ES2348277T3 - Vectores lentivíricos para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas. - Google Patents

Abstract

Genoma de vector lentivírico que comprende tres o más secuencias de nucleótidos de interés ligadas funcionalmente por dos o más sitios internos de entrada ribosómica, en el que las secuencias de nucleótidos de interés codifican una proteína seleccionada de entre el grupo siguiente: tirosina hidroxilasa, GTP-ciclohidrolasa I, aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa y transportador vesicular de monoaminas de tipo

Description

Vectores lentivíricos para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas.

La presente invención se refiere a un sistema de vector. En particular, la presente invención se refiere a un sistema de vector lentivírico destinado al tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

Antecedentes Enfermedad de Parkinson

La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la pérdida de la ruta nigroestriatal. Aunque la causa de la enfermedad de Parkinson es desconocida, se asocia a la muerte progresiva de las neuronas mesencefálicas dopaminérgicas (positivas para tirosina hidroxilasa (TH)), induciendo alteraciones motoras. Los síntomas característicos de la enfermedad de Parkinson aparecen tras la degeneración de por lo menos 70% de las neuronas nigroestriatales TH-positivas.

En la actualidad no existe una cura satisfactoria para la enfermedad de Parkinson. El tratamiento sintomático de las alteraciones motoras asociadas a la enfermedad implica la administración oral de dihidroxifenilalanina (L-DOPA). La L-DOPA resulta transportada a través de la barrera hematocefálica y se convierte en dopamina, parcialmente por parte de neuronas dopaminérgicas residuales, conduciendo a una mejora sustancial de la función motora. Sin embargo, tras unos cuantos años, progresa la degeneración de las neuronas dopaminérgicas, se reducen los efectos de la L-DOPA y reaparecen los efectos secundarios. Por lo tanto, resulta necesaria una terapia mejor para la enfermedad de Parkinson.

Una estrategia alternativa para la terapia es el injerto neural, que se basa en la idea de que la dopamina suministrada por las células implantadas en el cuerpo estriado puede sustituir la pérdida de células nigroestriatales. Los ensayos clínicos han demostrado que las neuronas mesencefálicas TH-positivas obtenidas de cadáveres de embrión humano (fetos abortados) pueden sobrevivir y funcionar en los cerebros de pacientes con la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, la recuperación funcional sólo ha sido parcial, y la eficacia y reproducibilidad del procedimiento son limitadas. Además, existen cuestiones éticas, prácticas y de seguridad asociadas a la utilización de tejidos derivados de fetos humanos abortados. Además, las grandes cantidades de tejido necesarias para producir un efecto terapéutico probablemente demostrarán ser prohibitivas. Se han realizado algunos intentos para utilizar neuronas TH-positivas de otras especies (con el fin de evitar algunos de los problemas éticos y prácticos). Sin embargo, el xenotrasplante requiere el tratamiento inmunosupresor y también resulta controvertido debido a, por ejemplo, el posible riesgo de transferencia entre especies de agentes infecciosos. Otra desventaja es que, en los protocolos actuales de injertación, no sobreviven más de 5% a 20% del número esperado de neuronas TH-positivas injertadas. Con el fin de desarrollar un protocolo de trasplante practicable y eficaz, resulta necesaria una fuente alternativa de neuronas TH-positivas.

Una estrategia adicional para la terapia es la terapia génica. Se ha sugerido que la terapia génica podría utilizarse en la enfermedad de Parkinson de dos maneras: sustituyendo la dopamina en el cuerpo estriado afectado, mediante la introducción de los enzimas responsables de la síntesis de L-DOPA o de dopamina (por ejemplo tirosina hidroxilasa), e introduciendo moléculas neuroprotectoras potenciales que podrían evitar la muerte de las neuronas TH-positivas o estimular la regeneración y recuperación funcional en el sistema nigroestriatal dañado (Dunnet S.B. y Björklund A., Nature 399:A32-A39, 1999).

In vivo, la dopamina es sintetizada a partir de la tirosina por dos enzimas: la tirosina hidroxilasa (TH) y la aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa (AADC). Se ha demostrado que la enfermedad de Parkinson responde al tratamiento que facilita la transmisión dopaminérgica en el núcleo caudado-putamen. En animales experimentales, las células modificadas genéticamente que expresan tirosina hidroxilasa y que de esta manera sintetizan L-DOPA, inducen la recuperación comportamental en modelos de roedor de PD (Wolff et al., PNAS (USA) 86:9011-14, 1989; Freed et al., Arch. Neurol. 47:505-12, 1990; Jiao et al., Nature 262:4505, 1993).

La actividad funcional de la tirosina hidroxilasa depende de la disponibilidad de su cofactor tetrahidrobiopterina (BH_{4}). El nivel de cofactor puede resultar insuficiente en el cuerpo estriado denervado, y por lo tanto se cree que también podría resultar necesaria la transducción de la GTP ciclohidrolasa I, el enzima que cataliza la etapa limitante de la velocidad en la ruta de síntesis de BH_{4}, para obtener niveles suficientes de producción de L-DOPA in vivo (Bencsics et al., J. Neurosci. 16:4449-4456, 1996; Leff et al., Exp. Neurol. 151:249-264, 1998).

Aunque ya se han propuesto estrategias de terapia génica in vivo y ex vivo para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (Dunnet y Björklund, supra, 1999; Raymon et al., Exp. Neurol. 144:82-91, 1997; Kang, Mov. Dis. 13:59-72, 1998), la limitada eficiencia de la transferencia génica y de la expresión en las células diana ha dificultado un avance significativo de esta tecnología. Un problema a este respecto es que las células diana habitualmente son células que no se dividen (es decir, neuronas), que son notoriamente recalcitrantes a la transducción.

Expresión de más de una proteína

El documento WO nº 98/18934 se refiere a una secuencia polinucléotida para la utilización en la terapia génica, comprendiendo dicha secuencia polinucléotida dos o más genes terapéuticos ligados funcionalmente a un promotor, y que codifica un producto de proteína de fusión de los genes terapéuticos. Lo expuesto anteriormente proporciona un modo de expresar dos genes terapéuticos a partir de un único "gen quimérico". En una forma de realización preferida, la secuencia polinucleótida es capaz de codificar una proteína de fusión que comprende tirosina hidroxilasa y DOPA descarboxilasa en el orden TH-DD o DD-TH, unidos mediante una molécula conectora flexible.

Tal como se ha expuesto en el documento WO nº 98/18924, entre los sistemas de transferencia génica, los vectores retrovíricos resultan sustancialmente prometedores para la terapia génica. Estos sistemas pueden transferir genes eficientemente y están emergiendo nuevos vectores que resultan particularmente útiles para la transferencia génica a células cerebrales (Naldini et al., Science 272:263, 1996). Sin embargo, resulta evidente a partir de la literatura que los vectores retrovíricos consiguen los títulos más altos y las propiedades de expresión génica más potentes en el caso de que se mantengan en un estado genéticamente simple (patente PCT nº GB96/01230; Bowtell et al., J. Virol. 62:2464, 1988; Correll et al., Blood 84:1812, 1994; Emerman y Temin, Cell 39:459, 1984; Ghattas et al., Mol. Cell. Biol. 11:5848, 1991; Hantzopoulos et al., PNAS 86:3519, 1989; Hatzoglou et al., J. Biol. Chem. 266:8416, 1991; Hatzoglou et al., J. Biol. Chem. 263:17798, 1988; Li et al., Hum. Gen. Ther. 3:381, 1992; McLachlin et al., Virol. 195:1, 1993; Overell et al., Mol. Cell. Biol. 8:1803, 1988; Scharfman et al., PNAS 88:4626, 1991; Vile et al., Gene Ther. 1:307, 1994; Xu et al., Virol. 171:331, 1989; Yee et al., PNAS 84:5197, 1987). Lo expuesto anteriormente implica utilizar una única unidad de transcripción dentro del genoma del vector y organizar la expresión génica apropiada a partir de secuencias dentro del 5'LTR o a partir de un promotor interno utilizando un LTR autoinactivante, o utilizando la tecnología de eliminación de intrones descrita en el documento WO nº 99/15683.

Según el documento WO nº 98/18934, en el caso de que exista una necesidad de expresar dos proteínas a partir de un único vector retrovírico, resulta preferido expresarlas en forma de proteína de fusión (codificada por una única secuencia de nucleótidos) que utilizar un sitio interno de entrada ribosómica (IRES) para iniciar la traducción de la segunda secuencia codificante en un mensaje policistrónico. Esto se debe a que, según el documento WO nº 98/18934, la eficiencia de un IRES con frecuencia es baja y dependiente del tejido, provocando que la estrategia resulte no deseable si se busca maximizar la eficiencia de la conversión metabólica de, por ejemplo, tirosina hasta dopamina.

En el caso de que se localice entre marcos de lectura abiertos en un ARN, un IRES permite la traducción del marco de lectura abierto situado cadena abajo mediante la estimulación de la entrada del ribosoma en un elemento IRES, seguido del inicio cadena abajo de la traducción. Se ha investigado la utilización de elementos IRES en vectores retrovíricos (ver, por ejemplo, el documento WO nº 93/0314), pero la expresión del ADNc situado cadena abajo del IRES se ha encontrado con frecuencia que resulta ineficiente. Esto puede deberse a la competencia por los ribosomas y por otros factores celulares. Por lo tanto, se esperaría que la eficiencia del inicio de la traducción se redujese a medida que se incrementa el número de elementos IRES.

Expresión de genes heterólogos de gran tamaño

Aunque el concepto de utilización de vectores víricos para transferir un gen heterólogo a una célula receptora es bien conocido (Verma y Somia, Nature 389:239-242, 1997), se encuentra ampliamente aceptado que existen límites al tamaño del gen heterólogo que puede transducirse con éxito (ver, por ejemplo, la página 446, capítulo 9 de Coffin et al., "Retrovirus", Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1997). En el caso de que la incorporación del gen heterólogo y elementos reguladores asociados incremente drásticamente el tamaño del genoma vírico, existe un riesgo significativo de que ya no sea capaz de ser empaquetado con éxito, o por lo menos de que la eficiencia de empaquetamiento se vea reducida significativamente.

A pesar del aparente prejuicio de la técnica, en el contexto de la presente invención se ha demostrado que los vectores lentivíricos que expresan un casete bicistrónico (codificante de TH y de GTP-CH1) e incluso de un casete tricistrónico (codificante de TH, AADC y GTP-CH1) pueden proporcionar la expresión de los enzimas apropiados en células heterólogas en cultivo e in vivo. La incorporación del casete tricistrónico en el vector lentivírico provoca un incremento del tamaño del genoma de ARN de aproximadamente 10% a 30% (respecto al genoma de ARN de tipo salvaje) pero inesperadamente, la eficiencia de la transferencia génica no resulta afectada marcadamente. Las eficiencias de integración son comparables y se muestra una transferencia génica eficiente a las neuronas. Además, se ha demostrado que dichos vectores pueden utilizarse para incrementar los niveles de determinadas catecolaminas en tejido denervado y, por lo tanto, corrigen modelos de roedor y de primate de la enfermedad de Parkinson.

Sumario de la invención

El primer aspecto de la invención se refiere a genomas de vector vírico. En una primera forma de realización según el primer aspecto de la invención se proporciona un genoma de vector lentivírico que comprende tres o más NOI (secuencias de nucleótidos de interés) funcionalmente ligadas por dos o más sitios internos de entrada ribosómica, en el que los NOI codifican una proteína seleccionada de entre el grupo siguiente: tirosina hidroxilasa, GTP-ciclohidrolasa I, aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa y transportador vesicular de monoaminas de tipo 2.

El segundo aspecto de la invención se refiere a sistemas de vector.

En una primera forma de realización del segundo aspecto de la invención se proporciona un sistema de vector que comprende un genoma según el primer aspecto de la invención.

Según aspectos adicionales de la invención se proporciona:

-

un método para producir una partícula lentivírica, que comprende introducir dicho genoma vírico en una célula productora,

-

una partícula vírica producida por dicho sistema o método,

-

una composición farmacéutica que comprende dicho genoma, sistema o partícula,

-

la utilización de dicho genoma, sistema o partícula en la preparación de una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir una enfermedad, y

-

una célula que ha sido transducida con dicho sistema.

Descripción detallada de la invención

El primer aspecto de la invención se refiere a genomas de vector retrovírico y lentivírico.

Retrovirus

El concepto de utilización de vectores víricos para la terapia génica es bien conocido (Verma y Somia, Nature 389:239-242, 1997).

Existen muchos retrovirus. Para la presente solicitud, el término "retrovirus" incluye: el virus de la leucemia murina (VLM), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la anemia infecciosa equina (VAIE), el virus del tumor mamario de ratón (VTMR), el virus del sarcoma de Rous (VSR), el virus del sarcoma de Fujinami (VS-Fu), el virus de la leucemia murina de Moloney (VLM-Mo), el virus del osteosarcoma murino FBR (VSM FBR), el virus del sarcoma murino de Moloney (VSM-Mo), el virus de la leucemia murina de Abelson (VLM-A), el virus 29 de la mielocitomatosis aviar (MC29), y el virus de la eritroblastosis aviar (VEA) y todos los demás virus de la familia Retroviridae, incluyendo los lentivirus.

Puede encontrarse una lista detallada de retrovirus en Coffin et al. ("Retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1997, editores: J.M. Coffin, S.M. Hughes y H.E. Varmus, páginas 758 a 763).

Los lentivirus también pertenecen a la familia de los retrovirus, pero pueden infectar células que se dividen como células que no se dividen (Lewis et al., EMBO J. 3053-3058, 1992).

El grupo de los lentivirus puede dividirse en "de primates" y "no de primates". Entre los ejemplos de lentivirus de primate se incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el agente causativo del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida humana (SIDA) y el virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS). El grupo de lentivirus no de primates incluye el prototipo de "virus lento" visna/maedi (VMV), así como el virus relacionado de la artritis-encefalitis caprina (VAEC), el virus de la anemia infecciosa equina (VAIE) y el recientemente descrito virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) y el virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB).

Pueden encontrarse detalles de la estructura genómica de algunos lentivirus en la técnica. A título de ejemplo pueden encontrarse detalles sobre VIH y VAIE en la base de datos Genbank del NCBI (es decir, los números de acceso de genomas AF033819 y AF033820, respectivamente). También pueden encontrarse detalles de las variantes de VIH en http://hiv-web.lanl.gov. Pueden encontrarse detalles de las variantes de EIAV en http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Durante el proceso de la infección, un retrovirus inicialmente se une a un receptor específico de superficie celular. Tras entrar en la célula huésped susceptible, el genoma del ARN retrovírico es a continuación copiado a ADN por la transcriptasa inversa codificada en el virus, que es transportada en el interior del virus parental. Este ADN es transportado al núcleo de la célula huésped, en donde posteriormente se integra en el genoma del huésped. En esta etapa, típicamente se denomina provirus. El provirus es estable dentro del cromosoma del huésped durante la división celular y se transcribe al igual que otros genes celulares. El provirus codifica las proteínas y otros factores necesarios para construir más virus, que pueden salir de la célula mediante un proceso en ocasiones denominado "gemación".

Cada genoma retrovírico comprende genes denominados gag, pol y env que codifican proteínas y enzimas del virión. Estos genes se encuentran flanqueados en ambos extremos por regiones denominadas repeticiones terminales largas (LTR). Las LTR son responsables de la integración provírica y de la transcripción. También sirven de secuencias de intensificador-promotor. En otras palabras, las LTR pueden controlar la expresión de los genes víricos. La encapsidación de los ARNs retorvíricos se produce en virtud de una secuencia psi situada en el extremo 5' del genoma vírico.

Los LTR mismos son secuencias idénticas que pueden dividirse en tres elementos, que se denominan U3, R y U5. U3 se deriva de la secuencia única para el extremo 3' del ARN. R se deriva de una secuencia repetida en ambos extremos del ARN, y U5 se deriva de la secuencia única para el extremo 5' del ARN. Los tamaños de los tres elementos pueden variar considerablemente entre diferentes retrovirus.

Para el genoma vírico, el sitio de inicio de transcripción se encuentra en el límite entre U3 y R en la LTR del lado izquierdo y el sitio de adición de poli(A) (terminación) se encuentra en el límite entre R y U5 en la LTR del lado derecho. U3 contiene la mayor parte de los elementos de control transcripcional del provirus, incluyendo el promotor y múltiples secuencias de intensificador que responden a proteínas activadoras de transcripción celulares y, en algunos casos, víricas. Algunos retrovirus presentan uno o más genes cualesquiera de entre los genes siguientes que codifican proteínas implicadas en la regulación de la expresión génica: tat, rev, tax y rex.

Con respecto a los genes estructurales mismos gag, pol y env, gag codifica la proteína estructural interna del virus. La proteína Gag se procesa proteolíticamente en las proteínas maduras MA (matriz), CA (cápside) y NC (nucleocápside). El gen pol codifica la transcriptasa inversa (RT), que contiene ADN polimerasa, ARNasa H asociada e integrasa (IN), que median en la replicación del genoma. El gen env codifica la glucoproteína de superficie (SU) y la proteína transmembranal (TM) del virión, que forman un complejo que interactúa específicamente con proteínas receptoras celulares. Esta interacción conduce finalmente a la infección mediante fusión de la membrana vírica con la membrana celular. Los retrovirus también pueden contener genes "adicionales" que codifican proteínas diferentes de gag, pol y env. Entre los ejemplos de genes adicionales se incluyen, en VIH, uno o más de entre vif, vpr, vpx, vpu, tat, rev y nef. VAIEC presenta, por ejemplo, los genes adicionales S2 y dUTPasa.

Las proteínas codificadas por genes adicionales satisfacen a diversas funciones, algunas de las cuales pueden duplicar una función proporcionada por una proteína celular. En el VAIE, por ejemplo, tat actúa como un activador transcripcional de la LTR vírica. Se une a una estructura secundaria de tallo-bucle de ARN denominada TAR. Rev regula y coordina la expresión de los genes víricos mediante elementos sensibles a rev (RRE). Los mecanismos de acción de dichas dos proteínas se cree que son ampliamente similares a mecanismos análogos en los virus de primate. La función de S2 es desconocida. Además, se ha identificado una proteína de VAIE, Ttm, que se encuentra codificada por el primer exón de tat empalmado con la secuencia codificante env al inicio de la proteína trans-
membranal.

Sistemas de administración

Se han propuesto sistemas de vector retrovírico como sistema de administración para, inter alia, la transferencia de un NOI a uno o más sitios de interés. La transferencia puede producirse in vitro, ex vivo, in vivo o en combinaciones de los mismos. Los sistemas de vector retrovírico incluso han sido explotados para estudiar diversos aspectos del ciclo vital de los retrovirus, incluyendo el uso de receptores, la transcripción inversa y el empaquetamiento del ARN (revisados por Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:1-24, 1992).

Una partícula de vector retrovírico recombinante es capaz de transducir una célula receptora con un NOI. Tras la introducción en la célula, el genoma de ARN de la partícula de vector se transcribe inversamente en ADN y se integra en el ADN de la célula receptora.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "genoma vírico" se refiere tanto al constructo de ARN presente en la partícula de vector retrovírico como al constructo de ADN integrado. La expresión también comprende un constructo de ADN separado o aislado capaz de codificar dicho genoma de ARN. Un genoma retrovírico o lentivírico debería comprender por lo menos una parte componente derivable de un retrovirus o de un lentivirus. El término "derivable" se utiliza en su sentido normal, haciendo referencia a una secuencia de nucleótidos o a una parte de la misma que no se obtiene necesariamente de un virus, tal como de un lentivirus, sino que podría derivarse a partir del mismo. A título de ejemplo, la secuencia puede prepararse sintéticamente o mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante. Preferentemente, el genoma comprende una región psi (o un componente análogo que es capaz de provocar la encapsidación).

El genoma del vector vírico preferentemente es "defectuoso en replicación", refiriéndose a que el genoma no comprende por sí solo suficiente información genética para permitir la replicación independiente y para producir partículas víricas infecciosas dentro de la célula receptora. En una forma de realización preferida, el genoma no presenta un gen env, gag o pol funcional.

El genoma del vector vírico puede comprender algunas o la totalidad de las repeticiones terminales largas (LTR). Preferentemente, el genoma comprende por lo menos parte de las LTR o una secuencia análoga que es capaz de mediar en la integración provírica y en la transcripción. La secuencia también puede comprender o actuar como secuencia de intensificador-promotor.

El genoma del vector vírico según el primer aspecto de la invención puede proporcionarse en forma de un kit de partes. Por ejemplo, el kit puede comprender: (i) uno o más plásmidos que contienen los NOI y la secuencia o secuencias de IRES, e (ii) un constructo de genoma retrovírico con sitios adecuados de reconocimiento de enzimas de restricción para la clonación de los NOI e IRE o IREs en el genoma vírico.

Es conocido que la expresión separada de los componentes requerida para producir una partícula de vector retrovírico en secuencias de ADN separadas cointroducidas en la misma célula rendirá partículas retrovíricas que portan genomas retrovíricos defectuosos que incluyen genes terapéuticos (por ejemplo revisados por Miller, 1992). Esta célula se denomina célula productora (ver posteriormente).

Existen dos procedimientos comunes para generar células productoras. En uno, las secuencias codificantes de las proteínas retrovíricas Gag, Pol y Env se introducen en la célula y se integran establemente en el genoma celular; se produce una línea celular estable que se denomina línea celular de empaquetamiento. La línea celular de empaquetamiento produce las proteínas necesarias para empaquetar el ARN retrovírico pero no puede llevar a la encapsidación debido a la falta de una región psi. Sin embargo, al introducir un genoma de vector según el primer aspecto de la invención (que presenta una región psi) en la línea celular de empaquetamiento, las proteínas ayudantes pueden empaquetar el ARN del vector recombinante psi-positivo para producir el reservorio de virus recombinante. Este reservorio puede utilizarse para transducir el NOI en las células receptoras. El virus recombinante cuyo genoma no presenta todos los genes necesarios para producir proteínas víricas únicamente puede infectar una vez y no puede propagarse. Por lo tanto, se introduce el NOI en el genoma de la célula huésped sin generar retrovirus potencialmente dañinos. Se presenta un resumen de las líneas de empaquetamiento disponibles en "Retroviruses" (Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1997; editores: J.M. Coffin, S.M. Hughes, H.E. Varmus, página 449).

La presente invención también proporciona una línea celular de empaquetamiento que comprende un genoma de vector vírico según el primer aspecto de la invención. Por ejemplo, la línea celular de empaquetamiento puede transducirse con un sistema de vector vírico que comprende el genoma o que ha sido transfectado con un plásmido que porta un constructo de ADN capaz de codificar el genoma de ARN. La presente invención también proporciona una partícula de vector retrovírico (o lentivírico) producida por dicha célula.

El segundo enfoque es introducir las tres secuencias diferentes de ADN que resultan necesarias para producir una partícula de vector retrovírico, es decir las secuencias codificantes env, las secuencias codificantes gag-pol y el genoma retrovírico defectuoso que contiene uno o más NOI en la célula, simultáneamente mediante transfección transitoria, y el procedimiento se denomina triple transfección transitoria (Landau y Littman 1992; Pear et al. 1993). El procedimiento de triple transfección ha sido optimizado (Soneoka et al. 1995; Finer et al. 1994). El documento WO nº 94/29438 describe la producción de células productoras in vitro utilizado dicho método de transfección transitoria de múltiples ADN.

Los componentes del sistema vírico que resultan necesarios para complementar el genoma del vector pueden encontrarse presentes en uno o más "plásmidos productores" para transfectarse a células.

La presente invención también proporciona un sistema de vector, que comprende:

(i)

un genoma vírico según el primer aspecto de la invención,

(ii)

una secuencia de nucleótidos codificante de proteínas gag y pol lentivíricas,

(iii)

secuencias de nucleótidos codificantes de otros componentes de empaquetamiento vírico esenciales no codificados por la secuencia de nucleótidos de ii). En una forma de realización preferida, la secuencia de nucleótidos de (iii) es capaz de codificar una proteína de env. La presente invención también proporciona una célula transfectada con dicho sistema de vector y una partícula de vector retrovírico producida por dicha célula. Preferentemente, la secuencia de gag-pol de codones optimizados para la utilización en la célula productora particular (ver a continuación).

La proteína de env codificada por la secuencia de nucleótidos de iii) puede ser una proteína de env retrovírica o lentivírica homóloga. Alternativamente, puede ser un env heterólogo, o un env de un virus no retrovírico o de un lentivirus (ver a continuación, en la sección titulada "Seudotipado").

La expresión "sistema de vector vírico" se utiliza de manera general para referirse a un kit de partes que puede utilizarse en combinación con otros componentes necesarios para la producción de partículas víricas para producir partículas víricas en células huésped. Por ejemplo, el genoma del vector retrovírico puede no presentar uno o más de los genes necesarios para la replicación vírica. Éste puede combinarse en un kit con una secuencia o secuencias de nucleótidos complementarios adicionales, por ejemplo en uno o más plásmidos productores. Mediante la cotransfección del genoma conjuntamente con el plásmido o plásmidos productores, deben proporcionarse los componentes necesarios para la producción de partículas víricas infecciosas.

Alternativamente, la secuencia o secuencias de nucleótidos complementarias pueden encontrarse presentes establemente dentro de una línea celular de empaquetamiento que se incluye en el kit.

Preferentemente, el sistema de vector retrovírico de la presente invención es un sistema de vector autoinactivante (SIN).

A título de ejemplo, se han construido sistemas de vector retrovírico autoinactivantes mediante deleción de los intensificadores transcripcionales o de los intensificadores y promotor en la región U3 de la LTR 3'. Tras una ronda de transcripción inversa e integración del vector, se copian estos cambios en las LTR tanto 5' como 3', produciendo un provirus transcripcionalmente inactivo. Sin embargo, cualquier promotor o promotores situados dentro de las LTR en dichos vectores seguirán siendo transcripcionalmente activos. Se ha utilizado esta estrategia para eliminar efectos de los intensificadores y promotores en las LTR víricas sobre la transcripción de genes internos. Entre dichos efectos se incluyen el incremento o la supresión de la transcripción. Esta estrategia también puede utilizarse para eliminar la transcripción cadena abajo a partir de la LTR 3' en ADN genómico. Lo anterior resulta especialmente interesante en la terapia génica en el ser humano, en donde puede resultar importante para evitar la activación accidental de un oncogén endógeno (Yu et al., PNAS 83:3194-98, 1986; Marty et al., Biochimie 72:885-7, 1990; Naviaux et al., J. Virol.
70:5701-5, 1996; Iwakuma et al., Virol. 261:120-32, 1999; Deglon et al., Human Gene Therapy 11:179-90, 2000).

Preferentemente, se utiliza un mecanismo asistido por recombinasa que facilita la producción de vectores lentivíricos regulados y de título elevado a partir de las células productoras de la presente invención.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sistema asistido por recombinasa" incluye, aunque sin limitación, un sistema que utiliza la recombinasa Cre/sitio de reconocimiento loxP del bacteriófago P1 o la recombinasa FLP sitio-específica de S. cerevisiae que cataliza sucesos de recombinación entre dianas de reconocimiento de FLP de 34 pb (FRTs).

La FLP recombinasa sitio-específica de S. cerevisiae que cataliza sucesos de recombinación entre dianas de reconocimiento de FLP de 34 pb (FRTs) ha sido configurada en constructos de ADN con el fin de generar líneas celulares productoras de nivel elevado utilizando sucesos de recombinación asistidos por recombinasa (Karreman et al., NAR 24:1616-1624, 1996). Se ha desarrollado un sistema similar utilizando la recombinasa Cre/sitios de reconocimiento loxP del bacteriófago P1 (Vanin et al., J. Virol. 71:7820-7826, 1997). Éste ha sido configurado en un genoma lentivírico de manera que se generasen líneas celulares productoras lentivíricas de título elevado.

Mediante la utilización de líneas celulares productoras/de empaquetamiento, resulta posible propagar y aislar cantidades de partículas de vector retrovírico (por ejemplo para preparar títulos adecuados de las partículas de vector retrovírico) para la transducción posterior de, por ejemplo, un sitio de interés (tal como tejido cerebral adulto). Las líneas celulares productoras habitualmente son mejores para la producción a gran escala de partículas de vector.

La transfección transitoria presenta numerosas ventajas sobre el método de la célula de empaquetamiento. A este respecto, la transfección transitoria evita el tiempo más prolongado necesario para generar líneas celulares productoras de vector estable y se utiliza en el caso de que el genoma del vector o los componentes del empaquetamiento retrovírico resulten tóxicos para las células. En el caso de que el genoma del vector codifique genes tóxicos o genes que interfieren con la replicación de la célula huésped, tal como inhibidores del ciclo celular o genes que inducen apoptosis, puede resultar difícil generar líneas celulares productoras de vector estables, aunque puede utilizarse la transfección transitoria para producir el vector antes de que mueran las células. Además, se han desarrollado líneas celulares utilizando la infección transitoria que producen niveles de título de vector que son comparables a los niveles obtenidos de líneas celulares productoras de vector estables (Pear et al., PNAS 90:8392-8396, 1993).

Las células productoras/células empaquetadoras pueden ser de cualquier tipo celular adecuado. Las células productoras generalmente son células de mamífero pero pueden ser, por ejemplo, células de insecto.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula productora" o "célula productora de vector" se refiere a una célula que contiene todos los elementos necesarios para la producción de partículas de vector retrovírico.

Preferentemente, la célula productora puede obtenerse a partir de una línea celular productora estable.

Preferentemente, la célula productora es obtenible a partir de una línea celular productora estable derivada.

Preferentemente, la célula productora es obtenible a partir de una línea celular productora derivada.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "línea celular productora derivada" es una línea celular productora transducida que ha sido cribada y seleccionada para la expresión elevada de un gen marcador. Dichas líneas celulares dan soporte a un nivel elevado de expresión a partir del genoma retrovírico. La expresión "línea derivada de células productoras" se utiliza intercambiablemente con la expresión "línea derivada estable de células productoras" y la expresión "línea estable de células productoras".

Preferentemente, la línea derivada de células productoras comprende de manera no limitativa una célula productora retrovírica y/o lentivírica.

Preferentemente, la línea derivada de células productoras es una línea de células productoras de VIH o de VAIE, más preferentemente una línea de células productoras de VAIE.

Preferentemente, todas las secuencias de proteína de cubierta, y secuencias de nucleocápside se encuentran establemente integradas en la célula productora y/o de empaquetamiento. Sin embargo, también podría existir una o más de dichas secuencias en forma episómica y podría producirse la expresión a partir del episoma.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula de empaquetamiento" se refiere a una célula que contiene aquellos elementos necesarios para la producción de un virus recombinante infeccioso que no presenta el genoma de ARN. Típicamente, dichas células de empaquetamiento contienen uno o más plásmidos productores que son capaces de expresar proteínas estructurales víricas (tales como gag-pol y env de codones optimizados) pero que no contienen una señal de empaquetamiento.

La expresión "señal de empaquetamiento", que se denomina intercambiablemente "secuencia de empaquetamiento" o "psi" se utiliza en referencia a la secuencia no codificante de acción en cis necesaria para la encapsidación de las cadenas de ARN retrovírico durante la formación de las partículas víricas. En VIH-1, esta secuencia ha sido localizada en loci que se extienden desde cadena arriba del sitio donador de empalme (SD) principal y por lo menos el codón de inicio de gag.

Las líneas celulares de empaquetamiento adecuadas para la utilización con los constructos de vector anteriormente indicados pueden prepararse fácilmente (ver también el documento WO nº 92/05266) y utilizarse para crear líneas celulares productoras para la producción de partículas de vector retrovírico. Tal como ya se ha mencionado, se proporciona un resumen de las líneas de empaquetamiento disponibles en "Retroviruses" (supra).

También tal como se ha expuesto anteriormente, se ha encontrado que algunas líneas celulares de empaquetamiento simples, que comprenden un provirus en el que se ha delecionado la señal de empaquetamiento, conducen a la producción rápida de virus de replicación competente no deseables mediante recombinación. Con el fin de mejorar la seguridad, se han producido líneas celulares de segunda generación en las que la LTR 3' del provirus se ha delecionado. En dichas células, resultarían necesarias dos recombinaciones para producir un virus de tipo salvaje. Una mejora adicional implica la introducción de los genes gag-pol y el gen env en constructos separados, que son las líneas celulares de empaquetamiento denominadas de tercera generación. Estos constructos se introducen secuencialmente para evitar la recombinación durante la transfección.

Preferentemente, las líneas celulares de empaquetamiento son líneas celulares de empaquetamiento de segunda generación.

Preferentemente, las líneas celulares de empaquetamiento son líneas celulares de empaquetamiento de tercera generación.

En estas líneas celulares de división en constructos, de tercera generación, puede conseguirse una reducción adicional de la recombinación mediante la modificación de los codones. Esta técnica, basada en la redundancia del código genético, está destinada a reducir la homología entre los constructos separados, por ejemplo entre las regiones de solapamiento en los marcos de lectura abiertos de gag-pol y de env.

Las líneas celulares de empaquetamiento resultan útiles para proporcionar los productos génicos necesarios para encapsidar y proporcionar una proteína membranal para una producción de título elevado de partículas de vector. La célula de empaquetamiento puede ser una célula cultivada in vitro, tal como una línea celular de cultivo de tejidos. Entre las líneas celulares adecuadas se incluyen, aunque sin limitación, células de mamífero tales como las líneas celulares derivadas de fibroblastos murinos o las líneas celulares humanas. Preferentemente, la línea celular de empaquetamiento es una línea celular de primate o humana, tal como, por ejemplo, HEK293, 293-T, TE671 o HT1080.

Alternativamente, la célula de empaquetamiento puede ser una célula derivada del individuo que debe tratarse, tal como un monocito, macrófago, célula sanguínea o fibroblasto. La célula puede aislarse de un individuo y los componentes de empaquetamiento y de vector administrarse ex vivo, seguido de la nueva administración de la células de empaquetamiento autólogas.

Resulta altamente deseable utilizar preparaciones de virus de título elevado en aplicaciones tanto experimentales como prácticas. Entre las técnicas para incrementar el título vírico se incluyen la utilización de una señal de empaquetamiento psi^{+}, tal como se ha comentado anteriormente, y la concentración de reservorios víricos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "título elevado" se refiere a una cantidad efectiva de un vector o partícula retrovírica que es capaz de transducir un sitio diana, tal como una célula.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un vector o partícula de vector regulado retrovírico o lentivírico que resulta suficiente para inducir la expresión de los NOI en un sitio diana.

Una preparación vírica de título elevado para una célula productora/de empaquetamiento habitualmente presenta del orden de 10^{5} a 10^{7} partículas retrovíricas por ml. Para la transducción en tejidos, tales como el cerebro, resulta necesario utilizar volúmenes muy pequeños, de manera que se concentra la preparación vírica mediante ultracentrifugación. La preparación resultante debería presentar por lo menos 10^{8} u.t./ml, preferentemente entre 10^{8} y 10^{9} u.t./ml, más preferentemente por lo menos 10^{9} u.t./ml (el título se expresa en unidades de transducción por ml (u.t./ml) según titulación realizada en una línea celular D17 estándar, ver el Ejemplo 9). Pueden utilizarse otros métodos de concentración, tales como la ultrafiltración o la unión a una matriz y la elución respecto de la misma).

Los productos de expresión codificados por los NOI pueden ser proteínas que resultan secretadas de la célula. Alternativamente, los productos de expresión del NOI no se secretan y son activos dentro de la célula. Para algunas aplicaciones resulta preferido que el producto de expresión del NOI demuestre un efecto observador o un efecto observador distante; es decir, la producción del producto de expresión en una célula que conduce a la modulación de células relacionadas adicionales, vecinas o distantes (por ejemplo metastásicas) que presenten un fenotipo común (Zennou
et al., Cell 101:173, 2000; Folleuzi et al., Nat. Genetics 25:217, 2000; Zennou et al., Nat. Biotechnol. 19:446, 2001).

La presencia de una secuencia denominada tracto central de polipurina (cPPT) podría mejorar la eficiencia de la administración génica en células que no se dividen. Este elemento de acción en cis se encuentra situado, por ejemplo, en el elemento de región codificante de polimerasa de VAIE. Preferentemente, el genoma de la presente invención comprende una secuencia cPPT.

Preferentemente, el genoma vírico comprende un elemento regulador postraaduccional. Por ejemplo, el genoma puede comprender un elemento, tal como el elemento regulador postraanscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE) (Zufferey et al., J. Virol. 73:2886, 1999; Barry et al., Human Gene Therapy 12:1103, 2001).

Además, o alternativamente, el genoma vírico puede comprender un intensificador traduccional.

Los NOI pueden ligarse funcionalmente a uno o más elementos de promotor/intensificador. La transcripción de uno o más NOI puede encontrarse bajo el control de LTR víricos o alternativamente, elementos promotores-intensificadores. Preferentemente, el promotor es un promotor vírico fuerte, tal como CMV, o es un promotor constitutivo celular, tal como PGK, beta-actina o EF1alfa. El promotor puede encontrarse regulado o ser específico de un tejido. Dichos promotores pueden seleccionarse de entre genes, tales como neurofilamentos, nestina, parquina, receptores de dopamina y tirosina hidroxilasa. Dichos promotores también pueden contener secuencias supresoras neurorestrictivas, tales como las presentes en el gen del receptor mu-opioide. En una forma de realización preferida, el promotor puede ser específico de células gliales o específico de neuronas. El control de la expresión también puede conseguirse mediante la utilización de sistemas tales como el sistema tetraciclina que activa o desactiva la expresión génica en respuesta a agentes externos (en este caso, tetraciclina o sus análogos).

Seudotipado

En el diseño de los sistemas de vector retrovírico resulta deseable construir partículas con diferentes especificidades de la célula diana para el virus nativo, para permitir la administración de material genético en un rango expandido o alterado de tipos celulares. Una manera de conseguirlo es manipular la proteína de cubierta vírica con el fin de alterar su especificidad. Otro enfoque es introducir una proteína de cubierta heteróloga en la partícula de vector para sustituir o añadirse a la proteína de cubierta nativa del virus.

El término seudotipado se refiere a la incorporación en por lo menos una parte, o sustituyendo una parte, o sustituyendo la totalidad de un gen env de un genoma vírico por un gen env heterólogo, por ejemplo un gen env de otro virus. El seudotipado no es un fenómeno nuevo y pueden encontrarse ejemplos en: los documentos WO 99/61639, WO-A-98/05759, WO-A-98/05754, WO-A-97/17457, WO-A-96/09400, WO-A-91/00047 y Mebatsion et al., Cell 90:841-847, 1997.

En una forma de realización preferida de la presente invención, el sistema de vector se seudotipa con un gen codificante de por lo menos parte de la proteína G del virus de la rabia. En otra forma de realización preferida de la presente invención, el sistema de vector se seudotipa con un gen codificante de por lo menos parte de la proteína
VSV-G.

Se ha demostrado que puede construirse un sistema mínimo de lentivirus a partir de los virus VIH, VIS, VIF y VAIE. Este tipo de sistema no requiere ninguno de los genes adicionales vif, vpr, vpx, vpu, tat, rev y nef para la producción de vector o para la transducción de células que se dividen o de células que no se dividen. También se ha demostrado que puede construirse un sistema de vector mínimo de VAIE que no requiere S2 para la producción de vector ni para la transducción de células que se dividen o de células que no se dividen. La deleción de genes adicionales resulta altamente ventajosa. En primer lugar, permite producir vectores sin los genes asociados a enfermedad en infecciones por lentivirus (por ejemplo VIH). En particular, tat se asocia a enfermedades. En segundo lugar, la deleción de genes adicionales permite que el vector empaquete más ADN heterólogo. En tercer lugar, los genes cuya función es desconocida, tales como S2, se omitan, reduciendo de esta manera el riesgo de provocar efectos no deseados. Se dan a conocer ejemplos de vectores mínimos lentivíricos en los documentos WO nº A-99/32646 y nº A-98/17815.

De esta manera, preferentemente el sistema de administración utilizado en la invención no presenta por lo menos tat y S2 (en el caso de que sea un sistema de vector VAIE) y posiblemente también vif, vpr, vpx, vpu y nef. Más preferentemente, los sistemas de la presente invención tampoco presentan rev. Anteriormente se creía que Rev resultaba esencial en algunos genomas retrovíricos para la producción eficiente de virus. Por ejemplo, en el caso del VIH, se creía que debían incluirse rev y la secuencia RRE. Sin embargo, se ha encontrado que la necesidad de rev y de RRE puede reducirse o eliminarse mediante optimización de codones (ver a continuación) o mediante sustitución por otros sistemas equivalentes funcionales, tales como el sistema de MPMV. Debido a que la expresión de gag-pol con codones optimizados es independiente de REV, puede eliminarse RRE del casete de expresión gag-pol, eliminando de esta manera cualquier potencial de recombinación con cualquier elemento RRE contenido en el genoma del vector.

En una forma de realización preferida, el genoma vírico según el primer aspecto de la invención no presenta el elemento de respuesta a Rev (RRE).

En una forma de realización preferida, el sistema utilizado en la presente invención se basa en un sistema denominado "mínimo" en el que algunos o la totalidad de los genes adicionales ha sido eliminado.

Optimización de codones

La optimización de codones ha sido descrita anteriormente, en la patente WO nº 99/41397. Diferentes células difieren en su utilización de codones particulares. Este sesgo en los codones corresponde a un sesgo en la abundancia relativa de los ARNt particulares en el tipo celular. Mediante la alteración de los codones en la secuencia de manera que se ajusten para corresponder a la abundancia relativa de los ARNt correspondientes, resulta posible incrementar la expresión. Análogamente, resulta posible reducir la expresión seleccionando deliberadamente los codones para los que los ARNt correspondientes es conocido que son infrecuentes en el tipo celular particular. De esta manera, se dispone de un grado adicional de control de la traducción.

Muchos virus, incluyendo VIH y otros lentivirus, utilizan un gran número de codones infrecuentes, y mediante la modificación de ellos para que se correspondan a codones de mamífero utilizados comúnmente, puede conseguirse una expresión incrementada de los componentes de empaquetamiento en las células productoras de mamífero. Son conocidas en la técnica las tablas de uso de codones para las células de mamífero, así como para una diversidad de otros organismos.

La optimización de codones presenta otras ventajas. En virtud de las alteraciones de sus secuencias, se eliminan secuencias de inestabilidad del ARN (INS) de las secuencias de nucleótidos codificantes de los componentes de empaquetamiento de las partículas víricas requeridas para el ensamblaje de las mismas en las células productoras/células de empaquetamiento. Simultáneamente, se conserva la secuencia codificante de la secuencia de aminoácidos para los componentes de empaquetamiento de manera que los componentes víricos codificados por las secuencias sigan siendo los mismos, o por lo menos sean suficientemente similares para que no resulte comprometida la función de los componentes de empaquetamiento. La optimización de codones también supera el requisito de Rev/RRE para la exportación, provocando que las secuencias optimizadas sean independientes de Rev. La optimización de codones también reduce la recombinación homóloga entre diferentes constructos dentro del sistema de vector (por ejemplo entre las regiones de solapamiento en los marcos de lectura abiertos de gag-pol y de env). Por lo tanto, el efecto global de la optimización de codones es un incremento notable del título vírico y una seguridad mejorada.

En una forma de realización, únicamente los codones relacionados con las INS presentan codones optimizados. Sin embargo, en una forma de realización mucho más preferente y práctica, las secuencias presentan codones optimizados en su totalidad, con la excepción de la secuencia que comprende el sitio de desplazamiento de marco.

El gen gag-pol comprende dos marcos de lectura solapantes codificantes de las proteínas gag y pol, respectivamente. La expresión de ambas proteínas depende de un desplazamiento de marco durante la traducción. Este desplazamiento de marco se produce como resultado del "deslizamiento" ribosómico durante la traducción. Se cree que este deslizamiento está causado por lo menos en parte por estructuras secundarias de ADN que obstaculizan el ribosoma. Dichas estructuras secundarias existen cadena abajo del sitio de desplazamiento de marco en el gen gag-pol. Para el VIH, la región de solapamiento se extiende desde el nucleótido 1.222 cadena abajo del inicio de gag (en el que el nucleótido 1 es la A de ATG de gag) al final de gag (nt 1.503). En consecuencia, un fragmento de 281 pb que comprende el sitio de desplazamiento de marco y la región solapante de los dos marcos de lectura preferentemente no presenta codones optimizados. La retención de este fragmento permite una expresión más eficiente de las proteínas de gag-pol.

Para VAIE, el inicio del solapamiento se considera que es nt 1.262 (en donde el nucleótido 1 es la A de ATG de gag). Al final del solapamiento se encuentra en 1.461 pb. Con el fin de garantizar que el sitio de desplazamiento de marco y el solapamiento de gag-pol se conservan, se ha retenido la secuencia de tipo salvaje entre nt 1.156 y 1.465.

Pueden llevarse a cabo derivaciones del uso óptimo de los codones, por ejemplo con el fin de incluir sitios de restricción convenientes, y pueden introducirse cambios conservadores de aminoácidos en las proteínas de gag-pol.

En una forma de realización muy preferida, la optimización de codones se basa en genes de mamífero altamente expresados. Puede modificarse la tercera base, y en ocasiones la segunda y tercera bases.

Debido a la naturaleza degenerada del código genético, se apreciará que el experto en la materia puede conseguir numerosas secuencias de gag-pol. También existen muchas variantes retrovíricas descritas que pueden utilizarse como punto de partida para generar una secuencia de gag-pol de codones optimizados. Los genomas lentivíricos son bastante variables. Por ejemplo, existen muchas cuasi-especies de VIH-1 que todavía son funcionales. Éste también es el caso de VAIE. Estas variantes pueden utilizarse para potenciar partes particulares del procedimiento de transducción. Pueden encontrarse ejemplos de variantes de VIH-1 en http://hiv-web.lanl.gov. Pueden encontrarse detalles de los clones de VAIE en la base de datos del NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

La estrategia para las secuencias de gag-pol de codones optimizados puede utilizarse en relación con cualquier retrovirus. Lo expuesto anteriormente se aplica a todos los lentivirus, incluyendo VAIE, VIF, VIB, VAEC, VMR, VIS, VIH-1 y VIH-2. Además, dicho método podría utilizarse para incrementar la expresión de genes de HTLV-1, HTLV-2, HFV, HSRV y retrovirus endógenos humanos (HERV), MLV y otros retrovirus.

La optimización de codones puede convertir la expresión de gag-pol en independiente de Rev. Con el fin de permitir la utilización de factores anti-rev o RRE en el vector retrovírico, sin embargo, resultaría necesario convertir al sistema de generación de vector vírico en totalmente independiente de Rev/RRE. De esta manera, también debe modificarse el genoma. Esto se consigue mediante la optimización de componentes del genoma del vector. Ventajosamente estas modificaciones también conducen a la producción de un sistema más seguro que no presenta ninguna de las proteínas adicionales tanto en la célula productora como en la célula transducida.

Tal como se ha indicado anteriormente, entre los componentes de empaquetamiento para un vector retrovírico se incluyen productos de expresión de genes gag, pol y env. Además, el empaquetamiento eficiente depende de una secuencia corta de 4 tallos-bucles seguido de una secuencia parcial de gag y env (la "señal de empaquetamiento"). De esta manera, la inclusión de una secuencia gag delecionada en el genoma del vector retrovírico (además de la secuencia gag completa en el constructo de empaquetamiento) optimizará el título de vector. Se informa de que en la actualidad un empaquetamiento eficiente requiere entre 255 y 360 nucleótidos de gag en vectores que todavía conservan secuencias env, o aproximadamente 40 nucleótidos de gag en una combinación particular de mutación de sitio donador de empalme, y deleciones de gag y env. Inesperadamente se ha descubierto que una deleción de la totalidad de los aproximadamente 360 nucleótidos N-terminales en gag conduce a un incremento del título de vector. De esta manera, preferentemente, el genoma del vector retrovírico incluye una secuencia gag que comprende una o más deleciones, más preferentemente la secuencia gag comprende aproximadamente 360 nucleótidos derivables del extremo N-terminal.

NOI

En la presente invención, la NOI (secuencia de nucleótidos de interés) puede ser, por ejemplo, una secuencia de ARN/ADN sintético, una secuencia de ARN/ADN optimizada, una secuencia de ARN/ADN recombinante (es decir, preparada mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante), una secuencia de ADNc o una secuencia parcial de ADN genómico, incluyendo combinaciones de los mismos. Preferentemente, se encuentra en una orientación de sentido. Preferentemente, la secuencia es ADNc, comprende ADNc o se ha transcrito a partir de ADNc.

La NOI o NOI también pueden denominarse en la presente invención "secuencia o secuencias heterólogas", "gen o genes heterólogos" o "transgén o transgenes".

Las NOI en el genoma del vector lentivírico de la invención resultan útiles en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

La NOI puede codificar un enzima implicado en la síntesis o almacenamiento de la dopamina. Por ejemplo, el enzima puede ser uno de los siguientes: tirosina hidroxilasa, GTP-ciclohidrolasa I y/o aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa. Las secuencias de la totalidad de los tres genes se encuentran disponibles: nº de acceso X05290, U19523 y M76180, respectivamente.

Alternativamente, la NOI puede codificar el transportador vesicular de monoaminas de tipo 2 (VMAT2, nº de acceso L23205.1). En una forma de realización preferida, el genoma vírico comprende una NOI codificante la aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa y una NOI codificante de VMAT 2. Dicho genoma puede utilizarse en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, en particular conjuntamente con la administración periférica de L-DOPA.

La NOI puede codificar la totalidad o parte de la proteína de interés ("POI"), o un mutante, homólogo o variante de la misma. Por ejemplo, la NOI puede codificar un fragmento de la POI que sea capaz de funcionar in vivo de una manera análoga a la proteína de tipo salvaje.

En una forma de realización altamente preferente, una de las NOI comprende una forma truncada del gen TH, que no presenta el dominio regulador. Este tipo de NOI evita la inhibición por retroalimentación por parte de la dopamina, que podría limitar la expresión del enzima de longitud completa.

El término "mutante" comprende las POIs que incluyen una o más variaciones de aminoácidos respecto a la secuencia de tipo salvaje. Por ejemplo, un mutante puede comprender una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos. Un mutante puede aparecer naturalmente o ser creado artificialmente (por ejemplo mediante mutagénesis sitio-dirigida).

En la presente memoria, el término "homólogo" se refiere a una entidad que presenta una determinada homología con la NOI, o que codifica una proteína que presenta un grado de homología respecto a la POI. En la presente memoria, el término "homología" puede considerarse equivalente a "identidad".

En el presente contexto, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser por lo menos 75%, 85% ó 90% idéntica, preferentemente por lo menos 95% ó 98% idéntica a la secuencia de la base de datos. Típicamente, los homólogos pueden comprender las mismas secuencias que codifican los sitios activos, etc. que la secuencia de la base de datos. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, residuos aminoácidos que presentan propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención resulta preferido expresar la homología en términos de identidad de secuencia.

Pueden llevarse a cabo comparaciones de homología visualmente, o más habitualmente, con ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.

El % de homología puede calcularse a lo largo de secuencias contiguas, es decir, se alinea una secuencia con la otra secuencia y se compara directamente cada aminoácido en una secuencia con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo cada vez. Lo expuesto anteriormente se denomina alineación "sin huecos". Típicamente, dichas alineaciones sin huecos se llevan a cabo únicamente a lo largo de un número relativamente corto de residuos.

Aunque dicho método es muy simple y consistente, no considera que, por ejemplo en una pareja de secuencias que aparte de lo siguiente son idénticas, una inserción o deleción provocará que los residuos aminoácidos siguientes se encuentren desalineados, resultando potencialmente, de esta manera, en una gran reducción del % de homología al llevar a cabo una alineación global. En consecuencia, la mayoría de métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineaciones óptimas que consideran posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación de homología global. Lo expuesto anteriormente se consigue mediante la inserción de "huecos" en la alineación de secuencias para intentar maximizar la homología local.

Sin embargo, dichos métodos complejos asignan "penalizaciones de hueco" a cada hueco que aparece en la alineación, de manera que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencias con el mínimo número de huecos posible, que refleja un grado de relación más elevado entre las dos secuencias comparadas, alcanzará una puntuación más alta que una con muchos huecos. Típicamente se utilizan "costes de hueco afín" que cargan un coste relativamente alto a la existencia de un hueco, y una penalización más baja para cada residuo posterior en el hueco. Éste es el sistema de puntuación de huecos utilizado más comúnmente. Evidentemente las penalizaciones de hueco elevadas producirán alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de programas de alineación permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, resulta preferido utilizar los valores por defecto al utilizar dichos software para las comparaciones de secuencias. Por ejemplo, al utilizar el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización de hueco por defecto para las secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada
extensión.

Por lo tanto, el cálculo del % máximo de homología en primer lugar requiere la producción de una alineación óptima, considerando las penalizaciones por hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicha alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., Nucleic Acids Research 12:387, 1984). Entre los ejemplos de otros programas que pueden llevar a cabo comparaciones de secuencias se incluyen, aunque sin limitación, el paquete BLAST (ver Ausubel et al., ibid, 1999, capítulo 18), FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 403-410, 1990) y el grupo GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA se encuentran disponibles para búsquedas fuera de línea y en línea (ver Ausubel et al., ibid, 1999, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones resulta preferido utilizar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta, denominada BLAST 2 Sequences, también se encuentra disponible para comparar secuencias de proteína y de nucleótidos (ver FEMS Microbiol. Lett. 174(2):247-50, 1999; FEMS Microbiol. Lett. 177(1):187-8, 1999, y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).

Aunque puede medirse el % final de homología en términos de identidad, el procedimiento de alineación mismo típicamente no se basa en una comparación de la pareja del tipo todo-o-nada. Por el contrario, generalmente se utiliza una matriz de escala de puntuaciones de similitud que asigna puntuaciones a cada comparación de pareja basándose en la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de este tipo de matriz utilizado comúnmente es la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto para el grupo BLAST de programas. Los programas del GCG Wisconsin generalmente utilizan los valores por defecto públicos o una tabla de comparaciones de símbolos personalizados en caso de que se proporcione (ver el manual para el usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones resulta preferido utilizar los valores por defecto públicos para el paquete de GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como en BLOSUM62.

Tras producir el software una alineación óptima, resulta posible calcular el % de homología, preferentemente el % de identidad de secuencia. El software típicamente realiza lo anterior como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

Las secuencias también pueden presentar deleciones, inserciones o sustituciones de residuos aminoácidos que producen un cambio silencioso y que resultan en una sustancia funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácidos deliberadas pueden realizarse basándose en similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos, con la condición de que se conserve la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, entre los aminoácidos de carga negativa se incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; entre los aminoácidos de carga positiva se incluyen lisina y arginina; y entre los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que presentan valores de hidrofilicidad similares se incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.

Pueden realizarse sustituciones conservadoras, por ejemplo según la Tabla a continuación. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma fila en la tercera columna pueden sustituirse mutuamente.

1

La presente invención también comprende una sustitución homóloga (sustitución y reemplazamiento se utilizan ambos en la presente memoria para referirse al intercambio de un residuo aminoácido existente por un residuo alternativo), es decir, la sustitución de igual por igual, tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También puede producirse la sustitución no homóloga, es decir, de una clase de residuo por otra.

Preferentemente, la NOI codifica una única POI o un mutante, homólogo o variante de la misma. En una forma de realización muy preferida, la NOI no codifica una proteína de fusión. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "proteína de fusión" se utiliza en su sentido convencional para referirse a una entidad que comprende dos o más actividades de proteína, unidas entre sí mediante un enlace peptídico para formar una única proteína quimérica. Una proteína de fusión se encuentra codificada por un único polinucleótido controlado por un único promotor.

Sitio interno de entrada ribosómica (IRES)

El genoma vírico según el primer aspecto de la invención comprende dos o más NOI. Con el fin de que se expresen ambas NOI, pueden existir dos o más unidades transcripcionales dentro del genoma del vector, una para cada NOI. Sin embargo, resulta evidente a partir de la literatura que los vectores retrovíricos alcanzan los títulos más altos y las propiedades de expresión génica más potentes en el caso de que se mantengan genéticamente simples (patente PCT nº GB96/01230; Bowtell et al., J. Virol. 62:2464, 1988; Correll et al., Blood 84:1812, 1994; Emerman y Temin, Cell 39:459, 1984; Ghattas et al., Mol. Cell. Biol. 11:5848, 1991; Hantzopoulos et al., PNAS 86:3519, 1989; Hatzoglou et al., J. Biol. Chem. 266:8416, 1991; Hatzoglou et al., J. Biol. Chem. 263:17798, 1988; Li et al., Hum. Gen. Ther. 3:381, 1992; McLachlin et al., Virol. 195:1, 1993; Overell et al., Mol. Cell. Biol. 8:1803, 1988; Scharfman et al., PNAS 88:4626, 1991; Vile et al., Gene Ther. 1:307, 1994; Xu et al., Virol. 171:331, 1989; Yee et al., PNAS 84:5197, 1987) y por lo tanto resulta preferido utilizar un sitio interno de entrada ribosómica (IRES) para iniciar la traducción de la segunda (y posteriores) secuencias codificantes en un mensaje policistrónico (Adam et al., J. Virol. 65:4985, 1991).

La inserción de elementos IRES en vectores retrovíricos es compatible con el ciclo de replicación retrovírico y permite la expresión de múltiples regiones codificantes a partir de un único promotor (Adam et al., supra; Koo et al., Virology 186:669-675, 1992; Chen et al., J. Virol. 67:2142-2148, 1993). Los elementos IRES se encontraron por primera vez en los extremos 5' no traducidos de picornavirus, en los que estimulan la traducción independiente de caperuza de proteínas víricas (Jang et al., Enzyme 44:292-309). En el caso de que se encuentren situados entre marcos abiertos de lectura en un ARN, los elementos IRES permiten la traducción eficiente del marco de lectura abierto cadena abajo mediante la estimulación de la entrada del ribosoma en el elemento IRES, seguido del inicio cadena abajo de la traducción.

Mountford y Smith presentan una revisión de los IRES (TIG 11(5):179-184, mayo de 1995). Se conocen varias secuencias IRES diferentes, incluyendo las del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) (Ghattas I.R. et al., Mol. Cell. Biol. 11:5848-5859, 1991); proteína BiP [Macejak y Sarnow, Nature 353:91, 1991], el gen Antennapedia de Drosophila (exones d y e) [Oh et al., Genes & Development 6:1643-1653, 1991], así como aquellos en el virus de la poliomielitis (VP) [Pelletier y Sonenberg, Nature 334:320-325, 1988; ver también Mountford y Smith, TIG 11:179-184, 1985].

Según el documento WO nº A-97/14809, las secuencias de IRES típicamente se encuentran en la región 5' no codificante de los genes. Además de los presentes en la literatura, pueden encontrarse empíricamente mediante la búsqueda de secuencias genéticas que afectan a la expresión y después determinando si dicha secuencia afecta al ADN (es decir, actúa como promotor o intensificador) o únicamente al ARN (es decir, actúa como una secuencia IRES).

Los elementos IRES de VP, VEMC y del virus de la enfermedad vesicular porcina han sido utilizados anteriormente en vectores retrovíricos (Coffin et al., supra).

El término "TIRES" incluye cualquier secuencia o combinación de secuencias que funciona como IRES o que mejora la función del mismo.

El IRES o los IRES pueden ser de origen vírico (tal como IRES de VEMC, IRES de VP, o secuencias de tipo 2A del virus FMDV) o de origen celular (tal como IRES de FGF2, IRES de NRF, IRES Notch 2 o IRES EIF4).

Para que el IRES sea capaz de iniciar la traducción de cada NOI, debe encontrarse situado entre las NOI o antes de las mismas en el genoma del vector. Por ejemplo, para una secuencia multicistrónica que contiene n NOI, el genoma puede ser de la manera siguiente:

2

Para las secuencias bicistróicas y tricistrónicas, el orden puede ser el siguiente:

3

También pueden utilizarse configuraciones alternativas de IRESs y NOI. Por ejemplo, los transcritos que contienen los IRESs y NOI no es necesario que se encuentren regulados por el mismo promotor.

Un ejemplo de esta ordenación podría ser:

IRES_{1}-NOI_{1}-promotor-NOI_{2}-IRES_{2}-NOI_{3}

En una forma de realización preferida, en cualquier constructo que utilice un casete interno que presente más de un IRES y NOI, los IRES pueden ser de diferentes orígenes, es decir, heterólogos entre sí. Por ejemplo, un IRES puede proceder del VEMC y el otro IRES puede proceder del virus de la poliomielitis.

Otros métodos de expresar múltiples genes a partir de un vector

Aunque los IRES son una manera eficiente de coexpresar múltiples genes a partir de un vector, también resultan útiles otros métodos, y pueden utilizarse solos o conjuntamente con IRES. Entre ellos se incluyen la utilización de múltiples promotores internos en el vector (Overell et al., Mol. Cell. Biol. 8:1803-8, 1988), o la utilización de patrones de corte y empalme alternativos que conducen a múltiples especies de ARN derivadas a partir del único genoma vírico que expresa los diferentes genes. Esta estrategia ha sido utilizada anteriormente por sí sola para dos genes (Cepko et al., Cell 37:1053, 1984).

Células transducidas

La presente patente también da a conocer una célula que ha sido transducida con un sistema de vector que comprende un genoma vírico según el primer aspecto de la invención.

La transducción con el sistema de vector de la presente invención puede proporcionar o incrementar la capacidad de la célula de producir catecolaminas. Puede, por ejemplo, proporcionar o incrementar la capacidad de la célula de convertir la tirosina en L-DOPA y/o la L-DOPA en dopamina. La liberación de las catecolaminas puede medirse mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo mediante la utilización de un detector electroquímico conectado a una celda analítica. Además de las catecolaminas mismas, también pueden detectarse productos secundarios asociados a la liberación de catecolamina (tal como DOPAC, un producto específico de degradación de la dopamina).

La célula puede transducirse in vivo, in vitro o ex vivo. Por ejemplo, en el caso de que la célula sea una célula de un sujeto mamífero, la célula puede extraerse del sujeto y transducirse para la reimplantación en el sujeto (transducción ex vivo). Alternativamente, la célula puede transducirse mediante transferencia génica directa in vivo utilizando el sistema de vector de la presente invención de acuerdo con técnicas estándares (tal como mediante inyección de reservorios de vector que expresan las NOI). En el caso de que la célula sea parte de una línea celular que sea estable en cultivo (es decir, que pueda sobrevivir numerosos pases y que pueda multiplicarse in vitro), puede transducirse in vitro mediante técnicas estándares, por ejemplo mediante exposición de la célula a sobrenadantes víricos que comprenden vectores que expresen las NOI.

La célula puede ser cualquier célula que sea susceptible a la transducción. En el caso de que el sistema de vector sea capaz de transducir células que no se dividen (por ejemplo en el caso de que sea un sistema lentivírico), la célula puede ser una célula que no se divide, tal como una neurona.

La célula transducida preferentemente forma parte de una línea celular neuronal genéticamente modificada. Dicha línea celular puede, por ejemplo, trasplantarse en el cerebro para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

La célula puede, además, ser una célula madre neuronal. Dicha línea celular puede, por ejemplo, trasplantarse en el cerebro para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

La célula puede además ser una célula en el cuerpo estriado de un sujeto, tal como una neurona o una célula glial. La transferencia génica directa in vivo en dicha célula puede, por ejemplo, convertirla en una célula productora de dopamina.

Composiciones farmacéuticas

La presente invención también proporciona la utilización de un genoma de vector retrovírico según se define en el primer aspecto de la invención, para la preparación de una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede utilizarse para el tratamiento de un individuo mediante terapia génica, en la que la composición comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una partícula de vector retrovírico según la presente invención.

La composición farmacéutica puede utilizarse para tratar un sujeto humano o animal. Preferentemente, el sujeto es un sujeto mamífero. Más preferentemente, el sujeto es un ser humano. Típicamente, un médico determinará la dosis real que resulta más adecuada para un sujeto individuo y varía según la edad, el peso y la respuesta del paciente particular.

La composición opcionalmente puede comprender un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. El portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía pretendida de administración y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como portador, excipiente o diluyente, o además de los mismos, uno o más ligantes, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de recubrimiento, agentes solubilizadores cualesquiera que resulten adecuados y otros agentes portadores que pueden ayudar a la entrada vírica, o incrementar la misma, en el sitio diana (tal como, por ejemplo, un sistema de administración lipídico).

En el caso apropiado, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante uno o más de entre: inhalación, en forma de un supositorio o pesario, tópicamente en forma de una loción, solución, crema, pomada o polvos, mediante la utilización de un parche en la piel, oralmente en forma de comprimidos que contienen excipientes, tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos, solos o mezclados con excipientes, o en forma de elixires, soluciones o suspensiones que contienen agentes saborizantes o colorantes, o pueden inyectarse parenteralmente, por ejemplo intracavernosamente, intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente. Para la administración parenteral, las composiciones se utilizan mejor en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para que la solución sea isotónica respecto a la sangre. Para la administración bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o pastillas que pueden formularse del modo convencional.

Preferentemente, las partículas de vector vírico de la presente invención se administran mediante inyección en putamen y caudado.

\vskip1.000000\baselineskip

Enfermedades

El genoma del vector retrovírico y las partículas de vector de la presente invención resultan particularmente útiles para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades neurodegenerativas.

Entre las enfermedades que pueden tratarse están comprendidas de manera no limitativa: la enfermedad de Parkinson, las enfermedades de las neuronas motoras, la enfermedad de Huntington y los trastornos del movimiento que responden a la L-DOPA, tales como las distonias.

En particular, la presente invención resulta útil en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Parkinson.

El tratamiento mediante terapia génica con vectores capaz de administrar, por ejemplo, TH, GTP-CH1 y opcionalmente AADC o AADC y VMAT2 probablemente resulte particularmente útil para los últimos estadios de los pacientes de EP que no responden significativamente al tratamiento de L-DOPA. El tratamiento con AADC o AADC y VMAT2, en combinación con L-DOPA administrada periféricamente también puede resultar útil para pacientes de EP de último estadio.

A continuación, se describe la presente invención únicamente a título de ejemplo, haciendo referencia a las figuras y Tablas siguientes:

Figura 1: secuencias oligonucleótidas de los cebadores utilizados para la clonación del ADNc de la tirosina hidroxilasa de tipo 2 humana (número de acceso X05290). Los sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción (BamHI e HindIII) se encuentran subrayados, la secuencia de Kozak de consenso se encuentra en cursiva y el epítopo c-myc se proporciona en negrita.

Figura 2: mapa del plásmido pNE4. Un plásmido de expresión de mamífero derivado de pcDNA3.1/Zeo que expresa la tirosina hidroxilasa de tipo 2 humana etiquetada con c-myc (cmyc-hTH).

Figura 3: secuencias oligonucleótidas de los cebadores utilizados para la clonación del ADNc de la aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa humana (número de acceso M76180 M30772). Los sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción (BglII e HindIII) se encuentran subrayados, la secuencia de Kozak de consenso se encuentra en cursiva y el epítopo HA se proporciona en negrita.

Figura 4: mapa del plásmido pNE2. Un plásmido de expresión de mamífero derivado de pcDNA3.1/Neo que expresa la aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa humana etiquetada con HA (HA-hAADC).

Figura 5: secuencias oligonucleótidas de los cebadores utilizados para la clonación del ADNc de la GTP-ciclohidrolasa 1 humana (número de acceso U19523). Los sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción (BglII e HindIII) se encuentran subrayados, la secuencia de Kozak de consenso se encuentra en cursiva y el epítopo FLAG se proporciona en negrita.

Figura 6: mapa del plásmido pNE6. Plásmido de expresión de mamífero derivado de pcDNA3.1/Hygro que expresa la GTP-ciclohidrolasa 1 humana etiquetada con FLAG (FLAG-hGTP).

Figura 7: secuencias oligonucleótidas de los cebadores utilizados para la clonación de una forma truncada de la tirosina hidroxilasa de tipo 2 humana. Los sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción (BamHI, HindIII y EcoRI) se encuentran subrayados, la secuencia de Kozak de consenso se encuentra en cursiva y el epítopo c-myc se proporciona en negrita.

Figura 8: mapa del plásmido phTHt-1. Plásmido de expresión de mamífero derivado de pcDNA3.1/Zeo que expresa la forma truncada de hTH etiquetado con el epítopo c-myc (cmyc-hTHt).

Figura 9: mapa del plásmido pneo2. Plásmido de expresión de mamífero derivado de BL-EP (Science 269:847, 1995) que expresa cmyc-hTHt y FLAG-hGTP en forma de un casete bicistrónico. El IRES del virus de la poliomielitis se encuentra dispuesto cadena abajo del gen cmyc-hTHt.

Figura 10: mapa del plásmido ptricis. Plásmido de expresión de mamífero derivado de BL-EP (Science 269:847, 1995) que expresa HA-hAADC, cmyc-hTHt y FLAG-hGTP en forma de un casete tricistrónico. El IRES del VEMC se encuentra dispuesto cadena abajo del gen HA-hAADC y el IRES del virus de la poliomielitis, cadena abajo del gen cmyc-hTHt.

Figura 11: expresión transitoria de los casetes bicistrónico y tricistrónico en células HEK 293T. Transferencia western sondeada con anticuerpos monoclonales de ratón específicos. Las proteínas etiquetadas unidas a los anticuerpos se detectaron con una IgG antirratón de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). Carriles: 1, control; 2, phTHt; 3, plásmido bicistrónico (pneo2); 4, plásmido tricistrónico (ptricis), y 5, los tres plásmidos monocistrónicos (phTHt, pNE2 y pNE6).

Figura 12: diagrama esquemático de vectores mínimos de VAIE.

Figura 13: diagrama esquemático de los vectores BIC VAIE y TRIC VAIE.

Figura 14: diagrama esquemático de vectores TRIC VAIE que contienen el tracto central de polipurina (cppt).

Figura 15: contenido de PERT y de ARN vírico de vectores de VAIE.

Figura 16: expresión de vectores BIC VAIE y TRIC VAIE en células D17 transducidas con diferentes MOIs (MOI). Transferencia western sondeada con anticuerpos monoclonales de ratón específicos. Las proteínas etiquetadas unidas a los anticuerpos de detectar con una IgG de conejo antirratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). Carriles: a, pONY8G (100x); b, pONY8.1Z (100X); c, pONY8.1BIC (100X); d, pONY8.1BIC (10X); e, pONY8BIC (1X); f, células no transducidas; h, pONY8.1TRIC (100X); i, pONY8.1TRIC (10X); j, pONY8.1TRIC (1X); k, pONY8TRIC (100X); l, pONY8TRIC (10X); m, pONY8TRIC (1X); n, pONY8.1TRIC-B (100X); o, pONY8.1TRIC-B (10X); p, pONY8.1TRIC-B (1X); y g, células HEK 293T transfectadas con los plásmidos monocistrónicos (ver la figura 11).

Figura 17: expresión de vectores TRIC VAIE en células D17 transducidas a una MOI\sim100. (A) Inmunotinción de células D17 transducidas con vectores VAIElacZ o TRIC VAIE utilizando anti-LacZ policlonal de conejo o anti-HA monoclonal de ratón, respectivamente. El anticuerpo unido a las proteínas nativas se detectó con IgG anticonejo de cabra o antirratón de cabra conjugado con Alexa 488 (verde) (magnificación: \sim100X). (B) Células D17 transducidas con vectores TRIC VAIE. Inmunotinción tal como en (A) + yoduro de propidio (rojo) que tiñe los núcleos (magnificación: \sim40X).

Figura 18: catecolaminas (pg/10^{6} células) producidas por células HEK 293T transducidas con vectores TRIC VAIE.

Figura 19: transducción del cuerpo estriado de rata adulto con vectores VAIE-lacZ. Los paneles A-C corresponden a 3 secciones coronales independientes de 50 \mum teñidas con X-gal. Se tiñeron aproximadamente cincuenta secciones de este tipo por animal, indicando que la transducción comprende todo el cuerpo estriado de la rata. Los paneles D-H representan una magnificación más alta de la sección en C, mostrando que muchas de las células transducidas presentan una morfología neuronal, tanto dentro del cuerpo estriado (D-F) como en el núcleo accumbens (G-H).

Figura 20: transducción del cuerpo estriado adulto con vectores TRIC VAIE. El panel A representa secciones coronales de 50 \mum teñidas con anticuerpo de HA monoclonal de ratón. La detección inmunofluorescente con un anticuerpo secundario FITC indica la expresión de AADC. El panel C representa secciones coronales de 50 \mum teñidas con anticuerpo FLAG monoclonal de ratón. La detección inmunofluorescente con Alexa 488 indica la expresión de GTP-CH1. No se detectó expresión en el cuerpo estriado contralateral (paneles B y D). El panel E representa la tinción con anticuerpo c-myc monoclonal de ratón detectado con inmunohistoquímica DAB. Los resultados indican que la TH se expresa en el cuerpo estriado ipsilateral, pero no en el contralateral (panel F). La especificidad celular de la expresión de estas proteínas en el lado transducido es confirmación adicional de que se ha producido una transducción efectiva.

Figura 21: mapa del plásmido pONY8G.

Figura 22: mapa del plásmido pONY8.1G.

Figura 23: mapa del plásmido pONY8Z.

Figura 24. (A) Histograma que muestra el cambio en rotaciones/minuto inducido por la estimulación con apomorfina (0,05 mg/kg) en ratas lesionadas con 6-OHDA tras la inyección de pONY8.1Z o pONY8.1T.pONY8.1Z n=5, pONY8.1Tn=2). (B) Comportamiento de rotación en círculos inducido con apomorfina en las ratas lesionadas con 6-OHDA tras la inyección de pONY8.1Z (n=4) o pONY8.1T (n=7).

Figura 25: inmunorreactividad a la tirosina hidroxilasa (TH) en la sustancia negra (A) y en el cuerpo estriado (B) de ratas lesionadas con 6-OHDA en las que se han inyectado vectores TRIC VAIE. Se aprecia la falta de inmunorreactividad a TH en el lado ipsilateral, en comparación con el lado contralateral (control), lo que indica que 6-OHDA ha afectado a las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars reticulata (SNr).

Figura 26: contenido de catecolaminas (ng/mg de tejido fresco) en los cuerpos estriados normales y denervados de ratas lesionadas con 6-OHDA que han recibido una inyección de vectores TRIC VAIE. La cantidad de catecolaminas detectada en el cuerpo estriado denervado confirmó que la lesión con 6-OHDA había afectado a la mayoría de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra. La cantidad de dopamina producida por TRIC VAIE está comprendida entre 5% y 8% en comparación con el cuerpo estriado no lesionado.

Figura 27: proporciones de DOPAC/dopamina en los cuerpos estriados normales y denervados de ratas lesionadas con 6-OHDA que han recibido inyecciones de vectores TRIC VAIE. Observar que los animales inyectados que presentaban una reducción más pronunciada de las rotaciones en círculo inducidas farmacológicamente son los animales en los que la proporción DOPAC/dopamina (metabolismo de la dopamina) en el cuerpo estriado denervado es más baja.

Tabla 1: catecolaminas (ng/hora/10^{8} células) liberadas por células HEK 293T transfectadas con plásmidos monocistrónicos, bicistrónicos o tricistrónicos (n.d., no detectable).

Tabla 2: catecolaminas (ng/hora/10^{6} células) producidas por células HEK 293T transfectadas con plásmidos monocistrónicos, bicistrónicos o tricistrónicos (n.d., no detectable).

Tabla 3: eficiencia de integración de los vectores VAIE.

\vskip1.000000\baselineskip

Parte experimental Ejemplo 1 Clonación del ADNc de la tirosina hidroxilasa 1 de tipo 2 humana

El ADNc de la tirosina hidroxilasa 1 de tipo 2 humana (número de acceso X05290) se amplificó mediante RT-PCR a partir de ARNm poliA^{+} de sustancia negra humana (Clontech) y se etiquetó con el epítopo c-myc utilizando los cebadores indicados en la figura 1. Se amplificó un fragmento de 169 pb correspondiente al extremo 5' del gen utilizando los cebadores 5'hTH2 y 3'hTH2 (figura 1), mientras que el fragmento de 1.418 pb del extremo 3' del ADNc de la tirosina hidroxilasa se obtuvo utilizando los cebadores 5'hTH3 y 3'hTH1 (figura 1).

Se utilizó el kit de RT-PCR-RT Titan One Tube (Boehringer) para llevar a cabo la reacción de RT-PCR. Típicamente la reacción está compuesta por dos soluciones.

Solución A

Contiene 0,2 \mug de ARN poliA^{+} de sustancia negra humana, 32 \muM de cada dNTP, DTT 10 mM, 1 \mul de inhibidor de ARNasa (RNAsin, Promega), -100 ng de cada cebador y agua, hasta 25 \mul.

Solución B

Contiene 10 \mul de 5X de tampón para RT-PCR, 1 \mul de mezcla de enzimas y agua hasta 25 \mul. Se mezclaron las soluciones A y B y se fijaron las condiciones de la RT-PCR.

1.1. La amplificación del producto de 169 pb se llevó a cabo a 50ºC, 30 minutos, para permitir que tuviese lugar la reacción RT, seguido de 2 minutos a 94ºC, y 35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC y 45 segundos a 68ºC.

1.2. La amplificación del producto de 1.418 pb se llevó a cabo a 50ºC, 30 minutos, para permitir que tuviese lugar la reacción RT, seguido de 2 minutos a 94ºC, y 35 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC y 2 minutos a 68ºC.

Se purificaron ambos fragmentos y se utilizaron como molde en una tercera reacción de PCR para obtener el ADNc de tirosina hidroxilasa (TH) de longitud completa. Se llevó a cabo la reacción de PCR recombinante utilizando los cebadores 5'hTH2 y 3'hTH1 (figura 1) y un kit KlenTaq (Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se fijaron las condiciones de PCR siguientes: 35 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC y 2 minutos a 68ºC. Se clonó el producto de PCR recombinante en el vector pGEM-Teasy (Promega) para crear pNE3.

A continuación, se extrajo el ADNc de la TH del pNE3 en forma de un fragmento BamHI-EcoRI de 1,57 kb y se ligó en pcDNA3.1/Zeo (Invitrogen) digerido previamente con los mismos enzimas. El nuevamente generado plásmido de expresión de mamífero se denominó pNE4 (figura 2).

Ejemplo 2 Clonación del ADNc de la aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa 1 humana

El ADNc de la aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa (AADC) humana (número de acceso M76180
M30772) se amplificó a partir de una biblioteca de expresión de ADNc de hígado humano (Clontech) y se etiquetó con el epítopo HA utilizando los cebadores 5'hAADC y 3'hAADC, indicados en la figura 3. Se llevó a cabo la reacción de PCR utilizando un kit KlenTaq (Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante. La reacción contenía 4 \mul de ADNc de hígado humano y 1 \muM de cada cebador, en un volumen final de 50 \mul. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: una primera etapa de 30 segundos a 94ºC; una segunda etapa de 5 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 58ºC y 2 minutos a 68ºC, y una tercera etapa de 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 2 minutos a 68ºC.

La PCR amplificó las dos bandas esperadas, 1.485 kb y 1,36 kb, correspondientes a los dos transcritos de la aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa (AADC). La banda de 1.485 kb se purifica y se clona en el vector pGEM-Teasy (Promega) para generar el plásmido denominado pNE1. Se extrajo el ADNc de la AADC humana de longitud completa a partir de pNE1 en forma de un fragmento BglII-SalI de \sim1,5 kb y se ligó en pcDNA3.1/Neo digerido previamente con los enzimas BamHI y XhoI. El nuevo plásmido generado se denominó pNE2 (figura 4).

Ejemplo 3 Clonación del ADNc de la GTP-ciclohidrolasa 1 humana

Se amplificó el ADNc de la GTP-ciclohidrolasa I humana (GTP-CH1) (número de acceso U19523) a partir de ARNm poliA^{+} procedente de sustancia negra humana y se etiquetó con el epítopo FLAG utilizando los cebadores 5'hGTP y 3'hGTP (figura 5). Se utilizó el kit Titan One Tube de RT-PCR (Boehringer) para llevar a cabo la reacción de RT-PCR. Típicamente la reacción está compuesta de dos soluciones, tal como se ha indicado anteriormente en el Ejemplo 1. Se mezclaron las soluciones A y B y se fijaron las condiciones de RT-PCR siguientes: 50ºC, 30 minutos, para permitir que tuviese lugar la reacción de RT-PCR, seguido de 30 segundos a 94ºC, y 35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC y 1 minuto a 68ºC.

Se purificó el producto de RT-PCR (\sim0,75 kb) y se clonó en el vector pGEM-Teasy (Promega), generando el plásmido pNE5. Se extrajo el ADNc de GTP-CH a partir de pNE5 en forma de un fragmento BglII-NotI de \sim0,75 kb y se ligó en pcDNA3.1/Hygro digerido con los enzimas BamHI y NotI, generando pNE6 (figura 6).

Ejemplo 4 Clonación de una forma truncada de la tirosina hidroxilasa I de tipo 2 humana

Para evitar la inhibición por retroalimentación por parte de la dopamina sobre el enzima TH, se decidió utilizar la forma truncada de la TH de tipo 2 que carecía del domino regulador. La TH se activa mediante fosforilación de los sitios situados en dicho dominio N-terminal y experimenta inhibición por retroalimentación del producto final mediada por lo menos por uno de dichos sitios de fosforilación (J. Biol. Chem. 267:25754-25758, 1992; Adv. Exp. Med. & Biol. 338:87-92, 1993). Esta TH truncada (hTHt) se etiquetó con el epítopo c-myc y se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores 5'hTHt y 3'hTHt (figura 7) y el plásmido pNE4 como molde. Se llevó a cabo la reacción de PCR utilizando la polimerasa PfuI (Stratagene) a 95ºC durante 1 minuto y 30 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 60ºC y 1 minuto a 72ºC. Se amplificó una banda de \sim1,04 kb, se digirió con los enzimas BamHI y EcoRI y se ligó en pcDNA3.1/Zeo previamente digerido con los mismos enzimas. El nuevo plásmido generado se denominó phTHt (figura 8).

Ejemplo 5 Clonación de TH, AADC y GTP-CH en un vector de expresión de mamífero

Se clonó el ADNc de hTHt en el plásmido BL-EP (Science 269:847, 1995) cadena abajo del IRES del VEMC. Para conseguirlo, se extrajeron los fragmentos CMVp-hTHt de phTHT en forma de un fragmento BglII-EcoRV y se clonaron en BLEP digerido con BamHI-EcoRV, generando pneo1. Se extrajo el fragmento CMVp-DC de pNE2 en forma de un fragmento BglII-EcoRV y se ligó en BLEP cortado con SmaI-BamHI, generando BLEP-CMV-DC.

Para crear un casete de expresión de mamífero que comprendiese los genes hTHt y GTP-CH1 (casete bicistrónico), se clonó el ADNc de GTP-CH1 cadena abajo del IRES del virus de la poliomielitis, de la manera siguiente. Se extrajo el ADNc de GTP-CH1 de pNE6 en forma de un fragmento NheI-XbaI de \sim0,75 kb y se clonó en BLEP-THt digerido con los mismos enzimas. El nuevo plásmido se denominó BLEP-THt-CH1. Se extrajo el fragmento CMVp-THt de pneo1 en forma de un fragmento XbaI-EcoRV y se ligó en BLEP-hTHt-CH1 digerido con los mismos enzimas, generando pneo2 (pbicis) (figura 9).

Para crear un casete tricistrónico que comprendiese los genes hTHt, GTP-CH1 y AADC, se digirieron BLEP-CMVp-DC y BLEP-hTHt-CH1 con BlnI-ClaI, generando ptricis (figura 10). Lo expuesto anteriormente crea un casete que presenta promotor de CMV, DC, hTHt y GTP-CH1, en este orden.

Ejemplo 6 Expresión transitoria a partir de los casetes bicistrónico y tricistrónico en células humanas heterólogas

Las células 293T renales embrionarias humanas (HEK293T) no sintetizan ninguna catecolamina y no expresan enzimas catecolaminérgicos. Se seleccionaron para determinar si los casetes de expresión bicistrónicos y tricistrónicos eran funcionales. Se sembraron células HEK 293T en placas de 6X pocillos a una densidad de \sim2,3x10^{5} células/pocillo. Veinticuatro horas después de la siembra, la células se transfectaron con 2 \mug de ADN de plásmido utilizando Fugene^{TM} (Roche) en medio libre de suero, siguiendo las instrucciones del fabricante. A modo de control de transfección se añadieron 0,2 \mug (1/10) del plásmido pEGFP-C1 que expresaba GFP (Clontech) a la mezcla de ADN-Fugene^{TM}.

Aproximadamente 48 horas después de la transfección, las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se recolectaron. Se prepararon extractos celulares totales utilizando tampón de lisis (Promega). Se cargaron aproximadamente 10 \mug de proteínas totales en tres geles de SDS-PAGE al 10% y se separaron las proteínas y se transfirieron a una membrana western de nitrocelulosa ECL (Amersham-Pharmacia). Se sondearon las membranas con una dilución 1/1.000 de anticuerpo anti-HA de ratón (Roche), anti-cmyc de ratón (Roche) o anti-FLAG de ratón (Sigma). El anticuerpo secundario era una dilución 1/2.000 de antirratón de conejo marcado con HRP (Dako). Los anticuerpos unidos a las membranas se detectaron utilizando un kit de detección ECL-Western.

Las proteínas del peso molecular aparente apropiado se detectaron en las células transfectadas y no en el control falsamente transfectado: HA-hAADC, \sim53 kDa; cmyc-hTHt, \sim42 kDa y FLAG-GTP/CH1, \sim30 kDa. Los casetes bicistrónicos y tricistrónicos expresaban dos o tres de los enzimas, respectivamente (figura 11).

Ejemplo 7 Producción de catecolaminas en células humanas transitoriamente transfectadas

Tal como se ha indicado en el Ejemplo 6, se sembraron células HEK 293T en placas de 6X pocillos a una densidad de \sim2-3x10^{5} células/pocillo. Veinticuatro horas después de la siembra, las células se transfectaron con 2 \mug de ADN de plásmido utilizando Fugene^{TM} (Roche) en medio libre de suero siguiendo las instrucciones del fabricante. A modo de control de transfección se añadieron 0,2 \mug (1/10) del plásmido pEGFP-C1 que expresaba GFP (Clontech) a la mezcla de ADN-Fugene^{TM}.

Aproximadamente 48 horas después de la transfección, las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para medir las catecolaminas liberadas en el medio, se añadieron 0,5 ml de "tampón de liberación" (solución salina equilibrada de Hank, Hepes 25 mM, pH 7,4, BSA al 0,25% y tirosina 1 nM) a las células transfectadas. Estas células se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. No se añadió tetrahidrobiopterina (BH_{4}), el cofactor de TH, a las células en este experimento. Las catecolaminas presentes en el tampón se extrajeron con el mismo volumen de ácido perclórico 0,8 M (PCA) y EDTA 0,2 mM. Se eliminaron los residuos celulares mediante centrifugación en una microcentrífuga a 4ºC, 10.000 rpm, durante 15 minutos. La etapa de liberación puede repetirse durante 30 minutos adicionales. Las catecolaminas producidas en las células se extrajeron en 0,5 ml de PCA 0,4 M y EDTA 0,1 mM.

Se separaron las catecolaminas en una columna C18 de fase inversa (ESA Analytical) mediante HPLC (Dionex) utilizando la fase móvil Cat-A-Phase (ESA Analytical) a un caudal de 1,5 ml/minuto durante 15 minutos. Se inyectaron aproximadamente 20 \mul en el sistema. Se detectaron las catecolaminas en un detector electroquímico (ESA Analytical) conectado a una celda analítica (modelo 5144, ESA Analytical) con los siguientes potenciales de entrada: células de guarda, +250 mV; canal 1, 10 mV y canal 2, -250 mV. Se calculó la cantidad de catecolaminas en las muestras mediante integración del área de los picos respecto de estándares conocidos separados siguiendo el mismo protocolo. Este método permite la detección de L-DOPA, dopamina y DOPAC, un producto de degradación específico de la dopamina.

La detección de catecolaminas liberadas (Tabla 1) y/o producidas (Tabla 2) por células heterólogas independientemente de BH_{4} confirma que los enzimas son funcionales. Tal como se esperaba, los casetes de expresión monocistrónicos, bicistrónicos y tricistrónicos producían L-DOPA, mientras que la dopamina únicamente era producida por el casete tricistrónico. El casete bicistrónico producía una cantidad mucho mayor de L-DOPA que TH sola, confirmando la utilidad de GTP-CH1 en la provisión de BH_{4} en estas células. La dopamina también era producida por el casete bicistrónico en combinación con AADC. DOPAC, el producto de degradación específico de la dopamina, únicamente se detectaba al producirse cantidades elevadas de dopamina.

Ejemplo 8 Construcción de vector lentivírico que expresa los casetes bicistrónico y tricistrónico

Los vectores lentivíricos resultan particularmente útiles para la transferencia génica a células que no se dividen. Entre las muchas células diana que no se dividen se encuentran las neuronas del cerebro humano. Estas células podrían ser células diana para la administración de TH, AADC y GTP-CH1 para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. En la presente memoria se describe la construcción de vectores mínimos basados en VAIE que administran y expresan TH, AADC y GTP-CH1 y que son capaces de producir el neurotransmisor (dopamina) que falta en el cerebro severamente afectado de enfermedad de Parkinson. Esta terapia resultaría apropiada para los estadios tardíos de la EP en pacientes que no responden al tratamiento de L-DOPA. La estructura de los vectores de VAIE mínimos generales se muestra en la figura 12.

Construcción de pONY8G

Se derivó pONY8G de pONY8.0Z mediante el intercambio del gen informador lacZ por el gen de la proteína fluorescente verde potenciada (GFP). Lo anterior se llevó a cabo mediante la transferencia del fragmento SaclI-KpnI correspondiente al gen de la GFP y las secuencias flanqueantes de pONY2.13GFP (documento WO nº 99/32646) en pONY8.0Z cortadas con los mismos enzimas. Se derivo pONY8.0Z a partir de pONY4.0Z (documento WO nº 99/32646) mediante la introducción de mutaciones que: 1) impiden la expresión de TAT mediante una deleción de 83 nt en el exón 2 de tat, 2) impiden la expresión del ORF de S2 mediante una deleción de 51 nt, 3) impiden la expresión de REV mediante la deleción de una única base dentro del exón 1 de rev, y 4) impiden la expresión de la parte N-terminal de gag mediante la inserción de T en los codones de inicio ATG, modificando de esta manera la secuencia de ATG a ATTG. Con respecto a la secuencia de VAIE de tipo salvaje nº de acceso U01866, éstas corresponden a la deleción de los nt 5.234-5.316 ambos inclusive, de los nt 5.346-5.396 ambos incluso y del nt 5.538. La inserción de residuos T se realizó después de los nt 526 y 543.

Se extrajo el casete bicistrónico que expresa los genes THt y GTP-CH1 humanos de pneo2 en forma de un fragmento XhoI-XbaI y se ligó en pONY8G (SEC ID nº 1, figura 21), la construcción del cual se ha descrito anteriormente, digerido con los mismos enzimas. En este caso, se sustituyó el casete CMVp-GFP por el casete CMVp-hTHt-CH1. El nuevo plásmido se denominó pONY8-BIC (SEC ID nº 4).

Se extrajo el casete tricistrónico que expresaba los genes AADC, THt y GTP-CH1 humanos de pTricis en forma de un fragmento XhoI-XbaI y se ligó al esqueleto de pONY8G (SEC ID nº 1, figura 21), la construcción del cual se ha descrito anteriormente. El nuevo plásmido se denominó pONY8TRIC (SEC ID nº 5). El tamaño del genoma de ARN del vector resultante era de 8,8 kb y, por lo tanto, era 10% más largo que el genoma de ARN del VAIE, de 8 kb.

Construcción de pONY8.1Z y pONY8.1G

Se obtuvo pONY8.1Z directamente a partir de pONY8.0Z mediante la digestión con SalI y la digestión parcial con SapI. Tras los cortes, los extremos salientes del ADN se convirtieron en romos mediante tratamiento con ADN polimerasa de T4. A continuación, se ligó nuevamente el ADN resultante. Esta manipulación resulta en una deleción de la secuencia entre el gen informador lacZ e inmediatamente cadena arriba de 3'PPT. El límite 3' de la deleción es nt 7.895 con respecto al VAIE de tipo salvaje, número de acceso U01866. De esta manera, pONY8.1Z no contiene secuencias correspondientes a los RREs del VAIE. Se derivó pONY8.1G de pONY8G utilizando la misma estrategia.

Se extrajeron los casetes tanto bicistrónicos como tricistrónico en forma de fragmentos NsiI-XhoI de pONY8BIC o pONY8TRIC y se ligaron al esqueleto de pONY8.1G (construcción indicada anteriormente, SEC ID nº 2, figura 22) digerida con los mismos enzimas. Los dos nuevos plásmidos se denominaron pONY8.1BIC y pONY8.1TRIC (figura 13).

La presencia de una secuencia denominada tracto central de polipurina (cPPT) podría mejorar la eficiencia de la administración génica a células que no se dividen. Dicho elemento de acción en cis se encuentra situado en el elemento de región codificante de la polimerasa del VAIE y puede obtenerse en forma de un elemento funcional mediante la utilización de la amplificación por PCR utilizando cualquier plásmido que contenga la región codificante de la polimerasa del VAIE (por ejemplo pONY3.1, que se describe en la patente WO nº 99/32646 (ver, por ejemplo, el Ejemplo 9, fig. 6), de la manera siguiente. El producto de PCR incluye las secuencias cPPT y de terminación central (CTS). Los cebadores oligonucleótidos utilizados en la reacción de PCR fueron:

VAIE cPPT EP-POS.:

5'- CGG ATC AGA TCT TGA TCA CTG CAG GCT CTC ATT ACT TGT AAC AAA GGG AG-3'

VAIE cPPT EP-NEG.:

5'- AG CTC GGA TCC CTG CAG CAT GTT CAC CAG GGA TTT TG-3'

El sitio de reconocimiento para BgIII se encuentra subrayado, el sitio para BcII se encuentra en cursiva, el sitio para BamHI se encuentra en cursiva negrita y el sitio para PstI, en negrita. La introducción de cPPT/CTS en una posición cadena arriba del IRES de VEMC o del IRES de VP se consiguió mediante subclonación del fragmento BclI-BsslII único de pONY8TRIC en pSL-1180 (Pharmacia) utilizando los mismos sitios en el vector. Lo expuesto anteriormente se denominó pSL-1180-PD. La digestión del producto de PCR cPPT/CTS con BgIII y BamHI permitió la inserción en el sitio BcII situado cadena arriba del IRES de VEMC o con PstI, en el sitio PstI único cadena arriba del IRES del virus de la poliomielitis, generando pSL-1180-PD-5'cPPT o pSL-1180-PD-3'cPPT, respectivamente. La orientación del fragmento clonado en pSL-1180-PD se confirmó mediante secuenciación del ADN. El fragmento BcII-BssHII de estos dos clones se ligó en pONY8TRICdelCTS, una forma modificada de pONY8TRIC. Se construyó pONY8TRICdelCTS mediante ligación del fragmento SalII-PinAI a partir de pONY8ZdelCTS (descrito a continuación) en pONY8TRIC digerido con XhoI y PinAI. Los dos nuevos genomas de vector se denominaron pONY8TRIC5'cPPT y pONY8TRIC3'cPPT. Se muestra una representación esquemática de estos genomas de vector en la figura 14.

Construcción de pONY8ZdelCTS

Se modificó pONY8Z (SEC ID nº 3, figura 23) para eliminar el CTS que ya se encontraba presente en el vector pONY8Z. Lo expuesto anteriormente se consiguió mediante subclonación del fragmento SalI a ScaI que comprendía CTS y la región RRE de pONY8Z en pSP72, preparado para la ligación mediante digestión con SalI y EcoRV. A continuación, se eliminó la región CTS mediante digestión con KpnI y PpuMI, se convirtieron los extremos salientes en romos mediante tratamiento con ADN polimerasa de T4 y después se ligaron nuevamente los extremos. A continuación, el fragmento modificado del vector VAIE se extrajo utilizando SalI y NheI y se ligó en pONY8Z que había sido preparado para la ligación mediante digestión con los mismos enzimas. Este nuevo vector VAIE se denominó pONY8ZdelCTS.

Ejemplo 9 Producción de reservorios de vector lentivírico que expresan genes terapéuticos

Se utilizó el método de transfección de los tres plásmidos tal como se ha descrito anteriormente (Soneoka et al., 1995), para generar vectores lentivíricos seudotipados. Las transfecciones se llevaron a cabo en la línea celular HEK293T (Soneoka et al., 1995) para producir los viriones del vector. Se recolectaron los sobrenadantes de cultivo 48 horas después de la transfección y se filtraron a través de filtros de 0,45 \mum de tamaño de poro (Millipore). Se concentró el sobrenadante vírico 100 a 1.000 veces mediante ultracentrifugación (Burns et al., PNAS 90:8033-8037, 1993) y se resuspendió en PBS.

Se tituló el número de partículas en los reservorios víricos mediante ensayos de transcriptasa inversa de alto rendimiento (PERT) y se compararon con una preparación vírica estándar de pONY8G de título biológico conocido. Se evaluó el título biológico mediante transducción de células D17, una línea celular de osteosarcoma de perro. El título se expresa en unidades de transducción por ml (u.t./ml). Para este fin, las células se sembraron en placas de cultivo de tejido de 12x pocillos el día antes de la infección a una densidad de 1x10^{5} células por pocillo. Se prepararon sobrenadantes víricos mediante transfección de células 293T con plásmidos apropiados, tal como se ha descrito anteriormente, en las células diana. Se añadió polibreno (8 \mug/ml) a cada pocillo en el momento de la transducción en 0,5 ml del sobrenadante de cultivo utilizado para la infección. Aproximadamente 2 a 5 horas después de la transducción, se sustituyó el sobrenadante de cultivo por medio fresco. Se observaron las células que expresaban GFP (verde) bajo luz UV y se realizó un recuento.

El ensayo PERT utiliza tecnología de RT-PCR cuantitativa en tiempo real para detectar un producto de PCR específico de ARN de MS2 ya la transcriptasa inversa retrovírica presente en las partículas víricas (en el presente caso, RT de VAIE). Brevemente, se fragmentaron las partículas víricas mediante la mezcla de 1:1 volúmenes de reservorios de vector vírico y tampón de rotura (Tris-HCl 40 mM, pH 7,5, KCl 50 mM, DTT 20 mM y NP-40 al 0,2%). Se llevaron a cabo diluciones en serie de las partículas fragmentadas previamente a su adición a la mezcla de reacción TaqMan de RT-PCR (Perkin-Elmer). Además, la mezcla de reacción contenía un volumen 1/10 de partículas víricas fragmentadas, cebador directo de PERT 300 nM, cebador inverso de PERT 300 nM, sonda de PERT 150 nM y 1/10 de ARN de MS2 0,8 mg/ml. Las condiciones de RT-PCR fueron las siguientes: mantenimiento a 48ºC durante 30 minutos; mantenimiento a 95ºC durante 10 minutos; cuarenta ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto. Los datos se analizaron utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® (Perkin-Elmer).

De manera similar, también se estimó el contenido de ARN de las preparaciones víricas mediante RT-PCR en comparación con una preparación vírica de pONY8G estándar. Se aisló el ARN vírico a partir de los reservorios víricos utilizando un kit de ARN vírico de Qiagen (Qiagen) y se trató con ADNasa I (Ambion). Se utilizaron diluciones en serie del ARN vírico como molde en la reacción de RT-PCR. Se prepararon dos mezclas de reacción, +RT y -RT, que contenían un volumen 1/10 de molde de ARN vírico y los cebadores directo e inverso y sonda específicos. Las condiciones de la RT-PCR fueron las siguientes: mantenimiento a 48ºC durante 30 minutos; mantenimiento a 95ºC durante 10 minutos; cuarenta ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto. Los datos se analizaron utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® (Perkin-Elmer). La figura 15 muestra los resultados del ensayo de PERT y el contenido de ARN vírico de los vectores TRIC de VAIE y GFP de VAIE. Los vectores TRIC de VAIE aparentemente presentaban un número similar de partículas en cada preparación, aunque 4 veces menos ARN que los vectores GFP de VAIE.

Se midió la eficiencia de integración de los genomas de vector TRIC-VAIE mediante PCR cuantitativa en tiempo real para el ADN genómico total a partir de células transducidas. Con este fin, se transdujeron células diana, tales como células D17 o HT1080 con TRIC-VAIE o GFP-VAIE a diferentes MOIs, tal como se ha indicado anteriormente. Las células transducidas se dividieron por lo menos tres veces antes de aislar el ADN total de las mismas. Se utilizaron aproximadamente 100 ng del ADN total como molde en la reacción de PCR. La amplificación del fragmento de señal de empaquetamiento del VAIE se cuantificó mediante la comparación con la amplificación de un gen de mantenimiento, tal como la beta-actina o GAPDH. Las condiciones de la PCR cuantitativa en tiempo real fueron las siguientes: mantenimiento a 95ºC durante 10 minutos; cuarenta ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto. Los datos se analizaron utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM R (Perkin-Elmer). La Tabla 3 muestra la eficiencia de integración de los vectores VAIE.

Ejemplo 10 Los vectores BIC de VAIE y TRIC de VAIE proporcionan la expresión de TH, AADC y GTP-CH1 en células heterólogas en cultivo

Se transdujeron células heterólogas, tales como células D17 o HEK293T con vectores TRIC-VAIE a diferentes multiplicidades de infección (MOI). Se prepararon sobrenadantes vírico mediante transfección de células 293T con los plásmidos apropiados y se añadieron a las células diana tal como se ha descrito en ejemplos anteriores. Se dividieron las células por lo menos tres veces antes de analizarlas para garantizar que no se producía seudotransducción. Se analizó la expresión de los genes TH, AADC y GTP-CH1 mediante transferencia western (figura 16) e inmunocitoquímica (figura 17). Las bandas del peso molecular aparente apropiado se detectaron en extractos celulares de células D17 transducidas: HA-hAADC, \sim53 kDa; cmyc-hTHt, \sim42 kDa y FLAG-GTP/CH1, \sim30 kDa. Se han utilizado anticuerpos monoclonales de ratón que reconocen las proteínas etiquetadas tal como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos unidos a las proteínas se detectaron con una IgG antirratón de conejo conjugada con HRP. Los casetes bicistrónicos y tricistrónicos expresan dos o tres de los enzimas, respectivamente (figura 16).

La transducción de las células D17 se determinó mediante inmunocitoquímica utilizando anticuerpo HA monoclonal de ratón (Roche) e IgG antirratón de cabra conjugada con Alexa 488 (Molecular Probes) (figura 17). A modo de control se transdujeron células D17 con lacZ de VAIE.

Las catecolaminas producidas en las células transducidas se extrajeron en 0,5 ml de PCA 0,4 M y EDTA 0,1 mM, se separaron mediante HPLC y se detectaron electroquímicamente tal como se ha indicado anteriormente en los ejemplos anteriores. Las células HEK 293T transducidas con los vectores TRIC-VAIE produjeron L-DOPA, dopamina y DOPAC (figura 18).

Ejemplo 11 Los vectores VAIE proporcionan la expresión de TH, AADC y GTP-CH1 en el núcleo caudado de ratas adultas

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la pérdida de la ruta nigroestriatal y es sensible a tratamientos que facilitan la transmisión dopaminérgica en núcleo caudado-putamen. En animales experimentales, las células genéticamente modificadas que expresan tirosina hidroxilasa, y que de esta manera sintetizan dihidroxifenilalanina (L-DOPA), inducen la recuperación comportamental en modelos de roedor de la EP (Wolff et al., PNAS (USA) 86:9011-14, 1989; Freed et al., Arch. Neurol. 47:505-12, 1990; Jiao et al., Nature 262:4505, 1993). Un enfoque alternativo es la transferencia génica directa in vivo en células somáticas, de manera que las células del cuerpo estriado se convierten en células productoras de dopamina mediante transducción con un vector que expresa TH, AADC y GTP-CH1.

Con el fin de examinar la expresión génica codificada víricamente se microinyectaron estereotácticamente TRIC-VAIE y lacZ de VAIE en el cuerpo estriado de ratas adultas, de la manera siguiente. Las ratas se anestesiaron con Hypnorm/Hypnovel (Wood et al., Gene Therapy 1:283-291, 1994) y recibieron inyecciones de 2x1 \mul de reservorios víricos (para lacZ de VAIE, típicamente 1 a 5x10^{9} u.t./ml) en el cuerpo estriado, en las coordenadas Bregma siguientes: 3,5 mm lateral, 4,75 mm vertical respecto a la duramadre, y 1 mm rostral, 3,5 mm lateral, 4,75 mm vertical, utilizando una micropipeta fina de vidrio estirado durante un periodo de 2 minutos. Se sacó la pipeta 1 mm y se dejó durante 2 minutos adicionales antes de retraerla lentamente hasta la superficie. Los animales se analizaron 1 y 2 semanas después de la inyección. Las ratas se perfundieron con paraformaldehído al 4% (PFA) que contenía MgCl_{2} 2 mM y ácido etilenglicol-bis(beta-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetraacético 5 mM. Se extrajeron los cerebros y se introdujeron en fijador durante la noche, se sumergieron en sacarosa al 30% a 4ºC durante la noche y se congelaron en compuesto de inclusión OCT Tissue-Tech (Miles, IN, USA). Se cortaron secciones de cincuenta micrómetros en un micrótomo de congelación y flotaron brevemente en PBS-2mM MgCl_{2} a 4ºC como un lavado. La expresión de lacZ es determinada disponiendo las secciones en solución de tinción X-gal durante 3 a 5 horas. Se inyectó TRIS-VAIE en el cuerpo estriado de la rata utilizando las coordenadas indicadas anteriormente. Además, se utilizaron dos sitios de inyección adicionales, en Bregma 2,5 mm lateral, 4,75 mm vertical y 1,8 mm rostral, 2,5 mm lateral y 5 mm vertical. La expresión de AADC, TH y GTP-CH1 se detectó mediante inmunohistoquímica utilizando anticuerpos monoclonales de ratón cultivados contra las etiquetas epítopo HA, c-myc y FLAG, respectivamente. Estos anticuerpos distinguen entre las proteínas de rata y humanas. Se incubaron secciones de cerebro con los anticuerpos anti-HA de ratón (Santa Cruz), anti-c-myc (Santa Cruz) o anti-FLAG (Sigma) (diluciones 1:100) a 4ºC durante la noche en suero de cabra al 10% en PBS y Triton X-100 al 0,5%. Las secciones se lavaron con PBS y después se incubaron con IgG de cabra antirratón o anticonejo conjugado con Alexa 488 (Molecular Probes) o FITC (Jackson Laboratories) (diluciones 1/1.000) a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas. Tras el lavado, las secciones se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia. Para la tinción DAB, se revelaron secciones utilizando el sistema avidina-biotina (kit Vectastain (Vactor Laboratories)).

TH no se expresa en neuronas o células gliales del cuerpo estriado de la rata (Chatterjee et al., Science 258:1485-88, 1992). La inmunorreactividad de la TH endógena (IR-TH) dentro del cuerpo estriado se encuentra limitada a los terminales dopaminérgicos de fibras aferentes de la sustancia negra. Para determinar si las células transducidas eran neuronas o células gliales se utilizó un anticuerpo de TH conjuntamente con anticuerpos que reconocen marcadores neuronales (NeuN) o gliales (GFAP). Se llevó a cabo una doble inmunotinción de secciones de cerebro. Se incubaron las secciones con anticuerpo policlonal de TH de conejo (1/100; Affinitti) y anticuerpo monoclonal de neurofilamento de ratón (NeuN) (1/50; Chemicon) o anticuerpo monoclonal de GFAP de ratón (1/50; Chemicon) a 4ºC durante la noche en suero de cabra al 10% en PBS y Triton X-100 al 0,5%. Se lavaron las secciones con PBS y después se incubaron con IgG anticonejo de cabra conjugado con Alexa 488 (1/200; Molecular Probes) o IgG antirratón de cabra conjugado con CY3 (1/200; Jackson Laboratories) a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas. Tras el lavado, las secciones se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia.

La figura 19 muestra la transducción de un cuerpo estriado de rata adulta con pONY8Z siete días después de la inyección. La figura 20 muestra la transducción del cuerpo estriado de rata con pONY8TRIC dos semanas después de la inyección.

Ejemplo 12 Eficacia de los vectores TRIC-VAIE en un modelo de roedor de la enfermedad de Parkinson: comportamiento de rotación en círculos inducido con apomorfina

El objetivo del presente estudio consiste en sustituir la dopamina en el cuerpo estriado del modelo animal de enfermedad de Parkinson. Las ratas recibieron lesiones con 6-OHDA del haz medial del cerebro anterior (MFB). Se llevaron a cabo inyecciones estereotácticas bajo anestesia utilizando una jeringa de Hamilton de 10 \mul con una aguja de punta roma de calibre 33. Cada rata recibió 4 \mul de HCl de 6-OHDA 4 \mug/\mul (Sigma) disueltos en ascorbato-solución salina 2 mg/ml (ácido ascórbico al 0,2%, NaCl al 0,9%). Se infusionó lentamente la solución a un caudal de 0,5 \mul/minuto. Tres semanas después de la lesión con 6-OHDA, se llevó a cabo el ensayo de las ratas para la rotación inducida por anfetamina. Los animales recibieron inyecciones i.p. de D-anfetamina 2,5 mg/kg (Sigma). Se diluyó la anfetamina en PBS. Se realizó un seguimiento de la asimetría rotacional durante 90 minutos. Se utilizaron únicamente las ratas con >7 rotaciones por minuto para el experimento siguiente. Para la rotación inducida por apomorfina, se sometió a ensayo a los animales en dos ocasiones con 0,05 mg/kg s.c. separadas por 4 días. Quince ratas mostraron buena homogeneidad del grado de las lesiones de 6-OHDA. Se llevaron a cabo dos experimentos con vectores TRIC-VAIE. Tres semanas después de las lesiones inducidas por 6-OHDA, se inyectaron unilateralmente en el cuerpo estriado (ipsilateralmente respecto a la lesión) vectores lentivíricos basados en VAIE portadores de los genes implicados en la síntesis de la dopamina. Se incluyeron dos grupos de animales en cada estudio: en el primer experimento, pONY8.1Z (n=5) y pONY8.1T (n=4); en el segundo estudio, pONY8.1Z (n=4) y pONY8.1T (n=7). Con el fin de evaluar un posible beneficio funcional del tratamiento, se sometió a ensayo la rotación inducida por apomorfina semanalmente tras la inyección vírica (figura 24.A). Dos animales en los que se había inyectado pONY8.1T (C3R5 y C5R4) mostraron una reducción de la rotación contralateral respecto a la rotación con pre-apo2 durante el periodo experimental total, alcanzando un 65% y un 70% de reducción 3 semanas después de la inyección vírica (que sugiere que el 70% probablemente es un artefacto, debido a que una rata escapó del arnés durante esta rotación). Se observó una reducción de 60% y de 35% 10 semanas después de la inyección de la solución vírica para estas dos ratas. En el segundo estudio, la sustitución de la dopamina no redujo el número de rotaciones inducidas por apomorfina observado en 6 animales (de 7 ratas) que habían recibido inyecciones de pONY8.1T (figura 24.B). La media de reducción de las rotaciones 6 semanas después de la inyección vírica era de aproximadamente 45% en comparación con la pre-apomorfina
2.

Al final de cada experimento, las ratas se perfundieron con PBS helado que contenía ácido ascórbico al 0,02% y 5.000 unidades de heparina, seguido de solución de paraformaldehído al 4%. Se diseccionaron los cerebros y se introdujeron durante la noche en solución de paraformaldehído al 4% seguido de la crioprotección en solución de sacarosa al 30%. Se llevó a cabo el marcaje inmunohistoquímico de la TH en secciones de sustancia negra y de cuerpo estriado para someter a ensayo la extensión de la lesión. Se llevó a cabo la inmunotinción de la TH utilizando anticuerpos policlonales anti-TH de conejo en secciones de sustancia negra (figura 25.A) y de cuerpo estriado (figura 25.B). Las catecolaminas producidas por los vectores TRIC-VAIE en los cuerpos estriados denervados de ratas 6-OHDA se determinó mediante HPLC y detección electroquímica tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores. Se muestran los resultados en las figuras 26 y 27.

Ejemplo 13 Vectores TRIC-VAIE utilizados para corregir el modelo de primate lesionado con 6-OHDA de la enfermedad de Parkinson

El presente modelo comprende la inyección unilateral de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) en el haz nigroestriatal de un mono del Nuevo Mundo de pequeño tamaño, el tití común (Callithrix jacchus). Como modelo de roedor, la asimetría causada por la toxina en la sensibilidad de los receptores entre cuerpo estriado denervado e intacto resulta en el comportamiento de rotación tras la administración i.m. de factores dopaminérgicos, tales como la apomorfina (Annett et al., 1997). La tasa de rotaciones inducidas por apomorfina se relaciona directamente con la disfunción dopaminérgica estriatal y se utiliza para evaluar la eficacia terapéutica de diferentes tratamientos de la EP (Annett et al., Exp. Neurol. 125:228-246, 1994; Annett et al., Brain 115:825-856, 1992). Los titís de 18 a 24 meses de edad fueron lesionados bajo anestesia mediante la administración de 4 mg/ml de peso de base libre de 6-OHDA (Sigma) disueltos en ascorbato en solución salina al 0,01%. Se inyectó 6-OHDA estereotácticamente en cinco sitios en el haz nigroestriatal en un lado del cerebro (coordenadas: AP+6,5; L+/-1,2, V+6 y +7; L+/-2,2, V+6,5 y V+7,5, L+/-3,2, V+7,5, tal como se indica en Stephan et al., Berlin: Springer-Verlag, 1980). Se inyectaron tres microlitros en el sitio más lateral y dos microlitros en los otros cuatro sitios. Se examinaron los animales lesionados con 6-OHDA para el comportamiento de rotación antes de la lesión, tras la lesión antes de la inyección de vectores víricos y un mes después de la inyección de los vectores. Se registraron las rotaciones durante sesiones de 30 minutos desde 30 minutos después de la inyección del fármaco. Se filmaron los titís en una caja de Perspex transparente y se contó el número de rotaciones completas.

En cuatro animales lesionados con 6-OHDA se inyectaron 30 \mul de reservorios víricos de TRIC-VAIE o VAIE-lacZ en el núcleo caudado-putamen en 6 sitios (5 \mul/sitio). Se realizó la evaluación del comportamiento de los monos en tareas de alcance y en ensayos de rotación inducida con apomorfina un mes después de la inyección y a intervalos regulares durante varios meses para el seguimiento de largo plazo. Se sacrificaron los animales y se analizaron secciones de tejido cerebral para la inmunorreactividad de la TH tal como se ha descrito anteriormente. Se determinó el nivel de catecolaminas en el cuerpo estriado denervado mediante HPLC y detección electroquímica (tal como se ha descrito anteriormente).

Ejemplo 14 Vectores TRIC-VAIE utilizados para corregir el modelo de primate MPTP de la enfermedad de Parkinson

El modelo de primate de la enfermedad de Parkinson se considera el modelo de estándar de oro para la evaluación de potenciales terapias previamente al inicio de los ensayos clínicos con seres humanos. Este modelo se desarrolló originalmente a partir de la observación al principio de 1980 de que grupos de personas más jóvenes desarrollaban un trastorno neurodegenerativo inesperadamente similar a la enfermedad de Parkinson idiopática. El origen de este trastorno se ha asociado a la utilización de una droga de uso callejero, y específicamente al compuesto químico conocido 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) (Langston, Trends in Pharmacol. Sci. 6:375-378, 1985). Al administrar MPTP en primates, los animales desarrollaron un trastorno parquinsoniano que se ha convertido en el modelo de principio para el ensayo de agentes anti-parquinsonianos. La MPTP administrada periféricamente atraviese la barrera hematocefálica, en donde es convertida en MPP+ por la monoaminaoxidasa B (MAO-B). MPP+ es una potente neurotoxina que finamente provoca la degeneración de la ruta nigroestriatal de la dopamina, tal como se observa en la enfermedad de Parkinson.

Se convirtieron monos Cynomolgus (Macaca fascicularis) en parquinsonianos mediante inyecciones intravenosas semanales de 0,5 a 1 mg/kg de MPTP durante diez meses consecutivos. Se entrenaron los animales para llevar a cabo tareas motoras finas previamente a la administración de MPTP. Se sometieron a ensayo los monos parquinsonianos para una reducción marcada de la actividad espontánea, temblor de acción bilateral, bloqueo y alteraciones de la postura y del equilibrio para evaluar la eficacia de la lesión. Los déficits motores se evalúan según una escala de evaluación de discapacidad de primates no humanos (Herrero et al., Neuroscience 56:965-72, 1993). Además, también se proporciona apomorfina (0,1 mg/kg i.m.) cada dos semanas para someter a ensayo la aparición del comportamiento de rotación en círculos. Se dejó que los monos se recuperasen de la última administración de MPTP durante 3 meses antes de la transducción intraestriatal. Se anestesiaron los animales con una mezcla de quetamina (10 mg/kg) y midazolán (1 mg/kg) y se introdujeron en el marco estereotáctico. Se perforó un orificio en el cráneo al nivel del ventrículo frontal derecho según el atlas de Szabo y Cowan (Szabo y Cowan, J. Comp. Neurol. 222:265-300, 1984) y se llevó a cabo una ventriculografía mediante la inyección de 0,4 ml de Omnigrass en el ventrículo derecho. Se midió la línea intercomisural (línea AC-PC) y se ajustaron las coordenadas del núcleo putamen según el atlas.

\newpage

Se inyectaron estereotácticamente de manera unilateral en el putamen izquierdo en dos sitios a lo largo del eje rostrocaudal utilizando una jeringa de Hamilton los vectores víricos TRIC-VAIE y lacZ-VAIE (5 \mul de \sim1 a 5x10^{9} u.t./ml). Brevemente, se inyectaron 2x5 \mul de \sim1 a 5x10^{9} u.t./ml en el núcleo putamen de la manera siguiente: putamen rostral, AP +3,4 mm desde el punto medio de la línea AC-PC; ML 12 mm desde el seno longitudinal, y VD 15 mm por debajo de la duramadre. Los animales recibieron antibióticos (ampicilina 250 mg/día, i.m.) profilácticamente durante dos semanas y analgesia con fármacos antiinflamatorios no esteroideos (flunixina, 2,5 mg/kg). Se realizó un seguimiento periódico de los animales (cada dos semanas) durante 3 a 5 meses con el fin de determinar si los vectores terapéuticos mejoraban el comportamiento parquinsoniano (During et al., 1994). Se sometieron a ensayo para déficits motores tal como se ha indicado anteriormente. Al final del periodo experimental, los animales se perfundieron transcárdicamente con PFA al 4% en PBS. Los cerebros se fijaron durante la noche en el mismo fijador a 4ºC y después se sumergieron en sacarosa al 30% en PBS. Se cortaron secciones coronales de cerebro (de 30 \mum de grosor) en un micrótomo de congelación y se recolectaron en PBS. Se analizaron la inmunorreactividad frente a TH y los niveles de catecolaminas en el putamen denervado tal como se ha descrito anteriormente.

Todas las publicaciones mencionadas en la memoria anterior se incorporan a la presente memoria como referencia. Diversas modificaciones y variaciones de los métodos y sistema de la invención descritos resultarán evidentes para el experto en la materia sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención ha sido descrita en relación a formas de realización preferidas específicas, debe entenderse que la invención según las reivindicaciones no debe considerarse indebidamente limitada a dichas formas de realización específicas. En efecto, diversas modificaciones de los modos descritos de puesta en práctica de la invención que resultan evidentes para los expertos en química, biología y campos afines pretenden encontrarse comprendidas dentro del alcance según las reivindicaciones siguientes.

TABLA 1

4

TABLA 2

5

TABLA 3 Eficiencia relativa de integración

6

SEC ID nº 1:

pONY8G

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID nº 2:

PONY8.1G

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\newpage

SEC ID nº 3:

PONY8Z

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

\newpage

SEC ID nº 4

PONY8-BIC

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

\newpage

SEC ID nº 5

PONY8TRIC

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

Claims (25)

1. Genoma de vector lentivírico que comprende tres o más secuencias de nucleótidos de interés ligadas funcionalmente por dos o más sitios internos de entrada ribosómica, en el que las secuencias de nucleótidos de interés codifican una proteína seleccionada de entre el grupo siguiente: tirosina hidroxilasa, GTP-ciclohidrolasa I, aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa y transportador vesicular de monoaminas de tipo 2.

2. Genoma según la reivindicación 1, en el que las secuencias de nucleótidos de interés codifican tirosina hidroxilasa, GTP-ciclohidrolasa I y aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa.

3. Genoma según la reivindicación 1 ó 2, que es derivable del VIH.

4. Genoma según la reivindicación 1 ó 2, que es derivable del VAIE.

5. Genoma según la reivindicación 1 ó 2, en el que el vector lentivírico es un vector lentivírico de no primates.

6. Genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos una de las secuencias de nucleótidos de interés se encuentra funcionalmente ligada a un promotor o elemento(s) promotor(es).

7. Genoma de vector lentivírico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los intensificadores transcripcionales o intensificadores y promotor en la región U3 de la 3'LTR se delecionan, de manera que tras una ronda de transcripción inversa e integración, estos cambios se copian tanto en las LTR 5' como 3' que producen un provirus transcripcionalmente activo, de manera que el vector lentivírico es autoinactivante.

8. Genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que carece del elemento sensible a rev.

9. Genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia de cPPT.

10. Genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un elemento regulador postraanscripcional o un intensificador traduccional.

11. Genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos una de las secuencias de nucleótidos de interés es una secuencia de ARN/ADN optimizada por codones.

12. Genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una de las secuencias de nucleótidos de interés comprende una forma truncada del gen de la tirosina hidroxilasa, que carece del dominio regulador.

13. Sistema de vector que comprende un genoma según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

14. Sistema de vector según la reivindicación 13, que comprende:

(i)

un genoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,

(ii)

una secuencia de nucleótidos codificante de las proteínas lentivíricas gag y pol,

(iii)

secuencias de nucleótidos codificantes de otros componentes de empaquetamiento vírico esenciales no codificados por la secuencia de nucleótidos de ii).

15. Genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o un sistema según la reivindicación 13 ó 14 para la utilización en un método para producir partículas lentivíricas.

16. Método para producir una partícula lentivírica, comprendiendo dicho método introducir en una célula productora:

i)

un genoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,

ii)

una secuencia de nucleótidos codificante de las proteínas lentivíricas gag y pol; y

iii)

secuencias de nucleótidos codificantes de otros componentes esenciales de empaquetamiento vírico no codificados por una o más de las secuencias de nucleótidos de ii).

17. Método según la reivindicación 16, en el que la secuencia de nucleótidos codificante de gag y pol está optimizada por codones optimizados para la expresión en la célula productora.

18. Partícula vírica producida por el sistema según la reivindicación 13 ó 14 o mediante el método según la reivindicación 16 ó 17.

19. Partícula vírica según la reivindicación 18, que es seudotipada con un gen env heterólogo.

20. Partícula vírica según la reivindicación 19, que es seudotipada con un gen codificante de por lo menos parte de la proteína VSV-G.

21. Composición farmacéutica que comprende el genoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, el sistema según la reivindicación 13 ó 14 o la partícula vírica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, conjuntamente con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

22. Utilización de un genoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un sistema según la reivindicación 13 ó 14, o la partícula vírica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento y/o a la prevención de una enfermedad en un sujeto.

23. Utilización según la reivindicación 22, en la que la composición farmacéutica está destinada al tratamiento y/o a la prevención de una enfermedad neurodegenerativa.

24. Utilización según la reivindicación 23, en la que la composición farmacéutica está destinada al tratamiento y/o a la prevención de la enfermedad de Parkinson.

25. Sistema de vector de VAIE según la reivindicación 13, que comprende un genoma que comprende tres secuencias de nucleótidos de interés ligadas funcionalmente a dos IRES, en el que las secuencias de nucleótidos de interés codifican las proteínas siguientes: tirosina hidroxilasa; GTP-ciclohidrolasa I; y aminoácido aromático DOPA-descarboxilasa.