CN111315761A - 用于选择性转导靶细胞的基于衔接子的逆转录病毒载体系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种组合物，该组合物包含：i)假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其包含a)具有抗原结合活性的一种包膜蛋白，其中所述包膜蛋白是不与至少一个其天然受体相互作用的重组蛋白，并在其胞外域与包含对标记的多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域的多肽融合，并且其中所述包膜蛋白是源自副粘病毒科的蛋白G、HN或H，和b)源自副粘病毒科的具有融合活性的包膜蛋白；和ii)所述标记的多肽，其中所述标记的多肽与靶细胞表面上表达的抗原特异性结合，从而用所述逆转录病毒载体颗粒转导靶细胞或从而诱导病毒样颗粒摄取到靶细胞中。还公开了其药物组合物和用所述载体颗粒转导靶细胞的体外方法。

Description

用于选择性转导靶细胞的基于衔接子的逆转录病毒载体系统

技术领域

本发明涉及具有对标签的特异性的假型逆转录病毒载体颗粒或其载体样颗粒(VLP)的领域，其中所述标签与结合至靶细胞上表达的抗原的多肽偶联，从而允许用所述逆转录病毒载体颗粒或其载体样颗粒靶向转导多个靶细胞部分。

背景技术

使用逆转录病毒载体进行基因递送是纠正缺陷基因并为细胞提供新功能的一种广泛使用的方法。然而，由于常用类型的逆转录病毒载体的性质，它们按照设计不是选择性的，这阻碍了逆转录病毒载体在许多治疗领域中的安全性特性和适用性。

通常，逆转录病毒载体是用水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV-G)的包膜蛋白假型化的。这种假型转导包括治疗相关细胞类型在内的广泛的靶细胞，但是它可能需要使用刺激剂进行预激活以达到足够的转导效率水平。

而且，在混合细胞群体中，需要如磁性细胞分选的选择程序以仅在限定的细胞类型中表达靶基因。因此，避免了导致潜在的副作用的脱靶群体的转导。

或者，测试了设计按照设计具有选择性并因此不需要预选择靶群体的LV系统的尝试。但是，这些系统在选择性、生产率或适用性方面受到限制。

US20160333374描述了一种基于与VSV-G的胞外域融合的抗体片段如scFV(VSVG-scFV)的系统。目标是将VSV-G的有利生产率与scFV的特异性结合起来。该方法能够实现与靶抗原的结合，但是VSVG-scFV不能介导逆转录病毒与靶细胞膜的融合，并因此也不能介导转导。为了克服这一障碍，必须将未修饰的VSV-G与VSVG-scFV共同展示。因此，功能性但非选择性的VSV-G与选择性但非功能性VSV-G-scFV的共同展示仅导致靶抗原表达细胞的优先转导。但最重要的是，由于(非选择性)天然VSV-G的保留功能，不表达靶抗原的细胞也被转导。因此，该系统有利于靶抗原表达细胞的转导，但不是真正选择性的。

较高选择性对于已融合至scFV的用包含具有融合活性的蛋白(F蛋白)和具有抗原结合活性的蛋白(H蛋白)的麻疹病毒包膜蛋白(MV-LV)假型化的重靶向慢病毒载体观察到(WO2008/037458A2)。已经对该系统的广泛应用在体外而且在体内进行了多种抗原的测试(Anliker等(2010))。然而，对于靶向逆转录病毒载体的各自特异性，需要单独的逆转录病毒生产。因此，该系统不允许逆转录病毒载体特异性的完全灵活性。而且，从而对靶向细胞群体的转导效率的控制，例如，通过整合的载体拷贝数(VCN)来控制目的基因的表达率受到限制。

不仅成功地用截短的麻疹病毒包膜蛋白对慢病毒载体进行了假型化，而且对γ逆转录病毒载体也进行了成功的假型化(Edes(2016)，Frecha等(2008))。有趣的是，在γ-逆转录病毒载体的情况下，与对于慢病毒载体假型化测试的变体相比，用略有不同的截短变体测量了最高的逆转录病毒载体滴度。尽管这些系统是功能性的，但已观察到一些技术缺陷。例如，逆转录病毒载体滴度高度依赖于生产过程中(即转染HEK-293T细胞时)嵌合H-scFV蛋白的表面表达水平。特别地，已经显示出scFV的框架区的序列影响所展示的scFV的生物物理特性，并因此影响功能性逆转录病毒载体滴度(Friedel等(2015))。

Bender等(2016)，Khetawat和Broder(2010)和US9486539B2还显示，源自另一副粘病毒科病毒尼帕(Nipah)病毒的包膜蛋白也可用于假型化慢病毒载体，并任选地将其重新靶向以用于选择性转导。有趣的是，Rasbach等(2013)向MV-LV添加了具有抗原结合功能的非病毒跨膜蛋白，使得使用了3种不同的膜蛋白进行假型化。使用这种方法，麻疹H蛋白的附着功能被非病毒跨膜蛋白替代，但是仍然需要麻疹H蛋白的融合辅助功能来产生功能性假型化慢病毒载体。与仅用2种包膜蛋白假型化的慢病毒载体相比，添加另一膜蛋白使功能性慢病毒载体滴度提高约一个数量级。

然而，对于先前已经描述的所有假型化逆转录病毒载体系统，仍然存在一个主要缺点：对于靶向逆转录病毒载体的各自特异性，由于必须使用不同的包膜蛋白构建体，因此需要单独的逆转录病毒产生。假型化逆转录病毒载体的产生不仅费力且昂贵，而且还需要分批进行QC测试以测定功能性逆转录病毒载体滴度。另外，这些系统既不提供高度灵活的解决方案以即时改变假型化逆转录病毒载体的特异性，也不能够控制转导效率以对于特定应用的实际需求而调节。从安全的角度来看，特别是在讨论VCN上限的临床环境中，需要控制整合的载体拷贝数基因组。

可选地，在本领域中开发了具有通用逆转录病毒载体的基于通用衔接子的系统，其通过添加对选择的抗原具有特异性的工程化多肽而变得具有选择性(在Metzner等(2013)中综述)。例如，Roux等(1989)描述了在基于双特异性抗体复合物的γ逆转录病毒载体的情况下的基于衔接子的系统。一种对γ逆转录病毒颗粒特异性的生物素化抗体通过抗生物素蛋白与另一种对靶细胞选择表达的所选择靶抗原特异性的生物素化抗体偶联。但是，作者注意到低转导率，并假设测试的特异性或抗体复合物本身可以解释所观察到的有限效率。

Snitkovsky等(2002)提供了基于逆转录病毒载体的替代系统，所述逆转录病毒载体结合由与抗原结合配体如scFV融合的细胞外受体结构域组成的重组衔接子分子。在这里，再次观察到具有最高5％的转导靶细胞的非常有限的效率。

Morizono等(2009)开发了慢病毒载体，其提供了特异性结合用作衔接子分子的抗体Fc部分的蛋白A结构域。由于Fc对蛋白A的亲和力低，因此还评估了生物素抗生物素蛋白的相互作用。生物素通过插入的细菌生物素衔接子肽(BAP)将加入病毒包膜蛋白中。在此，使用抗生物素蛋白缀合的IgG作为衔接子。然而，抗生物素蛋白也结合带电的细胞表面分子。因此，作为结果，抗生物素蛋白缀合的抗体也可以非特异性地与非靶细胞结合，这限制了其适用性。

Kaikkonen等(2009年)也使用生物素抗生物素蛋白相互作用来特异地转导具有衔接子分子的靶细胞。这次，展示抗生物素蛋白的逆转录病毒载体应用于生物素化的配体或抗体。将抗生物素蛋白添加到VSV-G的跨膜锚中以有效并入(抗生物素蛋白-VSVG)。由于该重组包膜蛋白仅促进结合但不再促进融合，所以源自杆状病毒的gp64在逆转录病毒载体的表面上共表达。Kaikkonen等(2009)选择了对在肿瘤细胞上过表达的受体(转铁蛋白受体，EGFR和CD46)特异性的衔接子。该系统并非真正选择性的，因为gp64与抗生物素蛋白-VSVG一起在逆转录病毒载体包膜上共同展示。衔接子的添加增强了靶细胞群体的转导，但是还检测到非特异性转导。对于使用生物素相互作用的所有适应性逆转录病毒载体系统，非特异性转导尤其关键。生物素特异性逆转录病毒载体可与细胞表面上存在的天然存在的生物素结合，其诱导这些细胞的非特异性转导。反之亦然，对生物素特异性的衔接子分子也可以与非靶细胞上存在的天然存在的生物素结合。

Hoop(2014)使用以麻疹病毒包膜蛋白(MV-LV)假型化的慢病毒载体来开发基于衔接子的逆转录病毒载体系统。这次使用了识别天然受体的截短的H蛋白变体(即，无scFV)。衔接子设计的方式使得慢病毒载体结合结构域是麻疹病毒受体(CD46)的胞外部分。可溶性受体片段通过柔性(G4S)3接头与靶细胞抗原结合区域融合。令人惊讶地发现，衔接子使假型化LV颗粒成为非选择性的：即，不仅在靶细胞群体上的转导效率提高，而且在不表达衔接子的靶抗原的非靶标群体上的转导效率也提高。该衔接子的作用可与众所周知的转导增强试剂如

Protaminesulfate或

相当。但是这些试剂的作用方式是克服病毒和靶细胞膜的电荷排斥作用，从而使两层膜紧密靠近，并提高转导效率水平和基因转移率。

因此，本领域中描述的技术显示在选择性、控制性或适用性方面的结果，但是这些系统均未提供组合地满足所有这些参数的解决方案。

总之，在本领域中需要在假型化逆转录病毒载体或其病毒样颗粒领域中可选的和/或改进的转导技术，例如组合地满足上述参数并允许用假型化逆转录病毒载体或其病毒样颗粒受控和选择性地转导靶细胞且可在临床上应用的方法。

发明内容

发明人惊异地发现用副粘病毒科病毒包膜蛋白假型化的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒(其具有抗原结合和融合活性且其中所述具有抗原结合活性的蛋白质是不与至少一个其天然受体相互作用的嵌合蛋白质)可用于产生具有高靶细胞选择性的适应性逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒系统。这一发现是令人惊讶的，因为同样基于副粘病毒科源的包膜蛋白进行假型化的另一种可选途径清楚地表明，这种假型化的逆转录病毒载体在衔接子存在下非选择性地转导(Hoop，2014)。

在本发明的一个实施方式中，提供了一种适应性逆转录病毒载体或其病毒样颗粒系统，其也使用生物素相互作用来结合于衔接子分子，其中衔接子分子包含通过特异性接头与生物素偶联的多肽，例如，与靶细胞抗原结合的抗体。与游离生物素或以另一种方式与如多肽的部分偶联的生物素相比，如本文公开的逆转录病毒的包膜蛋白以更高的优先度结合衔接子分子的生物素。因此，与现有技术的可选系统相反，与天然存在的生物素没有竞争或竞争较少，从而避免了例如受限的或非特异性的转导。

本发明的发现利用了以大规模更有效地产生的“通用”逆转录病毒载体。通过调整衔接子的量和特异性，用户可以仅在靶细胞上以可调的方式获得对转导过程的完全控制。

例如，产生不与其天然受体CD46、Nectin-4和/或SLAM相互作用的重组的截短H蛋白形式(通过将众所周知的突变引入截短的H蛋白中)以及包含抗原结合结构域的多肽，其中所述多肽对标记的多肽的标签具有特异性，并且其中所述标记的多肽与靶细胞表面上表达的抗原特异性结合。因此，本文公开的适应性逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的系统包含本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒和相应的标记的多肽。

例如，截短的F蛋白介导病毒膜和靶细胞的细胞膜的融合。截短的H蛋白支持融合功能，但不与其天然受体CD46、Nectin-4或SLAM相互作用，因为它通过引入突变而失能(blinded)。包含含有抗原结合结构域的多肽的嵌合蛋白的部分特异性结合标记的多肽的标签。标签可以是葡聚糖、半抗原如FITC和生物素或者如本文公开的靶细胞结合分子(TCBM)的接头/标记表位(LLE)。标记的多肽可以是，例如，特异性结合在靶细胞表面上表达的抗原的半抗原化(haptenylated)抗体或其抗原结合片段，例如，对所选抗原特异性的生物素化抗体。

因此，如本文所公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒进入表达由标记的多肽的抗原结合结构域结合的相应标志物(抗原)的那些细胞，其中逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒通过包含对截短的受体结合蛋白(例如，逆转录病毒载体颗粒的H蛋白)的标签具有特异性的抗原结合结构域的多肽结合于所述标记的多肽的标签；但是，在不表达这些标志物(抗原)的细胞上，转导受到影响。

同样，本文所公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒仅在所述多肽存在下可以转导表达相应标志物的靶细胞。在缺少所述多肽的情况下，所述逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的转导在任何细胞类型上受到影响。

因此，使用本发明的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒进行的细胞进入和转导被证明是以适应性方式将高度选择性的基因转移到特定细胞中的高效的和有效的手段。在本发明的一个实施方式中，此类靶细胞选自于免疫细胞、造血细胞、干细胞、癌细胞、神经系统细胞、肌细胞、内皮祖细胞(EPC)、内皮细胞和患病细胞。

可以使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂以任何常规方式配制基于本发明的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒和相应的标记的多肽的药物组合物。因此，可以将本发明的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒配制用于通过例如，注射、吸入或隔离(通过口或鼻)或通过口服、颊部、肠胃外或直肠施用而施用(与标记的多肽一起或随后施用)。

本发明的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒和标记的多肽可以分开施用或已经缀合。本发明的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒和标记的多肽的分开施用可以同时或随后进行。本发明的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒和标记的多肽可以仅施用一次或多次施用。

本发明的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒可以首先施用，然后施用标记的多肽，反之亦然。此类药物组合物可用于用所需蛋白质的基因产物特异性转导靶细胞(尤其可以包括免疫细胞、癌细胞或干细胞)，其如果在靶细胞中表达，则导致特定医学状况的预防或治疗。

附图简述

图1：衔接子介导的转导的示意图

A.用负责抗原结合(A)和融合(F)的包膜蛋白将逆转录病毒载体假型化。A经修饰以使得其不能与至少一个其天然受体相互作用，如盾形所描绘的。为了恢复抗原结合，A在其胞外域处与其中包含抗原结合结构域如scFV的多肽融合。它对标记的多肽(衔接子)的标签具有特异性，且衔接子分子的抗原结合结构域与靶细胞上表达的抗原结合，从而诱导融合和转导。

B.衔接子介导的用麻疹病毒包膜蛋白的转导。H蛋白(H)被突变以使得它不能与其天然受体CD46和SLAM相互作用，如盾形所描绘的。抗原结合结构域，如对标签特异性的scFV，已被添加到突变的H中。衔接子分子由对靶细胞表达的抗原特异性的生物素化抗体组成。标签包含生物素。转导后72小时，通过使用流式细胞仪定量GFP阳性细胞来测定转导效率。

C.描述了衔接子分子的不同结构域。

图2：构建体Hmut-α-标签的示意图

编码构建体Hmut-α-标签的遗传元件，包括对具有沿两个不同方向的可变结构域(VH-VL或VL-VH)的标签特异性的scFV。蛋白在CMV启动子接着H蛋白编码序列下表达，该序列在四个位置突变(显示为星号)以使得与其天然受体CD46和SLAM相互作用不再可能(Hmut)。H蛋白和scFV通过(G4S)3接头连接。可变结构域也通过(G4S)3接头连接。包含His标签用于检测目的。

图3：Hmut-α-标签的表达水平和与标记的多肽的结合

HEK-293T细胞保持不转染或用编码Hmut-α-标签(VH-VL)或Hmut-α-标签(VL-VH)的质粒转染。

A.转染后两天用α-His抗体染色时通过流式细胞仪测定的Hmut-α-标签的表面表达。

B.转染后两天，使用荧光标记和标签标记的α-CD25抗体测量Hmut-α-标签与标记的多肽的结合。

图4：用Hmut-α-标签假型化的逆转录病毒载体的滴度的定量

A.为了避免可能发生的变异(例如，由于不同的衔接子形式或用于不同的衔接子特异性)，开发了没有标记的多肽的α-标签-LV的滴定方法。HT1080细胞使用生物素-LC-LC-NHS进行生物素化，从而导致所有细胞表面蛋白的随机生物素化。通过用α-生物素抗体染色确认成功的生物素化(左)。然后用限定体积的编码GFP的α-标签-LV转导生物素化的细胞。转染后三天，GFP阳性细胞的比率表明成功转导，如通过流式细胞仪测量的(右)。显示了门控策略的实例。

B.HT1080细胞上浓缩的α-CD46-LV，HT1080-CD20上浓缩的α-CD20-LV以及生物素化的HT1080细胞上浓缩的α-标签-LV的筛选滴度。

图5：添加编码GFP的逆转录病毒载体(α-标签-LV、α-CD20-LV或α-CD46-LV)、多肽α-CD20-Ab-标签(对CD20特异性的生物素化抗体)和靶细胞(Raij(CD20和CD46阳性)或作为对照的Jurkat(CD20阴性、CD46阳性))的顺序对转导效率的影响。以MOI 0.05加入逆转录病毒载体。转导后72小时，通过流式细胞术测定GFP阳性细胞的比率来测定转导效率。

A.在不存在(-)或存在(+)标记的多肽的情况下将慢病毒载体于4℃孵育30分钟。随后，将预孵育的LV/α-CD20-Ab-标签混合物添加到细胞中，或细胞保持未转导(w/o)。

B.在不存在(-)或存在(+)α-CD20-Ab-标签的情况下将Raji和Jurkat细胞于4℃预孵育30分钟。预孵育的细胞/α-CD20-Ab-标签混合物保持不转导或进行转导。

C.将Raji和Jurkat细胞与慢病毒载体在37℃下预孵育30分钟或没有逆转录病毒载体(w/o)。随后，添加(+)或不补充(-)α-CD20-Ab-标签。

图6：转导增强试剂关于选择性和转导效率的评估。将Raji细胞(CD20和CD46阳性)或Jurkat细胞(CD20阴性，CD46阳性)在4℃下与(+)或不与(-)多肽α-CD20-Ab-标签预孵育30分钟，然后添加α-标签-LV、α-CD20-LV或α-CD46-LV(MOI＝0.05)。标记的多肽是生物素化的抗体，和所使用的标签包含生物素。转导后72小时，通过使用流式细胞仪定量GFP阳性细胞来测定转导效率。

A.未添加转导增强剂。

B.添加

作为转导增强剂。

C.添加

作为转导增强剂。

图7：将标记的多肽的特异性扩展至CD4、CD8、CD19、CD20和CD46。分别在不存在(-)或存在(+)多肽α-CD4-Ab-标签、α-CD8-Ab-标签、α-CD19-Ab-标签、α-CD20-Ab-标签或α-CD46-Ab-标签的情况下，在4℃下孵育表达或不表达靶抗原的靶细胞30分钟。标记的多肽是生物素化的抗体，和所使用的标签包含生物素。在

存在下，以0.05的MOI应用编码GFP的α-标签-LV。转导后三天，用对与所使用的标记的多肽相同的抗原具有特异性的抗体染色细胞，并通过使用流式细胞仪定量GFP阳性细胞来测定转导效率。对于表达标记的多肽的相应抗原的细胞的转导，转导率是指表达靶抗原的所有细胞。对于不表达标记的多肽的相应抗原的细胞的转导，转导率是指不表达靶抗原的所有细胞。

A.使用了SupT1细胞(对CD4、CD8和CD46为阳性；对CD19和CD20为阴性)。

B.使用了Jurkat细胞(对CD4和CD46阳性，对CD8、CD19和CD20阴性)。

C.HT1080细胞(对CD46阳性，对CD4、CD8、CD19、CD20阴性)。

D.Raji细胞(对CD19、CD20和CD46阳性；对CD4和CD8阴性)。

图8：在具有表达靶抗原的细胞和不表达靶抗原的细胞的混合细胞群体中的选择性。标记的多肽是生物素化的抗体，和所使用的标签包含生物素。将Raji细胞(对CD19、CD20和CD46阳性；对CD4和CD8阴性)与SupT1细胞(对CD4、CD8和CD46阳性；对CD19和CD20阴性)等份地混合。

A.在存在(具有衔接子转导)或不存在(没有衔接子的转导)对于如顶部所示的抗原具有特异性的标记的多肽的情况下，用编码GFP的α-标签-LV(MOI＝0.05，包括

)转导共培养细胞。作为对照，共培养的细胞保持不转导。转导后三天，用对与标记的多肽相同的抗原具有特异性的抗体染色细胞，并通过使用流式细胞仪定量GFP阳性细胞来测定转导效率。

B.A的流式细胞分析数据的定量。分别对于不表达或表达标记的多肽的靶抗原的细胞显示GFP阴性和GFP阳性细胞的比率。

图9：在倾向于诱导非特异性转导的条件下的选择性。

标记的多肽是生物素化的抗体，和所使用的标签包含生物素。转导后三天，通过使用流式细胞仪定量GFP阳性细胞来测定转导效率。

A.血清存在下的转导。在存在(+)或不存在(-)多肽α-CD20-Ab-标签的情况下，用具有编码GFP的α-标签-LV(MOI 0.05)的补充有10％FCS的培养基中的

转导CD20阳性Raij细胞和CD20阴性Jurkat细胞。

B.用有或不具有标签的多肽的转导。CD20阳性Raij细胞用具有编码GFP的α-标签-LV(MOI 0.05)的

转导，其具有多肽α-CD20-Ab-标签或α-CD20-Ab。

C.用提高量的逆转录病毒载体的转导。Raji细胞(CD20和CD46阳性)和Jurkat细胞(CD20阴性，CD46阳性)保持不转导(w/o)，或者在存在(+)或不存在(-)α-CD20-Ab-标签的情况下用具有α-标签-LV、α-CD20-LV或α-CD46-LV的

以0.4的MOI进行转导。

图10：标记的多肽的滴定以测定最佳衔接子分子浓度。标记的多肽是生物素化的抗体，和所使用的标签包含生物素。转导后三天，通过使用流式细胞仪定量GFP阳性细胞来测定转导效率。

A.在指示浓度的标记的多肽α-CD4-Ab-标签存在下，用具有

的编码GFP的α-标签-LV以0.05的MOI转导Jurkat细胞(CD4阳性，低表达)。

B.Raji(CD20阳性，高表达)细胞在具有指示的浓度的α-CD20-Ab-标签的用

的编码GFP的α-标签-LV以0.05的MOI转导。

图11：替代衔接子形式评估：标记的抗体片段(Fab)。标记的多肽是生物素化的Fab片段，并且所使用的标签包含生物素。转导后三天，通过使用流式细胞仪定量GFP阳性细胞来测定转导效率。

A.在不存在(w/o)或存在1μg/ml标记的α-CD4-FAb-标签、α-CD8-FAb-标签或α-CD19-FAb-标签的情况下，以0.05的MOI用具有

的编码GFP的α-标签-LV转导CD19阳性Raji细胞。

B.在不存在(w/o)或存在1μg/mlα-CD4-FAb-标签、α-CD8-FAb-标签或α-CD19-FAb-标签的情况下，以0.05的MOI用具有

的编码GFP的α-标签-LV转导CD4和CD8阳性SupT1细胞。

图12：替代衔接子形式评估：葡聚糖作为标记的多肽的标签。标记的多肽是与葡聚糖偶联的Fab片段，并且标签是葡聚糖。将对于葡聚糖特异性的scFV与用于假型化的Hmut融合。

在不存在(w/o衔接子)或存在标记的α-CD19-Fab或标记的α-CD4-Fab的情况下，通过具有

的编码GFP的α-tag-LV转导CD19阳性Raji细胞。转导后三天，通过使用流式细胞仪定量GFP阳性细胞来测定转导效率。

图13：使用尼帕包膜蛋白进行假型化的衔接子-LV：在4℃下，分别在不存在(w/o)任何衔接子的情况下或在存在标记的衔接子α-CD4-Ab-标签、α-CD19-Ab-标签、α-CD20-Ab-标签或不含任何标签α-CD20-Ab或α-CD19-Ab的衔接子的情况下孵育CD19阳性、CD20阳性、CD4阴性的Raji细胞30分钟。标记的多肽是生物素化的抗体，并且使用的标签是生物素。以0.25的MOI应用编码GFP的α-标签-LV。转导后三天，通过使用流式细胞仪定量GFP阳性细胞来测定转导效率。

图14：衔接子-VLP介导的蛋白质转移：在4℃下，分别在不存在任何多肽(w/o)的情况下或在存在标记或未标记的多肽α-CD4、α-CD8或α-CD20的情况下，孵育CD4阳性、CD8阳性、CD20阴性SupT1细胞30分钟。标记的多肽是生物素化的抗体，且所使用的标签包含生物素。以0.05的MOI应用没有整合的携带GFP或单体红色荧光蛋白的病毒基因组的α-tag VLP。在添加VLP后四小时，通过使用流式细胞仪对GFP或单体红色荧光蛋白阳性细胞进行定量来测定蛋白质转移效率。

具体实施方式

本发明提供了用于逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的适应性转导系统(组合物或制剂)，其用于在同时存在可结合于标签的逆转录病毒载体或其病毒样颗粒及可以与靶细胞上表达的抗原结合的相应的标记的多肽的情况下靶向靶细胞上的不同的和变化的抗原。

在第一方面，本发明提供了一种组合物，其包含

i)假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其包含：

a)一种具有抗原结合活性的包膜蛋白，其中所述包膜蛋白是不与至少一个其天然受体相互作用的重组蛋白，并且在其胞外域处与包含对标记的多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域的多肽融合，并且其中所述包膜蛋白是源于副粘病毒科的蛋白G、HN或H，

b)一种源自副粘病毒科的具有融合活性的包膜蛋白；和

ii)所述标记的多肽，其中所述标记的多肽与靶细胞表面上表达的抗原特异性结合，从而用所述逆转录病毒载体颗粒转导该靶细胞或从而诱导病毒样颗粒摄取至靶细胞中。

所述假型化逆转录病毒载体或其病毒样颗粒可通过接头与所述重组蛋白的胞外域融合，其不与至少一个其天然受体相互作用。

在本发明的优选的实施方式中，抑制了与所述重组蛋白的所有天然受体的相互作用，然后本发明提供了以下的组合：

i)假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其包含：

a)一种具有抗原结合活性的包膜蛋白，其中所述包膜蛋白是不与其天然受体相互作用的重组蛋白，并且在其胞外域处与包含对标记的多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域的多肽融合，和其中所述包膜蛋白是源自副粘病毒科的蛋白G、HN或H，

b)一种源自副粘病毒科的具有融合活性的包膜蛋白；和

ii)所述多肽，其中所述标记的多肽与靶细胞表面上表达的抗原特异性结合，从而用所述逆转录病毒载体颗粒转导靶细胞或由此诱导病毒样颗粒摄取入靶细胞中。

在本发明的另一个实施方式中，与主要用于细胞进入的受体的相互作用被抑制。在本发明的另一个实施方式中，与至少一个受体的相互作用被抑制。

另外，抗体片段如scFV可能需要接头序列以融合所述scFV的两条链。产生包含已经使用接头多肽融合于其他结构域的结构域或片段的重组蛋白在本领域中是充分描述的(例如，Chen等(2013))。原型接头是(G4S)3接头，其在本发明中也被示例性使用，但是不打算限制该原型接头，因为其他接头序列也可以在本发明的情况中是功能性的。

所述标记的多肽的所述标签不在其中所述逆转录病毒载体或其病毒样颗粒应用于转导(例如，在人类中)的受试者或细胞培养物的任何物种的任何细胞(靶细胞和非靶细胞)上表达。因此，所述逆转录病毒载体或其病毒样颗粒仅可在存在所述标记的多肽的情况下转导任何靶细胞。此外，非靶细胞在存在所述标记的多肽的情况下不转导。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中具有抗原结合活性的所述包膜蛋白在没有所述标记的多肽的情况下不与靶细胞的任何抗原结合。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中在存在所述标记的多肽的情况下所述靶细胞上的所述转导或所述诱导的摄取与不存在所述标记的多肽的情况下在所述靶细胞上的所述转导或所述诱导摄取相比可以至少高2倍、高5倍、高10倍、高25倍、高50倍、高100倍、高1000倍，高2000倍或高5000倍。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中具有抗原结合活性的所述包膜蛋白在没有所述标记的多肽的情况下不与任何靶细胞和非靶细胞结合。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中人细胞在没有所述标记的多肽的情况下不转导。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的产生、使用和施用可以在较低风险的环境中进行，因为人细胞在没有所述标记的多肽的情况下不转导。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中没有所述标记的多肽的情况下没有任何物种的细胞(靶细胞和非靶细胞)被转导。所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中与所述标记的多肽结合的抗原被瞬时表达。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中根据细胞周期相或者激活和/或分化状态，与所述标记的多肽结合的抗原可以瞬时表达。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中与所述标记的多肽结合的抗原的表达可以是可控的，例如，通过诱导型表达。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述转导或所述诱导摄取在所述靶细胞上与非靶细胞相比可以至少高2倍、高5倍、高10倍、高25倍、高50倍、高100倍、高1000倍、高2000倍或高5000倍。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述副粘病毒科病毒可以是麻疹病毒属或亨尼巴病毒(Henipavirus)属的病毒。用副粘病毒科来源的包膜蛋白对逆转录病毒载体进行假型化在本领域中已充分描述。为了用源自麻疹病毒属的包膜蛋白对逆转录病毒载体有效假型化，F蛋白的截短的胞质部分应包含至少1个带正电荷的氨基酸残基，以及从F蛋白的胞质部分的N末端起计数不超过9个连续氨基酸残基，并且H蛋白的截短的胞质部分应包含从H蛋白的胞质部分的C末端起计数至少9个且不超过19个连续的氨基酸残基，加上N末端的另外的蛋氨酸(Frecha等(2008)，EP2066795B9，Edes(2016))。因此，如上所述，使用截短的F和H蛋白变体有效地对慢病毒载体和γ逆转录病毒载体进行假型化。

一些报道表明，逆转录病毒载体也可以用来自尼帕病毒的包膜蛋白进行假型化。它是源自副粘病毒科，副粘病毒(Paramyxovirinae)亚科，亨尼巴病毒属的病毒。该属的另一个成员是亨德拉病毒(Hendravirus)。与麻疹病毒属的H蛋白相反，具有抗原结合功能的尼帕包膜蛋白是G蛋白。它没有使血凝功能，但它也是Typell膜蛋白。尽管G蛋白的胞质结构域很长，并因此可能需要在胞质结构域内进行较大的删除以进行有效的假型化，但一些报告显示了不同截短和即使G蛋白的胞质结构域内没有任何截短的功能滴度的数据(Khetawat等(2010)，Bender等(2016)Palomares等(2013))。对于尼帕F蛋白，已经得到了类似的观察，表明对于两种病毒包膜蛋白，胞质结构域的截短对于产生功能性逆转录病毒载体滴度不那么关键。然而，Bender等(2016)表明，当使用具有G蛋白的胞质结构域的剩余11个氨基酸加蛋氨酸和F蛋白的胞质结构域的剩余6个氨基酸的构建体时，检测到最高的逆转录病毒载体滴度。相反，Khetawat等(2010)用G蛋白的未截短形式和F蛋白胞质域上的4个剩余氨基酸观察到最高的逆转录病毒载体滴度。Palomares等(2013年)的结果表明，未截短的形式或具有G蛋白的胞质结构域上的35或20个剩余氨基酸加蛋氨酸的形式与尼帕F蛋白的6个剩余氨基酸加6个额外的氨基酸结合导致了最高的逆转录病毒载体滴度。

此外，慢病毒载体已经成功地用源自副粘病毒科中的另一种病毒：Tupaia病毒的包膜蛋白进行假型化(Enkrich等(2013))。它与麻疹病毒和亨尼巴病毒有关，但未归类于这些属之一，因为在遗传上相差太大。尽管遗传差异太大，但为实现高效假型化，有必要与麻疹病毒包膜蛋白相当的胞质结构域截短：F蛋白胞质结构域的6个剩余氨基酸和H蛋白的胞质结构域的13个剩余氨基酸加蛋氨酸导致最高的逆转录病毒载体滴定。

所述假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述源自副粘病毒科病毒的蛋白G、H、HN或F的蛋白质缺少至少所述蛋白G、H、HN或F的胞质区的一部分，即所述蛋白质G、H、HN或F可以是截短的蛋白质。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述源自麻疹病毒或亨尼巴病毒属的病毒的蛋白质G、H或F的蛋白质缺少至少所述蛋白质G、H或F的胞质区的一部分，即所述蛋白质G、H、HN或F可以是截短的蛋白质。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述源自麻疹病毒属病毒的蛋白H或F的蛋白质缺少至少所述蛋白H或F的胞质区的一部分，即所述蛋白H或F可以是截短的蛋白质。所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述源自亨尼巴病毒属的病毒的蛋白G或F的蛋白质缺少至少所述蛋白G或F的胞质区的一部分，即所述蛋白G或F可能是截短的蛋白质。所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述源自麻疹病毒的蛋白H或F的蛋白质缺少至少所述蛋白H或F的胞质区的一部分，即所述蛋白H或F可以是截短的蛋白质。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述源自尼帕病毒的蛋白G或F的蛋白质缺少至少所述蛋白G或F的胞质区的一部分，即所述蛋白G或F可以是截短的蛋白质。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述源自副粘病毒科的具有融合活性的包膜蛋白缺少至少所述包膜蛋白的胞质区的一部分。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述麻疹病毒属是麻疹病毒或麻疹病毒的Edmonston株。

所述逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述亨尼巴病毒是尼帕病毒。

所述逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述截短的副粘病毒科病毒包膜蛋白是具有融合活性的融合(F)蛋白和具有亨尼巴病毒的抗原结合活性的附着(G)蛋白。

所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述逆转录病毒载体颗粒是慢病毒或γ逆转录病毒载体颗粒或其病毒颗粒。所述逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒源自选自于HIV-1、HIV-2、SIVmac、SIVpbj、SIVagm、FIV和EIAV的慢病毒。

所述逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒源自选自于猫白血病病毒，长臂猿白血病病毒(GALV)和鼠白血病病毒(MLV)的γ逆转录病毒属。

所述逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述F和H蛋白的胞质部分通过从所述胞质部分删除氨基酸残基而被截短，并且其中所述F蛋白的截短胞质部分包含至少1个带正电的氨基酸残基和从F蛋白的胞质部分的N末端起计数的不超过9个连续的氨基酸残基，其中H蛋白的截短的胞质部分包含从H蛋白胞质部分的C末端起计数的至少9个和不超过19个连续氨基酸残基加N末端的额外的蛋氨酸。

H蛋白的所述截短的胞质部分被截短以允许有效的假型化并具有融合支持功能。

所述逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述颗粒包含麻疹病毒的融合蛋白(F)和血凝素(H)蛋白，其中所述F和H蛋白的胞质部分通过从所述胞质部分删除氨基酸残基而被截短，和其中F蛋白的截短的胞质部分包含至少1个带正电的氨基酸残基和从F蛋白的胞质部分的N末端起计数不超过9个连续的氨基酸残基，H蛋白的截短的胞质部分被截短以允许有效的假型化并具有融合支持功能，其中H蛋白的截短的胞质部分包含从H蛋白的胞质部分的C末端起计数的至少9个且不超过19个连续氨基酸残基加N末端的额外的蛋氨酸，和其中截短的H蛋白是嵌合蛋白，其不与CD46、SLAM相互作用且在其胞外域处还具有包含对标记的多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域的多肽，并且其中所述的标记的多肽与靶细胞表面上表达的抗原特异性结合。

所述逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其中所述颗粒包含麻疹病毒或麻疹病毒的Edmonston株的融合蛋白(F)和血凝素(H)蛋白，和/或其中F蛋白的截短的胞质部分包含从F蛋白的胞质部分的N末端计数的至少3个连续的氨基酸残基，且H蛋白的截短的胞质部分包含从H蛋白的胞质部分的C末端计数的至少13个连续的氨基酸残基加N末端的额外的蛋氨酸，其中所述从H蛋白的胞质部分的C-末端计数的至少13个连续氨基酸残基的N末端氨基酸残基中的1-4个可以被丙氨酸残基代替，和/或其中假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒源自选自于HIV-1、HIV-2、SIVmac、SIVpbj、SIVagm、FIV和EIAV的慢病毒，和/或其中截短的F蛋白是FcΔ24或FcΔ30和/或截短的H蛋白选自于HcΔ14、HcΔ15、HcΔ16、HcΔ17、HcΔ18、HcΔ19、HcΔ20、HcΔ21+A和HcΔ24+4A。

所述逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒和标记的多肽的组合物，其中所述标记的多肽的多肽可以是具有与靶细胞上表达的抗原的抗原结合部分(例如抗体或其抗原结合片段)、细胞因子或生长因子的蛋白质。

所述标记的多肽的所述多肽可以是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与在所述靶细胞表面上表达的所述抗原结合，并且其中所述标记的多肽的标签可以是半抗原。

所述半抗原可以选自生物素、荧光素异氰酸酯(FITC)、荧光素、NHS-荧光素、2,4-二硝基苯酚(DNP)、地高辛(digoxigenin)和右旋糖酐。

所述半抗原可以是生物素。

所述标记的多肽的所述多肽可以结合在所述靶细胞表面上表达的抗原，并且其中所述多肽与所述抗原的结合可以激活所述靶细胞。

所述标签可以是可催化降解的。

包含对标记的多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域的所述多肽，并且其中所述抗原结合结构域源自抗体来源的scFV，并且其中氨基酸序列已经在所述scFV的框架区中突变以改善所述多肽的表面表达和/或稳定性。

所述标记的多肽的所述多肽可以是抗原结合部分(ABM)，其中所述标记的多肽的标签是靶细胞结合分子(TCBM)的接头/标记表位(LLE)，该靶细胞结合分子(TCBM)包含

i)抗原结合部分(ABM)，其中所述ABM特异性结合于在所述靶细胞表面上表达的所述抗原，

ii)标记部分(LaM)，其中所述LaM是受试者中的天然存在的分子或其衍生物，

iii)将所述ABM和所述LaM缀合的接头部分(LiM)，从而形成接头/标记表位(LLE)结合结构域，

其中对标签具有特异性的所述多肽的所述抗原结合结构域是接头/标记表位(LLE)结合结构域，

其中所述LLE结合结构域与所述LLE的结合优先于所述天然存在的分子。

所述LLE结合结构域与所述LLE结合的亲和力可以比与所述天然存在的分子结合的亲和力高至少两倍，优选至少5倍，更优选至少10倍，最优选至少50倍。

所述LLE结合结构域之间的结合的k(off)值对于单体LLE和所述天然存在的分子可以比对多聚LLE更高。

所述天然存在的分子可以在所述受试者的循环系统中。

所述LLE可以位点特异性地产生，从而形成包含所述LaM的一部分和所述LiM的一部分的表位。

所述LaM可以选自氨基酸、肽、蛋白质、肌酸酐、生物素、生物胞素、脂质、激素、维生素、碳水化合物或其衍生物。

所述LiM可以是能够产生所述LLE的分子。

所述LiM可以选自肽、蛋白质、核酸、碳水化合物、聚羟基链烷酸酯、烷基链、链烷酸、羧酸、法呢基类、聚乙二醇、脂质或其衍生物。

所述LaM可以是生物素或其衍生物，并且所述LiM可以是6-(6-氨基己酰胺基)己酰基部分或6-氨基己酰基部分。

所述LLE结合结构域可以包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列，优选地从N末端到C末端的序列的顺序是VH-VL。

所述标记的多肽的所述抗原可以选自TCR、CD3、CD4、CD8、CD25、CD62L、CD69、CD137、CD44、CD45RA、CD45RO、CD137、CD152、CD154、CCR5、CCR7、PD-1、CTLΑ-4、CD105、NKR-P1A、CD56、NCAM-1、CD57、CD14、CD16、CD19、CD20、CD30、CD34、CD133、CD38、BDCΑ-1、BDCΑ-2、BDCΑ-3、GM-CSF、CD11b、A2B5、ACSΑ-2、GLAST、AN2、CX3CR1、O4、CD15、CD11、CD144、SSEΑ-4、TRΑ-1CD33(Siglec-3)、CD123(IL3RA)、CD135(FLT-3)、CD44(HCAM)、CD44V6、CD47、CD184(CXCR4)、CLEC12A(CLL1)、LeY、FRβ、MICA/B、CD305(LAIR-1)、CD366(TIM-3)、CD96(TACTILE)、CD29(ITGB1)、CD47(IAP)、CD66(CEA)、CD112(Nectin2)、CD117(c-Kit)、CD146(MCAM)、CD155(PVR)、CD171(L1CAM)、CD221(IGF1)、CD227(MUC1)、CD243(MRD1)、CD246(ALK)、CD271(LNGFR)、GD2和EGFR。

所述ABM可以是抗体或其抗原结合片段。

所述靶细胞可以选自免疫细胞、造血细胞、干细胞、肌细胞、癌性细胞、神经系统细胞、内皮祖细胞(EPC)、内皮细胞和患病细胞。

逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒与标记的多肽的组合的任何以上公开的变体和实施方式可以彼此组合。

在第二方面，本发明提供了假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其包含：

a)一种具有抗原结合活性的包膜蛋白，其中所述包膜蛋白是重组蛋白，其不与至少一种其天然受体相互作用并且在其胞外域与包含对标记的多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域的多肽融合，和其中所述包膜蛋白是源自副粘病毒科的蛋白G、HN或H；

b)一种源自副粘病毒科的具有融合活性的包膜蛋白；且其中所述标记的多肽与靶细胞表面上表达的抗原特异性结合，从而用所述逆转录病毒载体颗粒转导靶细胞或从而诱导病毒样颗粒摄取到靶细胞中。

在第三方面，本发明提供了药物组合物，其包含如本文公开的假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒和如本文公开的标记的多肽，任选地还包含药学上可接受的载体。

在第四方面，本发明提供了用作药物的如本文公开的假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒和标记的多肽的组合物。

在第五方面，本发明提供了本文公开的假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒和标记的多肽的组合物在制备药物中的用途。

在第六方面，本发明提供了一种用于产生假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的方法，该方法包括：

包装细胞系与本文公开的至少一个编码逆转录病毒gag/pol/rev基因的psi-阴性表达载体、psi阳性逆转录病毒表达载体和一个或两个编码副粘病毒科病毒包膜蛋白的psi阴性表达载体共转染。

在第七方面，本发明提供了用如本文公开的假型化逆转录病毒载体颗粒转导靶细胞或递送其病毒样颗粒的蛋白质的体外方法，其包括以下步骤：

a)将靶细胞与本文公开的标记的多肽一起预孵育，以及

b)将所述逆转录病毒载体颗粒或其载体样颗粒添加到步骤a)的预孵育的靶细胞中。

令人惊讶地，发现如本文公开的方法的添加标记的多肽、靶细胞和逆转录病毒载体的顺序强烈影响转导效率(参见图5)。

所述方法，其中在步骤b)中还可以使用转导增强剂。

所述方法，其中所述增强剂可以是具有SEQ ID NO：15中表示的序列的LAH4肽

或其功能衍生物，其具有提高逆转录病毒载体或病毒样颗粒的转导效率的能力或提高其摄取到靶细胞中的能力。

在第八方面，本发明提供了一种体内方法，其用于转导造血细胞，优选免疫亚集细胞或干细胞，该方法包括：

a)向需要治疗的受试者施用本文公开的标记的多肽的制剂，其中所述标记的多肽结合靶细胞，其中所述靶细胞是造血细胞，优选是免疫亚集细胞，例如，T细胞或NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞或干细胞(其能够产生所述免疫亚集细胞)，

b)向受试者施用如本文公开的假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的制剂，其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒结合标记的多肽，从而用所述逆转录病毒载体颗粒转导靶细胞，或从而诱导病毒样颗粒摄取到靶细胞中。

所述方法，其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒携带至少一个转基因，从而将所述转基因转导至靶细胞中，并从而在靶细胞中表达所述转基因后能够通过转导的细胞对受试者进行免疫治疗。

所述方法，其中所述转基因是编码例如嵌合抗原受体的基因。

在第九方面，本发明提供了一种用于转导缺陷的干细胞的体内方法，其包括：

a)向需要治疗的受试者施用如本文公开的标记的多肽的制剂，其中所述标记的多肽结合靶细胞，其中所述靶细胞是缺陷干细胞；

b)向受试者施用本文公开的假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的制剂，其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒结合标记的多肽，从而用所述逆转录病毒载体颗粒转导靶细胞或从而诱导病毒样颗粒摄取入靶细胞中。

所述方法，其中所述假型化逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒携带至少一种转基因，从而将所述转基因转导至靶细胞中。

所述方法，其中所述转基因编码单基因疾病(例如，β-地中海贫血、SCID-X1、Wiskott-Aldrich综合征)的非突变等位基因，从而将缺陷干细胞校正为非缺陷干细胞。

在本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的变体中，具有抗原结合活性的包膜蛋白，其中所述包膜蛋白是不与至少一个其天然受体相互作用的重组蛋白并且不与包含对标记的多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域的多肽融合，并且其中所述包膜蛋白是源自副粘病毒科的蛋白G、HN或H。在该变体中，包含对标记的多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域的所述多肽与存在于逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的包膜中的另一种膜蛋白或其片段融合，从而产生锚定在包膜中三个离散的蛋白质。因此，在该变体中，假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒包含：

a)一种具有抗原结合活性的包膜蛋白，其中所述包膜蛋白是不与至少一个其天然受体相互作用的重组蛋白，其中所述包膜蛋白是源自副粘病毒科的蛋白G、HN或H；

b)一种源自副粘病毒科的具有融合活性的包膜蛋白；和

c)一种膜蛋白或其片段，其包含对标记的多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域，

其中所述标记的多肽与靶细胞表面上表达的抗原特异性结合，从而用所述逆转录病毒载体颗粒转导靶细胞或从而诱导病毒样颗粒(VLP)选择性摄取到靶细胞中。

本文中关于本发明的第一方面所定义的所有定义、特征和实施方式、包含本文所公开的假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒和本文所公开的标记的多肽的组合物，在细节上作必要修改后也适用于如本文所公开的本发明的其他方面的情况。

实施方式

除了本文公开的适应性逆转录病毒载体颗粒系统或本文公开的病毒样颗粒系统的上述应用之外，以下描述了本发明的其他实施方式，但无意将本发明限于这些实施方式。

在适应性逆转录病毒载体系统的优选实施方式中，选择性转导存在于具有非靶细胞的混合细胞群体中的靶细胞或选择性地诱导VLP摄取。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，根据抗原在靶细胞上的表达水平来调节标记的多肽的特异性。

例如，使用适应性逆转录病毒载体系统和对于与VSV-G受体的表达水平相比以更高水平表达的受体抗原特异性的标记的多肽，可以更有效地转导不表达足够水平的VSV-G受体并因此对VSV-G假型化逆转录病毒载体转导具有抗性的细胞或细胞类型。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，在逆转录病毒载体颗粒或病毒样颗粒复合物与靶抗原结合后诱导靶细胞的激活。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，表达不同抗原的靶细胞群体可以同时或随后通过组合具有不同特异性的标记的多肽而被转导。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，如果需要对所有抗原具有特异性的标记的多肽来诱导选择性转导或VLP摄取，则以多种抗原为特征的靶细胞选择性地转导或其已经选择性摄取VLP。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，通过添加可选的多肽或配体从标记的多肽释放逆转录病毒载体，降低了转导效率或VLP摄取，其中相比于对于与所述逆转录病毒载体或其病毒样颗粒的所述包膜蛋白的胞外域融合的标签具有特异性的多肽，所述可选的多肽或配体优选以更高的亲和力与标签标记的衔接子上的标签结合。

例如：将抗生物素蛋白—生物素的配体—添加到与标记的多肽结合的标签-特异性逆转录病毒载体可以减少或抑制这种结合，并且减少转导或VLP摄取。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，通过去除或降解所述标记的多肽的所述标签来降低转导效率或VLP摄取。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，通过去除或降解所述标记的多肽来降低转导效率或VLP摄取。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，通过添加可选标签来降低转导效率或VLP摄取，其中所述逆转录病毒载体或其病毒颗粒优选以更高的亲和力与可选标签结合且逆转录病毒载体或其病毒样颗粒不再与标记的多肽结合。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，通过过量添加标签分子来降低转导效率或VLP摄取，其中所述逆转录病毒载体或其病毒颗粒优先结合所添加的标签。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，通过添加可选的标记的多肽降低转导效率或VLP摄取，其中所述可选的衔接子对相同的抗原具有特异性，但是以更高的亲和力与在所述靶细胞上表达的所述抗原结合。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，通过去除或降解与具有抗原结合活性的所述包膜蛋白的胞外域融合的所述多肽降低转导效率或VLP摄取。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，通过改变所述标记的多肽与在所述靶细胞上表达的所述抗原的亲和性和/或亲合力来控制转导效率或VLP摄取。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，通过改变所述标记的多肽的量来控制转导效率或VLP摄取。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，选择性转导或VLP摄取在体内发生。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，选择性转导或VLP摄取在体外或体内发生，并用于筛选和鉴定被所述标记的多肽结合的抗原。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，选择性转导或VLP摄取在体外或体内发生，并用于筛选和鉴定被所述标记的多肽结合的抗原和/或靶细胞。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，选择性转导或VLP摄取在体外或体内发生，并用于筛选和鉴定与靶细胞上表达的靶抗原结合的多肽。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，逆转录病毒载体或其VLP递送目的基因以产生重组细胞或动物。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，逆转录病毒载体或其VLP递送编码治疗性蛋白质的目的基因以治疗或预防疾病。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，逆转录病毒载体或其VLP递送可用于疫苗接种目的或例如用Crispr/Cas进行基因编辑的目的蛋白质。

在适应性逆转录病毒载体系统的另一个实施方式中，逆转录病毒载体是整合缺陷的。

定义

除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

逆转录病毒科是具有单链、二倍体、正义RNA基因组的病毒科，该RNA基因组被反转录成DNA中间体，其然后整合到宿主细胞基因组中。逆转录病毒来源的病毒是直径为80-120nm的包膜颗粒。

(逆转录病毒/慢病毒/γ逆转录病毒)病毒载体是源自相应的病毒科的复制缺陷型病毒颗粒。它们包含Gag和Pol蛋白，单链RNA基因组，且通常用源自其他病毒的异源包膜蛋白进行假型化。所述病毒载体的RNA基因组不包含任何病毒基因以产生病毒后代，而是包含有效包装和DNA逆转录所需要的psi元件和LTR。DNA中间体可以包含在合适的启动子(例如，CMV启动子)控制下的目的基因，并且当所述DNA整合到宿主细胞的基因组中时目的基因被表达。进入宿主细胞、递送RNA基因组、整合和表达目的基因的过程称为转导。基于γ逆转录病毒或慢病毒的病毒载体的最低要求已在本领域中详细描述。

另外，已经开发出不能整合逆转录病毒载体基因组到宿主细胞基因组中的整合酶缺陷的逆转录病毒载体(ID-RV)。ID-RV源自常规的逆转录病毒载体，但不包含逆转录病毒整合酶或包含突变形式的逆转录病毒整合酶。进入宿主细胞中后，逆转录病毒载体基因组在细胞质中逆转录，递送到细胞核中，但不稳定整合到宿主细胞基因组中。ID-RV是有用的工具以瞬时表达目的基因。逆转录病毒载体和转导的定义也扩大了整合缺陷的逆转录病毒载体及其应用。

慢病毒是逆转录病毒科的一个属，其在人类和其他哺乳动物物种中引起以长潜伏期为特征的慢性和致命性疾病。最著名的慢病毒是可有效感染非分裂细胞的人类免疫缺陷病毒HIV，因此慢病毒衍生的逆转录病毒载体是最有效的基因传递方法之一。

γ逆转录病毒是逆转录病毒科的一个属。代表性的物种是鼠白血病病毒和猫白血病病毒。

副粘病毒科是单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)下的病毒科。该科目前有49个种，分为7个属。与该病毒科有关的疾病包括麻疹、腮腺炎和呼吸道感染。该病毒科的成员是具有约16kb的非分段负链RNA基因组的包膜病毒。具有两种不同功能的两种膜蛋白在病毒体表面上显示为刺突。H/HN/G蛋白介导与细胞表面受体的结合。

因此，如本文所用，术语“具有抗原结合活性的病毒包膜蛋白”是指病毒包膜上负责与靶细胞的细胞膜上的互补受体或抗原结合的蛋白。对于副粘病毒科H、HN或G蛋白是具有抗原结合活性的病毒包膜蛋白。

结合时，H/HN/G蛋白改变其构象，这诱导称为融合辅助功能的过程，从而导致F蛋白内随后的构象变化，其介导病毒和细胞膜的融合。衣壳和病毒基因组现在可以进入并感染或转导宿主细胞。如本文所用，术语“具有融合活性的病毒包膜蛋白”是指引发病毒和细胞膜融合的蛋白。副粘病毒科F蛋白是指具有融合活性的病毒包膜蛋白。

病毒样颗粒(VLP)与病毒颗粒相似，但不是感染或转导的，因为它们不包含编码病毒样颗粒的蛋白质的病毒遗传物质。特别地，在逆转录病毒载体的情况下，VLP不包含psi阳性核酸分子。一些病毒样颗粒可含有与其基因组不同的核酸。病毒结构蛋白(例如，包膜或衣壳)的表达可导致病毒样颗粒(VLP)的组装。像逆转录病毒载体一样，VLP也可以使用与对于逆转录病毒载体相同的包膜构建体假型化。VLP可用于将蛋白质但也将核酸递送至靶细胞的细胞质。特别地，VLP可用作疫苗。如本文所用，术语“VLP摄取”是指VLP与靶细胞膜的结合，从而将核酸分子、蛋白质或肽释放到靶细胞中。嵌合蛋白是通过将最初编码单独的蛋白质的两个或更多个基因连接而产生的蛋白质。该基因的翻译产生具有来自各个原始蛋白质的功能特性的单个或多个多肽。重组蛋白通过重组DNA技术人工产生用于生物学研究或治疗。

如本文所用，术语“胞外域”是指延伸到细胞外空间(细胞外部的空间)中的膜蛋白的结构域。

如本文所用，术语“激活”是指诱导细胞的生理变化，其增加靶细胞功能、增殖和/或分化。

如本文所用，术语“假型化”或“假型的”是指带有源自具有包膜的其他病毒的包膜糖蛋白的载体颗粒。因此，可以根据糖蛋白使用的细胞表面受体的类型来扩展或改变本发明的慢病毒载体或载体颗粒的宿主范围。

为了产生逆转录病毒载体，通过包装细胞系例如HEK-293T反式提供组装载体颗粒所需的gag、pol和env蛋白。这通常通过用一种或多种包含gag、pol和env基因的质粒转染包装细胞系来完成。为了生成假型化载体，将最初源自与gag和pol基因以及与RNA分子或表达载体相同的逆转录病毒的env基因交换成不同包膜病毒的包膜蛋白。例如，使用副粘病毒科的F和H或HN或G蛋白。因此，基于HIV-1逆转录病毒的示例性假型化载体颗粒包含(1)HIV-1Gag和Pol蛋白，(2)源自HIV-1基因组的RNA分子，其可用于产生逆转录病毒载体颗粒，其基于缺少gag、env、pol、tat、vif、vpr、vpu和nef基因但仍然包含LTR，psi元件和CMV启动子，随后是要转导的基因(例如，GFP蛋白的基因)的HIV-1基因组，以及(3)麻疹病毒的F和H蛋白，例如，为截短的形式。

如本文所用，术语“天然受体”是指在细胞的细胞表面上表达的受体或抗原，该受体或抗原被具有抗原(受体)结合活性的天然存在的病毒包膜蛋白结合。天然麻疹病毒受体是SLAM、nectin-4和CD46。尼帕包膜蛋白使用ephrin-B2和ephrin-B3作为用于进入的受体。

如本文所用，术语“不与至少一种其天然受体相互作用的具有抗原结合活性的一种包膜蛋白”是指所述蛋白与正常情况下由具有如本文其他地方描述的所述蛋白质的病毒所靶向的细胞的至少一种受体的相互作用降低或消除。相互作用降低是指所述截短和/或突变的蛋白质与所述至少一种天然受体的相互作用与非突变蛋白质相比效率降低至少50％、效率降低至少60％、效率降低至少70％、效率降低至少80％、效率降低至少90％、效率降低至少95％、效率降低至少99％。优选地，所述蛋白质不再与所述至少一种其天然受体相互作用。该相互作用可以是这两个分子彼此结合。

低效率的相互作用可以是所述蛋白质与其天然受体的亲和力降低。所述具有抗原结合活性的包膜蛋白可以具有超过一种天然受体，然后所述蛋白的这些天然受体之一的相互作用的降低或消除导致载体颗粒或其病毒样颗粒的嗜性降低。所述蛋白质与其天然受体的相互作用被突变抑制的越多，减少载体颗粒或其病毒样颗粒的向性越有效。

在一些情况下，抑制一些而非全部天然受体与所述蛋白质的相互作用可能是足够的，因为其余的相互作用与本文所公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的预期应用或用途无关，例如，当天然受体不在打算被转导的靶细胞环境中的任何细胞(靶细胞和非靶细胞)上表达时。

如果具有抗原结合活性的包膜蛋白具有2种以上的天然受体，例如3种天然受体，那么优选地，所述蛋白质不与大多数其天然受体相互作用，例如，3种中的2种。

更优选地，具有抗原结合活性的包膜蛋白不与所有其天然受体相互作用。

如本文所用，术语“嗜性”是指病毒、逆转录病毒载体或其病毒样颗粒的宿主范围或特异性。如本文所用，对在靶细胞上表达的抗原具有特异性的标记的多肽定义了逆转录病毒载体或其病毒样颗粒的宿主范围。

如本文所用，术语“非人嗜性的”是指病毒、逆转录病毒载体或其病毒样颗粒感染、转导或诱导VLP摄取的失能，因为具有抗原结合活性的病毒包膜蛋白已经突变以减少，优选地消除与人类细胞上表达的任何抗原的结合。

如本文所用，术语“靶细胞”是指在其细胞表面上表达应当能够被本文所公开的适应性系统的标记的多肽识别(结合)的抗原(标志物)的细胞。靶细胞可以是真核原代细胞或细胞系。靶细胞可以是哺乳动物细胞，例如，鼠科动物细胞，优选地，靶细胞是人类细胞。

如本文所用，术语“非靶细胞”是指在其细胞表面上不表达可以被如本文所公开的适应性系统的标记的多肽识别(结合)的抗原(标志物)的细胞。

如本文所用，术语“选择性的”和“靶向的”是指在靶细胞中诱导优先转导或病毒样颗粒摄取的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒。因此，在所述靶细胞上，假型化逆转录病毒载体颗粒的转导或诱导的其假型化病毒样颗粒的摄取比非靶细胞高10倍，优选高100倍，最优选高1000倍。在本发明中，这是通过在假型化逆转录病毒载体或其病毒样颗粒存在下将细胞与标记的多肽一起孵育来实现的，所述逆转录病毒载体或其病毒样颗粒包含具有减弱或消融的与其天然受体的相互作用的具有抗原结合活性的包膜蛋白及含有在所述包膜蛋白的胞外域处对标记的多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域的融合多肽。对于副粘病毒科，H/HN和G蛋白是具有抗原结合活性的蛋白质。

因此，本发明的选择性或靶向逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的嗜性不是由H蛋白所来源的病毒的嗜性来限定的，而是取决于标记的多肽对靶细胞的细胞表面抗原的特异性。如本文所用，具有对标记的多肽的标签特异性的抗原结合结构域融合具有抗原结合活性的包膜蛋白的多肽与在细胞表面表达的任何抗原的相互作用减少或消除。对于用麻疹病毒包膜蛋白假型化的选择性逆转录病毒载体或其病毒样颗粒，与包含对本文公开的标记的多肽的标签特异性的抗原结合结构域的多肽融合的截短的蛋白H必须具有通常降低或消除与其天然受体的生产性相互作用的突变。这样的突变是本领域众所周知的。消除麻疹H蛋白与CD46的相互作用的突变是例如，在Y481、F431、V451、Y452、A527、P486、I487、A428、L464、G546、S548、F549位置处的点突变，其中这些氨基酸被另一氨基酸替代，并且该突变阻止或帮助阻止H蛋白与CD46的相互作用。或者，用丙氨酸替换H蛋白中的所有五个连续残基473至477可防止H蛋白与CD46的相互作用。以上引用的任何突变可能相互组合。

例如，以下的突变引入分别消除了麻疹H蛋白与CD46和SLAM的生产性相互作用：Y481A R533A。(Nakamura等(2004)，Nakamura等(2005)，Vongpunsawad等(2004)，Masse等(2002)，Masse等(2004)，Patterson等(1999))。在另一个实施方式中，Hmut蛋白还包括突变S548L和F549S，其导致经由CD46的残留感染力的更完全消除。而且，残基V451和Y529的突变消除了与CD46和SLAM的生产性相互作用。上面已经描述了用于消除/防止H蛋白与CD46的相互作用的可选突变。被引入到截短的H蛋白中以减少或消除天然的受体使用的所有这些突变位于麻疹H蛋白的胞外域中。为了防止H蛋白与SLAM的相互作用，可以用任何其他氨基酸，特别是丙氨酸替换以下残基之一：I194、D530、Y553、T531、P554、F552、D505、D507。

对于nectin-4，本领域已经提出了也消除与这种受体的结合的突变。例如，Tahara等表明，wt麻疹病毒H蛋白的氨基酸置换F483A、Y541S和Y543S导致Nectin-4阳性细胞上消除的融合活性(Tahara等(2008))。Liu等已经证实了这一点，其表明Edmonston株H的氨基酸置换F543A和P497S消除了用Edmonston株F和H包膜蛋白假型化的水疱性口炎病毒的感染(Liu等(2014))。H分子表面上还有在可能参与Nectin-4依赖性融合的不同麻疹病毒中保守的其他的残基，例如，Phe483、Asp521、Leu522、Tyr524、Tyr541、Tyr543、Ser544、Arg547、Ser550和Tyr551(Tahara等(2008))。这表明进一步的突变可能有助于阻止与Nectin-4的相互作用。用截短的F蛋白和在其胞外域处还呈现显示包含对标记的多肽的标签特异性的抗原结合结构域的多肽的突变H蛋白假型化的慢病毒或γ逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒(其中所述标记的多肽对靶细胞的细胞表面标志物具有特异性)不再通过CD46、SLAM和/或nectin-4进入细胞，而是靶向并通过包含对与截短的蛋白H融合的标签具有特异性的抗原结合结构域和标记的多肽的多肽的抗标签结构域仅进入那些在其表面呈现各自相应的标志物的细胞。

对于用尼帕包膜蛋白假型化的选择性逆转录病毒载体或其病毒样颗粒，需要减少或消除的G蛋白与天然受体ephrin-B2和ephrin-B3的相互作用。通过筛选突变体产生具有消除的受体结合能力的变体来鉴定G蛋白内的残基(Bender等(2016))。E501、W504、Q530、E533是单一突变的或组合的。E501A、W504A、Q530A、E533A的组合突变显示完全消除的对受体ephrin-B2和ephrin-B3的受体结合能力。

本发明中使用的“源自”例如HIV-1的假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒是指其中载体颗粒所包含的用于RNA和/或Gag和Pol蛋白的遗传信息最初源自所述逆转录病毒(在上述情况中，HIV-1)的颗粒。原始的逆转录病毒基因组可以包含突变，例如缺失、移码突变和插入。

如本文所用，术语“胞质部分”、“胞质尾”或“胞质区”是指相应蛋白质的与该蛋白质的跨膜结构域相邻，并且如果该蛋白质在生理条件下被插入膜中，则延伸到细胞质中的部分。在副粘病毒科中，所有具有抗原结合功能的包膜蛋白迄今被表征为II型膜蛋白，这意味着胞质结构域位于包膜蛋白的N末端。

对于麻疹F蛋白，跨膜结构域通过五个氨基酸的序列(SEQ ID NO：3)鉴定，对于麻疹H蛋白，该结构域通过四个氨基酸的序列(SEQ ID NO：4)鉴定。麻疹F蛋白的胞质部分通常由33个C末端氨基酸组成，麻疹Edmonston株的序列可在SEQ ID NO：5中找到。麻疹H蛋白的胞质部分通常由34个N末端氨基酸组成，麻疹Edmonston株的序列可在SEQ ID NO：6中找到。

对于尼帕G蛋白，跨膜结构域通常通过SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列和SEQ IDNO：8中所示的胞质部分鉴定。

对于尼帕F蛋白，跨膜结构域通常通过如SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列定义，而胞质部分通常由如SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列组成。

在本发明中使用的术语“截短的”是指缺失指定蛋白质的氨基酸残基。技术人员清楚的是蛋白质由核酸编码。因此，“截短的”也指编码给定的“截短的”蛋白质的核酸分子中的相应编码核酸。

此外，应理解，同样涵盖编码特定的截短或修饰的蛋白质的核酸分子，反之亦然

在本发明中，特别提及“截短的H”、“截短的G”或“截短的F”蛋白，其指定副粘病毒科，优选地分别麻疹H蛋白、尼帕G蛋白和尼帕或麻疹F蛋白，其胞质部分已被部分或完全截短，即氨基酸残基(或编码该蛋白质的相应核酸分子的编码核酸)已被删除。

F蛋白的胞质部分位于该蛋白质的C-末端。

对于具有位于C末端的胞质部分的所有包膜蛋白，当确定所需序列时，从该蛋白质的C末端开始计数。例如，对于源自麻疹Edmonston株的F蛋白，FcΔ30是指具有带氨基酸序列“RGR”的胞质部分的F蛋白。

相反，H、HN或G蛋白的胞质部分位于N末端。因此，当确定所需序列时，在H、HN或G蛋白的N末端的第二氨基酸残基处开始计数(即省略第一蛋氨酸残基)。在WO2008037458A2中公开了，可以将麻疹F蛋白的胞质结构域截短以包含至少1个带正电荷的氨基酸残基，并且可以将H蛋白的胞质部分截短以包含H蛋白的C-末端胞质部分的至少9个连续氨基酸残基加N末端的额外的蛋氨酸。然而，如果将H蛋白截短以允许有效的假型化并且仍具有融合支持功能，则预期H蛋白的胞质部分的进一步截短是可行的。

允许截短以进行有效假型化的修饰可以与消除天然受体结合功能的修饰结合。

本领域技术人员将能够容易地将突变，例如添加和缺失，引入给定的核酸或氨基酸序列中。

本发明的蛋白质还包括功能同源物。如果同源物具有与原始蛋白质相似的功能，则该蛋白质对于特定功能被视为另一种蛋白质的功能同源物。同源物可以是例如，蛋白质的片段，或者蛋白质的置换、添加或缺失突变体。

通常基于FASTA搜索来确定两个氨基酸序列是否基本同源。例如，如果第一蛋白质的氨基酸序列与第二蛋白质的序列具有至少约70％的氨基酸序列同一性，优选至少约80％的同一性，和更优选至少约85％、90％、95％或99％的同一性，则认为第一蛋白质的氨基酸序列与第二蛋白质的氨基酸序列是同源的。

如本申请中所使用的，术语“Psi阳性”和“psi阴性”分别指其中存在和不存在逆转录病毒psi元件的核酸分子。psi元件是位于逆转录病毒基因组5'端附近的顺式作用信号，并指定包装信号，该信号在病毒组装过程中是重要的并导致病毒RNA掺入病毒核心中。因此，psi阴性RNA不包含逆转录病毒psi元件，且因此不被组装到本发明的载体颗粒中；相反，确实包含所述psi元件的psi阳性RNA被有效地组装到载体颗粒中。

术语“滴度”或“转导效率”用作表征和比较载体颗粒关于转导其靶细胞的能力的手段。因此，具有“滴度”或“增加的转导效率”的载体颗粒能够在给定的载体颗粒体积下比具有相同体积的其他载体颗粒转导更多数量的细胞。

本发明中使用的术语“在(靶)细胞的表面上表达的抗原”或“细胞(表面)标志物”是指存在于细胞表面上，优选靶细胞上的分子。此类分子尤其可以是可包含糖链或脂质、分化簇(CD)、抗体或受体的肽或蛋白质。由于并非所有细胞群体表达相同的细胞标志物，因此可以使用细胞标志物来鉴定、选择或分离表达特定细胞标志物的给定细胞群体。例如，CD4是由T辅助细胞、调节性T细胞和树突状细胞表达的细胞标志物。因此，T辅助细胞、调节性T细胞和树突状细胞可以尤其通过FACS细胞分选仪利用CD4细胞标志物来鉴定、选择或以其他方式分离。

本文所用的术语“标记的多肽”是指直接或间接结合至少一种另外的组分(即，标签)的多肽。本文所用的标记的多肽能够结合在靶细胞上表达的抗原。该多肽可以是与在靶细胞表面上表达的抗原(例如，癌细胞上的肿瘤相关抗原)结合的抗体或其抗原结合片段。可选地，标记的多肽的多肽可以是细胞因子或生长因子或另一种能够与靶细胞的抗原结合的可溶性多肽。

如本文所用，术语“衔接子”或“衔接子分子”是指可以结合靶细胞的抗原的标记的多肽(例如，抗体或其抗原结合片段)，并直接或间接结合于至少一种其他成分(即，标签)。衔接子或衔接子分子可以是标记的抗体或其抗原结合片段、细胞因子或生长因子或能够与靶细胞的抗原结合的另一种可溶性多肽。

标签可以是例如半抗原或右旋糖酐并且该半抗原或右旋糖酐可以被包含对标签具有特异性的抗原结合结构域的多肽的抗原结合结构域结合。诸如FITC、生物素、PE、链霉亲和素或右旋糖酐的半抗原是仅当与大载体(如蛋白质)连接时才引发免疫反应的小分子；载体可以是本身也不引起免疫反应的载体。一旦身体产生了针对半抗原-载体加合物的抗体，小分子半抗原也可能能够与抗体结合，但通常不会引发免疫反应；通常只有半抗原-载体加合物才能做到这一点。

如本文所用，术语“包含对标签具有特异性的抗原结合结构域的多肽”是指可以结合标记的多肽的标签的多肽。标记的多肽不同于包含对标签具有特异性的抗原结合结构域的多肽。包含对标签具有特异性的抗原结合结构域的多肽可以是与标记的多肽的所述标签结合的抗体或其抗原结合片段。

可选地，“标记的多肽”可以是被包含对标签具有特异性的抗原结合结构域的融合多肽的抗原结合结构域结合的“靶细胞结合分子”(TCBM)，其中所述抗原结合结构域现在是抗-接头/标记表位(LLE)结合结构域，即标签结合结构域的特定变体。在下文中简要描述了使用如本文公开的TCBM和(载体)颗粒的适应性逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的系统。

如本文所公开的慢病毒或γ逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒可包含含有对融合于具有受体结合活性的截短蛋白质(例如，蛋白H)的TCBM的LLE具有特异性的抗原结合结构域的多肽，其中所述对LLE具有特异性的抗原结合结构域能够区分受试者中的天然存在的分子与包含抗原结合分子(ABM)、标记部分(LaM)和接头部分(LiM)的靶细胞结合分子(TCBM)，其中所述LiM将所述ABM和所述LaM缀合。ABM可以是所述标记的多肽的多肽部分。标记部分(LaM)可以是受试者中的天然存在的分子或其衍生物。接头部分(LiM)可以与标记部分(LaM)偶联。LiM和LaM一起代表所述标记的多肽的标签部分。具有LLE结合结构域的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒相比于没有接头部分的内源标记部分以更高的亲和力将TCBM与LaM和特定LiM结合。因此，在可能存在内源性LaM的生理条件下，TCBM的识别/结合性得到了改善。

该方法的益处在于，允许逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的适应性系统的LaM是非免疫原性的，因为它是受试者内源的天然存在的分子。LaM是自身抗原，与LiM偶联的LaM是修饰的自身抗原，其构建新的表位，接头/标记表位(LLE)，并且该LLE相比于在受试者中天然存在的分子更好地与包含对LLE具有特异性的抗原结合结构域的多肽的LLE结合域结合。

天然存在的分子可以是存在于受试者的循环系统中的分子，但是相比于TCBM以更低的亲和力被如本文所公开的逆转录病毒载体系统结合。优选地，受试者中的天然存在的分子可以是细胞外分子或具有部分细胞外结构的分子，更优选地，受试者中的天然存在的分子可以是人类非核蛋白。

接头部分和标记部分是还包含抗原结合部分(ABM)的靶细胞结合分子(TCBM)的部分，其中接头部分将LaM和ABM缀合。通常，所述ABM针对在靶细胞表面上表达的抗原。

将TCBM与本文公开的适应性逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒一起施用仅靶向在靶细胞表面上表达抗原(标志物)的那些细胞，从而选择性地转导靶细胞。本文公开的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的适应性系统可以用作“通用”逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒系统以靶向多种多样的靶细胞，例如，多种多样的肿瘤，而无需制备单独的逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的构建体。被包含所述LLE结合结构域的多肽的LLE结合结构域识别的TCBM的标记/接头表位(LLE)也可以保持恒定。只有TCBM的ABM才需要改变以允许系统靶向具有不同身份的靶细胞。

所述多肽的抗LLE结合结构域利用TCBM作为逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒与表达抗原的靶细胞之间的桥梁。TCBM在分子的一端包含标记部分(LaM)，和在另一端包含抗原结合部分(ABM)，其通过接头部分连接。对标记部分的身份的唯一要求仅在于其必须是受试者中的天然分子(自身抗原)，并且其接头部分缀合的变体可以被所述多肽的LLE结合结构域识别和相比于与非接头部分缀合的天然变体以更高的亲和力与其接头部分缀合的变体(修饰的自身抗原)结合。

每个可能能够产生LLE的分子可以用作接头部分。对接头部分的身份的唯一要求是该接头部分可以化学缀合(或偶联)于标记部分或者遗传地(重组地)编码，并且应能够在接头部分和标记部分的情况、界面和/或环境处产生新的表位。LiM可以优选是不引起或不倾向于在受试者中引起免疫反应的分子，例如，LiM是自身抗原。在这种情况下，LaM和LiM的界面生成新的表位，LLE。

LiM可以例如，选自肽、蛋白质、核酸、碳水化合物、聚羟基脂肪酸酯、烷基链、链烷酸、羧酸(例如，ε-氨基己酸(6-氨基己酸)或6-(6-氨基己酰胺基)己酸)法呢基类、聚乙二醇、脂质及其衍生物。

特别优选的LiM可以是6-(6-氨基己酰胺基)己酰基部分，例如，衍生自6-(6-氨基己酰胺基)己酸或6-(6-氨基己酰胺基)己酸活性酯或6-氨基己基部分，例如，衍生自6-氨基己酸或6-氨基己酸活性酯。适应性逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒系统可以是具有包含LLE结合结构域的多肽的系统，其中所述LaM是生物素，并且所述LiM是6-(6-氨基己酰胺基)己酰基接头部分或6-氨基己酰基接头部分。

如本文所用，术语“抗体”以最广义使用以涵盖抗体结构的各种形式，包括但不限于单克隆和多克隆抗体(包括全长抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段，即抗体、免疫粘附素和抗体-免疫粘附素嵌合体的抗原结合片段，其特异性识别(即结合)抗原。“抗原结合片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合位点(“抗体的抗原结合片段”)。抗原结合片段的实例包括Fab(片段抗原结合)、scFv(可变单链片段)、单域抗体、双抗体、dsFv、Fab'、双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用，术语“抗原”旨在包括结合一种或多种抗体或引起一种或多种抗体产生的物质，并且可以包括但不限于蛋白质、肽、多肽、寡肽、脂质、碳水化合物如右旋糖酐、半抗原及其组合，例如，糖基化蛋白质或糖脂。如本文所用，术语“抗原”是指可以在靶细胞的表面上表达并且可以通过适应性免疫系统识别的分子实体，其中适应性免疫系统包括但不限于抗体或TCR或工程化分子，包括但不限于内源或转基因TCR、CAR、scFv或其多聚体、Fab片段或其多聚体、抗体或其多聚体、单链抗体或其多聚体或者可以以高亲和力与结构进行结合的任何其他分子。

本文所用的术语“表达”定义为细胞中由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

术语“表位”是指可以被免疫系统，特别是抗体、B细胞或T细胞识别的抗原部分。例如，表位是抗体或其抗原结合片段与其结合的抗原的特定区块。

本文所用的术语“接头/标记表位”(LLE)或“标记/接头表位”可以互换使用，并且是指如本文公开的TCBM的缀合接头部分和标记部分的情况、界面和/或环境形成的表位。

通过标记部分与接头部分的偶联产生的表位在受试者中不是天然存在的。生成的表位包含所述LaM的部分和所述LiM的部分。优选地，在打算用本文公开的适应性系统治疗的受试者中，LLE不引起或不倾向于引起免疫反应。对于LLE的唯一要求是它是用于包含LLE结合结构域的多肽的表位。如本文公开的所述多肽的LLE结合结构域(其源自表位识别分子，例如识别标记/接头表位的抗体)以更高的优先性与新产生的表位结合，即标记/接头表位(修饰的自身抗原)，而不是没有接头部分的内源性标记部分，即受试者中的天然存在的分子(自身抗原)。

所述LLE结合结构域与所述LLE的结合亲和力比与所述天然存在的分子的亲和力至少高两倍，优选地至少5倍，更优选地至少10倍。

“循环系统”是受试者的器官系统，其允许血液循环和向体内细胞和从体内细胞输送养分(例如氨基酸和电解质)、氧、二氧化碳、激素和血细胞以提供营养，并有助于对抗疾病，稳定温度和pH值以及维持体内平衡。循环系统包括两个独立的系统：分配血液的心血管系统和循环淋巴的淋巴系统。

如本文所用，术语“受试者中的天然存在的分子或其衍生物”是指受试者中的分子或物质，优选地，所述分子位于细胞外或具有至少细胞外的部分，例如跨膜跨越蛋白质。天然存在的分子可以以游离形式存在或者共价或非共价结合于另一分子，例如，与蛋白质结合。例如，生物素以在血液系统中循环的游离形式存在，但也结合于例如血浆蛋白。

由于该要求，这些分子是非免疫原性的，因为它们是受试者的内源性分子(自身抗原)。例如，生物素是受试者中的天然存在的分子，因为它是受试者的血液系统(循环系统)中的循环分子。术语“其衍生物”在本情况中是指受试者中的所述天然存在的分子可以进行一些小的修饰而不改变所述分子的特性。所述修饰不同于接头基团与所述分子的缀合。术语“肿瘤”在医学上被称为赘生物。并非所有的肿瘤都是癌性的；良性肿瘤不会侵袭邻近的组织并且不会扩散到全身。

术语“癌症”在医学上被称为恶性肿瘤。癌症是涉及失调的细胞生长的广泛疾病并包括各种白血病。在癌症中，细胞(癌细胞)分裂并不受控制地生长，从而形成恶性肿瘤，并侵入身体的附近部位。癌症也可以通过淋巴系统或血流扩散到身体的更远端部分。有超过200种不同的影响人类的已知癌症。

实施例

实施例1：适应性逆转录病毒载体系统的原理

具有降低或消除的与其天然受体的相互作用的具有抗原结合活性的包膜蛋白分别配备有对生物素具有特异性的scFv(SEQ ID NO：1和2)、克隆Bio3-18E)和右旋糖酐(SEQID NO：13和14)。对于生物素特异性的scFv，可应用本文公开的LLE原理(图1C)，即scFVBio3-18E的抗原结合结构域相比于游离生物素或与其他接头偶联的生物素以更高的优先性结合于与6-(6-氨基己酰胺)己酰基基团或6-氨基己酰基部分(LiM)偶联的生物素(LaM)。LiM连接生物素和靶结合分子(TCBM)的抗原结合部分(ABM)。

scFV的两条链通过3(G4S)接头(SEQ ID NO：11)连接，并且可以沿任一定向(VH-VL或VL-VH)存在。定向可以分别影响假型化逆转录病毒载体或其病毒样颗粒的表达水平、稳定性、对标记的多肽的标签的亲和力和滴度。His标签(SEQ ID NO：12)添加到具有抗原结合活性蛋白的蛋白质的C末端，以使得能够通过流式细胞术测量表面表达(图2)。

通过基因合成(ATUM，Newark，California)获得编码以VH-VL定向的葡聚糖特异性(SEQ ID NO：13和14)和生物素特异性抗体(SEQ ID NO：1和2)的scFV的DNA。插入侧翼限制性位点SfiI和NotI以使其能够插入到SfiI和NotI消化的Hmut编码质粒pCG-Hmut中(Anliker等(2010))。使用编码以VL-VH定向的scFV的质粒，用添加限制性位点的引物通过PCR获得了编码以VL-VH定向的生物素特异性scFV的DNA。如前所述，通过SfiI和NotI将扩增的scFV插入消化的Hmut编码质粒中。就假型化逆转录病毒载体或其病毒样颗粒的生产力而言，具有抗原结合活性的重组蛋白的细胞表面表达至关重要。通过HEK-293T细胞的瞬时转染来测定表面表达，其中HEK-293T细胞在转染前一天以8×10⁵细胞/孔的密度接种在6个孔中。每一个构建体，将1.5μg DNA被转染。转染后两天，按照制造商的说明将一部分细胞用His标签-特异性的抗体染色(Miltenyi Biotec，目录号130-092-691)，然后用流式细胞仪测定His阳性细胞的比率(图3A)。用与生物素偶联的CD25特异性的抗体和荧光蛋白对另一部分细胞进行染色(Miltenyi Biotec，目录号130-019-010)。HEK-293T细胞为CD25阴性的，意味着仅检测到含有Bio3-18E scFV的具有抗原结合活性的蛋白质。因此，标记的细胞的定量可以与包膜蛋白的抗原结合能力间接相关(图3B)。

实施例2：标签特异性的假型化逆转录病毒载体的产生

通过HEK-293T细胞的瞬时转染产生对标记的多肽的标签具有特异性的假型化逆转录载体颗粒。将前一天接种在T175烧瓶中DMEM/10％FCS(Biowest，目录号12362；Biochrom，目录号S0415)中的HEK-293T细胞用编码H蛋白的质粒、编码F蛋白的质粒、编码gag/pol/rev的包装质粒和编码GFP的psi-阳性转移载体质粒转染。转染后48小时收获假型化逆转录病毒载体颗粒。为了除去细胞碎片，收集上清液，以1000rpm离心10分钟，然后通过0.45μm过滤器过滤。为了浓缩，将过滤的上清液通过20％蔗糖(Sigma Aldrich，目录号84097-250g，PBS中20％w/v)垫在4℃下以5350xg离心24小时。将沉淀的逆转录病毒载体重悬于250μl预冷的PBS中，等分并储存在-80℃下以备后用。

实施例3：标记的多肽的产生

根据本领域众所周知的方案，用LC-LC-生物素对如抗体或其片段的蛋白质进行随机标记。通过根据制造商的说明在平衡的Amicon Ultra-15过滤单元上运行将抗体或其片段重缓冲到1×PBS/2mM EDTA/0.5％BSA中。将生物素-LC-LC-NHS添加到重缓冲的蛋白质中，然后在室温(21℃)下孵育1小时。通过凝胶过滤除去剩余的生物素-LC-LC-NHS。测定收集的级分的蛋白质含量。通过在表达所述抗体或其片段的抗原的细胞系上孵育标记的抗体或其片段来确认生物素化。用荧光染料偶联的抗生物素抗体(Miltenyi Biotec，目录号130-104-563)和流式细胞术检测结合的标记的抗体。

实施例4：标签特异性的假型化逆转录病毒载体的滴定

在不存在标记的多肽的情况下，将假型化逆转录病毒载体颗粒在HT1080细胞上滴定。因此，通过生物素-LC-LC-NHS用LC-LC-生物素随机标记细胞表面上的蛋白质。重悬于1ml的PBS中的HT1080补充生物素-LC-LC-NHS，然后在恒定混合下于4℃孵育。除去无细胞的上清液后，洗涤细胞并以1×10⁵个细胞/孔在培养基(DMEM，10％FCS)中接种在24孔中直至细胞完全粘附。通过用荧光染料偶联的抗生物素抗体(Miltenyi Biotec，目录号130-090-856)染色和流式细胞术确认成功的生物素化(图4A)。将编码GFP的载体颗粒在含有

(Sigma Aldrich，目录号H9268-5G)的DMEM中连续稀释。转导后72小时，通过流式细胞术测定GFP阳性的比率来测定转导效率(图4A)。使用GFP阳性细胞的比率、稀释因子和所应用的逆转录病毒的体积来计算逆转录病毒载体滴度(即每体积的转导单位(TU/ml))(图4B)。

实施例5：用逆转录病毒载体转导细胞系

如所述(实施例4)的进行未生物素化的HT1080细胞的转导。

在RPMI，2mM稳定的谷氨酰胺(Biowest，目录号L0501-500；Lonza，目录号882027-12)中的48孔板中以3.3×10⁵细胞/ml转导Raji细胞(图5-11)。将逆转录病毒载体添加到细胞中，其培养至少72h，直到进行流式细胞术分析以确定转导细胞的比率和计算的滴度。SupT1以在接种在96孔U型底板中的RPMI，2mM稳定的谷氨酰胺中的1×10⁶细胞/ml转导(图7、8、11)。将逆转录病毒载体添加到细胞中，其培养至少72h直到进行流式细胞术分析以确定转导细胞的比率和计算的滴度。Jurkat细胞以2×10⁶细胞/ml的细胞密度在48孔板中在RPMI，2mM稳定的谷氨酰胺中转导(图5、7、9、10)。将逆转录病毒载体添加到细胞中，其至少培养72小时直到进行流式细胞术分析以确定转导细胞的比率和计算的滴度。为了验证由靶细胞表达的抗原的表达，用标记的多肽染色接着用荧光标记的α-生物素抗体(MiltenyiBiotec，目录号130-090-856)进行染色，并进行流式细胞术分析。

实施例6：用适应性逆转录病毒载体系统的选择性转导

为了用标签特异性逆转录病毒载体和对所选抗原特异性的标记的多肽选择性地转导靶细胞，将靶细胞如前所述(实施例5)接种在无血清培养基中。将标记的抗体或标记的Fab片段以100ng/ml至1000ng/ml的浓度添加到细胞中(图7、11、12)。将细胞与标记的多肽在4℃孵育至少30分钟。之后，加入编码GFP的逆转录病毒载体。在48孔板中以1×10⁶细胞/ml的总密度用等量的Raji和SupT1细胞显示混合细胞群体中的选择性。应用了Raji特异性转导方案(图8)。

实施例7：适应性逆转录病毒载体系统的优化

通过确定将细胞、标签特异性逆转录病毒载体和标记的多肽组合在一起的最佳顺序，可以容易地改善适应性逆转录病毒载体系统的性能和适用性。因此，将两个组分预孵育，然后添加第三组分。用作为多肽的α-CD20-Ab-标签、编码GFP的标签特异性逆转录病毒载体和作为靶细胞的Raji(CD20+)或作为非靶细胞的Jurkat细胞(CD20-)进行该分析。首先，使用1μg/mlα-CD20-Ab-标签和MOI 0.05的逆转录病毒载体剂量将α-CD20-Ab-标签和逆转录病毒载体在对于Raji细胞的300μl的RPMI或对于Jurkat细胞的150μl中合并。在4℃下孵育30分钟后，将靶细胞(Raji或Jurkat)重悬于预孵育的逆转录病毒载体/标记的多肽混合物中。在转导后至少72小时进行流式细胞术分析(图5A)。

其次，靶细胞或非靶细胞与逆转录病毒载体预孵育，细胞接种在RPMI培养基中(对于Jurkat为150μl，对于Raji为300μl)。将病毒载体以0.05的MOI加入到细胞，然后在37℃下孵育30分钟。之后，以1μg/ml的终浓度添加衔接子分子。在转导后至少72小时进行流式细胞术分析(图5B)。为了使衔接子与细胞初步结合，靶细胞接种于150μl(用于Jurkat)或300μl(用于Raji细胞)的RPMI中，并以1μg/ml的终浓度添加衔接子分子。在4℃下孵育30分钟后，添加编码GFP的病毒载体。在转导后至少72小时进行流式细胞术分析(图5C)。对于所有三种实验方案条件，在预孵育4小时后添加补充有10％FCS的RPMI至最终体积为1ml。

为了提高转导效率，使用了

(Miltenyi Biotec，目录号130-111-163)(图6C)。在转导之前直接在RPMI中制备

在转导之前，将逆转录病毒载体的体积与对应体积的

以1：2混合5分钟。然后将混合物添加到细胞中：对于Jurkat是50μl，或对于Raji细胞是100μl。应用

(Sigma Aldrich，目录号H9268-5G)作为对照(图6B)。

对于Jurkat细胞(图10A)或Raji细胞(图10B)上的CD4和CD20特异性的标记的多肽，示例性地测定了衔接子分子的最佳浓度。因此，使用了具有衔接子分子与细胞的初始结合的方案。

为了在倾向于诱导非特异性转导的条件下显示选择性，细胞在血清存在下，在未标记的多肽存在下和用高逆转录病毒载体剂量转导(图9)。

实施例8：筛选方法

在该实施例中，使用假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒通过将未知的标记的多肽与确定的细胞或细胞混合物一起孵育来测定未知的标记的多肽的特异性。假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒编码允许确定未知的标记的多肽所结合的细胞类型的标志物。该方法可以在体外或使用例如但不限于小鼠模型在体内进行。

实施例9：使用尼帕包膜蛋白进行假型化的衔接子-LV

通过使用编码尼帕病毒的G和F蛋白的质粒而不是麻疹病毒蛋白H、F编码质粒来修改如前所述的方案(实施例2)产生了用尼帕包膜蛋白假型化的衔接子-LV。在存在α-CD20-Ab-标签作为多肽的情况下，在Raji细胞上滴定假型化逆转录病毒载体颗粒。如前所述应用Raji特异性转导方案。在RPMI中连续稀释编码GFP的逆转录病毒载体颗粒。转导后72小时，通过流式细胞术测定EGFP阳性细胞的比率来测定转导效率。使用测量的GFP阳性细胞的比率、稀释因子和应用的逆转录病毒体积计算逆转录病毒载体滴度(即每体积转导单位(TU/ml))。如前所述，用标签特异性的尼帕包膜蛋白假型化逆转录病毒载体选择性转导接种在无血清培养基中的CD19阳性、CD20阳性Raji细胞(实施例5)。在4℃下将标记的衔接子以100ng/ml的浓度添加到细胞中至少30分钟。随后添加了编码GFP的尼帕包膜蛋白假型化的逆转录病毒载体。转导后3天通过流式细胞术分析测定转导效率(图13)。

实施例10：使用衔接子-VLP的靶向蛋白质递送

通过修改用于逆转录病毒载体的生产方案(实施例2)来产生假型化逆转录病毒VLP。HEK细胞用编码标签特异性麻疹H的质粒、编码麻疹F蛋白的质粒、编码gag/pol/rev的质粒和包含在基质和衣壳蛋白之间插入的所选择转基因的gag/pol/rev/转基因编码质粒转染。使用eGFP或单体红色荧光蛋白作为转基因。通过添加侧翼HIV-1蛋白酶切割位点将荧光蛋白释放到成熟的颗粒中(Uhlig等(2015))。如前所述(实施例4)滴定VLP。与此相反，分析已经在添加VLP后4小时进行。为了选择性地转移荧光蛋白，在不存在(w/o)或存在对SupT1细胞表达的抗原具有特异性的标记的或未标记的衔接子分子的情况下，将标签特异性的VLP添加到无血清培养基中的CD4阳性、CD8阳性SupTl细胞中(实施例5)。衔接子浓度设定为100ng/ml(对于α-CD8-AB为10ng/ml)。将细胞与衔接子在4℃下孵育至少30分钟后，以0.05的MOI加入VLP。4小时后，通过流式细胞术测量蛋白质转移率，图14A和14B。

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Claims (15)

1.一种组合物，包含

i)假型化逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒，其包含：

a)一种具有抗原结合活性的包膜蛋白，其中所述包膜蛋白是不与至少一个其天然受体相互作用的重组蛋白，并且在其胞外域处与包含对标记的多肽的标签特异性的抗原结合结构域的多肽融合，并且其中所述包膜蛋白源自副粘病毒科的蛋白G、HN或H，

b)一种源自副粘病毒科的具有融合活性的包膜蛋白，和

ii)所述标记的多肽，其中所述标记的多肽与靶细胞表面表达的抗原特异性结合，从而用所述逆转录病毒载体颗粒转导所述靶细胞或从而诱导所述病毒样颗粒摄取至所述靶细胞中。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述具有抗原结合活性的包膜蛋白不是人嗜性的。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中在存在所述标记的多肽的情况下，所述靶细胞上的所述转导或所述诱导的摄取比在非靶细胞上高至少10倍。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述副粘病毒科病毒是麻疹病毒属或亨尼巴病毒属的病毒。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述源自副粘病毒科病毒的蛋白G或H的蛋白质缺少所述蛋白G或H的胞质区的至少一部分。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述源自副粘病毒科的具有融合活性的包膜蛋白缺少所述包膜蛋白的胞质区的至少一部分。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的组合物，其中所述麻疹病毒属是麻疹病毒或麻疹病毒的Edmonston株。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述逆转录病毒载体颗粒是慢病毒或γ逆转录病毒载体颗粒或其病毒颗粒。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述标记的多肽的多肽是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与在所述靶细胞表面上表达的所述抗原结合，并且其中所述标记的多肽的标签是半抗原。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，

其中所述标记的多肽的多肽是抗原结合部分(ABM)，其中所述标记的多肽的标签是靶细胞结合分子(TCBM)的接头/标记表位(LLE)，其包含

i)抗原结合部分(ABM)，其中所述ABM特异性结合于所述靶细胞表面上表达的所述抗原，

ii)标记部分(LaM)，其中所述LaM是受试者中的天然存在的分子或其衍生物，

iii)偶联所述ABM和所述LaM的接头部分(LiM)，从而形成接头/标记表位(LLE)，

其中对标签特异性的所述多肽的所述抗原结合结构域是接头/标记表位(LLE)结合结构域，

其中所述LLE结合结构域优先于所述天然存在的分子与所述LLE结合。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述LLE结合结构域以比与所述天然存在的分子结合至少高两倍的亲和力与所述LLE结合。

12.根据权利要求10或11所述的组合物，其中所述LaM是生物素或其衍生物，并且所述LiM是6-(6-氨基己酰胺基)己酰基部分或6-氨基己酰基部分。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述LLE结合结构域包含SEQ ID NO：1(VH)和SEQ ID NO：2(VL)的序列。

14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，任选地进一步包含药学上可接受的载体。

15.一种用于用根据权利要求1至13中任一项所述的组合物的假型逆转录病毒载体颗粒或其病毒样颗粒的假型逆转录病毒载体颗粒转导靶细胞或递送其病毒样颗粒的蛋白质的体外方法，包括以下步骤：

a)用根据权利要求1至13中任一项所述标记的多肽组合物的标记的多肽对靶细胞进行预孵育，以及

b)将所述逆转录病毒载体颗粒或其载体样颗粒添加到步骤a)的所述预孵育的靶细胞中。

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