ES2618508T3 - Células que comprenden partículas lentivíricas con codones optimizados - Google Patents

Células que comprenden partículas lentivíricas con codones optimizados Download PDF

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Abstract

Un método de producción de un vector de VIH de replicación defectuosa, que comprende transfectar una célula productora con lo siguiente: i) un genoma del VIH que comprende un nucleótido de interés (NOI), una señal de empaquetamiento y RRE; ii) una secuencia nucleotídica que codifica las proteínas gag y pol del VIH; y iii) una secuencia nucleotídica que codifica una proteína env; caracterizado por que la secuencia nucleotídica que codifica las proteínas gag y pol del VIH está optimizada en sus codones para la expresión en la célula productora, a excepción de la secuencia que engloba el sitio de desplazamiento de fase de lectura, y en el que (ii) no comprende RRE; en el que la célula productora expresa rev y en el que el vector de VIH es un vector de autoinactivación.

Description

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eliminando así cualquier posibilidad de recombinación con cualquier RRE contenido en el genoma del vector.
Una vez, es necesario expresar las secuencias de los NOI del vector retrovírico. En un retrovirus, el promotor se sitúa en la región U3 de LTR 5' del provirus. En los vectores retrovíricos, el promotor que conduce la expresión de un gen terapéutico puede ser el promotor retrovírico nativo en la región U3 de 5', o un promotor alternativo diseñado mediante ingeniería en el vector. El promotor alternativo puede reemplazar físicamente al promotor U3 de 5' nativo en el retrovirus o se puede incorporar en un sitio diferente dentro del genoma del vector, tal como entre las LTR.
Por lo tanto, el NOI también estará unido de forma operativa a una secuencia de control reguladora de la transcripción para permitir que se produzca la transcripción de la primera secuencia nucleotídica en la célula diana. La secuencia de control normalmente será activa en células de mamífero. La secuencia de control puede ser, por ejemplo, un promotor vírico tal como el promotor vírico natural o un promotor de CMV, o puede ser un promotor de mamífero. Se prefiere usar en particular un promotor que sea preferentemente activo en un determinado tipo de célula o de tejido, en el que el virus que se va tratar infecte principalmente. Por lo tanto, en una realización, se pueden usar secuencias reguladoras específicas de tejidos. Las secuencias de control reguladoras que dirigen la expresión de la una o más primeras secuencias nucleotídicas pueden ser promotores constitutivos o regulados.
La expresión "unida de forma operativa" indica una relación entre una región reguladora (normalmente un elemento promotor, pero puede incluir un elemento potenciador) y la región codificante de un gen, mediante la que la transcripción de la región codificante está bajo el control de la región reguladora.
Como se usa en el presente documento, el término "potenciador" incluye una secuencia de ADN que se une a otros componentes proteicos del complejo de iniciación de la transcripción y facilita así el inicio de la transcripción dirigida por su promotor asociado.
En una realización preferida de la presente invención, el potenciador es un elemento de respuesta de tipo isquémico (ILRE).
La expresión "elemento de respuesta de tipo isquémico" -escrito de otro modo como ILRE -incluye un elemento que es sensible a o es activo en condiciones de isquemia o condiciones que son similares a la isquemia o están provocadas por la isquemia. A modo de ejemplo, las condiciones que son similares a la isquemia o que están provocadas por la isquemia incluyen la hipoxia y/o una o varias concentraciones bajas de glucosa.
El término "hipoxia" significa un estado en el que un determinado órgano o tejido recibe un suministro inadecuado de oxígeno.
La isquemia puede ser un suministro insuficiente de sangre a un órgano o tejido específico. Una consecuencia de la reducción del suministro de sangre es un suministro inadecuado de oxígeno al órgano o tejido (hipoxia). La hipoxia prolongada puede dar lugar a una lesión en el órgano o tejido afectado.
Un ILRE preferido es un elemento de respuesta a la hipoxia (HRE).
En una realización preferida de la presente invención, hay una expresión regulable por la hipoxia o la isquemia de los componentes del vector retrovírico. En este sentido, la hipoxia es un potente regulador de la expresión génica en un amplio intervalo de diferentes tipos celulares, y actúa mediante la inducción de la actividad de factores de transcripción inducibles por la hipoxia, tales como el factor 1 inducible por la hipoxia (HIF-1; 6); que se une a sitios de reconocimiento de ADN afines, los elementos sensibles a la hipoxia (HRE) en diversos promotores génicos. Dachs et al. (7) han usado una forma multimérica del HRE del gen de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK-1) de ratón (8) para controlar la expresión de genes tanto marcadores como terapéuticos mediante células de fibrosarcoma humano en respuesta a la hipoxia in vitro y dentro de tumores sólidos in vivo (7 ibid).
Los elementos potenciadores de la respuesta a la hipoxia (HREE) también se han resultado estar en asociación con un número de genes, incluyendo el gen de la eritropoyetina (EPO) (9; 10). Otros HREE se han aislado de regiones reguladoras tanto del gen de la enzima glucolítica muscular piruvato quinasa (PKM) (11), el gen de β-enolasa específico del músculo humano (ENO3; 12) como el gen de endotelina-1 (ET-1) (13).
Preferentemente, el HRE para el uso de acuerdo con la presente invención se selecciona, por ejemplo, entre el elemento HRE de eritropoyetina (HREE1), el elemento HRE de piruvato quinasa (PKM) muscular, el HRE de fosfoglicerato quinasa (PGK), el elemento HRE de B-enolasa (enolasa 3; ENO3), el elemento HRE de endotelina-1 (ET-1) y el elemento HRE de metalotioneína II (MTII).
Preferentemente, el ILRE se usa en combinación con un elemento regulador de la transcripción, tal como un promotor, elemento regulador de la transcripción que es preferentemente activo en uno o más tipos de células seleccionados, siendo preferentemente activo solo en un tipo de célula.
Como se ha perfilado anteriormente, este aspecto de combinación se denomina elemento sensible.
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Preferentemente, el elemento sensible comprende al menos el ILRE como se define en el presente documento.
Los ejemplos no limitantes de dicho elemento sensible se presentan como OBHRE1 y XiaMac. Otro ejemplo no limitante incluye el ILRE en uso conjuntamente con un promotor de MLV y/o un promotor sensible a la isquemia restringido a los tejidos. Estos elementos sensibles se desvelan en el documento WO99/15684.
Otros ejemplos de promotores/potenciadores adecuados restringidos a los tejidos son aquellos que son muy activos en las células tumorales, tales como un promotor/potenciador de un gen MUC1, un gen CEA o un gen antigénico 5T4. El promotor de alfa-fetoproteína (AFP) es también un promotor específico de los tumores. Una combinación preferida de promotor/potenciador es una combinación del promotor/potenciador temprano inmediato principal (MIE) del citomegalovirus humano (hCMV).
El término "promotor" se usa en el sentido normal de la técnica, por ejemplo, un sitio de unión a ARN polimerasa.
El promotor puede estar situado en la LTR de 5' retrovírica para controlar la expresión de un ADNc codificante de un NOI, y/o proteínas gag-pol.
Preferentemente, el NOI y/o las proteínas gag-pol pueden ser expresados a partir del genoma del retrovirus, tal como a partir de promotores retrovíricos endógenos en la repetición terminal larga (LTR).
Preferentemente, el NOI y/o las proteínas gag-pol se expresan a partir de un promotor heterólogo al que está unido de forma operativa el gen o secuencia heterólogo, y/o la secuencia de gag-pol con codones optimizados.
Como alternativa, el promotor puede ser un promotor interno.
Preferentemente, el NOI se expresa a partir de un promotor interno.
Los vectores que contienen promotores internos también se han usado ampliamente para expresar múltiples genes. Un promotor interno hace posible aprovechar las combinaciones de promotor/potenciador distintas de las encontradas en la LTR vírica para conducir la expresión génica. En un vector retrovírico, se pueden incluir múltiples promotores internos, y se ha demostrado que es posible expresar al menos tres ADNc diferentes, cada uno procedente de su propio promotor (14). Los elementos de sitios de entrada ribosómicos internos (IRES) también se han usado para permitir la traducción de múltiples regiones codificantes procedentes bien de un solo ARNm o de proteínas de fusión que luego se pueden expresar a partir de una fase de lectura abierta.
El promotor puede ser constitutivamente eficiente o puede estar restringido temporalmente en su actividad.
Preferentemente, el promotor es un promotor constitutivo tal como CMV.
Preferentemente, los promotores son específicos de tejidos. Es decir, son capaces de conducir la transcripción de un NOI o varios NOI en un tejido mientras que permanecen en buena parte "silenciosos" en otros tipos de tejidos.
La expresión "específico de tejidos" significa un promotor cuya actividad no se restringe a un solo tipo de tejido, pero que, no obstante, muestra selectividad por cuanto puede ser activo en un grupo de tejidos y menos activo o “silencioso” en otro grupo.
El nivel de expresión de uno o varios NOI bajo el control de un determinado promotor se puede modular manipulando la región promotora. Por ejemplo, dominios diferentes dentro de una región promotora pueden poseer diferentes actividades reguladoras génicas. Los papeles de estas diferentes regiones normalmente se evalúan usando construcciones vectoriales que tienen diferentes variantes del promotor con regiones específicas eliminadas (es decir, análisis de eliminación). Esta metodología se puede usar para identificar, por ejemplo, la región más pequeña capaz de conferir especificidad tisular o la región más pequeña que confiere sensibilidad a la hipoxia.
Hay un número de promotores específicos de tejidos, descritos anteriormente, que pueden ser particularmente ventajosos. En la mayoría de los casos, estos promotores se pueden aislar como fragmentos de digestión de restricción convenientes, adecuados para la clonación en un vector seleccionado. Como alternativa, los fragmentos de promotores se pueden aislar usando la reacción en cadena de la polimerasa. La clonación de los fragmentos amplificados se puede facilitar incorporando sitios de restricción en el extremo 5' de los cebadores.
El uno o varios NOI pueden estar bajo el control de la expresión de un elemento regulador de la expresión, tal como un promotor y potenciador.
Preferentemente, el promotor sensible a la isquemia es un promotor sensible a la isquemia restringido a tejidos.
Preferentemente, el promotor sensible a la isquemia restringido a tejidos es un promotor específico de macrófagos restringido mediante represión.
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uno o más de estos componentes en células que contienen los otros componentes requeridos. Si el vector codifica genes tóxicos o genes que interfieren con la replicación de la célula huésped, tales como inhibidores del ciclo celular
o genes que inducen la apoptosis, puede ser difícil generar líneas celulares productoras de vectores estables, pero se puede usar la transfección transitoria para producir el vector antes de que las células mueran. Además, se han desarrollado líneas celulares usando transfección transitoria que produce niveles de títulos de vectores que son comparables a los niveles obtenidos a partir de líneas celulares productoras de vectores estables (25).
Las células productoras/células de empaquetamiento pueden ser cualquier tipo de célula adecuada. En general, las células productoras son células de mamíferos, pero pueden ser, por ejemplo, células de insectos. Una célula productora puede ser una célula de empaquetamiento que contiene los genes estructurales del virus, normalmente integrados en su genoma en el que se introducen los vectores retrovíricos regulados de la presente invención. Como alternativa, la célula productora se puede transfectar con secuencias de ácido nucleico que codifican componentes estructurales, tales como gag-pol y env con codones optimizados en uno o más vectores tales como plásmidos, vectores de adenovirus, vectores víricos del herpes o cualquier método conocido por suministrar ADN funcional en células diana. Los vectores para su uso de acuerdo con la presente invención se introducen luego en la célula de empaquetamiento mediante los métodos de la presente invención.
Como se usa en el presente documento, la expresión "célula productora" o "célula productora de vectores" se refiere a una célula que contiene todos los elementos necesarios para la producción de partículas de vectores retrovíricos regulados y sistemas de suministro retrovírico regulados.
Preferentemente, la célula productora se puede obtener a partir de una línea celular productora estable. Preferentemente, la célula productora se puede obtener a partir de una línea celular productora estable derivada.
Preferentemente, la célula productora se puede obtener a partir de una línea celular productora derivada. Como se usa en el presente documento, la expresión "línea celular productora derivada" es una línea celular productora transducida que se ha explorado y seleccionado para la expresión elevada de un gen marcador. Dichas líneas celulares contienen inserciones retrovíricas en sitios de integración que soportan un alto nivel de expresión a partir del genoma retrovírico. La expresión "línea celular productora derivada" se usa indistintamente con la expresión "línea celular productora estable derivada" y la expresión "línea celular productora estable".
La línea celular productora derivada es una línea celular productora del VIH.
Preferentemente, las secuencias proteicas de la envoltura y las secuencias de las nucleocápsidas se integran todas de forma estable en la célula productora y/o de empaquetamiento. Sin embargo, una o más de estas secuencias también podrían existir en forma episómica, y la expresión génica se podría producir a partir del episoma.
Como se usa en el presente documento, la expresión "célula de empaquetamiento" se refiere a una célula que contiene aquellos elementos necesarios para la producción de virus recombinantes infecciosos que están ausentes en un vector vírico recombinante. Por lo general, dichas células de empaquetamiento contienen uno o más vectores que son capaces de expresar proteínas estructurales víricas (tales como gag-pol y env con codones optimizados), pero no contienen una señal de empaquetamiento.
La expresión "señal de empaquetamiento", que se cita indistintamente como "secuencia de empaquetamiento" o "psi" se usa con referencia a la secuencia no codificante, que actúa en cis, requerida para el encapsidamiento de hebras de ARN retrovírico durante la formación de las partículas víricas. En VIH-1, esta secuencia se ha cartografiado hasta los locus que se extienden desde cadena arriba del sitio donante (SD) de corte y empalme principal hasta al menos el codón de inicio de gag.
Las líneas celulares de empaquetamiento adecuadas para su uso con las construcciones vectoriales descritas anteriormente se pueden preparar fácilmente (véase también el documento WO 92/05266), y se utilizan para crear líneas celulares productoras para la producción de partículas de vectores retrovíricos. Como ya se ha mencionado, en "Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: J. M. Coffin, S. M. Hughes, H. E. Varmus, pág. 449), se presenta un resumen de las líneas de empaquetamiento disponibles.
También como se ha tratado anteriormente, se ha descubierto que las líneas celulares de empaquetamiento simples, que comprenden un provirus en el que se ha eliminado la señal de empaquetamiento, conducen a la producción rápida de virus competentes para la replicación, no deseados, a través de la recombinación. Para mejorar la seguridad, se han producido líneas celulares de segunda generación, en las que se ha eliminado la LTR de 3' del provirus. En dichas células, serían necesarias dos recombinaciones para producir un virus de tipo silvestre. Una mejora adicional implica la introducción de los genes gag-pol y del gen env en construcciones separadas, denominadas líneas celulares de empaquetamiento de tercera generación. Estas construcciones se introducen secuencialmente para evitar la recombinación durante la transfección (26; 27),
Preferentemente, las líneas celulares de empaquetamiento son líneas celulares de empaquetamiento de segunda generación.
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Preferentemente, las líneas celulares de empaquetamiento son líneas celulares de empaquetamiento de tercera generación.
En estas líneas celulares de tercera generación, de construcciones divididas, se puede lograr una reducción adicional en la recombinación mediante "el movimiento de codones". Esta técnica, basada en la redundancia del código genético, sirve para reducir la homología entre las construcciones separadas, por ejemplo, entre las regiones de solapamiento en las fases de lectura abiertas de gag-pol y env.
Las líneas celulares de empaquetamiento son útiles para proporcionar los productos génicos necesarios para encapsidar y proporcionar una proteína de membrana para un vector retrovírico regulado de título elevado y la producción de vehículo de suministro génico nucleico regulado. Cuando se introducen secuencias retrovíricas reguladas en las líneas celulares de empaquetamiento, dichas secuencias se encapsidan con las proteínas de la nucleocápsida (gag-pol), y estas unidades brotan entonces a través de la membrana celular para rodearse en la membrana celular y contener la proteína de la envoltura producida en la línea celular de empaquetamiento. Estos retrovirus regulados infecciosos son útiles como unidades infecciosas en sí o como vectores de suministro de genes.
La célula de empaquetamiento puede ser una célula cultivada in vitro, tal como una línea celular de cultivo de tejidos. Las líneas celulares adecuadas incluyen, pero sin limitación, células de mamíferos tales como líneas celulares derivadas de fibroblastos murinos o líneas celulares humanas. Preferentemente, la línea celular de empaquetamiento es una línea celular humana tal como, por ejemplo: HEK293, 293-T, TE671, HT1080.
Como alternativa, la célula de empaquetamiento puede ser una célula derivada del individuo que se va a tratar, tal como un monocito, macrófago, glóbulo rojo o fibroblasto. La célula se puede aislar de un individuo, y los componentes de empaquetamiento y del vector administrase ex vivo tras lo que se vuelven a administrar las células de empaquetamiento autólogas.
Es muy deseable usar preparaciones víricas de título elevado en aplicaciones tanto experimentales como prácticas. Las técnicas para aumentar el título vírico incluyen el uso de una señal de empaquetamiento psi plus, como se ha descrito anteriormente, y la concentración de reservas víricas. Además, el uso de diferentes proteínas de la envoltura, tales como la proteína G del virus de la estomatitis vesicular, ha mejorado los títulos tras la concentración hasta 109 por ml (28). Sin embargo, normalmente, la proteína de la envoltura se escogerá de forma que la partícula vírica infectará preferentemente células que estén infectadas con el virus que se desea tratar. Por ejemplo, cuando se esté usando un vector de VIH para tratar la infección por VIH, la proteína env usada será la proteína env del VIH.
El proceso de producción de un vector retrovírico en el que la proteína de envoltura no es la envoltura nativa del retrovirus se conoce como "pseudotipificación". Ciertas proteínas de envoltura, tales como la proteína de envoltura de MLV y la proteína del virus G de la estomatitis vesicular (VSV-G), pseudotipifican retrovirus muy bien. La pseudotipificación no es un nuevo fenómeno, y los ejemplos se pueden encontrar en los documentos WO-A98/05759, WO-A-98/05754, WO-A-97/17457, WO-A-96/09400, WO-A-91/00047 y (29).
Como se usa en el presente documento, la expresión "título elevado" significa una cantidad eficaz de un vector retrovírico o partícula retrovírica que es capaz de transducir un sitio diana tal como una célula.
Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" significa una cantidad de un vector retrovírico
o lentivírico regulado, o partícula vectorial, que es suficiente para inducir la expresión de un NOI en un sitio diana.
Preferentemente, el título es de al menos 106 partículas retrovíricas por ml, tal como de 106 a 107 por ml, más preferentemente al menos 107 partículas de retrovirus por ml.
De acuerdo con la presente invención, es posible manipular el genoma vírico o la secuencia nucleotídica del vector retrovírico regulado de forma que los genes víricos se reemplacen o complementen con uno o más NOI que pueden ser NOI heterólogos.
El término "heterólogo" se refiere a una secuencia de ácido nucleico o secuencia proteica ligada a una secuencia de ácido nucleico o de proteína que no está enlazada de forma natural.
Con la presente invención, el término NOI (es decir, secuencia nucleotídica de interés) incluye cualquier secuencia nucleotídica adecuada, que no necesariamente necesita ser una secuencia de ADN de origen natural completa. Por lo tanto, la secuencia de ADN puede ser, por ejemplo, una secuencia de ADN sintético, una secuencia de ADN recombinante (es decir, preparada mediante el uso de técnicas de ADN recombinante), una secuencia de ADNc o una secuencia de ADN genómico parcial, incluyendo sus combinaciones. No es necesario que la secuencia de ADN sea una región codificante. Si es una región codificante, no es necesario que sea una región codificante entera. Además, la secuencia de ADN puede estar en una orientación sentido o en una orientación antisentido. Preferentemente, está en una orientación sentido. Preferentemente, el ADN es o comprende ADNc.
El o los NOI pueden ser uno cualquiera o más de gen/es de selección, gen/es marcadores y gen/es terapéutico/s.
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componentes inmunitarios e inflamatorios de enfermedad del fondus degenerativa, componentes inflamatorios de traumatismo ocular, inflamación ocular causada por infección, vitreorretinopatías proliferativas, neuropatía óptica isquémica aguda, cicatrización excesiva, por ejemplo, tras la operación de filtración de glaucoma, reacción inmunitaria y/o de inflamación contra implantes oculares, y otras enfermedades oftálmicas relacionadas con el sistema inmunitario y relacionadas con la inflamación, inflamación asociada con enfermedades o afecciones o trastornos autoinmunitarios en los que, tanto en el sistema nervioso central (SNC) como en cualquier otro órgano, sería beneficiosa la eliminación inmunitaria y/o de la inflamación, enfermedad de Parkinson, complicación y/o efectos secundarios debidos al tratamiento de la enfermedad de Parkinson, complejo de demencia relacionada con el SIDA, encefalopatía relacionada con el VIH, enfermedad de Devic, corea de Syndenham, enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades degenerativas, afecciones o trastornos del SNC, componentes inflamatorios de apoplejías, síndrome posterior a la polio, componentes inmunitarios e inflamatorios de trastornos psiquiátricos, mielitis, encefalitis, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomielitis, neuropatía aguda, neuropatía subaguda, neuropatía crónica, síndrome de Guillaim-Barre, corea de Sydenham, miastenia grave, seudotumor cerebral, síndrome de Down, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, componentes inflamatorios de compresión del SNC o traumatismo del SNC o infecciones del SNC, componentes inflamatorios de atrofias y distrofias musculares, enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario y relacionadas con la inflamación, afecciones o trastornos de los sistemas nerviosos central y periférico, inflamación post-traumática, choque séptico, enfermedades infecciosas, complicaciones inflamatorias o efectos secundarios de la cirugía, transplante de médula ósea u otras complicaciones y/o efectos secundarios del transplante, complicaciones inflamatorias y/o inmunitarias y efectos secundarios de la terapia génica, por ejemplo, debido a infección con un vehículo vírico o inflamación asociada con el SIDA, para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, para tratar o mejorar enfermedades proliferativas de monocitos o leucocitos, por ejemplo, leucemia, reduciendo la cantidad de monocitos o linfocitos, para la prevención y/o el tratamiento de rechazo de injerto en los casos de transplante de células, tejido y órganos naturales o artificiales, tales como córnea, médula ósea, órganos, lentes, marcapasos, tejido de piel natural o artificial.
A continuación, se describirá la invención adicionalmente por medio de ejemplos que pretenden servir para ayudar al experto en la materia a llevar a cabo la invención, y no pretenden, bajo ningún concepto, ser limitantes del alcance de la invención. Los ejemplos se refieren a las figuras. En las figuras:
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra esquemáticamente cómo crear una LTR de 3' adecuada mediante PCR;
la Figura 2 muestra la tabla de uso de codones para gag-pol del VIH de tipo silvestre de la cepa HXB2 (número de acceso: K03455);
la Figura 3a muestra la tabla de uso de codones de la secuencia con codones optimizados denominada gagpol-SYNgp. La Figura 3b muestra una tabla de uso de codones comparativa;
la Figura 4 muestra la tabla de uso de codones del env del VIH de tipo silvestre denominado env-mn;
la Figura 5 muestra la tabla de uso de codones de la secuencia con codones optimizados de env del VIH denominada SYNgp160mm;
la Figura 6 muestra dos construcciones plasmídicas para su uso en la invención;
la Figura 7 muestra el principio que hay tras dos sistemas de producción de partículas de vector retrovírico;
la Figura 8 muestra una comparación de secuencias entre la secuencia de gag-pol del VIH de tipo silvestre (pGP-RRE3) y la secuencia de gag-pol con codones optimizados (pSYNGP);
la Figura 9 muestra una comparación de secuencias entre la secuencia de gag-pol de EIAV de tipo silvestre (WT) y la secuencia de gag-pol con codones optimizados (CO);
la Figura 10 muestra la independencia de Rev de la formación de partículas de expresión de proteína;
la Figura 11 muestra las velocidades de traducción de gag-pol de tipo silvestre (WT) y con codones optimizados;
la Figura 12 muestra los niveles de ARNm de gag-pol en fracciones totales y citoplásmicas; la Figura 13 muestra el efecto de la inserción de gag de WT cadena abajo del gen con codones optimizados sobre los niveles de ARN y de proteína;
la Figura 14 muestra los plásmidos usados para estudiar el efecto de gag de VIH-1 sobre el gen con codones optimizados;
la Figura 15 muestra el efecto sobre el ARN citoplásmico de la inserción de gag del VIH-1 cadena arriba del gen
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con codones optimizados; la Figura 16 muestra el efecto de Leptomicina B (LMB) sobre la producción de proteína; la Figura 17 muestra los niveles de ARN citoplásmico de los genomas del vector; la Figura 18 muestra la eficiencia de la transducción a MOI1; la Figura 19 muestra una representación esquemática de pGP-RRE3; la Figura 20 muestra una representación esquemática de pSYNGP; la Figura 21 muestra títulos del vector generados con diferentes construcciones de gag-pol; la Figura 22 muestra títulos del vector a partir de los genomas Rev/RRE (-) y (+); la Figura 23 muestra títulos del vector a partir de la serie pHS de genomas del vector; la Figura 24 muestra títulos del vector para la serie de pHS de genomas del vector en presencia o ausencia de
Rev/RRE; la Figura 25 muestra un análisis de las construcciones de gag-pol; la Figura 26 muestra una transferencia Western de extractos de 293T; la Figura 27 es una representación esquemática de pESYNGP; la Figura 28 es una representación esquemática de LpESYNGP; la Figura 29 es una representación esquemática de LpESYNGPRRE; la Figura 30 es una representación esquemática de pESYNGPRRE; la Figura 31 es una representación esquemática de pONY4.0Z; la Figura 32 es una representación esquemática de pONY8.0Z; la Figura 33 es una representación esquemática de pONY8.1Z; la Figura 34 es una representación esquemática de pONY3.1; la Figura 35 es una representación esquemática de pClneoERev; la Figura 36 es una representación esquemática de pESYNREV; las Figuras 37 y 38 muestran el efecto de diferentes construcciones vectoriales sobre los títulos de vectores
víricos; las Figuras 39 y 40 muestran el efecto de diferentes construcciones vectoriales sobre la actividad de RT; la Figura 41 muestra el efecto de la secuencia líder de 5' en el título del vector vírico; la Figura 42 muestra títulos del vector vírico cuando se usa pONY8.1Z; la Figura 43 muestra una comparación entre las secuencias de pONY3.1 y pONY3.2OPTI con codones
optimizados en los primeros 372 nucleótidos de gag; la Figura 44 es una representación esquemática de pIRES1hygESYNGP; las Figuras 45 y 46 muestran los resultados de experimentos para confirmar que gag-pol con codones
optimizados se puede usar en la producción de líneas celulares de empaquetamiento y productoras;
las Figuras 47 y 48 muestran los resultados de experimentos que confirman que el ARN procedente de gag-pol con codones optimizados está empaquetado menos eficazmente que el del gen de tipo silvestre; la Figura 49 muestra los resultados de un experimento que confirma que la expresión de pESYNGP y
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pESDSYNGP son similares;
la Figura 50 es una representación esquemática de pESDSYNGP; y
la Figura 51 muestra los resultados de un experimento que confirma que la eficiencia de encapsidar ARN de gagpol en células PEV-17 y células B-241 es similar.
En más detalle, la Figura 8 muestra una comparación de secuencias entre la secuencia de gag-pol del VIH de tipo silvestre (pGP-RRE3) y la secuencia de gag-pol con codones optimizados (pSYNGP), en la que la secuencia superior representa pSYNGP y la secuencia inferior representa pGP-RRE3.
La Figura 10 muestra la independencia de Rev de la formación de partículas para la expresión de proteínas. Se transfectaron 5 g de los plásmidos de expresión de gag-pol en células 293T en presencia o ausencia de Rev (pCMV-Rev, 1 g), y se determinaron los niveles de proteína 48 horas después de la transfección en sobrenadantes de cultivo (A) y lisados celulares (B). Para detectar las proteínas gag-pol, se usó suero humano positivo en VIH-1. Las transferencias se volvieron a sondar con un anticuerpo anti-actina, como control interno (C). Los tamaños (en kDa) de los marcadores proteicos (New England Biolabs) se muestran al lado del gel. Carriles: 1. células 293T transfectadas simuladamente, 2. pGP-RRE3, 3. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 4. pSYNGP, 5. pSYNGP + pCMV-Rev, 6. pSYNGP-RRE, 7. pSYNGP-RRE + pCMV-Rev, 8. pSYNGP-ERR, 9. pSYNGP-ERR + pCMV-Rev.
La Figura 11 muestra las velocidades de traducción de gag-pol de WT y con codones optimizados. Se transfectaron células 293T con 2 g de pGP-RRE3 (± 1 g de pCMV-Rev) o 2 g de pSYNGP. Las muestras de proteínas de sobrenadantes de cultivo (A) y de extractos celulares (B) se analizaron mediante transferencia Western 12, 25, 37 y 48 horas después de la transfección. Para detectar las proteínas gag-pol (A, B), se usó suero humano positivo en VIH-1, y como control interno (C), se usó un anticuerpo anti-actina. Los tamaños de los marcadores proteicos se muestran al lado del gel (en kD). Se usó un Phosphorimager para la cuantificación de los resultados. Carriles: 1. pGP-RRE3 12 h, 2. pGP-RRE3 25 h, 3. pGP-RRE3 37 h, 4. pGP-RRE3 48 h, 5. pGP-RRE3 + pCMV-Rev 12 h, 6. pGP-RRE3 + pCMV-Rev 25 h, 7. pGP-RRE3 + pCMV-Rev 37 h, 8. pGP-RRE3 + pCMV-Rev 48 h, 9. pSYNGP 12 h,
10. pSYNGP 25 h, 11. pSYNGP 37 h, 12. pSYNGP 48 h, 13. células 293T transfectadas simuladamente.
La Figura 12 muestra los niveles de ARNm de gag-pol en fracciones totales y citoplásmicas. Se extrajo el ARN total y citoplásmico de células 293T 36 horas después de la transfección con 5 g del plásmido de expresión de gag-pol (± 1 g de pCMV-Rev), y se estimaron los niveles de ARNm mediante análisis de transferencia Northern. Se usó una sonda complementaria a los nucleótidos 1222-1503 de tanto el gen de tipo silvestre como el gen con codones optimizados. El panel A muestra la banda que corresponde a la gag-pol del VIH-1. Los tamaños de los ARNm son de 4,4 kb para el gen con codones optimizados, y de 6 kb para el gen de tipo silvestre. El panel B muestra la banda que corresponde a ubiquitina humana (control interno para la normalización de los resultados). La cuantificación se realizó usando un Phosphorimager. Numeración de los carriles: c indica fracción citoplásmica y t indica fracción de ARN total. Carriles: 1. pGP-RRE3, 2. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 3. pSYNGP, 4. pSYNGP + pCMV-Rev, 5. pSYNGP-RRE, 6. pSYNGP-RRE + pCMV-Rev, 7. células 293T transfectadas simuladamente, 8. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 9. células 293T transfectadas 65 simuladamente, 10. pSYNGP.
La Figura 13 muestra el efecto de la inserción de gag de WT cadena abajo del gen con codones optimizados sobre los niveles de ARN y de proteína. La secuencia de gag de WT se insertó cadena abajo del gen con codones optimizados en ambas orientaciones (sitio NotI), dando como resultado los plásmidos pSYN6 (orientación correcta, véase la Figura 14) y pSYN7 (orientación inversa, véase la Figura 14). También se insertó el gen codificante de βgalactosidasa (LacZ) en el mismo sitio y en la orientación correcta (plásmido pSYN8, véase la Figura 14). Se transfectaron células 293T con 5 g de cada plásmido, y 48 horas después de la transfección, se determinaron los niveles de ARNm y de proteína como se ha descrito previamente, por medio de análisis de transferencia Northern y Western.
Análisis de transferencia Northern en fracciones de ARN citoplásmico. Se sondó la transferencia con una sonda complementaria a los nucleótidos 1510-2290 del gen con codones optimizados (I), y se volvió a sondar con una sonda específica para la ubiquitina humana (II). Carriles: 1. pSYNGP, 2. pSYN8, 3. pSYN7, 4. pSYN6. Análisis de transferencia Western: se usó suero humano positivo en VIH-1 para detectar las proteínas gag-pol (I), y como control interno, se usó un anticuerpo anti-actina (II). Carriles: lisados celulares: 1. células 293T transfectadas simuladamente, 2. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 3. pSYNGP, 4. pSYN6, 5. pSYN7, 6. pSYN8. Sobrenadantes: 7. células 293T transfectadas simuladamente, 8. pGP-RRE3 + pCMV-Rev, 9. pSYNGP, 10. pSYN6, 11. pSYN7, 12. pSYN8. Los tamaños de los marcadores proteicos (New England Biolabs) se muestran al lado del gel.
La Figura 14 muestra los plásmidos usados para estudiar el efecto de gag del VIH-1 sobre el gen con codones optimizados. La estructura principal para todas las construcciones fue pCI-Neo. Syn gp: el gen gag-pol del VIH-1 con codones optimizados. HXB2 gag: el gen gag del VIH-1 de tipo silvestre. HXB2 gag: el gen gag del VIH-1 de tipo silvestre en la orientación inversa. HXB2 gagΔATG: el gen gag del VIH-1 de tipo silvestre sin el ATG de gag. HXB2 gag-fr.sh.: el gen gag de VIH-1 de tipo silvestre con una mutación de desplazamiento de fase. HXB2 gag 625-1503:
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