CN117467705A - 一种高效的BaEV囊膜病毒包装方法 - Google Patents

一种高效的BaEV囊膜病毒包装方法 Download PDF

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Abstract

提供了一种高效的BaEV囊膜病毒包装方法，所述方法使用的囊膜糖蛋白，以及使用所述方法包装的假病毒颗粒，提升了假病毒的包装效率及转导效率。

Description

一种高效的BaEV囊膜病毒包装方法
技术领域
本申请涉及假病毒的包装方法，尤其涉及适宜于转导NK、T细胞等免疫细胞以及干细胞的假病毒的高效包装方法。
背景技术
近年来，以CAR-T细胞治疗为代表的肿瘤免疫治疗展现了良好的效果及巨大的潜力。不过CAR在T细胞的表达是影响CAR-T细胞疗效重要因素之一，随着CAR-T临床的进展，为了进一步优化CAR-T疗效，改善免疫微环境、提高CART持续性等方案增加进了CAR的设计中，对CAR转导T细胞的能力有了更高的要求。并且随着技术的发展有了通用型细胞治疗产品的需求，已有研究将自然杀伤细胞(Nature killer cell后文缩写为“NK”或“NK细胞”)、γδT细胞应用于通用型免疫细胞治疗，但是这一类细胞较传统的T细胞更难进行转导或采用其他方法进行修饰、编辑。除此之外，针对巨噬细胞、DC细胞等固有免疫细胞、干细胞进行基因编辑也越来越被关注，这些细胞同样存在者难于进行遗传操作的现象。
以电穿孔技术为代表的非病毒转导技术由于其较高的安全性以及便捷的工艺逐渐得到广泛认可。然而，电穿孔导致的大量细胞死亡阻碍了这一技术的进一步推广。虽然通过电穿孔递送mRNA的方法可以有效降低毒性提高细胞活率，但这种转导是瞬时的，不利于CAR-NK的药效持续性。
目前应用成熟的VSV-G(包装有VSV-G(水疱性口炎病毒囊膜糖蛋白)的假型慢病毒)不足以解决上述转导、遗传操作难题，有大量研究表明，VSV-G慢病毒转导NK细胞的效率极低(仅为5～10％)，导致这种现象的原因极有可能是因为NK细胞具有天然的抗病毒能力，同样具有天然抗病毒能力的固有免疫细胞如γδT细胞、DC细胞、巨噬细胞也有文献报道采用VSV-G慢病毒转导效率极低，我们前期的数据也证实了这一点。虽然也有文献报道一些提高VSV-G假型慢病毒转导能力的方案，但是采用的试剂较难符合临床应用要求，如文献报道使用PDK1抑制剂BX795可有效提高VSV-G假型慢病毒转导NK细胞的效率，但是BX795会对NK细胞的杀伤功能及增殖能力带来一定的影响，这显然不符合临床应用的要求。有研究表明一些逆转录病毒可高效的转导NK细胞，但逆转录病毒插入位点的安全性存在着一定风险，这一缺点限制了其在临床应用中的推广。
专利WO2013/045639A1公布了改造后的包装有狒狒内源性逆转录病毒(Baboonendogenous virus，BaEV)囊膜糖蛋白的慢病毒(BaEV慢病毒)可以高效转导T细胞及B细胞。虽然BaEV囊膜糖蛋白(BaEV-G)具有极高的应用价值，但BaEV囊膜糖蛋白难以生产出高滴度的假病毒颗粒。目前，用于慢病毒包装的BaEV囊膜糖蛋主要有两种形式：1、BaEV-Rless，即无融合抑制性R肽(Fusion restrictive R peptide)的BaEV囊膜糖蛋白形式；2、BaEV/TR，即胞尾结构域替换为MLV囊膜糖蛋白胞尾结构域的BaEV囊膜糖蛋白形式。BaEV-Rless在293T中表达会使293T形成大量的合胞体，导致细胞大量死亡，严重影响了慢病毒包装。通过293F优化BaEV-Rless慢病毒包装工艺，可在1L体系中生产最多约1E9 TU(ELISA测定p24蛋白)的BaEV-Rless慢病毒，但这种工艺产量不稳定，且滴度仍难以满足需求(Bauler,M.,etal.,Production of lentiviral vectors using suspension cells grown in serum-free media.Molecular Therapy-Methods Clinical Development,2020.17:p.58-68)。BaEV/TR形式相对于BaEV-Rless，细胞毒性大大降低，大幅度减少了病毒包装过程中合胞体的出现，但病毒滴度低于BaEV-Rless形式。因此，优化BaEV囊膜糖蛋白的结构，提高包装的病毒滴度，是BaEV囊膜糖蛋白能否应用于难转导的工程化免疫细胞、干细胞生产制备的关键。
发明概述
为提高囊膜病毒包装滴度，同时保持或进一步提升其对难于转导的免疫细胞或干细胞的转导效率，本申请提供了一种假病毒的包装方法，其中使用的囊膜糖蛋白，以及使用所述方法包装的假病毒。
具体地，本申请涉及：
1、一种包装假病毒的方法，包含：
向靶细胞中导入BaEV囊膜糖蛋白或包含BaEV囊膜糖蛋白编码核酸的载体，目的基因编码核酸及病毒包装元件；或
构建稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系，并向所述细胞系导入目的基因编码核酸及病毒包装元件。所述稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系可以是混合克隆细胞系，也可以经筛选后的单克隆细胞系。
2、根据项1所述的方法，其中所述假病毒为慢病毒或其他逆转录病毒。在一些实施方案中，所述慢病毒源自HIV。
3、根据项2所述的方法，其中所述目的基因编码核酸为慢病毒或其他逆转录病毒包装系统的转移质粒，所述病毒包装元件是慢病毒或其他逆转录病毒包装系统的包装质粒。
4、根据项1-3中任一项所述的方法，其中构建稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系是通过慢病毒转导或转座将编码BaEV囊膜糖蛋白的核酸插入靶细胞基因组实现的。
5、根据项4的方法，其中所述转座使用的转座子系统选自：PB转座子系统、SB转座子系统、ΦC31整合酶系统。
6、根据项4或5的方法，其中所述慢病毒或其他逆转录病毒转导加入了增感试剂DEAE或polybrene，或具有与所述DEAE或polybrene相同有效成分的试剂。
7、根据项1-6中任一项所述的方法，其还包含向所述靶细胞或细胞系中导入VSV囊膜糖蛋白或其编码序列，或所述稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系还稳定表达VSV囊膜糖蛋白。在一些实施方案中，所述VSV囊膜糖蛋白为野生型VSV囊膜糖蛋白或其变体。在一些实施方案中，所述VSV囊膜糖蛋白包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，或其功能衍生物，或包含与如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有70％以上序列同一性的氨基酸序列。
8、根据项1-7中任一项所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的胞尾结构域中蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点取代。
9、根据项8所述的HIV蛋白酶切割位点，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
10、根据项1-9中任一项所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白包含BaEV囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、以及MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白包含BaEV囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、胞内段近膜区以及MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白包含BaEV囊膜糖蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区、胞内段近膜区以及MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白相较于野生型BaEV-G，其区别仅在于其相对于野生型BaEV-G具有不同的胞尾结构域，且所述胞尾结构域源自MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域，即所述胞尾结构域为野生型MoRV囊膜糖蛋白或其功能衍生物。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白(BaEV-G)的信号肽、胞外区、跨膜区、胞内段近膜区，和/或MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域通过连接子连接或通过化合价(例如肽键)直接连接。
11、根据项10所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的胞外区序列包含如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的序列。
12、根据项10或11所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的跨膜区序列包含如SEQID NO：2或19所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQ ID NO：2或19所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列。
13、根据项10-12中任一项所述的方法，其中所述MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域包含如SEQ ID NO：3或20所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQ ID NO：3或20所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域中蛋白酶切割位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
14、根据项10所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的序列。
15、根据项10所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白编码核酸根据不同的靶细胞进行了密码子优化。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白编码核酸包含选自如SEQ IDNO：5、6、7、8、27中任一项的多核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO：5、6、7、8和27中任一多核苷酸序列具有70％以上同一性的多核苷酸序列。
16、根据项1-15中任一项所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白编码核酸的启动子为CAG、miniCMV、或SV40。
17、根据项1-16中任一项的方法，其中所述靶细胞是293T细胞或其衍生细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞选自293T细胞、293T/17细胞、293F细胞、HEK293细胞、293T/17SF细胞.
18、一种用于假病毒包装的嵌合BaEV囊膜糖蛋白或多肽，，其胞尾结构域为BaEV囊膜糖蛋白或非BaEV的囊膜病毒的囊膜糖蛋白胞尾结构域，并且其胞尾结构域的蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点替代。
19、根据项18中所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，所述的HIV蛋白酶切割位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
20、根据项18或19中所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其中所述假病毒为逆转录病毒。
21、根据项20所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其中所述假病毒为慢病毒，优选HIV病毒。
22、根据项18-21中任一项所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白包含或不包含R肽。
23、根据项18-22中任一项所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白包含野生型BaEV囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、以及野生型MoRV病毒囊膜糖蛋白的胞尾结构域。
24、根据项18-23中任一项所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白的胞外区序列包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列。
25、根据项18-24中任一项所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白的跨膜区序列包含如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列。
26、根据项18-25中任一项所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其中所述MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域包含如SEQ ID NO：3或20所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQ ID NO：3或20所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列。
27、根据项18-26中任一项所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白包含如SEQ ID NO：4或21所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或与SEQ ID NO：4或21所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列。
28、根据项18-23中任一项所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白的编码核酸包含如SEQ ID NO：5、6、7、8、27中任一项所示的多核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO：5、6、7、8和27中任一项所示的核苷酸序列具有70％以上同一性的多核苷酸序列。
29、根据项28中所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白编码核酸的启动子为CAG、miniCMV、或SV40。
30、根据项18-22中任一项所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其中所述非BaEV的囊膜病毒选自：FLV、KoRV、GaLV、MoRV和MLV。
31、根据项30中所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其中所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白包含野生型BaEV囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、以及野生型FLV、KoRV、GaLV、或MLV病毒囊膜糖蛋白的胞尾结构域。
32、根据项1-17中任一项所述的方法包装的假病毒。在一些实施方案中，所述假病毒的野生型病毒本身就是囊膜病毒。在一些实施方案中，所述假病毒的野生型病毒本身并非囊膜病毒。在一些实施方案中，所述假病毒为慢病毒或其他逆转录病毒。在一些实施方案中，所述假病毒为逆转录病毒或慢病毒载体。
此外，本申请还涉及：
1、一种包装假病毒的方法，包含：
向靶细胞中导入BaEV囊膜糖蛋白或包含BaEV囊膜糖蛋白编码核酸的载体，目的基因编码核酸及病毒包装元件；或
构建稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系，并向所述细胞系导入目的基因编码核酸及病毒包装元件。
2、根据项1中所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的胞尾结构域中蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点取代，优选所述的HIV蛋白酶切割位点的氨基酸序列如SEQIDNO：9所示。
3、根据项1或2中所述的方法，其中所述假病毒为逆转录病毒。
4、根据项3所述的方法，其中所述假病毒为慢病毒，优选HIV病毒。
5、根据项1-4任一项所述的方法，其中转移质粒携带所述目的基因编码核酸，包装质粒携带所述病毒包装元件。
6、根据项1-5中任一项所述的方法，其中BaEV囊膜糖蛋白编码核酸通过基因工程方法插入靶细胞基因组构建稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系。
7、根据项6的方法，其中所述基因工程方法为转座，优选所述转座使用的转座子系统选自：PB转座子系统、SB转座子系统或ΦC31整合酶系统。
8、根据项6的方法，其中所述基因工程方法为转导，优选所述转导过程中使用增感试剂DEAE或polybrene。
9、根据项1-8中任一项所述的方法，其还包含向所述靶细胞或细胞系中导入VSV囊膜糖蛋白或其编码序列，或所述稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系还稳定表达VSV囊膜糖蛋白。
10、根据项9中所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白不包含BaEV囊膜糖蛋白的R肽。
11、根据项1-10任一项所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白包含BaEV囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、以及MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域。
12、根据项1-11中任一项所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的胞外区序列包含如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列。
13、根据项1-12任一项所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的跨膜区序列包含如SEQIDNO：2或SEQIDNO：19所示的序列或其功能衍生物，或包含与SEQIDNO：2或SEQIDNO：19所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列。
14、根据项1-13任一项所述的方法，其中所述MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域包含如SEQIDNO：3或20所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQIDNO：3或20所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列。
15、根据项1-11任一项所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白包含如SEQIDNO：4或21所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或与SEQIDNO：4或21所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列。
16、根据项1-15中任一项所述的方法，其中所述VSV囊膜糖蛋白包含如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列或其功能衍生物，或包含与SEQIDNO：18所示的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列。
17、根据项1-16任一项所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的编码核酸包含选自如SEQIDNO：5、6、7、8、27中任一项所示的多核苷酸序列，或包含与SEQIDNO：5、6、7、8和27中任一项所示的核苷酸序列具有70％以上同一性的多核苷酸序列。
18、根据项1-17中任一项所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白编码核酸的启动子为CAG、miniCMV、或SV40。
19、根据项1-18中任一项的方法，其中所述靶细胞是293T细胞或其衍生细胞。
20、一种用于假病毒包装的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其胞尾结构域中的蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点替代。
21、根据项20的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其胞尾结构域不包含R肽。
22、根据项20或21所述的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其胞尾结构域为MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域。
23、由根据项1-22中任一项所述的方法包装的假病毒。
24、根据项23的假病毒用于将外源基因导入细胞中的用途。
25、根据项24的用途，其中所述外源基因为免疫嵌合受体基因。
26、根据项23或24的用途，其中所述细胞为免疫细胞，优选T细胞、NK细胞或树突细胞。
附图说明
图1.野生型BaEV囊膜糖蛋白结构示意图。
图2.替换了胞尾的BaEV嵌合囊膜糖蛋白结构示意图。
图3.使用SERV-Rless囊膜糖蛋白进行慢病毒包装后感染293T的阳性标志物(GFP或CD19-CAR)流式检测结果。
图4.使用不同囊膜糖蛋白包装形成的囊膜慢病毒滴度检测结果。
图5.用HERV-wt或HERV-Rless包装的慢病毒按照MOI＝5转导pbNK后使用流式细胞仪检测的转导效率。
图6.用包装有BaEVRless、BaEVTR、BaEV-MoRV tail、BaEV-FLV tail、BaEV-KLVtail、BaEV-GaVL tail囊膜糖蛋白的慢病毒按照MOI＝1转导pbNK，转导后3天进行检测，其转导效率的流式检测结果(以GFP阳性率表示)。
图7用包装有BaEV-MoRV tail、BaEV-GaVL tail囊膜糖蛋白和BaEV-HIV蛋白酶切割位点的慢病毒按照MOI＝3或者MOI＝5转导pbNK，转导后3天进行检测，其转导效率的流式检测结果(以CAR-NK阳性率表示)。
图8.不同囊膜糖蛋白包装的囊膜慢病毒与对比文献中的优选方案(BaEVRless和BaEVTR)的滴度比较。
图9.显示将BaEV-MoRV tail囊膜糖蛋白编码核酸通过转座进入293T细胞基因组，并成功构建稳定表达BaEV-MoRV tail囊膜糖蛋白的293T细胞。
图10.BaEV-MoRV-tail::VSV-G嵌合慢病毒和BaEV-MoRV-tail嵌合慢病毒对pbNK细胞的转导效率的流式细胞仪测试结果。
图11.替换蛋白酶切割位点的囊膜慢病毒与未替换蛋白酶切割位点的囊膜慢病毒转导效率比较。
图12.显示将使用293T-BaEV-MoRV Tail(LV)细胞系包装的包含CD123-CAR或mbIL15的慢病毒按MOI＝3转导活化2天的pbNK细胞，转导后三天用流式细胞仪检测的NK细胞转导效率。
图13.对于免疫细胞等难转染细胞，不同包装方式产生的囊膜慢病毒对CAR的递送及转导效率测试结果。
图14.通过转座构建的表达BaEV-G的阳性单克隆扩大培养后通过流式细胞仪检测的不同克隆BaEV的表达丰度及丰度水平划分。
图15.通过不同方式构建囊膜慢病毒的包装效率比较。PB表示转座方式，LV表示慢病毒转导方式。
图16.293T-BaEV-Rless(PB)，即使用由PB转座子转座构建的细胞系包装的慢病毒(左)及293T-BaEV-Rless(LV)，即使用由慢病毒转导构建的细胞系包装的慢病毒(右)转导pbNK细胞的效率。
图17.对多种不同目的基因进行慢病毒包装后的滴度检测结果。
图18.使用293T-BaEV-Rless细胞系包装不同目的基因形成的慢病毒对pbNK的转导效率。
图19.BaEV-Rless:VSV-G嵌合囊膜慢病毒和VSV-G囊膜慢病毒转导γδT细胞效率对比。
图20.使用293T-BaEV-Rless包装的BaEV-Rless囊膜病毒转导小鼠B细胞的效率。
图21.BaEV-Rless与BaEV-Rless::VSV-G嵌合慢病转导pbNK效果对比申请详述
本申请提供一种高效包装假病毒的方法、其中使用的囊膜糖蛋白、以及使用所述方法包装的假病毒。所述方法节约了假病毒包装的步骤、提高了包装效率。为难于转导的细胞，例如免疫细胞、干细胞、原代细胞等提供了可用的病毒载体。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有本申请所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般定义：Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nded.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al(编),Springer Verlag(1991)；以及Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有赋予它们的含义。
如本文所用，术语“转导”是指天然或人工改造的病毒颗粒进入细胞并将其中包含的遗传物质带入所述细胞的过程。
如本文所用，术语“野生型”具有本领域技术人员通常理解的含义，意指大自然中存在的典型形式的生物体、菌株、基因或特征，其未经人工的刻意修饰。除非另有说明，本申请所述的“囊膜糖蛋白”包含“野生型”囊膜糖蛋白和工程化的囊膜糖蛋白，例如嵌合囊膜糖蛋白或野生型囊膜糖蛋白去掉了部分结构域或增添了部分源自其他囊膜糖蛋白的结构域后形成的囊膜糖蛋白。但当提及某个特定病毒的“囊膜糖蛋白”的某个部分时，则指该特定囊膜糖蛋白的“野生型”的该部分。例如MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域，则指野生型MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域。“野生型”蛋白包括本申请提及的任何参比蛋白及其天然存在的变体。本申请中，凡提及某种特定病毒的囊膜糖蛋白的某个部分或其某个氨基酸位点，均指其相对于野生型蛋白的相应部分或相应氨基酸位点。为方便描述，本申请以野生型蛋白中的一种作为参比蛋白。对于本申请列举的具体参比蛋白，其具体序列，及序列各功能区段的划分是本领域技术人员可以通过已知数据库获取的。在本申请中，人内源性病毒囊膜糖蛋白(HERV-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号AAM68163.1所示，考拉逆转录病毒囊膜糖蛋白(KLV-G)如NCBI GeneBank编号ALX81658.1所示，长臂猿白血病病毒囊膜糖蛋白(GaLV-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号AAC96085.1所示，鼠内源性逆转病毒囊膜糖蛋白(MoRV-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号AAC42271.1所示，猫白血病病毒囊膜糖蛋白(FLV-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号ACB05740.1所示，猫内源性病毒囊膜糖蛋白(RD114-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号CAA61093.1所示，猿猴内源性逆转录病毒囊膜糖蛋白(SERV-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号AEJ22866.1所示，鼠白血病病毒囊膜糖蛋白(MLV-G)的参比蛋白如NCBI GeneBank编号AAP13891.1所示。在本申请中，如非另有说明，则当提及例如MoRV-G的胞尾结构域，则是指所述MoRV-G对应于NCBI GeneBank编号AAC42271.1胞尾结构域的部分。本领域技术人员可以理解，除本申请举例的具体参比蛋白外的其他天然存在的野生型变体蛋白也在本申请保护范围内，而且其相应结构域和氨基酸位置也是本领域技术可以确定的。
如本文所用，“载体”是指通过其可以将多核苷酸序列(例如目的基因序列)引入宿主细胞中，以转化宿主并促进引入序列的表达(例如转录和翻译)的载体。载体包括质粒、噬菌体、病毒、人造纳米颗粒等。
如本文所用，术语“人造纳米颗粒”指具有小于1000nm的直径的人工合成或经人工改造后形成的颗粒，其适于将本申请的核酸和/或蛋白递送至把细胞中。示例性的人造纳米颗粒包括但不限于：脂质纳米颗粒、外泌体等。其中所述“脂质纳米颗粒”通常是球形囊泡结构，其由围绕内部水性隔室的单层或多层脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。所述直至纳米颗粒可由若干种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成脂质纳米颗粒。尽管当脂质膜与水性溶液混合时，脂质纳米颗粒形成是自发的，但是也可通过使用匀化器、超声波破碎仪或挤出装置以摇动的形式施加力来加速脂质纳米颗粒的形成。可将若干种其他添加剂添加到脂质纳米颗粒中以便改变它们的结构和特性。例如，可将胆固醇或鞘磷脂添加到脂质纳米颗粒混合物中，以便帮助稳定脂质纳米颗粒结构并防止脂质纳米颗粒内容物(inner cargo)的泄漏。脂质纳米颗粒制剂可主要由以下组成：天然磷脂和脂质，诸如
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱和单唾液酸神经节苷脂。可作为固体纳米颗粒(例如金属，诸如银、金、铁、钛)、非金属、基于脂质的固体、聚合物)、纳米颗粒的悬浮液或其组合提供。
如本申请所用，“目的基因”是指包含于载体，例如病毒载体中，意在通过将所述载体导入靶细胞而在靶细胞中启动表达的基因或其编码序列。
如非特别说明，本申请中的“慢病毒载体”及“慢病毒颗粒”可互换使用，均指包装有目的基因序列的假型慢病毒颗粒。慢病毒载体的构建方法是本领域已知的，且具体描述于Naldini等人(2000)Adv.Virus.Res.55:599 609和Negre等人(2002)Biochimie84:1161-1171等文献中。通常，根据本发明的慢病毒载体颗粒至少包含以下组分：(i)包膜组分(在本申请中“包膜”与“囊膜”可互换使用)，其由与包膜蛋白结合的磷脂双分子层构成，其中所述包膜蛋白至少包含上述定义的嵌合或修饰的糖蛋白，所述包膜环绕(ii)由gag蛋白结合构成的核心组分，所述核心本身环绕(iii)通常由核糖核酸(RNA)构成的基因组组分和(iv)酶组分(pol)。所述生物材料可以存在于包膜内、核心内和/或基因组组分内。慢病毒载体可以容易地由本领域技术人员，例如，通过遵循由Sandrin等人(2002)Biood100:823 832提供的通用指导来制备。简而言之，慢病毒载体颗粒可通过在生产细胞(例如293T人胚胎肾细胞或其衍生细胞)中共表达包装元件(即核心和酶组分)、基因组组分和包膜组分来生成。通常可以采用3至4种质粒，但所述质粒的数目也可以根据慢病毒组分被分解成单独元件的程度而更多。在一些实施方案中，所述部分组分，例如包膜组分、酶组分等可插入生产细胞基因组中，并利用所述生产细胞进行病毒载体的包装。在一些实施方案中，所述包装元件和囊膜组分可以存在于质粒中，其中包含病毒基因组组分的质粒、包含所述囊膜组分的质粒、以及包含酶组分和/或核心组分蛋白质编码序列的组分分别称为转移质粒、包装质粒和包膜质粒。常用的慢病毒包装质粒包括psPAX2，以及pMDlg/pRRE和pRSV-Rev，其分别作为第二代和第三代慢病毒包装系统的组分。其中psPAX2质粒上还有gag、pol、rev及tat的编码序列，pMDlg/pRRE质粒包含gag和pol的编码序列，pRSV-Rev包含rev的编码序列。
在本申请中，“假病毒”和“假病毒颗粒”可互换使用，是指包含外来病毒包膜糖蛋白的病毒载体。例如，根据本申请的病毒载体可以使用下文定义的嵌合囊膜糖蛋白或所述囊膜糖蛋白的变体假型化。“假病毒”包含“假型慢病毒”及其他假型逆转录病毒。其中“慢病毒”是“假型慢病毒”、野生型慢病毒及其他工程化慢病毒的统称。“逆转录病毒”是“假型逆转录病毒”、野生型逆转录病毒及其他工程化逆转录病毒的统称。本领域技术人员应当知晓，慢病毒是一种逆转录病毒。
在本申请中，“病毒载体”是“病毒颗粒”的一种。“病毒载体”强调该病毒颗粒是工程化的病毒，其中包含人工引入或改造的蛋白或核酸片段。
如本文所用，“狒狒内源性逆转录病毒”或“BaEV”是以多个前病毒拷贝存在于狒狒DNA中的C型逆转录病毒。术语“BaEV囊膜糖蛋白”(BaEV-G)在本领域中也被称为“BaEV包膜糖蛋白”。BaEV囊膜糖蛋白具体描述于Benveniste等人(1974)Nature248:17-20和Todaro等人(1974)Cell 2:55-61等文献中。本申请所述的BaEV囊膜糖蛋白包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：13所示的序列具有至少70％、80％、85％、90％、或95％同一性的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列保持SEQ ID NO：13所决定的蛋白或多肽的基本功能，其相对于SEQ ID NO：13的差异不导致所述糖蛋白吸附宿主细胞的细胞膜、与宿主细胞膜融合、以及协助将基因组核酸或目的基因编码核酸注入宿主细胞的能力丧失。在本申请中，当提及某嵌合囊膜糖蛋白时，其以其胞外区所源自的囊膜糖蛋白命名。例如，BaEV嵌合囊膜糖蛋白，则是BaEV囊膜糖蛋白中除胞外区以外的某些部分被替换为其他病毒囊膜糖蛋白的结构域的嵌合蛋白形式。例如“BaEV/TR”包含或由BaEV包膜糖蛋白的跨膜和胞外区与MLV(鼠白血病病毒)包膜糖蛋白的胞尾结构域的融合体组成的嵌合囊膜糖蛋白。“BaEVRLess”则指胞尾结构域缺乏融合抑制性R肽的修饰的BaEV囊膜糖蛋白。所述“BaEVRLess”和“BaEV/TR”的具体形式详细描述于中国专利CN104080917B中。。
在本申请中，术语“融合抑制性R肽”或“R肽”是指囊膜糖蛋白的胞尾结构域的C末端部分，其携带酪氨酸内吞信号-YXXL，并在病毒颗粒成熟过程中被病毒蛋白酶裂解，从而增强囊膜糖蛋白的膜融合能力。BaEV囊膜糖蛋白的融合抑制性R肽通常位于野生型BaEV囊膜糖蛋白氨基酸序列的547和564之间。
囊膜糖蛋白从氨基端到羧基端通常可依次包含胞外区、跨膜区和胞尾结构域(Cytoplasmic tail domain，在本申请中有时以“tail”表示)。在囊膜病毒中，跨膜区穿过病毒囊膜分别于位于病毒囊膜外侧的胞外区以及位于病毒囊膜内侧的胞尾结构域相连。在本申请中，“胞外区”是对应于参比BaEV囊膜糖蛋白(NCBI序列登记号：YP_009109691.1)氨基酸1-503位(包括端点)的部分，“跨膜区”是对应于所述参比BaEV囊膜糖蛋白氨基酸504至532位(包括端点)或者氨基酸504至524位(包括端点)的部分，胞内结构域是对应于所述参比BaEV囊膜糖蛋白氨基酸534至563位(包括端点)的部分。
如本文所用，某种蛋白的“功能衍生物”包括所述蛋白的各种变体或功能结构域，只要所述变体或功能结构域保留了所述蛋白的某个功能结构域的功能(无论是增强的所述功能或减弱的所述功能)，即可称为所述蛋白的功能衍生物。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一组工程化多肽或蛋白，当其在免疫效应细胞中时，与靶细胞上包含的特定抗原结合，并在识别所述特定抗原后产生细胞内信号，激活所述受体所在细胞的下游通路，以启动所述免疫效应细胞对所述靶细胞的杀伤作用。所述免疫效应细胞包括但不限于NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞等。CAR通常包括至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域。所述细胞外抗原结合结构域可特异性识别抗原，非限制性实例包括衍生自抗体的单链可变片段(scFv)、选自文库的片段抗原结合区(Fab)、单结构域片段或与接合其同源受体的自然配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合区域可以包含scFv、Fab或天然配体，以及它们的任何衍生物。细胞外抗原结合区可以指除完整抗体之外的分子，其可以包含完整抗体的一部分并且可以与完整抗体所结合的抗原结合。抗体片段的实例可以包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双功能抗体、线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。所述“信号转导结构域”通常包含免疫受体的酪氨酸活化基序(immune-receptortyrosine-based activation motifs，ITAM)，其基本组成是：YXXL/V。其中Y为酪氨酸，L/V指亮氨酸或缬氨酸，X可为任意氨基酸。当受体与相应配体结合后，与其连接的ITMA中的酪氨酸在与细胞膜相连的一类蛋白酪氨酸激酶PTK的作用下，可被磷酸化，从而招募胞内游离的其他蛋白激酶或衔接蛋白，向细胞内传导活化信号。在一些实施方案中，所述“信号转导结构域”选用TCRζ(CD3ζ)或FcεRIγ的胞内信号转导结构域。如本文所用，所述“共刺激结构域”又称为“共刺激信号域”，主要用于提供共刺激信号来增强免疫细胞的能力，包括例如增强记忆细胞的增殖、存活和/或发育。在一些实施方案中，所述“共刺激结构域”选自CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)等。如本文所用，所述“跨膜结构域”又称“跨膜区”，是指锚定在细胞膜内具有热力学稳定的蛋白质结构区域。跨膜结构域可以从天然蛋白质中获得，例如来源于T细胞受体(TCR)的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域选自CD4，CD8α，CD28和CD3ζ的跨膜结构域。
如本文所用，术语“连接子”是一条短肽，用于连接蛋白或多肽中多个结构域或部件。例如本申请中的BaEV-MoRV-tail囊膜糖蛋白，其包含的BaEV囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、及胞尾结构域可通过连接子或具有一定功能的其他氨基酸链相连，也可以直接相连。所述“直接相连”则是指所述结构域或部件之间不包含任何其他氨基酸残基。
在本申请中，“293T细胞”即HEK 293T细胞，是一种来源于人类胚胎肾脏的永生化细胞系。HEK 293T细胞是由HEK 293细胞通过基因技术派生出的细胞系，其由HEK 293细胞经过腺病毒E1A基因的转染，能稳定表达SV40大T抗原，并含有SV40复制起始点与启动子区。而HEK 293细胞及其他所有HEK293细胞的衍生细胞，在本申请中均被归为“293T细胞的衍生细胞”，其包括但不限于293F细胞及293T/17SF细胞。
如本文所用，术语“蛋白酶切割位点”是指逆转录病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域包含的供其表达的蛋白酶识别以便于切割的一段氨基酸序列。当蛋白酶识别所述“蛋白酶切割位点”并完成所述切割后，所述病毒囊膜糖蛋白的胞尾结构域将失去R肽。本申请中使用的各种囊膜糖蛋白包含的蛋白酶切割位点是本领域已知的，例如BaEV囊膜糖蛋白包含如SEQID NO：14所示的氨基酸序列。HIV蛋白酶切割位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。在本文中，凡提及某种特定囊膜糖蛋白的蛋白酶切割位点则指所述特定囊膜糖蛋白的野生型蛋白胞尾结构域中包含的蛋白酶切割位点。
包装方法
本申请一方面提供了一种具有提高了的包装效率的假病毒的包装方法，所述假病毒对于难转导的靶细胞，尤其是免疫细胞，具有较高的转导效率。如本文所用，术语“靶细胞”是指向其中导入外源核酸或蛋白，以进行蛋白表达或病毒包装的细胞。
所述假病毒的包装方法包含：向靶细胞中导入前述BaEV囊膜糖蛋白或包含前述BaEV囊膜糖蛋白编码核酸的载体，目的基因编码核酸及病毒包装元件；或构建稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系，并向所述细胞系导入目的基因编码核酸及病毒包装元件。其中所述载体可选自：质粒、噬菌体、病毒、人造纳米颗粒等。在一些实施方案中，所述载体除包含BaEV囊膜糖蛋白编码核酸以外，还进一步包含可启动BaEV囊膜糖蛋白表达的启动子。本申请中，“病毒包装元件”指病毒包装所需要的调节元件、(囊膜糖蛋白以外的)结构蛋白及相关酶，或编码所述调节元件、结构蛋白及相关酶的核酸。对于特定的病毒，其包装元件记载于本领域相关公开的学术文件中，本领域技术人员可查阅获取。在一些实施方案中是，所述假病毒是慢病毒或其他逆转录病毒，因此，所述BaEV囊膜糖蛋白或包含BaEV囊膜糖蛋白编码核酸的载体、目的基因编码核酸及病毒包装元件，或稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系、目的基因编码核酸及病毒包装元件组成慢病毒或其他逆转录病毒包装系统。所述慢病毒或其他逆转录病毒包装系统，可选自第一代、第二代、及第三代慢病毒包装系统。在一些实施方案中，所述目的基因编码核酸是慢病毒或其他逆转录病毒包装系统的转移质粒，其包含所述慢病毒或其他逆转录病毒的LTRs和psi包装信号。在一些实施方案中，所述目的基因编码核酸也可以指任何包含所述目的基因编码核酸以及慢病毒或其他逆转录病毒的LTRs和psi包装信号的核酸或载体，例如其可以为线状核酸、病毒载体、人造纳米颗粒等。在一些实施方案中，所述假病毒为慢病毒或其他逆转录病毒，其包装元件包含Gag，Pol，Rev与Tat基因的编码序列。在一些实施方案中，所述假病毒为慢病毒或其他逆转录病毒，所述包装元件仅包含Gag，Pol和Rev基因的编码序列，且所述目的基因编码核酸中还包含专门的启动子。在一些实施方案中，所述假病毒为慢病毒，所述“病毒包装元件”选自psPAX2质粒，或pMDlg/pRRE和pRSV-Rev质粒的组合。其中，psPAX2、pMDlg/pRRE和pRSV-Rev均为本领域常见质粒，其中必要的功能元件是本领域已知的。具体地，psPAX2质粒包含gag、pol、rev及tat的编码序列，pMDlg/pRRE质粒包含gag和pol的编码序列，pRSV-Rev包含rev的编码序列。本申请所述方法适用于多种目的基因，包括但不限于嵌合抗原受体(例如靶向CD19、CD123的CAR)以及各种细胞因子的基因。
在一些实施方案中，所述假病毒为慢病毒或其他逆转录病毒，且所述慢病毒或其他逆转录病毒选自：劳斯肉瘤病毒、劳斯相关病毒、鸡肉瘤病毒、禽白血病病毒(ALV)、鼠肉瘤病毒(MSV)、鼠白血病毒(MLV)、鼠内源性病毒、猪肉瘤病毒、牛白血病病毒、猪白血病病毒、鼠乳腺瘤病毒、灵长类肉瘤病毒、猴白血病病毒、狒狒C型肿瘤病毒、梅森辉瑞猴病毒(MPMV)、人嗜T细胞病毒I型、II型、V型(HTLV-I、II、V)、HIV(人类免疫缺陷病毒)、绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒、绵羊肺腺瘤病毒、马传染性贫血病毒(EIAV)、灵长类泡沫病毒、猫泡沫病毒、牛泡沫病毒、人泡沫病毒等。在一些实施方案中，所述慢病毒或其他逆转录病毒源自HIV。
如本文所用，术语“核酸”可以指任何形式的核酸，包括但不限于线状核酸、环状核酸(例如质粒)、基因组核酸、经人工修饰的核酸、DNA、RNA或由DNA和RNA组成的核酸。在一些实施方案中，本申请中所述目的基因编码核酸为慢病毒或其他逆转录病毒包装系统的转移质粒。
任何构建稳定表达外源蛋白的细胞系的方法均可用于构建所述稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系，例如利用单纯的同源重组。在一些实施方案中，构建稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系是通过慢病毒转导或转座将编码BaEV囊膜糖蛋白的核酸插入靶细胞基因组实现的。在一些实施方案中，所述慢病毒可以是使用本申请提供的方法包装的慢病毒也可以是使用传统方法包装的慢病毒。在一些实施方案中，所述转座可使用任何常见的转座子系统进行，例如所述转座子系统选自：PB转座子系统、SB转座子系统、ΦC31整合酶系统。在一些实施方案中，所述构建稳定表达外源蛋白的细胞系的方法是基因编辑的方法，例如CRISPR基因编辑方法、ZFN基因编辑方法、TALEN基因编辑方法、Mega核酸酶基因编辑方法等。
在一些实施方案中，所述构建稳定表达外源蛋白的细胞系的方法为慢病毒转导的方法，其包含使包含所述BaEV囊膜糖蛋白编码核酸的慢病毒与靶细胞接触时，或与包细胞接触前或后，加入增感试剂(或助转试剂)DEAE或polybrene，或具有与所述DEAE或polybrene相同有效成分的试剂。DEAE和polybrene试剂的有效成分是本领域已知的，并且各厂家提供的所述试剂的有效成分没有差异，且来源于不同厂家的所述试剂不会造成病毒转导效率的明显差距。DEAE的有效成分可参考生工生物工程(上海)股份有限公司官网的产品信息。Polybrene的有效成分可参考Santa Cruz Animal Health公司官网相应产品的信息。
在一些实施方案中，所述假病毒的包装方法还包含向所述靶细胞或细胞系中导入VSV囊膜糖蛋白或其编码序列，或使所述稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系同时还稳定表达VSV囊膜糖蛋白。在一些实施方案中，所述VSV囊膜糖蛋白为野生型VSV囊膜糖蛋白或其变体。在一些实施方案中，所述VSV囊膜糖蛋白具有SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列，或其功能衍生物，或与如SEQ ID NO：18中的序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VSV囊膜糖蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
在一些实施方案中，本方法中所使用的BaEV囊膜糖蛋白是一种嵌合囊膜糖蛋白，其囊膜糖蛋白的胞尾结构域中的蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点所取代。在一些实施方案中，所述的HIV蛋白酶切割位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。需要说明的是，前述BaEV囊膜糖蛋白可以是野生型BaEV囊膜糖蛋白，也可以是经过改造的BaEV囊膜糖蛋白。所述经过改造的BaEV囊膜糖蛋白包括其胞尾结构域替换为非BaEV囊膜囊膜糖蛋白的胞尾结构域的嵌合蛋白。所述“非BaEV囊膜糖蛋白”可指代除野生型BaEV囊膜糖蛋白以外的任何其他囊膜糖蛋白，包括但不限于：FLV、KoRV、GaLV、MoRV和MLV。
在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白包含BaEV囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、以及MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白包含BaEV囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、胞内段近膜区以及MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白包含BaEV囊膜糖蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区、胞内段近膜区以及MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白相较于野生型BaEV-G，其区别仅在于其相对于野生型BaEV-G具有不同的胞尾结构域，且所述胞尾结构域源自MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域，即所述胞尾结构域为野生型MoRV囊膜糖蛋白或其功能衍生物。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白(BaEV-G)的信号肽、胞外区、跨膜区、包内段近膜区，和/或MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域通过连接子连接或直接连接。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白是BaEV-MoRV-tail，即将胞尾结构域替换为MoRV囊膜糖蛋白胞尾结构域的BaEV囊膜糖蛋白。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白是BaEVRless，即去掉胞尾结构域中的R肽的BaEV囊膜糖蛋白。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白是BaEV/TR，即将胞尾结构域替换为MLV囊膜糖蛋白胞尾结构域的BaEV囊膜糖蛋白。
在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白的胞外区序列包含如SEQ ID NO：1中所示的序列或其功能衍生物，或与其具有70％以上同一性的序列。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白的胞外区序列如SEQ ID NO：1所示。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白的跨膜区序列包含如SEQ ID NO：2或19中所示的序列或其功能衍生物，或与其具有70％以上同一性的序列。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白的跨膜区序列如SEQ ID NO：2或19所示。在一些实施方案中，所述MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域包含如SEQ ID NO：3或20所示的序列或其功能衍生物，或与其具有70％以上同一性的序列。在一些实施方案中，所述MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域序列如SEQ ID NO：3或20所示。在一些实施方案中，所述MoRV病毒囊膜糖蛋白包含如SEQ ID NO：1-3所示，或如SEQ ID NO：1、3、19，或如SEQ ID NO：1、2、20，或如SEQ ID NO：1、19、20所示的序列或其功能衍生物，或与其具有70％以上同一性的序列。在一些实施方案中，所述MoRV病毒囊膜糖蛋白序列由SEQ ID NO：1-3，或由SEQ IDNO：1、3、19，或由SEQ ID NO：1、2、20，或由SEQ ID NO：1、19、20的序列，或由SEQ ID NO：1、3、19的序列顺次连接而成。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白中下述结构域由N端到C端的排列顺序依次为：BaEV-G胞外区、BaEV-G胞外区跨膜区、及MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、及MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域直接相连或通过连接子连接。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白包含如SEQ ID NO：4所示的序列或其功能衍生物，或与其具有70％以上同一性的序列。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白序列如SEQ ID NO：4所示。在一些实施方案中，所述MoRV病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域中如SEQ ID NO：14所示的蛋白酶切割位点被替换为HIV蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，所述MoRV病毒囊膜糖蛋白包含如SEQ ID NO：21所示的序列或其功能衍生物，或与其具有70％以上同一性的序列。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白序列如SEQ ID NO：21所示。
在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白编码核酸根据不同的靶细胞进行了密码子优化。在一些实施方案中，所述BaEV囊膜糖蛋白编码核酸包含选自如SEQ ID NO：5、6、7、8、27中任一项的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5、6、7、8和27中任一核苷酸序列具有70％以上同一性的核苷酸序列。用于启动BaEV囊膜糖蛋白表达的启动子可以是任何适用于靶细胞的启动子，优选的为利于在靶细胞中表达的启动子。针对特定的靶细胞，其优选的启动子是本领域已知的。例如在一些实施方案中，所述靶细胞为293T细胞或其衍生细胞，则所述BaEV囊膜糖蛋白编码核酸的启动子为CAG、miniCMV、或SV40。本领域技术人员应当知晓，293T细胞或其衍生细胞包括但不限于：293T细胞、293T/17细胞、293F细胞、HEK293细胞、293T/17SF细胞.
具体的示例性的实施方案包括：
(1)选择转基因系统
将不同结构的BaEV整合到用于病毒包装的细胞系基因组的方法包括但不限于慢病毒系统、PB转座子系统、SB转座子系统、ΦC31整合酶系统等,具体采用了慢病毒系统和PB转座子系统。
(2)载体构建
将不同结构的BaEV(包括BaEV-Rless，BaEV-MoRV，BaEV-HIV cleavage site(即将BaEV蛋白酶切割位点替换为HIV蛋白酶切割位点的BaEV-G))编码序列插入慢病毒系统载体或非病毒系统载体中。驱动BaEV表达的启动子可以是不同强度的启动子，包括CAG、miniCMV、SV40等。在PB转座子系统的质粒结构中，可在ORF 3’末端加入WPRE或bGH poly A，以提高转录本的稳定性。在质粒中也加入包括但不限于嘌呤霉素、新霉素等抗性基因，以方便后续细胞系的筛选。
(3)细胞的转导
慢病毒系统可在增感试剂包括DEAE、polybrene等的作用下将BaEV-MoRV编码序列插入到293T基因组中。对于非病毒系统，需要通过包括但不限于电穿孔、脂质体转染、钙转、PEI等方法将转座子及转座酶的质粒导入293T中，在转座酶的作用下将不同形式的BaEV编码序列插入到293T基因组中。
完成转导后的293T可以通过筛选细胞系的方法包括但不限于流式细胞仪分选、药物筛选等。在此基础上，为了进一步优化病毒包装的效率，可通过流式分选、有限稀释等方法将上述细胞单克隆化。经鉴定，293T-BaEV细胞系的不同克隆的BaEV表达丰度有所差异，且中等表达丰度的克隆在病毒包装效率上更具优势。
(4)病毒包装
将转移质粒(例如编码嵌合抗原受体的质粒)、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev按一定比例转染上述293T-BaEV细胞系后进行病毒包装，转染48小时后收获培养及上清，经PEG6000浓缩后病毒流式滴度可达1e8 TU/ml以上。可在此基础上，在包装过程中加入VSV-G编码质粒，可进一步提高慢病毒滴度，提升幅度可达5-8倍。
(5)病毒转导效果检测
将上述慢病毒慢按MOI＝1-5，转导活化后的PBMC来源的NK(PBNK)。在添加病毒前可加入polybrene、DEAE等阳离子聚合物，提高转导效率。转导后3天，通过流式进行阳性率检测，结果显示阳性率可达50-80％。
嵌合囊膜糖蛋白或多肽
第三方面，本申请一种用于假病毒包装的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，并且其胞尾结构域的蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点替代。在一些实施方案中是，所述HIV蛋白酶切割位点的序列如SEQ ID NO：9所示。
在一些实施方案中，所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽的胞尾结构域不是野生型BaEV囊膜糖蛋白的胞尾结构域，而是被替换为非BaEV的囊膜病毒的囊膜糖蛋白胞尾结构域，并且其包含R肽。在一些实施方案中，所述其BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽的胞尾结构域不是野生型BaEV囊膜糖蛋白的胞尾结构域，而是被替换为非BaEV的囊膜病毒的囊膜糖蛋白胞尾结构域，并且其不包含R肽。在一些实施方案中，所述非BaEV的囊膜病毒选自：FLV、KoRV、GaLV、MoRV和MLV。在一些实施方案中，所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽的胞尾结构域是野生型BaEV囊膜糖蛋白的胞尾结构域，并且其不包含R肽。在一些实施方案中，所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽的胞尾结构域被替换为MLV囊膜糖蛋白的胞尾结构域。在一些实施方案中，所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽的胞尾结构域被替换为MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域。在一些实施方案中，所述BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽的胞尾结构域被替换为MoRV囊膜糖蛋白的胞尾结构域，且其中包含的如SEQ ID NO：14所示的序列被替换为如SEQ ID NO：9所示的序列。在一些实施方案中，所述用于假病毒包装的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽选自：BaEV-MoRV-tail、BaEVRless、BaEV/TR、BaEV-FLV-tail、BaEV-KoRV-tail、BaEV-GaLV-tail。
假病毒
第三方面，本申请还提供了使用前述包装方法包装的假病毒，所述假病毒囊膜中包含前述嵌合囊膜糖蛋白或多肽，和/或VSV囊膜糖蛋白。在一些实施方案中，所述假病毒的野生型病毒本身就是囊膜病毒。在一些实施方案中，所述假病毒的野生型病毒本身并非囊膜病毒。在一些实施方案中，所述假病毒为慢病毒或其他逆转录病毒。在一些实施方案中，所述假病毒为逆转录病毒或慢病毒载体。
本申请提供的方案的有益效果在于：
1、使BaEV-Rless等BaEV囊膜糖蛋白包装的病毒的细胞毒性得到有效的控制，避免靶细胞的大量死亡，从而提升了病毒的包装效率和产量；
2、有效提高了包装细胞系的安全性，降低了慢病毒自主复制的风险。
应当理解，本申请包含本文所描述的各种方面、实施方案以及所述方面和/或实施方案的组合。以上描述以及随后的实施例旨在说明而不是限制本申请的范围。在本申请范围内的其他方面、改进和修改对于本申请所属领域的技术人员将是显而易见的。因此，本领域的普通技术人员应该认识到，本申请的范围还包括对所述方面和实施方案的所述改进和修改。
下面结合附图对本申请的示例性实施例进行描述，其中包括了本申请实施例的各种细节以助于理解，应当认为其仅仅是示例性的。因此，本领域的普通技术人员应该认识到，可以对这里描述的实施例进行各种改变和修改而不背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简洁，以下描述中省略了对众所周知的特征和结构的描述。
实施例
实施例1：BaEV结构优化及筛选
在NCBI数据库中检索库检索并收集type-C或D的内源性逆转录病毒，其中包括(AAM68163.1(人内源性病毒囊膜糖蛋白，HERV-G)、ALX81658.1(考拉逆转录病毒囊膜糖蛋白，KLV-G)、AAC96085.1(长臂猿白血病病毒囊膜糖蛋白，GaLV-G)、AAC42271.1(鼠内源性逆转病毒囊膜糖蛋白，MoRV-G)、ACB05740.1(猫白血病病毒囊膜糖蛋白，FLV-G)、CAA61093.1(猫内源性病毒囊膜糖蛋白，RD114-G)、AEJ22866.1(猿猴内源性逆转录病毒囊膜糖蛋白，SERV-G)、AAP13891.1(鼠白血病病毒囊膜糖蛋白，MLV-G))。
将BaEV囊膜糖蛋白(BaEV-G)的胞尾结构域及R肽用FLV-G、KLV-G、GaLV-G、或MoRV-G胞尾结构域及R肽替换后(如图2所示)分别称为：BaEV-FLV tail、BaEV-KLV tail、BaEV-GaVL tail、BaEV-MoRV tail。将SERV-Rless(去除R肽的SERV-G)、HERV-wt(野生型HERV-G)、HERV-Rless(去除R肽的HERV-G)、BaEV-FLV tail、BaEV-KLV tail、BaEV-GaVL tail、BaEV-MoRV tail编码序列通过密码子优化、序列合成、双酶切、连接、测序验证等一系列流程连接至pMD2.G的载体质粒骨架(Addgene，货号#12259)中，分别形成下述载体质粒SERV-Rless-pcDNA3.1、HERV-wt-pcDNA 3.1、HERV-Rless-pcDNA 3.1、BaEV-FLV tail-pcDNA3.1、BaEV-KLV tail-pcDNA 3.1、BaEV-GaVL tail-pcDNA3.1、BaEV-MoRV tail-pcDNA3.1。
将慢病毒转移质粒：包含CAR(嵌合抗原受体)编码序列的慢病毒转移质粒(本实施例中使用的是靶向CD19的CAR，其具体信息详细记载于中国专利：CN107226867A中，其全文通过引用并入本文)或pBKL2-GFP(自制质粒，插入了GFP绿色荧光蛋白编码序列的慢病毒转移质粒)，以及pMDLg/pRRE和pRSV-Rev；分别与SERV-Rless-pcDNA3.1、HERV-wt-pcDNA3.1、HERV-Rless-pcDNA3.1、BaEV-FLV tail-pcDNA 3.1、BaEV-KLV tail-pcDNA3.1、BaEV-GaVLtail-pcDNA3.1或BaEV-MoRV tail-pcDNA3.1组合，共转染293T细胞，进行慢病毒包装和浓缩。
浓缩后的慢病毒，用293T进行滴度检测。将1×105个293T细胞接种至24孔板中，将浓缩后的病毒稀释10倍后按1、2、5ul/孔的体积分别感染293T，并加入DEAE助转剂(上海生工，货号：A600147)，感染后2天，收集被感染后的293T细胞，进行流式检测。其中CAR结构阳性率(包含CAR结构的细胞占细胞总数的比例，后简称“阳性率”)用PE偶联的L蛋白(Sinobiological，货号：11044-H07E-P)进行流式细胞检测。滴度计算方式为：Titer(TU/ml)＝1×105×阳性率×稀释倍数÷病毒体积×1000。结果显示包含SERV-Rless的组合无法形成慢病毒(图3)，而包含HERV-wt、HERV-Rless、BaEV-FLV tail、BaEV-KLV tail、BaEV-GaVLtail、BaEV-MoRV tail的组合可形成慢病毒(图4)。
以DEAE为助转剂，用HERV-wt或HERV-Rless包装的慢病毒按照MOI＝5转导pbNK(外周血NK细胞)，转导后3天进行流式检测，结果显示转导效率不足5％(图5)，即：不能进行有效转导。
用包装有BaEV-FLV tail、BaEV-KLV tail、BaEV-GaVL tail、BaEV-MoRV tail囊膜糖蛋白的慢病毒按照MOI＝1转导pbNK，转导后3天进行流式检测，如图6所示。
用包装有BaEV-MoRV tail和BaEV-GaLV tail囊膜糖蛋白的慢病毒按照MOI＝3或者MOI＝5转导pbNK，转导后3天进行流式检测，如图7所示
综合图4、图6及图7，可见相对于前述其他慢病毒，包装有BaEV-MoRV tail的慢病毒具有相对更高的包装滴度，并且对外周血NK细胞具有相对更高的转导效率，尤其在转导CAR基因时，BaEV-MoRV-tail囊膜糖蛋白在转导效率方面显示出更突出的优势。
将包装有BaEV-MoRV tail的慢病毒与包装有BaEV-Rless及BaEV/TR的慢病毒(具体结构描述于国际申请WO2013/045639A1中，所述申请全文在此通过引用并入本文)的包装滴度(图8)及对pbNK细胞的转染效率(图6)进行比较，结果表明包装有BaEV-MoRV tail的慢病毒依然具有相对更高的包装滴度，并且对外周血NK细胞具有相对更高的转导效率。
实施例2 PB转座子系统构建293T-BaEV-MoRV tail细胞系及其应用
将密码子优化后的BaEV-MoRV tail编码序列通过双酶切连入PB转座子质粒(由金斯瑞公司合成，其包含PiggyBac转座子必要功能部件)中，经过酶切及测序验证后，扩增并提取相应的质粒pPBK-CAG-BaEVRless-WPRE-bGH，使用的质粒浓度不应低于1000ng/ul。将1×107个293T细胞与5μg pPBK-CAG-BaEVRless-WPRE-bGH质粒及5μg转座酶质粒2P(由金斯瑞公司合成，可在哺乳动物细胞中表达PB转座酶)在总体积为100μl的电转液中混匀，通过Lonza 4D电转系统进行电转，电转程序为DG130，电转液为OPTI-MEM。
将电转后的293T细胞进行扩大培养，并通过流式细胞仪分选阳性细胞，使用的标记抗体为BaEV胞外区的鼠多克隆抗体(自制，可通过本领域已知的任何多克隆抗体的制备方法制备)，荧光二抗为兔抗鼠的Alexa 647(Thermos货号：A21239)。对分选后的表达BaEV-MoRV tail的293T细胞(293T-BaEV-MoRV tail)进行扩大培养后再次进行阳性率复测(图9)，由下图可以看出，分选后的表达BaEV-MoRV tail的293T细胞依然具有较高的阳性率表达。
使用如表1所示的组合物转导上述分选后的表达BaEV-MoRV tail的293T细胞(293T-BaEV-MoRV tail细胞系)，并检测囊膜慢病毒滴度。滴度检测结果也显示于表1中。可见，在包装的过程中同时加入VSV-G和BaEV-MoRV-tail囊膜糖蛋白，相对于仅加入BaEV-MoRV-tail囊膜糖蛋白可进一步提升慢病毒包装效率。
表1、293T-BaEV-MoRV tail(PB)包装的病毒滴度
将上述慢病毒按MOI＝5转导pbNK细胞，在转导后3天，用anti-CD19-scFv-APC单克隆抗体(自制，可使用本领域任何已知的单克隆抗体制备方法制备)检测CAR-NK阳性率。结果如图10所示，可以看出，包装有BaEV-MoRV-tail囊膜糖蛋白的慢病毒，无论是否还进一步包含VSV-G，都可以对pbNK细胞达到较高的感染效率。
实施例3不同结构BaEV囊膜糖蛋白酶切位点改造
将BaEV-Rless、BaEV/TR、BaEV-MoRV tail的蛋白酶切割位点分别替换为HIV蛋白酶切割位点(HIV cleavage site)或人工合成位点(synthetic sequence)(如图2所示)。pBKL2-GFP、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev与候选囊膜糖蛋白BaEV-Rless、BaEV/TR、BaEV-MoRVTail、BaEV-MoRVT-HIV蛋白酶切割位点(BaEV-MoRV-tail胞尾结构域的对应蛋白酶切割位点替换为HIV蛋白酶切割位点)、BaEV-HIV蛋白酶切割位点(将自身蛋白酶切割位点替换为HIV蛋白酶切割位点的BaEV-G)分别组合进行慢病毒包装，方法同实施例1；收获慢病毒粗提液后，用胰酶将293T细胞消化下来，收集至离心管中，标记7-AAD后用流式细胞仪检测其细胞活率，如下表所示，由表2可以看出，包装后的慢病毒均能保持较高的细胞活率。
表2、包含不同囊膜糖蛋白的囊膜慢病毒转导后细胞活率检测
用上述慢病毒按MOI＝5转导pbNK，在转导后三天，用流式细胞仪进行检测，结果如图11所示，可以看出，BaEV-MoRV Tail结构中改变蛋白酶切位点，例如将其蛋白酶切割位点更改为HIV蛋白酶切割位点可以增强该结构的细胞转导效率。
实施例4慢病毒法构建的293T-BaEV-MoRV Tail细胞系进行CD123-CAR及mbIL15的慢病毒包装
通过密码子优化和序列合成获得BaEV-MoRV Tail编码序列，通过酶切连入使用不同启动子的慢病毒转移质粒pBKL2中。经过酶切及测序验证后，提取相应的质粒pBKL2-MoRVtail(该质粒中囊膜糖蛋白的表达使用CAG启动子)、pBKL2-miniCMV-MoRV tail及pBKL2-SV40-MoRV tail。
将pBKL2-BaEV-MoRV tail或pBKL2-miniCMV-BaEV-MoRV tail或pBKL2-SV40-BaEV-MoRV tail分别与慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE及pRSV-Rev通过钙转法转染293T细胞。48h收获病毒粗提液。通过PEG-6000浓缩病毒粗提液后，通过RT-PCR测定病毒滴度。
按MOI＝1-2，将上述慢病毒转导293T，转导后3天通过流式细胞仪检测转导效率，阳性率>85％即可进行后续验证。BaEV细胞系阳性率检测抗体为BaEV胞外区的鼠多克隆抗体，荧光二抗为兔抗鼠的Alexa 647。结果说明使用慢病毒转导细胞也可以成功构建表达BaEV-MoRV tail囊膜糖蛋白的细胞系(293T-BaEV-MoRV Tail(LV))并用于后续慢病毒包装。
将CD123-CAR(来源于专利ZL201810207761.2)及mbIL15的慢病毒质粒与三个慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G转导293T细胞。48h收获病毒粗提液。通过PEG-6000浓缩病毒粗提液后，通过流式检测病毒滴度。病毒可在-80℃保存，由表3可以看出，以CD123-CAR和mbIL15为目的基因也可以使用本申请的囊膜糖蛋白成功地进行慢病毒的包装。
表3、CD123-CAR及mbIL15包装滴度测试
随后，按MOI＝3将上述慢病毒转导活化2天的pbNK细胞，转导后三天用流式细胞仪检测NK细胞阳性率，检测方法可参考实施例2，结果如图12所示，可见使用本申请的囊膜糖蛋白包装包含CD123-CAR、mbIL15等其他外源蛋白编码序列的慢病毒也均可以较高效率地感染pbNK细胞。
实施例5、利用慢病毒系统构建293T-BaEV-Rless细胞系及其应用
通过密码子优化和序列合成获得BaEV-Rless编码序列，通过酶切连入具有不同启动子的慢病毒转移质粒pBKL2中。经过酶切及测序验证后，提取相应的质粒pBKL2-BaEVRless(CAG启动子)、pBKL2-miniCMV-BaEVRless(miniCMV启动子)及pBKL2-SV40-BaEVRless(SV40启动子)。
将pBKL2-BaEVRless或pBKL2-miniCMV-BaEVRless或pBKL2-SV40-BaEVRless与三个慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G通过钙转法转染293T细胞。48h收获病毒粗提液。通过PEG-6000浓缩病毒粗提液后，通过RT-PCR测定病毒滴度。
按MOI＝1-2，将上述慢病毒转导293T，转导后3天通过流式检测转导效率，阳性率>85％即可进行后续验证。BaEV细胞系阳性率检测抗体为BaEV胞外区的鼠多克隆抗体，荧光二抗为兔抗鼠的Alexa 647；
将包含靶向CD19的CAR的编码序列的慢病毒转移质粒(PCAR-19B，其具体信息详细记载于中国专利：CN107226867A中，其全文通过引用并入本文)与两个慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev(表2最右列)，或与三个慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G分别转导上述慢病毒的293T细胞(表4-5)。48h收获病毒粗提液。通过PEG-6000浓缩病毒粗提液后，通过流式检测病毒滴度。病毒可在-80℃保存。
结果显示，同时使用BaEVRless及VSV-G，相对于单独使用表达BaEVRless(及去除了R肽的BaEV-G)进行慢病毒包装，可以进一步提高包装效率。对照表1中使用BaEV-MoRV-tail囊膜糖蛋白及VSV-G进行慢病毒包装的结果，可知在使用BaEV-G的基础上，额外引入VSV-G可提升囊膜病毒包装效率这一结论是普适性的。此外，如表5所示，可见使用BaEVRless及VSV-G进行包装的方法适用于多种启动子，包括但不限于CAG、miniCMV和SV40。
表4.293T-BaEVRless细胞系包装BaEV慢病毒及BaEV::VSV-G嵌合慢病毒
表5.具有不同启动子的293T-BaEVRless细胞系包装的BaEV::VSV-G嵌合慢病毒(囊膜中包含VSV-G及BaEVRless的慢病毒颗粒)
将选自上述慢病毒转导活化2天后的PbNK，在转导后7天通过流式检测CAR-NK的阳性率，体外杀伤及IFN-γ分泌，结果如图13和表6所示。其中标有(2G)的组别表示同时转染了pMD2.G质粒的组别，即BaEV::VSV-G嵌合囊膜慢病毒的组别，而标有(BaEV)的最别表示其中包装的慢病毒囊膜糖蛋白为BaEV而不包含VSV-G。293T-BaEVmini表示BaEV在细胞系中用于表达的启动子为miniCMV，293T-BaEV则表示BaEV在细胞系中用于表达的启动子为CAG。293T表示使用的细胞系是未改造的293T细胞，改组通过将BaEV-G囊膜质粒导入293T细胞来包装慢病毒。对照组则不包装任何病毒，仅以未改造的NK细胞作为其他组包装病毒转导的NK细胞的空白对照。
表6.不同细胞系包装的BaEV慢病毒及BaEV::VSV-G嵌合慢病毒转导NK的效率及CAR-NK体外功能检测
由如图13和表6的结果可知在囊膜中同时包含VSV-G和BaEV-G的病毒相对于囊膜中仅包含BaEV-G囊膜糖蛋白或其变体的病毒，对免疫细胞等难于转导的细胞具有更高的感染效率(体现在CAR阳性率上)。并且，通过转导包含VSV-G和BaEV-G的病毒构建的包含CAR的免疫效应细胞均具有良好的杀伤力(体现在杀伤率和IFN-γ的表达上)，并且使用BaEV::VSV-G嵌合慢病毒构建的工程化免疫效应细胞相对使用BaEV-G或其变体包装的慢病毒具有更强的杀伤力。
此外，本实施例的结果还证明通过慢病毒感染宿主细胞构建的表达BaEV-G或其变体蛋白的细胞系，与通过转座构建的表达BaEV-G或其变体的细胞系类似，均可用于高效的慢病毒包装，并且所述慢病毒可高效转导免疫细胞等难于转导的细胞。
实施例6、利用PB转座子系统构建293T-BaEV-Rless细胞系及其应用
将密码子优化后的BaEV-Rless编码序列通过双酶切连入PB转座子质粒中，经过酶切及测序验证后，提取相应的质粒pPBK-CAG-BaEVRless-WPRE，质粒浓缩不应低于1000ng/ul；
将1e7个293T细胞与2.5ug pPBK-CAG-BaEVRless质粒及2.5ug转座酶质粒2P在总体积为100ul的电转液中混匀，通过Lonza 4D电转系统进行电转，电转程序为DG130，电转液为OPTI-MEM；
将电转后的293T细胞进行扩大培养，并通过流式细胞仪分选阳性单细胞至96孔板中(即1cell/孔)，用于流式标记的抗体为BaEV胞外区的鼠多克隆抗体，荧光二抗为兔抗鼠的Alexa 647
阳性单克隆扩大培养后通过流式细胞仪检测的不同克隆BaEV的表达丰度如图14所示。将丰度划分为高、中、低三个水平，示于图14右图。
在前述高、中、低三个水平中分别挑选部分克隆进行后续病毒包装及滴度测定。将PCAR-19B(详细描述于专利：CN107226867A)的慢病毒质粒与三个慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G通过钙转法转染上述阳性克隆，用病毒粗提液直接进行滴度检测，结果如表7所示。
表7.不同293T-BaEV-Rless(PB)细胞克隆包装的BaEV::VSV-G嵌合慢病在细胞培养物上清中的滴度
挑选上述实验中滴度较高的克隆，进行病毒大量包装，并按实施案例1中的方法进行浓缩，浓缩后进行滴度检测。如图15所示，其中293T-BaEV(PB)-1和293T-BaEV(PB)-2分别为使用表7中的11号和19号293T-BaEVRless(PB)克隆包装的慢病毒，293T-BaEV(LV)表示使用慢病毒转导293T细胞系构建的表达BaEVRless的293T细胞系包装的慢病毒，293T则表示通过直接共转染BaEVRless包装质粒的方式包装形成的慢病毒。可见，通过转座的方式构建的表达BaEV-G及其各种变体(包括前述BaEV-MoRV-tail囊膜糖蛋白以及本实施例的BaEVRless囊膜糖蛋白)的细胞系，并用此进行慢病毒包装，相对于直接转染包含囊膜糖蛋白编码核酸的质粒进行包装的方法，均可提高包装效率及滴度。
将26号克隆扩大培养后进行大体系慢病毒包装。按MOI＝3转导活化2天后的pbNK，并在转导后3天进行CAR-NK阳性率检测，结果如图16所示。可见使用本申请的方案包装的BaEV囊膜慢病毒对NK细胞等较难转导的细胞具有较高的转导效率。
实施例7、293T-BaEV-Rless细胞系用于包装不同目的基因的慢病毒
将编码CD123-CAR、mbIL15、mbIL12的基因通过双酶切连入慢病毒转移质粒pBKL2，通过双酶切及测序验证后分别获得pBKL2-CD123-CAR、pBKL2-mbIL15、pBKL2-mbIL12三个质粒；按实施案例6中的慢病毒包装方法进行病毒包装、浓缩及滴度测定，病毒滴度如图17所示。可见本申请的方案可用于各种目的基因的慢病毒包装。
将上述慢病毒按MOI＝3转导活化2天的pbNK，分别获得mbIL12-NK、mbIL15-NK和CD123-CAR-NK细胞，并在转导后三天用流式细胞仪进行阳性率检测，mbIL12-NK和mbIL15-NK分别用IL12-PE(带PE标签的抗IL12单抗)和CD215-PE(带PE标签的抗CD215单抗)标记，CD123-CAR-NK用rCD123-his+anti His-APC标记后进行检测，结果如图18所示。可见使用本方案构建的携带各种目的基因的慢病毒均可高效构建工程化免疫效应细胞。
实施例8.不同结构BaEV嵌合慢病毒制备CAR-γδT细胞
将γδT细胞在体外活化8天，BaEV-Rless::VSV-G嵌合慢病毒按MOI＝1转导γδT，VSV-G慢病毒作为对照组按MOI＝5转导γδT。慢病毒转导后第5天，用PE偶联的L蛋白标记CAR蛋白，通过流式检测CAR-γδT细胞，结果如图19所示(BaEV-Rless:VSV-G嵌合慢病毒和VSV-G慢病毒转导γδT细胞效率对比)：嵌合慢病毒具有较高的转导率。即相对于现有技术中囊膜慢病毒的包装方法(仅用VSV-G一种囊膜糖蛋白包装囊膜病毒)，用VSV-G及BaEV-G或其变体共同包装嵌合囊膜病毒可提高所述囊膜病毒的转导效率。
实施例9.293T-BaEV-Rless包装逆转病毒及BaEV-Rless逆转录病毒转导小鼠B细胞的效率
用逆转录病毒包装元件相关质粒pCL-Eco、MSGV1-GFP各10μg转染293T-BaEV-Rless细胞系，病毒包装及浓缩方法参考实施例5；用CHO细胞测定上述逆转录病毒滴度，检测方法及计算方法参考实施例1，结果显示病毒滴度为1.4e8 Tu/ml；从小鼠脾脏分离的B细胞体外培养3天后按MOI＝1、3、6添加上述逆转录病毒；逆转录病毒添加后24h，通过流式检测B细胞GFP阳性率；结果如图20所示，可见使用本申请的方案包装的病毒可高效地转导B细胞。并且可高效地转导原代细胞。
实施例10BaEV-Rless与BaEV-Rless::VSV-G嵌合慢病毒转导效率对比
按照实施例6的方法进行BaEV-Rless及BaEV-Rless::VSV-G嵌合慢病毒包装、浓缩及滴度检测，滴度结果如表8所示，结果显示，嵌合慢病毒的滴度与BaEV-Rless的滴度相当。说明通过表达BaEV-G的细胞系包装囊膜病毒的方法适用于各种BaEV-G的变体(例如BaEV-Rless，BaEV-MoRV-tail，BaEV/TR等)，或嵌合囊膜病毒(例如BaEV-G及其各种变体与VSV-G的嵌合囊膜病毒)的包装，并且对被包装的目的基因种类没有限制。该方法是具有普适性的。
表8：BaEV-Rless与BaEV-Rless::VSV-G嵌合慢病毒滴度对比
将上述慢病毒按MOI＝3转导活化2天的pbNK细胞，转导后三天用流式细胞仪检测NK细胞阳性率，检测方法可参考实施例7，结果如图21所示，由下图中可以看出，本申请提供的囊膜病毒包装方案中，适用VSV-G与BaEV-G或其变体包装的囊膜病毒可以具有对免疫细胞等难转导细胞的进一步提升的转导效率。
附：序列信息

Claims (10)

1.一种包装假病毒的方法，包含：
向靶细胞中导入BaEV囊膜糖蛋白或包含BaEV囊膜糖蛋白编码核酸的载体，目的基因编码核酸及病毒包装元件；或
构建稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系，并向所述细胞系导入目的基因编码核酸及病毒包装元件。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的胞尾结构域中蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点取代，优选所述的HIV蛋白酶切割位点的氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示。
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中所述假病毒为逆转录病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述假病毒为慢病毒，优选HIV病毒。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中转移质粒携带所述目的基因编码核酸，包装质粒携带所述病毒包装元件。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中BaEV囊膜糖蛋白编码核酸通过基因工程方法插入靶细胞基因组构建稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系。
7.根据权利要求6的方法，其中所述基因工程方法为转座，优选所述转座使用的转座子系统选自：PB转座子系统、SB转座子系统或ΦC31整合酶系统。
8.一种用于假病毒包装的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其胞尾结构域中的蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点替代。
9.由根据权利要求1-7中任一项所述的方法包装的假病毒。
10.根据权利要求9的假病毒用于将外源基因导入细胞中的用途。
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