ES2298745T3 - Promotores bidireccionales de sintesis y utilizacion de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Promotor bidireccional para la expresión de al menos dos secuencias codificantes en dirección opuesta en células animales que comprende desde el extremo 5¿ hasta el extremo 3¿: a) una primera secuencia promotora mínima procedente de genomas de citomegalovirus (CMV) o de virus de tumor mamario de ratón (MMTV); b) una secuencia de promotor procedente de un gen animal que comprende una región potenciadora y una segunda secuencia de promotor mínimo; conduciendo las dos secuencias promotoras a una transcripción coordinada de las citadas secuencias codificantes en orientación opuesta.
Description
Promotores bidireccionales de síntesis y
utilización de los mismos.
La presente invención se refiere a promotores
bidireccionales que permiten una expresión eficaz y coordinada de
dos o más genes, a vectores de transferencia génica que contienen a
estos promotores, a partículas que transducen los citados vectores
dentro de una célula, a la utilización de los citados vectores para
la administración y la expresión de genes múltiples en células
diana y también para la terapia génica y la fabricación de
medicamentos.
Para varias aplicaciones de transferencia y de
terapia génica se requiere la expresión de transgenes múltiples
dentro de las mismas células diana^{1}. La mejor forma de llevar a
cabo los estudios de función génica es mediante la expresión de
cADNs junto con un gen marcador; mediante este sistema, se pueden
identificar y controlar in vitro e in vivo células
modificadas genéticamente. De forma similar, las aplicaciones de la
terapia génica se pueden mejorar mediante la purificación de
células genéticamente corregidas antes de la administración in
vivo, aprovechando la expresión coordinada de los marcadores
selectivos. Las células modificadas genéticamente se pueden
amplificar ex vivo o in vivo mediante la introducción
de genes promotores del crecimiento o resistentes a fármacos junto
con el gen terapéutico, tal como se mostró recientemente por medio
de la selección mediante MGMT de Células Madre Hematopoyéticas
transducidas (HSC)^{2}; utilizando este sistema, se
puede aumentar la eficacia de la terapia génica y su aplicación se
puede extender potencialmente a un amplio espectro de
enfermedades^{3,4}.
Por el contrario, las células modificadas
genéticamente que expresan condicionalmente genes citotóxicos, junto
con el gen terapéutico, se pueden eliminar in vivo si tienen
lugar eventos adversos; este sistema se utiliza para controlar la
enfermedad del injerto contra el huésped después de la infusión de
linfocitos T de un donante para tratar una recaída de la
leucemia^{5}; este sistema también puede proporcionar una
importante provisión de seguridad en la transferencia génica de
HSC, dada la aparición reciente de leucemia relacionada con la
integración del vector en un ensayo clínico con éxito de
Inmunodeficiencia Combinada Grave ligada al cromosoma X^{6}. La
expresión coordinada de más de un transgen es esencial cuando la
actividad que se va a reconstituir mediante transferencia génica
depende de múltiples subunidades codificadas por genes diferentes, o
requiere la sinergia de moléculas separadas. Por ejemplo, la
reconstitución de la ruta biosintética de la dopamina en las
neuronas estriadas de pacientes con la enfermedad de Parkinson
requiere la coexpresión de la tirosina hidroxilasa con
GTP-ciclohidrolasa I y/o con DOPA
decarboxilasa^{7}; la terapia génica del cáncer puede requerir la
coexpresión de múltiples antígenos y/o citoquinas en células que
presentan antígenos para inmunoterapia y la de dos cadenas de
receptor de células T en células T diseñadas para la
transferencia
adoptiva^{8}.
adoptiva^{8}.
A pesar de dichas necesidades bien reconocidas,
la obtención de un alto nivel de expresión, coordinado, de
transgenes múltiples en la mayoría de las células diana ha sido un
reto importante para la tecnología de transferencia génica.
Mediante dos vectores diferentes se han expresado dos transgenes
diferentes; sin embargo, solo una fracción de las células diana se
transdujo por parte de ambos vectores y se obtuvo una población
heterogénea de células que expresaban o uno o los dos genes en
proporciones diferentes, impidiendo la realización de estudios
fiables y/o de aplicaciones eficaces. De forma alternativa, se han
expresado dos o más transgenes mediante promotores diferentes
dentro del mismo vector^{9}; no obstante, la distinta
especificidad tisular y la interferencia mutua entre los promotores
impedía con frecuencia la coexpresión eficaz en las mismas células
diana^{10}. El corte y empalme diferencial genera transcripciones
múltiples del mismo promotor, aunque se ha probado que es difícil
adaptarlo a la administración viral de transgenes múltiples^{11}.
Se han generado poliproteínas quiméricas que se autoprocesan de
forma cotranslacional en componentes separados utilizando el péptido
de autocortado del Virus 2A de la Fiebre Aftosa^{12, 13}; no
obstante, hasta ahora la aplicación de esta tecnología a la
transferencia de genes múltiples ha estado limitada porque requiere
una ingeniería sofisticada, restringe ambas proteínas al mismo
compartimento celular e introduce cambios en la secuencia que pueden
afectar a la actividad, a la estabilidad y a la inmunogenicidad de
la proteína.
Hasta ahora el sistema más satisfactorio para la
transferencia de genes múltiples se ha apoyado en la utilización de
los sitios internos de entrada al ribosoma (IRESs)^{14}.
Estas secuencias, identificadas en transcripciones virales y
celulares, controlan la traducción de una forma independiente de la
^{ARNm}Cap y, cuando se insertan entre dos genes en un ARN
mensajero bicistrónico, permiten la traducción del gen aguas abajo.
Los autores pusieron a prueba el funcionamiento de diferentes IRESs
en el contexto de vectores lentivirales (LVs) autoinactivantes
(SIN) y descubrieron importantes limitaciones en este sistema.
El documento WO 02/064804 describe complejos de
promotores duales bidireccionales que son eficaces para mejorar la
actividad transcripcional de transgenes en plantas.
Los promotores bidireccionales de la invención
incluyen una región potenciadora modificada con al menos dos
promotores mínimos en cualquiera de los lados de la región
potenciadora modificada situados en una orientación divergente. La
solicitud se refiere a la expresión génica en plantas. Además, el
sistema requiere la duplicación de secuencias del potenciador
orientadas en tándem en una región interna modificada de la
construcción, para unirse mediante dos promotores mínimos idénticos
u homólogos en cualquiera de los dos lados. La presente invención
no requiere la duplicación del potenciador ni ninguna otra secuencia
en el promotor eficaz de la construcción bidireccional, ni se
necesita que los promotores mínimos situados sobre cualquiera de los
dos lados de la misma compartan al menos el 30% de la identidad.
Por último, la duplicación en tándem puede ser incompatible con la
administración retro/lentiviral.
El documento US 6.388.170 da a conocer vectores
de plantas, que tienen promotores bidireccionales, que comprenden
un promotor mínimo y un promotor común, en los que los citados
promotores mínimos están unidos de forma operable al citado
promotor común, en orientación opuesta al citado promotor común y en
el extremo 5' al citado promotor común. Las secuencias promotoras
procedentes de plantas y de virus que infectan plantas se demuestra
que son dnd probadas en células de plantas o en partes de
plantas.
Dada la considerable distancia evolutiva que
existe entre animales y plantas, el documento US 6.388.170 no
enseña como diseñar promotores animales para actividad
bidireccional, ni los promotores bidireccionales pueden trabajar de
forma eficaz en células animales. Además, el documento US 6.388.170
no enseña como diseñar promotores bidireccionales para la expresión
génica en animales ni en células de animales utilizando los
procedimientos de transferencia génica disponibles.
El documento WO 01/34825 da a conocer líneas
celulares, plásmidos y vectores útiles para la producción de virus
recombinantes tales como adenovirus, que son útiles en la terapia
génica. Las líneas celulares, los plásmidos y los vectores
comprenden promotores inducibles, tales como promotores
bidireccionales para la expresión coordinada de genes clonados
bidireccionalmente. No obstante, solo se dan a conocer
construcciones bidireccionales reguladas mediante Tet.
Así, los autores exploraron nuevas estrategias
para aprovechar al máximo los sistemas de transferencia génica,
tales como LV, que permiten una transducción ex vivo eficaz y
una administración in vivo directa.
Los autores han desarrollado un nuevo diseño de
vector en el que mediaron promotores bidireccionales de síntesis en
la transcripción coordinada de dos ARNs divergentes. Los autores
demuestran que los LVs que llevan promotores bidireccionales
expresaron de forma coordinada dos transgenes en la inmensa mayoría
de las células transducidas, superando claramente a los vectores
bicistrónicos. Se determinó el funcionamiento eficaz de los nuevos
LVs bidireccionales en células hematopoyéticas primarias, ensayadas
ex vivo y después de transplante y en varios tejidos in
vivo, después de la administración directa del vector o de
transgénesis. La invención supera un antiguo obstáculo en la
búsqueda de herramientas mejoradas para la expresión génica y se
espera avanzar en el logro y en la seguridad de la terapia
génica.
Por consiguiente, un objetivo de la presente
invención es un promotor bidireccional para la expresión de al
menos dos secuencias codificantes en dirección opuesta en células
animales que comprende desde el extremo 5' hasta el extremo 3':
a) una primera secuencia promotora mínima
procedente de genomas de citomegalovirus (CMV) o de virus de tumor
mamario de ratón (MMTV);
b) una secuencia promotora completamente eficaz
procedente de un gen animal;
conduciendo las dos secuencias promotoras a una
transcripción coordinada de las citadas secuencias codificantes en
orientación opuesta.
En el ámbito de la presente invención una
secuencia promotora completamente eficaz significa una secuencia
que conduce a una transcripción eficaz de la transcripción primaria.
Preferentemente, ésta comprende una región potenciadora y una
secuencia promotora mínima, diferenciada o solapada. Más
preferentemente la secuencia promotora completamente eficaz procede
de la fosfoglicerato quinasa o del promotor de la ubiquitina.
Es un objetivo de la invención un casete de
expresión bidireccional que comprende esencialmente al promotor
bidireccional tal como se describió anteriormente, sitios de
inserción adecuados ubicados aguas abajo de cada promotor y sitios
de poliadenilación ubicados aguas abajo de cada sitio de
inserción.
Preferentemente el casete de expresión
bidireccional comprende además al menos un elemento regulador
post-transcripcional situado aguas arriba de uno o
de cada sitio de poliadenilación. Más preferentemente el casete de
expresión bidireccional comprende además al menos una secuencia de
un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para expresar tres o
más genes.
Es un objetivo de la invención una construcción
de expresión que contiene el promotor bidireccional, tal como se
describió anteriormente.
Es un objetivo de la invención una construcción
de expresión que contiene el casete de expresión bidireccional, tal
como se describió anteriormente.
\newpage
Es un objetivo de la invención un vector de
expresión de transferencia génica que contiene la construcción de
expresión tal como se describió anteriormente y que comprende además
secuencias lentivirales o retrovirales.
Es un objetivo de la invención la utilización
del vector de expresión de transferencia génica para la preparación
de un sistema de administración y de expresión en células animales,
preferentemente en células de tejido animal in vivo, más
preferentemente neuronas cerebrales.
Es un objetivo de la invención un procedimiento
in vitro para la expresión coordinada de dos secuencias
codificantes exógenas dentro de una célula animal que comprende las
siguientes etapas:
a) clonación de las citadas secuencias
codificantes dentro del vector de expresión de transferencia génica,
según la reivindicación 8, estando cada secuencia codificante bajo
el control de uno de los dos promotores del promotor
bidireccional;
b) transformación de células animales por medio
de los citados vectores;
c) permitir la expresión del vector.
Preferentemente la célula animal es una célula
humana, más preferentemente la célula humana es una célula humana
retransplantable, incluso más preferentemente la célula humana
retransplantable es una célula hematopoyética.
De forma alternativa, la transformación de
células de tejidos in vivo se puede llevar a cabo mediante la
administración directa del vector, tal como en neuronas
cerebrales.
Es un objetivo de la invención un procedimiento
para la generación de un organismo transgénico no humano que
comprende la etapa de la transformación de células adecuadas por
medio del vector de expresión de transferencia génica tal como se
describió anteriormente.
Los vectores de la invención se pueden utilizar
de forma ventajosa para estudios de función génica y de validación
de dianas in vitro e in vivo; terapia génica;
expresión de genes múltiples en células animales; generación de
animales transgénicos y eventualmente para la destrucción de genes
múltiples; y también para la fabricación de medicamentos.
A continuación se describirá la invención
haciendo referencia a las siguientes figuras:
Figura 1. Funcionamiento de la transferencia
génica de vectores lentivirales bicistrónicos. (a) Esquema de la
forma del vector proviral. Un casete bicistrónico de expresión que
contiene un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) procedente
del virus de la encefalomiocarditis (EMCV), con el sitio de inicio
de la traducción de tipo natural (wt) o de tipo mutado (mut), o
procedente del factor represor de NF-kB (NRF) sin
traducir del extremo 5' de ARNm se activó por medio del
citomegalovirus (CMV) humano de expresión precoz o mediante el
promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK). Regiones LTR
\DeltaU3, R y U5, con deleción en U3; SD y SA, sitio de
acoplamiento de donante y de aceptor; \Psi, señal de encapsidación
que incluye la porción 5' del gen gag (GA); RRE, elemento
Rev-respuesta; cPPT, fragmento central de
polipurina; WPRE, elemento regulador
post-transcripcional del virus de la hepatitis de la
marmota. (b) Análisis de mediante la técnica de hibridación tipo
Southern de células HeLa transducidas mediante los vectores
monocistrónicos (CMV) o bicistrónicos indicados que expresaban
luciferasa (gen 1) y GFP (gen 2) a partir del promotor de CMV,
examinado para la secuencia del WPRE. Todos los vectores
incorporaron la longitud esperada de ADN. La cantidad de copias del
vector se determinó en relación con una curva estándar de plásmido
y se utilizó para normalizar las poblaciones de vectores y para
asegurar niveles de integración similares para cada vector en un
tipo dado de célula diana en los experimentos mostrados en
c-f. (c-f) Expresión de luciferasa y
GFP en células HeLa humanas (c), células endoteliales de la vena
umbilical (HUVEC, d), linfocitos de la sangre periférica (PBL, e) y
progenitores CD34+ procedentes de la sangre del cordón umbilical
(f) transducidos 5-7 días antes con un vector
monocistrónico (\Box, CMV) o con el vector bicistrónico
CMV-luciferasa-GFP que se indica.
Columna de la izquierda, histogramas que representan la actividad
neta de la luciferasa en extractos de células, media \pm SD. Panel
derecho, gráficos de puntos que representan la expresión de GFP
mediante análisis FACS, se indica la frecuencia y la intensidad
media de la fluorescencia (MFI, X) de las células GFP+. El vector
monocistrónico de control expresó luciferasa en el histograma
(\Box) y GFP en el gráfico de puntos que está situado más a la
izquierda (CMV) para cada tipo de célula. (g, h) Análisis FACS de
la expresión de \DeltaNGFR y GFP en células 293T (g) y en
progenitores CD34+ (h) transducidos mediante un vector EMCV wt IRES
que expresa \DeltaNGFR y GFP a partir del promotor PGK. Los
histogramas situados en el panel (h) muestran la distribución de la
expresión de \DeltaNGFR en todas las células viables analizadas
(izquierda) y la distribución de la expresión de GFP en la células
controladas (M1) \DeltaNGFR+ (derecha). Los experimentos
mostrados son representativos de al menos tres experimentos
llevados a cabo con resultados similares.
Figura 2. Funcionamiento de la transferencia
génica de vectores lentivirales bidireccionales. (a) Esquema de la
forma del vector proviral. Un promotor bidireccional fabricado
mediante elementos de promotor mínimo a partir de citomegalovirus
(mCMV) humano unido aguas arriba y en orientación opuesta a un
promotor eficaz, procedente de la fosfoglicerato quinasa (PGK)
humana o del gen UBI-C de la poliubiquitina, se
condujo a la transcripción divergente de dos ARNs. CTE, elemento de
transporte constitutivo a partir del virus del mono
Mason-Pfizer; pA, sitio A de poliadenilación del
Virus Simio 40. Otras características del vector son tal como en la
leyenda de la figura 1. (b) Actividad neta de la luciferasa y
(c-e) expresión de GFP en células HeLa transducidas
5-7 días antes con LVs que llevaban los casetes de
expresión bidireccional o de control que se indican. La frecuencia
y la MFI (X) de las células GFP+ en el análisis FACS se indican a la
derecha de los gráficos de puntos. La actividad de la luciferasa se
determinó para los dos vectores marcados (\Box, \ding{110}).
(f-j) Expresión de \DeltaNGFR y GFP en células
HeLa transducidas 5-7 días antes con 10 diluciones
en serie de LVs que llevaban el casete de expresión que se indica.
Las frecuencias de las células \DeltaNGFR+ (región superior
izquierda) y de las células doble positivo \DeltaNGFR/GFP (región
superior derecha), con la MFI respectiva de \DeltaNGFR (Y) y de
GFP (X), se indican en los gráficos de puntos FACS. Los experimentos
mostrados son representativos de al menos tres experimentos
llevados a cabo con resultados similares.
Figura 3. Comparación del funcionamiento de
vectores bidireccionales y lentivirales bicistrónicos. Expresión de
\DeltaNGFR y GFP en células 293T transducidas 3 semanas antes con
10 diluciones en serie de LVs que llevaban el casete de expresión
que se indica. El porcentaje de células que expresan \DeltaLNGFR y
el de células doble positivo \DeltaLNGFR/GFP (entre paréntesis)
se indica encima de los gráficos de puntos FACS. En cada gráfico se
indica la cantidad media de Copias del vector por Célula (CpC), con
la frecuencia esperada de células transducidas expresada de acuerdo
con la distribución de Poisson de sucesos independientes aleatorios.
Aunque virtualmente todos los vectores integrados expresaron
\DeltaNGFR, su nivel de expresión y la fracción de células
transducidas que co-expresaban GFP fue mucho mayor
para los dos vectores bidireccionales probados (MA1 y MA4) en
comparación con el vector bicistrónico EMCV wt IRES.
Figura 4. Transferencia génica dual en células
hematopoyéticas mediante vectores bidireccionales.
(a-c) Se transdujeron progenitores CD34+
procedentes de sangre de cordón umbilical humano mediante el vector
GFP-\DeltaNGFR MA1 en presencia de citoquinas de
acción temprana tal como se describe^{23} y se analizaron después
de 7 días de cultivo en el mismo medio (a) y después de 10 días
adicionales en un medio promotor de la diferenciación mieloide (b),
o después de la siembra en medio clonogénico basado en
metilcelulosa. Para (a) y (b) se muestra un gráfico de puntos que
muestra expresión de \DeltaNGFR y GFP mediante el análisis FACS,
junto con histogramas que muestran la distribución de la expresión
de \DeltaNGFR en todas las células viables analizadas (parte
superior) y la distribución de la expresión de GFP en las células
controladas (M1) \DeltaNGFR+ (parte inferior). Se indica el
porcentaje de progenitores inmaduros que en el momento del análisis
expresan CD34 y el porcentaje de células diferenciadas que expresan
el marcador mieloide CD 13. Para (c), se muestran micrografías
representativas ópticas (izquierda) y fluorescentes (derecha) del
tipo de CFC que se indica. (d, e) Se transdujeron linfocitos de
sangre periférica humana después de una activación de 2 días con
anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28
(d), o después de 4 días de tratamiento con
interleucina-7, tal como se describe^{24}, (e), y
se analizaron para determinar la expresión de \DeltaNGFR y GFP
tal como se describió anteriormente. (f, g) Se transdujeron
progenitores de médula ósea purificada (lin-) de roedor sin
estimulación con citoquina tal como se describe^{48} y se analizó
la expresión de \DeltaNGFR y GFP después de 7 días en un cultivo
líquido (f), o se transplantaron de inmediato en recipientes
singénicos irradiados letalmente. El análisis FACS de la sangre
periférica de un ratón representativo 2 meses después del
transplante se muestra en g. Los experimentos mostrados son
representativos de tres experimentos llevados a cabo con resultados
similares. Para un análisis del funcionamiento más riguroso, en
d-f se muestran las células transducidas para
cantidades bajas de copias del vector.
Figura 5. Transferencia génica dual in
vivo mediante vectores bidireccionales. Se inyectaron
estereotácticamente GFP-\DeltaNGFR MA1 LV con un
resultado de titulación elevado en el cuerpo estriado de ratones
adultos. Dos meses después de la inyección se obtuvieron secciones
criostáticas cerebrales y se analizaron mediante microscopía de
inmunofluorescencia y microscopía confocal. Se muestran fotografías
representativas del área inyectada, después de la inmunotinción
para \DeltaNGFR (rojo), GFP (verde) y de la tinción con
TO-PRO3 para el ADN nuclear (azul). Las señales
fluorescentes se adquirieron de forma secuencial a partir de
secciones ópticas individuales y se muestran individualmente y
después de la combinación (combinación). Aumento original 200X
(barra de escala = 120 \mum).
Figura 6. Transgénesis dual mediante vector
bidireccional. Se generaron líneas de ratones transgénicos mediante
inyección directa de GFP-\DeltaNGFR MA1 LV en el
interior del espacio perivitelino de embriones de una célula, tal
como se describe^{19} y en los tejidos que se indican se analizó
la expresión de \DeltaNGFR (rojo) y GFP (verde) mediante
microscopía de inmunofluorescencia y microscopía confocal en
secciones criostáticas. Los núcleos se tiñeron con
TO-PRO3 (azul). Las señales fluorescentes se
adquirieron de forma secuencial a partir de secciones ópticas
individuales y se muestran individualmente y después de la
combinación (combinación). Las fotografías mostradas se obtuvieron
para un ratón F1 que llevaba genomas de dos vectores integrados
dentro de la línea germinal. Se obtuvieron fotografías similares a
partir de otros ratones transgénicos analizados que llevaban una
cantidad similar o mayor de copias de vectores. Aumento original
200X (bazo, pulmón), 400X (corazón, riñón, cerebro, hígado), 630X
(intestino) (barra de escala = 120 \mum).
Figura 7a. Mapa del plásmido que contiene la
construcción del vector lentiviral
RRL-MA1-lucif/GFP.
Figura 7b. Secuencia del plásmido que contiene
la construcción del vector lentiviral
RRL-MA1-lucif/GFP.
Figura 8a. Mapa del plásmido que contiene la
construcción del vector lentiviral
CCL-MA1-GFP/deltaLNGFR.
Figura 8b. Secuencia del plásmido que contiene
la construcción del vector lentiviral
CCL-MA1-GFP/deltaLNGFR.
Figura 9a. Mapa del plásmido que contiene la
construcción del vector lentiviral
RRL-MA2-lucif/GFP.
Figura 9b. Secuencia del plásmido que contiene
la construcción del vector lentiviral
RRL-MA2-lucif/GFP.
Figura 10a. Mapa del plásmido que contiene la
construcción del vector lentiviral
CCL-MA3-GFP/deltaLNGFR.
Figura 10b. Secuencia del plásmido que contiene
la construcción del vector lentiviral
CCL-MA3-GFP/
deltaLNGFR.
deltaLNGFR.
Figura 11a. Mapa del plásmido que contiene la
construcción del vector lentiviral
CCL-MA4-GFP/deltaLNGFR.
Figura 11b. Secuencia del plásmido que contiene
la construcción del vector lentiviral
CCL-MA4-GFP/
deltaLNGFR.
deltaLNGFR.
Todos los vectores de transferencia se
construyeron a partir del plásmido pCCL.sin.cPPT.PGK.GFP.WPRE
utilizando los siguientes elementos de secuencia descritos
anteriormente: EMCV IRESs con la secuencia codificante de genes
situada aguas abajo iniciándose en el 11º ATG de IRES (wt) o con el
11º ATG de IRES mutado para crear un sitio de clonación HindIII y
permitir el inicio de la traducción en el transgen situado aguas
abajo ATG(EMCVmut), NRF IRES, MPMV CTE^{21}, un promotor
mínimo del CMV^{20}, un fragmento 1226 bp del promotor de la
Ubiquitina-C.
Para generar la construcción lentiviral
RRL-MA1, se clonó un fragmento de
XhoI-XhoI que contenía los elementos
SV40polyA.CTE.Luciferasa.minhCMV (procedentes de la construcción
lentiviral pRRL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.
Luciferasa.minhCMV.TetO7.minMMTV.eGFP) en la construcción del vector lentiviral pRRL.sin.cPPT.hPGK.eGFP.
Wpre (Follenzi y otros, 2000) cortada con la misma enzima para obtener RRL-MA1-lucif/GFP (pRRL.sin.cPPT.
SV40polyA.CTE.Luciferasa.minhCMV.hPGK.eGFP.Wpre).
Luciferasa.minhCMV.TetO7.minMMTV.eGFP) en la construcción del vector lentiviral pRRL.sin.cPPT.hPGK.eGFP.
Wpre (Follenzi y otros, 2000) cortada con la misma enzima para obtener RRL-MA1-lucif/GFP (pRRL.sin.cPPT.
SV40polyA.CTE.Luciferasa.minhCMV.hPGK.eGFP.Wpre).
Para generar la construcción lentiviral
CCL-MA1, se clonaron dos fragmentos en la
construcción lentiviral
pRRL.sin.cPPT.hPGK.\DeltaLNGFRWpre cortada primero con KpnI, truncada y a continuación cortada con XhoI, el primer fragmento que contenía los elementos minhCMV.eGFP se obtuvo a partir de la construcción lentiviral pRRL.sin.
cPPT.SV40polyA.CTE.Luciferasa.minMMTV.TetO7.minhCMV.eGFP cortada con KpnI, truncada y a continuación cortada con XhoI y el segundo derivado se obtuvo a partir de la construcción pRRL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.tTA2.
Wpre cortada con BamHI, truncada y a continuación cortada con NotI. La construcción lentiviral resultante pRRL.sin.
cPPT.SV40polyA.CTE.Luciferasa.minMMTV.TetO7.minhCMV.eGFP se cortó con NotI y con AvrII y el fragmento que contenía la construcción cPPT.SV40polyA.CTE.eGFP.minhCMV.hPGK.\DeltaLNGFRWpre se clonó en la construcción lentiviral pCCL.sin.cPPT.hPGK.eGFP.Wpre cortada con las mismas enzimas para obtener CCL-MA1-GFP/
\DeltaLNGFR (pCCL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.eGFP.minhCMV.hPGK.\DeltaLNGFRWpre).
pRRL.sin.cPPT.hPGK.\DeltaLNGFRWpre cortada primero con KpnI, truncada y a continuación cortada con XhoI, el primer fragmento que contenía los elementos minhCMV.eGFP se obtuvo a partir de la construcción lentiviral pRRL.sin.
cPPT.SV40polyA.CTE.Luciferasa.minMMTV.TetO7.minhCMV.eGFP cortada con KpnI, truncada y a continuación cortada con XhoI y el segundo derivado se obtuvo a partir de la construcción pRRL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.tTA2.
Wpre cortada con BamHI, truncada y a continuación cortada con NotI. La construcción lentiviral resultante pRRL.sin.
cPPT.SV40polyA.CTE.Luciferasa.minMMTV.TetO7.minhCMV.eGFP se cortó con NotI y con AvrII y el fragmento que contenía la construcción cPPT.SV40polyA.CTE.eGFP.minhCMV.hPGK.\DeltaLNGFRWpre se clonó en la construcción lentiviral pCCL.sin.cPPT.hPGK.eGFP.Wpre cortada con las mismas enzimas para obtener CCL-MA1-GFP/
\DeltaLNGFR (pCCL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.eGFP.minhCMV.hPGK.\DeltaLNGFRWpre).
Para generar la construcción lentiviral
RRL-MA2, se clonó un fragmento de
HindIII-BamHI que contenía los elementos
hFGK.Luciferasa (procedentes de la construcción del vector
lentiviral pRRL.sin.cPPT.hPGK.Luciferasa.IRES.
Wpre) en la construcción retroviral SF2-cLCM2G (obtenida de Rainer Loew, Universidad de Heidelberg, FRG) cortada con las mismas enzimas para obtener la construcción cPPT.SV40polyA.CTE.Luciferasa.hPGK.minMIVITV.eGFP. Esta construcción se cortó primero con SalI, se truncó y a continuación se cortó con BamHI y el fragmento que contenía los elementos Luciferasa.hPGK.minMMTV.eGFP se clonó en la construcción del vector lentiviral pRRL.sin.cPPT.
SV40polyA.CTE.tTA2.Wpre cortada de la misma forma, para obtener RRL-MA2-lucif/GFP (pRRL.sin.cPPT.
SV40polyA.CTE.Luciferasa.hPGK.minMMTV.eGFP.Wpre).
Wpre) en la construcción retroviral SF2-cLCM2G (obtenida de Rainer Loew, Universidad de Heidelberg, FRG) cortada con las mismas enzimas para obtener la construcción cPPT.SV40polyA.CTE.Luciferasa.hPGK.minMIVITV.eGFP. Esta construcción se cortó primero con SalI, se truncó y a continuación se cortó con BamHI y el fragmento que contenía los elementos Luciferasa.hPGK.minMMTV.eGFP se clonó en la construcción del vector lentiviral pRRL.sin.cPPT.
SV40polyA.CTE.tTA2.Wpre cortada de la misma forma, para obtener RRL-MA2-lucif/GFP (pRRL.sin.cPPT.
SV40polyA.CTE.Luciferasa.hPGK.minMMTV.eGFP.Wpre).
Para generar la construcción lentiviral
CCL-MA3, se clonaron dos fragmentos en pBLKS+
cortado con HindIII y con XhoI, el primer fragmento que contenía
los elementos CTE.SV40polyA se obtuvo a partir de la construcción
del vector lentiviral pRRL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.tTA2 cortada con
HindIII y con XbaI y el segundo fragmento que contenía los
elementos minMMTV.GFP se obtuvo a partir de la construcción
cPPT.SV40polyA.CTE.Luciferasa.
hPGK.minMMTV.eGFP cortada con XhoI y con XbaI para obtener la construcción pBLKS+ minMMTV.GFP.
CTE.SV40polyA. La construcción resultante se cortó con EcoRV y con XhoI y el fragmento que contenía minMMTV.
GFP.CTE.SV40polyA se clonó en la construcción del vector lentiviral pCCL.sin.cPPT.hPGK.\DeltaNGFR.Wpre cortada con las mismas enzimas, para obtener la construcción final del vector lentiviral CCL-MA3-GFP/\DeltaNGFR (pCCL.sin.
cPPT.SV40polyA.CTE.GFP.minMMTV.hPGK.\DeltaNGFR.Wpre).
hPGK.minMMTV.eGFP cortada con XhoI y con XbaI para obtener la construcción pBLKS+ minMMTV.GFP.
CTE.SV40polyA. La construcción resultante se cortó con EcoRV y con XhoI y el fragmento que contenía minMMTV.
GFP.CTE.SV40polyA se clonó en la construcción del vector lentiviral pCCL.sin.cPPT.hPGK.\DeltaNGFR.Wpre cortada con las mismas enzimas, para obtener la construcción final del vector lentiviral CCL-MA3-GFP/\DeltaNGFR (pCCL.sin.
cPPT.SV40polyA.CTE.GFP.minMMTV.hPGK.\DeltaNGFR.Wpre).
Para generar la construcción lentiviral
CCL-MA4 el fragmento procedente de
pHR'.UBI-C.eGFP cortado con PacI, truncado y
cortado con PstI, que contenía la secuencia promotora de la
UBI-C, se insertó en el lugar del promotor PGK en
la construcción
pCCL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.GFP.minCMV.PGK.\DeltaNGFR.Wpre cortada
con EcoRV y con PstI para obtener la construcción final del vector
lentiviral CCL-MA4-GFP/\DeltaNGFR
(pCCL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.
GFP.minCMV.UBI-C. \DeltaNGFR.Wpre).
GFP.minCMV.UBI-C. \DeltaNGFR.Wpre).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los mapas y las secuencias de nucleótidos de las
construcciones RRL-MA1-lucif/GFP,
CCL-MA1-GFP/\DeltaLNGFR,
RRL-MA2-lucif/GFF;
CCL-MA3-GFP/\DeltaLNGFR;
CCL-MA4-GFP/\DeltaLNGFR se
muestran, respectivamente, en las figuras 7a-11a y
en las figuras 7b-11b.
Se produjeron LV de tercera generación
pseudotipificados con VSV mediante la cotransfección transitoria de
4 plásmidos en células 293T y se purificaron mediante
ultracentrifugación tal como se describe^{15}, con la
modificación de que para la recolección del vector se añadió
Butirato de Na 1 mM a los cultivos^{47}. Los resultados de las
titulaciones de la expresión de los vectores GFP o \DeltaLNGFR se
estimaron en células HeLa mediante dilución límite. Las partículas
del vector se midieron mediante inmunocaptura con el antígeno p24
de la región gag del HIV-1 (NEN Life Science
Products). La infectividad del vector se calculó como la proporción
entre el resultado de la titulación y el de las partículas medidas
para el vector que expresa GFP o \DeltaNGFR. El resultado de la
titulación de la expresión del vector en el sobrenadante de 293T
varió entre 0,7 y 1 x 10^{7} Unidades de
Transducción^{HeLa}(TU)/ml para el vector CMV o PGK
monocistrónico, entre 3 y 8 x 10^{6} TU/ml para vectores
bicistrónicos y para vectores bidireccionales. La infectividad del
vector varió entre 0,5 y 1 x 10^{5} TU/ng de p24 para el vector
CMV o PGK monocistrónico y entre 2 y 6 x 10^{4} TU/ng de p24 para
los vectores bicistrónicos y bidireccionales.
Se mantuvieron cultivos continuos de células
HeLa y 293T en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM;
Sigma, Milán, Italia) suplementados con suero bovino fetal al 10%
(FBS; Gibco, Invitrogen Corporation, Reino Unido) y con una
combinación de penicilina-estreptomicina y
glutamina. Se obtuvieron cultivos primarios de células endoteliales
de la vena umbilical humana (HCTVECs), linfocitos de la sangre
periférica y progenitores CD34+ procedentes de sangre de cordón
umbilical humano y se mantuvieron tal como se describe^{15}. Se
transdujeron progenitores CD34+ con 5 x 10^{7} TU/ml de LV y se
cultivaron durante al menos 7 días en presencia de interleucina 6
humana recombinante (rhIL6, 20 ng/ml), factor recombinante de célula
madre humana (rhSCF, 100 ng/ml), ligando FLT-3
humano recombinante (ligando rhFLT-3, 100 ng/ml),
procedentes todos de PeproTech (Rocky Hill, NJ) y trombopoyetina
humana recombinante (rhTPO, 20 ng/ml; Amgen, Thousand Oaks, CA) tal
como se describe^{23}. Para la diferenciación de las condiciones,
se cultivaron progenitores transducidos durante 10 días en presencia
de rhSCF, 50 ng/ml, factor estimulante de colonias de granulocitos
monocitos humanos recombinantes (rhGM-CSF, 20
ng/ml) y factor estimulante de colonias de monocitos humanos
recombinantes (rhG-CSF, 20 ng/ml), todos ellos
procedentes de PeproTech. Para las pruebas clonogénicas, se
recubrieron células transducidas con una densidad de 800 células/ml
en medio MethoCult humano completo (StemCell Technologies,
Vancouver, CA) y se sometieron a conteo mediante microscopía óptica
y por fluorescencia 14 días después.
Se purificaron linfocitos de sangre periférica
humana mediante gradiente de Ficoll y se transdujeron con
0,5-5 x 10^{7} TU/ml de vector después de 2 días
de activación con 30 ng/ml de anticuerpos anti-CD3
(Orthoclone, Milán, Italia) mas 1 \mug/ml de anticuerpos
anti-CD28 (PharMingen, San Diego, CA), o después de
4 días de tratamiento con 5 ng/ml de interleucina-7
(Boehringer Mannheim-Roche GmbH, Mannheim,
Alemania), tal como se describe^{24}.
La purificación de la línea de células con
marcador negativo de médula ósea de ratón C57BL/6 con una técnica
magnética de agotamiento celular (StemCell Technologies, Vancouver,
CA), la transducción ex vivo en medio StemSpan libre de
suero (StemCell Technologies, Vancouver, CA) con
0,5-2 x 10^{7} TU/ml de vector y el transplante
en recipientes singénicos irradiados letalmente se llevaron a cabo
tal como se describe.
Se adquirieron ratones CD1, C57BL/6 y FVB a
Charles Rivers Laboratories (Calco, Italia) y se mantuvieron en
condiciones SPF. Todos los procedimientos animales se llevaron a
cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité
Institucional para el Cuidado y la Utilización de Animales del
Hospital San Raffaele.
Las copias del vector por genoma se
cuantificaron mediante PCR en tiempo real a partir de 300 ng de
cadena de ADN molde extraídos de células mediante un kit comercial
(Qiagen), que utiliza un conjunto de cebadores y de sondas para
detectar la columna vertebral del LV:
Cebador del LV hacia adelante,
5'-TGAAAGCGAAAGGGAAACCA-3';
Cebador del LV hacia atrás,
5'-CCGTGCGCGCTTCAG-3';
Sonda del LV,
5'-(VIC)-CTCTCTCGACGCAGGACT-(TAMRA)-3'.
Las reacciones se llevaron a cabo de acuerdo con
las instrucciones del fabricante y se analizaron utilizando el
sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700
(PE-Applied Biosystem). Para la técnica de
hibridación tipo Southern, se extrajo ADN de células transducidas,
se digirió con Afl-II para liberar el casete de
expresión del ADN del vector integrado y se analizó con una sonda
WPRE para detectar las secuencias del vector. La cantidad media de
copias integradas del vector se determinó en relación con una curva
estándar de plásmido.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Esas cantidades se utilizaron para calcular el
resultado de la titulación de la integración del vector y normalizar
las poblaciones de vectores para todos los experimentos posteriores
de transducción, para asegurar niveles similares de integración
para cada vector ensayado.
Se anestesiaron ratones C57BL/6 de nueve semanas
de edad con una inyección por vía intraperitoneal de Tribromoetanol
al 1,25% (SIGMA), se situaron en un marco estereotáctico (David Kopf
Instruments, Tujunga, CA) y mediante una pequeña incisión se expuso
el cráneo. Se inyectaron dos \mul de concentrado de vector (2 x
10^{6} TU/\mul) mediante una jeringa Hamilton con una aguja de
punta truncada 33G (Hamilton, Reno, NV) en el hemisferio izquierdo
del cuerpo estriado (coordenadas estereotácticas en mm desde el
bregma: AP=+0,74, ML=-1,9 y DV=-3,5 desde la superficie del cráneo)
a una velocidad de 0,2 \mul/min. La aguja se dejó en su lugar
durante 5 minutos más antes de retirarla lentamente.
Se generaron ratones transgénicos utilizando LV
tal como describieron Lois y otros^{19}. En síntesis, se
sometieron a superovulación ratones FVB hembra con una combinación
de suero de yegua preñada y gonadotropina coriónica humana. Por
término medio se recogieron entre 20 y 30 embriones por cada hembra
y en el mismo día se les microinyectaron a los embriones dentro del
espacio perivitelino 10-100 pL de disolución de LV
con una concentración de 5 x 10^{7} TU/ml. Los embriones
manipulados se implantaron de inmediato dentro del oviducto de
ratonas CD1 pseudopreñadas. Las crías se clasificaron según su
genotipo por la presencia de la secuencia GFP mediante análisis PCR
tal como se describe^{49}. Los ratones positivos se reprodujeron
para poner a prueba la transmisión de la línea germinal del
transgen. Se extrajo ADN de la cola y se utilizó para cuantificar
el número de copias del vector mediante PCR en tiempo real en los
ratones fundadores y en los ratones F1 descendientes.
Las células transducidas se cultivaron durante
al menos 4 días antes de realizar el análisis FACS para que
alcanzasen el estado estacionario de la expresión de GFP y para
descartar la pseudotransducción. Antes del análisis FACS, se
desprendieron células adherentes con una disolución de 0,05%
tripsina-EDTA, se lavaron y se fijaron en solución
salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía paraformaldehído
(PFA) al 1% y FBS al 2%. Células cultivadas en suspensión se
lavaron y se pusieron de nuevo en suspensión en PBS que contenía 2
\mug/ml de yoduro de propidio (IP) (BD Bioscience PharMingen, San
Diego, CA) y FBS al 2%. Para la inmunotinción, se bloquearon
10^{5} células en suero de ratón con PBS al 5%, suero humano al
5%, FBS al 2% durante 15 min a 4ºC. Después del bloqueo, se
añadieron 10 \mul de anticuerpos (anti-CD34 y
anti-CD13, Dako, Glostrup, Dinamarca y
anti-\DeltaLNGFR, BD Bioscience PharMingen, San
Diego, CA) conjugados con R-ficoeritrina (RPE) y
las células se incubaron durante 30 min a 4ºC, se lavaron, se
tiñeron con IP y se analizaron mediante citometría de flujo con
analizador de tres colores. Para el análisis sólo se utilizaron
células viables, IP negativas.
La luciferasa se ensayó en lisatos celulares
preparados tal como describe el fabricante (sistema de ensayo de
luciferasa, Promega). Las URL se midieron con un luminómetro Lumat
LB9507 (Berthold) después de mezclar los lisatos celulares
(normalizados para el contenido de proteína medido mediante el
sistema BCA Protein Assay Reagent kit de Pierce) con Sustrato de
Luciferasa (Promega).
Ratones anestesiados se perfundieron con NaCl al
0,9% seguido de PFA al 4% en PBS. Se recogieron muestras de tejido,
se equilibraron en sacarosa al 20% en PBS durante 48 h a 4ºC y se
embebieron en un compuesto de temperatura de corte óptima (TCO)
para un enfriamiento rápido. Se incorporaron en PFA secciones
criostáticas con un espesor de 10 \mum (para ratones
transgénicos) y de 20 \mum (para ratones inyectados en el marco
estereotáctico) y se congelaron a -80ºC. Las secciones se bloquearon
con suero de cabra al 5% (Vector Laboratories) en PBS que contenía
albúmina de suero bovino (BSA) al 1% y Triton X-100
(PBS-T) al 0,1% y se incubaron con anticuerpos GFP
de conejo purificados por afinidad (Molecular Probes) y con
anticuerpos monoclonales \DeltaLNGFR conjugados con
R-ficoeritrina (RPE) (BD Bioscience PharMingen, San
Diego, CA) durante 1 h, se lavaron y se tiñeron con anticuerpos de
cabra anti-conejo conjugados con AlexaFluor488
(Molecular Probes) en PBS-T y en BSA al 1% durante
1 h. Los núcleos celulares se tiñeron con TOPRO-3
después de 1 h de tratamiento con ARNasa (Molecular Probes). Las
secciones se montaron y se analizaron mediante un microscopio láser
confocal con tres fuentes de láser (Radiance 2100; BioRad). Se
adquirieron de forma secuencial señales fluorescentes a partir de
secciones ópticas individuales y se analizaron mediante PhotoShop
7.0 (Adobe).
A efectos de expresar más de un transgen a
partir de un vector individual, los autores evaluaron primero el
funcionamiento de diferentes IRESs en el contexto de LVs
autoinactivantes de última generación^{15}. Los autores
utilizaron los promotores fuertes de CMV y de PGK para conducir a la
expresión de transcripciones bicistrónicas que codifiquen, entre el
extremo 5' y el extremo 3', el indicador de la luciferasa, un IRES
y el marcador GFP asociado a las células (figura 1a). A partir del
virus de la Encefalomiocarditis se obtuvieron dos IRESs; una forma
natural (EMCVwt) y una forma mutante (EMCVmut), que se diferenciaban
en el ATG desde el que se inició la traducción aguas abajo. A
partir de la secuencia sin traducir del extremo 5' de ARNm del
Factor Represor de la transcripción de NF-kB
(NRF)^{18} se obtuvo otro IRES.
Los autores generaron poblaciones
pseudotificadas con VSV con resultados de titulación elevados de
todos los vectores bicistrónicos y monocistrónicos de control y las
normalizaron para la medida de la actividad de transducción en
células HeLa mediante la técnica de hibridación tipo Southern
(figura 1b). A continuación compararon la expresión génica en
células transducidas hasta cantidades iguales de copias del vector
(figuras 1c-f). Aunque la actividad de la
luciferasa fue similar en las células HeLa transducidas con el
vector CMV-luciferasa y en células transducidas
mediante el vector bicistrónico que tiene el mejor funcionamiento,
solo una pequeña fracción de las últimas células expresaron el gen
GFP dependiente del IRES, con una reducción de 10 veces en el
resultado de la titulación de la expresión en comparación con
células transducidas mediante el vector de control
CMV-GFP (figura 1c). Además, la intensidad media de
la fluorescencia (MFI) del GFP fue significativamente menor en las
células que expresaban la proteína a partir de los IRESs que en las
células que la expresaban a partir del ^{ARNm}Cap. A continuación
los autores ensayaron LVs bicistrónicos en células primarias
humanas, que incluían células endoteliales de la vena umbilical,
linfocitos de la sangre periférica y progenitores CD34+
hematopoyéticos procedentes de sangre de cordón umbilical (HPC)
(figura 1d-f). Todos los tipos de células se
transdujeron de forma eficaz, tal como se indicó mediante la
frecuencia de células positivas para GFP en cultivos transducidos
mediante el vector de control CMV-GFP, aunque la
expresión de GFP dependiente del IRES solo se observó en una
fracción de las células transducidas mediante vectores
bicistrónicos. La actividad del IRES varió ampliamente con el tipo
de célula diana; el IRES del NRF fue el único que alcanzó una
expresión génica en linfocitos detectable aguas abajo, mientras que
el IRES del EMCVwt fue el más eficaz en los otros tipos de células.
Además, todos los IRESs se redujeron, en algunos casos más de un
log, aguas arriba de la expresión génica, en comparación con el
vector de control CMV-luciferasa.
También evaluaron los vectores basados en IRES
mediante la expresión de dos marcadores asociados a las células,
GFP y una versión truncada del receptor NGF de baja afinidad
(\DeltaLNGFR) (figura 1g, h). Entre las células HeLa transducidas
por medio de una dosis baja del vector bicistrónico que mostró el
mejor funcionamiento, solo las células que expresaban altos niveles
de \DeltaLNGFR expresaban también GFP, con una media de una entre
cuatro células positivas para \DeltaLNGFR que expresaban GFP hasta
niveles detectables (figura 1g). De forma similar, solo una pequeña
fracción de progenitores CD34+ transducidos que expresaban
\DeltaNGFR expresaban también GFP hasta niveles detectables
(figura 1h). En general, estos resultados indicaban que los
vectores bicistrónicos basados en IRES fracasaron en asegurar la
expresión coordinada de dos transgenes en la mayoría de las células
diana ensayadas, e indicaban que para obtener una población que
expresase ambos transgenes en la mayoría de las células se
requerían la transducción de multi-copias o la
selección de células transducidas para la expresión génica aguas
abajo.
Para superar las limitaciones de los vectores
bicistrónicos, los autores exploraron un nuevo diseño de promotor
para la expresión coordinada de transgenes. Unieron un promotor
mínimo aguas arriba, y en orientación opuesta, a un promotor
eficaz. La razón fundamental de este diseño fue que los elementos
situados aguas arriba en el promotor eficaz, cuando se encuentran
flanqueados estrechamente por promotores mínimos a ambos lados,
pueden conducir a actividad transcripcional en ambas direcciones.
Si tuviese lugar dicha activación bidireccional, la expresión de
ambas transcripciones se regularía de forma coordinada. Los autores
ensayaron dos promotores expresados ubícuamente, que anteriormente
habían mostrado que conducían a una expresión de transgenes robusta
y eficaz en LV; el fragmento 516 bp mencionado anteriormente
procedente del promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK) humana y
un fragmento 1226 bp procedente del promotor de la ubiquitina C (UBI
C)^{19} humana. Los unieron a un promotor mínimo
procedente del citomegalovirus (minCMV) que se había desarrollado
anteriormente para iniciar el acoplamiento de la transcripción
eucariótica a operadores^{20} dependientes de la tetraciclina
(Tc). Flanquearon el promotor bidireccional con dos casetes de
expresión optimizados para la administración de genes mediada por
LV (figura 2a). El casete situado aguas arriba -con orientación en
sentido contrario en relación con el vector LTR- incluía al
elemento de transporte constitutivo (CTE) del virus del mono
Mason-Pfizer^{21} y un sitio de poliadenilación
para el Virus Simio 40 (SV40). El casete situado aguas abajo incluía
el elemento regulador post-transcripcional del
virus de la hepatitis de la marmota (WPRE)^{22} y el sitio
de poliadenilación SIN HIV-1 LTR.
Tal como se describió anteriormente para los LVs
bicistrónicos, los autores verificaron la correcta transferencia y
la transducción normalizada de cada vector por medio del análisis de
la técnica de hibridación tipo Southern y mediante PCR en tiempo
real de células transducidas. Se produjeron LVs que llevaban casetes
de expresión bidireccional con resultados de titulación e
infectividad elevados, similares a los obtenidos con los vectores
estándar (véase Procedimientos). El diseño bidireccional mejoró de
forma significativa la transcripción del promotor mínimo situado
aguas abajo sin afectar a la expresión del promotor eficaz situado
aguas arriba (figura 2b-h). La expresión de
luciferasa a partir del promotor minCMV, por ejemplo, se incrementó
en al menos un log cuando se fundió aguas arriba al promotor PGK
(figura 2b). De forma notable, el promotor PGK bidireccional
permitió la detección de GFP (o de \DeltaLNGFR, no mostrado) en la
misma frecuencia y hasta niveles de expresión similares en células
transducidas mediante el vector bidireccional y permitió la
expresión de la proteína desde cualquiera de los lados del promotor
(figura 2c, d), tal como en células transducidas mediante el vector
PGK de control (figura 2e). Utilizando dos marcadores asociados a
las células, \DeltaLNGFR y GFP, los autores evidenciaron la
expresión estable, eficaz y coordinada de LVs bidireccionales, tanto
con cantidades de copias de vectores altas como con cantidades
bajas (figura 2f). Con una aportación alta de vectores, alcanzaban
un alto nivel de expresión de ambos transgenes en virtualmente
todas las células diana. Con una aportación baja de vectores,
cuando la mayoría de las células transducidas portaban una copia
proviral, evidenciaron la coexpresión de transgenes en virtualmente
todas las células marcadas, lo que indicaba la existencia de
transcripción divergente desde el promotor bidireccional. En ambas
condiciones, la expresión de transgenes se mantuvo en niveles
similares en las células analizadas en los momentos iniciales y
finales después de la transcripción (no mostrado y parte inferior
de la figura 3). Las células que expresaban transgenes tendían a
distribuirse a lo largo de una línea diagonal en el gráfico FACS de
dos colores, lo que indicaba que la expresión de los dos transgenes
estaba regulada de forma coordinada.
De forma curiosa, los autores observaron la
expresión bidireccional coordinada, aunque en un nivel de eficacia
significativamente más bajo en el lado situado aguas arriba en
comparación con el lado situado aguas abajo, cuando ensayaron solo
el promotor PGK en el contexto del casete de expresión bidireccional
que habían desarrollado (figura 2g). Reprodujeron este resultado
después de intercambiar la posición de los dos transgenes en cada
uno de los lados del promotor PGK (no mostrado). Estos resultados
indicaban que los elementos que activaban la transcripción en el
promotor PGK son intrínsecamente capaces de desencadenar la
transcripción divergente y así proporcionar la fuerza impulsora
principal para la expresión dual de genes en el nuevo LV, asegurando
la regulación coordinada de la transcripción en ambos lados del
promotor bidireccional. La adición del promotor mínimo minCMV, que
de por sí tenía una actividad muy baja (figura 2h y parte superior
de la figura 2b), mejoró la transcripción aguas arriba desde el
promotor PGK posiblemente debido a un inicio más eficaz (compare la
figura 2g y la 2f). Cuando los autores cambiaron el promotor
conductor en vectores bidireccionales desde PGC hasta
UBI-C, reprodujeron los resultados observados con el
promotor PGK (figura 2i). Revelaron una actividad bidireccional
intrínseca del promotor de la UBI-C (figura 2j) que
se mejoraba de forma significativa mediante la adición aguas arriba
del promotor minCMV.
A continuación los autores compararon
directamente el funcionamiento de vectores bidireccionales y
bicistrónicos en relación con la cantidad de copias integradas, tal
como se mide mediante PCR en tiempo real (figura 3). Mediante el
análisis de células 293T transducidas con dosis crecientes de
vector, probaron que la inmensa mayoría de los vectores
bidireccionales integrados basados en el promotor PGK (MA1) o en el
UBI-C (MA4) expresaban de forma eficaz ambos
transgenes, superando claramente al mejor vector bicistrónico basado
en IRES.
A continuación los autores evaluaron el
funcionamiento del MA1 LV bidireccional en dianas más relevantes
para las aplicaciones de la terapia génica y mediante distintas
estrategias de administración. Transdujeron HPC y PBL de sangre de
cordón umbilical humano con \DeltaLNGFR-GFP MA1 LV
ex vivo, de acuerdo con los protocolos anteriormente
optimizados^{23, 24} (figura 4). Ambos productos génicos se
expresaron de forma coordinada hasta niveles elevados en una gran
fracción de HPC marcados ambos como células inmaduras cultivadas en
presencia de citoquinas de acción temprana (figura 4a) y después de
la diferenciación en cultivo líquido (figura 4b) o de prueba
clonogénica (figura 4c, solo GFP). De forma similar, obtuvieron la
expresión coordinada de \DeltaLNGFR y GFP en PBL transducido en
condiciones estándar de proliferación, iniciada mediante la
co-estimulación con CD3/CD28 (figura 4d) y células
no proliferantes, tratadas solo con IL-7 para
mantener las propiedades de las células naïve (figura 4e). También
llevaron a cabo estudios de transplantes con HPC de roedor
transducida, enriquecida a partir de médula ósea mediante selección
negativa, para probar la expresión transgénica dual y estable en la
repoblación a largo plazo de HSC en la progenie (figura 4f). Los
\DeltaLNGFR y GFP se expresaron de forma coordinada en niveles
similares en las células transducidas ex vivo, antes del
transplante y en los leucocitos de ratones injertados a largo
plazo. En general, estos resultados validaron el nuevo LV para una
transferencia génica dual muy competente en células hematopoyéticas
primitivas, precursoras y diferenciadas.
Inyectaron \DeltaLNGFR-GFP MA1
LV concentrado en el cuerpo estriado de ratones adultos y
determinaron la puntuación de la expresión de transgenes 4 semanas
después de la inyección mediante microscopía confocal de secciones
del cerebro inmunoteñidas para GFP y \DeltaLNGFR (figura 5).
Observaron la coexpresión robusta de ambos transgenes en el tejido
del cerebro que rodeaba el lugar de la inyección. Tal como se
informó anteriormente después de la inyección de
LV^{25-27} pseudotipificado con VSV en el cuerpo
estriado, la inmensa mayoría de las células que expresaban los
marcadores tenían la morfología típica de las neuronas estriadas.
Así, el nuevo LV bidireccional permitió una transferencia génica
dual eficaz in vivo.
Los autores evaluaron si el nuevo LV
bidireccional permitía la generación de líneas duales de ratones
transgénicos. Tal como describieron anteriormente Lois y
otros^{19}, inyectaron el \DeltaNGFR-GFP LV
dentro del espacio perivitelino de embriones de una célula única y
los implantaron dentro de hembras pseudopreñadas. Se obtuvieron
ratones transgénicos con una frecuencia elevada, tal como evaluamos
mediante la presencia de ADN del vector (más del 50% de los
neonatos), y probamos la integración del vector en la línea germinal
por medio del cruce de algunos ratones fundadores y mediante el
análisis del contenido de ADN del vector en su progenie y el
análisis de la expresión de transgenes (figura 6). En los dos
ratones F1 analizados, que llevaban las copias 2 y 5 del vector en
el genoma, los autores encontraron una expresión notablemente
coherente de ambos transgenes en virtualmente cada célula de los
tejidos estudiados, que incluían cerebro, hígado, bazo, intestino,
corazón, músculo esquelético y riñón. La expresión del vector
también se detectó bien en la médula ósea y en la sangre periférica
de los mismos ratones, aunque en menos del 100% de las células y más
claramente para \DeltaNGFR que para GFP (no mostrado). Estos
datos indicaban que la transgénesis bidireccional mediante el LV es
un procedimiento rápido y eficaz para obtener la expresión robusta,
estable y coordinada de dos transgenes en ratones diseñados
genéticamente. Además, los autores evidenciaron que el promotor
bidireccional minCMV-PGK que habían desarrollado
controla la expresión dual de los transgenes en la mayoría de los
tejidos diferenciados del ratón y mantiene la expresión después de
la herencia a través de la línea germinal.
En la búsqueda de estrategias que permitan una
transferencia génica dual eficaz, los autores inicialmente se
enfrentaron a las importantes limitaciones de los sistemas basados
en IRES. Cuando se ensayó en el contexto de LV bicistrónico, la
expresión génica dependiente de IRES era significativamente más baja
que la que dependía del ^{ARNm}Cap y requería la transducción de
multi-copias para la coexpresión del gen aguas abajo
en una fracción grande de las células transducidas. Además, los
IRESs reducían la expresión de los genes aguas arriba en la
transcripción y mostraban una variación importante en su actividad
que era dependiente del tipo de célula. Se han informado
limitaciones similares cuando se incorporan IRESs dentro de otros
tipos de vectores de transferencia
génica^{14,28-32}. Así, es probable que se
requiera la selección para la expresión génica aguas abajo cuando
se utilice IRES para asegurar la coexpresión en todas las células
diana. Aunque los protocolos de selección son compatibles con
algunas transferencias génicas ex vivo y con algunas
aplicaciones de la terapia génica, éstos pueden afectar de forma
negativa a las propiedades biológicas de las células corregidas
genéticamente, en particular cuando la expresión del marcador
seleccionable es ineficaz. De hecho, el cultivo prolongado ex
vivo y una composición de tamaño limitado o clonal de la
población de células transducidas pueden reducir el injerto, la
supervivencia a largo plazo y la repoblación del tejido después del
transplante^{33}. De forma incluso más importante, la ineficacia
de la expresión dependiente de IRES impide la mayoría de las
aplicaciones de vectores bicistrónicos en la transferencia génica
directa in vivo. Así, los autores exploraron nuevas
estrategias para aprovechar al máximo los sistemas de transferencia
génica, tales como LV, que permiten una transducción ex vivo
eficaz y una administración in vivo directa^{34}.
Los autores han desarrollado un nuevo diseño de
promotor basado en la yuxtaposición de elementos de promotor mínimo
aguas arriba, y en orientación opuesta, a un promotor eficaz. El
ensamblaje bidireccional condujo a la transcripción divergente, lo
que indicaba que los elementos potenciadores/promotores situados
aguas arriba dentro del promotor eficaz eran capaces de promover la
transcripción de una forma independiente de la orientación y desde
ambos lados de forma simultánea. Tras la incorporación de estos
promotores dentro del LV, alcanzaron la transferencia génica dual
eficaz y la expresión coordinada en líneas celulares continuas y en
células primarias ex vivo. Debido a que en la inmensa
mayoría de las células transducidas se expresaron ambos transgenes,
los autores no necesitaron seleccionar células para asegurar la
coexpresión de los transgenes. Tras la inyección directa del LV
bidireccional dentro del SNC, los autores evidenciaron la expresión
coordinada de dos transgenes en células neuronales in vivo.
Además, el LV bidireccional permitió una transgénesis dual robusta,
lo que condujo a la expresión de todas las células de ambos
transgenes en todos los tejidos examinados. Todos estos resultados
no se habían podido alcanzar hasta ahora utilizando las tecnologías
disponibles en la actualidad.
Mediante el seguimiento de las células
transducidas que portaban una copia individual del vector, los
autores probaron que tenía lugar la transcripción divergente desde
un promotor bidireccional individual, que la expresión de ambos
transgenes estaba ligada funcionalmente y regulada de forma
coordinada y probaron que los promotores bidireccionales eran
activos de forma coherente en todos los tipos de células diana
ensayados, sin ser silenciados o fijados de forma aleatoria en una
dirección de la transcripción, incluso después de la diferenciación
celular. Aunque no acotaron cuán cerca deben estar los dos
promotores mínimos opuestos para que tenga lugar la unión
funcional, los autores pueden prever que se pueda requerir la
yuxtaposición íntima del promotor mínimo fusionado a alguno de los
elementos situados aguas arriba en el promotor eficaz, tal como se
observa en promotores naturales entre elementos mínimos y elementos
situados aguas arriba. Tanto los promotores PGK como los
UBI-C ensayados en este trabajo condujeron a
transcripción divergente cuando se fusionaron a un promotor mínimo
en la orientación opuesta. De forma curiosa, se evidenció que ambos
promotores eran intrínsecamente capaces de promover la transcripción
divergente, aunque con una eficacia más baja en el lado situado
aguas arriba que en el lado situado aguas abajo, cuando se
incorporaban dentro del casete de expresión bidireccional que habían
desarrollado los autores. Esta sorprendente observación puede
indicar una característica específica de un tipo de promotores de
mantenimiento expresados ubícuamente, posiblemente relacionada con
su contenido de islas CpG (véase a continuación y
^{35-37}). No obstante, los autores no deberían
olvidar que tanto la ubicación del promotor entre dos casetes de
expresión eficaces dotados con elementos reguladores
post-transcripcionales que mejoran la traducción,
como la integración mediada por LV, que se ha evidenciado que se
centra preferentemente en genes transcritos diana en la cromatina,
pueden contribuir a descifrar la actividad transcripcional latente.
Aunque la actividad bidireccional intrínseca de los promotores de
mantenimiento ensayados puede no ser lo suficientemente eficaz para
su aprovechamiento de por sí, sin el ensamblaje de los elementos de
promotor mínimo aguas arriba descrito en este trabajo, ésta
proporciona la base para la regulación coordinada de la expresión
dual de genes lograda por nuestros nuevos vectores. Por otra parte,
se debería tener en cuenta la predisposición de estos promotores
para conducir a la transcripción divergente cuando se diseñen
vectores y cuando se analicen células o tejidos transducidos^{38}
y pueden proporcionar un posible mecanismo para la interferencia
observada con frecuencia entre promotores cercanos en la misma
construcción de vector. Es posible que el diseño bidireccional aquí
descrito se pueda aplicar con éxito en promotores específicos de
tejidos para obtener la expresión coordinada de dos transgenes en
tejidos específicos. Además, mediante la combinación de promotores
bidireccionales con transcripciones bicistrónicas se pueden
expresar más de dos transgenes dentro de la misma célula, aunque con
las limitaciones descritas anteriormente para los vectores que
dependen de IRES.
Los promotores bidireccionales inducibles se
desarrollaron originalmente en sistemas de expresión regulados
mediante Tet, por medio de la duplicación de un promotor mínimo en
ambos lados de una serie de repeticiones del operador Tet, para
obtener la expresión regulada de forma exógena de dos
transgenes^{36, 40,41}. Este diseño se aplicó recientemente a
otros sistemas que también combinan elementos potenciadores
procarióticos con transactivadores quiméricos para regular la
expresión génica^{42}. Aunque estos sistemas de expresión
inducibles representan herramientas poderosas para los estudios de
la función génica, dependen de la coexpresión y de la actividad
funcional de transactivadores de proteínas y presentan varios
desafíos cuando se aplican a la administración basada en vectores y
a aplicaciones in vivo. Recientemente se ensayó un promotor
bidireccional constitutivo para la expresión de genes exógenos en
biotecnología vegetal^{43}. Los resultados de los inventores
proporcionan la primera descripción de promotores bidireccionales de
síntesis que aprovechan los sistemas transcripcionales endógenos
disponibles para la mayoría de los tipos de células animales para
conducir a una expresión robusta y constitutiva de dos
transcripciones divergentes. De hecho, hasta hace poco se habían
documentado pocos ejemplos de promotores bidireccionales. De forma
curiosa, un informe reciente del genoma humano indicó una
abundancia de pares de genes transcritos de forma divergente, cuyos
sitios de inicio para la transcripción se encuentran separados por
menos de 1 kb. Es probable que muchos de los elementos del promotor
encontrados entre estos pares de genes puedan iniciar la
transcripción en ambas direcciones y puedan contener elementos
compartidos que regulen ambos genes^{46}. Así, los promotores
bidireccionales de síntesis que han desarrollado pueden copiar una
característica bien representada y evolutiva conservada de la
transcripción eucariótica, lo que proporciona una base estructural
para su robusto funcionamiento. Los nuevos vectores lentivirales
construidos alrededor de estos promotores bidireccionales
probablemente harán progresar el alcance y la seguridad de la
terapia génica, el poder de la función génica y de los estudios de
validación de dianas y las aplicaciones de la transgénesis animal.
Si se adaptan para la expresión de ARN interferente pequeño, también
pueden permitir la destrucción coordinada de genes múltiples.
1. Kay, M.A., Glorioso, J.C. y
Naldini, L. Nat Med 7, 33-40
(2001).
2. Neff, T. y otros. J Clin Invest
112, 1581-1588 (2003).
3. Bordignon, C. y Roncarolo, M.G.
Nat. Immumol. 3, 318-321 (2002).
4. Sadelain, M. J Gene Med 4,
113-121 (2002).
5. Bonini, C. y otros. Science
276, 1719-1724 (1997).
6.
Hacein-Bey-Abina, S. y otros.
Science 302, 415-419 (2003).
7. Burton, E.A., Glorioso, J.C. y
Fink, D.J. Gene Ther 10, 1721-1727
(2003).
8. Sadelain, M., Riviere, I. y
Brentjens, R. Nat Rev Cancer 3, 35-45
(2003).
9. Miller, A.D. en Retroviruses. (eds. J.
Coffin, S.H. Hughes y H.E. Varmus) 437-474 (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Plainview; 2000).
10. Emerman, M. y Temin, H.M.
Mol Cell Biol 6, 792-800 (1986).
11. Zhu, Y. y otros. Mol. Ther. 4,
375-382 (2001).
12. Klump, H. y otros. Gene Ther.
8, 811-817 (2001).
13. Furler, S. y otros. Gene Ther
8, 864-873 (2001).
14. Martinez-Salas, E.
Curr. Opin. Biotechnol. 10, 458-464
(1999).
15. Follenzi, A. y otros. Nat
Genet 25, 217-222 (2000).
16. Ghattas, I.R., Sanes, J.R. y
Majors, J.E. Mol. Cell Biol. 11,
5848-5859 (1991).
17. Qiao, J. y otros. Hum Gene
Ther 13, 881-887 (2002).
18. Oumard, A. y otros. 20,
2755-2759 (2000).
19. Lois, C. y otros. Science 295,
868-872 (2002).
20. Baron, U. y Bujard, H.
Methods Enzymol. 327, 401-421
(2000).
21. Bray, M. y otros. Proc Natl Acad
Sci USA 91, 1256-1260 (1994).
22. Zufferey, R. y otros. J.
Virol. 73, 2886-2892 (1999).
23. Ailles, L. y otros. Mol Ther
6, 615-626 (2002).
24. Cavalieri, S. y otros. Blood
102, 497-505 (2003).
25. Naldini, L. y otros. Proc Natl
Acad Sci USA 93, 11382-11388 (1996).
26. Baekelandt, V. y otros. Hum Gene
Ther 13, 841-853 (2002).
27. Deglon, N. y otros. Hum. Gene
Ther. 11, 179-190 (2000).
28. Sokolic, R.A. y otros. Blood
87, 42-50 (1996).
29. Wong, E.T., Ngoi, S.M. y
Lee, C.G. Gene Ther 9, 337-344
(2002).
30. Kozak, M. Gene 318,
1-23 (2003).
31. Mizuguchi, H. y otros. Mol
Ther1, 376-382 (2000).
32. Hennecke, M. y otros. Nucleic
Acids Res 29, 3327-3334 (2001).
33. Mazurier, F. y otros. Blood
103, 545-552 (2004).
34. Vigna, E. y Naldini, L. J
Gene Med 2, 308-316 (2000).
35. Gardiner-Garden, M. y
Frommer, M. J. Mol Biol 196, 261-282
(1987).
36. Lavia, P., Macleod, D. y
Bird, A. EMBO J6, 2773-2779
(1987).
37. Johnson, P. y Friedmann, T.
Gene 88, 207-213 (1990).
38. Scacheri, P.C. y otros.
Genesis 30, 259-263 (2001).
39. Vigna, E. y otros. Mol Ther 5,
252-261 (2002).
40. Baron, U. y otros. Nucleic. Acids.
Res. 23, 3605-3606 (1995).
41. Unsinger, J. y otros. Mol Ther
4, 484-489 (2001).
42. Fux, C. y otros. J Gene Med 5,
1067-1079 (2003).
43. Xie, M., He, Y. y Gan,
SNat Biotechnol 19, 677-679
(2001).
44. Trinklein, N.D. y otros. Genonze
Res 14, 62-66 (2004).
45. Takai, D. y Jones, P.A. Mol Biol
Evol 21, 463-467 (2004).
46. Adachi, N. y Lieber, M.R.
Cell 109, 807-809 (2002).
47. Farson, D. y otros. Hum Gene
Ther 12, 981-997 (2001).
48. De Palma, M. y otros. Nat Med
9, 789-795 (2003).
49. Follenzi, A. y otros. Hum Gene
Ther 13, 243-260 (2002).
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> FONDAZIONE CENTRO SAN RAFFAELE DEL
MONTE TABOR
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VECTORES LENTIVIRALES QUE LLEVAN
PROMOTORES BIDIRECCIONALES DE SÍNTESIS Y UTILIZACIONES DE LOS
MISMOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 81240PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/IT2004/000227
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
21-04-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador del LV hacia adelante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaagcgaa agggaaacca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador del LV hacia atrás
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgtgcgcgc ttcag
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda del LV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctctcgac gcaggact
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9613
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(9613)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plásmido que contiene la
construcción del vector lentiviral
RRL-MA1-lucif/GFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9380
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(9380)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(9380)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plásmido que contiene la
construcción del vector lentiviral
CCL-MA1-GFP/de ItaLNGFR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9718
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(9718)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(9718)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plásmido que contiene la
construcción del vector lentiviral
RRL-MA2-lucif/GFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9490
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(9490)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(9490)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plásmido que contiene la
construcción del vector lentiviral
CCL-MA3-GFP/de ItaLNGFR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10086
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10086)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10086)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> plásmido que contiene la
construcción del vector lentiviral
CCL-MA4-GFP/de ltaLNGFR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
Claims (17)
1. Promotor bidireccional para la expresión de
al menos dos secuencias codificantes en dirección opuesta en
células animales que comprende desde el extremo 5' hasta el extremo
3':
a) una primera secuencia promotora mínima
procedente de genomas de citomegalovirus (CMV) o de virus de tumor
mamario de ratón (MMTV);
b) una secuencia de promotor procedente de un
gen animal que comprende una región potenciadora y una segunda
secuencia de promotor mínimo;
conduciendo las dos secuencias promotoras a una
transcripción coordinada de las citadas secuencias codificantes en
orientación opuesta.
2. Promotor bidireccional, según la
reivindicación 1, en el que la secuencia completa del promotor
eficaz procede de genes expresados ubícuamente que comprenden el
gen de la fosfoglicerato quinasa o de la ubiquitina.
3. Casete de expresión bidireccional que
comprende esencialmente el promotor bidireccional, según las
reivindicaciones anteriores, sitios de inserción adecuados ubicados
aguas abajo de cada promotor y sitios de poliadenilación ubicados
aguas abajo de cada sitio de inserción.
4. Casete de expresión bidireccional, según la
reivindicación 4, que comprende además al menos un elemento
regulador post-transcripcional situado aguas arriba
de uno o de cada sitio de poliadenilación.
5. Casete de expresión bidireccional, según la
reivindicación 4 ó 5, que comprende además al menos una secuencia
de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para expresar tres
o más genes.
6. Construcción de expresión que contiene el
promotor bidireccional según la reivindicación 1 ó 2.
7. Construcción de expresión que contiene el
casete de expresión bidireccional según las reivindicaciones
4-6.
8. Vector de transferencia génica que contiene
la construcción de expresión, según las reivindicaciones 7 u 8, que
comprende además secuencias lentivirales o retrovirales.
9. Utilización del vector de expresión de
transferencia génica, según la reivindicación 8, para la preparación
de un sistema de administración y de expresión en células
animales.
10. Utilización del vector de expresión de
transferencia génica, según la reivindicación 9, en el que las
células animales son células de tejidos animales in vivo.
11. Utilización del vector de expresión de
transferencia génica, según la reivindicación 10, en el que las
células de tejidos animales comprenden neuronas cerebrales.
12. Procedimiento in vitro para la
expresión coordinada de dos secuencias codificantes exógenas dentro
de una célula animal que comprende las siguientes etapas:
a) clonación de las citadas secuencias
codificantes dentro del vector de expresión de transferencia génica,
según la reivindicación 8, estando cada secuencia codificante bajo
el control de uno de los dos promotores del promotor
bidireccional;
b) transformación de células animales por medio
de los citados vectores;
c) permitir la expresión del vector.
13. Procedimiento in vitro para la
expresión coordinada de dos secuencias codificantes exógenas, según
la reivindicación 12, en el que la célula animal es una célula
humana.
14. Procedimiento in vitro para la
expresión coordinada de dos secuencias codificantes exógenas, según
la reivindicación 13, en el que la célula humana es una célula
humana retransplantable.
15. Procedimiento in vitro para la
expresión coordinada de dos secuencias codificantes exógenas, según
la reivindicación 14, en el que la célula humana retransplantable
es una célula hematopoyética.
16. Procedimiento para la generación de un
organismo transgénico no humano que comprende la etapa de la
transformación de las células adecuadas con una construcción de
expresión que contiene el casete bidireccional según las
reivindicaciones 6 ó 7.
17. Procedimiento para la generación de un
organismo transgénico no humano que comprende la etapa de la
transformación de las células adecuadas por medio de un vector de
expresión de transferencia génica según la reivin-
dicación 8.
dicación 8.
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Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2609142C (en) | 2005-05-27 | 2016-02-09 | Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor | Therapeutic gene vectors comprising mirna target sequences |
| EP2188386A2 (en) * | 2007-09-17 | 2010-05-26 | Universite De Strasbourg | Method for detecting or quantifying a truncating mutation |
| WO2010075956A1 (de) | 2008-12-16 | 2010-07-08 | C-Lecta Gmbh | Expressionsvektor |
| US8728458B2 (en) | 2009-04-30 | 2014-05-20 | The Regents Of The University Of California | Combination anti-HIV vectors, targeting vectors, and methods of use |
| US9719146B2 (en) * | 2009-09-09 | 2017-08-01 | General Electric Company | Composition and method for imaging stem cells |
| US8956828B2 (en) * | 2009-11-10 | 2015-02-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases |
| CN101851637B (zh) * | 2010-01-15 | 2011-12-14 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种制备同时表达多个基因的转基因动物的方法 |
| WO2012004778A1 (en) * | 2010-07-09 | 2012-01-12 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Method for in-vitro monitoring of neuronal disorders and use thereof |
| US8945876B2 (en) | 2011-11-23 | 2015-02-03 | University Of Hawaii | Auto-processing domains for polypeptide expression |
| EP4223772A3 (en) | 2013-02-15 | 2023-10-18 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Optimized factor viii gene |
| JP6346266B2 (ja) | 2013-03-21 | 2018-06-20 | サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド | 操作されたジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼを使用するｔ細胞受容体遺伝子の標的化された破壊 |
| EP3160478A4 (en) | 2014-06-30 | 2018-05-16 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Optimized factor ix gene |
| EP3283634B1 (en) * | 2015-04-14 | 2019-05-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter |
| WO2017096363A1 (en) * | 2015-12-04 | 2017-06-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Reporter system for detecting and targeting activated cells |
| PT3411478T (pt) | 2016-02-01 | 2022-09-13 | Bioverativ Therapeutics Inc | Genes do fator viii otimizados |
| AU2017254665C1 (en) * | 2016-04-20 | 2021-03-11 | Centro de Investigaciones Energeticas, Medioambientales Y Tecnologicas, O.A., M.P. | Compositions and methods for enhanced gene expression of PKLR |
| KR101864581B1 (ko) * | 2016-11-04 | 2018-07-13 | 국립암센터 | 양방향 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터 및 이의 용도 |
| EP3346001A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-11 | TXCell | Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells |
| WO2018127585A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Txcell | Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells |
| CA3072334A1 (en) | 2017-08-09 | 2019-02-14 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Nucleic acid molecules and uses thereof |
| US11814432B2 (en) | 2017-09-20 | 2023-11-14 | The University Of British Columbia | Anti-HLA-A2 antibodies, related chimeric antigen receptors, and uses thereof |
| CN111163810A (zh) | 2017-10-16 | 2020-05-15 | 能源环境和技术研究中心O.A., M.P. | 用于递送pklr以治疗丙酮酸激酶缺乏症的慢病毒载体 |
| WO2019118508A1 (en) * | 2017-12-12 | 2019-06-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Genetically modified immune cells targeting ny-eso-1 and methods of use thereof |
| BR112020015228A2 (pt) | 2018-02-01 | 2020-12-29 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Uso de vetores lentivirais que expressam fator viii |
| CN112292400A (zh) | 2018-04-13 | 2021-01-29 | 桑格摩生物治疗法国公司 | 对白介素-23受体特异的嵌合抗原受体 |
| MX2021001599A (es) | 2018-08-09 | 2021-07-02 | Bioverativ Therapeutics Inc | Moleculas de acido nucleico y sus usos para la terapia genica no viral. |
| CA3109253A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Sangamo Therapeutics France | New car constructs comprising tnfr2 domains |
| WO2020081759A1 (en) * | 2018-10-17 | 2020-04-23 | Texas Tech University System | Multivalent virus like particle vaccines |
| GB201817821D0 (en) | 2018-10-31 | 2018-12-19 | Ospedale San Raffaele Srl | TCR and peptides |
| EP3884056A1 (en) * | 2018-11-20 | 2021-09-29 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Recombinant vectors suitable for the treatment of ipex syndrome |
| WO2020118069A2 (en) | 2018-12-06 | 2020-06-11 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Use of lentiviral vectors expressing factor ix |
| CN115279896A (zh) | 2019-09-30 | 2022-11-01 | 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 | 慢病毒载体配制品 |
| EP3808766A1 (en) | 2019-10-15 | 2021-04-21 | Sangamo Therapeutics France | Chimeric antigen receptor specific for interleukin-23 receptor |
| CA3168089A1 (en) * | 2020-02-13 | 2021-08-19 | Rosa Bacchetta | Crispr-based foxp3 gene engineered t cells and hematopoietic stem cell precursors to treat ipex syndrome patients |
| CA3172120A1 (en) | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Inserm (Institut De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Chimeric antigen receptor specific for human cd45rc and uses thereof |
| IL299333A (en) | 2020-06-24 | 2023-02-01 | Bioverativ Therapeutics Inc | Methods for the purification of viral vectors |
| AU2021320902A1 (en) | 2020-08-07 | 2023-04-06 | Spacecraft Seven, Llc | Plakophilin-2 (PKP2) gene therapy using AAV vector |
| IL300445A (en) | 2020-08-23 | 2023-04-01 | Bioverativ Therapeutics Inc | A baculovirus system adapted to improve the production of closed-end DNA (cadna) |
| CN113106091B (zh) * | 2021-03-04 | 2022-08-16 | 杭州师范大学 | 一种植物叶片高表达双向启动子及其应用 |
| IL310997A (en) | 2021-08-23 | 2024-04-01 | Bioverativ Therapeutics Inc | Factor VIII gene optimization |
| WO2023028440A2 (en) | 2021-08-23 | 2023-03-02 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Baculovirus expression system |
| WO2023035002A1 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Mog-binding proteins and uses thereof |
| CA3232988A1 (en) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Nucleic acids encoding factor viii polypeptides with reduced immunogenicity |
| KR102632204B1 (ko) * | 2022-03-24 | 2024-02-02 | (주)셀레브레인 | 신규 재조합 벡터 및 이의 용도 |
| WO2023182870A1 (ko) * | 2022-03-24 | 2023-09-28 | (주)셀레브레인 | 신규 재조합 벡터 및 이의 용도 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6013516A (en) | 1995-10-06 | 2000-01-11 | The Salk Institute For Biological Studies | Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells |
| US6136597A (en) * | 1997-09-18 | 2000-10-24 | The Salk Institute For Biological Studies | RNA export element |
| CA2314683A1 (en) | 1997-12-12 | 1999-06-24 | Luigi Naldini | Therapeutic use of lentiviral vectors |
| CN1281512A (zh) | 1997-12-12 | 2001-01-24 | 昂尼克斯药物公司 | p53+肿瘤细胞的选择性杀伤和诊断 |
| JP2002530070A (ja) | 1998-11-13 | 2002-09-17 | セル ジェネシス インコーポレイテッド | エンベロープ欠損組換えウイルスについての感度のよいスクリーニング系。 |
| CA2803417A1 (en) | 1998-11-13 | 2000-05-25 | Gbp Ip, Llc | Selection system for generating efficient packaging cells for lentiviral vectors |
| WO2000066769A2 (en) | 1999-04-30 | 2000-11-09 | Advance Sentry Corporation | System and method for screening of nasopharyngeal carcinoma |
| US6630324B1 (en) * | 1999-07-29 | 2003-10-07 | Baylor College Of Medicine | Aldehyde reductase bidirectional promoter and its use |
| US6780639B1 (en) * | 1999-08-24 | 2004-08-24 | Universite Libre De Bruxelles | Antibiotic inducible/repressible genetic construct for gene therapy or gene immunization |
| AU2001278430A1 (en) | 2000-05-22 | 2001-12-03 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Systemic and cardiovascular transduction with lentiviral vectors |
| JP2003033179A (ja) * | 2001-07-05 | 2003-02-04 | Asahi Kasei Corp | 可逆的遺伝子導入ベクター |
| EP1497439B1 (de) * | 2002-04-15 | 2006-09-06 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf | Rekombinante virale vektoren zur tetracyclinregulierbaren genexpression |
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