CN105039411B - 附着型慢病毒载体、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种附着型慢病毒载体、制备方法及应用，属于生物技术领域。本发明中附着型慢病毒载体由pLRZM载体与包装系统共同转染宿主细胞获得，pLRZM载体为pLVX‑IRES‑ZsGreen1载体中土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件替换为人源性MAR序列或其95％以上同源序列所得，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件序列如SEQ ID NO.2所示，人源性MAR序列如SEQ ID NO.3中第14～2161位碱基所示。该附着型慢病毒载体附着于宿主细胞染色体上，而非整合到宿主细胞染色体中，并且能够介导外源基因在哺乳动物细胞中稳定、高效、持久的表达，可用于基因治疗，具有广阔的市场前景。

Description

附着型慢病毒载体、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种附着型慢病毒载体，以及该附着型慢病毒载体的制备方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

随着对疾病分子机制认识的加深及生物技术的发展，基因治疗已成为治疗疾病的一种新途径，治疗的疾病也从遗传病扩展到感染性疾病、神经系统疾病以及肿瘤等。目前，用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。慢病毒载体是一种特殊的逆转录病毒，与常用的逆转录病毒载体、腺病毒载体相比，不仅能感染分裂期细胞，还能感染非分裂期细胞(如神经细胞、造血干细胞、肌纤维细胞和肝细胞等)，并且具有容纳大片段外源性目的基因、不易诱发宿主免疫反应(免疫反应小、安全性好)等优点。慢病毒载体在基因治疗中具有广泛的应用前景，已成为当前基因治疗载体研究的热点。

典型的慢病毒载体系统为HIV-载体系统，由包装成分和载体成分两部分组成。包装成分由HIV-1基因组除去包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

从慢病毒载体诞生至今，其安全性、滴度及转导能力等均有较大改进。第一代慢病毒载体系统以三质粒系统为代表，由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。包装质粒是HIV-1前病毒基因组5’端LTR由巨细胞病毒早期启动子取代，3’端LTR由SV40 polyA序列取代。包装成分分别构建在两个质粒上，一个表达gag和pol，另一个表达env。包膜质粒采用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)替代原病毒的env基因。载体质粒携带5’端LTR和全部5’端非翻译区域，另外还带有rev应答元件(RRE)。第二代慢病毒载体系统在第一代的基础上作出改进，即在包装质粒中删除HIV的所有辅助基因(如vif、vpr、vpu和nef基因)，在增加载体安全性的同时不影响病毒的滴度和感染能力。第三代慢病毒载体系统采用四质粒替代原有的三质粒系统，改进之处在于：1)将rev基因单独放在一个包装质粒上；2)增加两个安全特性，一是构建自身失活的慢病毒载体，删除U3区的3’LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即存在所有病毒蛋白也不能转录出RNA，二是采用异源启动子序列替代tat基因，仅保留原始HIV-1基因组中的gag、pol和rev。因此，第三代慢病毒载体系统更加安全、可靠。

虽然慢病毒载体的安全性、滴度及转导能力等均有所提高，但也存在以下问题，即现有载体必须整合到宿主细胞染色体上，而载体的随机整合会引起插入突变或导致转基因的沉默，严重影响载体在基因治疗中的应用。公告号CN101532031B的发明专利公开了一种非整合慢病毒载体系统，由pLVTH载体、pHelper 1.0载体和pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞后，在宿主细胞中包装获得，其中pHelper 1.0载体为pCMV-dR8.2dvpr载体中HIV整合酶基因编码的HIV整合酶第257～259位氨基酸由IKV突变为AAH获得，该载体系统能够克服随机整合的缺点，但其持久稳定表达时间较短，15天左右表达目的基因的细胞个数较常规病毒减少70～80％。因此，构建高效安全的慢病毒载体是基因治疗中亟待解决的问题。

核基质附着区(matrix attachment region，MAR)是指经限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列，长度为200～2000bp，具有典型的结构特点(没有同源序列)，如富含AT碱基对(＞70％)，含有几个短的“共有序列”和拓朴异构酶Ⅱ结合位点。MAR序列在哺乳动物细胞转基因表达调控中起重要作用：1)提供顺式作用元件，具有复制起始点和启动子功能；2)避免表观沉默，提高载体的转基因表达水平。然而，尚未有MAR序列用于介导慢病毒载体附着存在的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种附着型慢病毒载体，一方面介导外源基因在哺乳动物细胞中稳定、高效、持久的表达，另一方面附着的、而非整合到靶细胞基因组中，安全性能好。

同时，本发明还提供一种附着型慢病毒载体的制备方法。

最后，本发明再提供一种附着型慢病毒载体的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

附着型慢病毒载体，由pLRZM载体与包装系统共同转染宿主细胞获得，所述pLRZM载体为pLVX-IRES-ZsGreen1载体(图谱见图1)中土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE)替换为人源性MAR序列或其95％以上同源序列所得。土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件序列如SEQID NO.2所示，也即pLVX-IRES-ZsGreen1载体序列(Cat.Nos.632187)中第4126～4717位碱基；人源性MAR序列为GenBank登录号为M83137.1序列(如SEQ ID NO.3所示)中第14～2161位碱基。

所述宿主细胞为HEK293T细胞，包装系统为pHelper1.0和pHelper2.0，pLRZM载体在宿主细胞中包装得到附着型慢病毒载体。

上述附着型慢病毒载体的制备方法，步骤如下：

1)分别采用PacI和XmaI双酶切人工合成序列A及pLVX-IRES-ZsGreen1载体，回收并连接，得到pLVX-IRES-ZsGreen2载体；

2)以人外周血基因组DNA为模板，利用引物P1、P2扩增人源性MAR序列得扩增产物A；

3)分别采用PacI和XmaI双酶切扩增产物A及pLVX-IRES-ZsGreen2载体，回收并连接，得到pLRZM载体；

4)采用pLRZM载体、包装系统共同转染宿主细胞，培养得到含附着型慢病毒载体的细胞培养液，分离、纯化得到附着型慢病毒载体。

步骤1)中人工合成序列A的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤2)中引物P1、P2为：

P1：5’-CCGTTAATTTATCGCCACGCACAAGATC-3’，

P2：5’-CAACCCGGGCTATCAAGATATTTAAAGAAAAAAAAATTGTATCA-3’，

下划线处为酶切位点，其中P1含有PacI酶切位点，P2含有XmaI酶切位点。

步骤2)中扩增产物A的碱基序列与GenBank登录号为M83137.1的人源性MAR序列一致(见SEQ ID NO.3中第14～2161位碱基)。

步骤4)中宿主细胞为HEK293T细胞，包装系统为pHelper1.0和pHelper2.0。

上述附着型慢病毒载体的应用，具体为：将外源基因插入附着型慢病毒载体的多克隆酶切位点中，与包装系统共同转染宿主细胞，得到插入有外源基因的附着型慢病毒载体，再转染靶细胞，即可。

所述宿主细胞为HEK293T细胞，包装系统为pHelper1.0和pHelper2.0。插入有外源基因的附着型慢病毒载体在宿主细胞中包装成病毒颗粒后即可用于转染靶细胞(如哺乳动物细胞)。

具体的，附着型慢病毒载体的应用，步骤如下：

1)以人基因组DNA为模板，利用引物P3、P4扩增miR-145序列得扩增产物B；

2)分别采用XhoI和BamHI双酶切扩增产物B及附着型慢病毒载体，回收并连接，得到pLRZM-miR145载体；

3)采用pLRZM-miR145载体、包装系统共同转染宿主细胞，培养后分离、纯化得到含miR-145序列的附着型慢病毒载体。

步骤1)中所述引物P3、P4为：

P3：5’-CCGCTCGAGGAATGGTTGGTTTAAATCCACCC-3’，

P4：5’-CCGGGATCCCATGCCTGATGGTGTCCTG-3’，

下划线处为酶切位点，其中P3含有XhoI酶切位点，P4含有BamHI酶切位点。

步骤1)中扩增产物B的碱基序列与Genbank登录号为GQ292874.1的人miR-145前体序列一致(见SEQ ID NO.6中第1357～2001位碱基)。

步骤3)中宿主细胞为HEK293T细胞，包装系统为pHelper1.0和pHelper2.0。

本发明的有益效果：

本发明中pLRZM载体含有核基质附着区序列，将该载体与包装系统共同转染宿主细胞后，即在宿主细胞中包装获得附着型慢病毒载体。该附着型慢病毒载体附着于宿主细胞染色体上，而非整合到宿主细胞染色体中，并且能够介导外源基因在哺乳动物细胞中稳定、高效、持久的表达，可用于基因治疗，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为pLVX-IRES-ZsGreen1载体的图谱；

图2为pLVX-IRES-ZsGreen2载体的结构示意图；

图3为pLRZM载体的结构示意图；

图4为附着型慢病毒液滴度测定结果；

图5为用慢病毒感染ECA109靶细胞ZsGreen1基因表达；

图6为转染质粒、还原质粒与转染前质粒的酶切结果；

图7为荧光原位杂交实验结果；

图8为pLRZM-miR145载体的结构示意图；

图9为荧光定量PCR检测miR-145基因在转染细胞中的表达；

图10为miR-145对ECA109细胞增殖的影响；

图11为miR-145对ECA109细胞凋亡的影响。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

附着型慢病毒载体的构建：

1、构建pLVX-IRES-ZsGreen2载体

(1)人工合成序列A

根据pLVX-IRES-ZsGreen1序列(Cat.Nos.632187)，设计并合成A序列(如SEQ IDNO.1所示，由通用生物系统(安徽)有限公司合成)，序列A中引入有PacI酶切位点(TTAATTTA)和XmaI酶切位点(CCCGGG)。

(2)构建pLVX-IRES-ZsGreen2载体

使用BsrGI和Bsu36I酶切人工合成序列A及pLVX-IRES-ZsGreen1质粒。采用常规的酶切方法和琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收A序列DNA片段及载体并连接。

序列A酶切体系如下表1所示，充分混匀后，在37℃条件下水浴6h。

表1 序列A酶切体系

pLVX-IRES-ZsGreen1载体酶切体系如下表2所示，充分混匀后，在37℃条件下水浴6h。

表2 pLVX-IRES-ZsGreen1载体酶切体系

连接体系如下表3所示，充分混合均匀，16℃连接反应12小时。

表3 连接体系

将感受态细胞置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μL连接产物加入感受态细胞中，于冰上(4℃)放置30min，之后置于42℃水浴中热击90s，再迅速置于冰上(4℃)放置2.5min(2～3min均可)。加入500μL不含抗生素的SOC培养基，于37℃、225rpm振荡培养45min。3000转/min离心2min，弃掉上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有氨苄的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。用新鲜菌液2.5μL(2～3μL均可)进行菌液PCR初步鉴定。在初步鉴定为阳性的样品中挑选两个单克隆送测序公司进行测序鉴定。将序列完全正确的载体命名为pLVX-IRES-ZsGreen2(WPRE序列两端插入PacI及XmaI)，结构示意图见图2。

2、PCR扩增MAR序列

根据人源性MAR序列(GenBank登录号为M83137.1，如SEQ ID NO.3所示)，设计并合成引物P1和P2，引物序列如下：

P1：5’-CCGTTAATTTATCGCCACGCACAAGATC-3’(如SEQ ID NO.4所示)，

P2：5’-CAACCCGGGCTATCAAGATATTTAAAGAAAAAAAAATTGTATCA-3’(如SEQ ID NO.5所示)，

下划线处为酶切位点，其中P1含有PacI酶切位点，P2含有XmaI酶切位点。

用基因组DNA快速提取试剂盒提取人外周血基因组DNA，使用引物P1和P2扩增MAR序列，扩增反应体系如下表4所示。

表4 扩增反应体系

扩增反应程序为：95℃预变性5min，94℃40s，55℃30s，72℃40s，30个循环，最后72℃延伸5min。反应结束后取10μL反应产物于1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测。用琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，并送生物公司测序验证，结果表明扩增出的DNA片段与报道的MAR序列完全一致(如SEQ ID NO.2中第14～2161位碱基所示)。

3、构建pLRZM载体

用PacI及XmaI双酶切验证正确的MAR序列PCR扩增产物，同时用PacI及XmaI双酶切pLVX-IRES-ZsGreen2载体，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收MAR序列DNA片段及载体并连接。

MAR序列双酶切的酶切体系如下表5所示，充分混匀后，在37℃条件下水浴6h。

表5 MAR序列双酶切的酶切体系

pLVX-IRES-ZsGreen2载体的酶切体系如下表6所示，充分混匀后，在37℃条件下水浴6h。

表6 pLVX-IRES-ZsGreen2载体的酶切体系

连接体系如下表7所示，充分混合均匀，16℃连接反应12小时。

表7 连接体系

将感受态细胞置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μL连接产物加入感受态细胞中，于冰上(4℃)放置30min，之后置于42℃水浴中热击90s，再迅速置于冰上(4℃)放置2.5min(2～3min均可)。加入500μL不含抗生素的SOC培养基，于37℃、225rpm振荡培养45min。3000转/min离心2min，弃掉上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有氨苄的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。用新鲜菌液2.5μL(2～3μL均可)进行菌液PCR初步鉴定。在初步鉴定为阳性的样品中挑选两个单克隆送测序公司进行测序鉴定。每个克隆挑选两个送测序公司进行测序鉴定，将序列完全正确的载体命名为pLRZM，结构示意图见图3。

4、pLRZM载体的包装

(1)HEK 293T细胞培养

慢病毒的包装细胞HEK 293T细胞为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。生长条件为37℃、5％CO₂，贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

(2)质粒提取

取构建成功的pLRZM载体，采用Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取质粒DNA，并溶于无菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，所提质粒DNA的A260/A280为1.9(1.8～2.0均可)。

(3)pLRZM载体的包装

常规培养293T细胞，用胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，以含10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为1.0×10⁶/ml，重新接种于10cm培养皿中。当细胞长至75％融合密度(70～80％均可)时准备转染。转染前1.5h(1～2h均可)将需要转染的细胞换新鲜的培养基，12mL/10cm皿。向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(重组pLRZM载体20μg，pHelper1.0载体15μg，pHelper2.0载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5min。另取100μL lipofectamine2000试剂在另一管中与2.4mlOpti-MEM混合，在室温下温育5min。把稀释后的DNA与lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，在室温下温育20min，以便形成DNA-lipofectamine2000稀释液的转染复合物。将DNA-lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，轻轻混匀，于室温下放置18min(15～20min均可)，再均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于CO₂培养箱中培养。转染11h(10～12h均可)后，均匀滴加100×Enhancing buffer促进转染，120μL/皿。转染19h(18～20h均可)后，小心吸掉细胞培养液并弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15mL新鲜的细胞培养基继续培养。换液48h后，吸取细胞上清液于50mL离心管中，4℃、4500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到浓缩装置中，4℃、4500g离心10min，弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中，最后一次4℃、4500g离心20min，此时滤器上层的液体即为含附着型慢病毒载体的浓缩液(也即慢病毒液)。将慢病毒液以45μL/管分装(40～50μL/管均可)，于-80℃保存。

(4)附着型慢病毒载体的滴度测定

将HEK 293T细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为含10％FBS的细胞培养基。第一天：细胞胰酶消化计数后，按照每孔8000细胞接种96孔板，37℃培养过夜，感染时细胞长至40％融合密度(30～50％均可)；第二天：当天转染时，将保存于-80℃的病毒浓缩液冰浴融化，用含有10％FBS的细胞培养基进行梯度稀释。

1号稀释液：10μL病毒浓缩液+90μL病毒稀释用培养基；

2号稀释液：10μL 1号稀释液+90μL病毒稀释用培养基；

3号稀释液：10μL 2号稀释液+90μL病毒稀释用培养基；

4号稀释液：10μL 3号稀释液+90μL病毒稀释用培养基；

5号稀释液：10μL 4号稀释液+90μL病毒稀释用培养基。

选取所需的细胞孔，吸去90μL培养基，丢弃，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，取90μL加入每孔细胞中，放入37℃的细胞培养箱中过夜培养；第三天：去除含慢病毒的培养基，加入100μL完全培养基；第五、六天：在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应的稀释倍数。六号孔中观察到表达绿色荧光的细胞为20个，即病毒的滴度为：20TU/(10×10^-8)mL＝2×10⁸TU/mL。感染图片见图4，图中A为一号孔，含有10×10^-3mL慢病毒液，B为六号孔，含有10×10^-8mL慢病毒液。

试验例

1、附着型慢病毒载体感染靶细胞基因表达

(1)ECA109细胞培养

ECA109细胞生长培养基为RPMI 1640(含10％FBS)，生长条件为37℃、5％CO₂。

(2)慢病毒感染靶细胞

第一天：以4×10⁴ cells/孔的密度接种靶细胞于3.5cm培养皿中(两组，对照组和处理组)。第二天：感染前，从-80℃冰箱中取出慢病毒液，冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按感染复数(MOI)30稀释病毒原液，吸除原有的培养基，含有pLRZM慢病毒液稀释液加到处理组细胞中。第四天：更换培养液，在感染48小时后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液。第六天：感染效率检测，在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。

(3)流式细胞仪检测

通过荧光显微镜观察荧光细胞数及荧光强度，并摄片。结果显示，ZsGreen1基因在宿主细胞ECA109中高效表达(见图5，图中A为荧光显微照片，B为流式分析ZsGreen1基因表达)。

2、慢病毒载体附着状态的验证

质粒还原试验：

(1)利用Hirt裂解法提取pLRZM慢病毒载体感染的靶细胞中的附着体质粒：向收集的细胞中加入Hirt裂解缓冲液2mL，室温静置20min，加入1/4体积(0.5mL)的5mol/L NaCl，4℃过夜。次日，15000rpm离心40min，取上清，加RNase A(10mg/mL)125μL，于37℃水浴60min，再用酚氯仿抽提2次，取上清，加入5mL-20℃预冷的异丙醇，置于-20℃过夜。次日，12000rpm离心30min，无水乙醇洗涤2次，空气中干燥后加入10μL洗脱缓冲液溶解附着体质粒。

(2)无菌状态下取新鲜制备的感受态细胞250μL，加入10μL附着体质粒进行转化。复苏时加入37℃预热的SOC溶液800μL，置于37℃摇床250rpm振荡培养2h。取上述转化的菌液300μL，均匀地涂布于整个含50μg/mL Kan+并37℃预热的琼脂平板表面，直至阳性转化子长出。

(3)挑取单克隆细胞，摇菌提取质粒，双酶切体系如下：质粒10μL，10×buffer 1μL，PacI/XmaI各0.5μL，补超纯水至20μL，充分混匀，在37℃水浴6h，而后于1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测。

转染质粒、还原质粒与转染前质粒酶切结果见图6，图中M:DL5000DNA marker，1:转染前质粒，2:转染后质粒，3:转染前质粒PacI/XmaI双酶切，4:还原质粒PacI/XmaI双酶切，M:1kb DNA marker。

荧光原位杂交试验：

(1)培养细胞中期染色体的制备

当细胞系融合达到80％(75～90％均可)时，每5mL培养基细胞中加入40μL秋水仙素，继续培养2h并收集细胞。低渗：加入37℃水浴预热的0.075mol/L KCl溶液10mL，37℃水浴低渗30min，使细胞充分分散悬浮于溶液中。预固定：向离心管中加1.5mL固定液(甲醇:乙酸＝3:1)并用吸管轻轻吹匀，预固定10min。2000rpm离心5min，弃上清液。固定I：沿管壁慢慢加入固定液6mL，用吸管吹打成细胞悬液后，37℃水浴20min。1000rpm离心10min，弃上清液。固定II：操作步骤同固定I，离心后留下上清液0.8mL(0.5～1mL均可)，用吸管吹打成细胞悬液。滴片：用吸管吸取少量细胞悬液，高度35cm(30～40cm均可)，垂直滴在预冷的载玻片上，室温晾干。老化：染色体玻片置于37℃老化5天(1～7天均可)。使用前玻片置于60℃温箱孵育3.5h(3～4h均可)。

(2)荧光原位杂交试验

将4mL(3～5mL均可)变性液置于74±1℃水浴(或杂交仪)平衡至少30min，将玻片浸入杂交液中3min(2～5min均可)。梯度脱水1min。将探针置于PCR仪内变性，程序设为：77℃5min，37℃2min，将变性后的探针Rubber胶封片于玻片上，杂交过夜(12～18h均可)。将玻片置于温度72℃下至少30min，轻轻揭去玻片上的胶。72℃洗涤2min，常温洗涤2min。梯度脱水各1min，脱水后空气中干燥。复染并观察结果：加二氨基苯基吲哚(DAPI)20μL复染，加盖玻片。置于暗处20min，荧光显微镜观察结果并采集图像(见图7)。结果表明，慢病毒载体在ECA109细胞中以低拷贝数附着存在，没有特定的结合位点。

实施例2

附着型慢病毒载体的应用：

(1)miR-145的克隆

根据人的miR-145前体序列(Genbank登录号GQ292874.1，如SEQ ID NO.6所示)设计PCR引物P3和P4，引物序列如下：

P3：5’-CCGCTCGAGGAATGGTTGGTTTAAATCCACCC-3’(如SEQ ID NO.7所示)，

P4：5’-CCGGGATCCCATGCCTGATGGTGTCCTG-3’(如SEQ ID NO.8所示)，

下划线处为酶切位点，其中P3含有XhoI酶切位点，P4含有BamHI酶切位点。

利用引物及提取的人基因组DNA模板进行PCR扩增，扩增反应体系如下表8所示，反应程序为：95℃预变性5min，94℃40s，50℃30s，72℃40s，30个循环，最后72℃延伸5min。反应结束后分别取10μL反应产物于1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测，回收目的基因并测序，结果表明扩增产物的序列与已报道序列完全一致(如SEQ ID NO.6中第1357～2001位碱基所示)。

表8 扩增反应体系

(2)构建pLRZM-miR145载体

用XhoI及BamHI双酶切验证正确的miR-145序列PCR扩增产物，同时用PacI及XmaI双酶切实施例1中制备的附着型慢病毒载体，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收miR-145序列DNA片段及载体并连接。

miR-145扩增产物双酶切的酶切体系如下表9所示，充分混匀后，在37℃条件下水浴6h。

表9 miR-145序列双酶切的酶切体系

附着型慢病毒载体的酶切体系如下表10所示，充分混匀后，在37℃条件下水浴6h。

表10 附着型慢病毒载体的酶切体系

连接体系如下表11所示，充分混合均匀，16℃连接反应12小时。

表11 连接体系

将感受态细胞置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μL连接产物加入感受态细胞中，于冰上(4℃)放置30min，之后置于42℃水浴中热击90s，再迅速置于冰上(4℃)放置2.5min(2～3min均可)。加入500μL不含抗生素的SOC培养基，于37℃、225rpm振荡培养45min。3000转/min离心2min，弃掉上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有氨苄的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。用新鲜菌液2.5μL(2～3μL均可)进行菌液PCR初步鉴定。在初步鉴定为阳性的样品中挑选两个单克隆送测序公司进行测序鉴定。每个克隆挑选两个送测序公司进行测序鉴定，将序列完全正确的载体命名为pLRZM-miR145载体，图谱见图8。

(3)pLRZM-miR145载体的包装及病毒液滴度测定

操作基本同实施例1，其中转染体系为：pLRZM-miR145质粒DNA 20μg，pHelper1.0载体15μg，pHelper2.0载体10μg，100μL lipofectamine2000。

(4)miR-145表达的检测

总RNA的提取：第一天：取生长状态良好的细胞分盘，第二天：每10cm²细胞加入1mLTrizol液，采用Trizol常规方法提取总RNA，提取的RNA溶于80μL(50～100μL均可)水中。

miR-145反转录：按下表12中所列组分配制反应液，反应液配制在冰上进行。

表12 反应液组分

37℃孵育60min，85℃孵育5s终止反应，所得到的cDNA保存于-20℃备用。向得到的RT反应液中添加RNase Free dH₂O补足至100μL。

qPCR检测miR-145的表达：通过qPCR检测细胞样品中目的基因和内参基因的表达量，根据qPCR反应曲线得到各样品目的基因和内参基因的Ct值(threshold cycle number，域值循环数)，采用△△Ct的方法进行相对定量。数据分析使用QIAGEN公司RT²ProfilerPCR Array Data Analysis系统。

其中，△△ct＝(待测样品的目的基因的ct平均值-待测样本的内参基因的ct的平均)-(对照样品的目的基因的ct的平均值-对照样本的看家基因的ct的平均值)。基因的表达量F＝2^-△△ct。

所用的miR-145引物P5及内参基因U6引物P6的序列如下：

P5：5’-TCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3’(如SEQ ID NO.9所示)，

P6：5’-TGGAACGATACAGAGAAGATTAGCA-3’(如SEQ ID NO.10所示)。

PCR反应体系为：超纯水7.2μL、2×SYBR Mix 10μL、P5(10μM)0.4μL、Uni-miR qPCR引物(10μM)0.4μL、模板2μL，总体积20μL。

PCR反应条件为：预变性95℃10min，95℃15s，60℃60s，40cycles。

结果证实，miR-145能在ECA109细胞中高效表达(见图9)。

(5)细胞增殖测定

第一天：准备3个96孔板，在96孔板中接种ECA109，ECA109pLRZM-miR145转导细胞(1000cell/孔)，每种细胞至少3个复孔。将培养板放在培养箱中预培养(37℃，5％CO₂)。21个小时后，取其中一个96孔板，向每孔加入10μL CCK8溶液。其余的96孔板在45h、69h、93h、117h后进行同样的操作。将培养板在培养箱内孵育3小时。用酶标仪测定450nm处的吸光度(若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下，24小时内测定吸光度不会发生变化)。

结果显示，与未感染慢病毒载体组相比，感染组细胞增殖明显下降(见图10)。

(6)细胞凋亡分析

第一天：以4×10⁴cells/孔的密度接种靶细胞于3.5cm的培养皿中，第二天收样。细胞先用不含EDTA的胰酶消化收集，再用预冷的PBS洗涤细胞二次，1000rpm离心5min收集细胞，用1×Binding Buffer重悬细胞，转移100μL细胞悬液于5mL培养管中，再分别加入5μLAnnexin V-PE和10μL 7-ADD染液混匀，室温下避光反应15min，再向每管中加入400μL 1×Binding Buffer，并在1h内进行流式细胞仪检测。

结果显示，miR-145过表达组的细胞凋亡率明显高于对照组(0.14％vs 0.04％，P<0.01，见图11，图中A为未感染miR-145组，B为转导miR-145组)。

上述pLVX-IRES-ZsGreen1载体购自Clontech，pHelper1.0和pHelper2.0购自上海吉凯基因技术公司，限制性内切酶(BsrGI、Bsu36I、PacI、XmaI)购自NEB(New EnglandBiolabs)公司，RNA提取试剂Trizol Reagent、脂质体lipofectamine2000购自Invitrogen公司。DMEM培养基、Opti-MEM养基、胎牛血清和PBS购自Gibco公司。

Claims (6)

1.附着型慢病毒载体，其特征在于：由pLRZM载体与包装系统共同转染宿主细胞获得，所述pLRZM载体为pLVX-IRES-ZsGreen1载体中土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件替换为人源性MAR序列所得；人源性MAR序列如SEQ ID NO.3中第14~2161位碱基所示。

2.根据权利要求1所述的附着型慢病毒载体，其特征在于：所述土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的附着型慢病毒载体，其特征在于：所述宿主细胞为HEK293T细胞，包装系统为pHelper1.0和pHelper2.0。

4.如权利要求1~3中任一项所述的附着型慢病毒载体的制备方法，其特征在于：步骤如下：

1）分别采用PacI和XmaI双酶切人工合成序列A及pLVX-IRES-ZsGreen1载体，回收并连接，得到pLVX-IRES-ZsGreen2载体；

2）以人外周血基因组DNA为模板，利用引物P1、P2扩增人源性MAR序列得扩增产物A；

3）分别采用PacI和XmaI双酶切扩增产物A及pLVX-IRES-ZsGreen2载体，回收并连接，得到pLRZM载体；

4）采用pLRZM载体、包装系统共同转染宿主细胞，培养得到含附着型慢病毒载体的细胞培养液，分离、纯化得到附着型慢病毒载体；

步骤1）中人工合成序列A的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤2）中引物P1、P2为：

P1：5’-CCGTTAATTTATCGCCACGCACAAGATC-3’，

P2：5’-CAACCCGGGCTATCAAGATATTTAAAGAAAAAAAAATTGTATCA-3’。

5.如权利要求1~3中任一项所述的附着型慢病毒载体的应用，其特征在于：将外源基因插入附着型慢病毒载体的多克隆酶切位点中，与包装系统共同转染宿主细胞，得到插入有外源基因的附着型慢病毒载体，再转染靶细胞，即可；所述靶细胞为EAC109。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤如下：

1）以人基因组DNA为模板，利用引物P3、P4扩增miR-145序列得扩增产物B；

2）分别采用XhoI和BamHI双酶切扩增产物B及附着型慢病毒载体，回收并连接，得到pLRZM-miR145载体；

3）采用pLRZM-miR145载体、包装系统共同转染宿主细胞，培养后分离、纯化得到含miR-145序列的附着型慢病毒载体；

步骤1）中所述引物P3、P4为：

P3：5’-CCGCTCGAGGAATGGTTGGTTTAAATCCACCC-3’，

P4：5’-CCGGGATCCCATGCCTGATGGTGTCCTG-3’。