JP4708661B2 - 増強された3’転写終結構造を含む、レトロウイルスベクター - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、レトロウイルスベクターに関する。本発明は特に増強された3'転写終結構造を有するレトロウイルスベクターおよび哺乳類細胞および生物において異種コード配列を発現するためにこのようなベクターを使用する方法に関する。
【0002】
発明の背景
レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターは、現在遺伝子治療プロトコールにおいて最も頻繁に使用されている遺伝子送達媒体の一つである。レトロウイルスベクターの有用性に必須であるのは、ベクターにより保持される種々のレトロウイルス性質である。このような性質は、多くの細胞タイプの優れたトランスフェクションおよび、ベクターによりコードされる遺伝子の長期発現を可能にする宿主細胞染色体へのそれらのゲノムの安定な統合を含む。他の重要な保持される特性は、ベクター粒子から、ウイルス粒子の結合からの、宿主細胞遺伝物質へのそのゲノムの統合を介した、ベクターライフサイクルの最初の段階が、ウイルスタンパク質の新たな合成を必要としないことである。
【0003】
レトロウイルスベクターの基本要素
野生型レトロウイルスゲノムの主要な性質は図1に要約し、それはオープンリーディングフレームおよびウイルスの長い末端反復(LTR)の構造を示す。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクター由来のゲノムを含む。レトロウイルスベクターの最も単純なタイプは、ウイルス遺伝子をコードする配列(例えば、gag、envおよびpol)の多くを欠き、パッケージング、逆転写および統合に必要な配列のみを保持する、著しく削減されたレトロウイルスゲノムを有する。削減されたレトロウイルスゲノムは、しばしば、レトロウイルス骨格と呼ばれ、その上に更なる修飾を成し得、それに異種遺伝子および配列を付加してレトロウイルスベクターを形成できる。典型的に、異種遺伝子を、5'LTRプロモーターがその続く発現を可能にするような方法で骨格に挿入する。プロモーターと操作可能に結合している異種遺伝子を含む発現構築物は、また標的細胞への送達および発現のために骨格に挿入できる。
【0004】
ウイルス遺伝子のいくつかまたは全てを欠くレトロウイルスベクターは、複製欠損である。このようなベクターを含むウイルス粒子の生成は、トランスで欠損機能を提供する宿主細胞におけるベクター増殖を必要とする。トランス相補性は、宿主細胞を、またレトロウイルスから送達され、欠失ウイルスタンパク質を発現するが、パッケージングシグナルの欠失のためパッケージ化されない、パッケージングヘルパー構築物でトランスフェクトすることを含む種々の方法で達成できる。レトロウイルス製造のこのシステムを図2に説明する。ベクターおよびパッケージングヘルパー構築物の両方がプロデューサー細胞に存在するとき、感染性レトロウイルス粒子が放出され、それはその挿入遺伝子と共にベクターゲノムの送達ができる。遺伝子送達のこの工程は形質導入と呼ぶ。
【0005】
レンチウイルスベクター
今日まで、臨床的遺伝子治療プロトコールにおいて最も一般に使用されているレトロウイルスは、マウス白血病ウイルス(MuLV)を基にしており、ウイルス粒子内にベクターゲノムを封入する種々のパッケージングシステムが開発されている(Miller, AD. 1997. Development and applications of retroviral vectors. Retroviruses, Ed. Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE. CSHL Press, New Yorkにレビュー)。ベクターそれ自体は、全てのウイルス遺伝子が除去され、完全に複製欠損であり、約6−8kbの外来DNAを受け入れることができる。これらの現在のベクター/パッケージングシステムで患者に課される危険性は最少であり、今日までそれらの使用に関連する毒性または長期問題の報告はない。
【0006】
しかし、MuLVおよびそれ由来のベクターは、分割細胞の感染のみできる。これは、予め統合された核タンパク質複合体が無傷の核膜を通過できないためである。対照的に、原型的レンチウイルスHIV−1は、無傷の膜が存在する場合でさえ、核輸送の能力を示し、HIV−1由来ベクターはしたがって非分割細胞も形質導入できる(Naldini et al., Science 272:263-267 (1996))。HIVベクターのこの能力は、標的細胞が非分割であり、異種遺伝子の安定な統合が必要であるとき、それらを遺伝子治療の特に魅力的な候補物とする。
【0007】
レトロウイルス設計および製造システムの改善
上記のレトロウイルスベクター製造システムは機能的であるが、いくつかの方法で不充分である。特に、パッケージングヘルパー構築物におけるベクター配列とウイルス要素の間に残る重複は、感染性複製コンピテントレトロウイルス(RCR)を創生する可能性のある組換え事象の著しい危険性が存在することを意味する。このような重複は、gag遺伝子の広い配列がパッケージング効率を促進するためにベクターに保持されるために、主に存在する。加えて、LTRはパッケージングヘルパー構築物に頻繁に残り、プロモーターおよびポリアデニル化配列の両方を提供する。
【0008】
RCR製造の製造の危険性を減少させるために、ベクター設計および製造の種々の改善された試みが開発されている。一つの試みは、パッケージング要素を分け、gag−pol遺伝子をおよびenv遺伝子を、個々にパッケージング細胞に導入できる別々のプラスミドにおく。他の試みにおいて、env介在組換えを、異種エンベロープタンパク質の使用により避け、該異種エンベロープタンパク質のコード配列は親レトロウイルスのゲノムと相同性を有しないが、ベクター粒子内に包含できる(シュードタイピングと呼ぶ工程)。一般に使用される異種エンベロープタンパク質は、水疱性口内炎ウイルスのGタンパク質であるVSV Gである(Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:8033-8037 (1993))。図3、パネルA参照。
【0009】
更に別の試みにおいて、LTR−介在組換えは、パッケージングヘルパー構築物における異種プロモーターおよびポリアデニル化シグナルの使用により減少される。これはまたベクター力価の促進という利点を有する(Soneoka et al., Nucleic Acids Res 25:628-633 (1995))。この試みは、典型的にベクターLTRからの非必須配列の除去、および、適当な場合、欠失配列の異種配列での置換を含む。例えば、CMV即時−早期プロモーターのような異種プロモーターを5'U3プロモーターの置き換えに使用している。他の例において、インテグラーゼ認識配列(即ち、att配列)が保持される限り、3'U3配列が、自己不活性化(SIN)ベクターでのように著しく欠失している(Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci 83:3194-3198 (1986))。図3、パネルB参照。
【0010】
これらの試みは種々のレンチウイルスベースのベクターの開発に使用されており、これは組換え事象に起因する病原性RCRの可能性のために特別の安全性懸念をもたらす。この試みの生成物の例は、CMV駆動SINベクター(Zufferey et al., J. Virol. 72:9873-9880 (1988))、全ての非必須遺伝子が不活性化または除去された最少パッケージングヘルパー構築物(Zufferey et al., Nat. Biotechnol. 15:871-875 (1997))および、VSV Gのような非HIV−1エンベロープを含むレトロウイルス粒子を含む。
【0011】
レトロウイルスベクター統合
レトロウイルスベクターは、そのゲノムを宿主細胞の遺伝物質内に統合する。ウイルスインテグラーゼにより行なわれる、レトロウイルス統合の過程に関して多くのことが知られている。インテグラーゼはDNAプロウイルスのLTRの末端(att部位、図パネル1B)で配列を認識し、宿主ゲノムに多かれ少なかれ無作為にプロウイルスを挿入するが、ある配列優勢が報告されている(Carteau et al., J. Virol. 72:4005-4014 (1988))。
【0012】
統合のためのレトロウイルスベクターの能力は諸刃の刃である。一方で、統合プロウイルスの全娘細胞への継代を伴う、ベクターコード遺伝子の安定な長期発現の可能性を可能にする。他方で、ベクター統合が通常のフランキング宿主遺伝子を干渉する。実際、レトロウイルスは、腫瘍形成性形質転換をもたらす能力に基づいて、最初、同定された。干渉の一つのタイプは、読み通し転写による宿主遺伝子の不適当な活性化であり、即ち、ウイルス転写物の係属が3'LTR転写終結部位を越え、下流宿主遺伝子配列まで行く。プロウイルスの宿主配列への読み通し転写は、数種のレトロウイルスで観察されている(R. V. Gunataka Microbiol. Rev. 57:511-521 (1993); Bohnlein et al., J. Virol. 63:421-424 (1989); Herman et al., Science 236:845-848 (1997); Iwasaki et al., Genes & Dev. 4.2299-2307 (1990); Cherrington et al. EMBO J. 11:1513-1524 (1992))。最近の証拠は、統合HIV−1プロウイルスがまたフランキング宿主細胞配列の読み通し転写を行なうことができることを示す(Dron et al., Arch Virol. 144:19-28 (1999))。
【0013】
mRNAの転写終結
RNAポリメラーゼIIにより転写されたメッセンジャーRNA(mRNA)の3'末端を、発生期転写物の開裂により創生する。この事象は、ポリアデニル化部位で優勢に起こり、約250ヌクレオチドポリ(A)テイルの鋳型非依存的付加に続く(Wahle et al., FEMS Microbiol. Rev. 23:277-295 (1999))。ポリ(A)テイルは、安定性、翻訳効率、および核から細胞質への加工mRNAの輸送を含む、mRNA代謝の多くの態様に影響する(Lewis et al., Microbiol Mol Biol Rev. 63:405-445 (1999); Colgan et al., Genes & Dev. 11:2755-2766 (1997); Huang et al., Mol. Cel. Biol. 16:1534-1542 (1996); Sachs et al., J. Biol. Chem. 268:22955-22958 (1993))。強いポリアデニル化シグナルが、インビトロで製造したmRNAの前駆体開裂のレベルおよびポリ(A)の長さを促進することが観察されている(Lutz et al., Genes & Dev. 10:325-337 (1996))。一つの例において、増加したポリ(A)テイル長は増強されたトランスジーン発現と相関する(Loeb et al., 1999 West Cost Retrovirus Meeting, abstract p57)。
【0014】
ポリアデニル化シグナル
コアポリアデニル化シグナルは、開裂/ポリアデニル化部位にフランキングな二つの認識要素から成る。非常に保存性のAAUAAAヘキサヌクレオチド要素(Proudfoot et al., Nature 263:211-214 (1976))は、開裂部位の8から31ヌクレオチド上流に位置し(Chen et al., Nucleic Acid Res. 23:2614-2620 (1995))、乏しい保存性のGU−またはU−リッチ(G/U−リッチ)下流要素はAAUAAA要素の14から70ヌクレオチド下流に位置する。mRNA転写物の開裂は通常、これらの二つの要素の間のA残基、優勢にはCAジヌクレオチドの後に起こる(Sheets et al., Nucleic Acid Res. 18:5799-5805 (1990))(図4)。
【0015】
ポリアデニル化シグナルの増えている数はまた、転写終結を促進するAAUAAA配列の上流に位置する付加的要素を含むことが示されている(図4)。このような上流エンハンサー(UE)の初期の例は、HIV−1(Valsamakis et al., Mol. Cell. Biol. 12:3699-3705 (1992); Gilmartin et al., EMBO J. 11:4419-4428 (1992)、ウマ感染性貧血ウイルス(Graveley et al., J. Virol. 70:1612-1617 (1996))、サルウイルス40(SV40)(Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989))、アデノウイルス(Prescott et al., Mol. Cell. Biol. 14:4682-4693 (1994); DeZazzo et al., Mol. Cell. Biol. 9:4951-4961 (1989))、カリフラワーモザイクウイルス(Sanfacon et al., Genes & Dev. 5:141-149 (1991))および地リス肝炎ウイルス(Cherrington et al., J. Virol. 66:7589-7596 (1992))ポリ(A)を含む、種々のウイルスのポリアデニル化シグナルに見られた。より最近、UEはまたヒト補体C2遺伝子(Moreira et al., EMBO J. 14:3809-3819 (1995): Moreira et al., Genes & Dev. 12:2522-2534 (1998))およびラミンB2遺伝子(Brackenridge et al., Nucleic Acid Res. 25:2326-2335 (1997))のような哺乳類遺伝子のポリアデニル化シグナルにおいても同定されている。
【0016】
一般に、UEはU−またはUG−リッチ配列を含むが、異なるUE間で明らかな配列相同性はない(Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989): R. H. Russnak, Nucleic Acid Res. 19:6449-6456 (1991); Sanfacon et al., Genes & Dev. 5:141-149 (1991); Moreira et al., EMBO J. 14:3809-3819 (1995))(図5)。配列相同性が存在しないにもかかわらず、一定のウイルスUEは機能的に交換できるように見える(Russnak et al., Genes & Dev. 4:764-776 (1990); Valsamikis et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88:2108-2112 (1991); Graveley et al., J. Virol. 70:1612-1617 (1996))。
【0017】
SV40遅延ポリアデニル化シグナル(USEとしても既知)のUEは、AAUAAA要素の13−51ヌクレオチド上流に位置する(図5)(Schek et al., Mol. Cell. Biol. 12:5386-5393 (1992); Lutz et al., Genes & Dev. 8:576-586 (1994); Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989); Cooke et al., Mol Cell Biol. 19:4971-4979 (1999))。USEは、USE変異がインビトロおよびインビボの両方でポリアデニル化効率を75から85%まで減少させるため、コアポリアデニル化シグナルの活性の促進に重要な役割を担う(Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989); Schek et al., Mol. Cell. Biol. 12:5386-5393 (1992))。USE内で、コンセンサス配列AUUUGUPuAを伴う3つのコアUリッチ要素が活性要素として同定されている。それらは距離依存的方法で、複数の複製が存在する場合、ポリアデニル化効率に付加的な方法で機能するように見える(Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989))。地リス肝炎ウイルスポリアデニル化シグナルのUEはまたコアポリアデニル化シグナルに配向依存的、付加的な、しかし距離非依存的態様で影響する(R. H. Russnak, Nucleic Acid Res. 19:6449-6456 (1991))。
【0018】
レトロウイルスポリアデニル化シグナル
レトロウイルス5'および3'LTRはR領域にポリアデニル化シグナルAAUAAAを含み、G/Uリッチ下流要素はU5領域に位置し、開裂/ポリアデニル化部位はR/U5境界を定義する(図4)。HIV−1において、3LTRは、AAUAAAモチーフの77−94ヌクレオチド上流の、U3領域にUE(UHEとしても既知)を含む(図4、パネルCおよび図5)。UHEは3'LTRポリアデニル化シグナルの加工効率を著しく増加させる(DeZazzo et al. Mol Cell Biol. 12:5555-5562 (1991); Valsamakis et al., Mol Cell Biol. 12:3699-3705 (1992))。UHEMと名付けた推定マイナーポリアデニル化エンハンサーはまたAAUAAAモチーフの146−171ヌクレオチド上流に同定されている(Valsamakis et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88:2108-2112 (1991))(図4&5)。
【0019】
5'および3'LTRの両方でのAAUAAAおよびG/Uリッチ下流要素の存在にもかかわらず、3'LTRから複製したHIV−1ポリアデニル化シグナルが優勢に認識される。二つのポリアデニル化シグナルの異なる認識を説明するいくつかの機構が提案されている(Das et al., J. Virol. 73:81-91 (1999); Cherrington et al., J. Virol. 66:7589-7596 (1992); DeZazzo et al., Mol Cell Biol. 12:5555-5562 (1992); J. Cherrington, EMBO J. 11:1513-1524 (1992))。
【0020】
発明の要約
本発明は、増強された3'転写終結構造を有するレトロウイルスベクターに関する。一つの実施態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、3'LTRポリアデニル化シグナルと操作可能に関連した1個以上の異種上流エンハンサー(UE)を含む。他の実施態様において、本発明のレトロウイルスは、3'LTRポリアデニル化シグナルと操作可能に関連した内因性UE配列の付加的な複製を含む。本発明は、このようなレトロウイルスベクター、そのヌクレオチド配列、このようなベクターにより生成されるウイルス粒子、およびこのようなベクターおよびそのプロウイルス配列を含む細胞を含む組成物を提供する。本発明はまた哺乳類細胞および生物における異種コード配列を発現するためのこのようなレトロウイルスベクターの使用法も提供する。
【0021】
本発明は、1個以上の異種UE配列、または1種以上の内因性US配列の付加的複製のレトロウイルスへの挿入が、3'LTRの転写終結効率を増加させ、このような修飾を有するベクターがこのような修飾を有しない以外同一のベクターで製造されるよりも高いベクター力価(即ち、ベクターを含むウイルス粒子の力価)を製造するという驚くべき発見に基づく。いかなる理論にも縛れることを意図しないが、3'LTRによる転写終結の促進は、ベクターmRNAの製造、安定性、核輸出および/または翻訳を増加させ、このような増加がプロデューサー細胞におけるより高いベクターRNA製造および/または遺伝子発現、したがってより高いベクター力価を導くと考えられる。
【0022】
定義
特記しない限り、以下の単語および用語は、本明細書および特許請求の範囲に関して、以下の意味を有する。
【0023】
“3'LTR”は3'レトロウイルス長い末端反復を意味し、これはその対応する天然(即ち、野生型レトロウイルスに存在する)3'LTRから、内因性配列の欠失および/または変異および/または異種配列の付加により修飾され得、またはされ得ない。
【0024】
“5'LTR”は5'レトロウイルス長い末端反復を意味し、これはその対応する天然5'LTRから、内因性配列の欠失および/または変異および/または異種配列の付加により修飾され得、またはされ得ない。
【0025】
“3'LTRポリアデニル化シグナル”は、レトロウイルスの3'LTRに存在するポリアデニル化シグナルを意味する。
【0026】
“上流エンハンサー”および“UE”は互換性に使用され、エンハンサーの下流に位置するポリアデニル化シグナルにより転写終結を促進する、種々の真核およびウイルス遺伝子の3'非翻訳領域に存在する制御要素を意味する。UEの例はSV40遅延ポリアデニル化シグナル(USE)、HIV−1 LTR(UHE)および地リス肝炎ウイルス(UGE)に見られる。
【0027】
“上流エンハンサー配列”および“UE配列”は互換的に使用され、UEの配列またはその活性セグメントを意味する。UEと同様に、UEの活性セグメントは、シグナルの5'上流に置かれたとき、ポリアデニル化シグナルの転写終結活性を増加させる。UEは配列が重複し得るまたはし得ない多くの活性セグメントを含み得る。
【0028】
本発明のレトロウイルスベクターの状況で、“異種”UE配列は、本発明のレトロウイルスが由来するレトロウイルスの天然3'LTRに存在するものと同一でないUE由来のUE配列である。対照的に、“内因性”UE配列は、本発明のレトロウイルスベクターが由来するレトロウイルスの天然3'LTRにおいて、存在する、HIV−1のUHEのような、UE由来のUE配列である。
【0029】
レトロウイルスの“3'転写終結構造”は、構造の上流から開始する転写の終結を行なう3'LTRの中のおよび近接する構造を意味する。このような構造は3'LTRポリアデニル化シグナルを含み、更に、そのシグナルと操作可能に結合した、内因性UE配列および異種UE配列を含み得る。
【0030】
“ポリヌクレオチド”は、交換可能に、二本および一本鎖分子を意味する。特記しない限り、または必要でない限り、本明細書に記載の任意の実施態様は、二本鎖形および二本鎖形を形成することが既知のまたは予測される各相補的一本鎖形の両方を含むポリヌクレオチドである。
【0031】
“プロデューサー細胞”は、レトロウイルスベクターまたはそのプロウイルス配列を含み、レトロウイルスベクターを含む形質導入粒子を製造する細胞を意味する。レトロウイルスが複製欠損である場合、プロデューサー細胞は、必要な複製機能をトランスで製造することにより、欠損を補う。
【0032】
“レトロウイルス”はRNA指向DNAポリメラーゼ、または“逆転写酵素”を使用し、ウイルスRNAゲノムを二本鎖DNA中間体に複製し、それを宿主細胞の染色体DNAに統合するウイルスのクラスを意味する。レトロウイルスはレンチウイルスを含む。レトロウイルスの例は、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーヴェー肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、脊髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含むが、これらに限定されない。レンチウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ビスナウイルスを含む。
【0033】
“ベクター”は、特記しない限り“レトロウイルスベクター”を意味する。
“レトロウイルスベクターゲノム”は、そのポリヌクレオチドのRNAバージョンがレトロウイルス粒子にパッケージされるのを可能にし、そのパッケージ化RNAポリヌクレオチドが逆転写され、レトロウイルス粒子内に含まれる逆転写酵素およびインテグラーゼのようなレトロウイルス酵素の作用により宿主細胞染色体に統合されるのに充分である、レトロウイルスゲノム由来の配列を含むポリヌクレオチドを意味する。
【0034】
“遺伝子”はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
“コード配列”は、ポリペプチド、アンチセンスRNA、リボザイムまたは、snRNA、tRNAおよびrRNAのような構造RNAをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【0035】
本発明のレトロウイルスベクターの状況において、“異種”遺伝子またはコード配列は、本発明のレトロウイルスが由来するレトロウイルスに見られる任意の遺伝子またはコード配列と同一でない遺伝子またはコード配列である。
【0036】
二つの遺伝子または配列は、各遺伝子または配列におけるヌクレオチドの順番が、任意の付加、欠失または物質置換がなく同じである場合、“同一”である。
【0037】
ポリヌクレオチドの状況で、“配列”は、配列において互いに隣接する残基がポリヌクレオチドの一次構造において連続している、5'から3'方向のポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順番である。
【0038】
“操作可能に結合”は、要素が、それらを予期される方法で操作可能にする関係である、遺伝子要素の並置を意味する。例えば、UE配列は、同じDNA分子内のポリアデニル化シグナルと、UE配列がそのシグナルにより転写終結が促進される場合、操作可能に連結している。同様に、プロモーターは、同じDNA分子のコード領域と、プロモーターがコード配列の転写を可能にする場合、操作可能に結合している。機能的関係が維持される限り、このような関連要素の間に干渉残基が存在し得る。
【0039】
図面の簡単な説明
図1.レトロウイルスゲノム構成
パネルA.単純C型レトロウイルスの基本的構成を示す。長い末端反復(LTR)は、各々5'および3'LTRを優勢に使用するプロモーターおよびポリアデニル化配列を含む。完全長およびスプライスした転写物の両方を製造し、これらは3つの主用タンパク質をコードする;GagおよびGag−Polは完全長転写物からの翻訳であり、envはスプライスされた転写物からの翻訳物である。完全長転写物はまたRNAゲノムとして働く。ゲノムの5'領域に、ゲノムをウイルス粒子に統合するのに必要なパッケージングシグナル(Ψ)である。SD、スプライスドナー;SA、スプライスアクセプター。
パネルB.LTRは、U3、RおよびU5と名付けられる3つの領域を含む。プロモーターおよびエンハンサー配列は5'LTRでのみ活性であり、U3領域に位置し、一方3'LTRはR/U5境界を定義する。LTRの末端のatt配列は統合に必要である。
【0040】
図2.複製欠損レトロウイルスベクター粒子の製造
野生型レトロウイルス、パッケージングヘルパー構築物および複製欠損レトロウイルスのゲノムは、各々図面の上段、中段および下段に示すとおりである。パッケージングヘルパー構築物は、全てのウイルスタンパク質を、ウイルスタンパク質をコードしないが、パッケージングおよび統合のための必要なシス要素の全てを保持するベクターゲノムに対してトランスに提供する。パッケージングヘルパー構築物からのパッケージングシグナルの欠失は、ベクター粒子へのその統合を防止する。
【0041】
図3.レトロウイルスベクター設計の改善
パネルA.分けたパッケージングヘルパー構築物。Gag−PolおよびEnvタンパク質をコードする配列を、二つの異なるプラスミドに分け、異種融合タンパク質(例えばVSV Gタンパク質の使用により安全性を更に増加させる。発現は、非LTRプロモーター(例えば、ヒトCMVプロモーター)の使用を介してパッケージングヘルパーから最大化される。
パネルB.SINベクター。5'LTRのU3プロモーター配列をCMVプロモーターで置き換え、3'LTRのU3プロモーターを欠失により最少にする。逆転写に続いて、欠失U3配列(△U3)をプロウイルスの5'および3'LTRの両方に複製し、統合ベクター5'LTRからの非常に減少したプロモーター活性をもたらす。これは、自己不活性化(SIN)ウイルスの基礎である。
【0042】
図4.ポリアデニル化シグナル:上流エンハンサー(UE)の役割
パネルA.ポリアデニル化効率のUE仲介促進のモデル。コアポリアデニル化シグナルは二つの要素:AAUAAAヘキサヌクレオチドおよびG/Uリッチ要素からなり、これら二つの要素の間で開裂が起こる。
【0043】
パネルB.SV40遅延ポリアデニル化シグナルは上流エンハンサー(UE、a/k/aUSE)および下流エンハンサー(DSE)を含む。40ヌクレオチド長USEは、配列AUUGUPuAを有する3つのほぼ一の要素(矢印)から成る。USEはAAUAAAモチーフに対して−15から−54ヌクレオチドに位置する。
【0044】
パネルC.完全長HIV−1 LTRの模式的提示である。AAUAAA要素は、R/U5境界を定義する開裂/ポリアデニル化部位の19ヌクレオチド上流のR領域に位置する。G/Uリッチ配列はU5領域に位置する。内因性上流要素(UHE)は、AAUAAAモチーフの77−94ヌクレオチド上流のU3領域内に位置する。推定マイナー上流要素配列(UHEM)はAAUAAAシグナルの146−171ヌクレオチド上流に位置する。
【0045】
パネルD.自己不活性化(SIN)HIV−1 LTRの模式的提示。HIV−1コアポリアデニル化要素およびUHEはSIN−LTRにおいて保存され、U3領域内のプロモーターの395ヌクレオチド欠失により創生される。残りのU3配列は5'末端に38ヌクレオチドを含み、それはインテグラーゼ結合部位(att)および23ヌクレオチド領域を、18ヌクレオチド長UHEを含むU3の3'境界に含む(図7Aもまた参照)。
【0046】
図5.上流エンハンサー(UE)の例
ヒト免疫不全ウイルスタイプ1UHE(配列番号11);SV40 USE(配列番号1);ウマ感染性貧血ウイルスUE(配列番号2);カリフラワーモザイクウイルスUE(配列番号5);地リス肝炎ウイルスUGE(配列番号6);アデノウイルスL3 UE(配列番号8);ヒト補体C2 UE(配列番号9);ラミンB2 UE(配列番号10)。各UEの3'末端(枠内に示す)からAAUAAAシグナル(楕円として示す)までの距離を示す。
【0047】
図6.最少SINベクター
pCSOはレンチウイルス骨格を含むSINレトロウイルスベクターである。それはHIV−1ゲノムの2100ヌクレオチドを含む。pSCO−MPはpSCO由来であり、HIV−1配列は835ヌクレオチドに減少されている。RRE部位を含むenv配列が欠失しており、gag配列の長さがかなり減少している。全てのスプライス部位が欠失している。gagの1番目のコドンは停止コドン(L13X)に変異しており、中心ポリプリン・トラクト・セントラル停止配列(cPPT/CTS)を挿入し、逆転写の効率を増加させる。これらのベクターのヌクレオチド番号付けは、pNL4−3配列に基づく。
【0048】
図7A&7B.増強された転写終結構造を伴うSIN−LTRの操作
図7A.SIN−LTR−USE。SV40遅延ポリアデニル化シグナルの構造を黒背景で示す。SIN3'LTRの構造を白背景で示す。40ヌクレオチドSV40上流エンハンサー(USE)をatt部位とHIV LTR上流エンハンサー(UHE)の間に挿入した。
図7B.操作した転写終結構造を伴うSIN LTRの種々の立体配置の模式的提示。SV40遅延ポリアデニル化シグナルの構造を黒背景で示す。SIN3'LTRの構造を白背景で示す。地リス肝炎ウイルスの構造を斜線で示す。構築物SIN−LTR−UHEM、SIN−LTR−USEPおよびSIN−LTR−USEの構築物は、USE配列の挿入物または内因性推定UE配列を含む。SIN−LTR−UHEMはマイナーHIV−1推定UE(UHEM)の27ヌクレオチド挿入物を含む(短い黒矢印)。構築物SIN−LTR−USEは、3つの同一AUUUGUPuA要素から成る、SV40遅延ポリアデニル化シグナル由来の完全40ヌクレオチド長USEを含む(白矢印)。SIN−LTR−USEPは、二つのAUUUGUPuA要素を含む、USEの20ヌクレオチドセグメントを含む(白矢印)。構築物SIN−LTR−UGEは地リス完全ウイルス由来の完全56ヌクレオチド長UGE配列を含む。楕円はAAUAAAシグナルを意味する。小さい長方形はG/Uリッチダウンストリーム要素を示す。
【0049】
図8A&8B.転写終結効率の測定
図8A.多シストロン性発現構築物の模式図。
CMVはサイトメガロウイルスプロモーターを意味する。R lucはレニラルシフェラーゼコード配列を意味する。TTSは転写終結構造を意味する。IRESは内部リボザイム挿入部位を意味する。F lucはホタルルシフェラーゼコード配列を意味する。SVポリ(A)はSV40ポリアデニル化シグナルを示す。
図8B.転写終結活性
図7Aおよび7Bに示す操作した転写終結構造を有するSIN−LTRを、各々、多シストロン性発現構築物における二つのルシフェラーゼ遺伝子の間に、TTS部位で挿入する。構築物を293T細胞にトランスフェクトし、R lucおよびF lucの発現を測定する。R luc/F lucの比率が修飾SIN−LTRの効率/強度を反映する。
【0050】
図9.RAase保護アッセイによる3'ポリ(A)効率の分析のためのリボプローブの設計。
図は、標準SIN−LTR(例えば、ベクターpCSO、pCSO−MP)またはSIN−LTR−USE(例えば、ベクターpCSO−MP.USE)のいずれかを含む統合ベクターにおける配列の配置を示す。正常ポリ(A)/開裂部位の位置は3'R/U5境界である。特異的リボプローブを、全LTR領域、上流ポリプリントラクト(PPT)およびPPTに5'の36ヌクレオチド非関連ヌクレオチドの更なる範囲を含むために、各ベクターのために設計した。予期される保護フラグメントのサイズを示す。3'R/U5境界で正確に終結する転写物を、示すように、サイズの差異のために読み通し転写物から区別できる。
【0051】
図10.USE配列を含むベクターの力価
pCSO−MP、pCO−MP.USEP、pCSO−MP.USEまたはpCSO−MP.UGEベクターを含むウイルス粒子を、一過性トランスフェクションにより生成し、293T細胞で力価測定した。力価はml当たりの形質導入単位として示す。
【0052】
発明の詳細な説明
本発明のレトロウイルスベクター
本発明は、増強された3'転写終結構造を有するレトロウイルスベクターを提供する。本発明のベクターは、5'LTR、ポリアデニル化シグナルを含む3'LTR、およびパッケージングシグナルを有するレトロウイルスベクターゲノムを含む。レトロウイルスベクターゲノムは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーヴェー肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、脊髄増殖性肉腫ウイルス、乳癌ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ビスナウイルスを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ベクターは複製欠損のレトロウイルスベクターを含む。典型的に、このような欠損は1個以上のウイルス構造および複製機能(例えば、gag、pol、env)の変異および/または欠失のためである。したがって、本発明のベクターは当分野で既知の複製欠損レトロウイルスベクターに由来し得る。このようなベクターは:pCLのようなモロニーマウス白血病ウイルス(Naviaux et al., J Virol. 70:5701-5705 (1996))、G1XsvNA(Shubert et al., Curr. Eye Res. 16.656.662 (1997))およびpTIN414(Cannon et al., J Virol. 70:8234-40 (1996))のようなモロニーマウス白血病ウイルス;およびRCASBP−M2C(Zheng et al., J Virol. 73:6946-52 (1999))のようなトリ肉腫/白血病ウイルスに基づくレトロウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
【0053】
より好ましくは、本発明のベクターは:pHR'CMVlacZ、pHR'CMlacZ SIN18およびpRRLPGK−GFP(Zufferey et al., J. Virol. 72:9873-9880 (1998))、LL−CG、CL−CG、LS−CG、CS−CGおよびCL−G(Miyoshi et al., J. Virol. 72. 8150-8157 (1998))、pV653CMVβ−gal(Gasmi et al., J Virol 73:1828-1834 (1999))、pTV(Iwakuma et al., Virology 261:120-232 (1999))、pH3Z、pH4Z、pH5Z(Kim et al., Virol. 72:811-516))のようなHIV−1;HIV−2(Arya et a., Hum Gene Ther. 9:1371-80 (1998));pVG(Schnell et al., Hum Gene Ther 11:439-47 (2000))のようなサル免疫不全ウイルス;FIV−gal(Wang et al., J Clin Invest. 104:R55-62 (1999));、PTFIV(Johnston et al., J Virol 73:4991-5000 (1999));pONY2.10lacZ、pONY4.0Z(Mitrophanous et al., Gene Ther. 6:1808-18 (1999))のようなウマ感染性貧血ウイルスを含むが、これらに限定されない。
【0054】
最も好ましくは、本発明のベクターはpHR'CMVlacZ SIN18(Zufferey et al., J Virol. 72:9873-9880 (1988))、LS−CG、CS−CG(Miyosih et al., J. Virol. 72. 8150-8157 (1988))、SIN−W−PGK(Deglon et al., Hum Gene Ther. 11:179-190 (2000))、pVG(Schnell et al., Hum Gene Ther. 11:439-47 (2000))およびpTC(Iwakuma et al., Virology 261:120-132 (1999))に由来するSINレンチウイルスベクター由来である。
【0055】
ベクターの5'LTRは、非修飾レトロウイルス5LTRである。すなわち、天然5'LTRがレトロウイルスにそのまま存在する。好ましい実施態様において、5'LTRの内因性U3プロモーターが、変異および/または欠失により不活性化されており、異種プロモーターで置換されている。異種プロモーターの活性は構造的、誘導可能または標的細胞特異的(即ち、発現が1個のまたは数個の特異的細胞タイプに優勢であるか限定され、他の細胞には無いか少ない)であり得る。有用な異種プロモーターは、CMV(Miyoshi et al., J. Virol. 72:. 8150-8157 (1988))、ラウス肉腫ウイルスプロモーター(Dull et al., J Virol.72:8463-71 (1998))、テトラサイクリン誘導可能プロモーター(Hwang et al., J. Virol. 71:7128-31 (1997))を含むが、これらに限定されない。
【0056】
ベクターの3'LTRは非修飾レトロウイルス3'LTRであり得る。好ましい実施態様において、3'LTRのU3プロモーターは変異または欠失により不活性化されている。より好ましい実施態様において、このような不活性化はU3プロモーターに特異的である。即ち、不活性化は、att配列および任意の内因性UEのような3'LTRの他の構造に不利に働かない。最も好ましい実施態様において、プロモーターはHIV−1のpNL4−3株のほぼ9113から9506の残基に対応する領域において配列の変異または欠失により不活性化される。
【0057】
本発明のベクターは、3'LTRにおけるポリアデニル化シグナルと操作可能に結合した1個以上のUE配列を含み得る、増強された3'転写終結構造を有する。UE配列は異種UE配列または3'LTRに存在し得る任意の内因性UE配列の付加的複製であり得る。一つの実施態様において、3'転写終結構造は1個以上の異種UE配列を含む。他の実施態様において、3'転写終結構造は内因性UE配列の1個または数個の付加的複製を含む。更に別の実施態様において、3'転写終結構造は異種および内因性UE配列の付加的複製の両方を含む。
【0058】
本発明のベクターは更に、細菌および酵母のような微生物細胞におけるベクター配列の増幅に使用するための、複製の微生物起点および微生物スクリーニング可能または選択可能マーカーを含み得る。
【0059】
UEおよびその活性セグメント
本発明のベクターは任意のUEを含み得る。好ましくは、UEは真核生物またはウイルス遺伝子由来である。例示的ウイルスUEは、SV40ウイルス(例えばUSE)、カリフラワーモザイクウイルス、HIV−1(例えばUHE)、地リス肝炎ウイルス(例えばUGE)、またはウマ感染性貧血ウイルスUEのものを含むが、これらに限定されない(図5参照)。真核生物UEの例は、哺乳類補体C2およびラミンB2遺伝子のものを含むが、これらに限定されない(図5参照)。好ましい実施態様において、レトロウイルスベクターはSV40由来のUSEまたは地リス肝炎ウイルス由来のUGEを含む。
【0060】
本発明のベクターはまたUEの活性セグメントを含み得る。このようなセグメントは、例えば、転写読み通しアッセイを使用した、慣用の実験により決定し得る。例えば、このようなアッセイは、多シストロン性発現構築物によりコードされる二つのレポーターポリペプチドの相対的発現レベルを測定するためのシステムを含み、ここでレポーターポリペプチドのコード配列は転写終結構造および内部リボソーム挿入配列(IRES)により分離される。特に、発現構築物は5'から3'方向で以下の要素:宿主細胞中で活性な転写制御要素(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)、第1レポーターポリペプチドのコード配列、第1転写終結構造、内部リボソーム挿入配列(IRES)、第2レポーターのコード配列、および、所望により、第2転写終結構造を含み、ここで、第1転写終結構造はポリアデニル化シグナルを含む。このような構築物の模式図は図8Aに示す。
【0061】
構築物において使用する転写終結構造は、真核生物またはウイルス遺伝子の3'非翻訳領域を含み得る。好ましくは、3'非翻訳領域は内因性ポリアデニル化シグナルを含む。一つの実施態様において、転写終結構造はレトロウイルス3'LTRを含む。好ましい実施態様において、転写終結構造は修飾3'LTRを含み、ここでU3プロモーターは欠失または他の手段により不活性化される。より好ましい実施態様において、転写終結構造は、本発明のベクターに挿入する3'LTRを含む。
【0062】
UEセグメントの活性は、それを第1転写終結構造のポリアデニル化シグナルの上流に置き、その位置がその構造を通過する転写読み通しを減少させるかどうかを測定することにより測定し得る。挿入UEセグメントの3'LTRにおけるポリアデニル化シグナルに対する配向は、UEセグメントが由来する遺伝子におけるポリアデニル化シグナルに対するその配向と同じべきである。
【0063】
UEセグメントは、第1レポーターポリペプチドのコード配列と第1転写終結構造のポリアデニル化シグナルの間の領域のどこでも挿入し得る。好ましくは、セグメントはポリアデニル化シグナルの100ヌクレオチドより少ない上流に挿入する。最も好ましくは、セグメントはポリアデニル化シグナルの20ヌクレオチドより少ない上流に挿入する。
【0064】
読み通しアッセイは、発現構築物を含むDNAを哺乳類宿主細胞に当分野で既知の任意の方法を使用して送達することにより行ない得る。好ましくは、宿主細胞はレトロウイルスベクターの標的細胞として意図するものと同じ哺乳類種由来である。より好ましくは、宿主細胞はレトロウイルスベクターの標的細胞として意図するものと同じ種および組織タイプ由来である。より好ましくは、宿主細胞はレトロウイルスベクターの標的細胞として意図するものと同じである。
【0065】
読み通し活性は、両方のポリペプチドをコードするmRNAと、第1レポーターポリペプチドのみをコードするmRNAのレベルを比較することにより測定し得る。あるいは、活性は二つのレポーターポリペプチドの相対的レベルの比較により測定できる。
【0066】
本発明により、UEセグメントは“活性”であり、したがって、3'LTRポリアデニル化シグナルと操作可能に結合しているとき、それが読み通しを少なくとも約10%減少させるか、ベクター力価を少なくとも10%促進する場合、“UE配列”と見なす。本発明にしたがい、UE配列は少なくとも5ヌクレオチド長である。
【0067】
本発明のベクターを含み得るUEおよび活性UEセグメント(即ち、集合的にUE配列)の具体的な実施態様は、以下のものを含むが、これらに限定されない:
a)配列
TTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAA(配列番号1)を含むSV40由来のUE;およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはATTTGTGAまたはATTTGTAAを含む。
【0068】
b)配列
TTTGTGACGCGTTAAGTTCCTGTTTTTACAGTATTATAAGTACTTGTGTTCTGACAATT(配列番号2)を含むウマ感染性貧血ウイルスUE;およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはTTTGTまたはTGTTTTTまたはTTGTGTTを含む。
【0069】
c)配列
TGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGT(配列番号5)を含むカリフラワーモザイクウイルスUE;およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはTGTGTGAGTAGTT(配列番号3)またはTGTGTTGまたはTTAGTATGTATTTGTATTTGTA(配列番号4)を含む。
【0070】
d)配列
TCATGTATCTTTTTCACCTGTGCCTTGTTTTTGCCTGTGTTCCATGTCCTACTGTT(配列番号6)を含む地リス肝炎ウイルスUE(UGE);およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはTTTTT、またはTTGTTTTTGまたはTGTGTTを含む。
【0071】
e)配列
CCACTTCTTTTTGTCACTTGAAAAACATGTAAAAATAATGTACTAGGAGACACTTT(配列番号8)を含むアデノウイルスL3 UE;およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはTTCTTTTTGT(配列番号7)を含む。
【0072】
f)配列
CAGCTGCTTTTTGCCTGT(配列番号11)を含むHIV−1 UE(UHEとしても既知);およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはTTTTTを含む。
【0073】
g)配列
TTGACTTGACTCATGCTTGTTTCACTTTCACATGGAATTTCCCAGTTATGAAATT(配列番号9)を含む補体C2 UE;およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはTTGTTTまたはGTTATGを含む。
【0074】
h)配列
ATTCGGTTTTTAAGAAGATGCATGCCTAACGTGTTCTTTTTTTTTTCCAATGATTTGTAATATACATTTTATGACTGGAAACTTTTTT(配列番号10)を含むラミンB2 UE;およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはTTTTT、またはGTGTT、またはTTTGT、またはTTTTATGを含む。
【0075】
UE配列と3'LTRポリアデニル化シグナルの操作可能に結合
本発明のベクターは、3'LTRポリアデニル化シグナルに操作可能に結合した1個または数個のUE配列を含む。特に、操作可能に結合は、ベクター3'LTRの転写終結因子を促進するUE配列の取り込みを意味する。増強された転写終結を有するベクターは、種々の改善された特性を有し得る。可能性ある改善は、フランキングベクターまたは宿主配列への減少した転写読み通し;ベクターRNAおよび/またはベクターコードポリペプチドの増加した製造;およびプロデューサー細胞における高いベクター力価を含む。本発明により、UE配列は、取りこみが任意のこれらの特性の約10%以上の改善に影響する場合、3'LTRポリアデニル化シグナルと操作可能に結合する。
【0076】
UE配列は、シグナルの5'上流であるベクター部位に配列を挿入することにより3'LTRポリアデニル化シグナルと操作可能に結合し得る。挿入UE配列のポリアデニル化シグナルに対する配向は、配列が由来する遺伝子におけるポリアデニル化シグナルに対する配向と同じでなければならない。
【0077】
好ましくは、挿入部位は、対照として非修飾ベクターを使用して、シグナルの約500ヌクレオチドより少ない上流である。より好ましくは、部位は約100ヌクレオチドより少ない上流である。より更に好ましくは、部位は約50ヌクレオチドより少ない上流である。
【0078】
特に好ましい実施態様において、挿入は3'LTRのU3領域における部位である。更に好ましい実施態様において、このような部位はatt配列とU3領域に存在し得る任意の内因性UE配列の間である。より更に好ましい実施態様において、att配列と、U3プロモーター構造のいくつかまたは全てを含むUE配列の間の3'LTR配列は欠失し、UE配列が欠失部位に挿入される。最も好ましい実施態様において、このような欠失は、HIV−1のpNL4−3株の約9113から9506残基に対応する領域に伸び、UE配列が欠失部位に挿入される。
【0079】
複数のUE配列を含むベクター
本発明のベクターは、3'LTRポリアデニル化シグナルと操作可能に結合した複数のUE配列を含む。本発明は、複数のUE配列の可能性のある組合せ全てを含むベクターを意図する。組み合わせの例は;2個以上の異種UE配列が同一または同じUE由来である;異なるUEに由来する2個以上の異種UE配列;同じ内因性UEの2個以上の複製、異なる内因性UE配列の2個以上の複製;1個以上の異種UE配列と1個以上の内因性UE配列の付加的複製を含むが、これらに限定されない。
【0080】
異種遺伝子およびコード配列
本発明のベクターは哺乳類細胞および生物における所望の遺伝子産物の発現に有利に使用し得る。したがって、ベクターは更に1個以上の異種コード配列を含み得、ここでこのような配列はベクターが由来するレトロウイルスゲノム以外の源由来である。
【0081】
一つの実施態様において、異種コード配列をレトロウイルス骨格に、好ましくは、5'および3'LTRの間に、それらが5'LTRプロモーターと操作可能に結合するように挿入する。このような挿入物が異種コード配列を含む多シストロン性mRNAの製造を導く場合、また各配列の効率的な翻訳を達成するために各異種コード配列とIRESを操作可能に結合するのも有利であり得る。
【0082】
他の実施態様において、異種コード配列は、個々のプロモーターと各々操作可能に結合し、発現構築物を形成し、このような構築物をレトロウイルス骨格に、好ましくは、5'および3'LTRの間に挿入する。発現構築物は、構造的、誘導可能、組織特異的、または細胞サイクル特異的であるプロモーターを含み得る。有用なプロモーターの例は、SV40プロモーター、CMVプロモーター、アデノウイルスプロモーター、B19パルボウイルスプロモーター、ヒストンプロモーター、pol IIIプロモーターおよびベータ−アクチンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【0083】
別種の遺伝子生成物を、本発明のベクターを使用して発現し得る。それらはポリペプチド、構造RNA、アンチセンスRNAおよびリボザイムを含む。一つの実施態様において、本発明のベクターは治療的ポリペプチドをコードする1個以上の異種配列を含み、発現する。治療的ポリペプチドの例は、サイトカイン、成長因子、ホルモン、キナーゼ、レセプター、レセプターリガンド、酵素、抗体ポリペプチド、転写因子、血液因子および前記の任意の人工誘導体を含む。
【0084】
他の実施態様において、本発明のベクターは陰性選択可能マーカーをコードする1個以上の異種配列を含み、発現する。陰性選択可能マーカーは、宿主細胞を直接的または間接的に阻害するまたは殺す細胞毒素であり得る。“直接”細胞毒素の例は、コレラの活性部分およびボツリヌス毒素を含む。好ましい実施態様において、本発明のベクターは間接細胞毒素をコードする1種以上の異種配列を含み、発現する。間接細胞毒素は、それ自体は毒性ではないが、他の作動物質との相互作用により細胞性阻害を達成する。例は、非毒性であるが、ガンシクロビルのような薬剤を哺乳類細胞を殺す毒性ヌクレオチドに活性化できるHSV−チミジンキナーゼ(TK)である。
【0085】
ベクター粒子
本発明のベクターを含む感染性レトロウイルス粒子は、当分野で既知の方法により製造し得る。例えば、ベクター粒子は、Gag/PolおよびEnvタンパク質のような必要なレトロウイルス複製機能をトランスで発現するパッケージング細胞をトランスフェクトすることにより製造できる。GagおよびPolはウイルス構造をおよび酵素要素を提供し、Envはベクター粒子を標的細胞に向けるために機能する。Env機能は任意のレトロウイルスまたは、他の包含されたタンパク質(例えば、VSV Gタンパク質)または特異的細胞表面レセプターを結合する任意の分子由来の、融合またはスパイクタンパク質を含むことができる。
【0086】
本発明の感染性ベクター粒子は哺乳類細胞および生物中で異種コード配列の発現に使用し得る。一つの実施態様において、異種コード配列を含む感染性ベクター粒子の有効な投与量を、直接哺乳類生物に投与し、生物内で標的細胞の形質導入を達成する。他の実施態様において、哺乳類細胞を、このようなベクター粒子でインビトロで形質導入し、形質導入細胞をついでインビボで宿主に投与する。好ましくは、本発明の感染性ベクター粒子は、霊長類および霊長類細胞に異種コード配列を発現するために使用する。より好ましくは、本発明のベクター粒子はヒトおよびヒト細胞に異種コード配列を発現するために使用する。
【0087】
実施例
導入
本実施例は3'LTRに非常に効率的な転写終結構造を有する新規レトロウイルスベクターの構築を証明する。これは、SV40遅延ポリアデニル化シグナルに由来するUSE配列の、自己不活性化(SIN)レンチウイルスベクターの3'LTR U3領域への挿入により達成された。逆転写の間、3'LTR U3領域は、両方のLTRに複製され、統合ベクターの5'および3'LTRの両方がこのUSE−SIN配置となるようにする。新規LTR構造を含むベクターは、増強されたポリアデニル化効率、統合プロウイルスからの減少した読み通し転写、および親SINレトロウイルスベクターpCSO−MPと比較した場合、少なくとも2倍増加したベクター力価を有する。
【0088】
方法および結果
レトロウイルスベクター
親SINベクターpCSO−MPは、レンチウイルス骨格を含み、先に記載のものと類似のpCSOのような関与のSINベクターよりも改善されている(Miyoshi et al., J. Virol. 72:8250-7 (1988))(図6)。pCSOは、HIV−1ゲノム配列の2100ヌクレオチドを含む。pCSO−MPにおいて、HIV−1配列は835ヌクレオチドまで減少されている。先に記載のSINベクターと比較したこのベクターの重要な性質は、全てのHIV−1スプライス部位のおよびenv配列の欠失、gagオープンリーディングフレームの量の著しい減少およびpCSO−MPへの中心ポリプリントラクト/中心終結配列(cPPT/CTS)の挿入である(図6)。これらの修飾は、ベクターとパッケージング要素をコードする配列の相同配列重複の程度を非常に減少させ、それにより相同組換えを介した複製コンピテントレトロウイルス(RCR)の生成の危険性を減少させ、最適ベクター機能は維持されている。種々の転写終結構築物を含むpCSO−MPの誘導体が製造され、その特性が試験されている。
【0089】
転写終結構築物
種々のUE配列で修飾されたSIN−LTRを含む数個の転写終結構築物が、標準組換えDNA法を使用して製造され、試みられている。一つの構築物SIN−LTR−USEは、3つのコアAUUUGUPuA要素を有するSV40の完全USEを含む40ヌクレオチド配列を含む。他の構築物SIN−LTR−USEPは、二つのコア要素のみを含む部分的USEを含む。第3の構築物SIN−LTR−UHEMは、配列TTTCCGCTGGGACTTT(配列番号12)(UHEM)を有するHIV−1推定マイナーポリアデニル化エンハンサーを含む。第4の構築物SIN−LTR−UGEは地リスB型肝炎ウイルス由来の完全56ヌクレオチド長UGE配列を含む。各構築物において、UE配列は、pCSO−MPの3'LTRの統合接合部位(Masuda et al., J. Virol. 72:8396-8402 (1998))と内因性HIV−1上流エンハンサー(UHE)(Valsamakis et al., Mol. Cell Biol. 12:3699-3705 (1992))の間に挿入する。これらの挿入は、SIN−LTRのU3領域におけるattとUHEの結合部におけるXho I制限部位の操作により促進される。これらの構築物の構造は図7Aおよび7Bに示す。
【0090】
転写読み通しアッセイ
これらの転写終結構築物の活性は、図8Aに示す多シストロン性発現カセットに基づく転写読み通しアッセイを使用して評価する。転写終結構築物は二つのレポーター遺伝子、レニラルシフェラーゼ(R luc)およびホタルルシフェラーゼ(F luc)の間に挿入し、R lucおよびF luc活性の量を、発現カセットを含むプラスミドの293T細胞へのトランスフェクションに続いて測定する。R lucおよびF luc活性は、ルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を使用して測定する。発現カセット中の内部リボソーム挿入部位(IRES)配列の存在は、mRNA上で第2コード配列であってさえ、F luc発現を可能にする。この配置において、F lucの発現は転写が挿入構築物により終結する効率と逆相関する。加えて、第1レポーター遺伝子、R lucの発現レベルはmRNAの全体的安定性/翻訳可能性を反映し、それはまた挿入構築物の強度により影響される。一緒に考えて、挿入終結構築物のこれら二つの異なる効果は、二つのルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現の比率の変化を組み合わる。構築物の活性は、発現されたR luc:F lucの比率におけるそれらの効果に基づいて比較できる(即ち、高い比率を有する構築物は、低い比率を有する構築物と比較して増強された終結活性を有する)。
【0091】
前記のアッセイは、SIN−LTR−USEにおける転写終結構造が、天然HIV−1 LTRまたは既知の最強のシグナルの一つであると考えられる野生型SV40遅延ポリアデニル化シグナルよりさえ、強いポリアデニル化シグナルである。完全USEの付加はSIN−LTRのポリアデニル化強度を約3倍増加させ、一方SIN−LTR−USEPへの2個のUSEのAUUUGUPuA要素の付加は、約2倍ポリアデニル化強度を増強する。HIV−1推定マイナーエンハンサー(SIN−LTR−UHEM)の付加はポリアデニル化効率を減少させる。これらの結果を図8に要約する。
【0092】
RNase保護アッセイ
RNase保護アッセイを、LTRに異なる転写終結構造を有する種々のSIN由来ベクターに関する正確に終結したベクター転写物対読み通し転写物の比率の分析に使用する。標識RNAプローブを各ベクター3'LTR配置(図9)に関して製造し、種々のベクターを含む293T細胞集団におけるベクター由来転写物のプローブに使用する。これらのアッセイは、ベクターpCSO−MPにおけるSIN−LTRポリアデニル化シグナルが、ほぼ同じ効率で正確にポリアデニル化および読み通し転写物の両方を生成することを示す。対照的に、USEまたはUSEP要素のSIN−LTRへのattおよびUHE境界への挿入は、正確なポリアデニル化部位の量を実質的に増加させ、読み通し転写物の量を対応して減少させる。(データは示していない)
【0093】
ベクター力価
完全および部分的USEおよび完全UGEを、ベクターpSCO−MPの3'LTRに挿入し、ベクターpCSO−MP.USE、pCSO−MP.USEPおよびpCSO−MP.UGEをそれぞれ創生する。ベクター粒子は、記載のように、これらのベクターを含むプラスミドと、複製ヘルパープラスミドpCMV△R8.71およびpMD.Gの293T細胞への共トランスフェクションにより生成する(Naldini et al., Science 272:263-267 (1996))。トランスフェクト細胞から製造したベクター上清は、293T細胞で力価測定する。これらの分析は、ベクターpCSO−MP.USEが標準SIN−LTRベクターであるpCSO−MPよりも少なくとも2倍高いベクター力価を提供することを示す(図10)。ベクター力価を増加させる能力は、ベクターpCSO−MP.USE中のUGEが約2倍までベクター力価を増加させるため、USEの特性だけではない。mRNAの高い定常状態レベルは強いポリアデニル化シグナルによる処理に起因することが知られている。したがって、3'SIN−LTR−USEまたは3'SIN−LTR−UGE配置は、プロデューサー細胞においてベクター転写物に高い安定性を付与し、それは高いベクター力価をもたらす。
【0094】
本発明は本明細書に記載の具体的実施態様により範囲を限定するものではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて種々の修飾が、前記および添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。このような修飾は特許請求の範囲の範囲内にあると解釈する。
【0095】
種々の刊行物を本明細書で引用し、その記載はその全体を出典明示により本明細書に包含させる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 レトロウイルスゲノム構成
パネルA.単純C型レトロウイルスの基本的構成を示す。長い末端反復(LTR)は、各々5'および3'LTRを優勢に使用するプロモーターおよびポリアデニル化配列を含む。完全長およびスプライスした転写物の両方を製造し、これらは3つの主用タンパク質をコードする;GagおよびGag−Polは完全長転写物からの翻訳であり、envはスプライスされた転写物からの翻訳物である。完全長転写物はまたRNAゲノムとして働く。ゲノムの5'領域に、ゲノムをウイルス粒子に統合するのに必要なパッケージングシグナル(Ψ)である。SD、スプライスドナー;SA、スプライスアクセプター。
パネルB.LTRは、U3、RおよびU5と名付けられる3つの領域を含む。プロモーターおよびエンハンサー配列は5'LTRでのみ活性であり、U3領域に位置し、一方3'LTRはR/U5境界を定義する。LTRの末端のatt配列は統合に必要である。
【図2】 複製欠損レトロウイルスベクター粒子の製造
野生型レトロウイルス、パッケージングヘルパー構築物および複製欠損レトロウイルスのゲノムは、各々図面の上段、中段および下段に示すとおりである。パッケージングヘルパー構築物は、全てのウイルスタンパク質を、ウイルスタンパク質をコードしないが、パッケージングおよび統合のための必要なシス要素の全てを保持するベクターゲノムに対してトランスに提供する。パッケージングヘルパー構築物からのパッケージングシグナルの欠失は、ベクター粒子へのその統合を防止する。
【図3】 レトロウイルスベクター設計の改善
パネルA.分けたパッケージングヘルパー構築物。Gag−PolおよびEnvタンパク質をコードする配列を、二つの異なるプラスミドに分け、異種融合タンパク質(例えばVSV Gタンパク質の使用により安全性を更に増加させる。発現は、非LTRプロモーター(例えば、ヒトCMVプロモーター)の使用を介してパッケージングヘルパーから最大化される。
パネルB.SINベクター。5'LTRのU3プロモーター配列をCMVプロモーターで置き換え、3'LTRのU3プロモーターを欠失により最少にする。逆転写に続いて、欠失U3配列(△U3)をプロウイルスの5'および3'LTRの両方に複製し、統合ベクター5'LTRからの非常に減少したプロモーター活性をもたらす。これは、自己不活性化(SIN)ウイルスの基礎である。
【図4】 ポリアデニル化シグナル:上流エンハンサー(UE)の役割
パネルA.ポリアデニル化効率のUE仲介促進のモデル。コアポリアデニル化シグナルは二つの要素:AAUAAAヘキサヌクレオチドおよびG/Uリッチ要素からなり、これら二つの要素の間で開裂が起こる。
パネルB.SV40遅延ポリアデニル化シグナルは上流エンハンサー(UE、a/k/aUSE)および下流エンハンサー(DSE)を含む。40ヌクレオチド長USEは、配列AUUGUPuAを有する3つのほぼ一の要素(矢印)から成る。USEはAAUAAAモチーフに対して−15から−54ヌクレオチドに位置する。
パネルC.完全長HIV−1 LTRの模式的提示である。AAUAAA要素は、R/U5境界を定義する開裂/ポリアデニル化部位の19ヌクレオチド上流のR領域に位置する。G/Uリッチ配列はU5領域に位置する。内因性上流要素(UHE)は、AAUAAAモチーフの77−94ヌクレオチド上流のU3領域内に位置する。推定マイナー上流要素配列(UHEM)はAAUAAAシグナルの146−171ヌクレオチド上流に位置する。
パネルD.自己不活性化(SIN)HIV−1 LTRの模式的提示。HIV−1コアポリアデニル化要素およびUHEはSIN−LTRにおいて保存され、U3領域内のプロモーターの395ヌクレオチド欠失により創生される。残りのU3配列は5'末端に38ヌクレオチドを含み、それはインテグラーゼ結合部位(att)および23ヌクレオチド領域を、18ヌクレオチド長UHEを含むU3の3'境界に含む(図7Aもまた参照)。
【図5】 上流エンハンサー(UE)の例
ヒト免疫不全ウイルスタイプ1UHE(配列番号11);SV40 USE(配列番号1);ウマ感染性貧血ウイルスUE(配列番号2);カリフラワーモザイクウイルスUE(配列番号5);地リス肝炎ウイルスUGE(配列番号6);アデノウイルスL3 UE(配列番号8);ヒト補体C2 UE(配列番号9);ラミンB2 UE(配列番号10)。各UEの3'末端(枠内に示す)からAAUAAAシグナル(楕円として示す)までの距離を示す。
【図6】 最少SINベクター
pCSOはレンチウイルス骨格を含むSINレトロウイルスベクターである。それはHIV−1ゲノムの2100ヌクレオチドを含む。pSCO−MPはpSCO由来であり、HIV−1配列は835ヌクレオチドに減少されている。RRE部位を含むenv配列が欠失しており、gag配列の長さがかなり減少している。全てのスプライス部位が欠失している。gagの1番目のコドンは停止コドン(L13X)に変異しており、中心ポリプリン・トラクト・セントラル停止配列(cPPT/CTS)を挿入し、逆転写の効率を増加させる。これらのベクターのヌクレオチド番号付けは、pNL4−3配列に基づく。
【図7】 増強された転写終結構造を伴うSIN−LTRの操作
図7A.SIN−LTR−USE。SV40遅延ポリアデニル化シグナルの構造を黒背景で示す。SIN3'LTRの構造を白背景で示す。40ヌクレオチドSV40上流エンハンサー(USE)をatt部位とHIV LTR上流エンハンサー(UHE)の間に挿入した。
図7B.操作した転写終結構造を伴うSIN LTRの種々の立体配置の模式的提示。SV40遅延ポリアデニル化シグナルの構造を黒背景で示す。SIN3'LTRの構造を白背景で示す。地リス肝炎ウイルスの構造を斜線で示す。構築物SIN−LTR−UHEM、SIN−LTR−USEPおよびSIN−LTR−USEの構築物は、USE配列の挿入物または内因性推定UE配列を含む。SIN−LTR−UHEMはマイナーHIV−1推定UE(UHEM)の27ヌクレオチド挿入物を含む(短い黒矢印)。構築物SIN−LTR−USEは、3つの同一AUUUGUPuA要素から成る、SV40遅延ポリアデニル化シグナル由来の完全40ヌクレオチド長USEを含む(白矢印)。SIN−LTR−USEPは、二つのAUUUGUPuA要素を含む、USEの20ヌクレオチドセグメントを含む(白矢印)。構築物SIN−LTR−UGEは地リス完全ウイルス由来の完全56ヌクレオチド長UGE配列を含む。楕円はAAUAAAシグナルを意味する。小さい長方形はG/Uリッチダウンストリーム要素を示す。
【図8】 転写終結効率の測定
図8A.多シストロン性発現構築物の模式図。
CMVはサイトメガロウイルスプロモーターを意味する。R lucはレニラルシフェラーゼコード配列を意味する。TTSは転写終結構造を意味する。IRESは内部リボザイム挿入部位を意味する。F lucはホタルルシフェラーゼコード配列を意味する。SVポリ(A)はSV40ポリアデニル化シグナルを示す。
図8B.転写終結活性
図7Aおよび7Bに示す操作した転写終結構造を有するSIN−LTRを、各々、多シストロン性発現構築物における二つのルシフェラーゼ遺伝子の間に、TTS部位で挿入する。構築物を293T細胞にトランスフェクトし、R lucおよびF lucの発現を測定する。R luc/F lucの比率が修飾SIN−LTRの効率/強度を反映する。
【図9】 RAase保護アッセイによる3'ポリ(A)効率の分析のためのリボプローブの設計。
図は、標準SIN−LTR(例えば、ベクターpCSO、pCSO−MP)またはSIN−LTR−USE(例えば、ベクターpCSO−MP.USE)のいずれかを含む統合ベクターにおける配列の配置を示す。正常ポリ(A)/開裂部位の位置は3'R/U5境界である。特異的リボプローブを、全LTR領域、上流ポリプリントラクト(PPT)およびPPTに5'の36ヌクレオチド非関連ヌクレオチドの更なる範囲のを含むために、各ベクターのために設計した。予期される保護フラグメントのサイズを示す。3'R/U5境界で正確に終結する転写物を、示すように、サイズの差異のために読み通し転写物から区別できる。
【図10】 USE配列を含むベクターの力価
pCSO−MP、pCO−MP.USEP、pCSO−MP.USEまたはpCSO−MP.UGEベクターを含むウイルス粒子を、一過性トランスフェクションにより生成し、293T細胞で力価測定した。力価はml当たりの形質導入単位として示す。
Claims (44)
- a)5'LTR;および
b)ポリアデニル化シグナルならびに該ポリアデニル化シグナルと操作可能に結合している配列番号1−11およびその活性断片からなる群から選択される1個またはそれ以上の異種上流エンハンサー(UE)配列を含む3'LTR
を含む、レトロウイルスベクター。 - 数個の異種UE配列を含み、少なくともその二つが同じUEに由来する、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 数個の異種UE配列を含み、少なくともその二つが異なるUEに由来する、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 数個の内因性UE配列の付加的複製を含み、少なくともその二つの複製が同一配列を有する、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 数個の内因性UE配列の付加的複製を含み、少なくともその二つの複製が異なる配列を有する、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 該異種UE配列、または該異種UE配列の少なくとも一つ、または内因性UE配列の該付加的複製、または内因性UE配列の該付加的複製の少なくとも一つが、該3'LTRにある、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 該異種UE配列、または該異種UE配列の少なくとも一つ、または内因性UE配列の該付加的複製、または内因性UE配列の該付加的複製の少なくとも一つが、該3'LTRのU3領域にある、請求項6に記載のレトロウイルスベクター。
- 該3'LTRが機能的U3プロモーターを有しない、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 該3'LTRがU3プロモーターの欠失を含む、請求項8に記載のレトロウイルスベクター。
- 該異種UE配列、または該異種UE配列の少なくとも一つ、または内因性UE配列の該付加的複製、または内因性UE配列の該付加的複製の少なくとも一つが、U3プロモーター欠失部位にある、請求項9に記載のレトロウイルスベクター。
- 該異種UE配列または該異種UE配列の少なくとも一つがウイルスUE配列である、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 該ウイルスUE配列がSV40、カリフラワーモザイクウイルス、HIV−1、地リス肝炎ウイルスまたはウマ感染性貧血ウイルスUE配列である、請求項11に記載のレトロウイルスベクター。
- 該ウイルスUE配列がATTTGTGAまたはATTTGTAAを含むSV40 UE配列である、請求項12に記載のレトロウイルスベクター。
- 該SV40 UE配列がTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAA(配列番号1)を含む、請求項13に記載のレトロウイルスベクター。
- 該異種UE配列または該異種UE配列の少なくとも一つが動物UE配列である、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 該動物UE配列が補体C2またはラミンB2 UE配列である、請求項15に記載のレトロウイルスベクター。
- レンチウイルス配列を含む、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 該3'LTRがさらに追加の内因性UE配列を含む、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 該5'LTRがU3領域に挿入された異種プロモーターを含む、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 5'LTRが内因性U3プロモーター配列の欠失を含む、請求項19に記載のレトロウイルスベクター。
- 該5'LTRの3'下流であり、該3'LTRの5'上流である異種コード配列を含む、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 該異種コード配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求項21に記載のレトロウイルスベクター。
- 該異種コード配列が陰性選択マーカーをコードする、請求項21に記載のレトロウイルスベクター。
- 請求項1に記載のレトロウイルスベクターを含む、細胞。
- 哺乳類細胞である、請求項24に記載の細胞。
- ヒト細胞である、請求項25に記載の細胞。
- 請求項1に記載のレトロウイルスベクター由来のプロウイルス配列を含む、細胞。
- 哺乳類細胞である、請求項27に記載の細胞。
- ヒト細胞である、請求項28に記載の細胞。
- 細胞がプロデューサー細胞である、請求項26に記載の細胞により製造された感染性レトロウイルス粒子。
- 細胞における異種コード配列の発現用医薬の製造のための請求項21に記載のレトロウイルスベクターの使用。
- 異種コード配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求項31に記載の使用。
- 該異種コード配列が陰性選択マーカーをコードする、請求項31に記載の使用。
- 細胞における異種コード配列の発現用医薬の製造のための請求項21に記載のレトロウイルスベクターを含む感染性レトロウイルス粒子の使用。
- 異種コード配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求項34に記載の使用。
- 該異種コード配列が陰性選択マーカーをコードする、請求項34に記載の使用。
- 被験体における異種コード配列の発現用医薬の製造のための請求項21に記載のレトロウイルスベクターを含む感染性レトロウイルス粒子の使用。
- 異種コード配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求項37に記載の使用。
- 該異種コード配列が陰性選択マーカーをコードする、請求項38に記載の使用。
- 該被検体が哺乳類である、請求項39に記載の使用。
- 該被検体がヒトである、請求項40に記載の使用。
- 被験体における異種コード配列の発現用医薬の製造のための請求項24に記載の細胞を含む組成物の使用。
- 該被検体が哺乳類である、請求項42に記載の使用。
- 該被検体がヒトである、請求項43に記載の使用。
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