JP7110096B2 - レトロウイルス産生のための一時的トランスフェクション法 - Google Patents
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Description
gagおよびpolタンパク質;ならびに
envタンパク質またはその機能的置換体;
をコードするレトロウイルス核酸配列を含んでなることを特徴とする核酸ベクターが提供される。
(a)本明細書に定義される核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物に導入すること;および
(b)前記哺乳動物宿主細胞を複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が産生される条件下で培養すること
を含んでなる方法が提供される。
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で参照される総ての特許および刊行物は、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。
本発明の第1の面によれば、非哺乳動物複製起点と少なくとも25キロベース(kb)のDNAを保持する能力とを含んでなる核酸ベクターであって、
gagおよびpolタンパク質;ならびに
envタンパク質またはその機能的置換体;
をコードするレトロウイルス核酸配列を含んでなることを特徴とする核酸ベクターが提供される。
用語「細菌人工染色体」または「BAC」は、大きな外因性DNAインサートを保持することができる細菌プラスミド由来のDNA構築物を意味する。それらは通常およそ350kbの最大DNAインサートを保持することができる。BACは、細菌の細胞分裂後にプラスミドの一様な分布を促進する分配遺伝子を含む、十分に特徴付けられた細菌機能的稔性プラスミド(Fプラスミド)から開発された。これはBACが安定に複製し、内在細菌ゲノム(例えば、大腸菌)とともに分離することを可能とする。BACは通常、少なくとも1コピーの複製起点(例えば、oriSまたはoriV遺伝子)、repE遺伝子(プラスミド複製およびコピー数の調節のため)および細菌細胞内でのBACの安定な維持を確保する分配遺伝子(例えば、sopA、sopB、parA、parBおよび/またはparC)を含む。BACは通常、環状およびスーパーコイル型であり、これはそれらをYACなどの直鎖人工染色体よりも回収容易とする。それらはまた、エレクトロポレーションなどの簡単な方法を用い、比較的容易に細菌宿主細胞に導入することもできる。
用語「酵母人工染色体」または「YAC」は、酵母DNAが細菌プラスミドに組み込まれている染色体を意味する。それらは自律的複製配列(autonomous replication sequence)(ARS)(すなわち、複製起点)、セントロメアおよびテロメアを含む。BACとは異なり、YACは直鎖であり、従って、宿主細胞後代に受け渡される際に、染色体の各末端に、その末端を分解から保護する酵母テロメアを含む。YACは、100~2000kbであれば、一定範囲のDNA挿入サイズを保持できる。
用語「P1由来人工染色体」または「PAC」は、P1バクテリオファージおよび細菌FプラスミドのDNAに由来するDNA構築物を意味する。それらは通常、およそ100~300kb最大DNAインサートを保持でき、大腸菌においてクローニングベクターとして使用される。PACは、精製および細菌宿主細胞への導入が容易など、BACと同様の利点を持つ。
用語「コスミド」は、バクテリオファージλに由来するcos部位を付加的に含む細菌プラスミドに由来するDNA構築物を意味する。コスミドは一般に、細菌複製起点(例えば、oriV)、選択マーカー、クローニング部位および少なくとも1つのcos部位を含む。コスミドは通常、40~45kbの最大DNAインサートを受容する。コスミドは、大腸菌細胞感染において標準的な細菌プラスミドよりも効率的であることが示されている。用語「フォスミド」は、細菌Fプラスミドに基づくこと以外はコスミドと同様の非哺乳動物核酸ベクターを意味する。特に、それらは、大きなDNA断片のクローニングを可能とするFプラスミド複製起点および分配機構を使用する。フォスミドは通常、40kbの最大DNAインサートを受容する。
レトロウイルスは、擬似二倍体一本鎖RNAゲノムを含むウイルス科である。それらは、RNAゲノムからDNAを産生する逆転写酵素をコードし、このDNAはその後、宿主細胞のDNAに挿入され得る。本明細書に記載の本発明は、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子を産生するために使用され得る。本発明のレトロウイルスベクター粒子は、任意の好適なレトロウイルスから選択されるか、またはそれに由来するものであり得る。
総てのレトロウイルスに共通の核酸配列は、次のようにより詳しく説明することができる:
長い末端反復配列(LTR):レトロウイルスゲノムの基本構造は、レトロウイルス産生に必要とされる遺伝子の間またはそれらが位置する範囲内に5’-LTRおよび3’-LTRを含んでなる。LTRはレトロウイルスの組込みおよび転写に必要とされる。それらはまた、レトロウイルス遺伝子の発現を制御するためのプロモーター配列として働くこともできる(すなわち、それらがシス作用遺伝子である)。LTRは、U3、R、U5と呼ばれる3つの部分領域から構成され、U3はRNAの3’末端にユニークな配列に由来し;RはRNAの量末端で反復する配列に由来し;U5はRNAの5’末端にユニークな配列に由来する。よって、一つの実施態様では、核酸ベクターは、5’-および3’-LTR を付加的に含んでなる。さらなる実施態様では、5’LTRのU5領域を欠失させ、非HIV-1ポリAテールに置換することができる(Hanawa et al. (2002) Mol. Ther. 5(3): 242-51参照)。
たはそれらのウイルスに由来する。さらなる実施態様では、envタンパク質またはその機能的置換体は、水疱性口内炎ウイルスから得られるか、またはそのウイルスに由来する。この実施態様では、レトロウイルス粒子がより広い宿主細胞範囲に感染し、野生型エンベロープタンパク質を産生するために組換えの機会を少なくすることを可能とする水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSVg)タンパク質が使用可能である。さらなる実施態様では、envタンパク質またはその機能的置換体をコードするレトロウイルス核酸配列は、ゲノム受託番号J02428.1の、例えば、塩基対3071~4720から取得可能な配列に由来する。
本発明の核酸ベクターは、さらなる付加的成分を含んでなり得る。これらの付加的特徴は、例えば、翻訳のために転写産物を安定化させる、遺伝子発現のレベルを増強する、および遺伝子転写のオン/オフを切り替える助けをするために使用され得る。
本発明のさらなる面によれば、レトロウイルスベクター粒子を産生する方法で使用するための本明細書に定義される核酸ベクターが提供される。本明細書に記載されるように、本発明は、主として、4プラスミドトランスフェクション系を単一の核酸ベクターへと縮小し、それにより使用する材料の量を低減することにより、一時的トランスフェクション法において記載の核酸ベクターを使用することの複数の利点を提供する。
本発明のさらなる面によれば、複製欠陥レトロウイルスベクター粒子を製造する方法であって、
(a)本明細書に定義される核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物に導入すること;および
(b)前記哺乳動物宿主細胞を複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が産生される条件下で培養すること
を含んでなる方法が提供される。
図1は、BACpack-WTGP-277delU5およびBACpack-SYNGP-277delU5の構築のための段階的ガイドを示す。XbaIおよびNheI消化の適合末端(the compatible ends)のために、レンチウイルスパッケージング遺伝子をpSmart BACベクターに段階的に搭載した。GagPolの付加に際して、野生型GagPol(WTGP)またはコドン最適化GagPol(SYNGP)のいずれかを含有する2つの構築物を作製した。これらをそれぞれBACpack-WTGPおよびBACpack-SYNGPと呼称した。次に、移入カセットをこれらの構築物の両方に負荷し、このようにしてBACpackWTGP-277delU5およびBACpackSYNGP-277delU5を作出した。
106個のHEK293T細胞を6ウェルプレートに播種した。翌日、接着細胞を、PEIを製造者の説明書に従って用いてトランスフェクトした。細胞に対し、pMDL.gp(GagPol)、pMD.G(VSVg)、pK-Rev(Rev)およびpCCL.277(GFP移入ベクター)からなる合計4μgの野生型(WT)レンチウイルスパッケージング構築物または2μgのBACpack(GagPol、VSVgおよびRevを含有する単一のBAC構築物)+2μgのeGFP移入ベクターのいずれかで個別のプラスミド上にトランスフェクトを行った。
(GFP陽性細胞/100)×希釈率×形質導入された細胞の数
を用い、形質導入単位(TU)/mLとして算出した。
本実施例では、GagPol、VSVgおよびRev発現カセットからなるBACpack構築物の能力を、GagPol、VSVgおよびRevが個別に送達される標準的な3プラスミドパッケージング系と比較した。両場合とも、ウイルスベクターの必須成分を完全なものとするため、移入ベクターを別個のプラスミドで一緒に送達した。
一時的トランスフェクション系におけるBACpack-277delU5構築物のレンチウイルスベクター産生能を確認するために、一時的トランスフェクションによりレンチウイルスベクターを産生するために慣用されている接着細胞株HEK293Tを、現行の4パッケージングプラスミド系、BACpackWTGP-277delU5またはBACpackSYNGP-277delU5のいずれかでトランスフェクトした。この2つのBACpack-277delU5構築物に、遺伝子発現がレンチウイルスベクター産生をもたらし得るかどうかを評価するために誘導を行うか、またはTetリプレッサー系の効率を試験するために誘導を行わずにおいた。
Claims (26)
- 非哺乳動物複製起点と少なくとも25キロベース(kb)のDNAを保持する能力とを含んでなる核酸ベクターであって、
前記核酸ベクターが細菌人工染色体であり、
gagおよびpolタンパク質;ならびに
envタンパク質;
をコードするレトロウイルス核酸配列を含んでなり、
前記レトロウイルス核酸配列のそれぞれが核酸ベクター内にそれ自体のプロモーターを有する、
核酸ベクター。 - レトロウイルスベクター粒子のRNAゲノムをコードする核酸配列を付加的に含んでなる、請求項1に記載の核酸ベクター。
- 補助遺伝子revまたはその類似遺伝子を付加的に含んでなる、請求項1または請求項2に記載の核酸ベクター。
- レトロウイルス核酸配列がレンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルスまたは泡沫状レトロウイルスから選択されるレトロウイルスに由来する、請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
- レトロウイルス核酸配列がHIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAVおよびVisnaからなる群から選択されるレンチウイルスに由来する、請求項4に記載の核酸ベクター。
- レトロウイルス核酸配列がHIV-1に由来する、請求項5に記載の核酸ベクター。
- envタンパク質が水疱性口内炎ウイルスに由来する、請求項1~6のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
- 転写調節エレメントを付加的に含んでなる、請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
- 転写調節エレメントがCMVプロモーターである、請求項8に記載の核酸ベクター。
- インスレーターを付加的に含んでなる、請求項1~9のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
- インスレーターが前記レトロウイルス核酸配列のそれぞれの間に存在する、請求項10に記載の核酸ベクター。
- 1以上の導入遺伝子を付加的に含んでなる、請求項1~11のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
- 内部リボソーム進入部位(IRES)を付加的に含んでなる、請求項1~12のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
- ポリAシグナルを付加的に含んでなる、請求項1~13のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
- イントロン配列を付加的に含んでなる、請求項1~14のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
- 多重クローニング部位(MCS)を付加的に含んでなる、請求項1~15のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
- レトロウイルスベクター粒子の製造方法において使用するための、請求項1~16のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
- 複製欠陥レトロウイルスベクター粒子の製造方法であって、
(a)請求項1~16のいずれか一項に記載の核酸ベクターを哺乳動物宿主細胞の培養物に導入すること;および
(b)前記哺乳動物宿主細胞を複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が産生される条件下で培養すること
を含んでなる、方法。 - 哺乳動物宿主細胞がHEK293細胞である、請求項18に記載の方法。
- 導入工程(a)がリポフェクション、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム処理などの化学薬品に基づくトランスフェクション法を用いて行われる、請求項18または請求項19に記載の方法。
- 培養工程(b)が哺乳動物宿主細胞を加湿条件下でインキュベートすることにより行われる、請求項18~20のいずれか一項に記載の方法。
- 複製欠陥レトロウイルスベクター粒子を単離することを付加的に含んでなる、請求項18~21のいずれか一項に記載の方法。
- 単離が低タンパク質結合膜などのフィルターを使用することにより行われる、請求項22に記載の方法。
- 複製欠陥レトロウイルスベクター粒子が導入工程(a)後72時間以内に単離される、請求項22または請求項23に記載の方法。
- 複製欠陥レトロウイルス粒子が導入工程(a)後48~72時間の間に単離される、請求項24に記載の方法。
- 前記哺乳動物宿主細胞が懸濁適応/非接着細胞株である、請求項18~25のいずれか一項に記載の方法。
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