JP2023521337A - レトロウイルス産生のための改変されたベクター - Google Patents

Abstract

本発明は、導入遺伝子発現のために適格であるスプライシングされたベクター転写物の低下した産生を示す核酸モジュール（レトロウイルス導入ベクターやＢＡＣなど）であって、改変プロモーターおよび／または「スプライストラップ」を含み、かつ、治療用導入遺伝子などの非内因性の導入遺伝子も発現する核酸モジュール、および、そのようなモジュールを含むベクター、ならびにそれらの使用および作製方法に関する。

Description

本発明は、導入遺伝子発現のために適格であるスプライシングされたベクター転写物の低下した産生を示す核酸モジュール（レトロウイルス導入ベクターやＢＡＣなど）であって、改変プロモーターおよび／または「スプライストラップ」を含み、かつ、治療用導入遺伝子などの非内因性の導入遺伝子も発現する核酸モジュール、および、そのようなモジュールを含むベクター、ならびにそれらの使用および作製方法に関する。

遺伝子治療において、遺伝物質が、処置を必要としている対象における内因性細胞に送達され、または代替として、単離されたエクスビボ細胞に送達される。遺伝物質により、新規な遺伝子が対象に導入される場合があり、あるいは既存遺伝子のさらなるコピー体が導入される場合があり、あるいは対象に存在する遺伝子の異なる対立遺伝子またはバリアントが導入される場合がある。様々なウイルスベクターシステムが、遺伝子治療における使用のための効果的な遺伝子送達方法として提案されている（ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ、３８９：２３９－２４２）。

特に、これらのウイルスベクターは、その遺伝子ペイロードを宿主のゲノムに組み込むことができるためにレトロウイルス科のウイルスに基づいている。様々なレトロウイルスベクターが、レトロウイルスゲノムのパッケージングおよび送達のために要求される必須タンパク質を保つように設計されており、しかし、疾患プロフィルに関わるタンパク質を含めて必須でないアクセサリータンパク質はどれも除かれている。レトロウイルスベクターの例には、非増殖性細胞に組み込まれることができるので広く使用されているレンチウイルスベクター（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）に基づくベクターなど）が含まれる。

現在、ウイルスベクターの大部分が、ウイルス遺伝子の宿主細胞株（産生者たる細胞株）への一過性同時トランスフェクションによって産生される。ウイルス遺伝子は、プラスミドに留まり、ゲノムには組み込まれないので、限られた期間だけにわたって宿主細胞に存在する細菌プラスミドを使用して導入される。

レンチウイルスベクターからの製造プロセスの大部分が典型的には、産生者たる細胞の一過性トランスフェクションを伴っており、これには、高品質またはＧＭＰ品位のプラスミドが要求され、このため、コストおよび生産スケジュール策定の点で難題が生じている。４つのプラスミドからなるシステムであって、（ｉ）治療用導入遺伝子を含有する移入ベクタープラスミドと、同様に、（ｉｉ）ベクターを産生させるために要求されるウイルス配列、すなわち、エンベロープ糖タンパク質、構造タンパク質、ならびに逆転写およびベクター組込みのために要求される酵素（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｒｅｖ）をコードする３つのプラスミドとからなるシステムが一般に使用されている。これらのプラスミドが産生者たる細胞に一緒に存在するとき、これらのプラスミドは、ウイルス粒子を産生させるために要求されるＲＮＡおよびタンパク質を生じさせる。

代替として、上記で記載されるような３個～４個の別々のプラスミドの使用の代わりに、製造プロセスは、非哺乳動物の複製起点、および少なくとも２５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡを収容する能力を含む核酸ベクターの使用を伴うことができる（例えば、国際公開ＷＯ２０１７／０８９３０７において提供される核酸ベクター（これには、例えば、それに記載される細菌人工染色体（ＢＡＣ）が含まれる）、および／または国際公開ＷＯ２０１７／０８９３０８において提供されるベクターもまた使用することができる）。そのようなベクターは、非哺乳動物の複製起点、および少なくとも２５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡを収容する能力を含んでおり、
ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質、ならびに
ｅｎｖタンパク質またはその機能的代用体
をコードするレトロウイルス核酸配列を含むことを特徴とする。

（治療用）導入遺伝子発現カセットに加えて、移入ベクターゲノムは、ＬＴＲなどのシス作用ウイルスエレメント、ならびに同様にリーダー配列およびパッケージングシグナルを含有しなければならない。このリーダー領域の内部には、保存された主要なスプライスドナーが位置する。この主要なスプライスドナーを下流側のスプライスアクセプター部位と共に使用することによって引き起こされるＲＮＡスプライシングにより、典型的には、効率的なゲノムパッケージングのために要求される完全なシス作用配列を含有しないスプライシングされたベクター転写物が生じ、そのため、この転写物は効率的なパッケージングができない。したがって、感染性ウイルスの状況においてレトロウイルスゲノム調節のためには不可欠であるが、これらのスプライシングされたベクター転写物は要求されず、また、もし産生されるならば、効率的なベクター製造を妨害することがあるかもしれず、しかもなお、その生成を妨げることは、主要なスプライスドナーの周りのＲＮＡ立体配座が改変に敏感であるので、極めて困難であることが判明している。

加えて、導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）の産生者たる細胞における発現は大抵の場合、ＬＴＲを起源とする転写物からであり、多くの場合、例えば、産生者たる細胞に対する細胞毒性作用のために望ましくなく、これも、製造および形質導入プロセスに負の影響を与える可能性がある。

したがって、改善された核酸ベクター、例えば、導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）を発現するレトロウイルス移入ベクター、および、例えば、ＢＡＣ（例えば、上記で記載されるＢＡＣおよび国際公開ＷＯ２０１７／０８９３０７において提供されるＢＡＣなど）、および、例えば、レトロウイルスベクター産生のために不可欠なレトロウイルス遺伝子のすべて、および上記に対処する導入遺伝子を含み、かつ、産生者たる細胞株における導入遺伝子の発現が低下している国際公開ＷＯ２０１７／０８９３０８に記載されるベクターなどが求められている。

そのため、本発明者らは上記の欠点に対処しており、導入遺伝子発現のために適格であるスプライシングされたベクター転写物の産生を低下させる、したがって、産生者たる細胞株における導入遺伝子の発現を低下させる、しかし、形質導入された細胞における導入遺伝子の発現には影響を及ぼすことがない改善されたベクターである核酸ベクターにおける使用のための改善された核酸モジュールを提供している。これは、例えば、より一貫的かつ効率的なベクター製造を可能にするであろうし、また、発現したときには当該細胞にとって問題となり得る導入遺伝子を保持する安定な産生者たる細胞株の産生もまた可能にするであろう。

本発明によって提供される核酸モジュールは、（ｉ）導入遺伝子発現を行わせるプロモーターの内部における改変されたスプライスアクセプター部位であって、そのような改変されたプロモーターが、この位置におけるスプライシングされた転写物の産生を低下させるように、または排除するように機能する、改変されたスプライスアクセプター部位、および／または（ｉｉ）スプライシングを本明細書中に記載されるように導入遺伝子カセットからそらすように仕向けるための１つまたは複数の「スプライストラップ」を含む；これらの改変はそれによって、導入遺伝子の発現を産生者たる細胞において低下させ、または排除する。特に、導入遺伝子が、リボソームによって認識されてタンパク質に翻訳されるＯＲＦであることが典型的である５’ＯＲＦになるであろう位置においてであるが、導入遺伝子カセットへのスプライシングを低下させ、または妨げることによって、導入遺伝子発現のために適格である転写物がより少なく産生されることになり、したがって、より少ない導入遺伝子タンパク質が産生者たる細胞において翻訳されることになる。

したがって、改変されたスプライスアクセプター部位を伴うプロモーターを含み、かつ／または本明細書中に記載されるスプライストラップを含む本発明の核酸モジュールを含むそのような改善された核酸ベクター（例えば、レトロウイルス移入ベクターまたはＢＡＣなど）の使用は、レトロウイルス産生者たる細胞株の作製、移入プラスミドを加えたときのパッケージング細胞株の使用において様々な利点を提供し、また、レトロウイルスの産生（例えば、治療用導入遺伝子を発現するレトロウイルスの産生）を、一過性の産生を改善することを含めて改善する。

したがって、本発明の第１の態様によれば、下記の核酸モジュールが提供される：
少なくとも１つの導入遺伝子をコードする核酸モジュールであって、（ａ）第１のプロモーターで、
（ｉ）シス作用レトロウイルスエレメント（例えば、ＬＴＲなど）、
（ｉｉ）スプライスドナー部位を含むレトロウイルスリーダー配列
をコードするレトロウイルス核酸配列に機能的に連結される第１のプロモーター、
および（ｂ）前記導入遺伝子に機能的に連結される導入遺伝子発現のための第２のプロモーターを含み、ただし、導入遺伝子発現のための前記第２のプロモーターが、（ａ）弱まったスプライスアクセプター部位を含むように改変される、ならびに／あるいは（ｂ）前記第２のプロモーターが、前記プロモーターの上流側および／または下流側に配置されるスプライストラップ配列を有し、前記スプライストラップ配列により、その位置におけるスプライシングが低下させられる、または排除される、核酸モジュール。

本発明はまた、本発明のモジュールを含む核酸ベクター、例えば、プラスミド（例えば、ゲノムをコードする移入プラスミドなど）または細菌人工染色体（ＢＡＣ）などを提供する。

本発明のモジュールを含む核酸ベクターを作製する方法であって、下記のレトロウイルス核酸配列：
シス作用ウイルスエレメント（例えば、ＬＴＲなど）、リーダー配列およびパッケージングシグナル、導入遺伝子発現のためのプロモーターであって、前記導入遺伝子（１つまたは複数）に機能的に連結されるプロモーター、ならびに同様に、必要な場合には、ｇａｇタンパク質、ｐｏｌタンパク質およびｅｎｖタンパク質（またはその機能的代用体）をコードするレトロウイルス核酸配列、ならびに同様に、非哺乳動物の複製起点を含む核酸ベクター、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、移入ベクターなど）またはＢＡＣ（例えば、国際公開ＷＯ２０１７／０８９３０７に記載されるＢＡＣなど）を得ること、その後、（ｉ）導入遺伝子発現のためのプロモーターを、スプライスアクセプター部位を（全体または一部において）欠失することによって改変して、または導入遺伝子発現のためのプロモーターを、例えば、挿入変異、欠失変異または置換変異によって改変して、その結果、導入遺伝子発現のためのプロモーターは、スプライスアクセプターとしての機能が低下しており、または排除されており、それによって、この位置におけるスプライシングが低下するように、または排除されるようにする工程、ならびに／あるいは（ｉｉ）前記ベクターに「スプライストラップ」を挿入して、その結果、「スプライストラップ」が導入遺伝子の上流側および／または下流側に配置される、あるいは主要なスプライスドナーと、導入遺伝子カセット転写開始部位との間に配置される、あるいは主要なスプライスドナーと、ポリアデニル化部位との間に配置されるようにする工程を実施することを含む方法もまた本発明によって提供される。

本発明のさらなる態様によれば、複製欠損レトロウイルスベクター粒子を産生させる方法における使用のための本明細書中で定義されるようなモジュールを含む核酸ベクターが提供される。

本発明のさらなる態様によれば、複製欠損レトロウイルスベクター粒子、例えば、導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子など）を発現する複製欠損レトロウイルスベクター粒子を産生させる方法であって、下記の工程：
（ａ）本発明のモジュールを含む核酸ベクター（例えば、本明細書中に記載されるような改変されたベクターまたは改変されたＢＡＣのいずれかなど）を宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞など）の培養物に導入する工程、および
（ｂ）前記宿主細胞を、前記複製欠損レトロウイルスベクター粒子が産生される条件のもとで培養する工程、および
（ｃ）前記複製欠損レトロウイルスベクター粒子を前記細胞から単離する工程
を含む方法もまた提供される。

上記で記載されるような単離されるそのような複製欠損レトロウイルスベクター粒子はその後、例えば、精製されることおよび／または配合されること、例えば、エクスビボ細胞形質導入のために精製されること、および／またはそのための好適な賦形剤と配合されること、あるいは、例えば、配合されること、例えば、対象（例えば、その必要性のあるヒト対象）に投与するための好適な医薬用賦形剤と配合されることが可能である。

本発明のさらなる態様によれば、本明細書中で定義されるような本発明の方法によって得ることができる、または得られる複製欠損レトロウイルスベクター粒子、およびその使用が提供される。

本発明のベクターおよびモジュールおよび形質導入細胞を含む医薬組成物もまた本発明によって提供される。

さらに本発明のさらなる態様によれば、哺乳動物宿主細胞の培養物に組み込まれる、本発明のモジュールを含む核酸ベクター（例えば、本明細書中に記載されるような改変されたベクターまたは改変されたＢＡＣなど）を含む細胞株が提供される。

スプライス部位コンセンサスマップ（Ｂｒｅｎｔ＆Ｇｕｉｇｏ、２００４：Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４（３）、２６４－２７２から得られる）を示す。 （図２（ａ）および図２（ｂ））：ヒトＰＧＫプロモーター内に位置する隠れたスプライスアクセプター部位の変異誘発であって、そのスプライスアクセプター活性が排除されるような変異誘発を例示する。パネルａ）は、隠れたスプライスアクセプター部位を含有するＰＧＫプロモーターの３’末端においてＢｓｐＥ１－ＥｃｏＲＩフラグメントを置換するために一緒にアニーリングされたオリゴヌクレオチドの配列を示す。配列は５’側から３’側へである。アニーリングして一緒になるように設計されるヌクレオチドが大文字であり、一方、突出部を生じさせるヌクレオチドが小文字である。パネルｂ）は、ＢｍｏｄＴ－ＰＧＷ（上側）と、ＢｍｏｄＴ－ＰＧＫｎｏＳＡＧＷ（下側）との間における標的化領域の注釈付きアラインメントを示す。 （図３ａ～図３ｃ）：ＰＧＫプロモーターの隠れたスプライスアクセプターを欠失することの導入遺伝子発現および力価に対する影響を明らかにする。ａ）は、ＷＴ型ＰＧＫおよびＰＧＫｎｏＳＡに関する蛍光顕微鏡観察を示す（３つの反復物が示される）。ｂ）は、トランスフェクション細胞および形質導入細胞（それぞれ、ＷＴ ＰＧＫ型、およびＰＧＫｎｏＳＡ型のプラスミド構築物、ならびにレンチウイルスベクター）における蛍光強度を示す。ｃ）はトランスフェクション効力および力価を示す（ＷＴ ＰＧＫ、およびＰＧＫｎｏＳＡ）。図中、ＰＧＫｎｏＳＡはＰＧＫΔｓａとして示されることに留意すること（これら２つの用語は交換可能に使用される）。３つの反復物を示す３つのデータ点が示される。 主要なスプライスドナーからの導入遺伝子へのスプライシングを低下させるための代替方策としてのスプライストラップの設計および試験を例示し、下記のことを示す：（ａ）ＳＴ１、（ｂ）ＳＴ１～ＳＴ６の配列、（ｃ）導入遺伝子発現に対するスプライストラップの影響を示す。 スプライストラップ（ＳＴ１～ＳＴ６）についてのＭａｘＥｎｔＳｃａｎスプライスアクセプタースコアを示す。 ＥＬＩＳＡアッセイの使用によって求められるような、ｗｔＰＧＫ型およびＰＧＫｎｏＳＡ２型のＢＡＣ ＤＮＡ構築物を使用して生じる安定なプールのＰ２４力価（ｐｇ／ｍＬ）の比較を示す。 デジタルドロップレットＰＣＲによって求められるような、ｗｔＰＧＫ型およびＰＧＫｎｏＳＡ２型のＢＡＣ ＤＮＡ構築物を使用して生じる安定なクローンにおけるＢＡＣ ＤＮＡモジュール（移入ＤＮＡモジュール：ＨＩＶを含む）のコピー数を示す。 ＥＬＩＳＡアッセイの使用によって求められるような、ＰＧＫｎｏＳＡ２型およびＰＧＫｎｏＳＡ２型のＢＡＣ ＤＮＡ構築物を使用して生じる安定なプールのＰ２４力価（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 ＳｕｐＴ１細胞を形質導入すること、およびデジタルドロップレットＰＣＲによる定量化によって求められる、ｗｔＰＧＫ型およびＰＧＫｎｏＳＡ２型のＢＡＣ ＤＮＡ構築物を使用して生じる安定なクローンの感染力価（ＴＵ／ｍＬ）を示す。 実施例４の移入ベクター構築物におけるエレメントの配置を示す。 ＰＧＷ型およびＳＴ＃－ＰＧＷ型のレンチウイルス移入ベクター設計－実施例３で使用されるレンチウイルスベクターに存在するエレメントの配置を示す。ＳＴ＃－は、試験されたスプライストラップ番号を示す。

発明の具体的説明

定義
別途定義される場合を除き、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で参照されるすべての特許および刊行物はそれらの全体が参照によって組み込まれる。

用語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”（含む）は、“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”（包含する）または“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ”（からなる）を包含しており、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなる場合があり、または何か追加のものを包含する場合がある（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

用語“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ”（から本質的になる）は、特徴の範囲を、指定された材料または工程、および実質的な影響を主張された特徴の基本的特性（１つまたは複数）に及ぼさない材料または工程に限定する。

用語“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ”（からなる）は、どのような成分であれ追加の成分（１つまたは複数）が存在することを除外する。

数値ｘに関連しての用語「約」は、例えば、ｘ±１０％、ｘ±５％、ｘ±２％、またはｘ±１％を意味する。

用語「ベクター」または用語「核酸ベクター」は、外来の（すなわち、外因性の）遺伝物質を、その複製および／または発現が可能である別の細胞の中に人為的に運ぶことができるビヒクルを示す。ベクターの例には、非哺乳動物核酸ベクター、例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、コスミドまたはフォスミドなどが含まれる。

ベクターの他の例には、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターおよび同様にレンチウイルスベクターなどが含まれ、これらは本発明において特に対象となる。

本発明の第１の態様によれば、下記の核酸モジュールが提供される：
少なくとも１つの導入遺伝子をコードする核酸モジュールであって、（ａ）第１のプロモーターで、
（ｉ）シス作用レトロウイルスエレメント（例えば、ＬＴＲなど）、
（ｉｉ）スプライスドナー部位を含むレトロウイルスリーダー配列
をコードするレトロウイルス核酸配列に機能的に連結される第１のプロモーター、
および（ｂ）前記導入遺伝子に機能的に連結される導入遺伝子発現のための第２のプロモーターを含み、ただし、導入遺伝子発現のための前記第２のプロモーターが、（ａ）弱まったスプライスアクセプター部位を含むように改変される、ならびに／あるいは（ｂ）前記第２のプロモーターが、前記プロモーターの上流側および／または下流側に配置されるスプライストラップ配列を有し、前記スプライストラップ配列により、その位置におけるスプライシングが低下させられる、または排除される、核酸モジュール。

本発明はまた、本発明のモジュールを含む核酸ベクター、例えば、プラスミドまたは細菌人工染色体（ＢＡＣ）などを提供する。

レトロウイルス：
レトロウイルスは、二倍体一本鎖ＲＮＡゲノムを含有するウイルスの一群である。レトロウイルスは、宿主細胞ＤＮＡに後で挿入され得るＤＮＡをＲＮＡゲノムから産生する逆転写酵素をコードする。

本明細書中に記載される本発明は、複製欠損レトロウイルスベクター粒子（例えば、複製欠損レンチウイルスなど）を含めたレトロウイルスベクター粒子（例えば、レンチウイルスなど）を産生させるために使用される場合がある。

本発明のレトロウイルス核酸配列は、どのようなレトロウイルスであれ好適なレトロウイルスから選択される場合があり、またはどのようなレトロウイルスであれ好適なレトロウイルスに由来する場合がある。

１つの実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルス、アルファ－レトロウイルス、ガンマ－レトロウイルスまたはフォーミーレトロウイルスに由来し、例えば、レンチウイルスまたはガンマ－レトロウイルスなどに由来し、特にレンチウイルスに由来し、あるいはレンチウイルス、アルファ－レトロウイルス、ガンマ－レトロウイルスまたはフォーミーレトロウイルスから選択され、例えば、レンチウイルスまたはガンマ－レトロウイルスなどから選択され、特にレンチウイルスから選択される。

さらなる実施形態において、レトロウイルスは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶおよびＶｉｓｎａからなる群から選択されるレンチウイルスである。レンチウイルスは非分裂性（すなわち、休止）細胞に感染することができ、このため、レンチウイルスは、遺伝子治療のための魅力的なレトロウイルスベクターとなっている。さらにさらなる実施形態において、レトロウイルスはＨＩＶ－１であり、またはＨＩＶ－１に由来する。いくつかのレトロウイルスのゲノム構造がこの技術分野において見出され得る。例えば、ＨＩＶ－１に関する詳細が、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（ゲノムアクセション番号ＡＦ０３３８１９）から見出され得る。ＨＩＶ－１は、最もよく理解されているレトロウイルスの１つであり、そのため、レトロウイルスベクターとして使用されることが多い。

レトロウイルス配列：
すべてのレトロウイルスに共通する核酸配列がより詳しくは、下記のように説明される場合がある：
長末端反復（ＬＴＲ）：レトロウイルスゲノムの基本的構造は５’－ＬＴＲおよび３’－ＬＴＲを含み、それらの間または内部に、レトロウイルス産生のために要求される遺伝子が位置する。これらのＬＴＲはレトロウイルスの組込みおよび転写のために要求される。それらはまた、レトロウイルス遺伝子の発現を制御するためにプロモーター配列として働くことができる（すなわち、それらはシス作用配列である）。ＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、Ｕ５と呼ばれる３つのサブ領域から構成される：Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に特有な配列に由来し、Ｒは、ＲＮＡの両末端において繰り返される配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に特有な配列に由来する。したがって、１つの実施形態において、核酸ベクターは追加として、５’－ＬＴＲおよび３’－ＬＴＲを含む。さらなる実施形態において、３’側ＬＴＲのＵ５領域は欠失させ、ＨＩＶ－１非由来のポリＡテールにより置換することが可能である（Ｈａｎａｗａ他（２００２）、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５（３）：２４２－５１を参照のこと）。

本発明の１つの実施形態において、本発明の核酸ベクターに存在するＬＴＲは、（ＳＩＮ ＬＴＲと称される）自己不活性化ＬＴＲであることが可能である。

本発明のさらなる実施形態において、本発明の核酸モジュールはまた、ｇａｇタンパク質、ｐｏｌタンパク質およびｅｎｖタンパク質（またはその機能的代用体）をコードするレトロウイルス核酸配列を含めて追加のレトロウイルス核酸配列、シス作用配列（例えば、ｃＰＰＴ（中央ポリプリン域）およびＲＲＥ（ｒｅｖ応答エレメント）をコードするシス作用配列など）を、これらの存在によりウイルス力価がさらに増大することになるので含むことができる。

複製能を有するウイルスが生じることに関する安全上の懸念に対処するために、自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターが、ＴＡＴＡボックスと、転写因子のＳｐ１およびＮＦ－κＢのための結合部位とが含まれる３’側ＬＴＲのＵ３領域内の部分を欠失することによって開発されている（Ｍｉｙｏｓｈｉ他（１９９８）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１０）：８１５０－７を参照のこと）。この欠失は感染細胞における逆転写および組込みの後で５’側ＬＴＲに移され、その結果、ＬＴＲの転写不活性化が生じる。これは、本発明において含まれることがある自己不活性化レンチウイルス型ベクターシステムとして知られている。

Ψ：レトロウイルスＲＮＡのカプシド形成が、レトロウイルスゲノムの５’末端に位置するΨ（プサイ）配列によって生じる。プサイ配列の下流側にあり、ｇａｇコード領域内にまで広がる配列が、効率的なレトロウイルスベクター産生に関与していることも、この技術分野では広く知られている（Ｃｕｉ他（１９９９）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（７）：６１７１－６１７６を参照のこと）。１つの実施形態において、核酸ベクターは追加として、Ψ（プサイ）配列を含む。

プライマー結合部位（ＰＢＳ）：レトロウイルスゲノムは、５’－ＬＴＲのＵ５領域の後に存在するＰＢＳを含有する。この部位は、逆転写の開始のために要求されるｔＲＮＡプライマーに結合する。１つの実施形態において、核酸ベクターは追加として、ＰＢＳ配列を含む。

ＰＰＴ：レトロウイルスゲノムは、ポリプリン域（ＰＰＴ）と呼ばれるプリン塩基の短い区域をレトロウイルスゲノムの３’末端の近くに含有する。このＰＰＴは、逆転写期間中におけるプラス鎖ＤＮＡ合成のためのＲＮＡプライマーとして機能する。複雑なレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ－１など）は、ＤＮＡ合成の開始のための第２の部位を提供する第２のより中央に位置するＰＰＴ（すなわち、中央ポリプリン域（ｃＰＰＴ））を含有する。ｃＰＰＴをコードするレトロウイルスベクターは、増強された形質導入および導入遺伝子発現を有することが示されている（Ｂａｒｒｙ他（２００１）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（９）：１１０３－８を参照のこと）。１つの実施形態において、核酸ベクターは追加として、３’－ＰＰＴ配列および／またはｃＰＰＴ配列を含む。

上記で記載される非コード領域のゲノム構造は当業者には広く知られている。例えば、ＨＩＶ－１における非コード領域のゲノム構造に関する詳細が、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋから、ゲノムアクセション番号ＡＦ０３３８１９により、またはＨＩＶ－１ ＨＸＢ２（一般に使用されるＨＩＶ－１参照株）についてはゲノムアクセション番号Ｋ０３４５５により見出され得る。１つの実施形態において、非コード領域は、ゲノムアクセション番号Ｋ０３４５５において利用可能な配列に由来し、例えば、塩基対４５４～１１２６（Ｒ－Ｕ５－ＰＢＳ－Ｇａｇについて）、塩基対７６２２～８４７９（ＲＲＥについて）または塩基対７７６９～８１４６（ＲＲＥについて）、塩基対４７８１～４８９８（ｃＰＰＴについて）、塩基対９０１５～９１２０＆塩基対９５２１～９７１９（ｄＮＥＦ－ＰＰＴ－ｓｉｎＵ３－Ｒ－Ｕ５について）に由来する。

Ｇａｇ／ｐｏｌ：ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の発現は、ｇａｇとｇａｇｐｏｌとの間での翻訳フレームシフトに依拠している。両者は、成熟期間中に切断されるポリタンパク質である。レトロウイルスベクターの主要な構造マトリックスタンパク質、カプシドタンパク質およびヌクレオカプシドタンパク質が、ｇａｇによってコードされる。ｐｏｌ遺伝子は下記の、下記のレトロウイルス酵素、ｉ）逆転写酵素（これは、レトロウイルスＲＮＡゲノムが二本鎖ＤＮＡに逆転写されるために不可欠である）、ｉｉ）インテグラーゼ（これは、レトロウイルスＤＮＡゲノムが宿主細胞染色体に組み込まれることを可能にする）、およびｉｉｉ）プロテアーゼ（これは、レトロウイルスの成熟タンパク質および機能的タンパク質を産生するために、合成されたポリタンパク質を切断する）をコードする。１つの実施形態において、ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質をコードするレトロウイルス核酸配列は、ＨＩＶ－１のＨＸＢ２配列（これはゲノムアクセション番号Ｋ０３４５５において利用可能である）に由来し、例えば、塩基対７９０～５１０５に由来する。

Ｅｎｖ：ｅｎｖ（「エンベロープ」）遺伝子はレトロウイルスエンベロープの表面成分および膜貫通成分（例えば、ＨＩＶ－１の糖タンパク質のｇｐ１２０およびｇｐ４１）をコードし、レトロウイルス－細胞膜融合に関与している。レトロウイルスベクターの組織指向性を広げるために、本明細書中に記載されるレトロウイルスベクターは、別のウイルスからのエンベロープタンパク質によりシュードタイプ化される場合がある。シュードタイプ化は、レンチウイルスベクターを含めたレトロウイルスベクターの宿主細胞範囲を、レトロウイルスベクター粒子表面の糖タンパク質（ＧＰ）を変化させることによって（例えば、他のエンベロープウイルスから得られるＧＰ、または他のエンベロープウイルスに由来するＧＰを使用することによって、あるいは合成／人工ＧＰを使用することによって）拡大することができる、または変更することができるプロセスを示す。レトロウイルスベクターをシュードタイプ化するための最も一般に使用されている糖タンパク質が、幅広い指向性および高いベクター粒子安定性のために、水疱性口内炎ウイルスのＧＰ（ＶＳＶｇ）である。しかしながら、他の糖タンパク質がシュードタイプ化のために使用され得ることが当業者によって理解されるであろう（Ｃｒｏｎｉｎ他（２００５）、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５（４）：３８７－３９８、これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。シュードタイプ化のために使用されるウイルスの選択はまた、いくつかのシュードタイプが組織タイプ優先を有することが示されているので、標的となる細胞および／または器官のタイプに依存する場合がある。

本発明の１つの実施形態において、ｅｎｖタンパクまたはその機能的代用体は、下記から選択されるウイルスから得られ、または下記から選択されるウイルスに由来する：ベシクロウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス）、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス、モコラウイルス）、アレナウイルス（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ））、アルファウイルス（例えば、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス）、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス・レストン、エボラウイルス・ザイール、ラッサウイルス）、アルファレトロウイルス（例えば、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ））、ベータレトロウイルス（例えば、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ＪＳＲＶ））、ガンマレトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４））、デルタレトロウイルス（例えば、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ－１））、スプーマウイルス（例えば、ヒトフォーミーウイルス）、レンチウイルス（例えば、マエディ・ビスナウイルス（ＭＶＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、レスピロウイルス（例えば、センダイウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、ヘパシウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ））、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザウイルスＡ）および核多角体ウイルス（例えば、オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ））。さらなる実施形態において、ｅｎｖタンパク質またはその機能的代用体は水疱性口内炎ウイルスから得られ、または水疱性口内炎ウイルスに由来する。この実施形態においては、レトロウイルス粒子がより幅広い宿主細胞範囲に感染することを可能にし、かつ、野生型エンベロープタンパク質を産生させる様々な組換え可能性を排除する水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶｇ）タンパク質が使用される場合がある。さらなる実施形態において、ｅｎｖタンパク質またはその機能的代用体をコードするレトロウイルス核酸配列は、ゲノムアクセション番号Ｊ０２４２８．１において利用可能である配列に由来し、例えば、塩基対３０７１～４７２０に由来する。

本明細書中に記載される構造遺伝子はすべてのレトロウイルスに共通している。さらなる補助遺伝子が、異なるタイプのレトロウイルスにおいて見出される場合がある。例えば、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１など）は、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ、ｎｅｆおよびｔａｔとして知られている６つのさらなる補助遺伝子を含有する。他のレトロウイルスが、本明細書中に記載される遺伝子に類似する補助遺伝子を有する場合があり、しかしながら、それらには必ずしも、文献におけるのと同じ名称が与えられていない場合がある。ＴｏｍｏｎａｇａおよびＭｉｋａｍｉ（１９９６）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７（Ｐｔ８）：１６１１－１６２１などの参考文献には、様々なレトロウイルス補助遺伝子が記載される。

Ｒｅｖ：補助遺伝子ｒｅｖ（「ビリオンの調節因子」）は、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）に結合し、レトロウイルス転写物の排出を容易にするアクセサリータンパク質をコードする。この遺伝子のタンパク質産物は、Ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）を含有するレトロウイルスｍＲＮＡのフラグメントが核から細胞質に排出されることを可能にする。ＲＲＥ配列は、複雑な折り畳まれた構造を形成することが予測される。ｒｅｖのこの特定の役割は、スプライシング工程と、核外輸送工程との緊密なつながりを反映している。１つの実施形態において、核酸ベクターはＲＲＥ配列を含む。さらなる実施形態において、ＲＲＥ配列は、ＨＩＶ－１のＨＸＢ２配列（これはゲノムアクセション番号Ｋ０３４５５において利用可能である）に由来し、例えば、塩基対７６２２～８４７９または塩基対７７６９～８１４６に由来し、特に塩基対７６２２～８４７９に由来する。

ＲｅｖはＲＲＥに結合し、個々にスプライシングされたウイルス転写物（ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕ）またはスプライシングされていないウイルス転写物（ｇａｇ、ｐｏｌおよびゲノムＲＮＡ）の排出を容易にし、したがって、遺伝子翻訳およびパッケージングのような下流側の事象を引き起こす（ＳｕｈａｓｉｎｉおよびＲｅｄｄｙ（２００９）、Ｃｕｒｒ．ＨＩＶ Ｒｅｓ．７（１）：９１－１００を参照のこと）。１つの実施形態において、核酸ベクターは追加として、補助遺伝子ｒｅｖ、またはそれに対する類似遺伝子（すなわち、他のレトロウイルスまたは機能的類似システムに由来する類似遺伝子）を含む。とりわけ、ＲＲＥエレメントも、輸送されることになる転写物に含まれるならば、ｒｅｖ遺伝子を含むことにより、レトロウイルスベクターゲノムのＲＮＡ転写物の核から細胞質への効率的な排出が確実になる。さらなる実施形態において、ｒｅｖ遺伝子は、ゲノムアクセション番号Ｍ１１８４０（すなわち、ＨＩＶ－１クローン１２のｃＤＮＡ、ＨＩＶＰＣＶ１２遺伝子座）の塩基対９７０～１３２０に対して少なくとも６０％の配列同一性（例えば、少なくとも７０％の配列同一性など）を含む。代替となる実施形態において、ｒｅｖ遺伝子は、ゲノムアクセション番号Ｋ０３４５５．１（すなわち、ヒト免疫不全ウイルス１型、ＨＸＢ２）の塩基対５９７０～６０４０および塩基対８３７９～８６５３に対して少なくとも６０％の配列同一性（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％または１００％の配列同一性など）を含む。

補助遺伝子は、レトロウイルスの複製および病理発生において役割を果たしていると考えられ、そのため、多くの現在のウイルスベクター産生システムでは、これらの遺伝子のいくつかが含まれない。例外が、通常の場合には存在するｒｅｖであり、すなわち、ｒｅｖ／ＲＲＥシステムに類似するシステムが使用される可能性がある。したがって、１つの実施形態において、上記補助遺伝子（ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｔａｔおよびｎｅｆ）または類似する補助遺伝子の１つまたは複数をコードする核酸配列は、前記補助遺伝子がレトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノムから除かれるように、または機能的な補助タンパク質をコードすることができないように破壊される。さらなる実施形態において、上記補助遺伝子（ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｔａｔおよびｎｅｆ）または類似する補助遺伝子の少なくとも２つ以上、３つ以上、４つ以上、またはすべてが、前記補助遺伝子がレトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノムから除かれるように、または機能的な補助タンパク質をコードすることができないように破壊される。機能的補助遺伝子の除去は、遺伝子全体の除去を必要としない場合がある；遺伝子の一部の除去または遺伝子の破壊が十分であろう。

複製欠損レトロウイルスベクター粒子をコードする核酸配列は、当該レトロウイルスベクター粒子が基づくレトロウイルスの野生型遺伝子と同じであってもよく、または当該レトロウイルスベクター粒子が基づくレトロウイルスの野生型遺伝子に由来してもよく、すなわち、配列は、野生型ウイルスに含有される配列の遺伝子変化型またはそうでなければ異なる変化型であってもよいことが理解されるであろう。したがって、核酸ベクターまたは宿主細胞ゲノムに取り込まれるレトロウイルス遺伝子はまた、野生型遺伝子のコドン最適化型を示す場合がある。

追加の成分：
本発明の核酸モジュールはさらなる追加の成分を含む場合がある。これらの追加の特徴物は、例えば、転写物を翻訳のために安定化すること、遺伝子発現のレベルを増大させること、および遺伝子転写を開始／停止させることを助けるために使用される場合がある。
特に、本発明のモジュールに存在する核酸配列（例えば、レトロウイルス核酸配列）のそれぞれが、核酸モジュール内に個々の発現構築物として配置される場合がある。

遺伝子治療：
本発明のモジュールまたは（本発明のモジュールを含む）本発明のベクターを宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）の培養物に導入することによって産生されるレトロウイルスベクター粒子は、遺伝子治療の様々な方法において使用される場合がある。したがって、核酸モジュールは、１つまたは複数の導入遺伝子（例えば、１つ、２つまたは３つの導入遺伝子）を含む。そのような導入遺伝子は、目的とする疾患の処置または改善をもたらすために使用され得る遺伝子産物をコードする治療活性な遺伝子である場合がある。導入遺伝子は、例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、タンパク質（例えば、腫瘍抑制タンパク質）、毒素、抗原（これは、抗体またはヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するために使用され得る）、または抗体（例えば、単鎖抗体）をコードする場合がある。１つの実施形態において、導入遺伝子は、ベータグロビン、Ｃａｓ－９、酵素（例えば、アリールスルファターゼＡ、ガラクトセレブロシダーゼ、ジルストロフィン（Ｄｙｒｓｔｒｏｐｈｉｎ）など）をコードする。別の実施形態において、導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、腫瘍抗原（例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１）に特異的なものなどをコードすることができる。

レンチウイルスベクター：
非増殖性細胞に組み込まれることができるので、様々なレンチウイルスベクター（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）に基づくベクターなど）が遺伝子治療において広く使用されている。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを別々の部分に分割することによって、例えば、別個のプラスミドに置くことによって複製欠損にすることができる。例えば、ソーク研究所（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ）によって開発されたいわゆる第１世代のレンチウイルスベクターは、パッケージング用発現カセット、エンベロープ発現カセットおよびベクター発現カセットからなる３つのプラスミドの発現システムとして構築された。「パッケージング用プラスミド」は、完全なｇａｇ－ｐｏｌ配列、調節配列（ｔａｔおよびｒｅｖ）、およびアクセサリー配列（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ）を含有する。「エンベローププラスミド」は、生来型ＨＩＶ－１エンベロープタンパク質の代わりに水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶｇ）をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下において収容する。第３のプラスミド（「移入プラスミド」）は、長末端反復（ＬＴＲ）、カプシド形成配列（例えば、パッケージング配列（Ψ））、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）配列、および導入遺伝子を宿主細胞内で発現させるためのＣＭＶプロモーターまたはＲＳＶプロモーターを保持する。

レンチウイルスベクターの第２世代が、ビルレンス配列（ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕおよびｎｅｆ）の欠失によって特徴づけられた。パッケージング用ベクターは、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｔａｔ遺伝子およびｒｅｖ遺伝子に縮小させられ、そのため、システムの安全性が増大した。

レンチウイルスシステムを改善するために、第３世代のベクターが、ｔａｔ遺伝子をパッケージング用構築物から除き、ベクターカセットからのＬＴＲを不活性化することによって設計されており、そのため、挿入変異誘発作用に関連づけられる様々な問題が軽減されている。

レンチウイルスの様々な世代が下記の参考文献に記載される：第１世代：Ｎａｌｄｉｎｉ他（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２（５２５９）：２６３－７；第２世代：ｕｆｆｅｒｅｙ他（１９９７）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（９）：８７１－５；第３世代：Ｄｕｌｌ他（１９９８）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３－７、これらのすべてがそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる。レンチウイルスベクターの開発についての総説を、Ｓａｋｕｍａ他（２０１２）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４４３（３）：６０３－１８、およびＰｉｃａｎｃｏ－Ｃａｓｔｒｏ他（２００８）、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｐａｔｅｎｔｓ、１８（５）：５２５－５３９において見出すことができる。

用語「非哺乳動物の複製起点」は、複製が開始され、非哺乳動物供給源に由来する核酸配列を示す。これは、宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である場合を除いて、本発明の核酸ベクターが、好適な宿主細胞（例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞または酵母細胞など）において内因性染色体と並行して安定に複製し、分離し、その結果、本発明の核酸ベクターが宿主細胞子孫に伝達可能であることを可能にする。哺乳動物宿主細胞において、非哺乳動物の複製起点を有する核酸ベクターは、哺乳動物宿主細胞が複製するときに哺乳動物宿主細胞の内因性染色体に組み込まれるか、または失われるかのどちらかであろう。例えば、非哺乳動物の複製起点を有する核酸ベクター（例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、コスミドまたはフォスミドなど）は、細菌細胞（例えば、大腸菌など）において内因性染色体と並行して安定に複製し、分離することができ、しかしながら、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミドまたはフォスミドは、哺乳動物宿主細胞に導入されるならば、哺乳動物宿主細胞が複製するときに組み込まれるか、または失われるかのどちらかであろう。酵母人工染色体（ＹＡＣ）は酵母細胞において内因性染色体と並行して安定に複製し、分離することができ、しかしながら、ＹＡＣは、哺乳動物宿主細胞に導入されるならば、哺乳動物宿主細胞が複製するときに組み込まれるか、または失われるかのどちらかであろう。

細菌人工染色体：
用語「細菌人工染色体」または用語「ＢＡＣ」は、外因性ＤＮＡの大きいインサートを収容することができる細菌プラスミド由来のＤＮＡ構築物を示す。細菌人工染色体またはＢＡＣは通常、およそ３５０ｋｂの最大ＤＮＡインサートを収容することができる。様々なＢＡＣが、プラスミドの一様な分布を細菌の細胞分裂の後で促進する分配遺伝子を含有する、細菌の十分に特徴づけられた機能的稔性プラスミド（Ｆ－プラスミド）から開発された。これは、ＢＡＣが内因性の細菌ゲノム（例えば、大腸菌など）と並行して安定に複製され、分離されることを可能にする。ＢＡＣは通常、少なくとも１コピーの複製起点（例えば、ｏｒｉＳ遺伝子またはｏｒｉＶ遺伝子など）、ｒｅｐＥ遺伝子（プラスミド複製およびコピー数の調節のために）、および細菌細胞におけるＢＡＣの安定な維持を確実にする分配用遺伝子（ｓｏｐＡ、ｓｏｐＢ、ｐａｒＡ、ｐａｒＢおよび／またはｐａｒＣなど）を含有する。ＢＡＣは天然では環状で、かつスーパーコイル状であり、これにより、ＢＡＣは、線状の人工染色体（例えば、ＹＡＣなど）よりも回収が容易になっている。ＢＡＣはまた、簡便な方法（例えば、エレクトロポレーションなど）を使用して比較的容易に細菌宿主細胞に導入することができる。

１つの実施形態において、細菌人工染色体はｏｒｉＳ遺伝子を含む。１つの実施形態において、細菌人工染色体はｒｅｐＥ遺伝子を含む。１つの実施形態において、細菌人工染色体は分配用遺伝子を含む。さらなる実施形態において、分配用遺伝子は、ｓｏｐＡ、ｓｏｐＢ、ｐａｒＡ、ｐａｒＢおよび／またはｐａｒＣから選択される。さらにさらなる実施形態において、細菌人工染色体はｓｏｐＡ遺伝子およびｓｏｐＢ遺伝子を含む。

本発明による使用のためのＢＡＣ、および本発明において記載されるようにさらに改変することができるＢＡＣは、商用供給元から得られる場合があり、例えば、ｐＳＭＡＲＴ ＢＡＣがＬＵＣＩＧＥＮ（商標）から得られる（全骨格配列についてはゲノムアクセション番号ＥＵ１０１０２２．１を参照のこと）。このＢＡＣは、ＴｒｆＡ複製タンパク質の存在下でのみ活性である中コピー数のｏｒｉＶ複製起点も含有するＬ－アラビノース「コピーアップ（ｃｏｐｙ－ｕｐ）」システムを含有する。ＴｒｆＡのための遺伝子がＬ－アラビノース誘導性プロモーターａｒａＣ－Ｐ_ＢＡＤの制御下で細菌宿主細胞のゲノムに組み込まれる場合がある（Ｗｉｌｄ他（２００２）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２（９）：１４３４－１４４４を参照のこと）。Ｌ－アラビノースが添加されると、ＴｒｆＡの発現が誘導され、このことはｏｒｉＶの活性化をもたらし、それにより、プラスミドが細胞あたり５０コピーまで複製することが引き起こされる。

したがって、これに関連して、本発明の核酸モジュールを含む核酸ベクター（例えば、本発明の改変されたＢＡＣまたは移入ベクターなど）は、レトロウイルス産生のために好適である安定な細胞株を生じさせるために哺乳動物細胞に容易に移送することができるＤＮＡのリザーバー（すなわち、レトロウイルス産生のために不可欠な遺伝子のためのリザーバー）として作用する。非哺乳動物の複製起点の例には、細菌の複製起点（例えば、ｏｒｉＣ、ｏｒｉＶまたはｏｒｉＳ）、または酵母の複製起点（これは自律複製配列（ＡＲＳエレメント）としても知られている）が含まれる。

本発明の核酸モジュールを含む核酸ベクター（例えば、ＢＡＣ）は非哺乳動物の複製起点を含み、例えば、少なくとも２５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡを収容することができる。１つの実施形態において、核酸ベクターは、少なくとも３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１１０ｋｂ、１２０ｋｂ、１３０ｋｂ、１４０ｋｂ、１５０ｋｂ、１６０ｋｂ、１７０ｋｂ、１８０ｋｂ、１９０ｋｂ、２００ｋｂ、２１０、２２０ｋｂ、２３０ｋｂ、２４０ｋｂ、２５０ｋｂ、２６０ｋｂ、２７０ｋｂ、２８０ｋｂ、２９０ｋｂ、３００ｋｂ、３１０ｋｂ、３２０ｋｂ、３３０ｋｂ、３４０ｋｂまたは３５０ｋｂのＤＮＡを収容する能力を有する。「収容する能力」への言及はその通常の意味を有しており、核酸ベクターのためのインサートのサイズについての上限が、主張されたサイズよりも小さくないこと（すなわち、２５ｋｂ以上のＤＮＡ）であることを含意することが理解されるであろう。

本発明の１つの実施形態において、そのような核酸ベクターはまた、一般には５ｋｂ～１１ｋｂの最大インサートのみを収容するバクテリオファージではない。したがって、１つの実施形態において、本発明のモジュールを含む核酸ベクターは、天然のプラスミド、バクテリオファージまたはエピソームではない。

用語「内因性染色体」は、外因性核酸ベクター（例えば、細菌人工染色体など）の生成または導入の前の宿主細胞において見出されるゲノム染色体を示す。用語「トランスフェクション」、用語「形質転換」および用語「形質導入」は、本明細書中で使用される場合、非哺乳動物ベクターまたはウイルスベクターが標的細胞に挿入されることを記述するために使用される場合がある。ベクターの挿入は通常、細菌細胞については形質転換と呼ばれており、真核細胞についてはトランスフェクションと呼ばれており、だが、ウイルスベクターの挿入はまた、形質導入と呼ばれる場合がある。当業者は、一般に使用される様々な異なる非ウイルストランスフェクション方法を認識しているであろうし、これらには、物理的方法（例えば、エレクトロポレーション、細胞スクイージング（ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、マグネトフェクション、遺伝子銃または微粒子銃）、化学試薬（例えば、リン酸カルシウム、高分岐度有機化合物またはカチオン性ポリマー）、またはカチオン性脂質（例えば、リポフェクション）の使用が含まれるが、これらに限定されない。多くのトランスフェクション方法では、プラスミドＤＮＡの溶液を細胞に接触させ、その後で細胞を成長させることが要求される。

用語「プロモーター」は、遺伝子発現を行わせる配列を示す。高レベルの発現を行わせるために、高効率のプロモーター（例えば、非レトロウイルスの高効率プロモーターなど）を使用することが有益である場合がある。

用語「ポリＡシグナル」は、様々な宿主因子が転写期間中に新生ｍＲＮＡの末端にポリアデノシン（ポリＡ）テールを付加することを可能にする（例えば、導入遺伝子の３’側に置かれる）ポリアデニル化シグナル配列を示す。ポリＡテールは、ｍＲＮＡを酵素分解から保護し、翻訳も助ける、アデノシンリボヌクレオチドが３００個までの区域である。したがって、本発明の核酸モジュール（または本モジュールを含むベクター）はポリＡシグナル配列を含む場合があり、例えば、ヒトベータグロビンまたはウサギベータグロビンのポリＡシグナル、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期ポリＡシグナルまたは後期ポリＡシグナル、ヒトインスリンのポリＡシグナル、あるいはウシ成長ホルモンのポリＡシグナルなどを含む場合がある。１つの実施形態において、ポリＡシグナル配列はヒトベータグロビンのポリＡシグナルである。

用語「イントロン配列」は、最終的な遺伝子産物からＲＮＡスプライシングによって除かれるヌクレオチド配列を示す。エンハンサー／プロモーター領域の下流側およびｃＤＮＡインサートの上流側におけるイントロンの使用は遺伝子発現のレベルを増大させることが示されている。発現における増大は特定のｃＤＮＡインサートに依存する。したがって、本発明の核酸モジュール（または本モジュールを含むベクター）はイントロンを含む場合があり、例えば、ヒトベータグロビンのイントロン、ウサギベータグロビンのイントロンＩＩ、またはキメラなヒトベータグロビン－免疫グロブリンのイントロンなどを含む場合がある。１つの実施形態において、イントロンはヒトベータグロビンのイントロンおよび／またはウサギベータグロビンのイントロンＩＩである。

用語「パッケージング細胞株」は、ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質ならびにエンベロープ糖タンパク質の遺伝子を発現することができる細胞株を示す。代替として、用語「産生者たる細胞株」は、目的とする導入遺伝子を含有する移入ベクターも発現することができるパッケージング細胞株を示す。

用語「一過性にトランスフェクトされた」は、標的核酸（すなわち、レトロウイルス遺伝子）が細胞のゲノムに永続的に取り込まれないトランスフェクションされた細胞を示す。そのため、細胞内における核酸の効果は短時間しか持続しない。

用語「安定的にトランスフェクトされた」は、標的核酸（すなわち、レトロウイルス遺伝子）が細胞のゲノムに永続的に取り込まれるトランスフェクションされた細胞を示す。そのため、細胞内における核酸の効果は短時間しか持続しない。

スプライスドナー配列：
すべてのレトロウイルスが、スプライシングされていないｍＲＮＡがｇａｇ ｍＲＮＡおよびゲノムＲＮＡの両方として働く異なるレトロウイルス遺伝子産物をコードする多数のスプライシングされたアイソフォームの生成を可能にする主要なスプライスドナーを５’側ＵＴＲ（非翻訳領域）に含有する。これは、すべてのレトロウイルスの保存された特徴であり、この技術分野において広く知られており、また記載されている（例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒ、Ｋｌａｖｅｒ、Ｂｅｒｋｈｏｕｓ＆Ｄａｓ、２０１５；Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第９６巻、第１１号、ｐｐ３３８９－３３９５）。

スプライスアクセプター配列：
スプライスアクセプターコンセンサス配列は、ＡＧ（アクセプターヌクレオチド）が続き、かつ、典型的にはその後にＧまたはＡが続く、ピリミジン塩基に富むヌクレオチドの連続である（Ｂｒｅｎｔ＆Ｇｕｉｇｏ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４、ｐｐ２６４－２７２、２００４）。そのような配列はこの技術分野において広く知られており、また記載されている（例えば、Ｍａｒｔｉｎ Ｓｔｏｌｔｚｆｕｓ、２００９、第１章：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ＲＮＡ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ（第７４巻、ｐｐ．１－４０）；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。これらの配列要件は厳密ではないので、様々なスプライスアクセプター配列が多くの場合、様々な配列で存在する。これらの配列がベクターゲノムにおける主要なスプライスドナーの下流側に現れる場合、これらの配列は、スプライスアクセプターとして作用する可能性がある。

図１：スプライスアクセプターについてのコンセンサスマップを示す（Ｂｒｅｎｔ＆Ｇｕｉｇｏ、２００４：Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４（３）、２６４－２７２）。図１における異なるサイズの文字は、特定の塩基がすべての知られているスプライス部位にわたってどのように保存されているかを示す。スプライスドナーのためにはＧＴが存在しなければならず、アクセプターのためにはＡＧが存在しなければならない。ＲＮＡにおいて広く知られているように、ＴはＵによって置き換えられるであろう。これらの周りの配列はあまり厳密ではない。コンセンサスに対するより良好な一致は、例えば、スプライスドナーについてはＡＧＧＴＡＡＧを意味するであろうし、アクセプターについてはＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＡＧＧを意味するであろう。これらの配列要件に加えて、可能性のあるスプライス部位は、スプライス部位をスプライシング機構に対してアクセス可能にし、かつ、インシリコでの予測が困難である二次構造を有しなければならない。スプライス部位予測アルゴリズムでは、配列が、一次配列要件を探してスキャンされ、実際の配列がコンセンサスとどの程度よく一致するかに基づくスコアが割り当てられる。ＭａｘＥｎｔＳｃａｎについては、スコアが１（最も弱い一致）から１３（最も強い一致）にまで及ぶ。使用することができるスプライス部位予測アルゴリズムが本明細書中に記載される。

核酸ベクター：
導入遺伝子発現を行わせるプロモーターの内部における弱まったスプライスアクセプター部位を伴う本発明の核酸モジュールを含み、それによって、導入遺伝子発現のために適格であるスプライシングされたベクター転写物の産生を低下させる、または排除する本発明のベクター（例えば、プラスミドまたはＢＡＣなど）は、産生者たる細胞における導入遺伝子の発現を低下させ、または排除し、それによって、産生者たる細胞における導入遺伝子の起こり得る望ましくない影響（例えば、細胞毒性作用など）を低下させるので好都合である。

したがって、本明細書中に記載されるような（例えば、改変あるいは完全または部分的な欠失によって弱められる）弱まったスプライスアクセプター部位を伴う改変されたプロモーターを有する本発明の核酸モジュールを含むベクター（例えば、本発明のプラスミドまたはＢＡＣ）の使用は、様々な利点をレトロウイルスのパッケージング細胞株および産生者たる細胞株ならびにまた一過性細胞株の生成において提供する。したがって、本明細書中に記載されるような弱まったスプライスアクセプター部位を伴うそのような好適なプロモーターは、レトロウイルスベクター転写物の状況において活性であり、その結果、５’側ＬＴＲから生じる転写物からのスプライシングを受け入れて、導入遺伝子発現のために適格であるスプライシングされた産物をもたらすようにするスプライスアクセプター部位を含むそのようなプロモーターであることが可能である。例には、ＳＶ－４０、ＰＧＫ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、およびＵｂｃプロモーターから選択されるプロモーターが含まれる。プロモーターはヒト由来プロモーターが可能であり、または他の種に由来するオルソログが可能である。１つの実施形態において、前記プロモーターはＰＧＫプロモーターであり、例えば、ヒトＰＧＫプロモーターである。本明細書中に記載される研究は、ヒトＰＧＫプロモーターは活性なスプライスアクセプターをその３’端に含むこと、および現時点では、特定されるこの活性なスプライスアクセプター部位は完全または部分的に欠失され得ることを示している。プロモーターがＰＧＫプロモーターであるこの例において、本発明者らは、活性なスプライスアクセプターを構成する最後の２塩基対がアデニンおよびグアニン（ＡＧ）であること、そして、これらの２塩基対（すなわち、ＡＧ）は両方が欠失され得ること、あるいは代替において、ＡまたはＧのどちらかのみが挿入変異誘発によって欠失される、または置換される、または破壊されるような部分的欠失が可能であることを見出している。ＡまたはＧが置換されるとき、好適な置換は、ＤＮＡを構成する他のヌクレオチドのどれもが可能であり、例えば、Ｇの代わりに、Ａ、チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）のいずれかを利用することができる。２３ｂｐのスプライスアクセプター（この場合、ＡＧが１９位および２０位である）の内部における、スプライスアクセプター活性を低下させる他の変異も可能である。

１つの実施形態において、改変されたＰＧＫプロモーターは、配列番号１９に示される核酸配列を有することができる。この配列において、上記で記載されるような活性なスプライスアクセプター部位を構成するグアニンが欠失される（これはＰＧＫｎｏＳＡ２である）。

１つの実施形態において、改変されたＰＧＫプロモーターは、配列番号２０に示される核酸配列を有することができる。この配列において、上記で記載されるような活性なスプライスアクセプター部位を構成するアデニンおよびグアニンの両方が欠失される（これはＰＧＫｎｏＳＡである）。

本発明による完全な欠失または部分的な欠失のために好適である（レンチウイルス／レトロウイルスの状況において活性である）隠れたスプライスアクセプターを含む、本発明による使用のための他の好適なプロモーターの例には、ＳＶ４０プロモーター、例えば、レトロウイルスの状況において活性化される隠れたスプライスアクセプター部位を含有することが以前に示されているＳＶ４０ ２２９プロモーターが含まれる（これは、ＡｎｓｏｎおよびＦｕｌｌｅｒ、２００３、Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＨＩＶ－１ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ、Ｊ Ｇｅｎｅ、５（１０）、ｐｐ８２９－８３８に記載される）。

本発明に従って使用されること（および修飾されること）も可能である他のプロモーターには、ＥＦＳ（ＥＦ１αショート）、Ｕｂｃプロモーター、ＳＦＦＶプロモーターが含まれる（表１を参照のこと）。

１つの実施形態において、本発明はまた、本明細書中に記載されるような改変されたプロモーターのいずれかを（例えば、導入遺伝子をコードするモジュールまたはベクターにおける使用のために）提供する。例えば、本発明は、配列番号１９および配列番号２０に示される核酸配列を伴うプロモーターを提供する。

本発明の１つの実施形態において、使用されるプロモーターは、記載されるような改変、例えば、変異誘発技術による改変が後でなされる野生型プロモーターまたは天然プロモーターである。代替において、プロモーターは、本明細書中に記載されるような改変が後でなされる野生型配列に基づく場合があり、しかし、変異誘発がインシリコで実施され、最終的な改変された核酸配列が、当該合成のためのこの技術分野で広く知られている様々な技術を使用して合成される。

プロモーターの改変は野生型プロモーターからの改変を示し、これには、プロモーターのインシリコ合成が、プロモーターの物理的変異誘発と同様に含まれ得る。

スプライスアクセプターの特定が、目的とするプロモーターを含有するレンチウイルス移入プラスミド（または類似の設計物）によりトランスフェクションされる細胞のｍＲＮＡを配列決定することを介して達成される場合がある。例えば、活性なスプライスアクセプターがＥＦＳプロモーター（Ｓｃｈａｍｂａｃｈ他、２００６、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ、第１３巻、第２号、ｐｐ３９１－４００）に存在するかどうかを、レンチウイルス移入プラスミドの状況にあるときにおいて実験的に明らかにするために、ＥＦＳプロモーターによって制御される導入遺伝子を伴うレンチウイルスベクター移入プラスミドがトランスフェクションされ得るであろう。その後、これらのトランスフェクションされた細胞からのｍＲＮＡが様々な技術によって配列決定され得るであろう。これには、的を絞ったアプローチ、例えば、５’ＲＡＣＥからのＰＣＲ産物の配列決定、またはＲＴ－ＰＣＲ後の接合部の増幅など、あるいは的を絞らないアプローチ、例えば、ＲＮＡｓｅｑなどが含まれ得るであろう。移入プラスミドに対するアラインメントにより、エクソン配列が示されるであろうし、また、移入プラスミドに対するアラインメントは、どのようなスプライスアクセプターであれ活性なスプライスアクセプターがイントロンの３’側接合部において特定されることを可能にするであろう。

代替において、スプライスアクセプターがインシリコで予測される場合がある。

ＭａｘＥｎｔＳｃａｎ：
多数のスプライス部位予測アルゴリズムが、これを容易にするために利用可能であり、例えば、位置特異的重み行列（ＰＷＭ）に基づく分析、最大依存分解（ＭＤＤ）、マルコフモデルまたは最大エントロピー分布（ＭＥＤ）が利用可能である。今日までのところ、最も偏りのないアプローチはＭＥＤであることが示された。これは、スプライス部位に隣接する位置における塩基を考慮して、利用可能なデータ（ヒト細胞におけるスプライシングされたＲＮＡ）からの特徴を使用するだけである方法である（Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ－Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ ｏｆ ｅｎｄ－ｕｓｅｒｓ、Ｘｕｅｑｉｕ Ｊｉａｎ、Ｅｒｉｃ ＢｏｅｒｗｉｎｋｌｅおよびＸｉａｏｍｉｎｇ Ｌｉｕ、Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ、２０１４を参照のこと）。このＭＥＤアプローチが、ＭａｘＥｎｔＳｃａｎにおいて、すなわち、５’側スプライスドナー部位の周りの９塩基と、スプライスアクセプター部位の周りの２３塩基とを分析する、Ｙｅｏ＆Ｂｕｒｇｅ、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２００４；１１（２－３）、ｐｐ３７７－９４に記載されるような「最大エントロピースキャニングツール」において実行される。ＭＥＤを使用すると、それぞれの特定された部位についての対数オッズ比としての最大エントロピースコアがもたらされ、この場合、より高いスコアは、その配列が真のスプライス部位であるという確率がより高いことを暗に示している。

プロモーター内の予測されたスプライスアクセプターを特定することができる。スプライシングされたｍＲＮＡにおける最初の開始コドン（ＡＴＧ）が導入遺伝子に属する（または導入遺伝子とインフレームである）ことを生じさせるであろうスプライスアクセプターをその後、当該スプライスアクセプターを無効にするために、または弱めるために変異させることができるであろう。しかしながら、それぞれの変異は、プロモーター活性を変化させる可能性があり、したがって、経験的に試験しなければならない。

上記の表には、ＭａｘＥｎｔＳｃａｎを使用してインシリコで特定されるモチーフが示される。ＡＧがプロモーター領域の最後の３ヌクレオチド（ｎｔｄ）に存在した場合、ＭａｘＥｎｔＳｃａｎは、スコア化されるための２３量体の１９位および２０位にＡＧが存在することを要求するので、追加の塩基が付加された（これは、ｃｃｔが付加されたＰＧＫ－４９２、およびＧが１つ付加されたＵｂｃ－１１８９に対して適用可能であった）。ＳＶ４０を例として使用すると、可能性のある２つのスプライスアクセプターが１７１位および２２９位において示される。１７１位におけるモチーフは導入遺伝子発現をもたらさないであろう：これは、ＡＴＧ（開始コドン）が存在し、その下流にはインフレームでの終止コドン（ＴＡＡ）がそのちょうど３コドン下流側にあるからである（ＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡ）。しかしながら、２２９位におけるモチーフはＡＴＧをプロモーター配列の内部において下流側に有しておらず、このことは、このスプライスアクセプターを使用した転写物に由来する５’側ＡＴＧ（開始コドン）は導入遺伝子に属するであろうことを意味する（したがって、そのような転写物は導入遺伝子タンパク質発現のために適格であろう）。

代替において、活性なスプライスアクセプターを含むプロモーターは改変することができる：
スプライシングを低下させるために本発明に従って使用することができる改変には、例えば、活性なスプライスアクセプター部位の周りのコンセンサス配列の改変であって、その配列が弱められ、したがって、スプライスアクセプターとして使用される傾向が低下しているような改変を挙げることができる。例えば、ＰＧＫプロモーターが使用される場合、最後の２塩基対（ＡＧ塩基対）における活性なスプライスアクセプターの周りのコンセンサス配列を、当該活性なスプライスアクセプターが弱められるように改変することができる。コンセンサス配列（ＡＧジヌクレオチドの下流側３ｂｐがｃｃｔである場合）における改変として、例えば、そのＭａｘＥｎｔＳｃｏｒｅが８．６９から３未満（可能性のあるスプライスアクセプターとしてスコア化されるための閾値よりも小さい値）に弱まるため、ＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＡＧ（ｃｃｔ）からＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＴＣＣＣＣｇＡＧ（ｃｃｔ）にすることを挙げることができる。

スプライストラップの使用：
しかしながら、活性なスプライスアクセプターを（例えば、改変または欠失によって）弱めることの上記で記載されるような起こり得る欠点の１つが、プロモーター配列内における配列のそのような変異誘発はまた導入遺伝子発現を形質導入された細胞において変化させるかもしれないということであり、このことは、導入遺伝子発現に対する影響が有意であるかどうかを判定するためにそれぞれのプロモーターについて評価される必要があるであろう。

したがって、導入遺伝子発現を産生者たる細胞において低下させ（しかし、導入遺伝子発現を形質導入された細胞において維持する）ための代替方策で、上記で記載されるこれらの制限を克服する代替方策が考案された。これには、産生者たる細胞における導入遺伝子発現の大多数が、ＬＴＲから生じるスプライシングされた転写物に起因することが示されているので、「スプライストラップ」の使用が伴う。

「スプライストラップ」を本発明による核酸モジュールにおいて使用することができ、上流側（すなわち、導入遺伝子の５’側）もしくは下流側（すなわち、導入遺伝子の３’側）に、または主要なスプライスドナーと導入遺伝子カセット転写開始部位との間に配置することができ、あるいは主要なスプライスドナーとポリアデニル化部位との間に配置することができる。

本明細書中において記載および定義されるようなスプライストラップは、スプライスアクセプター部位（例えば、強力なスプライスアクセプター部位）を含み、その後には必要に応じて、最小限のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（例えば、約５０個未満のコドン、例えば、約４０個のコドンもしくは約３０個のコドン、または約２０個もしくは約１０個のコドン）が続く短い核酸配列である。スプライスアクセプター部位が、コンセンサス配列に基づいて合成される場合があり、または天然に存在する知られているスプライスアクセプター、例えば、ヒトＥＦ１αプロモーターのイントロン１に由来するスプライスアクセプター（Ｋｉｍ、Ｕｅｔｓｕｋｉ、Ｋａｚｉｒｏ、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ＆Ｓｕｇａｎｏ、Ｕｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｇｅｎｅ、１９９０、９１（２）、２１７－２２３）などである場合がある。

本発明の１つの実施形態において、そのようなスプライストラップは、最適に働くためには、（Ｙｅｏ＆Ｂｕｒｇｅ、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２００４；１１（２－３）、ｐｐ３７７－９４に記載されるように求められる）ＭａｘＥｎｔＳｃａｎスコアが、導入遺伝子発現をもたらすプロモーターにおけるスプライスアクセプターのＭａｘＥｎｔＳｃａｎスコアよりも大きい。代替において、ＭａｘＥｎｔＳｃａｎスプライスアクセプタースコアは約８．７超であること、例えば、約９超または１０超または１１超または１２超または１３超であることが可能である。

本発明の１つの実施形態において、好適なスプライストラップは、５’末端がＣおよびＴに富み（例えば、約１４個を超える、または約１６個を超える、または約１８個を超えるＣヌクレオチドおよびＴヌクレオチドの配列であり）、ＡＧヌクレオチドを３’末端に有し、かつ、必要に応じて、約８．７超であるＭａｘＥｎｔ Ｓｃａｎスコア、例えば、約９超または１０超または１１超または１２超または１３超であるＭａｘＥｎｔ Ｓｃａｎスコアも有する核酸配列を有する。

スプライストラップを、例えば、どのようなプロモーターであれ導入遺伝子発現のためのプロモーターの上流側で利用することができる。例えば、本発明の核酸モジュールのプロモーターが、（ｉ）隠れたスプライスアクセプター部位についてスクリーニングされないとき、あるいは（ｉｉ）前記プロモーターがスクリーニングされており、その後、使用されたならば、導入遺伝子発現のために適格な転写物を生じさせ、プロモーター／転写活性に有意に寄与することが予想される、またはほんとうに有意に寄与する領域の内部に位置する、可能性のあるスプライスアクセプターを含有することが見出され、したがって、配列を変異させることが望ましくないかもしれないときには、そのようなスプライストラップを本発明の核酸モジュールにおいて使用することが望ましい。

導入遺伝子発現を評価するための様々な方法がこの技術分野では広く知られており、これらには、例えば、特異的な転写物アイソフォームを定量化するためのｑＰＣＲ、転写レポーターアッセイおよび導入遺伝子活性アッセイ、または導入遺伝子に対する抗体を、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫蛍光などの技法において使用する検出が含まれる。

プロモーター内の隠れたスプライスアクセプターモチーフが変異させられ、導入遺伝子発現が、適切な統計学的検定（例えば、Ｔ検定）に従って有意に変化し、その結果、形質導入された細胞における発現レベルが効力を悪化させているならば、活性なスプライスアクセプターの改変または欠失の代わりにスプライストラップを使用することが望ましい可能性がある。

したがって、本発明の１つの態様において、改変または欠失された活性なスプライスアクセプターの代替として（またはそのようなスプライスアクセプターに加えて）少なくとも１つの「スプライストラップ」、例えば、２つ以上のスプライストラップを含む核酸モジュールが提供される。

本発明のさらなる態様において、上記で記載されるような少なくとも１つの「スプライストラップ」を含む核酸モジュールを含むベクターが提供される。

スプライストラップ配列は、例えば、導入遺伝子カセットのすぐ上流側に配置され、その結果、スプライストラップ配列がＬＴＲ由来ｍＲＮＡにおける導入遺伝子カセットよりも前に転写されて、しかし、導入遺伝子カセット由来ｍＲＮＡから除外されるようにすることができる。主要なスプライスドナーと導入遺伝子カセット転写開始部位との間における代替位置も好適である場合がある。代替において、スプライストラップ配列は、主要なスプライスドナーとポリＡシグナルとの間のどこにでも配置することができる。

これらの配列は、スプライシングされる運命にあるＬＴＲ由来ｍＲＮＡを導入遺伝子カセットからそらして、スプライストラップに向けるために設計された。主要なスプライスドナーと併せてスプライスアクセプターとして使用されるとき、スプライシングされたｍＲＮＡは、導入遺伝子にではなく、最小限のＯＲＦ（または代用体）に属する５’側の開始コドンを有するであろう。最小限のＯＲＦは、開始コドンと、その後に続く終止コドンとからなる。哺乳動物リボソームは５’側ＯＲＦスキャニング機構を翻訳開始のために利用し、終止コドンに到達すると分解するので、下流側のＯＲＦ（例えば、導入遺伝子）が効率的に翻訳されることは起こりそうにない。それにもかかわらず、第２の最小限のＯＲＦが第１の最小限のＯＲＦのそばに配置され、その結果、リボソームが、スプライストラップを利用しているどのようなｍＲＮＡにおいてであれ導入遺伝子に到達する前に開始コドンおよび終止コドンの少なくとも２つを読み通さなければならないようにされた。さらに、第１の最小限のＯＲＦにおけるリボゾーム組立てを促進させるために、Ｋｏｚａｋ配列が含められた。したがって、そのようなプロセシングされたｍＲＮＡからの導入遺伝子の効率的な翻訳は起こりそうにない。

代替において、知られている機能または予想された機能を有するタンパク質をコードしないＯＲＦを最小限のＯＲＦの代わりに使用することができる。（典型的にはプロモーターにおける）スプライストラップの下流側にある配列はしばしば、そのような短いＯＲＦを含有するであろうし、そのような場合、追加のＯＲＦを挿入することは、導入遺伝子の抑制のために必要でないかもしれない。未知タンパク質の発現が産生者たる細胞またはベクターの特性に影響を及ぼす潜在的可能性をなくすことは依然として望ましいかもしれない。

本発明の核酸モジュールにおいて使用することができるスプライストラップの例が下記の表において詳述される。

ＳＴ６配列が、Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ他、１９９９；Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ５’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｍｅｄｉｃａｌ ｕｓｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３（５）、４０８３－４０８９に記載される。

本発明の１つの実施形態において、利用されるスプライストラップが、ＳＴ１、ＳＴ２、ＳＴ４およびＳＴ５、またはそれらの機能的フラグメントから選択される。そのような機能的フラグメント（またはバリアント）は、ＣＴに富む領域が５’末端に、ＡＧが３’末端に含まれるので表２で詳述されるような、ＳＴ１、ＳＴ２、ＳＴ４およびＳＴ５の配列の下線部分を含むことができる。どのＴもＣによって置き換えることができ、また、逆に、どのＣもＴによって置き換えることができる。代替において、ＳＴ１、ＳＴ２、ＳＴ４およびＳＴ５の機能的フラグメント（またはバリアント）は、約８．７超であるＭａｘＥｎｔＳｃａｎスプライスアクセプタースコア、例えば、約９超または１０超または１１超または１２超または１３超であるＭａｘＥｎｔＳｃａｎスプライスアクセプタースコアを有するものである。

本発明の核酸モジュールを含む核酸ベクターを作製する方法であって、下記のレトロウイルス核酸配列：
シス作用ウイルスエレメント（例えば、ＬＴＲなど）、パッケージングシグナル、導入遺伝子発現のためのプロモーターであって、前記導入遺伝子に機能的に連結されるプロモーター、ならびに同様に、必要な場合には、ｇａｇタンパク質、ｐｏｌタンパク質およびｅｎｖタンパク質（またはその機能的代用体）をコードするレトロウイルス核酸配列、ならびに同様に、非哺乳動物の複製起点を含む核酸ベクター、例えば、プラスミド、レトロウイルス移入ベクターまたはＢＡＣ（例えば、国際公開ＷＯ２０１７／０８９３０７に記載されるＢＡＣなど）を得ること、その後、（ｉ）導入遺伝子発現のためのプロモーターを、スプライスアクセプター部位を（全体または一部において）欠失することによって改変して、または導入遺伝子発現のためのプロモーターを、例えば、挿入変異、欠失変異または置換変異によって改変して、その結果、導入遺伝子発現のためのプロモーターは、スプライスアクセプターとしての機能が低下しており、または排除されており、それによって、この位置におけるスプライシングが低下しているように、または排除されているようにする工程、ならびに／あるいは（ｉｉ）前記ベクターに「スプライストラップ」を挿入して、その結果、「スプライストラップ」が導入遺伝子の上流側および／または下流側に配置される、あるいは主要なスプライスドナーと、導入遺伝子カセット転写開始部位との間に配置される、あるいは主要なスプライスドナーと、ポリアデニル化部位との間に配置されるようにする工程を実施することを含む方法もまた本発明によって提供される。

本発明のさらなる態様によれば、本明細書中で定義されるような本発明の方法によって得ることができる、または得られる複製欠損レトロウイルスベクター粒子が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、複製欠損レトロウイルスベクター粒子を産生させる方法における使用のための本明細書中で定義されるようなモジュールを含む核酸ベクターが提供される。

大きい核酸ベクターの使用：
本発明の核酸モジュールを含む核酸ベクター（例えば、人工染色体など、例えば、ＢＡＣ）は、例えば、国際公開ＷＯ２０１７／０８９３０７に記載されるベクター、または国際公開ＷＯ２０１７／０８９３０８に記載されるベクターに基づくことができ、この場合、核酸ベクター（例えば、ＢＡＣ）は、非哺乳動物の複製起点、および少なくとも２５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡを収容する能力を含み、
ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質、ならびにｅｎｖタンパク質またはその機能的代用体をコードし、かつ、本明細書中に記載されるような改変されたスプライスアクセプター部位または完全もしくは部分的に欠失されたスプライスアクセプター部位ならびに／あるいは本明細書中に記載されるようなスプライストラップをさらに含むレトロウイルス核酸配列を含むことにおいて特徴づけられる。

国際公開ＷＯ２０１７／０８９３０７のベクターはまた、当該公報において詳述されるように、レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノム、ならびに／あるいは補助遺伝子ｒｅｖもしくはそれに対する類似の遺伝子または機能的に類似したシステム、ならびに／あるいは転写調節エレメントをさらに含む場合がある。

したがって、１つの実施形態において、本発明の核酸モジュールを含む核酸ベクターは、例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体、Ｐ１由来人工染色体、フォスミドまたはコスミドから選択される大きい核酸ベクターである場合がある。

レトロウイルス遺伝子のすべてをそのような大きい核酸ベクター（例えば、ＢＡＣ）に含むことの利点は、レトロウイルス遺伝子のすべてが、ただ１つの工程で哺乳動物細胞に導入される前に、取り扱いおよび操作がはるかにより容易である微生物宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞または酵母宿主細胞）において最初に調製されることが可能であるということである。

宿主細胞：
さらに本発明のさらなる態様によれば、宿主細胞株への形質導入またはトランスフェクションの後で哺乳動物宿主細胞の培養物に組み込まれる、本明細書中に記載されるような本発明のモジュールを含む核酸ベクター（例えば、改変された移入ベクターまたは改変されたＢＡＣなど）を含む細胞株が提供される。

１つの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。さらなる実施形態において、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ６Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＫＳ６２細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＯＳ細胞、Ｈ９細胞、またはそれらの派生体もしくは機能的等価体から選択される。さらにさらなる実施形態において、哺乳動物宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞であり、またはＨＥＫ２９３細胞に由来する。そのような細胞は、接着性の細胞株（すなわち、細胞は、表面に付着する単層で成長する）、または懸濁適合／非接着性の細胞株（すなわち、細胞は培養培地において懸濁状態で成長する）であることが可能であろう。さらにさらなる実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ６Ｅ細胞である。用語「ＨＥＫ２９３細胞」は、バイオテクノロジーにおいて一般に使用されるヒト胚性腎臓２９３細胞株を示す。特に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、様々なレトロウイルスベクターの産生のために一般に使用されている。好適な市販細胞株の他の例には、Ｔ ＲＥＸ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞株が含まれる。

本明細書中で定義される方法を使用して形質導入される宿主細胞は、高力価のレトロウイルスベクターを産生するために使用される場合がある。

用語「高力価」に対する本明細書中での言及は、標的細胞（例えば、患者細胞など）に形質導入することができるレトロウイルスベクターまたはモジュール／粒子の効果的な量を示す。１つの実施形態において、高力価は、濃縮することなく１０^６ＴＵ／ｍｌを超えている（ＴＵ＝形質導入単位）。

当業者は、本明細書中に記載されるような本発明のモジュールを含む核酸ベクターを宿主細胞に導入することが、この技術分野において知られている好適な方法を使用して、例えば、脂質媒介トランスフェクション（リポフェクション）、マイクロインジェクション、細胞融合（例えば、ミクロセル融合など）、エレクトロポレーション、化学物質に基づくトランスフェクション方法、または微粒子銃を使用して実施され得ることを認識しているであろう。核酸ベクターを導入するために使用するための方法を選ぶことが、使用される哺乳動物宿主細胞のタイプに依存して選定され得ることが理解されるであろう。１つの実施形態において、導入工程（ａ）が、リポフェクション、エレクトロポレーション、または化学物質に基づくトランスフェクション方法を使用して実施される。さらなる実施形態において、核酸ベクターはリポフェクションによって宿主細胞に導入される。代替となる実施形態において、核酸ベクターは、化学物質に基づくトランスフェクション方法によって、例えば、リン酸カルシウム処理などによって宿主細胞に導入される。様々なリン酸カルシウム処理が、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａから商用的に利用可能である。

本明細書中に記載される方法において使用される条件は、使用される宿主細胞に依存するであろうことが当業者によって理解されるであろう。典型的な条件、例えば、使用されることになる培養培地または温度は、この技術分野において広く知られている（例えば、Ｋｕｔｎｅｒ他（２００９）、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、４（４）；４９５－５０５を参照のこと）。１つの実施形態において、培養工程（ｂ）が、哺乳動物宿主細胞を加湿条件下でインキュベーションすることによって実施される。さらなる実施形態において、加湿条件は、トランスフェクションされた細胞を５％のＣＯ_２において３７℃でインキュベーションすることを含む。１つの実施形態において、培養工程（ｂ）が、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、または血清非含有のＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（商標）培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１２－７２５Ｆ）、またはＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１２３３８ ０１８）から選択される培養培地を使用して実施される。

１つの実施形態において、方法は加えて、複製欠損レトロウイルスベクター粒子を単離することを含む。例えば、１つの実施形態において、分離することが、フィルターを使用することによって実施される。さらなる実施形態において、フィルターは、タンパク質低結合性メンブラン（例えば、０．２２μｍのタンパク質低結合性メンブランまたは０．４５μｍのタンパク質低結合性メンブラン）であり、例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）またはポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）の人工メンブランなどである。

１つの実施形態において、複製欠損レトロウイルスベクター粒子は、導入工程（ａ）後７２時間以降は単離されない。さらなる実施形態において、複製欠損レトロウイルスベクター粒子は導入工程（ａ）後４８時間～７２時間の間で単離され、例えば、４８時間、４９時間、５０時間、５１時間、５２時間、５３時間、５４時間、５５時間、５６時間、５７時間、５８時間、５９時間、６０時間、６１時間、６２時間、６３時間、６４時間、６５時間、６６時間、６７時間、６８時間、６９時間、７０時間、７１時間または７２時間で単離される。

単離されると、レトロウイルスベクター粒子はインビボ適用のために濃縮される場合がある。濃縮方法には、例えば、超遠心分離、沈殿またはアニオン交換クロマトグラフィーが含まれる。超遠心分離が、小規模でのレトロウイルスベクター濃縮のための迅速な方法として有用である。代替において、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑアニオン交換膜カートリッジを使用して）、または沈降反応（例えば、ＰＥＧ６０００を使用して）が、大量のレンチウイルスベクター上清を処理するために特に有用である。

本発明のさらなる態様によれば、複製欠損レトロウイルスベクター粒子を産生させる方法であって、
（ａ）本発明の核酸モジュールを含む核酸ベクター（例えば、本明細書中に記載されるようなＢＡＣ）を哺乳動物宿主細胞の培養物に導入すること、および
（ｂ）前記哺乳動物宿主細胞を、前記複製欠損レトロウイルスベクター粒子が産生される条件のもとで培養すること、
（ｃ）前記複製欠損レトロウイルスベクター粒子を単離すること
を含む方法が提供される。

そのような複製欠損レトロウイルスベクター粒子はその後、例えば、好適な賦形剤（例えば、エクスビボ使用のための細胞培養培地など）、または治療における使用のための、例えば、対象（例えば、その必要性のあるヒト対象など）への投与のための好適な医薬用賦形剤と配合されることが可能である。

本発明のさらなる態様によれば、本明細書中で定義されるような本発明の方法によって得ることができる、または得られる複製欠損レトロウイルスベクター粒子が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、複製欠損レトロウイルスベクター粒子を産生させる方法における使用のための本明細書中で定義されるような本発明の核酸モジュールを含む核酸ベクターが上記で述べられたように提供される。

本発明の１つの実施形態において、レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノムの多数のコピーが核酸ベクターに含まれる。ＲＮＡゲノムの多数のコピー体は、より高いウイルスベクター力価をもたらすことが予想される。例えば、核酸ベクターは、レトロウイルスベクター粒子のＲＮＡゲノムを２コピーまたはそれ以上（例えば、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー、８コピー、９コピーまたは１０コピーあるいはそれ以上）含む場合がある。

以下、限定されない実施例を参照して、本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１：ＰＫＧｎｏＳＡを作製するためのＰＧＫプロモーターの隠れたスプライスアクセプター部位の欠失
ヒトＰＧＫプロモーター内に見出される隠れたスプライスアクセプターを特定した後、ＰＧＫプロモーターの３’端に位置する（スプライスアクセプター活性に不可欠な）ＡＧジヌクレオチドを、以下で記載されるように欠失のための標的とした。

この欠失を達成するために、オリゴヌクレオチドｎｏＳＡ＿１ＦとオリゴヌクレオチドｎｏＳＡ＿１Ｒとを一緒になるようにアニーリングさせ、その結果、アニーリング生成物が、ＢｓｐＥ１およびＥｃｏＲＩにより制限酵素消化されたＤＮＡとの適合性を有する「粘着性」末端を有するようにした（図２ａを参照のこと）。

アニーリング生成物を、ＢＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩの制限酵素により消化されていた第３世代の自己不活性化レンチウイルスベクタープラスミドＢｍｏｄＴ－ＰＧＷに連結した。ＢｍｏｄＴ－ＰＧＫｎｏＳＡ ＧＷと称される得られたプラスミドは、（図２ｂに示されるように）８塩基対が欠失していた：隠れたスプライスアクセプターのＡＧジヌクレオチドおよび隣接するＡｖｒＩＩ制限部位。

ＰＧＫプロモーターのすぐ３’側に位置するこのＡｖｒＩＩ部位は、ＰＧＫからの欠失されたジヌクレオチドに効果的に取って代わることができたであろうＡＧジヌクレオチドを含有するので、この部位を除いた。したがって、この部位でのスプライス受容活性が継続したかもしれない。ＢｍｏｄＴ－ＰＧＷと、ＢｍｏｄＴ－＿ＰＧＫｎｏＳＡ ＧＷとの間における配列アラインメントが図２ｂに示される。変異は制限消化およびサンガー配列決定によって確認された。標的となった８ｂｐ欠失を除いて、構築物は同一である。

実施例２：ＰＧＫプロモーターの隠れたスプライスアクセプターを欠失することの導入遺伝子発現および力価に対する影響の判定
導入遺伝子発現に対するＰＧＫｎｏＳＡ（配列番号２０）の影響を評価するために、それぞれの移入プラスミド（ＢｍｏｄＴ－ＰＧＷ、およびＢｍｏｄＴ－ＰＧＫｎｏＳＡ ＧＷ）を、すべての第３世代パッケージング成分（Ｒｅｖ、Ｇａｇ、ｐｏｌおよびＶＳＶｇ）を（国際公開ＷＯ２０１７／０８９３０７および国際公開ＷＯ２０１７／０８９３０８に記載されるような）Ｔｅｔリプレッサー（Ｔｅｔ－Ｏｎ構成）の制御下でコードする構築物であるＢＡＣ１－ｐａｘとともに同時トランスフェクションした。

移入プラスミドを等モル量でのＢＡＣ１－ｐａｘと混合し、ＰＥＩｐｒｏと複合体化させた。その後、ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体をＨＥＫ２９３Ｔの懸濁適合（ＨＥＫ２９３Ｔｓａ）細胞にトランスフェクションした。ドキシサイクリンおよび酪酸ナトリウムを、転写を誘導するためにトランスフェクション後２４時間で加えた（それぞれ、２μｇ／ｍＬおよび５ｍＭ）。

トランスフェクションの２日後、細胞を、Ｅｖｏｓ Ａｍｆｕ ＦＬ３００倒立顕微鏡を使用してＧＦＰタンパク質について画像化した（図３ａ）。すべての画像を、同じ設定を使用して取り込んだ。示されるように、ＧＦＰタンパク発現が、ＢｍｏｄＴ－ＰＧＫｎｏＳＡ ＧＷによりトランスフェクションされた細胞では、ＢｍｏｄＴ－ＰＧＷによる場合よりも低かった。

トランスフェクション効率について考慮するために、効果を定量化するために、かつ、形質導入された細胞における力価および導入遺伝子発現に対するどのような影響であれ評価するために、細胞懸濁物を５００ｇでの３分間の遠心分離によって清澄化した。ベクター含有上清を採取し、物理的力価および機能的力価についてアッセイし、一方で、細胞ペレットを２％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。すべての細胞が等量のＢＡＣ１－ｐａｘによりトランスフェクションされたので、また、物理的力価はｇａｇ－ｐｏｌ発現に依存しており、しかし移入プラスミドには無関係であるので、物理的力価を使用して、トランスフェクション効率をモニターした。

機能的力価を求めるために、異なる量のベクター含有細胞培養培地をＨＥＫ２９３Ｔｓａ細胞に加えた。細胞を形質導入の３日後にフローサイトメトリー分析に供して、ＧＦＰを発現する細胞の割合を求めた。隠れたスプライスアクセプターの除去がＰＧＫプロモーター活性に影響するかを評価するために、ＧＦＰ＋細胞のメジアン蛍光強度を調べた。

図３ｂは、トランスフェクションプールに含まれるすべての単一細胞の平均蛍光強度、およびＧＦＰ＋形質導入細胞のメジアン蛍光強度を示す。すべての単一細胞の平均蛍光強度を、弱いＧＦＰ発現細胞をどのようなＧＦＰ＋ゲートからであっても除外することを避けるためにトランスフェクション細胞において選択した。

図３ｃは、隠れたスプライスアクセプターが除かれることのトランスフェクション効率および力価に対する影響を示す。機能的力価および物理的力価の両方が両方のベクター（ＰＧＫおよびＰＧＫｎｏＳＡ）について類似しており、このことは、隠れたスプライスアクセプターの除去がベクター産生またはベクター感染性に対する影響を何ら有していないことを示しており、一方で、トランスフェクションされた産生者たる細胞の蛍光強度がＰＧＫｎｏＳＡの場合、ＰＧＫの１０分の１よりも小さかった。

結果および結論：
この測定を使用すると、トランスフェクションされた細胞では平均蛍光強度が約１３分の１に低下することが、ＰＧＫに対してＰＧＫｎｏＳＡを使用して認められ、一方で、形質導入された細胞における導入遺伝子発現に対する影響は何ら認められなかった（図３ａ～図３ｃ）。この知見は、産生者たる細胞における導入遺伝子発現が、５’側ＬＴＲから生じるスプライシングされた転写物の翻訳に由来するという観察結果と一致している。したがって、このスプライスアクセプターの除去は、導入遺伝子発現を産生者たる細胞において低下させている。

対照的に、導入遺伝子発現が、形質導入された細胞ではもっぱら導入遺伝子カセット内のプロモーター（例えば、ＰＧＫ）によって行われる。重要なことに、図３ｂに示されるデータは、ＰＧＫプロモーターの３’端におけるＡＧジヌクレオチドが、形質導入された細胞におけるＰＧＫ活性に対する影響を何ら伴うことなく、または無視できるほどの影響を伴って除去され得ることを明らかにする。

上記に記載される実験の結果は、ハイブリッドＬＴＲプロモーターによって行われる導入遺伝子発現（すなわち、スプライシングされたｍＲＮＡにおける５’側ＯＲＦが導入遺伝子のＯＲＦである導入遺伝子発現）をもたらすことができるであろう導入遺伝子カセットにおける隠れたスプライスアクセプターの特定およびそれに続く除去が実際に、導入遺伝子発現を産生者たる細胞において低下させるための効果的な方策であることを明らかにしている。この方策はＰＧＫプロモーターに限定されず、本明細書中に記載されるような多くの他のプロモーターに対して適用することができるであろう。

実施例３：導入遺伝子からのスプライシングを最小限のＯＲＦに転用するためのスプライストラップの使用
しかしながら、実施例２に記載される方策に関して、ａ）ＬＴＲ由来転写物からの導入遺伝子発現を可能にし得るであろう、可能性のある隠れたスプライスアクセプターを最初に特定しなければならず、また、ｂ）プロモーター配列内の配列の変異誘発はまた、導入遺伝子発現を形質導入された細胞において変化させるかもしれず、このことは、それぞれのプロモーターについて評価される必要があるであろう。

したがって、導入遺伝子発現を産生者たる細胞において低下させための代替方策で、これらの制限を克服する代替方策が考案された。これには、産生者たる細胞における導入遺伝子発現の大多数が、ＬＴＲから生じるスプライシングされた転写物に起因することが示されているので、様々な「スプライストラップ」の使用が伴う。これらは、コンセンサスなスプライスアクセプター部位と、それ続いて最小限のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とが含まれる短い配列である。本発明者らはこれらのスプライストラップを導入遺伝子カセットのすぐ上流側に配置し、その結果、スプライストラップがＬＴＲ由来ｍＲＮＡにおける導入遺伝子カセットよりも前に転写され、しかし、導入遺伝子カセット由来ｍＲＮＡから除外されるようにした。これらの配列は、スプライシングされる運命にあるＬＴＲ由来ｍＲＮＡを捕捉し、したがって、スプライシングを導入遺伝子カセットからそらすために設計された。実施例３において使用されるベクターに存在するエレメントの配置を示す概略図が図１０に示される。主要なスプライスドナーと併せてスプライスアクセプターとして使用されるとき、スプライシングされたｍＲＮＡは、導入遺伝子にではなく、最小限のＯＲＦに属する５’側の開始コドンを有するであろう。最小限のＯＲＦは、開始コドンと、その後に続く終止コドンとからなる。哺乳動物リボソームは５’側ＯＲＦスキャニング機構を翻訳開始のために利用し、終止コドンに到達すると分解するので、下流側のＯＲＦ（例えば、導入遺伝子）が効率的に翻訳されることは起こりそうにない。それにもかかわらず、第２の最小限のＯＲＦが第１の最小限のＯＲＦのそばに配置され、その結果、リボソームが、スプライストラップを利用しているどのようなｍＲＮＡにおいてであれ導入遺伝子に到達する前に開始コドンおよび終止コドンの少なくとも２つを読み通さなければならないようにされた。さらに、開始を第１の最小限のＯＲＦにおいて促進させるために、Ｋｏｚａｋ配列が、リボゾーム開始を促進させるように含まれた。したがって、そのようなプロセシングされたｍＲＮＡからの導入遺伝子の効率的な翻訳は起こりそうにない。

２つのスプライストラップ（ＳＴ１およびＳＴ２）を、公開されたスプライスアクセプターコンセンサス配列に基づいて設計した。第３のスプライストラップ（ＳＴ３）では、ＰＧＫプロモーター内に特定されるスプライスアクセプターが使用された。スプライストラップ４およびスプライストラップ５（ＳＴ４およびＳＴ５）では、ＥＦ１プロモーター由来の広く知られているスプライスアクセプター、またはＣＡＧプロモーターにおいて使用されるウサギベータ－グロビンのスプライスアクセプターがそれぞれ使用された。最後のスプライストラップ（ＳＴ６）では、導入遺伝子発現をγ－レトロウイルスベクターにおいて改善するために記載されるスプライスアクセプター配列が使用された（Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ他、１９９９、Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ５’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｍｅｄｉｃａｌ ｕｓｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３（５）、４０８３－４０８９）。これらのスプライスストラップの配列が表２に示される。すべてのスプライストラップを、相補的なオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングすることによって組み立て（例が図４ａに示される）、ＢｍｏｄＴ－ＰＧＷにＣｌａＩ制限部位とＤｒａＩＩＩ制限部位との間においてクローン化して、ＢｍｏｄＴ－ＳＴ＃－ＰＧＷを作製した。構築物同一性が制限消化およびサンガー配列決定によって確認された。得られた移入プラスミドをそれぞれ、ＰＥＩｐｒｏを使用して第３世代パッケージングプラスミドとともにＨＥＫ２９３Ｔｓａ細胞に同時トランスフェクションした。前記のように、トランスフェクションされた細胞をフローサイトメトリーによって平均蛍光強度について分析し、一方で、ベクター上清を物理的力価および機能的力価についてアッセイした。導入遺伝子発現に対する影響を、形質導入された細胞のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによって評価した。結果が図４ｃに示される。

図４ｃに示されるように、調べられたスプライストラップはどれもが、ＰＧＫ活性に対する影響を、（図４ｃにおいて白抜きの棒として示される）形質導入された細胞において有していなかった。しかしながら、導入遺伝子発現は、スプライストラップ１、スプライストラップ２、スプライストラップ４およびスプライストラップ５が存在するときにはおよそ５分の１～１０分の１に低下することが見出された。（図４ｄに示されるような）力価データに基づいて、ＳＴ６を使用するトランスフェクションは他の構築物よりも効率的でないようであった：このことは、ＳＴ６のＭＦＩが過小評価されたことを示している。したがって、スプライストラップ３およびスプライストラップ６は、導入遺伝子発現を産生者たる細胞において低下させることにおいて比較的効果的でなかった。スプライストラップ設計物の間での（上記で記載されるような）成績における差異は、コンセンサスなスプライスアクセプターに対するそれらの相対的適合度によって説明することができる。ＭａｘＥｎｔＳｃａｎからのそれらのスコアが図５に示され、ヒトスプライスファインダー（ＨＳＦ）スコアも含む下記の表４にも示される。既に上記で記載されたように、スプライストラップ３およびスプライストラップ６のスコアは不良であり、一方、それら以外のスプライストラップはスコアが１２を超えている。

これらの結果から、本発明者らは、本発明において使用されるスプライストラップは好ましくは、最適に働くためには、（Ｙｅｏ＆Ｂｕｒｇｅ、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２００４；１１（２－３）、ｐｐ３７７－９４において記載されるように実施される）ＭａｘＥｎｔＳｃａｎスコアが、導入遺伝子発現をもたらすプロモーターにおけるスプライスアクセプターのＭａｘＥｎｔＳｃａｎスコアよりも大きいことを提案する。代替において、本発明において使用されるスプライストラップのＭａｘＥｎｔＳｃａｎは、約８．７より大きいスコアを有する。このことが下記の表５に要約される。

結論として、このデータは、スプライストラップが、推定的にはスプライシングを主要なスプライスドナーからスプライストラップに仕向けることによって、すなわち、これにより、リボソームを導入遺伝子にではなくむしろ最小限のＯＲＦに呼び寄せるｍＲＮＡが生じることによって、導入遺伝子発現を産生者たる細胞において効果的に低下させるために使用できることを示す。

実施例４：治療用導入遺伝子を発現するＢＡＣ構築物
レンチウイルスベクターを産生させるために要求されるすべてのベクター成分（ｇａｇｐｏｌ、ＶＳＶｇ、ｒｅｖおよび移入ベクター）、ならびにゼオシン耐性マーカーが、ただ１つの大きいＤＮＡ構築物から発現される細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ構築物を操作した。ベクターパッケージング成分がテトラサイクリン誘導性プロモーターによって制御されるので、ウイルス粒子の産生を培養におけるドキシサイクリンまたはテトラサイクリンの添加によって誘導することができる。移入ベクター配列は、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（これは遺伝子Ｘと呼ばれる）、同様に（ｉｉ）膜タンパク質（これは遺伝子Ｙと呼ばれる）の両方をコードする導入遺伝子を含有しており、これらは、野生型ＰＧＫプロモーター（ｗｔＰＧＫ）、またはスプライスアクセプターとして機能するその能力を欠失するために改変される、ここではＰＧＫｎｏＳＡ２（配列番号１９）と呼ばれるＰＧＫプロモーターのすぐ３’側である（配列番号１９～配列番号２１に示されるように、野生型ＰＧＫプロモーターに関して、ＰＧＫｎｏＳＡ２では３’側Ｇのみが欠失され、これに対して、ＰＧＫｎｏＳＡでは両方の３’側ＡＧが欠失されることを除いて、ＰＧＫｎｏＳＡ２は、本明細書中に記載されるＰＧＫｎｏＳＡと同じであることに留意すること）。移入ベクターにおけるエレメントの配置が図１０に示される。

これらのＢＡＣ ＤＮＡ構築物を、ＰＥＩに基づくトランスフェクション試薬（例えば、ＰＥＩｐｒｏ（商標））を使用して懸濁適合ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。２日後、細胞を、ゼオシンが補充される培地において培養した。その後、ゼオシン耐性の安定なプールが生じた。液滴における単一細胞を、成長培地を含有する９６ウェルプレートに置いた。単一細胞に由来するコロニーが培養において１９日後～２１日後に形成された。

３つの安定なプール（ＳＰ１～ＳＰ３）を、導入遺伝子（遺伝子ｘおよび遺伝子Ｙ）をｗｔＰＧＫプロモーターまたはＰＧＫｎｏＳＡ２プロモーターの制御下で発現させるＢＡＣ ＤＮＡ構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、ゼオシンに対する耐性について選択することによって得た。レンチウイルス産生を誘導し、上清を集め、上清のｐ２４の力価（ｐｇ／ｍＬ）を測定した。レンチウイルス産生のドキシサイクリンによる誘導の後、ｗｔＰＧＫ構築物により生じる安定なプールは、ＰＧＫｎｏＳＡ２構築物により生じる安定なプールよりも有意に少ない量のレンチウイルスベクター（ｐｇ／ｍＬ ｐ２４）を産生した（図６）。３つの安定なプールについての平均ｐ２４力価がｗｔＰＧＫまたはＰＧＫｎｏＳＡ２についてそれぞれ８，８０３および１１１，０００であり、このことは１２．５６倍の差を表した（図６）。

安定なプールを生じさせた後、単一細胞を、ｗｔＰＧＫ型の安定なプール３およびＰＧＫｎｏＳＡ２型の安定なプール２のそれぞれについてプレートあたり９６ウェルの２４枚のプレートに置いた。単一細胞に由来するコロニーが培養において３週間後に形成された（コロニーが形成された）。その後、これらのコロニーを選び取り、ゼオシン選択の存在下で４ｍＬの最少量の培養物にさらに拡大した（クローンを成長させた）。レンチウイルス産生をそれぞれのクローンについて誘導し、上清を集めた。ｐ２４の力価（ｐｇ／ｍＬ）を求め、１Ｅ４ ｐｇ／ｍＬ超のクローンの数を計数した。上清のＴＵ／ｍＬを、形質導入されたＳｕｐＴ１細胞における形質導入単位の数を定量化することによって測定し、１Ｅ７ ＴＵ／ｍＬ超のクローンの数を計数した。

ｗｔＰＧＫ構築物がトランスフェクションされる細胞のうち、２４個の単一細胞由来コロニーが９６ウェルプレートにおいて形成されたにすぎず、それらのうちの１１個が首尾よく、４ｍＬ以上のスケールに懸濁培養で拡大された。ドキシサイクリンによる誘導の後、１Ｅ４ ｐｇ／ｍＬ超のｐ２４が１１個中２個のクローンの上清において検出された。感染力価が、最大のｐ２４力価を有するクローンにおいてさえ検出されず（表６）、移入ベクター配列がこのクローンには存在しなかった（図７）。

対照的に、ＰＧＫｎｏＳＡ２構築物がトランスフェクションされる細胞のうち、１４４個の単一細胞由来コロニーが９６ウェルプレートにおいて形成され、それらのうちの８９個が首尾よく、４ｍＬ以上のスケールに懸濁培養で拡大された。ドキシサイクリンによる誘導の後で、１Ｅ４ ｐｇ／ｍＬ超のｐ２４が３６個のクローンの上清において検出され、１Ｅ７ ＴＵ／ｍＬ超の感染力価が、より高いｐ２４力価を有する１９個のクローンにおいて検出され（表６）、移入ベクター配列がこれらのクローンには存在した（図７）。

ほんの少量のレンチウイルス粒子（ｐｇ／ｍＬ ｐ２４）が誘導後のｗｔＰＧＫ構築物由来クローンに存在し、しかし、多量のレンチウイルス粒子が誘導後のＰＧＫｎｏＳＡ２クローンの多くに存在した（図８）。レンチウイルス感染力価が誘導後のｗｔＰＧＫ構築物由来クローンにおいて何ら検出されず、しかし、高い感染力価が誘導後のＰＧＫｎｏＳＡ２クローンの多くに存在した（図９）。

要約すると、本発明者らは、遺伝子Ｘおよび遺伝子Ｙをコードする本発明者らの治療用導入遺伝子カセットが、構成的に発現されるときには、高力価の産生者たる細胞株を生じさせることができないであろうように産生者たる細胞に対して細胞毒性であることを見出した。この問題が、高力価のレンチウイルスベクターを産生することができる安定な細胞株の生成を可能にした、ＰＧＫにおけるスプライスアクセプターを除くこと（ＰＧＫｎｏＳＡ２）によって解決された。

配列表

Claims (35)

1. 少なくとも１つの導入遺伝子をコードする核酸モジュールであって、
   （ａ）第１のプロモーターであって、
   （ｉ）シス作用レトロウイルスエレメント（例えば、ＬＴＲなど）、
   （ｉｉ）スプライスドナー部位を含むレトロウイルスリーダー配列
   をコードするレトロウイルス核酸配列に機能的に連結される、第１のプロモーター、および
   （ｂ）前記導入遺伝子に機能的に連結される導入遺伝子発現のための第２のプロモーター
   を含んでなり、
   導入遺伝子発現のための前記第２のプロモーターが、（ａ）弱まったスプライスアクセプター部位を含むように改変される、ならびに／あるいは（ｂ）前記第２のプロモーターが、前記プロモーターの上流側および／または下流側に配置されるスプライストラップ配列を有し、前記スプライストラップ配列により、その位置におけるスプライシングが低下させられる、または排除される、モジュール。
2. 前記スプライスアクセプター部位が、（ｉ）完全な欠失、（ｉｉ）部分的な欠失、（ｉｉｉ）挿入、（ｉｖ）置換から選択される前記部位の少なくとも１つの改変によって弱められる、請求項１に記載のモジュール。
3. 前記レトロウイルス核酸配列が、ｇａｇタンパク質、ｐｏｌタンパク質およびｅｎｖタンパク質（またはそれらの機能的等価体）と、同様に非哺乳動物の複製起点とをコードする、請求項１または２に記載のモジュール。
4. 前記レトロウイルス核酸が、レンチウイルス、アルファ－レトロウイルス、ガンマ－レトロウイルスまたはフォーミーレトロウイルスに由来する、請求項１～３のいずれか一項に記載のモジュール。
5. 前記レトロウイルス核酸がレンチウイルスに由来する、請求項１～４のいずれか一項に記載のモジュール。
6. 前記レンチウイルスが、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶおよびＶｉｓｎａから選択される、請求項５に記載のモジュール。
7. スプライストラップ配列を含み、前記スプライストラップ配列が、９を超えるＭａｘＥｎｔＳｃａｎスプライスアクセプタースコアを有するそのような配列からどのようなものであれ選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載のモジュール。
8. スプライストラップ配列を含み、前記スプライストラップ配列が、ＳＴ１、ＳＴ２、ＳＴ４もしくはＳＴ５と呼ばれるスプライストラップのいずれか１つまたはその機能的フラグメントから選択される、請求項７に記載のモジュール。
9. スプライストラップ配列を含み、前記配列の後には、約５０コドン未満である最小限のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が続く、請求項８に記載のモジュール。
10. スプライストラップ配列を含み、前記スプライストラップ配列が、（ｉ）前記導入遺伝子のすぐ上流、（ｉｉ）主要なスプライスドナー部位（ＭＳＤ）と導入遺伝子カセット転写開始部位との間、または（ｉｉｉ）ＭＳＤとポリＡとの間から選択される位置にある、請求項１～９のいずれか一項に記載のモジュール。
11. 前記第１のプロモーターがＣＭＶまたはＲＳＶであり、前記第２のプロモーターが、ＳＶ－４０、ＰＧＫ、ＥＦＳ、ＳＦＦＶ、およびＵｂｃから選択され、前記導入遺伝子に機能的に連結される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のモジュール。
12. 前記導入遺伝子が治療用導入遺伝子である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のモジュール。
13. 前記レトロウイルス核酸が、ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２に由来するレンチウイルス核酸であり、かつ、弱まったスプライスアクセプター部位、および／または前記導入遺伝子に機能的に連結されるスプライストラップを有するヒトＰＧＫプロモーターである第２のプロモーターをさらに含んでなる、請求項１１または１２に記載のモジュール。
14. 前記ＰＧＫプロモーターが、全体または一部において欠失したスプライスアクセプター部位を含むように改変され、かつ、前記スプライスアクセプター部位が前記ＰＧＫプロモーター配列の最後の２塩基対のアデニンおよびグアニンの位置に位置する、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のモジュール。
15. 前記改変されたＰＧＫプロモーターが、配列番号１９または配列番号２０に示される核酸配列を有する、請求項１４に記載のモジュール。
16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸モジュールを含んでなる、ベクター。
17. プラスミドである、請求項１６に記載のベクター。
18. 少なくとも２５ｋｂのＤＮＡを収容することができる細菌人工染色体（ＢＡＣ）であり、かつ、請求項３～１４のいずれかに記載の核酸モジュールを含む、請求項１６に記載のベクター。
19. 請求項１～１４に記載の核酸モジュールまたは請求項１６～１８に記載のベクターを含んでなる、細胞。
20. 哺乳動物細胞であり、かつ、請求項１８に記載のベクターを含む、請求項１９に記載の細胞。
21. 治療用導入遺伝子を発現する複製欠損レトロウイルスベクター粒子を産生させる方法であって、下記の工程：
    （ａ）請求項３～１４に記載の核酸モジュールまたは請求項１８に記載のベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物に導入する工程、および
    （ｂ）前記哺乳動物宿主細胞を、前記複製欠損レトロウイルスベクター粒子が産生される条件のもとで培養する工程、および
    （ｃ）前記複製欠損レトロウイルスベクター粒子を単離する工程
    を含んでなる、方法。
22. 治療用導入遺伝子を発現する複製欠損レトロウイルスベクター粒子を産生させる方法であって、下記の工程：
    （ａ）（ｉ）請求項１に記載の核酸モジュールを哺乳動物細胞の培養物に導入し、かつ、同様に、（ｉｉ）ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのレトロウイルス配列ならびに非哺乳動物の複製起点をコードする１つまたは複数のさらなる核酸モジュールを前記細胞に導入する工程、および
    （ｂ）前記哺乳動物宿主細胞を、前記複製欠損レトロウイルスベクター粒子が産生される条件のもとで培養する工程、および
    （ｃ）前記複製欠損レトロウイルスベクター粒子を単離する工程
    を含んでなる、方法。
23. 請求項２１または２２に記載の方法によって得られる、または得ることができる、複製欠損レトロウイルス。
24. 治療用導入遺伝子を発現するレンチウイルスである、請求項２３に記載の複製欠損レトロウイルス。
25. 弱まったスプライスアクセプター部位、および／または前記治療用導入遺伝子に機能的に連結されるスプライストラップを伴うＰＧＫプロモーターを含む、請求項２３または２４に記載の複製欠損レトロウイルス。
26. ＳＴ１、ＳＴ２、ＳＴ４もしくはＳＴ５と呼ばれるスプライストラップのいずれか１つまたはその機能的フラグメントから選択されるスプライストラップを含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の複製欠損レトロウイルス。
27. 請求項２３～２６のいずれか一項に記載の複製欠損レトロウイルスと、医薬的に許容され得る賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
28. 治療において使用されるための、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の複製欠損レトロウイルスまたは請求項２７に記載の医薬組成物。
29. エクスビボ細胞形質導入において使用されるための、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の複製欠損レトロウイルスまたは請求項２７に記載の医薬組成物。
30. 哺乳動物細胞をインビトロにおいて遺伝子改変する方法であって、（ｉ）請求項２３～２６のいずれか一項に記載の複製欠損レトロウイルスを前記細胞に導入すること、その後、（ｉｉ）前記細胞を成長のために好適な条件のもとで培養することを含んでなる、方法。
31. 前記細胞がヒト細胞である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記ヒト細胞が自家細胞である、請求項３１に記載の方法。
33. 請求項３０～３２のいずれか一項に記載の方法によって得られる、または得ることができる、細胞。
34. 請求項３０～３２のいずれか一項に記載の細胞を、医薬的に許容され得る賦形剤との組み合わせで含んでなる、医薬組成物。
35. 疾患の処置をその必要性のあるヒト対象において行う方法であって、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の複製欠損レトロウイルス、請求項３０もしくは３１に記載の細胞、または請求項３４に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含んでなる、方法。

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