ES2634424T3 - Vector multicistrónico lentivírico - Google Patents

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Abstract

Un genoma de vector multicistrónico derivable de un lentivirus para uso en un sistema de producción lentivírico independiente de rev para producir una partícula de vector derivada de lentivirus, comprendiendo dicho genoma una señal de empaquetamiento, un marco de lectura abierto (ORF) heterólogo en 3' de una LTR vírica y en 5' de un promotor, en el que el promotor controla la expresión de al menos un nucleótido de interés (NOI) en 3' útil en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, y en el que el ORF heterólogo está ligado operativamente con la LTR; en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen auxiliar rev está alterada de tal modo que dicho gen auxiliar es incapaz de codificar la proteína auxiliar funcional, o se retira del genoma del vector lentivírico, y en el que el elemento de respuesta a Rev (RRE) está alterado de tal modo que dicho RRE no es funcional, o se retira del genoma de vector lentivírico, y en el que el vector lentivírico es un vector lentivírico autoinactivante.

Description

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produce una línea celular estable a la que se hace referencia como la línea celular de empaquetamiento. La línea celular de empaquetamiento produce las proteínas necesarias para empaquetar ARN retrovírico, pero no pude causar la encapsidación debido a la falta de una región psi. Sin embargo, cuando se introduce un genoma de vector según el primer aspecto de la invención (que tiene una región psi) en la línea celular de empaquetamiento, las proteínas auxiliares pueden empaquetar el ARN del vector recombinante positivo de psi, produciendo una provisión de virus recombinante. Esta puede usarse para transducir el NOI en células receptoras. El virus recombinante cuyo genoma carece de todos los genes necesarios para preparar proteínas víricas puede infectar solo una vez y no puede propagarse. Por tanto, se introduce el NOI en el genoma de la célula hospedadora sin generación de retrovirus potencialmente dañinos. Se presenta un resumen de las líneas de empaquetamiento disponibles en "Retroviruses" (1997, Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus, pág. 449).
La presente invención proporciona también una línea celular de empaquetamiento que comprende un genoma de vector vírico del primer aspecto de la invención. Por ejemplo, la línea celular de empaquetamiento puede transducirse con un sistema de vector vírico que comprende el genoma o transfectarse con un plásmido portador de un constructo de ADN capaz de codificar el genoma de ARN. La presente invención puede proporcionar también una partícula de vector lentivírico producida por dicha célula.
El segundo enfoque es introducir las tres diferentes secuencias de ADN que son necesarias para producir una partícula de vector retrovírico, concretamente la secuencia de codificación de env, la secuencia de codificación de gag-pol y el genoma retrovírico defectivo que contiene uno o más NOI en la célula al mismo tiempo mediante transfección transitoria, y se hace referencia al procedimiento como transfección transitoria triple (Landau y Littman 1992; Pear et al. 1993). El procedimiento de transfección triple se ha optimizado (Soneoka et al. 1995; Finer et al. 1994). El documento WO 94/29438 describe la producción de células productoras in vitro usando este procedimiento de transfección transitoria múltiple de ADN.
Los componentes del sistema vírico que son necesarios para complementar el genoma de vector pueden estar presentes en uno o más “plásmidos productores” para transfectar en células.
La presente invención proporciona también un sistema de vector que comprende:
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un genoma vírico según el primer aspecto de la invención;
(ii)
una secuencia nucleotídica que codifica las proteínas gag y pol lentivíricas;
(iii) secuencias nucleotídicas que codifican otros componentes de empaquetamiento víricos esenciales no codificados por la secuencia nucleotídica de ii). En una realización preferida, la secuencia nucleotídica de (iii) es capaz de codificar una proteína env. La presente invención proporciona también una célula transfectada con dicho sistema de vector y una partícula de vector lentivírico producida por dicha célula. Preferiblemente, la secuencia de gag-pol tiene optimización de codones para uso en la célula productora particular (véase a continuación).
La proteína env codificada por la secuencia nucleotídica de (iii) puede ser una proteína env retrovírica o lentivírica homóloga. Como alternativa, puede ser una env heteróloga o una env de un no retrovirus ni lentivirus (véase a continuación “seudotipado”).
El término “sistema de vector vírico” se usa generalmente para indicar un kit de piezas que puede usarse combinado con otros componentes necesarios para la producción de partículas víricas para producir partículas víricas en células hospedadoras. Por ejemplo, el genoma de vector retrovírico puede carecer de uno o más de los genes necesarios para replicación vírica. Este puede combinarse en un kit con una secuencia o secuencias nucleotídicas complementarias adicionales, por ejemplo en uno o más plásmidos productores. Mediante la cotransfección del genoma junto con el plásmido o plásmidos productores, deberían proporcionarse los componentes necesarios para la producción de partículas víricas infecciosas.
Como alternativa, la secuencia o secuencias nucleotídicas complementarias pueden estar presentes establemente en una línea celular de empaquetamiento que se incluye en el kit.
La presente invención se refiere también un sistema de vector lentivírico que es capaz de suministrar un genoma de ARN a una célula receptora, como se define en las reivindicaciones, en las que el genoma es más largo que el genoma de tipo silvestre del retrovirus. El sistema de vector puede ser, por ejemplo, un sistema de vector de ELAV.
Preferiblemente, el genoma de ARN del sistema de vector tiene hasta un 5%, más preferiblemente hasta un 10% más bases que el genoma de tipo silvestre. Preferiblemente, el genoma de ARN es aproximadamente un 10% más largo que el genoma de tipo silvestre. Por ejemplo, el EIAV de tipo silvestre comprende un genoma de ARN de aproximadamente 8 kb. Un sistema de vector de EIAV de la presente invención puede tener un genoma de ARN de hasta (preferiblemente aproximadamente) 8,8 kb.
El sistema de vector lentivírico de la presente invención es un sistema de vector autoinactivante (SIN).
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Preferiblemente, las secuencias de proteína de cubierta y secuencias de nucleocápsida están todas integradas establemente en la célula productora y/o de empaquetamiento. Sin embargo, una o más de estas secuencias podría existir también en forma episómica y podría ocurrir expresión génica a partir del episoma.
Como se usa en la presente memoria, el término “célula de empaquetamiento” hace referencia a una célula que contiene aquellos elementos necesarios para la producción de un virus recombinante infeccioso de los que carece el genoma de ARN. Típicamente, dichas células de empaquetamiento contienen uno o más plásmidos productores que son capaces de expresar proteínas estructurales víricas (tales como gag-pol y env con optimización de codones) pero no contienen una señal de empaquetamiento.
El término “señal de empaquetamiento”, al que se hace referencia intercambiablemente como “secuencia de empaquetamiento” o “psi”, se usa con referencia a la secuencia no codificante de acción en cis requerida para la encapsidación de hebras de ARN retrovírico durante la formación de partículas víricas. En HIV-1, esta secuencia se ha cartografiado en loci que se extienden en 5’ del sitio donante de corte y empalme principal (SD) hasta al menos el codón de inicio de gag.
Pueden prepararse fácilmente líneas celulares de empaquetamiento adecuadas para uso con los constructos de vector descritos anteriormente (véase también el documento WO 92/05266), y utilizarse para crear líneas celulares productoras para la producción de partículas de vector retrovírico. Como ya se ha mencionado, se presenta un resumen de las líneas de empaquetamiento disponibles en "Retrovirus" (como anteriormente).
Como también se discute anteriormente, se ha encontrado que las líneas celulares de empaquetamiento sencillas, que comprenden un provirus en que se ha eliminado la señal de empaquetamiento, conducen a la rápida producción de virus competentes de replicación indeseables mediante recombinación. Para mejorar la seguridad, se han producido líneas celulares de segunda generación en las que se elimina la 3’ LTR del provirus. En dichas células, serían necesarias dos recombinaciones para producir un virus de tipo silvestre. Una mejora adicional implica la introducción de los genes gag-pol y el gen env en constructos separados en las llamadas líneas celulares de empaquetamiento de tercera generación. Estos constructos se introducen secuencialmente para evitar la recombinación durante la transfección.
Preferiblemente, las líneas celulares de empaquetamiento son líneas celulares de empaquetamiento de segunda generación.
Preferiblemente, las líneas celulares de empaquetamiento son líneas celulares de empaquetamiento de tercera generación.
En estas líneas celulares de tercera generación de constructo escindido, puede conseguirse una reducción adicional de la recombinación cambiando los codones. Esta técnica, basada en la redundancia del código genético, se orienta a reducir la homología entre los constructos separados, por ejemplo entre las regiones de superposición en los marcos de lectura abiertos de gag-pol y env.
Las líneas celulares de empaquetamiento son útiles para proporcionar los productos génicos necesarios para encapsidar y proporcionar una proteína de membrana para la producción de partículas de vector de alto título. La célula de empaquetamiento puede ser una célula cultivada in vitro tal como una línea celular de cultivo de tejido. Las líneas celulares adecuadas incluyen, pero sin limitación, células de mamífero tales como líneas celulares derivadas de fibroblasto de murino o líneas celulares humanas. Preferiblemente, la línea celular de empaquetamiento es una línea celular humana tal como, por ejemplo: HEK293, 293-T, TE671, HT1080.
Como alternativa, la célula de empaquetamiento puede ser una célula derivada del individuo para tratar tal como un monocito, macrófago, célula sanguínea o fibroblasto. La célula puede aislarse del individuo y administrarse los componentes de empaquetamiento y de vector ex vivo seguidos de la readministración de las células de empaquetamiento autólogas.
Con más detalle, la célula de empaquetamiento puede ser una célula de empaquetamiento in vivo en el cuerpo del individuo para tratar o puede ser una célula cultivada in vitro tal como una línea celular de cultivo de tejido. Las líneas celulares adecuadas incluyen células de mamífero tales como líneas celulares derivadas de fibroblasto de murino o líneas celulares humanas. Preferiblemente, la línea celular de empaquetamiento es una línea celular humana, tal como por ejemplo una línea celular 293, HEK293, 293-T, TE671, HT1080.
Como alternativa, la célula de empaquetamiento puede ser una célula derivada del individuo para tratar tal como un monocito, macrófago, citoblasto, célula sanguínea o fibroblasto. La célula puede aislarse del individuo y administrarse los componentes de empaquetamiento y de vector ex vivo seguidos de la readministración de las células de empaquetamiento antólogas. Como alternativa, los componentes de empaquetamiento y de vector pueden administrarse a la célula de empaquetamiento in vivo. Los procedimientos para introducir componentes de empaquetamiento lentivírico y de vector en células de un individuo son conocidos en la materia. Por ejemplo, es un enfoque introducir las diferentes secuencias de ADN que se requieren para producir una partícula de vector
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empalme, deleciones de gag y env. Se ha encontrado sorprendentemente que una deleción de todo menos los 360
o así nucleótidos N-terminales de gag conduce a un aumento del título de vector. Por tanto, preferiblemente, el genoma de vector retrovírico incluye una secuencia de gag que comprende una o más deleciones, más preferiblemente la secuencia de gag comprende aproximadamente 360 nucleótidos derivables del extremo N.
La secuencia de TetR puede someterse útilmente a optimización de codones usando los codones mostrados en la figura 21.
NOI
En la presente invención, el término NOI (secuencia nucleotídica de interés) se refiere a secuencias nucleotídicas útiles en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo. También se divulga cualquier secuencia nucleotídica adecuada que no tiene que ser necesariamente una secuencia de ADN o ARN de origen natural completa. Por tanto, el NOI puede ser, por ejemplo, una secuencia de ARN/ADN sintética, una secuencia de ARN/ADN recombinante (concretamente, preparada mediante el uso de técnicas de ADN recombinante), una secuencia de ADNc o una secuencia de ADN genómico parcial, incluyendo combinaciones de las mismas. La secuencia no tiene que ser una región de codificación. Si es una región de codificación, no tiene que ser una región de codificación entera. Además, la secuencia de ARN/ADN puede estar en orientación codificante o en orientación anticodificante. Preferiblemente, está en orientación codificante. Preferiblemente, la secuencia es de, o se transcribe a partir de, ADNc.
Los NOI, a los que también se hace referencia como “secuencias heterólogas”, “genes heterólogos” o “transgenes” pueden ser uno cualquiera o más de, por ejemplo, uno o varios genes de selección, genes marcadores o genes terapéuticos.
El NOI puede ser un gen candidato que es de significación potencial en un proceso patológico. Por tanto, el sistema de vector de la presente invención puede usarse, por ejemplo, con fines de validación de diana.
El NOI tiene una aplicación terapéutica. Los NOI adecuados incluyen, pero sin limitación: secuencias que codifican enzimas, citocinas, quimiocinas, hormonas, anticuerpos, moléculas antioxidantes, moléculas de tipo inmunoglobulina genomanipuladas, un anticuerpo monocatenario, proteínas de fusión, moléculas coestimuladoras inmunitarias, moléculas inmunomoduladoras, un ARN anticodificante, un mutante negativo transdominante de una proteína diana, una toxina, una toxina condicional, un antígeno, una proteína y factores de crecimiento supresores tumorales, proteínas de membrana, proteínas y péptidos vasoactivos, proteínas y ribozimas antivíricas y derivados de los mismos (tales como con un grupo informador asociado). Los NOI pueden codificar también enzimas activadoras de profármacos.
La secuencia de codificación de NOI puede codificar un segmento de una secuencia de codificación.
El NOI es útil en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo.
Preferiblemente, el NOI es útil en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
El NOI puede codificar una enzima involucrada en la síntesis de la dopamina. Por ejemplo, la enzima puede ser una de las siguientes: tirosina hidroxilasa, GTP-ciclohidrolasa 1 y/o aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa. Las secuencias de los tres genes están disponibles en los números de orden: X05290, U19523 y M76180, respectivamente.
Alternativamente, el NOI puede codificar el transportador vesicular de monoaminas de tipo 2 (VMAT2). En una realización preferente, el genoma vírico comprende un NOI que codifica el aminoácido aromático DOPAdescarboxilasa y un NOI que codifica el VMAT2. Tal genoma puede utilizarse en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, en particular, junto con la administración periférica de la L-DOPA.
Alternativamente, el NOI puede codificar un factor capaz de bloquear o inhibir la degeneración del sistema nigroestriatal. Un ejemplo de tal factor es un factor neurotrófico. Por ejemplo, el NOI puede codificar el factor neurotrófico obtenido de la línea celular glial (GDNF) o el factor neurotrófico obtenido del cerebro (BDNF).
Como alternativa, el NOI puede codificar un factor neuroprotector. En particular, los NOI pueden codificar moléculas que evitan que las neuronas positivas de TH mueran o que estimulan la regeneración y recuperación funcional en el sistema nigroestriado dañado.
El NOI puede codificar toda o parte de la proteína de interés (“POI”) o un mutante, homólogo o variante de la misma. Por ejemplo, el NOI puede codificar un fragmento de la POI que es capaz de funcionar in vivo de manera análoga a la proteína de tipo silvestre.
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