JP2004520016A - ベクターシステム - Google Patents

Abstract

本発明は、レトロウイルスベクターゲノムおよびそのようなゲノムを含むベクターシステムに関する。特に、本発明は、１つ以上の内部リボソームエントリー部位により機能的に結合された２つ以上のＮＯＩを含むレトロウイルスベクター；神経変性疾患の治療に適切な２つ以上のＮＯＩを含むレンチウイルスベクターゲノム、およびチロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩおよび任意選択により芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするレンチウイルスベクターゲノムに関する。

Description

【０００１】
本発明はベクターシステムに関する。特に、本発明はパーキンソン病を治療するのためのレンチウイルスベクターシステムに関する。
【０００２】
［背景技術］
パーキンソン病
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質線条体路の欠失を特徴とする神経変性疾患である。パーキンソン病の原因は不明であるが、運動障害を引き起こすドーパミン作動性（チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性）中脳ニューロンの進行性死滅が関係している。パーキンソン病の特徴的症状は、ＴＨ陽性黒質線条体ニューロンの変性が７０％に及ぶと出現する。
【０００３】
パーキンソン病の十分な治療法は現在のところない。パーキンソン病に関連する運動障害の対症療法は、ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）の経口投与を含む。Ｌ−ＤＯＰＡは、血液脳関門を通過して輸送され、ドーパミンに転換され、少しは残存しているドーパミン作動性ニューロンにより、運動機能の実質的な改善を引き起こす。しかし、数年後、ドーパミン作動性ニューロンの変性は進行し、Ｌ−ＤＯＰＡの効果は低下し、副作用が再発する。従って、より優れたパーキンソン病の治療法が必要とされている。
【０００４】
代替治療法は、神経移植である。これは、線条体に移植された細胞から供給されるドーパミンが、欠失した線条体細胞の代わりとなり得るという考えに基づいている。臨床試験により、ヒト胎児死体（流産胎児）から得られた中脳ＴＨ陽性ニューロンが、パーキンソン病患者の脳内で生存し、機能できることが明らかにされた。しかし、機能回復は部分的でしかなく、この方法の有効性と再現性は限られている。また、流産ヒト胎児から得られた組織を使用することに関連する倫理的、実用的および安全性の問題が存在する。更に、治療効果を引き起こすために必要な大量の組織は、極めて高価であることが判明する可能性が高い。その他の種由来のＴＨ陽性ニューロンを使用する幾つかの試みがなされた（幾つかの倫理的および実際的問題を回避するため）。しかし、異物移植術は免疫抑制療法が必要であり、例えば、感染性物質の種間移動のリスクの可能性があるため意見が分かれる。現行の移植プロトコールにおけるもう１つの欠点は、移植されるＴＨ陽性ニューロンの期待値の５〜２０％未満しか生存しない点である。実用的で有効な移植プロトコールを開発するために、ＴＨ陽性ニューロンの代替供給源が必要とされている。
【０００５】
更なる代替治療法は遺伝子治療である。遺伝子治療は、下記の２つの方法でパーキンソン病に利用できることが示唆されている（Ｄｕｎｎｅｔ Ｓ．Ｂ． およびＢｊｏｒｋｌｕｎｄ Ａ． （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ ３９９ Ａ３２−Ａ３９）。１つは、Ｌ−ＤＯＰＡまたはドーパミン合成に関与する酵素（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ）を導入する事により罹患線条体においてドーパミンを補充する方法、もう１つは損傷された黒質線条体系において、ＴＨ陽性ニューロンの死滅を予防するか、再生と機能回復を促進できる神経保護能を有する分子を導入する方法である。
【０００６】
ｉｎ ｖｏｖｏで、ドーパミンは２つの酵素、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）と芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）によりチロシンから合成される。パーキンソン病は、尾状被殻におけるドーパミン作動性伝達を促進する治療に反応することが明らかにされている。実験動物において、チロシンヒドロキシラーゼを発現し、それによってＬ−ＤＯＰＡを合成する遺伝的修飾細胞は、パーキンソン病の齧歯類モデルにおいて行動回復を引き起こす（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８６：９０１１−１４；Ｆｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ． ４７：５０５−１２； Ｊｉａｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ２６２：４５０５）。
【０００７】
チロシンヒドロキシラーゼの機能活性は、そのコファクターであるテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ_４）に依存する。コファクターの濃度は、脱神経線条体において不十分な可能性があり、従って、ＢＨ_４合成経路の律速段階を触媒する酵素であるＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩも、生体内で十分な濃度のＬ−ＤＯＰＡ産生を得るために形質導入される必要があると考えられる（Ｂｅｎｃｓｉｃｓ ｅｔ ａｌ（１９９６） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １６：４４４９−４４５６； Ｌｅｆｆ ｅｔ ａｌ（１９９８） Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．１５１：２４９−２６４）。
【０００８】
パーキンソン病治療のためのｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療法は既に提案されているが（Ｄｕｎｎｅｔ ａｎｄ Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ （１９９９） 上記； Ｒａｙｍｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：８２−９１； Ｋａｎｇ（１９９８） Ｍｏｖ．Ｄｉｓ．１３：５９−７２）、標的細胞における遺伝子転移と発現の有効性が限られているため、この技術の飛躍的進歩は阻まれている。この点に関する１つの問題点として、標的細胞が通常、形質導入に抵抗性を示すことで有名な非分裂細胞（すなわちニューロン）であることが挙げられる。
【０００９】
１つ以上のタンパク質の発現
ＷＯ９８／１８９３４は、遺伝子治療に利用するためのポリヌクレオチド配列に関する。このポリヌクレオチド配列は、プロモーターに機能的に結合された２つ以上の治療用遺伝子を含み、治療遺伝子の融合タンパク質産物をコードする。これによって、単一の「キメラ遺伝子」から２つの治療用遺伝子を発現する方法が提供される。好ましい実施例において、ポリヌクレオチド配列は、柔軟性のあるリンカーにより連結されたチロシンヒドロキシラーゼおよびドーパデカルボキシラーゼを含む融合タンパク質を、ＴＨ−ＤＤまたはＤＤ−ＴＨのどちらの順番でもコードすることが可能である。
【００１０】
ＷＯ９８／１８９２４に論じられているように、遺伝子転移系の中で、レトロウイルスベクターが遺伝子治療に実質的に有望である。これらのシステムは、遺伝子を効率的に転移でき、遺伝子を脳細胞に送達するのに特に有用な新しいベクターが出現しつつある（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２，２６３）。しかし、文献から、レトロウイルスベクターが遺伝的に単純な状態を維持すれば、最高力価と最も有効な遺伝子発現特性を達成することは明らかである（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０１２３０； Ｂｏｗｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，２４６４； Ｃｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｂｌｏｏｄ ８４， １８１２； Ｅｍｅｒｍｅｎ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎ １９８４ Ｃｅｌｌ ３９，４５９； Ｇｈａｔｔａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，５８４８； Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９ ＰＮＡＳ ８６，３５１９； Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６，８４１６； Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３， １７７９８； Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３，３８１； ＭｃＬａｃｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｖｉｒｏｌ．１９５，１； Ｏｖｅｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８， １８０３； Ｓｃｈａｒｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１ ＰＮＡＳ ８８， ４６２６； Ｖｉｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １， ３０７； Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｖｉｒｏｌ． １７１， ３３１； Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７ ＰＮＡＳ ８４，５１９７） 。これは、ベクターゲノム内の単一転写単位を使用し、５’ＬＴＲ内部の配列または自己不活化ＬＴＲを使用して内部プロモーターからの配列からの適切な遺伝子発現を組織化するか、あるいはＷＯ９９／１５６８３に説明されているスプリット−イントロン技術を使用することを意味する。
【００１１】
ＷＯ９８／１８９３４によれば、単一のレトロウイルスベクターから２つのタンパク質を発現する必要がある場合、ポリシストロン性メッセージ中の第二のコーディング配列の翻訳を開始するために、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ；ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）を使用するよりも、（単一のヌクレオチド配列によりコードされた）融合タンパク質としてそれらを発現するのが好ましい。これは、ＷＯ９８／１８９３４によれば、ＩＲＥＳの有効性がしばしば低く、組織依存性であるため、例えば、チロシンからドーパミンへの代謝転換を最大限にしたい場合には、この方法は望ましくないためである。
【００１２】
ＲＮＡのオープンリーディングフレームの間に位置する場合、ＩＲＥＳにより、ＩＲＥＳ成分におけるリボソームの侵入の促進とその後の翻訳の下流からの開始により、下流のオープンリーディングフレームの翻訳が可能となる。レトロウイルスベクターにおけるＩＲＥＳ成分の利用は、研究されてきたが（例えば、ＷＯ９３／０３１４参照）、ＩＲＥＳの下流に位置するｃＤＮＡの発現はしばしば非効率的であることが見いだされている。これは、リボソームとその他の細胞因子の競合によるものと思われる。従って、翻訳開始効率は、ＩＲＥＳ成分数の増加に伴い、低下するものと予測される。
【００１３】
大きな異種遺伝子の発現
異種遺伝子をレシピエント細胞に送達するためにウイルスベクターを使用する概念は公知であるが（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）、形質導入が成功する異種遺伝子の大きさに制限があることは広く受け入れられている（例えば、４４６ページ、第９章、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ”Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ” １９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ参照）。異種遺伝子と関連する調節成分の取り込みにより、ウイルスゲノムの大きさが劇的に増大したら、もはやパッケージング不能となるか、あるいは少なくともパッケージング効率が顕著に低下する多大なリスクが生じるであろう。
【００１４】
本発明の技術における明らかな先入観にもかかわらず、本発明者等は、バイシストロン性カセット（ＴＨおよびＧＴＰ−ＣＨ１をコード）およびトリシストロン性カセット（ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＧＴＰ−ＣＨ１をコード）まで発現するレンチウイルスベクターが、培養およびｉｎ ｖｉｖｏで異種細胞における適切な酵素の発現を生じることが可能であることを明らかにした。トリシストロン性カセットのレンチウイルスベクター内取り込みにより、ＲＮＡゲノムの大きさは（野生型ＲＮＡゲノムよりも）約１０％から３０％増大するが、驚くことに遺伝子転移効率は大きく影響されない。組み込み効率は同等で、ニューロンへの効率的転移が証明されている。更に、発明者等は、このようなベクターが、脱神経組織において、従って、適切なパーキンソン病の齧歯類および霊長類モデルにおいて、特定のカテコールアミン濃度を上昇させるために利用できることを明らかにした。
【００１５】
［発明の概要］
本発明の第一の点は、ウイルスベクターゲノムに関する。本発明の第一の側面における第一の実施態様において、１つ以上の内部リボソームエントリー部位に機能的に結合された２つ以上のＮＯＩ（目的のヌクレオチド配列；ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を含むレトロウイルスベクターゲノムが提供されている。好ましくは、２つ以上の内部リボソームエントリー部位に機能的に結合されたゲノムは３つ以上のＮＯＩを含む。好ましくは、それぞれのＮＯＩは、神経変性疾患の治療に有用である。好ましくは、ゲノムは、レトロウイルスベクターゲノムである。
【００１６】
本発明の第一の側面の第二の実施態様において、神経変性疾患の治療に適切な２つ以上のＮＯＩを含むレンチウイルスベクターゲノムが提供されている。好ましくは、ゲノムは、神経変性疾患の治療に適切な３つ以上のＮＯＩを含む。好ましくはＮＯＩは、１つ以上の内部リボソームエントリー部位により機能的に結合されている。
【００１７】
好ましくは、本発明のこれらの第一および第二の実施態様のＮＯＩは、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼおよび小胞性モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）からなる群から選択されるタンパク質をコードできる。より好ましくは、ＮＯＩは、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ、および任意選択により、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼまたは芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼおよび小胞性モノアミン輸送体２をコードできる。本実施例のＮＯＩは、成長因子および抗体の様なタンパク質もコードできる。
【００１８】
本発明の第一の側面の第三の実施態様において、チロシンヒドロキシラーゼおよびＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩをコードできるレンチウイルスベクターゲノムが提供されている。好ましくは、ゲノムは、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼまたは芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼおよび小胞性モノアミン輸送体２もコードできる。好ましくは、酵素はＮＯＩによりコードされ、ＮＯＩは１つ以上の内部リボソームエントリー部位により機能的に結合されている。
【００１９】
本発明の第二の点はベクターシステムに関する。
【００２０】
本発明の第二の側面の第一の実施態様において、本発明の第一の側面に従うゲノムを含むベクターシステムが提供されている。
【００２１】
本発明の第二の側面の第二の実施態様において、ＲＮＡゲノムをレシピエント細胞に送達できるレンチウイルスベクターシステムが提供されている。この場合、ゲノムは、レンチウイルスの野生型ゲノムよりも長い。好ましくはレンチウイルスベクターシステムは、ＥＩＡＶベクターシステムである。
【００２２】
本発明の更なる側面に従い、以下が提供されている。
−レンチウイルスゲノムのプロデューサー細胞への導入を含むレンチウイルス粒子の生産方法；
−そのようなシステムまたは方法により生産されるウイルス粒子；
−そのようなゲノム、システムまたは粒子を含む医薬組成物；
−疾病を治療および／または予防するために医薬組成物の製造におけるそのようなゲノム、システムまたは粒子の利用；
−そのようなシステムにより形質導入された細胞；
−そのようなゲノム、システム、ウイルス粒子または細胞を利用することによる疾病の治療および／または予防方法。
【００２３】
更なる側面に従い、１つ以上のＩＲＥＳにより機能的に結合されたチロシンヒドロキシラーゼをコードできるヌクレオチド配列、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩをコードできるヌクレオチド配列を含むバイシストロン性カセットが提供されている。芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼおよび小胞性モノアミン輸送体２をコードするバイシストロン性カセットも提供されている。
【００２４】
更なる側面に従い、２つ以上のＩＲＥＳにより機能的に結合されたチロシンヒドロキシラーゼをコードできるヌクレオチド配列、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩをコードできるヌクレオチド配列、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードできるヌクレオチド配列を含むトリシストロン性カセットも提供されている。
【００２５】
［発明の詳細な説明］
本発明の第一の側面はレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターゲノムに関する。
【００２６】
＜レトロウイルス＞
遺伝子治療にウイルスベクターを利用する概念は公知である（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）。
【００２７】
多くのレトロウイルスが存在する。本出願に関して、「レトロウイルス」という言葉は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、エイベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、トリ赤芽球腫症（ＡＥＶ）、およびレンチウイルスを含むその他全てのレトロウイルス科を含む。
【００２８】
レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ（”Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ” １９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ編； ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ， ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ， ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ７５８−７６３）を参照。
【００２９】
レンチウイルスもレトロウイルス科に属するが、レンチウイルスは分裂細胞と非分裂細胞の両者に感染できる（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ （１９９２） ＥＭＢＯ Ｊ．３０５３−３０５８）。
【００３０】
レンチウイルス群は、「霊長類」と「非霊長類」に分けられる。霊長類レンチウイルスの例として、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）があげられる。非霊長類レンチウイルス群には、プロトタイプ「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、および関連するヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血（ＥＩＡＶ）、より最近報告されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
【００３１】
幾つかのレンチウイルスのゲノム構造に関する詳細は、本技術において報告されている。具体例として、ＨＩＶおよびＥＩＡＶに関する詳細は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに見いだせる（すなわちＧｅｎｏｍｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＡＦ０３３８１９およびＡＦ０３３８２０にそれぞれ見いだせる）。ＨＩＶ変株の詳細も、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ．に見いだせる。ＥＩＡＶ変株の詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｆｏｖ．に見いだせる。
【００３２】
感染課程で、レトロウイルスはまず特異的細胞表面レセプターに付着する。感受性宿主細胞内に侵入すると、次にレトロウイルスＲＮＡゲノムは、親ウイルス内部に保持されているウイルスによりコードされた逆転写酵素によりＤＮＡにコピーされる。このＤＮＡは、宿主細胞核に輸送され、そこで宿主ゲノムに実質的に組み込まれる。この段階で、これはプロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、更にウイルスを作製するために必要なタンパク質とその他の因子をコードし、ウイルスは、「出芽」と時に呼ばれるプロセスにより、細胞から放出される。
【００３３】
各レトロウイルスゲノムは、ビリオンタンパク質と酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含む。これらの遺伝子は、両端を長末端反復（ＬＴＲ）と呼ばれる領域で挟まれている。ＬＴＲは、プロウイルス組み込みと転写に関与する。ＬＴＲは、エンハンサー−プロモーター配列としても作用する。換言すれば、ＬＴＲはウイルス遺伝子の発現を調節できる。レトロウイルスＲＮＡをカプセルに包み込む過程は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列により起こる。
【００３４】
ＬＴＲそのものは、Ｕ３、Ｒ、Ｕ５と呼ばれる３つの成分に分割できる同一配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に独特の配列から得られる。Ｒは、ＲＮＡの両端で反復される配列から得られ、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に独特の配列から得られる。３つの成分の大きさは、種々のレトロウイルス間で大きく異なることがある。
【００３５】
ウイルスゲノムに関して、転写開始部位は、左側ＬＴＲのＵ３とＲｎｏ境界であり、ポリアデニル酸付加（終結）の部位は、右側ＬＴＲ のＲとＵ５の境界である。Ｕ３は、プロウイルスの転写制御因子の殆どを含み、これには細胞転写活性化タンパク質および、場合によってはウイルス転写活性化タンパク質に反応性のプロモーターおよび複数のエンハンサー配列が含まれる。幾つかのレトロウイルスは、遺伝子発現の制御に関与するタンパク質をコードする、以下の遺伝子、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｔａｘ、ｒｅｘの内いずれか１つ以上の遺伝子を有する。
【００３６】
構造遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖそのものに関して、ｇａｇはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質は、タンパク質分解処理され、成熟タンパク質ＭＡ（基質）、ＣＡ（キャプシド）、ＮＣ（ヌクレオキャプシド）となる。ｐｏｌ遺伝子は、逆転写酵素（ＲＴ）をコードし、逆転写酵素はＤＮＡポリメラーゼ、関連するリボヌクレアーゼＨ、インテグラーゼ（ＩＮ）を含み、これらはゲノムの複製を仲介する。ｅｎｖ遺伝子は、ビリオンの表面（ＳＵ）糖タンパク質と膜貫通（ＴＭ）タンパク質をコードし、これらは細胞レセプタータンパク質と特異的に相互作用する複合体を形成する。この相互作用により、ウイルス膜と細胞膜の融合による感染が最終的に引き起こされる。
【００３７】
レトロウイルスは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ以外のタンパク質をコードする「更なる」遺伝子を含むこともある。更なる遺伝子の具体例として、ＨＩＶにおける１つ以上のｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆが挙げられる。例えば、ＥＩＡＶは、更なる遺伝子Ｓ２およびｄＵＴＰａｓｅを有する。
【００３８】
更なる遺伝子によりコードされたタンパク質は種々の機能を発揮し、その幾つかは、細胞タンパク質により供給される機能の複製の場合がある。例えば、ＥＩＡＶにおいて、ｔａｔはウイルスＬＴＲの転写活性化剤として作用する。ｔａｔは、ＴＡＲと呼ばれる安定なステムループＲＮＡ二次構造に結合する。ｒｅｖは、ｒｅｖ反応成分（ＲＲＥ）を通してウイルス遺伝子の発現を制御し、調整する。これら２つのタンパク質の作用機序は、霊長類ウイルスにおける類似機序とおおまかには同様であると考えられる。Ｓ２の機能は不明である。更に、ＥＩＡＶタンパク質、Ｔｔｍは、貫膜タンパク質の開始時にｅｎｖコーディング配列にスプライシングされるｔａｔの第一のエキソンによりコードされることが確認されている。
【００３９】
＜送達システム＞
レトロウイルスベクターシステムは、特にＮＯＩを１つ以上の目的の部位に移入するための送達システムとして提唱されてきた。移送は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはそれらの組み合わせにおいて生じ得る。レトロウイルスベクターシステムは、レセプターの使用法、逆転写、ＲＮＡパッケージングを含むレトロウイルスのライフサイクルの種々の点に関する研究のためにも開拓されてきた（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２ Ｃｕｔｔ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：１−２４により概説されている）。
【００４０】
組み換えレトロウイルスベクター粒子は、レシピエント細胞にＮＯＩを形質導入することが可能である。一旦細胞内に入ると、ベクター粒子のＲＮＡゲノムは、ＤＮＡに逆転写され、レシピエント細胞のＤＮＡに組み込まれる。
【００４１】
本明細書に使用されている「ベクターゲノム」は、レトロウイルスベクター粒子に存在するＲＮＡ構造物と、組み込まれたＤＮＡ構造物の両者を意味する。この言葉は、そのようなＲＮＡゲノムをコードできる別々の、すなわち分離されたＤＮＡ構造物も包含する。レトロウイルスまたはレンチウイルスゲノムは、レトロウイルスまたはレンチウイルスから誘導可能な少なくとも１つの構成部分を含むべきである。「誘導可能な」という言葉は、その一般的な意味で、必ずしもレンチウイルスの様なウイルスから得られなくてはならないわけではなく、それから誘導できるヌクレオチド配列またはその一部を意味するものとして使用される。具体例として、配列は合成により、あるいは組み換えＤＮＡ技術を利用することにより調製できる。好ましくは、ｐｓｉ領域（またはカプセル化を引き起こすことが可能な類似成分）を含む。
【００４２】
ウイルスベクターゲノムは、好ましくは「複製欠損性」であり、これは、レシピエント細胞内に感染性ウイルス粒子を生産する独立複製を単独で可能にするのに十分な遺伝情報を含まないことを意味する。好ましい実施例において、ゲノムは機能性ｅｎｖ、ｇａｇまたはｐｏｌ遺伝子を欠失している。
【００４３】
ウイルスベクターゲノムは、長末端反復（ＬＴＲ）の幾つかまたは全てを含むことができる。好ましくは、ゲノムはプロウイルス組み込みと転写を仲介できるＬＴＲの少なくとも一部または類似配列を含む。配列は、エンハンサー−プロモーター配列も含むか、あるいはその様な配列として作用する。
【００４４】
本発明の第一の側面のウイルスベクターゲノムは、部品を含むキットとして供給できる。例えば、キットは、（ｉ）ＮＯＩおよびＩＲＥＳ配列を含むプラスミド；および（ｉｉ）ウイルスゲノムの中にＮＯＩおよびＩＲＥＳをクローニングするための適切な制限酵素認識部位を有するレトロウイルスゲノム構造物を含んでも良い。
【００４５】
同じ細胞内に同時導入された別々のＤＮＡ配列においてレトロウイルスベクター粒子を生産するために必要な成分が別々に発現すると、治療遺伝子を有する欠損レトロウイルスゲノムを有するレトロウイルス粒子を生じることは公知である（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ １９９２により概説されている。）。この細胞はプロデューサー細胞と呼ばれる（下記参照）。
【００４６】
プロデューサー細胞を生産する２つの一般的方法がある。一方法において、レトロウイルスＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖタンパク質をコードする配列が細胞内に導入され、安定して細胞ゲノム内に組み込まれる。安定な細胞システムが生産され、これはパッケージング細胞システムと呼ばれる。パッケージング細胞システムは、レトロウイルスＲＮＡのパッケージに必要なタンパク質を生産するが、ｐｓｉ領域の欠失によりカプセル化は達成できない。しかし、本発明の第一の点のベクターゲノム（ｐｓｉ領域を有する）がパッケージング細胞システムに導入されると、ヘルパータンパク質がｐｓｉ陽性組み換えベクターＲＮＡをパッケージし、組み換えウイルス株を生産できる。これは、ＮＯＩをレシピエント細胞に形質導入するために利用できる。ウイルスタンパク質を作製するために必要な全ての遺伝子を欠失している組み換えウイルスは、一回だけ感染させることができるが、増殖はできない。従って、ＮＯＩは有害なレトロウイルスを生産せずに、宿主細胞ゲノムの中にＮＯＩが導入される。利用可能なパッケージングシステムの概要は「レトロウイルス」（１９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 編；ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ， ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ， ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ４４９）に記載されている。
【００４７】
本発明は、本発明の第一の点のウイルスベクターゲノムを含むパッケージング細胞系も提供する。例えば、パッケージング細胞系は、そのゲノムを含むウイルスベクターシステムにより形質導入でき、あるいはそのＲＮＡゲノムをコードできるＤＮＡ構造物を有するプラスミドによりトランスフェクションできる。本発明は、そのような細胞により生産されるレトロウイルス（またはレンチウイルス）ベクター粒子も提供する。
【００４８】
第二の方法は、レトロウイルスベクター粒子を生産するために必要な３つの異なるＤＮＡ配列、すなわちｅｎｖコーディング配列、ｇａｇ−ｐｏｌコーディング配列および１つ以上のＮＯＩを含む欠損レトロウイルスゲノムを同時に、一過性トランスフェクションにより導入するもので、この方法は一過性トリプルトランスフェクションと呼ばれる（Ｌａｎｄａｕ ＆ Ｌｉｔｔｍａｎ １９９２； Ｐｅａｒ ｅｔ ａｌ １９９３）。トリプルトランスフェクション法は最適化されている（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ １９９５； Ｆｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ １９９４）。ＷＯ９４／２９４３８に、このマルチプルＤＮＡトランスフェクション法を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏのプロデューサー細胞生産が説明されている。
【００４９】
ベクターゲノムを補足するために必要なウイルス系の成分は、細胞内にトランスフェクションするための１つ以上の「プロデューサープラスミド」に存在できる。
【００５０】
本発明は、（ｉ）本発明の第一の点のウイルスゲノム；
（ｉｉ）レンチウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）ｉｉ）のヌクレオチド配列によりコードされていないその他の必須ウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列を含むベクターシステムも提供する。好ましい実施例において、ヌクレオチド配列（ｉｉｉ）は、ｅｎｖタンパク質をコードできる。本発明は、そのようなベクターシステムによりトランスフェクションされた細胞と、そのような細胞により生産されるレンチウイルス粒子も提供する。好ましくは、ｇａｇ−ｐｏｌ配列は、特定のプロデューサー細胞における利用のために最適化されたコドンである（下記参照）。
【００５１】
（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列によりコードされるｅｎｖタンパク質は、同種レトロウイルスまたはレンチウイルスｅｎｖタンパク質である。あるいは、異種ｅｎｖまたは非レトロウイルスまたはレンチウイルス由来のｅｎｖでもよい（下記「シュードタイピング」の下参照）。
【００５２】
「ウイルスベクターシステム」という言葉は、一般に、宿主細胞においてウイルス粒子を生産するためのウイルス粒子生産に必要なその他の成分と組み合わせられた時、利用できる部分から成るキットを意味するために使用される。例えば、レトロウイルスベクターゲノムは、ウイルス複製に必要な１つ以上の遺伝子を欠失している場合がある。これは、例えば、１つ以上のプロデューサープラスミドの更なる補足的ヌクレオチド配列とキットの中で組み合わせることができる。ゲノムとプロデューサープラスミドの同時トランスフェクションにより、感染性ウイルス粒子の生産のために、必要な成分が供給される。
【００５３】
あるいは、補足的ヌクレオチド配列は、キットの中に含まれるパッケージング細胞系の中に安定して含めることができる。
【００５４】
本発明は、ＲＮＡゲノムをレシピエント細胞に送達できるレンチウイルスベクターシステムにも関する。この場合ゲノムはレンチウイルスの野生型ゲノムよりも長い。ベクターシステムは、例えば、ＥＩＡＶベクターシステムである。
【００５５】
好ましくは、ベクターシステムのＲＮＡゲノムは、野生型ゲノムよりも５％、より好ましくは１０％または３０％まで塩基が多い。好ましくは、ＲＮＡゲノムは、野生型ゲノムよりも約１０％長い。例えば、野生型ＥＩＡＶは、約８ｋｂのＲＮＡゲノムを含む。本発明のＥＩＡＶベクターシステムは、８．８ｋｂまでの（好ましくはおよそ８．８ｋｂ）のＲＮＡゲノムを有する。
【００５６】
好ましくは、本発明のレトロウイルスベクターシステムは自己不活化（ＳＩＮ）ベクターシステムである。
【００５７】
具体例として、自己不活化レトロウイルスベクターシステムは、３’ＬＴＲのＵ３領域においてエンハンサーまたはエンハンサーとプロモーターを削除することにより作製されている。ベクターの逆転写と組み込みが一回りした後、これらの変化は５’および３’ＬＴＲの両方にコピーされ、転写不活性プロウイルスが生じる。しかし、このようなベクターのＬＴＲの内部のプロモーターは全てまだ転写活性を有する。この方法は、内部にある遺伝子から、転写に及ぼすウイルスＬＴＲ内部のエンハンサーとプロモーターの影響を減じるために使用されてきた。このような影響には、転写の増大または転写の抑制が含まれる。この方法は、３’ＬＴＲからゲノムＤＮＡへの下流転写を減じるためにも利用できる。これは、内因性オンコジーンの外因性活性化を予防することが重要と思われる遺伝子治療において特に重要である。Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８６） ＰＮＡＳ ８３； ３１９４−９８； Ｍａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７２： ８８５−７； Ｎａｖｉａｕｘ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０： ５７０１−５； Ｉｗａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｖｉｒｏｌ．２６１： １２０−３２； Ｄｅｇｉｏｎ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１７９−９０。
【００５８】
好ましくは、本発明のプロデューサー細胞からの高力価制御レンチウイルスベクターの生産を促進するリコンビナーゼ補助機序が使用される。
【００５９】
本明細書に使用されている「リコンビナーゼ補助システム」には、Ｃｒｅリコンビナーゼ／バクテリオファージＰ１のｌｏｘＰ認識部位または３４ｂｐ ＦＬＰ認識標的（ＦＲＴ）の間の組み換えイベントを触媒するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの部位特異的ＦＬＰリコンビナーゼを使用するシステムが含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
３４ｂｐ ＦＬＰ認識標的（ＦＲＴ）の間の組み換えイベントを触媒するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの部位特異的ＦＬＰリコンビナーゼは、リコンビナーゼ補助組み換えイベントを使用して高レベルプロデューサー細胞系を生産するために、ＤＮＡの中に形成された（Ｋａｒｒｅｍａｎ ｅｔ ａｌ （１９９６） ＮＡＲ ２４：１６１６−１６２４）。同様のシステムが、Ｃｒｅリコンビナーゼ／バクテリオファージＰ１のｌｏｘＰ認識部位を用いて開発された（Ｖａｎｉｎ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７１：７８２０−７８２６）。これは、高力価レンチウイルスプロデューサー細胞系が産生される様にレンチウイルスゲノムの中に形成された。
【００６１】
プロデューサー／パッケージング細胞システムを使用することにより、例えば、（成人脳組織のような）目的部位の実質的な形質導入のために大量のレトロウイルスベクター粒子を増殖し、分離することが（例えば、適切な力価のレトロウイルスベクター粒子を作製することが）可能である。プロデューサー細胞系は通常、ベクター粒子の大量生産にとってより優れている。
【００６２】
一過性トランスフェクションは、パッケージング細胞法を凌ぐ多くの利点を有する。この観点から、一過性トランスフェクションは、安定なベクター−生産細胞系を生産するのに必要なより長い時間を要さず、ベクターゲノムまたはレトロウイルスパッケージング成分が細胞毒性を有する場合に使用される。ベクターゲノムが細胞サイクル阻害剤またはアポトーシスを誘導する遺伝子の様な毒性遺伝子または宿主細胞の複製を阻害する遺伝子をコードする場合、安定なベクター生産細胞系を産生するのは困難な場合があるが、一過性トランスフェクションは、細胞が死滅する前にベクターを生産するために利用できる。また、細胞系は、安定なベクター生産細胞系から得られるレベルに匹敵するベクター力価レベルを生じる一過性感染を用いて作製されている（Ｐｅａｒ ｅｔ ａｌ １９９３， ＰＮＡＳ ９０：８３９２−８３９６）。
【００６３】
プロデューサー細胞／パッケージング細胞システムは、適切な細胞型の全てが可能である。プロデューサー細胞は一般に哺乳動物細胞であるが、例えば、昆虫細胞でもよい。
【００６４】
本明細書に使用されている「プロデューサー細胞」または「ベクター生産細胞」という言葉は、レトロウイルスベクター粒子の生産に必要な全ての成分を含む細胞を意味する。
【００６５】
好ましくは、プロデューサー細胞は、安定なプロデューサー細胞系から得られる。
【００６６】
好ましくは、プロデューサー細胞は、安定な誘導プロデューサー細胞系から得られる。
【００６７】
好ましくは、プロデューサー細胞は、誘導プロデューサー細胞系から得られる。
【００６８】
本明細書に使用されている「誘導プロデューサー細胞系」という言葉は、マーカー遺伝子の高度の発現に関して、スクリーニングと選択が行われた形質導入プロデューサー細胞系である。このような細胞系は、レトロウイルスゲノムからの高度発現を維持する。「誘導プロデューサー細胞系」という言葉は、「安定な誘導プロデューサー細胞系」または「安定なプロデューサー細胞系」という言葉と互換性がある。
【００６９】
好ましくは、誘導プロデューサー細胞系には、レトロウイルスおよび／またはレンチウイルスプロデューサー細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
好ましくは、誘導プロデューサー細胞系はＨＩＶまたはＥＩＡＶ細胞系であり、より好ましくはＥＩＡＶプロデューサー細胞系である。
【００７１】
好ましくは、エンベロープタンパク質「配列」およびヌクレオキャプシド配列は全て、プロデューサー細胞および／またはパッケージング細胞に安定して組み込まれる。しかし、１つ以上のこれらの配列が、エピソーム形態で存在することも可能で、遺伝子発現はエピソームから生じることができる。
【００７２】
本明細書に使用されている「パッケージング細胞」という言葉は、ＲＮＡゲノムに欠失している感染性組み換えウイルスの生産に必要な成分を含む細胞を意味する。典型的には、このようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質（例えば、コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ）を発現できるが、パッケージングシグナルは含まない１つ以上のプロデューサープラスミドを含む。
【００７３】
「パッケージング配列」または「ｐｓｉ」と互換的に呼ばれる「パッケージングシグナル」という言葉は、ウイルス粒子形成時にレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプセル化に必要な非コーディング、シス作用配列に関して使用される。ＨＩＶ−１において、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）から少なくともｇａｇ開始コドンまでにわたる遺伝子座にマッピングされている。
【００７４】
上記ベクター構造物との併用に適したパッケージング細胞系は、容易に調製でき（ＷＯ９２／０５２６６も参照）、レトロウイルスベクター粒子生産のためのプロデューサー細胞系の作製に利用される。既述の様に、入手可能なパッケージング細胞系の概要は、「レトロウイルス」（上記）に記載されている。
【００７５】
上記に議論されているように、パッケージングシグナルが削除されたプロウイルスを含む単純なパッケージング細胞系は、組み換えにより望ましくない複製コンピテントウイルスの迅速な生産を引き起こすことが見いだされている。安全性を改善するために、プロウイルスの３’ＬＴＲが削除された第二世代の細胞系が生産された。このような細胞において、野生型ウイルスを生産するために２つの組み換えが必要と思われる。更なる改善には、別々の構造物におけるｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子とｅｎｖ遺伝子の導入、いわゆる第三世代パッケージング細胞系が含まれる。これらの構造物は、トランスフェクション中の組み換えを予防するために逐次導入される。
【００７６】
好ましくは、パッケージング細胞系は第二世代パッケージング細胞系である。
【００７７】
好ましくは、パッケージング細胞系は第三世代パッケージング細胞系である。
【００７８】
これらの分割構造物、第三世代細胞系において、組み換えにおける更なる削減が、コドンの変更により達成できる。遺伝子コードの重複性に基づくこの技術は、別々の構造物間、例えば、ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖオープンリーディングフレームにおけるオーバーラップ領域間の相同性を減少させることを目的としている。
【００７９】
パッケージング細胞系は、高力価ベクター粒子生産のためにカプセル化と膜タンパク質の供給が必要な遺伝子産物の供給に有用である。パッケージング細胞は、組織培養細胞系の様なｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞が可能である。適切な細胞系には、マウス繊維芽細胞誘導細胞系またはヒト細胞系のような哺乳動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、パッケージング細胞系は、例えば、ＨＥＫ２９３、２９３Ｔ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０の様な霊長類またはヒト細胞系である。
【００８０】
あるいは、パッケージング細胞は、単核細胞、マクロファージ、血球または繊維芽細胞の様な、投与される患者から得られる細胞が可能である。細胞は患者から分離され、パッケージングおよびベクター成分が体外で投与され、続いて自己由来パッケージング細胞の再投与が行われる。
【００８１】
高力価ウイルス製剤の使用は、実験的適用と実用的適用の両者においてきわめて望ましい。ウイルス力価を高める技術には、上記のｐｓｉとパッケージシグナルの併用と、ウイルス原液の濃縮が含まれる。
【００８２】
本明細書に使用されている「有効量」とは、標的部位におけるＮＯＩの発現を誘導するのに十分な制御されたレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターまたはベクター粒子の量である。
【００８３】
プロデューサー細胞／パッケージング細胞のための高力価ウイルス製剤は通常、１ｍｌあたりウイルス粒子数１０^５から１０^７のオーダーである。脳のような組織における形質導入には、極めて少量を使用する必要があるため、ウイルス製剤は超遠心分離法により濃縮される。得られた製剤は少なくとも１０^８ｔ．ｕ．／ｍｌ、好ましくは１０^８から１０^９ｔ．ｕ．／ｍｌ、より好ましくは１０^９ｔ．ｕ．／ｍｌでなくてはならない（力価は、標準Ｄ１７細胞系における力価として、１ｍｌあたりの形質導入単位（ｔ．ｕ．／ｍｌ）で表される−具体例９参照）。限外濾過または基質への結合と基質からの溶出の様なその他の濃縮方法が利用できる。
【００８４】
ＮＯＩによりコードされる発現産物は、細胞から分泌されるタンパク質が可能である。あるいはＮＯＩ発現産物は分泌されず、細胞内で活性である。幾つかの応用例において、ＮＯＩ発現産物に関して、傍観者効果または遠隔傍観者効果、すなわち、ある細胞における発現産物の生産が、共通の表現型を有する更なる隣接または遠隔（例えば、転移性）関連細胞の調整を引き起こすことを証明することが好ましい。Ｚｅｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ．，（２０００） Ｃｅｌｌ １０１： １７３； Ｆｏｌｌｅｕｚｉ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５： ２１７；Ｚｅｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９： ４４６。
【００８５】
中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と呼ばれる配列の存在により、非分裂細胞への遺伝子送達効率が改善される。このｃｉｓ作用成分は、例えば、ＥＩＡＶポリメラーゼコーディング領域成分に位置する。好ましくは、本発明のゲノムは、ｃＰＰＴ配列を含む。
【００８６】
好ましくは、ウイルスゲノムは、翻訳後制御成分を含む。例えば、ゲノムは、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後制御成分（ＷＰＲＥ）の様な成分を含むことができる。Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３： ２８８６； Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２： １１０３。
【００８７】
更に、または代わりに、ウイルスゲノムは翻訳エンハンサーを含むことができる。
【００８８】
ＮＯＩは、１つ以上のプロモーター／エンハンサー成分に機能的に結合されることが可能である。１以上のＮＯＩの転写は、ウイルスＬＴＲあるいはプロモーターーエンハンサー成分により制御下にある場合がある。好ましくは、プロモーターは、ＣＭＶの様な強力なウイルスプロモーターであるか、ＰＧＫ、β−アクチンまたはＥＦ１αの様な細胞構成性プロモーターである。プロモーターは、制御されるか、組織特異的である。このようなプロモーターは、ニューロフィラメント、テスチン、パーキン、ドーパミンレセプター、チロシンヒドロキシラーゼ等の遺伝子から選択され得る。このようなプロモーターは、ミューオピオイドレセプター遺伝子に見いだされる様に、神経拘束性抑制遺伝子配列も含むことができる。好ましい実施例において、プロモーターはグリア特異的またはニューロン特異的である。発現の制御は、外部物質（この場合テトラサイクリンまたはその同族体）に反応して、遺伝子発現のスイッチを入れたり、切ったりするテトラサイクリンの様なシステムを使用することによっても達成できる。
【００８９】
＜シュードタイピング＞
レトロウイルスベクターシステムのデザインにおいて、拡大された、あるいは変更された範囲の細胞型に遺伝物質を送達できる様に、天然のウイルスに対する宿主標的細胞特異性を有する粒子を作製することが望ましい。これを達成する一方法は、その特定を変えるためにウイルスエンベロープタンパク質を作製することにより達成される。別の方法は、異種エンベロープタンパク質をベクター粒子に導入し、ウイルスの天然エンベロープタンパク質と置換するか、追加する方法である。
【００９０】
シュードタイピングという言葉は、例えば、異種ｅｎｖ遺伝子を持つウイルスゲノムのｅｎｖ遺伝子、例えば、別のウイルスのｅｎｖ遺伝子の少なくとも一部に組み込まれるか、その一部を置換するか、あるいはその全てを患者することを意味する。シュードタイピングは、新しい現象ではなく、例がＷＯ９９／６１６３９、ＷＯ−Ａ−９８／０５７５９、ＷＯ−Ａ−９８／０５７５４、ＷＯ−Ａ−９７／１７４５７、ＷＯ−Ａ−９６／０９４００、ＷＯ−Ａ−９１／０００４７、およびＭｅｂａｔｓｉｏｎ ｅｔ ａｌ １９９７ Ｃｅｌｌ ９０， ８４１−８４７に見いだせる。
【００９１】
本発明の好ましい実施例において、ベクターシステムは、狂犬病Ｇタンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子によりシュードタイピングされる。
【００９２】
レンチウイルス最小システムは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶウイルスから作製できる。このようなシステムは、ベクター生産のためにも、分裂細胞と非分裂細胞の形質導入のためにも、更なる遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆのいずれをも必要としない。ＥＩＡＶ最小ベクターシステムは、ベクター生産のためにも、分裂細胞と非分裂細胞の形質導入のためにもＳ２を必要とせずに作製できることも証明されている。更なる遺伝子の削除は、極めて有利である。まず、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）における疾病に関連する遺伝子を含めずにベクターを生産することが可能となる。特に、ｔａｔは疾病に関係している。第二に、更なる遺伝子の削除により、ベクターはより異種性の高いＤＮＡをパッケージすることが可能となる。第三に、その機能が未知の遺伝子、例えば、Ｓ２を削除できると、望ましくない影響を引き起こすリスクを削減できる。最小レンチウイルスベクターの具体例は、ＷＯ−Ａ−９９／３２６４６およびＷＯ−Ａ−９８／１７８１５に開示されている。
【００９３】
従って、本発明において使用される送達システムは、少なくともｔａｔとＳ２を含まず（ＥＩＡＶベクターシステムの場合）、恐らくｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕ、ｎｅｆも含まない。より好ましくは、本発明のシステムは、ｒｅｖも含まない。ｒｅｖは、一部のレトロウイルスゲノムにおいて、従来、十分なウイルス生産に必須と考えられていた。例えば、ＨＩＶの場合、ｒｅｖおよびＲＲＥ配列は含めなくてはならないと考えられていた。しかし、ｒｅｖとＲＲＥの必要性は、コドン最適化（下記参照）により、あるいはＭＰＭＶシステムの様なその他の機能性同等システムによる置換により、削減できる。コドン最適化されたｇａｇ−ｐｏｌの発現は、ＲＥＶ非依存性で、ＲＲＥはｇａｇ−ｐｏｌ発現カセットから除去できるので、ベクターゲノムに含まれるあらゆるＲＲＥとの組み換えの可能性が削減される。
【００９４】
好ましい実施例において、本発明の第一の点のウイルスゲノムは、Ｒｅｖ反応成分（ＲＲＥ）を欠失している。
【００９５】
好ましい実施例において、本発明において使用されるシステムは、更なる遺伝子の一部または全てが除去されている所謂「最小」システムに基づく。
【００９６】
＜コドン最適化＞
コドン最適化は以前ＷＯ９９／４１３９７に報告されている。細胞が異なると、特定のコドンの利用法も異なる。このコドンの偏りは、その細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在度の偏りに対応する。対応するｔＲＮＡの相対存在度に合う様に、配列中のコドンを変更することにより、発現を増加させることが可能である。同じ様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型においてまれであることが知られているコドンを計画的に選択することにより、発現を減少させることが可能である。この様に、翻訳制御を更に行う事が可能である。
【００９７】
ＨＩＶおよびその他のレンチウイルスを含む多くのウイルスはまれなコドンを多数利用しており、これらを一般に使用される哺乳動物コドンに対応する様に変更することにより、哺乳動物プロデューサー細胞におけるパッケージング成分の発現を増大させることができる。コドン利用表は、哺乳動物細胞と、種々のその他の生物に関して、本技術において公知である。
【００９８】
コドン最適化はその他の利点が多数ある。配列の変更により、プロデューサー細胞／パッケージング細胞におけるウイルス粒子の組み立てに必要なウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列は、ＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）を削除される。同時に、パッケージング成分のアミノ酸配列コーディング配列は保持されるので、その配列によりコードされるウイルス成分は同じか、あるいは少なくともパッケージ成分の機能が損なわれない程度に十分同様である様に保持される。コドン最適化により、輸出のためのＲｅｖ／ＲＲＥの必要性も克服され、最適化配列にＲｅｖ非依存性を付与する。コドン最適化は、ベクターシステム内部の異なる構造物間（例えば、ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖオープンリーディングフレームにおけるオーバーラップ領域間）の相同組み換えを減少させる。従って、コドン最適化の総合的効果は、ウイルス力価の著しい上昇と安全性の改善である。
【００９９】
一実施例において、ＩＮＳに関係するコドンだけがコドン最適化される。しかし、遙かに多くの好ましい、実際的な実施例において、フレームシフト部位を包含する配列を例外として、配列全体がコドン最適化される。
【０１００】
ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をそれぞれコードする２つのオーバーラップするリーディングフレームを含む。両タンパク質の発現は、翻訳中のフレームシフトに依存している。このフレームシフトは、翻訳中のリボソームの「ずれ」の結果発生する。このずれは、少なくとも一部は、リボソーム失速ＲＮＡ二次構造により引き起こされると考えられている。このような二次構造は、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、オーバーラップ領域は、ｇａｇの始まりの下流のヌクレオチド１２２２から（この場合ヌクレオチド１はｇａｇＡＴＧのＡである）、ｇａｇの終わり（ヌクレオチド１５０３）まで延びている。その結果、フレームシフト部位と２つのリーディングフレームのオーバーラップ領域にまたがる２８１ｂｐ断片は、好ましくはコドン最適化されない。この断片を保持することにより、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現が可能となる。
【０１０１】
ＥＩＡＶの場合、オーバーラップの始まりは、ヌクレオチド１２６２と考えられている（この場合ヌクレオチド１はｇａｇＡＴＧのＡである）。オーバーラップの最後は１４６１ｂｐであるフレームシフト部位とｇａｇ−ｐｏｌオーバーラップの保存を確実にするために、野生型配列はヌクレオチド１１５６から１４６５まで保持された。
【０１０２】
最適コドン利用の派生的方法が、例えば、好都合な制限部位の調節のために可能であり、同類アミノ酸置換をｇａｇ−ｐｏｌタンパク質に導入することが可能である。
【０１０３】
極めて好ましい実施態様において、コドン最適化は、高度に発現される哺乳動物遺伝子に基づいた。三番目、しばしば二番目と三番目の塩基を変更できる。
【０１０４】
遺伝コードの変性する性質により、多数のｇａｇ−ｐｏｌ配列が達成できることは精通する技術者にとって明らかである。また、コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ生産の開始点として、利用できる多くのレトロウイルス変異株も報告されている。レンチウイルスゲノムは極めて変異性が高い可能性がある。例えば、なお機能性を有するＨＩＶ−１の多くの準種が存在する。これはＥＩＡＶの場合も同様である。これらの変異株は、形質導入過程の特定の部分を増強するために利用できる。ＨＩＶ−１変異株の具体例は、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｂ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ．に報告されている。ＥＩＡＶクローンの詳細は、ＮＣＢＩデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．に報告されている。
【０１０５】
コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列の方法は、あらゆるレトロウイルスに関して使用できる。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２を含む全てのレンチウイルスに適用される。更に、好ましい方法は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶおよびヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶおよびその他のレトロウイルスの遺伝子の発現を増大させるためにも利用できる。
【０１０６】
コドン最適化は、ｇａｇ−ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存性にすることができる。しかし、レトロウイルスベクターにおいて抗ｒｅｖまたはＲＲＥ因子の利用を可能にするために、ウイルスベクター生産システムを全体としてＲｅｖ／ＲＲＥ非依存性にする必要があると思われる。これは、ベクターゲノム成分を最適化することにより達成される。有利には、これらの修飾により、プロデューサー細胞および形質導入細胞の両者において更なるタンパク質の全てが存在しないより安全なシステムの生産も引き起こす。
【０１０７】
上記のように、レトロウイルスベクターのパッケージング成分には、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子の発現産物が含まれる。更に、効率的なパッケージングは、４つのステムループの短い配列と、それに続くｇａｇおよびｅｎｖの部分配列（「パッケージングシグナル」）に依存している。従って、レトロウイルスベクターゲノムに欠失が引き起こされたｇａｇ配列を含めることにより（パッケージング構造物の完全なｇａｇ配列に加えて）、ベクター力価は最適化される。現在まで、効率的なパッケージングは、なおｅｎｖ配列を保持するベクターにおいてｇａｇの２５５から３６０のヌクレオチドを必要とし、あるいは特定の組み合わせのスプライスドナー突然変異、ｇａｇおよびｅｎｖ欠失において、ｇａｇの約４０のヌクレオチドを必要とすることが報告されている。驚くことに、ｇａｇのＮ末端３６０程のヌクレオチド以外の全てを欠失させることにより、ベクター力価の増大が引き起こされることが見いだされた。従って、好ましくは、レトロウイルスゲノムは、１つ以上の欠失、より好ましくはＮ末端由来の約３６０のヌクレオチドを含むｇａｇ配列を含む。
【０１０８】
＜ＮＯＩ＞
本発明において、ＮＯＩ（目的のヌクレオチド配列）は、あらゆる適切なヌクレオチド配列を含み、これらは必ずしも完全に天然でまたはＲＮＡ配列でなくてもよい。従って、ＮＯＩは、例えば、合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、コドン最適化ＲＮＡ．ＤＮＡ配列、組み換えＲＮＡ／ＤＮＡ配列（すなわち組み換えＤＮＡ技術により調整されたもの）、ｃＤＮＡ配列または部分的ゲノムＤＮＡ配列が、それらの組み換えを含めて可能である。配列は、コーディング領域である必要はない。もしも、配列がコーディング領域である場合、全コーディング領域である必要はない。更に、ＲＮＡ／ＤＮＡ配列は、センス配向でもアンチセンス配向でもよい。好ましくはセンス配向である。好ましくは、配列は、ｃＤＮＡを含むか、ｃＤＮＡに転写される。
【０１０９】
「異種配列」、「異種遺伝子」または「導入遺伝子」とも呼ばれるＮＯＩは、例えば、選択遺伝子、マーカー遺伝子、治療遺伝子のいずれか１つ以上が可能である。
【０１１０】
ＮＯＩは、疾病過程で重大な可能性のある候補遺伝子でもよい。従って、本発明のベクターシステムは、例えば、標的確認目的に利用できる。
【０１１１】
ＮＯＩは、治療または診断利用が可能である。適切なＮＯＩは、酵素、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、アンチオキシダント分子、作製された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、免疫同時刺激分子、免疫修飾分子、アンチセンスＲＮＡ、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ突然変異体、毒素、条件毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質および成長因子、膜タンパク質、血管作用性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、およびそれらの誘導体（例えば、関連レポーター群）をコードする配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
好ましくは、ＮＯＩは神経変性疾患の治療に有用である。
【０１１３】
より好ましくは、ＮＯＩはパーキンソン病の治療に有用である。
【０１１４】
ＮＯＩは、ドーパミン合成または保存に関与する酵素をコードできる。例えば、酵素は、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩおよび／または芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼの１つが可能である。３つの遺伝子全ての配列が利用可能である：寄託番号はそれぞれＸ０５２９０、Ｕ１９５２３、Ｍ７６１８０である。
【０１１５】
あるいは、ＮＯＩは小胞性モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２、寄託番号Ｌ２３２０５．１）をコードできる。好ましい実施態様において、ウイルスゲノムは、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするＮＯＩとＶＭＡＴ２をコードするＮＯＩを含む。このようなゲノムは、パーキンソン病の治療に、特にＬ−ＤＯＰＡの末梢投与と組み合わせて利用できる。
【０１１６】
あるいは、ＮＯＩは、黒質線条体系における変性を遮断または阻害できる成長因子をコードできる。そのような成長因子の例は、神経栄養性因子である。例えば、ＮＯＩは、グリア細胞系由来の神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ペルセフィン成長因子、アルテミン成長因子、またはニューツリン成長因子、毛様神経栄養性因子 （ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、汎親和性ニューロトロフィン、およびその他の関連ニューロトロフィン因子または無関連ニューロトロフィン因子が挙げられる。ＷＯ９９／１４２３６、ＷＯ００／１８７９９、ＵＳ６，０９０，７７８、ＵＳ５，８３４，９１４、ＷＯ９７／０８１９６、ＵＳ６，０９０，７７８、ＵＳ５，２８８，６２２、ＷＯ９２／０５２５４、ＵＳ６，０３７，３２０、ＷＯ９５／３３８２９；Ｂｕｍｇａｒｔｎｅｒ， ＢＪ ａｎｄ Ｓｈｉｎｅ， ＨＤ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７： ６５０４−１１ （１９９７）。好ましい実施例において、レンチウイルスベクターは、１つ以上のこれらの神経栄養性因子をコードするＮＯＩを含む。
【０１１７】
あるいは、ＮＯＩは、神経保護因子をコードできる。特に、ＮＯＩは、ＴＨ陽性ニューロンの死滅を予防する分子、または損傷された黒質線条体系における再生および機能回復を促進する分子をコードできる。
【０１１８】
ＮＯＩは、目的のタンパク質（「ＰＯＩ」）の一部または全て、あるいはそれらの突然変異体、相同体、変異体をコードできる。例えば、ＮＯＩは、野生型タンパク質と同様に生体内で機能できるＰＯＩの断片をコードできる。
【０１１９】
極めて好ましい実施例において、ＮＯＩの１つは、調節領域を欠失した先端を欠いたＴＨ遺伝子を含む。このようなＮＯＩは、全長を有する酵素の発現を制限する可能性のあるドーパミンによるフィードバック阻害を回避する。
【０１２０】
「突然変異体」という言葉は、野生型からの１つ以上のアミノ酸変異を含むＰＯＩを含む。例えば、突然変異体は、１つ以上のアミノ酸付加、欠失または置換を含むことができる。突然変異体は、自然に生じても、人工的に作製することも可能である（例えば、特定部位の突然変異誘発により）。
【０１２１】
ここで「相同体」とは、ＮＯＩと特定の相同関係を有する、またはＰＯＩとある程度の相同性を有するタンパク質をコードする実体を意味する。この場合、「相同性」という言葉は「同一性」と同等と考えられる。
【０１２２】
この様な状況から、相同配列は、対象配列と少なくとも７５、８５または９０％、好ましくは少なくとも９５または９８％同一であるアミノ酸配列を含むと考えられる。典型的には、相同体は、対象アミノ酸配列と同じ活性部位等を含む。相同性は、類似性（すなわち、類似の化学特性／機能を持つアミノ酸残基）の見地から考えることもできるが、本発明に関しては、配列同一性の見地から相同性という表現を使用するのが好ましい。
【０１２３】
本発明において、相同配列は、対象配列と少なくとも７５、８５または９０％、好ましくは少なくとも９５または９８％同一であるヌクレオチド配列を含むと考えられる。典型的には、相同体は、対象配列と同じ活性部位等をコードする同じ配列を含む。相同性は、類似性（すなわち、類似の化学特性／機能を持つアミノ酸残基）の見地から考えることもできるが、本発明に関しては、配列同一性の見地から相同性という表現を使用するのが好ましい。
【０１２４】
相同性は、肉眼により、あるいはより一般的には簡単に入手できる配列比較プログラムの助けにより実施できる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列の相同率（％）を計算できる。
【０１２５】
相同率（％）は、近接配列に関して計算できる。すなわち、１つの配列はもう１つの配列と共に配列され、１つの配列のそれぞれのアミノ酸は、もう一方の配列の対応するアミノ酸と直接比較され、一度に１つずつ残基が比較される。これは、「ギャップのない（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」配列と呼ばれる。典型的には、このようなギャップのない配列は、比較的少数の残基にのみ実施される。
【０１２６】
これは非常に簡単で堅実な方法であるが、例えば、それ以外は同一の配列対において、１つの挿入または欠失により、その後のアミノ酸残基がアラインメントから除外され、全体的アラインメントが行われた場合、相同性（％）が大きく減少する可能性が生じる。従って、大部分の配列比較法は、総相同性スコアを過度に低下させずに、挿入および欠失の可能性を考慮に入れた最適アラインメントを生じる様にデザインされる。これは、局所的相同性を最大限にすることを試みるために、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【０１２７】
しかし、これらのより複雑な方法は、配列アラインメントに生じるそれぞれのギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てるため、同数の同一アミノ酸の場合、２つの比較される配列間の高度の相関性を反映して、できる限り少数のギャップを挿入された配列アライメントを行うことにより、多くのギャップを挿入されたものよりも高いスコアを達成できる。ギャップの存在には比較的高いコストを負担させ、ギャップのその後に続くそれぞれの残基にはペナルティを少なくする「アッフィンギャップコスト」が典型的に使用される。これは最も一般的に使用されるギャップ評点システムである。当然、高いギャップペナルティは、より少ないギャップを挿入された最適化アラインメントを生じる。多くのアライメントプログラムにより、ギャップペナルティは変更可能である。しかし、配列比較にこのようなソフトウェアを使用する場合には、デフォルト値を使用するのが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップ当たり−１２、各伸展あたり−４である。
【０１２８】
従って、最大相同率（％）の計算には、ギャップペナルティを考慮に入れた最適アラインメントの作製がまず必要である。このようなアラインメントを実施するための適切なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ パッケージ（ウィスコンシン大学、米国；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列比較を実施できるその他のソフトウェアの例として、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９同書−第１８章）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ４０３−４１０）およびＧＥＮＷＯＲＫＳ比較ツールセットが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡは共に、オフラインおよびオンライン検索に利用できる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９同書、７−５８から７−６０まで参照）。しかし、幾つかの応用例に関しては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムの利用が好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールも、タンパク質配列とヌクレオチド配列の比較に利用できる（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７４ （２）： ２４７−５０； ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７７ （１）： １８７−８ および ｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
【０１２９】
最終相同性（％）は、同一性の見地から測定できるが、アラインメントプロセスそのものは、典型的には全か無かの対比較に基づかない。代わりに、化学的類似性または真核生物距離に基づく各の比較にスコアを割り当てる基準化類似性スコアマトリックスが一般に使用される。一般的に使用されるそのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−ＢＬＡＳＴプログラムセットのデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは一般にパブリックデフォルト値またはカスタム記号比較表を、供給されている場合には使用する（詳細はユーザーマニュアルを参照）。アプリケーションによっては、ＧＣＧパッケージにはパブリックデフォルト値を使用するのが好ましく、あるいはその他のソフトウェアのばあいには、ＢＬＯＳＵＭ６２の様なデフォルトマトリックスを使用する。
【０１３０】
一旦ソフトウェアが最適アラインメントを作製してしまえば、相同性（％）、好ましい配列同一性（％）を計算することが可能である。典型的にはソフトウェアは、これを配列比較の一部として行い、数値で結果を示す。
【０１３１】
配列は、サイレント変化を引き起こし、機能的に同等の物質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有する場合もある。計画的なアミノ酸置換は、物質の二次的結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性に基づき実施できる。例えば、負に荷電されたアミノ酸は、アスパラギン酸を含み；正に荷電されたアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み；類似の疎水値を持つ非荷電極性基は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシンを含む。
【０１３２】
例えば、下記表に従って、同類置換を実施できる。縦２列目の同じブロックと、好ましくは縦３列目の同じ並びのアミノ酸が、互いに置換できる。
【０１３３】
【表１】

【０１３４】
本発明は、同族置換（本明細書において、置換および置き換えは、共に既存アミノ酸残基を代替残基との交換を意味するために使用されている。）すなわち塩基には塩基、酸には酸、極性には極性の様に、似たもの同士の置換が起こる可能性があることも包含している。非同族置換、すなわちあるクラスの残基から別のクラスの残基への置換も起こる可能性がある。
【０１３５】
好ましくは、ＮＯＩは単一のＰＯＩまたはその突然変異体、相同体、または変異体をコードする。極めて好ましい実施例において、ＮＯＩは融合タンパク質をコードしない。本明細書に使用されている「融合タンパク質」という言葉は、従来の意味で、単一のキメラタンパク質を形成するためにペプチド結合により連結された２つ以上のタンパク質活性を含む実体を意味する。融合タンパク質は、単一プロモーターにより駆動される単一ポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１３６】
＜内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）＞
本発明の第一の点のウイルスゲノムは、２つ以上のＮＯＩを含む。ＮＯＩの両方が発現されるために、ベクターゲノム内にそれぞれのＮＯＩに１つずつ、２つ以上の転写単位が存在できる。しかし、レトロウイルスベクターが遺伝的に単純であれば、レトロウイルスベクターが最高力価と極めて強力な遺伝子発現特性を発揮し（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０１２３０； Ｂｏｗｔｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，２４６４； Ｃｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｂｌｏｏｄ ８４，１８１２； Ｅｍｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎ １９８４ Ｃｅｌｌ ３９，４５９； Ｇｈａｔｔａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１，５８４８； Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９ ＰＮＡＳ ８６，３５１９； Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６６，８４１６； Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６３，１７７９８； Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３，３８１； ＭｃＬａｃｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｖｉｒｏｌ．１９５，１； Ｏｖｅｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，１８０３； Ｓｃｈａｒｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１ ＰＮＡＳ ８８，４６２６； Ｖｉｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １，３０７； Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｖｉｒｏｌ． １７１， ３３１； Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７ ＰＮＡＳ ８４， ５１９７）、従って、ポリシストロン性メッセージにおける２番目（およびその後の）コーディング配列の翻訳を介しするために内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を使用することが好ましい（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ １９９１ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５， ４９８５）ことは文献より明らかである。
【０１３７】
ＩＲＥＳ成分のレトロウイルスベクターへの挿入は、レトロウイルス複製サイクルに適合し、単一プロモーターからの複数コーディング領域の発現を可能にする（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ（上記）；Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ（１９９２） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６：６６９−６７５； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ １９９３ Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６７：２１４２−２１４８）。ＩＲＥＳ成分は、最初ピコナウイルスのウイルスタンパク質のキャップ非依存性翻訳を促進する非翻訳５’末端に見いだされた（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｅｎｚｙｍｅ ４４：２９２−３０９）。ＲＮＡのオープンリーディングフレームの間に位置すると、ＩＲＥＳ成分は、ＩＲＥＳ成分におけるリボソームの侵入の促進と、それに続く翻訳の下流開始より、下流オープンリーディングフレームの効率的翻訳を可能にする。
【０１３８】
ＩＲＥＳに関する概説は、Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈにより報告されている（ＴＩＧ Ｍａｙ １９９５ ｖｏｌ １１， Ｎｏ ５：１７９−１８４）。脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １１： ５８４８−５８５９ （１９９１）； Ｂｉｐタンパク質 ［Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ， Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９１（１９９１）］； ショウジョウバエのアンテナペディア遺伝子（エキソンｄおよびｅ）［Ｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ６：１６４３−１６５３（１９９２）］およびポリオウイルス（ＰＶ）のＩＲＥＳ ［Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ， Ｎａｔｕｒｅ ３３４： ３２０−３２５ （１９８８）； Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， ＴＩＧ１１， １７９−１８４ （１９８５）も参照］ を含む多くの異なるＩＲＥＳ配列が公知である。
【０１３９】
ＷＯ−Ａ−９７／１４８０９によれば、典型的には、ＩＲＥＳ配列は遺伝子の５’非コーディング領域に見いだされる。これらの他に文献において、ＩＲＥＳは、発現に影響を及ぼす遺伝配列を探し、次にその配列がＤＮＡに影響を及ぼす（すなわち、プロモーターまたはエンハンサーとして作用する）か、あるいはＲＮＡのみに影響を及ぼす（ＩＲＥＳ配列として作用する）かを決定することにより、経験的に見いだすことができる。
【０１４０】
ＰＶ、ＥＭＣＶおよびブタ小水疱性疾患ウイルス由来のＩＲＥＳ成分は、過去にレトロウイルスベクターにおいて使用されている（Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ， 上記）。
【０１４１】
「ＩＲＥＳ」という言葉は、ＩＲＥＳの機能を発揮するか、ＩＲＥＳの機能を改善するあらゆる配列または配列の組み合わせを含む。
【０１４２】
ＩＲＥＳは、ウイルス由来（例えば、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＰＶ ＩＲＥＳまたはＦＭＤＶ ２Ａ様ＩＲＥＳ配列）でも細胞由来（例えば、ＦＧＦ２ ＩＲＥＳ、ＮＲＦ ＩＲＥＳ、Ｎｏｔｃｈ ２ ＩＲＥＳまたはＥＩＦ４ＩＲＥＳ）でもよい。
【０１４３】
ＩＲＥＳがそれぞれのＮＯＩの翻訳を開始できるためには、ベクターゲノムのＮＯＩの間か前に位置していなくてはならない。例えば、ｎ個のＮＯＩを含むポリシストロン性配列の場合、ゲノムは以下の様になる：
【化１】

【０１４４】
バイシストロン性およびトリシストロン性配列の場合、順番は以下の通りである。
【化２】

【０１４５】
ＩＲＥＳおよびＮＯＩの別の形態も利用できる。例えば、ＩＲＥＳとＮＯＩを含む転写物は、同じプロモーターから駆動される必要はない。
【０１４６】
この配列の具体例は以下の通りである。
【化３】

【０１４７】
好ましい実施例において、１つ以上のＩＲＥＳとＮＯＩを含む内部カセットを利用するあらゆる構造物において、ＩＲＥＳは異なる供給源が可能である。すなわち互いに異種でよい。例えば、１つのＩＲＥＳはＥＭＣＶ由来で、もう１つのＩＲＥＳはポリオウイルスとすることができる。
【０１４８】
＜１つのベクターから複数の遺伝子を発現するその他の方法＞
ＩＲＥＳは、１つのベクターから複数の遺伝子を同時発現させるための効率的方法であるが、その他の方法も有用であり、単独またはＩＲＥＳと併用できる。これらの方法には、ベクターにおける複数の内部プロモーターの利用（Ｏｖｅｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８：１８０３−８（１９８８））、または種々の遺伝子を発現する単一ウイルスゲノム由来の複数のＲＮＡ種を生じる交互スプライシングパターンの利用が含まれる。この方法は、２つの遺伝子に関して単独で使用されている（Ｃｅｐｋｏ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ３７：１０５３（１９８４））。
【０１４９】
＜形質導入細胞＞
本発明は、本発明の第一の側面におけるウイルスゲノムを含むベクターシステムにより形質導入された細胞にも関する。
【０１５０】
本発明のベクターシステムによる形質導入により、細胞にカテコールアミンを生産する能力を付与するか、増大させることが可能である。例えば、細胞にチロシンをＬ−ＤＯＰＡおよび／またはＬ−ＤＯＰＡからドーパミンに転換する能力を付与するか、増大させることが可能である。カテコールアミンの放出は、本技術において公知の方法、例えば、分析用セルに接続された電気化学的検出器の使用により測定できる。カテコールアミンそのものに加えて、カテコールアミン放出に関係する副産物（例えば、ＤＯＰＡＣ、ドーパミンの特異的分解産物）も検出できる。
【０１５１】
細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏで形質導入できる。例えば、細胞が哺乳動物対象由来の細胞である場合、細胞は対象から取り出され、形質導入され、対象にいつでも再移植できる（ｅｘ ｖｉｖｏ形質導入）。あるいは、標準技術に従って、本発明のベクターシステムを用いて（例えば、ＮＯＩを発現するベクター原液の注入により）、細胞は、直接遺伝子移入によりｉｎ ｖｉｖｏで形質導入できる。細胞が、培養で安定な細胞系の一部である場合（すなわち、多くの継代培養で生存でき、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖できる場合）、細胞を標準技術により、例えばＮＯＩを発現するベクターを含むウイルス上清に接触させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入できる。
【０１５２】
細胞は、形質導入可能なあらゆる細胞が可能である。ベクターシステムが非分裂細胞を形質導入できる場合（例えば、レンチウイルスシステムの場合）、細胞はニューロンの様な非分裂細胞が可能である。
【０１５３】
好ましい実施態様において、形質導入細胞は、遺伝的に修飾されたニューロン細胞系の一部を形成する。そのような細胞系は、例えば、パーキンソン病の治療のために脳内に移植できる。
【０１５４】
更なる実施態様において、細胞はニューロン幹細胞である。そのような細胞系は、例えば、パーキンソン病の治療のために脳内に移植できる。
【０１５５】
更なる実施態様において、細胞は、ニューロンまたはグリア細胞の様な、患者の黒質線条体の細胞である。そのような細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ直接遺伝子移入により、例えば、細胞をドーパミンプロデューサー細胞に転換できる。
【０１５６】
＜カセット＞
本発明は、１つのＩＲＥＳにより機能的に結合された２つ以上のＮＯＩを含むポリシストロン性カセットも提供する。これらのカセットは、プロデューサー細胞におけるベクターゲノム生産方法において使用できる。
【０１５７】
本発明は、そのようなカセットを含む発現ベクターも提供する。そのような発現ベクターを用いる適切な細胞のトランスフェクションにより、カセットにおいてＮＯＩによりコードされる各ＰＯＩを発現する細胞を生じるはずである。本発明は、そのようなトランスフェクションされた細胞も提供する。
【０１５８】
カセットの発現ベクター内クローニングと、（カセットを発現させるための）そのベクターによる細胞のトランスフェクションは、本技術において公知の技術により実施できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））およびその他の実験教科書により説明されている方法）。
【０１５９】
好ましくは、カセットはプロモーターを含む。極めて好ましい実施例において、カセットはバイシストロン性またはトリシストロン性で、以下の成分を含む。
プロモーター−（ＮＯＩ_１）−（ＩＲＥＳ_１）−（ＮＯＩ_２）
プロモーター−（ＮＯＩ_１）−（ＩＲＥＳ_１）−（ＮＯＩ_２）−（ＩＲＥＳ_２）−（ＮＯＩ_３）
【０１６０】
特に、好ましい実施例において、カセットはバイシストロン性で、チロシンヒドロキシラーゼ（またはその突然変異体、変異型、相同体）をコードするＮＯＩ、およびＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（またはその突然変異体、変異型、相同体）をコードするＮＯＩをどちらの順序でも含む。別の特に好ましい実施例において、カセットはバイシストロン性で、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするＮＯＩと小胞性モノアミン輸送体２をコードするＮＯＩを、どちらの順番でも含む。
【０１６１】
別の特に好ましい実施例において、カセットはトリシストロン性で、チロシンヒドロキシラーゼ（またはその突然変異体、変異型、相同体）をコードするＮＯＩ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（またはその突然変異体、変異型、相同体）をコードするＮＯＩ、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（またはその突然変異体、変異型、相同体）をコードするＮＯＩを含む。
【０１６２】
＜医薬組成物＞
本発明は、医薬組成物の製造における本発明の第一の点において定義されたレトロウイルスベクターゲノムの利用法も提供する。医薬組成物は、遺伝子治療により個人を治療するために利用でき、この場合医薬組成物は、治療有効量の本発明のレトロウイルスベクター粒子を含む。
【０１６３】
医薬組成物は、ヒトまたは動物対象の治療に利用できる。好ましくは、対象は哺乳動物対象である。より好ましくは、対象はヒトである。典型的には、医師は、個々の対象に最適な実際の用量を決定し、それは特定の患者の年齢、体重、反応によって変動する。
【０１６４】
医薬組成物は、任意で薬剤学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を含むことができる。薬剤担体、賦形剤または希釈剤の選択は、目的の投与経路および標準薬剤学的実施基準を考慮して選択できる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として（あるいはそれらに加えて）、（例えば、脂質送達系の様な）標的部位へのウイルス侵入を補助または増大させるあらゆる適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤を含むことができる。
【０１６５】
適切な場合には、医薬組成物は、以下の１つ以上のいずれによっても投与できる；吸入、座薬またはペッサリーの形態で、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散粉剤の形態で局所的に、皮膚貼剤の利用により、デンプンまたは乳糖の様な賦形剤を含む錠剤の形態で、または単独または賦形剤と混合してカプセルまたは腔座剤の形態で、または香料または着色料を含むエリキシル剤、溶液または懸濁液の形態で投与できる。また、例えば、空洞内、静脈内、筋肉内または皮下注射により、非経口注入も可能である。非経口投与の場合、医薬組成物はその他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするための十分な塩または単糖類を含むことができる。バッカルまたは舌下投与の場合、医薬組成物は、通常の方法で処方できる錠剤またはトローチ剤の形態で投与できる。
【０１６６】
好ましくは、本発明のウイルスベクター粒子は、尾状被殻内注射により投与される。
【０１６７】
＜疾病＞
本発明のレトロウイルスベクターゲノムおよびベクター粒子は、神経変性疾患の治療および／または予防に特に有用である。
【０１６８】
治療できる疾病には、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、ハンチントン病、およびジストニーの様なＬ−ＤＯＰＡに反応する運動障害が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６９】
特に、本発明は、パーキンソン病の治療および／または予防に有用である。
【０１７０】
例えば、ＴＨ、ＧＴＰ−ＣＨ１、および任意でＡＡＤＣまたはＡＡＤＣとＶＭＡＴ２を送達できるベクターを用いる遺伝子治療による治療は、Ｌ−ＤＯＰＡ治療に著明に反応しないパーキンソン病末期患者の治療に特に有用である可能性が高い。Ｌ−ＤＯＰＡの末梢投与と併用するＡＡＤＣまたはＡＡＤＣとＶＭＡＴ２を使用する治療も、パーキンソン病末期患者に有用と思われる。
【０１７１】
本発明は、以下の図と表を引用して、例示する意図のみのために次のように説明される。
【０１７２】
表２：モノシストロン性、バイシストロン性、トリシストロン性プラスミドのいずれかによりトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞により放出されたカテコールアミン（ｎｇ／時／１０^６細胞）（ｎ．ｄ．検出されない）。
【０１７３】
表３：モノシストロン性、バイシストロン性、トリシストロン性プラスミドのいずれかによりトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞により生産されたカテコールアミン（ｎｇ／１０^６細胞）（ｎ．ｄ．検出されない）。
【０１７４】
表４：ＥＩＡＶベクターの組み込み効率
【０１７５】
［実験］
具体例１．ヒトチロシンヒドロキシラーゼ１ ２型ｃＤＮＡのクローニング
ヒトチロシンヒドロキシラーゼ１ ２型ｃＤＮＡ（寄託番号Ｘ０５２９０）を、ヒト黒質ポリＡ＋ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、図１に説明されているプライマーを用いてｃ−ｍｙｃエピトープによりエピトープ標識する。遺伝子の５’末端に対応する１６９ｂｐ断片は、５’ｈＴＨ２および３’ｈＴＨ２プライマー（図１）を用いて増幅され、一方チロシンヒドロキシラーゼｃＤＮＡの１４１８ｂｐ３’末端断片は、プライマー５’ｈＴＨ３および３’ｈＴＨ１（図１）を用いて得られる。
【０１７６】
Ｔｉｔａｎ Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。典型的には、反応は２つの溶液から構成される。
【０１７７】
溶液Ａ
０．２μｇのヒト黒質ポリＡ＋ＲＮＡ、３２μＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１μｌＲＮＡｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＲＮＡｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、〜１００ｎｇの各プライマーを含み、水を加え２５μｌにする。
【０１７８】
溶液Ｂ
１０μｌの５ＸＲＴ−ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、１μｌＥｎｚｙｍｅ ｍｉｘを含み、水を加え２５μｌにする。
溶液ＡとＢを混合し、ＲＴ−ＰＣＲ条件を設定する。
【０１７９】
１．１． １６９ｂｐ産物の増幅を５０℃で３０分間実施し、ＲＴ反応を発生させ、続いて、９４℃で２分間、９４℃で３０秒間３５サイクル、６０℃で３０秒間、６８℃で４５秒間実施する。
【０１８０】
１．２． １４１８ｂｐ産物の増幅を５０℃で３０分間実施し、ＲＴ反応を発生させ、続いて、９４℃で２分間、９４℃で１分間３５サイクル、６０℃で１分間、６８℃で２分間実施する。
【０１８１】
両断片を精製し、３回目のＰＣＲ反応において鋳型として使用し、全長チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）ｃＤＮＡを得る。組み換えＰＣＲ反応を、プライマー５’ｈＴＨ２および３’ｈＴＨ１（図１）と、製造者の指示に従いＫｌｅｎ Ｔａｑキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して実施する。ＰＣＲ条件を以下の様に設定する：９４℃で１分間３５サイクル、６０℃で１分間、６８℃で２分間。組み換えＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中にクローニングし、ｐＮＥ３を作製する。
【０１８２】
次に、ｐＮＥ３からＴＨｃＤＮＡをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ １．５７ｋｂ断片として切り出し、同じ酵素で前もって消化されたｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合する。新しく生産された哺乳動物発現プラスミドは、ｐＮＥ４と呼ばれる（図４）。
【０１８３】
具体例２：ヒト芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ１ ｃＤＮＡのクローニング
ヒト芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）ｃＤＮＡ（寄託番号Ｍ７６１８０ Ｍ３０７７２）をヒト肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅し、図３に説明されているプライマー５’ｈＡＡＤＣおよび３’ｈＡＡＤＣを用いてＨＡエピトープによりエピトープ標識する。ＰＣＲ反応は、製造者の指示に従って、Ｋｌｅｎ Ｔａｑキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて実施した。反応は、最終容量５０μｌに４μｌヒト肝臓ｃＤＮＡと１μＭの各プライマーを含む。ＰＣＲ条件は以下の通りである；第一段階が９４℃で３０秒間、第二段階が９４℃で３０秒間５サイクル、５８℃で３０秒間、６８℃で２分間、第三段階が、９４℃で３０秒間３０サイクル、５５℃で３０秒間、６８℃で２分間。
【０１８４】
ＰＣＲは、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）の２つの転写産物に対応する２つの予測されるバンド、１．４８５ｋｂと１．３６ｋｂを増幅する。１．４８５ｋｂバンドは精製され、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中にクローニングされ、ｐＮＥ１と呼ばれるプライマーを生産する。ｐＮＥ１からヒトＡＡＤＣ全長ｃＤＮＡを〜１．５ｋｂ ＢｇＩＩＩ−Ｓａｌｌ断片として切り出し、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏｌ酵素で前もって消化されたｐｃＤＮＡ３．１／Ｎｅｏに結合する。新しく生産された哺乳動物発現プラスミドは、ｐＮＥ２と呼ばれる（図４）。
【０１８５】
具体例３：ヒトＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＴＰ−ＣＨ１）ｃＤＮＡ（（寄託番号Ｕ１９５２３）を、ヒト黒質のポリＡ＋ｍＲＮＡから増幅し、プライマー５’ｈＧＴＰおよび３’ｈＧＴＰ（図５）を用いてＦＬＡＧエピトープによりエピトープ標識する。Ｔｉｔａｎ Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。典型的には、反応は上記具体例１に説明されている様に２つの溶液から構成される。溶液ＡとＢを混合して、ＲＴ−ＰＣＲ条件を以下の様に設定した：５０℃で３０分間実施し、ＲＴ反応を発生させ、続いて９４℃で３０秒間、９４℃で３０秒間３５サイクル、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間。
【０１８６】
ＲＴ−ＰＣＲ産物（〜０．７５ｋｂ）を精製し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中にクローニングし、ｐＮＥ５を作製する。ｐＮＥ５からＧＴＰ−ＣＨｃＤＮＡを〜ｏ／７５ｋｂ ＢｇＩＩＩ−Ｎｏｔｌ断片として切り出し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔｌ酵素で消化されたｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏに結合し、ｐＮＥ６を生産する（図６）。
【０１８７】
具体例４： ヒトチロシンヒドロキシラーゼ１ ２型の切断型のクローニング
ドーパミンによるＴＨ酵素へのフィードバック阻害を回避するために、調節領域を欠失するＴＨ２型の切断型を使用することを決定した。ＴＨは、このＮ−末端領域に位置する部位におけるリン酸化により活性化され、このリン酸化部位の少なくとも１つにより仲介されるフィードバック最終産物阻害を受ける（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９２） ２６７： ２５７５４−２５７５８； Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ＆ Ｂｉｏｌ． （１９９３） ３３８： ８７−９２）。この切断型ＴＨ（ｈＴＨｔ）をｃ−ｍｙｃエピトープによりエピトープ標識し、プライマー５’ｈＴＨｔと３’ｈＴＨｔ（図７）、および鋳型としてプラスミドｐＮＥ４を用いてＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ反応は、Ｐｆｕ １ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、９５℃で１分間、９５℃で１分間３０サイクル、６０℃で１分間、７２℃で１分間実施される。〜１．０４ｋｂバンドを増幅し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲｉ酵素で消化し、前もって同じ酵素で消化されたＤＮＡ３．１／Ｚｅｏに結合する。新しく生産されたプラスミドは、ｐｈＴＨと呼ばれる（図８）。
【０１８８】
具体例５：ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＧＴＰ−ＣＨの哺乳動物発現ベクター内へのクローニング
ｈＴＨｔｃＤＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ下流のＢＬ−ＥＰプラスミドの中にクローニングされる（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５９：８４７ （１９９５））。これを達成するために、ｐｈＴＨｔ由来のＣＭＶｐ−ｈＴＨｔ断片をＢｇＩＩＩ−ＥｃｏＲＶとして切り出し、ＢｇＩＩＩ−ＥｃｏＲＶにより消化されたＢＬＥＰの中にクローニングし、ｐｎｅｏ１を生産する。ｐＮＥ２からＣＭＶｐ−ＤＣ断片をＢｇＩＩＩ−ＥｃｏＲＶとして切り出し、Ｓｍａｌ−ＢａｍＨＩにより切断されたＢＬＥＰに結合し、ＢＬＥＰ−ＣＭＶ−ＤＣを生産する。
【０１８９】
ｈＴＨｔおよびＧＴＰ−ＣＨ１遺伝子を含む哺乳動物発現カセット（バイシストロン性カセット）を作製するために、ＧＴＰ−ＣＨ１ ｃＤＮＡをポリオＩＲＥＳの下流に以下のようにクローニングする。ｐＮＥ６からＧＴＰ−ＣＨ１ ｃＤＮＡを〜０．７５ｋｂ Ｎｈｅｌ−Ｘｂａｌ断片として切り出し、同じ酵素で消化されたＢＬＥＰ−ＴＨｔの中にクローニングする。新しいプラスミドはＢＬＥＰ−ＴＨｔ−Ｃｈ１と呼ばれる。ＣＭＶｐ−ＴＨｔ断片をｐｎｅｏ１からＸｂａｌ−ＥｃｏＲＶ断片として切り出し、同じ酵素で消化されたＢＬＥＰ−ＴＨｔ−Ｃｈ１に結合し、ｐｎｅｏ２（ｐｂｉｃｉｓ）を生産する（図９）。
【０１９０】
ｈＴＨｔ、ＧＴＰ−ＣＨ１、ＡＡＤＣ遺伝子を含むトリシストロン性カセットを作製するために、ＢＬＥＰ−ＣＭＶｐ−ＤＣおよびＢＬＥＰ−ｈＴＴＨｔ−ＣＨ１を、Ｂｌｎｌ−Ｃｌａｉにより消化し、ｐｔｒｉｃｉｓ（図１０）を生産する。これにより、ＣＭＶプロモーター、ＤＣ、ｈＴＨｔおよびＧＴＰ−ＣＨ１をこの順序で含むカセットが作製される。
【０１９１】
具体例６：異種ヒト細胞におけるバイシストロン性およびトリシストロン性カセットからの一過性発現
ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞は、カテコールアミンを合成せず、カテコールアミン作動性酵素を発現しない。バイシストロン性およびトリシストロン性発現カセットが機能するかどうかを決定するために、ＨＥＫ２９３細胞が選択される。ＨＥＫ２９３細胞を、６Ｘプレートに〜２−３Ｘ１０^５細胞／ウェルの濃度で接種する。培養後２４時間後、製造者の指示に従い、血清を含まない培地において、ＦｕｇｅｎＴＭ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて２μｌのプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクションする。トランスフェクションの対照として、０．２μｌ（１／１０）のＧＦＰ発現プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＤＮＡ−ＦｕｇｅｎＴＭミックスに加える。
【０１９２】
トランスフェクション後約４８時間後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において洗浄し、収集する。総細胞抽出物を、溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて調製する。約１０μｌの総タンパク質を３つの１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加し、タンパク質を分離し、ニトロセルロースＥＣＬウェスタン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に移す。膜を、マウス抗ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ）、マウス抗ｃ−ｍｙｃ（Ｒｏｃｈｅ）、またはマウス抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）抗体の１／１０００希釈でプロービングする。二次抗体は、ＨＲＰ標識ウサギ抗マウスの１／２０００希釈であった（Ｄａｋｏ）。膜に結合した抗体は、ＥＣＬ−ウェスタン検出キットを用いて検出される。
【０１９３】
適切な見かけの分子量のタンパク質が、トランスフェクションされた細胞には検出されるが、疑似対照には検出されない：ＨＡ−ｈＡＡＤＣ、〜５３ｋＤａ；ｃ−ｍｙｃ−ｈＴＨｔ、〜４２ｋＤａ、ＦＬＡＧ−ＧＴＰ／ＣＨ１、〜３ｋＤａ。バイシストロン性およびトリシストロン性カセットは、２つまたは３つの酵素をそれぞれ発現する（図１１）。
【０１９４】
具体例７：一過性にトランスフェクションされたヒト細胞におけるカテコールアミンの生産
具体例６に説明されているように、ＨＥＫ ２９３Ｔを、６Ｘプレートに〜２−３Ｘ１０^５細胞／ウェルの濃度で接種する。培養後２４時間後、製造者の指示に従い、血清を含まない培地において、ＦｕｇｅｎＴＭ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて２μｌのプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクションする。トランスフェクションの対照として、０．２μｌ（１／１０）のＧＦＰ発現プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＤＮＡ−ＦｕｇｅｎＴＭミックスに加える。
【０１９５】
トランスフェクション後約４８時間後に、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において洗浄し、収集する。培地内へのカテコールアミン放出量を測定するために、０．５ｍｌの「放出緩衝液」（ハンクス液、２５ｍＭヘペス ｐＨ７．４、０．２５％ ＢＳＡ、１ｎＭチロシン）をトランスフェクションされた細胞に加える。これらの細胞を３７℃で３０分間インキュベーションする。本実験において、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ_４）、ＴＨコファクターは加えない。緩衝液中に存在するカテコールアミンを、同量の０．８Ｍ過塩素酸（ＰＣＡ）と０．２ｍＭ ＥＤＴＡを用いて抽出する。細胞デブリスを４℃、１００，０００ｃｐｍで１５分間微量遠心分離にかける。放出段階を、更に３０分間繰り返すことができる。細胞内に生産されたカテコールアミンを、０．５ｍｌ ０．４Ｍ ＰＣＡと０．１ｍＭ ＥＤＴＡで抽出する。
【０１９６】
カテコールアミンは、流速 １．５ｍｌ／分で１５分間、Ｃａｔ−Ａ−Ｐｈａｓｅ移動相（ＥＳＡ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用しＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ）により逆相Ｃ１８カラム（ＥＳＡ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で分離される。約２０μｌをこの装置に注入する。カテコールアミンは、分析セル（モデル５１４４、ＥＳＡ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）に接続された電気化学的検出器（ＥＳＡ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で、以下の入力電位で検出される：ガードセル、＋２５０ｍＶ；チャネル１、１０ｍＶ、チャネル２、−２５０ｍＶ。試料中のカテコールアミン量は、同じプロトコールに従って分離された既知の標準に対し、ピーク面積を積分することにより計算される。この方法により、Ｌ−ＤＯＰＡ、ドーパミンおよびＤＯＰＡＣ、ドーパミンの特異的変性産物を検出することができる。
【０１９７】
ＢＨ_４とは無関係に異種細胞により放出および／または生産されたカテコールアミンの検出（表２）により、酵素が機能していることが確認される。予想通り、Ｌ−ＤＯＰＡは、モノシストロン性、バイシストロン性およびトリシストロン性カセットにより生産されるのに対し、ドーパミンは、トリシストロン性カセットによってのみ生産される。バイシストロン性が、ＴＨ単独よりもＬ−ＤＯＰＡをより多く作製することから、これらの細胞におけるＢＨ４を供給するためのＧＴＰ−ＣＨ１の有用性が確認される。ドーパミンも、ＡＡＤＣと組み合わせてバイシストロン性により生産される。ＤＯＰＡＣ、ドーパミンの特異的変性産物は、大量のドーパミンが生産される場合にのみ検出される。
【０１９８】
具体例８：バイシストロン性およびトリシストロン性カセットを発現するレンチウイルスベクターの作製
レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に遺伝子を移入するために特に有用である。多くの重要な非分裂標的細胞は、ヒト脳のニューロンである。これらの細胞は、パーキンソン病治療のために、ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＧＴＰ−ＣＨ１を送達するための標的細胞となると思われる。本章において、我々はＴＨ、ＡＡＤＣおよびＧＴＰ−ＣＨ１を送達、発現し、重度パーキンソン病患者の脳に欠失している神経伝達物質（ドーパミン）を生産できる最小のＥＩＡＶに基づくベクターの作製を説明する。この治療法は、Ｌ−ＤＯＰＡ投与に反応しない末期パーキンソン病患者に適している。一般的な最小ＥＩＡＶベクターの構造を図１２に示す。
【０１９９】
ｐＯＮＹ８Ｇの作製
ｐＯＮＹ８Ｇは、ＬａｃＺリポーター遺伝子を増強された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子に交換することによりｐＯＮＹ８．０Ｚから得られた。これは、ｐＯＮＹ２．１３ＧＦＰ（ＷＯ９９／３２６４６）のＧＦＰ遺伝子とフランキング配列に対応するＳａｃＩＩ−ＫｐｐｎＬ断片を、同じ酵素で切断されたｐＯＮＹ８．０Ｚの中に移入することにより実施された。ｐＯＮＹ８．０Ｚは、１）ｔａｔのエキソン２における８３ｎｔ欠失によりＴＡＴの発現を阻害し、２）５１ｎｔ欠失によりＳ２ ＯＲＦ発現を阻害し、３）ｒｅｖのエキソン１内部の１つの塩基の欠失によりＲＥＶ発現を阻害し、４）ＡＴＧ開始コドンにＴを挿入し、それによって、配列をＡＴＧからＡＴＴＧに変更することによりｇａｇのＮ−末端部分の発現を阻害する突然変異を導入することにより、ｐＯＮＹ４．０Ｚ（ＷＯ９９／３２６４８）から得られた。野生型ＥＩＡＶ配列寄託番号Ｕ０１８６６に関して、これらは、ｎｔ５２３４から５３１６まで、ｎｔ５３４６から５３９６までとｎｔ５５３８の欠失に対応する。Ｔ残基の挿入は、ｎｔ５２６と５４３の後であった。
【０２００】
ヒトＴＨおよびＧＴＰ−ＣＨ１遺伝子を発現するバイシストロン性カセットを、ｐｎｅｏ２からＸｈｏｌ−Ｘｂａｌ断片として切り出し、作製方法は上記に説明され、同じ酵素で消化されたｐＯＮＹ８Ｇ（配列番号１、図２１）に結合する。この場合、ＣＭＶｐ−ＧＦＰカセットは、ＣＭＶｐ−ｈＴＨｔ−Ｃｈ１カセットにより置き換えられる。新しいプラスミドは、ｐＯＮＹ８ＢＩＣ（配列番号４）と呼ばれる。
【０２０１】
ヒトＡＡＤＣ、ＴＨｔおよびＧＴＰ−ＣＨ１１遺伝子を発現するトリシストロン性カセットを、ｐＴｒｉｃｉｓからＸｈｏｌ−Ｘｂａｌ断片として切り出し、作製方法が上記に説明されているｐＯＮＹ８Ｇ（配列番号１、図１１）の骨格に結合する。このベクターの生成されたベクターＲＮＡゲノムサイズは８．８ｋｂで、従って、８ｋｂＥＩＡＶ ＲＮＡゲノムのサイズよりも１０％長い。
【０２０２】
ｐＯＮＹ８．１ＺおよびｐＯＮＹ８．１Ｇの作製
ｐＯＮＹ８．１Ｚは、Ｓａｌｌによる消化と、ＳａｐＩによる部分消化により、ｐＯＮＹ８．０Ｚから直接得られた。制限酵素処理後、ＤＮＡの懸垂末端を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端にした。次に、得られたＤＮＡを再結合した。この操作により、ＬａｃＺリポーター遺伝子と３’ＰＰＴのすぐ上流の間の配列の欠失を引き起こす。欠失の３’境界は、野生型ＥＩＡＶ、寄託番号Ｕ０１８６６に関しては、ｎｔ７８９５である。従って、ｐＯＮＹ８．１ＺはＥＩＡＶ ＲＲＥｓに対応する配列を含まない。ｐＯＮＹ８．１Ｇは、ｐＯＮＹ８Ｇから同じ方法を用いて得られた。
【０２０３】
バイシストロン性カセットとトリシストロン性カセットは共に、ｐＯＮＹ８ＢＩＣまたはｐＯＮＹ８ＴＲＩＣからそれぞれＮｓｉＬ−Ｘｈｏｌ断片として切り出され、同じ酵素で消化されたｐＯＮＹ８．１Ｇ（上記に説明されている構造、配列番号２、図２２）の骨格に結合される。２つの新しいプラスミドは、ｐＯＮＹ８．１ＧＢＩＣおよびｐＯＮＹ８．１ＴＲＩＣ（図１３）と呼ばれる。
【０２０４】
中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と呼ばれる配列の存在により、非分裂細胞への遺伝子送達効率が改善される可能性がある。このシス作用成分は、ＥＩＡＶポリメラーゼコーディング領域成分に位置し、以下の様に、ＥＩＡＶポリメラーゼコーディング領域を含むあらゆるプラスミド（例えば、ＷＯ９９／３２６４６に説明されているｐＯＮＹ３．１（具体例９、図６参照））、を使用するＰＣＲを用いることにより、機能成分として得ることができる。ＰＣＲ産物は、ｃＰＰＴと中心終結配列（ＣＴＳ）を含む。ＰＣＲ反応に使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りであった。
【化４】

【０２０５】
ＢｇＩＩＩの認識部位は、下線が付けられ、Ｂｃｉｌの認識部位は、イタリック体で、ＢａｍＨＩの認識部位は太字イタリック体で、ＰｓｔＩの認識部位は太字で示した。ｃＰＰＴ／ＣＴＳの、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳまたはＰＢＩＲＥＳ上流への導入は、ベクターの同じ部位を用いて、ｐＯＮＹ８ＴＲＩＣの独特のＢｃｌｌ−ＢｓｓＨＩＩ断片をｐＳＬ−１１８−ＰＤ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の中にサブクローニングすることにより達成された。これは、ｐＳＬ−１１８０−ＰＤと呼ばれた。ｃＰＰＴ／ＣＴＳのＰＣＲ産物をＢｇＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化することにより、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳの上流のＢｃＩＩ部位への挿入が可能となり、あるいはＰｓｔｌで消化することにより、ポリオＩＲＥＳの上流のＰｓｔｌ部位への挿入が可能となり、それぞれｐＳＬ−１１８０−ＰＤ−５’ｃＰＰＴまたはｐＳＬ−１１８０−ＰＤ−３’ｃＰＰＴを生産する。ｐＳＬ−１１８０−ＰＤの中にクローニングされた断片の配向は、ＤＮＡ配列決定により確認された。これら２つのクローンのＢｃｌｌ−ＢｓｓＨＩＩ断片を、ｐＯＮＹ８ＴＲＩＣの修飾型であるｐＯＮＹ８ＴＲＩＣｄｅｌＣＴＳの中に結合した。ｐＯＮＹ８ＴＲＩＣｄｅｌＣＴＳは、ｐＯＮＹＺｄｅｌＣＴＳ（下記に説明されている）のＳａｌｌ−ＰｉｎＡｌ断片を、ＸｈｏｌおよびＰｉｎＡＩにより消化されたｐＯＮＹ８ＴＲＩＣの中に結合することにより作製された。この２つの新しいゲノムは、ｐＯＮＹ８ＴＲＩＣ５’ｃＰＰＴおよびｐＯＮＹ８ＴＲＩＣ３’ｃＰＰＴと呼ばれる。これらのベクターの図を図１４に示す。
【０２０６】
ｐＯＮＹ８ＺｄｅｌＣＴＳの作製
ｐＯＮＹ８Ｚ（配列番号３、図２３）を修飾し、ｐＯＮＹ８Ｚベクターに既に存在しているＣＴＳを除去する。これは、ｐＯＮＹ８ＺのＣＴＳおよびＲＲＥ領域を包含するＳａｌＩからＳｃａＩ断片を、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＶによる消化により結合のために作製されたｐＳＰ７２の中にサブクローニングすることにより達成される。次に、ＣＴＳ領域を、ＫｐｎｌおよびＰｐｕＭＩによる消化により除去し、オーバーハング末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理により「平滑化」し、ついで末端を再結合する。修飾ＥＩＡＶベクター断片を次にＳａｌＩおよびＮｈｅＩを用いて切り出し、同じ酵素による消化により結合のために作製されたｐＯＮＹ８Ｚに結合する。新しいＥＩＡＶベクターは、ｐＯＮＹ８Ｚ ｄｅｌ ＣＴＳと呼ばれる。
【０２０７】
具体例９：治療遺伝子を発現するレンチウイルスベクター原液の生産
以前報告されている３プラスミドトランスフェクション法（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）を用いて、シュードタイプされたレンチウイルスベクターを生産した。トランスフェクションは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系（Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）において実施し、ベクタービリオンを生産した。トランスフェクション後４８時間後に培養上清を収集し、０．４５μｍ孔サイズフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。ウイルス上清を超遠心分離法により１００〜１０００倍に濃縮し（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３ ＰＮＡＳ ９０： ８０３３−８０３７）、ＰＢＳに再懸濁する。
【０２０８】
ウイルス原液中の粒子数を、性能強化逆転写酵素（ＰＥＲＴ）分析により力価測定し、生物学的力価が既知の標準ｐＯＮＹ８Ｇウイルス試料と比較した。生物学的力価は、イヌ骨肉腫細胞系、Ｄ１７細胞を形質導入することによる評価される。力価は、１ｍｌあたりの形質導入単位（ｔ．ｕ．／ｍｌ）として表される。この目的のために、感染前日にウェルあたり１×１０^５細胞の濃度で細胞を１２×ウェル組織培養皿に接種した。上記の様に、適切なプラスミドにより２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすることにより調製されたウイルス上清を標的細胞に加える。ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を、形質導入の時点で各ウェルに加え、感染に使用される０．５ｍｌの培養上清の中に加える。形質導入後約２〜５時間後に、培養上清を新鮮培地と交換する。ＧＦＰ（緑）を発現する細胞を、紫外線下に観察し、計数する。
【０２０９】
ＰＥＲＴ分析は、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、ＭＳ２ ＲＮＡからの特異的ＰＣＲ産物と、ウイルス粒子に存在する逆転写酵素を（この場合ＥＩＡＶ ＲＴ）を検出する。簡単に述べると、ウイルスベクター原液と破壊緩衝液（４０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ７．５，５０ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ ＤＴＴおよび０．２％ＮＰ−４０）を１：１の容量で混合することにより、ウイルス粒子が破壊される。破壊された粒子の連続希釈を、それらをＲＴ−ＰＣＲＴａｑＭａｎ反応ミックス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に加える前に実施する。更に、反応ミックスは、１／１０容量の破壊されたウイルス粒子、３００ｎＭ ＰＥＲＴフォワードプライマー、３００ｎＭ ＰＥＲＴリバースプライマー、１５０ｎＭ ＰＥＲＴ プローブ、１／１０の０．８ｍｇ／ｍｌ ＭＳ２ ＲＮＡを含む。ＲＴ−ＰＣＲの条件は以下の通りである。４８℃で３０分間維持；９５℃で１０分間維持；９５℃で１５秒間と６０℃で１分間を１５サイクル。データをＡＢＩ ＰＲＩＳＭＲ配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて分析する。
【０２１０】
同様に、ウイルス試料のＲＮＡ含有量も、標準ｐＯＮＹ８Ｇウイルス試料と比較してＲＴ−ＰＣＲにより推定される。ウイルスＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）と処理済みＤＮＡｓｅ Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してウイルス原液から分離する。ウイルスＲＮＡの連続希釈をＲＴ−ＰＣＲ反応において鋳型として使用する。１／１０容量のウイルスＲＮＡ鋳型と特異的フォワードおよびリバースプライマーおよびプローブを含む２つの反応混合物、＋ＲＴおよび−ＲＴを調製する。ＲＴ−ＰＣＲ条件は以下の通りである：４８℃で３０分間維持；９５℃で１０分間維持；９５℃で１５秒間、６０℃で１分間４０サイクル。データをＡＢＩ ＰＲＩＳＭＲ配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて分析する。図１５は、ＰＥＲＴ分析結果とＥＩＡＶ ＴＲＩＣおよびＥＩＡＶ ＧＦＰベクターのウイルスＲＮＡ含有量を示す。ＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターは、試料あたりの粒子数は同じであるが、ＲＮＡはＥＩＡＶ ＧＦＰよりも〜４倍少ない様に見える。
【０２１１】
ＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターゲノムの組み込み効率を、形質導入細胞の総ゲノムＤＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲにより測定する。この目的のために、Ｄ１７またはＨＴ１０８０細胞を、前に説明されている様に種々の感染多重度でＥＩＡＶ ＴＲＩＣまたはＥＩＡＶ ＧＦＰにより形質導入する。形質導入細胞を、それらから総ＤＮＡを分離する前に少なくとも３回分裂させる。約１００ｎｇの総ＤＮＡをＰＣＲ反応において鋳型としてしようする。ＥＩＡＶパッケージングシグナル断片の増幅を、ベータ−アクチンまたはＧＡＰＤＨの様なハウスキーピング遺伝子の増幅と比較することにより定量する。リアルタイム定量ＰＣＲの条件は以下の通りである：９５℃で１０分間維持；９５℃で１５分間と６０℃で１分間を４０サイクル。データをＡＢＩ ＰＲＩＳＭＲ配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて分析する。表４はＥＩＡＶベクターの組み込み効率を示す。
【０２１２】
具体例１０：ＥＩＡＶ−ＢＩＣおよび−ＴＲＩＣベクターは、培養で異種細胞においてＴＨ、ＡＡＤＣおよびＧＴＰ−ＣＨ１の発現を生じる
Ｄ１７またはＨＥＫ ２９３細胞の様な異種細胞を、種々の感染多重度（ＭＯＩ）でＥＩＡＶ−ＴＲＩＣベクターにより形質導入する。ウイルス上清を、適切なプラスミドにより２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすることにより調製し、前の具体例で説明されている様に標的細胞に加える。細胞を、それらを分析する前に少なくとも３回分裂させ、シュード形質導入が確実に存在しない様にする。ＴＨ、ＡＡＤＣ、ＧＴＰ−ＣＨ１遺伝子の発現を、ウェスタンブロッティング法と免疫化学により分析する（図１６）。適切な見かけの分子量のバンドが、形質導入Ｄ１７細胞の細胞抽出物において検出される：ＨＡ−ｈＡＡＤＣ、〜５３ｋＤａ；ｃ−ｍｙｃ−ｈＴＨｔ、〜４２ｋＤａ；ＦＬＡＧ−ＧＴＰ／ＣＨ１、〜３０ｋＤａ。標識タンパク質を認識するマウスモノクローナル抗体が前述の様に使用された。タンパク質に結合した抗体は、ＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧにより検出される。バイシストロン性およびトリシストロン性カセットは、２つまたは３つの酵素をそれぞれ発現する（図１６）。
【０２１３】
Ｄ１７細胞の形質導入は、マウスモノクローナルＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ）およびＡｌｅｘａ４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて免疫細胞化学による決定される（図１７）。対照として、Ｄ１７細胞をＥＩＡＶ ｌａｃＺを用いて形質導入した。
【０２１４】
形質導入細胞において生産されるカテコールアミンを、上記具体例に説明されているように０．５ｍｌ ０．４Ｍ ＰＣＡおよび０．１ｍＭ ＥＤＴＡにおいて抽出し、ＨＰＬＣにより分離し、電気化学的に検出する。Ｌ−ＤＯＰＡ、ドーパミン、およびＤＯＰＡＣは、ＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターにより形質導入されたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞により生産される。
【０２１５】
具体例１１：ＥＩＡＶベクターは、成熟ラットの尾状核においてＴＨ、ＡＡＤＣおよびＧＴＰ−ＣＨ１の発現を生じる
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質線条体路の欠失を特徴とする神経変性疾患で、尾状被殻内ドーパミン作動性伝達を促進する治療に反応する。チロシンヒドロキシラーゼを発現し、それによってＬ−ＤＯＰＡを合成する遺伝的修飾細胞は、パーキンソン病の齧歯類モデルにおいて行動回復を引き起こす（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ８６：９０１１−１４；Ｆｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ． ４７： ５０５−１２； Ｊｉａｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ２６２： ４５０５）。別の方法は、直接生体内体細胞遺伝子移入の方法で、これによって線条体の細胞は、ＴＨ、ＡＡＤＣおよびＧＴＰ−ＣＨ１を発現するベクターを用いる形質導入によりドーパミンプロデューサー細胞に転換される。
【０２１６】
ウイルスによりコードされた遺伝子発現を検討するために、以下の様にＥＩＡＶ−ＴＲＩＣおよびＥＩＡＶｌａｃＺを成熟ラット線条体に定位的にマイクロインジェクションする。ラットにヒプノームとヒプノベルで麻酔をかけ（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １： ２８３−２９１）、１μｌのウイルス原液（ＥＩＡＶ ｌａｃＺの場合、典型的には１〜５×１０^９ｔ．ｕ．／ｍｌ）を２回、細い機械引きガラス製マイクロピペットを使用して２分間にわたり、線条体にブレグマ３．５ｍｍ外側、硬膜から４．７５ｍｍ垂直、および１ｍｍ吻側、３．５ｍｍ外側４．７５ｍｍ垂直の座標で、注入する。ピペットを１ｍｍ引き上げ、更に２分間留置してから、ゆっくりと表面に引き抜く。注入後１および２週間目に分析する。ラットを、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２と５ｍＭエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸を含む４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて灌流する。脳を摘出し、固定液に一晩置き、４℃の３０％スクロースに一晩浸し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｃｈ ＯＣＴ包理コンパウンド（Ｍｉｌｅｓ ＩＮ ＵＳＡ）凍結した。５０μｍの切片を、凍結マイクロトームを使用して切断し、洗浄として４℃のＰＢＳ−２ｍＭ ＭｇＣｌ_２に短時間浮かべる。ｌａｃＺの発現は、切片をＸ−ｇａｌ染色溶液に３〜５時間入れて測定する。ＥＩＡＶ ＴＲＩＣを上記の様に同じ座標を用いてラット線条体に注入する。更に、ブレグマ２．５ｍｍ外側、４．７５ｍｍ垂直および１．８ｍｍ吻側、２．５ｍｍ外側および５ｍｍ垂直においてもう２カ所の注入部位に実施された。ＡＡＤＣ、ＴＨおよびＧＴＰ−Ｃｈ１の発現は、エピトープ標識、ＨＡ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧに対して作製されたマウスモノクローナル抗体を使用する免疫組織化学により検出される。これらの抗体は、ラットタンパク質とヒトタンパク質を識別する。脳切片を、ＰＢＳ−１０％ヤギ血清と０．５％トリトンＸ−１００の中でマウス抗ＨＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、抗ｃ−ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）抗体（１：１００希釈）と共に４℃で一晩インキュベーションする。切片をＰＢＳで洗浄し、次にＡｌｅｘａ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）またはＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）結合ヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ（１／１０００希釈）と共に室温で２−３時間インキュベーションする。洗浄後切片を蛍光顕微鏡で検査する。ＤＡＢ染色の場合、切片は、アビジン−ビオチンシステム（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎキット（Ｖａｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を用いて発色させた。
【０２１７】
ＴＨは、ラット線条体のニューロンの内部にもグリアの内部にも発現されない（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８： １４８５−８８）。線条体内部のＴＨ免疫反応性（ＴＨ−ＩＲ）は、黒質線条体からの求心性繊維のドーパミン作動性末端に限定される。形質導入された細胞がニューロンかグリア細胞かを決定するために、ＴＨ抗体を、ニューロン（ＮｅｕＮ）またはグリア（ＧＦＡＰ）マーカーと組み合わせて使用する。ダブル免疫染色を脳切片で実施する。切片をＰＢＳ−１０％ヤギ血清と０．５％トリトンＸ−１００の中で、ウサギポリクローナルＴＨ抗体（１／１００、Ａｆｆｉｎｉｔｔｉ）およびマウスモノクローナルニューロフィラメント（ＮｅｕＮ）抗体（１／５０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、またはマウスモノクローナルＧＦＰ（１／５０、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と共に４℃で一晩インキュベーションする。切片をＰＢＳで洗浄し、次にＡｌｅｘａ ４８８結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／２００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）またはＣＹ３結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１／２００；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に室温で２〜３時間インキュベーションする。洗浄後切片を蛍光顕微鏡で検査する。
【０２１８】
図１９は、注入後７日目のｐＯＮＹ８Ｚによる成熟ラット線条体の形質導入を示す。図２０は、注入後２週間目のｐＯＮＹＴＲＩＣによるラット線条体の形質導入を示す。
【０２１９】
具体例１２：パーキンソン病の齧歯動物モデルにおけるＥＩＡＶ−ＴＲＩＣベクターの有効性：アポモルヒネ誘発性回転行動
本実験の目的は、パーキンソン病動物モデルの線条体におけるドーパミンの補充である。ラットの右内側前脳束（ＭＦＢ）に６−ＯＨＤＡ損傷を加えた。３３ゲージの鈍な先端の針を付けた１０μｌ ハミルトンシリンジを用いて、定位注入を実施した。各ラットに、２ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸−生理食塩水（０．２％アスコルビン酸、０．９％ＮａＣｌ）に溶解した４μｌの４μｇ／μｌ ６−ＯＨＤＡ ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）を投与した。溶液を、０．５μｌ／分の速度でゆっくりと注入した。６−ＯＨＤＡ損傷後３週間目に、アンフェタミン誘発性回転に関してラットを試験した。動物に２．５ｍｇ／ｋｇ Ｄ−アンフェタミン（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内注射した。アンフェタミンは、ＰＢＳに希釈した。回転非対称を９０分間にわたり監視した。１分間あたり７回転以上のラットのみ、その後の実験に使用した。アポモルヒネ誘発性回転に関しては、動物を０．０５ｍｇ／ｋｇで２回、４日間あけて皮下注射した。１５匹のラットが６−ＯＨＤＡ損傷の範囲に関して均質性を示した。２つの実験を、ＥＩＡＶ−ＴＲＩＣベクターを使用して実施した。６−ＯＨＤＡ損傷後３週目に、ドーパミン合成に関与する遺伝子を有するＥＩＡＶに基づくレンチウイルスベクターを、線条体の片側に注入した（損傷と同側）。各実験に、２群の動物が含められた。第一の実験においてｐＯＮＹ８．１Ｚ Ｎ＝５；ｐＯＮＹ８．１Ｔ ｎ＝４；第二の実験において、ｐＯＮＹ８．１Ｚ Ｎ＝４；ｐＯＮＹ８．１Ｔ ｎ＝７。治療の機能に関する利点の可能性を評価するために、アポモルヒネ誘発性回転を、ウイルス注入後毎週試験した（図２４．Ａ）。２匹のｐＯＮＹ８．１Ｔ注入動物（Ｃ３Ｒ５＆Ｃ５Ｒ４）が、実験期間全体にわたり、アポモルヒネ２回前投与の回転よりも対側回転の減少を示し、ウイルス注入後３週目に６５％と７０％の減少に達した（本発明者は、１匹のラットがこの回転中にハーネスから滑り落ちたため、７０％は恐らくアーチファクトであると示唆している。）。これら２匹のラットに関しては、ウイルス溶液注入後１０週目に６０％と３０％の減少が観察されている。第二の実験において、ドーパミン補充により、ｐＯＮＹ８．１Ｔを注入された（７匹のラットの内）６匹においてアポモルヒネ誘発性回転数が減少しなかった（図２４Ｂ）。ウイルス注入後６週目の回転数の平均減少は、アポモルヒネ２回前投与と比較し、約４５％である。
【０２２０】
各実験の終わりに、ラットを、０．０２％アスコルビン酸と５０００単位のへパリンを含む氷冷ＰＢＳで灌流し、続いて４％パラホルムアルデヒドで灌流した。脳を切離し、４％パラホルムアルデヒド溶液に一晩置き、続いて３０％スクロース溶液中で凍結保護した。ＴＨ免疫組織化学標識を、黒質および線条体切片で実施し、損傷の範囲を試験した。ＴＨ免疫染色を、ポリクローナルウサギ抗ＴＨ抗体を用いて、黒質（図２５Ａ）および線条体（図２５Ｂ）切片に関して実施した。６−ＯＨＤＡラットの除神経線条体においてＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターにより生産されたカテコールアミンは、前述の具体例に説明されている様に、ＨＰＬＣおよび電気化学検出により測定される。結果を図２６と２７に示す。
【０２２１】
具体例１３：パーキンソン病の６−ＯＨＤＡ霊長類モデルの矯正に使用されるＥＩＡＶ−ＴＲＩＣベクター
このモデルは、小型新世界サル、コモンマルモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）の黒質線条体束への６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）の片側注入を含む。齧歯動物モデルの場合と同様に、脱神経線条体と無傷線条体の間でレセプター感受性において毒素により引き起こされる非対称は、アポモルヒネの様なドーパミン作動性因子の筋肉内投与時の回転行動を引き起こす（Ａｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９７））。アンフェタミンにより誘発される回転の割合は、線条体のドーパミン作動性機能不全に直接関係し、パーキンソン病の種々の治療法の治療効果を評価するために利用される（Ａｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ． １２５： ２２８−２４６； Ａｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｂｒａｉｎ， １１５： ８２５−８５６）。１８〜２４ヶ月齢のマルモセットに、麻酔下に０．０１％アスコルビン酸−生理食塩水に溶解された４ｍｇ／ｍｌ遊離塩基重量６−ＯＨＤＡ（Ｓｉｇｍａ）の投与により、損傷を加えた。６−ＯＨＤＡを、脳片側の黒質線条体束の５カ所に定位注入した（座標：Ｓｔｅｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０） Ｂｅｒｌｉｎ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇに説明されている様に、ＡＰ＋６．５； Ｌ＋／−１．２、Ｖ＋６および＋７：Ｌ＋／−２．２、Ｖ＋６．５およびＶ＋７．５、Ｌ＋／−３．２、Ｖ＋７．５）。３μｌを最外側部位に注入し、２μｌを他の４か所の部位に注入した。６−ＯＨＤＡ損傷動物を、損傷前、損傷後ウイルスベクター注入前、ベクター注入１ヶ月後に回転行動に関して検討した。回転は、薬物注入後３０分後から、３０分間間隔で記録した。マルモスタットは、透明なパースペックスボックスに入っている間撮影され、完全な回転数が計数される。
【０２２２】
４匹の６−ＯＨＤＡ損傷動物に、３０μｌのＥＩＡＶ−ＴＲＩＣまたはＥＩＡＶｌａｃＺウイルス原液を５か所で尾状被殻内注入する（５μｌ／部位）。仕事の目標到達とアポモルヒネにより誘発された回転テストに関するサルの行動評価を、長期フォローアップのために注入後１ヶ月と数ヶ月間定期的に実施する。動物を屠殺し、前に説明したように、脳組織切片をＴＨ免疫反応に関して分析する。脱神経線条体におけるカテコールアミン濃度を、ＨＰＬＣと電気化学的検出により決定する（上記の様に）。
【０２２３】
具体例１４：パーキンソン病のＭＰＴＰ霊長類モデルの矯正に使用されるＥＩＡＶ−ＴＲＩＣベクター
パーキンソン病の霊長類モデルは、ヒト臨床試験に入る前の有望な治療法を評価するための最高の容認できるモデルと考えられている。このモデルは最初、１９８０年代初期に若者集団が特発性パーキンソン病と著しく類似した神経変性疾患を発症することが観察されたことから発生した。この疾患の原因は、街で売られている麻薬、特に１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）として知られる化学薬品の使用に遡る（Ｌａｎｇｓｔｏｎ （１９８５） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． ６： ３７５−３７８）。ＭＰＴＰを霊長類に投与すると、動物はパーキンソン病様異常を発症し、これが抗パーキンソン病薬の原理モデルとなった。末梢投与されたＭＰＴＰは、血管脳関門を通過し、そのときモノアミンオキシダーゼＢ（ＭＡＯ−Ｂ）によりＭＰＰ＋に転換される。ＭＰＰ＋は、パーキンソン病に見られる様に、最終的に黒質線条体ドーパミン経路の変性を引き起こす強力な神経毒である。
【０２２４】
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、０．５〜１ｍｇ／ｋｇ ＭＰＴＰを毎週１回連続１０ヶ月静脈内注射することによりパーキンソン病にする。ＭＰＴＰ投与前に、微細運動作業を行う様動物を訓練する。損傷の有効性を評価するために、パーキンソン病サルを、自発的活動の著明な減少、両側動作振せん、動作停止、姿勢、バランス障害に関して検査する。運動欠損は、ヒト以外の霊長類障害評価スケール（Ｈｅｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ５６： ９６５−７２）に従って、評価する。更に、アポモルヒネ（０．１ｍｇ／ｋｇ、筋注）も、循環行動の出現をテストするために２週間ごとに投与する。線条体内形質導入前３ヶ月間、ＭＰＴＰ投与を止める。動物をケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）とミオダゾロン（１ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔し、定位フレームに配置する。Ｓｚａｂｏ ａｎｄ Ｃｏｗａｎの図解書（Ｓｚａｂｏ ａｎｄ Ｃｏｗａｎ （１９８４） Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２２２： ２６５−３００）に従って、右前脳室のレベルで頭蓋に穴をあけ、右脳室内に０．４ｍｌのオムニグラスを注入することにより脳室造影を実施する。交連神経路間ライン（ＡＣ−ＰＣライン）を測定し、被殻核の座標を図解書に従って調整する。
【０２２５】
ＥＩＡＶ−ＴＲＩＣおよびＥＩＡＶｌａｃＺウイルスベクター（５μｌの〜１−５Ｘ１０^９ｔ．ｕ．／ｍｌ）を、ハミルトンシリンジを用いて、左被殻内に吻尾軸に沿って２か所に定位注入する。要約すると、２ｘ５μｌ〜１−５ｘ１０^９ｔ．ｕ．／ｍｌを以下の様に被殻核内に注入する：吻側被殻、ＡＰ ＡＣ−ＰＣラインの中心点から−３．４ｍｍ； ＭＬ 縦洞から１２ｍｍ、およびＶＤ 脳硬膜下１５ｍｍ。動物に抗生物質を予防的に２週間（アンピシリン２５０ｍｇ／日、筋注）投与し、非ステロイド系抗炎症薬（フルニキシン、２．５ｍｇ／ｋｇ）により無痛法を行った。治療ベクターがパーキンソン病の行動を改善するかどうかを決定するために、動物を定期的に（２週間ごと）３〜５ヶ月間フォローアップする（Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９４））。動物は、上記に説明されているように、運動欠損に関してテストされる。実験期間の最後に、ＰＢＳに溶解された４％ＰＦＡにより動物に経心臓灌流を行う。脳を４℃の同じ固定液で一晩固定し、ＰＢＳに溶解された３０％スクロースに浸す。冠状脳切片（厚さ３０μｌ）を凍結マイクロトームで切断し、ＰＢＳに収集する。脱神経被殻におけるＴＨ免疫活性とカテコールアミン濃度を前述の様に分析する。
【０２２６】
上記明細書に言及されている全ての出版物は、引用する事により本明細書の一部を成す事とする。本発明の範囲と精神を逸脱しない、本発明の説明されている方法およびシステムの種々の改変および変更は、本技術に精通する者にとって明らかである。本発明は、特定の好ましい実施例と関連して説明されているが、請求されている本発明は、このような特定の実施例に過度に限定されるべきではないことは明らかである。事実、化学、生物学、または関連分野の技術に精通する者にとって明らかな、本発明を実施するための説明されている方法の種々の改変は、以下の請求項の範囲内にあることを意図している。
【０２２７】
表２
【表２】

【０２２８】
表３
【表３】

【０２２９】
表４：相対的組み込み効率
【表４】

Ｄ１７細胞は、種々の感染多重度でＥＩＡＶベクターにより形質導入された。ｄＣＴ値は、１００ｎｇの総ＤＮＡにおけるβ−アクチン／ＥＩＡＶゲノムの比を表す（ｄＣＴ＝β−アクチンＣｔ−ＣＭＶｐ Ｃｔ）。ＰＣＲ反応は、組み込まれたＥＩＡＶゲノムに存在するＣＭＶ領域を増幅する。非形質導入細胞のｄＣＴ値は 〜１．８５であった。同様の結果が、ＥＩＡＶパッケージングシグナルを用いて得られる。
【０２３０】
［配列］
配列番号１：
【化５−１】

【化５−２】

【化５−３】

【０２３１】
配列番号２：
【化６−１】

【化６−２】

【０２３２】
配列番号３：
【化７−１】

【化７−２】

【化７−３】

【化７−４】

【０２３３】
配列番号４：
【化８−１】

【化８−２】

【化８−３】

【０２３４】
配列番号５：
【化９−１】

【化９−２】

【化９−３】

【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒトチロシンヒドロキシラーゼ２型ｃＤＮＡのクローニングに使用されるプライマーのオリゴヌクレオチド配列（寄託番号Ｘ０５２９０）。制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＢａｍＨｉおよびＨｉｎｄＩＩ）は、下線が付けられ、コンセンサスコザック配列はイタリック体、ｃ−ｍｙｃエピトープは太字で表示されている。
【図２】
ｐＮＥ４のプラスミドマップ。ｃ−ｍｙｃ標識ヒトチロシンヒドロキシラーゼ２型（ｃｍｙｃ−ｈＴＨ）を発現するｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ由来の哺乳動物発現プラスミド。
【図３】
ヒト芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼｃＤＮＡのクローニングに使用されるプラスミドのオリゴヌクレオチド配列（寄託番号Ｍ７６１８０ Ｍ３０７７２）。制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂｇｌ ＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）は、下線が付けられ、コンセンサスコザック配列はイタリック体、ＨＡ エピトープは太字で表示されている。
【図４】
ｐＮＥ２のプラスミドマップ。ＨＡ 標識ヒト芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＨＡ−ｈＡＡＤＣ）を発現するｐｃＤＮＡ３．１／Ｎｅｏ由来の哺乳動物発現プラスミド。
【図５】
ヒトＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１ｃＤＮＡのクローニングに使用されるプラスミドのオリゴヌクレオチド配列（寄託番号Ｕ１９５２３）。制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｂｇｌ ＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）は、下線が付けられ、コンセンサスコザック配列はイタリック体、ＦＬＡＧ エピトープは太字で表示されている。
【図６】
ｐＮＥ６のプラスミドマップ。ＦＬＡＧ標識ヒトＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＦＬＡＧ−ｈＧＴＰ）を発現するｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ由来の哺乳動物発現プラスミド。
【図７】
ヒトチロシンヒドロキシラーゼ２型の切断型のクローニングに使用されるプラスミドのオリゴヌクレオチド配列。制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＥｃｏＲＩ）は、下線が付けられ、コンセンサスコザック配列はイタリック体、ｃ−ｍｙｃエピトープは太字で表示されている。
【図８】
ｐｈＴＨｔ−１のプラスミドマップ。ｃ−ｍｙｃエピトープで標識されたｈＴＨの切断型（ｃｍｙｃ−ｈＴＨｔ）を発現するｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ由来の哺乳動物発現プラスミド。
【図９】
ｐｎｅｏ２のプラスミドマップ。バイシストロン性カセットとしてｃｍｙｃ−ｈＴＨｔとＦＬＡＧ−ｈＧＴＰを発現するＢＬ−ＥＰ由来の哺乳動物発現プラスミド （Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９５） ２６９： ８４７）。ポリオウイルスのＩＲＥＳは、ｃｍｙｃ−ｈＴＨｔ遺伝子の下流に位置する。
【図１０】
ｐｔｒｉｃｉｓのプラスミドマップ。トリシストロン性カセットとして、ＨＡ−ｈＡＡＤＣ、ｃｍｙｃ−ｈＴＨｔとＦＬＡＧ−ｈＧＴＰを発現するＢＬ−ＥＰ由来の哺乳動物発現プラスミド （Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９５） ２６９： ８４７）。ＥＭＣＶのＩＲＥＳは、ＨＡ−ｈＡＡＤＣ遺伝子の下流に位置し、ポリオウイルスのＩＲＥＳはｃｍｙｃ−ｈＴＨｔ遺伝子の下流に位置する。
【図１１】
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるバイシストロン性およびトリシストロン性カセットの一過性発現。特異的マウスモノクローナル抗体によりプロービングされたウェスタンブロッティング法。抗体に結合された標識タンパク質は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合させた抗マウスウサギＩｇＧにより検出される。レーン；１、疑似；２、ｐｈＴＨ；３、バイシストロン性プラスミド（ｐｎｅｏ２）；４、トリシストロン性プラスミド（ｐｔｒｉｃ）；５、３つのモノシストロン性プラスミド（ｐｈＴＨｔ、ｐＮＥ２、ｐＮＥ６）。
【図１２】
ＥＩＡＶ最小ベクターの図解。
【図１３】
ＥＩＡＶ ＢＩＣおよびＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターの図解。
【図１４】
中心ポリプリン路（ｃｐｐｔ）を含むＥＩＡ ＴＲＩＣベクターの図解。
【図１５】
ＥＩＡＶベクターのＰＥＲＴおよびウイルスＲＮＡ含有量量。
【図１６】
種々の感染多重度で形質導入されたＤ１７細胞におけるＥＩＡＶ ＢＩＣおよびＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターの発現。ウェスタンブロッティング法は特異的マウスモノクローナル抗体によりプロービングされる。抗体に結合された標識タンパク質は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスウサギＩｇＧにより検出される。レーン： ａ，ｐＯＮＹ８Ｇ（１００Ｘ）； ｂ，ｐＯＮＹ８．１Ｚ（１００Ｘ）； ｃ，ｐＯＮＹ８．１ＢＩＣ（１００Ｘ）； ｄ，ｐＯＮＹ８．１ＢＩＣ（１０Ｘ）； ｅ，ｐＯＮＹ８ＢＩＣ（１Ｘ）； ｆ，ｕｎｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｓ； ｈ，ｐＯＮＹ８．１ＴＲＩＣ（１００Ｘ）； ｉ，ｐＯＮＹ８．１ＴＲＩＣ（１０Ｘ）； ｊ，ｐＯＮＹ８．１ＴＲＩＣ（１Ｘ）； ｋ，ｐＯＮＹ８ＴＲＩＣ（１００Ｘ）； ｌ，ｐＯＮＹ８ＴＲＩＣ（１０Ｘ）； ｍ，ｐＯＮＹ８ＴＲＩＣ（１Ｘ）； ｎ，ｐＯＮＹ８．１ＴＲＩＣ−Ｂ（１００Ｘ）； ｏ，ｐＯＮＹ８．１ＴＲＩＣ−Ｂ（１０Ｘ）； ｐ，ｐＯＮＹ８．１ＴＲＩＣ−Ｂ（１Ｘ）； ｇ，モノシストロン性プラスミドによりトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図１１参照）。
【図１７】
ＭＯＩ〜１００で形質導入されたＤ１７細胞におけるＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターの発現。（Ａ）ウサギ抗ポリクローナル抗ＬａｃＺまたはマウスモノクローナル抗ＨＡをそれぞれ用いてＥＩＡＶｌａｃＺまたはＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターにより形質導入されたＤ１７細胞の免疫染色。天然タンパク質に結合された抗体は、Ａｌｅｘａ ４８８（緑）結合ヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウスＩｇＧにより検出された（倍率〜１０×）。（Ｂ）ＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターにより形質導入されたＣ１７細胞。（Ａ）の場合の様に、核を染色するヨウ化プロピジウムをプラスした免疫染色（倍率〜×４０）。
【図１８】
ＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターにより形質導入されたＨＥＫ ２９３細胞により生産されるカテコールアミン（ｐｇ／１０６細胞）。
【図１９】
ＥＩＡＶ ｌａｃＺベクターによる成熟ラット線条体の形質導入。パネルＡ−Ｃは、Ｘ−ｇａｌで染色された３つの独立した５０μｍ冠状切片に対応する。動物１匹あたりこのような切片が約５０枚染色され、形質導入がラット線条体に及ぶことを示していた。パネルＤ−Ｈは、Ｃの切片の拡大図で、形質導入された細胞の多くが、線条体内部（Ｄ−Ｆ）と核側位の両者にニューロン形態を有することを表している。
【図２０】
ＥＩＡＶ ＴＲＩＣ ベクターによる成熟ラット線条体の形質導入。パネルＡは、マウスモノクローナルＨＡ抗体により染色された５０μｍ冠状切片を表す。ＦＩＴＣ二次抗体による免疫蛍検出法により、ＡＡＤＣの発現が示される。パネルＣは、マウスモノクローナルＦＬＡＧ抗体により染色された５０μｍ冠状切片を表す。Ａｌｅｘａ４８８による免疫蛍光検出法により、ＧＴＰ−ＣＨ１１の発現が示される。対側線条体には発現が検出されない（パネルＢおよびＤ）。パネルＥは、ＤＡＢ免疫組織化学により検出されるマウスモノクローナルｃ−ｍｙｃ抗体による染色を表す。結果は、ＴＨが同側に発現されるが、対側線条体には発現されないことを示している（パネルＦ）。形質導入側におけるこれらのタンパク質発現の細胞特異性により、有効な形質導入が更に確認される。
【図２１】
ｐＯＮＹ８Ｇのプラスミドマップ。
【図２２】
ｐＯＮＹ８．１Ｇのプラスミドマップ。
【図２３】
ｐＯＮＹ８Ｚのプラスミドマップ。
【図２４】
（Ａ）ｐＯＮＹ８．１ＺまたはｐＯＮＹ８．１Ｔ注入後の６−ＯＨＤＡ損傷ラットにおけるアポモルヒネ刺激（０．０５ｍｇ／ｋｇ）により誘発された回転数／分の変化を示すヒストグラム。ｐＯＮＹ８．１Ｚ ｎ＝５、ｐＯＮＹ８．１Ｔ ｎ＝２。（Ｂ）ｐＯＮＹ８．１Ｚ（ｎ＝４）またはｐＯＮＹ８．１Ｔ（ｎ＝７）注入後の６−ＯＨＤＡ損傷ラットにおけるアポモルヒネにより誘発された回転行動。
【図２５】
ＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターを注入された６−ＯＨＤＡ損傷ラットの黒質（Ａ）および線条体（Ｂ）におけるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫反応。同側（対照）と比較して、同側にＴＨ免疫反応が認められず、６−ＯＨＤＡが黒質網状部分（ＳＮｒ）のドーパミン作動性ニューロンに影響を及ぼしたことを示していることに留意すること。
【図２６】
ＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターを注入された６−ＯＨＤＡ損傷ラットの正常および変性線条体におけるカテコールアミン（ｎｇ／ｍｇ湿性組織）含有量。変性線条体に検出されたカテコールアミン量により、６−ＯＨＤＡ損傷が黒質のドーパミン作動性ニューロンの大部分に影響を及ぼしたことが確認される。ＥＩＡＶ ＴＲＩＣにより生産されるドーパミン量は、損傷のない線条体と比較して、５％から８％の間で変動する。
【図２７】
ＥＩＡＶ ＴＲＩＣベクターを注入された６−ＯＨＤＡ損傷ラットの正常および変性線条体におけるＤＯＰＡＣ／ドーパミン比。薬物誘発性回転がより著明に減少した注入動物は、変性線条体のＤＯＰＡＣ／ドーパミン比（ドーパミンのターンオーバー）が低い動物であることに留意すること。

Claims (40)

1. １つ以上の内部リボソームエントリー部位により機能的に結合された２つ以上のＮＯＩを含むレトロウイルスベクターゲノム。
2. ２つ以上の内部リボソームエントリー部位により機能的に結合された３つ以上のＮＯＩを含むレトロウイルスベクターゲノム。
3. それぞれのＮＯＩが神経変性疾患の治療に有用である請求項１記載のゲノム。
4. レンチウイルスベクターゲノムである請求項１〜３のいずれかに記載のゲノム。
5. 神経変性疾患の治療に適切な２つ以上のＮＯＩを含むレンチウイルスベクターゲノム。
6. 神経変性疾患の治療に適切な３つ以上のＮＯＩを含む請求項５記載のゲノム。
7. ＮＯＩが１つ以上の内部リボソームエントリー部位により機能的に結合された請求項５記載のゲノム。
8. ＮＯＩが、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼおよび小胞性モノアミン輸送体２からなる群から選択されるタンパク質をコードする前記請求項のいずれかに記載のゲノム。
9. ＮＯＩが、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩおよび任意選択的に芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼまたは芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼおよび小胞性モノアミン輸送体２をコードする請求項８記載のゲノム。
10. チロシンヒドロキシラーゼおよびＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩをコードするレンチウイルスベクターゲノム。
11. 芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼおよび／または小胞性モノアミン輸送体２もコードする請求項１０記載のレンチウイルスベクターゲノム。
12. １つ以上の内部リボソームエントリー部位により機能的に結合された２つ以上のＮＯＩを含む請求項１０または１１記載のゲノム。
13. ＨＩＶから誘導可能な前記請求項のいずれかに記載のゲノム。
14. ＥＩＡＶから誘導可能な請求項１から１２のいずれかに記載のゲノム。
15. レンチウイルスベクターが非霊長類レンチウイルスベクターである請求項４から１４のいずれかに記載のゲノム。
16. 少なくとも１つのＮＯＩがプロモーターまたはプロモーター成分に機能的に結合された前記請求項のいずれかに記載のゲノム。
17. ｒｅｖ反応配列を欠失している請求項４から１６のいずれかに記載のゲノム。
18. ｃＰＰＴ配列を含む請求項４から１７のいずれかに記載のゲノム。
19. 転写後調節成分または転写エンハンサーを含む請求項４から１８のいずれかに記載のゲノム。
20. 前記請求項のいずれかに記載のベクターシステム。
21. （ｉ）請求項４から１９のいずれかに記載のゲノムと、
    （ｉｉ）レンチウイルスｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
    （ｉｉｉ）ｉｉ）のヌクレオチド配列によりコードされていないその他の必須ウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列と
    を含む請求項２０記載のベクターシステム。
22. ＲＮＡゲノムをレシピエント細胞に送達できるレンチウイルスベクターシステムであって、ゲノムがレンチウイルスの野生型ゲノムよりも長いベクターシステム。
23. ＥＩＡＶベクターシステムである、請求項２２記載のレンチウイルスベクターシステム。
24. 機能的な別途の遺伝子を欠失している請求項２０から２３のいずれかに記載のベクターシステム。
25. 異種ｅｎｖタンパク質の少なくとも一部によりシュードタイピングされた、請求項２０から２４のいずれかに記載のベクターシステム。
26. 異種ｅｎｖタンパク質が狂犬病−Ｇまたは水泡性口内炎ウイルス−Ｇから誘導可能である請求項２５記載のベクターシステム。
27. レンチウイルス粒子生産方法に使用するための請求項１から１９のいずれかに記載のベクターゲノムまたは請求項２０から２６のいずれかに記載のシステム。
28. ｉ）請求項４から１９のいずれか１項に定義されているゲノムと、
    ｉｉ）レンチウイルスのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
    ｉｉｉ）ｉｉ）のヌクレオチド配列の１以上によりコードされていないその他の必須ウイルスパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列と
    をプロデューサー細胞へ導入することを含むレンチウイルス粒子の生産方法。
29. ｇａｇおよびｐｏｌをコードするヌクレオチド配列が、プロデューサー細胞における発現に関して最適化された請求項２８記載の方法。
30. 請求項２０から２６記載のいずれか１項記載のシステムにより、または請求項２８若しくは請求項２９記載の方法により生産されるウイルス粒子。
31. 請求項１から１９のいずれか１項記載のゲノム、請求項２０から２６のいずれか１項記載のシステム、または請求項３０記載のウイルス粒子を、薬剤学的に許容可能な担体または希釈剤と共に含む医薬組成物。
32. 被験対象における疾病の治療および／または予防のための医薬組成物の製造における請求項１から１９のいずれか１項に定義されたゲノム、請求項２０から２６のいずれか１項記載のシステム、または請求項３０記載のウイルス粒子の使用。
33. 請求項１から１９のいずれか１項に定義されたゲノム、請求項２０から２６のいずれか１項記載のシステムまたは請求項３０記載のウイルス粒子を利用するステップを含む、疾病の治療および／または予防が必要な被験対象における疾病の治療および／または予防方法。
34. 神経変性疾患の治療および／または予防のための請求項３４記載の方法。
35. パーキンソン病の治療および／または予防のための請求項３４記載の方法。
36. 請求項２０から２６のいずれかに記載のシステムにより形質導入された細胞。
37. 被験対象の脳に請求項３６記載の細胞を移植するステップを含む、パーキンソン病の治療を必要とする哺乳動物被験対象におけるパーキンソン病の治療方法。
38. １つ以上のＩＲＥＳにより機能的に結合されたチロシンヒドロキシラーゼをコードするヌクレオチド配列およびＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩをコードするヌクレオチド配列とを含むバイシストロン性カセット。
39. １つ以上のＩＲＥＳにより機能的に結合された芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列と、小胞性モノアミン輸送体２をコードするヌクレオチド配列とを含むバイシストロン性カセット。
40. ２つ以上のＩＲＥＳにより機能的に結合されたチロシンヒドロキシラーゼをコードするヌクレオチド配列、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩをコードするヌクレオチド配列、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列を含むトリシストロン性カセット。

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