CN114317610B

CN114317610B - 一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体

Info

Publication number: CN114317610B
Application number: CN202210101205.3A
Authority: CN
Inventors: 凌思凯; 汪啸渊
Original assignee: Shanghai Bendao Gene Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Bendao Gene Technology Co ltd
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2024-07-02
Anticipated expiration: 2042-01-27

Abstract

本发明公开了一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体；其包装质粒包括表达包膜蛋白的pMD.2G，表达REV蛋白的pRSV‑REV，整合酶突变失活的pMDlg/pRRE‑IN mut或pMDlg/pRRE，和表达TH、AADC和CH1的载体质粒。本发明提供了2种慢病毒载体递送外源基因，一种是具有基因整合作用的慢病毒载体，另一种是非整合型慢病毒载体；都将目的基因递送到细胞中长期表达蛋白；整合型慢病毒载体将所递送的外源基因整合至基因组中，在细胞扩增后依然可以稳定表达蛋白；非整合型慢病毒载体将所递送的外源基因游离于基因组外，不干扰宿主基因组，在终末分化的细胞内可以长期存在，并表达蛋白。

Description

一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体

技术领域

本发明属于医疗技术领域，涉及一种慢病毒载体，尤其涉及一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体。

背景技术

帕金森疾病是一种神经退行性疾病，患者表现出多种症状，有静止性震颤、行动缓慢和肌强直。60岁以上的人群中患病率有1％，世界总患病人数达到7,000,000-100,000,000。虽然帕金森疾病的具体病因尚不完全明确，但是病理是比较明确的。帕金森疾病是由黑质多巴胺能神经元的退化、损坏继而引起多巴胺分泌减少导致的。治疗帕金森疾病的要点是增加纹状体区域中多巴胺的量，现在临床上的治疗方法是服用一种主要成分为左旋多巴(Levodopa)的小分子药物来补充多巴胺以缓解症状和减慢疾病发展。左旋多巴是多巴胺的前体分子，通过血脑屏障进入中枢系统，经多巴脱羧酶作用转化成多巴胺的方式发挥药理作用，可用于早期患者。帕金森晚期患者还可采用帕金森脑深部电刺激术(Deep brainstimulation，DBS)的对症治疗方法进行治疗(Emily Bell,et al 2016,PMID:26909704)。

根据现在认识到的帕金森疾病的治疗机制，还可以开发一种基因治疗的方法缓解甚至治愈帕金森疾病。目前在开发中的帕金森基因疗法的原理是在体内长期表达治疗性蛋白，以维护神经元的正常功能。多个基于AAV递送载体的帕金森疾病基因治疗项目已进入临床研究阶段，根据所递送基因的不同，治疗机制可以分为以下几种：递送基因表达神经生长因子改善退化神经元的功能，防止进一步的神经退化(William J Marks Jr,et al.LancetNeurol.7(5):400-408.PMID:18387850)，递送基因表达L-氨基酸脱羧酶(L-amino aciddecarboxylase，AADC)促进左旋多巴向多巴胺的转化(C W Christine，et al,Neurology,2009,73(20):1662-1669.PMID:19828868；Shin-ichi Muramatsu,et al,MolecularTherapy.18:1731-1735)，递送基因表达谷氨酸脱羧酶促进神经递质抑制剂GABA的合成(Michael GKaplit t，et al,The Lancet,369:2097-2105.PMID:17586305)，降低丘脑下核的活性来改善晚期帕金森病的症状。慢病毒载体也是一种高效的递送载体，已被用于回体基因治疗药物的递送(Zynteglo)，该产品的上市证明了慢病毒载体的安全性。所以应用慢病毒载体作为体内基因治疗的递送载体也被用到帕金森基因治疗的临床研究上。一种可同时递送限速多巴胺生物合成酶酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)、AADC和环水解酶1(Cyclohydrolase 1，CH1)基因的三顺反子慢病毒载体(ProSavin,Oxford BioMedica,Oxford,UK)进入帕金森疾病基因治疗完成临床I/II期的研究，对晚期帕金森病患者安全且耐受性良好，所有患者的运动行为均有改善，长期随访(5-8年)安全性良好(StéphanePalfi,et al.Lancet,2014,383(9923):1138-1146.PMID:24412048；Stéphane Palfi,etal.Hum Gene Ther Clin Dev.2018,29(3):148–155.PMID:30156440)。

以上治疗方案中，左旋多巴适用于疾病早期的患者，而且随着时间的推移，功效逐渐减弱。除此之外，药物治疗还会引起运动障碍、出现幻觉等药物并发症。DBS的手术复杂，要求精细的植入技术和经验丰富的神经外科医生进行操作，也存在因患者个体差异，导致的电刺激的参数不易确定等问题，所以该方法推广性受限制。而且DBS术后也会给患者带来认知障碍、行为异常、精神障碍、情绪变化等一系列副作用。至今没有一种治疗方法能治愈帕金森疾病。

基因治疗的方法促进多巴胺分泌是一种具有发展前景的帕金森疾病治疗方法。目前，治疗机制相对明确。TH、AADC和CH1三种蛋白可促进神经元合成多巴胺，递送这三种蛋白的基因纹状体区域进而增加纹状体区域多巴胺的量是基因治疗帕金森的途径之一。然而，体内基因治疗需要一种良好的基因递送载体。现用较多的体内基因治疗载体是AAV载体，虽然AAV的基因治疗具有良好的安全和耐受性，但AAV载体承载力小(最大4.7K)的特点一直限制着AAV载体的应用范围，所递送的基因长度越长，效率越低。且AAV载体具有免疫原性，可能会引起炎症。相比较而言，慢病毒载体所携带的基因长度可达7K，可同时递送多个蛋白的基因。慢病毒载体也是被证明过安全性的载体，应用慢病毒载体的回体基因治疗药物已经上市。而且，与AAV载体相比，慢病毒载体具有低免疫原性和高效转导神经细胞的能力。慢病毒载体作为帕金森基因治疗载体可递送这三种基因到纹状体区域神经元内，长期表达蛋白以持续促进多巴胺的合成。Oxford Biomedica公司应用自己的慢病毒载体平台开发了针对帕金森基因治疗的技术ProSavin，由于多巴胺的表达量低已经被其优化的版本更新，其研究已进入临床研究阶段(NCT03720418)还未上市。所以现在还没有高效的治疗帕金森疾病的基因治疗方法。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中关于帕金森疾病基因治疗研究中的有效性和安全性问题，提供一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体；具体是提供一种慢病毒载体递送TH、AADC和CH1基因到神经元的方法，用于治疗帕金森疾病。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种慢病毒载体系统，为非整合型慢病毒载体系统，其包装质粒包括表达包膜蛋白的pMD.2G、表达REV蛋白的辅助质粒pRSV-REV、整合酶突变失活的pMDlg/pRRE-IN mut和表达TH、AADC和CH1的载体质粒。

本发明还提供一种整合型慢病毒载体系统，其包括表达包膜蛋白的pMD.2G、表达REV蛋白的pRSV-REV、pMDlg/pRRE和表达TH、AADC和CH1的载体质粒。

作为本发明的一个实施方案，所述表达TH、AADC和CH1的载体质粒是通过包括如下步骤的方法构建而得：

S1、设计需要合成的基因：TH和CH1通过多肽GS基因连接再通过P2A基因与AADC基因连接；

S2、合成基因：根据设计，在TH、AADC和CH1基因的5’端加入Kozak序列，合成基因；

S3、构建载体质粒：将合成的基因片段连接入限制性内切酶BamHI/XhoI酶切后的载体，即得。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中还包括对设计好的基因进行适合在哺乳动物真核细胞表达的密码子优化的步骤。

作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，所述载体为载体pCCL-PGK-eGFP。

作为本发明的一个实施方案，所述表达TH、AADC和CH1基因的载体质粒为pCCL-PGK-TH-GS15-CH1-P2A-AADC，载体序列如SEQ ID NO.3所示。

作为本发明的一个实施方案，整合酶突变失活的pMDlg/pRRE-IN mut，包括整合酶具有D64V的pMDlg/pRRE-D64V。

作为本发明的一个实施方案，pMDlg/pRRE-D64V表达的失活整合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。基因序列如SEQ ID NO.1所示序列。

本发明还提供一种前述慢病毒载体系统的制备方法，将所述质粒pMD.2G,pRSV-REV,整合酶突变失活的pMDlg/pRRE-IN mut或pMDlg/pRRE，和载体质粒共转染进宿主细胞，浓缩、纯化，得到能表达TH、AADC和CH1蛋白的慢病毒系统。

本发明还提供前述慢病毒载体系统在制备治疗帕金森疾病的制剂中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明提供的用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体递送的TH、AADC和CH1基因经过密码子优化，使其更利于在人源细胞中的表达；

2)本发明提供的用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体所递送的TH、AADC和CH1基因是使TH和CH1融合表达，AADC蛋白单独表达的，在基因的设计中，TH和CH1是通过GS15连接，再通过P2A与AADC相连的，在翻译成蛋白成熟时，AADC被剪切为单独的蛋白，以便单独作用于左旋多巴向多巴胺的转化；

3)本发明提供的用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体所递送的TH、AADC和CH1基因是由PGK启动子表达的，以提高基因在真核细胞中的表达效率；

4)本发明提供了2种慢病毒载体递送外源基因，一种是具有基因整合作用的慢病毒载体，另一种是非整合型慢病毒载体。两种载体均能高效地感染神经细胞，递送补偿的基因。两种载体都将目的基因递送到细胞中长期表达蛋白；整合型慢病毒载体将所递送的外源基因整合至基因组中，在细胞扩增后依然可以稳定表达蛋白。非整合型慢病毒载体将所递送的外源基因游离于基因组外，不干扰宿主基因组，在终末分化的细胞内(正常情况下，细胞几乎不增殖)可以长期存在，并表达蛋白。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为表达TH、AADC和CH1基因的质粒示意图；

图2为体内表达TH蛋白示意图；

图3为体内表达CH1蛋白示意图；

图4为体内表达AADC蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明提供一种慢病毒载体递送TH、AADC和CH1基因到神经元的方法，用于治疗帕金森疾病；包括：

1.选择载体：

1)利用慢病毒载体高效的感染细胞的能力，将TH、AADC和CH1基因递送到细胞内整合至基因组，长期表达TH、AADC和CH1，持续合成多巴胺。

2)非整合型慢病毒载体递送所需基因，该非整合型慢病毒载体将在长期存在于终末分化的神经细胞中，表达TH、AADC和CH1，持续合成多巴胺。第三代慢病毒的包装质粒是pMD.2G、pRSV-REV、pMDlg/pRRE和第三代慢病毒载体质粒pCCL-PGK-eGFP。在本发明中，将普通慢病毒整合酶的第64位氨基酸天冬氨酸(D)突变为缬氨酸(V)，整合酶失活，使慢病毒失去基因整合的特性。即将质粒pMDlg/pRRE中的整合酶基因做碱基突变，构建出质粒pMDlg/pRRE-D64V。在生产非整合型慢病毒时，将质粒pMD.2G、pRSV-REV、pMDlg/pRRE-D64V和载体质粒pCCL-PGK-eGFP共转染进HEK293T细胞。经过浓缩、纯化步骤得到非整合型慢病毒颗粒。

2.设计治疗基因：

帕金森疾病的基因治疗方法是通过补充外源TH、AADC和CH1基因促进多巴胺的合成。TH基因表达酪氨酸羟化酶，AADC基因表达L-氨基酸脱羧酶，CH1基因表达环水解酶1。环水解酶1(CH1)负责催化四氢生物蝶呤(Tetrahydrobiopterin)的形成，四氢生物蝶呤是酪氨酸羟化酶(TH)的重要辅助因子。酪氨酸羟化酶催化L-酪氨酸成左旋多巴，左旋多巴再经L-氨基酸脱羧酶(AADC)转化为多巴胺。本发明所涉及的三个基因TH、AADC和CH1基因的组合方式是将TH和CH1通过多肽GS基因连接再通过P2A基因与AADC基因连接的。基因表达成蛋白的结果是TH与CH1融合存在，AADC单独存在。

3.密码子优化：

将设计好的所需递送的基因进行适合在哺乳动物真核细胞表达的密码子优化。密码子优化是由基因合成公司的优化工具进行的，将基因优化为在真核细胞，尤其是人源的细胞中表达量增高的序列，而所表达的蛋白氨基酸序列不变。优化的主要原则为：1)避免使用稀有密码子，使基因序列更符合人源密码子的偏好性。优化后，密码子更适应在人源细胞中表达，其密码子适应指数(Codon Adaptation Index，CAI)的值为0.96(CAI取值范围在0—1之间，序列优化的最佳值为1)；2)增加GC含量的平稳度，避免在整条基因中出现GC含量过高或过低的片段。优化后，GC含量的值较平稳，GC含量维持在40-60％之间。

4.构建表达TH、AADC和CH1基因的慢病毒载体质粒

本发明描述的针对帕金森疾病的基因治疗方法中，所递送的基因是由整合型或非整合型慢病毒载体完成的。因此需要将TH、AADC和CH1基因的表达框装载入慢病毒的载体基因上。表达框所应用的启动子是PGK启动子。其表达质粒是pCCL-PGK-TH-GS15-CH1-P2A-AADC。

5.慢病毒载体包装TH、AADC和CH1基因：

包装适用帕金森疾病的整合型慢病毒载体需要将表达包膜蛋白的pMD.2G、表达REV蛋白的pRSV-REV、表达Gag-Pol蛋白的pMDlg/pRRE和载体质粒pCCL-PGK-TH-GS15-CH1-P2A-AADC共转染进宿主细胞，浓缩、纯化，得到能表达TH、AADC和CH1蛋白的整合型慢病毒载体。

6.非整合型慢病毒载体包装TH、AADC和CH1基因：

包装适用帕金森疾病的非整合型慢病毒载体需要将表达包膜蛋白的pMD.2G、表达REV蛋白的pRSV-REV、整合酶突变失活的pMDlg/pRRE-IN mut和载体质粒pCCL-PGK-TH-GS15-CH1-P2A-AADC共转染进宿主细胞，浓缩、纯化，得到能表达TH、AADC和CH1蛋白的非整合型慢病毒载体。其中，整合酶突变失活的pMDlg/pRRE-IN mut，包括整合酶具有D64V的pMDlg/pRRE-D64V；也可以是其他位置突变，如N120L,W235E,Q148A,K264R，K264E,F185A,D116A,D64A,H12A，D64E，D116N。

实施例1、构建表达TH、AADC和CH1的质粒

1、设计需要合成的基因：如图1，在TH和CH1之间加入15个拷贝的GS序列(SEQ IDNO.7)用于蛋白成熟时连接TH和CH1蛋白。然后通过P2A基因(基因序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)连接AADC。进行适合在哺乳动物真核细胞表达的密码子优化，密码子优化后的序列如SEQ ID NO.8所示。

2、合成基因。上述基因设计好后，在优化后的TH、AADC和CH1基因的5’端加入Kozak序列(gccacc)，为了之后的构建载体，在基因两端各添加一段序列，使5’端包含限制性内切酶BamHI识别位点，3’端包含限制性内切酶XhoI识别位点。

3、用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切合成的基因和载体pCCL-PGK-eGFP(质粒基因序列如SEQ ID NO.6所示)，经过DNA纯化后连接基因和载体，构建出质粒pCCL-PGK-TH-GS15-CH1-P2A-AADC。质粒构建谱图如图1。

实施例2、生产非整合型表达TH、AADC和CH1的慢病毒颗粒IDLV-PD

1.第一天，接种HEK293T细胞到直径为15cm规格的细胞培养皿，细胞数量为1.3×10⁷每皿。

2.第二天，细胞接种24小时后，密度接近85％。换新鲜的细胞完全培养基。1小时后转染。将质粒9.07μg pMD.2G、7.26μg pRSV-REV、31.46μg pMDlg/pRRE-D64V和31.46μg载体质粒pCCL-PGK-TH-GS15-CH1-P2A-AADC共转染进HEK293T细胞。

本实施例应用钙磷转染法转染，方法步骤如下：

1)取15mL离心管，依次加无菌水和各种质粒配成总体积为1089μL的DNA MIX混匀；

2)在DNA MIX液面上缓慢滴加121μL 2.5M CaCl₂溶液，轻轻吸取反复滴加混匀(约重复3次左右)；

3)滴加1210μL 2×HEBS溶液，混匀，静置；

4)5分钟内将液体滴加到细胞中，混匀，放入培养箱。

3.第三天，弃掉原来的培养基，换成新鲜的细胞完全培养基。

4.第四天，质粒转染48小时后收取粗病毒液，再加入新鲜的细胞完全培养基。

5.第五天，质粒转染72小时后收取粗病毒液，与前一天收的粗病毒液合并。加入全能核酸酶，37℃处理粗病毒液1小时。用0.45μm的滤膜的一次性过滤器将粗病毒液过滤到超滤管中，每管加入32mL粗病毒液,并在管底加6mL 20％的蔗糖PBS溶液，使蔗糖溶液和粗病毒液界限分明。把超滤管放入超速离心机的适配器中，配平衡后，在Beckman&optima L-100XP超速离心机中以25,000rpm,4℃的条件下离心2小时。离心结束后，拿出超离管，倒掉上清液，擦干内管壁，加入30μL PBS浸泡慢病毒颗粒4-18h。

6.浸泡完全后，用移液器轻柔地将慢病毒吹吸均匀后分装，储存在-80℃冰箱。

7.取5μL IDLV-PD，用慢病毒滴度ELISA检测试剂盒检测物理滴度p24的值。

实施例3、生产整合型表达TH、AADC和CH1的慢病毒颗粒LV-PD

具体操作同实施例2，不同的是，生产LV-PD时转染到生产细胞的质粒为9.07μgpMD.2G、7.26μg pRSV-REV、31.46μg pMDlg/pRRE和31.46μg载体质粒pCCL-PGK-TH-GS15-CH1-P2A-AADC。

实施例4、IDLV-PD体内表达TH、AADC和CH1蛋白

1.注射：选取6-8周龄雄性C57BL/6小鼠。麻醉后颅内注射IDLV-PD。用汉密尔顿显微注射器在小鼠脑右侧纹状体(2mm lateral and 0.5mm rostral to the bregma at 3mmdepth)注射1μL(p24 60ng)IDLV-PD。

2.取材：注射7天后，安乐死小鼠，4％多聚甲醛灌流。解剖脑组织置于4％(wt/vol)多聚甲醛4℃过夜固定。固定后转移到30％蔗糖溶液放置48h。

3.切片：处理后的大脑组织做冰冻切片。脑内纹状体区域右侧为注射测，是待检测的一侧；左侧为对侧，未注射，为阴性对照。

4.通透：将切片浸泡在0.4％triton X-100中做细胞通透处理。

5.封闭：2％的山羊血清封闭切片。

6.敷一抗：为染色TH、AADC和CH1蛋白，分别敷相应的一抗，4℃过夜。所用一抗分别是mouse anti-GCH-1protein antibody(1:250稀释,Santa Cruz),mouse anti-DDCantibody(1:250稀释,Santa Cruz)和mouse anti-tyrosine hydroxylase(TH；1:250稀释,Santa Cruz)。

7.敷二抗：洗片后敷二抗，室温避光2h，所用二抗是secondary anti-Mouseantibody conjugated to a red fluorescent molecule(Alexa Fluor 488；1：1000稀释，Jackson ImmunoResearch)。

8.铺片：敷抗体后，将切片置于载玻片上，滴加抗荧光淬灭剂(含DAPI)，盖上盖玻片。

9.成像：用激光共聚焦显微镜拍片。

如图2、图3和图4所示，注射的位点是这三种蛋白无本底表达的纹状体区域。慢病毒载体感染此区域的细胞，表达出TH、AADC和CH1三种蛋白，分别被相对应的抗体染色。DAPI染色细胞核。结果显示，注射IDLV-PD后，感染神经元细胞并表达出3种蛋白。箭头指向的是表达蛋白的细胞。比例尺：20μm。

综上所述，本发明提供的用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体递送的TH、AADC和CH1基因经过密码子优化并由PGK启动子表达，以提高基因在真核细胞中的表达效率；应用常用的连接子P2A来分割两个蛋白，序列短，易构建、效果好。且本发明的非整合型慢病毒载体可实现不干扰宿主细胞基因组。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 上海本导基因技术有限公司

<120> 一种适用于帕金森疾病基因治疗的慢病毒载体

<130> DD17350

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 867

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Leu Leu Trp Lys Gly Glu Gly Ala Val Val Ile Gln Asp Asn Ser Asp

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20

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<212> DNA

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tagtgtcacc taaatcgtat gtgtatgata cataaggtta tgtattaatt gtagccgcgt 4680

tctaacgaca atatgtacaa gcctaattgt gtagcatctg gcttactgaa gcagacccta 4740

tcatctctct cgtaaactgc cgtcagagtc ggtttggttg gacgaacctt ctgagtttct 4800

ggtaacgccg tcccgcaccc ggaaatggtc agcgaaccaa tcagcagggt catcgctagc 4860

ctaggctttt gcgtcgagac gtacccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacgcgcgct 4920

cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 4980

gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 5040

gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cgacgcgccc tgtagcggcg 5100

cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc 5160

tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc 5220

gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg 5280

accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg 5340

tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg 5400

gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt 5460

cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa 5520

tattaacgtt tacaatttcc caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat 5580

ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata 5640

aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct 5700

tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa 5760

agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa 5820

cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt 5880

taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg 5940

tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca 6000

tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa 6060

cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt 6120

gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc 6180

cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa 6240

actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga 6300

ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc 6360

tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga 6420

tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga 6480

acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga 6540

ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat 6600

ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 6660

ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 6720

gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc 6780

ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 6840

aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 6900

gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc 6960

gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 7020

aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 7080

cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 7140

tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 7200

ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 7260

atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 7320

cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 7380

ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 7440

gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc 7500

cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg 7560

cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 7620

ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 7680

aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa 7740

gctggagctg c 7751

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ggaggaggag gcagcggagg aggagggtct ggaggaggag gatca 45

<210> 8

<211> 3312

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

atggtgaagg tgccctggtt ccccagaaag gtgagcgagc tggacaagtg ccaccacctg 60

gtgaccaagt tcgaccccga cctggacctg gaccaccctg gatttagcga ccaggtgtac 120

agacagagaa gaaagctgat cgccgagatt gccttccagt atagacacgg cgaccccatc 180

cccagagtgg aatacacagc tgaggaaatc gccacctgga aggaagtgta caccacactg 240

aaaggactgt acgccaccca tgcctgcgga gaacacctgg aagccttcgc tctgctggag 300

agatttagcg gctaccggga agacaacatc ccccagctgg aggacgtgag cagattcctg 360

aaggagagaa ccggctttca gctgagaccc gtggccggac tgctgtctgc tagagatttc 420

ctggcctctc tggcctttag agtgttccag tgcacccagt atatcagaca cgcctccagc 480

cccatgcact cccctgaacc tgactgctgc cacgagctgc tgggacatgt gccaatgctg 540

gccgacagaa ccttcgccca gtttagccag gacatcgggc tggcttccct gggagcttct 600

gacgaagaga tcgagaaact gtctaccctg tattggttca ccgtggagtt cggcctgtgt 660

aagcagaacg gcgaggtgaa ggcctacgga gctggactgc tgtcctccta cggagagctg 720

ctgcactgcc tgagcgagga acctgagatc agagctttcg atcccgaggc tgccgccgtg 780

cagccttacc aggatcagac ataccagagt gtgtacttcg tgtccgagag cttttccgac 840

gccaaggaca agctgagaag ctacgccagc agaatccaga gaccattcag cgtgaagttc 900

gacccttaca ccctggccat cgacgtgctg gactcccctc aggctgtgag aagaagcctg 960

gaaggcgtgc aggacgaact ggataccctg gctcacgccc tgtccgctat tggaggagga 1020

ggaggcagcg gaggaggagg gtctggagga ggaggatcag aaaagggacc cgtgagagcc 1080

cccgctgaaa agcctagagg ggctagatgt agcaatggct tccctgagag agacccacca 1140

agaccaggac caagtagacc agccgagaag ccccctagac cagaagctaa gagcgcccag 1200

cccgctgatg gatggaaagg agagagaccc agatctgagg aggacaacga gctgaacctg 1260

cccaacctgg ccgctgctta cagctcaatc ctgagcagcc tgggagagaa cccccagaga 1320

cagggactgc tgaagacacc ctggagagcc gctagcgcta tgcagttttt taccaagggc 1380

taccaggaaa ccatcagcga cgtgctgaac gacgccatct ttgacgaaga ccacgacgag 1440

atggtgatcg tgaaagacat cgacatgttc tccatgtgcg aacaccatct ggtgcccttc 1500

gtggggaaag tgcacattgg gtacctgccc aacaagcagg tgctgggact gagcaagctg 1560

gccagaatcg tggagatcta cagcaggagg ctgcaggtgc aggaacggct gacaaagcag 1620

atcgccgtgg ccatcacaga ggccctgaga cctgctggag tgggagtggt ggtggaagct 1680

acacacatgt gtatggtgat gaggggagtg cagaagatga acagcaaaac agtgaccagc 1740

accatgctgg gcgtgtttag agaagatcct aagactaggg aggagttcct gaccctgatc 1800

agaagcggct ccggcgctac aaatttcagc ctgctgaagc aggccggcga tgtggaagaa 1860

aaccctggcc ctgatgctag cgagtttagg agaagaggga aggagatggt ggactacgtg 1920

gccaactaca tggaggggat tgaggggaga caggtgtacc ccgacgtgga acctggatac 1980

ctgaggcctc tgatccccgc tgctgctcct caggaaccag acacatttga ggacatcatc 2040

aacgacgtgg agaagatcat catgcccggc gtgacccact ggcatagccc ttatttcttc 2100

gcctactttc ccaccgcctc ctcatacccc gccatgctgg ctgatatgct gtgcggagcc 2160

attggctgta tcggcttctc ctgggctgct tctcccgctt gtaccgagct ggagaccgtg 2220

atgatggact ggctgggcaa gatgctggag ctgcctaagg ctttcctgaa cgaaaaggcc 2280

ggcgaggggg gaggagtgat tcagggatct gcttccgagg ccacactggt ggctctgctg 2340

gctgctagaa ccaaggtgat ccacagactg caggccgcca gccctgaact gacacaggct 2400

gctatcatgg agaagctggt ggcttactcc agcgaccagg cccatagttc cgtggaaaga 2460

gccggactga tcggcggagt gaaactgaag gccattccct ccgacggcaa cttcgccatg 2520

cgggcttcag ctctgcagga ggctctggaa agggacaagg ccgctggact gatccccttc 2580

ttcatggtgg ctacactggg caccaccacc tgctgtagct ttgataacct gctggaggtg 2640

ggacccatct gtaacaaaga agacatctgg ctgcacgtgg atgctgccta cgccggatct 2700

gctttcatct gccccgagtt cagacacctg ctgaacggcg tggagttcgc tgactccttc 2760

aacttcaacc cccacaagtg gctgctggtg aacttcgact gttccgccat gtgggtgaag 2820

aagaggaccg acctgaccgg agccttcaga ctggacccta cttacctgaa gcactcccac 2880

caggactccg gcctgatcac tgactaccgg cactggcaga tccccctggg aagaagattc 2940

agaagcctga aaatgtggtt tgtgttcaga atgtacggcg tgaaaggact gcaggcctac 3000

atcaggaaac acgtgcagct gagccacgag tttgagagcc tggtgaggca ggaccccaga 3060

ttcgaaatct gcgtggaggt gatcctgggc ctggtgtgtt tcagactgaa gggaagcaac 3120

aaggtgaacg aggccctgct gcagagaatc aactcagcca agaagatcca cctggtgccc 3180

tgtcacctga gagacaagtt cgtgctgaga tttgccatct gctctagaac cgtggagagc 3240

gcccacgtgc agagagcttg ggaacacatc aaggagctgg ccgccgacgt gctgagagct 3300

gaaagagagt aa 3312

Claims

1.一种慢病毒载体系统，其特征在于，所述载体系统为非整合型慢病毒载体系统，其包装质粒包括表达包膜蛋白的pMD.2G、表达REV蛋白的pRSV-REV、整合酶突变失活的pMDlg/pRRE-IN mut和表达TH、AADC和CH1的载体质粒；

所述整合酶突变失活的pMDlg/pRRE-IN mut为具有D64V的pMDlg/pRRE-D64V；

所述pMDlg/pRRE-D64V表达的失活整合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述表达TH、AADC和CH1的载体质粒为pCCL-PGK-TH-GS15-CH1-P2A-AADC，其载体序列如SEQ ID NO.3所示；

所述表达TH、AADC和CH1的载体质粒，其构建方法包括S1、设计需要合成的基因，TH和CH1通过多肽GS基因连接再通过P2A基因与AADC基因连接；还包括对设计好的基因进行适合在哺乳动物真核细胞表达的密码子优化的步骤，密码子优化后的序列如SEQ ID NO.8所示。

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体系统，其特征在于，所述表达TH、AADC和CH1的载体质粒的构建方法还包括：

S2、合成基因：根据设计，在TH、AADC和CH1基因的5’端加入Kozak序列，合成基因；

S3、构建载体质粒：将合成的基因片段连接入限制性内切酶BamHI/XhoI酶切后的载体，即得表达TH、AADC和CH1基因的载体质粒。

3.根据权利要求2所述的慢病毒载体系统，其特征在于，步骤S3中，所述载体为载体pCCL-PGK-eGFP。

4.一种根据权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于，将所述质粒pMD.2G,pRSV-REV,整合酶突变失活的pMDlg/pRRE-IN mut和载体质粒共转染进宿主细胞，浓缩、纯化，得到能表达TH、AADC和CH1蛋白的慢病毒系统。