ES2236888T3 - Expresion de una proteina modificada de la envoltura del virus espumoso. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a contrucciones para la expresión de una proteína que comprende al menos una proteína de envoltura de FV, la proteína así obtenida así como la línea celular de complemento permiten la producción de una partícula de tipo pseudoviral. También se refiere a una composición farmacéutica que comprende las mencionadas partículas y a un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad.

Description

Expresión de una proteína modificada de la envoltura del virus espumoso.

El subgrupo de virus espumosos (FV) de los virus retroides ha atraído el interés científico a causa de su estrategia de replicación única y a su utilización potencial como vectores de transferencia génica (35). Se ha propuesto que los FVs pueden constituir herramientas ideales para el desarrollo de un sistema de suministro génico, debido a propiedades específicas de este grupo vírico tales como la ausencia de anticuerpos FV en la población humana, el curso benigno de las infecciones naturales de FV, su ámbito muy extenso de células huésped, y un límite amplio de empaquetamiento, debido al tamaño del genoma de FV (4,30,32). Sin embargo, el conocimiento limitado de la biología molecular de este grupo vírico no ha permitido hasta ahora el desarrollo de progenies celulares y vectores de empaquetamiento seguros, tales como los que se han derivado para los retrovirus murinos, entre otros (27). Por ejemplo, el FV es un virus ADN con una compleja organización genómica. Además de las LTRs (repeticiones terminales largas), de una región de empaquetamiento y de los genes gag, pol, env, comprende también varios genes tales como bel1, bel2, bel3, bet, beo y bes, localizados entre env y 3'LTR. El gen env codifica un precursor glicosilado de 130 kDa que es fragmentado, dando lugar a las subunidades de superficie (SU) y transmembranosa (TM) (véase la Fig 1 y 4). La subunidad TM incluye en su parte 3' un dominio de anclaje transmembranoso (A en la Fig 4) compuesto por residuos hidrofóbicos, que es seguido por una cola citoplásmica. Además los FVs expresan su proteína Pol a partir de un ARNm de corte y empalme, independientemente de la proteína Gag, siendo ampliamente desconocidos el mecanismo del empaquetamiento y del ensamblaje de partícula del genoma FV, así como el significado de altas cantidades del ADN transcrito inverso en las partículas extracelulares (10, 18, 39). Otras características únicas incluyen la localización nuclear de la proteína precursora Gag (31, 40) y la gemación predominante en las vesículas intracitoplásmicas que puede ser una consecuencia de la retención de la proteína precursora Env en el ER (13).

Los vectores de transferencia génica basados en el retrovirus de Moloney constituyen habitualmente los principales vehículos para una transferencia génica estable de alta eficiencia en una amplia variedad de tipos celulares (20).

Las mayores limitaciones de este sistema vectorial son el ámbito restringido de la célula huésped y la infectividad ineficiente para algunas células humanas (revisado en (1)). Recientemente, se han mostrado varios procedimientos que superan estas desventajas que utilizan la pseudotipificación con proteínas extrañas de envoltura, tales como la glicoproteína G (6,38) del virus de la estomatitis vesicular (VSV), o la proteína de envoltura (2,34) del virus de la leucemia (GALV) del mono gibón.

Sin embargo, la expresión de VSV-G por ejemplo es altamente tóxica para las células productoras y ha evitado la generación de la progenie de células de empaquetamiento VSV-G estables (8, 22, 37). [Algunas modificaciones en la proteína env del virus espumoso ya se han dado a conocer. De hecho, Mahnke et al (J. Virol. Methods, 29 (1), 1990, 13-22), dan a conocer constructos para la expresión de la proteína env del HSRV (Virus Espumoso Humano) fusionada al péptido MS2 polimerasa, y la expresión resultante de dicha proteína de fusión en E.coli, y Goepfert et al (Journal of Virology, vol 71, nº1, 1997, 778-784) dan a conocer constructos con codones env de HFV alterados].

Sin embargo, la invención se refiere a constructos para la expresión de una proteína que comprende por lo menos una proteína modificada de la envoltura de FV que se trunca en el aminoácido nº 975, o más preferentemente, en el 981. El truncamiento puede extenderse hasta el codon de detención o de forma alternativa, comprende opcionalmente antes de este codon de detención, uno o varios residuos de la proteína env original de FV.

La proteína env modificada de FV que se utiliza en la presente invención es una proteína de fusión que comprende además la totalidad o preferentemente una parte de una proteína de la envoltura que no es de FV.

El FV preferido según la presente invención es el virus espumoso humano (HFV), pero pueden utilizarse otros (por ejemplo, el FV de simio).

Ejemplos de virus no FV apropiados incluyen retrovirus aviarios, retrovirus bovinos, retrovirus felinos, retrovirus murinos tal como el Virus de la Leucemia Murino (MuLV) y particularmente Maloney MuLV (MoMuLV), virus Friend de la Leucemia Murina (FrMuLV) especialmente la cepa FB 29, el Virus del Sarcoma Murino (MSV), retrovirus de primates, tales como GaLV, o lentivirus tales como HIV (Virus de la Inmunodeficiencia Humana) o SIV (Virus de la Inmunodeficiencia de simio).

La fusión entre las proteínas env de FV y las que no son de FV puede llevarse a cabo en diferentes localizaciones. Las fusiones en el interior de la subunidad TM son ventajosas. Según una primera alternativa, la fusión se lleva a cabo dentro del dominio de anclaje transmembranoso de dichas proteínas de la envoltura de FV y de proteínas de la envoltura que no son de FV. Un ejemplo preferido es una proteína que comprende el dominio extracelular y la parte del extremo 5' del dominio de anclaje transmembranoso de la proteína de la envoltura de HFV y la parte del extremo 3' del dominio del anclaje transmembranoso y el dominio citoplásmico de la proteína de la envoltura que no es de FV, particularmente de la proteína de la envoltura del SIV.

Una segunda alternativa es que la fusión se lleve a cabo dentro del sitio de división de dichas proteínas de la envoltura de FV y de las proteínas de la envoltura que no son de FV. Un ejemplo preferido es una proteína que comprende el dominio SU y la totalidad o parte del sitio de división de la proteína de la envoltura de HFV y la totalidad o parte del sitio de división y el dominio TM, que comprende el dominio del anclaje transmembranoso y el dominio citoplásmico, de la proteína de la envoltura que no es de FV, particularmente de la proteína de la envoltura del SIV. También puede considerarse el reemplazamiento del sitio de división de la proteína de la envoltura de FV por su equivalente de la proteína de la envoltura que no es de FV.

Otra alternativa es que la fusión se lleve a cabo en la unión entre el dominio de anclaje transmembranoso y el dominio citoplásmico o dentro de los dominios citoplásmicos de dichas proteínas de la envoltura de FV y de las proteínas de la envoltura que no son de FV. Un ejemplo preferido es una proteína que comprende el dominio extracelular, el dominio de anclaje transmembranoso y la totalidad o parte del dominio citoplásmico de la proteína de la envoltura y la totalidad o parte del dominio citoplásmico de la proteína de envoltura que no es de FV, particularmente de la proteína de la envoltura de SIV.

En una forma de realización particularmente preferida, una proteína según la invención consiste en una envoltura proteica del HFV en la que la totalidad o parte del dominio citoplásmico es reemplazada por la totalidad o parte de un dominio citoplásmico de una proteína de la envoltura vírica que no es de FV, especialmente de una proteína de la envoltura de MuLV. Ventajosamente, la proteína de fusión consiste en la fusión de un dominio citoplásmico de MuLV a una proteína modificada de la envoltura de HFV. El dominio citoplásmico de MuLV que se utiliza en la presente invención puede procesarse o no. "Procesarse" significa que contiene el sitio de división reconocido normalmente por la correspondiente proteasa retrovírica y "no procesarse", que no lo contiene o que no es funcional (mutación, deleción o truncamiento).

El constructo preferido de la invención es el que permite la expresión de la proteína de fusión que se denomina en lo sucesivo, en la presente memoria, HFV \Delta2 MuLV.

Alternativamente, una proteína preferida según la invención consiste en una proteína de la envoltura de HFV en la que toda o parte de la cola citoplásmica es reemplazada por la totalidad o parte de un dominio citoplásmico de una proteína de la envoltura del SIV. Existen dos versiones de la proteína de la envoltura de SIV: una forma larga que presenta una cola citoplásmica de 164 aminoácidos que se encuentra en las partículas SIV que se replican en el huésped natural, el mono rhesus (Macaca mulatta), y una forma corta que contiene sólo 18 aminoácidos. Esta forma corta es seleccionada cuando el virus aislado del mono se cultiva en progenies celulares humanas (42).

También es posible que el constructo de la invención esté cambiado en los sitios de corte y empalme del donante y/o receptor que se encuentran naturalmente en la secuencia que codifica la proteína env de FV.

El constructo de la invención puede incluir elementos regulatorios para permitir la transcripción y traducción de la secuencia que codifica la proteína env modificada de FV. En particular, un promotor apropiado puede unirse contracorriente de la secuencia de codificación de env de FV de una forma operativa, mediante técnicas recombinantes convencionales. Dicho promotor puede ser de origen procariótico, eucariótico o vírico, y puede ser constitutivo o regulado. Dichos elementos regulatorios son bien conocidos en la técnica.

Pertenece también al alcance de la invención que el constructo de la invención puede comprender además un gen de selección que permita la detección y aislamiento de las células que expresan la proteína env modificada de FV. En el contexto de la invención, el gen de selección puede estar bajo el control transcripcional del promotor que dirige la expresión de la proteína env modificada de FV que da lugar a un transcrito bicistrónico, o bajo el control de una región promotora adicional. Los posibles genes de selección son numerosos, por ejemplo, el neo gen que confiere resistencia al antibiótico G418, el gen de la dihidrofolato reductasa (dhFr), el gen puromicina acetiltransferasa (pac) o el xantina fosforibosil transferasa (gpt).

El constructo de la invención puede insertarse en cualquier vector apropiado, un vector vírico (por ejemplo, un vector retrovírico) o un plásmido. La selección del vector apropiado es amplia y pertenece a las competencias del experto en la técnica. Dicho vector puede ser integrador o no. Para disminuir la posibilidad de generar partículas víricas competentes para la replicación, es ventajoso que al constructo le falte cualquier LTR y región de empaquetamiento retrovírica.

La invención se refiere también a proteínas de fusión, tal como se expresa por los constructos de expresión anteriores, así como por partículas víricas pseudotipificadas que comprenden una proteína env de FV. Esta última puede derivarse de una proteína env FV nativa, de una parte de la misma o de una modificada. En una forma de realización preferida, la partícula vírica pseudotipificada en su superficie comprende una proteína env modificada de FV, tal como se expresa mediante un constructo según la invención. La partícula vírica pseudotipificada de la invención puede generarse después de la transfección de un vector vírico recombinante en una progenie celular de complementación. La tecnología es convencional y se describe en numerosos documentos de la técnica anterior. Un vector vírico que se utilice en la presente invención, comprende preferentemente por lo menos una 5'LTR, una región de empaquetamiento y una 3'LTR derivada de cualquier retrovirus tales como los citados anteriormente y un gen capaz de expresar un ribozima, una molécula de ARN anti-sentido y un ARNm para producir además un polipéptido de interés. De particular interés son los polipéptidos terapéuticos, que incluyen pero no se limitan a las citoquinas (IL-2, IFN \alpha, \beta ó \gamma), timidínquinasa (TK) del tipo 1 del Virus del Herpes Simple (HSV-1), Regulador de la Conductancia Transmembranal de la Fibrosis Quística (CFTR), Distrofina, Factores de Coagulación (FVIII, FIX,....), antígenos asociados a tumores (MUC-1, antígenos HPV), anticuerpos, inmunotoxinas, medicamentos anti-HIV, factores de crecimiento (Factor de Crecimiento Fibroblástico FGF, Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF), inductores de la apoptosis (Bax...), inhibidores de la apoptosis (Bcl2, Bclx...), agentes citostáticos (p21, p16, Rb), epolipoproteínas, ácido nítrico sintetasa (Nos), eliminadores de radicales de oxígeno (SOD, catalasa), productos supresores de tumores (p53, p73) y marcadores. La lista no es limitativa. Además, el vector vírico que se utiliza en la presente invención puede transferir uno o más genes en una forma nativa, truncada, mutada o híbrida. El gen o genes se sitúa bajo el control de elementos que permiten su expresión en una célula eucariota. Dichos elementos incluyen un promotor, que puede ser de cualquier origen (LTR retrovírico o promotor interno). Puede ser constitutivo o sensible para las células o los factores histo-específicos.

Otro objeto de la invención se refiere a progenies celulares de complementación que permiten la producción de las partículas víricas pseudotipificadas y el procedimiento de su preparación.

La invención se refiere además a progenies celulares de complementación que comprenden un constructo de la invención.

Preferentemente, dicha progenie celular de complementación comprende un constructo de la invención caracterizado porque la fusión se realiza en una unión entre el dominio de anclaje transmembranoso y el dominio citoplásmico, o dentro de los dominios citoplásmicos de dichas proteínas de la envoltura de FV y de la envoltura que no es de FV, y porque la proteína expresada comprende el dominio extracelular, el dominio de anclaje transmembranoso y la totalidad o parte del dominio citoplásmico de la proteína de la envoltura de HVF y de la totalidad o parte del dominio citoplásmico de la proteína de la envoltura que no es de FV, particularmente de la proteína de la envoltura del SIV.

En otra forma de realización preferida, dicha progenie celular de complementación comprende un constructo de la invención para la expresión de una proteína caracterizada porque la proteína es HFV, \Delta2MuLV.

La progenie celular de complementación de la invención puede derivar de cualquier célula y, particularmente, de la célula eucariótica. Se pueden considerar progenies celulares murinas, progenies celulares farmacéuticamente aceptables (Vero, CHO) o una progenie celular humana tal como 293 ó A549. Puede generarse mediante la transfección de un constructo según la invención, junto con un primer gen de selección. Las células mas productotas de env se rastrean entonces respecto a la expresión de niveles altos de la proteína env de FV mediante inmunodetección, utilizando anticuerpos contra env de FV, transferencia Western, FACS (Clasificador de células activadas fluorescentes) o cualquier otro procedimiento. Alternativamente, la progenie celular de complementación de la invención, puede también comprender un constructo que exprese un gen vírico gag/pol, más preferentemente de MuLV, FB29, SIV o HFV junto con un segundo gen de selección diferente del primero. Preferentemente, los genes env y gag/pol son transportados por vectores de expresión separados, que carecen de LTR y la región de empaquetamiento. Las etapas de selección y de rastreo se repiten para seleccionar un clon que produzca env que expresa ulteriormente el producto de expresión gag/pol.

Una progenie celular de complementación de la invención puede utilizarse para empaquetar el vector vírico recombinante. El título puede analizarse utilizando un vector vírico convencional que expresa un tercer gen de selección diferente de los previos o un gen marcador (por ejemplo, Lac Z). Como resultado, las células que producen altos títulos de partículas víricas pseudotipificadas, son seleccionadas y pueden cultivarse para suministrar una progenie celular estable de complementación. Las células pueden también ensayarse transitoriamente, tal como se lleva a cabo y se describe habitualmente a continuación en la presente memoria.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona también un procedimiento para preparar una partícula vírica pseudotipificada de la invención. Dicho procedimiento comprende la operación de (1) introducir un vector retrovírico recombinante en una progenie celular de complementación de la invención, (2) cultivar dicha progenie celular de complementación bajo condiciones apropiadas que permiten la producción de dicha partícula vírica pseudotipificada y (3) recuperar la partícula vírica pseudotipificada resultante a partir del cultivo celular.

Preferentemente, la partícula vírica pseudotipificada se recupera a partir del sobrenadante del cultivo celular, pero también puede considerarse una etapa de lisis celular. La partícula vírica pseudotipificada puede también purificarse posteriormente mediante tecnología convencional (por ejemplo, ultracentrifugación en gradiente de sacarosa o ClCs). Ventajosamente, la partícula vírica pseudotipificada producida de este modo, es capaz de infectar (preferentemente en ausencia de policationes, tal como el polibreno), una amplia variedad de células y opcionalmente resistir la inactivación mediante suero humano.

Según otro aspecto de la invención, también se proporciona una célula huésped de mamífero infectada mediante la partícula vírica pseudotipificada de la invención o que puede obtenerse mediante un procedimiento de la invención. Dicha célula huésped incluye sin limitación células humanas epiteliales, pulmonares, musculares, hepáticas, hematopoyéticas, fibroblastos y linfocitos.

Una partícula infecciosa pseudotipificada, así como una célula de mamífero de la invención, puede aplicarse en la prevención o tratamiento de varias enfermedades, como una vacuna o un agente terapeútico.

Pertenece también al alcance de la invención proporcionar una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de una partícula vírica pseudotipificada de la invención, o que puede obtenerse mediante un procedimiento de la invención, así como una célula de mamífero de la invención como agente terapéutico. Dicha composición farmacéutica puede producirse de una forma convencional. En particular, la partícula o la célula de mamífero de la invención pueden combinarse con sustancias apropiadas bien conocidas en la técnica, tal como un transportador, diluyente, adyuvante o excipiente. La formulación particular de la composición farmacéutica depende de varios parámetros, por ejemplo, el polipéptido que interesa expresar el sitio deseado de acción, el procedimiento de administración y el individuo que va a tratarse. Dicha formulación puede determinarse por los expertos en la técnica y mediante el conocimiento convencional.

Típicamente, las partículas pseudotipificadas se preparan como una solución en un diluyente aceptable, tal como un diluyente salino, salino tamponado con fosfato u otro farmacéuticamente aceptable. La vía de inoculación puede ser intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intrapulmonar, intratraqueal, intragástrica e intratumoral. La dosis puede ser única o repetida. La cantidad variará, dependiendo del individuo (peso, sexo, edad, condiciones médicas..) y de la enfermedad que va a tratarse. En general, es deseable proporcionar partículas víricas pseudotipificadas de la invención del orden de entre 10^{4} a aproximadamente 10^{13} unidades formadoras de placa (pfu)/dosis, ventajosamente del orden de 10^{5} a aproximadamente 10^{10}, y preferentemente, de entre 10^{6} a aproximadamente 10^{9}. La composición de la invención puede introducirse en un mamífero (humano) ex vivo mediante una exposición previa de las células diana a las partículas víricas pseudotipificadas, antes de la introducción de las células transducidas en un mamífero, o inyectadas in vivo en el tejido afectado, en la circulación o localmente.

En una última forma de realización de la invención, también se proporciona un procedimiento para tratar un trastorno genético o una enfermedad inducida por cualquier gen patogénico, tal como cáncer o una enfermedad inducida víricamente, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una partícula vírica pseudotipificada o una célula de mamífero de la invención a un individuo que necesite un tratamiento.

Estas y otras ventajas del objeto de la invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de los ejemplos siguientes y de los dibujos adjuntos. Estas formas de realización no representan el alcance completo de la invención.

En particular, la incorporación de las proteínas de la envoltura de virus espumoso humano (HFV) a las partículas del virus de la leucemia murina (MuLV) se estudió en un sistema celular de empaquetamiento de transfección transitoria. Se describe en la presente memoria que la proteína de la envoltura de HFV de tipo salvaje puede pseudotipificar partículas MuLV, aunque con una baja eficiencia. La eliminación completa o parcial de la cola citoplásmica de HFV dio lugar a la abolición o reducción de la infectividad mediada de HFV, lo que implica un papel de la cola citoplásmica de la envoltura de HFV en la pseudotipificación de las partículas MuLV. La mutación de la señal de retención ER que se encuentra en la cola citoplásmica de la envoltura de HFV, no dio lugar a una infectividad relativa más alta de los vectores retrovíricos pseudotipificados. Sin embargo, una proteína quimérica de la envoltura que contiene un dominio citoplásmico no procesado de la envoltura de MuLV que se fusionó a una proteína truncada de la envoltura de HFV, mostró una infectividad potenciada específica de HFV, como resultado del aumento de la incorporación de proteínas quiméricas de la envoltura en las partículas de MuLV.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1

Ilustración esquemática de los constructos de expresión de la envoltura de HFV

El tramo extracelular de la membrana (también denominado dominio A de anclaje transmembranoso), y los dominios citoplásmicos de los componentes TM del HFV (espacios en blanco) y las envolturas de MuLV (espacios sombreados) se muestran según (11, 24). La secuencia aminoácida de las proteínas del MuLV y HFV de tipo salvaje se proporcionan a continuación de la ilustración esquemática. Las posiciones de los aminoácidos en los constructos de la envoltura de HFV están marcadas en la regla (presente en la Figura). La localización del motivo secuencial en el dominio citoplásmico de la envoltura de HFV, responsable de la retención de ER (13), se indica como un espacio en negro, y la secuencia mutada como un espacio rayado. El sitio de división de la proteasa de MuLV en el dominio citoplásmico completo de la proteína de la envoltura de MuLV, se indica mediante dos flechas invertidas.

Figura 2

Infectividad de las partículas de MuLV pseudotipificadas con distintas proteínas de envoltura

Las células NIH3T3 (franja sombreada) ó QT-6 (franja continua) se infectaron con distintas partículas MuLV pseudotifipicadas generadas mediante transfección transitoria de las células 293T. 48 horas después de la transducción, el porcentaje de las células que expresaban GFP se cuantificó mediante análisis FACS. La fluorescencia media de las células que expresaban GFP fue de 100 a 300 veces superiores a la de las células infectadas simuladas. Los constructos individuales de la envoltura utilizados para el pseudotipificado se indican en el eje y del gráfico. El porcentaje medio de las células que expresan GFP para cada constructo se muestra en el eje x con la correspondiente desviación estándar. Los constructos individuales se ensayaron 2-6 veces.

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Figura 3

Neutralización de la infectividad específica de la envoltura del HFV

Se generaron partículas MuLV pseudotipificadas con distintas proteínas de la envoltura, tal como se indicó en el eje y, mediante transfección transitoria de las células 293T. Los sobrenadantes (1 ml) se incubaron con suero específico de chimpancé anti-HFV (1:60) (franja continua), o suero humano (1:60) de un individuo sano (franja sombreada) durante 1 hora a 37ºC, antes de la adición a células NIH3T3 (A) o QT-6. El sobrenadante se aspiró cuatro horas después, y se reemplazó con medio de crecimiento recién preparado. 48 horas después de la transducción, el porcentaje de las células que expresan GFP se determinó tal como se describe en la leyenda de la Fig 2. El experimento se llevó a cabo dos veces con un suero neutralizante de mono y además, con un suero de conejo anti-HFV (datos que no se muestran) dando lugar a una inhibición relativa similar de la infectividad de los vectores retrovíricos pseudotipificados de la envoltura de HFV.

Figura 4

Representación esquemática de los constructos quiméricos HFV/SIV de la envoltura

HFV WT y SIV son versiones de tipo salvaje de los genes de la envoltura de virus espumoso humano y de virus de simio de la inmunodeficiencia (clon molecular mm 251). Los dominios del HFV se representan en blanco y los del SIV, en gris. El sitio de división que separa el dominio SU y TM se indica con una línea vertical. RRE representa el elemento sensible rev y A el dominio de anclaje transmembranoso. El dominio extracelular en el extremo 5' del dominio de anclaje transmembranoso y el dominio citoplásmico en el extremo 3' del dominio de anclaje transmembranoso, también está indicados. Env 1 a 9 representan los constructos quiméricos HFV/SIV de env, que comprenden la fusión con la versión larga (Env 1, 3 y 5) o la versión corta (Env 2, 4, 6, 7, 8 y 9) de la envoltura del SIV.

Figura 5

Secuencia de los genes de HFV, SIV y env quiméricos que flanquean los sitios de fusión y las secuencias aminoácidas de las colas citoplásmicas largas y cortas de la env de SIV

A. Ilustra los dominios de anclaje transmembranoso de los genes HFV y SIV mm251 env y la fusión en el dominio de anclaje transmembranoso de HFV y SIV mm251 (Chim): aminoácidos idénticos en las envolturas de HFV y SIV están en negrita, las secuencias del dominio de anclaje transmembramoso de las envolturas de HFV y SIV, están subrayadas. B. ilustra la fusión en el sitio de división entre los dominios de las envolturas SU y TM de HFV y las envolturas SIV mm251: la secuencia consenso del sitio de división está en negrita, y el sitio de división está indicado por un espacio en la secuencia aminoácida. C. Ilustra la sustitución de la cola citoplásmica de la envoltura de HFV con la cola citoplásmica de la envoltura de SIV mm251: las secuencias del anclaje transmembranoso están subrayadas, (141) indica los últimos 141 aminoácidos de la larga cola citoplásmica SIV. D. Secuencias aminoácidas de las colas citoplásmicas largas y cortas de la envoltura de SIV; los dominios de anclaje transmembranosos están subrayados. ^{*} indica un codon de detención, (141) indica los últimos 141 aminoácidos de la cola citoplásmica larga del SIV.

Figura 6

Destrucción del sitio de corte y empalme del extremo 3' interno del SIV mm 251 env

La secuencia aminoácida que se muestra en la parte superior es del gen SIV mm251 env, que indica ^{*} el codon de detención del gen env humanizado. A indica la mutación de G a A que da lugar a la destrucción del sitio de empalme del extremo 3'. El exón Tat/Rev 2 empieza en la secuencia TAGACT pero el marco de lectura es diferente que el de env.

La presente invención se ilustrará a continuación en los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Todas las construcciones se llevan a cabo utilizando técnicas estándar de ADN recombinante, tales como las descritas en T. Maniatis et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY 1982. Las progenies celulares son accesibles mediante colecciones de cultivos tales como ATCC y se cultivan en condiciones estándar (NIH3T3: CRL-1658, Mv.1.Lu CCL64, HT 1080 CCL 121, BHK 21 CCL 10, QT 26 CRL 1708 y 293 CRL 1573). La secuencia de la proteína env de HFV ya se ha publicado y está disponible en la base de datos de EMBL (número de registro 407725).

Ejemplo 1 Quimeras HFV/MLV 1. Generación del constructo de expresión de env FV

Se generó un constructo de expresión eucariótica para el gen de la envoltura de la cepa del FV humano (HFV), insertando un fragmento AflII/EcoRI de 3076 pares de bases del clon provírico pHSRVI de HFV (28), que contiene el marco de lectura de longitud completa (ORF), abierto, de la env, en el vector pCDNA3 (Invitrogen). Este constructo se denominó pCHFV wt y se utilizó para generar las proteínas mutantes y quiméricas de la envoltura de HFV que se muestran en la Fig 1. Brevemente, se obtuvieron constructos truncados o quiméricos de la env, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa sobre los genes de HFV y/o de MuLV env, como matrices y oligonucleótidos que incorporaban las mutaciones deseadas. Los mutantes se insertaron en el vector básico descrito anteriormente y se secuenciaron, para excluir mutaciones fuera de lugar. Se generaron tres constructos mutantes de la envoltura de HFV. pCHFV \Delta1 y pCHFV \Delta2 codifican las proteínas de la envoltura de HFV truncadas en los aminoácidos 975 ó 981, respectivamente. pCHFV \Delta2 tiene una arginina C-terminal añadida, que no se encuentra en la secuencia original de env de HFV. Según la estructura del dominio de la envoltura de HFV propuesta por Flugel et al (11), los truncamientos dieron lugar a una eliminación completa (pCHFV \Delta1) o parcial (pCHFV \Delta2) del dominio citoplásmico. Finalmente, el constructo pCHFV SSS produce una proteína de la envoltura de HFV que posee el motivo triple de lisina (aminoácidos 984-086) en el extremo C-terminal de la cola citoplásmica de la proteína transmembranosa (TM) reemplazada por residuos de serina. Se ha mostrado que este motivo secuencial es responsable de la retención por ER de la envoltura de HFV (13, 14).

En total, se construyeron 6 proteínas quiméricas de la envoltura mediante la fusión C-terminal de las secuencias que codifican el dominio citoplásmico procesado o no procesado de la proteína de la envoltura de MuLV (16,17). pCHFV \Delta1MuLVR-, pCHFV \Delta2MuLVR- y pCHFV SSSMuLVR- codifican proteínas de fusión formadas por las tres mutaciones descritas anteriormente y un dominio citoplásmico procesado de la envoltura de MuLV (en los aminoácidos 634-649), mientras que pCHFV \Delta1MuLV, pCHFV \Delta2MuLV y pCHFV SSSMuLV codifican las proteínas de fusión respectivas que contenían un dominio citoplásmico no procesado de la envoltura de MuLV (en aminoácidos 634-665) en el extremo C.

Los constructos de expresión para las gag/pol de MuLV (pHIT60), y las envolturas ecotrópicas (pHITl23) y anfotrópicas (pHIT456) de MuLV fueron amablemente proporcionadas por A. Kingsman (33). El vector retrovírico SFG GFPS65T contiene el ORF humanizado de la proteína verde fluorescente (7) (una donación de M. Vogel) insertado en los sitios de clonación del vector retrovírico SFG basado en MuLV (5, 22), mientras que MFG.S NLS-LacZ (22) contiene el gen de la \beta-galactosidasa fusionado con la señal de localización nuclear del SV40 (NLS) (una donación de R. Mulligan). El constructo de expresión VSV-G se generó insertando un fragmento EcoRI de 1,6 kb del plásmido pSVGL-1 (29) (una donación de J. Rose) que contiene el ORF de VSV, en el vector pHIT.

2. Infectividad de partículas MuLV pseudotipificadas con varias proteínas env de HFV

Se generaron partículas retrovíricas recombinantes utilizando esencialmente el sistema pHIT de enpaquetamiento, tal como se ha descrito anteriormente (33). Brevemente, las células 293T (9) se transfectaron transitoriamente con un constructo de expresión para gag/pol de MuLV (pHIT60), el vector SFG GFPS65T retrovírico basado en MuLV, y los distintos constructos de expresión de la envoltura descritos anteriormente. Los sobrenadantes víricos se recuperaron 48-72 horas después de la transfección. Los sobrenadantes de las transfecciones independientes con los mismos plásmidos, se juntaron, se filtraron (tamaño de poro de 0,45 \mum), se añadió polibreno a una concentración final de 8 \mug/ml y los sobrenadantes se utilizaron inmediatamente o se guardaron a -80ºC hasta su utilización. Las células diana que expresaban la proteína GFP después de la transducción retrovírica se identificaron mediante análisis FACS en un rastreo FACS, y el número de células positivas se cuantificaron utilizando el empaquetamiento de Software LysisII y CellQuest (Becton Dickinson).

Los experimentos iniciales utilizando el constructo de expresión pCHFV mostraron que las partículas MuLV pueden pseudotipificarse con la proteína HFV wt de la envoltura y pueden transducir las células NIH3T3, aunque con una baja eficiencia (Fig 2). La proteína de la envoltura de HFV contiene una secuencia señal en su dominio citoplásmico que conduce a una retención en el ER de las células de expresión (13, 14). Por tanto, tres constructos pCHFV \Delta1, pCHFV \Delta2, y pCHFV SSS, que codifican las proteínas de la envoltura de HFV mutadas o truncadas citoplásmicamente, se examinaron para determinar la influencia del dominio citoplásmico de la envoltura de HFV y de su retención ER en la eficiencia de la pseudotipificación. La eliminación completa (pCHFV \Delta1) o parcial (pCHFV \Delta2) del dominio citoplásmico de la envoltura de HFV da lugar a una abolición o reducción de la ya baja actividad de pseudotipificación que se observó para la proteína de tipo salvaje (Fig 2). La mutación de la señal de retención ER citoplásmica (pCHFV SSS) ha mostrado aumentar la expresión superficial celular de la proteína de la envoltura de HFV (13). Sin embargo, la pseudotipificación de las partículas víricas con dicha proteína mutante no dio lugar, también, a una infectividad más alta de estos virus (Fig 2).

Ya que la eliminación o modificación del dominio citoplásmico del HFV no fue capaz de aumentar la eficiencia de la infección del virus pseudotipificado, se ha utilizado posteriormente un segundo planteamiento para probar si el reemplazamiento del dominio citoplásmico del HFV por el dominio citoplásmico del MuLV, o la fusión del dominio citoplásmico de MuLV a una envoltura modificada completa del HFV tendría el efecto deseado. Se mostró que el dominio citoplásmico de la envoltura del MuLV era procesado por la proteasa de MuLV en la partícula vírica (16, 17). La expresión de una forma ya procesada de la forma de la proteína de la envoltura de MuLV en las células dio lugar a la formación de grandes sincitios multinucleados y a una disminución de la infectividad vírica (24, 26). Por tanto, se generaron las proteínas de fusión C-terminal de los tres mutantes descritas anteriormente y el dominio citoplásmico procesado (MuLVR-) o no procesado (MuLV) de la proteína de la envoltura del MuLV, y las partículas pseudotipificadas con estas proteínas quiméricas de la envoltura, se ensayaron en cuanto a su infectividad sobre las células NIH3T3. De forma interesante, los virus pseudotipificados con una mutante, la proteína HFV \Delta2MuLV, mostraron una infectividad entre 10 y 20 veces mayor que las partículas pseudotipificadas con la proteína de la envoltura de HFV de tipo salvaje (Fig 2). Este aumento en la infectividad a través de la proteína de HFV \Delta2MuLV no fue específico para las células NIH3T3 o las murinas, pues resultados similares se obtuvieron para la progenie celular fibroblástica de la codorniz QT-6, que no es infectable mediante partículas víricas revestidas con proteínas de la envoltura de MuLV (Fig 2). En estas células la infectividad de las partículas pseudotipificadas con la proteína de la envoltura de HFV \Delta2 MuLV fue consistentemente más alta que las pseudotipificadas con la proteína VSV-G. Todas las otras proteínas analizadas dieron lugar a virus pseudotipificados con una infectividad similar relativa o más baja, cuando se compara con la envoltura de HFV de tipo salvaje en ambas progenies celulares (Fig 2). Además, las proteínas quiméricas de la envoltura de HFV que contienen un dominio citoplásmico procesado de MuLV, mostraron una actividad de fusión más intensa que las proteínas que presentan con un dominio citoplásmico no procesado de MuLV sobre la expresión en las células L929 mediante vectores retrovíricos (datos no mostrados). Este resultado coincide con los datos que muestran que el dominio citoplásmico de la envoltura de MuLV puede controlar la actividad de fusión de las proteínas extrañas de la envoltura, tal como el virus de simio de inmunodeficiencia (SIV), cuando se expresan como una proteína quimérica de la envoltura (36). Además, los sobrenadantes que contienen un vector retrovírico que codifica una proteína \beta-galactosidásica localizada en el núcleo, vector pseudotipificado con las distintas proteínas de la envoltura, se dosificaron sobre las progenies celulares de varias especies (Tabla). Más precisamente, células diana (1 x 10^{4}/pocillo) se sembraron 24 horas antes de la infección con diluciones seriales de los sobrenadantes de las células 293T transfectadas. Cuarenta y ocho horas después de la infección, los números de focos azules se contaron por duplicado y se calcularon los títulos. Los valores de los duplicados eran del orden del triple. Los resultados que se muestran representan dos titulaciones independientes sobre las progenies celulares indicadas, utilizando para todas éstas sobrenadantes libres procedentes de las mismas transfecciones, con títulos relativos reproducibles en ambos experimentos. Los sobrenadantes que contienen partículas pseudotipificadas se dosificaron hasta 6 veces sobre células HIH3T3 con resultados reproducibles. Las partículas retrovíricas pseudotipificadas con la proteína de la envoltura HFV wt ó con la quimeras HIV \Delta2MuLV pudieron infectar células de origen humano, de visón, de codorniz y de hamster, además de células murinas (Tabla 1). Los títulos de los vectores retrovíricos pseudotipificados con la proteína de la envoltura de HFV \Delta2MuLV, fueron entre 8 y 35 veces más altos que los (vectores) pseudotipificados con la proteína de la envoltura de HFV de tipo salvaje, dependiendo de las células diana que se utilizaron.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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3. Neutralización de la infectividad de las partículas pseudotipificadas de HFV env mediante antisueros específicos de HFV

Para confirmar que la infectividad de las partículas de MuLV pseudotipificadas con distintas proteínas de la envoltura de HFV era específica para la envoltura de HFV, las partículas pseudotipificadas se preincubaron con suero específico de chimpancé anti-HFV antes de la adición a las células diana (3). La infectividad de las partículas víricas pseudotipificadas con la envoltura anfotrófica de MuLV o la proteína VSV-G, no se redujo por la preincubación con el antisuero específico para HFV cuando se comparó con la preincubación de estos virus con suero normal humano termoinactivado (Fig 3) o con partículas víricas simuladas incubadas (datos no mostrados). En contraste, la infectividad de partículas pseudotipificadas con la proteína de la envoltura de HFV de tipo salvaje o con la quimera de HFV \Delta2MuLV se abolió completamente mediante la preincubación con el antisuero específico de HFV, pero no con el suero de control humano (Fig 3). Esta neutralización de la infectividad específica de la envoltura de HFV se observó para las células NIH3T3 (Fig 3A) y QT-6 (Fig 3B). Una neutralización específica similar de las partículas víricas pseudotipificadas con las proteínas de la envoltura de HFV se obtuvo en experimentos que utilizaban un suero de conejo producido contra el dominio SU expresado del baculovirus de la proteína de la envoltura de HFV (datos que no se muestran).

4. Expresión e incorporación de las partículas de las proteínas env de HFV

La expresión e incorporación de las distintas proteínas de la envoltura de HFV en las partículas MuLV se determinó mediante análisis de radioinmunoprecipitación (RIPA) de células 293 T transfectadas transitoriamente. Cuarenta y ocho horas después de la adición del ADN (pHIT60, SFG GFPS65T y varios constructos env), las células se marcaron metabólicamente con [^{35}]metionina durante aproximadamente 20 horas. Las partículas víricas que se encontraban en el sobrenadante se sedimentaron mediante centrifugación a 25.000 rpm mediante una banda de sacarosa al 20% antes de la solubilización en tampón de lisis. A continuación, las muestras se sometieron a inmunoprecipitación. Los inmunoprecipitados de las partículas víricas con un suero de chimpancé específico de HFV, o los sobrenadantes de los hibridomas antiMuLV gag se analizaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE), junto con sus correspondientes lisados celulares. Las bandas específicas de HFV en los inmunoprecipitados del sedimento vírico o de los lisados celulares, se observaron sólo en las muestras transfectadas con los constructos de expresión de env de HFV, pero no en las muestras que expresaban la proteína de la envoltura anfotrópica de MuLV o los cultivos transfectados simulados. Dos bandas precursoras predominantes de la envoltura de HFV de 130 y 110 KD, se observaron en inmunoprecipitados de lisados celulares de células transfectadas HFV env (12,21). Además, dos bandas que corresponden a las proteínas procesadas, de aproximadamente 90 KD SU y \sim40-50 KD TM, pudieron observarse después de una exposición más larga. Los tamaños aparentes diferentes de las proteínas TM en las muestras celulares transfectadas con los varios mutantes HFV reflejaron las modificaciones en la porción TM de las proteínas individuales. Sólo se observaron diferencias moderadas en el nivel de equilibrio de las distintas proteínas de la envoltura en las células transfectadas, excepto para las proteínas HFV SSSMuLVR- y HFV SSSMuLV que mostraron una expresión celular claramente reducida. Tanto las proteínas precursoras de la envoltura como las proteínas procesadas SU y TM se detectaron también en inmunoprecipitados de las partículas víricas sedimentadas. Sin embargo, en general, la proporción relativa de las proteínas procesadas a las precursoras, aumentó en los inmunoprecipitados de partículas víricas, comparado con los lisados
celulares.

De forma interesante, se pudo observar una buena correlación entre la cantidad de proteínas SU y TM procesadas en los inmunoprecipitados individuales de las partículas víricas y la infectividad relativa de las partículas pseudotipificadas correspondientes (Fig 2). La envoltura quimérica de HFV \Delta2 MuLV, que dio lugar a partículas pseudotipificadas con la infectividad relativa más alta, mostró también las bandas SU y TM más intensas en los RIPA. La cantidad de proteínas gag/pol de MuLV en las preparaciones de partículas víricas individuales, determinada en los sedimentos víricos en bruto o en los inmunoprecipitados con sobrenadantes de hibridomas anti-gag, fue similar en todas las muestras, excepto para la transfección de la envoltura de HFV \Delta2MuLV. Esta muestra mostró una disminución significativa en las proteínas gag/pol asociadas a partículas, que indica que se encontraban menos partículas MuLV en esta preparación, comparadas con los otros sedimentos víricos. Como resultado, la cantidad relativa de las proteínas procesadas TM y SU HFV por partícula vírica individual, puede ser incluso más alta que la estimada a partir de los inmunoprecipitados de las preparaciones de partículas víricas con anticuerpos específicos HFV. Una posible explicación para este fenómeno es el aumento de la absorbancia de estas partículas por células transfectadas que no expresan la proteína env de HFV, como resultado del aumento de la infectividad de las partículas HFV \Delta2MuLV pseudotipificadas, comparado con las partículas pseudotipificadas por las otras proteínas de la envoltura de HFV. Esto puede conducir a una depuración de las partículas pseudotipificadas HFV \Delta2 MuLV a partir del sobrenadante. Además, en contraste con las partículas de MuLV pseudotipificadas con la envoltura anfotrópica de MuLV o VSV-G, los virus HFV pseudotipificados no mostraron reducción en la infectividad en ausencia de policationes tal como el polibreno (30). Por tanto, los títulos relativos de los vectores retrovíricos pseudotipificados con la envoltura de HFV, mediante transfección transitoria, pueden ser subestimados, comparados con los pseudotipos con una envoltura anfotrópica de MuLV o VSV-G. Experimentos posteriores, sin embargo, utilizando progenies celulares que expresaban establemente la envoltura HFV, que deberán ser resistentes a la infección por virus pseudotipificados con la envoltura de HFV, son necesarios para clarificar estos fenómenos con más
detalle.

5. Inactivación de los sitios donadores y receptores de corte y empalme localizados en el gen FV env

Además, los transcritos Bel-1 y Bet derivados del promotor interno de HFV (Posición 8419 relativa al comienzo de la transcripción en las 5'LTR), localizado en el interior del ORF de la envoltura de HFV (posición 6310-9276), utilizan eficientemente un donador de corte y empalme (SD, Posición 9119) y un receptor de corte y empalme (SA, Posición 9237), dentro de la región de codificación de la subunidad TM de la proteína env. El corte y empalme alternativo del ARNm que codifica la proteína env de HFV, que utiliza estos sitios SD y SA, da lugar a proteínas de fusión potenciales envoltura/bel. Una de aproximadamente 170 KD puede detectarse en células infectadas por HFV mediante inmunoprecipitación, y el ARNm es detectable mediante la PCR RT (transcriptasa inversa) del ARNm total, a partir de fibroblastos humanos infectados. La inactivación de SD (Posición 9119) mediante una mutación GT->GG da lugar a la desaparición de la proteína de fusión de la envoltura de 170 KD, mientras que la expresión de la proteína de 130 KD precursora de la envoltura no cambia. La función biológica de las proteínas de fusión env/bel, así como la influencia sobre los títulos víricos de las partículas pseudotipificadas de MuLV no se conoce habitualmente.

En resumen, se ha generado un sistema para producir vectores retrovíricos basados en MuLV, pseudotipificados con proteínas de la envoltura de HFV. El dominio citoplásmico de la proteína de la envoltura de HFV estuvo implicado por lo menos parcialmente en la pseudotipificación de las partículas de MuLV, pues la deleción progresiva del dominio citoplásmico condujo a una reducción en la transferencia génica y a la incorporación de las subunidades TM y SU de HFV env en la partícula vírica. La adición de un dominio citoplásmico no procesado de la envoltura de MuLV a un mutante de deleción, la envoltura HFV \Delta2MuLV, dio lugar a un aumento de 10-20 veces en la infectividad, comparado con la proteína de la envoltura de HFV de tipo salvaje y de una potenciación en la incorporación de la proteína quimérica de la envoltura en las partículas pseudotifipicadas. Los títulos retrovíricos fueron entre 8 y 35 veces más altos que los alcanzados por la pseudotipificación con la proteína de la envoltura de HFV de tipo salvaje. En algunos tipos celulares diana, la eficiencia de la transferencia génica fue similar o más alta que la de los vectores retrovíricos pseudotopificados con la proteína VSV-G. En el caso de la proteína de la envoltura del MuLV de tipo salvaje, el papel del dominio citoplásmico para la incorporación específica de la envoltura a la partícula vírica no está claro. En algunos mutantes con deleción de la cola citoplásmica hubo una pérdida de proteínas de la envoltura asociadas con la partícula (15), mientras que otras proteínas mutantes de la envoltura mostraron escasa o nula reducción en la asociación de partículas (25, 26). Nuestros resultados sostienen un papel del dominio citoplásmico de MuLV env en la asociación de partículas de la proteína de la envoltura, por lo menos en la incorporación potenciada de las proteínas quiméricas de la envoltura en las partículas MuLV.

Recientemente, la pseudotipificación de los vectores retrovíricos basados en MuLV con proteínas de la envoltura extrañas, tales como la glicoproteína VSV G (6, 38) o la envoltura GALV (2, 34), ha provocado a un aumento en la estabilidad vírica, a una gama más amplia de células huésped, y a un aumento en la eficiencia de transducción de ciertos tipos celulares. La gama amplia de huéspedes de FVs, la resistencia a la inactivación por el suero humano (30), y la infección eficiente de las células de diverso origen en ausencia de policationes (observaciones no publicadas y (30)), harían a los vectores retrovíricos basados en MuLV pseudotipificados con la proteína quimérica de la envoltura de HFV \Delta2MuLV, una nueva y útil herramienta para una eficiente transferencia génica en distintos tipos celulares. A diferencia de la expresión de VSV-G, que es muy tóxica para las células productoras y ha evitado la generación de progenies celulares estables VSV-G de empaquetamiento hasta recientemente (8, 22, 37), la expresión transitoria de la envoltura de HFV \Delta2MuLV no dio lugar a una toxicidad evidente en las células 293T (datos no mostrados,
(19)).

Ejemplo 2 Quimeras HFV/SIV env

Este ejemplo describe la construcción de envolturas quiméricas entre las proteínas de la envoltura de HFV y SIV. Se construyeron tres tipos distintos de envolturas quiméricas. La secuencia de los diferentes elementos utilizados a continuación en la presente memoria, están disponibles en Genbank: el genoma SIV mm251 con el número de registro M19499, el promotor CMV bajo X03922 y pEGFP-C1 (gen GFP) bajo U55763.

En el primer tipo, la cola citoplásmica de SIV se fusiona al dominio extracelular (que también se denomina en la literatura ectodominio) del HFV, dentro del dominio del anclaje transmembranoso (constructos 1,2 y 7 de la Figura 4 y de la Figura 5A). El dominio de anclaje transmembranoso de la env HFV se deduce de su secuencia aminoácida, y por tanto, es hipotético. El dominio de anclaje transmembranoso de la proteína env de SIV contiene una pequeña región de aminoácidos idénticos respecto a env HFV. Es en esta región donde se ha realizado la fusión. Así, el dominio extracelular completo del gen quimérico env es de HFV, incluyendo la subunidad superficial entera (SU) y la mayoría de la subunidad transmembranosa (TM). La cola citoplásmica es enteramente del SIV.

En el segundo tipo de envolturas quiméricas, los genes de fusión están al nivel del sitio de división entre las subunidades SU y TM (constructos 3, 4 y 8 de la Figura 4 y de la Figura 5B). Así, la subunidad SU procede de HFV y la subunidad TM procede de SIV. En la proteína quimérica de la envoltura, se utilizó el sitio de división de la env SIV (Arg-Gln-Lys-Arg).

En el tercer tipo de envoltura quimérica, la cola citoplásmica de SIV se fusiona con la envoltura de HFV en el dominio citoplásmico (constructos 5, 6 y 9 de la Figura 4 y de la Figura 5C). Este constructo es similar en diseño a la envoltura quimérica \Delta2MuLV y conserva los primeros 6 aminoácidos citoplásmicos de la envoltura de HFV. La cola citoplásmica entera del SIV se fusiona con esta proteína de la envoltura.

Existen dos versiones del gen de la envoltura del SIV (véase la Figura 5D y la referencia 42): una forma larga que tiene una cola de 164 aminoácidos que se encuentra en las partículas SIV que se replican en el huésped natural, el mono rhesus (Macaca mulatta), y una forma corta denominada "humanizada" que contiene sólo 18 aminoácidos. Esta forma corta es seleccionada cuando el virus aislado del mono se cultiva en progenies celulares humanas. Las envolturas quiméricas se han construido utilizando ambas colas. Los constructos 1, 3 y 5 comprenden la versión larga y los constructos restantes, la versión corta.

La posible presencia de secuencias represoras actuantes cis (CRS) en los genes de la envoltura de SIV, pueden conservar el ARN mensajero de env en el núcleo de las células productoras. El efecto inhibitorio sobre la expresión de loa genes env puede obviarse si estos ARNs mensajeros contienen el elemento sensible rev (RRE) y si, al mismo tiempo, rev se expresa. Este es el caso del segundo tipo de constructos quiméricos de la envoltura, ya que el RRE se encuentra en la subunidad TM del SIV y rev se expresará a partir de un plásmido que contenga el genoma provírico de SIV. Sin embargo, el RRE no se encuentra en los otros constructos de la envoltura. Aunque la naturaleza exacta de las secuencias CRS en el gen SIV env no se conoce, es posible que el sitio de corte y empalme del extremo 3' del segundo exon tat/rev en el gen env, constituya un CRS. Se decidió, por tanto, construir una tercera variante de los constructos quiméricos env en la que este sitio de corte y empalme del extremo 3' se destruyera (43, 44, Figura 6). La destrucción del sitio de corte y empalme del extremo 3' se llevó a cabo sólo en envolturas quiméricas con la cola citoplásmica corta, humanizada, del SIV env.

En total, se han construido 9 envolturas quiméricas (Fig 4):

Env 1, 2 y 7, en las que la fusión se realiza en el dominio de anclaje transmembranoso. Env 1 posee una cola citoplásmica larga de SIV, y Env 2 y 7, una corta. El sitio de corte y empalme del extremo 3' en el gen env, se encuentra en env 2, pero se ha suprimido en env 7. Las secuencias aminoácidas de Env 2 y 7 son idénticas.

Env 3, 4 y 8, en las que la fusión se realiza en el sitio de división; Env 3 posee una larga cola citoplásmica, Env 4 y 8 una corta. El sitio de corte y empalme del extremo 3' en el gen env, se encuentra en env 4, pero se ha borrado en env 8. La secuencia aminoácida de Env 4 y 8 son idénticas.

Env 5, 6 y 9 en las que la fusión se realiza en la cola citoplásmica, Env 5 tiene una larga cola citoplásmica, Env 6 y Env 9, una corta. El sitio de corte y empalme del extremo 3' en el gen env, se encuentra en env 6, pero se ha borrado en env 9. La secuencia aminoácida de Env 6 y 9 son idénticas.

1. Construcción de los genes quiméricos env

Todos los genes quiméricos env se han clonado reemplazando las secuencias HFV env apropiadas en el plásmido pczHFVenv wt con secuencias del gen SIV env. pczHFVenv wt contiene el HFV env de tipo salvaje que codifica las secuencias clonadas en pcADN3.1/Zeo (Invitrogene) bajo el control del promotor CMV. Las secuencias de SIV env se amplificaron a partir de un plásmido que contiene la versión larga del gen env (pTG 664) para los constructos 1, 3 y 5 de la envoltura, y a partir de un plásmido que contiene la versión corta del gen env (pTG 626Sma^{+}) para los constructos restantes. Estos dos plásmidos pueden generarse por un experto en la materia clonando las versiones de SIV env en un p poly III^{*} I (45). La amplificación se llevó a cabo con un iniciador contracorriente que posee una extensión del extremo 5' de 50 nucleótidos a partir del gen HFV eng, y un iniciador corriente abajo que posee una extensión del extremo 3' de 15 nucleótidos que contiene sitios de reconocimiento para los enzimas de restricción XhoI y EcoRI. Ambos iniciadores tienen una región de 20 nucleótidos que es complementaria al gen SIV env que permite la amplificación de partes específicas de los genes SIV env.

Después de la PCR de partes C-terminales del gen SIVenv, se aislaron amplímeros a partir del gel y se digirieron con Xho I para eliminar los nucleótidos 3'terminales del amplímero. El plásmido pczHFVenv wt se digirió con XhoI y EcoRI. Los amplímeros se ligaron al plásmido lineal pczHFVenv utilizando los extremos superfluos XhoI. Esto da lugar a un fragmento lineal de ADN que contiene el gen HFV env entero y la cola citoplásmica del SIV. El extremo 5' de la cola citoplásmica contiene secuencias homólogas al gen HFV env que se recombina mediante transformación de este plásmido en células E. coli BJ 5183 (46), según la tecnología que se describe en (41). Esto da lugar a un plásmido circular cerrado en el que la parte del extremo 3' del HFV env ha sido reemplazada por el extremo 3' del SIV env. Utilizando distintas combinaciones de iniciadores, todas las envolturas quiméricas se han construido de esta manera (véase Tabla 2). En el plásmido resultante, las secuencias que codifican la quimera se sitúan bajo el control del inmediato promotor temprano del CMV.

TABLA 2

2

2. Producción de las partículas SIV pseudotipificadas y transducción de las células diana

La producción de las partículas retrovíricas pseudotipificadas se alcanza mediante la co-transfección de las células 293 con distintos plásmidos que expresan las quimeras de las envolturas y un plásmido que contiene el genoma provírico SIV en el cual el gen env no es funcional, debido a la inserción de un casette de expresión que está formado por el inmediato promotor temprano de CMV y por el gen que codifica la Proteína potenciada verde fluorescente (GFP) (números 613 al 1330 de la secuencia U55763 del Genbank).

El protocolo es el siguiente: las células 293 se sembraron en placas de Petri de 10 cm con una densidad de 2 x 10^{6} por placa, en medio DMEM complementado con suero fetal de ternera al 10%, aminoácidos no esenciales, gentamicina y glutamina (DMEM completo). Al día siguiente, las células se transfectaron utilizando la técnica estándar de transfección del Fosfato Cálcico con 25 \mug del plásmido provírico SIV y 5 \mug del plásmido de la envoltura (los 9 plásmidos de expresión de la envoltura quimérica o plásmidos de control: plásmido de expresión vacío; plásmido de expresión de la proteína VSV-G o pczHFVenv WT). Al día siguiente, el medio se eliminó y las células se lavaron una vez en medio DMEM complementado con suero fetal de ternera al 5%, aminoácidos no esenciales, gentamicina y glutamina, incubándose entonces en 6 ml del mismo medio. El medio que contenía los virus se recuperó dos días después y se depuró mediante centrifugación (5 minutos a 3500 rpm). Las células diana (293 ó HT 1080) que se habían sembrado el día previo con una densidad de 5 x 10^{5} células por pocillo de una placa de 6 pocillos se transdujeron de la forma siguiente: las células diana se lavaron con 1 ml de DMEM (sin suero), cubriéndose entonces con 300 \mul de DMEM. Se añadieron 300 \mul del sobrenadante que contiene virus suplementados con 10 \mug de sulfato de protamina/ml, y las células se incubaron durante 2 horas en una atmósfera de CO_{2} al 5% a 37ºC. Después de añadir 3 ml de DMEM completo, la incubación continuó durante 3 días.

Las células productoras y diana se analizaron mediante FACScan de la forma siguiente: las células se tripsinizaron y lavaron con PBS. Las células se fijaron con 1 ml de PBS/formaldehído al 4% durante 10 minutos a 4º. Después de una etapa más de lavado, las células se volvieron a suspender en 1 ml de PBS y se analizaron con un FACScan Becton-Dickinson utilizando el software Cell-Quest. La fluorescencia se midió utilizando el filtro FITC. Todas las células productoras se transfectaron con alta eficiencia. La transducción de la células diana de control se realizó según se esperaba: las partículas VSV-G pseudotipificadas son capaces de transducir las células 293 y las células HT 1080. Los sobrenadantes de las células transfectadas sin proteínas de la envoltura o partículas pseudotipificadas con HFV env, no fueron capaces de transducir cualquier célula diana. Las partículas víricas producidas por los constructos 6 y 9 pueden transducir las células 293 y HT 1080, mostrando que su envoltura quimérica es funcional.

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15/ Granowitz, C., J. Colicelli, y S. P. Goff. 1991. Analysis of mutations in the envelope gene of Moloney Murine Leukemia Virus: Separation of infectivity from superinfections Resistance. Virology 183 : 545-554.

16/ Green, N., T. M. Shinnick, O. Witte, A. Ponticelli, J. G. Sutcliffe, y R. A. Lerner. 1981. Sequence-specific antibodies show that maturation of Moloney leukemia virus envelope polyprotein involves removal of a COOH-terminal peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6023-6027.

17/ Henderson, L. E., R. Sowder, T. D. Copeland, G. Smythers, y S. Oroszlan. 1984. Quantitative separation of murine leukemia virus proteins by reversed-phase high pressure liquid chromatography reveals newly described gag and env cleavage products. J. Virol. 52:492-500.

18/ Jordan, I., J. Enssle, E. Guttler, B. Mauer, y A. Rethwilm. 1996. Expression of human foamy virus reverse transcriptase involves a spliced pol mRNA. Virology 224 : 314-319.

19/ Mikovits, J. A., P. M. Hoffman, A. Rethwilm, y F. W. Ruscetti. 1996. In vitro infection of primary and retroviral infected human leukocytes by human foamy virus. J. Virol. 70:2774-2780

20/ Miller, A. D. 1992 Human gene therapy comes of age. Nature 357 : 455-60.

21/ Netzer, K. O., A. Rethwilm, B: Maurer, y V. ter Meulen. 1990. ldentification of the major immunogenic structural proteins of human foamy virus. J Gen Virol. 71:1237-41.

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25/ Ragheb, J. A., y W. F. Anderson. 1994. Uncoupled expression of Moloney Murine Leukemia Virus envelope polypeptides SU and TM: a functional analysis of the role of TM domains in viral entry. J. Virol. 68 : 3207-3219.

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27/ Rethwilm, A. 1996. Unexpected replication pathways of foamy viruses. J. Acquired Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol.

28/ Rethwilm, A., G. Baunach, K. O. Netzer, B. Maurer, B. Borisch, y V. T. Meulen. 1990. Infectious DNA of the human spumaretrovirus. Nucleic Acids Res. 18:733-738.

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30/ Russel, D. W., y A. D. Miller. 1996. Foamy virus vectors. J. Virol. 70:217-222.

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33/ Soneoka, Y., P. M. Cannon, E. E. Ramsdale, J. C. Griffiths, G. Romano, S. M. Ringsman, y A. J. Kingsman. 1995. A transient three-plasmid expression system for the production of high titer retroviral vectors. Nucleic Acids Res 23 : 628-33.

34/ von Kalle, C., H. P. Kiem, S. Goehle, B. Darovsky, S. Heinfeld, B. Torok-Storb, R. Storb, y F. G. Schuening. 1994. Increased gene transfer into human hematopoietic progenitor cells by extended in vitro exposure to a pseudotyped retroviral vector. Blood 84:2890-7.

35/Weiss, R. A. 1996. Foamy viruses bubble on. Nature 380 : 201.

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38/ Yee, J. K., A. Miyanohara, P. LaPorte, K. Bouic, J. C. Burns, y T. Friedmann. 1994. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors. Highly efficient infection of primary hepatocytes Proc Natl Acad Sciences USA 91:9564-9568.

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40/ Yu, S. F., K. Edelmann, R. K. Strong, A. Moebes, A. Rethwilm, y M. L. Linial. 1996. The carboxyl terminus of the human foamy virus gag protein contains separable nucleic acid binding and nuclear transport domains. J. Virol. 70 : 835-8262.

41/ Chartier C., Degryse, E., Gantzer, M., Dieterle, A., Pavirani, A. y Mehtali, M. 1996. Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli. J. Virol. 70, 4805-4810.

42/ Zingler, K. y Littman, D.R. 1993. Truncation of the cytoplasmic domain of the simian immunodeficiency virus envelope glycoprotein increases env incorporation into particles and fusogenicity and infectivity. J. Virol. 67, 2824-2831

43/ Hammarskjöld, M.L., Li, H., Rekosh, D. y Prasad, S. 1994. human immunodeficiency virus env expression becomes Rev-independent if the env region is not defined as an intron. J. Virol. 68, 951-958.

44/ Chang, D.D. y Sharp, P.A. 1989. Regulation by HIV rev depends upon recognition of splice sites. Cell 59; 789-795.

45/ Lathe, R. et al., 1987. Gene 57, 193-201.

46/ Hananan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-58.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: TRANSGENE S.A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 11 rue de Molsheim

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Strasbourg

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Francia

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CP: 67000

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: 03 88 27 91 00

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: 03 88 27 91 41

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Expresión de una proteína modificada de la envoltura del virus espumoso

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release # 1,0, Versión # 1,25 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLAMIENTO INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG11854

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAACTGCC TTTAGTCTCT TGGGATACTT AAAGCCTATC CTAATAGGAC TAGGAGTAAT

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTGTTAAGA

\hfill

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLAMIENTO INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG11855

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCTCGAGG AATTCTCACA AGAGCGTGAG CTCAA

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLAMIENTO INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG11956

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCTCGAGG AATTCCTACT GGAAATAAGA GGGTG

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLAMIENTO INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG11857

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCTTCCTA TCCCAATGTT ACTAGGGAAC ATTATACTTC CTGTAATAAT AGAAATAAAA

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGGGTCTT

\hfill

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLAMIENTO INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG11858

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGGGGTCAT TCTCTTGGTT ATTCTTATAT TTAAAATTGT ATCCTGGATT AAGTTAAGGC

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGGGTATAG

\hfill

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLAMIENTO INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG11866

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCTCGAGG AATTCCTATT GGAAATAAGA GGGTG

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (27)

1. Constructo para la expresión de una proteína que comprende por lo menos una proteína modificada de la envoltura de virus espumoso (FV), para la producción de partículas víricas pseudotipificadas, en el que la modificación consiste, por lo menos, en un truncamiento en el residuo 975 o 981 de dicha proteína, caracterizado porque dicha proteína es una proteína de fusión que comprende además la totalidad o parte de una proteína de la envoltura que no es de FV.

2. Constructo para la expresión de una proteína según la reivindicación 1, caracterizado porque el virus espumoso es el virus espumoso humano (HFV).

3. Constructo para la expresión de una proteína según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la proteína de la envoltura que no es de FV deriva de un virus seleccionado de entre el grupo constituido por MuLV, MoMuLV, FB 29, HIV y SIV.

4. Constructo para la expresión de una proteína según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha fusión dentro del dominio de anclaje transmembranoso de dichas proteínas de FV y de las proteínas de la envoltura de FV y que son de FV.

5. Constructo para la expresión de una proteína según la reivindicación 4, caracterizado porque la proteína comprende el dominio extracelular y la parte del extremo 5' del dominio de anclaje transmembranoso de la proteína de la envoltura de HFV y la parte del extremo 3' del dominio de anclaje transmembranoso y el dominio citoplásmico de la proteína de la envoltura que no es de FV, particularmente de la proteína de la envoltura de SIV.

6. Constructo para la expresión de una proteína según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha fusión se realiza dentro del sitio de división de dichas proteínas de la envoltura de FV y que no son de FV.

7. Constructo para la expresión de una proteína según la reivindicación 6, caracterizado porque la proteína comprende el dominio SU y la totalidad o parte del sitio de división de la proteína de la envoltura de HFV, y la totalidad o parte del sitio de división y del dominio TM, que comprende el dominio de anclaje transmembranoso y el dominio citoplásmico, de la proteína de la envoltura que no es de FV, particularmente de la proteína de la envoltura del
SIV.

8. Constructo para la expresión de una proteína según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha fusión se realiza en la unión entre el dominio de anclaje transmembranoso y el dominio citoplásmico, o dentro de los dominios citoplásmicos de dichas proteínas de la envoltura de FV y que no son de FV.

9. Constructo para la expresión de una proteína según la reivindicación 8, caracterizado porque la proteína comprende el dominio extracelular, el dominio anclaje transmembranoso y la totalidad o parte del dominio citoplásmico de la proteína de la envoltura de HFV, y la totalidad o parte del dominio citoplásmico de la proteína de la envoltura que no es de FV, particularmente la proteína de la envoltura de SIV.

10. Constructo para la expresión de una proteína según cualquiera de las proteínas 1 a 9, caracterizado porque la proteína de la envoltura de HFV, cuya totalidad o parte del dominio citoplásmico está reemplazado por la totalidad o parte de una proteína de la envoltura viral que no es de FV, y preferentemente de la proteína de la envoltura retrovírica de MuLV.

11. Constructo para la expresión de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la proteína está formada por la fusión de la totalidad o parte de un dominio citoplásmico de MuLV con una proteína modificada de la envoltura de HFV.

12. Constructo para la expresión de una proteína según las reivindicaciones 10 y 11, caracterizado porque el dominio citoplásmico de MuLV se procesa o no.

13. Constructo para la expresión de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la proteína comprende una proteína modificada de la envoltura de HFV truncada de residuo 981, que se fusiona con un residuo de arginina y el dominio citoplásmico no procesado de MuLV que comprende desde el residuo 634 al residuo 665 de la proteína de la envoltura de MuLV de tipo salvaje.

14. Constructo para la expresión de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el constructo comprende una mutación del sitio o sitios de corte y empalme del donante y/o del receptor, que se encuentran de modo natural en la secuencia de codificación de la proteína de la envoltura de FV.

15. Proteína tal como se expresa mediante un constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Partícula vírica pseudotipificada que comprende una proteína según la reivindicación 15.

17. Progenie celular de complementación que comprende un constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

18. Progenie celular de complementación según la reivindicación 17, que comprende un constructo según la reivindicación 9 ó 13.

19. Progenie celular de complementación según la reivindicación 17 ó 18, que comprende además un constructo que expresa un gen vírico gag/pol.

20. Progenie celular de complementación según la reivindicación 19, caracterizada porque el gen retrovírico gag/pol deriva de MuLV ó FB 29 ó SIV.

21. Progenie celular de complementación según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizada porque la progenie celular deriva de la progenie 293.

22. Procedimiento para la preparación de una partícula vírica pseudotipificada según la reivindicación 16, que comprende:

(i) introducir un vector retrovírico recombinante en una célula de complementación, según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21,

(ii) cultivar dicha progenie celular de complementación bajo condiciones apropiadas para permitir la producción de dicha partícula vírica pseudotipificada y

(iii) recuperar dicha partícula vírica pseudotipificada a partir del cultivo celular.

23. Célula de mamífero infectada con una partícula vírica pseudotipificada según la reivindicación 16, o con una partícula vírica pseudotipificada que puede obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 22.

24. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de una partícula vírica pseudotipificada según la reivindicación 16, o que puede obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 22, o una célula de mamífero según la reivindicación 23.

25. Utilización de una partícula vírica pseudotipificada según la reivindicación 16 o que puede obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 22, o una célula de mamífero según la reivindicación 23 para preparar un medicamento previsto para el tratamiento de un trastorno genético, un cáncer o una enfermedad inducida víricamente.

26. Utilización de un constructo tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para expresar una proteína con objeto de producir partículas víricas pseudotipificadas, comprendiendo dicha proteína por lo menos una proteína modificada de la envoltura del virus espumoso (FV) y consistiendo dicha modificación, por lo menos en una envoltura en el residuo 975 ó 981 de dicha proteína.

27. Utilización de un constructo según la reivindicación 26, caracterizado porque el virus espumoso es el virus espumoso humano (HFV).