JP5601898B2 - ウイルスベクター - Google Patents

ウイルスベクター Download PDF

Info

Publication number
JP5601898B2
JP5601898B2 JP2010144625A JP2010144625A JP5601898B2 JP 5601898 B2 JP5601898 B2 JP 5601898B2 JP 2010144625 A JP2010144625 A JP 2010144625A JP 2010144625 A JP2010144625 A JP 2010144625A JP 5601898 B2 JP5601898 B2 JP 5601898B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
vector
cells
cell
gene
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2010144625A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2010263904A (ja
Inventor
フィリッパ ラドクリフ
ジェイムス イー ミスキン
フレイザー ジェー ウィルクス
キリアコス エイ ミトロファノス
Original Assignee
オックスフォード バイオメディカ （ユーケー） リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0202403A external-priority patent/GB0202403D0/en
Priority claimed from GB0212768A external-priority patent/GB0212768D0/en
Application filed by オックスフォード バイオメディカ （ユーケー） リミテッド filed Critical オックスフォード バイオメディカ （ユーケー） リミテッド
Publication of JP2010263904A publication Critical patent/JP2010263904A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5601898B2 publication Critical patent/JP5601898B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C12N2830/003—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor tet inducible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

本発明は、ウイルスベクターゲノム、生産システム、及びそれを含むウイルス粒子、並びにこれに限定されるものではないが、特に治療におけるその使用に関する。本発明はさらに、標的部分及び／又は結合モジュレート部分を同定する方法に関する。本発明はさらに、本発明の同定法に用いることのできるベクターに関する。
たとえばレンチウイルスベクター系などのレトロウイルスベクター系は、とりわけ対象となるヌクレオチドを対象となる１つ又は複数部位に輸送するための送達系として提案されている。実際、遺伝子療法にウイルスベクターを用いるという概念は、よく知られている（Ｖｅｒｍａ及びＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９〜２４２）。レトロウイルスゲノムは、ｒｅｖ遺伝子、ｔａｔ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、ｎｅｆ遺伝子、ｖｐｒ遺伝子、又はＳ２遺伝子などの補助（accessory）遺伝子を含む。特にレトロウイルスベクター系を遺伝子療法に用いる場合、そのような補助遺伝子の欠失は非常に有利である。第１に、通常はレトロウイルス感染における疾患（たとえばＨＩＶ）に関連する遺伝子を含まないベクターの生産を可能にする。第２に、補助遺伝子の欠失は、ベクターのさらなる異種ＤＮＡのパッケージを可能にする。第３に、ｄＵＴＰａｓｅ及びＳ２などの機能が知られていない遺伝子を除去し、それにより望ましくない作用を引き起こすリスクを低減することができる。本出願人等は以前に、たとえば本出願人等のＷＯ９８／１７８１５において、多くの補助遺伝子を除去する方法を教示している。さらに、本出願人等のＷＯ９９／４５１２６において、本出願人等は、輸送のためのＲｅｖ／ＲＲＥ要求を克服し、ＲＮＡ安定性を増強するための手段としてｇａｇ−ｐｏｌ配列のコドン最適化を記載している。
ＷＯ９８／１７８１５ ＷＯ９９／４５１２６ ＷＯ９９／１５６８３ ＷＯ０１／７９５１８ ＷＯ９９／３２６４６ ＷＯ９４／２９４３８ ＷＯ９２／０５２６６ ＷＯ９９／６１６３９ ＷＯ−Ａ−９８／０５７５９ ＷＯ−Ａ−９８／０５７５４ ＷＯ−Ａ−９７／１７４５７ ＷＯ−Ａ−９６／０９４００ ＷＯ−Ａ−９１／０００４７ ＷＯ９９／４１３９７ ＰＣＴ／ＧＢ９６／０１２３０ ＷＯ−Ａ−９７／１４８０９ ＷＯ９８／５３０５７ ＷＯ９８／５３０６０ ＷＯ９８／５３０５８ ＷＯ９８／５３０５９ ＷＯ９９／４１３９７ ＷＯ００／７５３７０ ＷＯ９６／１７０５３ ＷＯ９５／３００１８ ＷＯ００／２９４２８ ＷＯ００／２８０１６ ＷＯ−Ａ−９８／０９９８５ ＷＯ９８／１７８１６ ＷＯ９９／４０９３０ ＷＯ９６／３７６２３ Ｖｅｒｍａ及びＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９〜２４２ Ｂｉｅｒｉ等、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９９）１７：１１０５〜１１０８ Ｌｉ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）２８（１３）：２６０５〜２６１２ Ｂｅｇｅｒ等、ＰＮＡＳ（２００１）９８（１）１３０〜１３５ Ｋｅｓｔｌｅｒ等、１９９９、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０（１０）：１６１９〜３２ Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９） Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（及び完全版Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ） 「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、１９９７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ編、ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ、７５８〜７６３頁 Ｌｅｗｉｓ等（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．３０５３〜３０５８ Ｙｕ等、１９８６、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８３：３１９４〜３１９８ Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＴｅｍｉｎ、１９８７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：１１９７〜１２０１ Ｈａｗｌｅｙ等、１９８７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：２４０６〜２４１０ Ｙｅｅ等、１９８７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：９５６４〜９５６８ Ｊｏｌｌｙ等、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １１：１８５５〜１８７２ Ｅｍｅｒｍａｎ及びＴｅｍｉｎ、１９８４、Ｃｅｌｌ ３９：４４９〜４６７ Ｈｅｒｍａｎ及びＣｏｆｆｉｎ、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８４５〜８４８ Ｃｌａｂｏｕｇｈ等、１９９１、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６５：６２４２〜５１ Ｄｅｒｓｅ及びＮｅｗｂｏｌｄ、１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９４：５３０〜６ Ｍａｕｒｙ等、１９９４、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００：６３２〜４２ Ｍａｒｔａｒａｎｏ等、１９９４、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６８：３１０２〜１１ Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：１〜２４ Ｋａｒｒｅｍａｎ等（１９９６）ＮＡＲ ２４：１６１６〜１６２４ Ｖａｎｉｎ等（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７１：７８２０〜７８２６ Ｐｅａｒ等、１９９３、ＰＮＡＳ ９０：８３９２〜８３９６ Ｌａｎｄａｕ及びＬｉｔｔｍａｎ、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６、５１１０ Ｓｏｎｅｏｋａ等、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：６２８〜６３３ Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ等、１９９７、Ｃｅｌｌ ９０、８４１〜８４７ Ｓｅｎｔｅｒ等、１９８８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８５：４８４２〜４８４６ Ｍｕｌｌｅｎ等、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４：１５０３〜１５０６ Ｋｅｒｒ等、１９９０、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３１：２０２〜２０６ Ｂｏｒｒｅｌｌｉ等、１９８８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８５：７５７２〜７５７６ Ｆｒｉｅｄｌｏｓ等、１９９７、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４０：１２７０〜１２７５ Ｃｈｅｎ等、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：１３３１〜１３４０ Ｂｏｗｔｅｌｌ等、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、２４６４ Ｃｏｒｒｅｌｌ等、１９９４、Ｂｌｏｏｄ ８４、１８１２ Ｅｍｅｒｍａｎ及びＴｅｍｉｎ、１９８４、Ｃｅｌｌ ３９、４５９ Ｇｈａｔｔａｓ等、１９９１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１、５８４８ Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓ等、１９８９、ＰＮＡＳ ８６、３５１９ Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ等、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６６、８４１６ Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ等、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３、１７７９８ Ｌｉ等、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３、３８１ ＭｃＬａｃｈｌｉｎ等、１９９３、Ｖｉｒｏｌ．１９５、１ Ｏｖｅｒｅｌｌ等、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８、１８０３ Ｓｃｈａｒｆｍａｎ等、１９９１、ＰＮＡＳ ８８、４６２６ Ｖｉｌｅ等、１９９４、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １、３０７ Ｘｕ等、１９８９、Ｖｉｒｏｌ．１７１、３３１ Ｙｅｅ等、１９８７、ＰＮＡＳ ８４、５１９７ Ａｄａｍ等、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５、４９８５ Ｋｏｏ等、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６：６６９〜６７５ Ｃｈｅｎ等、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２１４２〜２１４８） Ｊａｎｇ等、１９９０、Ｅｎｚｙｍｅ ４４：２９２〜３０９ Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ及びＳｍｉｔｈ、ＴＩＧ、１９９５年５月、ｖｏｌ １１、Ｎｏ５：１７９〜１８４ Ｇｈａｔｔａｓ、Ｉ．Ｒ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５８４８〜５８５９、１９９１ Ｍａｃｅｊａｋ及びＳａｒｎｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９１、１９９１ Ｏｈ等、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：１６４３〜１６５３、１９９２ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３２０〜３２５、１９８８ Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ、１９８９ 「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ、Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ、Ｔ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０ Ｗｉｎｔｅｒ等、１９９４、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２、４３３〜５５ Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、１９９７、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５、６２〜７０ Ｐａｒｍｌｅｙ及びＳｍｉｔｈ、１９８８、Ｇｅｎｅ、７３、３０５〜１８ Ｌｏｗｍａｎ等、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０、１０８３２〜８ Ｎｉｓｓｉｍ等、１９９４、Ｅｍｂｏ Ｊ、１３、６９２〜８ Ｙｅｌａｍｏｓ等、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ、３７６、２２５〜９ Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ等、１９９５、ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ． Ｚａｃｃｏｌｏ等、１９９６、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２５５、５８９〜６０３ Ｌｅｕｎｇ等、１９８９、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１、１１〜１５ Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ等、１９９４、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、５８、４０１〜６５ Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４ａ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０、３８９〜９１ Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４ｂ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９１、１０７４７〜５１ Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、ＪＶＫ、１９９１、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２８４：３８６〜３９１ 「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、ＲＡ Ｍｅｙｅｒｓ編、１９９５、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ、８３１〜８３２０頁 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６、１４：５５６ Ｔｏｍｋｏ等、１９９７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９４：３３５２〜２２５８ Ｗｉｃｋｈａｍ等、１９９３、Ｃｅｌｌ ７３：３０９〜３１９ Ｗｉｃｋｈａｍ等、１９９４、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２７：２５７〜２６４ Ｈｏｎｇ等、１９９７、ＥＭＢＯ １６：２２９４〜２３０６ Ｍｅｙｅｒ等、１９９１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０３１〜１０３８ Ｓｍｉｔｈ及びＭｏｓｓ、１９８３、Ｇｅｎｅ、２５：２１〜２８ Ｕｐｔｏｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６０：９２０、１９８６ Ｇｅｒｓｈｏｎ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２５、１９８９ Ｗｅｉｒ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ４６：５３０、１９８３ Ｅｓｐｏｓｉｔｏ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３５：５６１、１９８４ Ｈｒｕｂｙ等、ＰＮＡＳ、８０：３４１１、１９８３ Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４３：３９９、１９８５ Ｂｉｎｎｓ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ６９：１２７５、１９８８ Ｂｏｙｌｅ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５６：３５５、１９８７ Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｉｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ、２０：３４１、１９８８ Ｌｙｔｖｙｎ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ７３：３２３５〜３２４０、１９９２ Ｍｏｓｓ、Ｂ．１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６６２〜７ Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ、Ｍ．等、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２２〜５２６ Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ、Ｆ．等、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：９９７７〜９９８１ Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ等、１９９５、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：２９５７〜２９６２ Ｍａｒｓｈａｌｌ、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１２９ Ｗａｎｇ及びＳｅｍｅｍｎｚａ、１９９３、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：４３０４ Ｆｉｒｔｈ等、１９９４、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：６４９６ Ｋａｌｌｉｏ等、Ｅｍｂｏ Ｊ、１９９８、１７：６５７３〜８６ Ｓｅｍｅｎｚａ、Ｇ．等、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９４、２６９：２３７５７〜６３ Ｒｏｙｄｓ等、Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ、１９９８、５１：５５〜６１ Ｍａｔｓｕｉ等、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ、１９９９、４２：１０４〜１２ Ｙａｎ等、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９７、２７２：４２８７〜９４ Ｅｓｔｅｓ等、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、１９９５、２２０：４７〜５４ Ｇａｚｉｔ等、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１６６０ Ｍａｔｔｈｉａｓ等（１９８９）ＮＡＲ １７、６４１８ Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｃａｒｒｏｌｌ、ＭＷ、ＧＷ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、及びＫ Ｌｕｎｓｔｒｏｍ、２００１、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ、ＣＪ Ｒｉｎｇ及びＥＤ Ｂｌａｉｒ編、１０７〜１５７頁、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ Ｄａｖｉｓｏｎ及びＭｏｓｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８９、２１０：７４９〜７６９ Ａｔｔｅｎｅｌｌｏ及びＬｅｅ、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６、１８７〜１９０ Ｇａｚｉｔ等、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：１６６０〜１６６３ Ｍａｄａｎ等、１９９３、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９０：３９２８ Ｓｅｍｅｎｚａ及びＷａｎｇ、１９９２、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９９２、１２：５４４７〜５４５４ Ｔａｋｅｎａｋａ等、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：２３６３〜２３６７ Ｐｅｓｈａｖａｒｉａ及びＤａｙ、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２７５：４２７〜４３３ Ｉｎｏｕｅ等、１９８９、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１４９５４〜１４９５９ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５ Ｈａｎｓｏｎ及びＳｅｄｉｖｙ、１９９５、Ｍｏｌ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５（１）：４５〜５１ Ｏ’Ｈａｒｅ、Ｍ．Ｊ．等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２００１年１月１６日、９８（２）：６４６〜５１ Ｇｉｌｌｅｔｔ等、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４（７）：１８１２〜７ Ｙｕ等、２００１、Ｎａｔｕｒｅ ４１１（６８４１）：１０１７〜２１ Ｓｔｉｒｌｉｎｇ及びＣｈｕｎｇ、２０００、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ １６（６）：１１５８〜７４ Ｗｅｌｔｍａｎ及びＫａｒｉｍ、２０００、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ９（３）：４９１〜６ Ｃａｉ、Ｈ．等、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２００１年３月、４（３）：２３３〜４ Ｖｉｇｎｅｒｉ及びＷａｎｇ、２００１、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００１年２月、７（２）：２２８〜３４ Ｇｏｒｒｅ等、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年８月３日、２９３（５５３１）：８７６〜８０ ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、２００１、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年７月１９日、４１２（６８４４）：２８１〜２ Ｊａｈａｇｉｒｄａｒ等、２００１、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ、２００１年５月、２９（５）：５４３〜５６ Ｓｉｌｌａｂｅｒ等、２０００、Ｂｌｏｏｄ、２０００年３月１５日、９５（６）：２１１８〜２５ Ｌｉｕ等、１９９６、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９６年３月、１６（３）：９９８〜１００５ Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ、１９９８、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｇ、１９９８；９（１）：１〜１８ Ｓｈａｈ等、１９９１、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９９１年４月、１１（４）：１８５４〜６０ Ｚｈｕ等、１９９０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１９９０年１２月１１日、１８（２３）：７１１９〜７１２５ Ｃｏｌｌｉｎｓ等、１９８７、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９８７年８月、７（８）：２８７０〜２８７６ Ｖｏｎｃｋｅｎ等、１９９８、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、１９９８年１１月、２（５）：５７７〜５８３ Ｖｏｎｃｋｅｎ等、１９９５、Ｃｅｌｌ、１９９５年３月１０日、８０（５）：７１９〜７２８ Ｖｏｎｃｋｅｎ等、１９９８、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９８年４月１６日、１６（１５）：２０２９〜２０３２ Ｗｅｔｚｌｅｒ等、１９９３、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１９９３年１０月、９２（４）：１９２５〜１９３９ Ｐｅｒｋｉｎｓ等、２０００、Ｂｌｏｏｄ、２０００年２月１日、９５（３）：１０１４〜２２ Ｐｏｒｏｓｎｉｃｕ等、２００１、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００１年５月、１５（５）：７７２〜７７８ Ｋｗｏｎｇ及びＴｏｄｄ、１９９７、Ｂｌｏｏｄ、１９９７年５月１日、８９（９）：３４８７〜８ Ｐｕｃｃｅｔｔｉ等、２０００、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２０００年７月１日、６０（１３）：３４０９〜３４１３ Ａｎｄｒｅｗｓ及びＣｏｌｌｉｎｓ、１９８７、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１９８７年１０月、１（１０）：７１８〜２４ Ｄａｌｇａａｒｄ、１９５７、Ａｃｔａ Ｍｅｄ Ｓｃａｎｄ、１９５７、３２８：１〜２５５ Ｂａｃｏｌｌａ等、２００１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００１年５月２５日、２７６（２１）：１８５９７〜６０４ Ａｒｎａｏｕｔ、２００１、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ、２００１、５２：９３〜１２３、Ｒｅｖｉｅｗ Ｃａｌｖｅｔ及びＧｒａｎｔｈａｍ、２００１、Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ、２００１年３月、２１（２）：１０７〜２３、Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏｌｅｔｔａ等（２０００、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、２０００年１１月、６（５）：１２６７〜７３ Ｇｒａｎｔｈａｍ（２００１、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、２００１年７月、１０（４）：５３３〜４２ Ａｒｎｏｕｌｄ等（１９９９、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９９９年５月、１９（５）：３４２３〜３４ Ｐｕｇｈ等、１９９５、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．１９９５年３月、４７（３）：７７４〜８１ Ｒｉｃｈａｒｄ等、１９９８、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１９９８年３月１日、１０１（５）：９３５〜９ Ｉｂｒａｇｈｉｍｏｖ−Ｂｅｓｋｒｏｖｎａｙａ等、１９９７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９７年６月１０日、９４（１２）：６３９７〜４０２ Ｋｉｍ、２０００、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０００年２月１５日、９７（４）：１７３１〜６ Ｐｅｙ等、１９９９、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ、１９９９年１１月−１２月、３５（１０）：５７１〜９ Ｒａｏ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５、７０７〜７４７ Ｍｉｓｋｉｎ等、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、５６２〜５６５ Ｍｉｓｋｉｎ等、２０００、、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４、９４１２〜９４２０ Ｐｏｗｅｌｌ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、８５２７〜３３ Ｔａｉｔ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、３４６５６〜６４
しかしながら、有用且つ安全なウイルスベクターを提供するための方策、及びそれらを生産する効率的な手段の提供が依然として求められている。本発明は、これらの問題を扱い、特に有利には、治療に用いられるウイルスベクター粒子、又はその生産において、ｒｅｖなどのウイルス補助遺伝子が必要とされない、より安全な系の提供を目的とする。
したがって、本発明の一態様において、ｒｅｖ又はその機能的等価物の不在下、パッケージングに利用可能なゲノムＲＮＡのレベルが増大するように、プロモーター又はＩＲＥＳ（Internal Ribosome Entry Site）などの内部調節エレメントの上流に第１の核酸配列を含むマルチシストロン性レトロウイルスベクターゲノムが提供される。
したがって、本出願人等はさらに、ウイルス力価に有害な影響を与えることなく、ｒｅｖに非依存性のウイルスベクターを提供できることをここに見出した。
本発明によれば、さらに、ベクターがマルチシストロン性であり、ベクターゲノムがウイルスＬＴＲに機能しうる形で連結されたヌクレオチド配列を含有し、前記ヌクレオチド配列が内部調節エレメントの上流である、レンチウイルスなどのレトロウイルスベクターが提供される。
本発明によれば、さらに、ベクターがマルチシストロン性であり、ベクターゲノムがウイルスＬＴＲに機能しうる形で連結されたヌクレオチド配列を含有し、前記ヌクレオチド配列が内部プロモーター又はＩＲＥＳの上流であり、ｒｅｖの不在下、パッケージングに利用可能なゲノムＲＮＡのレベルを増大することのできる、レンチウイルスなどのレトロウイルスベクターが提供される。このヌクレオチド配列は、好ましくは、ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする。
好ましくは、ベクターゲノムは、２、３、又は４シストロン性である。
好ましくは、ベクターは、レンチウイルスベクターゲノムの形態である。
好ましくは、第１の核酸配列は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又はその一部である。
一実施形態において、第１の核酸配列は、リポーター部分（moiety）、又は選択可能マーカーである。
好ましくは、ＯＲＦは、ウイルスＬＴＲの下流である。
好ましくは、ＯＲＦは、ＬＴＲに機能しうる形で連結している。
好ましくは、補助（auxiliary）遺伝子ｒｅｖ又はその機能的等価物をコードする核酸配列は、前記補助遺伝子が機能的補助タンパク質をコードできないように破壊されている、又はベクターゲノムから除去されている、又は他の供給源からトランスで供給されていない。
他の実施形態において、第１の核酸配列は、モジュレーター遺伝子をコードする。
好ましくは、モジュレーター遺伝子は、テトラサイクリン抑制因子（repressor）、たとえばＴｅｔＲなど、及びテトラサイクリン調節トランス活性化因子（transactivator）、たとえばｔＴＡ及びｒｔＴＡなどから選択される。
好ましくは、テトラサイクリン抑制因子は、哺乳動物細胞における発現に最適化されているコドンである。
好ましくは、テトラサイクリン抑制因子は、核局在化シグナルに結合している。
好ましい実施形態において、ベクターはさらに、内部プロモーター又はＩＲＥＳの下流であり、任意選択でそれに機能しうる形で連結している１つ又は複数のＮＯＩを含む。
好ましくは、ＮＯＩは、治療効果を生じる。
一実施形態において、１つ又は複数のＮＯＩは、テトラサイクリンオペレーターに機能しうる形で連結している。
他の実施形態において、ベクターはさらに、内部プロモーター又はＩＲＥＳの下流にテトラサイクリン抑制因子を含む。
好ましくは、ベクターは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＬＶ、ＥＩＡＶ、ＣＥＶ、又はビスナレンチウイルスに由来する。
好ましくは、ベクターは、非霊長類レンチウイルスに由来する。
好ましくは、ベクターゲノムは、ｃＰＰＴ配列を含む。
好ましくは、ベクターゲノムは、転写後調節エレメント、又は翻訳エレメントを含む。
好ましくは、野生型レンチウイルスベクターゲノムのｇａｇパッケージングシグナルのＡＴＧモチーフは、ＡＴＴＧモチーフである。
好ましくは、ベクターゲノムのＲ領域間の距離は、野生型レンチウイルスベクターにおける距離と実質的に同じである。
好ましくは、ベクターゲノムの３’Ｕ３領域は、ウイルス及び／又は真核生物プロモーターの配列を含む。
好ましくは、ベクターゲノムの３’Ｕ３領域は、野生型ウイルス及び／又は真核生物プロモーターを含む。
好ましくは、ウイルスプロモーターは、ＥＩＡＶ又はＭＬＶ Ｕ３領域である。
好ましくは、プロモーターは、自己不活型ＬＴＲである。
したがって、本発明によれば、ベクターが以下を有するレンチウイルスベクターが提供される：野生型レンチウイルスベクターのｇａｇパッケージングシグナルのＡＴＧモチーフが、ＡＴＴＧモチーフであり；レンチウイルスベクターのＲ領域間の距離が、野生型レンチウイルスベクターにおける距離と実質的に同じであり；レンチウイルスベクターの３’Ｕ３領域が、ウイルス及び／又は真核生物プロモーターの配列を含む。好ましくは、３’Ｕ３領域は、ＥＩＡＶ又はＭＬＶ Ｕ３領域、或いは他のウイルス又は真核生物プロモーターの配列を含むことができる。一実施形態において、３’Ｕ３領域は、野生型ウイルス又は真核生物プロモーターを含むことができる。
本発明の他の態様によれば、レトロウイルス由来ベクター粒子を生産するためのレトロウイルスベクター生産システムが提供され、この系は、請求項のいずれか１つのベクターゲノム、ｇａｇ及びｐｏｌタンパク質、ｅｎｖタンパク質、又はそれらの機能的代替物を含むベクターの成分をコードする１セットの核酸配列を含み、ベクターのゲノムは、マルチシストロン性であり、ｒｅｖの不在下でのパッケージングに利用可能なゲノムＲＮＡ、又は前記粒子が由来するレトロウイルスの類似補助遺伝子（analogous auxiliary gene）のレベルが増大するように、プロモーター又はＩＲＥＳなどの内部調節エレメントの上流に第１の核酸配列を含む。
好ましくは、この系において、補助遺伝子ｒｅｖ、又は前記粒子が由来するレトロウイルスの類似補助遺伝子をコードする核酸配列は、前記補助遺伝子が機能的補助タンパク質をコードできないように破壊されているか、又は系から除去されているか、又は他の供給源からトランスで供給されていない。
好ましくは、この系において、前記粒子が由来するレトロウイルスの少なくとも１つの補助遺伝子ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｔａｔ、及びｎｅｆ、又は類似補助遺伝子をコードする核酸配列も、前記補助遺伝子が機能的補助タンパク質をコードできないように破壊されているか、又は系から除去されている。
好ましくは、ベクターは、レンチウイルスに由来する。
好ましくは、ベクターは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＬＶ、ＥＩＡＶ、ＣＥＶ、又はビスナレンチウイルスに由来する。
好ましくは、ベクターは、非霊長類レンチウイルスに由来する。
好ましくは、ベクターの成分をコードする核酸配列のセットは、ベクターのＲＮＡゲノム、Ｇａｇ及びＰｏｌタンパク質、及びＥｎｖタンパク質、又はそれらの機能的代替物をコードする３つのＤＮＡ構築物を含む。
本発明の他の態様によれば、本発明の系で用いるＤＮＡ構築物が提供され、前記ＤＮＡ構築物は、本発明によるパッケージ可能なＲＮＡベクターゲノムをコードする。
本発明の他の態様によれば、本発明によるＤＮＡ構築物並びにＧａｇ及びＰｏｌタンパク質、又はその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を含み、本発明の系で用いる１セットのＤＮＡ構築物が提供される。
好ましくは、このセットはさらに、Ｅｎｖタンパク質、又はその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を含む。
本発明の他の態様によれば、本発明の１セットの核酸配列又はＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入するステップ、レトロウイルスベクター粒子を得るステップを含むレトロウイルスベクター粒子を調製する方法、及び本発明による系又は方法によって生産されたレトロウイルスベクター粒子が提供される。
本発明の他の態様によれば、ベクターのＲＮＡゲノム、Ｇａｇ及びＰｏｌタンパク質、並びにＥｎｖタンパク質、又はそれらの機能的代替物を含み、ベクターのゲノムが本発明による、レトロウイルス由来ベクター粒子が提供される。
他の態様において、本発明のレトロウイルスベクター粒子又はＤＮＡ構築物によって形質導入された細胞が提供される。
本発明の他の態様において、薬剤として許容される担体又は希釈剤と共に、本発明によるベクター、系、粒子、又は細胞を含む医薬組成物が提供される。
本発明の他の態様において、それを必要としている標的部位にＮＯＩを送達する薬剤を調製するための、本発明のレトロウイルスベクター粒子又はＤＮＡ構築物、又は細胞の使用が提供される。
本発明の他の態様において、医薬に用いる、本発明のレトロウイルスベクター粒子又はＤＮＡ構築物、又は細胞の形態である送達系が提供される。
複雑な生物において、各遺伝子産物は、多くの場合、一連の複雑な細胞内又は細胞外相互作用の単一ステップのみを表す可能性のあるネットワーク又は経路の一部であり、遺伝子産物の機能は、その細胞状況によって決まると考えられる。したがって、細胞内の遺伝子産物の機能を理解し、それを生物学的過程と結びつけることによって、薬理学的操作の候補、すなわち治療標的を同定することができる。任意の潜在的な遺伝子標的の価値の確立には、疾患過程におけるその役割を見出すこと、及びその確認が必要であることは明らかである。理想的には、標的候補遺伝子の独自の役割は、疾患関連調節経路において解明される。しかしながら、細胞レベルでの遺伝子調節機構は非常に複雑であり、シグナル伝達経路の複雑な性質を反映する。潜在的標的遺伝子の役割の解明は、細胞型特異性の問題によってもさらに複雑なものとなっている。すなわち、ある細胞型、又は１つの種であっても、その潜在的遺伝子標的の機能は、他の細胞型と異なる可能性がある。
他の問題は、標的遺伝子、その臨床適用性、及び生じる遺伝子産物の関係の解明である。生物学的調節系において、ユニークな「因果」関係があるのであれば、潜在的標的遺伝子の機能は、比較的容易に解明される可能性がある。例として、インスリン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、及び顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を含むいくつかの非常に成功した生物薬剤産物は、そのような関係をモジュレートする能力を通じて作用する。しかしながら、ユニークな「因果」関係は例外であり、一般的ではない。さらに、治療薬としての受容体リガンドの開発は、リガンド重複及び細胞型特異性のために複雑である。例として、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８など）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ｂ）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリガンドは、重複、細胞型特異性、及び非線形用量依存性を示す可能性があり、これらの潜在的治療剤の臨床試験を失敗に導く可能性がある。
細胞調節の複雑性がもたらす課題に取り組むためのこれまでの試みは、複雑な生物学的ネットワークの解明及び理解に役立つ技法の開発に向けられてきた。これらの技法には、これに限定されるものではないが、プロテオミクス、マルチハイブリッドシステム、発現クローニング、及びＤＮＡチップを含む、個々の経路成分を同定する方法が含まれる。これらの方法は、個々のシグナル伝達成分間の直接及び間接的な関連から機能を推論することによって、或いは事象の相関から機能を仮定することによって適用される。しかしながら、そのような方法は面倒であり、時間がかかり、多くの場合、不明瞭な結果をもたらす。
例として、活性の容易な検出を可能にするために、固体表面に受容体を固定する「チップ」の考え方を用いる、Ｇタンパク質のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）との相互作用を測定する新規なアッセイが開発されている（Ｂｉｅｒｉ等、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９９）１７：１１０５〜１１０８を参照）。この系の重要な特徴は、受容体−Ｇタンパク質複合体が機能的形態でセンサーチップに固定されることである。すなわち、チップ表面上でのＧＰＣＲのパターン化された固定化、及び機能的応答の直接検出である。このアプローチの考えられる適用例は、既知又はオーファン受容体を活性化することのできる低分子又はペプチドのスクリーニングである。しかしながら、このスクリーニングは、受容体が活性でＧタンパク質の放出をもたらさなければならないので、アンタゴニストが認識されないという欠点を有する。さらに、チップをベースとするスクリーニングに伴う技術的問題には、ＧＰＣＲがハイスループットスクリーニング中に依然として機能的でアクセス可能であるかどうかの判定が含まれる。
シグナル伝達経路の複雑性に対処するための他のアプローチは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）などのハイスループット技法を用いて、特定の疾患関連遺伝子部位に対する直接の有効性に関して薬剤候補をスクリーニングするために、操作された細胞をベースとするアッセイを用いてきた。そのようなスクリーニングは、ゲノム内の任意の調節部位における遺伝子の活性を直接示す、細胞に導入されたレポーター遺伝子の活性に基づいている。例として、細胞ベースのアッセイは、標的ＧＰＣＲが細胞ベースである場合、機能のほとんどの局面を行わなければならず、適切なリガンド結合配置での原形質膜へのアセンブリ、及び細胞内部へのリガンド結合シグナルの伝達を含む自然の状況で行われるので、標的ＧＰＣＲの同定に有用である。
レトロウイルスベクターを用いるいくつかの細胞ベーススクリーニング法も開発されている。例として、Ｌｉ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）２８（１３）：２６０５〜２６１２は、レトロウイルスベクターに構築されたランダム化標的認識配列を伴うヘアピン型リボザイム遺伝子ライブラリーを用いる機能的ゲノムアプローチを開示している。さらなる例として、Ｂｅｇｅｒ等、ＰＮＡＳ（２００１）９８（１）１３０〜１３５は、レトロウイルスベクターを用いて、ＢＲＣＡ１発現を調節する細胞遺伝子を同定するために、リボザイムライブラリーベクターを生産できることを教示している。しかしながら、レトロウイルスベクターは１次分化非分裂細胞などの非分裂細胞を形質導入できないので、レトロウイルスベクタースクリーニングは欠点を有する。
その結果として、標準的なスクリーニング技法を用いて、今日までにいくつかの標的部分が同定されたが、これらの技法は、標的宿主細胞に特異的な候補部分の選択を可能にしていない。特にこれらのスクリーニング技法は、特定の標的細胞に適合されたスクリーニング技法の開発を可能にしていない。さらに、特にこれらのスクリーニング技法は、分化を停止し、非分裂状態である標的宿主細胞に特定の候補部分の選択を可能にしていない。
したがって、本発明のこの態様の目的は、治療的介入の潜在的薬剤標的として有用な可能性のある細胞応答経路の未知成分を同定する、細胞ベースのスクリーニングを提供することである。
本発明のこの態様はさらに、潜在的な治療剤として有用な可能性のあるこれらの標的と相互作用できる成分の同定を目的とする。
このスクリーニングはさらに、通常は所与の環境条件又は疾患状態において生じる応答に対して変化した細胞応答の検出を容易にする。
本発明のこの態様は、
（ｉ）特定の細胞又は疾患状態に合わせてスクリーニングを適合する、
（ｉｉ）非分裂細胞型又は１次最終分化非分裂細胞などの緩慢分裂細胞型を用いて行うことのできるスクリーニングを用いる組み合わせによって、新しい標的部分及び／又は結合モジュレート部分を同定する、
（ｉｉｉ）２重目的スクリーニングを用いて、考えられる標的及び治療配列を同定する、
（ｉｖ）特にｉｎ ｖｉｖｏ状態に適切である経路を用いてスクリーニングするための手段を提供するので有利である。
他の利点は、以下の説明において述べられ、明らかにされる。
本発明のこの態様は、候補部分の選択を可能にし、非分裂細胞又は緩慢分裂細胞に適切であるスクリーニング系を用いて、候補標的部分及び／又は結合モジュレート部分をスクリーニングする改善された方法を提供することを目的とする。
したがって、本発明は、候補標的部分の選択を可能にするスクリーニング系を用い、候補標的部分及び／又は非分裂細胞又は緩慢分裂細胞に適切であるベクターを用いる結合モジュレート部分をスクリーニングする改善された方法を提供することを目的とする。
本発明のこの態様によれば、細胞応答部分及び／又は結合モジュレート部分を同定する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）複数のモジュレート部分をコードする一群のＮＯＩを含む標的非分裂又は緩慢分裂細胞を提供するステップ、
（ｉｉ）任意選択で細胞を生物応答改変物質に暴露するステップ、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのモジュレート部分をコードする又は発現している標的非分裂又は緩慢分裂細胞と、モジュレート部分が存在しないコントロール細胞との間の表現型の相違を検出するステップであって、表現型の相違が、モジュレート部分と細胞応答部分との結合の結果であるステップ、及び
（ｉｖ）細胞応答部分及び／又は結合モジュレート部分を回収するステップ
を含む。
重要な非分裂標的細胞の例には、ニューロン、免疫系のある種の細胞、ある種の上皮細胞、肝細胞、及びランゲルハンス島が含まれる。さらに、分裂するが、非常に緩慢に分裂する多くの細胞が、たとえばヒトの体内に存在する。これらの緩慢分裂細胞も、たとえばＭＬＶベースベクターによって送達された遺伝子の不良なレシピエントであり、それらの細胞には、充実性腫瘍内の細胞、及び脳内のいくつかの非神経細胞が含まれる。たとえば、腫瘍内部でほとんどの細胞はいずれの時点においても分裂していないか、緩慢に分裂している。
さらに、体内で通常は分裂しない細胞が、培養時に緩慢に分裂する可能性があり、たとえば培養の１次及び神経細胞である。したがって、本発明は、非分裂細胞のみならず緩慢分裂細胞にも適用できる。
特に好ましい実施形態において、一群のＮＯＩは、ウイルスベクターで構築される。特に、このウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ベクター、ヘルペスベクター、ポックスウイルスベクター、パルボウイルス、及びバキュロウイルスベクターからなるグループから選択することができる。レンチウイルスベクターの使用が特に好ましい。
好ましくは、本発明のウイルスベクターは、最小ウイルスゲノムを有する。
本明細書では、「最小ウイルスゲノム」という用語は、必要とされる機能性を提供して、標的宿主細胞に対象となるヌクレオチド配列を感染、形質導入、及び送達するために、非必須エレメントを除去し、必須エレメントを保持するように操作されたウイルスベクターを意味する。
好ましくは、最小ウイルスゲノムを有するウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
本発明の他の実施形態において、候補モジュレート部分のライブラリーは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに導入される。
本発明の他の実施形態において、候補モジュレート部分のライブラリーは、ポックスウイルスベクターに導入される。
本発明の他の実施形態において、候補モジュレート部分のライブラリーは、ヘルペスウイルスベクターに導入される。
本発明の他の実施形態において、候補モジュレート部分のライブラリーは、バキュロウイルスベクターに導入される。
本発明の他の実施形態において、候補モジュレート部分のライブラリーは、パルボウイルスベクターに導入される（Ｋｅｓｔｌｅｒ等、１９９９、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０（１０）：１６１９〜３２を参照）。
本発明の第２の態様によれば、標的部分及び／又は結合モジュレート部分を同定する方法が提供され、この方法は、
任意選択で細胞を生物応答改変物質に暴露するステップ、複数のモジュレート部分をコードしており、レンチウイルスベクターに構築された一群のＮＯＩを含む標的細胞を提供するステップ、
少なくとも１つのモジュレート部分をコードする又は発現している標的細胞と、モジュレート部分が存在しないコントロール細胞との間の表現型の相違を検出するステップであって、表現型の相違が、モジュレート部分と標的部分との結合の結果であるステップ、及び
標的部分及び／又は結合モジュレート部分を回収するステップ
を含む。
本発明のレンチウイルスベクターには、ＨＩＶベクター（たとえばＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ベクター）、及びＳＩＶベクターなどの霊長類レンチウイルスベクター、並びに非霊長類レンチウイルスベクターが含まれる。霊長類レンチウイルスベクターは、ある種の疾患への治療的適用を制限する可能性のあるいくつかの欠点を有する。たとえば、ＨＩＶ−１は、潜在的に発癌性のタンパク質及び配列を有するヒト病原体であるという欠点を有する。ＨＩＶｇａｇ−ｐｏｌを発現するパッケージング細胞に生産されたベクター粒子の導入により、個体にこれらのタンパク質が導入され、セロコンバージョンが生じるリスクがでてくる。したがって、特に好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、又はＭＶＶなどの非霊長類レンチウイルスベクターであり、ＥＩＡＶが特に好ましい。非霊長類レンチウイルスベースベクターは、ＨＩＶタンパク質を個体に導入しない。
一実施形態において、この方法はさらに、細胞応答部分及び／又は結合モジュレート部分を単離及び／又は配列決定するステップを含む。
好ましい一実施形態において、表現型の相違は、レポーター遺伝子の転写又は発現の相違である。好ましくは、このレポーター遺伝子は、調節部分に機能しうる形で連結している。
他の好ましい実施形態において、表現型の相違は、少なくとも１つのポリペプチドと他のポリペプチドとの結合のモジュレーションである。
好ましくは、表現型の相違は、検出可能な表現型の出現又は欠損である。
好ましくは、一群のＮＯＩは、リボザイムライブラリー、アンチセンスライブラリー、及びｃＤＮＡライブラリーからなるグループから選択される。或いは、ＮＯＩは、抗体ライブラリーから選択された、又は抗体ライブラリーを用いるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であることができる。抗体ライブラリーは、好ましくは、細胞内抗体（又は「細胞内発現抗体」）ライブラリーである。
好ましい実施形態において、ＮＯＩは、構成的に発現している。他の実施形態において、ＮＯＩの発現は、調節可能プロモーターの制御下にある。
好ましい実施形態において、任意の生物応答改変物質は、疾患状態を模倣する。
好ましくは、レンチウイルスベクターは、ＥＩＡＶベクターである。
好ましい実施形態において、標的細胞は、調節可能部分に機能しうる形で連結されたレポーター部分を含む。一実施形態において、調節部分は、調節エレメントである。調節エレメントには、虚血様応答エレメント（ＩＬＲＥ）、たとえば低酸素症応答エレメント（ＨＲＥ）などが含まれる。他の実施形態において、調節エレメントは、プロモーターである。
本発明の他の態様によれば、前記請求項のいずれか一項による方法によって同定された標的部分及び／又は結合モジュレート部分が提供される。
本発明の第３の態様によれば、医療に用いるための、本発明による同定された標的部分及び／又は結合モジュレート部分を含む組成物が提供される。
本発明の第４の態様によれば、対象において疾患を治療する方法が提供され、この方法は、本発明による同定された標的部分及び／又は結合モジュレート部分を被験体に投与するステップを含む。
本発明の第５の態様によれば、細胞応答部分及び／又は結合モジュレート部分に関連する疾患を治療する薬剤の調製における、本発明による同定された標的部分及び／又は結合モジュレート部分の使用が提供される。
本発明の他の態様において、
（ｉ）選択可能マーカーをコードする任意選択の第１のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）それぞれ独立してマーカー又はモジュレーター遺伝子をコードする１つ又は複数の任意選択の第２のヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド配列に結合し、その切断を直接又は間接的にもたらすことのできる遺伝子産物をコードする機能可能にプロモーターに結合した第３のヌクレオチド配列
を含むライブラリーベクターを用いることができ、
（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）は、宿主において連続ＲＮＡ分子として（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の転写を指令できる調節配列に機能しうる形で連結している。
他の実施形態において、
（ａ）モジュレーター遺伝子をコードする第１のヌクレオチド配列、
（ｂ）前記第１ヌクレオチド配列がモジュレートするヌクレオチド配列に機能しうる形で連結している検出可能マーカー遺伝子及びプロモーターをコードする第２のヌクレオチド配列、及び
（ｃ）対象となるヌクレオチド配列
を含む標的ベクターを用いることができ、
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、宿主において連続ＲＮＡ分子として（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の転写を指令できる調節配列に機能しうる形で連結している。
本発明のスクリーニング方法は、多様な適用例に用いることができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーは、タンパク質相互作用経路の分析を助けるために、対象となるタンパク質と相互作用するタンパク質に関してスクリーニングすることができる（機能ゲノム学）。
ランダム化配列、特に部分的ランダム化配列のライブラリーは、野生型タンパク質／ヌクレオチドと比較して、向上した結合親和性又は触媒活性を有するタンパク質又はヌクレオチドを「進化させる」ために、定方向進化スクリーニングに用いることができる。たとえば、ランダム化ライブラリーは、所与の配列に特定の特異性を有するＤＮＡ結合タンパク質を選択するために用いることができる。このアプローチの他の適用例は、抗体の親和性成熟である。
他の適用例には、酵素などの、タンパク質のペプチド阻害因子又は活性化因子を同定する、ペプチドをコードするライブラリーのスクリーニングが含まれる。
本発明の様々な好ましい特徴及び実施形態を、ここに非限定的な例として説明する。一般に本明細書に記載の技法は当分野においてよく知られているが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（及び完全版Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）を参照することができる。
レトロウイルス及びレンチウイルス
前述のとおり、遺伝子療法にウイルスベクターを用いるという概念はよく知られている（Ｖｅｒｍａ及びＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９〜２４２）。
多くのレトロウイルスが存在する。本出願において、「レトロウイルス」という用語には、マウス白血球ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血球ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉種ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血球ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、鳥類骨髄細胞腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、及び鳥類赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、並びにレンチウイルスを含む他のすべてのレトロウイルス科が含まれる。
レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ等（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、１９９７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ編、ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ、７５８〜７６３頁）に見出すことができる。
レンチウイルスもレトロウイルス科に属するが、レンチウイルスは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染できる（Ｌｅｗｉｓ等（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．３０５３〜３０５８）。
レンチウイルス群は、「霊長類」及び「非霊長類」に分類することができる。霊長類レンチウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原因子、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。非霊長類レンチウイルス群には、原型「遅発性ウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、並びに関連ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、並びにより最近記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
いくつかのレンチウイルスのゲノム構造に関する詳細は、当分野において見出すことができる。例として、ＨＩＶ及びＥＩＡＶは、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに見出すことができる（すなわち、それぞれゲノムアクセッション番号ＡＦ０３３８１９及びＡＦ０３３８２０）。ＨＩＶ変異株の詳細も、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ．に見出すことができる。ＥＩＡＶ変異株の詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．に見出すことができる。
感染の過程で、レトロウイルスは最初に特定の細胞表面受容体に付着する。感受性宿主細胞に侵入すると、次いでレトロウイルスＲＮＡゲノムは、親ウイルス内部に保持されているウイルスでコードされた逆転写酵素によってＤＮＡにコピーされる。このＤＮＡは宿主細胞核に輸送され、そこで続いて宿主ゲノムに組み込まれる。このステップでは、典型的にプロウイルスと呼ばれる。このプロウイルスは、細胞分裂中、宿主染色体において安定であり、他の細胞遺伝子と同様に転写される。プロウイルスは、さらにウイルスを作製するために必要なタンパク質及び他の因子をコードし、「出芽」と称されることのあるプロセスによって細胞を離れることができる。
各レトロウイルスゲノムは、ビリオンタンパク質及び酵素をコードする、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含む。これらの遺伝子は、両端を長末端反復（ＬＴＲ）と呼ばれる領域に挟まれている。ＬＴＲは、プロウイルス組み込み及び転写に関与する。ＬＴＲはさらに、エンハンサー／プロモーター配列として作用する。換言すると、ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのカプシド化は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列によって起こる。
ＬＴＲ自体は、Ｕ３、Ｒ、Ｕ５と呼ばれる３つのエレメントに分けることのできる同一配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両端で反復する配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する。３つのエレメントの大きさは、種々のレトロウイルス間でかなり多様であり得る。
ウイルスゲノムの場合、転写開始部位は、左側ＬＴＲのＵ３とＲの境界であり、ポリ（Ａ）付加（終止）部位は、右側ＬＴＲのＲとＵ５の境界である。Ｕ３は、プロウイルスの転写制御エレメントの大部分を含み、これには、細胞転写活性化タンパク質、及び場合によっては、ウイルス転写活性化タンパク質に応答性の複数のエンハンサー配列及びプロモーターが含まれる。いくつかのレトロウイルスは、遺伝子発現の調節に関与するタンパク質をコードする以下の遺伝子、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｔａｘ、ｒｅｘのいずれか１つ又は複数の遺伝子を有する。
構造遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ自体に関して、ｇａｇは、ウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質は、タンパク質分解によって、成熟タンパク質ＭＡ（基質）、ＣＡ（カプシド）、及びＮＣ（ヌクレオカプシド）に処理される。ｐｏｌ遺伝子は、逆転写酵素（ＲＴ）をコードするが、逆転写酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、関連ＲＮアーゼＨ、及びインテグラーゼ（ＩＮ）を含み、ゲノムの複製を媒介する。ｅｎｖ遺伝子は、ビリオンの表面（ＳＵ）糖タンパク質、及び膜貫通（ＴＭ）タンパク質をコードし、細胞受容体タンパク質と特異的に相互作用する複合体を形成する。この相互作用は最終的に、ウイルス膜と細胞膜との融合による感染をもたらす。
レトロウイルスはさらに、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの他にタンパク質をコードする「追加」遺伝子を含有することができる。追加遺伝子の例には、ＨＩＶにおいてｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、及びｎｅｆの１つ又は複数が含まれる。ＥＩＡＶは（特に）追加遺伝子Ｓ２を有する。
追加遺伝子によってコードされたタンパク質は種々の機能を果たし、その一部は、細胞タンパク質によって提供される機能の重複である可能性がある。ＥＩＡＶでは、たとえばｔａｔは、ウイルスＬＴＲの転写活性化因子として作用する。ｔａｔは、ＴＡＲと呼ばれる安定なステムループＲＮＡ２次構造に結合する。ｒｅｖは、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）によって、ウイルス遺伝子の発現を調節及び調整する。これらの２つのタンパク質の作用機構は、霊長類ウイルスの類似の機構に広く類似すると考えられている。Ｓ２の機能は未知である。さらに、ＥＩＡＶタンパク質、Ｔｔｍは、膜貫通タンパク質の開始時にｅｎｖコード配列にスプライシングされたｔａｔの第１のエキソンによってコードされることが確認されている。
本発明の一実施形態において、本発明のレンチウイルスベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。
本明細書において、「組換えレンチウイルスベクター」（ＲＬＶ）という用語は、パッケージング成分の存在下で、標的細胞を感染し、形質導入することのできるウイルス粒子へのＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にするのに充分な遺伝子情報を備えたベクターをいう。標的細胞の感染及び形質導入には、標的細胞ゲノムへの組み込み、及び逆転写が含まれる。ＲＬＶは、ベクターによって標的細胞に送達される非ウイルスコード配列を保持する。ＲＬＶは、独立複製によって、最終標的細胞内に感染レトロウイルス粒子を生産することができない。通常、ＲＬＶは、機能性ｇａｇ−ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子及び／又は複製に必要な他の遺伝子を欠失している。本発明のベクターは、スプリット−イントロンベクターとして構成することができる。スプリットイントロンベクターの例は、ＷＯ９９／１５６８３に記載されている。
好ましくは、本発明の組換えレンチウイルスベクター（ＲＬＶ）は、最小ウイルスゲノムを有する。
本明細書では、「最小ウイルスゲノム」という用語は、必要とされる機能性を提供して、標的宿主細胞に対象となるヌクレオチド配列を感染、形質導入、及び送達するために、非必須エレメントを除去し、必須エレメントを保持するように操作されたウイルスベクターを意味する。この戦略に関するさらなる詳細は、本出願人等のＷＯ９８／１７８１５に見出すことができる。
したがって、本発明に用いられる最小レンチウイルスゲノムは、（５’）Ｒ−Ｕ５−１つ又は複数の第１のヌクレオチド配列−（調節エレメント−ＮＯＩ）ｎ−Ｕ３−Ｒ（３’）を含む。しかしながら、宿主細胞／パッケージング細胞内でレンチウイルスゲノムを生産するために用いられるプラスミドベクターには、さらに宿主細胞／パッケージング細胞でゲノムの転写を指令するようにレンチウイルスゲノムに機能しうる形で連結された転写調節制御配列が含まれる。これらの調節配列は、転写レトロウイルス配列、すなわち、５’Ｕ３領域に関連する自然配列であることができ、或いは別のウイルスプロモーター、たとえばＣＭＶプロモーターなどの異種プロモーターであることができる。いくつかのレンチウイルスゲノムは、効率的なウイルス生産のために追加の配列を必要とする。たとえば、ＨＩＶの場合、好ましくは、ｒｅｖ及びＲＲＥ配列が含まれる。しかしながら、ｒｅｖ及びＲＲＥの要件は、本発明を用いて低減又は除去することができる。ｒｅｖ及びＲＲＥの任意の要件は、コドン最適化によってさらに低減又は除去することができる。この戦略のさらなる詳細は、本出願人等のＷＯ０１／７９５１８に見出すことができる。さらにｒｅｖの要件は、以下の少なくとも１つを有するベクターの使用によって、さらに低減又は除去することができる。野生型ウイルスベクターのｇａｇパッケージングシグナルのＡＴＧモチーフがＡＴＴＧモチーフである；ウイルスベクターのＲ領域間の距離が野生型ウイルスベクターにおける距離と実質的に同じである；ウイルスベクターの３’Ｕ３領域がＭＬＶ Ｕ３領域の配列を含む；且つウイルスＬＴＲに機能しうる形で連結されたヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列は、内部プロモーターの上流であり、前記ヌクレオチド配列は、好ましくはポリペプチド又はそのフラグメントをコードする。
ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同じ機能を果たす別の配列も知られている。たとえば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的類似体が、マソン−ファイザーサルウイルスに見出されている。これはＣＴＥとして知られており、感染細胞において因子と相互作用すると考えられているゲノムのＲＲＥ型配列を含む。この細胞因子は、ｒｅｖ類似体と考えることができる。したがって、ＣＴＥは、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の代替として用いることができる。知られている又は利用可能になる任意の他の機能的等価物は、本発明に関連する可能性がある。たとえば、ＨＴＬＶ−ＩのＲｅｘタンパク質は、機能的にＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質に取って代わり得ることも知られている。さらに、Ｒｅｖ及びＲｅｘが、ＩＲＥ−ＢＰに類似の作用を有することが知られている。
好ましい実施形態において、本発明の第１の態様のウイルスゲノムは、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を欠失している。
好ましい実施形態において、本発明に用いられる系は、追加遺伝子の一部又はすべてが除去された、いわゆる「最小」系をベースにしている。
本発明の一実施形態において、レンチウイルスベクターは、自己不活性化ベクターである。換言すると、ウイルスプロモーターは、自己不活性化ＬＴＲである。
例として、自己不活性化レトロウイルスベクターは、３’ＬＴＲのＵ３領域において転写エンハンサー、又はエンハンサー及びプロモーターを削除することによって構築されてきた。一連のベクターの逆転写及び組み込み後、これらの変化は、５’及び３’ＬＴＲの両方にコピーされ、転写不活性なプロウイルスが生産される（Ｙｕ等、１９８６、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８３：３１９４〜３１９８、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＴｅｍｉｎ、１９８７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：１１９７〜１２０１、Ｈａｗｌｅｙ等、１９８７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：２４０６〜２４１０、Ｙｅｅ等、１９８７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：９５６４〜９５６８）。しかしながら、そのようなベクターのＬＴＲ内部の任意のプロモーターは依然として転写活性である。この戦略は、内部に位置する遺伝子の転写に対する、ウイルスＬＴＲのエンハンサー及びプロモーターの影響を排除するために用いられてきた。そのような影響には、転写の増大（Ｊｏｌｌｙ等、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １１：１８５５〜１８７２）又は転写の抑制（Ｅｍｅｒｍａｎ及びＴｅｍｉｎ、１９８４、Ｃｅｌｌ ３９：４４９〜４６７）が含まれる。この戦略は、ゲノムＤＮＡへの３’ＬＴＲからの下流転写を排除するために用いることもできる（Ｈｅｒｍａｎ及びＣｏｆｆｉｎ、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８４５〜８４８）。これは、内因性癌遺伝子の外因性活性化の防止が非常に重要であるヒトの遺伝子治療において特に重要である。
本発明の一実施形態において、レンチウイルスベクターは、非霊長類レンチウイルスに由来する。非霊長類レンチウイルスは、天然には霊長類に感染しないレンチウイルス科の任意のメンバーであることができ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ）、又はウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を含むことができる。好ましくは、レンチウイルスはＥＩＡＶである。ウマ伝染性貧血ウイルスは、ウマ科のすべてに感染し、血漿ウイルス血症及び血小板減少を引き起こす（Ｃｌａｂｏｕｇｈ等、１９９１、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６５：６２４２〜５１）。ウイルス複製は、単球のマクロファージへの成熟過程によって調節されると考えられている。
ＥＩＡＶは、レンチウイルスのもっとも単純なゲノム構造を有し、本発明での使用に特に好ましい。ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子に加えて、ＥＩＡＶは、他の３つの遺伝子、ｔａｔ、ｒｅｖ、及びＳ２をコードする。Ｔａｔは、ウイルスＬＴＲの転写活性化因子として作用し（Ｄｅｒｓｅ及びＮｅｗｂｏｌｄ、１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９４：５３０〜６、Ｍａｕｒｙ等、１９９４、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００：６３２〜４２）、Ｒｅｖは、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）によって、ウイルス遺伝子の発現を調節及び調整する（Ｍａｒｔａｒａｎｏ等、１９９４、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６８：３１０２〜１１）。これらの２つのタンパク質の作用機構は、霊長類ウイルスの類似の機構に広く類似すると考えられている（Ｍａｒｔａｎｏ等、前出）。Ｓ２の機能は未知である。さらに、ＥＩＡＶタンパク質、Ｔｔｍは、膜貫通タンパク質の開始時にｅｎｖコード配列にスプライシングされたｔａｔの第１のエキソンによってコードされることが確認されている。
本出願人等のＷＯ９９／３２６４６において、本出願人等は、本発明に有利に適用できる特徴の詳細を提供している。特に、非霊長類レンチウイルスゲノムは、（１）好ましくは、ｇａｇにおける欠失がｇａｇコード配列の約ヌクレオチド３５０又は３５４の下流の１つ又は複数のヌクレオチドを除去する欠失ｇａｇ遺伝子を含み、（２）好ましくは、非霊長類レンチウイルスゲノムからの１つ又は複数の補助遺伝子の欠如を有し、（３）好ましくは、ｔａｔ遺伝子を欠くが、５’ＬＴＲ末端とｇａｇのＡＴＧとの間にリーダー配列を含み、且つ（４）（１）、（２）、及び（３）の組み合わせであることが理解される。特に好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは、（１）（２）（３）のすべての特徴を含む。
レンチウイルス、たとえば非霊長類ベクターを用いることもでき、ベクターは少なくとも以下の１つを含む。野生型レンチウイルスベクターのｇａｇパッケージングシグナルのＡＴＧモチーフがＡＴＴＧモチーフである；レンチウイルスベクターのＲ領域間の距離が野生型レンチウイルスベクターにおける距離と実質的に同じである；レンチウイルスベクターの３’Ｕ３領域がＭＬＶ Ｕ３領域の配列を含む；ウイルスＬＴＲに機能しうる形で連結されたヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列は、内部プロモーターの上流であり、前記ヌクレオチド配列は、好ましくはポリペプチド又はそのフラグメントをコードする。
本発明は、標的細胞に対象となるヌクレオチド（ＮＯＩ）を送達するために用いることができることが理解される。本発明の第１の態様の他の好ましい実施形態において、１つ又は複数の対象となるヌクレオチド（ＮＯＩ）は、クローニング部位でベクターに導入される。好ましくは、ＮＯＩは治療遺伝子であり、そのような治療遺伝子は、レトロウイルスＬＴＲに配置されたプロモーターから発現することができ、或いはクローニング部位に導入された内部プロモーターから発現することもできる。好ましい実施形態において、ＮＯＩは、内部調節エレメントの下流に導入される。
送達系
レトロウイルスベクター系は、特にＮＯＩを１つ又は複数の対象となる部位に移動するための送達系として提示されてきた。この移動は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はそれらの組み合わせにおいて生じ得る。レトロウイルスベクター系は、受容体の用法、逆転写、及びＲＮＡパッケージングを含むレトロウイルスのライフサイクルの様々な面を研究するために開発されてきた（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：１〜２４に概説されている）。
組換えレトロウイルスベクター粒子は、レシピエント細胞にＮＯＩを形質導入することができる。細胞内で、ベクター粒子のＲＮＡゲノムは、ＤＮＡに逆転写され、レシピエント細胞のＤＮＡに組み込まれる。
本明細書では、「ベクターゲノム」という用語は、レトロウイルスベクター粒子に存在するＲＮＡ構築物、及び組み込まれたＤＮＡ構築物の両方をいう。この用語はさらに、そのようなＲＮＡゲノムをコードすることのできる個別の、又は単離されたＤＮＡ構築物を包含する。レトロウイルス又はレンチウイルスゲノムは、レトロウイルス又はレンチウイルスから誘導可能な少なくとも１つの成分を含むべきである。「誘導可能」という用語は、必ずしもレンチウイルスなどのウイルスから得られる必要はないが、そこから誘導することができるヌクレオチド配列又はその一部を意味する通常の語義で用いられる。例として、配列は合成によって、又は組換えＤＮＡ技法を用いることによって調製できる。好ましくは、ゲノムは、ｐｓｉ領域（又はカプシド化を引き起こすことのできる類似成分）を含む。
ウイルスベクターゲノムは、好ましくは「複製欠陥」であり、この用語によって本出願人等は、このゲノムがレシピエント細胞内で感染性ウイルス粒子を生産するための独立複製を単独で可能にするのに充分な遺伝情報を含まないことを意味する。好ましい実施形態において、ゲノムは、機能性ｅｎｖ、ｇａｇ、又はｐｏｌ遺伝子を欠失している。非常に好ましい実施形態において、ゲノムは、ｅｎｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子を欠失している。
ウイルスベクターゲノムは、長末端反復（ＬＴＲ）の一部又はすべてを含むことができる。好ましくは、ゲノムは、ＬＴＲの少なくとも一部、又はプロウイルスの組み込み及び転写を媒介することのできる類似配列を含む。この配列はさらに、エンハンサー−プロモーター配列を含むか、又はエンハンサー−プロモーター配列として作用することができる。
本発明の第１の態様のウイルスベクターゲノムは、部品のキットとして提供することができる。たとえば、このキットは、（ｉ）ＮＯＩ及び内部調節エレメント配列を含有する１つ又は複数のプラスミド、並びに（ｉｉ）ウイルスゲノムにＮＯＩ及び調節エレメントをクローニングするための適切な制限酵素認識部位を有するレトロウイルスゲノム構築物を含むことができる。
同一の細胞内に同時導入された個別のＤＮＡ配列においてレトロウイルスベクター粒子を生産するために必要とされる成分の個別の発現によって、治療遺伝子を保持する欠損レトロウイルスゲノムを保持しているレトロウイルス粒子が生じることが知られている。この細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれる（下記参照）。
プロデューサー細胞を生産するための２つの一般的な手順がある。１つの手順において、レトロウイルスＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖタンパク質をコードする配列が細胞に導入され、細胞ゲノムに安定に組み込まれる。安定な細胞系が生産され、これはパッケージング細胞系と呼ばれる。パッケージング細胞系は、レトロウイルスＲＮＡのパッケージングに必要とされるタンパク質を生産するが、ｐｓｉ領域の欠損により、カプシド化をもたらすことはできない。しかしながら、本発明の第１の態様によるベクターゲノム（ｐｓｉ領域を有する）がパッケージング細胞系に導入されるとき、ヘルパータンパク質は、ｐｓｉ陽性組換えベクターＲＮＡをパッケージして、組換えウイルス株を生産することができる。これは、ＮＯＩをレシピエント細胞に形質導入するために用いることができる。ゲノムがウイルスタンパク質の作製に必要なすべての遺伝子を欠失している組換えウイルスは、１回のみ感染できるが、増殖できない。したがって、ＮＯＩは、有害である可能性のあるレトロウイルスを生産することなく、宿主細胞ゲノムに導入される。利用可能なパッケージング系の概要は、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」（１９９７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ編、ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ、４４９頁）に記載されている。
本発明はさらに、本発明の第１の態様のウイルスベクターゲノムを含むパッケージング細胞系を提供する。たとえば、パッケージング細胞系は、そのゲノムを含むウイルスベクター系を形質導入することができ、或いはそのＲＮＡゲノムをコードすることのできるＤＮＡ構築物を保持するプラスミドをトランスフェクトすることができる。本発明はさらに、そのような細胞によって生産されたレトロウイルス（又はレンチウイルス）ベクター粒子を提供する。
第２のアプローチは、レトロウイルスベクター粒子を生産するために必要な３つの異なるＤＮＡ配列、すなわちｅｎｖコード配列、ｇａｇ−ｐｏｌコード配列、及び１つ又は複数のＮＯＩを含む欠損レトロウイルスゲノムを一過性トランスフェクションによって同時に細胞に導入するもので、この手順は、一過性３重トランスフェクションと呼ばれる（Ｌａｎｄａｕ及びＬｉｔｔｍａｎ、１９９２、Ｐｅａｒ等、１９９３）。３重トランスフェクション法は、最適化されている（Ｓｏｎｅｏｋａ等、１９９５、Ｆｉｎｅｒ等、１９９４）。ＷＯ９４／２９４３８は、この多重ＤＮＡ一過性トランスフェクション法を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏでのプロデューサー細胞の生産を記載している。
ベクターゲノムを補うために必要とされるウイルス系の成分は、細胞にトランスフェクトするための１つ又は複数の「プロデューサープラスミド」に存在することができる。
本発明はさらに、
（ｉ）本発明の第１の態様によるウイルスゲノム、
（ｉｉ）レンチウイルスｇａｇ及びｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）ｉｉ）のヌクレオチド配列によってコードされていない他の必須ウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列
を含むベクター系を提供する。好ましい実施形態において、（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列は、ｅｎｖタンパク質をコードすることができる。本発明はさらに、そのようなベクター系でトランスフェクトされた細胞、及びそのような細胞によって生産されたレトロウイルスベクター粒子を提供する。好ましくは、ｇａｇ−ｐｏｌ配列は、特定のプロデューサー細胞で用いるためにコドン最適化されている（下記参照）。
ヌクレオチド配列ｉｉｉ）によってコードされるｅｎｖタンパク質は、同種レトロウイルス又はレンチウイルスｅｎｖタンパク質であることができる。或いは、異種ｅｎｖ、或いは非レトロウイルス又はレンチウイルス由来のｅｎｖであることもできる（下記の「シュードタイピング」を参照）。
「ウイルスベクター系」という用語は、一般に、宿主細胞においてウイルス粒子を生産するために、ウイルス粒子生産に必要な他の成分と組み合わせたときに用いることのできる部品のキットを意味するために用いられる。たとえば、レトロウイルスベクターゲノムは、ウイルス複製に必要な１つ又は複数の遺伝子を欠失している可能性がある。これは、たとえば１つ又は複数のプロデューサープラスミドの１つ又は複数のさらなる補足ヌクレオチド配列とキットにおいて組み合わせることができる。ゲノムのプロデューサープラスミドとの同時トランスフェクションによって、感染性ウイルス粒子の生産に必要な成分が提供される。
或いは、補足ヌクレオチド配列は、キットに含まれるパッケージング細胞系内に安定して存在することもできる。
本発明はさらに、ＲＮＡゲノムをレシピエント細胞に送達することのできるレトロウイルスベクター系に関し、このゲノムは、レトロウイルスの野生型ゲノムより長い。たとえば、このベクター系は、ＥＩＡＶベクター系であることができる。
好ましくは、ベクター系のＲＮＡゲノムは、野生型ゲノムより、５％まで、より好ましくは１０％まで多くの塩基を有する。好ましくは、ＲＮＡゲノムは、野生型ゲノムより約１０％長い。たとえば、野生型ＥＩＡＶは、約８ｋｂのＲＮＡゲノムを含む。本発明のＥＩＡＶベクター系は、８．８ｋｂまで（好ましくは約８．８ｋｂ）のＲＮＡゲノムを有する。
好ましくは、本発明のレトロウイルスベクター系は、自己不活性化（ＳＩＮ）ベクター系である。
例として、自己不活性化レトロウイルスベクター系は、３’ＬＴＲのＵ３領域において転写エンハンサー、又はエンハンサー及びプロモーターの削除することによって構築されてきた。一連のベクター逆転写及び組み込み後、これらの変化は、５’及び３’ＬＴＲの両方にコピーされ、転写不活性なプロウイルスが生産される。しかしながら、そのようなベクターのＬＴＲ内部の任意のプロモーターは依然として転写活性である。この戦略は、内部に位置する遺伝子の転写に対する、ウイルスＬＴＲのエンハンサー及びプロモーターの影響を排除するために用いられてきた。そのような影響には、転写の増大又は転写の抑制が含まれる。この戦略は、ゲノムＤＮＡへの３’ＬＴＲからの下流転写を排除するために用いることもできる。これは、内因性癌遺伝子の外因性活性化の防止が重要であるヒトの遺伝子治療において特に重要である。
好ましくは、本発明のプロデューサー細胞からの高力価調節性レンチウイルスベクターの生産を促進するリコンビナーゼ補助機構が用いられる。
本明細書では、「リコンビナーゼ補助系」という用語には、これに限定されるものではないが、Ｃｒｅリコンビナーゼ／バクテリオファージＰ１のｌｏｘＰ認識部位、又は３４ｂｐのＦＬＰ認識標的（ＦＲＴ）間の組換え事象を触媒するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの部位特異ＦＬＰリコンビナーゼを用いる系が含まれる。
３４ｂｐのＦＬＰ認識標的（ＦＲＴ）間の組換え事象を触媒するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの部位特異ＦＬＰリコンビナーゼは、リコンビナーゼ補助組換え事象を用いて、高レベルのプロデューサー細胞系を生産するために、ＤＮＡ構築物に構成されている（Ｋａｒｒｅｍａｎ等（１９９６）ＮＡＲ ２４：１６１６〜１６２４）。類似の系が、Ｃｒｅリコンビナーゼ／バクテリオファージＰ１のｌｏｘＰ認識部位を用いて開発されている（Ｖａｎｉｎ等（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７１：７８２０〜７８２６）。これは、高力価のレンチウイルスプロデューサー細胞系が生産されるように、レンチウイルスゲノムに構成された。
プロデューサー／パッケージング細胞系を用いることによって、たとえば対象となる部位（成体脳組織など）のその後の形質導入のための多量のレトロウイルスベクター粒子を増殖し、単離する（たとえば適切な力価のレトロウイルスベクター粒子を調製する）ことが可能になる。プロデューサー細胞系は、通常、大規模な生産、又はベクター粒子に有利である。
一過性トランスフェクションは、パッケージング細胞法に比べて多くの利点を有する。この点で、一過性トランスフェクションは、安定なベクター生産細胞系を生じるために必要とされる時間の長さを回避し、ベクターゲノム又はレトロウイルスパッケージング成分が細胞に毒性である場合に用いられる。ベクターゲノムが、細胞周期の阻害因子又はアポトーシスを誘導する遺伝子などの、毒性遺伝子又は宿主細胞の複製を妨げる遺伝子をコードする場合、安定なベクター生産細胞系を生じるのは困難である可能性があるが、一過性トランスフェクションを用いて、細胞死の前にベクターを生産することができる。さらに、一過性感染を用いて、安定なベクター生産細胞系から得られるレベルに相当するベクター力価レベルを生じる細胞系が開発されている（Ｐｅａｒ等、１９９３、ＰＮＡＳ ９０：８３９２〜８３９６）。
プロデューサー細胞／パッケージング細胞系は、任意の適切な細胞型であり得る。プロデューサー細胞は、一般に哺乳動物細胞であるが、たとえば昆虫細胞であり得る。
本明細書では、「プロデューサー細胞」又は「ベクター生産細胞」という用語は、レトロウイルスベクター粒子の生産に必要なすべてのエレメントを含む細胞をいう。
好ましくは、プロデューサー細胞は、安定なプロデューサー細胞系から得ることができる。
好ましくは、プロデューサー細胞は、安定な誘導プロデューサー細胞系から得ることができる。
好ましくは、プロデューサー細胞は、誘導プロデューサー細胞系から得ることができる。
本明細書では、「誘導プロデューサー細胞系」という用語は、マーカー遺伝子の高発現に関してスクリーニングされ、選択された形質導入プロデューサー細胞系である。そのような細胞系は、レトロウイルスゲノムからの高レベルの発現を維持する。「誘導プロデューサー細胞系」という用語は、「安定な誘導プロデューサー細胞系」及び「安定なプロデューサー細胞系」という用語と同義的に用いられる。
好ましくは、誘導プロデューサー細胞系には、これに限定されるものではないが、レトロウイルス及び／又はレンチウイルスプロデューサー細胞が含まれる。
好ましくは、誘導プロデューサー細胞系は、ＨＩＶ又はＥＩＡＶプロデューサー細胞系であり、より好ましくは、ＥＩＡＶプロデューサー細胞系である。
好ましくは、エンベロープタンパク質配列、及びヌクレオカプシド配列は、すべてプロデューサー及び／又はパッケージング細胞に安定に組み込まれる。しかしながら、１つ又は複数のこれらの配列は、エピソーム形態で存在することもでき、遺伝子発現は、エピソームから生じることができる。
本明細書では、「パッケージング細胞」という用語は、ＲＮＡゲノムにおいて欠失している感染性組換えウイルスの生産に必要なエレメントを含有する細胞をいう。典型的には、そのようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質（コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖなど）を発現できる１つ又は複数のプロデューサープラスミドを含むが、パッケージングシグナルは含まない。
同義的に「パッケージング配列」又は「ｐｓｉ」をいう「パッケージングシグナル」という用語は、ウイルス粒子形成時に、レトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド化に必要とされる非コード、シス作用性配列に関して用いられる。ＨＩＶ−１において、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンにわたる座にマッピングされている。
上述のベクター構築物と共に用いるのに適したパッケージング細胞系は、容易に調製することができ（ＷＯ９２／０５２６６も参照）、レトロウイルスベクター粒子を生産するためのプロデューサー細胞系の作製に利用される。すでに述べたように、利用可能なパッケージング系の概要は、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」（上記）に記載されている。
これも上で述べたとおり、パッケージングシグナルが削除されているプロウイルスを含む単純なパッケージング細胞系は、組換えによって、所望でない複製可能ウイルスの迅速な生産をもたらすことが判っている。安全性を改善するために、プロウイルスの３’ＬＴＲが削除された第２世代細胞系が生産された。そのような細胞において、野生型ウイルスを生産するために２つの組換えが必要となる。さらなる改善には、個々の構築物におけるｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子の導入、いわゆる第３世代パッケージング細胞系が含まれる。これらの構築物は、トランスフェクション中の組換えを防ぐために順次導入される。
好ましくは、パッケージング細胞系は、第２世代パッケージング細胞系である。
好ましくは、パッケージング細胞系は、第３世代パッケージング細胞系である。
これらのスプリット構築物、第３世代細胞系において、コドンを変更することによって、さらなる組換えの削減を達成することができる。遺伝子コードの重複性に基づくこの技法は、個々の構築物間、たとえばｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖオープンリーディングフレームの重複領域間の相同性を低減することを目的としている。
パッケージング細胞系は、高力価ベクター粒子を生産するためのカプシド化及び膜タンパク質の提供に必要な遺伝子産物を提供するのに有用である。パッケージング細胞は、組織培養細胞系など、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞培養することができる。適切な細胞系には、これに限定されるものではないが、マウス線維芽細胞由来細胞系又はヒト細胞系などの哺乳動物細胞が含まれる。好ましくは、パッケージング細胞系は、ヒト細胞系であり、たとえばＨＥＫ２９３、２９３−Ｔ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０などである。
或いは、パッケージング細胞は、単球、マクロファージ、血球、又は線維芽細胞などの、治療される個体に由来する細胞であることができる。この細胞を個体から単離し、ｅｘ ｖｉｖｏでパッケージング及びベクター成分を投与し、その後、自己由来パッケージング細胞を再投与することができる。
より詳細には、パッケージング細胞は、治療される個体の体内のｉｎ ｖｉｖｏパッケージング細胞であることができ、或いは組織培養細胞系などのｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された細胞であることもできる。適切な細胞系には、マウス線維芽細胞由来細胞系又はヒト細胞系などの哺乳動物細胞が含まれる。好ましくは、パッケージング細胞系は、ヒト細胞系であり、たとえば２９３細胞系、ＨＥＫ２９３、２９３−Ｔ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０などである。
或いは、パッケージング細胞は、単球、マクロファージ、幹細胞、血球、又は線維芽細胞などの、治療される個体に由来する細胞であることができる。この細胞を個体から単離し、ｅｘ ｖｉｖｏでパッケージング及びベクター成分を投与し、その後、自己由来パッケージング細胞を再投与することができる。或いは、パッケージング及びベクター成分を、ｉｎ ｖｉｖｏでパッケージング細胞に投与することができる。レンチウイルスパッケージング及びベクター成分を個体の細胞に導入する方法は、当分野において知られている。たとえば、１つのアプローチは、レンチウイルスベクター粒子を生産するために必要な種々のＤＮＡ配列、たとえばｅｎｖコード配列、ｇａｇ−ｐｏｌコード配列、及び欠損レンチウイルスゲノムを一過性３重トランスフェクションによって同時に細胞に導入するものである（Ｌａｎｄａｕ及びＬｉｔｔｍａｎ、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６、５１１０、Ｓｏｎｅｏｋａ等、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：６２８〜６３３）。
一実施形態において、本発明のベクター構造は、その生産システムとして、ゲノム、ｇａｇ−ｐｏｌ成分、及びエンベロープを発現する３つの転写ユニットを用いる。エンベロープ発現カセットは、ＶＳＶ−Ｇなどのいくつかのエンベロープ、又は４０７０Ａなどの種々のマウスレトロウイルスエンベロープの１つを含むことができる。
通常どおり、これらの３つのカセットは、２９３Ｔなどの適切な細胞系に一過性にトランスフェクトされた３つのプラスミド、又は安定なプロデューサー細胞系に組み込まれたコピーから発現させる。別のアプローチは、３つのカセットの発現系として別のウイルス、たとえばバキュロウイルス又はアデノウイルスを用いるものである。これらは共に核発現系である。今日まで、レンチウイルスベクター系のすべての成分を発現させるためのポックスウイルスの使用は記載されていない。特に、レンチウイルスの異例なコドン使用、及びｒｅｖ／ＲＲＥ系などのＲＮＡ操作系の要件を仮定すれば、３つすべてのカセットの組み込み、及び核ではなく細胞質に発現するその後のベクターでの発現が実行可能であるかどうかは明らかになっていない。今日まで、鍵となる核因子、及び核ＲＮＡ操作経路が、ベクター成分の発現、及び遺伝子送達媒体での機能に必要である可能性が残されていた。ここに、本出願人等は、そのような系を記載し、レンチウイルス成分を細胞質で作製することができ、それらの成分が機能性遺伝子送達系にアセンブルすることを示す。この系の利点は、ポックスウイルスを容易に操作できること、高い発現レベル、及びベクターゲノムにイントロンを保持する能力である。
本発明によるレンチウイルスベクター粒子はさらに、緩慢に分裂し、ＭＬＶなどの非レンチウイルスが効率的に形質導入することができない細胞を形質導入することができる。ある種の腫瘍細胞を含む、緩慢分裂細胞は、約３から４日ごとに１回分裂する。腫瘍は迅速に分裂する細胞を含むが、一部の腫瘍細胞、特に腫瘍の中心にある細胞の分裂頻度は低い。或いは、標的細胞は、腫瘤の中心部分にある細胞、又は造血幹細胞などの幹細胞、又はＣＤ３４陽性細胞などの細胞分裂を受けることのできる成長停止細胞であることができる。さらなる代案として、標的細胞は、単球前駆体、ＣＤ３３陽性細胞、又は骨髄前駆体などの分化細胞の前駆体であることができる。さらなる代案として、標的細胞は、ニューロン、星状細胞、グリア細胞、ミクログリア細胞、マクロファージ、単球、上皮細胞、内皮細胞、又は肝細胞などの分化細胞であることができる。標的細胞は、ヒト個体からの単離後にｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入することができ、又はｉｎ ｖｉｖｏで直接形質導入することもできる。
実験及び実用的適用例の両方において、高力価ウイルス調製物の使用が非常に望ましい。ウイルス力価を高める技法には、上述のｐｓｉとパッケージングシグナルの使用、及びウイルスストックの濃化が含まれる。
本発明書では、「高力価」という用語は、細胞などの標的部位を形質導入することのできるレトロウイルスベクター又は粒子の有効量を意味する。
本明細書では、「有効量」という用語は、標的部位においてＮＯＩの発現を誘導するのに充分な調節性レトロウイルス又はレンチウイルスベクター又はベクター粒子の量を意味する。
プロデューサー／パッケージング細胞の高力価ウイルス調製物は、通常、１ｍｌ当たり１０５から１０７程度のレトロウイルス粒子である。脳などの組織での形質導入の場合、非常に少量を用いる必要があり、そのためウイルス調製物は、超遠心分離法によって濃化される。結果として生じた調製物は、少なくとも１０８ｔ．ｕ．／ｍｌ、好ましくは１０８から１０９ｔ．ｕ．／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０９ｔ．ｕ．／ｍｌを有するべきである（力価は、標準Ｄ１７細胞系の力価として、１ｍｌ当たりの形質導入単位（ｔ．ｕ．／ｍｌ）で表される）。
ＮＯＩは、１つ又は複数のプロモーター／エンハンサーエレメントに機能しうる形で連結していることができる。１つ又は複数のＮＯＩの転写は、ウイルスＬＴＲの制御下にあることができ、或いは、プロモーター／エンハンサーエレメントは、導入遺伝子を用いて組み入れることもできる。好ましくは、プロモーターは、ＣＭＶなどの強力なプロモーターである。プロモーターは、調節性プロモーターであることができる。プロモーターは、組織特異的であることができる。
中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と称される配列の存在は、非分裂細胞への効率的な遺伝子送達を改善する可能性がある。このシス作用性エレメントは、たとえばＥＩＡＶポリメラーゼコード領域エレメントに位置している。好ましくは、本発明のゲノムは、ｃＰＰＴ配列を含む。
好ましくは、ウイルスゲノムは、翻訳後調節エレメントを含む。たとえば、ゲノムは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）などのエレメントを含むことができる。
さらに、又は代わりに、ウイルスゲノムは、翻訳エンハンサーを含むことができる。
シュードタイピング
レトロウイルスベクター系の設計において、拡大又は改変された範囲の細胞型に遺伝物質を送達できるように、天然ウイルスに対する種々の標的細胞特異性を有する粒子を作製することが望ましい。これを達成する一方法は、その特異性を改変するためにウイルスエンベロープタンパク質を作製することによるものである。他のアプローチは、ウイルスの天然エンベロープタンパク質を置換又はそれに追加するために、異種エンベロープタンパク質をベクター粒子に導入するものである。
シュードタイピングという用語は、たとえば他のウイルスのｅｎｖ遺伝子などの異種ｅｎｖ遺伝子で、ウイルスゲノムのｅｎｖ遺伝子の少なくとも一部を組み込む、又は一部を置換する、又はすべてを置換することを意味する。シュードタイピングは、新しい現象ではなく、ＷＯ９９／６１６３９、ＷＯ−Ａ−９８／０５７５９、ＷＯ−Ａ−９８／０５７５４、ＷＯ−Ａ−９７／１７４５７、ＷＯ−Ａ−９６／０９４００、ＷＯ−Ａ−９１／０００４７、及びＭｅｂａｔｓｉｏｎ等、１９９７、Ｃｅｌｌ ９０、８４１〜８４７に例を見出すことができる。
本発明の好ましい実施形態において、ベクター系は、狂犬病Ｇタンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子でシュードタイプされている。本発明の他の好ましい実施形態において、ベクター系は、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子でシュードタイプされている。
より詳細には、「レンチウイルス粒子」という用語は、好ましくは標的細胞に結合し、侵入することのできる、パッケージされたレトロウイルスベクターをいう。ベクターに関してすでに論じたように、粒子の成分は、野生型レトロウイルスに関して修飾することができる。たとえば、標的化特異性を改変するため、或いはいくつかの他の所望の機能を得るために、粒子のタンパク質被覆のＥｎｖタンパク質を遺伝子的に修飾することができる。
好ましくは、ウイルスベクターは、ある１つ又は複数の細胞型を主に形質導入する。
より好ましくは、ウイルスベクターは標的化ベクターであり、すなわちこのベクターが特定の細胞に標的化されるように、天然ウイルスと比較して改変された組織親和性を有する。レンチウイルスベクターの場合、これはＥｎｖタンパク質の修飾によって達成することができる。レトロウイルス２次ベクターのＥｎｖタンパク質は、非毒性エンベロープ、又は１次標的細胞内で非毒性量で生産され得るエンベロープ、たとえばＭＭＬＶ両栄養性エンベロープ、又は修飾両栄養性エンベロープなどである必要がある。そのような場合の安全性の特徴は、好ましくは、レンチウイルス成分間の領域又は配列相同性の欠失である。
好ましくは、エンベロープは、ヒト細胞の形質導入を可能にするものである。適切なｅｎｖ遺伝子の例には、これに限定されるものではないが、ＶＳＶ−Ｇ、ＭＬＶ両栄養性ｅｎｖ、たとえば４０７０Ａ ｅｎｖなど、ＲＤ１１４ネコ白血病ウイルスｅｎｖ、又はインフルエンザウイルス由来の血球凝集素（ＨＡ）が含まれる。Ｅｎｖタンパク質は、限られた数のヒト細胞型の受容体に結合できるものであってよく、標的化部分を含有する操作されたエンベロープであり得る。ｅｎｖ及びｇａｇ−ｐｏｌコード配列は、プロモーター、及び任意選択で選択されたパッケージング細胞系において活性なエンハンサーから転写され、その転写単位は、ポリアデニル化シグナルによって終止する。たとえば、パッケージング細胞がヒト細胞である場合、適切なプロモーター−エンハンサー組み合わせは、ヒトサイトメガロウイルス主要前初期（ｈＣＭＶ−ＭＩＥ）遺伝子由来のものであり、ＳＶ４０ウイルスのポリアデニル化シグナルを用いることができる。他の適切なプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、当分野で知られている。
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
第１の核酸配列は、たとえば第１の核酸配列が存在しない状態と比較して、Ｒｅｖの不在下、パッケージングに利用可能であるゲノムＲＮＡのレベルを増大することのできる配列である。好ましくは、第１の核酸配列は、Ｒｅｖの不在下、パッケージングに利用可能なゲノムＲＮＡのレベルを増大するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又はそのフラグメントである。ＯＲＦによって、本出願人等は、終止コドンに通じる５’開始コドン（コザック配列であることができる）を含む一連のコドントリプレットを含むものとし、推定又は既知遺伝子を表す。しかしながら、パッケージングのためのゲノムＲＮＡのレベルを増大する任意の核酸配列を用いることができる。
したがって、本発明は、好ましくはウイルスＬＴＲに機能可能に結合し、下流であり、且つ内部プロモーター又はＩＲＥＳなどの調節エレメントの上流であるＯＲＦ又は部分的ＯＲＦを有するマルチシストロン性ベクターゲノムに関する。
ベクターゲノムが、コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の使用など、Ｒｅｖの不在下、パッケージング成分と共に用いられるとき、プロデューサー細胞又は標的細胞において、アクセサリーウイルス遺伝子を持たない完全な最小ベクターを生産することができる。
いかなる理論にも縛られることを望まないが、本出願人等は、本発明の系において、第１の核酸配列の転写は、「真の」ｍＲＮＡであるとして細胞に認識され、したがって核からの輸出に値すると考える。そのような配列の不在下、ｍＲＮＡは、細胞質に輸送され、続いてパッケージされる前に、たとえば「ナンセンス媒介分解」によって、核において分解していると考えられる。アクセサリータンパク質Ｒｅｖは、この監視システムの回避を可能にすると考えられ、したがって他の状態ではベクターゲノムが分解されるウイルス力価を維持する。本発明は、ウイルス力価を維持する代替のより安全な方法を提供する。
ＯＲＦの一部が逆転されたゲノムは、親ゲノムと誘導ゲノムの異なるＲｅｖ依存性をもたらしたことに留意されたい。いかなる理論にも縛られることを望まないが、本出願人等は、これは、誘導（Ｒｅｖ依存性）ゲノムでは破壊された、親（Ｒｅｖ非依存性）ゲノムにおけるＯＲＦの存在によるものであると考える。したがって、ＯＲＦは、逆方向ではなく、正しい方向であるべきである。
効果的には、ＯＲＦは、約０．６から４ｋｂの間、たとえば約０．６５又は０．７から３．１又は３．０ｋｂの間であることができる。
一実施形態において、第１の核酸配列は、ウイルスＬＴＲに機能しうる形で連結しているが、他の調節エレメントにも同様に充分に機能しうる形で連結していることができる。
好ましくは、第１の核酸配列は、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子であることができる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質及び他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンに対する抵抗性を付与する、栄養素要求性欠損を補足する、又は複合培地から利用可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。適切な第１の核酸配列に関するさらなる詳細は、下記のレポーター遺伝子の項に記載する。
さらに第１の核酸配列は、対象となるヌクレオチド（ＮＯＩ）であることが可能であり、ＮＯＩに関するさらなる詳細は以下に記載するが、一般に、良好なレベルの発現を得るために、ＮＯＩは、プロモーター又はＩＲＥＳなどの内部調節エレメントに機能しうる形で連結していることが好ましい。しかしながら、低いレベルの発現が所望である場合、たとえばＮＯＩが細胞毒性である場合、ＮＯＩはＬＴＲに機能可能に結合していてもよい。この実施形態において、マーカー遺伝子などの核酸配列は、内部調節エレメントの下流に配置されることができる。
テトラサイクリン調節性発現系
他の好ましい実施形態において、第１の核酸配列は、任意選択で核局在化シグナル（ＮＬＳ）に連結したＴｅｔ抑制因子遺伝子である。いかなる理論にも縛られることを望まないが、本出願人等は、ＴｅｔＲのアミノ末端はテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）の結合に重要であるので、カルボキシ末端へのＮＬＳの付加は、核におけるＴｅｔＲの濃度を増大すると考える。したがって、この実施形態において、下流ＮＯＩの少なくとも１つは、ｔｅｔＯとなる。好ましい一実施形態において、Ｔｅｔ抑制因子遺伝子の少なくとも２次コピーは、ＩＲＥＳ又は内部プロモーターの下流に存在する。
他の好ましい実施形態において、Ｔｅｔ抑制因子遺伝子は、哺乳動物系における発現に関してコドン最適化されている。コドン最適化のさらなる詳細は以下に記載する。
したがって本発明は、コドン最適化によって得られた、哺乳動物細胞におけるテトラサイクリン調節性発現に関して改善されたＴｅｔＲ遺伝子配列に関する。調節テトラサイクリン性発現系は、誘導遺伝子発現が有利であるか、又は必須である多くの適用例において、広範な有用性を有する。コドン最適化エフェクタータンパク質に起因する可能性のある遺伝子発現の改善は、より迅速なＴｅｔＲ媒介発現を促進することによって、系の効率を著しく高める可能性がある。
本発明はさらに、最初のＡＵＧが発現に関してより好都合なコンテクストにあり、それによって真核細胞リボソームによる開始の忠実性が向上するように、ＴｅｔＲ遺伝子の５’配列を改変することに関する。一実施形態において、５’配列は、５’ｇｃｃＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ３’である（Ｇは＋４位であり、セリンのコドンを変更するか、追加のアミノ酸残基の挿入を必要とする）。
本発明はさらに、核におけるＴｅｔＲの局所濃度を増大するＮＬＳの取り込みに関する。
コドン最適化
コドン最適化は、以前にＷＯ９９／４１３９７に記載されている。種々の細胞は、特定のコドンの使用法が異なる。このコドンの偏りは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的な存在量に相当する。対応するｔＲＮＡの相対的な存在量に適合するように、配列中のコドンを変更することによって、発現を増大することができる。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において希少であることが知られているコドンを計画的に選択することによって、発現を低減することができる。したがって、さらなる翻訳の制御を得ることができる。
ＨＩＶ及び他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは、多数の希少コドンを用いており、それらを一般に用いられる哺乳動物コドンに対応するように変更することにより、哺乳動物プロデューサー細胞においてパッケージング成分の発現の増大を達成することができる。コドン使用表は、哺乳動物細胞、並びに他の種々の生物に関して、当分野において知られている。
コドン最適化は、他のいくつかの利点を有する。配列の改変により、プロデューサー細胞／パッケージング細胞においてウイルス粒子のアセンブリに必要とされるウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列から、ＲＮＡ不安定配列（ＩＮＳ）が排除される。同時に、パッケージング成分のアミノ酸コード配列は維持されるので、その配列によってコードされるウイルス成分は同一であるか、少なくともパッケージ成分の機能が損なわれないほど充分に類似しているように保持される。コドン最適化はさらに、輸出のためのＲｅｖ／ＲＲＥ要求を克服し、最適化配列にＲｅｖ非依存性を付与する。コドン最適化はさらに、ベクター系内の異なる構築物間（たとえばｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖオープンリーディングフレームの重複領域間）の相同組換えを低減する。したがって、コドン最適化の総体的効果は、ウイルス力価の顕著な増加、及び安全性の改善である。
一実施形態において、ＩＮＳに関連するコドンのみが最適化される。しかしながら、はるかに好ましく、実用的な実施形態において、フレームシフト部位を包含する配列を除いて、配列はその全体がコドン最適化される。
ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子は、それぞれｇａｇ及びｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複リーディングフレームを含む。両方のタンパク質の発現は、翻訳中のフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳中のリボソームの「ずれ」の結果として起こる。このずれは、少なくとも一部は、リボソーム停止ＲＮＡ２次構造に起因すると考えられている。そのような２次構造は、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、重複領域は、ｇａｇ先頭の下流のヌクレオチド１２２２（ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）からｇａｇの末端（ヌクレオチド１５０３）まで延びている。その結果として、フレームシフト部位、及び２つのリーディングフレームの重複部位にわたる２８１ｂｐのフラグメントは、好ましくは、コドン最適化されていない。このフラグメントを保持することによって、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現が可能となる。
ＥＩＡＶの場合、重複の先頭は、ヌクレオチド１２６２であると考えられている（ヌクレオチド１は、ｇａｇ ＡＴＧのＡである）。重複の末端は、１４９１ｂｐにある。フレームシフト部位及びｇａｇ−ｐｏｌ重複の保存を確実にするために、野生型配列はヌクレオチド１１５６から１４６５まで保持された。
たとえば、好都合な制限部位を適合させるために、最適コドンの使用を派生させることができ、保存アミノ酸変更を、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質に導入することができる。
非常に好ましい実施形態において、コドン最適化は、容易に発現する哺乳動物遺伝子をベースにした。第３の塩基、場合によって第２及び第３の塩基を変更できる。
遺伝コードの縮重という性質により、技術者によって多数のｇａｇ−ｐｏｌ配列が得られることが理解される。さらに、コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列生産の開始点として利用できる、多くのレトロウイルス変異株が記載されている。レンチウイルスゲノムは、非常に可変性であり得る。たとえば、依然として機能性である、ＨＩＶ−１の多くの準種が存在する。ＥＩＡＶの場合も同様である。これらの変異株は、形質導入法の特定の部分を改善するために用いることができる。ＨＩＶ−１変異株の例は、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ．に見出すことができる。ＥＩＡＶクローンの詳細は、ＮＣＢＩデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．に見出すことができる。
コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ及びＴｅｔＲ配列の戦略は、任意のレトロウイルスに関して用いることができる。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１、及びＨＩＶ−２を含むすべてのレンチウイルスに適用される。さらにこの方法は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶ、並びにヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶ、及び他のレトロウイルスの遺伝子の発現を増大させるために用いることもできる。
コドン最適化は、ｇａｇ−ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存性にすることができる。しかしながら、レトロウイルスベクターでの抗ｒｅｖ又はＲＲＥ因子の使用を可能にするためには、ウイルスベクター生産システムを完全にＲｅｖ／ＲＲＥ非依存性にすることが必要であろう。したがって、このゲノムはさらに修飾される必要がある。これは、本発明に従ってベクターゲノム成分を最適化することによって達成される。有利には、これらの修飾はさらに、プロデューサー細胞及び形質導入細胞の両方で、あらゆる追加タンパク質の存在しない、より安全な系の生産をもたらす。
上述のとおり、レトロウイルスベクターのパッケージング成分には、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子の発現産物が含まれる。さらに、効率的なパッケージングは、４つのステムループの短い配列、それに続くｇａｇ及びｅｎｖの部分配列（「パッケージングシグナル」）に依存する。したがって、レトロウイルスベクターゲノムに欠失ｇａｇ配列を含むことにより（パッケージング構築物の完全ｇａｇ配列に加えて）、ベクター力価は最適化される。今日まで、効率的なパッケージングには、ｅｎｖ配列を依然として保持するベクターにおいてｇａｇの２５５から３６０ヌクレオチド、又はスプライスドナー突然変異の特定の組み合わせ、ｇａｇ及びｅｎｖ欠失においてｇａｇの約４０ヌクレオチドが必要であることが報告されている。驚いたことに、ｇａｇのＮ末端の約３６０ヌクレオチド以外のすべてを欠失させることにより、ベクター力価が増大することが見出された。したがって、好ましくは、レトロウイルスベクターゲノムは、１つ又は複数の欠失を含むｇａｇ配列を含み、より好ましくは、ｇａｇ配列は、Ｎ末端から誘導可能な約３６０ヌクレオチドを含む。
ＴｅｔＲ配列は、図２１に示したコドンを用いて、有効にコドン最適化することができる。
ＮＯＩ
本発明において、ＮＯＩ（対象となるヌクレオチド配列）という用語は、任意の適切なヌクレオチド配列を含み、必ずしも完全に天然のＤＮＡ又はＲＮＡ配列である必要はない。したがって、ＮＯＩは、たとえば合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、組換えＲＮＡ／ＤＮＡ配列（すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて調製された配列）、ｃＤＮＡ配列又は部分ゲノムＤＮＡ配列であることができ、それらの組み合わせを含む。この配列は、コード領域である必要はない。配列がコード領域である場合、全コード領域である必要はない。さらに、ＲＮＡ／ＤＮＡ配列は、センス配向性又はアンチセンス配向性であり得る。好ましくは、センス配向性である。好ましくは、この配列は、ｃＤＮＡを含むか、又はｃＤＮＡから転写される。
「異種配列」、「異種遺伝子」、又は「導入遺伝子」とも呼ばれるＮＯＩは、たとえば任意の１つ又は複数の選択遺伝子、マーカー遺伝子、及び治療遺伝子であることができる。
ＮＯＩは、疾患過程において重要である可能性のある候補遺伝子とすることもできる。したがって、本発明のベクター系は、たとえば標的確認のために用いることができる。
ＮＯＩは、治療又は診断の適用を有することができる。適切なＮＯＩには、これに限定されるものではないが、酵素、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作免疫グロブリン様分子、１本鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、アンチセンスＲＮＡ、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ変異体、毒素、条件毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質及び増殖因子、膜タンパク質、血管作用性タンパク質及びペプチド、抗ウイルスタンパク質及びリボザイム、並びにそれらの誘導体（関連レポーター群など）をコードする配列が含まれる。ＮＯＩは、プロドラッグ活性化酵素をコードすることもできる。
ＮＯＩコード配列は、コード配列の断片をコードすることができる。
本発明のレンチウイルスベクターは、癌を治療するために、腫瘍部位にプロドラッグ活性化酵素などのＮＯＩを送達するために用いることができる。いずれの場合も、適切なプロドラッグ活性化酵素との組み合わせで、個体（患者など）の治療に適切なプロドラッグが用いられる。適切なプロドラッグが、ベクターと共に投与される。プロドラッグの例には、リン酸エトポシド（アルカリホスファターゼと共に。Ｓｅｎｔｅｒ等、１９８８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８５：４８４２〜４８４６）、５−フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼと共に。Ｍｕｌｌｅｎ等、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４：１５０３〜１５０６）、ドキソルビシン−Ｎ−ｐ−ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン−Ｖ−アミダーゼと共に。Ｋｅｒｒ等、１９９０、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３１：２０２〜２０６）、パラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノベンゾイルグルタメート（カルボキシペプチダーゼＧ２と共に）、セファロスポリンナイトロジェンマスタードカルバメート（β−ラクタマーゼと共に）、ＳＲ−４２３３（Ｐ４５０レダクターゼと共に）、ガンシクロビル（ＨＳＶチミジンキナーゼと共に。Ｂｏｒｒｅｌｌｉ等、１９８８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８５：７５７２〜７５７６）、マスタードプロドラッグ、ニトロレダクターゼと共に（Ｆｒｉｅｄｌｏｓ等、１９９７、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４０：１２７０〜１２７５）、及びシクロホスファミド（Ｐ４５０と共に。Ｃｈｅｎ等、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：１３３１〜１３４０）が含まれる。
好ましくは、ＮＯＩは、神経変性疾患の治療に有用である。
より好ましくは、ＮＯＩは、パーキンソン病の治療に有用である。
ＮＯＩは、ドーパミン合成に関与する酵素をコードすることができる。たとえば、酵素は、以下のチロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドラーゼＩ及び／又は芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼの１つであることができる。３種すべての遺伝子の配列が利用可能である。アクセッション番号はそれぞれＸ０５２９０、Ｕ１９５２３、及びＭ７６１８０。
或いは、ＮＯＩは、小胞モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２）をコードすることができる。好ましい実施形態において、ウイルスゲノムは、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするＮＯＩ、及びＶＭＡＴ２をコードするＮＯＩを含む。そのようなゲノムは、パーキンソン病の治療に、特にＬ−ドーパの末梢投与と共に用いることができる。
或いは、ＮＯＩは、黒質線状体系の変性を遮断又は阻害できる因子をコードすることができる。そのような因子の例は、神経栄養因子である。たとえば、ＮＯＩは、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、又は脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードすることができる。
或いは、ＮＯＩは、神経保護因子をコードすることができる。特に、ＮＯＩは、ＴＨ陽性ニューロンの死滅を防ぐ分子、又は損傷黒質線状体系において再生及び機能回復を促進する分子をコードすることができる。
ＮＯＩは、対象となるタンパク質（「ＰＯＩ」）、或いはその突然変異体、相同体、又は変異体のすべて又は一部をコードすることができる。たとえば、ＮＯＩは、ｉｎ ｖｉｖｏで野生型タンパク質と類似の方式で機能できるＰＯＩのフラグメントをコードすることができる。
非常に好ましい実施形態において、ＮＯＩの１つは、調節領域を欠失しているＴＨ遺伝子の短縮形態を含む。そのようなＮＯＩは、全長酵素の発現を制限する可能性のあるドーパミンによるフィードバック抑制を回避する。
「突然変異体」という用語には、野生型配列の１つ又は複数のアミノ酸変異を含むＰＯＩが含まれる。たとえば、突然変異体は、１つ又は複数のアミノ酸付加、削除、又は置換を含むことができる。突然変異体は、天然に生じるか、又は人工的に作製することもできる（たとえば、部位特異的突然変異誘発による）。
ＩＲＥＳ
本発明の第１の態様のウイルスゲノムは、１つ又は複数のＮＯＩを含む。複数のＮＯＩが発現されるために、それぞれのＮＯＩに対して１つ、ベクターゲノム内に２つ以上の転写単位が存在できる。しかしながら、レトロウイルスベクターが遺伝子的に単純なままである場合、レトロウイルスベクターは最高の力価、及び非常に強力な遺伝子発現特性を獲得し（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０１２３０、Ｂｏｗｔｅｌｌ等、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、２４６４、Ｃｏｒｒｅｌｌ等、１９９４、Ｂｌｏｏｄ ８４、１８１２、Ｅｍｅｒｍａｎ及びＴｅｍｉｎ、１９８４、Ｃｅｌｌ ３９、４５９、Ｇｈａｔｔａｓ等、１９９１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１、５８４８、Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓ等、１９８９、ＰＮＡＳ ８６、３５１９、Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ等、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６６、８４１６、Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ等、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３、１７７９８、Ｌｉ等、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３、３８１、ＭｃＬａｃｈｌｉｎ等、１９９３、Ｖｉｒｏｌ．１９５、１、Ｏｖｅｒｅｌｌ等、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８、１８０３、Ｓｃｈａｒｆｍａｎ等、１９９１、ＰＮＡＳ ８８、４６２６、Ｖｉｌｅ等、１９９４、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １、３０７、Ｘｕ等、１９８９、Ｖｉｒｏｌ．１７１、３３１、Ｙｅｅ等、１９８７、ＰＮＡＳ ８４、５１９７）、そのためポリシストロン性メッセージにおいて第２（及びそれに続く）コード配列の翻訳を開始するためにＩＲＥＳを用いることが好ましい（Ａｄａｍ等、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５、４９８５）ことが文献から明らかである。
ＩＲＥＳエレメントのレトロウイルスベクターへの挿入は、レトロウイルス複製周期に適合し、単一プロモーターからの複数のコード領域の発現を可能にする（Ａｄａｍ等（上記）、Ｋｏｏ等、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６：６６９〜６７５、Ｃｈｅｎ等、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２１４２〜２１４８）。ＩＲＥＳエレメントは、それらがウイルスタンパク質のキャップ非依存性翻訳を促進するピコルナウイルスの非翻訳５’末端で最初に見出された（Ｊａｎｇ等、１９９０、Ｅｎｚｙｍｅ ４４：２９２〜３０９）。ＲＮＡのオープンリーディングフレームの間に位置するとき、ＩＲＥＳエレメントは、ＩＲＥＳエレメントにおけるリボソームの侵入、それに続く下流の翻訳開始を促進することによって、下流オープンリーディングフレームの効率的な翻訳を可能にする。
ＩＲＥＳに関する概説は、Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ及びＳｍｉｔｈによって提示されている（ＴＩＧ、１９９５年５月、ｖｏｌ １１、Ｎｏ５：１７９〜１８４）。脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｇｈａｔｔａｓ、Ｉ．Ｒ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５８４８〜５８５９、１９９１）、ＢｉＰタンパク質（Ｍａｃｅｊａｋ及びＳａｒｎｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９１、１９９１）、ショウジョウバエのＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ遺伝子（エキソンｄ及びｅ）（Ｏｈ等、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：１６４３〜１６５３、１９９２）、及びポリオウイルス（ＰＶ）（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３２０〜３２５、１９８８、Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ及びＳｍｉｔｈ、ＴＩＧ １１、１７９〜１８４、１９８５も参照）由来の配列を含むいくつかの異なるＩＲＥＳ配列が知られている。
ＷＯ−Ａ−９７／１４８０９によれば、ＩＲＥＳ配列は典型的に、遺伝子の５’非コード領域に見出される。この文献に記載のものに加えて、ＩＲＥＳ配列は、発現に影響を及ぼす遺伝子配列を探し、次いでその配列がＤＮＡに影響を及ぼすか（すなわち、プロモーター又はエンハンサーとして作用する）、或いはＲＮＡのみに影響を及ぼすか（ＩＲＥＳ配列として作用する）を判定することによって、経験的に見出すことができる。
ＰＶ、ＥＭＣＶ、及びブタ水痘性疾患ウイルス由来のＩＲＥＳエレメントは、これまでにレトロウイルスベクターにおいて用いられている（Ｃｏｆｆｉｎ等、上記）。
「ＩＲＥＳ」という用語には、ＩＲＥＳとして作用する、又はＩＲＥＳの機能を改善する任意の配列又は配列の組み合わせが含まれる。
ＩＲＥＳは、ウイルス由来（ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ又はＰＶ ＩＲＥＳなど）、或いは細胞由来であることができる。
ＩＲＥＳがそれぞれのＮＯＩの翻訳を開始できるためには、ＩＲＥＳはベクターゲノムのＮＯＩの間に位置しているべきである。換言すると、ＮＯＩに比べて１つ少ないＩＲＥＳ配列が常に存在する。たとえば、ｎ個のＮＯＩを含むマルチシストロン性配列の場合、ゲノムは以下のとおりであることができる。
［（ＮＯＩ１−ｎ−１）−（ＩＲＥＳ１−ｎ−１）］−ＮＯＩｎ
２及び３シストロン性配列の場合、順序は以下のとおりであることができる。
ＮＯＩ１−ＩＲＥＳ１−ＮＯＩ２
ＮＯＩ１−ＩＲＥＳ１−ＮＯＩ２−ＩＲＥＳ２−ＮＯＩ３
１つ又は複数のＮＯＩは、内部プロモーターに機能可能に結合していてもよい。プロモーターに関する議論は以下に示す。プロモーターとＩＲＥＳの組み合わせを用いることも可能である。
形質導入細胞
本発明はさらに、本発明の第１の態様によるウイルスゲノムを含むベクター系で形質導入された細胞に関する。
本発明のベクター系による形質導入は、カテコールアミンを生産する細胞の能力を付与又は増大することができる。たとえば、チロシンをＬ−ドーパに及び／又はＬ−ドーパをドーパミンに転換する細胞の能力を付与又は増大することができる。カテコールアミンの放出は、当分野で知られている技法、たとえば分析細胞に接続した電気化学検出器を用いて測定できる。カテコールアミン自体に加えて、カテコールアミン放出に伴う副産物（ＤＯＰＡＣ、ドーパミンの特異分解産物など）も検出することができる。
細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｅｘ ｖｉｖｏで形質導入することができる。たとえば、細胞が哺乳動物対象由来の細胞である場合、細胞を対象から摘出し、形質導入して、対象への再移植に備えることができる（ｅｘ ｖｉｖｏ形質導入）。或いは、細胞は、標準的な技法に従って（たとえばＮＯＩを発現するベクターストックの注入によって）、本発明のベクター系を用いてｉｎ ｖｉｖｏで直接遺伝子移入することによって形質導入することもできる。細胞が培養において安定な細胞系の一部である場合（すなわち、多数の継代培養で生存でき、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖できるもの）、標準的な技法によって、たとえばＮＯＩを発現するベクターを含むウイルス上清に細胞を暴露することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入することができる。
細胞は、形質導入を受けることのできる任意の細胞であることができる。ベクター系が非分裂細胞を形質導入できる場合（たとえばレンチウイルス系である場合）、細胞は、ニューロンなどの非分裂細胞であることができる。
好ましい実施形態において、形質導入細胞は、遺伝子修飾神経細胞系の一部を形成する。そのような細胞系は、たとえばパーキンソン病の治療のために脳に移植することができる。
他の実施形態において、細胞は、神経幹細胞である。そのような細胞系は、たとえばパーキンソン病の治療のために脳に移植することができる。
他の実施形態において、細胞は、ニューロン又はグリア細胞などの、対象の線条体の細胞である。そのような細胞へのｉｎ ｖｉｖｏでの直接遺伝子移入により、たとえばドーパミンプロデューサー細胞に転換することができる。
カセット
本発明はさらに、ＩＲＥＳ又は内部プロモーターなどの調節エレメントによって機能可能に結合された２つ以上のＮＯＩ及びＯＲＦを含むマルチシストロン性カセットを提供する。このカセットは、プロデューサー細胞でベクターゲノムを生産する方法において用いることができる。
本発明はさらに、そのようなカセットを含む発現ベクターを提供する。そのような発現ベクターによる適切な細胞のトランスフェクションにより、カセットのＮＯＩによってコードされた各ＰＯＩを発現する細胞が生じる。本発明はさらに、そのようなトランスフェクト細胞を提供する。
カセットの発現ベクターへのクローニング、及びそのベクターによる細胞のトランスフェクション（カセットの発現をもたらすため）は、当分野でよく知られている技法によって行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ、１９８９）及び他の実験書に記載のものなど）。
好ましくは、カセットは、プロモーターを含む。非常に好ましい実施形態において、カセットは、２シストロン性又は３シストロン性であり、以下のエレメントを含む。
ＬＴＲ−ＯＲＦ−プロモーター／ＩＲＥＳ−（ＮＯＩ１）−（ＩＲＥＳ１）−ＮＯＩ２）
ＬＴＲ−ＯＲＦ−プロモーター／ＩＲＥＳ−（ＮＯＩ１）−（ＩＲＥＳ１）−（ＮＯＩ２）−（ＩＲＥＳ２）−（ＮＯＩ３）
特に好ましい実施形態において、カセットは、２シストロン性であり、チロシンヒドロキシラーゼ（或いはその突然変異体、変異体、又は相同体）をコードするＮＯＩ、及びＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（或いはその突然変異体、変異体、又は相同体）をコードするＮＯＩを含む。
他の特に好ましい実施形態において、カセットは、３シストロン性であり、チロシンヒドロキシラーゼ（或いはその突然変異体、変異体、又は相同体）をコードするＮＯＩ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（或いはその突然変異体、変異体、又は相同体）をコードするＮＯＩ、及び芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（或いはその突然変異体、変異体、又は相同体）をコードするＮＯＩを含む。
標的部分及びシグナル伝達経路
本発明の態様は、シグナル伝達経路の同定されていない成分の同定を可能にする。そのような成分は、本明細書では「標的部分」と呼ばれる。シグナル伝達経路の同定成分又は標的部分は、薬剤標的として有用である可能性がある。「シグナル伝達経路」という表現は、経路の活性化をもたらす、又は経路の活性化から生じる（及び含む）任意の１つ又は複数の事象をいう。好ましくは、「シグナル伝達経路」によって、本出願人等は、遺伝子的及び／又は分子的に相互作用するエレメントを含むシグナル伝達経路をいう。このシグナル伝達経路には、細胞外又は細胞膜で起こるシグナル伝達事象、並びに細胞内、たとえば細胞質内部、又は細胞核内部で起こるシグナル伝達事象が含まれる。
本発明を適用することのできるシグナル伝達経路に特別の制限はないが、表現型の相違が測定できるものであるべきである。
本発明を有用に適用することのできる経路の例には、乳癌に関連するＮｅｕ−Ｒａｓ経路、及びアポトーシス経路が含まれる。いくつかの他の経路が、乳癌及び他の癌に関連があるとされており、たとえばＥｒｂＢ受容体ファミリー、エストロゲン受容体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インテグリン受容体系である。前立腺癌において、アンドロゲン受容体（ＡＲ）シグナル伝達経路は、疾患の初期発生並びに後の進行で重要な役割を果たすと考えられている。
本発明が適用される疾患状態の非限定的な一覧を後に示す。たとえば、本発明は、パーキンソン病、及び他の神経疾患に関して有用である可能性がある。
鎌状赤血球症を有する患者の場合、たとえば、胎児性ヘモグロビンの発現を誘導することが有利であろう。レポーター発現を駆動するこの遺伝子のプロモーターを用いて、胎児性ヘモグロビンの発現を誘導するｃＤＮＡのペプチドを同定することができる。しかしながら、この遺伝子の発現が成体において抑制されている場合、アンチセンス又はリボザイムライブラリーの使用がより適切であろう。同様に、タンパク質ジストロフィンの突然変異による喪失に起因するデュシェーヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の場合、研究はユートロフィン遺伝子のアップレギュレーションに集中している。
モジュレート部分
モジュレート部分は、標的部分と結合することによってシグナル伝達経路に影響を及ぼすことができ、すなわちシグナル伝達経路をアップレギュレート又はダウンレギュレートできる化合物である。
本明細書では、「モジュレートする」という用語は、シグナル伝達経路の生物活性の変化をいう。したがって、経路のモジュレーションには、たとえばシグナル伝達経路の正常な生物活性を少なくともある程度、遮断する化合物による、シグナル伝達の阻害又はダウンレギュレーションが含まれる。或いは、「モジュレーション」という用語は、たとえばシグナル伝達経路の正常な生物活性を少なくともある程度、促進又はアップレギュレートする化合物による、シグナル伝達の活性化又はアップレギュレーションをいうこともできる。
シグナル伝達伝達のモジュレーションによって、本出願人等は、
（ａ）（ｉ）抑制因子の優性阻害又は阻害因子、及び（ｉｉ）活性化因子によるシグナル伝達経路の活性化、並びに
（ｂ）（ｉ）活性化因子の優性阻害又は阻害因子、及び（ｉｉ）阻害因子によるシグナル伝達経路の遮断
を含む。
モジュレート部分は、好ましくは、ポリペプチド及びそのフラグメント、線状ペプチド、環状ペプチド、それらをコードする核酸、低分子量有機又は無機化合物を含む合成又は天然化合物、リボザイム、アンチセンス分子、及び抗体から選択される。
本発明のポリペプチドの非機能性相同体はさらに、タンパク質の通常の機能を果たすことはできないが、シグナル伝達経路の他の成分との結合に関して野生型タンパク質と競合する可能性があるので、任意の所与のシグナル伝達経路のモジュレーションについて（たとえば細胞周期進行の阻害について）試験できることが理解される。或いは、本発明のポリペプチドの非機能性相同体は、シグナル伝達経路の成分と結合したとき、タンパク質の機能を遮断する可能性がある。そのような非機能性相同体には、天然突然変異体、及び修飾配列又はそのフラグメントを含むことができる。
或いは、成分の結合を直接妨げる代わりに、この物質は、本発明のポリペプチドの生物学的利用可能量を抑制することができる。これは、たとえば転写、転写安定性、翻訳又は翻訳後安定性のレベルで成分の発現を阻害することによることができる。そのような物質の例は、ｍＲＮＡ生合成の量を抑制するアンチセンスＲＮＡ又は２本鎖干渉ＲＮＡ配列である。
適切な候補物質には、実施例に記載するポリペプチドの配列をベースにした、特にアミノ酸約５から３０、又は１０から２５の大きさのペプチド、或いは１つ又は複数の残基が置換されたそのようなペプチドの変異体が含まれる。ランダム配列、又はペプチドの最大限に多様なパネルを提供するように連続して改変された配列を含むペプチドのパネル由来のペプチドを用いることができる。
適切な候補物質にはさらに、本発明のポリペプチドに特異的な抗体産物（たとえば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、１本鎖抗体、キメラ抗体、並びにＣＤＲグラフト化抗体）が含まれる。さらに、コンビナトリアルライブラリー、ペプチド及びペプチド擬似物質、定義された化学物質、オリゴヌクレオチド、天然産物ライブラリーも、シグナル伝達経路機構、たとえば有糸分裂／減数分裂装置（微小管など）などの細胞分裂周期機構の他の成分に対する本発明のポリペプチドの結合の阻害因子としての活性に関してスクリーニングすることができる。候補物質は、たとえば反応当たり１０種の物質を含むバッチでの初回スクリーニングに用いることができ、それらのバッチの阻害を示す物質は個々に試験される。
候補物質は典型的に、最終濃度１から１０００ｎｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは１から１００ｎｍｏｌ／ｍｌで添加される。抗体の場合、用いられる最終濃度は典型的に、１００から５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２００から３００μｇ／ｍｌである。
候補物質は、全細胞に関して試験される前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって同定することができる。或いは、全細胞アッセイ、好ましくは高速スループットスクリーニングの形態の全細胞アッセイを、予備スクリーニングとして用いることができ、その後、その効果を確認するためにｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いることができる。用いることのできる適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイには、結合アッセイが含まれ、このアッセイにおいて、ポリペプチドは固体支持体に固定され、候補物質は非固定化であり、ポリペプチドと候補物質が互いに結合するかどうか、及び／又はどの程度結合するかどうかが判定される。或いは、候補物質が固定され、ポリペプチドが非固定化であってもよい。
一実施形態において、候補モジュレート部分のライブラリーが作製されるか、又は用いられる。
ライブラリー
本明細書では、「ライブラリー」という用語には、これに限定されるものではないが、候補モジュレート部分をコードする核酸フラグメントの集積が含まれる（本明細書では候補モジュレート部分のライブラリーと呼ぶ）。
本発明のライブラリーは、これに限定されるものではないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発及び／又は組換え法、たとえば化学処理、オリゴヌクレオチドを介する突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリング、ランダムプライミング組換え（ＲＰＲ）、制限酵素フラグメント誘導テンプレートスイッチング（ＲＥＦＩＴＳ）、及び付着伸長プロセス（ＳｔＥＰ）などを含む方法によって作製することができる。配列変異体のライブラリーは、ランダム、セミランダム、又は既知配列であることができる。
本発明によってスクリーニングされるヌクレオチド配列は、典型的に、対象となる活性を有するポリペプチド、又はリボザイムなどの触媒活性を有するＲＮＡ分子をコードする。しかしながら、ＤＮＡ結合タンパク質によって結合した配列モチーフなど、非転写分子として活性を有する可能性のあるヌクレオチド配列もスクリーニングすることができる。
対象となる活性を有するポリペプチドには、抗体、抗原、酵素、増殖因子などのリガンド、細胞表面受容体などの受容体、他の細胞シグナル伝達経路の成分、ＤＮＡ修復酵素などのＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、リコンビナーゼ、及び転写因子、並びに構造タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、上記のフラグメントも含まれる。
本発明のスクリーニング法に用いられるポリペプチドには、既知又は候補核酸結合モチーフを有するポリペプチドのファミリーを含むことができる。これらには、たとえばジンクフィンガータンパク質（下記を参照）を含むことができる。本発明による分子にはさらに、当分野の技術者によく知られているへリックス−ターン−へリックスタンパク質、ホメオドメイン、ロイシンジッパータンパク質、へリックス−ループ−へリックスタンパク質、又はβ−シートモチーフを含むことができる。
例として、ＤＮＡ結合タンパク質は、特にタンパク質のＤＮＡ結合部分、たとえばジンクフィンガー転写因子、Ｚｉｆ２６８、ＡＴＦファミリー転写因子、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ｂＺＩＰタンパク質、ＣＨＯＰ、ＮＦ−κＢ、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、ＭＤＭ、ｃ−ｊｕｎ、ｅｌｋ、血清応答因子（ＳＲＦ）、３重複合体因子（ＴＣＦ）など、ＫＲＵＰＰＥＬ、ｏｄｄ Ｓｋｉｐｐｅｄ、ｅｖｅｎ ｓｋｉｐｐｅｄ、及び他のＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ転写因子、ＧＣＮ４などの酵母転写因子、ガラクトース誘導転写因子のＧＡＬファミリー、ＬａｃＩｑなどの細菌転写因子又は抑制因子、或いはそれらのフラグメント又は誘導体を含むことができる。誘導体は、当分野の技術者によって、たとえば少なくとも４０％の配列相同性によって、それらが誘導された分子に機能的及び／又は構造的に関連するとみなされる。
ポリペプチドは、非ランダム化ポリペプチド、たとえば「野生型」又は天然ポリペプチドの対立遺伝子変異体であることができ、或いは特定の突然変異体であることができ、或いは完全又は部分ランダム化ポリペプチド、たとえば特にＤＮＡ結合モチーフがランダム化された本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質のランダム化ライブラリーであることができる。
好ましくは、ポリペプチド機能に重要であることが知られているアミノ酸残基、たとえば核酸結合又は抗原結合などのリガンド結合又は触媒活性に重要であることが知られているアミノ酸残基などがランダム化されている。たとえばジンクフィンガータンパク質及び他のいくつかの転写因子など、ランダム化され得る残基の詳細な手引きは、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９に示されている。
ランダム化は、突然変異誘発の任意の適切な手段によって、ヌクレオチドレベルで達成される。突然変異誘発は、たとえば突然変異ポリペプチドをコードする新規な遺伝子を合成し、種々の異なるタンパク質を得るためのそれらを発現することによって行うことができる。或いは、存在する遺伝子自体を、部位特異的又はランダム突然変異誘発によって突然変異させ、所望の突然変異遺伝子を得ることができる。
突然変異は、当分野の技術者に知られている任意の方法で行うことができる。しかしながら、対象となるタンパク質をコードする核酸配列の部位特異的突然変異誘発が好ましい。Ｍ１３などの１本鎖ファージを用いる方法からＰＣＲベースの技法まで、いくつかの部位特異的突然変異誘発の方法が当分野において知られている（「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ、Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ、Ｔ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０を参照）。好ましくは、製造者使用説明書に従って、市販され入手可能なＡｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅ ＩＩ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることができる。他の技法は以下に記載する。
対象となるポリペプチドをコードする多様なヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからクローニングすることができる。たとえば、免疫又は非免疫ドナー由来の抗体遺伝子レパートリーのＰＣＲ増幅によって作製されたライブラリーは、機能性抗体フラグメントの非常に有効な供給源であることが示されている（Ｗｉｎｔｅｒ等、１９９４、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２、４３３〜５５、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、１９９７、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５、６２〜７０）。遺伝子のライブラリーを作製することもでき、それらは遺伝子のすべて（たとえばＰａｒｍｌｅｙ及びＳｍｉｔｈ、１９８８、Ｇｅｎｅ、７３、３０５〜１８を参照）又は一部（たとえばＬｏｗｍａｎ等、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０、１０８３２〜８を参照）、或いは遺伝子のプール（たとえばＮｉｓｓｉｍ等、１９９４、Ｅｍｂｏ Ｊ、１３、６９２〜８を参照）をコードする。
多様なヌクレオチド配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｍｕｔＤ５（Ｌｏｗ等、１９９６）などの細菌の「突然変異誘発株」の使用、及びＢリンパ球の抗体超変異系の使用（Ｙｅｌａｍｏｓ等、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ、３７６、２２５〜９）の使用を含む、ｉｎ ｖｉｖｏの種々の技法によってランダムに、突然変異をヌクレオチド配列、又はヌクレオチド配列のプールに導入することによって作製することもできる。ランダム突然変異は、化学突然変異原、及びイオン化又はＵＶ照射（Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ等、１９９５、ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．を参照）、或いは変異原性塩基類似体の取り込み（Ｚａｃｃｏｌｏ等、１９９６、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２５５、５８９〜６０３）によって、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で導入することができる。「ランダム」突然変異は、たとえば変異性ポリメラーゼを用いて（Ｌｅｕｎｇ等、１９８９、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１、１１〜１５）、重合中にｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子に導入することもできる。
さらなる多様化は、ｉｎ ｖｉｖｏ（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ等、１９９４、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、５８、４０１〜６５を参照）又はｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４ａ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０、３８９〜９１、Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４ｂ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９１、１０７４７〜５１）で相同組換えを用いて導入することができる。
本発明で用いるヌクレオチド配列の特に好ましいライブラリーは、ＰＣＲアセンブルコンビナトリアルライブラリーである。
理論上の研究は、より多数の遺伝因子変異体が作られるほど、所望の特性を有する分子が作られる可能性が高くなることを示唆している。最近、より大きなレパートリーのファージ−抗体が、実際に小さなレパートリーに比べて良好な結合親和性を有するより多くの抗体をもたらすことが実験的に確認された。したがって、確実に希少変異体が生産され、選択されることができるように、大きなサイズのライブラリーが望ましい。したがって、本発明で用いられるヌクレオチド配列のライブラリーは、典型的に、少なくとも１００、５００、１０００、又は１００００の異なるヌクレオチド配列、好ましくは少なくとも１０５、１０６、又は１０７の異なるヌクレオチド配列を含む。
本発明のスクリーニング法に用いる複数のヌクレオチド配列は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含むことができるが、典型的にはＤＮＡを含む。ヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ又は触媒性リボザイムなどのＲＮＡ配列をコードする場合、ヌクレオチド配列は、典型的に、コード配列に加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでコード配列の発現を方向づけるのに適した転写調節配列を含む核酸ベクターの一部として提供される。たとえば、コード配列の上流にＴ７又はＴ３プロモーターを含むベクターを用いることができる。ヌクレオチド配列は、線状ＤＮＡ又は環状ＤＮＡとして提供されることができる。コード配列がポリペプチドをコードする場合、コード配列は、典型的に、成熟タンパク質をコードする配列に加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系でコード配列の翻訳を方向づける配列をさらに含む。
好ましくは、ライブラリー候補モジュレート部分は、一群のリボザイム又はアンチセンス分子を含む。
リボザイムは、タンパク質の不可欠な関与なしに、細胞内の特定の化学反応を触媒するように機能できるＲＮＡ分子である。たとえば、グループＩのリボザイムは、自己スプライシング型前駆体ＲＮＡからの自己切除を媒介できるイントロンの形態を取る。他のリボザイムは、ウイルスＲＮＡ分子の複製に必須である自己切断型ＲＮＡ構造から誘導される。タンパク質酵素と同様に、リボザイムは、基質及び金属イオンなどの補助因子に特異的な結合部位を提供する２次及び３次構造に折りたたむことができる。そのような構造の例には、ハンマーヘッド、ヘアピン、又はステムループが含まれ、シュードノット及びデルタ肝炎アンチゲノムリボザイムが記載されている。
それぞれ個々のリボザイムは、標的ＲＮＡの認識部位を認識し、結合するモチーフを有する。このモチーフは、１つ又は複数の「結合アーム」の形態を取るが、一般に２つの結合アームの形態を取る。ハンマーヘッド型リボザイムの結合アームは、ＨｅｌｉｘＩＩに隣接する隣接配列ＨｅｌｉｘＩ及びＨｅｌｉｘＩＩＩである。これらは、通常はそれぞれ６から１０ヌクレオチドの様々な長さであり得るが、それより短くても長くてもよい。隣接配列の長さは、切断の速度に影響を及ぼし得る。たとえば、隣接配列の全ヌクレオチド数を２０から１２に低減することにより、ＨＩＶ配列を切断するリボザイムの代謝回転速度を１０倍に増大できることが判っている（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、ＪＶＫ、１９９１、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２８４：３８６〜３９１）。ハンマーヘッド型リボザイムのリボザイムＨｅｌｉｘＩＩの触媒モチーフは、切断部位と呼ばれる部位で標的ＲＮＡを切断する。リボザイムが任意の所与のＲＮＡを切断するかどうかは、適切な切断部位を含有するリボザイムに対する認識部位の有無によって決定される。
リボザイムのそれぞれの型は、独自の切断部位を認識する。ハンマーヘッド型リボザイム切断部位は、すぐ上流にヌクレオチド塩基トリプレットＧＵＸを有し、配列中、Ｇはグアニンであり、Ｕはウラシルであり、Ｘは任意のヌクレオチド塩基である。ヘアピン型リボザイムは、ＢＣＵＧＮＹＲの切断部位を有し、配列中、Ｂはアデニン以外の任意のヌクレオチド塩基であり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｙはシトシン又はチミンであり、Ｒはグアニン又はアデニンである。この切断部位において、ヘアピン型リボザイムによる切断は、ＧとＮの間で起こる。
リボザイムに関するさらなる詳細は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（ＲＡ Ｍｅｙｅｒｓ編、１９９５、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ、８３１〜８３２０頁）、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」（ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ等編、１９９７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、６８３頁）、並びに本出願人等のＷＯ９９／４１３９７及びＷＯ００／７５３７０に見出すことができる。
或いは、成分の結合を直接妨げる代わりに、この物質は、本発明のポリペプチドの生物学的利用可能量を抑制することができる。これは、たとえば転写、転写安定性、翻訳又は翻訳後安定性のレベルで成分の発現を阻害することによることができる。そのような物質の例は、ｍＲＮＡ生合成の量を抑制するアンチセンスＲＮＡ又は２本鎖干渉ＲＮＡ配列である。
ｍＲＮＡ配列の逆転写によってｃＤＮＡライブラリーを作製するためのプロトコルは当分野でよく知られており、それを行うためのキットは市販され入手可能である（たとえばＧｉｂｃｏ ＢＲＬから）。例として、相補ＤＮＡ（すなわち「ｃＤＮＡ」）のライブラリーを調製するために、細胞が選択される。それらの細胞には、これに限定されるものではないが、正常細胞、又は典型的な疾病状態である疾病状態の対象由来の細胞が含まれる。例として、対象がメラノーマを有する場合、細胞はメラノーマ細胞である。対象が神経疾患を罹患している場合、細胞は、好ましくは、罹患細胞のサンプルである。罹患細胞はｃＤＮＡの最良の供給源である可能性が高いので、このアプローチが選択される。すなわち、そのような分子は特異的に対象となる疾病状態と関連する。
発現ライブラリーの調製は、タンパク質が細胞によって発現される場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が存在しなければならないという確立された事実に基づいている。それらのｍＲＮＡ分子は長く生存せず、不安定であるため、実用的でない。したがって、選択された細胞は、相補ＤＮＡ（すなわち「ｃＤＮＡ」）のライブラリーの調製に用いられる。ｃＤＮＡはまず、逆転写により、細胞から単離されたメッセンジャーＲＮＡから調製される。ｍＲＮＡ配列の逆転写によってｃＤＮＡライブラリーを作製するためのプロトコルは当分野でよく知られており、それを行うためのキットは市販され入手可能である（たとえばＧｉｂｃｏ ＢＲＬから）。ｃＤＮＡの作製後、ｃＤＮＡはベクターライブラリーを構築するために用いられる。要するに、ｃＤＮＡの分子を受容するために、切断及びスプライシングなどによって、キャリアベクターは処理される。技術者は多くのそのような例に精通しているので、ベクターの選択は多様であってよい。ライブラリーを作製するための、市販され入手可能なベクターの１つは、ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）ベクターシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
ｉｎ ｖｉｖｏ選択方法
リボザイムなどの阻害ＲＮＡ分子の選択は、理論上、通常どおりに設計されている。しかしながら、この方法で試験されたリボザイムは、多くの場合、細胞環境では良好に機能しない。本出願人等はここにｉｎ ｖｉｖｏ選択法を提供し、これは本出願人等のＷＯ００／７５３７０に記載の方法の別法である。
より詳細には、
（ｉ）選択可能マーカーをコードする任意選択の第１のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）それぞれ独立してマーカー又はモジュレーター遺伝子をコードする１つ又は複数の任意選択の第２のヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド配列に結合し、その切断を直接又は間接的にもたらすことのできる遺伝子産物をコードする、機能可能にプロモーターに結合した第３のヌクレオチド配列
を含む、ｉｎ ｖｉｖｏで用いるのに適したベクターが提供され、
（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）は、宿主において連続ＲＮＡ分子として（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の転写を指令できる調節配列に機能しうる形で連結している。
参照を容易にするため、これはいわゆる「ライブラリーベクター」であり、すなわちこのベクターは、ＮＯＩのライブラリーを作製するために用いることができる。本発明の目的のために、このライブラリーベクターは、リボザイムのライブラリーを作製するために用いられる。
一実施形態において、（ｉｉ）は、その転写を指令できる調節配列と読み枠がずれている。
好ましい実施形態において、ベクターは、単一の第２のヌクレオチド配列を含む。より好ましい実施形態において、ベクターは、２つの第２のヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態において、ベクターは、３〜５個の第２のヌクレオチド配列を含む。
第１のヌクレオチドは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子などの選択可能マーカー遺伝子をコードする。選択可能マーカーは、本発明のベクターで形質導入された細胞を選択するために用いられる。
本発明の選択系の第３のヌクレオチドは、阻害ＲＮＡ分子をコードする複数のヌクレオチド配列であることができる。阻害ＲＮＡ分子は、配列に結合することによって、核酸配列の転写及び／又は翻訳を阻害することのできるリボ核酸として定義されている。一般に阻害ＲＮＡ分子は、ヌクレオチド配列又はその転写産物に結合し、その切断を直接又は間接的にもたらすことができる。例には、リボザイム（直接切断）、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、及びアンチセンス又はセンスＲＮＡ（他の因子によって切断を起こす）が含まれる。
さらにｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適したベクターが提供され、この系は、
（ａ）モジュレーター遺伝子をコードする第１のヌクレオチド配列、
（ｂ）前記第１ヌクレオチド配列がモジュレートするヌクレオチド配列に機能しうる形で連結している検出可能マーカー遺伝子及びプロモーターをコードする第２のヌクレオチド配列、及び
（ｃ）対象となるヌクレオチド配列を含み、
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、宿主において連続ＲＮＡ分子として（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の転写を指令できる調節配列に機能しうる形で連結している。
参照を容易にするため、これはいわゆる「標的ベクター」である。
標的ベクターの配列（ｃ）は、好ましくは、Ｐａｒｋｉｎ又はＴａｔなどの、ポリペプチド又はそのフラグメントをコードすることのできる遺伝子又はそのフラグメントを含む。この配列は、ベクター構築物の（ａ）と（ｂ）の間に位置し、（ａ）の発現を駆動する転写単位と読み枠がずれている。
このベクターは、好ましくは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
このモジュレーターは、活性因子又は抑制因子として作用する。たとえば、このモジュレーターは、ＴｅｔＲなどのテトラサイクリン抑制因子、並びにｔＴＡ及びｒｔＴＡなどのテトラサイクリン制御トランス活性化因子から選択することができ、検出可能マーカー遺伝子は、テトラサイクリンオペレーターに機能しうる形で連結していることができる。
検出可能マーカーは、発現が検出され得る任意の遺伝子産物であることができ、たとえばＧＦＰ又はＬＮＧＦＲなどのＮＦＡＴ−依存性レポーター遺伝子である。
好ましい実施形態において、ライブラリーベクターに用いられる１つ又は複数のマーカー遺伝子の少なくとも１つは、標的ベクターに用いられる検出可能マーカー遺伝子と同一であり、且つ／又はライブラリーベクターに用いられる１つ又は複数のモジュレーター遺伝子の少なくとも１つは、標的ベクターに用いられるモジュレーター遺伝子と同一であり、且つ／又はライブラリーベクターの第３のヌクレオチド配列に機能しうる形で連結しているプロモーターは、標的ベクター（ｂ）部分に用いられるプロモーターと同一である。
本出願人等はさらに、
（ｉ）標的ベクター及びライブラリーベクターを宿主細胞に導入し、
（ｉｉ）検出マーカー遺伝子が宿主細胞で発現される場合、その宿主細胞を選択し、任意選択で、
（ｉｉｉ）前記第３のヌクレオチド配列を単離して、そのヌクレオチド配列を決定することにより、複数の阻害分子から選択する方法を提供する。
モジュレーターの投与
候補物質、すなわちモジュレート部分は、標的非分裂細胞又は緩慢分裂細胞を形質導入することのできる任意のベクターにおいて非分裂細胞又は緩慢分裂細胞に投与することができる。たとえば、細胞に注入することができる。或いは、ポリペプチド候補物質の場合、細胞においてポリペプチドの発現を方向づける核酸構築物で細胞をトランスフェクトすることができる。好ましくは、ポリペプチドの発現は、調節プロモーターの制御下にある。一実施形態において、モジュレート部分は、レンチウイルスベクターに送達される。
ベクター
当分野でよく知られているように、ベクターは、１つの環境から別の環境へのある実体の移入を可能にする、又は容易にするツールである。本発明によれば、例として、組換えＤＮＡ技法に用いられるいくつかのベクターは、ＤＮＡのセグメント（異種ＤＮＡセグメント、異種ｃＤＮＡセグメントなど）などの実体が、ＤＮＡのセグメントを含むベクターの複製のために宿主細胞に移入されることを可能にする。組換えＤＮＡ技法に用いられるベクターの例には、これに限定されるものではないが、プラスミド、染色体、人工染色体、又はウイルスが含まれる。
「ベクター」という用語には、発現ベクター及び／又は形質転換ベクターが含まれる。
「発現ベクター」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏ発現が可能な構築物を意味する。
「形質転換ベクター」という用語は、１つの種から別の種に移入されることのできる構築物を意味する。
好ましくは、ベクターは、ウイルスをベースとするベクターである。
好ましくは、標的非分裂細胞又は緩慢分裂細胞を形質導入することのできるベクターは、組換えウイルスベクターである。
本発明の方法で用いられる典型的なベクターにおいて、複製に必須な１つ又は複数のタンパク質コード領域の少なくとも一部を、ウイルスから除去することができる。これによりレトロウイルスベクターは、複製欠陥となる。レトロウイルスゲノムの一部は、標的非分裂宿主細胞又は緩慢分裂宿主細胞を形質導入することができ、且つ／又は宿主ゲノムにそのゲノムを組み込むことのできる候補モジュレート部分を含むベクターを生産するために、調節制御領域に機能しうる形で連結された候補モジュレート部分及びそのベクターゲノムのレポーター部分をコードするライブラリーによって置換されていてもよい。
ベクターが形質導入された標的細胞及び／又は宿主細胞に組み込まれたゲノムを有するとき、その形質導入細胞は、候補モジュレート部分に関してスクリーニングすることができる。したがって、ベクターゲノムの対象となる部位へのライブラリーの移入は、典型的に、（ｉ）候補モジュレート部分をコードするライブラリーを組換えウイルスベクターに組み込み、（２）修飾ウイルスベクターをビリオン被覆にパッケージし、（３）標的化非分裂細胞又は緩慢分裂細胞、或いは標的化非分裂細胞又は緩慢分裂細胞集団などの対象となる部位を形質導入させることによって達成される。
レンチウイルスベクター
好ましくは、標的非分裂細胞又は緩慢分裂細胞を形質導入することのできるウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
レンチウイルスベクターは、より大きなレトロウイルスベクターグループの一部であり、本発明のこの態様に有用なそのようなベクターは上に詳しく記載している。
本発明のベクターは、ウイルス又は非ウイルスベクターによって、標的部位に送達することができる。
非ウイルス送達系には、これに限定されるものではないが、ＤＮＡトランスフェクション法が含まれる。本発明において、トランスフェクションには、非ウイルスベクターを用いて、標的哺乳動物細胞に遺伝子を送達するプロセスが含まれる。
典型的なトランスフェクション法には、エレクトロポレーション、ＤＮＡバイオリスティクス、脂質媒介トランスフェクション、コンパクトＤＮＡ媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性剤媒介、カチオン性表面両親媒性物質（ＣＦＡ）（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６、１４：５５６）、及びそれらの組み合わせが含まれる。
ウイルス送達系には、これに限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターが含まれる。ベクターの他の例には、ｅｘ ｖｉｖｏ送達系が含まれ、これにはエレクトロポレーション、ＤＮＡバイオリスティクス、脂質媒介トランスフェクション、コンパクトＤＮＡ媒介トランスフェクションなどのＤＮＡトランスフェクション法が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明のベクター系による１つ又は複数の治療遺伝子の送達は、単独で、或いは他の治療、又は治療の成分と組み合わせて用いることができる。
アデノウイルスベクター
本発明の他の実施形態において、候補モジュレート部分のライブラリーは、アデノウイルスベクターに導入することができる。
アデノウイルスは、ＲＮＡ中間体を経由しない、２本鎖線状ＤＮＡウイルスである。遺伝子配列相同性に基づいて６つのサブグループに分類される、５０種を超えるヒト血清型のアデノウイルスが存在する。アデノウイルスの天然の標的は、気道上皮及び消化管上皮であり、一般に軽度の症状のみを生じる。血清型２及び５（配列相同性９５％）は、アデノウイルスベクター系においてもっとも一般的に用いられ、通常は、若齢者の上気道感染症に関連する。
アデノウイルスは、エンベロープを有さない、正二十面体である。典型的なアデノウイルスは、１４０ｎｍのカプシド化ＤＮＡウイルスを含む。ウイルスの２０面体対称は、１５２のカプソマー、２４０のヘキソン及び１２のペントンからなる。粒子のコアは、３６ｋｂの線状２本鎖ＤＮＡを含有し、これはＤＮＡ複製のプライマーとして作用する末端タンパク質（ＴＰ）と５’末端で共有結合している。このＤＮＡは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）を有し、それらの長さは血清型によって異なる。
アデノウイルスの細胞への侵入は、一連の別個の事象を含む。ウイルスの細胞への付着は、ウイルス線維（３７ｎｍ）と細胞上の線維受容体との間の相互作用を介して起こる。この受容体は、近ごろＡｄ２／５血清型に関して同定され、ＣＡＲ（コクサッキー及びアデノ受容体、Ｔｏｍｋｏ等（１９９７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９４：３３５２〜２２５８）と命名された。細胞αｖβ３及びαｖβ５インテグリンを介するウイルスのエンドソームへの内在化は、ペントンベースのカプシドタンパク質のウイルスＲＧＤ配列によって媒介される（Ｗｉｃｋｈａｍ等、１９９３、Ｃｅｌｌ ７３：３０９〜３１９）。内在化後、エンドソームは、エンドソーム溶解として知られるプロセスであり、細胞αｖβ５インテグリンにより主に促進されると考えられている事象によって破壊される（Ｗｉｃｋｈａｍ等、１９９４、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２７：２５７〜２６４）。さらに、Ａｄ５ファイバーノブは、ヒト上皮細胞及びＢリンパ球芽を含むある種の細胞型の表面において、高い親和性でＭＨＣクラス１α２ドメインに結合するという新しい証拠がある（Ｈｏｎｇ等、１９９７、ＥＭＢＯ １６：２２９４〜２３０６）。
その後、ウイルスは核に移行し、そこで初期領域の活性化が起こり、その直後にＤＮＡ複製及び後期領域の活性化が起こる。アデノウイルスＤＮＡの転写、複製、及びパッケージングは、宿主及びウイルス両方の機能性タンパク質機構を必要とする。
ウイルス遺伝子発現は、初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）ステップに分けることができる。後期ステップは、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって定義される。アデノウイルス構造タンパク質は一般に、後期ステップで合成される。アデノウイルス感染後、ほとんどの血清型によって感染した細胞において、宿主細胞ｍＲＮＡ及びタンパク質合成は阻害される。アデノウイルス２及びアデノウイルス５によるアデノウイルス溶解サイクルは、非常に効率的であり、ビリオンに取り込まれない過剰なウイルスタンパク質合成及びＤＮＡに加えて、感染細胞当たり約１００００のビリオンが生じる。初期アデノウイルス転写は、相互に関連する複雑な連続的生化学事象であるが、ＤＮＡ複製の開始前にウイルスＲＮＡの合成が本質的に必要である。
以下の概略図は、初期及び後期遺伝子転写の相対的方向及び位置を示すアデノウイルスゲノムの図である。
アデノウイルスゲノムの構成は、アデノウイルス群のすべてにおいて類似しており、特定の機能は、研究された各血清型に関して一般に同じ場所に位置している。初期細胞質メッセンジャーＲＮＡは、ウイルスＤＮＡ上の４つの定義された不連続領域に相補的である。これらの領域はＥ１〜Ｅ４と呼ばれる。初期転写産物は、中間初期（Ｅ１ａ）、後発初期（Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、及びＥ４）、及び中間領域の配列に分類されている。
初期遺伝子は、感染の約６〜８時間後に発現し、遺伝子ブロックＥ１〜４の７つのプロモーターから駆動される。
Ｅ１ａ領域は、ウイルス及び細胞遺伝子の転写トランス活性化、並びに他の配列の転写抑制に関与する。Ｅ１ａ遺伝子は、他のすべての初期アデノウイルスメッセンジャーＲＮＡに対して重要な制御機能を果たす。正常な組織では、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、又はＥ４領域を効率的に転写するために、活性Ｅ１ａ産物が必要とされる。しかしながら、このＥ１ａ機能は回避され得る。Ｅ１ａ様機能を提供するように細胞を操作することができ、或いは天然にそのような機能を含有する可能性もある。Ｅ１ａ機能を回避するようにこのウイルスを操作することもできる。ウイルスパッケージングシグナルは、Ｅ１ａエンハンサーと重複する（１９４〜３５８ヌクレオチド）。
Ｅ１ｂ領域は、ウイルス及び細胞の代謝、並びに宿主タンパク質停止に影響を及ぼす。この領域にはさらに、完全長ウイルスＤＮＡのパッケージングに必要とされ、ウイルスの熱安定性に重要であるｐＩＸタンパク質をコードする遺伝子が含まれる（３５２５〜４０８８ヌクレオチド）。Ｅ１ｂ領域は、感染後期のウイルス事象の正常な進行に必要とされる。Ｅ１ｂ産物は、宿主の核において作用する。Ｅ１ｂ配列内部で生産された変異体は、後期ウイルスｍＲＮＡ蓄積の低減、並びにアデノウイルス感染後期に通常見られる宿主細胞輸送阻害の障害を示す。Ｅ１ｂは、プロセシング及び輸送がウイルス後期遺伝子産物に有利にシフトするように、宿主細胞の機能を改変するために必要とされる。その後これらの産物は、ウイルスのパッケージング、及びビリオンの放出をもたらす。Ｅ１ｂは、アポトーシスを妨げる１９ｋＤのタンパク質を生産する。Ｅ１ｂはさらに、ｐ５３に結合する５５ｋＤのタンパク質を生産する。アデノウイルス及びそれらの複製に関する概説は、ＷＯ９６／１７０５３を参照されたい。
Ｅ２領域は、７２ｋＤａのＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡ合成を開始させるタンパク質プライミングに必要な５５ｋＤａの末端タンパク質（ＴＰ）の８０ｋＤａの前駆体をコードするので、必須である。
１９ｋＤａのタンパク質（ｇｐ１９Ｋ）は、Ｅ３領域内でコードされ、ウイルスに対する宿主免疫応答のモジュレーションに関係するとされている。このタンパク質の発現は感染の第１期にＴＮＦアルファに応答してアップレギュレートされ、その後タンパク質は結合して、ＭＨＣクラスＩ抗原の上皮表面への移動を阻止し、それによって細胞傷害性Ｔリンパ球によるアデノウイルス感染細胞の認識を抑制する。Ｅ３領域は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究において重要ではなく、１．９ｋｂＸｂａＩフラグメントの削除によって除去することができる。
Ｅ４領域は、宿主タンパク質合成の低減、及びウイルスのＤＮＡ複製の増大に関係している。
後期遺伝子には５つのファミリーがあり、それらはすべて主要後期プロモーターから開始される。後期遺伝子の発現には、ＲＮＡスプライシングを含む非常に複雑な転写後調節機構が含まれる。線維タンパク質はＬ５領域内部でコードされている。アデノウイルスゲノムは、Ａｄ５において１０３ｂｐであり、ＤＮＡ複製に必須の逆方向末端反復に隣接している。感染の３０〜４０時間後に、ウイルス生成は完了する。
アデノウイルスは、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４プロモーターの誘導に重要なＥ１遺伝子の削除により、遺伝子移入にベクターとして用いるために変換することができる。Ｅ１複製欠陥ウイルスは、ヒト胎生期腎細胞系２９３などの、トランスでＥ１ポリペプチドを提供する細胞系において増殖することができる。１つ又は複数の治療遺伝子は、Ｅ１遺伝子の代わりに組み換えることによって挿入できる。この遺伝子の発現は、Ｅ１プロモーター又は異種プロモーターから駆動される。
さらに弱毒化されたアデノウイルスベクターも、Ｅ４オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部又はすべてを削除することにより開発されている。しかしながら、ある種の第２世代ベクターは、ＤＮＡが維持されていると考えられるにもかかわらず、長期遺伝子発現をもたらさないようである。したがって、１つ又は複数のＥ４ ＯＲＦの機能は、ウイルスに保持される少なくともある種のウイルスプロモーターからの遺伝子発現を増大するものであり得ると考えられる。
さらに欠損したウイルスを作製するための別のアプローチは、ウイルス複製に必要とされる末端反復のみを維持して、完全にウイルスの「内部を抜く（ｇｕｔ）」ことであった。「内部を抜かれた（ｇｕｔｔｅｄ）」又は「内部のない（ｇｕｔｌｅｓｓ）」ウイルスは、２９３細胞系において第１世代のヘルパーウイルスと共に高力価で増殖させることができるが、ヘルパーウイルスから「内部を抜かれた」ベクターを分離することが困難であった。
アデノウイルスは、以下の理由から、他の遺伝子治療ベクター系に比べて候補モジュレート部分を同定するためのベクターとして利点を提供する。
アデノウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト及び非ヒト起源の広範な細胞型を形質導入することのできる、エンベロープを有さない２本鎖ＤＮＡウイルスである。これらの細胞には、呼吸気道上皮細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、滑膜細胞、１次乳房上皮細胞、及びニューロンなどの有糸分裂後最終分化細胞が含まれる。
アデノウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入することもできる。これは、肺上皮において罹患細胞が遅い代謝回転速度を有する嚢胞性線維症などの疾患にとって非常に重要である。実際、罹患成人嚢胞性線維症患者の肺への嚢胞性線維症輸送体（ＣＦＴＲ）のアデノウイルス媒介移入を用いて、いくつかの試験が進行中である。
アデノウイルスは、遺伝子治療及び異種遺伝子発現のベクターとして用いられてきた。大きい（３６キロベース）ゲノムは、８ｋｂまでの外来挿入ＤＮＡを収容することができ、相補細胞系において効率的に複製して、１０１２までの非常に高い力価を生じることができる。したがって、アデノウイルスは、１次非複製細胞における遺伝子の発現を研究するための最良の系の１つである。
アデノウイルスゲノムからのウイルス又は外来遺伝子の発現には、複製細胞を必要としない。アデノウイルスベクターは、受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞に侵入する。細胞に入ると、アデノウイルスベクターはめったに宿主染色体に組み込まれることはない。その代わりに、アデノウイルスベクターは宿主核において、線状ゲノムとして（宿主ゲノムから独立して）エピソーム性に機能する。したがって、組換えアデノウイルスの使用は、宿主ゲノムへのランダムな組み込みに伴う問題を軽減する。
ポックスウイルスベクター
本発明の他の実施形態において、候補モジュレート部分のライブラリーは、ポックスウイルスベクターに導入される。
ポックスウイルスベクターは、ＤＮＡの大きなフラグメントがそのゲノムに容易にクローニングされるので本発明によって用いることができ、組換え弱毒化ワクシニア変異体はすでに記載されている（Ｍｅｙｅｒ等、１９９１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０３１〜１０３８、Ｓｍｉｔｈ及びＭｏｓｓ、１９８３、Ｇｅｎｅ、２５：２１〜２８）。
ポックスウイルスベクターの例には、これに限定されるものではないが、レポリポックスウイルス：Ｕｐｔｏｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６０：９２０（１９８６）（ショープ線維腫ウイルス）、カプリポックスウイルス：Ｇｅｒｓｈｏｎ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２５（１９８９）（ケニアヒツジ−１）、オルソポックスウイルス：Ｗｅｉｒ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ４６：５３０（１９８３）（ワクシニア）、Ｅｓｐｏｓｉｔｏ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３５：５６１（１９８４）（サルポックス及び痘瘡ウイルス）、Ｈｒｕｂｙ等、ＰＮＡＳ、８０：３４１１（１９８３）（ワクシニア）、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４３：３９９（１９８５）（ヤバサル腫瘍ウイルス）、アビポックスウイルス、Ｂｉｎｎｓ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ６９：１２７５（１９８８）（トリポックス）、Ｂｏｙｌｅ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５６：３５５（１９８７）（トリポックス）、Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｉｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ、２０：３４１（１９８８）（トリポックス、ウズラポックス）、エントモポックス（Ｌｙｔｖｙｎ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ７３：３２３５〜３２４０（１９９２）が含まれる。
ポックスウイルスベクターは、真核細胞において対象となる遺伝子の発現ビヒクルとして広く用いられている。種々の宿主細胞においてクローニング及び増殖が容易であるため、特に外来タンパク質の発現のため、及びワクチン抗原の送達ビヒクルとしてポックスウイルスベクターは広く用いられている（Ｍｏｓｓ、Ｂ．１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６６２〜７）。
本発明による使用に好ましいベクターは、組換えポックスウイルスベクター、たとえばトリポックスウイルス（ＦＰＶ）、エントモポックスウイルス、ＮＹＶＡＣなどのワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、ＭＶＡ、又は他の非複製ウイルスベクター系、たとえばＷＯ９５／３００１８に記載のものなどである。少なくとも１つの免疫回避遺伝子が削除されたポックスウイルスベクターも記載されている（ＷＯ００／２９４２８を参照）。
好ましい一実施形態において、ポックスウイルスベクターは、エントモポックスウイルスベクターである。
ワクシニアウイルスベクター
好ましくは、ポックスウイルスベクターは、ワクシニアウイルスベクターである。
好ましくは、このベクターは、ＭＶＡ又はＮＹＶＡＣなどのワクシニアウイルスベクターである。もっとも好ましくは、ワクシニア株変性ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）又はそれら由来の株である。ワクシニアベクターの代替には、ヒト細胞に感染し、組換えタンパク質を発現できるが、複製できない、ＡＬＶＡＣとして知られるトリポックス又はカナリアポックスなどのアビポックスベクター、及びそれら由来の株が含まれる。
ポックスウイルスベクターライブラリーの構築
典型的に、候補モジュレート部分をコードする核酸フラグメント又は核酸フラグメント群は、相同組換えによってポックスウイルスゲノムに導入される。候補モジュレート部分をコードする核酸フラグメント又は核酸フラグメント群は、ポックスウイルスの非必須領域に相同の配列に隣接したワクシニアプロモーターの後ろにクローニングされ、プラスミド中間体は、相同組換えによってウイルスゲノムに組み換えられる。この方法は、原核生物宿主に許容される比較的小さな挿入部分に関して、効率的に機能する。
この方法は、相同組換えの頻度が低く、挿入部分のサイズが増すにつれて低減するので、大きな挿入部分が必要とされる場合、核酸フラグメントのライブラリー生産など労働集約型プラスミド中間体の構築が必要とされる場合、及びＤＮＡの増殖が細菌において許容されない場合には、実行可能性が低い。
相同組換えを容易に行うことができない状況で、効率的にキメラゲノムを構築するために、直接連結ベクターを用いる別法が開発されている（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ、Ｍ．等、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２２〜５２６、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ、Ｆ．等、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：９９７７〜９９８１）。これらの直接連結プロトコルは、ポックスウイルスキメラゲノムを生産するための相同組換えの必要性を排除した。そのようなプロトコルでは、ゲノム由来のＤＮＡを消化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで挿入ＤＮＡに連結し、ヘルパーウイルスに感染した細胞にトランスフェクトする（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ、Ｍ．等、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２２〜５２６、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ、Ｆ．等、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：９９７７〜９９８１）。１つのプロトコルでは、ゲノムは、ユニークなＮｏｔＩ部位で消化し、キメラゲノムを選択又は検出するためのエレメントを含有するＤＮＡ挿入部分を、ゲノムアームに連結する（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ、Ｆ．等、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：９９７７〜９９８１）。この直接連結法は、ワクシニアウイルスゲノムへの外来ＤＮＡの挿入に関して記載されている（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ等、１９９５、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：２９５７〜２９６２）。或いは、ワクシニアＷＲゲノムは、ＨｉｎｄＩＩＩ ＦフラグメントのＮｏｔＩ部位を除去し、その座における配列の挿入がチミジンキナーゼ遺伝子を破壊して、薬剤選択の使用によりキメラゲノムの単離が可能となるように、チミジンキナーゼ遺伝子近傍のＮｏｔＩ部位に再導入することによって修飾される（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ、Ｍ．等、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２２〜５２６）。
直接連結ベクター、ｖＮｏｔＩ／ｔｋは、少なくとも２６キロベース対の長さのＤＮＡ挿入物の効率的なクローニング及び増殖を可能にする（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ、Ｍ．等、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２２〜５２６）。大きなＤＮＡフラグメントは効率的にゲノムにクローニングされるが、ＤＮＡ挿入物によってコードされたタンパク質は、ワクシニアにおいて比較的発現の弱い初期クラス遺伝子であるチミジンキナーゼ遺伝子に相当する低レベルでのみ発現する。さらに、ＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位で両方向に挿入される。
そのようなＤＮＡライブラリーを効率的に構築するための、改善され、修飾されたワクシニアウイルスベクターは、スクリーニングの効率を改善する「３分子組換え」アプローチを用いて調製することができる。
本発明の一実施形態において、候補モジュレート部分をコードする核酸フラグメントの代表的なライブラリーは、ワクシニアウイルスで構築される。好ましくは、修飾ワクシニアウイルスベクター及び関連転移プラスミドを用いる３分子組換え法が、ワクシニアウイルスにおいて代表的なライブラリーを構築するために用いられる。この方法は、１００％に近い組換えワクシニアウイルスを生産する（ＷＯ００／２８０１６を参照）。
３分子組換え
上述の３分子組換え法は、１００％に近いウイルス組換えを生じる。これは、プラスミド転移ベクターをワクシニアウイルス感染細胞にトランスフェクションしてウイルス組換えを生産する現行の方法に比べて、非常に顕著な改善である。後者の手順は、わずか０．１％程度の頻度でウイルス組換えを生じる。３分子組換えにおけるウイルス組換えの高収率により、ワクシニアウイルス由来ベクターでの効率的なライブラリーの構築が可能になる。２０マイクログラムのＮｏｔＩ及びＡｐａＩ消化ワクシニアベクターアームと等モル濃度の腫瘍細胞ｃＤＮＡとの混合物によるトランスフェクション後に、６×１０の力価の組換えウイルスを得ることができる。この技術的進歩は、候補モジュレート部分を含む特定のゲノム及びクローンを単離するための、新しく効率的なスクリーニング及び選択戦略を創出する。
本明細書に開示する３分子組換え法は、ワクシニア及びヘルペスウイルスを含む哺乳動物ウイルスなどの他のウイルスと共に用いることができる。典型的に、相同性を持たない２つのウイルスアームが生産される。ウイルスアームを結合し得る唯一の方法は、プラスミドなどの転移ベクターにおいて挿入物に隣接する相同配列を介して架橋することである。２つのウイルスアーム及び転移ベクターが同じ細胞に存在するとき、生産された感染ウイルスのみが転移ベクターのＤＮＡ挿入物の組換え体である。
本発明の３分子組換え法によってワクシニア及び他の哺乳動物ウイルスに構築されたライブラリーは、本発明のスクリーニング系における候補モジュレート部分の同定に用いることができる。
標的細胞
「標的細胞」という用語は、ベクターがトランスフェクト又は形質導入することのできる適切な生物から誘導可能な任意の細胞を含む。好ましくは、この細胞は、非分裂細胞又は緩慢分裂細胞である。
本発明の方法に有用な細胞は、器官培養又はｉｎ ｖｉｖｏの、たとえば初代培養由来、確立細胞系由来など、任意の供給源由来であることができる。本発明に有用な細胞系には、線維芽細胞系、神経芽腫細胞系などの癌細胞系、及び血液起源の細胞系が含まれる。宿主細胞の他の例には、これに限定されるものではないが、呼吸気道上皮細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、滑膜細胞、１次乳房上皮細胞、並びにマクロファージ及び／又はニューロンなどの有糸分裂後最終分化非複製細胞が含まれる。適切な細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ．から得ることができる。
細胞系の不朽化
非分裂細胞又は緩慢分裂細胞から誘導された不朽化細胞系の使用に伴う利点の１つは、一般の細胞系の使用に比べて、ｉｎ ｖｉｖｏ状態を反映する確率が高いことである。本発明の一実施形態において、標的細胞は非分裂細胞又は緩慢分裂細胞であるが、ＮＯＩによる形質導入直後、又は同時に、標的細胞は不朽化される。不朽化は、テロメラーゼの添加又は新生細胞との融合によるハイブリドーマの形成、或いはタンパク質又は遺伝子送達によるＳＶ４０大型Ｔ抗原の添加によって行うことができる。
本発明はさらに、確立された技法に従って、たとえば前核注入、又はＥＳ細胞キメラの調製によって調製可能なトランスジェニック動物におけるアッセイの実施を包含する。
翻訳後修飾
候補部分の発現をモジュレートするか、又は発現した候補モジュレート部分を所望の特定の様式で修飾し、プロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（たとえばグリコシル化）及びプロセシング（たとえば切断）は、タンパク質の機能にとって重要である可能性がある。種々の宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾に関して特徴及び特定の機構を有する。適切な細胞系又は宿主系を選択することによって、発現した外来タンパク質の正しい修飾を確実なものにすることができる。この目的を達成するために、１次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳動物宿主細胞には、これに限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＨＴ１０８０、及びＷＩ３８細胞系が含まれる。
好ましい実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
好ましい実施形態において、宿主細胞は、ヒト細胞である。
本発明はさらに、本発明の候補部分の発現及び／又は検出に適した条件下で細胞が本発明によるベクターで形質導入されている形質導入宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。
生物応答改変物質（ＢＲＭ）
対象となる経路は、それ自体では刺激物質に応答性である必要はない。例として、本発明のスクリーニング法は、構成的に発現された対象となる遺伝子の場合に適用することができる。他の実施形態において、ＢＲＭを用いて、研究中のシグナル伝達経路をモジュレートすることができる。
環境的ストレス因子には、これに限定されるものではないが、酸素枯渇、放射線、熱ショック、ｐＨ変化、低体温、又はグルコース欠乏の１つ又は複数が含まれる。
免疫調節因子、サイトカイン、増殖因子、細胞表面受容体、ホルモン、マイトジェン、循環分子、炎症性サイトカイン、及び病原性因子、たとえばウイルス、細菌、寄生生物、又は酵母などの広範な分子を、ＢＲＭとして用いることができる。これらの生物応答改変物質の例には、これに限定されるものではないが、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルジオトロフィン−１、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エキソダス−２、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子−１０（Ｍａｒｓｈａｌｌ、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１２９）、ＦＬＴ３リガンド（Ｋｉｍｕｒａ等、１９９７）、フラクタルキン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−β１、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト増殖因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンフォタクチン、ミューラー阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球誘導タンパク質（Ｍａｒｓｈａｌｌ、１９９８、前出）、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４、骨髄前駆体阻害因子１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニューロツリン（Ｎｅｕｒｔｕｔｉｎ）、神経成長因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１α、ＳＤＦ１β、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、及びＧＲＯ−γが含まれる。
低酸素、熱ショック、虚血、浸透圧変化などのストレス因子も、シグナル伝達経路を経て細胞応答を誘導し、そのような因子もＢＲＭとして用いることができる。
環境的ストレスもＢＲＭとして用いることができ、酸素枯渇、無酸素、放射線、熱ショック、ｐＨ変化、低体温、及びグルコース欠乏を含む。
環境刺激又は細胞外分子によるモジュレート経路に加えて、特定のシグナル伝達機構の既知成分であるタンパク質の過剰発現もＢＲＭとして用い得ることが想定される。
疾患状態に特定の刺激（ＢＲＭ）
神経アポトーシス応答は、そのような疾患状態を模倣するために用いることのできる刺激によってｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導することができる。考えられる刺激には、低酸素、虚血、低酸素／虚血、グルタミン酸、カイニン酸、６−ヒドロキシドーパミン、スタウロスポリン、一酸化窒素、又はウォルトマニン（ｗｏｒｔｍａｎｉｎ）がある。
虚血
虚血は、特定の器官又は組織への不充分な血液の供給であり得る。血液供給の減少の結果として、器官又は組織への酸素の供給が不適切となる（低酸素）。長期にわたる低酸素は、罹患器官又は組織の傷害をもたらす可能性がある。
例として、虚血様の状態、又は虚血に起因する状態には、低酸素及び／又は低グルコース濃度が含まれる。
低酸素
本明細書では、「低酸素」という用語は、脊椎動物又はその血液中の通常より低量の二酸素の存在をいう。炎症組織、及び充実性腫瘍、特に壊死領域は、低い酸素分圧（＜１％酸素）又は酸素の不適切な供給を有する可能性が高い。低い酸素分圧を有するこれらの組織は、低酸素組織と呼ばれる。したがって、「低酸素」という用語には、低酸素及び炎症部位の両方が含まれる。
低酸素は、広範囲の種々の細胞型において遺伝子発現の強力な調節因子であり（Ｗａｎｇ及びＳｅｍｅｍｎｚａ、１９９３、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：４３０４）、同種ＤＮＡ認識部位に結合する低酸素誘導性因子１（ＨＩＦ−１）（Ｗａｎｇ及びＳｅｍｅｍｎｚａ、１９９３、前出）、ＧＡＰＤＨ及びＶＥＧＦなどの種々の遺伝子プロモーターの低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）などの低酸素誘導性転写因子の活性の誘導によって作用し、その遺伝子の発現をアップレギュレートする。例として、Ｄａｃｈｓ等（１９９７、前出）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏ充実性腫瘍内部で低酸素に応答するヒト線維肉腫細胞によるマーカー遺伝子及び治療遺伝子両方の発現を制御するために、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ−１）遺伝子由来の多量体型ＨＲＥ（Ｆｉｒｔｈ等、１９９４、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：６４９６）を用いた（Ｄａｃｈｓ等、１９９７、前出）。
ＨＩＦ−１の核蓄積は、他の転写因子に比べて遅く（Ｋａｌｌｉｏ等、Ｅｍｂｏ Ｊ、１９９８、１７：６５７３〜８６）、ＨＩＦ／ＨＲＥ依存性遺伝子のアップレギュレーションは数時間を要することもあり（Ｓｅｍｅｎｚａ、Ｇ．等、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９４、２６９：２３７５７〜６３）、核因子κＢ及び核因子ＩＬ−６もいくつかの細胞型の低酸素応答に関係があるとされており（Ｒｏｙｄｓ等、Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ、１９９８、５１：５５〜６１、Ｍａｔｓｕｉ等、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ、１９９９、４２：１０４〜１２、Ｙａｎ等、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９７、２７２：４２８７〜９４）、ｂＺＩＰ（塩基性／ロイシンジッパー領域）転写因子クラスのいくつかのメンバーの誘導が無酸素中に線維芽細胞に見られる（Ｅｓｔｅｓ等、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、１９９５、２２０：４７〜５４）。
或いは、腫瘍の虚血領域に顕著なグルコース欠乏も存在するという事実は、低グルコースレベルを用いて、特に腫瘍において異種遺伝子発現を活性化できることを意味している。グルコース欠乏によって特異的に活性化されることが知られているｇｒｐ７８遺伝子プロモーターの末端切断型６３２塩基対配列も、ｉｎ ｖｉｖｏマウス腫瘍においてレポーター遺伝子の高レベルの発現を駆動できることが示されている（Ｇａｚｉｔ等、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：１６６０）。
表現型変化
本発明は、標的細胞とコントロール細胞との間の表現型の相違を検出することを含む。コントロール細胞は、本発明の方法を開始する前の標的細胞であることができ、すなわちこの実施形態において、独立したコントロール細胞は存在せず、標的細胞がモジュレート部分を導入される前後に、標的細胞の表現型の特性が観察される。
本出願人等は、「表現型」という用語を通常の意味で用い、すなわち、その遺伝子構成及び環境の相互作用によって決定される生物の観察可能な機能及び構造的特性である。
本発明は、任意の特定の機能又は構造的特性に限定されない。以下は単に例として示される。
適切な一般的及び特定的表現型スクリーニングには、眼底撮影法、血圧、行動分析、Ｘ線透視、２重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）、ＣＡＴスキャン、全血球算定（ＣＢＣ）、尿検査、血液化学、インスリンレベル、グルコース耐性、蛍光活性化細胞分離（ＦＡＣＳ）、磁気細胞分離技術（ＭＡＣＳ）、ＦＲＥＴ、組織病理学、発現データ、発生生物学の使用が含まれる。
表現型の相違は、細胞死である可能性がある。壊死及びアポトーシスを研究するために、細胞傷害アッセイを用いることができる。細胞傷害アッセイは、主として２種類である。死細胞は漏出性となるので、放射性及び非放射性アッセイは、原形質膜の透過性の増大を測定する。死細胞のミトコンドリアは色素を代謝することができないので、比色アッセイは、ミトコンドリアの代謝活性の低減を測定する。アポトーシスのアッセイには、以下のアポトーシスパラメータの１つを測定できるものが含まれる。集団又は個別細胞におけるＤＮＡの断片化、膜対称性の変化（ホスファチジルセリンが細胞膜の細胞質側から細胞外側に移動する）、アポトーシスカスパーゼの活性化（このタンパク質ファミリーが、多くの細胞機能の不能にする事象のカスケードを始動する）、ミトコンドリアによるシトクロムＣ及びＡＩＦの細胞質への放出である。
細胞集団においてアポトーシスを研究するための方法では、細胞の２つの主要なアポトーシス事象に重点が置かれてきた。１）アポトーシス及び細胞性細胞傷害は、ゲノムＤＮＡの離散フラグメントへの切断によって特徴づけられる。このＤＮＡフラグメントは、たとえばＡｐｏｐｔｏｔｉｃ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ Ｋｉｔを用いて、又はＥＬＩＳＡによるヒストン複合ＤＮＡフラグメントの定量によって、細胞集団由来の「はしご」（はしごの「段」として１８０ｂｐの倍数を有する）としてアッセイすることができる。２）カスパーゼ活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを含む種々の方法で分析することができる。特定のカスパーゼ、たとえばカスパーゼ３の活性は、カスパーゼを捕捉し、適切な基質のタンパク質分解性切断を測定することにより細胞溶解産物において、及びｉｎ ｖｉｖｏカスパーゼ基質の切断を検出することによって求めることができる。たとえば、カスパーゼ３は、初期ステップで活性化される。基質ＰＡＲＰ（ポリ−ＡＤＰ−リボース−ポリメラーゼ）及び切断フラグメントは、抗ＰＡＲＰ抗体によって検出することができる。
個別細胞においてアポトーシスを研究する方法は、１）ＤＮＡ断片化に重点が置かれている。ＤＮＡ鎖切断を評価するために用いられる方法は、細胞ＤＮＡの標識及び／又は染色に基づいている。標識／染色されたＤＮＡは、その後、フローサイトメトリ、蛍光顕微鏡検査、又は光学顕微鏡検査によって分析される。アポトーシス細胞のＤＮＡを同定するために、一般的に２つの異なる標識法が用いられる。細胞ＤＮＡを、外因性酵素（たとえばターミナルトランスフェラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて修飾ヌクレオチド（ｍｕｃｅｌｔｏｉｄｅ）（たとえばビオチン−ｄＵＴＰ、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ）で標識する酸素標識法。この標識法は、広範なＤＮＡ鎖切断を検出する。酵素標識技法には、いわゆるＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ媒介Ｘ−ｄＵＴＰニック末端標識）酵素標識化アッセイ、及びＩＳＮＴ（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｎｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）（ｉｎ ｓｉｔｕニック翻訳）技法が含まれる。２）さらに、個々の細胞死は、原形質膜の変化を測定するアッセイによって研究することもできる（膜が収縮し、次第に回旋状になるために生じる個々の細胞膜の対称性又は透過性の変化）。たとえば、アポトーシス中、ホスファチジルセリンは膜の細胞質側から細胞外側に移動し、アネキシンＶで検出することができる。
細胞傷害を測定するアッセイは、一般に、原形質膜透過性の変化、及びその結果として生じる上清への成分の放出（漏出）、又は通常は生存細胞によって排除される色素の取り込みに基づいている。或いは、死細胞は、種々のテトラゾリウム塩を代謝することができない。これにより、細胞生存を測定するために、ＭＴＴ、ＸＴＴ、又はＷＳＴ−１などの比色アッセイを使用することが可能になる。
個々の細胞の生存及び増殖は、標準的な顕微鏡検査法によって評価できる。たとえば、細胞を、生染色又は色素排除によって処理し、血球計で直接に算定することができる。細胞が、ＤＮＡを結合する蛍光色素（ＤＮＡ蛍光色素）で異なって染色される場合、同じ細胞パラメータをフローサイトメトリによって判定することができる。増殖を観察するアッセイには、ＤＮＡ合成を測定するアッセイ、すなわち標識化ＤＮＡ前駆体を細胞培養に添加し、分裂間近である細胞はこの前駆体をＤＮＡに取り込むアッセイ、及び細胞周期関連抗原の発現をモニターするアッセイが含まれる。細胞周期を調節する分子は、それらの活性（たとえばＣＤＫキナーゼアッセイ）によって、又はそれらの量の定量化（たとえばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、又は免疫組織化学）によって測定される。
表現型の相違は、たとえば標的細胞の血清学的特性、大きさ、形状、色、におい、質感、培地への付着程度から明らかな、形態の変化であることができる。
寒天ベースのアッセイは、利便性及びハイスループットを提供し、特に試験化合物の効力及び有効性に関する質的評価を提供する。したがって、表現型の相違は、軟寒天において増殖する細胞の能力であることができる。
表現型の相違は、細胞の分化する能力であることができる。細胞の分化する能力は、培養において表面への細胞の付着によって判定することができる。
表現型の相違は、薬剤、たとえばシスプラチン、ドキソルビシン、タキソール、カンプトテシン、ダウノルビシン、及びメトトレキサートからなるグループから選択された薬剤に対する耐性であることができる。
表現型の相違は、レポーター遺伝子又はｃＤＮＡの転写又は発現の相違であることができる。好ましい一実施形態において、表現型の相違は、その調節を改変することが所望される遺伝子に結合したレポーター遺伝子の発現レベルの変化であることができる。
スクリーニングは、細胞周期の適切なステップで行うことができる。
本発明の範囲内で、２次２次スクリーニングを用いることもでき、たとえば酵母２−ハイブリッドベクターである。
レポーターベース構築物
この原理は、遺伝子の発現がその転写プロモーターに制御されているという仮設に基づいている。レポーター遺伝子発現（ＥＧＦＰなど）のレベルは、その特定の遺伝子のＲＮＡの内因性レベルに相関している可能性がある。細胞は、その特定の遺伝子の発現レベルの変化に関して機能的に選択することができる。たとえば、レポーター遺伝子のレベルは、リボザイムライブラリー形質導入細胞及び非形質導入細胞において比較することができる。選択されたリボザイムが選択された遺伝子プロモーター媒介遺伝子発現を増大させ、レポーター遺伝子のレベルを上昇させる細胞を選択することができる。
特定のリボザイムの配列は、推定標的遺伝子を同定するために用いることができる。したがって、リボザイムをベースとする選択系を用いて、特定プロモーター駆動レポーター系のモジュレーターを標的にし、同定することができる。このアプローチは、特定の表現型に関与する主要な細胞因子を標的にするリボザイムの機能的選択を可能にする。さらに、このアプローチは、特定のプロモーターだけでなく、生物学的に関連のある任意の上流の調節因子を直接調節する遺伝子の同定を可能にする。
レポーター遺伝子の構築
レポーター遺伝子は、当分野で知られている標準的な技法に従って構築することができる。一般に、このレポーターは、選択された調節配列に非相同なコード配列であるか（下記参照）、通常は選択された調節配列に結合しているコード配列の発現を検出可能にするような修飾であることができ、場合によっては、その配列の発現が検出可能な事象をもたらす場合、通常は選択された調節配列に結合している天然コード配列をレポーター遺伝子として用いることができる。
レポーター遺伝子は、ＬＴＰ誘導に関連する事象によって、直接又は間接的に誘導されることができる。すなわち、ＬＴＰに関連する前初期遺伝子の発現を、レポーター遺伝子の発現を誘導する第２のシグナルとして用いることができる。このことは、いくつかの前初期遺伝子産物が、ｚｉｆ−２６８などの転写因子であるか、そうでなければ遺伝子転写の調節に関与するという事実によって促進される。この場合、レポーター遺伝子は、前初期遺伝子産物の発現に応答性の配列に、機能しうる形で連結している。たとえば、このレポーター遺伝子は、ｚｉｆ−２６８応答性エンハンサーの制御下にあることができ、又はＣＲＥを含むことができる。
本発明の好ましい態様において、レポーター遺伝子は、ＤＮＡの複製、及び／又は細胞の一過性又は永続性形質転換及びレポーター遺伝子の発現のために設計されたベクターに組み込むことができる。
本明細書では、ベクター（プラスミド）は、その発現又は複製のために、細胞に異種ＤＮＡを導入するために用いられる離散エレメントをいう。そのようなビヒクルの選択及び使用は、充分に技術者の技術の範囲内である。多くのベクターが入手可能であり、適切なベクターの選択は、そのベクターの使用目的、すなわちＤＮＡ増幅又はＤＮＡ発現に用いられるのかによって、そのベクターに挿入されるＤＮＡの大きさ、及びそのベクターで形質転換される宿主細胞によって決まる。それぞれのベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅又はＤＮＡの発現）、及びそれが適合する宿主細胞に応じて、様々な成分を含有する。ベクター成分には一般的に、これに限定されるものではないが、複製起点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終止配列、及びシグナル配列の１つ又は複数が含まれる。
発現ベクター及びクローニングベクターは共に、一般に１つ又は複数の選択された宿主細胞におけるベクターの複製を可能にする核酸配列を含有する。典型的にクローニングベクターでは、この配列は、宿主染色体ＤＮＡから独立したベクターの複製を可能にする配列であり、複製起源、又は自己複製配列を含む。そのような配列は、様々な細菌、酵母、及びウイルスに関してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点はほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２プラスミド起点は、酵母に適しており、種々のウイルス起点（たとえばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス）は、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般に複製起点成分は、ＣＯＳ細胞など高レベルのＤＮＡ複製に適した哺乳動物細胞で用いられるのでない限り、哺乳動物発現ベクターには必要でない。
ほとんどの発現ベクターはシャトルベクターであり、すなわち少なくとも１つのクラスの生物において複製することができるが、発現のために別のクラスの生物にトランスフェクトされ得る。たとえば、あるベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉでクローニングされ、その後、宿主細胞染色体から独立して複製することができないにもかかわらず、同じベクターが酵母又は哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。或いは、ＤＮＡはＰＣＲによって増幅し、複製成分なしに、直接宿主細胞にトランスフェクトすることができる。
有利には、発現ベクター及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有することができる。この遺伝子は、選択培地で増殖した形質転換宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、この培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質及び他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンに対する耐性を付与する、栄養素要求性欠損を補足する、又は複合培地から利用可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
酵母に適切な選択遺伝子マーカーに関しては、マーカー遺伝子の表現型発現により、形質転換体の選択を容易にする任意のマーカー遺伝子を用いることができる。酵母に適切なマーカーは、たとえば、抗生物質Ｇ４１８、ハイグロマイシン、又はブレオマイシンに対する耐性を付与する、又は栄養素要求性酵母変異株に原栄養体性を提供するものであり、たとえばＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＴＲＰ１、又はＨＩＳ３遺伝子である。
ベクターの複製はＥ．ｃｏｌｉにおいて都合よく行われるので、有利にはＥ．ｃｏｌｉ遺伝マーカー及びＥ．ｃｏｌｉ複製起点が含まれる。それらはＥ．ｃｏｌｉプラスミド、たとえばｐＢＲ３２２、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（著作権）ベクター、又はｐＵＣプラスミド、たとえばｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９から得ることができ、これらはＥ．ｃｏｌｉ複製起点、及びアンピシリンなどの抗生物質に対する耐性を付与するＥ．ｃｏｌｉ遺伝マーカーの両方を含有する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーは、ベクターを取り込んだ細胞を同定できるものであり、たとえばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ、メトトレキサート耐性）、チミジンキナーゼ、或いはＧ４１８又はハイグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子などである。哺乳動物細胞形質転換体は、マーカーを取り込み、発現している形質転換体のみが独自に生存するように適合される淘汰圧下に置かれる。ＤＨＦＲ、又はグルタミンシンターゼ（ＧＳ）マーカーの場合、圧力が徐々に増加し、それによって選択遺伝子、及びレポーター遺伝子をコードする結合ＤＮＡ両方の増幅をもたらす（染色体組込み部位において）条件下で形質転換体を培養することによって、淘汰圧を負荷することができる。増幅は、それによって増殖に重要なタンパク質の生産のために大きな需要のある遺伝子が、所望のタンパク質をコードする可能性のある密接に関連する遺伝子と共に、組換え細胞の染色体内部で縦列に反復される過程である。増量した所望のタンパク質は、通常、このように増幅ＤＮＡから合成される。
発現ベクター及びクローニングベクターは、一般に、宿主生物によって認識され、レポーター構築物に機能しうる形で連結しているプロモーターを含有する。そのようなプロモーターは、誘導性又は構成性であるが、いずれの場合でも本明細書に定義した調節配列による調節を受ける。供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、単離プロモーター配列をベクターに挿入することによって、プロモーターはレポーター遺伝子をコードするＤＮＡに機能可能に結合することができる。通常はレポーターに結合している天然プロモーター配列、及び多くの異種プロモーターの両方を、レポーター遺伝子の発現を方向づけるために用いることができる。「機能可能に結合」という用語は、記載の成分が意図する様式で機能することを可能にするような関係にある並置をいう。コントロール配列に適合する条件下でコード配列の発現が得られるような方法で、コード配列に「機能しうる形で連結された」コントロール配列を連結する。
好ましくは、プロモーターはそれ自体、ＬＴＰに関連する事象によるモジュレーションに応答性である。したがって、プロモーターは、その発現がＬＴＰに関連してモジュレートされる遺伝子から誘導されるプロモーターであることができ、或いはその発現がＬＴＰに関連してモジュレートされる遺伝子の遺伝子産物によってモジュレートされるプロモーターであることもできる。
高等真核生物によるレポーター遺伝子の転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによってモジュレートすることができる。これにより、通常はＬＴＰ誘導に関連する事象に応答性でないプロモーターを応答性にすることが可能になる。エンハンサーは、比較的に配向性であり、位置非依存性である。多くのエンハンサー配列が、ＬＴＰ関連モジュレーションを受ける前初期遺伝子から知られており、必要に応じて、当分野の技術者によって選択され得る。
真核生物発現ベクターは、転写を終止し、ｍＲＮＡを安定化するために必要な配列を含有することもできる。そのような配列は一般に、真核生物又はウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び３’非翻訳領域から得ることができる。これらの領域は、レポーター遺伝子をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化フラグメントに転写されたヌクレオチド断片を含有する。
発現ベクターには、本明細書に記載したレポーター遺伝子を発現することのできる任意のベクターが含まれる。したがって発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入されたときに、クローンＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、又は他のベクターなどの組換えＤＮＡ又はＲＮＡ構築物をいう。適切な発現ベクターは、当分野の技術者によく知られており、真核生物及び／又は原核生物細胞において複製可能であるもの、並びにエピソームのままであるもの、又は宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが含まれる。たとえば、レポーター遺伝子をコードするＤＮＡを、哺乳動物細胞におけるｃＤＮＡの発現に適したベクターに挿入することができ、たとえばｐＥＶＲＦなどのＣＭＶエンハンサーベースベクターである（Ｍａｔｔｈｉａｓ等（１９８９）ＮＡＲ １７、６４１８）。
本発明の実施に有用であるのは、哺乳動物細胞においてレポーター遺伝子をコードするＤＮＡの一過性発現を提供する発現ベクターである。一過性発現は、通常、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、そのように刺激されたとき、順に高いレベルのレポーター遺伝子を合成するように、宿主細胞において効率的に複製することのできる発現ベクターの使用を含む。
本発明によるベクターの構築は、通常の連結技法を用いる。必要なプラスミドを生産するために、単離プラスミド又はＤＮＡフラグメントを、所望の形態に切断し、適合させ、再び連結する。所望であれば、構築されたプラスミド中の正しい配列を確認するための分析を、既知の様式で行う。発現ベクターを構築し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を調製し、ＤＮＡを宿主細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現及び機能を評価するために分析を行うのに適した方法は、当分野の技術者に知られている。遺伝子の存在、増幅、及び／又は発現は、本明細書に提供されている配列に基づいていることのできる適切に標識されたプローブを用いて、たとえば通常のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するノザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、サンプル中で直接測定することができる。当分野の技術者は、所望であれば、これらの方法をどのように変更できるかを容易に構想できるであろう。
増幅
本発明のさらなる態様によれば、この方法は、遺伝因子を増幅するさらなるステップを含む。所望の遺伝子産物をコードする遺伝因子を富化する手段として、選択的増幅を用いることができる。
上述のすべての構造において、遺伝エレメントに含まれる遺伝物質は増幅され、このプロセスは反復ステップで繰り返されることができる。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉ等、１９８８）、又はＱレプリカーゼ増幅（Ｃａｈｉｌｌ、Ｆｏｓｔｅｒ、及びＭａｈａｎ、１９９１、Ｃｈｅｔｖｅｒｉｎ及びＳｐｉｒｉｎ、１９９５、Ｋａｔａｎａｅｖ、Ｋｕｒｎａｓｏｖ、及びＳｐｉｒｉｎ、１９９５）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等、１９８８、Ｂａｒａｎｙ、１９９１）、自立配列複製系（Ｆａｈｙ、Ｋｗｏｈ、及びＧｉｎｇｅｒａｓ、１９９１）、並びに鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒ等、１９９２）を含む他の様々な遺伝子増幅技法の１つの使用によることができる。
細胞の形質転換
本発明によるアッセイを行うのに適切な細胞は、好ましくは、多細胞生物由来の高等真核生物細胞であり、有利には哺乳動物細胞である。好ましい細胞型は神経細胞であり、神経系統の細胞の初代培養物、又は神経系統の不朽化細胞系であることができる。
細胞は、当分野で利用可能な任意の適切な技法によって形質転換することができる。リン酸カルシウム沈殿及びエレクトロポレーションなどのいくつかの技法が、参照により本明細書の一部とするＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒに記載されている。好ましい細胞数は、約１から約５×１０５個、又は約２×１０２から約５×１０４個である。これらの方法において、試験される分子の所定の量又は濃度は、典型的にサンプルの量に基づくか、或いは約１．０ｐＭから約２０μＭ、又は約１０ｎＭから約５００μＭである。
本発明はさらに、たとえば前核マイクロインジェクションによって、又は確立された技法に従ってＥＳ細胞キメラを調製することによって調製可能なトランスジェニック動物におけるアッセイの実施を包含する。
細胞の試験化合物への暴露
典型的に接触は、約１から約２４時間、好ましくは約２から約１２時間行われる。さらに、接触は典型的に、試験される分子の複数の所定量で行われる。これらの方法において、試験される分子は、精製分子、分子の混合物、又は均質サンプルであり得る。
アッセイされる細胞又は組織は、好ましくは暴露の期間、試験化合物、或いはハンク平衡食塩水（ＨＢＳＳ）などの等張食塩水、又は人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中の混合物と共にインキュベートされる。試験化合物は、単純な添加、好ましくは試験される化合物を含む「増強培地」との置換によって細胞に添加することができる。その後この培地は、有利には、問題の細胞型の増殖を支持する培地と交換される。神経細胞の場合、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）などの神経増殖培地を用いることができる。次いで、細胞は、下記に記載のとおりレポーター遺伝子発現に関してアッセイされる。
化合物、又は化合物の混合物は、有利には、ハイスループットスクリーニングアッセイにおいて細胞に接触させる。したがって、いくつかの試験系を、同時に異なる化合物、又は化合物の混合物、或いは異なる量の化合物又は混合物と接触させることができる。化合物の添加の影響は、本発明によって用いられる試験系のために選択された検出可能シグナルを追跡することによって測定される。
ＬＴＰは化学的手段又は他の手段で誘導され、ＬＴＰのモジュレーションにおける試験化合物の活性は、本発明のアッセイによってモニターされる。たとえば、ＬＴＰは以下に記載のとおり化学的に、又は培養細胞の電界電気的刺激によって誘導することができる。細胞をマルチウェルプレートに配置し、グリッドを用いて刺激して適切な電場を供給し、ＬＴＰ誘導を記載のとおり光学スクリーニングによって測定することができる。
検出可能シグナルの生成
検出可能シグナルは、本発明の方法に用いられるレポーター遺伝子の性質に応じて、いくつかの方法のうち任意の１つの方法で生成することができる。たとえば、検出可能シグナルは、発光性シグナル、たとえばＧＦＰなどの蛍光シグナルとすることができる。ＧＦＰは、基質又は補助因子を必要とせずに蛍光シグナルを生成する蛍光ポリペプチドである。ＧＦＰの発現及び検出技法は当分野でよく知られており、キットは、たとえばＣｌｏｎｔｅｃｈから市販され入手可能である。ＧＦＰの発現は、細胞を溶解したり、さらなる試薬を添加したりする必要なしに、無傷細胞でアッセイすることができる。或いは、検出可能シグナルは、酵素活性、又は細胞表面マーカー、たとえばＬＮＧＦＲの認識の結果として発生したシグナル、或いは抗生物質選択後、又は自殺遺伝子の活性化によって、たとえばＴＫを発現する細胞へのＧＣＶの添加によって発生したシグナルであることができる。
ルシフェラーゼは、アッセイのベースとして用いることもできる。ルシフェラーゼの発現は当分野で知られており、キットはＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から市販され入手可能である。ルシフェラーゼの存在は、有利には、細胞を溶解し、細胞へルシフェリン基質を添加し、その後、シンチレーション計数法によって発光シグナルをモニターすることにより評価される。
酵素ベースのアッセイは、検出が必ずしも発光によらないことを除いて、ルシフェラーゼベースのアッセイと類似の方法で行われる。検出技法はその酵素によって決まり、したがって光学であってもよい（β−ガラクトシダーゼの場合など）。
可能な経路調節性成分
本明細書では、「転写調節制御エレメント」という用語には、これに限定されるものではないが、転写因子に結合し、正（誘導）又は負（抑制）の方向に遺伝子プロモーターを結合し、その活性を改変するエレメントが含まれる。例として、「ストレス応答性エレメント」又は「ストレス応答性調節エレメント」は、環境ストレスに応答して細胞によって活性化された転写因子に結合する調節エレメントである。
可能なプロモーター
調節制御エレメントの他の例には、これに限定されるものではないが、組織特異的プロモーター、誘導プロモーター、生理的調節プロモーター、又は他の種類の任意の最適化プロモーターが含まれる。これらのプロモーターエレメントは、天然由来プロモーターエレメント、又は合成プロモーターエレメントであることができる。合成プロモーターエレメントは、Ｅｄｅｌｍａｎ等（（２０００）前出）に概説されている新しい合成プロモーター構築法（ＳＰＣＭ）によって調製することができる。
本発明のコントロール配列は、たとえば、さらなる転写調節エレメントを添加して、コントロール配列に方向づけられる転写のレベルを転写モジュレーターに対してより応答性にすることによって修飾することができる。
対象となるプロモーターをコードするヌクレオチド配列は、対象となるレポーターをコードするヌクレオチド配列に機能しうる形で連結している。
機能可能に結合
「機能可能に結合」という用語は、記載の成分が意図する様式で機能することを可能にするような関係にあることを意味する。レポーター配列に「機能しうる形で連結された」調節配列を含むライブラリーは、コントロール配列に適合する条件下で核酸レポーター配列の発現が得られるような方法で連結される。
プロモーター
プロモーターという用語は当分野でよく知られており、当分野の通常の意味で、たとえばＲＮＡポリメラーゼ結合部位として用いられる。この用語は、最小プロモーターから、上流エレメント及びエンハンサーを含むプロモーターにわたる大きさ及び複雑性の核酸領域を包含する。
プロモーターは、典型的に哺乳動物細胞で機能性であるプロモーターから選択されるが、他の真核生物細胞で機能性のプロモーターも用いることができる。プロモーターは、典型的にウイルス又は真核生物遺伝子のプロモーター配列に由来する。たとえば、プロモーターは、発現が生じる細胞のゲノム由来のプロモーターであることができる。真核生物プロモーターに関しては、これらは偏在様式（たとえばαアクチン、βアクチン、チューブリンのプロモーターなど）、或いは組織特異的様式（ピルビン酸キナーゼの遺伝子のプロモーターなど）で機能するプロモーターであることができる。
好ましくは、プロモーターは、修飾Ｈ５又はｓＥ／Ｌプロモーターである（Ｃａｒｒｏｌｌ、ＭＷ、ＧＷ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、及びＫ Ｌｕｎｓｔｒｏｍ、２００１、Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ、ＣＪ Ｒｉｎｇ及びＥＤ Ｂｌａｉｒ編、１０７〜１５７頁、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫを参照）。
好ましくは、プロモーターは、タンパク質最大生産に用いられる初期後期プロモーターであり、これにより抗体同定プロセス中の最適感受性が可能になる。
１つの好ましいプロモーター−エンハンサー組み合わせは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）主要前初期（ＭＩＥ）プロモーター／エンハンサー組み合わせである。
好ましくは、このプロモーターは、Ｄａｖｉｓｏｎ及びＭｏｓｓ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８９、２１０：７４９〜７６９）のデータを用いて設計される。
特定のプロモーターの制御下のヌクレオチド配列発現のレベルは、プロモーター領域を操作することによってモジュレートすることができる。たとえば、プロモーター領域内の異なるドメインは、異なる遺伝子調節活性を持つことができる。これらの異なる領域の役割は、典型的には、特定の領域が欠失したプロモーターの種々の変異体を有するベクター構築物を用いて評価される（すなわち、欠失分析）。
好ましくは、プロモーターは、低酸素調節プロモーターである。
好ましくは、低酸素調節プロモーターは、細胞特異的低酸素調節プロモーターである。
好ましくは、低酸素調節プロモーターは、特定の細胞型に最適な既知のＤＮＡ結合部分の組み合わせから誘導される。
エンハンサー／プロモーターは、宿主細胞が虚血性条件などのある種の条件下で培養されるとき、低酸素、又は虚血、又は低グルコース環境で主に活性であり得る。エンハンサーエレメント、又は発現を調節する他のエレメントは、複数のコピーに存在することができる。エンハンサー／プロモーターは、宿主細胞が虚血性条件などのある種の条件下で培養されるとき、低酸素、又は虚血、又は低グルコース環境で主に活性であり得る。エンハンサーエレメント、又は発現を調節する他のエレメントは、複数のコピーに存在することができる。
同様に、又はそれに加えて、エンハンサー及び／又はプロモーターは、１つ又は複数の特定の宿主細胞型、たとえば任意の１つ又は複数のマクロファージ、内皮細胞、又はそれらの組み合わせなどにおいて主に活性であり得る。
好ましくは、組織特異的プロモーターは、心筋細胞プロモーターである。
好ましくは、組織特異的プロモーターは、マクロファージプロモーターである。
適切な組織制限プロモーター／エンハンサーの例には、これに限定されるものではないが、腫瘍細胞において活性の高いもの、たとえばＭＵＣ１遺伝子、ＣＥＡ遺伝子、又は５Ｔ４抗原遺伝子のプロモーター／エンハンサーなどである。一時的制限プロモーター／エンハンサーの例は、虚血及び／又は低酸素に応答性のもの、たとえば低酸素応答エレメント、或いはｇｒｐ７８又はｇｒｐ９４遺伝子のプロモーター／エンハンサーなどである。アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターも、腫瘍特異的プロモーターである。
好ましくは、本発明のプロモーターは、組織特異的である。
「組織特異的」という用語は、単一の組織型に対する活性に限定されないが、ある群の組織で活性であり、別の群ではあまり活性でない又はサイレントであり得る点で選択性を示すプロモーターを意味する。本発明のプロモーターの望ましい特性は、活性化低酸素調節エンハンサーエレメントの不在下で比較的低い活性を有することである。これを達成する一手段は、低酸素の不在下で選択されたプロモーターの活性を抑制する「サイレンサー」エレメントを用いることである。
特定のプロモーターの制御下の１つ又は複数の対象となるヌクレオチド配列発現のレベルは、プロモーター領域を操作することによってモジュレートすることができる。たとえば、プロモーター領域内の異なるドメインは、異なる遺伝子調節活性を持つことができる。これらの異なる領域の役割は、典型的に、特定の領域が欠失したプロモーターの種々の変異体を有するベクター構築物を用いて評価される（すなわち、欠失分析）。このアプローチは、たとえば組織特異性を付与できる最小領域、又は低酸素感受性を付与する最小領域を同定するために用いることができる。
上述のいくつかの組織特異的プロモーターは、本発明の実施に特に有利である可能性がある。ほとんどの場合、これらのプロモーターは、選択されたベクターにおけるクローニングに適した好都合な制限消化フラグメントとして単離することができる。或いは、プロモーターフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて単離することができる。増幅されたフラグメントのクローニングは、プライマーの５’末端に制限部位を組み込むことによって容易にすることができる。
好ましくは、虚血応答性プロモーターは、組織制限虚血応答性プロモーターである。
好ましくは、組織制限虚血応答性プロモーターは、抑制によって制限されたマクロファージ特異的プロモーターである。
好ましくは、組織制限虚血応答性プロモーターは、内皮特異的プロモーターである。
好ましくは、本発明の組織制限虚血応答性プロモーターは、ＩＬＲＥ応答性プロモーターである。
たとえば、ｇｒｐ７８及びｇｒｐ９４などのグルコース調節タンパク質（ｇｒｐ）は、グルコース欠乏によって誘導されることが知られている高度に保存されたタンパク質である（Ａｔｔｅｎｅｌｌｏ及びＬｅｅ、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６、１８７〜１９０）。ｇｒｐ７８遺伝子は、基底レベルのプロモーターエレメントの影響下、ほとんどの正常な健常組織において低レベルで発現されるが、ＴＡＴＡエレメントの上流に少なくとも２つの重要な「ストレス誘導性調節エレメント」を有する（Ａｔｔｅｎｅｌｌｏ、１９８４、前出、Ｇａｚｉｔ等、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：１６６０〜１６６３）。ｇｒｐ７８プロモーターの５’末端の末端切断型６３２塩基対配列への付加は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてレポーター遺伝子にグルコース欠乏への高い誘導性を付与する（Ｇａｚｉｔ等、１９９５、前出）。さらに、レトロウイルスベクター中のこのプロモーター配列は、マウス線維肉腫、特に中央の比較的虚血性／線維症性部位の腫瘍細胞においてレポーター遺伝子の高レベルの発現を駆動することができた（Ｇａｚｉｔ等、１９９５、前出）。
好ましくは、選択された生理的調節プロモーターエレメントは、熱ショックプロモーターエレメントである。
好ましくは、選択された生理的調節プロモーターエレメントは、放射線エレメントである。
好ましくは、選択された生理的調節プロモーターエレメントは、虚血エレメントである。
エンハンサー
さらに、本発明のこれらのプロモーターは、さらなる調節配列、たとえばエンハンサー配列を付加することによって修飾することができる。上述の２つ以上の異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターを用いることもできる。
「エンハンサー」という用語には、転写開始複合体の他のタンパク質成分に結合し、それによって結合プロモーターによって導かれる転写の開始を促進するＤＮＡ配列が含まれる。
適切な組織制限プロモーター／エンハンサーの他の例は、ＭＵＣ１遺伝子、ＣＥＡ遺伝子、又は５Ｔ４抗原遺伝子のプロモーター／エンハンサーなど、腫瘍細胞において活性の高いものである。アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターも、腫瘍特異的プロモーターである。１つの好ましいプロモーター−エンハンサー組み合わせは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）主要前初期（ＭＩＥ）プロモーター／エンハンサー組み合わせである。
好ましいエンハンサーは、低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）である。
ＨＲＥ
上述のように、低酸素は、広範囲の種々の細胞型において遺伝子発現の強力な調節因子であり、同種ＤＮＡ認識部位に結合する低酸素誘導性因子１（ＨＩＦ−１、Ｗａｎｇ及びＳｅｍｅｎｚａ、１９９３、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、９０：４３０）、種々の遺伝子プロモーターの低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）などの低酸素誘導性転写因子の活性の誘導によって作用する。Ｄａｃｈｓ等（１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ５：５１５）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏ充実性腫瘍内部で低酸素に応答するヒト線維肉腫細胞によるマーカー遺伝子及び治療遺伝子両方の発現を制御するために、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ−１）遺伝子由来の多量体型ＨＲＥ（Ｆｉｒｔｈ等、１９９４、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、９１：６４９６〜６５００）を用いた（Ｄａｃｈｓ等、前出）。
低酸素応答エンハンサーエレメント（ＨＲＥＥ）も、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）遺伝子を含むいくつかの遺伝子に関連して見出されている（Ｍａｄａｎ等、１９９３、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９０：３９２８、Ｓｅｍｅｎｚａ及びＷａｎｇ、１９９２、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９９２、１２：５４４７〜５４５４）。他のＨＲＥＥは、筋肉解糖酵素ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）遺伝子（Ｔａｋｅｎａｋａ等、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：２３６３〜２３６７）、ヒト筋肉特異的βエノラーゼ遺伝子（ＥＮＯ３、Ｐｅｓｈａｖａｒｉａ及びＤａｙ、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２７５：４２７〜４３３）、及びエンドセリン−１（ＥＴ−１）遺伝子（Ｉｎｏｕｅ等、１９８９、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１４９５４〜１４９５９）の調節領域から単離されている。
好ましくは、本発明のＨＲＥは、たとえばエリスロポイエチンＨＲＥエレメント（ＨＲＥＥ１）、筋肉ピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）、ＨＲＥエレメント、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）ＨＲＥ、β−エノラーゼ（エノラーゼ３、ＥＮＯ３）ＨＲＥエレメント、エンドセリン１（ＥＴ−１）ＨＲＥエレメント、及びメタロチオネインＩＩ（ＭＴＩＩ）ＨＲＥエレメントから選択される。
作用物質
本発明の候補標的部分及び／又はモジュレート部分の発現及び／又は検出は、その候補部分を直接又は間接的に認識することのできる作用物質を用いて行うことができる。作用物質には、これに限定されるものではないが、被験体から得たサンプル又は動物から得たサンプル、或いは組織のサンプル又は体液のサンプルを含み得るサンプルを含むことができるが、これに限定されない。
本明細書では、「組織」という用語は、１つの細胞、複数の細胞、細胞の集塊、又は器官全体で構成されている任意の生物物体をいう。組織という用語はさらに、正常又は異常（すなわち腫瘍）であり得る１つ又は複数の細胞を包含する。「体液」は、生物、又は生物の組織から抽出、排泄、又は分泌された任意の液体物質であることができる。体液は必ずしも細胞を含有する必要はない。本発明に関連する体液には、これに限定されるものではないが、全血、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙、及び羊水が含まれる。
結合パートナー（ＢＰ）
本発明の候補標的及び／又はモジュレート部分の発現の検出は、たとえば、本発明のレポーター部分と特異的に反応することのできる結合パートナーの適用によって達成することができる。
好ましくは、結合パートナー（ＢＰ）は、レポーター部分を検出する且つ／又はレポーター部分を発現している１つ又は複数の宿主細胞に結合することのできる１つ又は複数の結合ドメインを含む。したがって、ＢＰは、レポーター部分に対する親和性によって特定の細胞に向けられる。
ＢＰの１つ又は複数の結合ドメインは、たとえばレポーター部分の天然リガンドからなり、天然リガンドは、接着分子、又は増殖因子受容体リガンド（たとえば上皮増殖因子）、或いはレポーター部分に対する結合親和性を保持している天然リガンドのフラグメントであることができる。
或いは、結合ドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）可変領域の重鎖及び軽鎖配列に由来することができる。そのような可変領域は、天然ヒト抗体、又は齧歯類抗体などの別の種の抗体に由来することができる。或いは、可変領域は、ヒト化抗体などの操作された抗体、或いは免疫化又は非免疫化動物のファージディスプレイライブラリー、突然変異ファージディスプレイライブラリーに由来することができる。別の代案として、可変領域は、１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）に由来することができる。ＢＰは、多量体化を達成するために、又は結合ドメイン間のスペーサーとして作用するために、或いはＢＰをコードする遺伝子における制限部位挿入に起因する他の配列を含有することができ、Ｉｇヒンジ配列又は新規のスペーサー、及び操作されたリンカー配列を含む。
ＢＰは、１つ又は複数の免疫グロブリン可変領域に加えて、Ｉｇ重鎖定常領域のすべて又は一部を含むことができ、そのため天然全Ｉｇ、操作されたＩｇ、操作されたＩｇ様分子、１本鎖Ｉｇ、又は１本鎖Ｉｇ様分子を含むことができる。或いは、又はそれに加えて、ＢＰは、毒素などの他のタンパク質由来の１つ又は複数のドメインを含有することができる。
抗体
好ましくは、結合パートナーは抗体である。
本明細書では、「抗体」は、実質的に免疫グロブリン遺伝子、又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにコードされている１つ又は複数のポリペプチドからなるタンパク質をいう。抗体は、無傷免疫グロブリン、又は種々のペプチダーゼによる消化によって生産された特性の明らかなフラグメントを含むいくつかのフラグメントとして存在することができる。種々の抗体フラグメントが無傷抗体の消化に関して定義されているが、技術者は、化学的に、又は組換えＤＮＡ法を用いて初めから抗体フラグメントを合成できることを理解するであろう。したがって本明細書では、抗体という用語はさらに、全抗体の修飾によって生産されるか、又は組換えＤＮＡ法を用いて初めから合成された抗体フラグメントを含む。「抗体」という用語の使用により包含される抗体フラグメントには、これに限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ２重特異性抗体、及びＦｄフラグメントが含まれる。
本発明のレポーター部分に特異的に免疫反応性である抗体は、本発明の他の実施形態である。これらの抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであることができる。これらの抗体は、任意選択で組換えであっても、純粋に合成であってもよい。抗体は、無傷抗体又はフラグメントであることができる。本発明の候補部分に特異的な抗体の調製は、当分野の技術者には通常の手順である。
本発明において、抗体アレイを用いることができる。アレイ上の抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであることができる。アレイ上の抗体は、本発明のレポーター部分に特異的に結合できる無傷抗体、又は抗体のフラグメントであることができる。好ましくは、抗体アレイは、少なくとも４つの異なる抗体、好ましくは約１０を超える異なる抗体を含む。たとえば、レポーター部分の発現を検出及び／又はアッセイする方法は、動物から得た体液又は組織のサンプル、又は抗体アレイを、まず最初に本発明の候補モジュレート部分のライブラリー由来のクローンと接触させるステップを含む。レポーター部分を、動物の組織又は体液サンプル、或いは直接抗体アレイと接触させ、レポーター部分とアレイ上の抗体との結合を検出することができる。或いは、クローンとの接触前に、組織又は体液サンプルを精製して、抗体又はｍＲＮＡ転写物を単離することができる。
好ましくは、抗体は、ポリクローナル抗体である。
好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。
好ましくは、抗体は、高親和性及び高力価である。
抗体が低親和性及び／又は力価である場合、好ましくは、レポーター部分は高レベルで発現される。
標的候補モジュレート部分のスクリーニング
本発明のレポーター部分の発現の直接又は間接検出は、たとえばレポーター部分の発現産物に特異的に免疫反応性である標識抗体を適用することによって達成できる。この抗体は、ヒト又は動物から摘出された組織又は体液サンプルから得ることができる。当分野の技術者に知られている典型的な免疫アッセイの様々な形態をこれに適用することができる。これらのアッセイには、競合アッセイ及び非競合アッセイの両方が含まれる。たとえば、「サンドイッチアッセイ」と呼ばれることもあるアッセイの一様式では、特異的にレポーター部分と反応する固定化抗体を、生物組織又は体液サンプルに接触させる。次いで、固定化レポーター部分抗体複合体の存在は、レポーター部分、又はレポーター部分−抗体複合体に免疫反応性の第２の標識抗体を適用することによって達成できる。本発明の他の実施形態において、ウエスタンブロット様式のアッセイを用いることもできる。
同定された標的及び／又はモジュレート部分の使用
本発明の同定された標的及び／又はモジュレート部分は、調節制御領域及び／又は対象となるヌクレオチド配列（ＮＯＩ）に機能しうる形で連結されたベクターにおいて用いることができる。一実施形態において、本発明の同定された標的及び／又はモジュレート部分は、ベクターをたとえば標的細胞又は標的組織に送達するために、ベクターの調節制御領域及び／又はヌクレオチド配列に機能しうる形で連結していることができる。
医薬組成物
一態様において、本発明は、調節制御領域及び／又はＮＯＩに機能しうる形で連結された同定されたモジュレート部分を含むベクター、及び薬剤として許容される担体、希釈剤、又は賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含む医薬組成物を提供する。
この医薬組成物は、ヒト及び動物医療においてヒト又は動物に用いるものであることができ、典型的に、１種又は複数の薬剤として許容される希釈剤、担体、又は賦形剤を含む。治療上の使用に許容される担体又は希釈剤は、薬学分野でよく知られており、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。薬剤担体、賦形剤、又は希釈剤の選択は、意図する投与経路及び標準的な薬剤実務に関して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、又は希釈剤として、又はそれに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、被覆剤、可溶化剤を含むことができる。
保存剤、安定剤、色素、及び香料添加剤も医薬組成物に提供することができる。保存剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。抗酸化剤及び懸濁化剤も用いることができる。
異なる送達系に応じて異なる組成／製剤要件が存在し得る。例として、本発明の医薬組成物は、ミニポンプを用いて、或いは粘膜経路によって、たとえば吸入又は摂取可能溶液用の鼻腔スプレー又はエアロゾルとして、或いは組成物がたとえば静脈内、筋内、又は皮下経路によって送達するための注射可能形態で製剤化されている非経口によって送達されるように製剤化することができる。或いは、製剤は、両方の経路で送達されるように設計することができる。
医薬組成物が、胃腸粘膜を介して粘膜経路で送達される場合、胃腸管を経て輸送中、安定性が維持できるべきであり、たとえば、タンパク質分解に耐性であり、酸性のｐＨで安定であり、胆汁の洗浄作用に耐性であるべきである。
適切な場合、医薬組成物は、吸入によって、座剤又は膣座剤の形態で、ローション剤、液剤、乳剤、軟膏剤、又は粉剤の形態で局所的に、皮膚パッチの使用により、デンプン又はラクトース又は白亜などの賦形剤を含有する錠剤の形態で、或いは単独又は賦形剤との混合であるカプセル剤又は小卵剤で、或いは香料又は着色剤を含むエリキシル剤、液剤、又は懸濁剤の形態で経口投与することができ、或いは医薬組成物は、たとえば静脈内、筋内、又は皮下によって非経口で注射することができる。非経口投与の場合、この組成物は、たとえば溶液を血液と等張にするのに充分な塩又は単糖などの他の物質を含有することのできる無菌水溶液の形態で用いるのが最良であり得る。口腔内又は舌下投与の場合、組成物は、通常の方法で製剤化することのできる錠剤又はロゼンジの形態で投与することができる。
投与
典型的に、医師は、個々の被験体により適切な実際の投与量を決定し、これは特定の患者の年齢、体重、及び反応、並びに疾患の重篤度によって異なる。以下の投与量は、平均的な場合の例である。当然ながら、より多い又は少ない投与量が有益である個々の場合が存在し得る。
本発明の組成物（又はその成分）は、経口で投与することができる。さらに、又はその代わりに、本発明の組成物（又はその成分）は、直接注射によって投与することができる。さらに、又はその代わりに、本発明の組成物（又はその成分）は、局所的に投与することができる。さらに、又はその代わりに、本発明の組成物（又はその成分）は、吸入によって投与することができる。さらに、又はその代わりに、本発明の組成物（又はその成分）はさらに、非経口、粘膜、筋内、静脈内、皮下、眼内、又は経皮的投与手段の１つ又は複数によって投与することができ、そのような投与用に製剤化される。
さらなる例として、本発明の医薬組成物は、１日１回から１０回、たとえば１日１回又は２回などの投薬計画に従って投与することができる。任意の特定の患者に対する特定の用量レベル及び投薬頻度は多様であることができ、これは、用いられる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用時間、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与様式及び時間、排泄速度、薬剤組み合わせ、特定の疾患の重篤度、及び宿主が受けている治療を含む様々な要因によって決まる。
「投与」という用語はさらに、これに限定されるものではないが、たとえば吸入用の鼻腔スプレー又はエアロゾルとして、或いは摂取可能溶液として、粘膜経路による送達、たとえば静脈内、筋内、又は皮下経路など、送達が注射可能形態による場合には非経口による送達が含まれる。
したがって、本発明の医薬組成物は、経口投与、注射（直接注射など）、局所、吸入、非経口投与、粘膜投与、筋内投与、静脈内投与、皮下投与、眼内投与、又は経皮投与の１つ又は複数の経路によって投与することができる。
疾患
ＮＯＩに機能しうる形で連結された同定されたモジュレート部分を含む有効量のベクターを含む医薬組成物は、ＷＯ−Ａ−９８／０９９８５に挙げられているものなどの疾患の治療に用いることができる。参照を容易にするために、リストの一部を以下に示す。マクロファージ阻害及び／又はＴ細胞阻害活性、及びそれによる抗炎症活性；抗免疫活性、すなわち炎症に関連しない応答を含む細胞及び／又は体液性免疫応答に対する阻害作用；ウイルス及び／又は他の細胞内病原体に関連する疾患；マクロファージ及びＴ細胞の細胞外マトリクス成分及びフィブロネクチンへの接着能力、並びにＴ細胞におけるアップレギュレートされたｆａｓ受容体発現の阻害；望ましくない免疫反応及び炎症の阻害、関節リウマチを含む関節炎、過敏症に伴う炎症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、抗原病及び他の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症に伴う炎症、動脈硬化、動脈硬化性心疾患、再潅流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性疾患、呼吸窮迫症候群又は他の心肺疾患、消化性潰瘍に伴う炎症、潰瘍性大腸炎、及び他の胃腸管疾患、肝線維症、肝硬変又は他の肝疾患、甲状腺炎又は他の腺疾患、糸球体腎炎又は他の腎臓及び泌尿器疾患、耳炎又は他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎又は他の皮膚疾患、歯周病又は他の歯科疾患、精巣炎又は精巣−精巣上体炎、不妊症、精巣外傷又は他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣性流産、子癇、子癇前症並びに他の免疫及び／又は炎症関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、眼内炎症、たとえば網膜炎又は類嚢胞黄斑水腫、交感性眼炎、強膜炎、色素性網膜炎、変性眼底疾患の免疫及び炎症成分、眼外傷の炎症成分、感染による眼の炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経障害、たとえば緑内障濾過手術後の過剰瘢痕、眼移植片に対する免疫及び／又は炎症反応、並びに他の免疫及び炎症関連眼疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）又は他の器官において免疫及び／又は炎症の抑制が有益である自己免疫疾患又は状態又は障害に伴う炎症、パーキンソン病、パーキンソン病治療の合併症及び／又は副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆複合ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シドナム舞踏病、アルツハイマー疾患及び他のＣＮＳの変性疾患、状態、又は障害、ストークスの炎症成分、ポリオ後症候群、精神障害の免疫及び炎症成分、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギラン−バレー症候群、シドナム舞踏症、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ圧迫又はＣＮＳ外傷又はＣＮＳ感染の炎症成分、筋萎縮及びジストロフィーの炎症成分、中枢神経系及び末梢神経系の免疫及び炎症関連疾患、状態、及び障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染症、手術の炎症性合併症又は副作用、骨髄移植又は他の移植の合併症及び／又は副作用、たとえばウイルスキャリアからの感染による遺伝子治療の炎症及び／又は免疫合併症及び副作用、又はＡＩＤＳに伴う炎症、体液性及び／又は細胞性免疫応答を抑制又は阻害、一定量の単球又はリンパ球を低減することによる、単球又は白血球増殖疾患、たとえば白血病の治療又は緩和、天然又は人工の細胞、組織、及び器官、たとえば角膜、骨髄、器官、レンズ、ペースメーカー、天然又は人工皮膚組織などの移植時の移植片拒絶の予防及び／又は治療を含む。特定の癌関連疾患には、これに限定されるものではないが、充実性腫瘍；白血病などの血液性腫瘍；腫瘍転移；良性腫瘍、たとえば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫；関節リウマチ；乾癬；眼脈管形成疾患、たとえば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後繊維増殖、ルベオーシス；オスラー−ウェーバー症候群；心筋新脈管形成；プラーク形成新生血管；毛細血管拡張症；血友病関節症；血管線維腫；創傷肉芽形成；冠側副；脳側副；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成；血管新生緑内障；水晶体後繊維増殖；糖尿病性新生血管形成；ヘリオバクター関連疾患、骨折、脈管形成、造血、排卵、月経、及び胎盤形成が含まれる。
本発明を、以下の図面を参照し、単に例として説明する。
細胞応答部分及びモジュレート部分の同定におけるステップ
・標的遺伝子の同定（発現プロファイリングを使用）
・標的細胞の同定
・レポーター遺伝子（たとえばＧＦＰ、ＬＮＧＦＲ）に機能しうる形で連結されたプロモーター（及びエンハンサー）を含む構築物の標的細胞への導入
・細胞の培養、及び適切に形質導入された細胞の同定
・対象となるライブラリーによる細胞の形質導入
・細胞応答経路を活性化し、検出可能な表現型（たとえばレポーター発現／転写の増加など、細胞死など）をもたらす条件下での細胞のスクリーニング
・表現型に変化を示す細胞の回収
・単離、ライブラリー挿入、増幅
・これにより細胞応答部分及びモジュレート部分の同定が可能になる
・任意選択のモジュレート部分再試験
図１は、本発明の方法の概略図である。
ステップ１ 標的ＮＯＩの同定
本発明は、対象となる細胞応答経路に適合されているシグナル伝達経路の未同定成分を単離するためのスクリーニング法を提供する。
この実施例において、このアプローチは、経路を活性化する刺激（又はその中止）に応答してその発現が特異的にアップレギュレート又はダウンレギュレートされるＮＯＩの事前同定を必要とする。
適切な標的ＮＯＩが既知でない場合、標的ＮＯＩは発現プロファイリングにより同定された候補であることができる。
ステップ２ 構築物の調製
レポーター遺伝子に機能しうる形で連結されたＮＯＩのプロモーターを含む構築物を調製する。例として、その後、ＮＯＩのプロモーターは、ＧＦＰ又はＬＮＧＦＲなどのレポーター遺伝子の発現を駆動するために用いられる。
ステップ３ 対象となる標的細胞の同定
標的細胞を同定し、この構築物を、対象となる部位での相同組換えを可能にする充分な配列が隣接しているレポーターｃＤＮＡからなる構築物でトランスフェクトすることにより、標的細胞に導入することができる（Ｈａｎｓｏｎ及びＳｅｄｉｖｙ、１９９５、Ｍｏｌ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５（１）：４５〜５１）。このアプローチは、任意のエンハンサーを含む完全長プロモーターがレポーター発現を駆動する利点を有する。
或いは、発現カセットをウイルスベクターにクローニングし、対象となる標的細胞の形質導入に用いることができる（安定して発現する標的細胞を提供する）。
ステップ４ 適切にトランスフェクト又は形質導入された標的細胞の同定
トランスフェクト／形質導入細胞を、トランスフェクト／形質導入細胞の同定を可能にする適切な細胞培養条件下で維持する。
ステップ５ 対象となるライブラリーの形質導入細胞への導入
安定にトランスフェクト／形質導入された細胞がクローニングされるか、類似のＧＦＰレベルを発現する細胞がプールされたら、リボザイムライブラリー、又はアンチセンスライブラリーなどのモジュレート部分のライブラリーを、トランスフェクション又は形質導入によって標的細胞に導入することができる。ライブラリーベクターの略図を図２に示す。
このベクターゲノムは、特定条件の研究を目的として設計することができる。
コードされたｃＤＮＡの構成的発現
このベクターゲノムは、コードされたｃＤＮＡの発現が構成的であるか（この技術は本出願人等のＷＯ９８／１７８１６、ＷＯ９９／３２６４６、及びＷＯ９８／１７８１５に記載のとおりである）、又は形質導入細胞のみに限定される（この技術は本出願人等のＷＯ９９／１５６８３に記載のとおりである）ように設計することができる。
遺伝子の発現を形質導入細胞のみに限定することによって、細菌宿主内でのライブラリーの構築、及びそれに続く真核生物細胞内のレンチウイルスベクターの生産が可能になり、それと同時に所与の細胞又は組織内で発現したすべての遺伝子を代表するサンプルが維持される。これにより、ライブラリーの構築中、又はレンチウイルスベクターの生産中に調節されていない発現が起こらないので、毒素遺伝子を表すライブラリーが得られることに伴う問題が回避される。
このベクターゲノムは、市販され入手可能な対象となるＧＡＴＥＷＡＹ（商標）ライブラリーのベクターへの迅速なクローニングを可能にするために、ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）クローニング技術（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を組み入れることができる。
簡単に述べると、このライブラリーを、必要とされる成果を考慮して選択されたＧＡＴＥＷＡＹ（商標）エントリークローンに構築することができる。レンチウイルスゲノムは、製造者によって記載されているとおり、変換カセットを組み込むことにより、ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）技術に適合させることができる。
ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）技術の使用は、その後の対象となる遺伝子の確認を容易にし、たとえば、他のＧＡＴＥＷＡＹ（商標）適合性ベクターの使用は、所与の遺伝子の作用機構を決定するための、２次スクリーニング及び確認の迅速な手段を提供することができる（たとえば、酵母２−ハイブリッドベクター）。
このベクターゲノムは、遺伝子発現に関与するプロモーター及び／又はエンハンサー領域の迅速な改変を容易にするプロモーターカセットを組み込むことができる。これにより、ベクターゲノム内のプロモーターは標的細胞／組織型を考慮して選択される。たとえば、低酸素応答中の組織へのライブラリー遺伝子の影響を研究するために、低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）をベクタープロモーターのエンハンサー領域に組み込み、そのような実験条件下で対象となる遺伝子の発現を増強することができる。
細胞／組織型／ライブラリーの組み合わせが選択されたら、対象となるライブラリーは、必要なプロモーター／エンハンサーカセットを含有するＧＡＴＥＷＡＹ（商標）適合性レンチウイルスゲノムにクローニングすることができ、これはＧＡＴＥＷＡＹ（商標）クローニング技術の使用者マニュアル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に概説されているとおりＬＲ反応を用いて行われる。
適切なベクターゲノムに設計に関する他の重要な考慮すべき事項は、形質導入細胞からの対象となる遺伝子の回収が確実に迅速に行えることである。このために、ＤＮＡのベクター特異的領域は、組み込まれた遺伝子／プロモーターカセットに隣接するように設計され、これにより、その隣接領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって、細胞ＤＮＡ抽出物からの遺伝子の回収が可能になる。
対象となる遺伝子のさらなる確認は、他のＧＡＴＥＷＡＹ（商標）ベクターへのそのような遺伝子の単純且つ迅速な移動によって容易なものとなる。これは、ＧＡＴＥＷＡＹ（商標）マニュアルに記載されているＬＲとＢＰの交互反応によって行われる。
レンチウイルスライブラリーウイルスの生産後、それを用いて細胞を形質導入する。これらは、特定の環境条件に暴露された細胞、又は特定の疾患状態にある組織であり得る。形質導入細胞／組織の分析は、所与の環境条件又は疾患状態で通常起こる応答に対して改変された細胞応答を検出することを目的とする。
レンチウイルスベクターライブラリーに関して上述したものに類似のアプローチを、他のベクター系に関して設計することができる。可能な他のベクター系の例は、レトロウイルス（たとえばＭｏＭＬＶ）ベースの系、アデノウイルスベースの系、又はアデノ関連ウイルス−２（ＡＡＶ−２）ベースの系である。
ステップ６ トランスフェクト／形質導入細胞のスクリーニング
その後、細胞応答経路を活性化し、それによりレポーター発現を活性化する条件下で、このトランスフェクト／形質導入細胞をスクリーニングする。例として、経路の活性化によってダウンレギュレートされるプロモーターの場合、ＧＦＰスイッチオンに関して形質導入細胞をスクリーニングする。
ステップ７ 対象となる表現型を発現する細胞の単離
対象となる表現型（たとえばＧＦＰ発現のアップレギュレーション又はダウンレギュレーション）を発現する同定された細胞をＦＡＣＳによって収集し、ライブラリー挿入物を、隣接領域のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する。標的細胞の再形質導入によって、候補をさらに試験する。
不朽化
最終分化しているか、又は限定された増殖可能性の初代細胞（非分裂又は緩慢分裂／老化／休止と説明することもできる）であってもよい標的細胞を、細胞分裂を誘導／維持することができるＮＯＩをコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入する（不朽化）。ＮＯＩは１つ又は複数の「不朽化遺伝子」であることができ、たとえば、ヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）とシミアンウイルスラージ腫瘍抗原の温度感受性突然変異体との組み合わせの異所性発現は、新しく単離された乳房線維芽細胞及び内皮細胞を条件付きで不朽化することが示されている（Ｏ’Ｈａｒｅ、Ｍ．Ｊ．等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００１年１月１６日）９８（２）：６４６〜５１）。阻害タンパク質が細胞分裂を妨げる場合、ＮＯＩはリボザイムを含むことができる。
この目的は操作された細胞のスクリーニングを容易にしながら、できる限り厳密にｉｎ ｖｉｖｏ状態の細胞環境を再現することである。
ｉｎ ｖｉｖｏ細胞との類似に関しては「望ましさ」の高い順に、取扱いの容易さに関しては低い順にｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の細胞を以下に挙げたが、標的細胞及び方法の選択は、結局はこれら２つの因子のバランスである。
１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ初代細胞
２．レンチウイルスベクターによる適切なＮＯＩの送達によって「不朽化」された初代細胞
３．確立された不朽化細胞系
現行の技術は標的細胞を分裂細胞に限定するが、本発明はこれらすべての細胞型のスクリーニングを可能にする。
乳癌など癌応答経路に関与する薬剤標的及びモジュレート部分の同定
Ｎｅｕ−Ｒａｓ経路
乳癌は女性ではもっとも一般的な悪性疾患である。ほとんどの乳癌ではサイクリンＤ１が過剰に発現されている（Ｇｉｌｌｅｔｔ等、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４（７）：１８１２〜７）。乳房上皮細胞において、Ｎｅｕ−Ｒａｓ経路は、サイクリンＤ１によって細胞周期装置に連結しており（Ｙｕ等、２００１、Ｎａｔｕｒｅ ４１１（６８４１）：１０１７〜２１）、これはこの組織の悪性転換に絶対的な要件である。抗サイクリンＤ１療法は、Ｎｅｕ−Ｒａｓ経路活性化を伴うヒト乳癌の治療において大きな可能性を持つと考えられている。本発明の方法は、サイクリンＤ１プロモーターの不適切なアップレギュレーションをもたらすＮｅｕ−Ｒａｓシグナルを伝えるサイクリンＤ１以外の標的を同定するために用いることができる。
標的細胞に導入する構築物の調製
レポーター遺伝子に機能しうる形で連結されたサイクリンＤ１プロモーターを含む構築物を調製する。
乳房上皮細胞はサイクリンＤ１不在下で増殖しないので、乳房上皮細胞以外の細胞を選択手順に用いることができる。可能性のある標的細胞には、これに限定されるものではないが、Ｒａｓ及びＮｅｕ駆動線維芽細胞腫瘍が含まれ、これはサイクリンＤ１に加えて高レベルのサイクリンＤ２及びサイクリンＤ３を発現するので、サイクリンＤ１の除去は細胞増殖を妨げない。これらの細胞の選択は、サイクリンＤ２及び／又はサイクリンＤ３の発現は影響を受けないままで、選択をサイクリンＤ１特異的標的に向ける利点を有する。不朽化ヒト線維芽細胞系であるＨＴ１０８０などの細胞も適している。
応答経路を活性化する条件下での細胞の維持
経路の活性化は、Ｒａｓ又はＮｅｕ（Ｒａｓの上流である）の過剰発現によって達成できる。レポーター発現は、細胞周期のステージに依存する可能性がある。したがって、通常はサイクリンＤ１が高発現である細胞周期のあるステージ（たとえばＧ１）にスクリーニングが行われるように、このスクリーニング法を適合させることができる。或いは、スクリーニングの前に、ブロック及びリリース、又はエルトリエーションによって標的細胞を同調することができる。他の選択肢は、細胞周期の適切な時期にスクリーニングされるすべての細胞の確率が一致するように連続的スクリーニングを行うことである。
喘息などの炎症性疾患応答経路に関与する薬剤標的及びモジュレート部分の同定。炎症性疾患の薬剤標的を同定するためのレンチウイルス方法の概要を図３に示す。
炎症性疾患
多くの炎症性疾患状態は、Ｔヘルパー細胞集団の不均衡が原因であると考えられる（Ｓｔｉｒｌｉｎｇ及びＣｈｕｎｇ、２０００、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ １６（６）：１１５８〜７４）。ＣＤ４前駆細胞のＴｈ１分化ではなくＴｈ２分化をもたらすシグナル伝達経路における標的の同定が、一連の炎症性疾患型において有益であることがわかる。
喘息
喘息反応は、好酸球レベルのアップレギュレーションを特徴とする多因子応答経路である。ＩＬ−５受容体は好酸球系統の細胞に発現して、好酸球分化を誘導し、それらの生存を延長する作用をする。喘息反応も、Ｔヘルパー細胞集団の不均衡が原因であると考えられる。したがって、以下の１つの段階での介入は、好酸球増加を軽減する一助となる可能性がある。
可能な介入方法には、これに限定されるものではないが、
好酸球におけるＩＬ−５経路の阻害／遮断
Ｔｈ２由来サイトカイン発現、たとえばＩＬ−５の阻害
Ｔｈ２分化の阻害による、循環Ｔｈ２細胞数の低減が含まれる。
グルココルチコイドもＴｈ２細胞においてＩＬ−５プロモーターの転写を抑制するように作用するが、望ましくない副作用を有することが知られている（Ｗｅｌｔｍａｎ及びＫａｒｉｍ、２０００、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ９（３）：４９１〜６）。したがって、Ｔ細胞のＩＬ−５転写をもたらすタンパク質の同定も、Ｔ細胞によるＩＬ−５分泌を防ぐ別の薬剤標的を提供する可能性がある。
ＩＬ−５シグナル伝達経路
ＩＬ−５受容体は好酸球系統の細胞に発現して、好酸球分化を誘導し、それらの生存を延長する作用をする。好酸球増加は喘息の特徴であり、ＩＬ−５シグナル伝達経路の阻害は、この疾患の症状を軽減するはずである。
ＩＬ−５プロモーターを用いる構築物の調製
ＩＬ−５によってアップレギュレートされるＮＯＩのプロモーターを、適切な細胞型においてレポーター遺伝子の発現を駆動するために用いる。
適切な標的細胞の同定
ＴＦ−１．８細胞系などの、適切なＩＬ−５依存性標的細胞を選択する。或いは、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞などの標的Ｔ細胞の使用によって、一連の炎症性疾患型において有益である、ＣＤ４前駆細胞のＴｈ１分化ではなくＴｈ２分化をもたらすシグナル伝達経路における標的を同定できる可能性がある。
アルツハイマー病などの神経変性疾患応答経路に関与する薬剤標的及びモジュレート部分の同定
アルツハイマー病は、多くの脳領域におけるＡβ−アミロイドの沈着及び神経細線維のもつれを特徴とする。２種のβ−セクレターゼ、ＢＡＣＥ１及びＢＡＣＥ２が、毒性アルツハイマー疾患Ａβペプチドの生産に関与する。これらは、β及びγ−セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のエンドプロテアーゼ切断によって生産される。Ａβペプチドの分泌は、ＢＡＣＥ−１欠乏皮質ニューロンの培養で根絶されることが報告されている（Ｃａｉ、Ｈ．等、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００１年３月）４（３）：２３３〜４）。脳において、ＢＡＣＥ１ｍＲＮＡは高レベルである。ＢＡＣＥ１はプロ酵素として合成され、これはフューリン（ｆｕｒｉｎ）によって切断され、成熟酵素を生成する。マウスではＢＡＣＥ１欠乏に伴う明らかな悪影響は存在せず、したがってヒトにおけるＢＡＣＥ１の阻害は機構に基づく毒性を持たない可能性が示されている（Ｌｕｏ等、２００１）。
構築物の調製
レポーター発現を駆動するようにＢＡＣＥ１プロモーターを選択する。
標的細胞
標的細胞はニューロンである。
標的細胞の維持
この場合、レポーターの発現は構成的になる。
対象となるライブラリーの導入
ライブラリーによる形質導入に続いて（アンチセンス、ｃＤＮＡ、又はリボザイム）、レポータースイッチオフに関して細胞をスクリーニングする。
対象となる表現型を発現している細胞の同定
レポーターの発現を除去する分子、したがってＢＡＣＥ１は、アルツハイマーの治療の潜在的な治療／薬剤標的である。
γ−セクレターゼに関しても同様の方法に従うことができる。
対象となる遺伝子
アポトーシス応答を妨げる遺伝子
疾患状態
パーキンソン病
神経細胞において低酸素誘導アポトーシス
標的／宿主細胞
ラット神経細胞
原理
神経細胞のアポトーシスは、パーキンソン病を含むいくつかの神経疾患の病因の重要な因子である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激
神経アポトーシス応答は、そのような疾患状態を模倣するために用いることのできる刺激によってｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導することができる。考えられる刺激には、低酸素、虚血、低酸素／虚血、グルタミン酸、カイニン酸、６−ヒドロキシドーパミン、スタウロスポリン、一酸素窒素、又はウォルトマニンがある。
アポトーシスは、カスパーゼ３の活性化、ＤＮＡラダリング、又は細胞膜の透過などの分子アッセイと組み合わせた組織学及び免疫組織化学によって迅速に評価することができ、低酸素誘導アポトーシスを生き残る細胞は非アポトーシス細胞を示す。
たとえば、神経細胞において低酸素誘導アポトーシスを防ぐ受容能力を有する遺伝子を同定するために、ｃＤＮＡライブラリーをレンチウイルスベクターに構築する（たとえば代表的なラット神経（又は他のラット細胞型／組織）ｃＤＮＡライブラリー）。
ベクター設計
遺伝子を最小ＣＭＶプロモーター及びＨＲＥの制御下で発現させる。
標的宿主細胞
ラット神経細胞を、このレンチウイルスベクターライブラリーで形質導入する。
対象となる遺伝子の同定
低酸素誘導アポトーシスで生存する細胞を、この形質導入ベクターによって発現したｃＤＮＡを増幅するように設計されたＰＣＲをベースにしたアッセイで分析する。
ベクターゲノム＋遺伝子を用いる２次スクリーニング
遺伝子が単離、配列決定、及び同定されたら、ベクターゲノムを再構築し、低酸素誘導アポトーシス及び他の刺激によって誘導されるアポトーシスの両方を阻害する遺伝子の能力を試験するように２次スクリーニングを設計する。
さらなる特性研究
対象となる遺伝子の作用様式を特徴づけ、治療又は他の分野でのその遺伝子の可能な用途を同定するために、さらなる研究を行う。
ＩＬ−５の不在下、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト好酸球の生存を可能にする遺伝子を同定するためのレンチウイルスベクターの使用
好酸球、及びＴＦ−１などの好酸球細胞系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生存に関して外因性ＩＬ−５に依存している。これらの細胞からのＩＬ−５の除去は、急速な細胞死をもたらす。
ｃＤＮＡライブラリー
好酸球細胞系ＡＭＬ１４．３Ｄ１０から単離されたｃＤＮＡを発現するライブラリー。この細胞系は、その生存に関して外因性ＩＬ−５に依存しない。
ベクター設計
レンチウイルスｃＤＮＡライブラリーベクターを構築する（たとえば、好酸球細胞系ＡＭＬ１４．３Ｄ１０から単離されたｃＤＮＡを発現するライブラリー。この細胞系は、その生存に関して外因性ＩＬ−５に依存しない）
標的宿主細胞
ＩＬ−５依存性好酸球又はＴＦ−１細胞を、このライブラリーで形質導入し、外因性ＩＬ−５を除去する。
スクリーニング
ＩＬ−５の不在下で生存できる細胞を単離する。
対象となるｃＤＮＡの単離
この形質導入ベクターによって発現したｃＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅、クローニング、配列決定する。好酸球及びＴＦ−１細胞からのＩＬ−５の除去に伴う細胞死を阻害する遺伝子の能力を試験するように２次スクリーニングを設計する。対象となる遺伝子の作用様式を特徴づけ、治療（たとえば喘息）又は他の分野でのその遺伝子の可能な用途を同定するために、さらなる研究を行う。
このアプローチは、臓器移植又は他の治療領域で用いる指向性免疫抑制ｃＤＮＡ又はリボザイムの同定に有用である可能性がある。同定されたヌクレオチドは、臓器移植後に生涯服用しなければならない薬剤の代替物として有用である可能性がある。
このアプローチは、任意の細胞転写因子に対する正又は負の調節作用を研究するために適合させることができる（別の例は、転写因子の核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）のファミリーである）。
転写因子依存性レポーター遺伝子の活性化に影響を及ぼす遺伝子を同定するためのレンチウイルスベクターライブラリーの使用。この例は、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）転写因子の活性化を防ぐ遺伝子を探すことである。
簡単に述べると、ＮＦＡＴは、カルシウムイオノフォア（たとえばイオノマイシン）及びホルバルエステル（たとえばホルバルミリスチルアセテート、ＰＭＡ）と共にＮＦＴＡ（ヒトＴ細胞系など）を含有する細胞の刺激によってｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化できる。この処理は、カルシニューリンホスファターゼ（Ｃａ２＋依存性Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質ホスファターゼ）を活性化し、これが次にＮＦＡＴを脱リン酸化する。ＮＦＡＴの脱リン酸化は核局在をもたらし、そこで転写補助活性化因子ＡＰ−１（ＰＭＡ処理によって活性化）と共に、ＮＦＡＴ依存性遺伝子の転写を開始する。
対象となる転写因子に依存する遺伝子の転写に影響を及ぼすｃＤＮＡを検出するためには、その因子に依存性のレポーター遺伝子を発現する細胞系を得ることが必要である。次いでこれを、正又は負の調節作用を有する遺伝子に関してレンチウイルスライブラリーを用いて活用することができる。
ｃＤＮＡライブラリー
構成的に活性なプロモーターの制御下で、種々のヒト免疫細胞型からｃＤＮＡを発現するｃＤＮＡライブラリーを調製する。
標的宿主細胞（レポーター遺伝子を含む）
ヒトＴ細胞系を、ＧＦＰ（ＬＮＧＦＲ）などのＮＦＡＴ依存性レポーター遺伝子で安定にトランスフェクトする。
ベクターゲノム設計
これらの細胞を、構成的に活性なプロモーターの制御下で、種々のヒト免疫細胞型からｃＤＮＡを発現するレンチウイルスベクターｃＤＮＡライブラリーで形質導入する。
宿主細胞の刺激
形質導入された細胞を、通常はＧＦＰレポーター遺伝子の活性化をもたらす刺激に暴露する。
細胞スクリーニング
高レベルのＧＦＰを発現する細胞を除去するために、細胞をＦＡＣＳによって選別する。これらの細胞を、連続刺激下で増殖させ、さらなる一連のＦＡＣＳによる低レベルＧＦＰ発現細胞富化に供する。
単一の細胞を単離し、形質導入ウイルスによって発現したｃＤＮＡをクローニング、配列決定、同定する。これらの遺伝子を、関連する転写因子の既知の阻害剤と同時に評価する（たとえば、シクロスポリンＡは、ＮＦＡＴ依存性遺伝子発現の有効な阻害剤である）。
このアプローチは、臓器移植又は他の治療領域で用いる指向性免疫抑制ｃＤＮＡの同定に有用である可能性がある。このアプローチは、任意の細胞転写因子に対する正又は負の調節作用を研究するために適合させることができる（別の例は、転写因子の核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）のファミリーである）。対象となる転写因子に依存する遺伝子の転写に影響を及ぼすｃＤＮＡを検出するためには、その因子に依存性のレポーター遺伝子を発現する細胞系を得ることが必要である。次いでこれを、正又は負の調節作用を有する遺伝子に関してレンチウイルスライブラリーを用いて活用することができる。
他の可能性は、レンチウイルスリボザイムライブラリーを用いることである。これは転写因子の負の人工調節因子を単離するために用いられる。
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）：Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼの除去
ＣＭＬは、幹細胞起源の造血系悪性疾患である。これは、特定の細胞遺伝学的損傷であるフィラデルフィア染色体転座に関連する。２２番染色体上のＢＣＲ遺伝子内のゲノム配列が、９番染色体上のＡＢＬチロシンキナーゼ遺伝子のゲノム配列と並列している。これにより、ＡＢＬの第１のエキソンによってコードされた配列とＢＣＲ誘導配列との交換、及び調節されていないキナーゼ活性を有する２１０Ｋｄキメラ融合タンパク質Ｂｃｒ−Ａｂｌの発現が起こる。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の一部では、別のＢＣＲ再配列部位を反映して、１８５ｋＤａのキメラタンパク質産物が形成される。
このタンパク質の発現は、細胞骨格及び接着異常をもたらし、ＲＡＳ、ＰＩ３’キナーゼ、ＳＴＡＴ、ＥＲＫ、及びＪＮＫ ＭＡＰキナーゼ経路の活性によって増殖及び抗アポトーシスシグナルを生じる。これは形質転換細胞の細胞質に排他的に保持されており、核内に捕捉されたとき、アポトーシスを誘導することが報告されている（Ｖｉｇｎｅｒｉ及びＷａｎｇ、２００１、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００１年２月、７（２）：２２８〜３４）。
チロシンキナーゼ阻害剤である薬剤ＳＴＩ−５７１（Ｇｌｅｅｖｅｃ）は、ｐ２１０に結合し、スイッチオフすることによって、ＣＭＬの慢性期初期の治療に非常に有効であることが示されている。しかしながら後の急性期、さらなるゲノムの不安定性に起因する「急性転化」において、患者は、最初はその薬剤に充分に反応するが、ほとんどは再発する。これは、ｐ２１０の単一突然変異、又はＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子数の増加により、急性転化細胞がＳＴＩ−５７１に耐性となった結果である（Ｇｏｒｒｅ等、２００１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年８月３日、２９３（５５３１）：８７６〜８０）。そのため、ＣＭＬのこの病期の治療には、薬剤のカクテルが重要であろうと考えられている（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、２００１、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年７月１９日、４１２（６８４４）：２８１〜２）。Ｂｃｒ−ＡｂｌがＳＴＩ−５７１耐性細胞において活性なままであるという事実は、このキメラ癌タンパク質が依然として合理的な薬剤標的であることを示唆しており、Ｂｃｒ−Ａｂｌ癌遺伝子の発現が翻訳レベルで阻害されるいくつかの療法が提示されている（Ｊａｈａｇｉｒｄａｒ等、２００１、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ、２００１年５月、２９（５）：５４３〜５６）。
実験方法
１つのアプローチは、その転写がＢｃｒ−Ａｂｌによってアップレギュレートされる遺伝子を同定し、融合タンパク質の下流エフェクターを同定するために、それらのプロモーターを用いてレポーター発現を駆動することである。しかしながら、この方法の欠点は、チロシンキナーゼが多くの基質を有する可能性が高く、たとえばＳＴＡＴ５を直接リン酸化し（Ｓｉｌｌａｂｅｒ等、２０００、Ｂｌｏｏｄ、２０００年３月１５日、９５（６）：２１１８〜２５）、Ｂｃｒ−Ａｂｌに活性化されるすべての経路を標的にするのは困難なことである。さらに、これらのシグナル伝達経路は正常細胞の機能に重要である可能性が高い。
よりよい方法は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ癌遺伝子自体の発現を阻害することである。転写はＢＣＲプロモーターの下で制御され、その機能はゲノム再配列にもかかわらず完全なままであることが報告されている。これはさらに、正常な対立遺伝子によってコードされたＢｃｒタンパク質の発現を阻害する作用を有し、セリン／スレオニンキナーゼの機能は知られていないが（Ｌｉｕ等、１９９６、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９６年３月、１６（３）：９９８〜１００５）、Ｂｃｒ−Ａｂｌの癌遺伝子作用を拮抗することが報告されている（Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ、１９９８、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｇ、１９９８；９（１）：１〜１８）。このＢＣＲプロモーターは、ＢＣＲエキソン１コード配列の１ｋｂの５’領域に機能的に局在したが（Ｓｈａｈ等、１９９１、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９９１年４月、１１（４）：１８５４〜６０、Ｚｈｕ等、１９９０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１９９０年１２月１１日、１８（２３）：７１１９〜７１２５）、しかしながらＢＣＲｍＲＮＡの低い定常状態レベルが報告されている。したがって、レポーター遺伝子産物の検出の改善には、ＧＦＰではなく、ＬＮＧＦＲの使用が有利であろう。
Ｂｃｒは、進化的に保存されており、ヒト細胞の多くの異なる型で発現することが報告されており（Ｃｏｌｌｉｎｓ等、１９８７、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９８７年８月、７（８）：２８７０〜２８７６）、したがってＢＣＲ発現の除去が正常な細胞に毒性である可能性が考慮されるべきである。それでも、ＳＴＩ−５７１と組み合わせたＢＣＲ発現の阻害剤による短期間の治療は、有効な治療法を提供するのに充分である可能性がある。重要なことには、ＢＣＲは必須遺伝子ではなく（Ｖｏｎｃｋｅｎ等、１９９８、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、１９９８年１１月、２（５）：５７７〜５８３）、Ｂｃｒヌル突然変異マウスは好中球呼吸バーストの増加、並びにホルモン及び行動的ストレス反応を示すが、正常な発達及び受胎能を示すことが報告されている（Ｖｏｎｃｋｅｎ等、１９９５、Ｃｅｌｌ、１９９５年３月１０日、８０（５）：７１９〜７２８、１９９８、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９８年４月１６日、１６（１５）：２０２９〜２０３２）。新しいＣＭＬ及び正常造血骨髄細胞の分析から、ｐ２１０並びに正常Ｂｃｒ及びＡｂｌタンパク質が、主として骨髄成熟の初期ステップに発現し、細胞が多形核白血球に成熟すると、発現レベルが著しく低減することが報告されている（Ｗｅｔｚｌｅｒ等、１９９３、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１９９３年１０月、９２（４）：１９２５〜１９３９）。
Ｂｃｒ−Ａｂｌレベルを下げる作用因子、たとえば三酸化ヒ素（Ａｓ２Ｏ３）を、Ｂｃｒ−ＡｂｌＴＫ活性を阻害する作用因子、たとえばＳＴＩ−５７１と組み合わせる治療方法が、Ｂｃｒ−Ａｂｌ陽性ヒト白血病細胞のアポトーシス及び分化を強く誘導することを実証するデータによってこのアプローチは確認されている（Ｐｅｒｋｉｎｓ等、２０００、Ｂｌｏｏｄ、２０００年２月１日、９５（３）：１０１４〜２２、Ｐｏｒｏｓｎｉｃｕ等、２００１、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００１年５月、１５（５）：７７２〜７７８）。実際、化学療法以前の時代には、慢性骨髄性白血病の治療にヒ素誘導体が用いられていた（Ｋｗｏｎｇ及びＴｏｄｄ、１９９７、Ｂｌｏｏｄ、１９９７年５月１日、８９（９）：３４８７〜８、Ｐｕｃｃｅｔｔｉ等、２０００、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２０００年７月１日、６０（１３）：３４０９〜３４１３）。
慢性及び急性転化期細胞におけるＢｃｒ−Ａｂｌ転写の発現レベルの研究は、ゲノム増幅のないとき、急性転化期細胞において、時折、定常状態レベルの上昇が起こることを示した。これはＢＣＲプロモーター活性の変化に起因するものであり（Ａｎｄｒｅｗｓ及びＣｏｌｌｉｎｓ、１９８７、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１９８７年１０月、１（１０）：７１８〜２４）、ＢＣＲ発現を制御するエレメントの同定の重要性を示している。
実験概要
１．ＢＣＲプロモーターの制御下、ＬＮＧＦＲレポーター遺伝子カセットを含むレンチウイルスベクターを構築
２．フィラデルフィア染色体陽性及び陰性細胞系において構築物を試験
３．レポーター構築物を含む安定な細胞系又はプールを確立
４．レンチウイルスリボザイムライブラリー（抗生物質耐性マーカーを含有）でレポーター細胞を形質導入
５．抗生物質選択により形質導入細胞を単離
６．ＭＡＣビーズを用いて、ＬＮＧＦＲ発現細胞を除去
７．再試験のために残存細胞からライブラリー構築物を単離
８．さらなる下流試験及び確認
発現をアップレギュレートするエレメントを同定するための別のアプローチは、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを含む（Ｇａｔｅｗａｙ（商標）適合ベクターのＡＰｈ＋ＣＭＬライブラリーが利用可能である）。
多発性嚢胞腎
ＰＫＤ１遺伝子は、１：４００から１：１０００の発生頻度のもっとも一般的なヒト遺伝性疾患であり、成人の末期腎不全の症例のほぼ１０％の原因である常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）の８５％を占める（Ｄａｌｇａａｒｄ、１９５７、Ａｃｔａ Ｍｅｄ Ｓｃａｎｄ、１９５７、３２８：１〜２５５）。この疾患は一般に遅発性であり（３０年から７０年）、主として腎臓での液体の充満した嚢胞の形成を特徴とする。
腎嚢胞はほとんどの場合、同一遺伝子又は対応遺伝子の遺伝した健常な対立遺伝子を不活性化する第２の体性事象後に生じる。多発性嚢胞腎１（ＰＫＤ１）遺伝子のイントロン２１に存在する２．５キロベース対ポリ（プリン・ピリミジン）（ポリ（Ｒ．Ｙ））領域は、修復及び／又は組換え機能を刺激することにより、遺伝子の高い突然変異頻度の原因となることが報告されている（Ｂａｃｏｌｌａ等、２００１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００１年５月２５日、２７６（２１）：１８５９７〜６０４）。しかしながら、上皮における本質的に高頻度の体性セカンドヒットが、病原遺伝子において頻繁に起こる体性セカンドヒットの説明に充分であると考えられる（Ａｒｎａｏｕｔ、２００１、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ、２００１、５２：９３〜１２３、Ｒｅｖｉｅｗ）。
主要な型のＰＫＤを有する人の約半数が腎不全、すなわちその患者が透析又は腎移植を必要とする末期腎疾患（ＥＳＲＤ）に進行する。
ヒト患者、並びに標的化Ｐｋｄ１及びＰｋｄ２突然変異マウスモデルにおける同一の臨床表現型は、両方の遺伝子産物が同じ病原経路で作用する証拠を提供する。ポリシスチン１の推定タンパク質ドメイン構造は、ポリシスチン１が細胞−細胞又は細胞−マトリクス相互作用に関与することを示唆し、一部のカチオンチャネルの孔形成ドメインに対するポリシスチン２及びポリシスチンＬの類似は、それらすべてが大きな形質膜イオンチャネルのサブユニットを形成することを示唆する。このＰＫＤタンパク質は、シグナル伝達を開始することができ、ヘテロ３量体Ｇタンパク質、プロテインキナーゼＣ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、ベータカテニン、及びＡＰ−１転写因子を含むいくつかの下流エフェクターの活性化をもたらす。さらに、ポリシスチン２は、カルシウムフラックスの媒介において機能する可能性がある。
図４は、提示されたポリシスチンシグナル伝達経路の２つの成分を示す。
嚢胞形成の病因は、現在のところ、細胞増殖の増加、体液貯留、及び基底膜再造形を含むと考えられている。環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）代謝が、嚢胞形成の主要な構成成分であり、ＣＦＴＲチャネルによる頂端部塩素イオン分泌を刺激し、嚢胞液の貯留を駆動すると考えられる。細胞増殖が環状ＡＭＰによって阻害される正常な腎細胞と対照的に、ＡＤＰＫＤ細胞は増殖するように刺激される。したがって、ポリシスチン機能の改変は、正常な細胞表現型を細胞増殖速度の増加により上昇した環状ＡＭＰに応答する表現型に転換し、拡大嚢胞は、環状ＡＭＰ駆動体液分泌の速度の上昇によって大きくなる可能性が高い。環状ＡＭＰ、及び上皮増殖因子を含む増殖因子は、ＡＤＰＫＤ嚢胞の拡大を促進する相補的作用を有し、それにより疾患の進行の一因となる。この知識は、ＡＤＰＫＤの治療に用いることのできるシグナル伝達カスケードの阻害剤の発見に役立つはずである（Ｃａｌｖｅｔ及びＧｒａｎｔｈａｍ、２００１、Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ、２００１年３月、２１（２）：１０７〜２３、Ｒｅｖｉｅｗ）。
細胞増殖及びアポトーシスの増大は、嚢胞性疾患の病因に関与するとされている。Ｂｏｌｅｔｔａ等（２０００、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、２０００年１１月、６（５）：１２６７〜７３）は、ＰＫＤ１が両方の経路を調節するように機能し、細管形成をもたらす分化経路に細胞を送る可能性のあることを示唆している。最近の概説において、Ｇｒａｎｔｈａｍ（２００１、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ、２００１年７月、１０（４）：５３３〜４２）は、上皮形態発生及び成熟を制御し、その崩壊が嚢胞の問題の中心にあるシグナル伝達経路に関して生理学及び分子生物学の専門分野が集結されることを予測している。Ａｒｎｏｕｌｄ等（１９９９、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９９９年５月、１９（５）：３４２３〜３４）は、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞において、ＰＫＤ２がＡＰ−１依存性転写をアップレギュレートすることを見出した。このＰＫＤ２媒介ＡＰ−１活性は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼｐ３８、ＪＮＫ１、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）イプシロン、カルシウム非依存性ＰＫＣアイソザイムの活性化に依存した。
ＰＫＤ１の相互作用Ｃ末端とのＰＫＤ２の共発現は、ＰＫＤ２媒介ＡＰ−１活性化を劇的に増大した。ＡＰ−１は、増殖、分化、及びアポトーシスなどの種々の細胞プログラムを調節する転写因子である。これらのシグナル伝達カスケードの活性化は、発生中の細管上皮細胞の完全な成熟を促進する可能性があり、これらのシグナル伝達カスケードの不活性化は、最終分化を妨げ、尿細管嚢胞の発生を促進する可能性がある。
細胞レベルで、ＰＫＤ突然変異は、細管上皮において上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の異常な分布をもたらす。この受容体は、通常は細管上皮の基底外側領域に限定されているが、嚢胞上皮では先端（管腔）表面に現れる。嚢胞液は上皮増殖因子を含有し、ＥＧＦＲはリガンドと結合してマイトジェンシグナルを伝達するので、ＥＧＦＲの不適正な局在化は、嚢胞増殖を駆動する重要な機構かもしれない。器官培養において、嚢胞形成は、受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害する抗ＥＧＦＲ抗体又はチロホスチンを用いて、ＥＧＦＲ活性を遮断することにより防ぐことができる（Ｐｕｇｈ等、１９９５、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．１９９５年３月、４７（３）：７７４〜８１）。
Ｔｇ７３７欠損マウス（多発性嚢胞腎のモデル）において、嚢胞上皮への不活性ＥＧＦＲ（不適正に局在化されたＥＧＦＲの活性を遮断する）の導入は、実質的に嚢胞形成を低減する（Ｒｉｃｈａｒｄ等、１９９８、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１９９８年３月１日、１０１（５）：９３５〜９）。将来の多発性嚢胞腎の治療は、遺伝子治療又はチロホスチンを用いて不適正に局在されたＥＧＦＲの活性を阻害すること、或いは抗体又は他の中和剤を用いて尿中の上皮増殖因子を中和することに向けられる可能性がある。
実験方法
１．Ａ４３１細胞におけるＰＫＤ１の発現の確認（ノザン）
２．相同的組換えによる削除（２巡）
３．ノックアウト遺伝子発現対コントロールのアレイプロファイリング
４．その発現／抑制がＰＫＤ１を要する遺伝子のショートリスト
５．レポーター遺伝子発現を駆動する候補プロモーターを選択
６．プロモーター／レポーターカセットを用いて安定な細胞系を構築
７．レンチウイルスライブラリーによる形質導入
８．レポーター遮断／スイッチオンに関してスクリーニング
ＰＫＤ１は胎児腎臓で高発現し（Ｉｂｒａｇｈｉｍｏｖ−Ｂｅｓｋｒｏｖｎａｙａ等、１９９７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９７年６月１０日、９４（１２）：６３９７〜４０２）、突然変異ＰＫＤ１対立遺伝子のマウスホモは胚性致死である（Ｋｉｍ、２０００、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０００年２月１５日、９７（４）：１７３１〜６）。ポリシスチン１は、上皮細胞、星状細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞で検出される。追加の代替細胞型の使用は、ＰＫＤ１シグナリングによって誘導された経路が、適正な機能のＰＫＤ１を必要とすることが知られている組織型に共通であるのか、特異的であるのか調べるのに有用であろう。
レポーター遺伝子の発現を駆動する候補の選択には、ＰＫＤ１によって活性化されたシグナル伝達経路の単一の枝のみが標的化され得ることを考慮するべきである。したがって、実用的である場合、追加候補の選択及び別のレポーター構築物による平行スクリーニングは有利であろう。
ＰＫＤのマウス及びラットモデル、並びに嚢胞形成のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが存在し（Ｐｅｙ等、１９９９、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ、１９９９年１１月−１２月、３５（１０）：５７１〜９）、さらなる下流試験を容易にする。
転写因子のＮＦＡＴファミリーの活性化に影響を及ぼす遺伝子を同定するための、レンチウイルスベクターライブラリーの使用
活性化Ｔ細胞の核因子（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ−ｃｅｌｌｓ）（ＮＦＡＴ）は、最初にヒトＴ細胞において同定された転写因子のファミリーである。ＮＦＡＴは、５つのメンバーからなり（現在）、もっとも特徴的な４種（ＮＦＡＴ１〜４）は、偏在的に発現したＣａ２＋依存性Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質ホスファターゼ、カルシニューリン（ＣａＮ）によって調節される。ＮＦＡＴは、カルシウムイオノフォア（たとえばイオノマイシン）及びホルバルエステル（非特異的にＰＫＣを活性化するＰＭＡ）で刺激することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化され得る。ＣａＮは、免疫抑制薬剤、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の主要な標的である。ＣｓＡは、まずイムノフィリンリガンドシクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）に結合し、次いでこの薬剤−イムノフィリン複合体がＣａＮホスファターゼに結合して、その活性を不活性化することによって作用する。ＣａＮの阻害により、ＣｓＡはＮＦＡＴのＣａＮ媒介活性化を妨げ、したがってＮＦＡＴ依存性遺伝子転写を妨げる。不活性ＮＦＡＴは、休止Ｔ細胞の細胞質においてリン酸化状態にあり、細胞内Ｃａ２＋の放出によってＣａＮが活性化されると、ＮＦＡＴはＣａＮによって脱リン酸化される。これが核局在化シグナル（ＮＬＳ）の暴露をもたらし、ＮＦＡＴは核に移行する。ひとたび核に入ると、ＮＦＡＴは、転写補助活性化因子ＡＰ−１（ＰＫＣ経路によって活性化）と共に作用して、そのプロモーター−エンハンサー調節ドメインにＮＦＡＴエレメントを含有する遺伝子の転写を開始する。ＣｓＡは、数十億ドル規模の臓器移植市場において、現在の第１選択薬である。別の免疫抑制薬剤（ＦＫ５０６）は、イムノフィリンＦＫＢＰ１２への結合、ＣａＮホスファターゼ活性の不活性化により、類似の方法で作用する。ラパマイシンは、他の機構によるにもかかわらず、同様にＮＦＡＴを阻害する代替薬剤である。ＮＦＡＴの調節及び機能は、Ｒａｏ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５、７０７〜７４７に概説されている。
免疫抑制のさらに特定の手段が求められている。ＣｓＡは、腎不全及び種々の癌を含む広範囲の深刻な副作用を有する。臓器移植の性質により、患者は生涯にわたって持続的にＣｓＡを服用する必要があるので、そのような患者に副作用が起こる確率は増大する。免疫抑制のより特定な新しい機構を開発するためのアプローチの１つは、ＣａＮ調節ＮＦＡＴタンパク質に存在するＩＸＩＴ ＣａＮ結合モチーフ（ＳＰＲＩＥＩＴ）を含有するペプチドを用いることによる（特許国際公開番号ＷＯ９９／４０９３０）。今までのところ、このＣａＮ結合モチーフによってＮＦＡＴのＣａＮ媒介活性化を調節することが示されたヒト遺伝子はない。しかしながら、このモチーフを利用して、ＮＦＡＴと同じ部位でＣａＮを結合することにより、ＣａＮホスファターゼ活性を阻害することが示されている１つのタンパク質がある。これは、アフリカブタ熱ウイルス由来のＡ２３８Ｌタンパク質である（Ｍｉｓｋｉｎ等、１９９８及び２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、５６２〜５６５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４、９４１２〜９４２０）。Ａ２３８Ｌはさらに、ＮＦ−κＢ依存性遺伝子転写を阻害することも示されている（Ｐｏｗｅｌｌ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、８５２７〜３３、Ｔａｉｔ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、３４６５６〜６４）。
方法
ヒトＴ細胞系を、ＧＦＰ（又はＬＮＧＦＲ）などのＮＦＡＴ依存性レポーター遺伝子を含有するように操作する。これは、Ｔ細胞（Ａｌｏ−Ｔ細胞、又はＪｕｒｋａｔなどの細胞系）を形質導入することによって達成される。このレポーターは、いくつかの異なる形態を取ることができる。１つの可能性は、最小ＣＭＶプロモーター上流のＮＦＡＴエンハンサーエレメントの３タンデムコピーを含有する人工ＮＦＡＴプロモーター−エンハンサー領域を用いて、レポーター遺伝子の発現を制御することである。第２の可能性は、既知のＮＦＡＴ依存性遺伝子（ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−２など）のプロモーターをクローニングすることである。しかしながら、いくつかの他の転写因子もＩＬ−２転写制御をもたらすことが知られているので、これはほぼ確実により混乱した結果を生じる。さらなる可能性は、ＮＦＡＴ−ＮＦＡＴｃ２によってサイレンスされ、ヒトＴヘルパー細胞においてインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）受容体ベータ２近接プロモーターのサイレンサー活性を有することのできるプロモーターである。このレポーターは、既知のＮＦＡＴ依存性遺伝子転写阻害剤（たとえばシクロスポリンＡは、ＮＦＡＴ依存性遺伝子発現の有効な阻害剤である）又はＡＳＦＶのＡ２３８Ｌを用いて検証される。
これらの細胞を、調節プロモーター又は構成的に活性なプロモーターの制御下で、種々のヒト免疫細胞型（Ｔ細胞など）からｃＤＮＡを発現するレンチウイルスベクターｃＤＮＡライブラリーで形質導入する。形質導入された細胞を、通常はＧＦＰレポーター遺伝子の活性化をもたらす刺激に暴露する（たとえばＰＭＡ及びイオノマイシン）。高レベルのＧＦＰを発現する細胞を除去するために、細胞をＦＡＣＳによって選別する（サイレンシングプロモーターを用いた場合は逆）。これらの細胞を、連続刺激下で増殖させ、さらなる一連のＦＡＣＳによる低レベルＧＦＰ発現細胞富化に供する。単一の細胞を単離し、形質導入ウイルスによって発現したｃＤＮＡをクローニング、配列決定、同定する。これらの遺伝子を、関連する転写因子の既知の阻害剤と同時に評価する。このアプローチは、臓器移植又は他の治療領域で用いる指向性免疫抑制ｃＤＮＡの同定に有用である可能性がある（たとえばＣｓＡはＲＡに用いられる）。
他の可能性は、レンチウイルスリボザイムライブラリーを用いることである。これは、ＮＦＡＴ活性化又は発現を阻害する活性リボザイムを単離するために用いられる。
リボザイム選択方法
リボザイムの選択は、ｉｎ ｖｉｖｏ（組織培養）で行う。ｉｎ ｖｉｔｒｏで「理論的に」構築され、試験されたリボザイムは、多くの場合、細胞環境でうまく機能しない。
一実施形態において、本発明は、マルチシストロン性、好ましくは２シストロン性アプローチを用いる。
この実施形態において、ｐＯＮＹ８．４ベースであることができる標的ベクターは２シストロン性であり、テトラサイクリン抑制因子の発現は、ＬＴＲによって駆動される。標的遺伝子又は配列を、テトラサイクリン抑制因子の下流でクローニングし、好ましくはＩＲＥＳは存在せず、そのため対象となるｎｏｉからのタンパク質の発現は起こらない。形質導入されたレポーター細胞は、Ｄｏｘを添加することによって選択できる。Ｄｏｘはテトラサイクリン抑制因子に結合し、それによってＴｅｔオペレーターの抑制は解除され、ＬＮＧＦＲが発現する。その後、この細胞は、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、又は他の適切な方法によって選択できる。選択後、Ｄｏｘを除去し、ＬＮＧＦＲはもはや発現しない。この標的ベクターの略図を図５に示す。
このライブラリーベクター（同様にｐＯＮＹ８．４ベース）も２シストロン性である。ｎｅｏの発現はＬＴＲによって駆動され、必要に応じて選択される。フレーム外であり且つ／又はＩＲＥＳを含まないこの下流には、リボザイムによる切断が好ましくないいくつかの遺伝子がある。これらには、テトラサイクリン抑制因子、ＬＮＧＦＲ、及びＧＦＰが含まれる。ライブラリーのリボザイムがこれらのいずれかの遺伝子配列を切断する場合、パッケージされるゲノムは存在せず、リボザイムはレポーター細胞の形質導入に用いられるベクターライブラリーに表されるべきではない。さらに、リボザイムが必須分子（たとえばＲＮＡポリメラーゼ）を切断する場合、プロデューサー細胞は死滅する。リボザイムの発現は、ＣＭＶプロモーターの制御下にある。このライブラリーベクターの略図を図６に示す。
方法の概要
レポーター細胞（標的ベクターを含有）をリボザイムライブラリーで形質導入する。
遺伝子Ｘの切断は、ＴｅｔＲをコードするｍＲＮＡの分解をもたらす。
Ｔｅｔオペレーターは抑制が解除され、ＬＮＧＦＲが発現する。
細胞の単離
細胞をα−ＬＮＧＦＲで標識し、適切にコンジュゲートされたＭＡＣＳビーズと共にインキュベートし、ＭＡＣＳカラムを通す。このアプローチを図７に例示する。
ＬＮＧＦＲ発現細胞を維持する。これらは細胞数を増大するために、継代培養することができる（ライブラリーベクターを含有する細胞のみが確実に存在するように、ｎｅｏ選択を適用できる）。ＦＡＣＳ分析を行い、ＬＮＧＦＲ発現レベルを測定することができる。ＰＣＲによってこのリボザイムを増幅、配列決定することができる。
ｐＯＮＹ８．４
一連のｐＯＮＹ８．４ベクターは、力価には有害な影響を与えずに、アクセサリータンパク質に完全に非依存性である一過性又は永続性ベクター系の一部として機能できるようにいくつかの修飾を有する。通常は適切な力価を得るために、レンチウイルスベクターゲノムは、プロデューサー細胞（一過性又は永続性）にウイルスタンパク質ｒｅｖの存在を必要とした。これには現在のＨＩＶベクター系、並びに以前のＥＩＡＶベクターが含まれる。一連のｐＯＮＹ８．１ベクターゲノムと比較すると、４つの修飾が存在する。それらは、以下のとおりである。
ａ）ｇａｇから誘導され、パッケージングシグナルの一部を形成するＡＴＧモチーフはすべて、ＡＴＴＧを読み取るように修飾されている。これによりＬＴＲのプロモーターによって駆動され得るオープンリーディングフレームの挿入が可能になる。
ｂ）ゲノムの長さ、すなわちＲ領域間の距離は、野生型ウイルスに見られる距離に近い（７．９ｋｂ）。
ｃ）３’Ｕ３領域は、モロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）Ｕ３領域由来の配列を含むように修飾されており、そのため形質導入されると、内部カセットに加えて第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を駆動することができる。この実施例において、本出願人等はＭＬＶを用いるが、任意のプロモーターであることができる。
ｄ）このベクターは、ウイルスＬＴＲに機能しうる形で連結されたヌクレオチド配列を含有し、前記ヌクレオチド配列は、内部プロモーターの上流であり、前記ヌクレオチド配列は、ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする。
これらの修飾のすべてにより、アクセサリータンパク質を必要とせずにウイルス送達系の生産が可能になり、標的細胞には元のウイルス配列の１０％のみが組み込まれる。これらの要因は、免疫応答、及び複製型ウイルスの生産可能性の観点から、将来の安全性考慮のために重要である。ＬＴＲの修飾に関するさらなる詳細は、本出願人等のＷＯ９６／３７６２３及びＷＯ９８／１７８１６に見出すことができる。
図７は、ＥＩＡＶゲノムの略図である。これらのゲノムは、本発明の方法に従ってトランスフェクトするために用いることができる。トランスフェクションによって、３’ＬＴＲは５’ＬＴＲにコピーされる。図８は、ｐＯＮＹ８．１Ｇの全プラスミド配列を示す。図９は、ｐＯＮＹ８．４ＺＣＧの全プラスミド配列を示す。図１０は、ｐＯＮＹ８．４ＧＣＺの全プラスミド配列を示す。
図１１は、ハイブリッドＵ３領域の略図である。
図１２は、ハイブリッドＬＴＲの配列を示す。
ＥＩＡＶ／ＭＬＶハイブリッドＬＴＲベクターの構築
ＰＣＲは以下のように行った。
産物Ａ＝プライマーＫＭ００１＋ＫＭ００３、標的としてｐＯＮＹ８．１Ｚ
産物Ｂ＝プライマーＫＭ００４＋ＫＭ００５、標的としてｐＨＩＴ１１１
産物Ｃ＝プライマーＫＭ００６＋ＫＭ００２、標的としてｐＯＮＹ８．１Ｚ
ＰＣＲ産物（Ａ、Ｂ、及びＣ）をゲル精製した。産物Ａ及びＢを（プライマーＫＭ００１及びＫＭ００５と共に）用いてＰＣＲ反応を構成し、産物Ｄを得た。産物Ｂ及びＣを（プライマーＫＭ００４及びＫＭ００２と共に）用いてＰＣＲ反応を構成し、産物Ｅを得た。産物Ｄ及びＥをゲル精製し、プライマーＫＭ００１及びＫＭ００２と共に標的としてＰＣＲ反応に用い、産物Ｆを得た。ＰＣＲ産物Ｆをゲル精製した（約１ｋｂ）。次いで、これをＳａｐＩで切断し、ＳａｐＩで切断したｐＯＮＹ８．１Ｚにサブクローニングした。これにより、図１３及び１４に示すベクターｐＯＮＹ８．１Ｚハイブリッドを得た。ＥＩＡＶの３’ＬＴＲは、ＥＩＡＶ／ＭＬＶハイブリッドＬＴＲに置き換えられた。ＥＩＡＶ Ｕ３は、ＭＬＶ Ｕ３領域にほぼ置き換えられた。３’ＬＴＲのＥＩＡＶ５’Ｕ３配列はａｔｔ部位を含み、これは組込みに必要な配列であるため、３’ＬＴＲのＥＩＡＶ５’Ｕ３配列は保持された。
プライマー配列を以下に示す。
ＥＩＡＶ／ＭＬＶハイブリッドＵ３
最終ＰＣＲ産物の配列
パーキンソン病−チロシンヒドロキシラーゼの調節因子の同定
チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）は、ドーパミン合成に必要とされる酵素である。神経成長因子は、ラット交感神経節、副腎髄質、交感神経ニューロン、及びクロム親和細胞においてＴＨを誘導することが知られている。
パーキンソン病を治療する治療可能性を有する分子生物学上の発展は、ニューロトロフィン及び増殖因子をコードする遺伝子のクローニングである。たとえば、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、神経毒素ＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）によって誘発された黒質の変性の進行を停止することが報告されており、ＧＤＮＦ注入は、霊長類パーキンソン症候群モデルにおいて症状を軽減することが報告されている。いくつかの発生上の状況において重要な役割を有することが知られているシグナル伝達分子ソニックヘッジホッグは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発生中の中脳のニューロンを誘導してドーパミン作動性表現型と分化させることができる。これらの結果は、新しい治療方策はドーパミン作動性ニューロンの分化又は生存を促進する分子を同定することであり得ることを示唆している。
別の仮説は、ドーパミン作動性ニューロンは単純に、ドーパミン生産に関与する遺伝子の発現を停止するというものである。ＧＤＮＦに応答して、ドーパミン作動性細胞は、実はこれらの遺伝子の発現を活性化する可能性がある。この場合には、これらの遺伝子の発現を活性化する分子の同定は考慮すべき治療的機能であろう。したがって、これらの分子は、細胞増殖の副作用を伴わずに、ＧＤＮＦで見られる治療効果をもたらす。
チロシンヒドロキシラーゼの発現を調節する分子を同定するための１つのアプローチは以下のとおりである。
方法
１．チロシンヒドロキシラーゼプロモーターを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、低親和性成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）などの適切なレポーター遺伝子によってその活性がモニターされるように、クローニングする。
２．プロモーター−レポーターカセットを、通常はチロシンヒドロキシラーゼを発現してもしなくてもよい１次ニューロン又は１ＲＢ３ＡＮ２７などのドーパミン作動性細胞系に導入する。
３．レポーター細胞をＥＩＡＶベクターの適切なライブラリー（ｃＤＮＡ又はリボザイムなど）で形質導入する。
４．任意選択で細胞を、ＧＤＮＦ又は他の増殖因子の存在下、増殖させる。
５．レポーター遺伝子発現が改変されている細胞を単離し、配列決定によってライブラリーベクターからモジュレート部分を単離する。
６．ライブラリー挿入物の配列から標的部分を同定する。
ｐＯＮＹ８．１ＺＣＧ及びｐＯＮＹ８．０Ｇの相対的ＲＥＶ依存性を、ＲＥＶの存在下及び不在下で導入効率を評価することによって求めた（図１６を参照）。これはｐＥＳＹＮＲＥＶベクターを用いて行った。ｐＥＳＹＮＲＥＶ及びｐＯＮＹ８．０Ｚは、ＷＯ０１７９５１８に記載されている。ｐＯＮＹ８．０Ｇは、ｌａｃＺをＧＦＰで置換して、ｐＯＮＹ８．０Ｚから誘導される。ｐＯＮＹ８．１ＺＣＧはｐＯＮＹ８．４ＺＣＧから誘導されるが、ハイブリッドＬＴＲ又は完全ＡＴＴＧ配列を持たない。ｐＯＮＹ８．１ＺＣＧ及びｐＯＮＹ８．０Ｇの概要を図１５に示す。ｐＯＮＹ８．１ＺＣＧ及びｐＯＮＹ８．０Ｇの導入効率を、ＲＥＶの存在下及び不在下で標準細胞系を用いて評価した。
プロデューサー細胞の細胞質ＲＮＡレベルを定量ＰＣＲを用いて測定し、細胞βアクチンの１００コピーに正規化した。ウイルス採取時に測定を行ったが、この測定は、ＲＥＶの不在下ｐＯＮＹ８．０Ｇプロデューサー細胞においてＥＩＡＶパッケージングシグナルを伴うＲＮＡのレベルが低減することを示す。この相違はｐＯＮＹ８．１ＺＣＧプロデューサー細胞では見られない。このデータは、ｐＯＮＹ８．０Ｇ（±ｐＥＳＹＮＲＥＶ）構築物がＲＥＶ依存性となり、ｐＯＮＹ８．１ＺＣＧ導入効率がＲＥＶ非依存性であることを示す。
ｐＯＮＹ８．４ＥＩＡＶベクターを用い、Ｔ−Ｒｅｘテトラサイクリン調節系を組み込んでテトラサイクリン調節ベクターを作り、ｐＯＮＹ８．４ＴｓｙｎＣｏＧ１を作製した（
図１９及び２０）。このＴｅｔＯ２プロモーターを哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化した（図２１）。ＧＦＰをレポーター遺伝子として用い、発現を測定した。ｐＯＮＹ８．４ＴｓｙｎＣｏＧ１の発現レベル（図２３）は、ＴｅｔＲに結合し、ＴｅｔＯ２の抑制を解除するドキシサイクリン（ｄｏｘ）の不在下に比べて、その存在下で１０倍高いことが示された。親プラスミドｐＯＮＹ８．４ＺＣＧ及びｐＯＮＹ８．４ＴＣＯＧ１によるＧＦＰ発現の比較は、ｄｏｘ不在下での抑制は、ｐＯＮＹ８．４ＺＴｓｙｎＣＯＧ１でのみ得られることを示す。
ｐＯＮＹ８．４ＺＣＧ由来ベクターで形質導入した細胞を、ｄｏｘを含む又は含まない培地で培養し、適切に発現を誘導又は抑制するために交換し、その後再び戻した。コドン最適化ＴｅｔＲを含有するベクターからのＴｅｔ調節遺伝子の発現の「可逆性」を確認した。図２４に示したように交換細胞に見られるＧＦＰ発現は、＋又は−ｄｏｘのいずれかで継続的に増殖した細胞に観察された最高／最低レベルに到達していない。
ＴｅｔＲがそのＣ末端に以下の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有する、ｐＯＮＹ８．４ＴｓｙｎｎｌｓＣＯＧ１を作製した。
ＮＬＳは、核内のＴｅｔＲの濃度を上昇させることによって、転写抑制を３倍に上昇させることが報告されている（Ｏｇｕｅｔａ等）。このＮＬＳを、ＴｅｔＯ２の結合に重要なＴｅｔＲのＮ末端を妨げないように、Ｃ末端に結合した。
ｄｏｘ添加後、どれほど迅速に発現が起こるかを調べるために、経時変化を行った（ＧＦＰによって測定されたｄｏｘ除去後の発現の低減は、タンパク質代謝回転の影響を受ける）。
図２４は、発現はｄｏｘ添加の２４時間以内にほぼ最大であり、ＮＬＳ標識コドン最適化ＴｅｔＲは非標識型に比べて低い基底発現を有さないことを示す。
図２５は、ｐＯＮＹ８．３ベクターの代替ＬＴＲ ＰＧＫ及びＲＳＶからのＧＦＰ発現を示し、代替ハイブリッドＬＴＲもｐＯＮＹ８．４構成ベクターに用いられることを証明している。
２シストロン性Ｔｅｔ調節ベクターを改変して、Ｔｅｔ抑制遺伝子の第２のコピーを組み込むことができる（図２６）。この第２のコピーはＩＲＥＳの下流である。これは細胞が最初に形質導入され、初期にＴｅｔＲタンパク質を含有しないとき、活性に発現される。タンパク質レベルが増大するにつれ、ＩＲＥＳの下流に位置する遺伝子Ｘ及びＴｅｔＲの転写は停止する（テトラサイクリン又はドキシサイクリンは存在しない）。この抑制は、ここに示した改変構築物においてより迅速になる。
ＬＴＲ駆動ＴｅｔＲが存在しないとき、ＴｅｔＲの閾値に応じて、遺伝子Ｘの転写の循環をもたらすフィードバックループが存在する。ＴｅｔＲの構成的に転写されたコピーの存在は、細胞内のＴｅｔＲのレベルを一定に維持することによって、これを回避する。この実施例において、ＩＲＥＳ下流のＴｅｔＲ遺伝子は、望ましくない組換えが起こる可能性を最小にする野生型であるが、しかしながらＴｅｔＲタンパク質をコードする任意の組み合わせの遺伝子配列が想定され得る（ＮＯＩもＩＲＥＳの下流に位置することができる）。
感染細胞のウイルス力価をアッセイすることによって、Ｒｅｖの存在下及び不在下で、ｐＯＮＹ８．４及びｐＯＮＹ８．７ベクターからの発現を検査した。示したウイルスデータは非濃縮、単一プレート由来である。ｐＯＮＹ８．７ＮＣＺを、もう一方のベクターと異なる週、したがってわずかに高い力価で試験した。Ｒｅｖの不在は、ｐＯＮＹ８．４及びｐＯＮＹ８．７ベクターの力価に著しい相違をもたらさず、ｒｅｖ非依存性であることを示した。
本明細書に記載のすべての刊行物は、参照により本明細書の一部とする。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、記載した本発明の方法及び系の種々の修正及び変形が当分野の技術者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、請求されている本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと理解されるべきである。実際、分子生物学又は関連分野の技術者に明らかである本発明を実施するための記載の様式の種々の修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明のスクリーニング法の略図である。 ＮＯＩの標的細胞への導入に適したライブラリー構築物の略図である。 炎症性疾患の薬剤標的を同定するためのレンチウイルス法の略図である。 提示されたポリシスチンシグナル伝達経路の２つの成分を示す図である。 ２シストロン性標的ベクターの略図である。 ２シストロン性ライブラリーベクターの略図である。 細胞の単離を例示する図である。 ＥＩＡＶゲノムの略図である。 図８は、ｐＯＮＹ８．１Ｇの全プラスミド配列を示す図である。 図８は、ｐＯＮＹ８．１Ｇの全プラスミド配列を示す図である。 図９は、ｐＯＮＹ８．４ＺＣＧの全プラスミド配列を示す図である。 図９は、ｐＯＮＹ８．４ＺＣＧの全プラスミド配列を示す図である。 図９は、ｐＯＮＹ８．４ＺＣＧの全プラスミド配列を示す図である。 図１０は、ｐＯＮＹ８．４ＧＣＺの全プラスミド配列を示す図である。 図１０は、ｐＯＮＹ８．４ＧＣＺの全プラスミド配列を示す図である。 図１０は、ｐＯＮＹ８．４ＧＣＺの全プラスミド配列を示す図である。 ハイブリッドＵ３領域の略図である。 ハイブリッドＬＴＲの配列を示す図である。 図１３は、ｐＯＮＹ８．１Ｚｈｙｂの配列を示す図である。 図１３は、ｐＯＮＹ８．１Ｚｈｙｂの配列を示す図である。 図１３は、ｐＯＮＹ８．１Ｚｈｙｂの配列を示す図である。 ｐＯＮＹ８．１Ｚｈｙｂの略図である。 ｐＯＮＹ８．１ＺＣＧ及びｐＯＮＹ８．０Ｇの略図である。 Ｒｅｖの存在下及び不在下のｐＯＮＹ８．１ＺＣＧ及びｐＯＮＹ８．０Ｇの相対形質導入効率を示すグラフである。 図１７は、ｐＯＮＹ８．４ＴＣＯＧの完全配列を示す図である。 図１７は、ｐＯＮＹ８．４ＴＣＯＧの完全配列を示す図である。 図１７は、ｐＯＮＹ８．４ＴＣＯＧの完全配列を示す図である。 図１８は、ｐＯＮＹ８．４ＴｓｙｎＣＯＧ／ｐＯＮＹ８．４ＴｓｙｎＣＯＧ１の完全配列を示す図である。 図１８は、ｐＯＮＹ８．４ＴｓｙｎＣＯＧ／ｐＯＮＹ８．４ＴｓｙｎＣＯＧ１の完全配列を示す図である。 図１８は、ｐＯＮＹ８．４ＴｓｙｎＣＯＧ／ｐＯＮＹ８．４ＴｓｙｎＣＯＧ１の完全配列を示す図である。 ｐＯＮＹ８．４ＴｓｙｎＣＯＧ／ｐＯＮＹ８．４ＴｓｙｎＣＯＧ１の略図である。 ２シストロン性テトラサイクリン調節ベクターの例の略図である。 ＴｅｔＲ遺伝子のコドン使用の分析を示す図である。ＭＨ＝哺乳動物高発現遺伝子、ＷＴ＝野生型ＴｅｔＲ遺伝子、ＣＯ＝コドン最適化ＴｅｔＲ遺伝子。コドン使用は、高発現哺乳動物遺伝子により酷似するように改変されている。 野生型、コドン最適化Ｔｅｔ抑制遺伝子配列のアラインメントを示す図である。配列は、ヌクレオチドレベルで７１％同一である（相同性の最長連続１３ｂｐ）。 野生型、コドン最適化Ｔｅｔ抑制遺伝子配列のアラインメントを示す図である。配列は、ヌクレオチドレベルで７１％同一である（相同性の最長連続１３ｂｐ）。 野生型、コドン最適化Ｔｅｔ抑制遺伝子配列のアラインメントを示す図である。配列は、ヌクレオチドレベルで７１％同一である（相同性の最長連続１３ｂｐ）。 コドン最適化ＴｅｔＲによって、ｄｏｘ不在下でのＧＦＰ発現がｄｏｘ存在下より１０倍低下することを示す図である。この相違は他のベクターを用いるときよりも著しく大きく、ｐＯＮＹ８．４ＴｓｙｎＣＯＧがより良好な抑制の制御を可能にすることを示唆している。 コドン最適化ＴｅｔＲを含有するベクターからのＴｅｔ調節遺伝子発現の可逆性を示す図である。 ドキシサイクリン添加後のＧＦＰ発現の経時変化を示す図である。 代替ＬＴＲからの発現を示す図である。 Ｔｅｔ抑制遺伝子の第２コピーを組み込んでいる２シストロン性Ｔｅｔ調節ベクターの修飾の略図である。 Ｒｅｖの存在下及び不在下のｐＯＮＹ８．４及びｐＯＮＹ８．７ベクターのウイルス力価を示す図である。ｐＯＮＹ８．４及びｐＯＮＹ８．７の発現はＲｅｖ非依存性である。

Claims (22)

  1. ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）の下流で、かつプロモーターの上流に異種オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）又はその一部を含み、前記プロモーターが、パーキンソン病の治療に有用な少なくとも１つの下流の対象となるヌクレオチド（ＮＯＩ）の発現を制御し、補助遺伝子ｒｅｖ又はその機能的等価物をコードする核酸配列が、前記補助遺伝子が機能的補助タンパク質をコードできないように破壊されているか、又はベクターゲノム構築物から除去されており、且つトランスで供給されておらず、前記ＮＯＩが、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ、若しくは小胞モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２）の１又は２以上をコードする、マルチシストロン性レンチウイルスベクターゲノム構築物から作製されるパーキンソン病治療剤。
  2. 異種ＯＲＦ又はその一部が、ＬＴＲに機能しうる形で連結している、請求項１に記載の治療剤。
  3. 異種ＯＲＦ又はその一部が、レポーター部分又は選択可能マーカーである請求項１又は２に記載の治療剤。
  4. 異種ＯＲＦ又はその一部が、モジュレーター遺伝子をコードする請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
  5. ベクターゲノム構築物が、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＥＶ、ＣＡＥＶ、ＭＶＶ、又はビスナレンチウイルスに由来する請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。
  6. ベクターゲノム構築物が、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の治療剤。
  7. ベクターゲノム構築物が、転写後調節エレメント、又は翻訳エレメントを含む請求項１〜６のいずれかに記載の治療剤。
  8. 野生型レンチウイルスベクターゲノムのｇａｇパッケージングシグナルのＡＴＧモチーフがＡＴＴＧモチーフである、請求項１〜７のいずれかに記載の治療剤。
  9. ベクターゲノム構築物のＲ領域間の距離が、野生型レンチウイルスベクターにおける距離と実質的に同じである、請求項１〜８のいずれかに記載の治療剤。
  10. ベクターゲノム構築物の３’Ｕ３領域が、ウイルス及び／又は真核生物プロモーターの配列を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の治療剤。
  11. ベクターゲノム構築物の３’Ｕ３領域が、野生型ウイルス及び／又は真核生物プロモーターを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の治療剤。
  12. ウイルスプロモーターが、ＥＩＡＶ又はＭＬＶ Ｕ３領域である、請求項１〜１１のいずれかに記載の治療剤。
  13. ウイルスプロモーターが、自己不活型ＬＴＲである、請求項１〜１２のいずれかに記載の治療剤。
  14. ベクターゲノム構築物が、２、３又は４シストロン性である、請求項１〜１３のいずれかに記載の治療剤。
  15. Ｇａｇ及びＰｏｌタンパク質、Ｅｎｖタンパク質、又はそれらの機能的代替物を含むベクターの成分をコードする核酸配列のセットを含むレンチウイルスベクター生産システムから作製されるレンチウイルスベクター粒子を含み、
    前記核酸配列のセットが、ベクターゲノム構築物を含み、
    前記粒子が由来するレトロウイルスの補助遺伝子ｒｅｖ、又はその機能的等価物をコードする核酸配列が、前記補助遺伝子が機能的補助タンパク質をコードできないように破壊されているか、又はシステムから除去されている、
    請求項１〜１４のいずれかに記載の治療剤。
  16. 粒子が由来するレトロウイルスの補助遺伝子ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｔａｔ、及びｎｅｆ、又は類似補助遺伝子の少なくとも１つをコードする核酸配列も、前記補助遺伝子が機能的補助タンパク質をコードできないように破壊されているか、又はシステムから除去されている請求項１５に記載の治療剤。
  17. 核酸配列のセットが、ベクターのＲＮＡゲノム、Ｇａｇ及びＰｏｌタンパク質、並びにＥｎｖタンパク質、又はそれらの機能的代替物をコードする３つのＤＮＡ構築物を含む、請求項１５又は１６に記載の治療剤。
  18. ＲＮＡゲノム、Ｇａｇ及びＰｏｌタンパク質、並びにＥｎｖタンパク質、又はそれらの機能的代替物を含むレンチウイルス由来ベクター粒子を含む請求項１〜１４のいずれかに記載の治療剤。
  19. 粒子が由来するレンチウイルスの補助遺伝子ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｔａｔ、及びｎｅｆ、又は類似補助遺伝子の少なくとも１つをコードする核酸配列も、前記補助遺伝子が機能的補助タンパク質をコードできないように破壊されているか、又はシステムから除去されている請求項１８に記載の治療剤。
  20. 請求項１５〜１９のいずれかに記載の治療剤で形質導入された細胞。
  21. 薬学的に許容される担体又は希釈剤をさらに含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の治療剤、又は請求項２０に記載の細胞。
  22. 請求項１〜１９のいずれかに記載の治療剤、又は請求項２０に記載の細胞を含む、パーキンソン病の治療に用いる送達システム。
JP2010144625A 2002-02-01 2010-06-25 ウイルスベクター Expired - Lifetime JP5601898B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0202403A GB0202403D0 (en) 2002-02-01 2002-02-01 Method
GB0202403.2 2002-02-01
GB0212768A GB0212768D0 (en) 2002-05-31 2002-05-31 Method
GB0212768.6 2002-05-31

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003564256A Division JP4598398B2 (ja) 2002-02-01 2003-02-03 ウイルスベクター

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2010263904A JP2010263904A (ja) 2010-11-25
JP5601898B2 true JP5601898B2 (ja) 2014-10-08

Family

ID=27665368

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003564256A Expired - Lifetime JP4598398B2 (ja) 2002-02-01 2003-02-03 ウイルスベクター
JP2010144625A Expired - Lifetime JP5601898B2 (ja) 2002-02-01 2010-06-25 ウイルスベクター

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003564256A Expired - Lifetime JP4598398B2 (ja) 2002-02-01 2003-02-03 ウイルスベクター

Country Status (9)

Country Link
EP (2) EP2348119B1 (ja)
JP (2) JP4598398B2 (ja)
AU (1) AU2003238456A1 (ja)
CY (1) CY1114192T1 (ja)
DK (2) DK1504108T3 (ja)
ES (2) ES2634424T3 (ja)
PT (1) PT1504108E (ja)
SI (1) SI1504108T1 (ja)
WO (1) WO2003064665A2 (ja)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2348119B1 (en) * 2002-02-01 2017-04-26 Oxford BioMedica (UK) Limited Multicistronic lentiviral vector
DK2002003T3 (en) 2005-05-27 2016-03-21 Ospedale San Raffaele Srl Gene vector comprising miRNA
WO2007014363A2 (en) * 2005-07-27 2007-02-01 Genentech, Inc. Vectors for inducible expression of hairpin rna and use thereof
US8765146B2 (en) 2005-08-31 2014-07-01 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
GB0526210D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Vectors
JP5559185B2 (ja) * 2008-11-11 2014-07-23 オックスフォード バイオメディカ（ユーケー）リミテッド 方法
GB201118636D0 (en) 2011-10-28 2011-12-07 Oxford Biomedica Ltd Nucleotide sequence
GB201318804D0 (en) * 2013-10-24 2013-12-11 Adaptimmune Ltd Vectors for transgene expression
GB201322798D0 (en) 2013-12-20 2014-02-05 Oxford Biomedica Ltd Production system
RU2716991C2 (ru) 2014-11-05 2020-03-17 Вояджер Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды aadc для лечения болезни паркинсона
GB2540786A (en) * 2015-07-28 2017-02-01 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Codon optimised tet repressor proteins
EP3380620A1 (en) 2015-11-23 2018-10-03 Novartis AG Optimized lentiviral transfer vectors and uses thereof
FR3044017B1 (fr) 2015-11-24 2019-05-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Procede de transfection transitoire pour la production retrovirale
RU2752498C2 (ru) * 2015-11-24 2021-07-28 Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед Стабильные клеточные линии для продуцирования ретровирусов
CN110678197A (zh) 2017-03-15 2020-01-10 牛津生物医学（英国）有限公司 方法
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
ES2951857T3 (es) 2017-12-22 2023-10-25 Oxford Biomedica Ltd Vector retroviral
EP3836956A4 (en) * 2018-08-16 2022-05-18 Spacecraft Seven, LLC METHODS FOR PRODUCING VIRAL VECTORS
WO2020106621A1 (en) * 2018-11-19 2020-05-28 Board Of Regents, The University Of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
CA3133188A1 (en) 2019-03-10 2020-09-17 Oxford Biomedica (Uk) Limited Gene therapy compositions and methods for treating parkinson's disease
EP4058067A1 (en) 2019-11-12 2022-09-21 Oxford BioMedica (UK) Limited Production system
US20240052366A1 (en) 2020-02-13 2024-02-15 Oxford Biomedica (Uk) Limited Production of Lentiviral Vectors
EP4118217A1 (en) 2020-03-13 2023-01-18 Oxford BioMedica (UK) Limited Lentiviral vectors
AU2021264465A1 (en) 2020-04-27 2022-12-15 University Of Iowa Research Foundation Compositions and methods for the treatment of cystic fibrosis
GB202007199D0 (en) 2020-05-15 2020-07-01 Oxford Biomedica Ltd Viral vector production
IL300219A (en) * 2020-08-03 2023-03-01 Prevail Therapeutics Inc Parkin-encoding AAV vectors and uses thereof
GB202017725D0 (en) 2020-11-10 2020-12-23 Oxford Biomedica Ltd Method
GB202114530D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Retroviral vectors
GB202114529D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral vectors
GB202114532D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral Vectors
GB202114528D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral vectors
GB202114534D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Novel viral regulatory elements
GB202117844D0 (en) 2021-12-09 2022-01-26 Oxford Biomedica Ltd Purification method
GB202211935D0 (en) 2022-08-16 2022-09-28 Oxford Biomedica Ltd envelope proteins

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6075190A (en) 1989-06-30 1991-01-17 Regents Of The University Of California, The Retrovirus detection
EP1285967A3 (en) 1990-09-21 2005-03-02 Chiron Corporation Human retroviral packaging cell line
DE4228458A1 (de) * 1992-08-27 1994-06-01 Beiersdorf Ag Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung
US5834256A (en) 1993-06-11 1998-11-10 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
EP0758397B1 (en) 1994-04-29 2005-06-22 Baxter Healthcare S.A. Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions
WO1996009400A1 (en) 1994-09-19 1996-03-28 Systemix, Inc. Methods for genetically modifying hematopoietic stem cells
AU716045B2 (en) 1994-11-28 2000-02-17 Genetic Therapy, Inc. Vectors for tissue-specific replication
GB9510272D0 (en) 1995-05-22 1995-07-19 Isis Innovation Retroviral vectors
WO1997014809A2 (en) * 1995-10-16 1997-04-24 Dana-Farber Cancer Institute Novel expression vectors and methods of use
WO1997017457A2 (en) 1995-11-08 1997-05-15 Whitehead Institute For Biomedical Research Stable packaging cell line producing pseudotyped retroviruses
US6133027A (en) 1996-08-07 2000-10-17 City Of Hope Inducible expression system
US5739018A (en) 1996-08-07 1998-04-14 The Regents Of The University Of California Packaging cell lines for pseudotyped retroviral vectors
US6126939A (en) 1996-09-03 2000-10-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-inflammatory dipeptide and pharmaceutical composition thereof
CZ137399A3 (cs) 1996-10-17 1999-07-14 Oxford Biomedica (Uk) Limited Retrovirový produkční systém pro produkci replikačně defektivních vektorovýh partikulí
GB9621680D0 (en) 1996-10-17 1996-12-11 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral vectors
WO1999032646A1 (en) * 1997-12-22 1999-07-01 Oxford Biomedica (Uk) Limited Equine infectious anaemia virus (eiav) based
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9720465D0 (en) 1997-09-25 1997-11-26 Oxford Biomedica Ltd Dual-virus vectors
WO1999040930A1 (en) 1998-02-12 1999-08-19 Center For Blood Research, Inc. Specific inhibitors of nfat activation by calcineurin and their use in treating immune-related diseases
GB9803351D0 (en) 1998-02-17 1998-04-15 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
CA2322664A1 (en) 1998-03-06 1999-09-10 Oxford Biomedica (Uk) Limited Enhanced prodrug activation
CN1325653C (zh) 1998-05-22 2007-07-11 牛津生物医学（英国）有限公司 逆转录病毒传递系统
DE69839970D1 (de) 1998-11-10 2008-10-16 Univ Rochester Methoden zu herstellung von genbanken
EP1160323A1 (en) 1998-11-18 2001-12-05 Oxford Biomedica (UK) Limited 5T4 tumour-associated antigen for use in tumour immunotherapy
GB9912965D0 (en) 1999-06-03 1999-08-04 Oxford Biomedica Ltd In vivo selection method
GB0009760D0 (en) * 2000-04-19 2000-06-07 Oxford Biomedica Ltd Method
GB0024550D0 (ja) * 2000-10-06 2000-11-22 Oxford Biomedica Ltd
EP2348119B1 (en) * 2002-02-01 2017-04-26 Oxford BioMedica (UK) Limited Multicistronic lentiviral vector

Also Published As

Publication number Publication date
DK1504108T3 (da) 2013-06-10
ES2411981T3 (es) 2013-07-09
EP2348119A3 (en) 2011-11-02
AU2003238456A1 (en) 2003-09-02
JP2005515783A (ja) 2005-06-02
EP1504108B1 (en) 2013-04-17
WO2003064665A2 (en) 2003-08-07
SI1504108T1 (sl) 2013-07-31
WO2003064665A3 (en) 2004-12-02
EP2348119B1 (en) 2017-04-26
EP1504108A2 (en) 2005-02-09
DK2348119T3 (en) 2017-08-21
CY1114192T1 (el) 2016-08-31
JP4598398B2 (ja) 2010-12-15
EP2348119A2 (en) 2011-07-27
JP2010263904A (ja) 2010-11-25
PT1504108E (pt) 2013-06-12
ES2634424T3 (es) 2017-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5601898B2 (ja) ウイルスベクター
JP4981231B2 (ja) レトロウイルスパッケージング細胞での発現のためのコドン最適化
JP4578678B2 (ja) ウマ伝染性貧血ウイルス（ｅｉａｖ）系
EP1218528A1 (en) Producer cell for the production of retroviral vectors
JP2003511083A (ja) レンチウイルスの三重鎖ｄｎａ、並びにレンチウイルスの三重鎖ｄｎａを含有するベクター及び組換え細胞
US20050260164A1 (en) Gene regulation with aptamer and modulator complexes for gene therapy
US20040234505A1 (en) Polynucleotide constructs and uses thereof
JP2001517453A (ja) 方 法
US6969598B2 (en) Methods for producing high titre vectors and compositions used in such methods
US9738907B2 (en) Viral vector
EP1115877B1 (en) Polynucleotide constructs and uses thereof
US20030143205A1 (en) Alphavirus expression systems
AU2001248619C1 (en) Method
GB2356200A (en) Hybrid viral vectors
CA2343324A1 (en) Polynucleotide constructs and uses thereof
AU2001248619A1 (en) Method
ZA200101494B (en) Polynucleotide contructs and uses therof.

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20120827

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20121127

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20121130

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20121221

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20121227

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20130122

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20130125

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130227

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20131001

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20131217

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20131220

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140401

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20140804

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20140819

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5601898

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term