PT1504108E - Vetor lentiviral - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "VETOR LENTIVIRAL" A presente invenção refere-se a um genoma de vetor lentiviral, a um sistema de produção de vetor lentiviral e a uma partícula de vetor lentiviral que compreende o genoma, e particularmente mas não exclusivamente, à sua utilização em terapia.

Sistemas de vetores lentivirais, tais como sistemas de vetores lentivirais, foram propostos como um sistema de administração para, inter alia, a transferência de um nucleótido de interesse para um ou mais locais de interesse. De facto, o conceito da utilização de vetores virais para terapia génica é bem conhecido (Verma e Somia (1997) Nature 389: 239-242). Os genomas de retrovírus contêm genes acessórios, tais como um gene rev, um gene tat, um gene vif, um gene nef, um gene vpr, ou um gene de S2. A supressão de tais genes acessórios, em particular quando se utiliza sistemas de vetores lentivirais em terapia génica é altamente vantajosa. Em primeiro lugar, permite que vetores sejam produzidos sem os genes que estão normalmente associados com a doença em infeções lentivirais (por exemplo, infeções por HIV). Em segundo lugar, a supressão de genes acessórios permite que o vetor empacote mais ADN heterólogo. Em terceiro lugar, os genes cuja função é desconhecida, tais como dUTPase e S2, podem ser omitidos, reduzindo assim o risco de causar efeitos indesejáveis. Ensinamos anteriormente, por exemplo, no nosso documento W098/17815, como remover muitos dos genes acessórios. Além disso, no nosso documento W099/45126 descrevemos a otimização de codões da sequência gag-pol 2 como meio de procurar como superar o requisito de Rev/RRE para exportar e para melhorar a estabilidade do ARN. No entanto, permanece a necessidade de proporcionar estratégias para o fornecimento de vetores virais úteis e seguros, e meios eficientes para a sua produção. A presente invenção aborda estes problemas e, em particular, vantajosamente, tem como objectivo proporcionar um sistema mais seguro, no qual os genes acessórios virais, tais como rev, não são necessários nem na partícula de vetor virai que é utilizada no tratamento nem na sua produção.

Kingsman SM, FDA/BRMA 2 5-26 de outubro de 2001 é um conjunto de slides intitulados "Safety Features In The Design, Manufacture and Clinicai Monitoring of

Lentivectors For The Treatment Of Parkinson's Disease, Prostate Câncer and AIDS".

Fuller M e Anson DS, Human Gene Therapy, 2001, 12: 2081- 2093 refere-se a plasmideos auxiliares para a produção de vetores derivados de HIV-1.

Num aspeto da presente invenção é proporcionado um genoma de vetor muiticistrónico que pode ser derivado de um lentivirus, para utilização num sistema de produção de lentivirus independente de rev para produzir uma partícula de vetor derivada de lentivirus, o referido genoma compreendendo um sinal de empacotamento, um quadro de leitura aberta (ORF, do inglês Open Reading Frame) heteróloga a jusante de uma LTR (do inglês Long Terminal Repeat) virai e a montante de um promotor, em que o promotor controla a expressão de pelo menos um nucleótido de interesse (NOI, do inglês Nucleotide of Interest) a jusante, e em que o ORF heterólogo é ligado de forma 3 operacional à LTR; em que a sequência de ácido nucleico que codifica o gene auxiliar rev é interrompida de tal modo que o referido gene auxiliar é incapaz de codificar a proteina auxiliar funcional, ou é removido do genoma de vetor lentiviral e em que o elemento de Resposta a Rev (RRE, do inglês Rev Response Element) é interrompido de tal modo que o referido RRE é não funcional, ou é removido do genoma de vetor lentiviral, e em que o vetor de lentivirus é um vetor lentiviral auto-inativante.

Desse modo, constatamos agora que é possivel proporcionar um vetor virai que é independente de rev sem efeito negativo sobre o titulo virai.

De preferência, o genoma do vetor é bi, tricistrónico ou quadricistrónico.

Numa forma de realização, a primeira sequência de ácido nucleico é uma unidade repórter ou um marcador selecionável.

Numa outra forma de realização a primeira sequência de ácido nucleico codifica um gene modulador.

De preferência, o gene modulador é selecionado de repressores de tetraciclina, tais como TetR e transativadores controlados por tetraciclina, tais como tTA e rtTA.

De preferência, o repressor de tetraciclina é codão otimizado para a expressão numa célula de mamifero. 4

De preferência, o repressor de tetraciclina está associado a um sinal de localização nuclear.

Numa forma de realização preferida, o vetor compreende ainda um ou mais NOIs a jusante do promotor interno.

De preferência, o NOI dá origem a um efeito terapêutico.

Numa forma de realização um ou mais dos NOIs estão operacionalmente ligados a um operador de tetraciclina.

Noutra forma de realização do vetor compreende um outro repressor de tetraciclina a jusante do promotor interno.

De preferência, o vetor é derivado de HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV ou lentivírus visna.

De preferência, o vetor é derivado de um lentivirus de não primata.

De preferência, o genoma do vetor compreende uma sequência de cPPT.

De preferência, o genoma do vetor compreende um elemento de regulação pós-transcricional ou um elemento de tradução.

De preferência, os motivos ATG do sinal de empacotamento de gag do genoma do vetor lentiviral do tipo selvagem são motivos ATTG. 5

De preferência, a distância entre as regiões R do genoma do vetor é substancialmente a mesma que no vetor lentiviral do tipo selvagem.

De preferência, a região 3' U3 do genoma do vetor inclui uma sequência de um promotor virai e/ou eucariótico.

De preferência, a região 3' U3 do genoma do vetor inclui um promotor virai e/ou eucariótico do tipo selvagem.

De preferência, o promotor virai é um EIAV ou região MLV U3.

Desse modo, de acordo com a presente invenção, é proporcionado um vetor lentiviral em que o vetor tem o seguinte: os motivos ATG do sinal de empacotamento do gag do vetor lentiviral do tipo selvagem são motivos ATTG; a distância entre as regiões R do vetor lentiviral é substancialmente a mesma que no vetor lentiviral do tipo selvagem; e a região 3' U3 do vetor lentiviral inclui sequência de um promotor virai e/ou eucariótico. De preferência, a região 3' U3 pode incluir sequência de EIAV ou região MLV U3, ou outros promotores virais ou eucarióticos. Numa forma de realização, a região 3' U3 pode incluir promotores virais do tipo selvagem ou eucarióticos.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um sistema de produção de vetor lentiviral para produzir uma partícula de vetor derivada de lentivírus, cujo sistema compreende um conjunto de sequências de ácidos nucleicos que codificam os componentes do vetor lentiviral incluindo o genoma do 6 vetor lentiviral da presente invenção, proteínas Gag e Pol, e proteína Env ou um seu substituto funcional e em que uma sequência de ácido nucleico que codifica o gene auxiliar rev é interrompido de tal modo que o referido gene auxiliar é incapaz de codificar a proteína auxiliar funcional, ou não está presente no sistema de produção de vetor lentiviral, e não é fornecido em trans, e RRE é interrompido de tal modo que RRE é não funcional, ou não está presente no sistema de produção de vetor lentiviral e não é fornecido em trans.

De preferência, no sistema as sequências de ácidos nucleicos que codificam pelo menos um dos genes auxiliares vpr, vif, tat e nef, ou genes auxiliares análogos, do lentivírus a partir do qual as referidas partículas são derivadas, são também interrompidos, de tal modo que os referidos genes auxiliares são incapazes de codificar as proteínas auxiliares funcionais, ou são removidos do sistema.

De preferência, o vetor é derivado de HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV ou lentivírus visna.

De preferência, o vetor é derivado de um lentivírus de não primata.

De preferência, o conjunto de sequências de ácidos nucleicos que codificam os componentes do vetor incluem três construções de ADN que codificam o genoma de ARN do vetor, proteínas Gag e Pol e proteína Env, ou seus substitutos funcionais. 7

De acordo com outro aspecto da presente invenção é proporcionada uma construção de ADN para utilização no sistema da presente invenção, a referida construção de ADN codificando um genoma de vetor de ARN que pode ser empacotado de acordo com a invenção.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um conjunto de construções de ADN para utilização no sistema da invenção, que compreende a construção de ADN de acordo com a invenção, e uma construção de ADN que codifica as proteínas Gag ou Pol ou seus substitutos funcionais.

De preferência, o conjunto compreende ainda uma construção de ADN que codifica a proteína Env ou um seu substituto funcional.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção é proporcionado um processo para preparar uma partícula de vetor lentiviral, que compreende introduzir um conjunto de sequências de ácidos nucleicos ou construções de ADN da invenção numa célula hospedeira, obter a partícula de vetor lentiviral, e uma partícula de vetor lentiviral produzida pelo sistema ou processo de acordo com a invenção.

De acordo com outro aspecto da presente invenção é proporcionada uma partícula de vetor derivada de lentivírus que compreende um genoma de ARN do vetor, proteínas Gag e Pol e proteína Env, ou seus substitutos funcionais, em que o genoma do vetor é de acordo com a invenção. 8

Num outro aspecto é proporcionada uma célula transduzida com a partícula de vetor lentiviral ou construção de ADN da invenção.

Num outro aspecto da invenção é proporcionada uma composição farmacêutica que compreende o vetor, o sistema, uma partícula ou uma célula, de acordo com a invenção, juntamente com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Num outro aspecto da invenção é proporcionada a utilização de uma partícula de vetor lentiviral ou construção de ADN ou uma célula da invenção para a preparação de um medicamento para administrar um NOI a um local alvo em necessidade do mesmo.

Num outro aspecto da invenção, é proporcionado um sistema de libertação, sob a forma de uma partícula de vetor lentiviral ou construção de ADN ou uma célula da invenção para utilização em medicina.

De preferência, o vetor virai da presente invenção tem um genoma virai mínimo.

Tal como aqui utilizado, o termo "genoma virai mínimo" significa que o vetor virai foi manipulado de modo a remover os elementos não essenciais e a reter os elementos essenciais a fim de proporcionar a funcionalidade necessária para infetar, transduzir e administrar uma sequência de nucleótidos de interesse a uma célula hospedeira alvo. 9

Os vetores lentivirais da invenção incluirão vetores lentivirais de primatas, tais como vetores de HIV (por exemplo, vetores de HIV-1 e HIV-2) e vetores de SIV, e vetores lentivirais de não primatas. Os vetores lentivirais de primatas têm várias desvantagens que podem limitar a sua aplicação terapêutica para certas doenças. Por exemplo, o HIV-1 tem a desvantagem de ser um agente patogénico humano que transporta proteinas e sequências potencialmente oncogénicas. Há o risco de que a introdução de partículas de vetor produzidas em células de empacotamento que expressam gag-pol de HIV produzirá estas proteinas num individuo levando a seroconversão. Desse modo, numa forma de realização particularmente preferida, o vetor lentiviral será um vetor lentiviral de não primata, tal como EIAV, FIV, BIV, CAEV ou MVV, com EIAV sendo especialmente preferido. Os vetores de não primatas à base de lentivírus não introduzem proteinas do HIV em indivíduos.

De preferência, o vetor lentiviral é um vetor EIAV.

ASPECTOS DETALHADOS DA INVENÇÃO Várias caracteristicas e formas de realização preferidas da presente invenção serão agora descritas por meio de exemplo não limitativo. Embora, em geral, as técnicas aqui mencionadas sejam bem conhecidas na técnica, pode-se fazer referência em particular a Sambrook et al., Molecular Cloning, Ά Laboratory Manual (1989) e Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed., John Wiley & Sons, Inc. (bem como a versão completa de Current Protocols in Molecular Biology). 10

RETROVÍRUS E LENTIVÍRUS

Como mencionado anteriormente, o conceito de utilização de vetores virais para terapia génica é bem conhecido (Verma e Somia (1997) Nature 389: 239-242).

Existem muitos retrovirus. Para o presente pedido, o termo "retrovírus" inclui: virus da leucemia murina (MLV), virus da imunodeficiência humana (HIV), virus da anemia infeciosa equina (EIAV), virus de tumor mamário de murganho (MMTV), virus do sarcoma de Rous (RSV), virus do sarcoma de Fujinami (FuSV), virus da leucemia murina de Moloney (Mo-MLV), virus do osteossarcoma de murino FBR (FBR MSV), virus do sarcoma murino de Moloney (Mo-MSV), virus da leucemia murina de Abelson (A-MLV), virus da mielocitomatose-29 aviária (MC29) e virus da eritroblastose aviária (AEV) e todos os outros retroviridiae incluindo lentivirus.

Uma lista detalhada dos retrovirus pode ser encontrada em Coffin et al. ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763).

Os lentivirus também pertencem à família dos retrovírus, mas podem infetar tanto as células que se dividem como as células que não se dividem (Lewis et al. (1992) EMBO J. 3053-3058). O grupo lentivirus pode ser dividido em "primata" e "não primata". Exemplos de lentivirus de primatas incluem o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o agente causador da síndrome de imunodeficiência adquirida humana (SIDA), e 11 o vírus da imunodeficiência símia (SIV). O grupo de lentivírus de não primatas inclui o protótipo "vírus lentos" visna/maedi vírus (VMV), assim como o vírus relacionado da artrite-encefalite caprina (CAEV), o vírus da anemia infeciosa equina (EIAV) e os vírus da imunodeficiência felina, (FIV) e vírus da imunodeficiência bovina (BIV) mais recentemente descritos.

Detalhes da estrutura genómica de alguns lentivírus podem ser encontrados na técnica. A título de exemplo, detalhes sobre o HIV e o EIAV podem ser encontrados no banco de dados do NCBI Genbank (isto é, Números de Acesso do Genoma AF033819 e AF033820, respectivamente). Detalhes das variantes do HIV podem também ser encontrados em http://hiv-web.lanl.gov. Detalhes das variantes de EIAV podem ser encontrados através de http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Durante o processo de infeção, um retrovírus inicialmente une-se a um receptor específico da superfície celular. Com a entrada na célula hospedeira susceptível, o genoma de ARN retroviral é então copiado para o ADN pela transcriptase reversa codificada pelo vírus, que é realizada no interior do vírus progenitor. Este ADN é transportado para o núcleo da célula hospedeira, onde posteriormente se integra no genoma do hospedeiro. Nesta fase, é tipicamente referido como provírus. 0 provírus é estável no cromossoma do hospedeiro durante a divisão da célula e é transcrito como outros genes celulares. 0 provírus codifica as proteínas e outros fatores necessários para fazer mais vírus, que podem deixar a célula por um processo, por vezes chamado de "gemulação". 12

Cada genoma retroviral compreende genes chamados gag, pol e env que codificam para proteínas de virião e enzimas. Estes genes estão flanqueados em ambas as extremidades por regiões chamadas repetições terminais longas (LTRs). As LTRs são responsáveis pela integração proviral, e transcrição. Elas também servem como sequências potenciadoras-promotoras. Em outras palavras, as LTRs podem controlar a expressão dos genes virais. A encapsidação dos ARNs retrovirais ocorre em virtude de uma sequência psi localizada na extremidade 5' do genoma virai.

As próprias LTRs são sequências idênticas que podem ser divididas em três elementos, que são chamados U3, R e U5. 0 U3 é derivado da sequência original para a extremidade 3' do ARN. 0 R é derivado de uma sequência repetida em ambas as extremidades do ARN e o U5 é derivado da sequência original para a extremidade 5' do ARN. Os tamanhos dos três elementos podem variar consideravelmente entre diferentes retrovírus.

Para o genoma virai, o sítio de iniciação da transcrição é a fronteira entre o U3 e o R na LTR do lado esquerdo e o local de poli (A) adição (terminação) é no limite entre o R e o U5 na LTR do lado direito. 0 U3 contém a maior parte dos elementos de controlo da transcrição do provírus, que inclui as sequências promotoras e potenciadoras múltiplas sensíveis a proteínas ativadoras trancricionais celulares e em alguns casos virais. Alguns retrovírus têm qualquer um ou mais dos seguintes genes que codificam para proteínas que estão envolvidas na regulação da expressão de genes: tat, rev, tax e rex. 13

No que diz respeito aos próprios genes estruturais gag, pol e env, o gene gag codifica a proteina estrutural interna do virus. A proteina Gag é proteoliticamente processada nas proteinas maduras MA (matriz), CA (capsideo) e NC (nucleocapsideo) . 0 gene pol codifica a transcriptase reversa (RT) , que contém polimerase de ADN, ARNase H associada e a integrase (IN), que medeiam a replicação do genoma. 0 gene env codifica a glicoproteina de superficie (SU) e a proteina transmembranar (TM) do virião, que formam um complexo que interage especificamente com proteinas receptoras celulares. Esta interação conduz, em última instância, à infeção por fusão da membrana virai com a membrana celular.

Os retrovirus também podem conter genes "adicionais" que codificam para proteinas que não sejam gag, pol e env. Exemplos de genes adicionais incluem em HIV, um ou mais de vif, vpr, vpx, vpu, tat, rev e nef. 0 EIAV tem (entre outros) o gene adicional S2.

As proteinas codificadas pelos genes adicionais servem diversas funções, algumas das quais pode ser uma duplicação de uma função fornecida por uma proteina celular. Em EIAV, por exemplo, tat age como um ativador transcricional da LTR virai. Liga-se a uma estrutura secundária, estável de hairpin loops de ARN conhecida como TAR. Rev regula e coordena a expressão de genes virais através de elementos de resposta a rev (RRE). Acredita-se que os mecanismos de ação destas duas proteinas sejam muito semelhantes aos mecanismos análogos em virus de primatas. A função de S2 é desconhecida. Além disso, foi identificada uma proteína de EIAV, a Ttm, que é codificada 14 pelo primeiro exão do tat unido à sequência de codificação de env no inicio da proteina transmembranar. A presente invenção é um vetor lentiviral recombinante.

Tal como aqui utilizado, o termo "vetor lentiviral recombinante" (RLV) refere-se a um vetor com informação qenética suficiente para permitir o empacotamento de um qenoma de ARN, na presença de componentes de empacotamento, numa particula virai capaz de infetar e transduzir uma célula alvo. A infeção e a transdução de uma célula alvo inclui transcrição reversa e integração no genoma da célula alvo. 0 RLV transporta sequências de codificação não virais que se destinam a ser fornecidas pelo vetor à célula-alvo. Um RLV é incapaz de replicação independente para produzir particulas retrovirais infeciosas no interior da célula alvo final. Em geral, o RLV carece de um gene funcional gag-pol e/ou env e/ou outros genes essenciais para a replicação. 0 vetor da presente invenção pode ser configurado como um vetor de intrão dividido. Um exemplo de um vetor de intrão dividido é descrito no documento WO 99/15683.

De preferência, o vetor lentiviral recombinante (RLV) da presente invenção tem um genoma virai minimo.

Tal como aqui utilizado, o termo "genoma virai minimo" significa que o vetor virai foi manipulado de modo a remover os elementos não essenciais e a reter os elementos essenciais a fim de proporcionar a funcionalidade necessária para infetar, transduzir e fornecer uma sequência de nucleótidos de interesse a uma célula 15 hospedeira alvo. Mais detalhes sobre esta estratégia podem ser encontrados na nossa patente W098/17815.

Um genoma lentiviral minimo para utilização na presente invenção, por conseguinte, compreende (5')R - U5, uma ou mais primeiras sequências de nucleótidos (elemento regulador NOI)n -U3-R (3'). No entanto, o vetor plasmidico utilizado para produzir o genoma lentiviral dentro de uma célula hospedeira/célula de empacotamento incluirá também sequências de controlo reguladoras da transcrição operativamente ligadas ao genoma lentiviral para dirigir a transcrição do genoma numa célula hospedeira/célula de empacotamento. Essas sequências reguladoras podem ser as sequências naturais associadas com a sequência retroviral transcrita, isto é, a região 5' U3, ou podem ser um promotor heterólogo, tal como um outro promotor virai, por exemplo, o promotor de CMV. Alguns genomas lentivirais necessitam de sequências suplementares para a produção eficiente de virus. Por exemplo, no caso do HIV, rev e a sequência do RRE são de preferência incluídos. No entanto, a necessidade de rev e RRE é eliminada na presente invenção. A necessidade de rev e RRE é reduzida ou eliminada por otimização de codão. Mais detalhes sobre esta estratégia podem ser encontrados na nossa patente WOOl/79518. 0 vetor pode ter pelo menos um dos seguintes: os motivos ATG do sinal de empacotamento de gag do vetor virai do tipo selvagem são motivos ATTG; a distância entre as regiões R do vetor virai é substancialmente a mesma que no vetor virai do tipo selvagem; a região 3' U3 do vetor virai inclui a sequência de uma região MLV U3; e uma sequência de nucleótidos operativamente ligada à LTR virai e em que a referida sequência de nucleótidos é a montante de um promotor interno e em que a referida sequência de 16 nucleótidos, de preferência, codifica um polipéptido ou um seu fragmento.

Numa forma de realização preferida, o sistema utilizado na presente invenção baseia-se num chamado sistema "minimo", em que alguns ou todos os genes adicionais foram removidos.

Na presente invenção, o vetor é um vetor lentiviral é um vetor autoinativador. Em outras palavras, o promotor virai é uma LTR autoinativadora. A titulo de exemplo, os vetores retrovirais autoinativadores foram construídos por deleção dos potenciadores da transcrição ou os potenciadores e promotor na região U3 da LTR 3'. Depois de uma rodada de transcrição reversa e integração de vetor, essas mudanças são copiados tanto na LTR 5' como 3' produzindo um provirus transcricionalmente inativo (Yu et al. 1986 Proc Natl Acad Sei 83: 3.194-3.198/ Dougherty e Temin 1987 Proc Natl Acad Sei. 84: 1197-1201/ Hawley et al., 1987 Proc Natl Acad Sei 84: 2406-2410/ Yee et al., 1987 Proc Natl Acad Sei 91: 9564-9568). No entanto, qualquer promotor interno para as LTRs em tais vetores ainda será transcricionalmente ativo. Esta estratégia foi utilizada para eliminar os efeitos dos potenciadores e promotores nas LTRs virais na transcrição a partir de genes colocados internamente. Tais efeitos incluem o aumento da transcrição (Jolly et al. 1983 Nucleic Acids Res 11: 1855-1872) ou a supressão da transcrição (Emerman e Temin 1984 Cell 39: 449-467). Esta estratégia também pode ser utilizada para eliminar a transcrição a jusante da LTR 3' no ADN genómico (Herman e Coffin 1987 Science 236: 845- 17 848) . Isto é de particular interesse em terapia génica humana em que é de importância fundamental evitar a ativação acidental de um oncogene endógeno.

Numa forma de realização da presente invenção, o vetor lentiviral é derivado de um lentivirus de não primatas. 0 lentivirus de não primata pode ser qualquer membro da familia lentiviridae que não infeta naturalmente um primata e pode incluir um virus da imunodeficiência felina (FIV), um virus da imunodeficiência bovina (BIV), um virus da artrite encefalite caprina (CAEV), um virus Maedi visna (MVV) ou um virus da anemia infeciosa equina (EIAV). De preferência, o lentivirus é um EIAV. 0 virus da anemia infeciosa equina infeta todos os equídeos, resultando em viremia plasmática e trombocitopenia (Clabough, et al. 1991. J Virol. 65: 6242-51). Acredita-se que a replicação do vírus seja controlada pelo processo de maturação de monócitos em macrófagos. 0 EIAV tem a estrutura genómica mais simples dos lentivirus e é particularmente preferido para utilização na presente invenção. Para além dos genes gag, pol e env o EIAV codifica três outros genes: tat, rev, e S2. O tat atua como um ativador transcricional da LTR virai (Derse e Newbold 1993 Virology. 194: 530-6; Maury, et al. 1994

Virology. 200: 632-42) e o Rev regula e coordena a expressão de genes virais através de elementos de resposta ao rev (RRE) (Martarano et al. 1994 J Virol. 68: 3102-11). Acredita-se que os mecanismos de ação destas duas proteínas sejam muito semelhante aos mecanismos análogos nos vírus de primata (Martano et al., ibid) . A função de S2 é desconhecida. Além disso, foi identificada uma proteína de EIAV, a Ttm, que é codificada pelo primeiro 18 exão do tat unido à sequência de codificação de env no inicio da proteína transmembranar.

Na nossa patente W099/32646 damos detalhes de características que podem ser vantajosamente aplicadas à presente invenção. Em particular, será entendido que o genoma de lentivírus de não primata (1) compreende, de preferência um gene gag suprimido, em que a deleção em gag remove um ou mais nucleótidos a jusante a cerca do nucleótido 350 ou 354 da sequência de codificação do gag; (2), de preferência tem um ou mais genes acessórios ausentes do genoma de lentivírus de não primata; (3) de preferência, carece do gene tat, mas inclui a sequência líder entre a extremidade da LTR 5' e o ATG do gag; e (4) combinações de (1), (2) e (3). Numa forma de realização particularmente preferida, o vetor lentiviral compreende todas as características (1) e (2) e (3).

Pode-se fazer também a utilização de um vetor de lentivírus, por exemplo, de não primata, em que o vetor tem, pelo menos, um dos seguintes: os motivos ATG do sinal de empacotamento de gag do vetor virai do tipo selvagem são motivos ATTG; a distância entre as regiões R do vetor lentiviral é substancialmente a mesma que no vetor lentiviral do tipo selvagem; a região 3' U3 do vetor lentiviral inclui a sequência de uma região MLV U3; e uma sequência de nucleótidos operativamente ligada à LTR virai e em que a referida sequência de nucleótidos é a montante de um promotor interno e em que a referida sequência de nucleótidos, de preferência, codifica um polipéptido ou um seu fragmento. 19

Será entendido que a presente invenção pode ser utilizada para introduzir um nucleótido de interesse (NOI) a uma célula-alvo. Numa outra forma de realização preferida do primeiro aspecto da invenção, mais de um nucleótido de interesse (NOI) é introduzido no vetor no sítio de

clonagem. De preferência, o NOI é um gene terapêutico. SISTEMAS DE INTRODUÇÃO

Os sistemas de vetores retrovirais foram propostos como um sistema de introdução para, inter alia, a transferência de um NOI para um ou mais locais de interesse. A transferência pode ocorrer in vitro, ex vivo, in vivo, ou suas combinações. Os sistemas de vetores lentivirais têm mesmo sido explorados para estudar vários aspectos do ciclo de vida do retrovirus, incluindo a utilização do receptor, a transcrição reversa e empacotamento de ARN (revisto por Miller, 1992 Curr Top Microbiol Immunol 158: 1-24) .

Uma partícula de vetor lentiviral recombinante é capaz de transduzir uma célula receptora com um NOI. Uma vez dentro da célula o genoma do ARN da partícula de vetor é transcrito de forma reversa no ADN e integrado no ADN da célula receptora.

Tal como aqui utilizado, o termo "genoma de vetor" refere- se tanto à construção de ARN presente na partícula de vetor retroviral, como a construção de ADN integrado. 0 termo também abrange uma construção de ADN separada ou isolada capaz de codificar tal genoma de ARN. Um genoma lentiviral deve compreender pelo menos uma parte componente derivável de um lentivírus. 0 termo "derivável" 20 é utilizado no seu sentido normal, ou seja, uma sequência de nucleótidos ou de uma parte da mesma, que não precisa necessariamente de ser obtida a partir de um lentivirus, mas em vez disso pode ser derivada do mesmo. A titulo de exemplo, a sequência pode ser preparada sinteticamente ou através da utilização de técnicas de ADN recombinante.

De preferência, o genoma de vetor virai é uma "replicação defeituosa" pelo que pretendemos significar que o genoma sozinho não contém informação genética suficiente para permitir a replicação independente para produzir partículas virais infeciosas dentro da célula receptora. Numa forma de realização preferida, o genoma carece de um gene env, gag ou pol funcional. Numa forma de realização altamente preferida, o genoma carece dos genes env, gag e pol. O genoma do vetor virai pode compreender algumas das repetições terminais longas (LTRs). A sequência também pode compreender ou atuar como uma sequência promotora-potenciadora. O genoma do vetor virai do primeiro aspecto da invenção pode ser proporcionado como um kit de partes. Por exemplo, o kit pode compreender (i) um plasmídeo ou plasmídeos que contêm as sequências NOIs e elemento regulador interno; e (ii) uma construção de genoma retroviral com locais de reconhecimento de enzimas de restrição adequados para a clonagem de NOIs e elemento regulador no genoma virai. É conhecido que a expressão separada dos componentes necessários para produzir uma partícula de vetor lentiviral em sequências de ADN separadas co-introduzidas 21 na mesma célula irá produzir partículas lentivirais contendo genomas retrovirais defeituosos que transportam genes terapêuticos. Esta célula é referida como a célula produtora (ver adiante).

Existem dois procedimentos comuns para gerar células produtoras. Num deles, as sequências que codificam as proteínas retrovirais Gag, Pol e Env são introduzidas na célula e integradas de forma estável no genoma da célula; uma linha celular estável é produzida, que é referida como a linha celular de empacotamento. A linha celular de empacotamento produz as proteínas necessárias para o empacotamento do ARN retroviral, mas não pode provocar a encapsidação, devido à falta de uma região psi. No entanto, quando um genoma de vetor de acordo com o primeiro aspecto da invenção (que possui uma região psi) é introduzido na linha celular de empacotamento, as proteínas auxiliares podem empacotar o ARN de vetor recombinante psi-positivo para produzir a reserva de vírus recombinante. Isto pode ser utilizado para transduzir o NOI em células receptoras. 0 vírus recombinante, cujo genoma não tem todos os genes necessários para a produção de proteínas virais pode infetar apenas uma vez e não pode se propagar. Assim, o NOI é introduzido no genoma da célula hospedeira, sem a produção de retrovírus potencialmente prejudiciais. Um resumo das linhas de empacotamento disponíveis são apresentadas em "Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 449). A presente invenção também proporciona uma linha celular de empacotamento que compreende um genoma de vetor virai do primeiro aspecto da invenção. Por exemplo, a linha 22 celular de empacotamento pode ser transduzida com um sistema de vetor virai que compreende o genoma ou ser transfectadas com um plasmideo portador de uma construção de ADN capaz de codificar o genoma do ARN. A presente invenção também fornece uma partícula de vetor lentiviral produzidas por tal célula. A segunda abordagem é a introdução das três sequências diferentes de ADN que são necessárias para produzir uma partícula de vetor retroviral, isto é, as sequências de codificação de env, a sequência de codificação de gag-pol e o genoma retroviral defeituoso que contém um ou mais NOIs na célula ao mesmo tempo por transfecção transiente e o procedimento é referido como transfecção tripla

transiente (Landau & Littman 1992; Pear et al., 1993). 0 procedimento da transfecção tripla foi otimizado (Soneoka et al. , 1995; Finer et al., 1994). 0 documento WO 94/29438 descreve a produção de células produtoras in vitro utilizando este método de transfecção transiente de ADN múltiplo.

Os componentes do sistema virai que são necessários para complementar o genoma de vetor podem estar presentes num ou mais "plasmídeos produtores" para transfecção em células. A presente invenção proporciona também um sistema de vetor, que compreende (i) um genoma virai de acordo com o primeiro aspecto da invenção; (ii) uma sequência de nucleótidos que codifica as proteínas lentivirais gag e pol; 23 (iii) sequências de nucleótidos que codificam outros componentes de empacotamento virai essenciais não codificados pela sequência de nucleótidos de ii) . Numa forma de realização preferida, a sequência de nucleótidos de (iii) é capaz de codificar uma proteína env. A presente invenção também proporciona uma célula transfectada com tal sistema de vetor e uma partícula de vetor retroviral produzida por tal célula. De preferência, a sequência gag-pol é codão otimizada para utilização na célula produtora particular (ver adiante). A proteína env codificada pela sequência de nucleótidos de iii) pode ser uma proteína env retroviral ou lentiviral homóloqa. Alternativamente, pode ser um env heterólogo, ou um env a partir de um não retro ou lentivírus (veja adiante sob o título "pseudotipagem"). 0 termo "sistema de vetor virai" é utilizado genericamente para significar um kit de partes que pode ser utilizado quando combinado com outros componentes necessários para a produção de partículas virais produzir partículas virais em células hospedeiras. Por exemplo, o genoma do vetor retroviral pode carecer de um ou mais dos genes necessários para a replicação virai. Isto pode ser combinado num kit com uma sequência ou sequências complementares de nucleótidos, por exemplo, num ou mais plasmídeos produtores. Por co-transfecção do genoma em conjunto com o(s) plasmídeo(s) produtor(es), os componentes necessários devem ser fornecidos para a produção de partículas virais infeciosas. 24

Alternativamente, a(s) sequência(s) nucleotídicas complementar(es) pode(m) estar estavelmente presente(s) dentro de uma linha celular de empacotamento que é incluida no kit. A presente invenção também se refere a um sistema de vetor lentiviral que é capaz de introduzir um genoma de ARN a uma célula receptora, como definido nas reivindicações, em que o genoma é mais longo do que o genoma do tipo selvagem do retrovirus. 0 sistema vetor pode, por exemplo, ser um sistema de vetor EIAV.

De preferência, o genoma de ARN do sistema de vetor tem até 5%, mais preferencialmente até 10% mais bases do que o genoma do tipo selvagem. Por exemplo, EIAV do tipo selvagem compreende um genoma de ARN de cerca de 8 kb. Um sistema de vetor de EIAV da presente invenção pode ter um genoma de ARN de até (de preferência cerca de) 8,8 kb.

De preferência, o sistema de vetor retroviral da presente invenção é um sistema de vetor auto-inativador (SIN). A titulo de exemplo, foram construídos sistemas de vetores retrovirais autoinactivadores por exclusão dos potenciadores da transcrição ou os intensificadores e promotor na região U3 da LTR 3' . Depois de uma rodada de transcrição reversa e integração de vetor, essas mudanças são copiados tanto na LTR 5' como 3' produzindo um provírus transcricionalmente inativo. No entanto, qualquer promotor (es) interno (s) para as LTR em tais vetores ainda será(ão) transcricionalmente ativo(s). 25

Esta estratégia tem sido utilizada para eliminar os efeitos dos potenciadores e promotores nas LTR virais na transcrição a partir de genes colocados internamente. Tais efeitos incluem aumento da transcrição ou supressão de transcrição. Esta estratégia também pode ser utilizada para eliminar a transcrição a jusante da LTR 3' no ADN genómico. Isto é de particular interesse em terapia génica humana em que pode ser importante impedir a ativação acidental de um oncogene endógeno.

De preferência, é utilizado um mecanismo assistido por recombinase que facilita a produção de vetores lentivirais regulados por elevado titulo a partir das células produtoras da presente invenção.

Tal como aqui utilizado, o termo "sistema assistido por recombinase" inclui, mas não está limitado a um sistema que utiliza a recombinase Cre/sitios de reconhecimento IoxP do bacteriófago PI ou a FLP recombinase sítio-específica de S. cerevisiae que catalisa eventos de recombinação entre alvos de reconhecimento (FRT) de 34 pb FLP. A FLP recombinase sítio-específica de S. cerevisiae que catalisa eventos de recombinação entre alvos de reconhecimento 34 pb da FLP (FRT) foi configurada em construções de ADN, a fim de gerar linhas celulares produtoras de alto nível, utilizando eventos de recombinação assistidos por recombinase (Karreman et al. (1996) NAR 24: 1616-1624). Um sistema similar foi desenvolvido usando a recombinase Cre/sitios de reconhecimento IoxP do bacteriófago PI (Vanin et al. (1997) J. Virol 71: 7820-7826). Este foi configurado num 26 genoma lentiviral de tal modo que foram geradas linhas celulares produtoras lentivirais de elevado titulo.

Ao utilizar linhas celulares produtoras/de empacotamento, é possível propagar e isolar quantidades de partículas de vetor retroviral (por exemplo, para preparar títulos adequados das partículas de vetor retroviral) para a subsequente transdução de, por exemplo, um local de interesse (tal como o tecido cerebral adulto). Linhagens de células produtoras são geralmente melhores para a produção em larga escala ou partículas vetoriais. A transfecção transiente tem inúmeras vantagens em relação ao método de células de empacotamento. A este respeito, a transfecção transiente evita o tempo mais longo necessário para gerar linhas de células estáveis produtoras de vetores e é utilizada se o genoma do vetor ou componentes de empacotamento retroviral são tóxicos para as células. Se o genoma do vetor codifica genes tóxicos ou genes que interferem com a replicação da célula hospedeira, tais como inibidores do ciclo celular ou genes que induzem a apoptose, pode ser difícil gerar linhas celulares estáveis produtoras, mas a transfecção transiente pode ser utilizada para produzir o vetor antes das células morrerem. Além disso, foram desenvolvidas linhas celulares que utilizam infeção transitória que produzem níveis de titulação de vetor que são comparáveis com os níveis obtidos de linhas celulares estáveis produtoras de vetor (Pear et al., 1993, PNAS 90: 8.392-8.396). Células produtoras/células de empacotamento podem ser de qualquer tipo de célula adequado. Células produtoras são 27 geralmente células de mamífero, mas podem ser, por exemplo, células de insetos.

Tal como aqui utilizado, o termo "célula produtora" ou "célula produtora de vetor" refere-se a uma célula que contém todos os elementos necessários para a produção de partículas de vetor lentiviral.

De preferência, a célula produtora pode ser obtida a partir de uma linha celular produtora estável.

De preferência, a célula produtora pode ser obtida a partir de uma linha celular produtora estável derivada.

De preferência, a célula produtora pode ser obtida a partir de uma linha celular produtora derivada.

Tal como aqui utilizado, o termo "linha celular produtora derivada" é uma linha celular produtora transduzida que foi rastreada e selecionada para expressão elevada de um gene marcador. Tais linhas celulares suportam a expressão de alto nível a partir do genoma retroviral. 0 termo "linha celular produtora derivada" é usado de forma intercambiável com o termo "linha celular produtora estável derivada" e o termo "linha celular produtora estável".

De preferência, a linha celular produtora derivada inclui, mas não está limitada a uma células produtora retroviral e/ou de uma célula produtora lentiviral. 28

De preferência, a linha celular produtora derivada é uma linha celular produtora de HIV ou EIAV, mais preferencialmente uma linha celular produtora de EIAV.

De preferência, as sequências da proteina do envelope, e sequências de nucleocapsideo estão todas integradas de forma estável na célula produtora e/ou de empacotamento. No entanto, uma ou mais destas sequências também poderiam existir na forma epissomal e a expressão do gene poderia ocorrer a partir do epissoma.

Tal como aqui utilizado, o termo "células de empacotamento" refere-se a uma célula que contém os elementos necessários para a produção de virus infecioso recombinante que faltam no genoma do ARN. Tipicamente, estas células de empacotamento contêm um ou mais plasmideos produtores que são capazes de expressar proteínas estruturais virais (tais como gag-pol e env codão otimizados) , mas que não contêm um sinal de empacotamento. 0 termo "sinal de empacotamento" que é referido de forma intercambiável como "sequência de empacotamento" ou "psi" é utilizado em referência à sequência não codificante, de atuação cis necessária para a encapsidação de fitas de ARN retroviral durante a formação das partículas virais. No HIV-1, esta sequência foi mapeada para o loci que se estende desde a montante do principal sitio dador de splicing (DP) até pelo menos o codão de iniciação de gag.

Linhas celulares de empacotamento adequadas para utilização com as construções de vetor acima descritas podem ser facilmente preparadas (veja-se também o 29 documento WO 92/05266), e utilizadas para criar linhas celulares produtoras para a produção de partículas de vetor retroviral. Como já mencionado, um resumo das linhas de empacotamento disponíveis é apresentado em "Retroviruses" (como acima).

Do mesmo modo, como discutido acima, constatou-se que as linhas celulares de empacotamento simples, que compreendem um provirus no qual o sinal de empacotamento foi eliminado, levam à rápida produção de virus competentes de replicação indesejável de através de recombinação. A fim de melhorar a segurança, foram produzidas linhas celulares de segunda geração, em que o LTR 3' do provirus é suprimido. Em tais células, seriam necessárias duas recombinações para produzir um virus do tipo selvagem. Uma outra melhoria implica a introdução dos genes gag-pol e do gene env em construções separadas, chamadas linhas celulares de empacotamento de terceira geração. Estas construções são introduzidas sequencialmente para evitar a recombinação durante a transfecção.

De preferência, as linhas celulares de empacotamento são linhas celulares de empacotamento de segunda geração.

De preferência, as linhas celulares de empacotamento são linhas celulares de empacotamento de terceira geração.

Nestas construções partidas, linhas celulares de terceira geração, uma redução adicional na recombinação pode ser conseguida por meio da alteração dos codões. Esta técnica, com base na redundância do código genético, tem como objectivo reduzir a homologia entre as construções 30 separadas, por exemplo, entre as regiões de sobreposição nos quadros de leitura aberta do gag-pol e env.

As linhas celulares de empacotamento são úteis para fornecer os produtos dos genes necessários para encapsidar e proporcionar uma proteína de membrana para uma produção de partículas vetor de título elevado. A célula de empacotamento pode ser uma célula cultivada in vitro, tal como uma linha celular de cultura de tecidos. Linhas celulares adequadas incluem, mas não estão limitados a células de mamífero, tais como linhas celulares derivadas de fibroblastos murinos ou linhas celulares humanas. De preferência, a linha celular de empacotamento é uma linha celular humana, tais como por exemplo: HEK293, 293-T, TE671, HT1080.

Alternativamente, a célula de empacotamento pode ser uma célula derivada do indivíduo a ser tratado, tal como monócitos, macrófagos, células do sangue ou de fibroblastos. A célula pode ser isolada de um indivíduo e o empacotamento e os componentes de vetor administrados ex vivo, seguido por readministração das células de empacotamento autólogas.

Em mais detalhe, a célula de empacotamento pode ser uma célula de empacotamento in vivo no corpo de um indivíduo a ser tratado, ou pode ser uma célula cultivada in vitro, tal como uma linha celular de cultura de tecidos. Linhas celulares adequadas incluem células de mamífero, tais como linhas celulares derivadas de fibroblastos de murídeo ou linhas celulares humanas. De preferência, a linha celular de empacotamento é uma linha celular humana, tal como, por exemplo: linha celular 293, HEK293, 293-T, TE671, HT1080. 31

Alternativamente, a célula de empacotamento pode ser uma célula derivada a partir do indivíduo a ser tratado, tal como monócitos, macrófagos, células estaminais, células do sangue ou fibroblastos. A célula pode ser isolada de um indivíduo e os componentes de empacotamento e vetor administrados ex vivo, seguido por readministração de células de empacotamento autólogas. Alternativamente, os componentes de empacotamento e vetor podem ser administrados à célula de empacotamento in vivo. Métodos para a introdução de componentes de empacotamento e vetor lentiviral em células de um indivíduo são conhecidos na técnica. Por exemplo, uma abordagem consiste em introduzir sequências de ADN diferentes que são necessárias para produzir uma partícula de vetor lentiviral, por exemplo, a sequência de codificação env, a sequência de codificação gag-pol e o genoma lentiviral defeituoso na célula ao mesmo tempo por meio de transfecção tripla transiente (Landau & Littman 1992 J. Virol. 66, 5110; Soneoka et al., 1995 Nucleic Acids Res. 23: 628-633).

Numa forma de realização as configurações de vetor da presente invenção utilizam como sistema de produção, três unidades de transcrição que expressam um genoma, os componentes de gag-pol e um envelope. A cassete de expressão de envelope pode incluir vários envelopes tais como VSV-G ou vários envelopes de retrovírus murino, tais como 4070A.

Convencionalmente, estas três cassetes seriam expressas a partir de três plasmídeos transientemente transfectados numa linha celular apropriada, tal como 2 93T ou a partir de cópias integradas numa linha celular produtora estável. 32

Uma abordagem alternativa é a utilização de um outro vírus como sistema de expressão para as três cassetes, por exemplo, baculovírus ou adenovírus. Estes são ambos sistemas de expressão nuclear. Até à data, não foi descrita a utilização de poxvírus para expressar todos os componentes de um sistema de vetor lentiviral. Em particular, tendo em conta a utilização invulgar de codões de lentivírus e sua necessidade de sistemas de manipulação de ARN, tais como o sistema rev/RRE não ficou claro se é viável a incorporação de todos os três cassetes e sua subsequente expressão num vetor que expressa no citoplasma em vez do núcleo. Até agora, ficou a possibilidade de que fatores nucleares principais e vias de manipulação de ARN nuclear seriam necessários para a expressão dos componentes do vetor e sua função no veículo de introdução de genes. Aqui descrevemos tal sistema e mostramos que componentes de lentivírus podem ser feitos no citoplasma e que os mesmos se reúnem em sistemas funcionais de introdução de genes funcional. A vantagem deste sistema é a facilidade com que os poxvírus pode ser manipulados, os elevados níveis de expressão e a capacidade de retenção de intrões nos genomas de vetor. A partícula de vetor lentiviral de acordo com a invenção será também capaz de transduzir células que se dividem lentamente, e que os não lentivírus, como MLV não seriam capazes de transduzir eficazmente. As células que se dividem lentamente dividem uma vez em cerca de cada três a quatro dias, incluindo certas células tumorais. Embora os tumores contenham células que dividem rapidamente, algumas células de tumor, especialmente as do centro do tumor, dividem com pouca frequência. Alternativamente, a célula alvo pode ser uma célula de crescimento detido capaz de 33 sofrer divisão celular, tal como uma célula de uma porção central de uma massa tumoral ou uma célula estaminal tal como uma célula estaminal hematopoiética ou uma célula com CD34 positivo. Como uma outra alternativa, a célula alvo pode ser um precursor de uma célula diferenciada, tal como um precursor de monócitos, uma célula com CD33 positivo, ou um precursor mielóide. Como uma outra alternativa, a célula alvo pode ser uma célula diferenciada, tal como um neurónio, astrócito, célula glial, célula microglial, macrófagos, monócitos célula epitelial, célula endotelial ou hepatócito. As células alvo podem ser transduzidas in vitro após isolamento de um indivíduo humano, ou podem ser diretamente transduzidas in vivo. É altamente desejável a utilização de preparações de vírus de alta titulação, tanto em aplicações experimentais como práticas. Técnicas para aumentar o título virai incluem a utilização de um sinal de empacotamento psi positivo como discutido acima e concentração de reservas virais.

Tal como aqui utilizado, o termo "elevado título" significa uma quantidade eficaz de um vetor ou partícula lentiviral que é capaz de transduzir um local alvo tal como uma célula.

Tal como aqui utilizado, o termo "quantidade eficaz" significa uma quantidade de um vetor lentiviral regulado ou partícula de vetor lentiviral que é suficiente para induzir a expressão dos NOIs num local alvo.

Uma preparação virai de alta titulação para uma célula produtora/de empacotamento é geralmente da ordem de 105 a 107 partículas retrovirais por mL. Para a transdução em 34 tecidos tais como o cérebro, é necessário usar volumes muito pequenos, então a preparação virai é concentrada por ultracentrifugação. A preparação resultante deve ter, pelo menos, 108 t.u./mL, de preferência de 108 a 109 t.u./mL, mais preferencialmente pelo menos 109 t.u./mL. (O titulo é expresso em unidades de transdução por mL (t.u./mL) como titulado numa linha de células D17 padrão).

Os NOIs são operativamente ligados a um ou mais elementos promotor/potenciadores. De preferência, o promotor é um promotor forte tal como CMV. O promotor pode ser um promotor regulado. 0 promotor pode ser especifico do tecido. A presença de uma sequência denominada trato central de polipurina (cPPT) pode melhorar a eficiência de introdução de genes em células que não se dividem. Este elemento de atuação cis está localizado, por exemplo, na região do elemento de codificação de polimerase do EIAV. De preferência, o genoma da presente invenção compreende uma sequência cPPT.

De preferência, o genoma virai compreende um elemento de regulação pós-tradução. Por exemplo, o genoma pode compreender um elemento, tal como o elemento de regulação pós-transcricional (WPRE) do virus da hepatite da marmota.

Além disso, ou em alternativa, o genoma virai pode compreender um potenciador de tradução. 35

PSEUDOTIPAGEM

Na criação de sistemas de vetores retrovirais é desejável modificar geneticamente particulas com diferentes especificidades de células alvo para o virus nativo, para permitir a introdução de material genético numa gama alargada ou alterada de tipos de células. Uma maneira pela qual se consegue isso é através da modificação por engenharia genética das proteinas do envelope do virus para alterar a sua especificidade. Outra abordagem é a introdução de uma proteína heteróloga do envelope dentro da partícula de vetor para substituir ou acrescentar à proteína nativa do envelope do vírus. 0 termo pseudotipagem significa incorporar, em pelo menos uma parte, ou substituir uma parte, ou substituir todo um gene env de um genoma virai com um gene env heterólogo, por exemplo, um do gene env de um outro vírus. A pseudotipagem não é um fenómeno novo e exemplos podem ser encontrados nos documentos WO 99/61639, WO-A-98/05759, W0-A-98/05754, WO-A-97/17457, WO-A-96/09400, WO-A-91/00047 e Mebatsion et al. 1997 Cell 90, 841-847.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, o sistema de vetor é pseudotipado com um gene que codifica pelo menos uma parte da proteína G da raiva. Numa outra forma de realização preferida da presente invenção, o sistema de vetor é pseudotipado com um gene que codifica pelo menos uma parte da proteína VSV-G.

Em mais detalhe, o termo "partícula lentiviral" refere-se ao vetor retroviral empacotado, que é de preferência capaz de se ligar às células alvo e de entrar nas mesmas. Os 36 componentes da partícula, como já foi discutido para o vetor, podem ser modificados no que diz respeito ao retrovírus de tipo selvagem. Por exemplo, as proteínas Env no revestimento proteico da partícula podem ser geneticamente modificadas, a fim de alterar a sua especificidade de atingir alvos ou alcançar alguma outra função desejada.

De preferência, o vetor virai, preferencialmente transduz um certo tipo de célula ou tipos de células.

Mais preferencialmente, o vetor virai é um vetor direcionado, isto é que tem um tropismo de tecido, que é alterado em comparação com o vírus nativo, de modo que o vetor é dirigido a células particulares.

Para vetores lentivirais, isto pode ser conseguido por meio da modificação da proteína Env. A proteína Env do vetor retroviral secundário tem de ser um invólucro não tóxico ou um envelope que podem ser produzido em quantidades não tóxicas no interior da célula alvo primária, tal como, por exemplo, um envelope anfotrópico MMLV ou um envelope anfotrópico modificado. A característica de segurança em tal caso é de preferência a supressão ou regiões de sequência de homologia entre componentes do lentivírus.

De preferência, o envelope é um envelope que permite a transdução de células humanas. Exemplos de genes env adequados incluem, mas não estão limitados a VSV-G, um env anfotrópico MLV tal como o env 4070A, o env ou hemaglutinina (HA) do vírus da leucemia felina RD114 a partir de um vírus da gripe. A proteína do Env pode ser 37 uma proteína que seja capaz de se ligar a um receptor de um número limitado de tipos de células humanas e pode ser um envelope modificado geneticamente contendo unidades de direcionamento. As sequências codificadoras de env e gag-pol são transcritas a partir de um promotor e, opcionalmente, um potenciador ativo na linha celular de empacotamento escolhida e a unidade de transcrição é terminada por um sinal de poliadenilação. Por exemplo, se a célula de empacotamento for uma célula humana, uma combinação de promotor-potenciador adequada é a do gene principal precoce imediato de citomegalovírus humano (hCMV-MIE) e um sinal de poliadenilação do vírus SV40 pode ser utilizado. Outros promotores e sinais de poliadenilação adequados são conhecidos na técnica. QUADRO DE LEITURA ABERTA (ORF) A primeira sequência de ácido nucleico, é uma sequência que é capaz de aumentar os níveis de ARN genómico que está disponível para empacotamento na ausência de Rev, por exemplo, em comparação com a situação em que a primeira sequência de ácido nucleico não está presente. A primeira sequência de ácido nucleico, é um quadro de leitura aberta (ORF), que aumenta o nível de ARN genómico disponível para empacotamento na ausência de Rev. Por ORF incluímos uma série de tripletos de codões que incluem um codão de iniciação 5' (que pode ser uma sequência de Kozac) que passa através de um codão de terminação, e que representa um gene putativo ou conhecido. No entanto, pode ser utilizada qualquer sequência de ácido nucleico que aumenta o nível de ARN genómico para empacotamento. 38

Desse modo, a presente invenção refere-se a um genoma de vetor de multicistrónico que tem uma ORF operativamente ligada ao LTR virai, e a montante de um promotor interno.

Quando o genoma do vetor é utilizado com componentes de empacotamento nos quais Rev está ausente, tal como através da utilização de um gene de gag-pol codão otimizado, é possível produzir um vetor totalmente mínimo sem quaisquer genes virais acessórios, seja na célula alvo ou produtora.

Embora não se pretenda ficar limitado por qualquer teoria, acreditamos que no sistema da invenção o transcrito da primeira sequência de ácidos nucleicos é reconhecido por uma célula como sendo um "verdadeiro" ARNm e, portanto, digno de exportação do núcleo. Na ausência de tal sequência o ARNm parece ser degradado no núcleo, por exemplo, através de "degradação mediada por nonsense", antes de ser transportado para o citoplasma e subsequentemente empacotado. A proteína acessório Rev parece permitir contornar este sistema de vigilância e, desse modo, mantém títulos virais em que o genoma do vetor, de outra forma, seria degradado. A presente invenção proporciona uma maneira alternativa e mais segura de manter as titulações virais.

Deve notar-se que um genoma em que uma porção da ORF foi revertida resultou em diferentes dependências de Rev dos genomas parentais e derivados. Embora não se pretenda ficar limitado por qualquer teoria, isto é devido à presença de uma ORF no genoma parental (independente de Rev), que foi destruída no genoma derivado (dependente de Rev) . Desse modo, a ORF deve estar na orientação correta, e nao reversa. 39

De forma útil, a ORF pode estar entre cerca de 0,6 a 4 kb, por exemplo, cerca de 0,65 ou 0,7 a 3,1 ou 3,0 kb.

De preferência, a primeira sequência de ácido nucleico pode ser um gene de seleção também denominado marcador selecionável. Os genes de seleção tipicos codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos e outras toxinas, por exemplo ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, complementam deficiências auxotróficas, ou fornecem nutrientes críticos não disponíveis de meios complexos. Mais detalhes sobre primeiras sequências de ácidos nucleicos adequadas são apresentados adiante nas secções sobre genes repórter. É também possível que a primeira sequência de ácidos nucleicos seja o nucleótido de interesse (NOI), e mais detalhes sobre NOIs são dados a seguir.

SISTEMAS DE EXPRESSÃO REGULADOS POR TETRACICLINA

Numa outra forma de realização preferida, a primeira sequência de ácidos nucleicos é um gene repressor Tet, opcionalmente ligado a um sinal de localização nuclear (NLS). Embora não se pretenda ficar limitado por qualquer teoria, acreditamos que a adição de um NLS ao terminal carboxi aumenta a concentração de TetR no núcleo uma vez que o terminal amino de TetR é importante para a ligação do operador de tetraciclina (tetO). Desse modo, nesta forma de realização, pelo menos, um dos NOIs a jusante será o tetO. Numa forma de realização preferida, pelo menos uma segunda cópia do gene repressor Tet está presente a jusante de um IRES ou promotor interno. 40

Numa outra forma de realização preferida, o gene repressor Tet é codão otimizado para ser expresso num sistema de mamífero. Mais detalhes sobre a otimização de codões são dados adiante.

Desse modo, descrevemos uma sequência melhorada do gene TetR para a expressão regulada por tetraciclina em células de mamíferos, obtida por otimização de codões. Sistemas de expressão regulados por tetraciclina têm utilidade ampla em muitas aplicações onde a expressão génica induzida é vantajosa ou essencial. O melhoramento na expressão do gene, que pode surgir da otimização do codão da proteína efetora pode aumentar significativamente a eficácia do sistema, facilitando uma expressão mais rápida mediada por TetR.

Descrevemos também a alteração da sequência 5' do gene TetR de tal forma que o primeiro AUG é um contexto mais favorável para expressão, melhorando assim a fidelidade da iniciação por ribossomas eucarióticos. Numa forma de realização, a sequência 5' é 5 'gccGCCACCAUGG 3'. (O G na posição +4 mudaria o codão de serina ou requer a inserção de um resíduo de aminoácido adicional.)

Descrevemos ainda a incorporação de um NLS que aumenta a concentração local de TetR no núcleo.

OTIMIZAÇÃO DE CODÃO A otimização de codão foi previamente descrita no documento W099/41397. Células diferentes diferem na sua utilização de codões particulares. Este codão preferencial 41 corresponde a uma preferência na abundância relativa de ARNt particulares no tipo de célula. Ao alterar os codões da sequência de modo a que os mesmos sejam adaptados para coincidir com a abundância relativa de ARNt correspondente, é possivel aumentar a expressão. Da mesma forma, é possivel diminuir a expressão ao escolher deliberadamente codões para os quais os tARNs correspondentes são conhecidos por serem raros no tipo de célula particular. Desse modo, um grau adicional de controlo da tradução está disponível.

Muitos virus, incluindo o HIV e outros lentivirus, utilizam um grande número de codões raros e mudando estes para correspondem a codões de mamíferos usualmente utilizados, pode ser conseguida a expressão aumentada dos componentes de empacotamento em células produtoras de mamifero. São conhecidas na técnica tabelas de uso de codão para células de mamíferos, bem como para uma variedade de outros organismos. A otimização de codão tem uma série de outras vantagens. Em virtude das alterações nas suas sequências, as sequências de nucleótidos que codificam os componentes de empacotamento das partículas virais necessárias para a montagem de partículas virais nas células produtoras/células de empacotamento têm sequências de instabilidade de ARN (INS) eliminadas das mesmas. Ao mesmo tempo, a sequência de aminoácidos que codifica os componentes do elementos de empacotamento é retida de modo que os componentes virais codificados pelas sequências permanecem os mesmos, ou, pelo menos, suficientemente semelhantes de modo que a função dos componentes de empacotamento não seja comprometida. A otimização de codão 42 também supera a exigência Rev/RRE para exportação, tornando otimizadas as sequências Rev independentes. A otimização de codão também reduz a recombinação homóloga entre construções diferentes dentro do sistema de vetor (por exemplo, entre as regiões de sobreposição no quadro de leitura aberta de gag-pol e env) . 0 efeito global da otimização de codões é, portanto, um notável aumento no titulo virai e segurança melhorada.

Numa forma de realização apenas codões que se referem às INS são codões otimizados. No entanto, numa forma de realização muito mais preferida e prática, as sequências são codões otimizados na sua totalidade, com exceção da sequência que engloba o local de deslocação do quadro de leitura. 0 gene gag-pol compreende dois quadros de leitura sobrepostos que codificam as proteínas gag e pol, respectivamente. A expressão de ambas as proteínas depende de uma deslocação do quadro de leitura durante a tradução. Esta deslocação do quadro de leitura ocorre como resultado do "deslizamento" do ribossoma durante a tradução. Acredita-se que este deslizamento seja causado pelo menos em parte pelo ribossoma atrasar as estruturas secundárias do ARN. Tais estruturas secundárias existem a jusante do local de deslocação do quadro de leitura no gene gag-pol. Para o VIH, a região de sobreposição estende-se desde os nucleótidos 1222 a jusante do início da gag (em que o nucleótido 1 é o A do ATG de gag) até o fim de gag (nt 1503). Consequentemente, um fragmento de 281 pb que abrange o sítio de deslocação do quadro de leitura e a região de sobreposição dos dois quadros de leitura é de preferência codão não otimizado. Reter este fragmento irá 43 permitir uma expressão mais eficiente das proteínas de gag-pol.

Para EIAV o início da sobreposição foi feita em nt 1262 (onde o nucleótido 1 é o A do ATG de gag) . 0 fim da sobreposição é em 1461 pb. A fim de assegurar que o local de deslocação do quadro de leitura e a sobreposição do gag-pol são conservados, a sequência do tipo selvagem foi mantida desde o nt 1156 a 1465.

Derivações de utilização do codão ótimo podem ser feitas, por exemplo, a fim de acomodar locais de restrição convenientes, e alterações de aminoácidos conservativas podem ser introduzidas nas proteínas gag-pol.

Numa forma de realização altamente preferida, a otimização de codão foi baseada em genes de mamíferos levemente expressos. A terceira e, por vezes, a segunda e a terceira bases podem ser alteradas.

Devido à natureza degenerada do Código Genético, será entendido que inúmeras sequências gag-pol podem ser conseguidas por um trabalhador especializado. Além disso, existem muitas variantes retrovirais descritas que podem ser utilizadas como ponto de partida para a geração de uma sequência gag-pol codão otimizada. Os genomas de lentivírus podem ser bastante variáveis. Por exemplo, existem muitas quasi-espécies de VIH-1, que são ainda funcionais. Este é também o caso para EIAV. Essas variantes podem ser usadas para potenciar as partes particulares do processo de transdução. Exemplos de variantes de HIV-1 podem ser encontrados em http://hiv-web.lanl.gov. Detalhes de clones de EIAV podem ser 44 encontrados na base de dados NCBI: http://www.ncbi.nlm. nih.gov. A estratégia para sequências gag-pol e TetR codão otimizadas por pode ser utilizada em relação a qualquer retrovirus. Isso se aplica a todos os lentivirus, incluindo EIAV, FIV, BIV, CAEV, VMR, SIV, HIV-1 e HIV-2. Além disso, este método pode ser usado para aumentar a expressão de genes de HTLV-1, HTLV-2, HFV, HSRV e retrovirus endógenos humanos (HERV), MLV e outros retrovirus. A otimização do codão pode tornar a expressão de gag-pol independente de Rev. A fim de permitir o uso de fatores anti-rev ou RRE no vetor retroviral, no entanto, seria necessário para tornar o sistema de produção de vetor virai totalmente independente de Rev/RRE. Deste modo, o genoma necessita também de ser modificado. Isto é conseguido através da otimização dos componentes do genoma do vetor de acordo com a presente invenção. Com vantagem, estas modificações conduzem também à produção de um sistema mais seguro ausente de todas as proteinas adicionais, tanto na célula produtora como na transduzida.

Como descrito acima, os componentes de empacotamento para um vetor retroviral incluem produtos de expressão de genes gag, pol e env. Além disso, o empacotamento eficiente depende de uma curta sequência de quatro hairpin loops seguido por uma sequência parcial de gag e env (o "sinal de empacotamento"). Desse modo, a inclusão de uma sequência gag suprimida no genoma do vetor retroviral (para além da sequência gag completa na construção de empacotamento) irá otimizar o titulo do vetor. Até à data 45 foi relatado que o empacotamento eficiente exige 255 a 360 nucleótidos de gag em vetores que ainda mantêm sequências env, ou cerca de 40 nucleótidos de gag numa combinação particular de mutação de dador de splicing, exclusões de gag e env. Constatou-se, surpreendentemente, que a deleção de todos exceto o N-terminal, 360 ou mais nucleótidos em gag conduzem a um aumento no titulo de vetor. Desse modo, de preferência, o genoma do vetor retroviral inclui uma sequência de gag, que compreende uma ou mais deleções, mais preferencialmente a sequência de gag compreende cerca de 360 nucleótidos deriváveis do N-terminal. A sequência TetR pode ser codão otimizada de forma útil utilizando os codões apresentados na Figura 21. NOIs

Na presente invenção, o termo NOI (sequência de nucleótidos de interesse) inclui qualquer sequência nucleotidica adequada, a qual não precisa ser, necessariamente, uma sequência de ADN ou ARN de ocorrência natural completa. Desse modo, a NOI pode ser, por exemplo, uma sequência de ARN/ADN sintético, uma sequência de ADN/ARN recombinante (isto é, preparada por meio de utilização de técnicas de ADN recombinante) , uma sequência de ADNc ou uma sequência de ADN genómico parcial, incluindo as suas combinações. A sequência não precisa ser uma região de codificação. Se for uma região de codificação, não precisa ser uma região codificadora inteira. Além disso, a sequência de ADN/ARN pode estar numa orientação sentido ou numa orientação antissentido. De preferência, está numa orientação sentido. De 46 preferência, a sequência é, compreende, ou é transcrita a partir de ADNc.

As NOI(s), também referidas como "sequências heterólogas", "genes heterólogos" ou "transgenes", podem ser qualquer um ou mais de, por exemplo, gene(s) de seleção, gene(s) marcador(es) e gene(s) terapêutico (s) . A NOI pode ser um gene candidato, que é de importância potencial num processo de doença. Desse modo, o sistema de vetor da presente invenção pode ser utilizado, por exemplo, para fins de validação do alvo.

As sequências de NOIs podem ter uma aplicação terapêutica ou de diagnóstico. As NOIs adequadas incluem, mas não estão limitadas a: sequências que codificam enzimas, citocinas, quimiocinas, hormonas, anticorpos, moléculas antioxidantes, moléculas do tipo imunoglobulina geneticamente modificadas, um anticorpo de cadeia simples, proteinas de fusão, moléculas co-estimuladoras imunitárias, moléculas imunomoduladoras, ARN antessentido, um mutante negativo transdominante de uma proteína alvo, uma toxina, uma toxina condicional, um antigénio, uma proteína supressora de tumor e fatores de crescimento, proteínas membranares, proteínas e péptidos vasoativos, proteínas antivirais e ribozimas, e seus derivados (tal como com um grupo repórter associado) . As NOIs também podem codificar enzimas de ativação de pró-fármacos. A sequência de codificação de NOI pode codificar um segmento de uma sequência de codificação. 47 0 vetor lentiviral da presente invenção pode ser utilizado para introduzir uma NOI, tal como uma enzima de ativação de pró-fármaco a um local de tumor para o tratamento de um cancro. Em cada caso, uma pró-fármaco adequado é utilizado no tratamento do indivíduo (tal como um doente) em combinação com a enzima adequada de ativação do pró-fármaco. Um pró-fármaco adequado é administrado em conjunto com o vetor. Exemplos de pró-fármacos incluem: fosfato de etopósido (com fosfatase alcalina, Senter et ai., 1988 Proc Natl Acad Sei 85: 4842-4846); 5-fluorocitosina (com citosina desaminase, Mullen et ai., 1994 Câncer Res 54: 1503-1506); Doxorrubicina-N-p-hidroxifenoxiacetamida (com Penicilina-V-amidase, Kerr et ai., 1990 Câncer Immunol Immunother 31: 202-206); glutamato de para-N-bis(2-cloroetil)aminobenzoílo (com carboxipeptidase G2); carbamatos de mostarda de cefalosporina azotada (com β-lactamase); SR4233 (com Reducase P450); Ganciclovir (com timidina quinase de HSV, Borrelli et ai., 1988 Proc Natl Acad Sei 85: 7572-7576); pró-fármacos de mostarda com nitrorredutase (Friedlos et al. , 1997 J Med Chem 40: 1270-1275) e ciclof osf amida (com P450 Chen et al., 1996 Câncer Res 56: 1331-1340).

De preferência, a NOI é útil no tratamento de um distúrbio neurodegenerativo.

Alternativamente, a NOI pode codificar um fator neuroprotetor. Em particular, a(s) NOI(s) podem codificar moléculas que impedem neurónios TH-positivas de morte ou que estimulam a regeneração e recuperação funcional no sistema nigroestriatal danificado. 48 A NOI pode codificar a totalidade ou parte da proteína de interesse ("POI" do inglês Protein Of Interest), ou de um mutante, homólogo ou variante da mesma. Por exemplo, a NOI pode codificar um fragmento da POI, que é capaz de funcionar in vivo de uma forma análoga à proteína de tipo selvagem.

Numa forma de realização altamente preferida, uma das NOIs compreende uma forma truncada do gene TH, sem o domínio regulador. Tal NOI evita inibição de feedback por dopamina, que pode limitar a expressão da enzima de comprimento completo. 0 termo "mutante" inclui POIs que incluem uma ou mais variações de aminoácidos da sequência de tipo selvagem. Por exemplo, um mutante pode compreender uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos. Um mutante pode ocorrer naturalmente, ou pode ser criado artificialmente (por exemplo, por mutagénese sítio-dirigida). SÍTIO INTERNO DE ENTRADA DO RIBOSSOMA (IRES) 0 genoma virai do primeiro aspecto da invenção compreende um ou mais NOIs. A fim de que mais de um dos NOIs seja expresso, pode haver duas ou mais unidades de transcrição dentro do genoma do vetor, uma para cada NOI. No entanto, é evidente a partir da literatura que os vetores retrovirais alcançam os mais altos títulos e as propriedades de expressão génica mais potentes se forem mantidos geneticamente simples (documento PCT/GB96/01230; Bowtell et al., 1988 J. Virol. 62,2464; Correll et al., Blood 1994 84,1812; Emerman e Temin 1984 Cell 39, 459; Ghattas et al., 49 1991 Mol. Cell. Biol. 11, 5848; Hantzopoulos et al. , 1989 PNAS 8 6, 3519; Hatzoglou et al., 1991, J. Biol. Chem 2 66, 8416; Hatzoglou et al., 1988, J. Biol. Chem 263, 17798; Li et al., 1992 Hum. Gen. Ther. 3, 381; McLachlin et al., 1993 Virol. 195, 1; Overell et al., 1988 Mol. Cell Biol. 8, 1803; Scharfman et al., 1991 PNAS 88, 4626; Vile et al., 1994 Gene Ther 1, 307; Xu et al., 1989 Virol. 171, 331; Yee et al., 1987 PMAS 84, 5197) e por isso, é preferível utilizar um sítio interno de entrada de ribossoma (IRES) para iniciar a tradução da segunda (e subsequente) sequência de codificação numa mensagem policistrónica (Adam et al., 1991 J. Virol. 65, 4985). A inserção de elementos IRES em vetores retrovirais é compatível com o ciclo de replicação retroviral e permite a expressão de várias regiões de codificação a partir de um único promotor (Adam et al., (como acima); Koo et al., (1992) Virology 186: 669-675, Chen et al. 1993 J. Virol 67: 2142-2148). Elementos IRES foram encontrados primeiramente nas extremidades 5' não-traduzidas dos picornavírus onde promovem tradução de proteínas virais independente de tampão (Jang et al., (1990) Enzyme 44: 292-309). Quando localizados entre os quadros de leitura aberta num ARN, os elementos IRES permitir a tradução eficiente do quadro de leitura aberta a jusante, promovendo a entrada do ribossoma no elemento IRES seguido pela iniciação da tradução a jusante.

Uma análise sobre IRES é apresentada por Mountford e Smith (TIG maio de 1995 vol 11, N° 5: 179-184). São conhecidas

11:5848-5859 (1991); proteína BiP várias sequências IRES diferentes, incluindo aquelas do vírus da encefalomiocardite (EMCV) (Ghattas, I. R., et al., Mol. Cell. Biol., 50 [Macejak e Sarnow, Nature 353:91 (1991)]; o gene da

Antennapedia drosphilia (exões D e E) [Oh, et al., Genes & Development, 6:1643-1653 (1992)], bem como as sequências do virus da poliomielite (PV) [Pelletier e Sonenberg, Nature 334: 320-325 (1988), ver também Mountford e Smith, TIG 11, 179-184 (1985)].

De acordo com o documento WO-A-97/14809, as sequências IRES são tipicamente encontrados na região 5' não codificante dos genes. Além dessas na literatura as mesmas podem ser encontradas empiricamente ao procurar por sequências genéticas que afetam a expressão e, em seguida, determinar se aquela sequência afecta o ADN (isto é, funciona como um promotor ou um potenciador) ou apenas o ARN (atua como uma sequência IRES).

Elementos IRES de PV, EMCV e virus da doença vesicular dos suinos foram anteriormente utilizados em vetores retrovirais (Coffin et al., como acima). O termo "IRES" inclui qualquer sequência ou combinação de sequências que funcionam ou melhoram a função de uma IRES.

Os IRES (s) podem ser de origem virai (tais como IRES de EMCV ou IRES de PV) ou de origem celular. A fim de que o IRES seja capaz de iniciar a tradução de cada NOI, deve estar localizado entre NOIs no genoma do vetor. Em outras palavras, sempre haverá uma sequência IRES menos do que NOIs. Por exemplo, para uma sequência multicistrónica que contém n NOIs, o genoma pode ser como se segue: 51 [ (NOIl-n-i) - (IRESi-n-i) ] -NOIn para sequências bi e tricistrónicas, a ordem pode ser como se segue: NOI1-IRES1-NOI2 NOI1-IRESi-NOI2-IRES2-NOI3

Os um ou mais NOIs também pode ser operativamente ligados a um promotor interno. A discussão sobre promotores é dada adiante. É possível utilizar uma combinação de promotores e IRESs.

CÉLULAS TRANSDUZIDAS A presente invenção refere-se também a uma célula que tenha sido transduzida com um sistema de veto que compreende um genoma virai de acordo com o primeiro aspeto da invenção. A transdução com o sistema de vetor da presente invenção pode conferir ou aumentar a capacidade da célula de produzir catecolaminas. Pode, por exemplo, conferir ou aumentar a capacidade da célula de converter tirosina em L-dopa e/ou L-dopa em dopamina. A libertação de catecolaminas pode ser medida por métodos conhecidos na técnica, por exemplo por meio de um detector eletroquímico ligado a uma célula analítica. Para além das próprias catecolaminas, podem também ser detectados subprodutos associados com a libertação de catecolaminas (tais como DOPAC, um produto da degradação específico da dopamina). 52

As células podem ser transduzidas in vivo, in vitro ou ex vivo. Por exemplo, se a célula for uma célula de um indivíduo mamífero, a célula pode ser removida do indivíduo e transduzida pronta para reimplantação no indivíduo (transdução ex vivo) . Alternativamente, a célula pode ser transduzida por transferência direta de genes in vivo, utilizando o sistema de vetor da presente invenção de acordo com técnicas convencionais (tal como através de injeção de reservas de vetor que expressa as NOIs). Se a célula for parte de uma linha de células que é estável em cultura (isto é, que pode sobreviver numerosas passagens e pode multiplicar in vitro) , então a célula pode ser transduzidas in vitro por meio de técnicas convencionais, por exemplo pela exposição da célula aos sobrenadantes virais que compreendem os vetores que expressam as NOIs. A célula pode ser qualquer célula que é susceptível de transdução. Se o sistema de vetor for capaz de transduzir células que não se dividem (por exemplo, se for um sistema de lentivírus) , então a célula pode ser uma célula que não se divide tal como um neurónio.

Numa forma de realização preferida, a célula transduzida faz parte de uma linha celular neuronal geneticamente modificada. Tal linha celular pode, por exemplo, ser transplantada no cérebro para o tratamento da doença de Parkinson.

Numa outra forma de realização, a célula é uma célula estaminal neuronal. Tal linha celular pode, por exemplo, ser transplantada no cérebro para o tratamento da doença de Parkinson. 53

Numa outra forma de realização, a célula é uma célula no corpo estriado de um indivíduo, tal como um neurónio, ou célula glial. Transferência direta de genes in vivo para uma célula desse tipo pode, por exemplo, convertê-la numa célula produtora de dopamina.

CASSETES

Descrevemos também cassetes multicistrónicos e ORF e dois ou mais NOIs operativamente ligados por um elemento regulador, tal como um IRES ou promotor interno. Estas cassetes podem ser utilizadas num método para produzir o genoma do vetor numa célula produtora.

Descrevemos também um vetor de expressão compreendendo tal cassete. A transfecção de uma célula adequada com um vetor de expressão desse tipo deve resultar numa célula que expressa a cada POI codificado pelo NOI na cassete. A clonagem da cassete num vetor de expressão e a transfecção de células com o vetor (para dar expressão da cassete) podem ser efectuadas por métodos bem conhecidos na técnica (tais como os descritos em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), e outros livros de texto laboratoriais). A cassete pode compreender um promotor. A cassete pode ser bicistrónica ou tricistrónica e compreende os seguintes elementos: 54 LTR-ORF-Promotor (NOIi) - (IRESi) - (NOI2) LTR-ORF-Promotor (NOIi) - (IRESi) - (NOI2) - (IRES2) - (NOI3) A cassete pode ser bicistrónica e compreender uma NOI que codifica tirosina hidroxilase (ou um seu mutante, variante ou homólogo) e uma NOI que codifica GTP-ciclo-hidrolase (ou um seu mutante, variante ou homólogo). A cassete pode ser tricistrónica e compreender uma NOI que codifica a tirosina hidroxilase (ou um seu mutante, variante ou homólogo), uma NOI que codifica GTP-ciclo-hidrolase (ou um seu mutante, variante ou homólogo) e um NOI que codifica Aminoácido Aromático Dopa descarboxilase (ou um seu mutante, variante ou homólogo).

VETOR

Tal como é bem conhecido na técnica, um vetor é uma ferramenta que permite ou facilita a transferência de uma entidade de um ambiente para outro. De acordo com a presente invenção, e a titulo de exemplo, alguns vetores utilizados em técnicas de ADN recombinante permitem que entidades, tal como um segmento de ADN (tal como um segmento de ADN heterólogo, tal como um segmento de ADNc heterólogo) , sejam transferidas para uma célula hospedeira com a finalidade de replicar os vetores que compreendem um segmento de DNA. Exemplos de vetores utilizados em técnicas de ADN recombinante incluem, mas não estão limitados a plasmídeos, cromossomas, cromossomas artificiais ou virus. 55 0 termo "vetor" inclui vetores de expressão e/ou vetores de transformação. 0 termo "vetor de expressão" significa uma construção capaz de expressão in vivo ou in vitro/ex vivo. 0 termo "vetor de transformação" significa uma construção capaz de ser transferida de uma espécie em outra. VETOR LENTIVIRAL 0 vetor virai capaz de transdução de uma célula alvo que não se divide ou que se divide lentamente é um vetor lentiviral.

Os vetores lentivirais são parte de um grupo maior de vetores retrovirais. 0 vetor da presente invenção pode ser introduzido a um sitio alvo por um vetor virai ou um não virai.

Sistemas de introdução não virais incluem, mas não estão limitados aos métodos de transfecção de ADN. Aqui, a transfecção inclui um processo que utiliza um vetor não virai para introduzir um gene numa célula de mamifero alvo. Métodos de transfecção tipicos incluem eletroporação, biolistica de ADN, transfecção mediada por lipidos, transfecção mediada por DNA compactado, lipossomas, imunolipossomas, lipofectina, mediados por agente catiónico, anfifilos faciais catiónicos (CFAs) (Nature

Biotechnology 1996 14, 556), e combinações destes. 56

Sistemas de introduções virais incluem, mas não estão limitados a vetor de adenovírus, um vetor virai adenoassociado (AAV), um vetor virai de herpes, vetor retroviral, vetor lentiviral, vetor baculoviral. Outros exemplos de vetores incluem sistemas de entrega ex vivo, os quais incluem mas não estão limitados aos métodos de transfecção de ADN tais como eletroporação, biolistica de DNA, transfecção mediada por lípidos, transfecção mediada por DNA compactado. A introdução de um ou mais genes terapêuticos por um sistema de vetor de acordo com a presente invenção pode ser utilizada sozinha ou em combinação com outros tratamentos ou componentes do tratamento.

OPERATIVAMENTE LIGADO 0 termo "operativamente ligado" significa que os componentes descritos estão numa relação que lhes permite funcionar na sua forma pretendida. PROMOTORES 0 termo promotor é bem conhecido na técnica e é utilizado no sentido normal da técnica, por exemplo, como um sitio de ligação da polimerase de ARN. 0 termo engloba as regiões de ácidos nucleicos que variam em tamanho e complexidade de promotores minimos até os promotores que incluem elementos a montante e potenciadores. 0 promotor é tipicamente selecionado de promotores que são funcionais em mamíferos, células, embora possam ser utilizados promotores funcionais em outras células eucarióticas. 0 promotor é normalmente derivado de 57 sequências de promotores de genes virais ou eucarióticos. Por exemplo, pode ser um promotor derivado do genoma de uma célula em que a expressão é para ocorrer. No que diz respeito aos promotores eucarióticos, os mesmos podem ser promotores que funcionam de uma forma ubiqua (tal como promotores de a-actina, β-actina, tubulina) ou, alternativamente, de modo especifico de tecido (tais como os promotores dos genes para a piruvato quinase).

De preferência, o promotor é um promotor H5 ou sE/L modificado (ver Carroll, MW, GW Wilkinson & K Lunstrom 2001 Mammalian expression Systems and vaccination Genetically Engineered Vírus Ed CJ Ring & ED Blair pp 107-157 BIOS Scientific Oxford, Reino Unido).

De preferência, o promotor é um promotor precoce tardio utilizado para a produção máxima de proteina e que permite sensibilidade ótima durante o processo de identificação de anticorpos.

Uma combinação de promotor-potenciador preferida é uma combinação de promotor/intensificador de citomegalovirus humano (hCMV) precoce imediato principal (MIE).

De preferência, o promotor é concebido utilizando dados na Davison & Moss (J. Mol. Biol. 1989 210: 749-769). O nivel de expressão de uma sequência(s) de nucleótidos sob o controlo de um promotor particular, pode ser modulada por meio da manipulação da região promotora. Por exemplo, diferentes dominios numa região promotora podem possuir diferentes atividades reguladoras de genes. As funções destas diferentes regiões são tipicamente 58 avaliadas utilizando construções de vetores com diferentes variantes do promotor com regiões específicas deletadas (isto é, análise de deleção).

De preferência, o promotor é um promotor regulado por hipóxia.

De preferência, o promotor regulado por hipóxia é um promotor regulado por hipóxia específico da célula.

De preferência, o promotor regulado por hipóxia é derivado de uma combinação de unidades de ligação de ADN conhecidas ideais para um determinado tipo de célula. 0 promotor e/ou potenciador pode ser, de preferência ativo num ambiente hipóxico ou isquémico ou de baixo teor de glicose, quando a célula hospedeira é cultivada sob certas condições, tais como condições isquémicas. 0 elemento potenciador ou outros elementos que conferem expressão regulada pode estar presente em cópias múltiplas. 0 potenciador e/ou promotor pode ser de preferência ativo num ambiente hipóxico ou isquémico ou de baixo teor de glicose, quando a célula hospedeira é cultivada sob certas condições, tais como condições isquémicas. O elemento potenciador ou outros elementos que conferem expressão regulada pode estar presentes em cópias múltiplas.

Da mesma forma, ou adicionalmente, o potenciador e/ou promotor pode ser ativo, de preferência num ou mais tipos específicos de células hospedeiras, tais como qualquer uma ou mais de macrófagos, células endoteliais ou combinações destas. 59

De preferência, os promotores específicos de tecidos são promotores de cardiomiócitos.

De preferência, os promotores específicos de tecidos são promotores de macrófagos.

Exemplos de promotores/potenciadores restritos a tecidos adequados incluem, mas não estão limitados àqueles que são altamente ativos em células tumorais, como um promotor/potenciador de um gene MUC1, um gene CEA ou de um gene de antigénio 5T4. Exemplos de promotores/potenciadores temporariamente restritos são aqueles que são sensíveis à isquemia e/ou hipóxia, tais como elementos de resposta a hipóxia ou o promotor/potenciador de um gene grplQ ou um grp94. 0 promotor de alfa fetoproteína (AFP) também é um promotor específico de tumores.

De preferência, os promotores são específicos do tecido. 0 termo "específico do tecido" significa um promotor que não é restrito em atividade a um único tipo de tecido, mas que, no entanto, mostra seletividade na medida em que pode estar ativo num grupo de tecidos e menos ativo ou silencioso noutro grupo. Uma característica desejável dos promotores é que os mesmos possuem uma atividade relativamente baixa na ausência de elementos potenciadores regulados por hipóxia ativados. Uma forma de alcançar este objetivo é a utilização de elementos "silenciadores" que suprimem a atividade de um promotor selecionado na ausência de hipóxia. 60 O nível de expressão de uma ou mais sequências de nucleótido de interesse sob o controlo de um promotor particular, pode ser modulado por meio da manipulação da região promotora. Por exemplo, diferentes domínios dentro de uma região promotora podem possuir diferentes atividades reguladoras de genes. As funções destas diferentes regiões são tipicamente avaliadas utilizando construções de vetores com diferentes variantes do promotor com as regiões específicas deletadas (isto é, análise de deleção). Esta abordagem pode ser utilizada para identificar, por exemplo, a região mais pequena capaz de conferir especificidade de tecido ou a região mais pequena que confere sensibilidade à hipóxia. Vários promotores específicos de tecidos, conforme descrito acima, podem ser particularmente vantajosos na prática da presente invenção. Na maioria dos casos, esses promotores podem ser isolados como fragmentos de digestão de restrição convenientes adequados para clonagem num vetor selecionado. Alternativamente, os fragmentos de promotor podem ser isolados utilizando a reação em cadeia da polimerase. A clonagem dos fragmentos amplificados pode ser facilitada por incorporação de locais de restrição na extremidade 5' dos iniciadores.

De preferência, o promotor responsivo isquémico é um promotor responsivo isquémico restrito a tecido.

De preferência, promotor responsivo isquémico restrito a tecido é um promotor específico de macrófago restrito por repressão. 61

De preferência, o promotor responsivo isquémico restrito a tecido é um promotor especifico de endotélio.

De preferência, promotor responsivo isquémico restrito a tecido é um promotor responsivo ILRE.

Por exemplo, as proteínas reguladas por glucose (grps), tais como grp78 e grp94 são proteínas altamente conservadas conhecidas por serem induzidas por privação de glucose (Attenello e Lee 1984 Science 226 187-190). O gene grp 78 é expresso a níveis baixos na maioria dos tecidos saudáveis normais sob a influência de elementos promotores de nível basal, mas tem, pelo menos, dois "elementos reguladores induzíveis por stress" a montante do elemento TATA (Attenello 1984 ibid; Gazit et al., 1995 Câncer Res 55: 1660-1663) . A ligação a uma sequência de par de base truncada 632 da extremidade 5' do promotor grp78 confere alta capacidade de indução à privação de glucose em genes repórter in vitro (Gazit et al., 1995 ibid). Além disso, esta sequência de promotor em vetores retrovirais foi capaz de conduzir a um elevado nível de expressão um gene repórter em células tumorais em fibrossarcomas de murídeo, particularmente em locais centrais relativamente isquémicos/fibróticos (Gazit et al., 1995 ibid).

De preferência, os elementos promotores regulados fisiologicamente selecionados são elementos promotores de choque térmico.

De preferência, os elementos promotores regulados fisiologicamente selecionados são elementos de radiação. 62

De preferência, os elementos promotores regulados fisiologicamente selecionados são elementos de isquemia.

POTENCIADOR

Além disso, qualquer um destes promotores pode ser modificado através da adição de outras sequências reguladoras, por exemplo, sequências potenciadoras. Podem também ser utilizados promotores quiméricos que compreendem elementos da sequência de dois ou mais promotores diferentes acima descritos. 0 termo "potenciador", inclui uma sequência de ADN que se liga a outros componentes proteicos do complexo de iniciação da transcrição e, assim, facilita a iniciação da transcrição dirigida pelo seu promotor associado.

Outros exemplos de promotores/potenciadores restritos a tecidos apropriados são aqueles que são altamente ativos em células tumorais, como um promotor/potenciador de um gene MUC1, um gene CEA ou um gene do antigénio 5T4. 0 promotor alfa fetoproteina (AFP) também é um promotor especifico de tumor. Uma combinação de promotor- potenciador preferida é uma combinação de promotor/intensificador de citomegalovirus humano (hCMV) precoce imediato principal (MIE).

Um potenciador preferido é um elemento de resposta à hipóxia (HRE, do inglês Hypoxia Response Element) . 63

HRE

Como mencionado acima, a hipóxia é um potente regulador da expressão génica numa ampla gama de diferentes tipos de células e atua pela indução da atividade de fatores de transcrição induziveis por hipóxia, tais como o fator induzido por hipóxia-1 (HIF-1; Wang & Semenza 1993 Proc Natl Acad Sei 90: 430), gue se liga aos sítios de reconhecimento do ADN cognato, os elementos sensíveis à hipóxia (ERHs) em vários promotores de genes. Dachs et al., (1997 Nature Med. 5: 515), utilizaram uma forma multimérica do HRE do gene (PGK-1) da fosfoglicerato guinase-1 de murganho (Firth et al., 1994 Proc Natl Acad Sei 91: 6496-6500) para controlar a expressão dos genes marcadores e terapêuticos por células de fibrossarcoma humano em resposta à hipóxia in vitro e no interior de tumores sólidos in vivo (Dachs et al., ibid).

Os elementos potenciadores de resposta à hipóxia (HREEs) também foram encontrados em associação com vários genes, incluindo o gene da eritropoietina (EPO) (Madan et al., 1993 Proc Natl Acad Sei 90: 3928; Semenza e Wang 1992 Cell Mol Biol 1992 12: 5447-5454). Outros HREEs foram isolados de ambas as regiões reguladoras tanto do gene da enzima piruvato quinase glicolítica muscular (PKM) (Takenaka et al., 1989 J Biol Chem 264: 2363-2367) , como o gene β-enolase específico para músculo humano (EN03; Peshavaria e Day 1991 Biochem J 275: 427-433) e o gene da endotelina-1 (ET-1) (Inoue et al., 1989 J Biol Chem 264: 14.954-14.959).

De preferência, o HRE é selecionado, por exemplo, do elemento HRE eritropoietina (HREE1), piruvato quinase 64 muscular (PKM), elemento HRE, fosfoglicerato quinase (PGK), HRE, β-enolase (enolase 3; EN03), elemento HRE, endotelina-1 (ET-1) elemento HRE e metalotioneína II (MTII).

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

Num aspecto, A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica, tal como definido nas reivindicações, que compreende um vetor e um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis, (incluindo suas combinações).

As composições farmacêuticas podem ser para uso humano ou animal, em medicina humana e veterinária, e compreenderão tipicamente qualquer um ou mais de um diluente, veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. Veiculos ou diluentes aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985) . A escolha do veiculo, excipiente ou diluente farmacêutico, pode ser selecionada tendo em vista a via de administração pretendida e prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem compreender como veiculo, excipiente ou diluente ou, para além dos mesmos, quaisquer aglutinante (s), lubrificante (s), agente (s) de suspensão, agente (s) de revestimento, agente (s) solubilizante (s) adequado (s) .

Conservantes, estabilizantes, corantes e mesmo agentes de aromatização podem ser proporcionados na composição farmacêutica. Exemplos de conservantes incluem benzoato de 65 sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzóico. Antioxidantes e agentes de suspensão também podem ser usados.

Pode haver requisitos diferentes da composição/formulação dependentes dos diferentes sistemas de administração. A titulo de exemplo, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada para ser administrada usando uma minibomba ou por via mucosa, por exemplo, como um spray nasal ou aerossol para inalação ou solução ingerivel, ou parentericamente em que a composição é formulada por uma forma injetável, para administração, por exemplo, por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Alternativamente, a formulação pode ser concebida para ser administrada por ambas as vias.

Quando a composição farmacêutica é para ser administrada por mucosa através da mucosa gastrointestinal, a mesma deverá ser capaz de permanecer estável durante o trânsito pelo trato gastrointestinal; por exemplo, deverá ser resistente à degradação proteolitica, estável a pH ácido e resistente aos efeitos detergentes da bile.

Quando apropriado, as composições farmacêuticas podem ser administradas por inalação, na forma de um supositório ou pessário, topicamente na forma de uma loção, solução, creme, pomada ou pó fino, através da utilização de um adesivo para a pele, oralmente na forma de comprimidos contendo excipientes tais como amido ou lactose, ou giz, ou em cápsulas ou óvulos quer isoladamente quer em mistura com excipientes, ou na forma de elixires, soluções ou suspensões contendo agentes aromatizantes ou corantes ou podem ser injetadas parentericamente, por exemplo por via 66 intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Para administração parentérica, as composições podem ser melhor utilizadas na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo sais ou monossacáridos suficientes para tornar a solução isotónica com o sangue. Para administração bucal ou sublingual as composições podem ser administradas sob a forma de comprimidos ou pastilhas que podem ser formuladas de uma maneira convencional.

ADMINISTRAÇÃO

Tipicamente, um médico determinará a dosagem real que será mais adequada para um individuo e esta variará com a idade, peso e resposta do doente particular e da gravidade da doença. As dosagens adiante são exemplificativas do caso médio. Podem, certamente, existir casos individuais onde gamas de dosagem mais altas ou mais baixas são consideradas.

As composições (ou suas partes componentes) da presente invenção podem ser administrados por via oral. Além disso, ou em alternativa, as composições (ou suas partes componentes) da presente invenção podem ser administradas por injeção direta. Além disso, ou em alternativa, as composições (ou suas partes componentes) da presente invenção podem ser administradas por via tópica. Além disso, ou em alternativa, as composições (ou suas partes componentes) da presente invenção podem ser administradas por inalação. Além disso, ou em alternativa, as composições (ou suas partes componentes) da presente invenção podem também ser administradas por um ou mais dos seguintes: meios de administração parentérica, por mucosa, 67 intramuscular, intravenosa, subcutânea, intraocular ou transdérmica, e são formuladas para tal administração. A titulo de exemplo adicional, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada de acordo com um regime de 1 a 10 vezes por dia, como por exemplo uma ou duas vezes por dia. O nivel de dosagem especifico e a frequência de dosagem para qualquer doente particular pode ser variada e dependerá de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto especifico empregue, a estabilidade metabólica e a duração da ação desse composto, a idade, o peso corporal, saúde em geral, sexo, dieta, modo e tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos, a gravidade da doença particular e o hospedeiro submetido a terapia. 0 termo "administrado" inclui também, mas não se limita à administração por via mucosa, por exemplo, como um spray nasal ou aerossol para inalação, ou como uma solução ingerivel; uma via parentérica em que a administração é por uma forma injetável, tal como, por exemplo, uma via intravenosa, intramuscular ou subcutânea.

Desse modo, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por uma ou mais das seguintes vias: administração oral, injeção (tal como injeção direta), tópica, inalação, administração parentérica, administração na mucosa, administração intramuscular, administração intravenosa, administração subcutânea, administração intraocular ou transdérmica. 68

DOENÇAS

As composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade eficaz do vetor podem ser utilizadas no tratamento de distúrbios, tais como os enumerados no documento WO-A-98/09985. Para facilidade de referência, parte daquela lista aqora é fornecida: atividade inibidora de macrófagos e/ou inibidora da célula T e, assim, da atividade anti-inflamatória; atividade anti-imune, isto é, efeitos inibitórios contra uma resposta imune celular e/ou humoral, incluindo uma resposta que não está relacionada com a inflamação; doenças associadas com virus e/ou outros agentes patogénicos intracelulares; inibir a capacidade dos macrófagos e células T para aderir aos componentes da matriz extracelular e fibronectina, bem como regular positivamente a expressão do receptor de fas em células T; inibir a reação imune indesejada e inflamação, incluindo artrite, incluindo artrite reumatóide, inflamação associada com a hipersensibilidade, reações alérgicas, asma, lúpus eritematoso sistémico, doenças do colagénio e de outras doenças autoimunes, inflamação associada com a aterosclerose, arteriosclerose, doença cardíaca aterosclerótica, lesão de reperfusão, parada cardíaca, enfarte do miocárdio, desordens inflamatórias vasculares, síndrome do desconforto respiratório ou outras doenças cardiopulmonares, inflamação associada com a úlcera péptica, colite ulcerosa e outras doenças do trato gastrointestinal, fibrose hepática, cirrose hepática ou outras doenças hepáticas, tiroidite ou outras doenças glandulares, glomerulonefrite ou outras doenças renais e urológicas, otite ou outras doenças ou outras doenças ou outras doenças otorrinolaringológicas, dermatite cutâneas, doenças periodontais 69 dentárias, orquite ou epididimo orquite, infertilidade, trauma orquidal ou outras doenças testiculares relacionadas ao sistema imunológico, disfunções da placenta, insuficiência placentária, aborto habitual, eclampsia, pré-eclampsia e outras doenças autoimunes e/ou ginecológicas inflamatórias relacionadas, uveite posterior, uveite intermediária, uveite anterior, conjuntivite, coriorretinite, uveorretinite, neurite óptica, inflamação intraocular, por exemplo retinite ou edema macular cistóide, oftalmia simpática, esclerite, retinite pigmentosa, componentes do sistema imunológico e inflamatório da doença degenerativa fondus, componentes inflamatórios do trauma ocular, inflamação ocular causada por infecção, vítreo-retinopatias proliferativas, neuropatia óptica isquémica aguda, cicatrizes excessivas, por exemplo, após a operação de filtração de glaucoma, reação imune e/ou de inflamação contra implantes oculares e outras doenças imunes e inflamatórias oftálmicas relacionadas, inflamação associada a doenças autoimunes ou estados ou distúrbios em que, tanto no sistema nervoso central (CNS), como em qualquer outro órgão, a supressão imune e/ou da inflamação seria benéfica, complexo demência relacionada com a SIDA encefalopatia relacionada com o HIV, doença de Devic, coreia de Sydenham, doença de Alzheimer e outras doenças degenerativas, estados ou distúrbios do SNC, componentes inflamatórios de Stokes, sindrome pós-pólio, componentes imunes e inflamatórios de desordens psiquiátricas, mielite, encefalite, pan-encefalite esclerosante subaguda, encefalomielite, neuropatia aguda, neuropatia subaguda, neuropatia crónica, sindrome de Guillaim-Barre, Sydenham Chorea, miastenia grave, pseudotumor cerebral, Sindrome de Down, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, componentes 70 inflamatórios de compressão do CNS ou trauma do CNS ou infeções do SNC, componentes inflamatórios de atrofias e distrofias musculares, e doenças imunes e inflamatórias relacionadas, estados ou desordens dos sistemas nervosos central e periférico, inflamação pós-traumática, choque séptico, doenças infeciosas, complicações inflamatórias ou efeitos secundários de cirurgia, transplante de medula óssea ou outras complicações de transplante e/ou efeitos secundários, complicações inflamatórias e/ou imunes e efeitos secundários da terapia génica, por exemplo, devido a uma infeção com um transportador virai, ou inflamação associada com a SIDA, para suprimir ou inibir uma resposta imune humoral e/ou celular, para tratar ou melhorar doenças proliferativas de monócitos ou leucócitos, por exemplo, leucemia, através da redução da quantidade de monócitos e linfócitos, para a prevenção e/ou o tratamento da rejeição do enxerto em casos de transplante de células, tecidos e órgãos naturais ou artificiais, tais como a córnea, medula óssea, órgãos, lentes, pacemakers, tecido de pele natural ou artificial. Distúrbios específicos relacionados com o cancro incluem, mas não se limitam a: tumores sólidos; tumores nascidos no sangue, tais como leucemias; metástase tumoral; tumores benignos, por exemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas e granulomas piogénicos; artrite reumatóide; psoríase; doenças angiogénicas oculares, por exemplo, a retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade, degeneração macular, rejeição do enxerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeose; Síndrome de Osler-Webber; angiogénese miocárdica; neovascularização da placa; telangiectasia; articulações hemofílicas; angiofibroma; granulação de ferida; colaterais coronárias; colaterais cerebrais; malformações 71 arteriovenosas; angiogénese de membro isquémico; glaucoma neovascular; fibroplasia retrolental; neovascularização diabética; doenças relacionadas com heliobacter, fraturas, vasculogénese, hematopoiese, ovulação, menstruação e placentação.

FIGURAS A invenção é descrita apenas por meio de exemplo, em que é feita referência às seguintes figuras: a Figura 1 é uma representação esquemática de genomas de EIAV; a Figura 2 dá a sequência plasmidea total de pONY8.1G; a Figura 3 dá a sequência plasmidea total de pONY8.4ZCG; a Figura 4 dá a sequência plasmidea total de pONY8.4GCZ; a Figura 5 é uma representação esquemática da região U3 híbrida; a Figura 6 dá a sequência da LTR híbrida; a Figura 7 dá a sequência de pONY8.1Zhyb; a Figura 8 é uma representação esquemática de pONY8.1Zhyb; a Figura 9 é uma representação esquemática de pONY8.1ZCG e pONY8.OG; 72 a Figura 10 é uma representação gráfica que apresenta a eficiência de transdução relativa de pONY8.1 ZCG e pONY8.0G na presença e na ausência de Rev; a Figura 11 apresenta a sequência completa de pONY8.4TCOG; A Figura 12 apresenta a sequência de pONY8.4TsynCOG/pONY8.4TsyncCOGl; a Figura 13 é uma representação esquemática de pONY8.4TsynCOG/pONY8.4TsynCOGl; a Figura 14 é uma representação esquemática de um exemplo de um vetor bicistrónico regulado por tetraciclina; a Figura 15 apresenta a análise de uso de codão no gene TetR. MH = genes de mamíferos altamente expressos, WT = gene TetR do tipo selvagem, CO = gene TetR codão otimizado. A utilização de codões foi alterada de tal forma que se assemelha mais a de genes de mamíferos altamente expressos; a Figura 16 apresenta o alinhamento de sequências de gene Repressor Tet do tipo selvagem e codão otimizadas. As sequências são 71% idênticas ao nível dos nucleótidos (ciclo mais longo de homologia 13bp); a Figura 17 mostra que com codão otimizado o TetR permite a expressão de GFP na ausência de dox 10 vezes menos do que na presença de dox. Esta diferença é significativamente maior do que quando se utiliza outros vetores, o que sugere que pONY8.4TsynCOG permite um melhor controlo da repressão; 73 a Figura 18 apresenta a reversibilidade da expressão do gene regulado por Tet de vetores que contêm TetR codão otimizado; a Figura 19 apresenta um decurso de tempo para a expressão de GFP, após a adição de doxiciclina; a Figura 20 apresenta a expressão de LTRs alternativas; a Figura 21 é uma representação esquemática da modificação do vetor bicistrónico regulado por Tet incorporando uma segunda cópia do gene repressor de Tet; e a Figura 22 apresenta os títulos virais dos vetores pONY8.4 e pONY8.7 com e sem Rev presente. A expressão de pONY8.4 e pONY8.7 é independente de Rev. EXEMPLO 1 - pONY 8.4 A série de vetores pONY 8.4 tem várias modificações que permitem que funcione como parte de um sistema de vetor transiente ou estável totalmente independente das proteínas acessórias, sem qualquer efeito prejudicial na titulação. Convencionalmente, os genomas de vetor lentiviral têm exigido a presença da proteína virai rev em células produtoras (transitória ou estável), a fim de obter títulos adequados. Isso inclui os sistemas de vetores HTV atuais, bem como os vetores EIAV anteriores. Existem quatro modificações em comparação com a série pONY 8.1 de genomas vetoriais, estes são: a) Todos os motivos ATG que são derivados de gag e fazem parte do sinal de empacotamento foram modificados para ler 74 ATTG. Isto permite a inserção de um quadro de leitura aberto que pode ser conduzido por um promotor na LTR. b) 0 comprimento do genoma, isto é, a distância entre as reqiões R é mais perto do que a observada no virus wt (7,9kb). c) A região 3' U3 foi modificada para incluir sequências da região U3 do virus da leucemia de Moloney (MLV) , de modo que após a transdução pode conduzir o segundo quadro de leitura aberta (ORF), para além da cassete interna. Neste exemplo temos MLV, mas este pode ser qualquer promotor. d) 0 vetor contém uma sequência de nucleótidos operativamente ligada à LTR virai e em que a referida sequência de nucleótidos é a montante de um promotor interno e em que a referida sequência de nucleótidos codifica um polipéptido ou um seu fragmento.

Em conjunto, estas modificações permitem a produção de um sistema de entrega virai sem a necessidade de proteínas acessórias e apenas 10% da sequência virai de origem é integrada na célula alvo. Esses fatores são importantes para considerações de segurança futuras em termos de uma resposta imune e da probabilidade da geração de replicação dos vírus competentes. Mais detalhes sobre a modificação de LTRs podem ser encontrados nas nossas patentes W096/37623 e W098/17816. A Figura 1 é uma representação esquemática de genomas de EIAV. Estes podem ser utilizados para a transfecção de acordo com o método da presente invenção. Após a transfecção a LTR 3' será copiada na LTR 5'. A Figura 2 dá a sequência de plasmídeo total de pONY8.1G. A Figura 3 dá a sequência de plasmídeo total de pONY8.4ZCG. A Figura 4 75 dá a sequência do plasmídeo total de pONY8. 4GCZ. A Figura 5 é uma representação esquemática da região U3 hibrido. A Figura 6 dá a sequência da LTR híbrida.

EXEMPLO 2 - Construção de Vetores de EIAV/MLV de LTR híbrida

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada como se segue:

Produto A = iniciadores KM001 + KM003, com o pONY8.1Z como alvo.

Produto B = iniciadores KM004 + KM005, com o pHITlll como alvo.

Produto C = iniciadores KM006 + KM002, com o pONY8.1Z como alvo.

Os produtos de PCR (A, B e C) foram purificados em gel. A reação de PCR foi criada usando o produto A e B (com os iniciadores KM001 e KM005) para dar o Produto D. A reação de PCR foi criada usando o produto B e C (com os iniciadores KM004 e KM002) para dar o Produto E. 0 Produto D e E foram purificados em gel e utilizados numa reação de PCR, como alvos com os iniciadores KM001 e KM002 para dar o produto F. O produto F de PCR foi purificado em gel (cerca de 1 kb) . Este foi então cortado com Sap I e subclonado no pONY8.1Z cortado com Sap I. Isso deu o vetor pONY8.1Zhyb mostrado nas Figuras 7 e 8. A LTR 3' de EIAV foi agora substituída por um EIAV/MLV híbrido da LTR. 0 EIAV U3 foi quase substituído com a região U3 MLV. As sequências de EIAV 5'U3 da LTR 3' foram retidas uma vez 76 que estas compreendem o local att, isto é, as sequências necessárias para a integração.

As sequências iniciadoras são mostradas adiante: EIAV/MLV híbrido U3 KM001 (SEQ ID NO.l)

CAAAGCATGCCTGCAGGAATTCG KM002 (SEQ ID NO.2)

GAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAG KM003 (SEQ ID NO.3) GCCAAACCTACAGGTGGGGTC TTTCATTATAAAACCCCTCATAAAAACCCCACAG KM004 (SEQ ID NO.4)

CTGTGGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGG C CTGTGGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGG C KM005 (SEQ ID NO.5)

GAAGGGACTCAGACCGCAGAATCTGAGTGCCCCCCGAGTGAGGGGTTGTGGGC TCT GAAGGGACTCAGACCGCAGAATCTGAGTGCCCCCCGAGTGAGGGGTTGTGGGC TCT KM006 (SEQ ID NO.6)

AGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGG

GCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTC

Sequência do produto final PCR. EIAV PPT/U3(SEQ ID NO.7) 77

CAAAGCATGCCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGAATTGGA

AGAGCTTTAAATCCTGGCACATCTCATGTATCAATGCCTCAGTATGTTTAGAAA

AACAAGGGGGGAACTGTGGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAA MLV U3 |SEQ ID NO. 8}

TCAAAGACCCCACCTGTAÍXnTTGGCAAGCTAGCXTAAGXAACGCCATXTTGCA

AaCjCATCGAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGA

ACAGAXGGAACAGCrGAATATGGGCCAAACAGÕAtATCTGTCGTAAGCAGTrC ctgccccggctcagggccaagaacagatggaacagctgaatatgggccaaaca

GGATATCTGTGGTAAGCAGTrCCTOCCCCGGCTCAGGOCCAAGAACAGATGGTC CCCAGATGCGGTCCAGCCCTC AOC AG1TTCT AGAGÂ ACC ATCAG ATGTXTCC AG GGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCOTGTGCCTTAnTGAACrAACCAATCAGT TCGCrTCTOGCTrCTGlXGGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCC ACAACCCCTCACTCGGG MLV US/EIAV RÍUS (SEQ ID NO. 9} GGGCACTCAGAlTCTGCGGTCTGAGTCCCTrCTCTGCTGGGCXGAAAAGGCCTr XGXAATAAATATAATTCT€TACTCAGTCCCTGTCTCTAGTn'GTCTGTT€GAGAr

CCTACAGAGCXCATGCCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTrrCCTGTGTGAA

ATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGXA

AAGCCTC50GGTGCCTAATGAGT0AGCTAACICACATTAATTGCGTTGCGCXGAC

TGCCCGCTTrCQAGTCGGGAAACCXGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCC

AACGCGCGGGGAGAGGCGGTlTGCGTATrGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCA

CTGACTCGCTGCGCTC EXEMPLO 3

As dependências relativas de REV de pONY8.1ZCG e pONY8.0G foram determinadas por avaliação das eficiências de transdução na presença e na ausência de REV (ver Figura 10). Isto foi conseguido usando o vetor pESYNREV. Os vetores pESYNREV e pONY8.0Z são descritos no documento WO 0179518. O vetor pONY8.0G é a forma derivada de ρΟΝΥδ.ΟΖ 78 com GFP substituindo lacZ. O vetor pONY8.1ZCG é derivado de pONY8.4ZCG, mas não tem a sequência LTR híbrida ou a sequência ATTG completa. Um esquema de pONY8.1ZCG e pONY8.0G é mostrado na Figura 9. Eficiências de transdução de pONY8.1ZCG e pONY8.0G foram avaliadas utilizando linhas celulares padrão na presença e na ausência de REV.

Os níveis citoplasmáticos de ARN nas células produtoras foram medidos utilizando PCR quantitativa e foram normalizados para 100 cópias de β-actina celular. As medidas foram tomadas no momento da colheita virai, e mostram que os niveis de ARN, com o sinal de empacotamento de EIAV são reduzidos nas células produtoras de pONY8.0G na ausência de REV. Esta diferença não é visto nas células produtoras de pONY8.1ZCG. Os dados mostram que a construção pONY8.0G (+/-pESYNREV) são dependentes de REV, enquanto a eficiência de transdução de pONY8.1ZCG é independente de REV. EXEMPLO 4

Foram criados vetores regulados por tetraciclina usando o vetor de EIAV pONY8.4 e incorporando o sistema de regulação T-Rex com tetraciclina para fazer PONY8.4TsynCoGl (Figuras 13 e 14). O promotor Tet O2 foi codão otimizado para expressão em células de mamíferos (Figura 15) . GFP foi usado como um gene repórter para medir a expressão. Os níveis de expressão de pONY8.4TsynCO G1 (Figura 17) mostrou ser 10 vezes maior na presença de Doxiciclina (dox) , que se liga TetR e alivia a repressão de Tet02, depois na ausência do mesmo. A comparação da expressão de GFP com os plasmídeos progenitores p0NY8.4ZCG 79 e pONY8.4TCOGl mostra que a repressão na ausência de dox só é conseguida com pONY8.4ZTsynC0Gl. EXEMPLO 5

As células transduzidas com vetores derivados de pONY8.4ZCG foram cultivadas em meios com ou sem dox, em seguida, trocadas para induzir ou reprimir a expressão, conforme apropriado, em seguida, novamente trocadas. A 'reversibilidade' da expressão do gene regulada por Tet dos vetores que contêm TetR codão otimizado foi confirmada. A expressão da GFP vista nas células trocadas, como mostrado na Figura 18, ainda não atingiu os niveis máximos/minimas observadas em células que foram cultivadas continuamente quer com ou sem dox. EXEMPLO 6 0 vetor pONY8.4TsynnlsC0Gl foi feito em que TetR continha um sinal de Localização Nuclear (NLS): 5'GAC CCC AAG AAG AAG AAG CGC GTG TAA (SEQ ID NO. 10) DPKKKRKV parar (SEQ ID NO. 11) no seu terminal C. O NLS é relatado para melhorar a taxa de repressão transcricional tripla (Ogueta et al.) aumentando a concentração de TetR no núcleo. 0 NLS foi ligado à extremidade do terminal C de modo que não interfere com o terminal N de TetR, o que é importante para a ligação de Tet02.

Um curso de tempo foi realizado para determinar a rapidez com que a expressão ocorre a seguir à adição de dox (o 80 decréscimo na expressão depois da remoção de dox como medido por GFP é influenciado pelo volume de proteína). A Figura 18 mostra que a expressão está próxima do máximo dentro de 24 horas da adição da dox e que o TetR codão otimizado marcado com NLS não tinha um nível de expressão basal mais baixo do que a versão não marcada. EXEMPLO 7 A Figura 19 mostra a expressão de GFP da alternativa LTRs PGK e RSV em vetores pONY8.3, provando que as LTRs híbridas alternativas também podem ser usadas nos vetores configurados com pONY8.4. EXEMPLO 8 0 vetor bicistrónico regulado por Tet pode ser modificado para incorporar uma segunda cópia do gene repressor de Tet (Figura 20) . A segunda cópia é a jusante de um IRES. Isto será ativamente expressa quando uma célula é primeiro transduzida e inicialmente não contém a proteína TetR: à medida que os níveis de proteína se acumulam, a transcrição do gene X e TetR localizados a jusante de IRES é desligada (nenhuma tetraciclina ou doxiciclina presente). Esta repressão será mais rápida na construção modificada aqui representada.

Na ausência da TetR impulsionada por LTR haveria um anel de retorno resultando na ciclização da transcrição do gene X, dependendo dos níveis de limiar de TetR. A presença de uma cópia constitutivamente transcrita de TetR evita isso, mantendo um nível constante de TetR na célula. Neste exemplo, a gene tetR a jusante de IRES é a versão de tipo 81 selvagem minimizando a possibilidade de ocorrer recombinação indesejável, no entanto, qualquer combinação de sequências de genes que codificam para a proteína TetR pode ser prevista (o NOI pode também ser localizado a jusante de IRES) . EXEMPLO 9 A expressão dos vetores pONY8.4 e pONY8.7 foi verificada na presença e na ausência de Rev mediante a análise de títulos virais de células infetadas. Os dados de vírus mostrados não são concentrados e são a partir de uma única placa. 0 vetor pONY8.7NCZ foi testado numa semana diferente que os outros vetores, consequentemente obtém-se títulos ligeiramente maiores. A ausência de Rev não conduziu a diferenças significativas no título de vetores á base de pONY8.4 e pONY8.7, mostrando que eles são independentes de rev. Várias modificações e variações dos métodos e sistema descritos da invenção ficarão evidentes para os especialistas na técnica sem nos afastarmos do âmbito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em relação a formas de realização preferidas específicas, deve ser entendido que a invenção, como reivindicada, não deverá ser indevidamente limitada a tais formas de realização específicas. De facto, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são evidentes para os especialistas em biologia molecular ou campos relacionados destinam-se a estar dentro do âmbito das seguintes reivindicações. 82

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Lisboa, 04 de Junho de 2013

Claims (31)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Genoma de vetor multicistrónico que pode ser derivado de um lentivírus, para utilização num sistema de produção lentiviral independente de rev, o referido genoma compreendendo um sinal de empacotamento um quadro de leitura de sinal (OTF) heterólogo a jusante de uma LTR virai e a montante de um promotor, em que o promotora controla a expressão de pelo menos um nucleótido de interesse (NOI), e em que o ORG heterólogo é ligado de forma operacional à LTR; em que a sequência de ácido nucleico que codifica o gene auxiliar rev é interrompido de tal modo que o referido gene auxiliar é incapaz de codificar a proteína auxiliar funcional, ou é removido do genoma do vetor lentiviral, e em que o elemento de resposta a Rev (RRE) é interrompido de tal modo que o referido RRE é não funcional, ou é removido do genoma de vetor lentiviral, e em que o vetor lentiviral é um vetor lentiviral auto-inativante.

2. Genoma de vetor de acordo com a reivindicação 1, em que o ORF heterólogo é uma unidade repórter ou marcador selecionável.

3. Genoma de vetor de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o ORF heterólogo codifica um gene modulador.

4. Genoma de vetor de acordo com a reivindicação 3, em que o gene modulador é selecionado de repressores de tetraciclina, tal como TetR, e transativadores controlados por tetraciclina, tais como tTA e rtTA. 2

5. Genoma de vetor de acordo com a reivindicação 4, em que o repressor de tetraciclina é codão otimizado para expressão numa célula de mamífero.

6. Genoma de vetor de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o genoma de vetor pode ser derivado de um vetor lentiviral de não primata.

7. Genoma de vetor de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o genoma de vetor pode ser derivado de um lentivírus selecionado do grupo que consiste em HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CEV, MVV, e vetor lentiviral visna.

8. Genoma de vetor de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o genoma de vetor compreende uma sequência trato central de polipurina (cPPT).

9. Genoma de vetor de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o genoma de vetor compreende um elemento de regulação pós-transcricional ou um elemento de tradução.

10. Genoma de vetor de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que todos os motivos ATG que são derivados de gag e fazem parte do sinal de empacotamento foram modificados para ler ATTG.

11. Genoma de vetor de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o genoma de vetor é bi, tricistrónico ou quadricistrónico. 3

12. Genoma de vetor de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o NOI é pelo menos uma sequência que codifica uma enzima, uma citocina, uma quimiocina, uma hormonas, um anticorpo, uma molécula antioxidante, uma molécula do tipo imunoglobulina geneticamente modificada, uma proteina de fusão, uma molécula co-estimuladora imunitária, uma molécula imunomoduladora, um ARN anti-sentido, um mutante negativo transdominante de uma proteina alvo, uma toxina, uma toxina condicional, um antigénio, uma proteina supressora de tumor, um fator de crescimento, uma proteina membranar, uma proteina vasoativa, uma proteina antiviral, uma ribozima, ou uma enzimas de ativação de pró-fármacos.

13. Genoma de vetor de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o NOI é útil no tratamento de um distúrbio neurodegenerativo.

14. Genoma de vetor de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, em que o NOI codifica um fator neuroprotetor.

15. Genoma de vetor de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, em que o NOI é útil no tratamento de uveite posterior, uveite intermediária, uveite anterior, conjuntivite, coriorretinite, uveorretinite, neurite óptica, inflamação intraocular, retinite ou edema macular cistóide, oftalmia simpática, esclerite, retinite pigmentosa, componentes do sistema imunológico e inflamatório da doença degenerativa fondus, componentes inflamatórios do trauma ocular, inflamação ocular causada por infecção, vitreo- 4 retinopatias proliferativas, neuropatia óptica isquémica aguda, cicatrizes excessivas, por exemplo, após a operação de filtração de glaucoma, reação imune e/ou de inflamação contra implantes oculares e outras doenças oftálmicas imunes e associadas a uma inflamação com inflamação, doenças angiogénicas oculares, tais como a retinopatia diabética, a retinopatia da prematuridade, a degeneração macular, a rejeição de enxerto córneo, o glaucoma neovascular, a fibroplasia retrolental e a rubeose.

16. Sistema de produção de um vetor lentiviral para a produção de uma particula de vetor derivada de lentivirus, cujo sistema compreende um conjunto de sequências de ácidos nucleicos que codificam os componentes do genoma de vetor incluindo o genoma de vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, as proteínas Gag e Pol, e a proteína Env ou um seu substituto funcional e em que uma sequência de ácido nucleico que codifica o gene auxiliar rev, é interrompida de tal modo que o referido gene auxiliar é incapaz de codificar a proteína auxiliar funcional, ou não está presente no sistema de produção de vetor lentiviral, e não é fornecido em trans, e RRE é interrompido de tal modo que o RRE é não funcional, ou não está presente no sistema de produção de vetor lentiviral, e não é fornecido em trans.

17. Sistema de produção de acordo com a reivindicação 16, em que o conjunto de sequências de ácido nucleico compreende três construções de ADN que codificam (i) o genoma de vetor lentiviral, (ii) Gag e Pol e (iii) Env. 5

18. Sistema de produção de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que a sequência de ácido nucleico que codifica Gag e Pol é codão otimizada.

19. Sistema de produção de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, em que as sequências de ácido nucleico que codificam pelo menos um dos genes auxiliares vpr, vif, tat e nef ou genes auxiliares análogos, provenientes do lentivirus do qual as referidas particulas são derivadas, são também interrompidas de tal modo que os referidos genes auxiliares são incapazes de codificar as proteínas auxiliares funcionais, ou são removidos do sistema.

20. Construção de ADN para utilização no sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, a referida construção de ADN codificando um genoma de vetor de ARN empacotável tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

21. Conjunto de construções de ADN que compreende a construção de ADN de acordo com a reivindicação 20 e uma construção de ADN que codifica Gag e Pol tal como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 19.

22. Conjunto de construções de ADN de acordo com a reivindicação 21, que compreende ainda uma construção de ADN que codifica Env ou um seus substituto funcional.

23. Processo para a preparação de uma partícula de vetor lentiviral que compreende a introdução numa célula hospedeira de um conjunto de sequências de ácido 6 nucleico ou construções de ADN tal como definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 22 e a obtenção da partícula de vetor lentiviral.

24. Partícula de vetor lentiviral produzida pelo sistema, construções de ADN ou conjunto de construções de ADN ou processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23.

25. Partícula de vetor derivada de um lentivírus que compreende um genoma de vetor tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, proteínas Gag e Pol, e proteína Env, ou um seus substituto funcional.

26. Célula transduzida com a partícula de vetor lentiviral da reivindicação 24 ou 25 ou construção de ADN ou conjunto de construções de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22.

27. Partícula de vetor lentiviral de acordo com a reivindicação 24 ou 25 ou construção de ADN ou conjunto de construções de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 0 a 22 ou uma célula de acordo com a reivindicação 26 para utilização em medicina.

28. Composição farmacêutica que compreende o genoma de vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, o sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, a construção de ADN ou conjunto de construções de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, uma partícula de acordo com a reivindicação 24 ou 25, ou uma célula de acordo com a 7 reivindicação 26, juntamente com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

29. Utilização de uma partícula de vetor lentiviral de acordo com a reivindicação 24 ou 25 ou uma construção de ADN ou um conjunto de construções de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, ou uma célula de acordo com a reivindicação 26 para a preparação de um medicamento para administrar um NOI a um local alvo em necessidade do mesmo.

30. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que o NOI é tal como definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 15.

31. Sistema de administração na forma de uma partícula de vetor lentiviral de acordo com a reivindicação 24 ou 25 ou uma construção de ADN ou um conjunto de construções de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, ou uma célula de acordo com a reivindicação 26 para utilização em medicina. Lisboa, 04 de Junho de 2013