ES2411981T3 - Vector lentivírico - Google Patents

Abstract

Un genoma de vector multicistrónico derivable de un lentivirus para uso en un sistema de producción lentivíricoindependiente de rev para producir una partícula de vector derivada de lentivirus, comprendiendo dicho genoma unaseñal de empaquetamiento, un marco de lectura abierto (ORF) heterólogo en 3' de una LTR vírica y en 5' de unpromotor, en el que el promotor controla la expresión de al menos un nucleótido de interés (NOI) en 3', y en el que elORF heterólogo está ligado operativamente con la LTR; en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el genauxiliar rev está alterada de tal modo que dicho gen auxiliar es incapaz de codificar la proteína auxiliar funcional, ose retira del genoma del vector lentivírico, y en el que el elemento de respuesta a Rev (RRE) está alterado de talmodo que dicho RRE no es funcional, o se retira del genoma de vector lentivírico, y en el que el vector lentivírico esun vector lentivírico autoinactivante.

Description

Vector lentivírico

5 La presente invención se refiere a un genoma de vector lentivírico, a un sistema de producción de vector lentivírico y a una partícula de vector lentivírico que comprende el genoma y particularmente, pero no exclusivamente, a su uso en terapia.

Los sistemas de vector retrovírico, tales como sistemas de vector lentivírico, se han propuesto como sistema de suministro para, entre otras cosas, la transferencia de un nucleótido de interés a uno o más sitios de interés. Es más, el concepto de uso de vectores víricos para terapia génica es bien conocido (Verma y Somia (1997) Nature 389: 239-242). Los genomas retrovíricos contienen genes accesorios, tales como un gen rev, un gen tat, un gen vif, un gen nef, un gen vpr o un gen S2. La deleción de dichos genes accesorios, particularmente cuando se usan sistemas de vector retrovírico en terapia génica, es altamente ventajosa. En primer lugar, permite producir vectores sin los 15 genes asociados normalmente con enfermedades en infecciones retrovíricas (por ejemplo, VIH). En segundo lugar, la deleción de los genes accesorios permite empaquetar al vector más ADN heterólogo. En tercer lugar, pueden omitirse los genes cuya función es desconocida, tales como dUTPase y S2, reduciendo por tanto el riesgo de causar efectos indeseables. Se ha enseñado anteriormente por los inventores, por ejemplo en el documento WO 98/17815, cómo retirar muchos de los genes accesorios. Adicionalmente en el documento WO 99/45126, los inventores describen la optimización de codones de la secuencia gag-pol como medio para intentar superar el requisito de Rev/RRE para exportación y para potenciar la estabilidad del ARN. Sin embargo, sigue habiendo la necesidad de proporcionar estrategias para la provisión de vectores víricos útiles y seguros y de medios eficaces para su producción. La presente invención se enfrenta a estos problemas y de forma particularmente ventajosa se dirige a proporcionar un sistema más seguro en el que los genes accesorios víricos, tales como rev, no sean necesarios en

25 la partícula de vector vírico que se usa en el tratamiento ni en su producción.

Kingsman SM, FDA/BRMA 25-26 de octubre de 2001, es un conjunto de diapositivas titulado "Safety Features In The Design, Manufacture and Clinical Monitoring of Lentivectors For The Treatment Of Parkinson's Disease, Prostate Cancer and AIDS".

Fuller M y Anson DS, Human Gene Therapy, 2001, 12: 2081-2093 se refieren a plásmidos auxiliares para la producción de vectores derivados de VIH-1.

En un aspecto de la presente invención, se proporciona un genoma de vector multicistrónico derivable de un

35 lentivirus para uso en un sistema de producción lentivírico independiente de rev para producir una partícula de vector derivada de lentivirus, comprendiendo dicho genoma una señal de empaquetamiento, un marco de lectura abierto (ORF) heterólogo en 3’ de una LTR vírica y en 5’ de un promotor, en el que el promotor controla la expresión de al menos un nucleótido de interés (NOI) en 3’ y en el que el ORF heterólogo está ligado operativamente con la LTR; en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen auxiliar rev está alterada de tal modo que dicho gen auxiliar es incapaz de codificar la proteína auxiliar funcional, o se retira del genoma del vector lentivírico, y en el que el elemento de respuesta a Rev (RRE) está alterado de tal modo que dicho RRE no es funcional, o se retira del genoma del vector lentivírico, y en el que el vector lentivírico es un vector lentivírico autoinactivante.

Por tanto, los inventores han encontrado ahora que es posible proporcionar un vector vírico que sea independiente 45 de rev sin efecto perjudicial sobre el título vírico.

Preferiblemente, el genoma de vector es bicistrónico, tricistrónico o tetracistrónico.

En una realización, la primera secuencia de ácido nucleico es un resto informador o un marcador seleccionable.

En otra realización, la primera secuencia de ácido nucleico codifica un gen modulador.

Preferiblemente, el gen modulador se selecciona de represores de tetraciclina, tales como TetR, y transactivadores controlados por tetraciclina, tales como tTA y rtTA.

55 Preferiblemente, el represor de tetraciclina tiene optimización de codones para expresión en una célula de mamífero.

Preferiblemente, el represor de tetraciclina está ligado con una señal de localización nuclear.

En una realización preferida, el vector comprende más de un NOI en 3’ del promotor interno.

Preferiblemente, el NOI da lugar a un efecto terapéutico.

En una realización, uno o más de los NOI están ligados operativamente con un operador de tetraciclina.

65 En otra realización, el vector comprende un represor de tetraciclina adicional en 3’ del promotor interno.

Preferiblemente, el vector deriva de VIH-1, VIH-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV o lentivirus visna.

Preferiblemente, el vector deriva de un lentivirus no de primate. 5 Preferiblemente, el genoma de vector comprende una secuencia de cPPT.

Preferiblemente, el genoma de vector comprende un elemento regulador postranscripcional o un elemento traduccional.

Preferiblemente, los motivos ATG de la señal de empaquetamiento gag del genoma de vector lentivírico de tipo silvestre son motivos ATTG.

Preferiblemente, la distancia entre las regiones R del genoma de vector es sustancialmente la misma que en el 15 vector lentivírico de tipo silvestre.

Preferiblemente, la región 3' U3 del genoma de vector incluye la secuencia de un promotor vírico y/o eucariótico.

Preferiblemente, la región 3' U3 del genoma de vector incluye un promotor vírico y/o eucariótico de tipo silvestre.

Preferiblemente, el promotor vírico es una región U3 de EIAV o MLV.

Por tanto, según la presente invención, se proporciona un vector lentivírico en el que el vector tiene lo siguiente: los motivos ATG de la señal de empaquetamiento gag del vector lentivírico de tipo silvestre son motivos ATTG; la 25 distancia entre las regiones R del vector lentivírico es sustancialmente la misma que en el vector lentivírico de tipo silvestre y la región 3' U3 del vector lentivírico incluye secuencias de un promotor vírico y/o eucariótico. Preferiblemente, la región 3' U3 puede incluir secuencias de la región U3 de EIAV o MLV, u otros promotores víricos

o eucarióticos. En una realización, la región 3’ U3 puede incluir promotores víricos o eucarióticos de tipo silvestre.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de producción de vector lentivírico para producir una partícula de vector derivado de lentivirus, comprendiendo dicho sistema un conjunto de secuencias de ácido nucleico que codifican los componentes del vector lentivírico, incluyendo el genoma de vector lentivírico de la presente invención, proteínas Gag y Pol y la proteína Env o un sustituto funcional de las mismas, y en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen auxiliar rev está alterada de tal modo que dicho gen auxiliar es

35 incapaz de codificar la proteína auxiliar funcional, o no está presente en el sistema de producción de vector lentivírico, y no se suministra en trans, y RRE está alterado de tal modo que RRE no es funcional, o no está presente en el sistema de producción de vector lentivírico, y no se suministra en trans.

Preferiblemente en el sistema, las secuencias de ácido nucleico que codifican al menos uno de los genes auxiliares vpr, vif, tat y nef, o genes auxiliares análogos, del lentivirus del que derivan dichas partículas, están alteradas también de tal modo que dichos genes auxiliares son incapaces de codificar las proteínas auxiliares funcionales, o se retiran del sistema.

Preferiblemente, el vector deriva de VIH-1, VIH-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV o lentivirus visna.

45 Preferiblemente, el vector deriva de un lentivirus no de primate.

Preferiblemente, el conjunto de secuencias de ácido nucleico que codifican los componentes del vector incluye tres constructos de ADN que codifican el genoma de ARN del vector, las proteínas Gag y Pol y la proteína Env, o sustitutos funcionales de los mismos.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un constructo de ADN para uso en el sistema de la presente invención, codificando dicho constructo de ADN un genoma de vector de ARN empaquetable según la invención.

55 Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un conjunto de constructos de ADN para uso en el sistema de la invención que comprenden el constructo de ADN según la invención y un constructo de ADN que codifica las proteínas Gag y Pol o un sustituto funcional de las mismas.

Preferiblemente, el conjunto comprende adicionalmente un constructo de ADN que codifica la proteína Env o un sustituto funcional de la misma.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para preparar una partícula de vector lentivírico que comprende introducir un conjunto de secuencias de ácido nucleico o constructos de ADN de la

65 invención en una célula hospedadora y obtener la partícula de vector lentivírico, y una partícula de vector lentivírico producida por el sistema o proceso según la invención.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una partícula de vector derivado de lentivirus que comprende un genoma de ARN del vector, las proteínas Gag y Pol y la proteína Env o sustitutos funcionales de los mismos, en el que el genoma del vector es según la invención.

5 En otro aspecto, se proporciona una célula transducida con la partícula de vector lentivírico o constructo de ADN de la invención.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el vector, el sistema, una partícula o una célula según la invención, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de una partícula de vector lentivírico o constructo de ADN o célula de la invención para la preparación de un medicamento para suministrar un NOI a un sitio diana necesitado del mismo.

15 En otro aspecto de la invención, se proporciona un sistema de suministro en forma de una partícula de vector lentivírico o constructo de ADN o célula de la invención para uso en medicina.

Preferiblemente, el vector lentivírico de la presente invención tiene un genoma vírico mínimo.

Como se usa en la presente memoria, el término “genoma vírico mínimo” significa que el vector lentivírico se ha manipulado para retirar los elementos no esenciales y para retener los elementos esenciales para proporcionar la funcionalidad necesaria para infectar, transducir y suministrar una secuencia nucleotídica de interés a una célula hospedadora diana.

25 Los vectores lentivíricos de la invención incluirán vectores lentivíricos de primate tales como vectores de VIH (por ejemplo, vectores de VIH-1 y VIH-2) y vectores de SIV, y vectores lentivíricos no de primate. Los vectores lentivíricos de primate tienen una serie de desventajas que pueden limitar su aplicación terapéutica a ciertas enfermedades. Por ejemplo, el VIH-1 tiene la desventaja de ser un patógeno humano que porta potencialmente proteínas y secuencias oncogénicas. Existe el riesgo de que la introducción de partículas de vector producidas en células de empaquetamiento que expresan gag-pol de VIH introduzcan estas proteínas en un individuo, conduciendo a seroconversión. Por lo tanto, en una realización particularmente preferida, el vector lentivírico será un vector lentivírico no de primate, tal como de EIAV, FIV, BIV, CAEV o MVV, prefiriéndose especialmente EIAV. Los vectores basados en lentivirus no de primates no introducen proteínas de VIH en los individuos.

35 Preferiblemente, el vector lentivírico es un vector de EIAV.

Aspectos detallados de la invención

Se describirán ahora diversos rasgos y realizaciones preferidos de la presente invención a modo de ejemplo no limitante. Aunque en general las técnicas mencionadas en la presente memoria son bien conocidas en la materia, puede hacerse referencia en particular a Sambrook et al., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual” (1989) y a Ausubel et al., “Short Protocols in Molecular Biology” (1999) 4ª ed., John Wiley & Sons, Inc (así como a la versión completa de Current Protocols in Molecular Biology).

45 Retrovirus y lentivirus

Como se menciona anteriormente, el concepto de uso de vectores víricos para terapia génica es bien conocido (Verma y Somia (1997) Nature 389: 239-242).

Existen muchos retrovirus. Para la presente solicitud, el término “retrovirus” incluye: virus de leucemia de murino (MLV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de anemia infecciosa equina (EIAV), virus de tumor de mama de ratón (MMTV), virus de sarcoma de Rous (RSV), virus de sarcoma de Fujinami (FuSV), virus de leucemia de murino Moloney (Mo-MLV), virus de osteosarcoma de murino FBR (FBR MSV), virus de sarcoma de murino Moloney

55 (Mo-MSV), virus de leucemia de murino Abelson (A-MLV), virus de mielocitomatosis aviar 29 (MC29), virus de eritroblastosis aviar (AEV) y todos los demás retrovirus, incluyendo lentivirus.

Puede encontrarse una lista detallada de retrovirus en Coffin et al. (“Retroviruses”, 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus, pág. 758-763).

Los lentivirus pertenecen también a la familia de los retrovirus, pero pueden infectar tanto a células en división como no en división (Lewis et al. (1992) EMBO J. 3053-3058).

El grupo de lentivirus puede dividirse en “de primate” y “no de primate”. Los ejemplos de lentivirus de primate

65 incluyen el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el agente causante del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida humana (SIDA), y el virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV). El grupo lentivírico no de primate incluye el prototipo de “virus lento” virus visna/maedi (VMV), así como el virus de artritis-encefalitis caprina (CAEV) relacionado, el virus de anemia infecciosa equina (EIAV) y los más recientemente descritos virus de inmunodeficiencia felina (FIV) y virus de inmunodeficiencia bovina (BIV).

5 Pueden encontrarse en la materia los detalles sobre la estructura genómica de algunos lentivirus. A modo de ejemplo, pueden encontrarse detalles sobre VIH y EIAV en la base de datos NCBI Genbank (concretamente, nº de acceso a genoma AF033819 y AF033820, respectivamente). Pueden encontrarse también detalles de las variantes de VIH en http://hiv-web.lanl.gov. Pueden encontrarse detalles de las variantes de EIAV en http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Durante el proceso de infección, un retrovirus se enlaza inicialmente con un receptor de superficie celular específico. Con la entrada en la célula hospedadora sensible, el genoma de ARN retrovírico se copia entonces a ADN por la transcriptasa inversa codificada víricamente portada dentro del virus original. Se transporta este ADN al núcleo de la célula hospedadora, donde se integra posteriormente en el genoma del hospedador. En esta etapa, se hace

15 referencia a él típicamente como provirus. El provirus es estable en el cromosoma hospedador durante la división celular y se transcribe como otros genes celulares. El provirus codifica las proteínas y demás factores requeridos para preparar más virus, que pueden dejar la célula mediante un proceso a veces llamado "gemación”.

Cada genoma retrovírico comprende los genes llamados gag, pol y env, que codifican proteínas y enzimas del virión. Estos genes están flanqueados en ambos extremos por regiones llamadas repeticiones terminales largas (LTR). Las LTR son responsables de la integración y transcripción províricas. Sirven también como secuencias potenciadoraspromotoras. En otras palabras, las LTR pueden controlar la expresión de los genes víricos. La encapsidación de ARN retrovíricos ocurre a causa de una secuencia psi localizada en el extremo 5’ del genoma vírico.

25 Las LTR mismas son secuencias idénticas que pueden dividirse en tres elementos, que se llaman U3, R y U5. U3 deriva de la secuencia única del extremo 3’ del ARN. R deriva de una secuencia repetida en ambos extremos del ARN y U5 deriva de la secuencia única del extremo 5’ del ARN. Los tamaños de los tres elementos pueden variar considerablemente entre diferentes retrovirus.

Para el genoma vírico, el sitio de iniciación de la transcripción está en el límite entre U3 y R en la LTR del lado izquierdo y el sitio de adición de poli(A) (terminación) está en el límite entre R y U5 en la LTR del lado derecho. U3 contiene la mayoría de elementos de control transcripcional del provirus, que incluyen las secuencias promotora y potenciadoras múltiples sensibles a proteínas activadoras de la transcripción celular y en algunos casos vírica. Algunos retrovirus tienen uno cualquiera o más de los siguientes genes que codifican proteínas que están implicadas

35 en la regulación de la expresión génica: tat, rev, tax y rex.

Con respecto a los genes estructurales gag, pol y env mismos, gag codifica la proteína estructural interna del virus. La proteína Gag se procesa proteolíticamente a las proteínas maduras MA (matriz), CA (cápsida) y NC (nucleocápsida). El gen pol codifica la transcriptasa inversa (RT), que contiene ADN polimerasa, ARNasa H asociada e integrasa (IN), que median la replicación del genoma. El gen env codifica la glucoproteína de superficie (SU) y la proteína transmembrana (TM) del virión, que forman un complejo que interacciona específicamente con proteínas receptoras celulares. Esta interacción conduce en última instancia a infección por fusión de la membrana vírica con la membrana celular.

45 Los retrovirus pueden contener también genes “adicionales” que codifican proteínas distintas de gag, pol y env. Los ejemplos de genes adicionales incluyen, en VIH, uno o más de vif, vpr, vpx, vpu, tat, rev y nef. EIAV tiene (entre otros) el gen adicional S2.

Las proteínas codificadas por los genes adicionales sirven para diversas funciones, alguna de las cuales puede ser el duplicado de una función proporcionada por una proteína celular. En EIAV, por ejemplo, tat actúa como activador transcripcional de la LTR vírica. Se une a una estructura secundaria de ARN de horquilla estable designada como TAR. Rev regula y coordina la expresión de genes víricos mediante elementos de respuesta a rev (RRE). Los mecanismos de acción de estas dos proteínas se cree que son ampliamente similares a los mecanismos análogos en los virus de primates. La función de S2 es desconocida. Además, se ha identificado una proteína de EIAV, Ttm,

55 que está codificada por el primer exón de tat cortado y empalmado con la secuencia de codificación de env al inicio de la proteína transmembrana.

La presente invención es un vector lentivírico recombinante.

Como se usa en la presente memoria, el término “vector lentivírico recombinante” (RLV) hace referencia a un vector con suficiente información genética para permitir el empaquetamiento de un genoma de ARN, en presencia de componentes de empaquetamiento, en una partícula vírica capaz de infectar y transducir una célula diana. La infección y transducción de una célula diana incluyen la transcripción inversa e integración en el genoma de la célula diana. El RLV porta secuencias de codificación no víricas que se van a suministrar por el vector a la célula diana. Un 65 RLV es incapaz de replicación independiente para producir partículas retrovíricas infecciosas en la célula diana final. Habitualmente, el RLV carece de un gen gag-pol y/o env funcional y/o de otros genes esenciales para la replicación.

El vector de la presente invención puede configurarse como un vector de intrón escindido. Se describe un ejemplo de vector de intrón escindido en el documento WO 99/15683.

Preferiblemente, el vector lentivírico recombinante (RLV) de la presente invención tiene un genoma vírico mínimo.

5 Como se usa en la presente memoria, el término “genoma vírico mínimo” significa que el vector vírico se ha manipulado para retirar los elementos no esenciales y para retener los elementos esenciales para proporcionar la funcionalidad necesaria para infectar, transducir y suministrar una secuencia nucleotídica de interés a una célula diana hospedadora. Pueden encontrarse detalles adicionales sobre esta estrategia en el documento de los inventores WO 98/17815.

Un genoma lentivírico mínimo para uso en la presente invención comprenderá por lo tanto (5') R-U5-una o más primeras secuencias nucleotídicas-(elemento regulador-NOI)n-U3-R (3'). Sin embargo, el vector de plásmido usado para producir el genoma lentivírico en una célula hospedadora/célula de empaquetamiento incluirá también

15 secuencias de control regulador transcripcional ligadas operativamente con el genoma lentivírico para dirigir la transcripción del genoma a una célula hospedadora/célula de empaquetamiento. Estas secuencias reguladoras pueden ser las secuencias naturales asociadas a la secuencia retrovírica transcrita, concretamente, la región 5' U3,

o pueden ser un promotor heterólogo tal como otro promotor vírico, por ejemplo el promotor de CMV. Algunos genomas lentivíricos requieren secuencias adicionales para una producción de virus eficaz. Por ejemplo, en el caso de VIH, se incluyen preferiblemente rev y la secuencia de RRE. Sin embargo, el requisito de rev y RRE se elimina en la presente invención. El requisito de rev y RRE se reduce o elimina mediante la optimización de codones. Pueden encontrarse detalles adicionales de esta estrategia en el documento de los inventores WO 01/79518. El vector puede tener al menos uno de los siguientes: los motivos ATG de la señal de empaquetamiento gag del vector vírico de tipo silvestre son motivos ATTG; la distancia entre las regiones R del vector vírico es sustancialmente la misma

25 que en el vector vírico de tipo silvestre, la región 3' U3 del vector vírico incluye la secuencia una región U3 de MLV y una secuencia nucleotídica ligada operativamente con la LTR vírica, en el que dicha secuencia nucleotídica está en 5’ de un promotor interno y en el que dicha secuencia nucleotídica codifica preferiblemente un polipéptido o fragmento del mismo.

En una realización preferida, el sistema usado en la presente invención está basado en un sistema llamado “mínimo” en que se han retirado algunos o todos de los genes adicionales.

En la presente invención, el vector lentivírico es un vector autoinactivante. En otras palabras, el promotor vírico es una LTR autoinactivante.

35 A modo de ejemplo, se han construido vectores retrovíricos autoinactivantes eliminando los potenciadores transcripcionales o los potenciadores y promotores de la región U3 de la 3' LTR. Después de una ronda de transcripción inversa e integración de vector, se copian estos cambios en ambas 5' y 3' LTR, produciendo un provirus transcripcionalmente inactivo (Yu et al. 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 3194-3198; Dougherty y Temin 1987 Proc. Natl. Acad . Sci. 84: 1197-1201; Hawley et al. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2406-2410; Yee et al. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 9564-9568). Sin embargo, cualquier promotor interno en las LTR de dichos vectores será transcripcionalmente activo. Esta estrategia se ha empleado para eliminar los efectos de potenciadores y promotores en las LTR víricas sobre la transcripción de genes dispuestos internamente. Dichos efectos incluyen una transcripción aumentada (Jolly et al. 1983 Nucleic Acids Res. 11: 1855-1872) o la supresión de la transcripción

45 (Emerman y Temin 1984 Cell 39: 449-467). Esta estrategia puede usarse también para eliminar la transcripción en 3’ de la 3’ LTR a ADN genómico (Herman y Coffin 1987 Science 236: 845-848). Esta es una preocupación particular de la terapia génica, donde es de importancia crítica prevenir la activación accidental de un oncogén endógeno.

En una realización de la presente invención, el vector lentivírico deriva de un lentivirus no de primate. El lentivirus no de primate puede ser cualquier miembro de la familia de los lentivirus que no infecte naturalmente un primate, y puede incluir el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), el virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV), el virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV), el virus Maedi-Visna (MVV) o el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV). Preferiblemente, el lentivirus es EIAV. El virus de la anemia infecciosa equina infecta todos los equinos, dando como resultado viremia plasmática y trombocitopenia (Clabough, et al. 1991. J. Virol. 65: 6242-51). Se cree que la

55 replicación vírica está controlada por el proceso de maduración de monocitos a macrófagos.

El EIAV tiene la estructura genómica más sencilla de los lentivirus y se prefiere particularmente para uso en la presente invención. Además de los genes gag, pol y env, el EIAV codifica otros tres genes: tat, rev, y S2. Tat actúa como activador transcripcional de la LTR vírica (Derse y Newbold 1993 Virology, 194: 530-6; Maury, et al. 1994 Virology, 200: 632-42) y Rev regula y coordina la expresión de genes víricos mediante elementos de respuesta a rev (RRE) (Martarano et al. 1994 J. Virol. 68: 3102-11). Los mecanismos de acción de estas dos proteínas se cree que son ampliamente similares a los mecanismos análogos en los virus de primate (Martano et al. ibid). La función de S2 es desconocida. Además, se ha identificado una proteína de EIAV, Ttm, que está codificada por el primer exón de tat cortado y empalmado con la secuencia de codificación de env al inicio de la proteína transmembrana.

65 En el documento de los inventores WO 99/32646, se dan detalles de los rasgos que pueden aplicarse ventajosamente a la presente invención. En particular, se apreciará que el genoma de lentivirus no de primate (1) preferiblemente comprende un gen gag eliminado en el que la deleción de gag retira uno o más nucleótidos en 3’ del nucleótido aproximadamente 350 o 354 de la secuencia de codificación de gag; (2) preferiblemente tiene uno o más genes accesorios ausentes del genoma de lentivirus no de primate; (3) preferiblemente carece del gen tat, pero

5 incluye la secuencia líder entre el extremo de 5’ LTR y el ATG de gag y (4) combinaciones de (1), (2) y (3). En una realización particularmente preferida, el vector lentivírico comprende todos los rasgos (1) y (2) y (3).

También puede hacerse uso de un vector lentivírico, por ejemplo no de primate, en el que el vector tiene al menos uno de los siguientes: los motivos ATG de la señal de empaquetamiento gag del vector lentivírico de tipo silvestre son motivos ATTG; la distancia entre las regiones R del vector lentivírico es sustancialmente la misma que en el vector lentivírico de tipo silvestre; la región 3’ U3 del vector lentivírico incluye secuencias de una región U3 de MLV y una secuencia nucleotídica ligada operativamente con la LTR vírica, y en el que dicha secuencia nucleotídica está en 5’ de un promotor interno y en el que dicha secuencia nucleotídica codifica preferiblemente un polipéptido o fragmento del mismo.

15 Se apreciará que la presente invención puede usarse para suministrar un nucleótido de interés (NOI) a una célula diana. En una realización preferida adicional del primer aspecto de la invención, se introducen más de un nucleótido de interés (NOI) en el vector en el sitio de clonación. Preferiblemente, el NOI es un gen terapéutico.

Sistemas de suministro

Se han propuesto sistemas de vector lentivírico como sistema de suministro para, entre otros, la transferencia de un NOI a uno o más sitios de interés. La transferencia puede ocurrir in vitro, ex vivo, in vivo, o combinaciones de los mismos. Incluso se han explotado sistemas de vector lentivírico para estudiar diversos aspectos del ciclo vital de los

25 retrovirus, incluyendo el uso de receptor, transcripción inversa y empaquetamiento de ARN (revisado por Miller, 1992 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24).

Una partícula de vector lentivírico recombinante es capaz de transducir una célula receptora con un NOI. Una vez dentro de la célula, el genoma de ARN de la partícula de vector se transcribe inversamente a ADN y se integra en el ADN de la célula receptora.

Como se usa en la presente memoria, el término “genoma de vector” hace referencia tanto al constructo de ARN presente en la partícula de vector retrovírico como al constructo de ADN integrado. El término engloba también un constructo de ADN separado o aislado capaz de codificar dicho genoma de ARN. Un genoma lentivírico debería

35 comprender al menos una parte componente derivable de un lentivirus. El término “derivable” se usa en su sentido normal, significando una secuencia nucleotídica o una parte de la misma que no tiene que obtenerse necesariamente a partir de un lentivirus, sino que en lugar de ello podría derivar del mismo. A modo de ejemplo, la secuencia puede prepararse sintéticamente o mediante el uso de técnicas de ADN recombinante.

El genoma de vector vírico es preferiblemente “defectivo de replicación”, por lo que se entiende que el genoma no comprende suficiente información genética por si solo para posibilitar una replicación independiente para producir partículas víricas infecciosas en la célula receptora. En una realización preferida, el genoma carece de un gen env, gag o pol funcional. En una realización altamente preferida, el genoma carece de los genes env, gag y pol.

45 El genoma de vector vírico puede comprender algunas repeticiones terminales largas (LTR). La secuencia puede comprender también o actuar como una secuencia potenciadora-promotora.

El genoma de vector vírico del primer aspecto de la invención puede proporcionarse como un kit de piezas. Por ejemplo, el kit puede comprender (i) un plásmido o plásmidos que contienen los NOI y una secuencia o secuencias de elementos reguladores internos y (ii) un constructo de genoma retrovírico con sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuadas para clonación de los NOI y el elemento o elementos reguladores en el genoma vírico.

Es conocido que la expresión separada de los componentes necesarios para producir una partícula de vector

55 lentivírico en secuencias de ADN separadas cointroducidas en la misma célula proporcionará partículas lentivíricas portadoras de genomas retrovíricos defectivos que portan genes terapéuticos. Se hace referencia a esta célula como la célula productora (véase a continuación).

Hay dos procedimientos comunes para generar células productoras. En uno, se introducen las secuencias que codifican las proteínas Gag, Pol y Env retrovíricas en una célula y se integran establemente en el genoma celular; se produce una línea celular estable a la que se hace referencia como la línea celular de empaquetamiento. La línea celular de empaquetamiento produce las proteínas necesarias para empaquetar ARN retrovírico, pero no pude causar la encapsidación debido a la falta de una región psi. Sin embargo, cuando se introduce un genoma de vector según el primer aspecto de la invención (que tiene una región psi) en la línea celular de empaquetamiento, las 65 proteínas auxiliares pueden empaquetar el ARN del vector recombinante positivo de psi, produciendo una provisión de virus recombinante. Esta puede usarse para transducir el NOI en células receptoras. El virus recombinante cuyo

genoma carece de todos los genes necesarios para preparar proteínas víricas puede infectar solo una vez y no puede propagarse. Por tanto, se introduce el NOI en el genoma de la célula hospedadora sin generación de retrovirus potencialmente dañinos. Se presenta un resumen de las líneas de empaquetamiento disponibles en "Retroviruses" (1997, Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus, pág. 449).

5 La presente invención proporciona también una línea celular de empaquetamiento que comprende un genoma de vector vírico del primer aspecto de la invención. Por ejemplo, la línea celular de empaquetamiento puede transducirse con un sistema de vector vírico que comprende el genoma o transfectarse con un plásmido portador de un constructo de ADN capaz de codificar el genoma de ARN. La presente invención puede proporcionar también una partícula de vector lentivírico producida por dicha célula.

El segundo enfoque es introducir las tres diferentes secuencias de ADN que son necesarias para producir una partícula de vector retrovírico, concretamente la secuencia de codificación de env, la secuencia de codificación de gag-pol y el genoma retrovírico defectivo que contiene uno o más NOI en la célula al mismo tiempo mediante

15 transfección transitoria, y se hace referencia al procedimiento como transfección transitoria triple (Landau y Littman 1992; Pear et al. 1993). El procedimiento de transfección triple se ha optimizado (Soneoka et al. 1995; Finer et al. 1994). El documento WO 94/29438 describe la producción de células productoras in vitro usando este procedimiento de transfección transitoria múltiple de ADN.

Los componentes del sistema vírico que son necesarios para complementar el genoma de vector pueden estar presentes en uno o más “plásmidos productores” para transfectar en células.

La presente invención proporciona también un sistema de vector que comprende:

25 (i) un genoma vírico según el primer aspecto de la invención;

(ii) una secuencia nucleotídica que codifica las proteínas gag y pol lentivíricas;

(iii) secuencias nucleotídicas que codifican otros componentes de empaquetamiento víricos esenciales no codificados por la secuencia nucleotídica de ii).

En una realización preferida, la secuencia nucleotídica de (iii) es capaz de codificar una proteína env. La presente invención proporciona también una célula transfectada con dicho sistema de vector y una partícula de vector retrovírico producida por dicha célula. Preferiblemente, la secuencia de gag-pol tiene optimización de codones para

35 uso en la célula productora particular (véase a continuación).

La proteína env codificada por la secuencia nucleotídica de (iii) puede ser una proteína env retrovírica o lentivírica homóloga. Como alternativa, puede ser una env heteróloga o una env de un no retrovirus ni lentivirus (véase a continuación “seudotipado”).

El término “sistema de vector vírico” se usa generalmente para indicar un kit de piezas que puede usarse combinado con otros componentes necesarios para la producción de partículas víricas para producir partículas víricas en células hospedadoras. Por ejemplo, el genoma de vector retrovírico puede carecer de uno o más de los genes necesarios para replicación vírica. Este puede combinarse en un kit con una secuencia o secuencias nucleotídicas

45 complementarias adicionales, por ejemplo en uno o más plásmidos productores. Mediante la cotransfección del genoma junto con el plásmido o plásmidos productores, deberían proporcionarse los componentes necesarios para la producción de partículas víricas infecciosas.

Como alternativa, la secuencia o secuencias nucleotídicas complementarias pueden estar presentes establemente en una línea celular de empaquetamiento que se incluye en el kit.

La presente invención se refiere también un sistema de vector lentivírico que es capaz de suministrar un genoma de ARN a una célula receptora, como se define en las reivindicaciones, en las que el genoma es más largo que el genoma de tipo silvestre del retrovirus. El sistema de vector puede ser, por ejemplo, un sistema de vector de EIAV.

55 Preferiblemente, el genoma de ARN del sistema de vector tiene hasta un 5%, más preferiblemente hasta un 10% más bases que el genoma de tipo silvestre. Preferiblemente, el genoma de ARN es aproximadamente un 10% más largo que el genoma de tipo silvestre. Por ejemplo, el EIAV de tipo silvestre comprende un genoma de ARN de aproximadamente 8 kb. Un sistema de vector de EIAV de la presente invención puede tener un genoma de ARN de hasta (preferiblemente aproximadamente) 8,8 kb.

Preferiblemente, el sistema de vector retrovírico de la presente invención es un sistema de vector autoinactivante (SIN).

65 A modo de ejemplo, se han construido sistemas de vector retrovírico autoinactivante eliminando los potenciadores transcripcionales o los potenciadores y promotores de la región U3 de la 3’ LTR. Después de una ronda de transcripción inversa e integración del vector, se copian estos cambios en ambas 5’ y 3’ LTR, produciendo un provirus transcripcionalmente inactivo. Sin embargo, cualquier promotor interno en las LTR en dichos vectores seguirá siendo transcripcionalmente activo. Esta estrategia se ha empleado para eliminar los efectos de potenciadores y promotores en las LTR víricas sobre la transcripción de genes dispuestos internamente. Dichos

5 efectos incluyen una transcripción aumentada o la supresión de la transcripción. Esta estrategia puede usarse también para eliminar la transcripción en 3’ de la 3’ LTR a ADN genómico. Este es una preocupación particular de la terapia génica humana, donde puede ser importante prevenir la activación accidental de un oncogén endógeno.

Preferiblemente, se usa un mecanismo auxiliado por recombinasa que facilita la producción de vectores lentivíricos 10 regulados de alto título a partir de las células productoras de la presente invención.

Como se usa en la presente memoria, el término “sistema auxiliado por recombinasa” incluye, pero sin limitación, un sistema que usa los sitios de reconocimiento de recombinasa Cre/loxP del bacteriófago P1 o la recombinasa FLP específica de sitio de S. cerevisiae, que cataliza eventos de recombinación entre dianas de reconocimiento de FLP

15 de 34 pb (FRT).

La recombinasa FLP específica de sitio de S. cerevisiae que cataliza eventos de recombinación entre dianas de reconocimiento de FLP de 34 pb (FRT) se ha configurado en constructos de ADN para generar líneas celulares productoras de alto nivel usando eventos de recombinación auxiliada por recombinasa (Karreman et al. (1996) NAR

20 24: 1616-1624). Se ha desarrollado un sistema similar usando los sitios de reconocimiento de recombinasa Cre loxP del bacteriófago P1 (Vanin et al. (1997) J. Virol. 71: 7820-7826). Este se ha configurado en un genoma lentivírico de tal modo que se generaran líneas celulares productoras lentíviricas de alto título.

Al usar líneas celulares productoras/de empaquetamiento, es posible propagar y aislar cantidades de partículas de

25 vector retrovírico (por ejemplo, para preparar títulos adecuados de partículas de vector retrovírico) para la posterior transducción de, por ejemplo, un sitio de interés (tal como tejido de cerebro adulto). Las líneas celulares productoras son habitualmente mejores para la producción a gran escala que las partículas de vector.

La transfección transitoria tiene numerosas ventajas frente al procedimiento celular de empaquetamiento. A este

30 respecto, la transfección transitoria evita el mayor tiempo requerido para generar líneas celulares productoras de vector estables y se usa si el genoma de vector o componentes del empaquetamiento retrovírico son tóxicos para las células. Si el genoma de vector codifica genes tóxicos o genes que interfieren con la replicación de la célula hospedadora, tales como inhibidores del ciclo celular o genes que inducen la apoptosis, puede ser difícil generar líneas celulares productoras de vector estables, pero puede usarse la transfección transitoria para producir el vector

35 antes que las células mueran. También se han desarrollado líneas celulares que usan la infección transitoria que producen niveles de título de vector que son comparables con los niveles obtenidos a partir de líneas celulares productoras de vector estables (Pear et al. 1993, PNAS 90: 8392-8396).

Las células productoras/células de empaquetamiento pueden ser de cualquier tipo celular adecuado. Las células 40 productoras son generalmente células de mamífero pero pueden ser, por ejemplo, células de insecto.

Como se usa en la presente memoria, el término “célula productora” o “célula productora de vector” hace referencia a una célula que contiene todos los elementos necesarios para la producción de partículas de vector lentivírico.

45 Preferiblemente, la célula productora es obtenible a partir de una línea celular productora estable.

Preferiblemente, la célula productora es obtenible a partir de una línea celular productora estable derivada.

Preferiblemente, la célula productora es obtenible a partir de una línea celular productora derivada.

50 Como se usa en la presente memoria, el término “línea celular productora derivada” es una línea celular productora transducida que se ha cribado y seleccionado para la alta expresión de un gen marcador. Dichas líneas celulares soportan un alto nivel de expresión del genoma retrovírico. El término “línea celular productora derivada” se usa intercambiablemente con el término “línea celular productora estable derivada” y el término “línea celular productora

55 estable”.

Preferiblemente, la línea celular productora derivada incluye, pero sin limitación, una célula productora retrovírica y/o lentivírica.

60 Preferiblemente, la línea celular productora derivada es una línea celular productora de VIH o EIAV, más preferiblemente una línea celular productora de EIAV.

Preferiblemente, las secuencias de proteína de cubierta y secuencias de nucleocápsida están todas integradas establemente en la célula productora y/o de empaquetamiento. Sin embargo, una o más de estas secuencias podría

65 existir también en forma episómica y podría ocurrir expresión génica a partir del episoma.

Como se usa en la presente memoria, el término “célula de empaquetamiento” hace referencia a una célula que contiene aquellos elementos necesarios para la producción de un virus recombinante infeccioso de los que carece el genoma de ARN. Típicamente, dichas células de empaquetamiento contienen uno o más plásmidos productores que son capaces de expresar proteínas estructurales víricas (tales como gag-pol y env con optimización de codones)

5 pero no contienen una señal de empaquetamiento.

El término “señal de empaquetamiento”, al que se hace referencia intercambiablemente como “secuencia de empaquetamiento” o “psi”, se usa con referencia a la secuencia no codificante de acción en cis requerida para la encapsidación de hebras de ARN retrovírico durante la formación de partículas víricas. En HIV-1, esta secuencia se

10 ha cartografiado en loci que se extienden en 5’ del sitio donante de corte y empalme principal (SD) hasta al menos el codón de inicio de gag.

Pueden prepararse fácilmente líneas celulares de empaquetamiento adecuadas para uso con los constructos de vector descritos anteriormente (véase también el documento WO 92/05266), y utilizarse para crear líneas celulares

15 productoras para la producción de partículas de vector retrovírico. Como ya se ha mencionado, se presenta un resumen de las líneas de empaquetamiento disponibles en "Retrovirus" (como anteriormente).

Como también se discute anteriormente, se ha encontrado que las líneas celulares de empaquetamiento sencillas, que comprenden un provirus en que se ha eliminado la señal de empaquetamiento, conducen a la rápida producción 20 de virus competentes de replicación indeseables mediante recombinación. Para mejorar la seguridad, se han producido líneas celulares de segunda generación en las que se elimina la 3’ LTR del provirus. En dichas células, serían necesarias dos recombinaciones para producir un virus de tipo silvestre. Una mejora adicional implica la introducción de los genes gag-pol y el gen env en constructos separados en las llamadas líneas celulares de empaquetamiento de tercera generación. Estos constructos se introducen secuencialmente para evitar la

25 recombinación durante la transfección.

Preferiblemente, las líneas celulares de empaquetamiento son líneas celulares de empaquetamiento de segunda generación.

30 Preferiblemente, las líneas celulares de empaquetamiento son líneas celulares de empaquetamiento de tercera generación.

En estas líneas celulares de tercera generación de constructo escindido, puede conseguirse una reducción adicional de la recombinación cambiando los codones. Esta técnica, basada en la redundancia del código genético, se orienta

35 a reducir la homología entre los constructos separados, por ejemplo entre las regiones de superposición en los marcos de lectura abiertos de gag-pol y env.

Las líneas celulares de empaquetamiento son útiles para proporcionar los productos génicos necesarios para encapsidar y proporcionar una proteína de membrana para la producción de partículas de vector de alto título. La

40 célula de empaquetamiento puede ser una célula cultivada in vitro tal como una línea celular de cultivo de tejido. Las líneas celulares adecuadas incluyen, pero sin limitación, células de mamífero tales como líneas celulares derivadas de fibroblasto de murino o líneas celulares humanas. Preferiblemente, la línea celular de empaquetamiento es una línea celular humana tal como, por ejemplo: HEK293, 293-T, TE671, HT1080.

45 Como alternativa, la célula de empaquetamiento puede ser una célula derivada del individuo para tratar tal como un monocito, macrófago, célula sanguínea o fibroblasto. La célula puede aislarse del individuo y administrarse los componentes de empaquetamiento y de vector ex vivo seguidos de la readministración de las células de empaquetamiento autólogas.

50 Con más detalle, la célula de empaquetamiento puede ser una célula de empaquetamiento in vivo en el cuerpo del individuo para tratar o puede ser una célula cultivada in vitro tal como una línea celular de cultivo de tejido. Las líneas celulares adecuadas incluyen células de mamífero tales como líneas celulares derivadas de fibroblasto de murino o líneas celulares humanas. Preferiblemente, la línea celular de empaquetamiento es una línea celular humana, tal como por ejemplo una línea celular 293, HEK293, 293-T, TE671, HT1080.

55 Como alternativa, la célula de empaquetamiento puede ser una célula derivada del individuo para tratar tal como un monocito, macrófago, citoblasto, célula sanguínea o fibroblasto. La célula puede aislarse del individuo y administrarse los componentes de empaquetamiento y de vector ex vivo seguidos de la readministración de las células de empaquetamiento antólogas. Como alternativa, los componentes de empaquetamiento y de vector

60 pueden administrarse a la célula de empaquetamiento in vivo. Los procedimientos para introducir componentes de empaquetamiento lentivírico y de vector en células de un individuo son conocidos en la materia. Por ejemplo, es un enfoque introducir las diferentes secuencias de ADN que se requieren para producir una partícula de vector lentivírico, por ejemplo, la secuencia de codificación de env, la secuencia de codificación de gag-pol y el genoma lentivírico defectivo, en la célula simultáneamente mediante transfección transitoria triple (Landau y Littman 1992, J.

65 Virol. 66, 5110; Soneoka et al. 1995 Nucleic Acids Res. 23: 628-633).

En una realización, las configuraciones de vector de la presente invención usan como sistema de producción tres unidades de transcripción que expresan un genoma, los componentes gag-pol y una cubierta. El módulo de expresión de cubierta puede incluir una de una serie de cubiertas tales como VSV-G o diversas cubiertas de retrovirus de murino tales como 4070A.

5 Convencionalmente, estos tres módulos se expresarían a partir de tres plásmidos transfectados transitoriamente en una línea celular apropiada tal como 293T o a partir de copias integradas en una línea celular productora estable. Es un enfoque alternativo usar otro virus como sistema de expresión para los tres módulos, por ejemplo baculovirus o adenovirus. Estos son ambos sistemas de expresión nuclear. Hasta la fecha, no se ha descrito el uso de poxvirus

10 para expresar todos los componentes de un sistema de vector lentivírico. En particular, dado el uso de codón inhabitual de los lentivirus y su requisito de sistemas de manejo de ARN como el sistema rev/RRE, no ha estado claro si es factible la incorporación de los tres módulos y su posterior expresión en un vector que se exprese en citoplasma en lugar de en núcleo. Hasta ahora, existía la posibilidad de que se requirieran factores nucleares clave y rutas de manejo de ARN nuclear para la expresión de los componentes del vector y su función en el vehículo de

15 suministro génico. Aquí, los inventores describen dicho sistema y muestran que los componentes lentivíricos pueden prepararse en citoplasma y que se ensamblan en sistemas de suministro génico funcionales. La ventaja de este sistema es la facilidad con la que pueden manejarse los poxvirus, los altos niveles de expresión y la capacidad de retener intrones en los genomas de vector.

20 La partícula de vector lentivírico según la invención será también capaz de transducir células que son de división lenta, y que no lentivirus tales como MLV no serían capaces de transducir eficazmente. Las células de división lenta se dividen una vez cada tres a cuatro días, incluyendo ciertas células tumorales. Aunque los tumores contienen células de división rápida, algunas células tumorales, especialmente aquellas en el centro del tumor, se dividen infrecuentemente. Como alternativa, la célula diana puede ser una célula de crecimiento detenido capaz de

25 experimentar división celular tal como una célula en la parte central de una masa tumoral o un citoblasto tal como un citoblasto hematopoyético o una célula positiva de CD34. Como alternativa adicional, la célula diana puede ser la precursora de una célula diferenciada tal como un precursor de monocito, una célula positiva de CD33 o un precursor mieloide. Como alternativa adicional, la célula diana puede ser una célula diferenciada tal como una neurona, astrocito, gliocito, microgliocito, macrófago, monocito, célula epitelial, célula endotelial o hepatocito. Las

30 células diana pueden transducirse in vitro tras el aislamiento a partir de un individuo humano o pueden transducirse directamente in vivo.

Es altamente deseable usar preparaciones de virus de alto título en aplicaciones tanto experimentales como prácticas. Las técnicas para aumentar el título vírico incluyen usar un psi más señal de empaquetamiento como se

35 discute anteriormente y la concentración de las provisiones de virus.

Como se usa en la presente memoria, el término “alto título” significa una cantidad eficaz de un vector o partícula lentivírico que es capaz de transducir un sitio diana tal como una célula.

40 Como se usa en la presente memoria, el término “cantidad eficaz” significa una cantidad de un vector o partícula de vector lentivírico regulado que es suficiente para inducir la expresión de los NOI en un sitio diana.

Una preparación vírica de alto título para una célula productora/de empaquetamiento es habitualmente del orden de 105 a 107 partículas retrovíricas por ml. Para transducción en tejidos tales como el cerebro, es necesario usar

45 volúmenes muy pequeños, de modo que la preparación vírica se concentra mediante ultracentrifugación. La preparación resultante debería tener al menos 108 u.t./ml, preferiblemente de 108 a 109 u.t./ml, más preferiblemente al menos 109 u.t./ml. (El título se expresa en unidades de transducción por mol (u.t./ml) titulado en una línea celular D17 estándar).

50 Los NOI están ligados operativamente con uno o más elementos promotores/potenciadores. Preferiblemente, el promotor es un promotor fuerte tal como el de CMV. El promotor puede ser un promotor regulado. El promotor puede ser específico de tejido.

La presencia de una secuencia llamada tramo central de polipurina (cPPT) puede mejorar la eficacia del suministro

55 génico a células no en división. Este elemento de acción en cis está localizado, por ejemplo, en el elemento de la región de codificación de polimerasa de EIAV. Preferiblemente, el genoma de la presente invención comprende una secuencia de cPPT.

Preferiblemente, el genoma vírico comprende un elemento regulador postranscripcional. Por ejemplo, el genoma

60 puede comprender un elemento tal como el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de marmota (WPRE).

Además, o como alternativa, el genoma vírico puede comprender un potenciador traduccional.

65 Seudotipado En el diseño de sistemas de vector retrovírico, es deseable genomanipular partículas con diferentes especificidades por célula diana que el virus nativo, para posibilitar el suministro de material genético a un intervalo aumentado o alterado de tipos celulares. Una manera en que se consigue esto es genomanipulando la proteína de cubierta vírica para alterar su especificidad. Otro enfoque es introducir una proteína de cubierta heteróloga en la partícula de vector

5 para reemplazar o añadir a la proteína de cubierta nativa del virus.

El término seudotipado significa incorporar en al menos una parte de, o sustituir una parte de, o reemplazar todo, un gen env de un genoma vírico (por) un gen env heterólogo, por ejemplo, un gen env de otro virus. El seudotipado no es un fenómeno nuevo y pueden encontrarse ejemplos en los documentos WO 99/61639, WO-A-98/05759, WO-A98/05754, WO-A-97/17457, WO-A-96/09400, WO-A-91/00047 y Mebatsion et al. 1997 Cell 90, 841-847.

En una realización preferida de la presente invención, el sistema de vector se seudotipa con un gen que codifica al menos parte de la proteína G de la rabia. En una realización preferida adicional de la presente invención, el sistema de vector se seudotipa con un gen que codifica al menos parte de la proteína G de VSV.

15 Con más detalle, el término “partícula lentivírica” hace referencia al vector lentivírico empaquetado, que es preferiblemente capaz de unirse a y entrar en células diana. Los componentes de la partícula, como ya se discutió para el vector, pueden modificarse con respecto al lentivirus de tipo silvestre. Por ejemplo, las proteínas Env en la cubierta proteica de la partícula pueden modificarse genéticamente para alterar su especificidad de diana o conseguir alguna otra función deseada.

Preferiblemente, el vector vírico transduce preferiblemente un cierto tipo de célula o tipos de célula.

Más preferiblemente, el vector vírico es un vector orientado, es decir, tiene un tropismo de tejido que está alterado 25 en comparación con el virus nativo, de modo que el vector se orienta a células particulares.

Para vectores lentivíricos, esto puede conseguirse modificando la proteína Env. La proteína Env del vector retrovírico secundario tiene que ser una cubierta no tóxica o una cubierta que pueda producirse en cantidades no tóxicas en la célula diana primaria, tal como por ejemplo una cubierta anfotrópica de MMLV o una cubierta anfotrópica modificada. El rasgo de seguridad en dicho caso es preferiblemente la deleción de regiones de homología de secuencia entre los componentes lentivíricos.

Preferiblemente, la cubierta es una que permita la transducción de células humanas. Los ejemplos de genes env adecuados incluyen, pero sin limitación, VSV-G, un env anfotrópico de MLV tal como el env 4070A, el env del virus

35 de la leucemia felina RD114 o hemaglutinina (HA) de virus de la gripe. La proteína Env puede ser una que sea capaz de unirse a un receptor en un número limitado de tipos de célula humana y puede ser una cubierta genomanipulada que contiene restos orientadores. Las secuencias de codificación de env y gag-pol se transcriben a partir de un promotor y opcionalmente un potenciador activos en la línea celular de empaquetamiento elegida y la unidad transcripcional se termina mediante una señal de poliadenilación. Por ejemplo, si la célula de empaquetamiento es una célula humana, es una combinación de promotor-potenciador adecuada aquella del gen inmediato temprano principal de citomegalovirus humano (hCMV-MIE) y puede usarse una señal de poliadenilación del virus SV40. Son conocidos en la materia otros promotores y señales de poliadenilación adecuados.

Marco de lectura abierto (ORF)

45 La primera secuencia de ácido nucleico es una secuencia que es capaz de aumentar los niveles de ARN genómico que están disponibles para empaquetamiento en ausencia de Rev, por ejemplo, en comparación con la situación en que no está presente la primera secuencia de ácido nucleico. La primera secuencia de ácido nucleico es un marco de lectura abierto (ORF) que aumenta el nivel de ARN genómico disponible para empaquetamiento en ausencia de Rev. Se incluye en ORF una serie de tripletes de codones que incluyen un codón de iniciación 5’ (que puede ser una secuencia de Kozak) que abarca hasta un codón de terminación y que representa un gen presunto o conocido. Sin embargo, puede usarse cualquier secuencia de ácido nucleico que aumente el nivel de ARN genómico para empaquetamiento.

55 Por tanto, la presente invención se refiere a un genoma de vector multicistrónico que tiene un ORF ligado operativamente con la LTR vírica y en 5’ de un promotor interno.

Cuando el genoma de vector se usa con componentes de empaquetamiento en que está ausente Rev, tales como mediante el uso de un gen gag-pol con optimización de codones, es posible producir un vector totalmente mínimo sin ningún gen vírico accesorio en la célula productora o diana.

Aún sin desear ligarse a teoría alguna, los inventores creen que, en el sistema de la invención, el transcrito de la primera secuencia de ácido nucleico se reconoce por la célula por ser un ARNm “verdadero” y por lo tanto valioso para exportar del núcleo. En ausencia de dicha secuencia, el ARNm parece degradarse en el núcleo, por ejemplo

65 mediante “degradación mediada por mutación terminadora”, antes de transportarse al citoplasma y empaquetarse posteriormente. La proteína accesoria Rev parece permitir eludir este sistema de vigilancia y por tanto mantiene los títulos víricos cuando el genoma de vector se degradaría de otro modo. La presente invención proporciona un modo alternativo y más seguro de mantener los títulos víricos.

Debería observarse que un genoma en el que una parte del ORF se invertía daba como resultado dependencias de

5 Rev diferentes de los genomas original y derivado. Aún sin desear ligarse a teoría alguna, los inventores creen que esto es debido a la presencia de un ORF en el genoma original (independiente de Rev) que se destruía en el genoma derivado (dependiente de Rev). Por tanto, el ORF debería estar en la orientación correcta, y no inversa.

El ORF puede ser útilmente de aproximadamente 0,6 a 4 kb, por ejemplo de aproximadamente 0,65 o 0,7 a 3,1 o 3,0 kb.

Preferiblemente, la primera secuencia de ácido nucleico puede ser un gen de selección al que también se hace referencia como marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexacto o tetraciclina,

15 complementan deficiencias auxotróficas o suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos. Se dan a continuación detalles adicionales sobre las primeras secuencias de ácido nucleico adecuadas en las secciones sobre genes informadores.

También es posible que la primera secuencia de ácido nucleico sea el nucleótido de interés (NOI) y se dan a continuación detalles adicionales sobre los NOI.

Sistemas de expresión regulados por tetraciclina

En otra realización preferida, la primera secuencia de ácido nucleico es un gen represor Tet, opcionalmente ligado

25 con una señal de localización nuclear (NLS). Aún sin desear ligarse a teoría alguna, los inventores creen que la adición de una NLS al extremo carboxilo aumenta la concentración de TetR en el núcleo, puesto que el extremo amino de TetR es importante para la unión del operador de tetraciclina (tetO). Por tanto, en esta realización, al menos uno de los NOI en 3’ será tetO. En una realización preferida, al menos una segunda copia del gen represor Tet está presente en 3’ de un IRES o promotor interno.

En una realización preferida adicional, el gen represor Tet tiene optimización de codones para expresar en un sistema de mamífero. Se dan a continuación detalles adicionales sobre la optimización de codones.

Por tanto, los inventores describen una secuencia génica de TetR mejorada para expresión regulada por tetraciclina

35 en células de mamífero obtenida mediante optimización de codones. Los sistemas de expresión regulados por tetraciclina tienen una utilidad de amplio intervalo en muchas aplicaciones en que la expresión génica inducible es ventajosa o esencial. La mejora de la expresión génica que puede surgir de optimizar los codones de la proteína efectora puede potenciar significativamente la eficacia del sistema al facilitar una expresión mediada por TetR más rápida.

Los inventores describen también la alteración de la secuencia 5’ del gen TetR de tal modo que el primer AUG esté en un contexto más favorable para expresión, mejorando así la fidelidad de iniciación por ribosomas eucarióticos. En una realización, la secuencia 5’ es 5' gccGCCACCAUGG 3'. (La G en posición +4 cambiaría el codón de serina o requeriría la inserción de un residuo aminoácido adicional).

45 Los inventores describen adicionalmente la incorporación de una NLS que aumenta la concentración local de TetR en el núcleo.

Optimización de codones

La optimización de codones se ha descrito anteriormente en el documento WO 99/41397. Diferentes células difieren en su uso de codones particulares. Este sesgo de codón corresponde a un sesgo en la abundancia relativa de ARNt particulares en el tipo celular. Al alterar los codones en la secuencia de modo que se adapten para coincidir con la abundancia relativa de los ARNt correspondientes, es posible aumentar la expresión. Por la misma razón, es posible

55 reducir la expresión eligiendo deliberadamente codones que sean conocidos por ser raros para los ARNt correspondientes en el tipo celular particular. Por tanto, está disponible un grado adicional de control traduccional.

Muchos virus, incluyendo VIH y otros lentivirus, usan un gran número de codones raros y, al cambiar estos para que se correspondan con los codones usados habitualmente en mamíferos, puede conseguirse una expresión aumentada de los componentes de empaquetamiento en células productoras de mamífero. Las tablas de uso de codón son conocidas en la materia para células de mamífero, así como para una variedad de otros organismos.

La optimización de codones tiene otra serie de ventajas. En virtud de las alteraciones de sus secuencias, las secuencias nucleotídicas que codifican los componentes de empaquetamiento de las partículas víricas necesarios 65 para el ensamblaje de partículas víricas en las células productoras/células de empaquetamiento, tienen eliminadas las secuencias de inestabilidad de ARN (INS) de las mismas. Al mismo tiempo, la secuencia que codifica la

secuencia aminoacídica para los componentes de empaquetamiento se retiene de modo que los componentes víricos codificados por las secuencias permanecen iguales, o al menos suficientemente similares, de modo que la función de los componentes de empaquetamiento no se comprometa. La optimización de codones supera también el requisito de Rev/RRE para exportación, volviendo las secuencias optimizadas independientes de Rev. La

5 optimización de codones reduce también la recombinación homóloga entre diferentes constructos en el sistema de vector (por ejemplo, entre las regiones de superposición en los marcos de lectura abiertos de gag-pol y env). El efecto global de la optimización de codones es por lo tanto un notable aumento del título vírico y una seguridad mejorada.

10 En una realización, solo los codones relativos a INS tienen optimización de codones. Sin embargo, en una realización mucho más preferida y práctica, las secuencias tienen optimización de codones en su totalidad, con la excepción de la secuencia que abarca el sitio de desplazamiento de marco.

El gen gag-pol comprende dos marcos de lectura superpuestos que codifican las proteínas gag y pol

15 respectivamente. La expresión de ambas proteínas depende de un desplazamiento de marco durante la traducción. Este desplazamiento de marco ocurre como resultado de un “deslizamiento” ribosómico durante la traducción. Este deslizamiento se cree que está causado al menos en parte por estructuras secundarias de ARN que detienen el ribosoma. Dichas estructuras secundarias existen en 3’ del sitio de desplazamiento de marco en el gen gag-pol. Para VIH, la región de superposición se extiende desde el nucleótido 1222 en 3’ del inicio de gag (en el que el

20 nucleótido 1 es la A del ATG de gag) hasta el final de gag (nt 1503). En consecuencia, un fragmento de 281 pb que abarca el sitio de desplazamiento de marco y la región de superposición de los dos marcos de lectura preferiblemente no tiene optimización de codones. Retener este fragmento posibilitará una expresión más eficaz de las proteínas gag-pol.

25 Para EIAV, se ha tomado como comienzo de la superposición el nt 1262 (en que el nucleótido 1 es la A de ATG de gag). El final de la superposición está a 1461 pb. Para asegurar que se conservan el sitio de desplazamiento de marco y la superposición de gag-pol, se ha retenido la secuencia de tipo silvestre de nt 1156 a 1465.

Pueden hacerse derivaciones del uso óptimo de codones, por ejemplo, para acomodar sitios de restricción 30 convenientes, y pueden introducirse cambios aminoacídicos conservativos en las proteínas gag-pol.

En una realización altamente preferida, la optimización de codones se basaba en genes de mamífero expresados débilmente. Pueden cambiarse la tercera y a veces la segunda y tercera bases.

35 Debido a la naturaleza degenerada del código genético, se apreciará que pueden conseguirse numerosas secuencias gag-pol por un trabajador experto. También hay muchas variante retrovíricas descritas que pueden usarse como punto de partida para la generación de una secuencia gag-pol con optimización de codones. Los genomas lentivíricos pueden ser bastante variables. Por ejemplo, hay muchas cuasiespecies de HIV-1 que siguen siendo funcionales. Este es también el caso de EIAV. Estas variantes pueden usarse para potenciar partes

40 particulares del proceso de transducción. Pueden encontrarse ejemplos de variantes de HIV-1 en http://hivweb.lanl.gov. Pueden encontrarse detalles de clones de EIAV en la base de datos NCBI: http:llwww.ncbi.nlm.nih.gov.

La estrategia de secuencias gag-pol y TetR con optimización de codones puede usarse con relación a cualquier retrovirus. Esto se aplicaría a todos los lentivirus, incluyendo EIAV, FIV, BIV, CAEV, VMR, SIV, HIV-1 y HIV-2.

45 Además, este procedimiento podría usarse para aumentar la expresión de genes de HTLV-1, HTLV-2, HFV, HSRV y retrovirus endógenos humanos (HERV), MLV y otros retrovirus.

La optimización de codones puede volver la expresión de gag-pol independiente de Rev. Para posibilitar el uso de factores anti-rev o RRE en el vector retrovírico, sin embargo, sería necesario volver el sistema de generación vírica

50 totalmente independiente de Rev/RRE. Por tanto, el genoma tiene que modificarse también. Esto se consigue optimizando los componentes del genoma de vector de acuerdo con la presente invención. Ventajosamente, estas modificaciones conducen también a la producción de un sistema más seguro ausente de todas las proteínas adicionales tanto en la célula productora como en la transducida.

55 Como se describe anteriormente, los componentes de empaquetamiento para un vector retrovírico incluyen los productos de expresión de los genes gag, pol y env. Además, un empaquetamiento eficaz depende de una corta secuencia de 4 horquillas seguidas de una secuencia parcial de gag y env (la “señal de empaquetamiento”). Por tanto, la inclusión de una secuencia gag eliminada en el genoma de vector retrovírico (además de la secuencia gag completa en el constructo de empaquetamiento) optimizará el título de vector. Hasta la fecha, se ha reseñado que un

60 empaquetamiento eficaz requiere de 255 a 360 nucleótidos de gag en vectores que siguen reteniendo secuencias de env, o aproximadamente 40 nucleótidos de gag en una combinación particular de mutación de donante de corte y empalme, deleciones de gag y env. Se ha encontrado sorprendentemente que una deleción de todo menos los 360

o así nucleótidos N-terminales de gag conduce a un aumento del título de vector. Por tanto, preferiblemente, el

genoma de vector retrovírico incluye una secuencia de gag que comprende una o más deleciones, más 65 preferiblemente la secuencia de gag comprende aproximadamente 360 nucleótidos derivables del extremo N.

La secuencia de TetR puede someterse útilmente a optimización de codones usando los codones mostrados en la figura 21.

NOI

5 En la presente invención, el término NOI (secuencia nucleotídica de interés) incluye cualquier secuencia nucleotídica adecuada que no tiene que ser necesariamente una secuencia de ADN o ARN de origen natural completa. Por tanto, el NOI puede ser, por ejemplo, una secuencia de ARN/ADN sintética, una secuencia de ARN/ADN recombinante (concretamente, preparada mediante el uso de técnicas de ADN recombinante), una secuencia de ADNc o una secuencia de ADN genómico parcial, incluyendo combinaciones de las mismas. La secuencia no tiene que ser una región de codificación. Si es una región de codificación, no tiene que ser una región de codificación entera. Además, la secuencia de ARN/ADN puede estar en orientación codificante o en orientación anticodificante. Preferiblemente, está en orientación codificante. Preferiblemente, la secuencia es de, o se transcribe a partir de, ADNc.

15 Los NOI, a los que también se hace referencia como “secuencias heterólogas”, “genes heterólogos” o “transgenes” pueden ser uno cualquiera o más de, por ejemplo, uno o varios genes de selección, genes marcadores o genes terapéuticos.

El NOI puede ser un gen candidato que es de significación potencial en un proceso patológico. Por tanto, el sistema de vector de la presente invención puede usarse, por ejemplo, con fines de validación de diana.

El NOI puede tener una aplicación terapéutica o de diagnóstico. Los NOI adecuados incluyen, pero sin limitación: secuencias que codifican enzimas, citocinas, quimiocinas, hormonas, anticuerpos, moléculas antioxidantes, moléculas de tipo inmunoglobulina genomanipuladas, un anticuerpo monocatenario, proteínas de fusión, moléculas

25 coestimuladoras inmunitarias, moléculas inmunomoduladoras, un ARN anticodificante, un mutante negativo transdominante de una proteína diana, una toxina, una toxina condicional, un antígeno, una proteína y factores de crecimiento supresores tumorales, proteínas de membrana, proteínas y péptidos vasoactivos, proteínas y ribozimas antivíricas y derivados de los mismos (tales como con un grupo informador asociado). Los NOI pueden codificar también enzimas activadoras de profármacos.

La secuencia de codificación de NOI puede codificar un segmento de una secuencia de codificación.

El vector lentivírico de la presente invención puede usarse para suministrar un NOI tal como una enzima activadora de profármaco a un sitio tumoral para el tratamiento de un cáncer. En cada caso, se usa un profármaco adecuado en

35 el tratamiento del individuo (tal como un paciente) en combinación con la enzima activadora de profármaco apropiada. Se administra el profármaco apropiado junto con el vector. Los ejemplos de profármacos incluyen: fosfato de etopósido (con fosfatasa alcalina, Senter et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 4842-4846); 5-fluorocitosina (con citosina desaminasa, Mullen et al. 1994 Cancer Res. 54: 1503-1506); doxorubicin-N-p-hidroxifenoxiacetamida (con penicilina-V-amidasa, Kerr et al. 1990 Cancer Immunol. Immunother. 31: 202-206); glutamato de para-N-bis(2cloroetil)aminobenzoílo (con carboxipeptidasa G2); carbamatos de cefalosporina con mostaza nitrogenada (con �lactamasa); SR4233 (con reductasa P450); ganciclovir (con timidina cinasa de HSV, Borrelli et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 7572-7576); profármacos de mostaza con nitrorreductasa (Friedlos et al. 1997 J. Med. Chem. 40: 1270-1275) y ciclofosfamida (con P450, Chen et al. 1996 Cancer Res. 56: 1331-1340).

45 Preferiblemente, el NOI es útil en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo.

Como alternativa, el NOI puede codificar un factor neuroprotector. En particular, los NOI pueden codificar moléculas que evitan que las neuronas positivas de TH mueran o que estimulan la regeneración y recuperación funcional en el sistema nigroestriado dañado.

El NOI puede codificar toda o parte de la proteína de interés (“POI”) o un mutante, homólogo o variante de la misma. Por ejemplo, el NOI puede codificar un fragmento de la POI que es capaz de funcionar in vivo de manera análoga a la proteína de tipo silvestre.

55 En una realización altamente preferida, uno de los NOI comprende una forma truncada del gen TH, que carece del dominio regulador. Dicho NOI evita la inhibición por retroalimentación por dopamina que puede limitar la expresión de la enzima completa.

El término “mutante” incluye POI que incluyen una o más variaciones aminoacídicas de la secuencia de tipo silvestre. Por ejemplo, un mutante puede comprender una o más adiciones, deleciones o sustituciones aminoacídicas. Un mutante puede surgir naturalmente o puede crearse artificialmente (por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida a sitio).

Sitio interno de entrada de ribosoma (IRES)

65 El genoma vírico del primer aspecto de la invención comprende uno o más NOI. Para expresar más de un NOI, puede haber dos o más unidades de transcripción en el genoma de vector, una por cada NOI. Sin embargo, resulta evidente por la bibliografía que los vectores retrovíricos alcanzan los títulos más altos y las propiedades de expresión génica más potentes si se mantienen genéticamente simples (documento PCT/GB96/01230; Bowtell et al., 1988 J.Virol. 62, 2464; Correll et al., 1994 Blood 84, 1812; Emerman y Temin 1984 Cell 39, 459; Ghattas et al.,;

5 Hantzopoulos et al., 1989 PNAS 86, 3519; Hatzoglou et al., 1991 J. Biol.Chem. 266, 8416; Hatzoglou et al., 1988 J. Biol.Chem. 263, 17798; Li et al., 1992 Hum. Gen.Ther. 3, 381; McLachlin et al., 1993 Virol. 195, 1; Overell et al., 1988 Mol. Cell Biol. 8, 1803; Scharfman et al., 1991 PNAS 88, 4626; Vile et al., 1994 Gene Ther. 1, 307; Xu et al., 1989 Virol. 171, 331; Yee et al., 1987 PNAS 84, 5197) y así es preferible usar un sitio interno de entrada de ribosoma (IRES) para iniciar la traducción de la segunda (y posteriores) secuencias de codificación en un mensaje policistrónico (Adam et al. 1991 J. Virol. 65, 4985).

La inserción de elementos de IRES en vectores retrovíricos es compatible con el ciclo de replicación retrovírica y permite la expresión de múltiples regiones de codificación a partir de un solo promotor (Adam et al. (como anteriormente); Koo et al. (1992) Virology 186: 669-675; Chen et al. 1993 J. Virol. 67: 2142-2148). Los elementos de

15 IRES se encontraron por primera vez en los extremos 5’ no traducidos de picornavirus, donde promueven la traducción independiente de cap de proteínas víricas (Jang et al. (1990) Enzyme 44: 292-309). Cuando se localizan entre marcos de lectura abiertos en un ARN, los elementos de IRES permiten una traducción eficaz del marco de lectura abierto en 3’ al promover la entrada del ribosoma en el elemento de IRES seguido de la iniciación de la traducción en 3’.

Se presenta una revisión de IRES por Mountford y Smith (TIG mayo de 1995, vol 11, nº 5: 179-184). Son conocidas una serie de diferentes secuencias de IRES incluyendo aquellas del virus de encefalomiocarditis (EMCV) (Ghattas, I.R., et al., Mol. Cell. Biol., 11: 5848-5859 (1991); proteína BiP [Macejak y Sarnow, Nature 353: 91 (1991)]; el gen Antennapedia de Drosophila (exones d y e) [Oh, et al., Genes & Development, 6: 1643-1653 (1992)], así como las

25 del virus de la polio (PV) [Pelletier y Sonenberg, Nature 334: 320-325 (1988); véase también Mountford y Smith, TIG 11, 179-184 (1985)].

Según el documento WO-A-97/14809, las secuencias de IRES se encuentran típicamente en la región 5’ no codificante de los genes. Además de aquellas de la bibliografía, pueden encontrarse empíricamente buscando secuencias genéticas que afecten a la expresión y determinando entonces si esa secuencia afecta al ADN (concretamente, actúa como promotor o potenciador) o solo al ARN (actúa como secuencia de IRES).

Los elementos de IRES de PV, EMCV y virus de la enfermedad vesicular porcina se han usado anteriormente en vectores retrovíricos (Coffin et al., como anteriormente).

35 El término "IRES" incluye cualquier secuencia o combinación de secuencias que funcione como, o mejore la función de, un IRES.

El o los IRES pueden ser de origen vírico (tales como IRES de EMCV o IRES de PV) o de origen celular.

Para que el IRES sea capaz de iniciar la traducción de cada NOI, debería estar localizado entre NOI en el genoma de vector. En otras palabras, siempre habrá algunas secuencias de IRES menos que NOI. Por ejemplo, para una secuencia multicistrónica que contiene n NOI, el genoma puede ser como sigue:

45 [(NOI1-n-1)-(IRES1-n-1)]-NOIn

Para secuencias bicistrónicas y tricistrónicas, el orden puede ser como sigue:

NOI1-IRES1-NOI2

NOI1-IRES1-NOI2-IRES2-NOI3

El uno o más NOI están ligados operativamente con un promotor interno. Se da a continuación una discusión sobre promotores. Es posible usar una combinación de promotores e IRES.

55 Células transducidas

La presente invención se refiere también a una célula que se ha transducido con un sistema de vector que comprende un genoma vírico según el primer aspecto de la invención.

La transducción con el sistema de vector de la presente invención puede conferir o aumentar la capacidad de la célula de producir catecolaminas. Por ejemplo, puede conferir o aumentar la capacidad de la célula de convertir tirosina en L-dopa y/o L-dopa en dopamina. La liberación de catecolaminas puede medirse mediante técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, usando un detector electroquímico conectado con una celda analítica. Además

65 de las catecolaminas mismas, pueden detectarse también subproductos asociados a la liberación de catecolamina (tales como DOPAC, un producto de degradación específico de dopamina).

La célula puede transducirse in vivo, in vitro o ex vivo. Por ejemplo, si la célula es una célula de un sujeto mamífero, la célula puede retirarse del sujeto y transducirse fácilmente para reimplantación en el sujeto (transducción ex vivo). Como alternativa, la célula puede transducirse mediante transferencia génica in vivo, usando el sistema de vector de

5 la presente invención de acuerdo con técnicas estándares (tales como mediante inyección de provisiones de vector que expresa los NOI). Si la célula es parte de una línea celular que es estable en cultivo (concretamente, que puede sobrevivir a numerosos pasos y puede multiplicarse in vitro), puede transducirse entonces in vitro mediante técnicas estándares, por ejemplo, mediante la exposición de la célula a sobrenadantes víricos que comprenden vectores que expresan los NOI.

La célula puede ser cualquier célula que sea susceptible de transducción. Si el sistema vector es capaz de transducir células no en división (por ejemplo, si es un sistema lentivírico), entonces la célula puede ser una célula no en división tal como una neurona.

15 En una realización preferida, la célula transducida forma parte de una línea celular neuronal modificada genéticamente. Dicha línea celular puede transplantarse, por ejemplo, al cerebro para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

En una realización adicional, la célula es un citoblasto neuronal. Dicha línea celular puede transplantarse, por ejemplo, al cerebro para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

En una realización adicional, la célula es una célula en el cuerpo estriado de un sujeto, tal como una neurona o gliocito. La transferencia génica directa in vivo a dicha célula puede convertirla, por ejemplo, en una célula productora de dopamina.

25 Módulos

Los inventores describen también módulos multicistrónicos que comprenden un ORF y dos o más NOI ligados operativamente por un elemento regulador tal como un IRES o promotor interno. Estos módulos pueden usarse en un procedimiento para la producción de genoma de vector en una célula productora.

Los inventores describen también un vector de expresión que comprende dicho módulo. La transfección de una célula adecuada con dicho vector de expresión debería dar como resultado una célula que expresa cada POI codificada por el NOI en el módulo.

35 La clonación del módulo en un vector de expresión y la transfección de células con el vector (para dar la expresión del módulo) pueden llevarse a cabo mediante técnicas bien conocidas en la materia (tales como las descritas en Sambrook et al. (“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), y otros libros de texto de laboratorio).

El módulo puede comprender un promotor. El módulo puede ser bicistrónico o tricistrónico y comprender los siguientes elementos:

LTR-ORF-promotor-(NOI1)-(IRES1)-(NOI2)

45 LTR-ORF-promotor-(NOI1)-(IRES1)-(NOI2)-(IRES2)-(NOI3)

El módulo puede ser bicistrónico y comprender un NOI que codifica tirosina hidroxilasa (o un mutante, variante u homólogo del mismo) y un NOI que codifica GTP-ciclohidrolasa I (o un mutante, variante u homólogo del mismo).

El módulo puede ser tricistrónico y comprender un NOI que codifica tirosina hidroxilasa (o un mutante, variante u homólogo del mismo), un NOI que codifica GTP-ciclohidrolasa I (o un mutante, variante u homólogo del mismo) y un NOI que codifica aminoácido aromático DOPA descarboxilasa (o un mutante, variante u homólogo del mismo).

55 Vector

Como es bien conocido en la materia, un vector es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. De acuerdo con la presente invención, y a modo de ejemplo, algunos vectores usados en técnicas de ADN recombinante permiten transferir entidades, tales como un segmento de ADN (tal como un segmento de ADN heterólogo, tal como un segmento de ADNc heterólogo) a una célula hospedadora con fines de replicación de los vectores que comprenden un segmento de ADN. Los ejemplos de vectores usados en técnicas de ADN recombinante incluyen, pero sin limitación, plásmidos, cromosomas, cromosomas artificiales o virus.

El término “vector” incluye vectores de expresión y/o vectores de transformación.

65 El término “vector de expresión” significa un constructo capaz de expresión in vivo o in vitro/ex vivo.

El término “vector de transformación” significa un constructo capaz de transferencia de una especie a otra.

Vector lentivírico 5 El vector vírico capaz de transducir una célula diana no en división o en división lenta es un vector lentivírico.

Los vectores lentivíricos son parte de un grupo mayor de vectores retrovíricos.

El vector de la presente invención puede suministrarse a un sitio diana mediante un vector vírico o no vírico.

Los sistemas de suministro no víricos incluyen, pero sin limitación, procedimientos de transfección de ADN. Aquí, la transfección incluye un proceso que usa un vector no vírico para suministrar un gen a una célula de mamífero diana.

15 Los procedimientos de transfección típicos incluyen electroporación, biolística de ADN, transfección mediada por lípido, transfección mediada por ADN compactado, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, mediada por agente catiónico, anfífilos faciales catiónicos (CFA) (Nature Biotechnology 199614; 556), y combinaciones de los mismos.

Los sistemas de suministro vírico incluyen, pero sin limitación, vector adenovírico, vector vírico adenoasociado (AAV), vector herpesvírico, vector retrovírico, vector lentivírico y vector baculovírico. Otros ejemplos de vectores incluyen sistemas de suministro ex vivo que incluyen, pero sin limitación, procedimientos de transfección de ADN tales como electroporación, biolística de ADN, transfección mediada por lípido y transfección mediada por ADN compactado.

25 El suministro de uno o más genes terapéuticos por un sistema de vector según la presente invención puede usarse solo o en combinación con otros tratamientos o componentes del tratamiento.

Ligado operativamente

El término “ligado operativamente” significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida.

Promotores

35 El término promotor es bien conocido en la materia y se usa en el sentido normal de la materia, por ejemplo, como sitio de unión de ARN polimerasa. El término engloba regiones de ácido nucleico en el intervalo de tamaño y complejidad desde promotores mínimos hasta promotores que incluyen elementos en 5’ y potenciadores.

El promotor se selecciona típicamente de promotores que son funcionales en células de mamífero, aunque pueden usarse promotores funcionales en otras células eucarióticas. El promotor deriva típicamente de secuencias promotoras de genes víricos o eucarióticos. Por ejemplo, puede ser un promotor derivado del genoma de una célula en que va a ocurrir la expresión. Con respecto a los promotores eucarióticos, pueden ser promotores que funcionen de manera ubicua (tales como los promotores de a-actina, -actina o tubulina) o, como alternativa, de manera específica de tejido (tal como los promotores de los genes de piruvato cinasa).

45 Preferiblemente, el promotor es un promotor H5 o sE/L modificado (véase Carroll, MW, GW Wilkinson y K Lunstrom 2001 “Mammalian expression systems and vaccination”, “Genetically Engineered Viruses” Ed CJ Ring & ED Blair pág.107-157 BIOS Scientific Oxford RU).

Preferiblemente, el promotor es un promotor temprano-tardío usado para la producción máxima de proteína y que permite una sensibilidad óptima durante el proceso de identificación de anticuerpo.

Es una combinación de promotor-potenciador preferida la combinación de promotor/potenciador inmediato temprano principal (MIE) de citomegalovirus humano (hCMV).

55 Preferiblemente, el promotor se diseña usando los datos de Davison y Moss (J. Mol. Biol. 1989 210: 749-769).

El nivel de expresión de una o varias secuencias nucleotídicas bajo el control de un promotor particular puede modularse manipulando la región promotora. Por ejemplo, diferentes dominios en una región promotora pueden poseen diferentes actividades reguladoras génicas. Los papeles de estas diferentes regiones se evalúan típicamente usando constructos de vector que tienen diferentes variantes del promotor con regiones específicas eliminadas (es decir, análisis de deleción).

Preferiblemente, el promotor es un promotor regulado por la hipoxia.

65 Preferiblemente, el promotor regulado por la hipoxia es un promotor regulado por la hipoxia específico de célula.

Preferiblemente, el promotor regulado por la hipoxia deriva de una combinación de restos de unión a ADN conocidos óptima para un tipo celular particular.

5 El potenciador y/o promotor puede ser preferiblemente activo en entorno hipóxico o isquémico o bajo en glucosa, cuando la célula hospedadora se cultiva en ciertas condiciones tales como condiciones isquémicas. El elemento potenciador, u otros elementos que confieren expresión regulada, pueden estar presentes en múltiples copias. El potenciador y/o promotor pueden ser preferiblemente activos en un entorno hipóxico o isquémico o bajo en glucosa, cuando la célula hospedadora se cultiva en ciertas condiciones tales como condiciones isquémicas. El elemento potenciador u otros elementos que confieren expresión regulada pueden estar presentes en múltiples copias.

Igualmente, o además, el potenciador y/o promotor pueden ser preferentemente activos en uno o más tipos de células hospedadoras específicas, tales como una cualquiera o más de macrófagos, células endoteliales o combinaciones de las mismas.

15 Preferiblemente, los promotores específicos de tejido son promotores de cardiomiocitos.

Preferiblemente, los promotores específicos de tejido son promotores de macrófagos.

Los ejemplos de promotores/potenciadores limitados a tejido adecuados incluyen, pero sin limitación, aquellos que son altamente activos en células tumorales tales como el promotor/potenciador del gen MUC1, del gen CEA o del gen del antígeno 5T4. Son ejemplos de promotores/potenciadores limitados temporalmente aquellos que son sensibles a la isquemia y/o hipoxia, tales como elementos de respuesta a la hipoxia o el promotor/potenciador de un gen grp78 o grp94. El promotor de a-fetoproteína (AFP) es también un promotor específico de tumor.

25 Preferiblemente, los promotores son específicos de tejido.

El término “específico de tejido” significa un promotor que no está limitado en su actividad a un solo tipo de tejido, pero que no obstante muestra selectividad porque puede ser activo en un grupo de tejidos y menos activo o latente en otro grupo. Es una característica deseable de los promotores que poseen una actividad relativamente baja en ausencia de los elementos potenciadores regulados por hipoxia activados. Un medio para conseguir esto es usar elementos “silenciadores” que suprimen la actividad de un promotor seleccionado en ausencia de hipoxia.

El nivel de expresión de una o más secuencias nucleotídicas de interés bajo el control de un promotor particular

35 puede modularse manipulando la región promotora. Por ejemplo, diferentes dominios en una región promotora pueden poseer diferentes actividades reguladoras génicas. Los papeles de estas diferentes regiones se valoran típicamente usando constructos de vector que tienen diferentes variantes del promotor con regiones específicas eliminadas (es decir, análisis de deleción). Este enfoque puede usarse para identificar, por ejemplo, la región más pequeña capaz de conferir especificidad de tejido o la región más pequeña que confiere sensibilidad a la hipoxia.

Una serie de promotores específicos de tejido, descritos anteriormente, pueden ser particularmente ventajosos para practicar la presente invención. En la mayoría de casos, estos promotores pueden aislarse como fragmentos de restricción-digestión convenientes adecuados para clonación en un vector seleccionado. Como alternativa, los fragmentos promotores pueden aislarse usando la reacción en cadena de la polimerasa. La clonación de los

45 fragmentos amplificados puede facilitarse incorporando sitios de restricción al extremo 5’ de los cebadores.

Preferiblemente, el promotor sensible a la isquemia es un promotor sensible a la isquemia limitado a tejido.

Preferiblemente, el promotor sensible a la isquemia limitado a tejido es un promotor específico de macrófagos limitado por represión.

Preferiblemente, el promotor sensible a la isquemia limitado a tejido es un promotor específico de endotelio.

Preferiblemente, el promotor sensible a la isquemia limitado a tejido es un promotor sensible a ILRE.

55 Por ejemplo, las proteínas reguladas por glucosa (grp) tales como grp78 y grp94 son proteínas altamente conservadas conocidas por inducirse por la falta de glucosa (Attenello y Lee 1984 Science 226 187-190). El gen grp78 se expresa a bajos niveles en la mayoría de tejidos sanos normales bajo la influencia de elementos promotores de nivel basal, pero tiene al menos dos “elementos reguladores inducibles por estrés” en 5’ del elemento TATA (Attenello 1984 ibid; Gazit et al. 1995 Cancer Res. 55: 1660-1663). El enlazamiento con una secuencia de 632 pares de bases truncada del extremo 5’ del promotor grp78 confiere una alta inducibilidad a la falta de glucosa a los genes informadores in vitro (Gazit et al. 1995 ibid). Además, esta secuencia promotora en vectores retrovíricos era capaz de activar un alto nivel de expresión de un gen informador en células tumorales de fibrosarcomas de murino, particularmente en sitios centrales relativamente isquémicos/fibróticos (Gazit et al. 1995 ibid).

65 Preferiblemente, los elementos promotores regulados fisiológicamente seleccionados son elementos promotores de choque térmico.

Preferiblemente, los elementos promotores regulados fisiológicamente son elementos de radiación.

5 Preferiblemente, los elementos promotores regulados fisiológicamente seleccionados son elementos de isquemia.

Potenciador

Además, cualquiera de estos promotores puede modificarse mediante la adición de secuencias reguladoras adicionales, por ejemplo secuencias potenciadoras. Pueden usarse también promotores quiméricos que comprenden elementos de secuencia de dos o más promotores diferentes descritos anteriormente.

El término “potenciador” incluye una secuencia de ADN que se une a otros componentes proteicos del complejo de iniciación de la transcripción y facilita por tanto la iniciación de la transcripción dirigida por su promotor asociado.

15 Son otros ejemplos de promotores/potenciadores limitados a tejido adecuados aquellos que son altamente activos en células tumorales tales como el promotor/potenciador del gen MUC1, del gen CEA o del gen del antígeno 5T4. El promotor de a-fetoproteína (AFP) es también un promotor específico de tejido. Es una combinación de promotorpotenciador preferida una combinación de promotor/potenciador inmediato temprano principal (MIE) de citomegalovirus humano (hCMV).

Es un potenciador preferido un elemento de respuesta a la hipoxia (HRE).

HRE

25 Como se menciona anteriormente, la hipoxia es un potente regulador de la expresión génica en un amplio intervalo de diferentes tipos celulares, y actúa mediante la inducción de la actividad de factores de transcripción inducibles por hipoxia tales como el factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1; Wang y Semenza 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 430), que se une a sitios de reconocimiento de ADN asociados, y los elementos de respuesta a la hipoxia (HRE) en diversos promotores génicos. Dachs et al. (1997 Nature Med. 5: 515) han usado una forma multimérica del HRE del gen de fosfoglicerato cinasa 1 de ratón (PGK-1) (Firth et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 6496-6500) para controlar la expresión de genes tanto marcadores como terapéuticos por células de fibrosarcoma humano en respuesta a la hipoxia in vitro y en tumores sólidos in vivo (Dachs et al. ibid).

35 Se han encontrado también elementos potenciadores de respuesta a la hipoxia (HREE) asociados con una serie de genes que incluyen el gen de eritropoyetina (EPO) (Madan et al. 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 3928; Semenza y Wang 1992 Mol. Cell. Biol. 1992 12: 5447-5454). Se han aislado otros HREE de regiones reguladoras tanto del gen de la enzima glicolítica muscular piruvato cinasa (PKM) (Takenaka et al. 1989 J. Biol. Chem. 264: 2363-2367), del gen de -enolasa específica de músculo humano (ENO3; Peshavaria y Day 1991 Biochem. J. 275: 427-433) y del gen de endotelina 1 (ET-1) (Inoue et al. 1989 J. Biol. Chem. 264: 14954-14959).

Preferiblemente, el HRE se selecciona, por ejemplo, del elemento HRE de eritropoyetina (HREE1), del elemento HRE de piruvato cinasa muscular (PKM), del HRE de fosfoglicerato cinasa (PGK), del elemento HRE de -enolasa (enolasa 3; ENO3), del elemento HRE de endotelina 1 (ET-1) y del elemento HRE de metalotioneína II (MTII).

45 Composiciones farmacéuticas

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones que comprende el vector y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable (incluyendo combinaciones de los mismos).

Las composiciones farmacéuticas pueden ser para uso humano o animal en medicina humana y veterinaria y comprenderán típicamente uno cualquiera o más de un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la materia

55 farmacéutica y se describen, por ejemplo, en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede realizarse con respecto a la vía de administración pretendida y a la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además de, portador, excipiente y diluyente cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento o agente solubilizante adecuado.

Pueden proporcionarse en la composición farmacéutica conservantes, estabilizadores, tintes e incluso agentes aromatizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico. Pueden usarse también antioxidantes y agentes de suspensión.

65 Puede haber diferentes requisitos de composición/formulación dependientes de los diferentes sistemas de suministro. A modo de ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para suministrarse usando una minibomba o por vía mucosa, por ejemplo, como un pulverizador nasal o aerosol para inhalación o solución ingerible, o por vía parenteral en la que la composición se formula en forma inyectable para suministro, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Como alternativa, la formulación puede diseñarse para suministrarse por ambas vías.

5 Cuando la composición farmacéutica va a suministrarse por vía mucosa a través de la mucosa gastrointestinal, debería poder permanecer estable durante el tránsito a través del tracto gastrointestinal; por ejemplo, debería ser resistente a la degradación proteolítica, estable a pH ácido y resistente a los efectos detergentes de la bilis.

Cuando sea apropiado, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por inhalación, en forma de un supositorio o pesario, por vía tópica en forma de una loción, solución, crema, pomada o polvo para espolvorear, mediante el uso de un parche dérmico, por vía oral en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa o tiza, o en cápsulas u óvulos solos o mezclados con excipientes, o en forma de elixires, soluciones o suspensiones que contienen agentes aromatizantes o colorante, o pueden inyectarse por vía

15 parenteral, por ejemplo intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para administración parenteral, las composiciones pueden usarse mejor en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para hacer la disolución isotónica con la sangre. Para administración bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o trociscos que pueden formularse de manera convencional.

Administración

Típicamente, un facultativo determinará la dosificación real que será más adecuada para un sujeto individual, y variará con la edad, peso y respuesta del paciente particular y la gravedad de la afección. Las dosificaciones

25 siguientes son ejemplares del caso medio. Puede haber casos individuales, por supuesto, en que se justifiquen intervalos de dosificación mayores o menores.

Las composiciones (o partes componentes de las mismas) de la presente invención pueden administrarse por vía oral. Además, o como alternativa, las composiciones (o partes componentes de las mismas) de la presente invención pueden administrarse mediante inyección directa. Además, o como alternativa, las composiciones (o partes componentes de las mismas) de la presente invención pueden administrarse por vía tópica. Además, o como alternativa, las composiciones (o partes componentes de las mismas) de la presente invención pueden administrarse por inhalación. Además, o como alternativa, las composiciones (o partes componentes de las mismas) de la presente invención pueden administrarse también mediante uno o más de los medios de administración parenteral,

35 mucoso, intramuscular, intravenoso, subcutáneo, intraocular o transdérmico, y se formulan para dicha administración.

A modo de ejemplo adicional, la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse de acuerdo con un régimen de 1 a 10 veces al día, tal como una o dos veces al día. El nivel de dosis específico y la frecuencia de dosificación para cualquier paciente particular pueden variarse y dependerán de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y el periodo de acción de ese compuesto, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y momento de la administración, tasa de excreción, combinación de fármacos, gravedad de la afección particular y el hospedador que esté experimentando la terapia.

45 El término “administrado” incluye también, pero sin limitación, el suministro por vía mucosa, por ejemplo, como pulverizador nasal o aerosol para inhalación o como solución ingerible y la vía parenteral en que el suministro es por una forma inyectable tal como, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea.

Por tanto, la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse mediante una o más de las siguientes vías: administración oral, inyección (tal como inyección directa), tópica, por inhalación, administración parenteral, administración mucosa, administración intramuscular, administración intravenosa, administración subcutánea, administración intraocular o administración transdérmica.

55 Enfermedades

Las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz del vector pueden usarse en el tratamiento de trastornos tales como los enumerados en el documento WO-A-98/09985. Por facilidad de referencia, se proporciona ahora parte de esta lista: actividad inhibidora de macrófagos y/o inhibidora de linfocitos T y, por tanto, actividad antiinflamatoria; actividad antiinmunitaria, concretamente, efectos inhibidores frente a una respuesta inmunitaria celular y/o humoral, incluyendo una respuesta no asociada a inflamación; enfermedades asociadas a virus y/u otros patógenos intracelulares; inhibición de la capacidad de macrófagos y linfocitos T de adherirse a los componentes de matriz extracelular y fibronectina, así como expresión del receptor fas regulada positivamente en linfocitos T; inhibición de una reacción inmunitaria e inflamación indeseadas, incluyendo artritis, incluyendo artritis 65 reumatoide, inflamación asociada a hipersensibilidad, reacciones alérgicas, asma, lupus sistémico eritematoso, enfermedades de colágeno y otras enfermedades autoinmunitarias, inflamación asociada a aterosclerosis, arteriosclerosis, enfermedad cardiaca aterosclerótica, lesión por reperfusión, paro cardiaco, infarto de miocardio, trastornos inflamatorios vasculares, síndrome de dificultad respiratoria u otras enfermedades cardiopulmonares, inflamación asociada a úlcera péptica, colitis ulcerosa y otras enfermedades del tracto gastrointestinal, fibrosis hepática, cirrosis hepática u otras enfermedades hepáticas, tiroiditis u otras enfermedades glandulares, 5 glomerulonefritis u otras enfermedades renales y urológicas, otitis u otras enfermedades otorrinolaringológicas, dermatitis u otras enfermedades dérmicas, enfermedades periodontales u otras enfermedades dentales, orquitis o epididimoorquitis, infertilidad, traumatismo testicular u otras enfermedades testiculares relacionadas con el sistema inmunitario, disfunción placentaria, insuficiencia placentaria, aborto recurrente, eclampsia, preeclampsia y otras enfermedades ginecológicas relacionadas con el sistema inmunitario y/o la inflamación, uveítis posterior, uveítis 10 intermedia, uveítis anterior, conjuntivitis, coriorretinitis, uveorretinitis, neuritis óptica, inflamación intraocular, por ejemplo, retinitis o edema macular quistoide, oftalmía simpática, escleritis, retinitis pigmentosa, componentes inmunitarios e inflamatorios de la enfermedad degenerativa del fondo de ojo, componentes inflamatorios del traumatismo ocular, inflamación ocular causada por infección, vitreorretinopatías proliferativas, neuropatía óptica isquémica aguda, cicatrización excesiva, por ejemplo después de operación de filtración de glaucoma, reacción 15 inmunitaria y/o inflamatoria contra implantes oculares y otras enfermedades oftálmicas relacionadas con el sistema inmunitario y la inflamación, inflamación asociada a enfermedades o afecciones o trastornos autoinmunitarios en que, tanto en el sistema nervioso central (SNC) como en cualquier otro órgano, sería beneficiosa una supresión inmunitaria y/o inflamatoria, complejo de demencia relacionada con SIDA, encefalopatía relacionada con VIH, enfermedad de Devic, corea de Sydenham, enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades, afecciones o trastornos 20 degenerativos del SNC, componentes inflamatorios de apoplejías, síndrome pospoliomelítico, componentes inmunitarios e inflamatorios de trastornos psiquiátricos, mielitis, encefalitis, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomielitis, neuropatía aguda, neuropatía subaguda, neuropatía crónica, síndrome de Guillaim-Barre, corea de Sydenham, miastenia grave, seudotumor cerebral, síndrome de Down, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, componentes inflamatorios de compresión del SNC o traumatismo del SNC o infecciones del SNC, 25 componentes inflamatorios de atrofias y distrofias musculares y enfermedades, afecciones o trastornos relacionados con el sistema inmunitario y la inflamación de los sistemas nerviosos central y periféricos, inflamación postraumática, choque séptico, enfermedades infecciosas, complicaciones inflamatorias o efectos secundarios de cirugía, transplante de médula ósea u otras complicaciones y/o efectos secundarios de transplantes, complicaciones y efectos secundarios inflamatorios y/o inmunitarios de terapia génica, por ejemplo, debido a infección con un portador 30 vírico, o inflamación asociada al SIDA, para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, para tratar o mejorar enfermedades proliferativas de monocitos o leucocitos, por ejemplo leucemia, al reducir la cantidad de monocitos o linfocitos, para la prevención y/o tratamiento de rechazo de injerto en casos de transplante de células, tejidos y órganos naturales o artificiales tales como córnea, médula ósea, órganos, lentes, marcapasos, tejido cutáneo natural o artificial. Los trastornos relacionados con el cáncer específicos incluyen, pero sin limitación: 35 tumores sólidos; tumores de transmisión hemática tales como leucemias; metástasis tumorales; tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolenticular, rubeosis; síndrome de Osler-Webber; angiogénesis de miocardio; neovascularización de placa; telangiectasia;

40 artropatía hemofílica; angiofibroma; granulación de heridas; circulación colateral coronaria; circulación colateral cerebral; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis de miembro isquémico; glaucoma neovascular; fibroplasia retrolenticular; neovascularización diabética; enfermedades relacionadas con Heliobacter, fracturas, vasculogénesis, hematopoyesis, ovulación, menstruación y placentación.

45 Figuras

La invención se describe solo a modo de ejemplo en que se hace referencia a las siguientes figuras:

la figura 1 es una representación esquemática de genomas de EIAV; 50 la figura 2 da la secuencia plasmídica total de pONY8.1G;

la figura 3 da la secuencia plasmídica total de pONY8.4ZCG;

55 la figura 4 da la secuencia plasmídica total de pONY8.4GCZ;

la figura 5 es una representación esquemática de la región U3 híbrida;

la figura 6 da la secuencia de la LTR híbrida; 60 la figura 7 da la secuencia de pONY8.1Zhyb;

la figura 8 es una representación esquemática de pONY8.1Zhyb;

65 la figura 9 es una representación esquemática de pONY8.1ZCG y pONY8.0G;

la figura 10 es una representación gráfica que muestra la eficacia de transducción relativa de pONY8.1ZCG y pONY8.0G en presencia y ausencia de Rev;

la figura 11 muestra la secuencia completa de pONY8.4TCOG; 5 la figura 12 muestra la secuencia completa de pONY8.4TsynCOG/pONY8.4TsynCOG1;

la figura 13 es una representación esquemática de pONY8.4TsynCOG/pONY8.4TsynCOG1;

la figura 14 es una representación esquemática de un ejemplo de vector bicistrónico regulado por tetraciclina;

la figura 15 muestra el análisis de uso de codón del gen TetR. MH = genes altamente expresados en mamífero, WT = gen TetR de tipo silvestre, CO = gen TetR con optimización de codón. El uso de codón se ha alterado de tal modo que se parezca más estrechamente al de los genes de mamífero altamente expresados;

15 la figura 16 muestra el alineamiento de secuencias del gen represor de Tet de tipo silvestre y con optimización de codones. Las secuencias son idénticas al 71% a nivel nucleotídico (mayor tramo de homología 13 pb);

la figura 17 muestra que el TetR con optimización de codones permite la expresión de GFP en ausencia de dox 10 veces menos que en presencia de dox. Esta diferencia es significativamente mayor que cuando se usan otros vectores, sugiriendo que pONY8.4TsynCOG permite un mejor control de la represión;

la figura 18 muestra la reversibilidad de la expresión génica regulada por Tet de vectores que contienen TetR con optimización de codones;

25 la figura 19 muestra el transcurso temporal de expresión de GFP después de la adición de doxiciclina;

la figura 20 muestra la expresión de LTR alternativas;

la figura 21 es una representación esquemática de la modificación del vector bicistrónico regulado por Tet que incorpora una segunda copia del gen represor de Tet; y

la figura 22 muestra los títulos víricos de los vectores pONY8.4 y pONY8.7 con y sin Rev presente. La expresión de pONY8.4 y pONY8.7 es independiente de Rev.

35 Ejemplo 1 - pONY8.4

La serie de vectores pONY8.4 tiene una serie de modificaciones que les posibilitan funcionar como parte de un sistema de vector transitorio o estable totalmente independiente de proteínas accesorias, sin efecto perjudicial sobre el título. Los genomas de vector lentivírico convencionales requerían la presencia de la proteína vírica rev en las células productoras (transitorias o estables) para obtener títulos adecuados. Esto incluye los sistemas de vector HTV actual así como los vectores de EIAV iniciales. Hay 4 modificaciones cuando se comparan con la serie de vectores pONY8.1, estas son:

45 a) Todos los motivos ATG que derivan de gag y forman parte de la señal de empaquetamiento se han modificado para leer ATTG. Esto permite la inserción de un marco de lectura abierto que puede activarse por un promotor en la LTR.

b) La longitud del genoma, concretamente la distancia entre las regiones R, es menor que la observada en el virus silvestre (7,9 kb).

c) La región 3' U3 se ha modificado para incluir secuencias de la región U3 del virus de leucemia Moloney (MLV) de modo que, tras la transducción, puede activar un segundo marco de lectura abierto (ORF) además del módulo interno. En este ejemplo, los inventores tienen MLV, pero este podría ser cualquier promotor.

55 d) El vector contiene una secuencia nucleotídica ligada operativamente con la LTR vírica, en la que dicha secuencia nucleotídica está en 5’ de un promotor interno y en la que dicha secuencia nucleotídica codifica un polipéptido o fragmento del mismo.

En conjunto, estas modificaciones permiten la producción de un sistema de suministro vírico sin la necesidad de proteínas accesorias y solo un 10% de la secuencia vírica original se integra en la célula diana. Estos factores son importantes para futuras consideraciones de seguridad en términos de respuesta inmunitaria y probabilidad de generación de virus competentes de replicación. Pueden encontrarse detalles adicionales sobre la modificación de LTR en los documentos de los inventores WO 96/37623 y WO 98/17816.

65 La figura 1 es una representación esquemática de genomas de EIAV. Estos pueden usarse para transfección de acuerdo con el procedimiento de la presente invención. Tras la transfección, se copiará la 3’ LTR a la 5’ LTR. La figura 2 da la secuencia plasmídica total de pONY8.1G. La figura 3 da la secuencia plasmídica total de pONY8.4ZCG. La figura 4 da la secuencia plasmídica total de pONY8.4GCZ. La figura 5 es una representación esquemática de la región U3 híbrida. La figura 6 da la secuencia de la LTR híbrida.

Ejemplo 2 - Construcción de vectores de LTR híbridos de EIAV/MLV

Se llevó a cabo la PCR como sigue:

10 Producto A = cebadores KM001 + KM003, con pONY8.1Z como diana.

Producto B = cebadores KM004 + KM005, con pHIT111 como diana.

Producto C = cebadores KM006 + KM002, con pONY8.1Z como diana.

15 Se purificaron en gel los productos de PCR (A, B y C). Se configuró una reacción de PCR usando el producto A y B (con los cebadores KM001 y KM005), dando el producto D. Se configuró una reacción de PCR usando el producto B y C (con los cebadores KM004 y KM002), dando el producto E. Se purificaron en gel los productos D y E y se usaron en una reacción de PCR como dianas con los cebadores KM001 y KM002, dando el producto F. Se purificó en gel el

20 producto F de PCR (aproximadamente 1 kb). Se cortó entonces este con Sap I y se subclonó en pONY8.1Z cortado con Sap I. Esto dio el vector pONY8.1Zhyb mostrado en las figuras 7 y 8. La 3' LTR de EIAV se ha reemplazado ahora por una LTR híbrida de EIAV/MLV. La U3 de EIAV se ha reemplazado casi por la región U3 de MLV. Las secuencias 5’ U3 de EIAV de 3’ LTR se han retenido, ya que estas comprenden el sitio att, es decir las secuencias necesarias para integración.

25 Se muestran a continuación las secuencias cebadoras:

U3 híbrido de EIAV/MLV

30 KM001 (SEQ ID NO.1)

CAAAGCATGCCTGCAGGAATTCG

KM002 (SEQ ID NO. 2)

35 GAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAG

KM003 (SEQ ID NO. 3)

KM004 (SEQ ID NO. 4) CTGTGGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGG C

KM005 (SEQ ID NO. 5) GAAGGGACTCAGACCGCAGAATCTGAGTGCCCCCCGAGTGAGGGGTTGTGGGC TCT 50 KM006 (SEQ ID NO. 6)

Secuencia del producto de PCR final. PPT/U3 de EIAV (SEQ ID NO. 7)

U3 de MLV (SEQ ID NO. 8)

U3 de MLV/ R/U5 de EIAV (SEQ ID NO. 9)

Ejemplo 3

Se determinaron las dependencias relativas de REV de pONY8.1ZCG y pONYB.0G evaluando las eficacias de transducción en presencia y ausencia de REV (véase la figura 10). Esto se consiguió usando el vector pESYNREV.

15 Se describen pESYNREV y pONY8.0Z en el documento WO 0179518. pONY8.0G deriva de pONY8.0Z, con GFP reemplazando a lacZ. pONY8.1ZCG deriva de pONY8.4ZCG, pero no tiene la LTR híbrida ni la secuencia ATTG completa. Se muestra en la figura 9 una representación esquemática de pONY8.1ZCG y pONY8.0G. Se evaluaron las eficacias de transducción de pONY8.1ZCG y pONY8.0G usando líneas celulares estándares en presencia y ausencia de REV.

20 Se midieron los niveles de ARN citoplasmático en las células productoras usando PCR cuantitativa y se normalizaron a 100 copias de -actina celular. Se tomaron las medidas en el momento de recolección vírica y muestran que los niveles de ARN con la señal de empaquetamiento de EIAV se reducen en las células productoras de pONY8.0G en ausencia de REV. Esta diferencia no se observa en las células productoras de pONY8.1ZCG. Los

25 datos muestran que el constructo pONY8.0G (+/- pESYNREV) es dependiente de REV, mientras que la eficacia de transducción de pONY8.1ZCG es independiente de REV.

Ejemplo 4

Se crearon vectores regulados por tetraciclina usando el vector pONY8.4 EIAV e incorporando el sistema de regulación por tetraciclina T-Rex para preparar pONY8.4TsynCoG1 (figuras 13 y 14). Se optimizaron los codones del promotor TetO2 para expresión en células de mamífero (figura 15). Se usó GFP como gen informado para medir la

5 expresión. Se mostró que los niveles de expresión de pONY8.4TsynCO G1 (figura 17) eran 10 veces mayores en presencia de doxiciclina (dox), que se une a TetR y alivia la represión de TetO2, que en ausencia de la misma. La comparación de la expresión de GFP con los plásmidos originales pONY8.4ZCG y pONY8.4TCOG1 muestra que la represión en ausencia de dox se consigue solo con pONY8.4ZTsynCOG1.

Ejemplo 5

Se cultivaron células transducidas con vectores derivados de pONY8.4ZCG en medios con o sin dox, después se cambió para inducir o reprimir la expresión según fuera apropiado y después se cambió de nuevo. Se confirmó la “reversibilidad” de la expresión génica regulada por Tet a partir de los vectores que contienen TetR con optimización

15 de codones. La expresión de GFP observada en las células cambiadas, como se muestra en la figura 18, tiene que alcanzar todavía los niveles máximos/mínimos observados en células que han crecido continuamente con o sin dox.

Ejemplo 6

Se preparó pONY8.4TsynnlsCOG1 en que TetR contenía una señal de localización nuclear (NLS):

en su extremo C. La NLS se reseña que mejora la tasa de represión transcripcional tres veces (Ogueta et al.) al

25 aumentar la concentración de TetR en el núcleo. Se enlazó la NLS con el extremo C-terminal para que no interfiriera con el extremo N de TetR, que es importante para unir TetO2.

Se llevó a cabo un gráfico del transcurso temporal para determinar lo rápido que ocurre la expresión después de la adición de dox (la reducción de la expresión después de la retirada de dox medida por GFP está influida por el recambio de proteína). La figura 18 muestra que la expresión es casi máxima al cabo de 24 h de la adición de dox y que el TetR con optimización de codones marcado con NLS no tenía un nivel de expresión basal menor que la versión no marcada.

Ejemplo 7

35 La figura 19 muestra la expresión de GFP a partir de las LTR alternativas PGK y RSV en vectores pONY8.3, probando que las LTR híbridas alternativas pueden usarse también en vectores configurados como pONY8.4.

Ejemplo 8

El vector bicistrónico regulado por Tet puede modificarse para incorporar una segunda copia del gen represor de Tet (figura 20). La segunda copia está 3’ de un IRES. Esta se expresará activamente cuando se transduzca en primer lugar una célula e inicialmente no contenga proteína TetR: a medida que aumentan los niveles de proteína, se anula la transcripción del gen X y la TetR localizada en 3’ del IRES (sin tetraciclina ni doxiciclina presentes). Esta represión

45 será más rápida en el constructo modificado mostrado aquí.

En ausencia de TetR activado por LTR, habría un bucle de realimentación resultante en el ciclamiento de la transcripción del gen X dependiendo de los niveles umbral de TetR. La presencia de una copia transcrita constitutivamente de TetR evita esto al mantener un nivel constante de TetR en la célula. En este ejemplo, el gen TetR en 3’ del IRES es la versión de tipo silvestre que minimiza la posibilidad de que ocurra una recombinación indeseable, sin embargo, puede concebirse cualquier combinación de secuencias génicas codificantes de la proteína TetR (el NOI puede estar localizado también en 3’ del IRES).

Ejemplo 9

55 Se comprobó la expresión de los vectores pONY8.4 y pONY8.7 en presencia y ausencia de Rev ensayando los títulos víricos de células infectadas. Los datos de virus mostrados no están concentrados y son de una sola placa. Se ensayó pONY8.7NCZ en una semana diferente que los demás vectores, por tanto a títulos ligeramente mayores. La ausencia de Rev no condujo a una diferencia significativa en el título de los vectores basados en pONY8.4 y pONY8.7, mostrando que son independientes de rev.

Resultarán evidentes para los expertos en la materia diversas modificaciones y variaciones de los procedimientos y sistema de la invención descritos sin apartarse del alcance de la invención. Aunque la invención se ha descrito con respecto a realizaciones preferidas específicas, debería entenderse que la invención como se reivindica no debería limitarse indebidamente a dichas realizaciones específicas. Es más, se pretende que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son evidentes para los expertos en biología molecular o campos relacionados.

5 Referencias Bieri et al., (1999) Nat. Biotechnol., 17: 1105-1108; Li et al., (2000) Nucleic Acids Research, 28(13): 2605-2612;

10 Beger et al., (2001) PNAS, 98(1): 130-135; Kestler et al., (1999) Human Gene Ther., 10(10): 1619-32; 15 Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol., 12: 433-55; Hoogenboom, (1997) Trends Biotechnol., 15: 62-70; Parmley y Smith, (1988) Gene, 73: 305-18; 20 Lowman et al., (1991) Biochemistry, 30: 10832-8; Nissim et al., (1994) Embo J., 13: 692-8; 25 Yelamos et al., (1995) Nature, 376: 225-9; Zaccolo et al., (1996) J. Mol. Biol., 255: 589-603; Leung et al., (1989) Technique, 1: 11-15; 30 Kowalczykowski et al., (1994) Microbiol. Rev., 58: 401-65; Stemmer, (1994) Nature, 370: 389-91; 35 Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10747-51; Goodchild, JVK, (1991) Arch. Biochem. Biophys., 284: 386-391; "Molecular Biology and Biotechnology" (Ed. RA Meyers 1995 VCH Publishers Inc, pág. 831-8320); 40 "Retroviruses" (Ed. JM Coffin et al. 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press, pág. 683); “Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus, pág. 758-763; 45 Lewis et al., (1992) EMBO. J., 11: 3053-3058; Lewis et al., (1992) EMBO. J., 11: 3053-3058; Lewis y Emerman (1994) J. Virol., 68: 510-516; 50 Yu et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 3194-3198; Dougherty y Temin (1987) Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 1197-1201; 55 Hawley et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 2406-2410; Yee et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 9564-9568; Jolly et al., (1983) Nucleic Acids Res., 11: 1855-1872; 60 Emerman y Temin (1984) Cell, 39: 449-467; Herman y Coffin (1987) Science 236: 845-848; 65 Clabough, et al., (1991) J. Virol., 65: 6242-51;

Derse y Newbold (1993) Virology, 194: 530-6; Maury, et al., (1994) Virology, 200: 632-42;

5 Martarano et al., (1994) J. Virol. 68: 3102-11; Senter et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 4842-4846; Mullen et al., (1994) Cancer Res., 54: 1503-1506;

Kerr et al., (1990) Cancer Immunol. Immunother., 31: 202-206; Borrelli et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 7572-7576;

15 Friedlos et al., (1997) J. Med. Chem. 40: 1270-1275; Chen et al., (1996) Cancer Res., 56: 1331-1340; Nature Biotechnology (1996) 14: 556;

Landau y Littman (1992) J. Virol., 66: 5110; Soneoka et al., (1995) Nucleic Acids Res., 23: 628-633;

25 Tomko et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 3352-2258; Wickham et al., (1993) Cell, 73: 309-319; Wickham et al., (1994) J. Cell Biol., 127: 257-264;

Hong et al., (1997) EMBO. 16: 2294-2306; Meyer, et al., (1991) J. Gen. Virol.. 72: 1031-1038;

35 Smith y Moss (1983) Gene, 25: 21-28; Upton, et al., (1986) J. Virology, 60: 920; Gershon, et al., (1989) J. Gen. Virol., 70: 525;

Weir, et al., (1983) J. Virol., 46: 530; Esposito, et al., (1984) Virology, 135: 561;

45 Hruby, et al., (1983) PNAS, 80: 3411; Kilpatrick, et al., (1985) Virology 143: 399; Binns, et al., (1988) J. Gen. Virol., 69: 1275;

Boyle, et al., (1987) Virology, 156: 355; Schnitzlein, et al., (1988) J. Virological Method, 20: 341;

55 Lytvyn, et al., (1992) J. Gen. Virol., 73: 3235-3240; Moss, B. (1991), Science, 252: 1662-7; Merchlinsky, M. et al., (1992) Virology, 190: 522-526;

Scheiflinger, F. et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 89: 9977-9981; Merchlinsky, M. et al., (1992) Virology, 190: 522-526; 65 Scheiflinger, F. et al., (1992), Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 89: 9977-9981;

Pfleiderer et al., (1995) J. General Virology, 76: 2957-2962; Marshall (1998) Nature Biotechnology, 16: 129;

5 Wang y Sememnza (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 4304; Firth et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 6496; Kallio, et al., (1998) Embo J., 17: 6573-86; Semenza, G et al., (1994) J. Biol. Chem., 269: 23757-63; Royds et al., (1998) Mol. Pathol., 51: 55-61;

15 Matsui et al., (1999) Cardiovasc. Res., 42: 104-12; Yan, et al., (1997) J. Biol. Chem., 272: 4287-94; Estes et al., (1995) Exp. Cell Res., 220: 47-54; Gazit et al., (1995) Cancer Res., 55: 1660; Matthias, et al., (1989) NAR, 17: 6418;

25 Carroll, MW, GW Wilkinson y K Lunstrom 2001 “Mammalian expression systems and vaccination” “Genetically Engineered Viruses” Ed: CJ Ring & ED Blair, pág.107-157 BIOS Scientific Oxford RU; Davison y Moss (1989) J. Mol. Biol., 210: 749-769; Attenello y Lee (1984) Science, 226: 187-190; Gazit et al., (1995) Cancer Res., 55: 1660-1663; Wang y Semenza (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 430; 35 Dachs et al., (1997) Nature Med., 5: 515; Firth et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 6496-6500; Madan et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 3928; Semenza y Wang (1992) Mol. Cell Biol., 12: 5447-5454; Takenaka et al., (1989) J. Biol. Chem., 264: 2363-2367; 45 Peshavaria y Day (1991) Biochem. J. 275: 427-433; Inoue et al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 14954-14959; O'Hare, M. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 98(2): 646-51; Gillett et al., (1994) Cancer Res., 54(7): 1812-7; Yu et al., (2001) Nature, 411(6841): 1017-21; 55 Stirling y Chung (2000) Eur. Respir. J., 16(6): 1158-74; Weltman y Karim (2000) Expert Opin. Investig. Drugs 9(3): 491-6; Cai, H. et al., (2001) Nat. Neurosci., 4(3): 233-4; Vigneri y Wang (2001) Nat. Med., 7(2): 228-34; Gorre et al., (3 de agosto de 2001) Science; 293(5531): 876-80; 65 McCormick (19 de julio de 2001) Nature; 412(6844): 281-2;

Jahagirdar et al., (mayo de 2001) Exp. Hematol.; 29(5): 543-56; Sillaber et al., (15 de marzo de 2000) Blood; 95(6): 2118-25;

Liu et al., (marzo de 1996) Mol. Cell Biol.; 16(3): 998-1005; Arlinghaus (1998) Crit. Rev. Oncog., 9(1): 1-18; Shah et al., (abril de 1991) Mol. Cell. Biol.; 11(4): 1854-60; Zhu et al., (11 de diciembre de 1990) Nucleic Acids Res.; 18(23): 7119-7125; Collins et al., (agosto de 1987) Mol. Cell Biol.; 7(8): 2870-2876;

Voncken et al., (noviembre de 1998) Int. J. Mol. Med.; 2(5): 577-583; Voncken et al., (10 de marzo de de 1995) Cell; 80(5): 719-728; Voncken et al., (16 de abril de 1998) Oncogene; 16(15): 2029-2032; Wetzler et al., (octubre de 1993) J. Clin. Invest.; 92(4): 1925-1939; Perkins et al., (1 de febrero de 2000) Blood; 95(3): 1014-22;

Porosnicu et al., (mayo de 2001) Leukemia;15(5): 772-778; Kwong y Todd, (1 de mayo de 1997) Blood; 89(9): 3487-8; Puccetti et al., (1 de julio de 2000) Cancer Res. 60(13): 3409-3413; Andrews y Collins, (octubre de 1987) Leukemia; 1(10): 718-24; Dalgaard (1957) Acta. Med. Scand., 328: 1-255;

Bacolla et al., (25 de mayo de 2001) J. Biol. Chem.; 276(21): 18597-604; Arnaout (2001) Annu. Rev. Med., 52: 93-123; Calvet y Grantham (marzo de 2001) Semin. Nephrol. 21(2): 107-23; Boletta et al., (noviembre de 2000) Mol. Cell.; 6(5): 1267-73; Grantham (julio de 2001) Curr. Opin. Nephrol. Hypertens.; 10(4): 533-42;

Arnould et al., (mayo de 1999) Mol. Cell Biol.; 19(5): 3423-34; Pugh et al., (marzo de 1995) Kidney Int.; 47(3): 774-81; Richard et al., (11 de marzo de 1998) J. Clin. Invest.; 101(5): 935-9; Ibraghimov-Beskrovnaya et al., (10 de junio de 1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(12): 6397-402; Kim (15 de febrero de 2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4): 1731-6;

Pey et al., (noviembre-diciembre de 1999) In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35(10): 571-9; Miskin et al., (1998 y 2000) Science, 281: 562-565; J. Virol. 74: 9412-9420; Powell et al., J. Virol., 70: 8527-33; Tait et al., J. Biol. Chem., 275: 34656-64; O'Hare, M. J. et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 98(2): 646-51;

Cai, H. et al., (2001) Nat. Neurosci., 4(3): 233-4;

Emmons SW, Somlo S. (23 de septiembre de 1999) Nature, 401(6751): 339-40.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un genoma de vector multicistrónico derivable de un lentivirus para uso en un sistema de producción lentivírico independiente de rev para producir una partícula de vector derivada de lentivirus, comprendiendo dicho genoma una 5 señal de empaquetamiento, un marco de lectura abierto (ORF) heterólogo en 3’ de una LTR vírica y en 5’ de un promotor, en el que el promotor controla la expresión de al menos un nucleótido de interés (NOI) en 3’, y en el que el ORF heterólogo está ligado operativamente con la LTR; en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen auxiliar rev está alterada de tal modo que dicho gen auxiliar es incapaz de codificar la proteína auxiliar funcional, o se retira del genoma del vector lentivírico, y en el que el elemento de respuesta a Rev (RRE) está alterado de tal

   10 modo que dicho RRE no es funcional, o se retira del genoma de vector lentivírico, y en el que el vector lentivírico es un vector lentivírico autoinactivante.
2. 2. El genoma de vector de la reivindicación 1, en el que el ORF heterólogo es un resto informador o marcador

   seleccionable. 15

3. 3.

   El genoma de vector de la reivindicación 1 o 2, en el que el ORF heterólogo codifica un gen modulador.

4. 4.

   El genoma de vector de la reivindicación 3, en el que el gen modulador se selecciona de represores de tetraciclina

   tales como TetR y transactivadores controlados por tetraciclina tales como tTa y rtTA. 20
5. 5. El genoma de vector según la reivindicación 4, en el que el represor de tetraciclina tiene optimización de codones para expresión en una célula de mamífero.
6. 6. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el genoma de vector es derivable 25 de un vector lentivírico no de primate.
7. 7. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el genoma de vector es derivable de un lentivirus seleccionado del grupo consistente en HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CEV, CAEV, MVV y vector lentivírico visna.
8. 8. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el genoma de vector comprende una secuencia de tramo central de polipurina (cPPT).
9. 9. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el genoma de vector 35 comprende un elemento regulador postranscripcional o un elemento traduccional.
10. 10. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que todos los motivos ATG que derivan de gag y forman parte de la señal de empaquetamiento se han modificado para leer ATTG.

    40 11. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el genoma de vector es bicistrónico, tricistrónico o tetracistrónico.
11. 12. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el NOI es al menos una secuencia que codifica una enzima, citocina, quimiocina, hormona, anticuerpo, molécula antioxidante, molécula de

    45 tipo inmunoglobulina genomanipulada, proteína de fusión, molécula coestimuladora inmunitaria, molécula inmunomoduladora, ARN anticodificante, mutante negativo transdominante de una proteína diana, toxina, toxina condicional, antígeno, proteína supresora tumoral, factor de crecimiento, proteína de membrana, proteína vasoactiva, proteína antivírica, ribozima o proteína activadora de profármaco.

    50 13. El genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el NOI es útil en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo.
12. 14. El genoma de vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el NOI codifica un factor

    neuroprotector. 55
13. 15. El genoma de vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el NOI es útil en el tratamiento de uveítis posterior, uveítis intermedia, uveítis anterior, conjuntivitis, coriorretinitis, uveoretinitis, neuritis óptica, inflamación intraocular, retinitis o edema macular quistoide, oftalmía simpática, escleritis, retinitis pigmentosa, componentes inmunitarios e inflamatorios de enfermedad degenerativa de fondo de ojo, componentes inflamatorios 60 de traumatismo ocular, inflamación ocular causada por infección, vitreorretinopatías proliferativas, neuropatía óptica isquémica aguda, cicatrización excesiva tal como después de operación de filtración de glaucoma, reacción inmunitaria y/o inflamatoria contra implantes oculares y otras enfermedades oftálmicas relacionadas con el sistema inmunitario y la inflamación, enfermedades angiogénicas oculares tales como retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolenticular y

    65 rubeosis.
14. 16. Un sistema de producción de vector lentivírico para producir una partícula de vector derivada de lentivirus, comprendiendo dicho sistema un conjunto de secuencias de ácido nucleico que codifican los componentes del genoma de vector incluyendo el genoma de vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, proteínas Gag y Pol y proteína Env o un sustituto funcional de las mismas, y en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el

    5 gen auxiliar rev está alterada de tal modo que dicho gen auxiliar es incapaz de codificar la proteína auxiliar funcional,

    o no está presente en el sistema de producción de vector lentivírico y no se suministra en trans, y el RRE está alterado de tal modo que dicho RRE no es funcional, o no está presente en el sistema de producción de vector lentivírico, y no se suministra en trans.

    10 17. El sistema de producción según la reivindicación 16, en el que el conjunto de secuencias de ácido nucleico comprende tres constructos de ADN que codifican (i) el genoma de vector lentivírico, (ii) Gag y Pol y (iii) Env.
15. 18. El sistema de producción según las reivindicaciones 16 o 17, en el que la secuencia de ácido nucleico que

    codifica Gag y Pol tiene optimización de codones. 15
16. 19. El sistema de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que las secuencias de ácido nucleico que codifican al menos uno de los genes auxiliares vpr, vif, tat y nef, o genes auxiliares análogos, del lentivirus del que derivan dichas partículas, están también alteradas de tal modo que dichos genes auxiliares son incapaces de codificar las proteínas auxiliares funcionales, o se retiran del sistema.
17. 20. Un constructo de ADN para uso en el sistema según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, codificando dicho constructo de ADN un genoma de vector de ARN empaquetable como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

    25 21. Un conjunto de constructos de ADN que comprende el constructo de ADN según la reivindicación 20 y un constructo de ADN que codifica Gag y Pol como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19.
18. 22. El conjunto de constructos de ADN según la reivindicación 21, que comprende adicionalmente un constructo de

    ADN que codifica Env o un sustituto funcional de la misma. 30
19. 23. Un proceso para preparar una partícula de vector lentivírico que comprende introducir un conjunto de secuencias de ácido nucleico o constructos de ADN como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 en una célula hospedadora, y obtener una partícula de vector lentivírico.

    35 24. Una partícula de vector lentivírico producida mediante el sistema, constructo de ADN o conjunto de constructos de ADN o proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23.
20. 25. Una partícula de vector derivado de lentivirus que comprende un genoma de vector como se define en una

    cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, proteínas Gag y Pol y proteína Env, o un sustituto funcional de las mismas. 40

21. 26.

    Una célula transducida con la partícula de vector lentivírico de la reivindicación 24 o 25 o un constructo de ADN o un conjunto de constructos de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22.

22. 27.

    Una partícula de vector lentivírico de la reivindicación 24 o 25 o un constructo de ADN o un conjunto de

    45 constructos de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 o una célula de la reivindicación 26 para uso en medicina.
23. 28. Una composición farmacéutica que comprende el genoma de vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, el sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, el constructo de ADN o conjunto de constructos

    50 de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, una partícula de las reivindicaciones 24 o 25 o una célula de la reivindicación 26, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
24. 29. Uso de una partícula de vector lentivírico de la reivindicación 24 o 25, o un constructo de ADN o conjunto de

    constructos de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, o una célula de la reivindicación 26, para la 55 preparación de un medicamento para suministrar un NOI a un sitio diana necesitado del mismo.
25. 30. El uso de la reivindicación 29, en el que el NOI es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a
26. 15.

    60 31. Un sistema de suministro en forma de una partícula de vector lentivírico de la reivindicación 24 o 25, o un constructo de ADN o conjunto de constructos de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, o una célula de la reivindicación 26, para uso en medicina.

    Figura 2

    Figura 3

    Figura 4

    Figura 5 Figura 6 Figura 7

    Figura 8

    Figura 11

    Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15

    Figura 16 Figura 17 Figura 18 Figura 19 Figura 20 Figura 21 Figura 22