JP2003532426A

JP2003532426A - 増強された３’転写終結構造を含む、レトロウイルスベクター

Info

Publication number: JP2003532426A
Application number: JP2001582562A
Authority: JP
Inventors: ポーラ・マリー・キャノン; マリア・バルコワ
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2003-11-05
Anticipated expiration: 2021-05-14
Also published as: NZ522264A; US20020042136A1; AU2001258668A1; IL152527A; CA2408786A1; IL152527A0; CA2408786C; WO2001085974A3; JP4708661B2; EP1283895A2; WO2001085974A2; US6620595B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、増強された転写終結構造を有する新規レトロウイルスベクターを提供する。終結構造は、３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルと操作可能に結合した、１個以上の異種上流転写終結エンハンサー(ＵＥ)配列、または内因性ＵＥ配列の１個以上の付加的複製を含む。本発明のレトロウイルスベクターは、より強い遺伝子発現、増強されたベクター力価およびベクター開始転写事象の読み通しに起因する宿主遺伝子発現の減少した干渉を含む、慣用のベクターよりも改善された種々の特性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、レトロウイルスベクターに関する。本発明は特に増強された３'転
写終結構造を有するレトロウイルスベクターおよび哺乳類細胞および生物におい
て異種コード配列を発現するためにこのようなベクターを使用する方法に関する
。

【０００２】発明の背景レトロウイルスベクターレトロウイルスベクターは、現在遺伝子治療プロトコールにおいて最も頻繁に
使用されている遺伝子送達媒体の一つである。レトロウイルスベクターの有用性
に必須であるのは、ベクターにより保持される種々のレトロウイルス性質である
。このような性質は、多くの細胞タイプの優れたトランスフェクションおよび、
ベクターによりコードされる遺伝子の長期発現を可能にする宿主細胞染色体への
それらのゲノムの安定な統合を含む。他の重要な保持される特性は、ベクター粒
子から、ウイルス粒子の結合からの、宿主細胞遺伝物質へのそのゲノムの統合を
介した、ベクターライフサイクルの最初の段階が、ウイルスタンパク質の新たな
合成を必要としないことである。

【０００３】レトロウイルスベクターの基本要素野生型レトロウイルスゲノムの主要な性質は図１に要約し、それはオープンリ
ーディングフレームおよびウイルスの長い末端反復(ＬＴＲ)の構造を示す。レト
ロウイルスベクターは、レトロウイルスベクター由来のゲノムを含む。レトロウ
イルスベクターの最も単純なタイプは、ウイルス遺伝子をコードする配列(例え
ば、ｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌ)の多くを欠き、パッケージング、逆転写およ
び統合に必要な配列のみを保持する、著しく削減されたレトロウイルスゲノムを
有する。削減されたレトロウイルスゲノムは、しばしば、レトロウイルス骨格と
呼ばれ、その上に更なる修飾を成し得、それに異種遺伝子および配列を付加して
レトロウイルスベクターを形成できる。典型的に、異種遺伝子を、５'ＬＴＲプ
ロモーターがその続く発現を可能にするような方法で骨格に挿入する。プロモー
ターと操作可能に結合している異種遺伝子を含む発現構築物は、また標的細胞へ
の送達および発現のために骨格に挿入できる。

【０００４】ウイルス遺伝子のいくつかまたは全てを欠くレトロウイルスベクターは、複製
欠損である。このようなベクターを含むウイルス粒子の生成は、トランスで欠損
機能を提供する宿主細胞におけるベクター増殖を必要とする。トランス相補性は
、宿主細胞を、またレトロウイルスから送達され、欠失ウイルスタンパク質を発
現するが、パッケージングシグナルの欠失のためパッケージ化されない、パッケ
ージングヘルパー構築物でトランスフェクトすることを含む種々の方法で達成で
きる。レトロウイルス製造のこのシステムを図２に説明する。ベクターおよびパ
ッケージングヘルパー構築物の両方がプロデューサー細胞に存在するとき、感染
性レトロウイルス粒子が放出され、それはその挿入遺伝子と共にベクターゲノム
の送達ができる。遺伝子送達のこの工程は形質導入と呼ぶ。

【０００５】レンチウイルスベクター今日まで、臨床的遺伝子治療プロトコールにおいて最も一般に使用さｒている
レトロウイルスは、マウス白血病ウイルス(ＭｕＬＶ)を基にしており、ウイルス
粒子内にベクターゲノムを封入する種々のパッケージングシステムが開発されて
いる(Miller, AD. 1997. Development and applications of retroviral vector
s. Retroviruses, Ed. Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE. CSHL Press, New Yo
rkにレビュー)。ベクターそれ自体は、全てのウイルス遺伝子が除去され、完全
に複製欠損であり、約６−８ｋｂの外来ＤＮＡを受け入れることができる。これ
らの現在のベクター／パッケージングシステムで患者に課される危険性は最少で
あり、今日までそれらの使用に関連する毒性または長期問題の報告はない。

【０００６】しかし、ＭｕＬＶおよびそれ由来のベクターは、分割細胞の感染のみできる。
これは、予め統合された核タンパク質複合体が無傷の核膜を通過できないためで
ある。対照的に、原型的レンチウイルスＨＩＶ−１は、無傷の膜が存在するバイ
でさえ、核輸送の能力を示し、ＨＩＶ−１由来ベクターはしたがって非分割細胞
も形質導入できるNaldini et al., Science 272:263-267 (1996))。ＨＩＶベク
ターのこの能力は、標的細胞が非分割であり、異種遺伝子の安定な統合が必要で
あるとき、それらを遺伝子治療の特に魅力的な候補物とする。

【０００７】レトロウイルス設計および製造システムの改善上記のレトロウイルスベクター製造システムは機能的であるが、いくつかの方
法で不充分である。特に、パッケージングヘルパー構築物におけるベクター配列
とウイルス要素の間に残る重複は、感染性複製コンピテントレトロウイルス(Ｒ
ＣＲ)を創生する可能性のある組換え事象の著しい危険性が存在することを意味
する。このような重複は、ｇａｇ遺伝子の広い配列がパッケージング効率を促進
するためにベクターに保持されるために、主に存在する。加えて、ＬＴＲはパッ
ケージングヘルパー構築物に頻繁に残り、プロモーターおよびポリアデニル化配
列の両方を提供する。

【０００８】ＲＣＲ製造の製造の危険性を減少させるために、ベクター設計および製造の種
々の改善された試みが開発されている。一つの試みは、パッケージング要素を分
け、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子をおよびｅｎｖ遺伝子を、個々にパッケージング細胞
に導入できる別々のプラスミドにおく。他の試みにおいて、ｅｎｖ介在組換えを
、異種エンベロープタンパク質の使用により避け、該異種エンベロープタンパク
質のコード配列は親レトロウイルスのゲノムと相同性を有しないが、ベクター粒
子内に包含できる(シュードタイピングと呼ぶ工程)。一般に使用される異種エン
ベロープタンパク質は、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質であるＶＳＶＧ
である(Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:8033-8037 (1993))。図３、
パネルＡ参照。

【０００９】更に別の試みにおいて、ＬＴＲ−介在組換えは、パッケージングヘルパー構築
物における異種プロモーターおよびポリアデニル化シグナルの使用により減少さ
れる。これはまたベクター力価の促進という利点を有する(Soneoka et al., Nuc
leic Acids Res 25:628-633 (1995))。この試みは、典型的にベクターＬＴＲか
らの非必須配列の除去、および、適当な場合、欠失配列の異種配列での置換を含
む。例えば、ＣＭＶ即時−早期プロモーターのような異種プロモーターを５'Ｕ
３プロモーターの置き換えに使用している。他の例において、インテグラーゼ認
識配列(即ち、ａｔｔ配列)が保持される限り、３'Ｕ３配列が、自己不活性化(Ｓ
ＩＮ)ベクターでのように著しく欠失している(Yu et al., Proc. Natl. Acad. S
ci 83:3194-3198 (1986))。図３、パネルＢ参照。

【００１０】これらの試みは種々のレンチウイルスベースのベクターの開発に使用されてお
り、これは組換え事象に起因する病原性ＲＣＲの可能性のために特別の安全性懸
念をもたらす。この試みの生成物の例は、ＣＭＶ駆動ＳＩＮベクター(Ｚufferey
et al., J. Virol. 72:9873-9880 (1988))、全ての非必須遺伝子が不活性化ま
たは除去された最少パッケージングヘルパー構築物(Zufferey et al., Nat. Bio
technol. 15:871-875 (1997))および、ＶＳＶＧのような非ＨＩＶ−１エンベ
ロープを含むレトロウイルス粒子を含む。

【００１１】レトロウイルスベクター統合レトロウイルスベクターは、そのゲノムを宿主細胞の遺伝物質内に統合する。
ウイルスインテグラーゼにより行なわれる、レトロウイルス統合の過程に関して
多くのことが知られている。インテグラーゼはＤＮＡプロウイルスのＬＴＲの末
端(ａｔｔ部位、図パネル１Ｂ)で配列を認識し、宿主ゲノムに多かれ少なかれ無
作為にプロウイルスを挿入するが、ある配列優勢が報告されている(Carteau et
al., J. Virol. 72:4005-4014 (1988))。

【００１２】統合のためのレトロウイルスベクターの能力は諸刃の刃である。一方で、統合
プロウイルスの全娘細胞への継代を伴う、ベクターコード遺伝子の安定な長期発
現の可能性を可能にする。他方で、ベクター統合が通常のフランキング宿主遺伝
子を干渉する。実際、レトロウイルスは、腫瘍形成性形質転換をもたらす能力に
基づいて、最初、同定された。干渉の一つのタイプは、読み通し転写による宿主
遺伝子の不適当な活性化であり、即ち、ウイルス転写物の係属が３'ＬＴＲ転写
終結部位を越え、下流宿主遺伝子配列まで行く。プロウイルスの宿主配列への読
み通し転写は、数種のレトロウイルスで観察されている(R. V. Gunataka Microb
iol. Rev. 57:511-521 (1993); Bohnlein et al., J. Virol. 63:421-424 (1989
); Herman et al., Science 236:845-848 (1997); Iwasaki et al., Genes & De
v. 4.2299-2307 (1990); Cherrington et al. EMBO J. 11:1513-1524 (1992))。
最近の証拠は、統合ＨＩＶ−１プロウイルスがまたフランキング宿主細胞配列の
読み通し転写を行なうことができることを示す(Dron et al., Arch Virol. 144:
19-28 (1999))。

【００１３】ｍＲＮＡの転写終結ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写されたメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の
３'末端を、発生期転写物の開裂により創生する。この事象は、ポリアデニル化
部位で優勢に起こり、約２５０ヌクレオチドポリ(Ａ)テイルの鋳型非依存的付加
に続く(Wahle et al., FEMS Microbiol. Rev. 23:277-295 (1999))。ポリ(Ａ)テ
イルは、安定性、翻訳効率、および核から細胞質への加工ｍＲＮＡの輸送を含む
、ｍＲＮＡ代謝の多くの態様に影響する(Lewis et al., Microbiol Mol Biol Re
v. 63:405-445 (1999); Colgan et al., Genes & Dev. 11:2755-2766 (1997); H
uang et al., Mol. Cel. Biol. 16:1534-1542 (1996); Sachs et al., J. Biol.
Chem. 268:22955-22958 (1993))。強いポリアデニル化シグナルが、インビトロ
で製造したｍＲＮＡの前駆体開裂のレベルおよびポリ(Ａ)の長さを促進すること
が観察されている(Lutz et al., Genes & Dev. 10:325-337 (1996))。一つの例
において、増加したポリ(Ａ)テイル長は増強されたトランスジーン発現と相関す
る(Loeb et al., 1999 West Cost Retrovirus Meeting, abstract p57)。

【００１４】ポリアデニル化シグナルコアポリアデニル化シグナルは、開裂／ポリアデニル化部位にフランキングな
二つの認識要素から成る。非常に保存性のＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド要素
(Proudfoot et al., Nature 263:211-214 (1976))は、開裂部位の８から３１ヌ
クレオチド上流に位置し(Chen et al., Nucleic Acid Res. 23:2614-2620 (1995
))、乏しい保存性のＧＵ−またはＵ−リッチ(Ｇ／Ｕ−リッチ)下流要素はＡＡＵ
ＡＡＡ要素の１４から７０ヌクレオチド下流に位置する。ｍＲＮＡ転写物の開裂
は通常、これらの二つの要素の間のＡ残基、優勢にはＣＡジヌクレオチドの後に
起こる(Sheets et al., Nucleic Acid Res. 18:5799-5805 (1990))(図４)。

【００１５】ポリアデニル化シグナルの増えている数はまた、転写終結を促進するＡＡＵＡ
ＡＡ配列の上流に位置する付加的要素を含むことが示されている(図４)。このよ
うな上流エンハンサー(ＵＥ)の初期の例は、ＨＩＶ−１(Valsamakis et al., Mo
l. Cell. Biol. 12:3699-3705 (1992); Gilmartin et al., EMBO J. 11:4419-44
28 (1992)、ウマ感染性貧血ウイルス(Graveley et al., J. Virol. 70:1612-161
7 (1996))、サルウイルス４０(ＳＶ４０)(Carswell et al., Mol. Cell. Biol.
9:4248-4258 (1989))、アデノウイルス(Prescott et al., Mol. Cell. Biol. 14
:4682-4693 (1994); DeZazzo et al., Mol. Cell. Biol. 9:4951-4961 (1989))
、カリフラワーモザイクウイルス(Sanfacon et al., Genes & Dev. 5:141-149 (
1991))および地リス肝炎ウイルス(Cherrington et al., J. Virol. 66:7589-759
6 (1992))ポリ(Ａ)を含む、種々のウイルスのポリアデニル化シグナルに見られ
た。より最近、ＵＥはまたヒト補体Ｃ２遺伝子(Moreira et al., EMBO J. 14:38
09-3819 (1995): Moreira et al., Genes & Dev. 12:2522-2534 (1998))および
ラミンＢ２遺伝子(Brackenridge et al., Nucleic Acid Res. 25:2326-2335 (19
97))のような哺乳類遺伝子のポリアデニル化シグナルにおいても同定されている
。

【００１６】一般に、ＵＥはＵ−またはＵＧ−リッチ配列を含むが、異なるＵＥ間で明らか
な配列相同性はない(Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989):
R. H. Russnak, Nucleic Acid Res. 19:6449-6456 (1991); Sanfacon et al.,
Genes & Dev. 5:141-149 (1991); Moreira et al., EMBO J. 14:3809-3819 (199
5))(図５)。配列相同性が存在しないにもかかわらず、一定のウイルスＵＥは機
能的に交換できるように見える(Russnak et al., Genes & Dev. 4:764-776 (199
0); Valsamikis et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88:2108-2112 (1991); Grav
eley et al., J. Virol. 70:1612-1617 (1996))。

【００１７】ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナル(ＵＳＥとしても既知)のＵＥは、ＡＡＵ
ＡＡＡ要素の１３−５１ヌクレオチド上流に位置する(図５)(Schek et al., Mol
. Cell. Biol. 12:5386-5393 (1992); Lutz et al., Genes & Dev. 8:576-586 (
1994); Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989); Cooke et al
., Mol Cell Biol. 19:4971-4979 (1999))。ＵＳＥは、ＵＳＥ変異がインビトロ
およびインビボの両方でポリアデニル化効率を７５から８５％まで減少させるた
め、コアポリアデニル化シグナルの活性の促進に重要な役割を担う(Carswell et
al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989); Schek et al., Mol. Cell. Biol
. 12:5386-5393 (1992))。ＵＳＥ内で、コンセンサス配列ＡＵＵＵＧＵＰｕＡを
伴う３つのコアＵリッチ要素が活性要素として同定されている。それらは距離依
存的方法で、複数の複製が存在する場合、ポリアデニル化効率に付加的な方法で
機能するように見える(Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989
))。地リス肝炎ウイルスポリアデニル化シグナルのＵＥはまたコアポリアデニル
化シグナルに配向依存的、付加的な、しかし距離非依存的態様で影響する(R. H.
Russnak, Nucleic Acid Res. 19:6449-6456 (1991))。

【００１８】レトロウイルスポリアデニル化シグナルレトロウイルス５'および３'ＬＴＲはＲ領域にポリアデニル化シグナルＡＡＵ
ＡＡＡを含み、Ｇ／Ｕリッチ下流要素はＵ５領域に位置し、開裂／ポリアデニル
化部位はＲ／Ｕ５境界を定義する(図４)。ＨＩＶ−１において、３ＬＴＲは、Ａ
ＡＵＡＡＡモチーフの７７−９４ヌクレオチド上流の、Ｕ３領域にＵＥ(ＵＨＥ
としても既知)を含む(図４、パネルＣおよび図５)。ＵＨＥは３'ＬＴＲポリアデ
ニル化シグナルの加工効率を著しく増加させる(DeZazzo et al. Mol Cell Biol.
12:5555-5562 (1991); Valsamakis et al., Mol Cell Biol. 12:3699-3705 (19
92))。ＵＨＥ_Ｍと名付けた推定マイナーポリアデニル化エンハンサーはまたＡＡ
ＵＡＡＡモチーフの１４６−１７１ヌクレオチド上流に同定されている(Valsama
kis et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88:2108-2112 (1991))(図４＆５)。

【００１９】５'および３'ＬＴＲの両方でのＡＡＵＡＡＡおよびＧ／Ｕリッチ下流要素の存
在にもかかわらず、３'ＬＴＲから複製したＨＩＶ−１ポリアデニル化シグナル
が優勢に認識される。二つのポリアデニル化シグナルの異なる認識を説明するい
くつかの機構が提案されている(Das et al., J. Virol. 73:81-91 (1999); Cher
rington et al., J. Virol. 66:7589-7596 (1992); DeZazzo et al., Mol Cell
Biol. 12:5555-5562 (1992); J. Cherrington, EMBO J. 11:1513-1524 (1992))
。

【００２０】発明の要約本発明は、増強された３'転写終結構造を有するレトロウイルスベクターに関
する。一つの実施態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、、３'Ｌ
ＴＲポリアデニル化シグナルと操作可能に関連した１個以上の異種上流エンハン
サー(ＵＥ)を含む。他の実施態様において、本発明のレトロウイルスは、３'Ｌ
ＴＲポリアデニル化シグナルと操作可能に関連した内因性ＵＥ配列の付加的な複
製を含む。本発明は、このようなレトロウイルスベクター、そのヌクレオチド配
列、このようなベクターにより生成されるウイルス粒子、およびこのようなベク
ターおよびそのプロウイルス配列を含む細胞を含む組成物を提供する。本発明は
また哺乳類細胞および生物における異種コード配列を発現するためのこのおよう
なレトロウイルスベクターの使用法も提供する。

【００２１】本発明は、１個以上の異種ＵＥ配列、または１種以上の内因性ＵＳ配列の付加
的複製のレトロウイルスへの挿入が、３'ＬＴＲの転写終結効率を増加させ、こ
のような修飾を有するベクターがこのような修飾を有しない以外同一のベクター
で製造されるよりも高いベクター力価(即ち、ベクターを含むウイルス粒子の力
価)を製造するという驚くべき発見に基づく。いかなる理論にも縛れることを意
図しないが、３'ＬＴＲによる転写終結の促進は、ベクターｍＲＮＡの製造、安
定性、核輸出および／または翻訳を増加させ、このような増加がプロデューサー
細胞におけるより高いベクターＲＮＡ製造および／または遺伝子発現、したがっ
てより高いベクター力価を導くと考えられる。

【００２２】定義特記しない限り、以下の単語および用語は、本明細書および特許請求の範囲に
関して、以下の意味を有する。

【００２３】 “３'ＬＴＲ”は３'レトロウイルス長い末端反復を意味し、これはその対応す
る天然(即ち、野生型レトロウイルスに存在する)３'ＬＴＲから、内因性配列の
欠失および／または変異および／または異種配列の付加により修飾され得、また
はされ得ない。

【００２４】 “５'ＬＴＲ”は５'レトロウイルス長い末端反復を意味し、これはその対応す
る天然５'ＬＴＲから、内因性配列の欠失および／または変異および／または異
種配列の付加により修飾され得、またはされ得ない。

【００２５】 “３'ＬＴＲポリアデニル化シグナル”は、レトロウイルスの３'ＬＴＲに存在
するポリアデニル化シグナルを意味する。

【００２６】 “上流エンハンサー”および“ＵＥ”は互換性に使用され、エンハンサーの下
流に位置するポリアデニル化シグナルにより転写終結を促進する、種々の真核お
よびウイルス遺伝子の３'非翻訳領域に存在する制御要素を意味する。ＵＥの例
はＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナル(ＵＳＥ)、ＨＩＶ−１ＬＴＲ(ＵＨＥ)
および地リス肝炎ウイルス(ＵＧＥ)に見られる。

【００２７】 “上流エンハンサー配列”および“ＵＥ配列”は互換的に使用され、ＵＥの配
列またはその活性セグメントを意味する。ＵＥと同様に、ＵＥの活性セグメント
は、シグナルの５'上流に置かれたとき、ポリアデニル化シグナルの転写終結活
性を増加させる。ＵＥは配列が重複し得るまたはし得ない多くの活性セグメント
を含み得る。

【００２８】本発明のレトロウイルスベクターの状況で、“異種”ＵＥ配列は、本発明のレ
トロウイルスが由来するレトロウイルスの天然３'ＬＴＲに存在するものと同一
でないＵＥ由来のＵＥ配列である。対照的に、“内因性”ＵＥ配列は、本発明の
レトロウイルスベクターが由来するレトロウイルスの天然３'ＬＴＲにおいて、
存在する、ＨＩＶ−１のＵＨＥのような、ＵＥ由来のＵＥ配列である。

【００２９】レトロウイルスの“３'転写終結構造”は、構造の上流から開始する転写の終
結を行なう３'ＬＴＲの中のおよび近接する構造を意味する。このような構造は
３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルを含み、更に、そのシグナルと操作可能に結
合した、内因性ＵＥ配列および異種ＵＥ配列を含み得る。

【００３０】 “ポリヌクレオチド”は、交換可能に、二本および一本鎖分子を意味する。特
記しない限り、または必要でない限り、本明細書に記載の任意の実施態様は、二
本鎖形および二本鎖形を形成することが既知のまたは予測される各相補的一本鎖
形の両方を含むポリヌクレオチドである。

【００３１】 “プロデューサー細胞”は、レトロウイルスベクターまたはそのプロウイルス
配列を含み、レトロウイルスベクターを含む形質導入粒子を製造する細胞を意味
する。レトロウイルスが複製欠損である場合、プロデューサー細胞は、必要な複
製機能をトランスで製造することにより、欠損を補う。

【００３２】 “レトロウイルス”はＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ、または“逆転写酵素”
を使用し、ウイルスＲＮＡゲノムを二本鎖ＤＮＡ中間体に複製し、それを宿主細
胞の染色体ＤＮＡに統合するウイルスのクラスを意味する。レトロウイルスはレ
ンチウイルスを含む。レトロウイルスの例は、モロニーマウス白血病ウイルス、
脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーヴェー肉腫ウイルス、トリ白血病
ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、脊髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルス
を含むが、これらに限定されない。レンチウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイル
ス、サル免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、
ビスナウイルスを含む。

【００３３】 “ベクター”は、特記しない限り“レトロウイルスベクター”を意味する。 “レトロウイルスベクターゲノム”は、そのポリヌクレオチドのＲＮＡバージ
ョンがレトロウイルス粒子にパッケージされるのを可能にし、そのパッケージ化
ＲＮＡポリヌクレオチドが逆転写され、レトロウイルス粒子内に含まれる逆転写
酵素およびインテグラーゼのようなレトロウイルス酵素の作用により宿主細胞染
色体に統合されるするのに充分である、レトロウイルスゲノム由来の配列を含む
ポリヌクレオチドを意味する。

【００３４】 “遺伝子”はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。 “コード配列”は、ポリペプチド、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたは、
ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡのような構造ＲＮＡをコードするポリヌク
レオチドを意味する。

【００３５】本発明のレトロウイルスベクターの状況において、“異種”遺伝子またはコー
ド配列は、本発明のレトロウイルスが由来するレトロウイルスに見られる任意の
遺伝子またはコード配列と同一でない遺伝子またはコード配列である。

【００３６】二つの遺伝子または配列は、各遺伝子または配列におけるヌクレオチドの順番
が、任意の付加、欠失または物質置換がなく同じである場合、“同一”である。

【００３７】ポリヌクレオチドの状況で、“配列”は、配列において互いに隣接する残基が
ポリヌクレオチドの一次構造において連続している、５'から３'方向のポリヌク
レオチドにおけるヌクレオチドの順番である。

【００３８】 “操作可能に結合”は、要素が、それらを予期される方法で操作可能にする関
係である、遺伝子要素の並置を意味する。例えば、ＵＥ配列は、同じＤＮＡ分子
内のポリアデニル化シグナルと、ＵＥ配列がそのシグナルにより転写終結が促進
される場合、操作可能に連結している。同様に、プロモーターは、同じＤＮＡ分
子のコード領域と、プロモーターがコード配列の転写を可能にする場合、操作可
能に結合している。機能的関係が維持される限り、このような関連要素の間に干
渉残基が存在し得る。

【００３９】図面の簡単な説明図１.レトロウイルスゲノム構成パネルＡ.単純Ｃ型レトロウイルスの基本的構成を示す。長い末端反復(ＬＴＲ)
は、各々５'および３'ＬＴＲを優勢に使用するプロモーターおよびポリアデニル
化配列を含む。完全長およびスプライスした転写物の両方を製造し、これらは３
つの主用タンパク質をコードする；ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌは完全長転写物
からの翻訳であり、ｅｎｖはスプライスされた転写物からの翻訳物である。完全
長転写物はまたＲＮＡゲノムとして働く。ゲノムの５'領域に、ゲノムをウイル
ス粒子に統合するのに必要なパッケージングシグナル(Ψ)である。ＳＤ、スプラ
イスドナー；ＳＡ、スプライスアクセプター。パネルＢ.ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と名付けられる３つの領域を含む。プ
ロモーターおよびエンハンサー配列は５'ＬＴＲでのみ活性であり、Ｕ３領域に
位置し、一方３'ＬＴＲはＲ／Ｕ５境界を定義する。ＬＴＲの末端のａｔｔ配列
は統合に必要である。

【００４０】図２.複製欠損レトロウイルスベクター粒子の製造野生型レトロウイルス、パッケージングヘルパー構築物および複製欠損レトロ
ウイルスのゲノムは、各々図面の上段、中段および下段に示すとおりである。パ
ッケージングヘルパー構築物は、全てのウイルスタンパク質を、ウイルスタンパ
ク質をコードしないが、パッケージングおよび統合のための必要なシス要素の全
てを保持するベクターゲノムに対してトランスに提供する。パッケージングヘル
パー構築物からのパッケージングシグナルの欠失は、ベクター粒子へのその統合
を防止する。

【００４１】図３.レトロウイルスベクター設計の改善パネルＡ.分けたパッケージングヘルパー構築物。Ｇａｇ−ＰｏｌおよびＥｎｖ
タンパク質をコードする配列を、二つの異なるプラスミドに分け、異種融合タン
パク質(例えばＶＳＶＧタンパク質の使用により安全性を更に増加させる。発
現は、非ＬＴＲプロモーター(例えば、ヒトＣＭＶプロモーター)の使用を介して
パッケージングヘルパーから最大化される。パネルＢ.ＳＩＮベクター。５'ＬＴＲのＵ３プロモーター配列をＣＭＶプロモー
ターで置き換え、３'ＬＴＲのＵ３プロモーターを欠失により最少にする。逆転
写に続いて、欠失Ｕ３配列(△Ｕ３)をプロウイルスの５'および３'ＬＴＲの両方
に複製し、統合ベクター５'ＬＴＲからの非常に減少したプロモーター活性をも
たらす。これは、自己不活性化(ＳＩＮ)ウイルスの基礎である。

【００４２】図４.ポリアデニル化シグナル：上流エンハンサー(ＵＥ)の役割パネルＡ.ポリアデニル化効率のＵＥ仲介促進のモデル。コアポリアデニル化シ
グナルは二つの要素：ＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチドおよびＧ／Ｕリッチ要素
からなり、これら二つの要素の間で開裂が起こる。

【００４３】パネルＢ.ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルは上流エンハンサー(ＵＥ、ａ／
ｋ／ａＵＳＥ)および下流エンハンサー(ＤＳＥ)を含む。４０ヌクレオチド長Ｕ
ＳＥは、配列ＡＵＵＧＵＰｕＡを有する３つのほぼ一の要素(矢印)から成る。Ｕ
ＳＥはＡＡＵＡＡＡモチーフに対して−１５から−５４ヌクレオチドに位置する
。

【００４４】パネルＣ.完全長ＨＩＶ−１ＬＴＲの模式的提示である。ＡＡＵＡＡＡ要素は
、Ｒ／Ｕ５境界を定義する開裂／ポリアデニル化部位の１９ヌクレオチド上流の
Ｒ領域に位置する。Ｇ／Ｕリッチ配列はＵ５領域に位置する。内因性上流要素(
ＵＨＥ)は、ＡＡＵＡＡＡモチーフの７７−９４ヌクレオチド上流のＵ３領域内
に位置する。推定マイナー上流要素配列(ＵＨＥ_Ｍ)はＡＡＵＡＡＡシグナルの１
４６−１７１ヌクレオチド上流に位置する。

【００４５】パネルＤ.自己不活性化(ＳＩＮ)ＨＩＶ−１ＬＴＲの模式的提示。ＨＩＶ−１
コアポリアデニル化要素およびＵＨＥはＳＩＮ−ＬＴＲにおいて保存され、Ｕ３
領域内のプロモーターの３９５ヌクレオチド欠失により創生される。残りのＵ３
配列は５'末端に３８ヌクレオチドを含み、それはインテグラーゼ結合部位(ａｔ
ｔ)および２３ヌクレオチド領域を、１８ヌクレオチド長ＵＨＥを含むＵ３の３'
境界に含む(図７Ａもまた参照)。

【００４６】図５.上流エンハンサー(ＵＥ)の例ヒト免疫不全ウイルスタイプ１ＵＨＥ(配列番号１１)；ＳＶ４０ＵＳＥ(配
列番号１)；ウマ感染性貧血ウイルスＵＥ(配列番号２)；カリフラワーモザイク
ウイルスＵＥ(配列番号５)；地リス肝炎ウイルスＵＧＥ(配列番号６)；アデノウ
イルスＬ３ＵＥ(配列番号８)；ヒト補体Ｃ２ＵＥ(配列番号９)；ラミンＢ２ＵＥ(配列番号１０)。各ＵＥの３'末端(枠内に示す)からＡＡＵＡＡＡシグナ
ル(楕円として示す)までの距離を示す。

【００４７】図６.最少ＳＩＮベクターｐＣＳＯはレンチウイルス骨格を含むＳＩＮレトロウイルスベクターである。
それはＨＩＶ−１ゲノムの２１００ヌクレオチドを含む。ｐＳＣＯ−ＭＰはｐＳ
ＣＯ由来であり、ＨＩＶ−１配列は８３５ヌクレオチドに減少されている。ＲＲ
Ｅ部位を含むｅｎｖ配列が欠失しており、ｇａｇ配列の長さがかなり減少してい
る。全てのスプライス部位が欠失している。ｇａｇの１番目のコドンは停止コド
ン(Ｌ１３Ｘ)に変異しており、中心ポリプリン・トラクト・セントラル停止配列
(ｃＰＰＴ／ＣＴＳ)を挿入し、逆転写の効率を増加させる。これらのベクターの
ヌクレオチド番号付けは、ｐＮＬ４−３配列に基づく。

【００４８】図７Ａ＆７Ｂ.増強された転写終結構造を伴うＳＩＮ−ＬＴＲの操作図７Ａ.ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ。ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルの構造
を黒背景で示す。ＳＩＮ３'ＬＴＲの構造を白背景で示す。４０ヌクレオチドＳ
Ｖ４０上流エンハンサー(ＵＳＥ)をａｔｔ部位とＨＩＶＬＴＲ上流エンハンサ
ー(ＵＨＥ)の間に挿入した。図７Ｂ.操作した転写終結構造を伴うＳＩＮＬＴＲの種々の立体配置の模式的
提示。ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルの構造を黒背景で示す。ＳＩＮ３'
ＬＴＲの構造を白背景で示す。地リス肝炎ウイルスの構造を斜線で示す。構築物
ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＨＥ_Ｍ、ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ_ＰおよびＳＩＮ−ＬＴＲ−
ＵＳＥの構築物は、ＵＳＥ配列の挿入物または内因性推定ＵＥ配列を含む。ＳＩ
Ｎ−ＬＴＲ−ＵＨＥ_ＭはマイナーＨＩＶ−１推定ＵＥ(ＵＨＥ_Ｍ)の２７ヌクレオ
チド挿入物を含む(短い黒矢印)。構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥは、３つの同一
ＡＵＵＵＧＵＰｕＡ要素から成る、ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナル由来の
完全４０ヌクレオチド長ＵＳＥを含む(白矢印)。ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ_Ｐは、
二つのＡＵＵＵＧＵＰｕＡ要素を含む、ＵＳＥの２０ヌクレオチドセグメントを
含む(白矢印)。構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＧＥは地リス完全ウイルス由来の完全
５６ヌクレオチド長ＵＧＥ配列を含む。楕円はＡＡＵＡＡＡシグナルを意味する
。小さい長方形はＧ／Ｕリッチダウンストリーム要素を示す。

【００４９】図８Ａ＆８Ｂ.転写終結効率の測定図８Ａ.多シストロン性発現構築物の模式図。ＣＭＶはサイトメガロウイルスプロモーターを意味する。Ｒｌｕｃはレニラ
ルシフェラーゼコード配列を意味する。ＴＴＳは転写終結構造を意味する。ＩＲ
ＥＳは内部リボザイム挿入部位を意味する。Ｆｌｕｃはホタルルシフェラーゼ
コード配列を意味する。ＳＶポリ(Ａ)はＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを示す
。図８Ｂ.転写終結活性図７Ａおよび７Ｂに示す操作した転写終結構造を有するＳＩＮ−ＬＴＲを、各
々、多シストロン性発現構築物における二つのルシフェラーゼ遺伝子の間に、Ｔ
ＴＳ部位で挿入する。構築物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｒｌｕｃ
およびＦｌｕｃの発現を測定する。Ｒｌｕｃ／Ｆｌｕｃの比率が修飾ＳＩ
Ｎ−ＬＴＲの効率／強度を反映する。

【００５０】図９.ＲＡａｓｅ保護アッセイによる３'ポリ(Ａ)効率の分析のためのリボプロー
ブの設計。図は、標準ＳＩＮ−ＬＴＲ(例えば、ベクターｐＣＳＯ、ｐＣＳＯ−ＭＰ)また
はＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ(例えば、ベクターｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥ)のいずれ
かを含む統合ベクターにおける配列の配置を示す。正常ポリ(Ａ)／開裂部位の位
置は３'Ｒ／Ｕ５境界である。特異的リボプローブを、全ＬＴＲ領域、上流ポリ
プリントラクト(ＰＰＴ)およびＰＰＴに５'の３６ヌクレオチド非関連ヌクレオ
チドの更なる範囲のを含むために、各ベクターのために設計した。予期される保
護フラグメントのサイズを示す。３'Ｒ／Ｕ５境界で正確に終結する転写物を、
示すように、サイズの差異のために読み通し転写物から区別できる。

【００５１】図１０.ＵＳＥ配列を含むベクターの力価ｐＣＳＯ−ＭＰ、ｐＣＯ−ＭＰ.ＵＳＥ_Ｐ、ｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥまたはｐＣ
ＳＯ−ＭＰ.ＵＧＥベクターを含むウイルス粒子を、一過性トランスフェクショ
ンにより生成し、２９３Ｔ細胞で力価測定した。力価はｍｌ当たりの形質導入単
位として示す。

【００５２】発明の詳細な説明本発明のレトロウイルスベクター本発明は、増強された３'転写終結構造を有するレトロウイルスベクターを提
供する。本発明のベクターは、５'ＬＴＲ、ポリアデニル化シグナルを含む３'Ｌ
ＴＲ、およびパッケージングシグナルを有するレトロウイルスベクターゲノムを
含む。レトロウイルスベクターゲノムは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓
壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーヴェー肉腫ウイルス、トリ白血病ウイ
ルス、ヒト免疫不全ウイルス、脊髄増殖性肉腫ウイルス、乳癌ウイルス、ヒト免
疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不
全ウイルス、ビスナウイルスを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ベ
クターは複製欠損のレトロウイルスベクターを含む。典型的に、このような欠損
は１個以上のウイルス構造および複製機能(例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ)の
変異および／または欠失のためである。したがって、本発明のベクターは当分野
で既知の複製欠損レトロウイルスベクターに由来し得る。このようなベクターは
：ｐＣＬのようなモロニーマウス白血病ウイルス(Naviaux et al., J Virol. 70
:5701-5705 (1996))、Ｇ１ＸｓｖＮＡ(Shubert et al., Curr. Eye Res. 16.656
.662 (1997))およびｐＴＩＮ４１４(Cannon et al., J Virol. 70:8234-40 (199
6))のようなモロニーマウス白血病ウイルス；およびＲＣＡＳＢＰ−Ｍ２Ｃ(Zhen
g et al., J Virol. 73:6946-52 (1999))のようなトリ肉腫／白血病ウイルスに
基づくレトロウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。

【００５３】より好ましくは、本発明のベクターは：ｐＨＲ'ＣＭＶｌａｃＺ、ｐＨＲ'ＣＭ
ｌａｃＺＳＩＮ１８およびｐＲＲＬＰＧＫ−ＧＦＰ(Zufferey et al., J. Vir
ol. 72:9873-9880 (1998))、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＬＳ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ
およびＣＬ−Ｇ(Miyoshi et al., J. Virol. 72. 8150-8157 (1998))、ｐＶ６５
３ＣＭＶβ−ｇａｌ(Gasmi et al., J Virol 73:1828-1834 (1999))、ｐＴＶ(Iw
akuma et al., Virology 261:120-232 (1999))、ｐＨ３Ｚ、ｐＨ４Ｚ、ｐＨ５Ｚ
(Kim et al., Virol. 72:811-516))のようなＨＩＶ−１；ＨＩＶ−２(Arya et a
., Hum Gene Ther. 9:1371-80 (1998))；ｐＶＧ(Schnell et al., Hum Gene The
r 11:439-47 (2000))のようなサル免疫不全ウイルス；ＦＩＶ−ｇａｌ(Wang et
al., J Clin Invest. 104:R55-62 (1999))；、ＰＴＦＩＶ(Johnston et al., J
Virol 73:4991-5000 (1999))；ｐＯＮＹ２.１０ｌａｃＺ、ｐＯＮＹ４.０Ｚ(Mit
rophanous et al., Gene Ther. 6:1808-18 (1999))のようなウマ感染性貧血ウイ
ルスを含むが、これらい限定されない。

【００５４】最も好ましくは、本発明のベクターはｐＨＲ'ＣＭＶｌａｃＺＳＩＮ１８(Zu
fferey et al., J Virol. 72:9873-9880 (1988))、ＬＳ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ(Miy
osih et al., J. Virol. 72. 8150-8157 (1988))、ＳＩＮ−Ｗ−ＰＧＫ(Deglon
et al., Hum Gene Ther. 11:179-190 (2000))、ＰＶＧ(Schnell et al., Hum Ge
ne Ther. 11:439-47 (2000))およびｐＴＣ(Iwakuma et al., Virology 261:120-
132 (1999))に由来するＳＩＮレンチウイルスベクター由来である。

【００５５】ベクターの５'ＬＴＲは、非修飾レトロウイルス５ＬＴＲである。すなわち、
天然５'ＬＴＲがレトロウイルスにそのまま存在する。好ましい実施態様におい
て、５'ＬＴＲの内因性Ｕ３プロモーターが、変異および／または欠失により不
活性化されており、異種プロモーターで置換されている。異種プロモーターの活
性は構造的、誘導可能または標的細胞特異的(即ち、発現が１個のまたは数個の
特異的細胞タイプに優勢であるか限定され、他の細胞には無いか少ない)であり
得る。有用な異種プロモーターは、ＣＭＶ(Miyoshi et al., J. Virol. 72:. 81
50-8157 (1988))、ラウス肉腫ウイルスプロモーター(Dull et al., J Virol.72:
8463-71 (1998))、テトラサイクリン誘導可能プロモーター(Hwang et al., J. V
irol. 71:7128-31 (1997))を含むが、これらに限定されない。

【００５６】ベクターの３'ＬＴＲは非修飾レトロウイルス３'ＬＴＲであり得る。好ましい
実施態様において、３'ＬＴＲののＵ３プロモーターは変異または欠失により不
活性化されている。より好ましい実施態様において、このような不活性化はＵ３
プロモーターに特異的である。即ち、不活性化は、ａｔｔ配列および任意の内因
性ＵＥのような３'ＬＴＲの他の構造に不利に働かない。最も好ましい実施態様
において、プロモーターはＨＩＶ−１のｐＮＬ４−３株のほぼ９１１３から９５
０６の残基に対応する領域において配列の変異または欠失により不活性化される
。

【００５７】本発明のベクターは、３'ＬＴＲにおけるポリアデニル化シグナルと操作可能
に結合した１個以上のＵＥ配列を含み得る、増強された３'転写終結構造を有す
る。ＵＥ配列は異種ＵＥ配列または３'ＬＴＲに存在し得る任意の内因性ＵＥ配
列の付加的複製であり得る。一つの実施態様において、３'転写終結構造は１個
以上の異種ＵＥ配列を含む。他の実施態様において、３'転写終結構造は内因性
ＵＥ配列の１個または数個の付加的複製を含む。更に別の実施態様において、３
'転写終結構造は異種および内因性ＵＥ配列の付加的複製の両方を含む。

【００５８】本発明のベクターは更に、細菌および酵母のような微生物細胞におけるベクタ
ー配列の増幅に使用するための、複製の微生物起点および微生物スクリーニング
可能または選択可能マーカーを含み得る。

【００５９】ＵＥおよびその活性セグメント本発明のベクターは任意のＵＥを含み得る。好ましくは、ＵＥは真核生物また
はウイルス遺伝子由来である。例示的ウイルスＵＥは、ＳＶ４０ウイルス(例え
ばＵＳＥ)、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＩＶ−１(例えばＵＨＥ)、地リ
ス肝炎ウイルス(例えばＵＧＥ)、またはウマ感染性貧血ウイルスＵＥのものを含
むが、これらに限定されない(図５参照)。真核生物ＵＥの例は、哺乳類補体Ｃ２
およびラミンＢ２遺伝子のものを含むが、これらに限定されない(図５参照)。好
ましい実施態様において、レトロウイルスベクターはＳＶ４０由来のＵＳＥまた
は地リス肝炎ウイルス由来のＵＧＥを含む。

【００６０】本発明恩ベクターはまたＵＥの活性グメントを含み得る。このようなセグメン
トは、例えば、転写読み通しアッセイを使用した、慣用の実験により決定し得る
。例えば、このようなアッセイは、多シストロン性発現構築物によりコーとされ
る二つのレポーターポリペプチドの相対的発現レベルを測定するためのシステム
を含み、ここでレポーターポリペプチドのコード配列は転写終結構造および内部
リボソーム挿入配列(ＩＲＥＳ)により分離される。特に、発現構築物は５'から
３'方向で以下の要素：宿主細胞中で活性な転写制御要素(例えば、プロモーター
またはエンハンサー)、第１レポーターポリペプチドのコード配列、第１転写終
結構造、内部リボソーム挿入配列(ＩＲＥＳ)、第２レポーターのコード配列、お
よび、所望により、第２転写終結構造を含み、ここで、第１転写終結構造はポリ
アデニル化シグナルを含む。このような構築物の模式図は図８Ａに示す。

【００６１】構築物において使用する転写終結構造は、真核生物またはウイルス遺伝子の３
'非翻訳領域を含み得る。好ましくは、３'非翻訳領域は内因性ポリアデニル化シ
グナルを含む。一つの実施態様において、転写終結構造はレトロウイルス３'Ｌ
ＴＲを含む。好ましい実施態様において、転写終結構造は修飾３'ＬＴＲを含み
、ここでＵ３プロモーターは欠失または他の手段により不活性化される。より好
ましい実施態様において、転写終結構造は、本発明のベクターに挿入する３'Ｌ
ＴＲを含む。

【００６２】ＵＥセグメントの活性は、それを第１転写終結構造のポリアデニル化シグナル
の蒸留に置き、その位置がその構造を通過する転写読み通しを減少させるかどう
かを測定することにより測定し得る。挿入ＵＥセグメントの３'ＬＴＲにおける
ポリアデニル化シグナルに対する配向は、ＵＥセグメントが由来する遺伝子にお
けるポリアデニル化シグナルに対するその配向と同じべきである。

【００６３】ＵＥセグメントは、第１レポーターポリペプチドのコード配列と第１転写終結
構造のポリアデニル化シグナルの間の領域のどこでも挿入し得る。好ましくは、
セグメントはポリアデニル化シグナルの１００ヌクレオチドより少ない上流に挿
入する。最も好ましくは、セグメントはポリアデニル化シグナルの２０ヌクレオ
チドより少ない上流に挿入する。

【００６４】読み通しアッセイは、発現構築物を含むＤＮＡを哺乳類宿主細胞に当分野で既
知の任意の方法を使用して送達することにより行ない得る。好ましくは、宿主細
胞はレトロウイルスベクターの標的細胞として意図するものと同じ哺乳類種由来
である。より好ましくは、宿主細胞はレトロウイルスベクターの標的細胞として
意図するものと同じ種および組織タイプ由来である。より好ましくは、宿主細胞
はレトロウイルスベクターの標的細胞として意図するものと同じである。

【００６５】読み通し活性は、両方のポリペプチドをコードするｍＲＮＡと、第１レポータ
ーポリペプチドのみをコードするｍＲＮＡのレベルを比較することにより測定し
得る。あるいは、活性は二つのレポーターポリペプチドの相対的レベルの比較に
より測定できる。

【００６６】本発明により、ＵＥセグメントは“活性”であり、したがって、３'ＬＴＲポ
リアデニル化シグナルと操作可能に結合しているとき、それが読み通しを少なく
とも約１０％減少させるか、ベクター力価を少なくとも１０％促進する場合、“
ＵＥ配列”と見なす。本発明にしたがい、ＵＥ配列は少なくとも５ヌクレオチド
長である。

【００６７】本発明のベクターを含み得るＵＥおよび活性ＵＥセグメント(即ち、集合的に
ＵＥ配列)の具体的な実施態様は、以下のものを含むが、これらに限定されない
：ａ)配列ＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴ
ＧＴＡＡ(配列番号１)を含むＳＶ４０由来のＵＥ；およびその全ての活性セグメ
ント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはＡＴＴＴＧＴＧＡま
たはＡＴＴＴＧＴＡＡを含む。

【００６８】ｂ)配列ＴＴＴＧＴＧＡＣＧＣＧＴＴＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＡＣＡＧＴＡＴＴＡ
ＴＡＡＧＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＣＴＧＡＣＡＡＴＴ(配列番号２)を含むウマ感染
性貧血ウイルスＵＥ；およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様にお
いて、このようなセグメントはＴＴＴＧＴまたはＴＧＴＴＴＴＴまたはＴＴＧＴ
ＧＴＴを含む。

【００６９】ｃ)配列ＴＧＴＧＴＧＡＧＴＡＧＴＴＣＣＣＡＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＧＧＧＴＴＣ
ＴＴＡＴＡＧＧＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＴＧＡＧＣＡＴＡＴＡＡＧＡＡ
ＡＣＣＣＴＴＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴ(配列番号５)を含むカリ
フラワーモザイクウイルスＵＥ；およびその全ての活性セグメント。好ましい実
施態様において、このようなセグメントはＴＧＴＧＴＧＡＧＴＡＧＴＴ(配列番
号３)またはＴＧＴＧＴＴＧまたはＴＴＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧ
ＴＡ(配列番号４)を含む。

【００７０】ｄ)配列ＴＣＡＴＧＴＡＴＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴ
ＧＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＡＣＴＧＴＴ(配列番号６)を含む地リス肝炎ウイ
ルスＵＥ(ＵＧＥ)；およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様におい
て、このようなセグメントはＴＴＴＴＴ、またはＴＴＧＴＴＴＴＴＧまたはＴＧ
ＴＧＴＴを含む。

【００７１】ｅ)配列ＣＣＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴ
ＡＡＴＧＴＡＣＴＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＴＴ(配列番号８)を含むアデノウイルス
Ｌ３ＵＥ；およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、こ
のようなセグメントはＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴ(配列番号７)を含む。

【００７２】ｆ)配列ＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴ(配列番号１１)を含むＨＩＶ−１ＵＥ
(ＵＨＥとしても既知)；およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様に
おいて、このようなセグメントはＴＴＴＴＴを含む。

【００７３】ｇ)配列ＴＴＧＡＣＴＴＧＡＣＴＣＡＴＧＣＴＴＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＣＡＴＧＧＡ
ＡＴＴＴＣＣＣＡＧＴＴＡＴＧＡＡＡＴＴ(配列番号９)を含む補体Ｃ２ＵＥ；
およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグ
メントはＴＴＧＴＴＴまたはＧＴＴＡＴＧを含む。

【００７４】ｈ)配列ＡＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＡＡＣＧＴＧＴＴＣ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＡＴＴＴＧＴＡＡＴＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴ
ＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＴＴＴＴＴＴ(配列番号１０)を含むラミンＢ２ＵＥ；お
よびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメ
ントはＴＴＴＴＴ、またはＧＴＧＴＴ、またはＴＴＴＧＴ、またはＴＴＴＴＡＴ
Ｇを含む。

【００７５】ＵＥ配列と３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルの操作可能に結合本発明のベクターは、３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルに操作可能に結合し
た１個または数個のＵＥ配列を含む。特に、操作可能に結合は、ベクター３'Ｌ
ＴＲの転写終結因子を促進するＵＥ配列の取り込みを意味する。増強された転写
終結を有するベクターは、種々の改善された特性を有し得る。可能性ある改善は
、フランキングベクターまたは宿主配列への減少した転写読み通し；ベクターＲ
ＮＡおよび／またはベクターコードポリペプチドの増加した製造；およびプロデ
ューサー細胞における高いベクター力価を含む。本発明により、ＵＥ配列は、取
りこみが任意のこれらの特性の約１０％以上の改善に影響する場合、３'ＬＴＲ
ポリアデニル化シグナルと操作可能に結合する。

【００７６】ＵＥ配列は、シグナルの５'上流であるベクター部位に配列を挿入することに
より３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルと操作可能に結合し得る。挿入ＵＥ配列
のポリアデニル化シグナルに対する配向は、配列が由来する遺伝ｓにおけるポリ
アデニル化シグナルに対する配向と同じでなければならない。

【００７７】好ましくは、挿入部位は、対照として非修飾ベクターを使用して、シグナルの
約５００ヌクレオチドより少ない上流である。より好ましくは、部位は約１００
ヌクレオチドより少ない上流である。より更に好ましくは、部位は約５０ヌクレ
オチドより少ない上流である。

【００７８】特に好ましい実施態様において、挿入は３'ＬＴＲのＵ３領域における部位で
ある。更に好ましい実施態様において、このような部位はａｔｔ配列とＵ３旅行
きに存在し得る任意の内因性ＵＥ配列の間である。より更にこのましい実施多様
において、ａｔｔ配列と、Ｕ３プロモーター構造のいくつかまたは全てを含むＵ
Ｅ配列の間の３'ＬＴＲ配列は欠失し、ＵＥ配列が欠失部位に挿入される。最も
好ましい実施態様において、このような欠失は、ＨＩＶ−１のｐＮＬ４−３株の
約９１１３から９５０６残基に対応する領域に伸び、ＵＥ配列が欠失部位に挿入
される。

【００７９】複数のＵＥ配列を含むベクター本発明のベクターは、３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルと操作可能に結合し
た複数のＵＥ配列を含む。本発明は、複数のＵＥ配列の可能性のある組合せ全て
を含むベクターを意図する。組み合わせの例は；２個以上の異種ＵＥ配列が同一
または同じＵＥ由来である；異なるＵＥに由来する２個以上の異種ＵＥ配列；同
じ内因性ＵＥの２個以上の複製、異なる内因性ＵＥ配列の２個以上の複製；１個
以上のＵＥ配列配列と１個以上の内因性ＵＥ配列の付加的複製を含むが、これら
に現地得されない。

【００８０】異種遺伝子およびコード配列本発明のベクターは哺乳類細胞および生物における所望の遺伝子産物の発現に
有意に使用し得る。したがって、ベクターは更に１個以上の異種コード配列を含
み得、ここでこのような配列はベクターが由来するレトロウイルスゲノム以外の
源由来である。

【００８１】一つの実施態様において、異種コード配列をレトロウイルス骨格に、好ましく
は、５'および３'ＬＴＲの間に、それらが５'ＬＴＲプロモーターと操作可能に
結合するように挿入する。このような挿入物が異種コード配列を含む多シストロ
ン性ｍＲＮＡの製造を導く場合、また各配列の効率的な翻訳を達成するために各
異種コード配列とＩＲＥＳを操作可能に結合するのも有利であり得る。

【００８２】他の実施態様において、異種コード配列は、個々のプロモーターと各々操作可
能に結合し、発現構築物を形成し、このような構築物をレトロウイルス骨格に、
好ましくは、５'および３'ＬＴＲの間に挿入する。発現構築物は、構造的、誘導
可能、組織特異的、または細胞サイクル特異的であるプロモーターを含み得る。
有用なプロモーターの例は。ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、アデ
ノウイルスプロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーター、ヒストンプロモ
ーター、ｐｏｌ IIIプロモーターおよびベータ−アクチンプロモーターを含む
が、これらに限定されない。

【００８３】別種の遺伝子生成物を、本発明のベクターを使用して発現し得る。それらはポ
リペプチド、構造ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイムを含む。一つの
実施態様において、本発明のベクターは治療的ポリペプチドをコードする１個以
上の異種配列を含み、発現する。治療的ポリペプチドの例は、サイトカイン、成
長因子、ホルモン、キナーゼ、レセプター、レセプターリガンド、酵素、抗体ポ
リペプチド、転写因子、血液因子および前記の任意の人工誘導体を含む。

【００８４】他の実施態様において、本発明のベクターは陰性選択可能マーカーをコードす
る１個以上の異種配列を含み、発現する。陰性選択可能マーカーは、宿主細胞を
直接的または間接的に阻害するまたは殺す細胞毒粗であり得る。“直接”細胞毒
素の例は、コレラの活性部分およびボツリヌス毒素を含む。好ましい実施態様に
おいて、本発明のベクターは間接左房毒素をコードする１種以上の異種配列を含
み、発現する。間接細胞毒粗は、それ自体は毒性ではないが、他の作動物質との
相互作用により細胞性阻害を達成する。例は、非毒性であるが、ガンシクロビル
のような薬剤を哺乳類細胞を殺す毒性ヌクレオチドに活性化できるＨＳＶ−チミ
ジンキナーゼ(ＴＫ)である。

【００８５】ベクター粒子本発明のベクターを含む感染性レトロウイルス粒子は、当分野で既知の方法に
より製造し得る。例えば、ベクター粒子は、Ｇａｇ／ＰｏｌおよびＥｎｖタンパ
ク質のような必要なレトロウイルス複製機能をトランスで発現するパッケージン
グ細胞をトランスフェクトすることにより製造できる。ＧａｇおよびＰｏｌはウ
イルス構造をおよび酵素要素を提供し、Ｅｎｖはベクター粒子を標的細胞に向け
るために機能する。Ｅｎｖ機能は任意のレトロウイルスまたは、他の包含された
タンパク質(例えば、ＶＳＶＧタンパク質)または特異的細胞表面レセプターを
結合する任意の分子由来の、融合またはスパイクタンパク質を含むことができる
。

【００８６】本発明の感染性ベクター粒子は哺乳類細胞および生物中で異種コード配列の発
現に使用し得る。一つの実施態様において、異種コード配列を含む感染性ベクタ
ー粒子の有効な投与量を、直接哺乳類生物に投与し、生物無いで標的細胞の形質
導入を達成する。他の実施態様において、哺乳類細胞を、このようなベクター粒
子でインビトロで形質導入し、形質導入細胞をついでインビボで宿主に投与する
。好ましくは、本発明の感染性ベクター粒子は、霊長類および霊長類細胞に異種
コード配列を発現するために使用する。より好ましくは、本発明のベクター粒子
はヒトおよびヒト細胞に異種コード配列を発現するために使用する。

【００８７】実施例導入本実施例は３'ＬＴＲに非常に効率的な転写終結構造を有する新規レトロウイ
ルスベクターの構築を証明する。これは、ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナル
に由来するＵＳＥ配列の、自己不活性化(ＳＩＮ)レンチウイルスベクターの３'
ＬＴＲＵ３領域への挿入により達成された。逆転写の間、３'ＬＴＲＵ３領
域は、両方のＬＴＲに複製され、統合ベクターの５'および３'ＬＴＲの両方がこ
のＵＳＥ−ＳＩＮ配置となるようにする。新規ＬＴＲ構造を含むベクターは、増
強されたポリアデニル化効率、統合プロウイルスからの減少した読み通し転写、
および親ＳＩＮレトロウイルスベクターｐＣＳＯ−ＭＰと比較した場合、少なく
とも２倍増加したベクター力価を有する。

【００８８】方法および結果レトロウイルスベクター親ＳＩＮベクターｐＣＳＯ−ＭＰは、レンチウイルス骨格を含み、先に記載の
ものと類似のｐＣＳＯのような関与のＳＩＮベクターよりも改善されている(Miy
oshi et al., J. Virol. 72:8250-7 (1988))(図６)。ｐＣＳＯは、ＨＩＶ−１ゲ
ノム配列の２１００ヌクレオチドを含む。ｐＣＳＯ−ＭＰにおいて、ＨＩＶ−１
配列は８３５ヌクレオチドまで減少されている。先に記載のＳＩＮベクターと比
較したこのベクターの重要な性質は、全てのＨＩＶ−１スプライス部位のおよび
ｅｎｖ配列の欠失、ｇａｇオープンリーディングフレームの量の著しい減少およ
びｐＣＳＯ−ＭＰへの中心ポリプリントラクト／中心終結配列(ｃＰＰＴ／ＣＴ
Ｓ)の挿入である(図６)。これらの修飾は、ベクターとパッケージング要素をコ
ードする配列の相同配列重複の程度を非常に減少させ、それにより相同組換えを
介した複製コンピテントレトロウイルス(ＲＣＲ)の生成の危険性を減少させ、最
適ベクター機能は維持されている。種々の転写終結構築物を含むｐＣＳＯ−ＭＰ
の誘導体が製造され、その特性が試験されている。

【００８９】転写終結構築物種々のＵＥ配列で修飾されたＳＩＮ−ＬＴＲを含む数個の転写終結構築物が、
標準組換えＤＮＡ法を使用して製造され、試みられている。一つの構築物ＳＩＮ
−ＬＴＲ−ＵＳＥは、３つのコアＡＵＵＵＧＵＰｕＡ要素を有するＳＶ４０の完
全ＵＳＥを含む４０ヌクレオチド配列を含む。他の構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳ
Ｅ_Ｐは、二つのコア要素のみを含む部分的ＵＳＥを含む。第３の構築物ＳＩＮ−
ＬＴＲ−ＵＨＥ_Ｍは、配列ＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＡＣＴＴＴ(配列番号１２)(
ＵＨＥ_Ｍ)を有するＨＩＶ−１推定マイナーポリアデニル化エンハンサーを含む
。第４の構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＧＥは地リスＢ型肝炎ウイルス由来の完全５
６ヌクレオチド長ＵＧＥ配列を含む。各構築物において、ＵＥ配列は、ｐＣＳＯ
−ＭＰの３'ＬＴＲの統合接合部位(Masuda et al., J. Virol. 72:8396-8402 (1
998))と内因性ＨＩＶ−１上流エンハンサー(ＵＨＥ)(Valsamakis et al., Mol.
Cell Biol. 12:3699-3705 (1992))の間に挿入する。これらの挿入は、ＳＩＮ−
ＬＴＲのＵ３領域におけるａｔｔとＵＨＥの結合部におけるＸｈｏＩ制限部位
の操作により促進される。これらの構築物の構造は図７Ａおよび７Ｂに示す。

【００９０】転写読み通しアッセイこれらの転写終結構築物の活性は、図８Ａに示す多シストロン性発現カセット
に基づく転写読み通しアッセイを使用して評価する。転写終結構築物は二つのレ
ポーター遺伝子、レニラルシフェラーゼ(Ｒｌｕｃ)およびホタルルシフェラー
ゼ(Ｆｌｕｃ)の間に挿入し、ＲｌｕｃおよびＦｌｕｃ活性の量を、発現カ
セットを含むプラスミドの２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションに続いて測定
する。ＲｌｕｃおよびＦｌｕｃ活性は、ルシフェラーゼアッセイキット(Pro
mega)を使用して測定する。発現カセット中の内部リボソーム挿入部位(ＩＲＥＳ
)配列の存在は、ｍＲＮＡ上で第２コード配列であってさえ、Ｆｌｕｃ発現を
可能ににする。この配置において、Ｆｌｕｃの発現は転写が挿入構築物により
終結する効率と逆相関する。加えて、第１レポーター遺伝子、Ｒｌｕｃの発現
レベルはｍＲＮＡの全体的安定性／翻訳可能性を反映し、それはまた挿入構築物
の強度により影響される。一緒に考えて、挿入終結構築物のこれらら二つの異な
る効果は、二つのルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現の比率の変化を組み合
わる。構築物の活性は、発現されたＲｌｕｃ：Ｆｌｕｃの比率いのけるそれ
らの効果に基づいて比較できる(即ち、高い比率を有する構築物は、低い比率を
有する構築物と比較して増強された終結活性を有する)。

【００９１】前記のアッセイは、ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥにおける転写終結構造が、天然Ｈ
ＩＶ−１ＬＴＲまたは既知の最強のシグナルの一つであると考えられる野生型
ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルよりさえ、強いポリアデニル化シグナルで
ある。完全ＵＳＥの付加はＳＩＮ−ＬＴＲのポリアデニル化強度を約３倍増加さ
せ、一方ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ_Ｐへの２個のＵＳＥのＡＵＵＵＧＵＰｕＡ要素
の付加は、約２倍ポリアデニル化強度をＳ苦心する。ＨＩＶ−１推定マイナーエ
ンハンサー(ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＨＥ_Ｍ)の付加はポリアデニル化効率を減少させ
る。これらの結果を図８に要約する。

【００９２】ＲＮａｓｅ保護アッセイＲＮａｓｅ保護アッセイを、ＬＴＲに異なる転写終結構造を有する種々のＳＩ
Ｎ由来ベクターに関する正確に終結したベクター転写物対読み通し転写物の比率
の分析に使用する。標識ＲＮＡプローブを各ベクター３'ＬＴＲ配置(図９)に関
して製造し、種々のベクターを含む２９３Ｔ細胞集団におけるベクター由来転写
物のプローブに使用する。これらのアッセイは、ベクターｐＣＳＯ−ＭＰにおけ
るＳＩＮ−ＬＴＲポリアデニル化シグナルが、ほぼ同じ効率で正確にポリアデニ
ル化および読み通し転写物の両方を生成することを示す。対照的に、ＵＳＥまた
はＵＳＥ_Ｐ要素のＳＩＮ−ＬＴＲへのａｔｔおよびＵＨＥ境界への挿入は、正確
なポリアデニル化部位の量を実質的に増加させ、読み通し転写物の量を対応して
減少させる。(データは示していない)

【００９３】ベクター力価完全および部分的ＵＳＥおよび完全ＵＧＥを、ベクターｐＳＣＯ−ＭＰの３'
ＬＴＲに挿入し、ベクターｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥ、ｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥ_Ｐお
よびｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＧＥをそれぞれ創生する。ベクター粒子は、記載のよう
に、これらのベクターを含むプラスミドと、複製ヘルパープラスミドｐＣＭＶ△
Ｒ８.７１およびｐＭＤ.Ｇの２９３Ｔ細胞への共トランスフェクションにより生
成する(Naldini et al., Science 272:263-267 (1996))。トランスフェクト細胞
から製造したベクター上清は、２９３Ｔ細胞で力価測定する。これらの分析は、
ベクターｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥが標準ＳＩＮ−ＬＴＲベクターであるｐＣＳＯ
−ＭＰよりも少なくとも２倍高いベクター力価を提供することを示す(図１０)。
ベクター力価を増加させる能力は、ベクターｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥ中のが約２
倍までベクター力価を増加させるため、ＵＳＥの特性だけではない。ｍＲＮＡの
高い定常状態レベルは強いポリアデニル化シグナルによる処理に起因することが
知られている。したがって、３'ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥまたは３'ＳＩＮ−ＬＴ
Ｒ−ＵＧＥ配置は、プロデューサー細胞においてベクター転写物に高い安定性を
付与し、それは高いベクター力価をもたらす。

【００９４】本発明は本明細書に記載の具体的実施態様により範囲を限定するものではない
。実際、本明細書に記載されたものに加えて種々の修飾が、前記および添付の図
面から当業者に明らかとなるであろう。このような修飾は特許請求の範囲の範囲
内にあると解釈する。

【００９５】種々の刊行物を本明細書で引用し、その記載はその全体を出典明示により本明
細書に包含させる。

【図面の簡単な説明】

【図１】レトロウイルスゲノム構成パネルＡ.単純Ｃ型レトロウイルスの基本的構成を示す。長い末端反復(ＬＴＲ)
は、各々５'および３'ＬＴＲを優勢に使用するプロモーターおよびポリアデニル
化配列を含む。完全長およびスプライスした転写物の両方を製造し、これらは３
つの主用タンパク質をコードする；ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌは完全長転写物
からの翻訳であり、ｅｎｖはスプライスされた転写物からの翻訳物である。完全
長転写物はまたＲＮＡゲノムとして働く。ゲノムの５'領域に、ゲノムをウイル
ス粒子に統合するのに必要なパッケージングシグナル(Ψ)である。ＳＤ、スプラ
イスドナー；ＳＡ、スプライスアクセプター。パネルＢ.ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と名付けられる３つの領域を含む。プ
ロモーターおよびエンハンサー配列は５'ＬＴＲでのみ活性であり、Ｕ３領域に
位置し、一方３'ＬＴＲはＲ／Ｕ５境界を定義する。ＬＴＲの末端のａｔｔ配列
は統合に必要である。

【図２】複製欠損レトロウイルスベクター粒子の製造野生型レトロウイルス、パッケージングヘルパー構築物および複製欠損レトロ
ウイルスのゲノムは、各々図面の上段、中段および下段に示すとおりである。パ
ッケージングヘルパー構築物は、全てのウイルスタンパク質を、ウイルスタンパ
ク質をコードしないが、パッケージングおよび統合のための必要なシス要素の全
てを保持するベクターゲノムに対してトランスに提供する。パッケージングヘル
パー構築物からのパッケージングシグナルの欠失は、ベクター粒子へのその統合
を防止する。

【図３】レトロウイルスベクター設計の改善パネルＡ.分けたパッケージングヘルパー構築物。Ｇａｇ−ＰｏｌおよびＥｎｖ
タンパク質をコードする配列を、二つの異なるプラスミドに分け、異種融合タン
パク質(例えばＶＳＶＧタンパク質の使用により安全性を更に増加させる。発
現は、非ＬＴＲプロモーター(例えば、ヒトＣＭＶプロモーター)の使用を介して
パッケージングヘルパーから最大化される。パネルＢ.ＳＩＮベクター。５'ＬＴＲのＵ３プロモーター配列をＣＭＶプロモー
ターで置き換え、３'ＬＴＲのＵ３プロモーターを欠失により最少にする。逆転
写に続いて、欠失Ｕ３配列(△Ｕ３)をプロウイルスの５'および３'ＬＴＲの両方
に複製し、統合ベクター５'ＬＴＲからの非常に減少したプロモーター活性をも
たらす。これは、自己不活性化(ＳＩＮ)ウイルスの基礎である。

【図４】ポリアデニル化シグナル：上流エンハンサー(ＵＥ)の役割パネルＡ.ポリアデニル化効率のＵＥ仲介促進のモデル。コアポリアデニル化シ
グナルは二つの要素：ＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチドおよびＧ／Ｕリッチ要素
からなり、これら二つの要素の間で開裂が起こる。パネルＢ.ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルは上流エンハンサー(ＵＥ、ａ／
ｋ／ａＵＳＥ)および下流エンハンサー(ＤＳＥ)を含む。４０ヌクレオチド長Ｕ
ＳＥは、配列ＡＵＵＧＵＰｕＡを有する３つのほぼ一の要素(矢印)から成る。Ｕ
ＳＥはＡＡＵＡＡＡモチーフに対して−１５から−５４ヌクレオチドに位置する
。パネルＣ.完全長ＨＩＶ−１ＬＴＲの模式的提示である。ＡＡＵＡＡＡ要素は
、Ｒ／Ｕ５境界を定義する開裂／ポリアデニル化部位の１９ヌクレオチド上流の
Ｒ領域に位置する。Ｇ／Ｕリッチ配列はＵ５領域に位置する。内因性上流要素(
ＵＨＥ)は、ＡＡＵＡＡＡモチーフの７７−９４ヌクレオチド上流のＵ３領域内
に位置する。推定マイナー上流要素配列(ＵＨＥ_Ｍ)はＡＡＵＡＡＡシグナルの１
４６−１７１ヌクレオチド上流に位置する。パネルＤ.自己不活性化(ＳＩＮ)ＨＩＶ−１ＬＴＲの模式的提示。ＨＩＶ−１
コアポリアデニル化要素およびＵＨＥはＳＩＮ−ＬＴＲにおいて保存され、Ｕ３
領域内のプロモーターの３９５ヌクレオチド欠失により創生される。残りのＵ３
配列は５'末端に３８ヌクレオチドを含み、それはインテグラーゼ結合部位(ａｔ
ｔ)および２３ヌクレオチド領域を、１８ヌクレオチド長ＵＨＥを含むＵ３の３'
境界に含む(図７Ａもまた参照)。

【図５】上流エンハンサー(ＵＥ)の例ヒト免疫不全ウイルスタイプ１ＵＨＥ(配列番号１１)；ＳＶ４０ＵＳＥ(配
列番号１)；ウマ感染性貧血ウイルスＵＥ(配列番号２)；カリフラワーモザイク
ウイルスＵＥ(配列番号５)；地リス肝炎ウイルスＵＧＥ(配列番号６)；アデノウ
イルスＬ３ＵＥ(配列番号８)；ヒト補体Ｃ２ＵＥ(配列番号９)；ラミンＢ２ＵＥ(配列番号１０)。各ＵＥの３'末端(枠内に示す)からＡＡＵＡＡＡシグナ
ル(楕円として示す)までの距離を示す。

【図６】最少ＳＩＮベクターｐＣＳＯはレンチウイルス骨格を含むＳＩＮレトロウイルスベクターである。
それはＨＩＶ−１ゲノムの２１００ヌクレオチドを含む。ｐＳＣＯ−ＭＰはｐＳ
ＣＯ由来であり、ＨＩＶ−１配列は８３５ヌクレオチドに減少されている。ＲＲ
Ｅ部位を含むｅｎｖ配列が欠失しており、ｇａｇ配列の長さがかなり減少してい
る。全てのスプライス部位が欠失している。ｇａｇの１番目のコドンは停止コド
ン(Ｌ１３Ｘ)に変異しており、中心ポリプリン・トラクト・セントラル停止配列
(ｃＰＰＴ／ＣＴＳ)を挿入し、逆転写の効率を増加させる。これらのベクターの
ヌクレオチド番号付けは、ｐＮＬ４−３配列に基づく。

【図７】増強された転写終結構造を伴うＳＩＮ−ＬＴＲの操作図７Ａ.ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ。ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルの構造
を黒背景で示す。ＳＩＮ３'ＬＴＲの構造を白背景で示す。４０ヌクレオチドＳ
Ｖ４０上流エンハンサー(ＵＳＥ)をａｔｔ部位とＨＩＶＬＴＲ上流エンハンサ
ー(ＵＨＥ)の間に挿入した。図７Ｂ.操作した転写終結構造を伴うＳＩＮＬＴＲの種々の立体配置の模式的
提示。ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルの構造を黒背景で示す。ＳＩＮ３'
ＬＴＲの構造を白背景で示す。地リス肝炎ウイルスの構造を斜線で示す。構築物
ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＨＥ_Ｍ、ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ_ＰおよびＳＩＮ−ＬＴＲ−
ＵＳＥの構築物は、ＵＳＥ配列の挿入物または内因性推定ＵＥ配列を含む。ＳＩ
Ｎ−ＬＴＲ−ＵＨＥ_ＭはマイナーＨＩＶ−１推定ＵＥ(ＵＨＥ_Ｍ)の２７ヌクレオ
チド挿入物を含む(短い黒矢印)。構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥは、３つの同一
ＡＵＵＵＧＵＰｕＡ要素から成る、ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナル由来の
完全４０ヌクレオチド長ＵＳＥを含む(白矢印)。ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ_Ｐは、
二つのＡＵＵＵＧＵＰｕＡ要素を含む、ＵＳＥの２０ヌクレオチドセグメントを
含む(白矢印)。構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＧＥは地リス完全ウイルス由来の完全
５６ヌクレオチド長ＵＧＥ配列を含む。楕円はＡＡＵＡＡＡシグナルを意味する
。小さい長方形はＧ／Ｕリッチダウンストリーム要素を示す。

【図８】転写終結効率の測定図８Ａ.多シストロン性発現構築物の模式図。ＣＭＶはサイトメガロウイルスプロモーターを意味する。Ｒｌｕｃはレニラ
ルシフェラーゼコード配列を意味する。ＴＴＳは転写終結構造を意味する。ＩＲ
ＥＳは内部リボザイム挿入部位を意味する。Ｆｌｕｃはホタルルシフェラーゼ
コード配列を意味する。ＳＶポリ(Ａ)はＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを示す
。図８Ｂ.転写終結活性図７Ａおよび７Ｂに示す操作した転写終結構造を有するＳＩＮ−ＬＴＲを、各
々、多シストロン性発現構築物における二つのルシフェラーゼ遺伝子の間に、Ｔ
ＴＳ部位で挿入する。構築物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｒｌｕｃ
およびＦｌｕｃの発現を測定する。Ｒｌｕｃ／Ｆｌｕｃの比率が修飾ＳＩ
Ｎ−ＬＴＲの効率／強度を反映する。

【図９】ＲＡａｓｅ保護アッセイによる３'ポリ(Ａ)効率の分析のための
リボプローブの設計。図は、標準ＳＩＮ−ＬＴＲ(例えば、ベクターｐＣＳＯ、ｐＣＳＯ−ＭＰ)また
はＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ(例えば、ベクターｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥ)のいずれ
かを含む統合ベクターにおける配列の配置を示す。正常ポリ(Ａ)／開裂部位の位
置は３'Ｒ／Ｕ５境界である。特異的リボプローブを、全ＬＴＲ領域、上流ポリ
プリントラクト(ＰＰＴ)およびＰＰＴに５'の３６ヌクレオチド非関連ヌクレオ
チドの更なる範囲のを含むために、各ベクターのために設計した。予期される保
護フラグメントのサイズを示す。３'Ｒ／Ｕ５境界で正確に終結する転写物を、
示すように、サイズの差異のために読み通し転写物から区別できる。

【図１０】ＵＳＥ配列を含むベクターの力価ｐＣＳＯ−ＭＰ、ｐＣＯ−ＭＰ.ＵＳＥ_Ｐ、ｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥまたはｐＣ
ＳＯ−ＭＰ.ＵＧＥベクターを含むウイルス粒子を、一過性トランスフェクショ
ンにより生成し、２９３Ｔ細胞で力価測定した。力価はｍｌ当たりの形質導入単
位として示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 CA11 DA02 EA02 FA06 FA07 HA08 HA17 4B065 AA90X AA97Y AB01 AC20 BA02 CA45 4C084 AA16 NA13 NA14 ZC542 4C087 BC83 NA13 NA14 ZC54

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ)５'ＬＴＲ；ｂ)ポリアデニル化シグナルを含む３'ＬＴＲ；およびｃ)該ポリアデニル化シグナルと操作可能に結合している(ｉ)１個または数個の
異種上流エンハンサー(ＵＥ)配列および／または(ii)１個または数個の内因性Ｕ
Ｅ配列の付加的複製：を含む、レトロウイルスベクター。
【請求項２】数個のＵＥ配列を含み、少なくともその二つが同じＵＥに由
来する、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項３】数個のＵＥ配列を含み、少なくともその二つが異なるＵＥに
由来する、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項４】数個の内因性ＵＥ配列の付加的複製を含み、少なくともその
二つの複製が同一配列を有する、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項５】数個の内因性ＵＥ配列の付加的複製を含み、少なくともその
二つの複製が異なる配列を有する、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項６】該異種ＵＥ配列、または該異種ＵＥ配列の少なくとも一つ、
または内因性ＵＥ配列の該付加的複製、または内因性ＵＥ配列の該付加的複製の
少なくとも一つが、該３'ＬＴＲにある、請求項１に記載のレトロウイルスベク
ター。
【請求項７】該異種ＵＥ配列、または該異種ＵＥ配列の少なくとも一つ、
または内因性ＵＥ配列の該付加的複製、または内因性ＵＥ配列の該付加的複製の
少なくとも一つが、該３'ＬＴＲのＵ３領域にある、請求項１に記載のレトロウ
イルスベクター。
【請求項８】該３'ＬＴＲが機能的Ｕ３プロモーターを有しない、請求項
１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項９】該３'ＬＴＲがＵ３プロモーターの欠失を含む、請求項８に
記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１０】該異種ＵＥ配列、または該異種ＵＥ配列の少なくとも一つ
、または内因性ＵＥ配列の該付加的複製、または内因性ＵＥ配列の該付加的複製
の少なくとも一つが、Ｕ３プロモーター欠失部位にある、請求項９に記載のレト
ロウイルスベクター。
【請求項１１】該異種ＵＥ配列または該異種ＵＥ配列の少なくとも一つが
ウイルスＵＥ配列である、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１２】該ウイルスＵＥ配列がＳＶ４０、カリフラワーモザイクウ
イルス、ＨＩＶ−１、地リス肝炎ウイルスまたはウマ感染性貧血ウイルスＵＥ配
列である、請求項１１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１３】該ウイルスＵＥ配列がＡＴＴＴＧＴＧＡまたはＡＴＴＴＧ
ＴＡＡを含むＳＶ４０ＵＥ配列である、請求項１２に記載のレトロウイルスベ
クター。
【請求項１４】該ＳＶ４０ＵＥ配列がＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴ
ＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡ(配列番号１)を含む、請
求項１３に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１５】該異種ＵＥ配列または該異種ＵＥ配列の少なくとも一つが
動物ＵＥ配列である、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１６】該動物ＵＥ配列が補体Ｃ２またはラミンＢ２ＵＥ配列で
ある、請求項１５に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１７】レンチウイルス配列を含む、請求項１に記載のレトロウイ
ルスベクター。
【請求項１８】該３'ＬＴＲが内因性ＵＥ配列を含む、請求項１に記載の
レトロウイルスベクター。
【請求項１９】該５'ＬＴＲがＵ３領域に挿入された異種プロモーターを
含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２０】５'ＬＴＲが内因性Ｕ３プロモーター配列の欠失を含む、
請求項１９に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２１】該５'ＬＴＲの３'下流であり、該３'ＬＴＲの５'上流であ
る異種コード配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２２】該異種コード配列が治療的ポリペプチドをコードする、請
求項２１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２３】該異種コード配列が陰性選択マーカーをコードする、請求
項２１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２４】請求項１に記載のレトロウイルスベクターを含む、細胞。
【請求項２５】哺乳類細胞である、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】ヒト細胞である、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】請求項１に記載のレトロウイルスベクター由来のプロウイ
ルス配列を含む、細胞。
【請求項２８】哺乳類細胞である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】ヒト細胞である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】細胞がプロデューサー細胞である、請求項２６に記載の細
胞により製造された感染性レトロウイルス粒子。
【請求項３１】請求項２１に記載のレトロウイルスベクターを細胞に送達
することを含む、細胞において異種コード配列を発現する方法。
【請求項３２】異種コード配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求
項３１に記載の方法。
【請求項３３】該異種コード配列が陰性選択マーカーをコードする、請求
項３１に記載の方法。
【請求項３４】請求項２１に記載のレトロウイルスベクターを含む感染性
レトロウイルス粒子を細胞に送達することを含む、細胞において異種コード配列
を発現する方法。
【請求項３５】異種コード配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求
項３４に記載の方法。
【請求項３６】該異種コード配列が陰性選択マーカーをコードする、請求
項３４に記載の方法。
【請求項３７】請求項２１に記載のレトロウイルスベクターを含む感染性
レトロウイルス粒子を宿主に送達することを含む、被検体の細胞において異種コ
ード配列を発現する方法。
【請求項３８】異種コード配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求
項３７に記載の方法。
【請求項３９】該異種コード配列が陰性選択マーカーをコードする、請求
項３８に記載の方法。
【請求項４０】該被検体が哺乳類である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】該被検体がヒトである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】請求項２４に記載の細胞を含む組成物を被検体に注入する
ことを含む、被検体において異種コード配列を発現する方法。
【請求項４３】該被検体が哺乳類である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】該被検体がヒトである、請求項４３に記載の方法。