件的组合，以实现本方法的具体步骤，其对所述方法的生产率具有积极影响。令人惊讶地是，如直接与以灌注模式进行转染后培养基更换相比，以分批模式进行转染后培养基更换对在物理滴度、感染性病毒滴度方面的高生产率具有积极影响。如以上所公开，现有技术(WO 2018/007873)建议避免从生物反应器中排干细胞培养基，尤其在大规模中。相反，如实施例3所示的数据证实了以分批模式进行转染后培养基更换对在大规模进行的方法的效力和在小规模获得的结果的再现性没有负面影响。实施例3.2示出通过平行进行两种制造方法，所述制造方法一种在iCellis 500 (大规模表面积133m2)和另一种在iCellisnano (小规模1,06 m2)，在大规模的生产率由更高的感染性病毒滴度，并且在大规模的批量生产的感染率是在小规模获得的那些的两倍。此外，转染后培养基更换与以灌注收获收集LVV的组合允许获得表征为概况非常良好的最终批量生产，所述概况是在小规模以及大规模的总DNA含量和宿主细胞蛋白含量方面。如实施例2.4所示，在批量制备中，没有任何核酸内切酶处理，总DNA和宿主细胞蛋白污染物是极少的或甚至不可测。如实施例3.2所示，在大规模中以及证实了结果。这是进一步令人惊讶的效果，考虑到现有技术公开了在所述方法的生产阶段(即在收集LVV期间)，在所述生物反应器中需要进行第一核酸内切酶处理，随后通过核酸内切酶进一步处理批量制备，以获得在纯度方面可接受的结果。
此外，本发明人员识别了总DNA量的有效范围，以用于在所述生物反应器中的转染，其允许获得与在转染中用更大量的总DNA获得的生产率相比，相当或甚至更高的生产率。通过完全以分批模式操作所述方法已经观察到此类效果，如以上所公开，通过用于更有效的操作方法的组合进行进一步改进。在维持高生产率的同时，降低总DNA量在所述方法的经济方面具有重要优势，因为用于药物制备的大规模制造LVV要求使用GMP等级原料，并且DNA质粒是其中最贵的原料，因此，在成本方面具有重要的积极作用。例如，在实施例3.2中报告的数据示出进行在iCellis 500的大规模生产运行，并在转染中使用91 ng/cm2总量的多质粒DNA，有可能获得批量制备，所述批量制备具有60 ng/cm2物理滴度和感染性病毒滴度，所述感染性病毒滴度是相对于在小规模和低杂质概况中以相同方法获得的感染性病毒滴度的两倍。数据输出在小和大规模中所述方法的再现性和有效性。此外，在实施例4中报告的数据示出通过进一步将转染中使用的多质粒DNA总量减少至60 ng/cm2或45 ng/cm2，实质上维持了在物理滴度方面生产率，并且观察到良好水平的感染性病毒滴度。
附图描述
图1：展示实施例1中公开的实验中进行的方法的流程图。
图2：展示实施例2中公开的实验中进行的方法的流程图：(*) 对于运行PDE_B18172，在从第1天至第3天实施再循环，并且从运行PDE_B18187起，从第0天至第3天实施再循环；(**) 仅对运行PDE_B18172实施的条件。(***) 从运行PDE_B19013起实施的条件，除了运行PDE_B19087的bio2之外(转染后6小时的更换培养基)。
实施例
实施例1 – iCELLis NANO 0.53 m2中的慢病毒载体生产的描述
实施例1.1 – 材料和方法
包装细胞和细胞培养基
通过HEK 293T生产慢病毒载体，所述HEK 293T培养在没有酚红的IMDM，10% FBS和2% L-谷氨酰胺或2% Glutamax)中。
生物反应器
在可行性研究期间，已经在iCELLis nano中，以表1中报告的特征完成在本实施例1中描述的所有实验。
表1：iCELLis nano特征
<![CDATA[生物反应器尺寸(m<sup>2</sup>)]]> FB高度(cm) 压缩 载架密度(g/L) 载架数量
0.53 2 1 96 472
质粒
使用的多质粒DNA系统是第三代LVV包装系统，包括4个分离的质粒：一个携带gag-pol基因的质粒(pGag/Pol)，一个编码rev的质粒(pREV)，一个携带VSV-g基因的质粒(pENV-VSV-G))，和一个携带编码GFP蛋白的基因的转化载体质粒(pTransfer-GFP)。
分析方法
应用下列分析方法来评估方法性能：
• 物理病毒滴度：此分析方法是用于定量p24 HIV蛋白的ELISA，其可用于评估物理颗粒的浓度。
• 感染性病毒滴度：此分析方法是基于参考CEM A3.01细胞系的转导。通过FACS分析评估GFP蛋白的表达。
• 残余的宿主细胞蛋白：此分析方法是ELISA，用于定量LVV样品中来自HEK-293T包装细胞系的残余蛋白。
• 残余的总DNA：此分析方法基于荧光染料，其染色并允许定量残余的DNA。
制造方法的总结
图1中报告了实施例1中公开的实验中实施的方法的流程图。简而言之，对于每次实验，在烧瓶中的IMDM (w/o酚红且含有10% FBS和2% L-谷氨酰胺(或glutamax))中扩增细胞。在分裂后，将细胞接种在生物反应器iCELLis nano (5000个细胞/cm2)中。在扩增阶段(其中监测pH、DO%、葡萄糖和乳酸浓度)后，用新鲜的完整培养基替换细胞培养基，并且在第3或4天进行转染步骤。在18小时后，进行新培养基更换，以除去质粒DNA和PEI Pro的各种残余物。在转染步骤后48小时和72小时收集两次收获物。来自每次收获的慢病毒载体在0.45µm过滤，并在<-65℃储存在用于测试的样品中。在本实施例1显示的实验中，从运行PDE_B17054 B起，以灌注模型进行收获，并且在灌注48小时后收集LV载体。
转染步骤
在本实施例1中公开的所有实验中，使用聚乙烯亚胺(PEI)-介导的转染方法进行LV载体的生产，其易于使用，具有高度的再现性和一致性。为了确定用于PEI转染方案中的质粒DNA的合适的量，进行可行性实验，其始于在其它细胞培养系统(诸如烧瓶)中起作用的量且与现有技术公开的量一致(即：如Valkama等人，2018所公开的从300 ng/cm2至400 ng/cm2表面积，或Leinonen等人，2019所公开的从200至300 ng/cm2)。PEI的用量已设定为维持PEI和DNA之间1:1的比率。
转染方案
- 在转染前1小时用预温的完整培养基进行培养基更换。
- 制备DNA混合物，在IMDM free中稀释正确量的质粒DNA。
- 在IMDM free中稀释正确量的PEI。
- 将稀释的PEI转移至含有稀释的DNA的管中并混合。
- 根据制造商的说明书，孵育最终混合物(1个生物反应器100 mL)
- 将混合物转移至所述生物反应器中。
实施例1.2 – 总DNA的量
在该实验第一组中，应用以下条件用于在具有0.53 m2的表面积的iCellis Nano生物反应器中实施制造运行：
- 细胞接种密度：5000个细胞/cm2；
- 在18小时，分批进行转染后的培养基更换；
- 在转染后48小时和72小时进行2次收获。
已经研究出用于转染的最佳DNA量。对于每次运行，在接种后第3天进行转染。在运行PDE_M16142、PDE_M16155 Bio1和PDE_M16177中，使用181 ng/cm2总量的DNA进行转染。为了研究不同的比率，两倍量的DNA (2x)已经用于运行PDE_M16121 Bio1，即：363 ng/cm2(与现有技术中公开的DNA量一致)，并且在PDE_M16155 Bio2中，使用一半的量，即：91 ng/cm2。在表2中总结了使用的不同条件。
表2：实验条件
方法ID <![CDATA[DNA (ng)/表面积(cm<sup>2</sup>)]]> 质粒DNA的总量(µg)
PDE_M16121 Bio1 363 1925
PDE_M16142 181 962
PDE_M16155 Bio1 181 962
PDE_M16155 Bio2 91 481
PDE_M16177 Bio2 181 962
简而言之，在所有实验中，以5000个细胞/cm2在iCELLis nano中接种。从第3天至第6天进行取样，以监测细胞生长、测量pH、乳酸和葡萄糖浓度。在所有实验期间，在转染前第3天，从每个生物反应器取出3个微载架(microcarrier)并裂解；进行细胞核计数以评估cm2的细胞密度；除去耗竭的培养基并更换为新鲜培养基。根据此前所述的方案(实施例1.1)进行PEI-介导的转染。转染后18小时，除去耗竭的培养基(从生物反应器排出)并更换为用于生产的新鲜培养基。在更换培养基后24小时、48小时，分批进行两次收获。
表3中报告了在转染日的细胞量/cm2，以及从第3天至第6天产生的乳酸(mg/mL)。
表3：细胞密度(细胞/cm2)和乳酸(mg/mL)数据
结果总结在表4中：
表4：生产率数据
如结果所示，与用363 ng/cm2的总DNA获得的运行相比，使用181 ng/cm2和91 ng/cm2的总DNA量的转染，获得的批量生产具有更高的生产率。出于这样的原因，在后续的运行中，将962 µg用于转染步骤。
实施例1.3 –转染混合物的孵育
在以下的实验组中，在具有0.53 m2表面积的iCellis Nano生物反应器中，在第3天，使用每个生物反应器962 μg的总量的多质粒DNA (即：181ng/cm2表面积)和962 μg总量的PEI PRO (1 μg/μl)，进行转染。在运行PDE_B17028 A中，在转染阶段开始后6小时进行培养基更换，以研究较早的培养基更换是否与提高LVV生产率相关。为了减少在方法中使用的FBS的量，在运行PDE_M17028B中，研究在生产阶段期间降低的血清百分比(2.5%)。
表5中指示了不同的测试条件。
表5：实验方案
方法ID FBS的% 转染后的培养基更换
PDE_M16203 A 10 18h
PDE_M17028 A 10 6h
PDE_M17028 B 2.5 18h
在第0天，以5000个细胞/cm2在iCELLis nano中接种。从第3天至第6天进行取样，以监测细胞生长；在转染前第3天，从每个生物反应器取出3个载架并裂解；进行细胞核计数以评估cm2的细胞密度。除去耗竭的培养基，更换为新的生长培养基，并且进行PEI-介导的转染。转染步骤后18小时(对于PDE_M17028A运行，为6小时)，以分批模式进行耗竭培养基的更换。在PDE_M17028 B运行中，用IMDM 2.5%FBS和2% L-谷氨酰胺替换耗竭的培养基。如在之前的运行中，在更换培养基后24小时和48小时，分批进行两次收获。
表6中总结了汇集的收获物的物理病毒滴度和感染性病毒滴度以及感染性的结果。
表6：生产率数据
运行PDE_M17028 A的结果显示，在转染后较早的培养基更换(细胞与转染混合物孵育6小时)减少了载体的生产；在收获阶段期间降低FBS的百分比(PDE_M17028 B)，对生产没有影响，但降低了病毒滴度和LV载体的感染性。
实施例1.4 通过灌注收获，收集LVV
为了提高所生产的病毒载体的感染性并避免在iCELLis 500的收获之间的排空/填充时间，在运行PDE_B17133中，评估以灌注收获并与分批收获进行比较。详细来说，进行具有分批的两次收获的PDE_B17133 A，而在运行PDE_B17133B中，以灌注模式收获LV载体。两个生物反应器遵从进行相同的方法，直至转染阶段。简而言之，在第0天，以5000个细胞/cm2在两个生物反应器中接种。三天后，用完整的培养基进行转染前的培养基更换；随后，遵从线圈允许中相同的方案进行转染。18小时后，用新的完整培养基，分批进行转染后的培养基更换。从第3天至第6天进行取样以监测细胞生长；在转染前，从每个生物反应器和取出3个载架并裂解，以进行细胞核计数。
在PDE_B17133 A中，在固定速率(13.5 mL/小时的速率)，灌注收集上清液：将新鲜培养基转移至IN瓶中，与生物反应器相连，并灌注48小时。在以灌注收获期间，在OUT瓶中收集上清液。在更换培养基后24小时和48小时收集来自OUT瓶的样品，以0.45 µm过滤并储存在<-65℃。收集来自汇集物的样品，以0.45 µm过滤并储存在<-65℃。
在PDE_B17133 B中，在转染后的培养基更换之后24小时和48小时，分批收集两次收获物。收集来自每次收获的样品并储存在<-65℃。在方法结束时，合并两次收获物，过滤，并且储存在<-65℃。
表7中总结了用于两个生物反应器的条件。
表7：方法PDE_B17133A和PDE_B17133B的实验方案
结果报告在表8中。
表8：生产率数据
结果证明，从两个生物反应器获得的物理病毒滴度和感染性病毒滴度以及感染性是相当的。所引入的条件(在转染后分批更换培养基之后，开始以灌注收获上清液)允许维持分批收获物的相同生产率水平。
实施例1.5：转染前的培养条件
为了优化在iCELLis 500中的规模放大和避免在方法所有阶段期间的排空/填充时间，评估转染前的分批培养基更换的替代方案。具体而言，在运行PDE_B18034和PDE_B18068中，引入以灌注和以再循环进行的培养基更换。表9显示了每次运行中研究的条件。
表9：#9组的实验方案
方法ID 转染前的培养基更换 培养基更换的体积
PDE_B18034 A 灌注 1300 mL
PDE_B18034 B* 分批 650 mL
PDE_B18068 A 再循环 650 mL
PDE_B18068 B 灌注 1300 mL
PDE_B18068 C 灌注 650 mL
简而言之，在第3天，以5000个细胞/cm2接种每个iCellis nano生物反应器，并且从第3天至第6天进行取样，以监测pH、乳酸和葡萄糖。
在第3天，进行转染前的培养基更换，如以下所解释：
• PDE_B18034 A和PDE_B18068 B：以灌注模式用新的生长培养基更换耗竭的培养基。灌注体积为1300 mL。
• PDE_B18034 B：分批进行培养基更换；除去耗竭的培养基，并以650 mL新的生长培养基填充生物反应器。
• PDE_B18068 C：以灌注模式用新的生长培养基更换耗竭的培养基。灌注体积为650 mL。
PDE_B18068A：在该运行中，没有进行培养基更换，但在接种后第1天，开始使用650mL新鲜培养基进行再循环，直至第3天。
如实施例1.3中公开，进行PEI-介导的转染。从转染阶段至方法结束时，在三个生物反应器中进行灌注收获48小时。在灌注期间，在从OUT瓶更换培养基后24小时和48小时收集样品，以测量物理病毒滴度和感染性病毒滴度。
测试来自PDE_B18034和PDE_B18068的总汇集物的物理病毒滴度和感染性病毒滴度。
在表10中报告实验的物理病毒滴度和感染性病毒滴度以及感染率的结果：
表10：生产率数据
结果证明，如果与标准条件相比(运行PDE_B18034B，分批进行培养基更换)，在以灌注或再循环模式的培养基更换进行细胞培养扩增的运行中，LV载体的生产率更高。
实施例1.5：转染后的培养基更换
该组实验的目标是研究用于进行转染后的培养基更换的最佳技术方案。
详细来说，在运行PDE_B18080 A中，通过灌注进行转染后的培养基更换，以避免容器的排空和填充(在iCellis 500中是费力且困难的，并且在现有技术中，诸如WO 2018/007873中是不鼓励的)。转染后18小时，以9 mL/分钟的速率灌注1300 mL完全新鲜的IMDM，以交换90%的培养基。
在运行PDE_B18080 B中，在转染后的分批培养基更换期间，引入50'的保持时间，以模拟iCELLis 500排空/填充的时间。在转染阶段后18小时，除去耗竭的培养基，并且使生物反应器空置50'，仅在其中保留16 mL；这个培养基的量对应于由于系统的技术限制在排空期间，iCellis 500中不能回收的体积。50'之后，用新的新鲜培养基填充生物反应器。
在PDE_B18080C中，用标准条件进行转染后的培养基更换(分批，无保持时间)，以将其与引入的新条件比较。
在转染后的培养基更换之前和之后，从三个生物反应器进行取样，以评估质粒残余DNA。在生物反应器A中，在灌注一半体积之后，从容器中取样。
不同的培养基更换条件总结在表11中。
表11：测试的培养基更换条件
方法ID 转染后的培养基更换 保持时间
PDE_B18080 A 灌注 n.a.
PDE_B18080 B 分批 50’
PDE_B18080 C 分批 n.a.
在所述方法的其它阶段期间，所有三个生物反应器都遵循在此前运行中设定且在表12中报告的标准条件。
表12：实验方案
测试三个生物反应器的总汇集物的物理病毒滴度和感染性病毒滴度、HCP、质粒和总残余DNA。
结果报告在表13和表14中。
表13：生产率数据
表14：残余物数据
方法ID HCP (ng/mL) 总DNA   (ng/mL)
PDE_B18080 A 1882 997
PDE_B18080 B 2885 1597
PDE_B18080 C 2494 1262
如结果所示，令人惊讶地发现，以灌注模式进行转染后培养基更换的生物反应器A(PDE_B18080 A)中的LV载体的生产率低于以分批进行转染后培养基更换而实施的运行。运行PDE_B18080B (以具有保持时间的分批模式进行转染后培养基更换)的生产率也高于以灌注进行转染后培养基更换而实施的运行(PDE_B18080 A)中获得的生产率，并且甚至高于运行PDE_B18080 C，而运行PDE_B18080 B的感染性病毒滴度与运行PDE_B18080 C相同。污染物、HCP、质粒和总DNA的量在两次运行PDE_B18080 B和PDE_B18080 C之间是等同的。鉴于在iCellis 500中扩大至大规模，在iCellis nano中具有保持时间的分批培养基更换与在大规模iCellis 500进行的运行更为一致(因为50'是排空和填充生物反应器所需的时间)。因此，它更代表了大规模运行的性能。
实施例2 – 在iCELLis NANO 1.06 m2中的慢病毒载体生产
实施例2.1 – 材料和方法
包装细胞和细胞培养基
使用HEK 293T细胞系进行在本实施例2.1中描述的LVV载体的生产。解冻HEK 293T细胞，并在IMDM 10% FBS，2% Glutamax中扩增。
生物反应器
除了实施例2.2的第一次实验(其中一个运行在具有0.53m2表面积的生物反应器iCellis Nano中进行)之外，实施例2.2和2.3中描述的所以其它运行在具有1.06m2表面积的生物反应器iCellis Nano中进行。两类技术支持(support)的特征报告在表15中。
表15：iCellis Nano的特征
<![CDATA[生物反应器尺寸(m<sup>2</sup>)]]> FB高度(cm) 压缩 载架密度(g/L) 载架数量
0.53 2 1 96 473
1.06 4 1 96 946
质粒
在本实施例2的iCellis Nano中的LVV载体生产所使用的多质粒DNA系统是第三代LVV包装系统，包括4个分离的质粒：一个携带gag-pol基因的质粒(pGag/Pol)，一个编码rev的质粒(pREV)，一个携带VSV-g基因的质粒(pENV-VSV-G))，和一个携带编码GFP蛋白的基因的转化载体质粒(pTransfer-GFP)。
分析方法
应用下列分析方法以评估方法性能：
• 物理病毒滴度：此分析方法是用于定量p24 HIV蛋白的ELISA，其可用于评估物理颗粒的浓度。
• 感染性病毒滴度：此分析方法基于参考CEM A3.01细胞系的转导。通过FACS分析评估GFP蛋白的表达。
• 残余的宿主细胞蛋白：此分析方法是ELISA，以定量LVV样品中来自HEK-293T包装细胞系的残余蛋白。
• 残余的总DNA：此分析方法基于荧光染料，其染色并允许定量残余DNA。
制造方法总结
图2中报告了实施例2中公开的实验中所应用的方法的流程图。简而言之，对于每次实验，在T-烧瓶中的IMDM (w/o酚红且含有10% FBS和2% Glutamax)中扩增细胞。分裂后，将细胞接种在生物反应器iCELLis nano (5000个细胞/cm2)中。在扩增阶段(其中监测pH、DO%、葡萄糖和乳酸浓度)后，将细胞培养基更换(以灌注或通过再循环)为新鲜的完整培养基，并且在第3天进行转染步骤。21小时后，进行分批培养基更换，以除去质粒DNA和PEI Pro的所有残余物。以灌注模式进行收获。在转染后培养基更换之后48小时，收集慢病毒载体上清液。从运行PDE_B18030开始，预计分别在第3天和第5天进行转染后的培养基更换和收获，以收集具有高感染性的载体上清液。在以灌注收获期间的慢病毒载体样品，以0.45µm过滤并储存在<-65℃用于测试。
转染步骤
在本实施例2公开的所有实验中，使用聚乙烯亚胺(PEI)-介导的转染方法进行LV载体的生产。使用之前在实施例1中测试的µg质粒/mL的量进行优化研究。直到运行PDE_B18187 保持DNA/细胞的比率，在1.06m2生物反应器中，转染混合物的体积，以及DNA和PEI的量加倍(1924 μg总DNA)。随后，DNA/细胞的量减半，使用0.53m2的iCELLis nano的相同体积的转染混合物和DNA/mL比率(962 μg总DNA)。设定PEI的用量以维持PEI与DNA之间1:1的比率。
用于在第3天转染的方案：
1. 在转染前1小时用预温的完整培养基以灌注(仅在提供时)进行培养基更换。
2. 制备用于生物反应器的总DNA混合物，在IMDM free中稀释正确量的DNA
3. 在IMDM free中稀释正确量的PEI
4. 将稀释的PEI转移至含有稀释的DNA的管中并混合。
5. 根据制造商的说明书孵育最终混合物。
6. 从生物反应器中取出正确体积，将混合物转移至所述生物反应器中。
实施例2.2 – ICELLIS NANO 1.06M2与ICELLIS NANO 0.53M2中的制造
该实验第一组的目标是测试：
- 具有1.06m2面积的生物反应器；
- 在细胞培养期间再循环；
- 减少收获体积；
在所有这些实验中，在第0天，以5000个细胞/cm2在iCELLis nano中接种。在烧瓶T225中的扩增阶段之后，将26.5x106个细胞(在0.53m2的生物反应器中)和53x106个细胞(在1.06m2的生物反应器中)接种到生物反应器中。以5.50x105个细胞/皿平行接种对照皮氏培养皿，以监测转染阶段。
在该方法期间，从生物反应器中取样，以测量pH、乳酸和葡萄糖浓度。在前两个运行中，在第3天，从每个生物反应器取出三个载架并裂解；进行细胞核计数，以估计cm2的细胞密度。
评估在细胞培养扩增期间的再循环模式。对于所有实验，根据在实施例2.1所描述的方案，进行PEI-介导的转染。使用100ml总体积中的962 μg的总DNA(对应于181ng/cm2表面积)和962 μg PE，I制备用于0.53m2 iCELLis nano的转染混合物。在1.06m2 iCELLisnano中，转染混合物的体积和DNA与PEI的数量加倍。转染后21小时，除去耗竭的细胞培养基，并且在50分钟的保持时间后，使用用于生产的新鲜培养基替换耗竭的细胞培养基。进行灌注收获直至转染后培养基更换后的48小时。
表16：实验方案
评估细胞数/cm2和产生的乳酸量(mg/mL)，以监测细胞生长速率，并报告在表17中。
表17：细胞密度(细胞/cm2)和产生的乳酸(mg/mL)
表18中总结了在P24和TU方面的病毒滴度结果。
表18：生产率数据
表19中报告了汇集的收获物的HCP和总DNA的量。
表19：HCP和总DNA (ng/mL)的量
HCP 总DNA
方法ID 汇集的收获物 汇集的收获物
PDE_B18172 Bio1 1028 514
PDE_B18172 Bio2 2760 1766
PDE_B18172 Bio3 2831 1532
PDE_B18187 Bio1 1757 1144
PDE_B18187 Bio2 1981 1319
PDE_B18187 Bio3 2026 1337
PDE_B19002 Bio1 2151 1801
PDE_B19002 Bio2 2263 1479
PDE_B19002 Bio3 1840 1176
结果证明在1.06m2 iCELLis生物反应器中生产的载体的感染性病毒滴度高于在0.53m2 iCELLis nano中生产的载体的感染性病毒滴度。再循环模式没有导致LVV载体的细胞生产率的任何恶化，并且取代了培养基更换。
实施例2.3 – 在iCELLIS NANO 1.06m2中的制造
在本实施例2.3中，保持在此前运行(实施例2.2)中的条件设置：
- 1.06m2 iCELLis生物反应器；
- 转染前无培养基更换；
- 在细胞培养期间再循环；
- 以灌注收获。
研究在具有1.06m2表面积的生物反应器中的转染步骤和转染后培养基更换。在运行PDE_B18197中，测试不同比率的DNA/细胞数和DNA/mL。在Bio 1中，应用在实施例2.2中相同的转染条件(即：1924 μg总DNA，即：181ng/cm2表面积，1924 μg PEI，在200 ml的转染混合物体积中)。在Bio2中，与之前使用1.06m2生物反应器的实验相比，使用一半体积的转染混合物(100ml)。所以保持了DNA/细胞数比率，但DNA和PEI的浓度是总体积的两倍。在Bio3中，测试用于0.53m2 iCELLis nano的相同体积(100 ml)和量的DNA (962 μg，即：91ng/cm2表面积)和PEI (962 μg)。这样，保持了DNA/mL比率，但与细胞的数量相比，DNA和PEI的量减半。
表20：质粒DNA和PEI的量
*在200mL中
**在100mL中。
在运行PDE_B19013中，复制PDE_B18197 Bio3的条件，但测试转染步骤和随后的培养基更换的不同时间。在Bio1中，保持之前的条件(在星期一11.30转染，并在星期二上午进行转染后培养基更换)；在Bio2中，转染步骤和培养基更换均在星期一进行，分别在9.30和17.30。Bio3按照Bio2进行，但是从星期一开始延迟2小时。在所有3个生物反应器中，在转染后培养基更换之后，开始以灌注收获。
简而言之，在第0天，以5000个细胞/cm2在iCELLis nano中接种。在用于转染的细胞培养期间，进行培养基再循环。之后，如之前所述，进行转染步骤和分批的转染后培养基更换。在转染后培养基更换之后，开始以灌注收获。
从第3天至第6天(上午和下午)进行取样，以监测细胞生长。
实验条件总结在表21中。
表21：实验条件
方法   ID 转染 培养基更换 灌注收获
PDE_B18197 Bio1 21h 星期二 48h
PDE_B18197 Bio2 21h 星期二 48h
PDE_B18197 Bio3 21h 星期二 48h
PDE_B19013 Bio1 21h 星期二 48h
PDE_B19013 Bio2 8h 星期一 63h
PDE_B19013 Bio3 8h 星期一 61h
评估细胞数/cm2和产生的乳酸的量(mg/mL)，以监测细胞生长速率，并在表22中报告。
表22：细胞密度(细胞/cm2)和产生的乳酸(mg/mL)
表23中总结了汇集的收获物的物理病毒滴度和感染性病毒滴度以及感染性的结果。
表23：生产率数据
*：星期三
**：星期四。
表24中报告了汇集的收获物HCP和总DNA的量。
表24：HCP和总DNA (ng/mL)的量
结果显示，在PDE_B18197 Bio3中，在P24方面的LVV载体生产与Bio1相同，并且高于Bio2，令人惊讶的地证明，可以使用一半的DNA总量获得相同甚至更高的生产率。此外，该条件提高了感染性病毒滴度，使感染性增加。
在运行PDE_B19013中，转染时间从21小时减少至8小时，没有使物理病毒滴度降低太多，但增加了感染性。具体而言，该结果显示，在星期三Bio2和Bio3的感染性高于其它运行(其中进行收获直至星期四)。运行PDE_B19013 Bio2和Bio3的HCP和总DNA的结果低于之前的运行，证明上清液具有更低的杂质存在。
实施例2.4 – 在三天内的转染和收获
为了证实获得的结果，在表25中所述的运行中再次进行此前在实施例2.3中测试并选作最佳的条件。
表25：实验方案
如之前的运行中，在第0天，以5000个细胞/cm2在iCELLis nano中接种。用1300mL新鲜培养基进行培养基再循环直到第3天。在10.00 am进行PEI-介导的转染，并且8小时后分批进行转染后培养基更换，二者均在第3天。在转染后培养基更换之后，开始以灌注收获。从第3天至第6天进行取样，以监测细胞生长。
评估产生的乳酸量(mg/mL)，以监测生长速率，并报告在表26中。
表26：产生的乳酸(mg/mL)
表27中报告最终汇集的收获物的物理病毒滴度以和感染性病毒滴度以及感染性的结果。
表27：生产率数据
*第6天而不是第5天的物理滴度、病毒滴度和感染性。
表28中报告了汇集的收获物的HCP和总DNA的量。
表28：HCP和总DNA (ng/mL)的量
方法ID HCP 总    DNA
PDE_B19030 Bio1 989 <LLOQ
PDE_B19030 Bio2 1543 517
PDE_B19030 Bio3 769 < LLOQ (<0.6 µg/mL)
PDE_B19041 Bio2 578 阴性
PDE_B19041 Bio3 719 阴性
PDE_B19048 Bio1 696 < LOQ (624 ng/ml)
PDE_B19048 Bio2 1159 < LOQ (624 ng/ml)
PDE_B19048 Bio3 379 < LOQ (624 ng/ml)
PDE_B19054 Bio1 726 <LLOQ(<624ng/mL)
PDE_B19054 Bio2 784 <LLOQ(<624ng/mL)
PDE_B19054 Bio3 <LLOQ (<480) <LLOQ(<624ng/mL)
如结果所示，当转染后培养基更换和最终收获预期在一天时，即在三天内进行转染和收获时，感染性病毒滴度和感染性更高。此外，在总共三天中进行转染和收获获得的汇集收获物具有更少的污染物，其中总DNA不可测出或低于分析方法的限度。
实施例3 – 在iCellis 500中的制造
实施例3.1 – 在具有66m2表面积的iCellis 500中的制造
如在表29中所总结的，在具有66m2表面积的iCellis 500中和在具有0.53m2表面积的iCellis nano进行平行的两次载体生产。该方法使用293-T细胞系和在实施例1和2中使用的第三代多质粒DNA系统进行。
表29：生产运行的实验方案
表30中报告了在澄清之后核酸酶(benzonase)之前的iCellis500和iCellis nano的样品之间的可比性。
表30：iCellis500和iCellis nano之间的可比性
iCellis500 iCellisnano
<![CDATA[物理颗粒(ng/cm<sup>2</sup>)]]> 33 39
<![CDATA[病毒滴度(TU/cm<sup>2</sup>)]]> 3.2E+06 2.6E+06
感染性(TU/ng p24) 9.1E+04 6.6E+04
<![CDATA[宿主细胞蛋白含量(HCP) (ng/cm<sup>2</sup>)]]> 516 357
<![CDATA[总DNA含量(ng/cm<sup>2</sup>)]]> 302 230
<![CDATA[BSA (µg/cm<sup>2</sup>)]]> 414 388
结果显示，通过将所述方法扩大规模至iCellis 500，生产率得到保持，并且相对于使用iCellis nano获得的数据，将改进感染性病毒滴度和感染性。2次运行的杂质概况是可比的和可接受的。
实施例3.2 - 在具有133 m2表面积的iCellis 500中的制造
如在表31中所总结的，在具有133 m2表面积的iCellis 500中和在具有1.06 m2表面积的iCellis nano进行平行的两次载体制造。所述方法使用293-T细胞系和在实施例1和2中使用的第三代多质粒DNA系统进行。
表31：生产运行的实验方案
表32中报告了在澄清前的iCellis500和iCellis nano的样品之间的可比性。
表32：iCellis500和iCellis nano之间的可比性
iCellis500 iCellisnano*
<![CDATA[物理颗粒(ng/cm<sup>2</sup>)]]> 66 61
<![CDATA[病毒滴度(TU/cm<sup>2</sup>)]]> 7.7E+06 3.7E+06
感染性(TU/ng p24) 1.2E+05 6.0E+04
<![CDATA[宿主细胞蛋白含量(HCP) (ng/cm<sup>2</sup>)]]> 140 223
<![CDATA[总DNA含量(ng/cm<sup>2</sup>)]]> < LLOQ < LLOQ
结果显示，通过将所述方法扩大规模至iCellis 500，保持了生产率，并且相对于使用iCellis nano获得的数据，将改进感染性病毒滴度和感染性(加倍的感染性病毒滴度和感染性)。2次运行中获得的批量生产的杂质概况是可比的，并且在大规模以及小规模生产中的总DNA含量低于所使用的方法的检测限度，这个结果是由在核酸内切酶处理之前收集的样品获得。
实施例4 – 最小DNA总量
本实验的目标是评估通过使用总量45ng/cm2和60ng/cm2的DNA进行转染而获得的方法的生产率。
包装细胞和细胞培养基
在HEK 293T细胞系中进行在本实施例4中描述的LVV载体生产。解冻HEK 293T细胞，并在IMDM 10% FBS，2% Glutamax中扩增。
生物反应器
使用具有1.06m2表面积的生物反应器iCellis Nano进行实验。
表33：iCellis Nano特征
<![CDATA[生物反应器尺寸(m<sup>2</sup>)]]> FB高度(cm) 压缩 载架密度(g/L) 载架数量
1.06 4 1 96 946
质粒
在本实施例4中，为了在iCellis Nano中生产LVV载体，所使用的多质粒DNA系统是第三代LVV包装系统，包括4个分离的质粒：一个携带gag-pol基因的质粒(pGag/Pol)，一个编码rev的质粒(pREV)，一个携带VSV-g基因的质粒(pENV-VSV-G))，和一个携带编码GFP蛋白的基因的转化载体质粒(pTransfer-GFP)。
分析方法
应用下列分析方法以评估方法性能：
• 物理病毒滴度：此分析方法是用于定量p24 HIV蛋白的ELISA，其可用于评估物理颗粒的浓度。
• 感染性病毒滴度：此分析方法基于参考CEM A3.01细胞系的转导。通过FACS分析评估GFP蛋白的表达。
制造方法总结
在本实施例4中进行的方法总结在表34中。
表34：方法步骤
转染步骤
使用聚乙烯亚胺(PEI)-介导的转染方法进行LVV载体的生产。在Bio 1中，使用45ng/cm2表面积的总量的多质粒DNA进行转染，在Bio 2中，使用60ng/cm2表面积的总量的多质粒DNA进行转染。在Bio 1和Bio 2二者中，已经设定所使用的PEI的量，以保持PEI和DNA之间1:1的比率。
用于在第3天转染的方案：
1. 制备用于生物反应器的总DNA混合物，在IMDM free中稀释正确量的DNA
2. 在IMDM free中稀释正确量的PEI
3. 将稀释的PEI转移至含有稀释的DNA的管中并混合。
4. 根据制造商的说明书，孵育最终混合物。
5. 从生物反应器中取出正确体积，将混合物转移至所述生物反应器中。
所得的结果显示在表35中，其显示在Bio1和Bio2中获得的物理颗粒和病毒滴度，并且在第三列中显示通过使用90ng/cm2表面积的总量的多质粒DNA进行转染，在指示运行次数(“n”)中获得的相同参数值的培养基。
表35：在转染中使用最小DNA总量的方法的结果
* n是进行运行的次数。
结果显示，通过将转染中的多质粒DNA的总量减少至60 ng/cm2和45 ng/cm2，基本保持了在物理颗粒方面的生产率。使用60 ng/cm2或45 ng/cm2的多质粒DNA观察到病毒滴度稍有降低，但获得的数据仍然显示了良好水平的感染性病毒颗粒，令人惊讶的是，其与在实施例2.3中对运行PDE_B18197 Bio1和PDE_B18197 Bio2中观察到的感染性病毒颗粒相当，其中使用181 ng/cm2表面积进行转染，并且观察到的TU/cm2分别是2.2E+06和1.7E+06 (如表23中所示)。

Claims (16)

1.一种用于在填充床生物反应器中制造慢病毒载体的方法，其包括以下步骤：
a. 接种细胞，
b. 培养细胞以扩增至少一天，
c. 使用总量在45 ng/cm2至100 ng/cm2填充床表面积的多质粒DNA，和PEI转染试剂转染所述细胞，
d. 收获含有重组慢病毒载体的细胞培养上清液。
2.根据权利要求1的方法，其进一步包括在转染结束时的培养基更换，其中这个培养基更换以灌注模式或以分批模式进行。
3.根据权利要求2的方法，其中通过从生物反应器排出含有DNA转染颗粒的细胞培养基并且向细胞培养物添加新鲜培养基，进行分批模式的培养基更换。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述细胞培养上清液的收获以灌注模式进行。
5.根据权利要求3的方法，其包含添加新鲜培养基后，立即通过以灌注模式从所述生物反应器收获细胞培养基，开始重组慢病毒载体的收集。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中对所述细胞转染长达18小时的时段。
7.根据权利要求4或5中任一项的方法，其中灌注模式的收获在转染后的培养基更换之后进行至少39小时。
8.根据权利要求4或5中任一项的方法，其中灌注模式的收获在转染后的培养基更换之后进行39小时。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，进一步包括在培养扩增的步骤(b)和转染的步骤(c)之间的培养基完全更换。
10.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中通过以至少0.1 ml/cm2填充床表面积的总量，在所述生物反应器中提供新鲜培养基至扩增阶段结束，以灌注模式培养细胞以扩增。
11.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中使用至少0.1 ml/cm2填充床的总量的新鲜培养基作为储库，以再循环模式培养细胞以扩增。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中转染步骤(c)在不存在新鲜培养基的灌注或再循环的情况下进行。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使用对应于1:1的DNA量与PEI量之间的比率进行转染。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(c)，对所述细胞转染8小时的时段。
15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞选自HEK293、HEK293 T、HEK293E、HEK 293FT、293 Vec、TE671、HT1080或HeLa细胞系。
16.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述多质粒DNA由如下构成：一个携带慢病毒gag/pol基因的质粒，一个携带慢病毒rev基因的质粒，一个携带编码包膜蛋白的基因的质粒，和一个携带转化载体的质粒，所述转化载体包括所需的慢病毒基因组部分和外源目的基因。
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