JP6698114B2 - 構築物 - Google Patents
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Description
(i)その順で(つまりTH−CH1融合タンパク質を形成する)、CH1に対して連結されたTHを有する構築物が、高い絶対的なレベルのカテコールアミン産生を示し、
(ii)いずれかの順で(つまりAADC−THまたはTH−AADC融合タンパク質を形成する)連結されたAADCおよびTHを有する構築物が、L−ドパの、ドーパミンへの非常に効率的な変換を示す。そのような構築物と関連する、ドーパミン:L−ドパの比は、高い。
TH−L−CH1−IRES−AADC、
AADC−L−TH−L−CH1、
TH−L−CH1−L−AADC、および
TH−L−CH1−P−AADC
L=リンカーコード配列
IRES=配列内リボソーム進入部位
P=プロモーター
構築物は、TH−CH1融合タンパク質の翻訳を開始するために、TH−CH1コード配列の上流にIRESを含まなくてもよい。
TH−L−AADC−IRES−CH1
AADC−L−TH−IRES−CH1
AADC−L−TH1−L−CH1
TH1−L−AADC−L−CH1
L=リンカーコード配列
IRES=配列内リボソーム進入部位 。
(i)本発明の第2の態様によるゲノム、
(ii)gagタンパク質およびpolタンパク質をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列、
(iii)ii)のヌクレオチド配列によってコードされない、他の不可欠なウイルスパッケージング構成成分をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
i)本発明の第2の態様によるゲノム、
ii)gagタンパク質およびpolタンパク質をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列、ならびに
iii)ii)のヌクレオチド配列のうちの1つまたはそれより多くによってコードされない、他の不可欠なウイルスパッケージング構成成分をコードするヌクレオチド配列を導入するステップを包含する、方法を提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
(i)チロシンヒドロキシラーゼ(TH)をコードするヌクレオチド配列、(ii)GTP−シクロヒドロラーゼI(CH1)をコードするヌクレオチド配列、および(iii)芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ(AADC)をコードするヌクレオチド配列を含む構築物であって、融合タンパク質TH−CH1をコードするように、THをコードする前記ヌクレオチド配列が、CH1をコードする前記ヌクレオチド配列に対して連結されている、構築物。
(項目2)
以下:
TH−L−CH1−IRES−AADC、
AADC−L−TH−L−CH1、
TH−L−CH1−L−AADC、および
TH−L−CH1−P−AADC
から選択される、項目1に記載の構築物であって、ここで、
Lは、リンカーコード配列であり、
IRESは、配列内リボソーム進入部位であり、
Pは、プロモーターである、構築物。
(項目3)
TH−L−CH1−IRES−AADCである、項目2に記載の構築物。
(項目4)
ヒトの使用頻度についてコドン最適化されていないリンカーを含む、前述の項目のいずれか一項に記載の構築物。
(項目5)
配列番号1として示される配列を含むリンカーを含む、項目1〜3のいずれか一項に記載の構築物。
(項目6)
配列AADC−L1−TH−L2−CH1またはTH−L1−CH1−L2−AADCを有し、L1およびL2が、2つの異なるリンカー配列である、項目1または2に記載の構築物。
(項目7)
L1およびL2の核酸配列は異なるが、L1およびL2のアミノ酸配列は同じである、項目6に記載の構築物。
(項目8)
L1およびL2の核酸配列が異なり、そして配列番号1および配列番号3から選択される、項目7に記載の構築物。
(項目9)
配列TH−L−CH1−P−AADCを有し、前記プロモーターが、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターである、項目2に記載の構築物。
(項目10)
前記プロモーターが、CMVプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、またはチミジンキナーゼプロモーターである構成的プロモーターである、項目9に記載の構築物。
(項目11)
前述の項目のいずれか一項に記載の構築物を含むウイルスベクターゲノム。
(項目12)
レンチウイルスベクターゲノムまたはアデノ随伴ウイルスベクターゲノムである、項目11に記載のウイルスベクターゲノム。
(項目13)
項目11または12に記載のゲノムを含むウイルスベクター系。
(項目14)
レンチウイルスベクター系またはアデノ随伴ウイルスベクター系である、項目13に記載のウイルスベクター系。
(項目15)
以下:
(i)項目11に記載のゲノム、
(ii)gagタンパク質およびpolタンパク質をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列、
(iii)(ii)のヌクレオチド配列によってコードされない、他の不可欠なウイルスパッケージング構成成分をコードするヌクレオチド配列
を含む、項目14に記載のレンチウイルスベクター系。
(項目16)
レンチウイルスベクター粒子を産生するための方法であって、前記方法は、産生細胞の中に、以下:
i)項目11に記載のゲノム、
ii)gagタンパク質およびpolタンパク質をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列、ならびに
iii)ii)のヌクレオチド配列のうちの1つまたはそれより多くによってコードされない、他の不可欠なウイルスパッケージング構成成分をコードするヌクレオチド配列
を導入するステップを包含する、方法。
(項目17)
項目13〜15のいずれか一項に記載の系または項目16に記載の方法によって産生されるウイルス粒子であって、前記ウイルス粒子は、ドーパミン合成酵素GTP−シクロヒドロラーゼI(CH1)、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、および芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ(AADC)を含み、ここでTHおよびCH1が、TH−CH1融合タンパク質として存在する、ウイルス粒子。
(項目18)
EIAVベクター粒子であり、VSV−Gによりシュードタイプされた、項目17に記載のウイルスベクター粒子。
(項目19)
薬学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤と一緒に、項目17または18に記載のウイルス粒子を含む、薬学的組成物。
(項目20)
インビボにおいてドーパミンを産生するための方法であって、項目1〜10のいずれか一項に記載の構築物から、被験体においてドーパミン合成酵素GTP−シクロヒドロラーゼI(CH1)、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、および芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ(AADC)を発現させるステップを包含する、方法。
(項目21)
被験体における神経変性疾患を治療するおよび/または予防するための方法であって、項目17もしくは18に記載のウイルス粒子または項目18に記載の薬学的組成物を、前記被験体に対して投与するステップを包含する、方法。
(項目22)
インビボにおけるドーパミン合成を誘発することによって、被験体における神経変性疾患を治療するおよび/または予防するのに使用するための、項目17もしくは18に記載のウイルス粒子または項目19に記載の薬学的組成物。
(項目23)
前記神経変性疾患が、パーキンソン病である、項目21または22に記載の方法、ウイルス粒子、または薬学的組成物。
本発明の第1の態様は、構築物に関する。
構築物におけるそれぞれのNOIは、ドーパミン合成に関与する酵素をコードする。NOIは、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、GTP−シクロヒドロラーゼI(CH1)、および芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ(AADC)をコードする。
本発明のレンチウイルスベクターゲノムは、ドーパミン合成酵素をコードする3つのNOIを含む。NOIのうちの少なくとも2つは、リンカーコード配列(L)によってつながれ、その結果として、ゲノムは、酵素アミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。
2.(Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)5
3.酵母のHSF−1由来の(Asn−Phe−Ile−Arg−Gly−Arg−Glu−Asp−Leu−Leu−Glu−Lys−Ile−Ile−Arg−Gln−Lys−Gly−Ser−Ser−Asn)、Wiederrechtら、1988 Cell 54、841を参照されたい。
GGGGGAGGCGGTAGCGGCGGAGGGGGCTCCGGCGGAGGCGGGAGC(配列番号3) 。
mRNAにおけるオープンリーディングフレームの間に位置する場合、IRESは、IRESエレメントでのリボソームの侵入、その後に続く、下流の翻訳の開始を促進することによって、下流のオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。レトロウイルスベクターにおけるIRESエレメントの使用について、調査されている(たとえば国際公開第93/0314号パンフレットを参照されたい)。レンチウイルスベクターにおいて使用するための、適したIRES配列は、国際公開第02/29065号パンフレットにおいて記載される。
IRESは、とりわけ、AADC遺伝子の発現をコントロールするために、プロモーターと交換されてもよい。AADC発現がIRESのコントロール下にある配置において、AADCレベルは、ドーパミン産生を制限し得る。
適した構成的プロモーターの例は、CMVプロモーター、RSVプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)、およびチミジンキナーゼ(TK)プロモーターを含む。
適した組織特異的プロモーターの例は、シナプシン1、エノラーゼ、α−カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII、およびGFAPを含む。
本発明の構築物は、TH、AADC、およびCH1をコードするNOIを含む。3つのうちの2つまたは3つすべての酵素が、たとえば、可動性リンカーを使用することによって、融合されてもよい。2つの酵素が融合される場合、第3の酵素をコードするNOIは、たとえばIRESによって、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して作動可能に連結されてもよい。IRESは、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して5’または3’に位置してもよい。その代わりに、第3の酵素をコードするNOIは、プロモーターに対して適切に作用するように連結されてもよい。
(ii)いずれかの順で(つまりAADC−THまたはTH−AADC融合タンパク質を形成する)連結されたAADCおよびTHを有する構築物が、L−ドパの、ドーパミンへの非常に効率的な変換を示すことを発見した。
TH−L−CH1−IRES−AADC、
AADC−L−TH−L−CH1、
TH−L−CH1−L−AADC、および
TH−L−CH1−P−AADC
TH−L−AADC−IRES−CH1
AADC−L−TH−IRES−CH1
TH1−L−AADC−L−CH1
L=リンカーコード配列
IRES=配列内リボソーム進入部位
P=プロモーター 。
本発明はまた、本発明の第1の態様によるヌクレオチド配列を含む、レンチウイルスベクターゲノムまたはアデノ随伴ウイルスベクターゲノムなどのようなウイルスベクターゲノムを提供する。本発明はまた、そのようなゲノムを含むウイルスベクター産生系およびベクター粒子を提供する。
レンチウイルスは、より大きなグループであるレトロウイルスの一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Coffinら(1997)「Retroviruses」 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds:JM Coffin,SM Hughes,HE Varmus pp758−763)において見つけられてもよい。手短に言えば、レンチウイルスは、霊長動物および非霊長動物のグループに分けることができる。霊長動物レンチウイルスの例は、後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因病原体であるヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびサル免疫不全ウイルス(SIV)を含むが、これらに限定されない。非霊長動物レンチウイルスグループは、原型「スローウイルス」ビスナ/マエディウイルス(VMV)ならびに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、およびウシ免疫不全ウイルス(BIV)を含む。
Acad. Sci. 84:2406−2410、およびYeeら(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. 91:9564−9568)。しかしながら、そのようなベクターにおけるLTRに対して内部にあるあらゆるプロモーター(複数可)は、なお、転写活性である。この戦略は、内部に配置される遺伝子からの転写に対する、ウイルスLTRにおけるエンハンサーおよびプロモーターの効果を排除するために用いられた。そのような効果は、転写の増加(Jollyら(1983)Nucleic Acids Res. 11:1855−1872)または転写の抑制(Emerman
and Temin(1984)Cell 39:449−467)を含む。この戦略はまた、ゲノムDNAへの3’LTRから下流の転写を排除するために使用することもできる(Herman and Coffin(1987)Science 236:845−848)。これは、内因性癌遺伝子の偶発的な活性化を妨げることが決定的に重要であるヒト遺伝子療法において特有の関心事である。
「パッケージング配列」または「psi」とも区別なく呼ばれる用語「パッケージングシグナル」は、ウイルス粒子形成の間にレンチウイルスRNA鎖のキャプシド形成に必要とされる非コードシス作用性配列に関して使用される。HIV−1において、この配列は、主なスプライス供与部位(SD)の上流から少なくともgag開始コドンに及ぶ遺伝子座にマッピングされている。
本発明のレンチウイルスベクターは、シュードタイプされてもよい。この点に関して、シュードタイピングは、1つ以上の利点を付与することができる。たとえば、レンチウイルスベクターにより、HIVベースのベクターのenv遺伝子産物は、CD4と称されるタンパク質を発現する細胞のみの感染にこれらのベクターを制限するであろう。しかし、これらのベクターにおけるenv遺伝子が、他のウイルス由来のenv配列と置換された場合、それらは、より広い感染範囲を有し得る(Verma and Somia(1997)Nature 389(6648):239−242)。例として、Millerらは、広宿主性レトロウイルス4070A由来のエンベロープにより、MoMLVベクターをシュードタイプし(Mol. Cell. Biol. 5:431−437)、他の研究者らは、VSV由来の糖タンパク質により、HIVベースのレンチウイルスベクターをシュードタイプした(VermaおよびSomia(1997)Nature 389(6648):239−242)。
水疱性口内炎ウイルス(VSV)、ラブドウイルスのエンベロープ糖タンパク質(G)は、レンチウイルスを含む、あるレトロウイルスをシュードタイプすることができることが示されたエンベロープタンパク質である。
Acad. Sci. USA 91:9564−9568およびEmiら(1991)J. Virol. 65:1202−1207)。VSV−Gタンパク質はまた、その細胞質側末端がレトロウイルスのコアと相互作用することができるので、あるレンチウイルスおよびレトロウイルスをシュードタイプするために使用することもできる。
ロスリバーウイルスエンベロープは、非霊長動物レンチウイルスベクター(FIV)をシュードタイプするために使用され、続く全身投与は、主に、肝臓を形質導入した(Kangら(2002)J Virol 76(18):9378−9388)。効率は、VSV−Gシュードタイプベクターにより得られるものよりも20倍大きいことが報告され、肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによって測定されるように、引き起こされる細胞毒性は、より少なかった。
バキュロウイルスGP64タンパク質は、臨床上および商業上の適用に必要とされる高力価のウイルスの大規模生産において使用されるウイルスベクターにとってVSV−Gに対する魅力的な代替物となることが示された(Kumar M、Bradow BP、Zimmerberg J(2003)Hum. Gene Ther. 14(1):67−77)。VSV−Gシュードタイプベクターと比較して、GP64シュードタイプベクターは、類似する広い親和性および類似する天然の力価を有する。GP64発現は、細胞を死滅させないので、GP64を構成的に発現する293Tベースの細胞株を生成することができる。
本発明において、ベクターは、狂犬病Gタンパク質またはその突然変異体、変異体、ホモログ、もしくはフラグメントの少なくとも一部によりシュードタイプされてもよい。
レンチウイルスベクターをシュードタイプするために使用することができる他のエンベロープは、モコラ、エボラ、4070A、およびLCMV(リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス)を含む。
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターが、限られたパッケージング容量を有し、そのため、効率的に送達することができる遺伝子の数にマイナスに影響を与えることは、当技術分野において知られていた。しかしながら、この限界は、AAV血清型に対して依存性であることが現在知られている。たとえば、AAV5および7血清型のキャプシドは、8kbまでのゲノムをパッケージすることができる。この研究は、米国特許第7,943,374号明細書において記載されている。そのうえ、米国特許出願公開第2009/0214478号明細書は、9kbまでのパッケージング容量を有するAAV2/5組換えベクターについて記載している。
本発明において使用されるポリヌクレオチド(NOIおよび/またはベクター構成成分を含む)は、コドン最適化されてもよい。コドン最適化は、国際公開第99/41397号パンフレットおよび国際公開第01/79518号パンフレットにおいて以前に記載されている。細胞が異なると、特定のコドンのそれらの使用頻度が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のtRNAの相対的存在量におけるバイアスに相当する。コドンが、対応するtRNAの相対的存在量とマッチするように調整されるように、配列におけるコドンを改変することによって、発現を増加させることが可能である。同じ理由で、対応するtRNAが特定の細胞型においてまれであることが知られているコドンを故意に選ぶことによって、発現を減少させることが可能である。したがって、補足的な程度の翻訳のコントロールが、利用可能である。
for Biotechnology Information(NCBI)データベースで見つけられてもよい。
本発明の融合構築物は、機能的なドーパミン作動性合成酵素を産生し、国際公開第02/29065号パンフレットにおいて記載される、IRES配列によって分離された、ドーパミン合成酵素をコードする3つすべての遺伝子を有する構築物を使用して得られるレベルと比較した場合に、ドーパミン産生における増加を引き起こしてもよい。
本発明のレンチウイルスベクターは、薬学的組成物の形態で提供されてもよい。薬学的組成物は、遺伝子療法によって個人を治療するために使用されてもよく、組成物が、治療有効量のレンチウイルスベクターを含む。
ウイルスベクターは、神経学的な状態を治療するために使用されてもよい。たとえば、ベクターは、神経変性疾患の治療および/または予防に有用であってもよい。
本発明において使用されるウイルスベクターは、たとえば、尾状被殻への注射によって脳に投与される。
pONYK1と比較して、力価を改善するために生成し、かつ試験するための第1の融合構築物を、pONYK−TAiCとした(図1)。pONYK−TAiCまたはpONYK1のゲノムを使用するレンチウイルスベクター(LV)調製物を、三通り生成し、結果として生じるベクター力価を、DNA組み込みアッセイによって定量化した(図2a)。これらのデータは、驚いたことに、pONYK−TAiCから生成されたベクターの力価が、pONYK1と同じである、つまり、一方のIRESエレメントの除去が、力価を改善したわけではなかったことを実証した。HPLC分析は、産生されるL−ドパおよびドーパミンのレベルを検査するために、形質導入されたHEK293T細胞上清に対して実行した。HPLC結果(図2b)は、pONYK−TAiCベクターにより形質導入された細胞が、pONYK1ベクターにより形質導入された細胞と比較して、総カテコールアミンのレベルにおいて、2.4倍の増加をもたらしたことを実証した。L−ドパレベルは、両方のゲノムの間で同等であった、しかしながら、ドーパミンのレベルは、pONYK1よりもpONYK−TAiCについて15.3倍高かった。したがって、カテコールアミン産生は、改善された。全体として、これは、細胞が、pONYK1ベクターと比較して、pONYK−TAiCベクターにより形質導入される場合に、ドーパミン生合成経路がより効率的となることを示唆する。
pONYK−TAiCおよびpONYK1と共に、さらに3つのドーパミン酵素融合プラスミドについて試験した(pONYK−ATiC、pONYK−TCiA、pONYK−ATC(図1))。それぞれの異なるゲノムプラスミドを使用するLV調製物を、三通り生成し、結果として生じるベクターを、DNA組み込みアッセイによって定量化した(図3a)。結果は、力価が、すべてのベクターについて類似していることを実証し、力価は、1.3E+05TU/ml〜4.0E+05TU/mlの範囲にわたった。興味深いことには、両方のIRESエレメントを欠いたpONYK−ATCは、力価における増加を示さなかった。これは、融合構築物がベクター産生を改変せず、導入遺伝子の配置転換およびGS15リンカー(複数可)の存在が力価に影響を与えないことを示唆する。HPLC分析からの結果は、それぞれの異なるベクターにより形質導入したHEK293T細胞が、様々なカテコールアミン産生をもたらすことを実証した(図3b)。さらに、ドーパミンに変換されるL−ドパの量は、異なるベクターの間で有意に変動した。pONYK1ベクターは、最も低いレベルのドーパミン産生およびL−ドパのドーパミンへの最も低い変換を示した。pONYK−TCiAを使用して生成したベクターは、最も高いカテコールアミン産生を示し(pONYK1よりも4.8倍高い)、ドーパミンレベルは、pONYK1よりも13.2倍高かった。
タンパク質発現レベルについて調査するために、それぞれの導入遺伝子産物(AADC、CH1、およびTH)についてのウエスタンブロット分析を、それぞれの融合ゲノムプラスミドによりトランスフェクトしたHEK293T細胞の細胞溶解産物から実行した(図4)。結果は、それぞれの異なる融合構築物について、それぞれのドーパミン合成酵素が存在し、予測されるサイズをしていたことを実証した。124kDaのバンドが3つすべてのウエスタンブロットにおいて見られたように、3重融合カセット(pONYK−ATC)を含めて、GS15リンカーを有するドーパミン合成酵素を発現させることができることを実証した、また、これは、それぞれのゲノム構築物が、3つすべての連結されたドーパミン酵素タンパク質を含有する融合タンパク質について期待されるサイズである。異なるゲノム構築物によって発現される様々なタンパク質のそれぞれのレベルは、かなり変動する。3つすべてのタンパク質についての最も高いレベルは、pONYK1、pONYK−TAiC、およびpONYK−TCiAから発現されるように思われる。最も低いレベルのタンパク質は、pONYK−ATCで見られた。
上記論じられるように、THおよびCH1が単一のユニットとして発現される場合に、最も高いレベルのカテコールアミンが産生されるように思われる。L−ドパのレベルが、pONYK−TCiAで非常に高かったので、AADCの発現レベルは、L−ドパのドーパミンへの変換を制限していそうである。遺伝子がIRES配列の後に配置される場合、遺伝子発現が低下することが知られているので、この配置の方向を逆転させることにより、L−ドパのドーパミンへの変換を増加させることによって、最大のドーパミンレベルがもたらされるかもしれず、したがって、AADC遺伝子を発現カセットの最初に配置させる(その発現を最大限にするためにCMVプロモーターの下流に配置させ、その後IRES、次いでTH:CH1融合物が続く)。したがって、このゲノム構築物(pONYK−ATC、図1)を生成した。pONYK−ATCによりトランスフェクトした細胞からのウエスタンブロット結果は、低いレベルの大きな融合タンパク質を示した(実施例3)。しかしながら、これらの明らかな低いレベルにもかかわらず、pONYK−ATCから作製されたベクターにより形質導入された細胞は、L−ドパのドーパミンへの高レベルの変換を示し、これは、高レベルのドーパミン産生をもたらした。3つすべてのコード配列が相互に連結され、これにより、発現が比較的弱かった大きなタンパク質(124kDa)が得られることを考慮すれば、これは驚くべきことである。pONYK−TCiAを使用して生成されたベクターが、最も高いレベルのドーパミン産生を示したことおよびIRES配列が遺伝子発現を低下させると知られているという事実を考慮すれば、この同じ順(TH:CH1:AADC)で配置された導入遺伝子の3重融合物が、形質導入された細胞からのドーパミン産生のレベルの増強をもたらすということがあり得る。そのため、さらなる3重融合構築物、pONYK−TCA(図1)を生成した。
それぞれのベクターゲノムについてのタンパク質発現レベルを検査するために、それぞれの導入遺伝子産物(AADC、CH1、およびTH)についてのウエスタンブロット分析を、それぞれのベクターゲノムによりトランスフェクトしたHEK293T細胞からの細胞溶解産物を使用して実行した(図6)。結果は、ベクターゲノムのすべてについて、それぞれのドーパミン合成酵素が存在し、酵素が融合物として発現されたかどうかに依存して、予測されたサイズであったことを実証した。これは、先に試験していなかった新しい構築物(pONYK1−CTiA、pONYK1−AiTC、pONYK1−TCA、pONYK1−ATCmod、およびpONYK1−TCAmod)について最も重要なことであった。これは、それぞれのゲノム構築物が、GS15リンカーを有するドーパミン合成酵素を発現させることができることを実証した。これは、期待されるサイズ(124kDa)のタンパク質バンドが3つすべてのウエスタンブロットにおいて見られた3重融合カセット(TCAおよびATC)を含んだ。
上記に記載されるように、ウエスタン分析を、融合プラスミドによりトランスフェクトされた細胞由来の細胞溶解産物について実行した(図4および6)。このあとに、それぞれの融合ベクターにより形質導入された細胞からのドーパミン合成酵素レベルの分析を続けた。形質導入された細胞からのタンパク質レベルの分析は、結果として生じる機能的なベクターから発現されたタンパク質のレベルに対するよりよい洞察を与える。それぞれの融合構築物により形質導入されたHEK293T細胞は、それぞれのドーパミン合成酵素のタンパク質発現についてのウェスタンブロッティングによって分析され、また、結果を図8に示す。ブロットは、正確なサイズのタンパク質が、それぞれのベクターゲノムカセットについて発現されたことを実証した。データは、コード配列がIRESエレメントの下流に配置された場合に、タンパク質レベルが低下することを示唆した。
ドーパミン補充療法のための標的細胞集団であるラット線条体ニューロンを、それぞれの融合ベクターにより形質導入し、これらの初代細胞からのカテコールアミン産生を評価することを決定した。ニューロンについての最適な形質導入条件を確立するために、EIAV−GFPベクターを使用して予備実験を実行した(データ示さず)。ベクターの製造は、前に記載されるそれぞれのベクターゲノムを使用して実行し、非濃縮ベクター上清および濃縮した最終的なベクターを、DNA組み込みアッセイによって定量化した(図9)。濃縮ベクター調製物は、MOI 1で、三通り、線条体ニューロンを形質導入するために使用した。並行して、線条体ニューロンを、MOI 1で、EIAV−GFPベクターにより形質導入した。これは、形質導入の可視化が、GFPポジティブ細胞の存在によって、容易に観察することができるので、形質導入についてのコントロールとして、また、HPLC分析についてのネガティブコントロールとしても果たすために実行した。図10aから見られるように、ニューロン細胞は、MOI 1での、EIAV−GFPによる形質導入に成功した。
論じられるように、ATCmodおよびTCAmod3重融合ゲノムにおいてTHおよびCH1を連結するために使用した修飾GS15リンカー(GS15mod)は、親のゲノム(同一のGS15リンカーを含有する)から生成されたベクターにより形質導入された細胞からよりも、これらの構築物から作製されたベクターにより形質導入された細胞(ニューロンおよびHEK293T)からの高いドーパミン産生を実証した。この修飾GS15リンカーが、単一の融合ゲノムから作製されたベクターからのカテコールアミン産生の増加をもたらすかどうかを確証することを決定した。最も高いカテコールアミン産生が、TCiAベクターにより形質導入された細胞から観察されたので、TCiAにおける未修飾GS15リンカーを、修飾リンカーと交換し、TCiAmodを得ることを決定した(図1)。図11aにおいて見られるように、pONYK1およびTCiAに対するTCiAmodからのベクター力価は、より低かった(それぞれ3.4倍および2.2倍低い)が、これは、ベクター産生およびアッセイのばらつきによって引き起こされたものであろう。
AADC、CH1、およびTHを発現する10の融合ゲノムを構築した。5つは、IRESエレメントのうちの1つの代わりにGS15リンカーを含有する(TCiA、TAiC、ATiC、CTiA、およびAiTC)。残り4つの構築物は、GS15リンカーを両方のIRESエレメントと交換した3重融合構築物である。これらの構築物のうちの2つは、同一のGS15リンカーを含有し(ATCおよびTCA)、他の2つの3重構築物は、同じ遺伝子配置を含有するが、THおよびCH1遺伝子の間に配置される修飾リンカー(GS15mod)を有する(ATCmodおよびTCAmod)。このGS15modリンカーは、もとのGS15リンカーと同じアミノ酸配列をコードするが、異なるDNA配列を有する。GS15modリンカーはまた、TCiAの中にも挿入し、未修飾リンカーを交換して、TCiAmodを得た。
TCiAmod配置を使用するドーパミン産生は、IRES媒介性のAADC発現によって制限されるので、IRESの構成的プロモーターとの交換は、ADDC発現の増加をもたらし、形質導入された細胞のより高いレベルのドーパミン産生を可能にし得る。そのため、TCiAmodにおけるIRESエレメントをPGKまたはTKプロモーターと交換する代替の2つのゲノムを作り出した(図1を参照されたい)。
3つの融合ベクター(TACmod、TCiAmod、およびTCtkA)は、0.4のMOIで、三通り、ヒト初代皮質のニューロン(Innoprot、カタログ番号P10151)を形質導入するために使用した。これらのベクターは、pONYK1と類似する力価を有した(pONYK1 1.5E+08TU/ml、TACmod 7.4E+07TU/ml、TCiAmod 8.4E+07TU/ml、TCtkA 1.2E+08TU/ml)。コントロールとして、GFPベクターは、MOI 2および10で、ヒトニューロンを形質導入するために使用した。形質導入が起こったことを確実にするために、GFPが形質導入された細胞は、GFP蛍光について評価し、研究の終わりに(形質導入後9日目)、画像を取り込んだ、またそれを図12aに示す。GFP蛍光細胞の高いパーセンテージは、MOI 2および10の両方で可視化され、両方のMOIでのGFPベクターによる形質導入が成功したことを示した。細胞上清は、形質導入後5日目(収集1)および9日目(収集2)に、カテコールアミンHPLC分析のために収集した。収集1でのHPLC分析からの結果を図12bに示す。収集2からのHPLCデータは、収集1から見られたものと同等であった(データ示さず)。
進行中である研究のねらいは、MPTPにより処理された非ヒト霊長動物の行動上の回復について、2つの用量レベルのTCiA(mod)を、単一の用量レベルのpONYK1と比較することであり、そのうえ、18F−FMTおよび18F−ファリプリドPET画像化は、それぞれAADCまたはD2/D3受容体レベルを評価するために、手術の前におよび注射後3か月目に再び、すべて安定してパーキンソン病である動物に対して実行し、それぞれの放射性トレーサーの正常なベースラインレベルを決定するために、健康な動物をコントロールとして使用する。
* 1回のMRIベースラインスキャン
* 1か月のベースライン歩行活動のビデオベースの特徴づけ(Ethovisionによって評価)
* 2か月のMPTP中毒および歩行活動のビデオベースの評価(Ethovision)
* 1回のMPTP後の18F−FMT PETスキャン
* 1回のMPTP後の18F−ファリプリドPETスキャン
* 1回の経口L−ドパチャレンジ(challenge)および必要に応じた、1回の経口コントロールチャレンジ、それぞれ、Ethovision分析(6時間のフィルムにわたる)が後続
* ウイルス投与前に1回、血液サンプルを収集
* 脳にベクターを送達するための1回の外科的処置
* 3か月の、治療後の行動の経過観察(Ethovision)(0〜3か月)
* 治療の3か月後の1回のMRIスキャン
* 治療の3か月後の1回の18F−FMT PETスキャン
* 治療の3か月後の1回の18F−ファリプリドPETスキャン
* 治療の3か月後の、1回の経口L−ドパチャレンジおよび必要に応じた、1回の経口コントロールチャレンジ、それぞれ、Ethovision分析(6時間のフィルムにわたる)が後続
* さらに3か月の、治療後の行動の経過観察(Ethovision)(3〜6か月)** 安楽死の前に1回、血液サンプルを収集
* 安楽死(経心腔的灌流(transcardial perfusion)および脳摘出)
を受ける(詳細については材料および方法を参照されたい)。
細胞株
一過性のトランスフェクションに使用したHEK293T細胞は、M Calos(Stanford University)から得た。HEK293T細胞は、PAAから得られ、2mM L−グルタミン(Sigma、Cat.G7513)および1%非必須アミノ酸(Sigma、M7145)が補足された、10%(v/v)ウシ胎仔血清(FCS)を含有するダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)(Sigma、Poole、UK、Cat.D5671)において維持した。
線条体は、以前に記載されるように(Mazarakisら、2001)、ウィスターラット(胎児18日目)から摘出し、線条体をプールし、培養物を、以前に記載されるように(Azzouzら、2002)、調製した。結果として生じる培養物は、500μl
Neurobasal培地中で、ウェル当たり7.5E+04細胞の密度で24ウェルプレートに平板培養し、5%CO2を含有する37℃インキュベーターにおいて維持した。
ヒト凍結保存ニューロンは、Innoprot(Cat.P10151、ロット.6195、5E+06細胞/バイアル)から得た。24ウェルプレートは、2ug/cm2で、ポリ−L−リシン(PLL)コーティングした(Innoprot、Cat.PLL)。ヒトニューロンを解凍し、ニューロン増殖剤(NGS)およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液(Innoprot Cat.P60157)を補足した無血清ニューロン培地において1.2E+06細胞/mlの密度まで再懸濁した。希釈したニューロン懸濁液は、50μlの全容量で、6E+04細胞/ウェルで、PLLコーティングプレートのウェルの中心に追加した。プレートは、ニューロンを付着させるために、30分間、37℃でインキュベートし、その後、ウェルは、0.5mlの完全ニューロン培地により洗われた。細胞は、形質導入前の4日間、37℃でインキュベートした。形質導入前に、培地をそれぞれのウェルから除去し、組み合わせ、250μlをそれぞれのウェルに追加し、これにより、それぞれのウェルが、等量の条件培地を含有することを確実にした。MOI
0.4を実現するために必要とされるベクターの量を、三通り、それぞれのウェルに追加した。コントロールとして、ニューロンは、MOI 2および10で、GFP発現ベクターにより形質導入した(pONYK−GFP、ロット:KG290711)。形質導入の3〜6時間後に、250μl培地をそれぞれのウェルに追加した。
最小限のpONYK1ゲノムプラスミドは、pONY8.9.4TY(KanR遺伝子を含有する)として、最近になって、記載された(Jarrayaら、2009 Science Translational Medicine 1、2ra4)。このプラスミドは、Azzouz Mらによって、さらに詳細に記載されるpONY8.0Tに基づくものである(Azzouzら、2002 J Neurosci 22、10302−10312)。手短に言えば、pONYK1は、(順に)Neo、内部CMVプロモーター、切断型コドン最適化ヒトチロシンヒドロキシラーゼ(TH)、EMCV配列内リボソーム進入部位(IRES)、コドン最適化ヒト芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ(AADC)、ポリオウイルスIRES、GTP−シクロヒドロラーゼI(GTP−CH1)、およびヤマネズミ肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)を含有するカセットが挿入されたEIAV SINベクターゲノムである。2つの融合された遺伝子および1つのPV IRESエレメントを含有する融合プラスミド(図1:pONYK−ATiC、pONYK−TAiC、pONYK−TCiA、pONYK−CTiA、およびpONYK−AiTC)は、合成されたDNA(GeneArt、Germany)の領域を、トリシストロンカセットの中に挿入し、EMCV IRES領域および第1の遺伝子の終止コドンをGS15リンカーと交換することによって、生成した。GS15リンカーは、4×グリシンアミノ酸、その後に続く1×セリンアミノ酸が3回繰り返され、これにより、15アミノ酸のリンカーが得られる。このGS15リンカーについてDNA配列は、以下のとおりである:
GGGGGAGGCGGTAGCGGCGGAGGGGGCTCCGGCGGAGGCGGGAGC 。
GGAGGTGGCGGGTCCGGGGGCGGGGGTAGCGGTGGCGGGGGCTCC。
HEK293T細胞は、トランスフェクションの24時間前に、3.5×106細胞/皿の密度で10cm皿の中に接種した。ベクター産生は、メーカーの説明書に従って、Lipofectamine(商標)2000 CD(Invitrogen、Cat.12566−101)によって媒介された。手短に言えば、以下の量のプラスミドを、340μl OptiPRO(商標)(Gibco、Cat.12309−019)に追加した:4μgゲノムプラスミド(図1を参照されたい)、2μg pESGPK、および0.08μg pHG。次いで、このDNAミックスを、25μl Lipofectamine(商標)CD 2000および315μl OptiPRO(商標)を含有するミックスに追加した。トランスフェクションの14〜18時間後に、酪酸ナトリウムを、10mMの最終濃度まで追加した。培地は、酪酸ナトリウム誘発の6〜8時間後に変え、21〜23時間後に、ベクターを収集し0.45μmシリンジフィルターでろ過した。形質導入単位/ml(TU/ml)のベクター力価を、組み込み(DNA)力価アッセイによって評価した。
様々な融合構築物によってコードされるカテコールアミン酵素の機能性について試験するために、チロシンのドーパミンへの変換を測定する生化学アッセイを、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して実行した。このアッセイを実行するために、HEK293T細胞は、10μg ml−1ポリブレン(Sigma、cat. No.H9268)の存在下において、試験ベクターおよびPONYK1コントロールにより形質導入した。これらの細胞を3日間培養し、次いで、10分の1の細胞を、カテコールアミン生化学アッセイのための細胞を接種するために使用し、残りの細胞は、組み込み(DNA)力価アッセイによる分析のためにさらに継代した(上記を参照されたい)。2日後に、生化学アッセイのために接種した細胞の培地は、100mMの最終濃度でL−チロシン(Sigma、Cat. No.T1145)を補足した培地と交換し、細胞を一晩、培養した。翌朝、800μlの細胞培養上清を収集し、80μlの2M過塩素酸(Sigma、Cat. No.244252)および80μlのピロ亜硫酸ナトリウム(Sigma、Cat. No.S9000)を含有するチューブの中に入れた。サンプルを完全に混合し、一旦沈殿が形成されたら、サンプルを、あらゆるデブリを除去するために10分間、10,000xgで遠心分離した。次いで、別個のチューブに上清を取り出し、HPLC分析を実行することができるまで−80℃のフリーザーにおいて凍結させた。収集の時の細胞の数をさらに確かめた。
ベクター構成成分により一過性にトランスフェクトしたHEK293T細胞は、分画バッファー(0.1M Tris.Cl、pH7.3、0.2%(v/v)Nonidet
P40(BDS、cat. No.56009)中に溶解した。総タンパク質濃度を確かめ、10μgを、4〜20%ポリアクリルアミド変性ゲル(Invitrogen、Cat. No.EC60285BOX)上にロードした。ウェスタンブロッティングは、以下のうちの1つを使用して実行した:抗CH1抗体(Dr E. Werner、Austriaから得た)、抗TH抗体(Chemicon、Livingstone、UK、Cat.AB152)、または抗AADC抗体(Chemicon、Cat.AB136)。一次抗体インキュベーションの後に、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ二次抗体(DAKO、Ely、UK、Cat.P0448)とのインキュベーションを続けた。可視化は、ECL Advance Western Blotting Detection Kitにより実行した(GE Healthcare UK Ltd、Little Chalfont、Cat.RPN2135)。
ビデオケージ(フィルムは必要としなかった)に対する慣らしを、それぞれ30分間の3回のセッションにわたって実行する。ベースラインの運動の定量化は、Media Recorder収集ソフトウェア(Noldus)を使用して、特注品のビデオケージにおいて記録した、5回の30分間のビデオによって評価する。ビデオはすべて、ビデオ追跡ソフトウェア、Ethovision(Noldus)を使用して分析する。それぞれの動物のベースライン歩行活動は、MPTP中毒が始まる前に収集した最後の3つのビデオについて、総移動距離(TDT)として計算した平均歩行活動からなる。経口L−ドパによるチャレンジは、MPTP中毒前のベースライン時に実行しない。
動物(1回に4匹まで)を、筋肉内投与を介して7日間、0.2mg/kg MPTPの用量により処理し、新たなMPTPサイクルの開始前に少なくとも5日間休ませる。MPTPサイクルは、歩行活動が平均ベースライン活動の80〜90%まで低下するまで繰り返し、臨床スコアは、少なくとも8/14とする。少なくとも3週間の安定性のパーキンソン病の行動上のスコアは、PETスキャンおよび/またはウイルスベクターによる治療を実行する前に必要とされる。臨床スコアリングは、PapaおよびChaseから改良したものであり(Papa and Chase 1996 Ann. Neurol
39、574−578)、MPTP中毒の開始に際して、また、ウイルスベクターによる治療まで、一日単位で、MPTPにより誘発された運動障害をモニターするために使用する。30分間のビデオは、歩行活動を定量化するために、最後のMPTP注射後の3日目からスタートして毎週の単位で収集する。一旦、動物が、3週間、安定してパーキンソン病であることが評価されたら(TDT偏差≦15%)、L−ドパチャレンジおよび必要に応じて、別個のネガティブコントロールチャレンジを実行し、動物は、OFF時間の30分間のビデオと比較するための、最良の30分間のON期間を決定するために、Ethovision分析のために6時間、フィルムに記録する。
MRI:3D T2強調画像を使用する定位MRIは、注射座標を確立するために手術の前に収集する。画像はすべて、100mT/m(300μs立ち上がり時間)に達する傾斜磁場コイルおよび円形高周波1Hコイル(12cm内径)を装備した7テスラ水平システム(Varian−Agilent Technologies、USA)上で収集する。
ベクターを、それぞれの半球の被殻の中に注射する(m. ファスシクラリスの脳地図から計算する)。それぞれの半球について、50μLの1回目の注射は、前交連から1mm尾側とする。50μLの2回目の注射は、前交連から4mm尾側とする。2×50μL沈積物/半球の注射は、100μL Hamiltonガラスシリンジに付けられた28ゲージ51mm長ブラントステンレス鋼針を使用して、プロポフォール麻酔下で3μL/分の流量で行った。ベクター沈積物の正確な位置決めを確実にするために、ガイドチューブもまた使用する。
看護は、必要に応じて継続する。
安楽死の後に、脳を摘出し、抗体およびβgalによる染色の前にプロセシングする。
Claims (14)
- (i)チロシンヒドロキシラーゼ(TH)をコードするヌクレオチド配列、(ii)GTP−シクロヒドロラーゼI(CH1)をコードするヌクレオチド配列、および(iii)芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ(AADC)をコードするヌクレオチド配列を含む構築物であって、TH−AADCまたはAADC−TH融合タンパク質をコードするように、AADCをコードする前記ヌクレオチド配列が、THをコードする前記ヌクレオチド配列に対して作動可能に連結されており、前記構築物は、
以下:
TH −L− AADC −L− CH1、
TH −L− AADC −IRES− CH1、および
AADC −L− TH −IRES− CH1
から選択され、ここで、
Lは、リンカーコード配列であり、
IRESは、配列内リボソーム進入部位である、構築物。 - TH−L−AADC−L−CH1である、請求項1に記載の構築物。
- TH−L−AADC−IRES−CH1である、請求項1に記載の構築物。
- AADC−L−TH−IRES−CH1である、請求項1に記載の構築物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の構築物を含むウイルスベクターゲノム。
- 請求項5に記載のゲノムを含むウイルスベクター系。
- レンチウイルスベクター系またはアデノ随伴ウイルスベクター系である、請求項6に記載のウイルスベクター系。
- 以下:
(i)請求項5に記載のゲノム、
(ii)gagタンパク質およびpolタンパク質をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列、
(iii)(ii)のヌクレオチド配列によってコードされない、他の不可欠なウイルスパッケージング構成成分をコードするヌクレオチド配列
を含む、請求項7に記載のレンチウイルスベクター系。 - レンチウイルスベクター粒子を産生するための方法であって、前記方法は、産生細胞の中に、以下:
i)請求項5に記載のゲノム、
ii)gagタンパク質およびpolタンパク質をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列、ならびに
iii)ii)のヌクレオチド配列のうちの1つまたはそれより多くによってコードされない、他の不可欠なウイルスパッケージング構成成分をコードするヌクレオチド配列
を導入するステップを包含する、方法。 - 請求項6〜8のいずれか一項に記載の系または請求項9に記載の方法によって産生されるウイルス粒子であって、前記ウイルス粒子は、請求項5に記載のゲノムを含む、ウイルス粒子。
- EIAVベクター粒子であり、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質(VSV−G)によりシュードタイプされた、請求項10に記載のウイルスベクター粒子。
- 薬学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤と一緒に、請求項10または11に記載のウイルス粒子を含む、薬学的組成物。
- インビボにおけるドーパミン合成を誘発することによって、被験体における神経変性疾患を治療するおよび/または予防するのに使用するための、請求項10もしくは11に記載のウイルス粒子を含む薬学的組成物または請求項12に記載の薬学的組成物。
- 前記神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項13に記載の薬学的組成物。
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