CN117467706A - BaEV囊膜糖蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本涉及一种用于假病毒包装的病毒囊膜糖蛋白或多肽，及其组合物，以及使用所述囊膜糖蛋白或多肽包装的囊膜病毒。所述病毒囊膜糖蛋白或多肽可提高囊膜病毒的包装效率及包装后病毒的转导效率。

Description

BaEV囊膜糖蛋白及其应用
技术领域
本申请涉及用于转导NK细胞的慢病毒或其他逆转录病毒及用于所述慢病毒或其他逆转录病毒包装的质粒和细胞系。
背景技术
近年来，以CAR-T细胞为代表的肿瘤免疫疗法展现了良好的效果及巨大的潜力。CAR在T细胞的表达是影响CAR-T细胞疗效重要因素之一，随着CAR-T临床的进展，为了进一步优化CAR-T疗效，改善免疫微环境、提高CAR-T持续性等方案增加进了CAR的设计中，对CAR转导T细胞的能力有了更高的要求。并且随着技术的发展有了通用型细胞治疗产品的需求，已有研究将自然杀伤细胞(Nature killer cell后文缩写为“NK”或“NK细胞”)、γδT细胞应用于通用型免疫细胞疗法，但是这一类细胞较传统的T细胞更难进行转导或采用其他方法进行修饰、编辑。除此之外，针对巨噬细胞、DC细胞等固有免疫细胞、干细胞进行基因编辑也越来越被关注，这些细胞同样存在者难于进行遗传操作的现象。
目前应用成熟的VSV-G慢病毒(包装有VSV-G(水疱性口炎病毒囊膜糖蛋白)的假型慢病毒)或使用VSV-G包装的其他逆转录病毒均不足以解决上述转导、遗传操作难题，有大量研究表明，VSV-G慢病毒转导NK细胞的效率极低(仅为5～10％)，导致这种现象的原因极有可能是因为NK细胞具有天然的抗病毒能力，同样具有天然抗病毒能力的固有免疫细胞如γδT细胞、DC细胞、巨噬细胞也有文献报道采用VSV-G慢病毒转导效率极低，我们前期的数据也证实了这一点。虽然也有文献报道一些提高VSV-G假型慢病毒转导能力的方案，但是采用的试剂较难符合临床应用要求，如有文献报道使用PDK1抑制剂BX795可有效提高VSV-G假型慢病毒转导NK细胞的效率，但是BX795会对NK细胞的杀伤功能及增殖能力带来一定的影响，这显然不符合临床应用的要求。有研究表明一些逆转录病毒可高效的转导NK细胞，但逆转录病毒插入位点的安全性存在着一定风险，这一缺点限制了其在临床应用中的推广。
专利WO2013/045639A1公布了改造后的包装有狒狒内源性逆转录病毒(Baboonendogenous virus，BaEV)囊膜糖蛋白的慢病毒(BaEV慢病毒)可以高效转导T细胞及B细胞。虽然BaEV囊膜糖蛋白(BaEV-G)具有极高的应用价值，但BaEV囊膜糖蛋白难以生产出高滴度的假病毒颗粒。目前，用于慢病毒包装的BaEV囊膜糖蛋主要有两种形式：1、BaEV-Rless，即无融合抑制性R肽(Fusion restrictive R peptide)的BaEV囊膜糖蛋白形式；2、BaEV/TR，即胞尾结构域替换为MLV囊膜糖蛋白胞尾结构域的BaEV囊膜糖蛋白形式。BaEV-Rless在293T中表达会使293T形成大量的合胞体，导致细胞大量死亡，严重影响了慢病毒包装。通过293F优化BaEV-Rless慢病毒包装工艺，可在1L体系中生产最多约1E9 TU(ELISA测定p24蛋白)的BaEV-Rless慢病毒，但这种工艺产量不稳定，且滴度仍难以满足需求。BaEV/TR形式相对于BaEV-Rless，细胞毒性大大降低，大幅度减少了病毒包装过程中合胞体的出现，但病毒滴度低于BaEV-Rless形式。因此，优化BaEV囊膜糖蛋白的结构，提高包装的病毒滴度，是BaEV囊膜糖蛋白能否应用于难转导的免疫细胞、干细胞生产制备的关键。
发明概述
本申请通过构建BaEV囊膜糖蛋白变体，例如嵌合囊膜糖蛋白，以及引入VSV-G囊膜糖蛋白的假病毒包装方法，提高了BaEV囊膜病毒的包装效率，及其包装后的转导效率，尤其是对NK细胞、T细胞、B细胞等难于转导的细胞的转导效率。
具体地，本申请涉及：
1、一种用于假病毒包装的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽。所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽包含BaEV囊膜糖蛋白(BaEV-G)的胞外区、跨膜区、以及MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域。在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽相较于野生型BaEV-G，其区别仅在于所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽相对于野生型BaEV-G具有不同的胞尾结构域，且所述胞尾结构域源自MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域，即所述胞尾结构域为野生型MoRV囊膜糖蛋白或其功能衍生物。在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽中所述BaEV囊膜糖蛋白(BaEV-G)的胞外区、跨膜区、以及MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域通过连接子连接或直接连接。在一些实施方案中，所述假病毒是慢病毒或其他逆转录病毒。在一些实施方案中，所述慢病毒或其他逆转录病毒源自HIV。
2、根据项1所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的胞外区序列包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列具有约70％以上(例如75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上)同一性的序列。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白的胞外区序列为SEQ IDNO：1中所示的氨基酸序列。
3、根据项1或2所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的跨膜区序列包含如SEQ ID NO：2或19所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQ IDNO：2或19具有约70％以上(例如75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白的跨膜区氨基酸序列为SEQID NO：1或19所示的氨基酸序列。
4、根据项1-3中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其中所述MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域包含如SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或与SEQ IDNO：3具有约70％以上(例如75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域为如SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列。
5、根据项1所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其包含如SEQ ID NO：4中的氨基酸序列或其功能衍生物，或与SEQ ID NO：4具有约70％以上(例如75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，根据上述任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其中所述野生型BaEV-G及所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽均包含如SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或与SEQ ID NO：13具有70％以上(例如75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的序列如SEQ ID NO：4所示。
6、根据前述任一项所述的蛋白或多肽，其中所述MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域的蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点替代。
7、根据项6所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其中所述HIV蛋白酶切割位点包含如SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或与SEQ ID NO：9具有约70％以上(例如75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HIV蛋白酶切割位点为如SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域中被前述氨基酸序列替换的蛋白酶切割位点序列为如SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的胞尾结构域包含如SEQ ID NO：20中的氨基酸序列或其功能衍生物，或与SEQ ID NO：20具有约70％以上(例如75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的胞尾结构域为SEQ ID NO：20中的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽包含如SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，或其功能衍生物，或与SEQ IDNO：21具有70％以上(例如75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：21中所示。
8、编码根据项1-7中任一项所述的蛋白或多肽的核酸。在一些实施方案中，所述核酸是DNA。在一些实施方案中，所述核酸是RNA。在一些实施方案中，所述核酸同时包含脱氧核糖核苷和核糖核苷。在一些实施方案中，所述核酸包含化学修饰。在一些实施方案中，所述核酸包含的用于启动所述蛋白或多肽表达的启动子。在一些实施方案中，所述启动子为真核生物启动子。在一些实施方案中，所述启动子选自：CAG、miniCMV、SV40。
9、根据项8的核酸，其包含如SEQ ID NO：5、6、7、8和27中所示的任一多核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO：5、6、7、8和27中任一多核苷酸序列具有约70％以上(例如75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上)同一性的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸的多核苷酸序列选自SEQ ID NO：5、6、7、8和27。
10、包含根据项8或9所述的核酸的质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒。在一些实施方案中，所述质粒为用于病毒包装的囊膜质粒。在一些实施方案中，所述囊膜质粒为任何可用于在真核细胞内表达外源蛋白的质粒。在一些实施方案中，所述质粒为逆转录病毒囊膜质粒。在一些实施方案中，所述质粒为慢病毒囊膜质粒。在一些实施方案中，所述囊膜质粒为插入了项8或项9的核酸序列的pMD2.G的骨架结构。在一些实施方案中，所述质粒为使用项8或项9的核酸序列替换了VSV-G核酸编码序列的pMD2.G质粒。在一些实施方案中，所述囊膜质粒为插入了项8或项9的核酸序列的pcDNA3.1质粒。
11、包含根据项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽、和/或根据项8或9所述的核酸、和/或根据项10所述的质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒的细胞。
12、根据项11的细胞，其中所述细胞是293T细胞或其衍生细胞。在一些实施方案中，所述细胞选自293T细胞、293F细胞、HEK293细胞、293T/17SF细胞。在一些实施方案中，所述细胞为免疫效应细胞或干细胞。在一些实施方案中，所述细胞为T细胞、B细胞或NK细胞。
13、一种组合物或复合物，其包含：
VSV囊膜糖蛋白或编码VSV囊膜糖蛋白的核酸、质粒、病毒颗粒或人造纳米颗粒；以及
根据项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，根据项8或9所述的核酸，根据项10所述的质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒，或根据项11或12所述的细胞。
在一些实施方案中，所述组合物或复合物适用于第一、第二及第三代慢病毒包装系统。
在一些实施方案中，所述组合物还进一步包含Gag，Pol，Rev与Tat的编码核酸，或包含Gag、Pol和Rev的编码核酸而不包含Tat的编码核酸。在一些实施方案中，所述包含Gag，Pol，Rev与Tat的编码核酸分别存在于一个或两个或二个以上质粒中。在一些实施方案中，所述包含Gag和Pol的编码核酸的质粒为pMDlg/pRRE。在一些实施方案中，所述包含Rev编码核酸的质粒为pRSV-Rev质粒。
在一些实施方案中，Gag、Pol、Rev与Tat的编码核酸存在于根据项11或12所述的细胞中。在一些实施方案中，所述组合物还包含编码目的基因序列、启动目的基因表达的启动子、LTR和psi包装信号的核酸。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述包含编码目的基因序列、启动目的基因表达的启动子、LTR和psi包装信号的核酸的质粒为转移质粒。
在一些实施方案中，本申请还提供了一种用于假病毒包装的试剂盒，其包含项13中的组合物或复合物。在一些实施方案中，所述假病毒为逆转录病毒。在一些实施方案中，所述病毒为慢病毒。
14、将根据项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，根据项8或9所述的核酸，根据项10所述的质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒，根据项11或12所述的细胞，或根据项13的组合物用于假病毒包装的用途。在一些实施方案中，所述假病毒是慢病毒或其他逆转录病毒。在一些实施方案中，所述慢病毒或其他逆转录病毒源自HIV。
15、一种用于转导细胞的假病毒颗粒，其由根据根据项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽包装而成。在一些实施方案中，所述假病毒颗粒的囊膜糖蛋白包含根据项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽。在一些实施方案中，所述假病毒颗粒的囊膜糖蛋白包含根据项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽中除R肽以外的部分。在一些实施方案中，所述细胞选自：NK细胞、αβT细胞、γδT细胞、DC细胞和干细胞。在一些实施方案中，所述假病毒为慢病毒或其他逆转录病毒。在一些实施方案中，所述慢病毒或其他逆转录病毒源自HIV。所述在一些实施方案中，所述假病毒颗粒包装有嵌合抗原受体(CAR)或其编码序列。
16、根据项15所述的假病毒颗粒，其囊膜中还进一步包含VSV的囊膜糖蛋白。在一些实施方案中，所述囊膜中的蛋白组分由VSV-G和项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白组成。
17、根据项15或16所述的假病毒颗粒，其为慢病毒或其他逆转录病毒的假病毒颗粒。
18、根据项17所述的假病毒颗粒，所述慢病毒或其他逆转录病毒源自HIV病毒。
19、根据项15-18中任一项所述的假病毒颗粒，其包含嵌合抗原受体或其组分，或所述嵌合抗原受体或其组分的编码序列。
20、根据项19所述的假病毒颗粒，其中所述嵌合抗原受体特异性结合CD19或CD123。
21、通过转导根据项15-20中任一项所述的假病毒颗粒获得的细胞。
22、根据项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，根据项8或9所述的核酸，根据项10所述的质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒，根据项11或12所述的细胞、根据项13的组合物、根据项15-20中任一项所述的假病毒颗粒、或根据项21所述的细胞在制备细胞治疗药物中的用途。
因此本申请还涉及：
1、一种用于假病毒包装的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，包含BaEV囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、以及MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域。
2、根据项1所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的胞外区序列包含如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列具有约70％以上同一性的氨基酸序列。
3、根据项1或2所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的跨膜区序列包含如SEQIDNO：2或SEQIDNO：19所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：19所示的氨基酸序列具有约70％以上同一性的氨基酸序列。
4、根据项1-3中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其中所述MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域包含如SEQIDNO：3所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQIDNO：3所示的氨基酸序列具有约70％以上同一性的氨基酸序列。
5、根据项1-4中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其中所述MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域的蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点替代。
6、根据项5所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其包含如SEQIDNO：4或21所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQIDNO：4或21所示的氨基酸序列具有约70％以上同一性的氨基酸序列。
7、根据项6所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其中所述HIV蛋白酶切割位点包含如SEQIDNO：9中的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQIDNO：9所示的氨基酸序列具有约70％以上同一性的氨基酸序列。
8、编码根据项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的核酸。
9、根据项8的核酸，其包含如SEQIDNO：5、6、7、8和27中所示的任一多核苷酸序列，或与SEQIDNO：5、6、7、8和27中所示的任一多核苷酸序列具有约70％以上同一性的多核苷酸序列。
10、包含根据项8或9所述的核酸的载体，优选该载体为质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒。
11、包含根据项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽、和/或根据项8或9所述的核酸、或根据项10所述的载体的细胞。
12、根据项11的细胞，其中所述细胞是293T细胞或其衍生细胞。
13、用于假病毒包装的囊膜糖蛋白组合，其包含：
VSV囊膜糖蛋白或其编码核酸；以及
根据项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽或其编码核酸。
14、将根据项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，根据项8或9所述的核酸，根据项10所述的载体，根据项11或12所述的细胞，或根据项13的囊膜糖蛋白组合用于病毒包装的用途，优选所述病毒为逆转录病毒，更优选所述病毒为慢病毒。
15、一种用于转导细胞的假病毒颗粒，其包含根据项1-7中任一项所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，根据项8或9所述的核酸，根据项10所述的载体，或根据项13的囊膜糖蛋白组合。
16、根据项15所述的假病毒颗粒，其还进一步包含VSV的囊膜糖蛋白。根据项15所述的假病毒颗粒，其为逆转录病毒，优选为慢病毒。
17、根据项16所述的假病毒颗粒，其为HIV病毒。
18、根据项15-17中任一项所述的假病毒颗粒，其包含嵌合抗原受体或其编码序列。
19、根据项18所述的假病毒颗粒，其中所述嵌合抗原受体为特异性结合CD19或CD123的嵌合抗原受体。
20、根据项15-19中任一项所述的假病毒颗粒转导的细胞。
21、根据项20的细胞，其为NK细胞、αβT细胞、γδT细胞、DC细胞或造血干细胞。
22、根据项20或21所述的细胞在制备细胞治疗药物中的用途。
附图说明
图1.野生型BaEV囊膜糖蛋白结构示意图。
图2.替换了胞尾的BaEV囊膜糖蛋白结构示意图。
图3.使用SERV-Rless囊膜糖蛋白进行慢病毒包装后感染293T的阳性标志物(GFP或CD19-CAR)流式检测结果。
图4.使用不同囊膜糖蛋白包装形成的囊膜慢病毒滴度检测结果。
图5.用HERV-wt或HERV-Rless包装的慢病毒按照MOI＝5转导pbNK后使用流式细胞仪检测的转导效率。
图6.用包装有BaEVRless、BaEVTR、BaEV-MoRV tail、BaEV-FLV tail、BaEV-KLVtail、BaEV-GaVL tail囊膜糖蛋白的慢病毒按照MOI＝1转导pbNK，转导后3天进行检测，其转导效率的流式检测结果(以GFP阳性率表示)。
图7用包装有BaEV-MoRV tail、BaEV-GaVL tail囊膜糖蛋白和BaEV-HIV蛋白酶切割位点的慢病毒按照MOI＝3或者MOI＝5转导pbNK，转导后3天进行检测，其转导效率的流式检测结果(以CAR-NK阳性率表示)。
图8.不同囊膜糖蛋白包装的囊膜慢病毒与对比文献中的优选方案(BaEVRless和BaEVTR)的滴度比较。
图9.显示将BaEV-MoRV tail囊膜糖蛋白编码序列通过转座进入293T细胞基因组，并成功构建稳定表达BaEV-MoRV tail囊膜糖蛋白的293T细胞。
图10.BaEV-MoRV-tail::VSV-G嵌合慢病毒和BaEV-MoRV-tail嵌合慢病毒对pbNK细胞的转导效率的流式细胞仪测试结果。
图11.替换蛋白酶切割位点的囊膜慢病毒与未替换蛋白酶切割位点的囊膜慢病毒转导效率比较。
图12.显示将使用293T-BaEV-MoRV Tail(LV)细胞系包装的包含CD123-CAR或mbIL15的慢病毒按MOI＝3转导活化2天的pbNK细胞，转导后三天用流式细胞仪检测的NK细胞转导效率。
发明详述
本发明提供了一种BaEV囊膜糖蛋白(BaEV-G)的嵌合蛋白的结构，以及包含所述嵌合蛋白及VSV-G的假病毒颗粒，尤其是逆转录病毒的假病毒颗粒。使用所述BaEV-G变体包装的假病毒颗粒可具有更高的包装效率及产量。并且，使用所述BaEV-G变体包装的假病毒颗粒对难于转导的免疫细胞或干细胞具有更高的转导效率。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有本申请所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般定义：Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nded.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al(编),Springer Verlag(1991)；以及Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有赋予它们的含义。
如本文所用，术语“转导”是指天然或人工改造的病毒颗粒进入细胞并将其中包含的遗传物质带入所述细胞的过程。
如本文所用，术语“野生型”具有本领域技术人员通常理解的含义，意指大自然中存在的典型形式的生物体、菌株、基因或特征，其未经人工的刻意修饰。除非另有说明，本申请所述的“囊膜糖蛋白”包含“野生型”囊膜糖蛋白和工程化的囊膜糖蛋白(例如嵌合病毒囊膜糖蛋白或野生型囊膜糖蛋白去掉了部分结构域或增添了部分源自其他囊膜糖蛋白的结构域后形成的囊膜糖蛋白)。但当提及某个特定病毒的“囊膜糖蛋白”的某个部分时，则指该特定囊膜糖蛋白的“野生型”的该部分。例如MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域，则指野生型MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域。“野生型”蛋白包括本申请提及的任何参比蛋白及其天然存在的变体。本申请中，凡提及某种特定病毒的囊膜糖蛋白的某个部分或其某个氨基酸位点，均指其相对于野生型蛋白的相应部分或相应氨基酸位点。为方便描述，本申请以野生型蛋白中的一种作为参比蛋白。对于本申请列举的具体参比蛋白，其具体序列，及序列各功能区段的划分是本领域技术人员可以通过已知数据库获取的。在本申请中，人内源性病毒囊膜糖蛋白(HERV-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号AAM68163.1所示，考拉逆转录病毒囊膜糖蛋白(KLV-G)如NCBI GeneBank编号ALX81658.1所示，长臂猿白血病病毒囊膜糖蛋白(GaLV-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号AAC96085.1所示，鼠内源性逆转病毒囊膜糖蛋白(MoRV-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号AAC42271.1所示，猫白血病病毒囊膜糖蛋白(FLV-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号ACB05740.1所示，猫内源性病毒囊膜糖蛋白(RD114-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号CAA61093.1所示，猿猴内源性逆转录病毒囊膜糖蛋白(SERV-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号AEJ22866.1所示，鼠白血病病毒囊膜糖蛋白(MLV-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号AAP13891.1所示。在本申请中，如非另有说明，则当提及例如MoRV-G的胞尾结构域，则是指所述MoRV-G对应于NCBI GeneBank编号AAC42271.1胞尾结构域的部分。本领域技术人员可以理解，除本申请举例的具体参比蛋白外的其他天然存在的野生型变体蛋白也在本申请保护范围内，而且其相应结构域和氨基酸位置也是本领域技术可以确定的。
如本文所用，“载体”是指通过其可以将多核苷酸序列(例如目的基因序列)引入宿主细胞中，以转化宿主并促进引入序列的表达(例如转录和翻译)的载体。载体包括质粒、噬菌体、病毒、人造纳米颗粒等。
如本文所用，术语“人造纳米颗粒”指具有小于1000nm的直径的人工合成或经人工改造后形成的颗粒，其适于将本申请的核酸和/或蛋白递送至把细胞中。示例性的人造纳米颗粒包括但不限于：脂质纳米颗粒、外泌体等。其中所述“脂质纳米颗粒”通常是球形囊泡结构，其由围绕内部水性隔室的单层或多层脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。所述直至纳米颗粒可由若干种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成脂质纳米颗粒。尽管当脂质膜与水性溶液混合时，脂质纳米颗粒形成是自发的，但是也可通过使用匀化器、超声波破碎仪或挤出装置以摇动的形式施加力来加速脂质纳米颗粒的形成。可将若干种其他添加剂添加到脂质纳米颗粒中以便改变它们的结构和特性。例如，可将胆固醇或鞘磷脂添加到脂质纳米颗粒混合物中，以便帮助稳定脂质纳米颗粒结构并防止脂质纳米颗粒内容物(inner cargo)的泄漏。脂质纳米颗粒制剂可主要由以下组成：天然磷脂和脂质，诸如
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱和单唾液酸神经节苷脂。可作为固体纳米颗粒(例如金属，诸如银、金、铁、钛)、非金属、基于脂质的固体、聚合物)、纳米颗粒的悬浮液或其组合提供。
如本申请所用，“目的基因”是指包含于载体，例如病毒载体中，意在通过将所述载体导入靶细胞而在靶细胞中启动表达的基因或其编码序列。
如非特别说明，本申请中的“慢病毒载体”及“慢病毒颗粒”可互换使用，均指包装有目的基因序列的假型慢病毒颗粒。慢病毒载体的构建方法是本领域已知的，且具体描述于Naldini等人(2000)Adv.Virus.Res.55:599 609和Negre等人(2002)Biochimie84:1161-1171等文献中。通常，根据本发明的慢病毒载体颗粒至少包含以下组分：(i)包膜组分(在本申请中“包膜”与“囊膜”可互换使用)，其由与包膜蛋白结合的磷脂双分子层构成，其中所述包膜蛋白至少包含上述定义的嵌合或修饰的糖蛋白，所述包膜环绕(ii)由gag蛋白结合构成的核心组分，所述核心本身环绕(iii)通常由核糖核酸(RNA)构成的基因组组分和(iv)酶组分(pol)。所述生物材料可以存在于包膜内、核心内和/或基因组组分内。慢病毒载体可以容易地由本领域技术人员，例如，通过遵循由Sandrin等人(2002)Biood100:823 832提供的通用指导来制备。简而言之，慢病毒载体颗粒可通过在生产细胞(例如293T人胚胎肾细胞或其衍生细胞)中共表达包装元件(即核心和酶组分)、基因组组分和包膜组分来生成。通常可以采用3至4种质粒，但所述质粒的数目也可以根据慢病毒组分被分解成单独元件的程度而更多。在一些实施方案中，所述部分组分，例如包膜组分、酶组分等可插入生产细胞基因组中，并利用所述生产细胞进行病毒载体的包装。在一些实施方案中，所述包装元件和囊膜组分可以存在于质粒中，其中包含病毒基因组组分的质粒、包含所述囊膜组分的质粒、以及包含酶组分和/或核心组分蛋白质编码序列的组分分别称为转移质粒、包装质粒和包膜质粒。常用的慢病毒包装质粒包括psPAX2，以及pMDlg/pRRE和pRSV-Rev，其分别作为第二代和第三代慢病毒包装系统的组分。其中psPAX2质粒上还有gag、pol、rev及tat的编码序列，pMDlg/pRRE质粒包含gag和pol的编码序列，pRSV-Rev包含rev的编码序列。
在本申请中，“假病毒”和“假病毒颗粒”可互换使用，是指包含外来病毒包膜糖蛋白的病毒载体。例如，根据本申请的病毒载体可以使用下文定义的嵌合病毒囊膜糖蛋白或所述囊膜糖蛋白的变体假型化。“假病毒”包含“假型慢病毒”及其他假型逆转录病毒。其中“慢病毒”是“假型慢病毒”、野生型慢病毒及其他工程化慢病毒的统称。“逆转录病毒”是“假型逆转录病毒”、野生型逆转录病毒及其他工程化逆转录病毒的统称。本领域技术人员应当知晓，慢病毒是一种逆转录病毒。
在本申请中，“病毒载体”是“病毒颗粒”的一种。“病毒载体”强调该病毒颗粒是工程化的病毒，其中包含人工引入或改造的蛋白或核酸片段。
如本文所用，“狒狒内源性逆转录病毒”或“BaEV”是以多个前病毒拷贝存在于狒狒DNA中的C型逆转录病毒。术语“BaEV囊膜糖蛋白”(BaEV-G)在本领域中也被称为“BaEV包膜糖蛋白”。BaEV囊膜糖蛋白具体描述于Benveniste等人(1974)Nature248:17-20和Todaro等人(1974)Cell 2:55-61等文献中。本申请所述的BaEV囊膜糖蛋白包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：13所示的序列具有至少70％、80％、85％、90％、或95％同一性的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保持SEQ ID NO：13所决定的蛋白或多肽的基本功能，其相对于SEQ ID NO：13的差异不导致所述糖蛋白吸附宿主细胞的细胞膜、与宿主细胞膜融合、以及协助将基因组核酸或目的基因编码核酸注入宿主细胞的能力丧失。在本申请中，当提及某嵌合病毒囊膜糖蛋白时，其以其胞外区所源自的病毒囊膜糖蛋白命名。例如，BaEV嵌合囊膜糖蛋白，则是BaEV囊膜糖蛋白中除胞外区以外的某些部分被替换为其他病毒囊膜糖蛋白的结构域的嵌合蛋白形式。例如“BaEV/TR”包含或由BaEV包膜糖蛋白的跨膜和胞外区与MLV(鼠白血病病毒)包膜糖蛋白的胞尾结构域的融合体组成的嵌合囊膜糖蛋白。“BaEVRLess”则指胞尾结构域缺乏融合抑制性R肽的修饰的BaEV囊膜糖蛋白。所述“BaEVRLess”和“BaEV/TR”的具体形式详细描述于中国专利CN104080917B中。
在本申请中，术语“融合抑制性R肽”或“R肽”是指囊膜糖蛋白的胞尾结构域的C末端部分，其携带酪氨酸内吞信号-YXXL，并在病毒颗粒成熟过程中被病毒蛋白酶裂解，从而增强囊膜糖蛋白的膜融合能力。BaEV囊膜糖蛋白的融合抑制性R肽通常位于野生型BaEV囊膜糖蛋白氨基酸序列的547和564之间。
囊膜糖蛋白从氨基端到羧基端通常可依次包含胞外区、跨膜区和胞尾结构域(Cytoplasmic tail domain，在本申请中有时以“tail”表示)。在囊膜病毒中，跨膜区穿过病毒囊膜分别于位于病毒囊膜外侧的胞外区以及位于病毒囊膜内侧的胞尾结构域相连。在本申请中，“胞外区”是对应于参比BaEV囊膜糖蛋白(NCBI序列登记号YP_009109691.1)氨基酸1-503位(包括端点)的部分，“跨膜区”是对应于所述参比BaEV囊膜糖蛋白氨基酸504至532位(包括端点)或者氨基酸504至524位(包括端点)的部分，胞内结构域是对应于所述参比BaEV囊膜糖蛋白氨基酸534至563位(包括端点)的部分。
如本文所用，某种蛋白的“功能衍生物”包括所述蛋白的各种变体或功能结构域，只要所述变体或功能结构域保留了所述蛋白的某个功能结构域的功能(无论是增强的所述功能或减弱的所述功能)，即可称为所述蛋白的功能衍生物。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一组工程化多肽或蛋白，当其在免疫效应细胞中时，与靶细胞上包含的特定抗原结合，并在识别所述特定抗原后产生细胞内信号，激活所述受体所在细胞的下游通路，以启动所述免疫效应细胞对所述靶细胞的杀伤作用。所述免疫效应细胞包括但不限于NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞等。CAR通常包括至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域。所述细胞外抗原结合结构域可特异性识别抗原，非限制性实例包括衍生自抗体的单链可变片段(scFv)、选自文库的片段抗原结合区(Fab)、单结构域片段或与接合其同源受体的自然配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合区域可以包含scFv、Fab或天然配体，以及它们的任何衍生物。细胞外抗原结合区可以指除完整抗体之外的分子，其可以包含完整抗体的一部分并且可以与完整抗体所结合的抗原结合。抗体片段的实例可以包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双功能抗体、线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。所述“信号转导结构域”通常包含免疫受体的酪氨酸活化基序(immune-receptortyrosine-based activation motifs，ITAM)，其基本组成是：YXXL/V。其中Y为酪氨酸，L/V指亮氨酸或缬氨酸，X可为任意氨基酸。当受体与相应配体结合后，与其连接的ITMA中的酪氨酸在与细胞膜相连的一类蛋白酪氨酸激酶PTK的作用下，可被磷酸化，从而招募胞内游离的其他蛋白激酶或衔接蛋白，向细胞内传导活化信号。在一些实施方案中，所述“信号转导结构域”选用TCRζ(CD3ζ)或FcεRIγ的胞内信号转导结构域。如本文所用，所述“共刺激结构域”又称为“共刺激信号域”，主要用于提供共刺激信号来增强免疫细胞的能力，包括例如增强记忆细胞的增殖、存活和/或发育。在一些实施方案中，所述“共刺激结构域”选自CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)等。如本文所用，所述“跨膜结构域”又称“跨膜区”，是指锚定在细胞膜内具有热力学稳定的蛋白质结构区域。跨膜结构域可以从天然蛋白质中获得，例如来源于T细胞受体(TCR)的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域选自CD4，CD8α，CD28和CD3ζ的跨膜结构域。
如本文所用，术语“连接子”是一条短肽，用于连接蛋白或多肽中多个结构域或部件。例如本申请中的BaEV-MoRV-tail囊膜糖蛋白，其包含的BaEV囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、及胞尾结构域可通过连接子或具有一定功能的其他氨基酸链相连，也可以直接相连。所述“直接相连”则是指所述结构域或部件之间不包含任何其他氨基酸残基。
在本申请中，“293T细胞”即HEK 293T细胞，是一种来源于人类胚胎肾脏的永生化细胞系。HEK 293T细胞是由HEK 293细胞通过基因技术派生出的细胞系，其由HEK 293细胞经过腺病毒E1A基因的转染，能稳定表达SV40大T抗原，并含有SV40复制起始点与启动子区。而HEK 293细胞及其他所有HEK 293细胞的衍生细胞，在本申请中均被归为“293T细胞的衍生细胞”，其包括但不限于293F细胞及293T/17SF细胞。
如本文所用，术语“蛋白酶切割位点”是指逆转录病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域包含的供其表达的蛋白酶识别以便于切割的一段氨基酸序列。当蛋白酶识别所述“蛋白酶切割位点”并完成所述切割后，所述病毒囊膜糖蛋白的胞尾结构域将失去R肽。本申请中使用的各种囊膜糖蛋白包含的蛋白酶切割位点是本领域已知的，例如BaEV囊膜糖蛋白包含如SEQID NO：14所示的氨基酸序列。HIV蛋白酶切割位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。在本文中，凡提及某种特定囊膜糖蛋白的蛋白酶切割位点则指所述特定囊膜糖蛋白的野生型蛋白胞尾结构域中包含的蛋白酶切割位点。
嵌合病毒囊膜糖蛋白
本申请一方面提供了一种用于假病毒包装的嵌合病毒囊膜糖蛋白(亦可简称为“嵌合囊膜糖蛋白”)或多肽。“囊膜糖蛋白”，又称为“包膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)”。对于野生型的囊膜病毒，其囊膜糖蛋白由该病毒基因组编码，包被在病毒外层。GP是一种多功能蛋白质，在病毒的吸附、穿入宿主细胞、致病性、下调宿主细胞表面蛋白质表达和增加病毒装配和出芽过程中起着至关重要的作用。因此，囊膜糖蛋白的选择对病毒包装滴度和对宿主细胞的转导都起着至关重要的作用。
本申请提供的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽由来源于不同囊膜糖蛋白的多个区段连接而成，即所述“嵌合病毒囊膜糖蛋白”包含源自至少两种病毒囊膜糖蛋白的结构域或肽段。在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽包含BaEV囊膜糖蛋白(BaEV-G)的胞外区、跨膜区、以及MoRV(鼠内源性逆转病毒)囊膜糖蛋白的胞尾结构域。在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽相较于野生型BaEV-G，其区别仅在于所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽相对于野生型BaEV-G具有不同的胞尾结构域，且所述胞尾结构域源自MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域，即所述胞尾结构域为野生型MoRV囊膜糖蛋白或其功能衍生物。在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽中所述BaEV囊膜糖蛋白(BaEV-G)的胞外区、跨膜区、以及MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域通过连接子连接或直接连接。本申请实施例以慢病毒为示例，测试了所述嵌合病毒囊膜糖蛋白对病毒颗粒包装及转导的影响，证实了使用所述嵌合病毒囊膜糖蛋白包装的病毒，相对于现有技术中使用VSV-G或BaEV-G其他变体包装的病毒具有更高的包装效率和包装稳定性。并且对于难转导的细胞，例如NK细胞、T细胞等免疫细胞，其具有不输BaEV-G现有其他变体，或更优的转导效率。因此，本领域技术人员应当知晓，本申请提供的用于假病毒包装的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，不仅可用于慢病毒或逆转录病毒的包装，并且同时可适用于其他囊膜病毒的包装，并且对由其包装的病毒具有前述类似的影响。
示例性的BaEV囊膜糖蛋白的胞外区序列如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列具有约70％以上同一性的氨基酸序列。示例性BaEV囊膜糖蛋白的跨膜区如SEQ ID NO：2或19所示的序列或其功能衍生物，或与SEQID NO：2或19具有约70％以上同一性的氨基酸序列。示例性的MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或与SEQ ID NO：3具有约70％以上同一性的氨基酸序列。本领域技术人员应当知晓，虽然本申请提供的方案中，在使用所述嵌合病毒囊膜糖蛋白包装病毒颗粒的过程中，所述胞尾结构域包含R肽区段，由其包装完成的病毒中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白也可不包含所述胞尾的R肽区段。MoRV的R肽区段的位置和序列是本领域已知的。在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽为BaEV-MoRV tail囊膜糖蛋白，示例性的氨基酸序列为如SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其功能衍生物，或与SEQ ID NO：4具有约70％以上同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽包含野生型BaEV-G除胞尾结构域以外的全部序列。示例性地，所述野生型BaEV-G及所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽均包含如SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或与SEQ ID NO：13具有70％序列同一性的氨基酸序列。在包装的过程中，即使本方案提供的嵌合囊膜糖蛋白或多肽包含信号肽，经其包装形成的病毒颗粒中的嵌合囊膜糖蛋白或多肽也可不包含信号肽。因为，本领域技术人员应当知晓，所述信号肽分子可在包装过程中由蛋白酶切除。如本文所用，术语“信号肽”是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，长度通常为5-30个氨基酸。在一些实施方案中，所述信号肽为用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的氨基酸序列。在多数情况下，信号肽位于氨基酸序列的N端。在mRNA中，信号肽的编码序列通常位于起始密码子后，是一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域。在信号肽引导蛋白质完成定位后，通常会在信号肽酶的作用下被切除。修改或修饰信号肽分子，可以改变或改善蛋白质的转移、定位或组装特性，这是本领域众所周知的。因此，本申请中提供的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽可以不包含信号肽，也可以替换或修饰信号肽，其使用的信号肽无需被如SEQ ID NO：11中的示例性信号肽所限制。
在一些实施方案中，所述MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域的蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点替代。以示例性的野生型MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域为例，其中如SEQID NO：14所示的氨基酸序列由如SEQ ID NO：9中的氨基酸序列所替换。在一些实施方案中，所述嵌合囊膜病毒糖蛋白或多肽的胞尾结构域包含如SEQ ID NO：20的氨基酸序列或其功能衍生物，或与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有约70％以上同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽包含如SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，或其功能衍生物，或与SEQ ID NO：21具有70％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
核酸
第二方面，本申请还公开了一种编码前述嵌合病毒囊膜糖蛋白的核酸。在一些实施方案中所述核酸是DNA。在一些实施方案中，所述核酸是RNA。在一些实施方案中，所述核酸同时包含脱氧核糖核苷和核糖核苷。在一些实施方案中，所述核酸包含化学修饰。在一些实施方案中，所述核酸包含的用于启动所述蛋白或多肽表达的启动子。在一些实施方案中，所述启动子为真核生物启动子。在一些实施方案中，所述启动子选自：CAG、miniCMV、SV40。在一些实施方案中，所述核酸针对不同的宿主细胞进行了密码子优化。本申请的核酸可以是环状的、线状的、单链的或双链的。
在一些实施方案中所述核酸包含如SEQ ID NO：5中所示的多核苷酸序列，或与SEQID NO：5、6、7、8和27中任一多核苷酸序列具有约70％以上同一性的多核苷酸序列。在一些实施方案中所述核酸包含如SEQ ID NO：6所示的多核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5、6、7、8和27中任一多核苷酸序列具有约70％以上同一性的序列。在一些实施方案中所述核酸包含如SEQ ID NO：7中所示的多核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5、6、7、8和27中任一多核苷酸序列具有约70％以上同一性的序列。在一些实施方案中所述核酸包含如SEQ ID NO：5、6和7中所示的多核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5、6、7、8和27中任一多核苷酸序列具有约70％以上同一性的序列。在一些实施方案中所述核酸包含如SEQ ID NO：8中所示的多核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5、6、7、8和27中任一多核苷酸序列具有约70％以上同一性的多核苷酸序列。在一些实施方案中所述核酸包含如SEQ ID NO：27中所示的多核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5、6、7、8和27中任一多核苷酸序列具有约70％以上同一性的多核苷酸序列。
本申请的另一方面还提供了质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒，其包含前面描述的任一种核酸。在一些实施方案中，所述质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒中还进一步包含可在宿主细胞中启动前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽表达的启动子。在一些实施方案中，所述质粒为用于病毒包装的囊膜质粒。在一些实施方案中，所述囊膜质粒为任何可用于在真核细胞内表达外源蛋白的质粒。在一些实施方案中，所述质粒为逆转录病毒囊膜质粒。在一些实施方案中，所述质粒为慢病毒囊膜质粒。在一些实施方案中，所述囊膜质粒为插入了项8或项9的核酸序列的pMD2.G的骨架结构。在一些实施方案中，所述质粒为使用项8或项9的核酸序列替换了VSV-G核酸编码序列的pMD2.G质粒。在一些实施方案中，所述囊膜质粒为插入了项8或项9的核酸序列的pcDNA3.1质粒。所述病毒颗粒是任一种可感染或转导目的靶细胞并在其中表达、向所述靶细胞的细胞质中导入、或向所述靶细胞的基因组插入前述核酸的病毒颗粒或病毒载体。例如在一些实施方案中，所述靶细胞为真核细胞，则常见的所述病毒颗粒包括但不限于：慢病毒载体(LV)、腺病毒载体(ADV)、腺相关病毒载体(AAV)、小鼠白血病病毒(MLV)等。示例性的人造纳米颗粒，包括例如脂质纳米颗粒、量子点等。
本申请还提供了工程化的细胞，其包含前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽、或前述核酸、质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒。在一些实施方案中，所述细胞只是由于导入了所述包含前面描述的核酸，或包含前述任一种核酸的病毒颗粒、质粒、或人造纳米颗粒，因此可瞬时或在一段时间内表达前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽。在一些实施方案中，所述核酸、质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒还包含转座元件，其将前述核酸插入所述工程化细胞，而将所述工程化细胞构建成稳定表达前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的细胞。
组合物或复合物
第三方面，本申请还提供了包含前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，前述核酸、质粒、病毒颗粒、人造纳米颗粒，或细胞的组合物或复合物。在一些实施方案中所述组合物或复合物还进一步包含VSV囊膜糖蛋白或编码VSV囊膜糖蛋白的核酸、质粒、病毒颗粒或人造纳米颗粒。所述组合物或复合物可用于假病毒的包装，为假病毒的包装提供前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽。
在一些实施方案中，所述组合物或复合物适用于第一、第二及第三代慢病毒包装系统。在一些实施方案中，所述组合物还进一步包含Gag，Pol，Rev与Tat的编码核酸，或包含Gag、Pol和Rev的编码核酸而不包含Tat的编码核酸。在一些实施方案中，所述包含Gag，Pol，Rev与Tat的编码核酸分别存在于一个或两个质粒中。在一些实施方案中，所述包含Gag和Pol的编码核酸的质粒为pMDlg/pRRE。在一些实施方案中，所述包含Rev编码核酸的质粒为pRSV-Rev质粒。在一些实施方案中，Gag、Pol、Rev与Tat的编码核酸存在于前述细胞中。在一些实施方案中，所述组合物还包含编码目的基因序列、启动目的基因表达的启动子、LTR和psi包装信号的核酸。在一些实施方案中，所述包含编码目的基因序列、启动目的基因表达的启动子、LTR和psi包装信号的核酸为转移质粒。
在一些实施方案中，所述组合物或复合物包含在基因组中插入了可稳定表达前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的核酸的细胞，可用于将目的基因序列包装入假病毒颗粒。因此，所述组合物或复合物进一步包含编码目的基因序列、启动目的基因表达的启动子、LTR和psi包装信号的核酸，以及其他用于病毒包装的辅助成分。例如在一些实施方案中，所述组合物或复合物还包含Gag，Pol，Rev和/或Tat的编码核酸。所述编码目的基因序列、启动目的基因表达的启动子、LTR和psi包装信号的核酸，以及包含Gag，Pol，Rev和/或Tat的编码核酸可以质粒或基因组组分等任何便于在所述细胞中表达或包装的形式存在。在一些实施方案中，所述表达前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的核酸通过病毒转导或转座等方式插入所述细胞的基因组。
在一些实施方案中，所述复合物或组合物包含的是前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其可与其他包装所需元件的核酸或蛋白复合在一起或复合在一起。所述复合可以是蛋白与核酸复合形成的核蛋白。
在一些实施方案中，本申请还提供了一种用于假病毒包装的试剂盒，其包含前述的组合物或复合物。在一些实施方案中，所述假病毒为逆转录病毒。在一些实施方案中，所述病毒为慢病毒。
病毒载体
第四方面，本申请还提供了一种用于转导靶细胞的假病毒颗粒，其在囊膜中包含前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽。在一些实施方案中，所述靶细胞为免疫效应细胞或造血干/祖细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞选自：NK细胞、αβT细胞、γδT细胞、DC细胞和干细胞。在一些实施方案中，所述假病毒为慢病毒或其他逆转录病毒。在一些实施方案中，所述慢病毒或其他逆转录病毒源自HIV。所述在一些实施方案中，所述假病毒颗粒包装有嵌合抗原受体(CAR)或其编码序列。在一些实施方案中，使用所述病毒载体转导后，所述免疫效应细胞被改造为表达外源蛋白的工程化免疫效应细胞，例如CAR-T细胞、CAR-NK细胞等。在一些实施方案中，所述假病毒颗粒包含嵌合抗原受体或其组分，或所述嵌合抗原受体或其组分的编码序列。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体特异性结合CD19或CD123。
在一些实施方案中，所述假病毒颗粒的囊膜中还进一步包含VSV的囊膜糖蛋白。在一些实施方案中，所述囊膜中的蛋白组分由VSV-G和前述的嵌合病毒囊膜糖蛋白组成。在一些实施方案中所述VSV-G包含如SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本申请还提供了目的基因本身包含编码前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的核酸序列的病毒颗粒或假病毒颗粒。在一些实施方案中，所述病毒颗粒选自慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等工程化病毒载体。在一些实施方案中，所述假病毒颗粒的囊膜糖蛋白中可包含或不包含前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽。在一些实施方案中，所述目的基因本身包含编码前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的核酸序列的假病毒颗粒的靶细胞为293T细胞或其衍生细胞，例如选自：293T/17、293F、HEK293、293T/17SF的靶标细胞。
在一些实施方案中，所述假病毒颗粒为慢病毒或其他逆转录病毒的假病毒颗粒。在一些实施方案中，所述慢病毒或其他逆转录病毒源自HIV病毒。
细胞
本申请一方面还提供了表达或包含前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的细胞，所述细胞可用于囊膜慢病毒的包装，为所述包装提供囊膜糖蛋白。在一些实施方案中，所述细胞是293T细胞或其衍生细胞。在一些实施方案中，所述细胞选自293T细胞、293F细胞、HEK293细胞、293T/17SF细胞。
另一方面，本申请还提供了由前述由所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽包装的病毒载体转导形成的工程化细胞。所述工程化细胞表达外源的目的基因，或过表达其某种内源基因，或者通过所述目的基因的表达调节所述细胞内源基因的表达，或修饰所述细胞。所述目的基因序列的示例包括但不限于：嵌合抗原受体(CAR)编码序列、Ig基因编码序列、细胞因子基因编码序列、shRNA、CRISPR基因编辑系统及其他基因编辑系统。在一些实施方案中，所述细胞为免疫效应细胞或干细胞。在一些实施方案中，所述细胞为T细胞、B细胞或NK细胞。在一些实施方案中，所述细胞经所述病毒载体转导后形成例如：CAR-NK细胞、CAR-T细胞。
用途
本申请一方面还提供了前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽、前述核酸前述质粒、病毒颗粒、人造纳米颗粒、前述细胞的用途，尤其是用于假病毒包装的用途。在一些实施方案中，病毒包装是慢病毒包装或其他逆转录病毒包装。在一些实施方案中，所述慢病毒或其他逆转录病毒源自HIV。
在一些实施方案中，前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽所述包含前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽编码序列的核酸、质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒与编码目的基因的核酸、以及其他病毒包装所需元件或其表达载体，例如质粒，共同构成包装系统，所述包装系统被导入靶细胞中，并借由靶细胞中的相关细胞器、功能蛋白等进行假病毒的包装。
在一些实施方案中，首先将所述包含前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽编码序列的核酸、质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒导入靶细胞，进行所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的瞬时表达，或插入靶细胞基因组以构建稳定表达嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的细胞；随后，将其他编码目的基因的核酸、以及其他病毒包装所需元件或其表达载体导入细胞，或同样地插入细胞基因组，然后借由靶细胞中的相关细胞器、功能蛋白等进行假病毒的包装。
示例性的具体使用方法包括但不限于以下步骤：
(1)载体构建
使用插入了BaEV-MoRV tail编码序列的前述慢病毒载体或非病毒载体(包括但不限于人造纳米颗粒和质粒)将BaEV-MoRV tail整合到用于病毒包装的细胞系基因组。所述整合的方法包括但不限于慢病毒系统、PB转座子系统、SB转座子系统、ΦC31整合酶系统等。所述慢病毒可选自前述慢病毒载体，所述PB转座子系统可选自前述质粒。所述驱动BaEV表达的启动子可以是不同强度的启动子，包括CAG、miniCMV、SV40等。在PB转座子系统的质粒结构中，可在ORF 3’末端加入WPRE或bGH poly A，以提高转录本的稳定性。在质粒中也加入包括但不限于嘌呤霉素、新霉素等抗性基因，以方便后续细胞系的筛选。
(2)细胞的构建
将(1)中构建的载体导入细胞。当所述载体为慢病毒载体时，所述导入可在增感试剂包括DEAE、polybrene等的作用下，将BaEV-MoRV-tail的编码序列导入靶细胞基因组。所述靶细胞选自293T细胞或其衍生细胞。
当所述载体为非病毒载体时，所述导入的方法包括但不限于电穿孔、脂质体转染、钙转、PEI等方法，将包含转座子及转座酶的质粒导入靶细胞中，在转座酶的作用下将不同形式的BaEV编码序列插入到靶细胞的基因组中。
完成导入后的靶细胞可以通过筛选细胞系的方法(包括但不限于流式分选、药物筛选等)分选出表达BaEV-MoRV tail的细胞。在此基础上，为了进一步优化病毒包装的效率，可通过流式分选、有限稀释等方法将上述细胞单克隆化。经鉴定，在一些实施方案中，293T-BaEV细胞系的不同克隆的BaEV表达丰度有所差异，且中的表达丰度的克隆在病毒包装效率上更具优势。
(3)病毒包装
将包含目的基因的质粒、RRE、Rev按一定比例转导上述稳定表达BaEV-MoRV-Tail的293T细胞系后进行病毒包装，转染48小时后收获培养物上清，经PEG6000浓缩后病毒流式滴度可达1e8 TU/ml以上。可在此基础上，在包装过程中加入VSV-G编码质粒，以进一步提高慢病毒滴度，提升幅度可达5-8倍。
(4)病毒转导效果检测
将(3)中的慢病毒慢按MOI＝1-5，转导活化后的PBMC来源的NK细胞(pbNK)。在添加病毒前可加入polybrene、DEAE等阳离子聚合物，提高转导效率。转导后3天，通过流式细胞仪进行目的基因表达的阳性率检测，结果显示阳性率可达50-80％。
另一方面，本申请还提供了将前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，前述核酸前述质粒、病毒颗粒、人造纳米颗粒、前述细胞、前述组合物或复合物、前述假病毒颗粒在制备细胞治疗药物中的用途。示例性的使用方法包括，例如使用所述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽包装的慢病毒转导免疫效应细胞，以制备具有精准靶向性的工程化免疫效应细胞，例如CAR-T细胞、CAR-NK细胞等；制备在囊膜中表达前述嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的假病毒颗粒，所述假病毒颗粒包含的目的基因，并可携带所述目的基因在体内或体外转导来自受试者的细胞，以使所述细胞表达治疗性的外源蛋白、使所述细胞的内源性基因的表达被调节，或修饰所述细胞，所述目的基因序列的示例包括但不限于：嵌合抗原受体(CAR)编码序列、Ig基因编码序列、细胞因子基因编码序列、shRNA、CRISPR基因编辑系统及其他基因编辑系统组分。
本发明的有益效果在于：
1、在假病毒包装过程中，BaEV-MoRV-tail结构可在R肽不缺失的情况下形成具有功能的BaEV囊膜的慢病毒，细胞毒性低于BaEV-Rless、BaEV/RT等现有技术的优选方案，且病毒滴度与所述优选方案相当或更高；
2、在慢病毒包装过程中加入VSV-G可形成BaEV::VSV-G嵌合囊膜慢病毒，进一步提高慢病毒的滴度，拓展适用范围；
3、构建的293T-BaEV细胞系可提高病毒的转导效率。
应当理解，本发明包含本文所描述的各种方面、实施方案以及所述方面和/或实施方案的组合。以上描述以及随后的实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。在本发明范围内的其他方面、改进和修改对于本发明所属领域的技术人员将是显而易见的。因此，本领域的普通技术人员应该认识到，本申请的范围还包括对所述方面和实施方案的所述改进和修改。
下面结合附图对本申请的示例性实施例进行描述，其中包括了本申请实施例的各种细节以助于理解，应当认为其仅仅是示例性的。因此，本领域的普通技术人员应该认识到，可以对这里描述的实施例进行各种改变和修改而不背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简洁，以下描述中省略了对众所周知的特征和结构的描述。
实施例
实施例1：BaEV结构优化及筛选
在NCBI数据库中检索库检索并收集type-C或D的内源性逆转录病毒，其中包括(AAM68163.1(人内源性病毒囊膜糖蛋白，HERV-G)、ALX81658.1(考拉逆转录病毒囊膜糖蛋白，KLV-G)、AAC96085.1(长臂猿白血病病毒囊膜糖蛋白，GaLV-G)、AAC42271.1(鼠内源性逆转病毒囊膜糖蛋白，MoRV-G)、ACB05740.1(猫白血病病毒囊膜糖蛋白，FLV-G)、CAA61093.1(猫内源性病毒囊膜糖蛋白，RD114-G)、AEJ22866.1(猿猴内源性逆转录病毒囊膜糖蛋白，SERV-G)、AAP13891.1(鼠白血病病毒囊膜糖蛋白，MLV-G))。
将BaEV囊膜糖蛋白(BaEV-G)的胞尾结构域及R肽用上述FLV-G、KLV-G、GaLV-G、或MoRV-G胞尾结构域及R肽替换后(如图2所示)分别称为：BaEV-FLV tail、BaEV-KLV tail、BaEV-GaVL tail、BaEV-MoRV tail。将SERV-Rless(去除R肽的SERV-G)、HERV-wt(野生型HERV-G)、HERV-Rless(去除R肽的HERV-G)、BaEV-FLV tail、BaEV-KLV tail、BaEV-GaVLtail、BaEV-MoRV tail编码序列通过密码子优化、序列合成、双酶切、连接、测序验证等一系列流程连接至pMD2.G的载体质粒骨架(Addgene，货号#12259)中，分别形成下述载体质粒SERV-Rless-pcDNA 3.1、HERV-wt-pcDNA 3.1、HERV-Rless-pcDNA 3.1、BaEV-FLV tail-pcDNA 3.1、BaEV-KLV tail-pcDNA 3.1、BaEV-GaVL tail-pcDNA 3.1、BaEV-MoRV tail-pcDNA 3.1。
将慢病毒转移质粒：包含CAR(嵌合抗原受体)编码序列的慢病毒转移质粒(本实施例中使用的是靶向CD19的CAR，其具体信息详细记载于中国专利：CN107226867A中，其全文通过引用并入本文)或pBKL2-GFP(插入了GFP绿色荧光蛋白编码序列的慢病毒转移质粒)，以及pMDLg/pRRE和pRSV-Rev；分别与SERV-Rless-pcDNA 3.1、HERV-wt-pcDNA 3.1、HERV-Rless-pcDNA 3.1、BaEV-FLV tail-pcDNA 3.1、BaEV-KLV tail-pcDNA 3.1、BaEV-GaVLtail-pcDNA 3.1或BaEV-MoRV tail-pcDNA 3.1组合，共转染293T细胞，进行慢病毒包装和浓缩。
浓缩后的慢病毒，用293T进行滴度检测。将1×105个293T细胞接种至24孔板中，将浓缩后的病毒按1、2、5ul/孔的体积分别感染293T，并加入DEAE助转剂(上海生工，货号：A600147)，感染后2天，收集被感染后的293T细胞，进行流式检测。其中CAR结构阳性率(包含CAR结构的细胞占细胞总数的比例，后简称“阳性率”)用PE偶联的L蛋白(Sino biological，货号：11044-H07E-P)进行流式细胞检测。滴度计算方式为：Titer(TU/ml)＝1×105×阳性率×稀释倍数÷病毒体积×1000。结果显示包含SERV-Rless的组合无法形成慢病毒(图3)，而包含HERV-wt、HERV-Rless、BaEV-FLV tail、BaEV-KLV tail、BaEV-GaVL tail、BaEV-MoRVtail的组合可形成慢病毒(图4)。
以DEAE为助转剂，用HERV-wt或HERV-Rless包装的慢病毒按照MOI＝5转导pbNK(外周血NK细胞)，转导后3天进行流式检测，结果显示转导效率不足5％(图5)，即：不能进行有效转导。
用包装有BaEV-FLV tail、BaEV-KLV tail、BaEV-GaVL tail、BaEV-MoRV tail囊膜糖蛋白的慢病毒按照MOI＝1转导pbNK，转导后3天进行流式检测，如图6所示。
用包装有BaEV-MoRV tail和BaEV-GaLV tail囊膜糖蛋白的慢病毒按照MOI＝3或者MOI＝5转导pbNK，转导后3天进行流式检测，如图7所示
综合图4、图6及图7，可见相对于前述其他慢病毒，包装有BaEV-MoRV tail的慢病毒具有相对更高的包装滴度，并且对外周血NK细胞具有相对更高的转导效率，尤其在转到CAR基因时，BaEV-MoRV-tail囊膜糖蛋白在转导效率方面显示出更突出的优势。
将包装有BaEV-MoRV tail的慢病毒与包装有BaEV-Rless及BaEV/TR的慢病毒(具体结构描述于国际申请WO2013/045639A1中，所述申请全文在此通过引用并入本文)的包装滴度(图8)及对pbNK细胞的转染效率(图6)进行比较，结果表明包装有BaEV-MoRV tail的慢病毒依然具有相对更高的包装滴度，并且对外周血NK细胞具有相对更高的转导效率。
实施例2 PB转座子系统构建293T-BaEV-MoRV tail细胞系及其应用
将密码子优化后的BaEV-MoRV tail编码序列通过双酶切连入PB转座子质粒(由金斯瑞公司合成，其包含PiggyBac转座子必要功能部件)中，经过酶切及测序验证后，扩增并提取相应的质粒pPBK-CAG-BaEVRless-WPRE-bGH，使用的质粒浓度不应低于1000ng/ul。将1×107个293T细胞与5μg pPBK-CAG-BaEVRless-WPRE-bGH质粒及5μg转座酶质粒2P(由金斯瑞公司合成，可在哺乳动物细胞中表达PB转座酶)在总体积为100μl的电转液中混匀，通过Lonza 4D电转系统进行电转，电转程序为DG130，电转液为OPTI-MEM。
将电转后的293T细胞进行扩大培养，并通过流式细胞仪分选阳性细胞，使用的标记抗体为BaEV胞外区的鼠多克隆抗体(自制，可通过本领域已知的任何多克隆抗体的制备方法制备)，荧光二抗为兔抗鼠的Alexa 647(Thermos货号：A21239)。对分选后的表达BaEV-MoRV tail的293T细胞(293T-BaEV-MoRV tail)进行扩大培养后再次进行阳性率复测(图9)，由下图可以看出，分选后的表达BaEV-MoRV tail的293T细胞依然具有较高的阳性率表达。
使用如表1所示的组合物转导上述分选后的表达BaEV-MoRV tail的293T细胞(293T-BaEV-MoRV tail细胞系)，并检测囊膜慢病毒滴度。滴度检测结果也显示于表1中。可见，在包装的过程中同时加入VSV-G和BaEV-MoRV-tail囊膜糖蛋白，相对于仅加入BaEV-MoRV-tail囊膜糖蛋白可进一步提升慢病毒包装效率。
表1、293T-BaEV-MoRV tail(PB)包装的病毒滴度
将上述慢病毒按MOI＝5转导pbNK细胞，在转导后3天，用anti-CD19-scFv-APC单克隆抗体(自制，可使用本领域任何已知的单克隆抗体制备方法制备)检测CAR-NK阳性率。结果如图10所示，可以看出，包装有BaEV-MoRV-tail囊膜糖蛋白的慢病毒，无论是否还进一步包含VSV-G，都可以对pbNK细胞达到较高的感染效率。
实施例3不同结构BaEV囊膜糖蛋白酶切位点改造
将BaEV-Rless、BaEV/TR、BaEV-MoRV tail的蛋白酶切割位点分别替换为HIV蛋白酶切割位点(HIV cleavage site)或人工合成位点(synthetic sequence)(如图2所示)。pBKL2-GFP、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev与候选囊膜糖蛋白BaEV-Rless、BaEV/TR、BaEV-MoRVTail、BaEV-MoRVT-HIV蛋白酶切割位点(BaEV-MoRV-tail胞尾结构域的对应蛋白酶切割位点替换为HIV蛋白酶切割位点)、BaEV-HIV蛋白酶切割位点(将自身蛋白酶切割位点替换为HIV蛋白酶切割位点的BaEV-G)分别组合进行慢病毒包装，方法同实施例1；收获慢病毒粗提液后，用胰酶将293T细胞消化下来，收集至离心管中，标记7-AAD后用流式细胞仪检测其细胞活率，如下表所示，由表2可以看出，包装后的慢病毒均能保持较高的细胞活率。
表2、包含不同囊膜糖蛋白的囊膜慢病毒转导后细胞活率检测
用上述慢病毒按MOI＝5转导pbNK，在转导后三天，用流式细胞仪进行检测，结果如图11所示，可以看出，BaEV-MoRV Tail结构中改变蛋白酶切位点，例如将其蛋白酶切割位点更改为HIV蛋白酶切割位点可以增强该结构的细胞转导效率。
实施例4慢病毒法构建的293T-BaEV-MoRV Tail细胞系进行CD123-CAR及mbIL15的慢病毒包装
通过密码子优化和序列合成获得BaEV-MoRV Tail编码序列，通过酶切连入使用不同启动子的慢病毒转移质粒pBKL2中。经过酶切及测序验证后，提取相应的质粒pBKL2-MoRVtail(该质粒中囊膜糖蛋白的表达使用CAG启动子)、pBKL2-miniCMV-MoRV tail及pBKL2-SV40-MoRV tail。
将pBKL2-BaEV-MoRV tail或pBKL2-miniCMV-BaEV-MoRV tail或pBKL2-SV40-BaEV-MoRV tail分别与慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE及pRSV-Rev通过钙转法转染293T细胞。48h收获病毒粗提液。通过PEG-6000浓缩病毒粗提液后，通过RT-PCR测定病毒滴度。
按MOI＝1-2，将上述慢病毒转导293T，转导后3天通过流式细胞仪检测转导效率，阳性率>85％即可进行后续验证。BaEV细胞系阳性率检测抗体为BaEV胞外区的鼠多克隆抗体，荧光二抗为兔抗鼠的Alexa 647。结果说明使用慢病毒转导细胞也可以成功构建表达BaEV-MoRV tail囊膜糖蛋白的细胞系(293T-BaEV-MoRV Tail(LV))并用于后续慢病毒包装。
将CD123-CAR(来源于专利ZL201810207761.2)及mbIL15的慢病毒质粒与三个慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G转导293T细胞。48h收获病毒粗提液。通过PEG-6000浓缩病毒粗提液后，通过流式检测病毒滴度。病毒可在-80℃保存，由表3可以看出，以CD123-CAR和mbIL15为目的基因也可以使用本申请的囊膜糖蛋白成功地进行慢病毒的包装。
表3、CD123-CAR及mbIL15包装滴度测试
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随后，按MOI＝3将上述慢病毒转导活化2天的pbNK细胞，转导后三天用流式细胞仪检测NK细胞阳性率，检测方法可参考实施例2，结果如图12所示，可见使用本申请的囊膜糖蛋白包装包含CD123-CAR、mbIL15等其他外源蛋白编码序列的慢病毒也均可以较高效率地感染pbNK细胞。
附：序列信息
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Claims (10)

1.一种用于假病毒包装的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，包含BaEV囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、以及MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域。
2.根据权利要求1所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的胞外区序列包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有约70％以上同一性的氨基酸序列。
3.编码根据权利要求1或2中所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽的核酸。
4.包含根据权利要求3所述的核酸的载体，优选该载体为质粒、病毒颗粒、或人造纳米颗粒。
5.包含根据权利要求1或2中所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽、和/或根据权利要求3所述的核酸、或根据权利要求4所述的载体的细胞。
6.用于假病毒包装的囊膜糖蛋白组合，其包含：
VSV囊膜糖蛋白或其编码核酸；以及
根据权利要求1或2中所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽或其编码核酸。
7.将根据权利要求1或2中所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，根据权利要求3所述的核酸，根据权利要求4所述的载体，根据权利要求5所述的细胞，或根据权利要求6所述的囊膜糖蛋白组合用于病毒包装的用途，优选所述病毒为逆转录病毒，更优选所述病毒为慢病毒。
8.一种用于转导细胞的假病毒颗粒，其包含根据权利要求1或2所述的嵌合病毒囊膜糖蛋白或多肽，根据权利要求3所述的核酸，根据权利要求4所述的载体，或根据权利要求6的囊膜糖蛋白组合。
9.根据权利要求8所述的假病毒颗粒转导的细胞。
10.根据权利要求9的细胞在制备细胞治疗药物中的用途。
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