CN102443604B

CN102443604B - 一种安全性慢病毒载体及其应用

Info

Publication number: CN102443604B
Application number: CN201110385219.4A
Authority: CN
Inventors: 曾溢滔; 方彧聃; 张敬之
Original assignee: Shanghai City Children Hospital
Current assignee: Shanghai City Children Hospital
Priority date: 2011-11-25
Filing date: 2011-11-25
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2031-11-25
Also published as: CN102443604A

Abstract

本发明公开了一种安全性慢病毒载体及其应用。本慢病毒载体携带了整合酶Cre基因表达盒，并且在3’LTR的U3区含有LoxP位点序列，在U3区中并在LoxP位点的下游含有用于导入外源基因的限制性酶切位点。本慢病毒载体介导基因转移，所产生的假病毒在整合后发生“自杀效应”，将大部分慢病毒基本骨架删除，消除了发生重组相适应性病毒(LCV)存在的可能性。并且本发明的慢病毒载体通读率降低，进一步提高了安全性。本安全性慢病毒载体可以应用于基因克隆或表达，特别是在基因治疗，由本发明的慢病毒载体介导转基因具有更高的安全性。

Description

一种安全性慢病毒载体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种安全性慢病毒载体及其应用。

背景技术

β地中海贫血(简称β地贫)是一类由于血红蛋白(HbA)生成障碍导致的遗传性疾病。HbA生成过程中βHb合成受到抑制，破坏了血红蛋白两类亚基的平衡状态，相对过剩的αHb在红细胞内产生毒性沉积导致溶血性贫血。针对β地贫的发病环节，王宝斌等构建了可专一性地结合游离αHb的α血红蛋白稳定蛋白(AHSP)基因表达载体并将其导入β654地贫小鼠体内，以期阻止过剩的αHb产生毒性沉积。通过分子生物学、生物化学、病理学和血液学等技术手段检测小鼠后发现其地贫表型有所改善(Transgenic Humanα-Hemoglobin Stabilizing Protein Could PartiallyRelieve β^IVS-2-654-Thalassemia Syndrome in Model Mice.Human Gene Therapy.201 0 February，21(2)：149-156.)。

这是一个利用慢病毒介导方式治疗血液性疾病的成功范例。但是要将该慢病毒载体真正用于临床治疗，还需要解决一些安全性的问题。①尽管人们已经花了大量精力使慢病毒载体很安全(最低限度保留了约5％的原HIV序列，使之难以形成重组相适应性病毒)，但仍不能保证残留的序列不会对人体产生危害。②HIV具有强有力polyA断裂加尾功能，但是经过删减后的ΔU3的慢病毒载体却会出现“通读”(Readthrough)，转录下游基因，造成安全隐患(Anne-Kathrin Zaiss et al.，(2002).RNA 3’Readthrough ofOncoretrovirus and Lentivirus：Implications for Vector Safety and Efficacy.Journal of Virology.July；76(14)：7209-19.)。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前的慢病毒载体具有安全隐患的不足，提供一种安全性高的慢病毒载体。

本发明的解决上述技术问题的技术方案如下。

本发明的技术方案之一是：一种安全性慢病毒载体，该慢病毒载体携带了整合酶Cre基因表达盒，并且在3’LTR的U3区含有LoxP位点序列，在U3区中并在LoxP位点的下游含有用于导入外源基因的限制性酶切位点。

其中，整合酶Cre表达盒在慢病毒载体的位置是任何位置，只要不影响慢病毒载体的其他功能即可。较佳的如在慢病毒载体FUGW中为原GFP(荧光蛋白)的位置，将原GFP基因替换为整合酶Cre基因，仍然使用原来的表达元件即可。所述的整合酶Cre基因是常规的，较佳的其序列如SEQID NO：2所示。LoxP在U3区的位置可以是任何位置，较佳的是U3区的两个EcoRV酶切位点之间。所述的LoxP位点序列是常规的，较佳的其序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

优选的，本发明的安全性慢病毒载体进一步在3’LTR的U3区含有cHS4的400bp核心序列和SV40的2×USE两种元件中的任何一种或两种。这可以使载体的通读率下降。

本发明中，所含片段优选反向接入的cHS4元件和/或正向接入的2×USE元件。更优选反向接入的cHS4元件和正向接入的2×USE元件叠加。最优选5’方向至3’方向依次是反向接入的cHS4元件和正向接入的2×USE元件。cHS4反向和2×USE正向相连接入到3’LTR的U3区两个EcoRV位点之间，通读率降低效果最为明显。

本发明中，所述的cHS4的400bp核心序列为常规，较佳的是序列表中SEQ ID NO：3所示的序列。所述的SV40的2×USE是指2个串联的USE元件，为常规，较佳的是序列表中SEQ ID NO：4所示的序列。

本发明中，所述的cHS4的400bp核心序列和/或SV40的2×USE在U3区的位置可以是任何位置，较佳的是在U3区中并在LoxP位点序列的下游。

本发明中，所述的慢病毒载体可以是现有的任何慢病毒载体，较佳的是慢病毒载体FUGW。本发明的方法对所有3’LTR都有作用，对FUGW的3’LTR效果最佳。

本发明的一较佳实施方式为：一种安全性慢病毒载体，是改良的FUGW慢病毒载体，在出发慢病毒载体FUGW的3’LTR的U3区含有LoxP位点序列，将GFP基因替换为整合酶Cre基因，并且在U3区中LoxP位点的下游含有cHS4的400bp核心序列和SV40的2×USE两种元件中的任何一种或两种。更佳的，在U3区中LoxP位点的下游构建了一个用于导入外源基因的限制性酶切位点。根据慢病毒载体FUGW全序列，该限制性酶切位点优选Nhe I酶切位点。Nhe I酶切位点在改良了的慢病毒载体FUGW中没有第二个，因此有利于外源基因的插入。

本发明的技术方案之二是：一种上述安全性慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤，

1)构建携带了整合酶Cre基因表达盒，并且在3’LTR的U3区插入了LoxP位点序列得慢病毒载体；

2)在U3区中LoxP位点的下游位置插入cHS4的400bp核心序列和/或SV40的2×USE；

3)在U3区中LoxP位点的下游位置引入用于插入外源基因的酶切位点。

步骤3)所述的用于插入外源基因的酶切位点只要是在U3区中并在LoxP位点的下游且在cHS4的400bp核心序列和/或SV40的2×USE的上游。

本发明的一较佳实施方式为：一种安全性慢病毒载体的制备方法，是对FUGW慢病毒载体的改良，包括

在出发慢病毒载体FUGW的3’LTR的U3区插入LoxP位点序列，将GFP基因替换为整合酶Cre基因；

在LoxP位点后引入Nhe I酶切位点；

在Nhe I酶切位点插入cHS4的400bp核心序列或2×USE，

在cHS4的400bp核心序列或2×USE前后(或后前)各引入Nhe I酶切位点和EcoR V酶切位点；

在EcoR V酶切位点插入的2×USE。

本发明解决上述技术问题的技术方案之三是：一种携带外源基因的重组慢病毒载体，该慢病毒载体携带了整合酶Cre基因表达盒，并且在3’LTR的U3区含有LoxP位点序列，在U3区中并在LoxP位点的下游含有外源基因。

所述的外源基因是任何需要转移的基因，优选如AHSP基因。

本发明的一较佳实施方式为：所述安全性慢病毒载体是改良的慢病毒载体FUGW，在Nhe I酶切位点插入了外源基因AHSP。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

本发明所述的安全性慢病毒载体可以应用于基因克隆或表达。特别是在基因治疗，由本发明的慢病毒载体介导转基因具有更高的安全性。本发明的慢病毒载体介导基因，所产生的假病毒在整合后发生“自杀效应”，将大部分慢病毒基本骨架删除，进一步消除其发生重组相适应性病毒(LCV)存在的可能性。仅仅留下一个完整的LTR和所要被整合到染色体的表达元件。通过这种方法使慢病毒载体在用于人类基因治疗方面又迈出了一大步。并且本发明的慢病毒载体通读率降低，进一步提高了安全性。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是载体FW-AHSP的构建图。

图2是载体FCLA的构建图。

图3是载体FCLAC(-)U(+)的构建图。

图4是慢病毒通读示意图。

图5是安全性慢病毒载体感染细胞后发生自删除的示意图。

图6是用双重PCR方法鉴定Cre的自删除过程的PCR产物电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种安全性慢病毒载体，该慢病毒载体携带了整合酶Cre基因表达盒，并且在3’LTR的U3区含有LoxP位点序列，在U3区中并在LoxP位点的下游含有用于导入外源基因的限制性酶切位点。慢病毒在反转录过程中3’U3跃迁至5’端，5’U5跃迁至3’端，最后会在原病毒形成两个相同LTR。而两个LoxP位点之间的序列在整合酶Cre的作用下会被删除。因此，本发明提供的慢病毒载体在反转录过程中会形成两个LoxP位点，这两个LoxP位点的序列即大部分的慢病毒载体的骨架序列会被删除，从而大大降低慢病毒发生重组产生适应性病毒(LCV)的可能性。本发明的慢病毒载体在3’LTR的U3区还进一步含有cHS4的400bp核心序列和SV40的2×USE两种元件中的任何一种或两种，这可以使载体的通读率大大下降，进一步提高载体的安全性。

本发明的慢病毒载体所产生的假病毒在整合后发生“自杀效应”，将大部分慢病毒基本骨架删除，进一步降低产生适应性病毒(LCV)的可能性，只留下一个完整的LTR和外源基因，是一种既能发生自删除又降低了通读率的安全性慢病毒载体。

Cre/loxP重组系统

Cre/loxP重组系统可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列。这段34bp序列是Cre重组酶识别的位点，被称为loxP位点(locus of X-over in P1)。②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)。

该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子。loxP位点是一段较短的DNA序列，非常容易合成。Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用。Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用。

本发明在慢病毒载体5’端U3区序列中插入LoxP位点。使之在反转录过程中跳跃至5’端，在慢病毒载体两端形成两个相同LTR，也就是形成了两个LoxP位点。在Cre整合酶的作用下，loxP位点发生DNA重组，该两个LoxP位点之间所有的DNA都被删除，仅留下一个LTR和表达元件。这样的结果，使因任何原因而实际存在的病毒其他元件，不能与慢病毒载体的基本骨架发生重组，造成LCV产生的可能性，从而解决了慢病毒载体生物安全性的一个很大问题。

本发明同时使慢病毒载体内部可以表达Cre整合酶，从而使loxP位点发生DNA重组。

慢病毒载体

慢病毒是反转录病毒中的一属，反转录病毒的共性，是在胞浆内有一个将其RNA反转录成DNA进而整合到染色体的过程。而在这反转录过程中有一个3’U3跃迁至5’端，而5’端U5跃迁至3’端的过程，最终造成原病毒两端都带有相同的LTR。

本发明中，所述的慢病毒载体可以是现有的任何慢病毒载体，较佳的是慢病毒载体FUGW。

3’LTR

任何慢病毒或慢病毒载体都具有3’LTR。慢病毒载体的3’LTR元件依次包括U3，R，U5三个区域。本发明对所有3’LTR有作用，对FUGW的3’LTR效果最佳。对FUGW的3’LTR效果最佳。

cHS4元件

本发明中，所述的cHS4元件是鸡珠蛋白超敏区域4(Hypersensitivessite 4 of the chicken-globin locus)的400bp核心序列，较佳的是序列表中SEQ ID NO：3所示的序列。

2×USE元件

本发明中，所述的USE元件是猴空泡病毒40(Simian virus 40)的转录终止上游序列元件(Upstream sequence elements)。2×USE是指2个串联的USE元件，较佳的是序列表中SEQ ID NO：4所示的序列。

AHSP

地中海贫血是由于血红蛋白的珠蛋白链合成速率降低，血红蛋白产量减少所引起的一组遗传性溶血性贫血。血红蛋白内含有两种珠蛋白——α珠蛋白和β珠蛋白，二种珠蛋白比例失衡就会导致地中海贫血。任何一种珠蛋白含量过高都会产生毒性，引起包括发育不良、疲乏、骨损伤或皮肤溃疡等地中海贫血症状。

α血红蛋白稳定蛋白(lpha hemoglobin stabilizing protein，AHSP)，原称红细胞系分化相关因子(erythroid differentiation-related factor，EDRF)。AHSP是α血红蛋白分子伴侣，它能与α血红蛋白结合，但不能与β珠蛋白或血红蛋白四聚体结合。AHSP能维持α血红蛋白的稳定性，保持α血红蛋白可溶性，减弱α珠蛋白沉积对细胞膜的破坏作用。

本发明中，利用本发明的安全性慢病毒载体携带AHSP基因，从而将AHSP基因导入宿主中。动物试验证明了用本发明的安全性慢病毒载体携带AHSP基因，与常规慢病毒载体相比，所获得的治疗效果是类似的。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

实施例1

一、片段合成

a)AHSP片段的扩增。

用上游引物AHSP-F：5’-TGGCTCTTGCCTTGCATTTCC-3’，下游引物AHSP-R：5’-GGTAGAGTGGCAGGAGCACAG-3’，以人外周血细胞基因组DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系如下：

总共做4个反应管，反应条件为94℃5min；(94℃45sec，56℃45sec，72℃1min)×32个循环；72℃10min。扩出约1kb的AHSP片段(包括AHSP表达盒，即包括启动子、编码序列、终止子)，将反应液混合后，取5μL送至上海博尚生物技术公司进行测序。然后将测序所得序列与NC_000016.9序列进行比对，发现完全一致。

将剩余所有PCR产物加入2倍体积乙醇沉淀后，溶于10μL TE，进行补平。反应体系如下：

将补平产物用酚，氯仿各抽提一遍后，加入2倍体积乙醇沉淀与5μL 3M的醋酸钠沉淀，最后溶于15μL TE中待用。实施例中所述的所有补平实验均按照上述体系进行。扩增及补平所用酶购自TAKARA公司。

b)LoxP片段的合成

根据网上公布的LoxP序列用ABI3900型DNA合成仪合成两条互补的DNA单链：LoxP-F和LoxP-R。为满足克隆需要在序列的尾部加入了一个Nhe I位点。

LoxP-F：5′-ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTATTCC-3′。

LoxP-R：5′-GGAATAACTTCGTATA GCATACATTATACGAAGTTAT-3’。

将合成的单链各溶于50μL TE中，两者混合，沸水浴5分钟，而后等水温自然下降至常温取出。加入20μL 3M的醋酸钠和2倍体积乙醇沉淀后，溶于6μL TE，待用。

c)cHS4元件的制备

用上游引物(cHS4-F)：5’-GCTATCGACTCTAGAGGGACAG-3’(包含EcoR V位点)，下游引物(cHS4-R)：5’-GCTTCCCTGCAGGCATTCAAG-3’(包含Nhe I位点)，以PBC1质粒(Invitrogen)为模板，进行PCR扩增。反应体系为：

总共做4个反应管，反应条件为94℃5min；(94℃45sec，60℃45sec，72℃45sec)×32个循环；72℃10min。扩出约400bp的cHS4片段，将反应液混合后，取5μL送至上海博尚生物技术公司进行测序。然后将测序所得序列与PBC1序列进行比对，发现完全一致。将产物用酚，氯仿各抽提一遍后，加入2倍体积乙醇沉淀与5μL 3M的醋酸钠沉淀，最后溶于15μL TE中待用。

d)2×USE元件的制备

根据网上公布的SV40的USE序列用ABI3900型DNA合成仪合成两条互补的DNA单链：USE-F和USE-R。

USE-F：

5’-ATCATggTTACAAATAAAgCAATAgCATCACAAATTTCACAAATAAAATggTTACAAATAAAgCAATAgCATCACAAATTTCACAAATAAA-3’。

USE-R：

5’-TTTATTTgTgAAATTTgTgATgCTATTgCTTTATTTgTAACCATTTTATTTgTgAAATTTgTgATgCTATTgCTTTATTTgTAACCATgAT-3’。

2×USE：在设计合成序列时已经含有了2个正向串联的USE元件。

二、载体构建

1、FW-AHSP的构建。

①构建见图1。分子克隆中的所有限制性内切酶和连接酶均购自TAKARA公司。用Pac I和EcoR I双酶切慢病毒载体FUGW质粒(购自Addgene公司，货号14883)，酶切体系为：质粒15μg，Pac I(20U/μL)2μL，EcoR I(20U/μL)2μL，10×H buffer 15μL，补H₂O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒分别回收7.9Kb的DNA片段，经补平后在TE中溶解。

连接反应体系为200ng的1Kb AHSP片段，100ng 7.9Kb的载体片段，5μL 2×ligation buffer I，加H₂O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10感受态细胞，涂Amp抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定，测序确认。以上步骤详细方法请参见科学出版社2003年出版的《分子克隆实验指南(第三版)》。最终获得FW-AHSP载体。

2、FCL-AHSP的构建

构建见图2。

②FW-Cre的构建。

用Xba I酶切慢病毒载体FUGW质粒，酶切体系为：质粒15μg，Xba I(20U/μL)2μL，10×M buffer 15μL，补H₂O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒回收9.1Kb的载体片段，经补平后在TE中溶解。用Xho I和Mlu I双酶切pBS185质粒(购自Addgene公司，货号11916)，酶切体系为：质粒15μg，Xho I(20U/μL)2μL，Mlu I(20U/μL)2μL，10×H buffer 15μL，补H₂O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒回收1.1Kb的Cre片段，经补平后在TE中溶解。

连接反应体系为200ng的1.1Kb Cre片段，100ng 9.1Kb的载体片段，5μL 2×ligation buffer I，加H₂O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10感受态细胞，涂Amp抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定，测序确认。

③EGFP-N1-LTR的构建

用Kpn I和Apa I双酶切慢病毒载体FUGW质粒(购自Addgene公司，货号14883)，酶切体系为：质粒15μg，Kpn I(20U/μL)2μL，Apa I(20U/μL)2μL，10×L buffer 15μL，补H₂O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒分别回收9.3Kb和0.6Kb(含有3’LTR)的DNA片段，加入TE中溶解。用Kpn I和Apa I双酶切EGFP-N1载体(Clontech)得到4.7Kb的载体片段，与来自FUGW的0.6Kb的3’LTR片段进行T4DNA酶连接反应。反应体系为200ng 0.6Kb的3’LTR片段，100ng 4.7Kb的载体片段，5μL 2×ligation buffer I，加H₂O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10感受态细胞，涂Kana抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定，测序确认。最终将3’LTR(依次包括U3，R，U5)接入EGFP-N1载体的CMV启动子和GFP之间，获得一种载体，称为EGFP-N1-LTR。

④EGFP-N 1-LTR-LoxP的构建

用EcoRV酶切载体EGFP-N1-LTR，酶切体系为：质粒15μg，EcoR V(20U/μL)2μL，10×H buffer 15μL，补H2O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒回收约5Kb的EGFP-N1-LTR载体片段，加入TE中溶解。将之与之前保存的LoxP片段相连。反应体系为200ng的LoxP片段，100ng 5Kb的载体片段，5μL 2×ligation buffer I，加H₂O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10感受态细胞，涂Kana抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定，测序确认。获得EGFP-N1-LTR-LoxP。

⑤FW-Cre-LoxP的构建

用Kpn I和Apa I双酶切FW-Cre质粒，酶切体系为：质粒15μg，KpnI(20U/μL)2μL，Apa I(20U/μL)2μL，10×L buffer 15μL，补H₂O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒分别回收9.7Kb的载体片段，加入TE中溶解。用Kpn I和Apa I双酶切EGFP-N1-LTR-LoxP质粒，酶切体系为：质粒15μg，Kpn I(20U/μL)2μL，Apa I(20U/μL)2μL，10×L buffer 15μL，补H₂O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒回收0.6Kb的载体片段，加入TE中溶解。将两者连接，反应体系为200ng的LTR-LoxP片段，100ng的载体片段，5μL 2×ligationbuffer I，加H₂O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10感受态细胞，涂Amp抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定，测序确认，获得FW-Cre-LoxP载体。

⑥FCL-AHSP的构建。

用Nhe I酶切FW-Cre-LoxP质粒，酶切体系为：质粒15μg，Nhe I(20U/μL)2μL，10×M buffer 15μL，补H₂O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒回收11Kb的载体片段，经过补平后溶解于TE中。将之与AHSP片段连接，反应体系为200ng的AHSP片段，100ng的载体片段，5μL 2×ligation buffer I，加H₂O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10感受态细胞，涂Amp抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定，测序确认，获得FCL-AHSP载体。

3、FCL-AHSP-C(-)U(+)的构建。

构建见图3。

⑦EGFP-N1-LTR-LoxP-CHS4(-)的构建

用Nhe I酶切EGFP-N1-LTR-LoxP质粒，酶切体系为：质粒15μg，NheI(20U/μL)2μL，10×M buffer 15μL，补H₂O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒回收5.3Kb的载体片段，经过补平后溶解于TE中。将之与CHS4片段连接，反应体系为200ng的CHS4片段，100ng的载体片段，5μL 2×ligation buffer I，加H₂O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10感受态细胞，涂Kana抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定，测序确认，获得EGFP-N1-LTR-LoxP-CHS4(-)载体。

⑧EGFP-N1-LTR-LoxP-CHS4(-)USE(+)的构建

用EcoRV酶切EGFP-N1-LTR-CHS4(-)载体，酶切体系为：质粒15μg，EcoR V(20U/μL)2μL，10×H buffer 15μL，补H₂O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒回收约5.7Kb的EGFP-N1-LTR-cHS4(-)载体片段，加入TE中溶解。将其与上述2×USE片段，进行T4DNA酶连接反应，反应体系为200ng的2×USE片段，100ng的载体片段，5μL 2×ligation buffer I，加H₂O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10感受态细胞，涂Kana抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定，测序确认，获得EGFP-N1-LTR-LoxP-CHS4(-)USE(+)载体。

⑨FW-Cre-LoxP-C(-)U(+)的构建

用Kpn I和Apa I双酶切FW-Cre质粒，酶切体系为：质粒15μg，KpnI(20U/μL)2μL，Apa I(20U/μL)2μL，10×L buffer 15μL，补H₂O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒分别回收9.7Kb的载体片段，加入TE中溶解。用Kpn I和Apa I双酶切EGFP-N1-LTR-LoxP-CHS4(-)USE(+)质粒，酶切体系为：质粒15μg，Kpn I(20U/μL)2μL，Apa I(20U/μL)2μL，10×L buffer 15μL，补H₂O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒回收1.1Kb的载体片段，加入TE中溶解。将两者连接，反应体系为200ng的LTR-LoxP-CHS4(-)USE(+)片段，100ng的载体片段，5μL 2×ligation buffer I，加H₂O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10感受态细胞，涂Amp抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定，测序确认，获得FW-Cre-LoxP载体。

⑩FCL-AHSP-C(-)U(+)的构建。

用Nhe I酶切FW-Cre-LoxP-C(-)U(+)质粒，酶切体系为：质粒15μg，Nhe I(20U/μL)2μL，10×M buffer 15μL，补H₂O至150μL。37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖电泳，用试剂盒回收11.3Kb的载体片段，经过补平后溶解于TE中。将之与AHSP片段连接，反应体系为200ng的AHSP片段，100ng的载体片段，5μL 2×ligation buffer I，加H₂O至10μL。16℃连接过夜后，转化入TOP10感受态细胞，涂Amp抗性平板，挑斑，扩增培养，碱裂解法抽提质粒，酶切鉴定，测序确认，获得FCL-AHSP-C(-)U(+)载体。

三、细胞转染

(1)细胞株：293T细胞株购自中科院上海生化细胞所；

(2)细胞培养基高糖DMEM、小牛血清分别购自Gibco、民海公司。人胰岛素由上海生化制药厂生产，人表皮生长因子(EGF)购自中科院上海生化所。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。

(3)细胞培养方法：液氮中取293T细胞冻存管，快速置37℃水中冻融。冻融细胞1000rpm 5min，倾去上清，可见细胞沉淀，再加约5mL全培养液，轻轻重悬细胞。加入培养瓶中，镜下可见分散均匀的细胞。放置37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养。293T细胞用含10％小牛血清的DMEM培养基(含青链霉素)培养。两天后用0.25％胰酶将培养瓶中细胞消化下，转入6孔板中继续培养，每孔加入培养基1.5ml，次日用于转染。

(4)基因转染

1)转染液的制备：

取青霉素小瓶(玻璃离心管)稀释A液和B液。

A液：1.6μg慢病毒载体(分别是①，⑥，⑩，即FA，FCLA，FCLAC(-)U(+))，用Opti-MEM培养液分别定容稀释到100μL，轻摇。室温放置5min。

B液：3μL Lipofectamine TM 2000质脂体转染试剂(Invitrogen公司)用Opti-MEM培养液定容稀释到100μL，轻摇。室温放置5min。

将100μL B液分别加入到A液中，轻轻摇匀，室温静置20min，即得转染液。

2)转染：

细胞悬液用1mL不含血清DMEM培养液漂洗细胞二次，倾去培养液。每孔中加入200μL转染液，前后摇几次。使培养液完全覆盖细胞。37℃，5％CO₂下培养6h。

3)吸除转染液，加1.5mL完全培养液。

4)37℃，5％CO₂及饱和湿度下培养66h。

5)弃去培养液，用0.25％胰酶消化下293T细胞，抽提RNA，利用定量PCR方法检测通读(Read Through)效率。

四、定量PCR检测通读率

慢病毒载体会产生两种RNA，一种在3’LTR的R元件处断裂，为正常RNA；另一种将会继续向下转录，称之为通读RNA。示意图见图4。其中，引物PA-RP逆转录的产物是所有RNA，引物LTR3逆转录的产物是通读RNA。本发明利用引物PA-RP和引物LTR3分别来对RNA样本进行逆转录，而后做定量PCR，获得拷贝数，即分别得到所有RNA拷贝数和通读RNA拷贝数。将LTR3扩增的拷贝数数值除以PA-RP扩增的拷贝数数值，即可得到通读率。具体如下：

1)取抽提得到的细胞RNA，同一样本分别用引物LTR3和引物PA-RP进行逆转录(RT)得到cDNA。两个反应的体系和反应条件完全相同，包括样本中的RNA用量也是相同的，唯一不同的是所用引物的序列不同。

LTR3：5’-TGCTAGAGATTTTCCACACTG-3’；

PA-RP：5’-GAGAGCTCCCAGGCTCAGATC-3’。

2)而后运用定量PCR方法获得cDNA的拷贝数。该定量PCR获得cDNA的拷贝数的方法采用现有技术，按照文献进行。文献为：应用荧光实时定量PCR方法检测重组慢病毒滴度及其感染效率，生命科学研究，2009，13(5)：394-398。本发明在定量PCR体系中所用的引物对和探针和该文献相同。

3)根据拷贝数计算通读率。通读率计算公式如下：

通读率＝(通读RNA拷贝数)/(所有RNA拷贝数)

＝(用引物LTR3进行RT产物扩增得到的拷贝数)/(用引物PA-RP进行RT产物扩增得到的拷贝数)。

4)通读率结果见表1。

表1.含AHSP系列载体通读率

由表1可见，当将Cre-LoxP系统引入FUGW载体后，通读率会出现略微的上升，但是在加入反向的CHS4连接正向的2XUSE元件后，通读率会显著下降，确保了慢病毒载体的安全性。

五、病毒制备及病毒滴度测定

取FA，FCLA，FCLAC(-)U(+)三种慢病毒载体质粒分别制备病毒。首先准备细胞，在含有无血清DMEM培养液的10cm直径培养皿中，将293T细胞培养至成70％丰度，总细胞数为1×10⁷左右。利用ProFection Kit磷酸钙转染试剂盒(Promega公司)，将慢病毒载体15μg，8.9转运载体10μg，VSVG包装载体7.5μg，三者一起转入293T细胞，在转染6小时后换用含10％胎牛血清的DMEM培养液，继续在37℃，5％CO₂培养60小时。最后取出培养液，经过离心，过滤后，50000g超速离心1.5小时，弃净上清，用Hanks液溶(北京弘博康医药科技有限公司，货号：BS3866)解病毒沉淀，获得浓缩液。总共获得三种病毒(FA，FCLA，FCLAC(-)U(+))。

取2μl病毒浓缩液，经过DNA酶处理和蛋白酶处理后，用酚氯仿抽提，乙醇沉淀后，获得病毒RNA。利用PA-RP引物进行逆转录(RT)得到病毒cDNA。然后运用定量PCR方法获得病毒拷贝数，通过计算得到病毒滴度(cDNA拷贝数/2＝病毒颗粒数)。

病毒制备及病毒滴度测定的详细操作步骤按照文献进行。文献为：应用荧光实时定量PCR方法检测重组慢病毒滴度及其感染效率，生命科学研究，2009，13(5)：394-398。滴度见表2。

表2.含AHSP系列病毒的滴度(×10⁷颗粒/μL)

由表2可见相比于FA，FCLA和FCLAC(-)U(+)的滴度有所提高，更加有效。

六、病毒感染效率的测定

分别取FA，FCLA，FCLAC(-)U(+)病毒原液，稀释成1×10⁷粒/μL，取1μL病毒稀释液感染1×10⁶293T细胞。2天后用酚氯仿法抽提细胞DNA，并用定量PCR方法测定整合入细胞的病毒拷贝数，计算感染效率。

病毒感染效率的测定按照文献进行。文献为：应用荧光实时定量PCR方法检测重组慢病毒滴度及其感染效率，生命科学研究，2009，13(5)：394-398。感染效率见表3。

表3.含AHSP系列病毒的感染效率

由表3可见相比于FA，FCLA和FCLAC(-)U(+)的感染效率没有显著降低。

七、病毒自删除的鉴定

由于慢病毒在反转录过程中有一个3’U3跃迁至5’端，而5’U5跃迁至3’端，最后在原病毒形成两个相同LTR的过程。所以我们制备的安全性慢病毒载体在制备成病毒，感染细胞后会发生自删除。示意图如图5。

将FCLAC(-)U(+)病毒感染后的细胞，在六孔板中做连续培养。每隔两天换液时，取出一半约2×10⁶个细胞。共取2d，4d，6d，8d四个样本，酚氯仿法抽提DNA，用双重PCR方法鉴定Cre的自删除过程，扩增体系如下：

反应条件为94℃5min；(94℃45sec，60℃45sec，72℃1min)×32个循环；72℃10min。所用引物，AHSP-F：5’-TGGCTCTTGCCTTGCATTTCC-3’；ASAP-R：5’-CTCACCTGCTGATTCAGCAG-3’，可以扩出520bp的ahsp目的条带。Cre-F：5’-GATCGCTGCCAGGATATACG-3’；Cre-R5’-AGGCCAGGTATCTCTGACCA-3’，可扩出400bp的cre目的条带。PCR产物电泳(见图6)后发现，随着时间的推移Cre逐渐减少直至消失，而ahsp始终存在。这证明了，在cre酶的作用下，慢病毒载体的大部分序列被删除，只留下500bp的LTR以及AHSP基因。

八、动物实验

将制备好的病毒(FA和FCLAC(-)U(+))分别注射到β654地中海贫血模型小鼠成熟受精卵的卵周隙，再将该受精卵植入假孕母鼠体内，使其发育，直至生下转基因小鼠。通过PCR鉴定各获得一只双阳性的雄性小鼠，即：FA/β⁶⁵⁴，FCLAC(-)U(+)/β⁶⁵⁴(慢病毒介导转基因小鼠的制备和检测参见文献，Transgenic Humanα-Hemoglobin Stabilizing Protein Could Partially Relieveβ^IVS-2-654-Thalassemia Syndrome in Model Mice.Human Gene Therapy.201 0February，21(2)：149-156.)。将这两只小鼠，与一只正常小鼠和一只β⁶⁵⁴小鼠一起做定期血常规检测：小鼠8周龄时，每周采尾静脉血50μL，持续四周，并用希森美康KX-21N型血细胞计数仪检测，主要分析红细胞数(RBC)和血红蛋白(HBG)，来确定治疗效果。结果见表4和表5。

表4.小鼠RBC(10¹²/L)数值

表5.小鼠HBG(g/L)数值

由表4，表5可见安全性慢病毒载体介导产生的AHSP转基因小鼠与常规慢病毒载体介导产生的小鼠具有一样的治疗功能，甚至更好一些。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种安全性慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体是改良的FUGW慢病毒载体，在出发慢病毒载体FUGW的3’LTR的U3区的两个EcoRV酶切位点之间含有LoxP位点序列，将GFP基因替换为整合酶Cre基因，并且在U3区中LoxP位点的下游含有cHS4的400bp核心序列和SV40的2×USE两种元件，上述元件的连接方向为5’方向至3’方向依次为反向接入的cHS4元件和正向接入的2×USE元件，在U3区中并在LoxP位点的下游构建了一个用于导入外源基因的限制性酶切位点Nhe I酶切位点，并且该酶切位点是在U3区中并在LoxP位点的下游且在cHS4的400bp核心序列和SV40的2×USE的上游，所述的Nhe I酶切位点插入了外源基因AHSP，所述400bp核心序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述的2×USE元件序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。

2.一种如权利要求1所述的安全性慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

1)在出发慢病毒载体FUGW的3’LTR的U3区的两个EcoRV酶切位点之间插入LoxP位点序列，将GFP基因替换为整合酶Cre基因；

2)在步骤1)所述的LoxP位点后引入Nhe I酶切位点；

3)在步骤2)所述的Nhe I酶切位点插入正向连接的cHS4的400bp核心序列，所述400bp核心序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；

4)在步骤3)所述的cHS4的400bp核心序列前后分别引入Nhe I酶切位点和EcoR V酶切位点；

5)在步骤4)所述的EcoR V酶切位点插入反向连接的2×USE元件，所述的2×USE元件序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；

6)在步骤5)所述的Nhe I酶切位点插入外源基因AHSP。

3.如权利要求1所述安全性慢病毒载体在非疾病的诊断和治疗的基因克隆或表达中的应用。