ES2236888T3 - Expresion de una proteina modificada de la envoltura del virus espumoso. - Google Patents
Expresion de una proteina modificada de la envoltura del virus espumoso.Info
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Abstract
La invención se refiere a contrucciones para la expresión de una proteína que comprende al menos una proteína de envoltura de FV, la proteína así obtenida así como la línea celular de complemento permiten la producción de una partícula de tipo pseudoviral. También se refiere a una composición farmacéutica que comprende las mencionadas partículas y a un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad.
Description
Expresión de una proteína modificada de la
envoltura del virus espumoso.
El subgrupo de virus espumosos (FV) de los virus
retroides ha atraído el interés científico a causa de su estrategia
de replicación única y a su utilización potencial como vectores de
transferencia génica (35). Se ha propuesto que los FVs pueden
constituir herramientas ideales para el desarrollo de un sistema de
suministro génico, debido a propiedades específicas de este grupo
vírico tales como la ausencia de anticuerpos FV en la población
humana, el curso benigno de las infecciones naturales de FV, su
ámbito muy extenso de células huésped, y un límite amplio de
empaquetamiento, debido al tamaño del genoma de FV (4,30,32). Sin
embargo, el conocimiento limitado de la biología molecular de este
grupo vírico no ha permitido hasta ahora el desarrollo de progenies
celulares y vectores de empaquetamiento seguros, tales como los que
se han derivado para los retrovirus murinos, entre otros (27). Por
ejemplo, el FV es un virus ADN con una compleja organización
genómica. Además de las LTRs (repeticiones terminales largas), de
una región de empaquetamiento y de los genes gag, pol, env,
comprende también varios genes tales como bel1, bel2, bel3, bet,
beo y bes, localizados entre env y 3'LTR. El gen env codifica un
precursor glicosilado de 130 kDa que es fragmentado, dando lugar a
las subunidades de superficie (SU) y transmembranosa (TM) (véase la
Fig 1 y 4). La subunidad TM incluye en su parte 3' un dominio de
anclaje transmembranoso (A en la Fig 4) compuesto por residuos
hidrofóbicos, que es seguido por una cola citoplásmica. Además los
FVs expresan su proteína Pol a partir de un ARNm de corte y
empalme, independientemente de la proteína Gag, siendo ampliamente
desconocidos el mecanismo del empaquetamiento y del ensamblaje de
partícula del genoma FV, así como el significado de altas cantidades
del ADN transcrito inverso en las partículas extracelulares (10,
18, 39). Otras características únicas incluyen la localización
nuclear de la proteína precursora Gag (31, 40) y la gemación
predominante en las vesículas intracitoplásmicas que puede ser una
consecuencia de la retención de la proteína precursora Env en el ER
(13).
Los vectores de transferencia génica basados en
el retrovirus de Moloney constituyen habitualmente los principales
vehículos para una transferencia génica estable de alta eficiencia
en una amplia variedad de tipos celulares (20).
Las mayores limitaciones de este sistema
vectorial son el ámbito restringido de la célula huésped y la
infectividad ineficiente para algunas células humanas (revisado en
(1)). Recientemente, se han mostrado varios procedimientos que
superan estas desventajas que utilizan la pseudotipificación con
proteínas extrañas de envoltura, tales como la glicoproteína G
(6,38) del virus de la estomatitis vesicular (VSV), o la proteína
de envoltura (2,34) del virus de la leucemia (GALV) del mono
gibón.
Sin embargo, la expresión de
VSV-G por ejemplo es altamente tóxica para las
células productoras y ha evitado la generación de la progenie de
células de empaquetamiento VSV-G estables (8, 22,
37). [Algunas modificaciones en la proteína env del virus
espumoso ya se han dado a conocer. De hecho, Mahnke et al
(J. Virol. Methods, 29 (1), 1990, 13-22), dan a
conocer constructos para la expresión de la proteína env del
HSRV (Virus Espumoso Humano) fusionada al péptido MS2 polimerasa, y
la expresión resultante de dicha proteína de fusión en
E.coli, y Goepfert et al (Journal of Virology, vol
71, nº1, 1997, 778-784) dan a conocer constructos
con codones env de HFV alterados].
Sin embargo, la invención se refiere a
constructos para la expresión de una proteína que comprende por lo
menos una proteína modificada de la envoltura de FV que se trunca
en el aminoácido nº 975, o más preferentemente, en el 981. El
truncamiento puede extenderse hasta el codon de detención o de forma
alternativa, comprende opcionalmente antes de este codon de
detención, uno o varios residuos de la proteína env original de
FV.
La proteína env modificada de FV que se utiliza
en la presente invención es una proteína de fusión que comprende
además la totalidad o preferentemente una parte de una proteína de
la envoltura que no es de FV.
El FV preferido según la presente invención es el
virus espumoso humano (HFV), pero pueden utilizarse otros (por
ejemplo, el FV de simio).
Ejemplos de virus no FV apropiados incluyen
retrovirus aviarios, retrovirus bovinos, retrovirus felinos,
retrovirus murinos tal como el Virus de la Leucemia Murino (MuLV) y
particularmente Maloney MuLV (MoMuLV), virus Friend de la Leucemia
Murina (FrMuLV) especialmente la cepa FB 29, el Virus del Sarcoma
Murino (MSV), retrovirus de primates, tales como GaLV, o lentivirus
tales como HIV (Virus de la Inmunodeficiencia Humana) o SIV (Virus
de la Inmunodeficiencia de simio).
La fusión entre las proteínas env de FV y las que
no son de FV puede llevarse a cabo en diferentes localizaciones.
Las fusiones en el interior de la subunidad TM son ventajosas.
Según una primera alternativa, la fusión se lleva a cabo dentro del
dominio de anclaje transmembranoso de dichas proteínas de la
envoltura de FV y de proteínas de la envoltura que no son de FV. Un
ejemplo preferido es una proteína que comprende el dominio
extracelular y la parte del extremo 5' del dominio de anclaje
transmembranoso de la proteína de la envoltura de HFV y la parte
del extremo 3' del dominio del anclaje transmembranoso y el dominio
citoplásmico de la proteína de la envoltura que no es de FV,
particularmente de la proteína de la envoltura del SIV.
Una segunda alternativa es que la fusión se lleve
a cabo dentro del sitio de división de dichas proteínas de la
envoltura de FV y de las proteínas de la envoltura que no son de
FV. Un ejemplo preferido es una proteína que comprende el dominio
SU y la totalidad o parte del sitio de división de la proteína de la
envoltura de HFV y la totalidad o parte del sitio de división y el
dominio TM, que comprende el dominio del anclaje transmembranoso y
el dominio citoplásmico, de la proteína de la envoltura que no es
de FV, particularmente de la proteína de la envoltura del SIV.
También puede considerarse el reemplazamiento del sitio de división
de la proteína de la envoltura de FV por su equivalente de la
proteína de la envoltura que no es de FV.
Otra alternativa es que la fusión se lleve a cabo
en la unión entre el dominio de anclaje transmembranoso y el
dominio citoplásmico o dentro de los dominios citoplásmicos de
dichas proteínas de la envoltura de FV y de las proteínas de la
envoltura que no son de FV. Un ejemplo preferido es una proteína
que comprende el dominio extracelular, el dominio de anclaje
transmembranoso y la totalidad o parte del dominio citoplásmico de
la proteína de la envoltura y la totalidad o parte del dominio
citoplásmico de la proteína de envoltura que no es de FV,
particularmente de la proteína de la envoltura de SIV.
En una forma de realización particularmente
preferida, una proteína según la invención consiste en una
envoltura proteica del HFV en la que la totalidad o parte del
dominio citoplásmico es reemplazada por la totalidad o parte de un
dominio citoplásmico de una proteína de la envoltura vírica que no
es de FV, especialmente de una proteína de la envoltura de MuLV.
Ventajosamente, la proteína de fusión consiste en la fusión de un
dominio citoplásmico de MuLV a una proteína modificada de la
envoltura de HFV. El dominio citoplásmico de MuLV que se utiliza en
la presente invención puede procesarse o no. "Procesarse"
significa que contiene el sitio de división reconocido normalmente
por la correspondiente proteasa retrovírica y "no procesarse",
que no lo contiene o que no es funcional (mutación, deleción o
truncamiento).
El constructo preferido de la invención es el que
permite la expresión de la proteína de fusión que se denomina en lo
sucesivo, en la presente memoria, HFV \Delta2 MuLV.
Alternativamente, una proteína preferida según la
invención consiste en una proteína de la envoltura de HFV en la que
toda o parte de la cola citoplásmica es reemplazada por la
totalidad o parte de un dominio citoplásmico de una proteína de la
envoltura del SIV. Existen dos versiones de la proteína de la
envoltura de SIV: una forma larga que presenta una cola citoplásmica
de 164 aminoácidos que se encuentra en las partículas SIV que se
replican en el huésped natural, el mono rhesus (Macaca mulatta), y
una forma corta que contiene sólo 18 aminoácidos. Esta forma corta
es seleccionada cuando el virus aislado del mono se cultiva en
progenies celulares humanas (42).
También es posible que el constructo de la
invención esté cambiado en los sitios de corte y empalme del
donante y/o receptor que se encuentran naturalmente en la secuencia
que codifica la proteína env de FV.
El constructo de la invención puede incluir
elementos regulatorios para permitir la transcripción y traducción
de la secuencia que codifica la proteína env modificada de FV. En
particular, un promotor apropiado puede unirse contracorriente de
la secuencia de codificación de env de FV de una forma operativa,
mediante técnicas recombinantes convencionales. Dicho promotor puede
ser de origen procariótico, eucariótico o vírico, y puede ser
constitutivo o regulado. Dichos elementos regulatorios son bien
conocidos en la técnica.
Pertenece también al alcance de la invención que
el constructo de la invención puede comprender además un gen de
selección que permita la detección y aislamiento de las células que
expresan la proteína env modificada de FV. En el contexto de la
invención, el gen de selección puede estar bajo el control
transcripcional del promotor que dirige la expresión de la proteína
env modificada de FV que da lugar a un transcrito bicistrónico, o
bajo el control de una región promotora adicional. Los posibles
genes de selección son numerosos, por ejemplo, el neo gen que
confiere resistencia al antibiótico G418, el gen de la
dihidrofolato reductasa (dhFr), el gen puromicina acetiltransferasa
(pac) o el xantina fosforibosil transferasa (gpt).
El constructo de la invención puede insertarse en
cualquier vector apropiado, un vector vírico (por ejemplo, un
vector retrovírico) o un plásmido. La selección del vector
apropiado es amplia y pertenece a las competencias del experto en
la técnica. Dicho vector puede ser integrador o no. Para disminuir
la posibilidad de generar partículas víricas competentes para la
replicación, es ventajoso que al constructo le falte cualquier LTR
y región de empaquetamiento retrovírica.
La invención se refiere también a proteínas de
fusión, tal como se expresa por los constructos de expresión
anteriores, así como por partículas víricas pseudotipificadas que
comprenden una proteína env de FV. Esta última puede derivarse de
una proteína env FV nativa, de una parte de la misma o de una
modificada. En una forma de realización preferida, la partícula
vírica pseudotipificada en su superficie comprende una proteína env
modificada de FV, tal como se expresa mediante un constructo según
la invención. La partícula vírica pseudotipificada de la invención
puede generarse después de la transfección de un vector vírico
recombinante en una progenie celular de complementación. La
tecnología es convencional y se describe en numerosos documentos de
la técnica anterior. Un vector vírico que se utilice en la presente
invención, comprende preferentemente por lo menos una 5'LTR, una
región de empaquetamiento y una 3'LTR derivada de cualquier
retrovirus tales como los citados anteriormente y un gen capaz de
expresar un ribozima, una molécula de ARN
anti-sentido y un ARNm para producir además un
polipéptido de interés. De particular interés son los polipéptidos
terapéuticos, que incluyen pero no se limitan a las citoquinas
(IL-2, IFN \alpha, \beta ó \gamma),
timidínquinasa (TK) del tipo 1 del Virus del Herpes Simple
(HSV-1), Regulador de la Conductancia
Transmembranal de la Fibrosis Quística (CFTR), Distrofina, Factores
de Coagulación (FVIII, FIX,....), antígenos asociados a tumores
(MUC-1, antígenos HPV), anticuerpos, inmunotoxinas,
medicamentos anti-HIV, factores de crecimiento
(Factor de Crecimiento Fibroblástico FGF, Factor de Crecimiento
Endotelial Vascular (VEGF), inductores de la apoptosis (Bax...),
inhibidores de la apoptosis (Bcl2, Bclx...), agentes citostáticos
(p21, p16, Rb), epolipoproteínas, ácido nítrico sintetasa (Nos),
eliminadores de radicales de oxígeno (SOD, catalasa), productos
supresores de tumores (p53, p73) y marcadores. La lista no es
limitativa. Además, el vector vírico que se utiliza en la presente
invención puede transferir uno o más genes en una forma nativa,
truncada, mutada o híbrida. El gen o genes se sitúa bajo el control
de elementos que permiten su expresión en una célula eucariota.
Dichos elementos incluyen un promotor, que puede ser de cualquier
origen (LTR retrovírico o promotor interno). Puede ser constitutivo
o sensible para las células o los factores
histo-específicos.
Otro objeto de la invención se refiere a
progenies celulares de complementación que permiten la producción
de las partículas víricas pseudotipificadas y el procedimiento de
su preparación.
La invención se refiere además a progenies
celulares de complementación que comprenden un constructo de la
invención.
Preferentemente, dicha progenie celular de
complementación comprende un constructo de la invención
caracterizado porque la fusión se realiza en una unión entre el
dominio de anclaje transmembranoso y el dominio citoplásmico, o
dentro de los dominios citoplásmicos de dichas proteínas de la
envoltura de FV y de la envoltura que no es de FV, y porque la
proteína expresada comprende el dominio extracelular, el dominio de
anclaje transmembranoso y la totalidad o parte del dominio
citoplásmico de la proteína de la envoltura de HVF y de la
totalidad o parte del dominio citoplásmico de la proteína de la
envoltura que no es de FV, particularmente de la proteína de la
envoltura del SIV.
En otra forma de realización preferida, dicha
progenie celular de complementación comprende un constructo de la
invención para la expresión de una proteína caracterizada porque la
proteína es HFV, \Delta2MuLV.
La progenie celular de complementación de la
invención puede derivar de cualquier célula y, particularmente, de
la célula eucariótica. Se pueden considerar progenies celulares
murinas, progenies celulares farmacéuticamente aceptables (Vero,
CHO) o una progenie celular humana tal como 293 ó A549. Puede
generarse mediante la transfección de un constructo según la
invención, junto con un primer gen de selección. Las células mas
productotas de env se rastrean entonces respecto a la expresión de
niveles altos de la proteína env de FV mediante inmunodetección,
utilizando anticuerpos contra env de FV, transferencia Western, FACS
(Clasificador de células activadas fluorescentes) o cualquier otro
procedimiento. Alternativamente, la progenie celular de
complementación de la invención, puede también comprender un
constructo que exprese un gen vírico gag/pol, más preferentemente
de MuLV, FB29, SIV o HFV junto con un segundo gen de selección
diferente del primero. Preferentemente, los genes env y gag/pol son
transportados por vectores de expresión separados, que carecen de
LTR y la región de empaquetamiento. Las etapas de selección y de
rastreo se repiten para seleccionar un clon que produzca env que
expresa ulteriormente el producto de expresión gag/pol.
Una progenie celular de complementación de la
invención puede utilizarse para empaquetar el vector vírico
recombinante. El título puede analizarse utilizando un vector
vírico convencional que expresa un tercer gen de selección
diferente de los previos o un gen marcador (por ejemplo, Lac Z).
Como resultado, las células que producen altos títulos de
partículas víricas pseudotipificadas, son seleccionadas y pueden
cultivarse para suministrar una progenie celular estable de
complementación. Las células pueden también ensayarse
transitoriamente, tal como se lleva a cabo y se describe
habitualmente a continuación en la presente memoria.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona también un procedimiento para preparar una partícula
vírica pseudotipificada de la invención. Dicho procedimiento
comprende la operación de (1) introducir un vector retrovírico
recombinante en una progenie celular de complementación de la
invención, (2) cultivar dicha progenie celular de complementación
bajo condiciones apropiadas que permiten la producción de dicha
partícula vírica pseudotipificada y (3) recuperar la partícula
vírica pseudotipificada resultante a partir del cultivo
celular.
Preferentemente, la partícula vírica
pseudotipificada se recupera a partir del sobrenadante del cultivo
celular, pero también puede considerarse una etapa de lisis
celular. La partícula vírica pseudotipificada puede también
purificarse posteriormente mediante tecnología convencional (por
ejemplo, ultracentrifugación en gradiente de sacarosa o ClCs).
Ventajosamente, la partícula vírica pseudotipificada producida de
este modo, es capaz de infectar (preferentemente en ausencia de
policationes, tal como el polibreno), una amplia variedad de
células y opcionalmente resistir la inactivación mediante suero
humano.
Según otro aspecto de la invención, también se
proporciona una célula huésped de mamífero infectada mediante la
partícula vírica pseudotipificada de la invención o que puede
obtenerse mediante un procedimiento de la invención. Dicha célula
huésped incluye sin limitación células humanas epiteliales,
pulmonares, musculares, hepáticas, hematopoyéticas, fibroblastos y
linfocitos.
Una partícula infecciosa pseudotipificada, así
como una célula de mamífero de la invención, puede aplicarse en la
prevención o tratamiento de varias enfermedades, como una vacuna o
un agente terapeútico.
Pertenece también al alcance de la invención
proporcionar una composición farmacéutica que comprende una cantidad
terapéutica o profilácticamente efectiva de una partícula vírica
pseudotipificada de la invención, o que puede obtenerse mediante un
procedimiento de la invención, así como una célula de mamífero de la
invención como agente terapéutico. Dicha composición farmacéutica
puede producirse de una forma convencional. En particular, la
partícula o la célula de mamífero de la invención pueden combinarse
con sustancias apropiadas bien conocidas en la técnica, tal como un
transportador, diluyente, adyuvante o excipiente. La formulación
particular de la composición farmacéutica depende de varios
parámetros, por ejemplo, el polipéptido que interesa expresar el
sitio deseado de acción, el procedimiento de administración y el
individuo que va a tratarse. Dicha formulación puede determinarse
por los expertos en la técnica y mediante el conocimiento
convencional.
Típicamente, las partículas pseudotipificadas se
preparan como una solución en un diluyente aceptable, tal como un
diluyente salino, salino tamponado con fosfato u otro
farmacéuticamente aceptable. La vía de inoculación puede ser
intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intrapulmonar,
intratraqueal, intragástrica e intratumoral. La dosis puede ser
única o repetida. La cantidad variará, dependiendo del individuo
(peso, sexo, edad, condiciones médicas..) y de la enfermedad que va
a tratarse. En general, es deseable proporcionar partículas víricas
pseudotipificadas de la invención del orden de entre 10^{4} a
aproximadamente 10^{13} unidades formadoras de placa (pfu)/dosis,
ventajosamente del orden de 10^{5} a aproximadamente 10^{10}, y
preferentemente, de entre 10^{6} a aproximadamente 10^{9}. La
composición de la invención puede introducirse en un mamífero
(humano) ex vivo mediante una exposición previa de las
células diana a las partículas víricas pseudotipificadas, antes de
la introducción de las células transducidas en un mamífero, o
inyectadas in vivo en el tejido afectado, en la circulación o
localmente.
En una última forma de realización de la
invención, también se proporciona un procedimiento para tratar un
trastorno genético o una enfermedad inducida por cualquier gen
patogénico, tal como cáncer o una enfermedad inducida víricamente,
que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente
efectiva de una partícula vírica pseudotipificada o una célula de
mamífero de la invención a un individuo que necesite un
tratamiento.
Estas y otras ventajas del objeto de la invención
se pondrán más claramente de manifiesto a partir de los ejemplos
siguientes y de los dibujos adjuntos. Estas formas de realización
no representan el alcance completo de la invención.
En particular, la incorporación de las proteínas
de la envoltura de virus espumoso humano (HFV) a las partículas del
virus de la leucemia murina (MuLV) se estudió en un sistema celular
de empaquetamiento de transfección transitoria. Se describe en la
presente memoria que la proteína de la envoltura de HFV de tipo
salvaje puede pseudotipificar partículas MuLV, aunque con una baja
eficiencia. La eliminación completa o parcial de la cola
citoplásmica de HFV dio lugar a la abolición o reducción de la
infectividad mediada de HFV, lo que implica un papel de la cola
citoplásmica de la envoltura de HFV en la pseudotipificación de las
partículas MuLV. La mutación de la señal de retención ER que se
encuentra en la cola citoplásmica de la envoltura de HFV, no dio
lugar a una infectividad relativa más alta de los vectores
retrovíricos pseudotipificados. Sin embargo, una proteína quimérica
de la envoltura que contiene un dominio citoplásmico no procesado
de la envoltura de MuLV que se fusionó a una proteína truncada de la
envoltura de HFV, mostró una infectividad potenciada específica de
HFV, como resultado del aumento de la incorporación de proteínas
quiméricas de la envoltura en las partículas de MuLV.
Figura
1
El tramo extracelular de la membrana (también
denominado dominio A de anclaje transmembranoso), y los dominios
citoplásmicos de los componentes TM del HFV (espacios en blanco) y
las envolturas de MuLV (espacios sombreados) se muestran según (11,
24). La secuencia aminoácida de las proteínas del MuLV y HFV de
tipo salvaje se proporcionan a continuación de la ilustración
esquemática. Las posiciones de los aminoácidos en los constructos
de la envoltura de HFV están marcadas en la regla (presente en la
Figura). La localización del motivo secuencial en el dominio
citoplásmico de la envoltura de HFV, responsable de la retención de
ER (13), se indica como un espacio en negro, y la secuencia mutada
como un espacio rayado. El sitio de división de la proteasa de MuLV
en el dominio citoplásmico completo de la proteína de la envoltura
de MuLV, se indica mediante dos flechas invertidas.
Figura
2
Las células NIH3T3 (franja sombreada) ó
QT-6 (franja continua) se infectaron con distintas
partículas MuLV pseudotifipicadas generadas mediante transfección
transitoria de las células 293T. 48 horas después de la
transducción, el porcentaje de las células que expresaban GFP se
cuantificó mediante análisis FACS. La fluorescencia media de las
células que expresaban GFP fue de 100 a 300 veces superiores a la
de las células infectadas simuladas. Los constructos individuales
de la envoltura utilizados para el pseudotipificado se indican en
el eje y del gráfico. El porcentaje medio de las células que
expresan GFP para cada constructo se muestra en el eje x con la
correspondiente desviación estándar. Los constructos individuales
se ensayaron 2-6 veces.
\newpage
Figura
3
Se generaron partículas MuLV pseudotipificadas
con distintas proteínas de la envoltura, tal como se indicó en el
eje y, mediante transfección transitoria de las células 293T. Los
sobrenadantes (1 ml) se incubaron con suero específico de chimpancé
anti-HFV (1:60) (franja continua), o suero humano
(1:60) de un individuo sano (franja sombreada) durante 1 hora a
37ºC, antes de la adición a células NIH3T3 (A) o
QT-6. El sobrenadante se aspiró cuatro horas
después, y se reemplazó con medio de crecimiento recién preparado.
48 horas después de la transducción, el porcentaje de las células
que expresan GFP se determinó tal como se describe en la leyenda de
la Fig 2. El experimento se llevó a cabo dos veces con un suero
neutralizante de mono y además, con un suero de conejo
anti-HFV (datos que no se muestran) dando lugar a
una inhibición relativa similar de la infectividad de los vectores
retrovíricos pseudotipificados de la envoltura de HFV.
Figura
4
HFV WT y SIV son versiones de tipo salvaje de los
genes de la envoltura de virus espumoso humano y de virus de simio
de la inmunodeficiencia (clon molecular mm 251). Los dominios del
HFV se representan en blanco y los del SIV, en gris. El sitio de
división que separa el dominio SU y TM se indica con una línea
vertical. RRE representa el elemento sensible rev y A el dominio de
anclaje transmembranoso. El dominio extracelular en el extremo 5'
del dominio de anclaje transmembranoso y el dominio citoplásmico en
el extremo 3' del dominio de anclaje transmembranoso, también está
indicados. Env 1 a 9 representan los constructos quiméricos HFV/SIV
de env, que comprenden la fusión con la versión larga (Env 1, 3 y
5) o la versión corta (Env 2, 4, 6, 7, 8 y 9) de la envoltura del
SIV.
Figura
5
A. Ilustra los dominios de anclaje
transmembranoso de los genes HFV y SIV mm251 env y la fusión en el
dominio de anclaje transmembranoso de HFV y SIV mm251 (Chim):
aminoácidos idénticos en las envolturas de HFV y SIV están en
negrita, las secuencias del dominio de anclaje transmembramoso de
las envolturas de HFV y SIV, están subrayadas. B. ilustra la fusión
en el sitio de división entre los dominios de las envolturas SU y
TM de HFV y las envolturas SIV mm251: la secuencia consenso del
sitio de división está en negrita, y el sitio de división está
indicado por un espacio en la secuencia aminoácida. C. Ilustra la
sustitución de la cola citoplásmica de la envoltura de HFV con la
cola citoplásmica de la envoltura de SIV mm251: las secuencias del
anclaje transmembranoso están subrayadas, (141) indica los últimos
141 aminoácidos de la larga cola citoplásmica SIV. D. Secuencias
aminoácidas de las colas citoplásmicas largas y cortas de la
envoltura de SIV; los dominios de anclaje transmembranosos están
subrayados. ^{*} indica un codon de detención, (141) indica los
últimos 141 aminoácidos de la cola citoplásmica larga del SIV.
Figura
6
La secuencia aminoácida que se muestra en la
parte superior es del gen SIV mm251 env, que indica ^{*} el codon
de detención del gen env humanizado. A indica la mutación de G a A
que da lugar a la destrucción del sitio de empalme del extremo 3'.
El exón Tat/Rev 2 empieza en la secuencia TAGACT pero el marco de
lectura es diferente que el de env.
La presente invención se ilustrará a continuación
en los siguientes ejemplos no limitativos.
Todas las construcciones se llevan a cabo
utilizando técnicas estándar de ADN recombinante, tales como las
descritas en T. Maniatis et al., Molecular Cloning: a
laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY 1982. Las progenies
celulares son accesibles mediante colecciones de cultivos tales como
ATCC y se cultivan en condiciones estándar (NIH3T3:
CRL-1658, Mv.1.Lu CCL64, HT 1080 CCL 121, BHK 21
CCL 10, QT 26 CRL 1708 y 293 CRL 1573). La secuencia de la proteína
env de HFV ya se ha publicado y está disponible en la base de datos
de EMBL (número de registro 407725).
Se generó un constructo de expresión eucariótica
para el gen de la envoltura de la cepa del FV humano (HFV),
insertando un fragmento AflII/EcoRI de 3076 pares de bases del clon
provírico pHSRVI de HFV (28), que contiene el marco de lectura de
longitud completa (ORF), abierto, de la env, en el vector pCDNA3
(Invitrogen). Este constructo se denominó pCHFV wt y se utilizó para
generar las proteínas mutantes y quiméricas de la envoltura de HFV
que se muestran en la Fig 1. Brevemente, se obtuvieron constructos
truncados o quiméricos de la env, utilizando la reacción en cadena
de la polimerasa sobre los genes de HFV y/o de MuLV env, como
matrices y oligonucleótidos que incorporaban las mutaciones
deseadas. Los mutantes se insertaron en el vector básico descrito
anteriormente y se secuenciaron, para excluir mutaciones fuera de
lugar. Se generaron tres constructos mutantes de la envoltura de
HFV. pCHFV \Delta1 y pCHFV \Delta2 codifican las proteínas de
la envoltura de HFV truncadas en los aminoácidos 975 ó 981,
respectivamente. pCHFV \Delta2 tiene una arginina
C-terminal añadida, que no se encuentra en la
secuencia original de env de HFV. Según la estructura del dominio de
la envoltura de HFV propuesta por Flugel et al (11), los
truncamientos dieron lugar a una eliminación completa (pCHFV
\Delta1) o parcial (pCHFV \Delta2) del dominio citoplásmico.
Finalmente, el constructo pCHFV SSS produce una proteína de la
envoltura de HFV que posee el motivo triple de lisina (aminoácidos
984-086) en el extremo C-terminal
de la cola citoplásmica de la proteína transmembranosa (TM)
reemplazada por residuos de serina. Se ha mostrado que este motivo
secuencial es responsable de la retención por ER de la envoltura de
HFV (13, 14).
En total, se construyeron 6 proteínas quiméricas
de la envoltura mediante la fusión C-terminal de
las secuencias que codifican el dominio citoplásmico procesado o no
procesado de la proteína de la envoltura de MuLV (16,17). pCHFV
\Delta1MuLVR-, pCHFV \Delta2MuLVR- y pCHFV SSSMuLVR- codifican
proteínas de fusión formadas por las tres mutaciones descritas
anteriormente y un dominio citoplásmico procesado de la envoltura
de MuLV (en los aminoácidos 634-649), mientras que
pCHFV \Delta1MuLV, pCHFV \Delta2MuLV y pCHFV SSSMuLV codifican
las proteínas de fusión respectivas que contenían un dominio
citoplásmico no procesado de la envoltura de MuLV (en aminoácidos
634-665) en el extremo C.
Los constructos de expresión para las gag/pol de
MuLV (pHIT60), y las envolturas ecotrópicas (pHITl23) y
anfotrópicas (pHIT456) de MuLV fueron amablemente proporcionadas
por A. Kingsman (33). El vector retrovírico SFG GFPS65T contiene el
ORF humanizado de la proteína verde fluorescente (7) (una donación
de M. Vogel) insertado en los sitios de clonación del vector
retrovírico SFG basado en MuLV (5, 22), mientras que MFG.S
NLS-LacZ (22) contiene el gen de la
\beta-galactosidasa fusionado con la señal de
localización nuclear del SV40 (NLS) (una donación de R. Mulligan).
El constructo de expresión VSV-G se generó
insertando un fragmento EcoRI de 1,6 kb del plásmido
pSVGL-1 (29) (una donación de J. Rose) que contiene
el ORF de VSV, en el vector pHIT.
Se generaron partículas retrovíricas
recombinantes utilizando esencialmente el sistema pHIT de
enpaquetamiento, tal como se ha descrito anteriormente (33).
Brevemente, las células 293T (9) se transfectaron transitoriamente
con un constructo de expresión para gag/pol de MuLV (pHIT60), el
vector SFG GFPS65T retrovírico basado en MuLV, y los distintos
constructos de expresión de la envoltura descritos anteriormente.
Los sobrenadantes víricos se recuperaron 48-72
horas después de la transfección. Los sobrenadantes de las
transfecciones independientes con los mismos plásmidos, se
juntaron, se filtraron (tamaño de poro de 0,45 \mum), se añadió
polibreno a una concentración final de 8 \mug/ml y los
sobrenadantes se utilizaron inmediatamente o se guardaron a -80ºC
hasta su utilización. Las células diana que expresaban la proteína
GFP después de la transducción retrovírica se identificaron
mediante análisis FACS en un rastreo FACS, y el número de células
positivas se cuantificaron utilizando el empaquetamiento de
Software LysisII y CellQuest (Becton Dickinson).
Los experimentos iniciales utilizando el
constructo de expresión pCHFV mostraron que las partículas MuLV
pueden pseudotipificarse con la proteína HFV wt de la envoltura y
pueden transducir las células NIH3T3, aunque con una baja
eficiencia (Fig 2). La proteína de la envoltura de HFV contiene una
secuencia señal en su dominio citoplásmico que conduce a una
retención en el ER de las células de expresión (13, 14). Por tanto,
tres constructos pCHFV \Delta1, pCHFV \Delta2, y pCHFV SSS, que
codifican las proteínas de la envoltura de HFV mutadas o truncadas
citoplásmicamente, se examinaron para determinar la influencia del
dominio citoplásmico de la envoltura de HFV y de su retención ER en
la eficiencia de la pseudotipificación. La eliminación completa
(pCHFV \Delta1) o parcial (pCHFV \Delta2) del dominio
citoplásmico de la envoltura de HFV da lugar a una abolición o
reducción de la ya baja actividad de pseudotipificación que se
observó para la proteína de tipo salvaje (Fig 2). La mutación de la
señal de retención ER citoplásmica (pCHFV SSS) ha mostrado aumentar
la expresión superficial celular de la proteína de la envoltura de
HFV (13). Sin embargo, la pseudotipificación de las partículas
víricas con dicha proteína mutante no dio lugar, también, a una
infectividad más alta de estos virus (Fig 2).
Ya que la eliminación o modificación del dominio
citoplásmico del HFV no fue capaz de aumentar la eficiencia de la
infección del virus pseudotipificado, se ha utilizado
posteriormente un segundo planteamiento para probar si el
reemplazamiento del dominio citoplásmico del HFV por el dominio
citoplásmico del MuLV, o la fusión del dominio citoplásmico de MuLV
a una envoltura modificada completa del HFV tendría el efecto
deseado. Se mostró que el dominio citoplásmico de la envoltura del
MuLV era procesado por la proteasa de MuLV en la partícula vírica
(16, 17). La expresión de una forma ya procesada de la forma de la
proteína de la envoltura de MuLV en las células dio lugar a la
formación de grandes sincitios multinucleados y a una disminución de
la infectividad vírica (24, 26). Por tanto, se generaron las
proteínas de fusión C-terminal de los tres mutantes
descritas anteriormente y el dominio citoplásmico procesado
(MuLVR-) o no procesado (MuLV) de la proteína de la envoltura del
MuLV, y las partículas pseudotipificadas con estas proteínas
quiméricas de la envoltura, se ensayaron en cuanto a su infectividad
sobre las células NIH3T3. De forma interesante, los virus
pseudotipificados con una mutante, la proteína HFV \Delta2MuLV,
mostraron una infectividad entre 10 y 20 veces mayor que las
partículas pseudotipificadas con la proteína de la envoltura de HFV
de tipo salvaje (Fig 2). Este aumento en la infectividad a través de
la proteína de HFV \Delta2MuLV no fue específico para las células
NIH3T3 o las murinas, pues resultados similares se obtuvieron para
la progenie celular fibroblástica de la codorniz
QT-6, que no es infectable mediante partículas
víricas revestidas con proteínas de la envoltura de MuLV (Fig 2). En
estas células la infectividad de las partículas pseudotipificadas
con la proteína de la envoltura de HFV \Delta2 MuLV fue
consistentemente más alta que las pseudotipificadas con la proteína
VSV-G. Todas las otras proteínas analizadas dieron
lugar a virus pseudotipificados con una infectividad similar
relativa o más baja, cuando se compara con la envoltura de HFV de
tipo salvaje en ambas progenies celulares (Fig 2). Además, las
proteínas quiméricas de la envoltura de HFV que contienen un
dominio citoplásmico procesado de MuLV, mostraron una actividad de
fusión más intensa que las proteínas que presentan con un dominio
citoplásmico no procesado de MuLV sobre la expresión en las células
L929 mediante vectores retrovíricos (datos no mostrados). Este
resultado coincide con los datos que muestran que el dominio
citoplásmico de la envoltura de MuLV puede controlar la actividad
de fusión de las proteínas extrañas de la envoltura, tal como el
virus de simio de inmunodeficiencia (SIV), cuando se expresan como
una proteína quimérica de la envoltura (36). Además, los
sobrenadantes que contienen un vector retrovírico que codifica una
proteína \beta-galactosidásica localizada en el
núcleo, vector pseudotipificado con las distintas proteínas de la
envoltura, se dosificaron sobre las progenies celulares de varias
especies (Tabla). Más precisamente, células diana (1 x
10^{4}/pocillo) se sembraron 24 horas antes de la infección con
diluciones seriales de los sobrenadantes de las células 293T
transfectadas. Cuarenta y ocho horas después de la infección, los
números de focos azules se contaron por duplicado y se calcularon
los títulos. Los valores de los duplicados eran del orden del
triple. Los resultados que se muestran representan dos titulaciones
independientes sobre las progenies celulares indicadas, utilizando
para todas éstas sobrenadantes libres procedentes de las mismas
transfecciones, con títulos relativos reproducibles en ambos
experimentos. Los sobrenadantes que contienen partículas
pseudotipificadas se dosificaron hasta 6 veces sobre células HIH3T3
con resultados reproducibles. Las partículas retrovíricas
pseudotipificadas con la proteína de la envoltura HFV wt ó con la
quimeras HIV \Delta2MuLV pudieron infectar células de origen
humano, de visón, de codorniz y de hamster, además de células
murinas (Tabla 1). Los títulos de los vectores retrovíricos
pseudotipificados con la proteína de la envoltura de HFV
\Delta2MuLV, fueron entre 8 y 35 veces más altos que los
(vectores) pseudotipificados con la proteína de la envoltura de HFV
de tipo salvaje, dependiendo de las células diana que se
utilizaron.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Para confirmar que la infectividad de las
partículas de MuLV pseudotipificadas con distintas proteínas de la
envoltura de HFV era específica para la envoltura de HFV, las
partículas pseudotipificadas se preincubaron con suero específico
de chimpancé anti-HFV antes de la adición a las
células diana (3). La infectividad de las partículas víricas
pseudotipificadas con la envoltura anfotrófica de MuLV o la
proteína VSV-G, no se redujo por la preincubación
con el antisuero específico para HFV cuando se comparó con la
preincubación de estos virus con suero normal humano termoinactivado
(Fig 3) o con partículas víricas simuladas incubadas (datos no
mostrados). En contraste, la infectividad de partículas
pseudotipificadas con la proteína de la envoltura de HFV de tipo
salvaje o con la quimera de HFV \Delta2MuLV se abolió
completamente mediante la preincubación con el antisuero específico
de HFV, pero no con el suero de control humano (Fig 3). Esta
neutralización de la infectividad específica de la envoltura de HFV
se observó para las células NIH3T3 (Fig 3A) y QT-6
(Fig 3B). Una neutralización específica similar de las partículas
víricas pseudotipificadas con las proteínas de la envoltura de HFV
se obtuvo en experimentos que utilizaban un suero de conejo
producido contra el dominio SU expresado del baculovirus de la
proteína de la envoltura de HFV (datos que no se muestran).
La expresión e incorporación de las distintas
proteínas de la envoltura de HFV en las partículas MuLV se
determinó mediante análisis de radioinmunoprecipitación (RIPA) de
células 293 T transfectadas transitoriamente. Cuarenta y ocho horas
después de la adición del ADN (pHIT60, SFG GFPS65T y varios
constructos env), las células se marcaron metabólicamente con
[^{35}]metionina durante aproximadamente 20 horas. Las
partículas víricas que se encontraban en el sobrenadante se
sedimentaron mediante centrifugación a 25.000 rpm mediante una
banda de sacarosa al 20% antes de la solubilización en tampón de
lisis. A continuación, las muestras se sometieron a
inmunoprecipitación. Los inmunoprecipitados de las partículas
víricas con un suero de chimpancé específico de HFV, o los
sobrenadantes de los hibridomas antiMuLV gag se analizaron mediante
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE),
junto con sus correspondientes lisados celulares. Las bandas
específicas de HFV en los inmunoprecipitados del sedimento vírico o
de los lisados celulares, se observaron sólo en las muestras
transfectadas con los constructos de expresión de env de HFV, pero
no en las muestras que expresaban la proteína de la envoltura
anfotrópica de MuLV o los cultivos transfectados simulados. Dos
bandas precursoras predominantes de la envoltura de HFV de 130 y 110
KD, se observaron en inmunoprecipitados de lisados celulares de
células transfectadas HFV env (12,21). Además, dos bandas que
corresponden a las proteínas procesadas, de aproximadamente 90 KD
SU y \sim40-50 KD TM, pudieron observarse después
de una exposición más larga. Los tamaños aparentes diferentes de
las proteínas TM en las muestras celulares transfectadas con los
varios mutantes HFV reflejaron las modificaciones en la porción TM
de las proteínas individuales. Sólo se observaron diferencias
moderadas en el nivel de equilibrio de las distintas proteínas de
la envoltura en las células transfectadas, excepto para las
proteínas HFV SSSMuLVR- y HFV SSSMuLV que mostraron una expresión
celular claramente reducida. Tanto las proteínas precursoras de la
envoltura como las proteínas procesadas SU y TM se detectaron
también en inmunoprecipitados de las partículas víricas
sedimentadas. Sin embargo, en general, la proporción relativa de
las proteínas procesadas a las precursoras, aumentó en los
inmunoprecipitados de partículas víricas, comparado con los
lisados
celulares.
celulares.
De forma interesante, se pudo observar una buena
correlación entre la cantidad de proteínas SU y TM procesadas en
los inmunoprecipitados individuales de las partículas víricas y la
infectividad relativa de las partículas pseudotipificadas
correspondientes (Fig 2). La envoltura quimérica de HFV \Delta2
MuLV, que dio lugar a partículas pseudotipificadas con la
infectividad relativa más alta, mostró también las bandas SU y TM
más intensas en los RIPA. La cantidad de proteínas gag/pol de MuLV
en las preparaciones de partículas víricas individuales,
determinada en los sedimentos víricos en bruto o en los
inmunoprecipitados con sobrenadantes de hibridomas
anti-gag, fue similar en todas las muestras,
excepto para la transfección de la envoltura de HFV \Delta2MuLV.
Esta muestra mostró una disminución significativa en las proteínas
gag/pol asociadas a partículas, que indica que se encontraban menos
partículas MuLV en esta preparación, comparadas con los otros
sedimentos víricos. Como resultado, la cantidad relativa de las
proteínas procesadas TM y SU HFV por partícula vírica individual,
puede ser incluso más alta que la estimada a partir de los
inmunoprecipitados de las preparaciones de partículas víricas con
anticuerpos específicos HFV. Una posible explicación para este
fenómeno es el aumento de la absorbancia de estas partículas por
células transfectadas que no expresan la proteína env de HFV, como
resultado del aumento de la infectividad de las partículas HFV
\Delta2MuLV pseudotipificadas, comparado con las partículas
pseudotipificadas por las otras proteínas de la envoltura de HFV.
Esto puede conducir a una depuración de las partículas
pseudotipificadas HFV \Delta2 MuLV a partir del sobrenadante.
Además, en contraste con las partículas de MuLV pseudotipificadas
con la envoltura anfotrópica de MuLV o VSV-G, los
virus HFV pseudotipificados no mostraron reducción en la
infectividad en ausencia de policationes tal como el polibreno
(30). Por tanto, los títulos relativos de los vectores retrovíricos
pseudotipificados con la envoltura de HFV, mediante transfección
transitoria, pueden ser subestimados, comparados con los
pseudotipos con una envoltura anfotrópica de MuLV o
VSV-G. Experimentos posteriores, sin embargo,
utilizando progenies celulares que expresaban establemente la
envoltura HFV, que deberán ser resistentes a la infección por virus
pseudotipificados con la envoltura de HFV, son necesarios para
clarificar estos fenómenos con más
detalle.
detalle.
Además, los transcritos Bel-1 y
Bet derivados del promotor interno de HFV (Posición 8419 relativa
al comienzo de la transcripción en las 5'LTR), localizado en el
interior del ORF de la envoltura de HFV (posición
6310-9276), utilizan eficientemente un donador de
corte y empalme (SD, Posición 9119) y un receptor de corte y
empalme (SA, Posición 9237), dentro de la región de codificación de
la subunidad TM de la proteína env. El corte y empalme alternativo
del ARNm que codifica la proteína env de HFV, que utiliza estos
sitios SD y SA, da lugar a proteínas de fusión potenciales
envoltura/bel. Una de aproximadamente 170 KD puede detectarse en
células infectadas por HFV mediante inmunoprecipitación, y el ARNm
es detectable mediante la PCR RT (transcriptasa inversa) del ARNm
total, a partir de fibroblastos humanos infectados. La inactivación
de SD (Posición 9119) mediante una mutación GT->GG da lugar a la
desaparición de la proteína de fusión de la envoltura de 170 KD,
mientras que la expresión de la proteína de 130 KD precursora de la
envoltura no cambia. La función biológica de las proteínas de
fusión env/bel, así como la influencia sobre los títulos víricos de
las partículas pseudotipificadas de MuLV no se conoce
habitualmente.
En resumen, se ha generado un sistema para
producir vectores retrovíricos basados en MuLV, pseudotipificados
con proteínas de la envoltura de HFV. El dominio citoplásmico de la
proteína de la envoltura de HFV estuvo implicado por lo menos
parcialmente en la pseudotipificación de las partículas de MuLV,
pues la deleción progresiva del dominio citoplásmico condujo a una
reducción en la transferencia génica y a la incorporación de las
subunidades TM y SU de HFV env en la partícula vírica. La adición
de un dominio citoplásmico no procesado de la envoltura de MuLV a
un mutante de deleción, la envoltura HFV \Delta2MuLV, dio lugar a
un aumento de 10-20 veces en la infectividad,
comparado con la proteína de la envoltura de HFV de tipo salvaje y
de una potenciación en la incorporación de la proteína quimérica de
la envoltura en las partículas pseudotifipicadas. Los títulos
retrovíricos fueron entre 8 y 35 veces más altos que los alcanzados
por la pseudotipificación con la proteína de la envoltura de HFV de
tipo salvaje. En algunos tipos celulares diana, la eficiencia de la
transferencia génica fue similar o más alta que la de los vectores
retrovíricos pseudotopificados con la proteína
VSV-G. En el caso de la proteína de la envoltura
del MuLV de tipo salvaje, el papel del dominio citoplásmico para la
incorporación específica de la envoltura a la partícula vírica no
está claro. En algunos mutantes con deleción de la cola
citoplásmica hubo una pérdida de proteínas de la envoltura
asociadas con la partícula (15), mientras que otras proteínas
mutantes de la envoltura mostraron escasa o nula reducción en la
asociación de partículas (25, 26). Nuestros resultados sostienen un
papel del dominio citoplásmico de MuLV env en la asociación de
partículas de la proteína de la envoltura, por lo menos en la
incorporación potenciada de las proteínas quiméricas de la
envoltura en las partículas MuLV.
Recientemente, la pseudotipificación de los
vectores retrovíricos basados en MuLV con proteínas de la envoltura
extrañas, tales como la glicoproteína VSV G (6, 38) o la envoltura
GALV (2, 34), ha provocado a un aumento en la estabilidad vírica, a
una gama más amplia de células huésped, y a un aumento en la
eficiencia de transducción de ciertos tipos celulares. La gama
amplia de huéspedes de FVs, la resistencia a la inactivación por el
suero humano (30), y la infección eficiente de las células de
diverso origen en ausencia de policationes (observaciones no
publicadas y (30)), harían a los vectores retrovíricos basados en
MuLV pseudotipificados con la proteína quimérica de la envoltura de
HFV \Delta2MuLV, una nueva y útil herramienta para una eficiente
transferencia génica en distintos tipos celulares. A diferencia de
la expresión de VSV-G, que es muy tóxica para las
células productoras y ha evitado la generación de progenies
celulares estables VSV-G de empaquetamiento hasta
recientemente (8, 22, 37), la expresión transitoria de la envoltura
de HFV \Delta2MuLV no dio lugar a una toxicidad evidente en las
células 293T (datos no mostrados,
(19)).
(19)).
Este ejemplo describe la construcción de
envolturas quiméricas entre las proteínas de la envoltura de HFV y
SIV. Se construyeron tres tipos distintos de envolturas quiméricas.
La secuencia de los diferentes elementos utilizados a continuación
en la presente memoria, están disponibles en Genbank: el genoma SIV
mm251 con el número de registro M19499, el promotor CMV bajo X03922
y pEGFP-C1 (gen GFP) bajo U55763.
En el primer tipo, la cola citoplásmica de SIV se
fusiona al dominio extracelular (que también se denomina en la
literatura ectodominio) del HFV, dentro del dominio del anclaje
transmembranoso (constructos 1,2 y 7 de la Figura 4 y de la Figura
5A). El dominio de anclaje transmembranoso de la env HFV se deduce
de su secuencia aminoácida, y por tanto, es hipotético. El dominio
de anclaje transmembranoso de la proteína env de SIV contiene una
pequeña región de aminoácidos idénticos respecto a env HFV. Es en
esta región donde se ha realizado la fusión. Así, el dominio
extracelular completo del gen quimérico env es de HFV, incluyendo
la subunidad superficial entera (SU) y la mayoría de la subunidad
transmembranosa (TM). La cola citoplásmica es enteramente del
SIV.
En el segundo tipo de envolturas quiméricas, los
genes de fusión están al nivel del sitio de división entre las
subunidades SU y TM (constructos 3, 4 y 8 de la Figura 4 y de la
Figura 5B). Así, la subunidad SU procede de HFV y la subunidad TM
procede de SIV. En la proteína quimérica de la envoltura, se
utilizó el sitio de división de la env SIV
(Arg-Gln-Lys-Arg).
En el tercer tipo de envoltura quimérica, la cola
citoplásmica de SIV se fusiona con la envoltura de HFV en el
dominio citoplásmico (constructos 5, 6 y 9 de la Figura 4 y de la
Figura 5C). Este constructo es similar en diseño a la envoltura
quimérica \Delta2MuLV y conserva los primeros 6 aminoácidos
citoplásmicos de la envoltura de HFV. La cola citoplásmica entera
del SIV se fusiona con esta proteína de la envoltura.
Existen dos versiones del gen de la envoltura del
SIV (véase la Figura 5D y la referencia 42): una forma larga que
tiene una cola de 164 aminoácidos que se encuentra en las
partículas SIV que se replican en el huésped natural, el mono
rhesus (Macaca mulatta), y una forma corta denominada
"humanizada" que contiene sólo 18 aminoácidos. Esta forma
corta es seleccionada cuando el virus aislado del mono se cultiva
en progenies celulares humanas. Las envolturas quiméricas se han
construido utilizando ambas colas. Los constructos 1, 3 y 5
comprenden la versión larga y los constructos restantes, la versión
corta.
La posible presencia de secuencias represoras
actuantes cis (CRS) en los genes de la envoltura de SIV, pueden
conservar el ARN mensajero de env en el núcleo de las células
productoras. El efecto inhibitorio sobre la expresión de loa genes
env puede obviarse si estos ARNs mensajeros contienen el elemento
sensible rev (RRE) y si, al mismo tiempo, rev se expresa. Este es el
caso del segundo tipo de constructos quiméricos de la envoltura, ya
que el RRE se encuentra en la subunidad TM del SIV y rev se
expresará a partir de un plásmido que contenga el genoma provírico
de SIV. Sin embargo, el RRE no se encuentra en los otros
constructos de la envoltura. Aunque la naturaleza exacta de las
secuencias CRS en el gen SIV env no se conoce, es posible que el
sitio de corte y empalme del extremo 3' del segundo exon tat/rev en
el gen env, constituya un CRS. Se decidió, por tanto, construir una
tercera variante de los constructos quiméricos env en la que este
sitio de corte y empalme del extremo 3' se destruyera (43, 44,
Figura 6). La destrucción del sitio de corte y empalme del extremo
3' se llevó a cabo sólo en envolturas quiméricas con la cola
citoplásmica corta, humanizada, del SIV env.
En total, se han construido 9 envolturas
quiméricas (Fig 4):
Env 1, 2 y 7, en las que la fusión se realiza en
el dominio de anclaje transmembranoso. Env 1 posee una cola
citoplásmica larga de SIV, y Env 2 y 7, una corta. El sitio de
corte y empalme del extremo 3' en el gen env, se encuentra en env
2, pero se ha suprimido en env 7. Las secuencias aminoácidas de Env
2 y 7 son idénticas.
Env 3, 4 y 8, en las que la fusión se realiza en
el sitio de división; Env 3 posee una larga cola citoplásmica, Env
4 y 8 una corta. El sitio de corte y empalme del extremo 3' en el
gen env, se encuentra en env 4, pero se ha borrado en env 8. La
secuencia aminoácida de Env 4 y 8 son idénticas.
Env 5, 6 y 9 en las que la fusión se realiza en
la cola citoplásmica, Env 5 tiene una larga cola citoplásmica, Env
6 y Env 9, una corta. El sitio de corte y empalme del extremo 3' en
el gen env, se encuentra en env 6, pero se ha borrado en env 9. La
secuencia aminoácida de Env 6 y 9 son idénticas.
Todos los genes quiméricos env se han clonado
reemplazando las secuencias HFV env apropiadas en el plásmido
pczHFVenv wt con secuencias del gen SIV env. pczHFVenv wt contiene
el HFV env de tipo salvaje que codifica las secuencias clonadas en
pcADN3.1/Zeo (Invitrogene) bajo el control del promotor CMV. Las
secuencias de SIV env se amplificaron a partir de un plásmido que
contiene la versión larga del gen env (pTG 664) para los
constructos 1, 3 y 5 de la envoltura, y a partir de un plásmido que
contiene la versión corta del gen env (pTG 626Sma^{+}) para los
constructos restantes. Estos dos plásmidos pueden generarse por un
experto en la materia clonando las versiones de SIV env en un p
poly III^{*} I (45). La amplificación se llevó a cabo con un
iniciador contracorriente que posee una extensión del extremo 5' de
50 nucleótidos a partir del gen HFV eng, y un iniciador corriente
abajo que posee una extensión del extremo 3' de 15 nucleótidos que
contiene sitios de reconocimiento para los enzimas de restricción
XhoI y EcoRI. Ambos iniciadores tienen una región de 20 nucleótidos
que es complementaria al gen SIV env que permite la amplificación de
partes específicas de los genes SIV env.
Después de la PCR de partes
C-terminales del gen SIVenv, se aislaron amplímeros
a partir del gel y se digirieron con Xho I para eliminar los
nucleótidos 3'terminales del amplímero. El plásmido pczHFVenv wt se
digirió con XhoI y EcoRI. Los amplímeros se ligaron al plásmido
lineal pczHFVenv utilizando los extremos superfluos XhoI. Esto da
lugar a un fragmento lineal de ADN que contiene el gen HFV env
entero y la cola citoplásmica del SIV. El extremo 5' de la cola
citoplásmica contiene secuencias homólogas al gen HFV env que se
recombina mediante transformación de este plásmido en células E.
coli BJ 5183 (46), según la tecnología que se describe en (41).
Esto da lugar a un plásmido circular cerrado en el que la parte
del extremo 3' del HFV env ha sido reemplazada por el extremo 3'
del SIV env. Utilizando distintas combinaciones de iniciadores,
todas las envolturas quiméricas se han construido de esta manera
(véase Tabla 2). En el plásmido resultante, las secuencias que
codifican la quimera se sitúan bajo el control del inmediato
promotor temprano del CMV.
La producción de las partículas retrovíricas
pseudotipificadas se alcanza mediante la
co-transfección de las células 293 con distintos
plásmidos que expresan las quimeras de las envolturas y un plásmido
que contiene el genoma provírico SIV en el cual el gen env no es
funcional, debido a la inserción de un casette de expresión que
está formado por el inmediato promotor temprano de CMV y por el gen
que codifica la Proteína potenciada verde fluorescente (GFP)
(números 613 al 1330 de la secuencia U55763 del Genbank).
El protocolo es el siguiente: las células 293 se
sembraron en placas de Petri de 10 cm con una densidad de 2 x
10^{6} por placa, en medio DMEM complementado con suero fetal de
ternera al 10%, aminoácidos no esenciales, gentamicina y glutamina
(DMEM completo). Al día siguiente, las células se transfectaron
utilizando la técnica estándar de transfección del Fosfato Cálcico
con 25 \mug del plásmido provírico SIV y 5 \mug del plásmido de
la envoltura (los 9 plásmidos de expresión de la envoltura
quimérica o plásmidos de control: plásmido de expresión vacío;
plásmido de expresión de la proteína VSV-G o
pczHFVenv WT). Al día siguiente, el medio se eliminó y las células
se lavaron una vez en medio DMEM complementado con suero fetal de
ternera al 5%, aminoácidos no esenciales, gentamicina y glutamina,
incubándose entonces en 6 ml del mismo medio. El medio que contenía
los virus se recuperó dos días después y se depuró mediante
centrifugación (5 minutos a 3500 rpm). Las células diana (293 ó HT
1080) que se habían sembrado el día previo con una densidad de 5 x
10^{5} células por pocillo de una placa de 6 pocillos se
transdujeron de la forma siguiente: las células diana se lavaron
con 1 ml de DMEM (sin suero), cubriéndose entonces con 300 \mul
de DMEM. Se añadieron 300 \mul del sobrenadante que contiene
virus suplementados con 10 \mug de sulfato de protamina/ml, y las
células se incubaron durante 2 horas en una atmósfera de CO_{2}
al 5% a 37ºC. Después de añadir 3 ml de DMEM completo, la incubación
continuó durante 3 días.
Las células productoras y diana se analizaron
mediante FACScan de la forma siguiente: las células se
tripsinizaron y lavaron con PBS. Las células se fijaron con 1 ml de
PBS/formaldehído al 4% durante 10 minutos a 4º. Después de una
etapa más de lavado, las células se volvieron a suspender en 1 ml de
PBS y se analizaron con un FACScan Becton-Dickinson
utilizando el software Cell-Quest. La fluorescencia
se midió utilizando el filtro FITC. Todas las células productoras
se transfectaron con alta eficiencia. La transducción de la células
diana de control se realizó según se esperaba: las partículas
VSV-G pseudotipificadas son capaces de transducir
las células 293 y las células HT 1080. Los sobrenadantes de las
células transfectadas sin proteínas de la envoltura o partículas
pseudotipificadas con HFV env, no fueron capaces de transducir
cualquier célula diana. Las partículas víricas producidas por los
constructos 6 y 9 pueden transducir las células 293 y HT 1080,
mostrando que su envoltura quimérica es funcional.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: TRANSGENE S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11 rue de Molsheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Strasbourg
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 67000
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 03 88 27 91 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 03 88 27 91 41
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Expresión de una proteína modificada de la envoltura del virus espumoso
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release # 1,0, Versión # 1,25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLAMIENTO INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG11854
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGAACTGCC TTTAGTCTCT TGGGATACTT AAAGCCTATC CTAATAGGAC TAGGAGTAAT
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTGTTAAGA
\hfill70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLAMIENTO INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG11855
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCCTCGAGG AATTCTCACA AGAGCGTGAG CTCAA
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLAMIENTO INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG11956
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCCTCGAGG AATTCCTACT GGAAATAAGA GGGTG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLAMIENTO INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG11857
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCCTTCCTA TCCCAATGTT ACTAGGGAAC ATTATACTTC CTGTAATAAT AGAAATAAAA
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGGGGTCTT
\hfill70
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLAMIENTO INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG11858
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGGGGTCAT TCTCTTGGTT ATTCTTATAT TTAAAATTGT ATCCTGGATT AAGTTAAGGC
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGGGTATAG
\hfill70
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLAMIENTO INDIVIDUAL: oligonucleótido de síntesis oTG11866
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCCTCGAGG AATTCCTATT GGAAATAAGA GGGTG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (27)
1. Constructo para la expresión de una proteína
que comprende por lo menos una proteína modificada de la envoltura
de virus espumoso (FV), para la producción de partículas víricas
pseudotipificadas, en el que la modificación consiste, por lo
menos, en un truncamiento en el residuo 975 o 981 de dicha
proteína, caracterizado porque dicha proteína es una
proteína de fusión que comprende además la totalidad o parte de una
proteína de la envoltura que no es de FV.
2. Constructo para la expresión de una proteína
según la reivindicación 1, caracterizado porque el virus
espumoso es el virus espumoso humano (HFV).
3. Constructo para la expresión de una proteína
según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la
proteína de la envoltura que no es de FV deriva de un virus
seleccionado de entre el grupo constituido por MuLV, MoMuLV, FB 29,
HIV y SIV.
4. Constructo para la expresión de una proteína
según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha fusión
dentro del dominio de anclaje transmembranoso de dichas proteínas
de FV y de las proteínas de la envoltura de FV y que son de FV.
5. Constructo para la expresión de una proteína
según la reivindicación 4, caracterizado porque la proteína
comprende el dominio extracelular y la parte del extremo 5' del
dominio de anclaje transmembranoso de la proteína de la envoltura
de HFV y la parte del extremo 3' del dominio de anclaje
transmembranoso y el dominio citoplásmico de la proteína de la
envoltura que no es de FV, particularmente de la proteína de la
envoltura de SIV.
6. Constructo para la expresión de una proteína
según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha fusión
se realiza dentro del sitio de división de dichas proteínas de la
envoltura de FV y que no son de FV.
7. Constructo para la expresión de una proteína
según la reivindicación 6, caracterizado porque la proteína
comprende el dominio SU y la totalidad o parte del sitio de
división de la proteína de la envoltura de HFV, y la totalidad o
parte del sitio de división y del dominio TM, que comprende el
dominio de anclaje transmembranoso y el dominio citoplásmico, de la
proteína de la envoltura que no es de FV, particularmente de la
proteína de la envoltura del
SIV.
SIV.
8. Constructo para la expresión de una proteína
según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha fusión
se realiza en la unión entre el dominio de anclaje transmembranoso
y el dominio citoplásmico, o dentro de los dominios citoplásmicos
de dichas proteínas de la envoltura de FV y que no son de FV.
9. Constructo para la expresión de una proteína
según la reivindicación 8, caracterizado porque la proteína
comprende el dominio extracelular, el dominio anclaje
transmembranoso y la totalidad o parte del dominio citoplásmico de
la proteína de la envoltura de HFV, y la totalidad o parte del
dominio citoplásmico de la proteína de la envoltura que no es de
FV, particularmente la proteína de la envoltura de SIV.
10. Constructo para la expresión de una proteína
según cualquiera de las proteínas 1 a 9, caracterizado
porque la proteína de la envoltura de HFV, cuya totalidad o parte
del dominio citoplásmico está reemplazado por la totalidad o parte
de una proteína de la envoltura viral que no es de FV, y
preferentemente de la proteína de la envoltura retrovírica de
MuLV.
11. Constructo para la expresión de una proteína
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,
caracterizado porque la proteína está formada por la fusión
de la totalidad o parte de un dominio citoplásmico de MuLV con una
proteína modificada de la envoltura de HFV.
12. Constructo para la expresión de una proteína
según las reivindicaciones 10 y 11, caracterizado porque el
dominio citoplásmico de MuLV se procesa o no.
13. Constructo para la expresión de una proteína
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,
caracterizado porque la proteína comprende una proteína
modificada de la envoltura de HFV truncada de residuo 981, que se
fusiona con un residuo de arginina y el dominio citoplásmico no
procesado de MuLV que comprende desde el residuo 634 al residuo 665
de la proteína de la envoltura de MuLV de tipo salvaje.
14. Constructo para la expresión de una proteína
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13,
caracterizado porque el constructo comprende una mutación
del sitio o sitios de corte y empalme del donante y/o del receptor,
que se encuentran de modo natural en la secuencia de codificación
de la proteína de la envoltura de FV.
15. Proteína tal como se expresa mediante un
constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Partícula vírica pseudotipificada que
comprende una proteína según la reivindicación 15.
17. Progenie celular de complementación que
comprende un constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 14.
18. Progenie celular de complementación según la
reivindicación 17, que comprende un constructo según la
reivindicación 9 ó 13.
19. Progenie celular de complementación según la
reivindicación 17 ó 18, que comprende además un constructo que
expresa un gen vírico gag/pol.
20. Progenie celular de complementación según la
reivindicación 19, caracterizada porque el gen retrovírico
gag/pol deriva de MuLV ó FB 29 ó SIV.
21. Progenie celular de complementación según
cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizada
porque la progenie celular deriva de la progenie 293.
22. Procedimiento para la preparación de una
partícula vírica pseudotipificada según la reivindicación 16, que
comprende:
(i) introducir un vector retrovírico recombinante
en una célula de complementación, según cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 21,
(ii) cultivar dicha progenie celular de
complementación bajo condiciones apropiadas para permitir la
producción de dicha partícula vírica pseudotipificada y
(iii) recuperar dicha partícula vírica
pseudotipificada a partir del cultivo celular.
23. Célula de mamífero infectada con una
partícula vírica pseudotipificada según la reivindicación 16, o con
una partícula vírica pseudotipificada que puede obtenerse mediante
un procedimiento según la reivindicación 22.
24. Composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de una partícula
vírica pseudotipificada según la reivindicación 16, o que puede
obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 22, o
una célula de mamífero según la reivindicación 23.
25. Utilización de una partícula vírica
pseudotipificada según la reivindicación 16 o que puede obtenerse
mediante un procedimiento según la reivindicación 22, o una célula
de mamífero según la reivindicación 23 para preparar un medicamento
previsto para el tratamiento de un trastorno genético, un cáncer o
una enfermedad inducida víricamente.
26. Utilización de un constructo tal como se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para expresar
una proteína con objeto de producir partículas víricas
pseudotipificadas, comprendiendo dicha proteína por lo menos una
proteína modificada de la envoltura del virus espumoso (FV) y
consistiendo dicha modificación, por lo menos en una envoltura en
el residuo 975 ó 981 de dicha proteína.
27. Utilización de un constructo según la
reivindicación 26, caracterizado porque el virus espumoso es
el virus espumoso humano (HFV).
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